WO2000052033A1

WO2000052033A1 - Nouveaux derives de tetrapeptides cycliques et leur utilisation comme medicaments

Info

Publication number: WO2000052033A1
Application number: PCT/JP2000/001141
Authority: WO
Inventors: Norikazu Nishino; Minoru Yoshida; Sueharu Horinouchi; Yasuhiko Komatsu
Original assignee: Japan Energy Corporation
Priority date: 1999-03-02
Filing date: 2000-02-28
Publication date: 2000-09-08
Also published as: CA2362817A1; JP4269041B2; AU2694400A; NZ513983A; US20020120099A1; JP2000256397A; EP1174438A1; ZA200107320B; US6825317B2; NO20014225L; NO20014225D0; EP1174438A4

Description

明細書新規な環状テトラべプチド誘導体とその医薬用途技術分野

本発明は、新規な環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩と該化合物のヒストンデァセチラ一ゼ阻害剤並びに MHC cl ass— I分子発現促進剤としての応用、並びに、前記するヒストンデァセチラ一ゼ阻害作用あるいは MHC cl ass— I分子発現促進作用を利用した、抗癌剤等の医薬用途を有する当該環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物に関する。背景技術

自己の組織細胞は免疫細胞による誤った傷害を防ぐため、本来外部から侵襲した異物、病原体等と区別するための抗原提示分子として MHC class— I分子をその細胞表面に発現している。免疫系は、 MHC class— I分子を識別することで、自己の組織細胞であるとして、その攻撃対象から除いている。他方、本来自己細胞ではあるが、癌化した細胞、あるいは癌化ウィルスに感染した細胞では、正常な自己細胞と異なり、癌化に伴う蛋白質、あるいは癌化ウィルス由来蛋白質が生産され、これら非自己蛋白質に由来する抗原が MHC cl ass— I分子により提示される。免疫細胞、特には、細胞傷害性 T細胞は、この非自己蛋白質に由来する抗原を認識することで、癌細胞、あるいは癌化ウィルス感染細胞を排除することができる。

しかしながら、ある種の癌細胞あるいは癌化ゥィルス感染細胞においては、この MHC class— I分子の発現が低下しており、前記の免疫系による排除機構を回避し、癌化組織の伸長 ·拡大、癌化ウィルス感染の長期持続化、拡大が引き起こされることが報告されている。これら癌細胞あるいは癌化ウィルス感染細胞の造腫瘍性抑制を目的とした研究において、低下した MHC c lass— I分子の発現を回復させることで治療効果が達成されることを示唆する結果が報告されており、例えば、アデノウイルス 12型で形質転換した癌細胞や自然発症メラノ一マにおいて、低下している MHC class- 1分子の発現を MHC class- 1遺伝子の導入により高めてやることで、これら癌細胞の造腫瘍性が消失することを田中らが報告している（Tanaka, K.， Isselbacher, K.J. , Khoury, G,， and Jay, G. Science 228, 26-30， 1985; Tanaka, K.， Gorelik, E. , Watanabe, M. ,

Hozurai, N" and Jay, G. Mol. Cell. Biol. 8， 1857-1861, 1988等を参照) 。

ところで、 MHC class— I分子の発現は、その自己組織細胞の細胞増殖後、分化過程の一環として起こるものであり、この過程での内因性蛋白質の翻訳を促進することで、 MHC class— I分子の発現も促進されることが期待される。内因性蛋白質の翻訳を調整している機構は幾つかあるが、遺伝子発現に重要な役割を果たしていると考えられるものの一つに、核遺伝子クロマチン中にその構造蛋白質として含まれるヒストン蛋白のァセチル化がある。具体的には、クロマチンは、 4種類のコアヒストン 8量体に遺伝子 DMが巻き付き、所謂ヌクレオソ一ム構造と称される基本単位をなし、更にこれが高次構造を形成しているが、そのコアヒストンの N末端付近は塩基性アミノ酸に富んだテール状をとリ、前記ヌクレオソ一ム上の DNAをさらに被う構造をとる。このテール域付近のリジン残基は、可逆的なァセチル化の代謝回転を被っており、ヌクレオソ一ム自体の構造制御、あるいは、遺伝子 DNAに作用する他の蛋白質（転写因子群、サイレンサー蛋白質群、 RNAポリメラ一ゼなど）との結合制御を介する転写制御に密接に係わっているとされている。

ヒストンのァセチル化に依存する遺伝子発現制御の査証として、ヒストンの高ァセチル化は、その領域に存在する遺伝子からの発現誘導を促進し、一方脱ァセチル化は、ヘテロクロマチンと称される転写不活性な領域を形成することが報告されている。即ち、クロマチンの構造蛋白質であるヒストンとそのァセチル化は、染色体遺伝子の全域に及ぶものであるにも係わらず、その機能は特定の遺伝子の発現に大きな影響を及ぼし、いわば核内情報伝達にかかわる厳密な制御に関与することが示唆されている。ヒストンのァセチル化を行う酵素は、ヒストンァセチルトランスフェラ一ゼであり、逆に脱ァセチル化を行う酵素は、ヒストンデァセチラ一ゼであリ、この両酵素はヒストンァセチル化レベルの動的な代謝回転を調整している。

ヒス卜ンデァセチラ一ゼの作用が亢進すると、細胞の適正な分化や形態正常化が阻害されるが、このヒストンデァセチラーゼの酵素活性を阻害すると、ヒストンからの脱ァセチル化が抑制される結果、ヒストン高ァセチル化が引き起こされ、分化や形態正常化に必要な遺伝子発現が誘導される。この現象は、ヒストンデァセチラ一ゼに対する酵素阻害物質である、図 1に示すトリコスタチン A ( tri chostat in A) や図 2に示すトラポキシン（trapoxin) 類縁体を用いた研究によりある程度確認されている。加えて、これら阻害物質を更に高い濃度で細胞に作用させると、細胞周期の阻害が引き起こされ、結果として増殖阻害が起こる。なお、トリコスタチン Aは、低濃度で非拮抗的な酵素阻害作用を示し、また、可逆的な阻害剤であるが、トラポキシン類縁体は、競争的な阻害作用を示すが、不可逆的な阻害剤である。また、ヒト細胞由来のヒストンデァセチラ一ゼの酵素活性サブュニットは、トラポキシンと類似する環状テトラべプチド化合物の K-trapを用いたァフィ二ティーカラムで精製されたとの報告がなされており、トラポキシン等に見られる環状テトラべプチド構造が当該酵素活性サブュニットと選択的な分子間結合を形成することの有力な査証が与えらている。

上述するとおリ、ヒストンデァセチラーゼに対する酵素阻害物質は、細胞分化又は形状正常化を起こす薬剤となるので、分化過程の一環としておこる MHC c lass— I分子発現に対しても促進作用を示す可能性があるものの、これまでのところ、それを確認させる報告はされていない。従って、自己組織細胞での MHC cl ass— I分子発現に対する促進作用を示すヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害物質の探索 '提案が待望されている。また、上の述べた通り、ヒストンデァセチラーゼ酵素阻害物質は高濃度において、細胞周期の阻害を引き起こし、結果として増殖阻害が起こる作用を示すので、 MHC c l ass _ I分子発現促進に伴う、造腫瘍性の抑制、並びに、免疫系による癌細胞の排除、加えて、細胞増殖の阻害作用も寄与した複合的な抗癌作用を示す、新規な MHC class— I分子発現促進に由来する抗癌剤の提案も待たれている。

従って、本発明は、自己組織細胞での MHC c lass— I分子発現に対する促進作用を示す新規なヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害物質を提供することを目的とする。

また、本発明は、該ヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害物質を有効成分として含有する医薬組成物を提供することも目的とする。発明の開示

本発明は、一般式（ I ) 、（1 ' ) 、（Γ ' ) 又は（で示される環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩を提供する。

(式中、 R_u、 R₁₂、 R₂₁及び R₂₂は、それぞれ独立して、水素、非芳香族環状ァルキル基若しくは置換基を有することもある芳香環が結合してもよい炭素数 1 〜 6の直鎖アルキル基、又は非芳香族環状アルキル基若しぐは置換基を有することもある芳香環が結合してもよい炭素数 3〜 6の分岐のアルキル基を表し、 R,、 R₂及び R₃は、それぞれ独立して、鎖上に炭素数 1〜 6の分岐鎖を有してもよい鎖長炭素数 1〜 5の直鎖アルキレン基を表し、また前記直鎖アルキレン基上の分岐鎖は該アルキレン鎖上に縮合環構造を形成してもよい。但し、一般式 ( I ' " ) においては、 R„、 R₁₂、 R₂₁及び R₂₂の少なくとも 1っはシクロへキシルメチル基である。）

また、本発明は、前記の環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するヒストンデァセチラーゼ阻害剤および MHC c l ass— I分子発現促進剤を提供する。

さらに、本発明は、前記の環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、抗癌剤として使用されるとよい。

本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願平 1 1 - 5 3 8 5 1号の明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、トリコスタチン A、トラポキシンの分子構造並びにヒストン脱ァセチル化阻害の作用を示す。図 2は、トラポキシン類縁体の分子構造を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明の環状テトラペプチド誘導体、その製造方法に関して、以下にょリ詳しく説明する。加えて、該環状テトラペプチド誘導体の示す薬理活性につき概説する。

本発明の環状テトラペプチド誘導体は、上述する通り、一般式（ I ) 〜 ( 1 ' " ) の化学式で示される 4種の互いに相関した構造の何れかにより示される。一般式（ I ) 〜（Γ ' ' ) の化学式において、 R„、 R₁₂、 R₂₁及び R₂₂は、それぞれ独立して、水素、非芳香族環状アルキル基若しくは置換基を有することもある芳香環が結合してもよい炭素数 1〜 6の直鎖アルキル基、又は非芳香族環状アルキル基若しくは置換基を有することもある芳香環が結合してもよい炭素数 3〜 6の分岐のアルキル基を表す。ここで、炭素数 1〜 6の直鎖アルキル基、炭素数 3〜 6の分岐のアルキル基としては、メチル基、ェチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、へキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、 tert- ブチル基、 sec-ペンチル基、 tert-ペンチル基、 1-ェチル -1-メチル-プロピル基、 1，レジメチルプロピル基等を挙げることができる。非芳香族環状アルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基等を挙げることができる。置換基を有することもある芳香環が結合する炭素数 1〜6の直鎖または分岐のアルキル基としては、ベンジル基、 4 -メトキシベンジル基、 3-インドリルメチル基、（N-メトキシ- 3-インドリル）メチル基、 4-ニトロベンジル基等を挙げることができる。

一般式（ I ) 〜（1 " ' ) の化学式において、、 R₂及び R₃は、それぞれ独立して、鎖上に炭素数 1〜6の分岐鎖を有してもよい鎖長炭素数 1〜 5の直鎖ァルキレン基を表す。ここで、炭素数 1〜6の分岐鎖としては、メチル基、ェチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、へキシル基を挙げることができる。前記分岐鎖は前記アルキレン鎖上に縮合環構造を形成してもよい。このような縮合環構造を形成するアルキレン鎖としては、 1，2-フエ二レン基、 1，3-フエ二レン基、 2， 3-ピリジレン基、 4,5-ピリジニレン基、 3, 4-イソキサゾ二レン、 2,4-ピリジニレン、 3,4-ピリジニレン、 2， 3-ピラジ二レン、 4， 5-ピリミジニレン、 3， 4-ピリダジニレン、 4，5-ピリダジニレン等を挙げることができる。

先ず、一般式（ I ) 〜（Γ'') の化学式で示される 4種の分子構造が、以下に述べる通り、構造上、互いに密な相関関係を有し、その意味において、高い構造上の類似性を有する化合物群であることを説明する。

本発明の一般式（ I ) で示される環状テトラペプチド誘導体は、一旦それを構成する 4つのアミノ酸を連結して、対応する鎖状テトラペプチド誘導体を調製し、次いで、この鎖状テトラペプチド誘導体を環化して得られるものである。即ち、次の一般式（II) ：

(式中、は、一般式（ I ) のと同じ基を表す）で示される α—アミノ酸、一般式（ΙΠ) ：

(式中、 R₂₁、 R₂₂は、それぞれ一般式（ I ) の R₂₁、 R₂₂と同じ基を表す）で示されるひ一アミノ酸、一般式（IV) ：

(式中、 R₃は、一般式（ I ) の R₃と同じ基を表す）で示される環状の α—アミノ酸、一般式（V) ：

(V)

で示される α—アミノ酸、これら一般式（II) 〜（V) で示される 4種の α— アミノ酸をべプチド結合により環状テトラペプチド骨格を形成したのち、前記一般式（V) の側鎖カルボキシル基をヒドロキサム酸に誘導したものである。本発明の一般式（ ) で示される環状テトラペプチド誘導体は、前記の一般式（ I ) で示される環状テトラペプチド誘導体に対して、 α炭素を含む環状側鎖を有する α-アミノ酸の位置を変更したものである。即ち、一般式（I) で表される環状テトラペプチド誘導体においては、一般式（Π) のアミノ酸の位置が α炭素を含む環状側鎖を有するアミノ酸であるが、一般式（ΙΓ) で示される環状テトラペプチド誘導体は、一般式（I) で一般式（III) に相当する位置が α炭素を含む環状側鎖を有する α-アミノ酸となっている。

また一般式 U'') で示される環状テトラペプチド誘導体は一般式（I) での一般式（II) 及び（III) に相当する位置がいずれも α炭素を含む環状側鎖を有する α-アミノ酸となったものである。

更に、一般式（1''') で示される誘導体は一般式（I) での一般式（Π) 及び (III) に相当する位置がいずれも α炭素を含む環状側鎖を有するアミノ酸ではない。

本発明の一般式（ I ) で示される環状ペプチドにおいて、それを構成する α 一アミノ酸の立体配置は、 L一体、 D—体の何れをも取り得るが、構造的な安定性の観点から、少なくとも一つのアミノ酸残基は、他のアミノ酸残基と異なる立体配置をとることが好ましい。具体的には、これら 4種の α—アミノ酸の立体配置を、少なくとも 1つ又は 2つを!)一体にとり、残りを L—体とすると良い。 α炭素を含む環状構造を有するひ-アミノ酸が分岐を有しない場合は光学的に不活性であるが、その場合は一般式（III) または（IV) のアミノ酸のいずれかが D-体であることが望ましい。

より好ましくは、前記 4種のアミノ酸のうち、（IV) で示されるものを、 D —体に選択し、残る 3種を L—体に選択する、あるいは、一般式（I I ) 及び ( IV) で示されるものを、 D—体に選択し、残る 2種を L—体に選択するとよい。なお、この環状ペプチドにおいて、本来の基質である N—ァセチル化リジンの側鎖に替わり、ヒストンデァセチラ一ゼの酵素活性点に対して近接する部位は、一般式（V) のアミノ酸の側鎖カルボキシル基から誘導されるヒドロキサム酸であるので、この一般式（V) のアミノ酸は、天然のリジンと同じく、 L—体を選択するのがー層好ましい。

環状テトラペプチドの残る部分は、前記の一般式（V) のアミノ酸に由来する側鎖ヒドロキサム酸構造をヒストンデァセチラ一ゼの酵素活性点に向け、保持する役割を持ち、この働きは、既知の不可逆的な阻害剤であるトラポキシン類縁体の環状ペプチド部の機能と実質的に同じものである。即ち、この環状テトラペプチドの残る部分によりて、ヒストンデァセチラーゼの酵素活性点近傍に分子間結合し、前記の一般式（V) のアミノ酸に由来する側鎖ヒドロキサム酸構造を酵素活性点上に固定する役割を持つ。

従って、残る 3種の α—アミノ酸は、その側鎖を利用してヒストンデァセチラ一ゼ蛋白質表面に結合できるものであれば、如何なるものでもよいが、一般式（IV) の環状アミノ酸は、前記の一般式（V) のアミノ酸に由来する側鎖ヒドロキサム酸構造の向く方向を固定する際、主に機能する。一般式（IV) の環状アミノ酸の環構造は、図 2に示すトラポキシン Βにおける天然の!)一プロリンと同じ 5員環、あるいは、図 2に示すトラポキシン Αにおける天然の D—ピぺリジン一 2—カルボン酸と同じ 6員環の何れかが好ましい。従って、この環を構成する二価の基 R₃は、プロリンにおけるトリメチレン基、ピぺリジン一 2— カルボン酸におけるテトラメチレン基、あるいは、これら鎖長 3又は 4の直鎖炭化水素基に対応し、炭素一炭素二重結合を有する不飽和な直鎖炭化水素基が好ましい。あるいは、これら二価の炭化水素基において、ァミノ窒素原子並びにカルボン酸の位の炭素原子と結合を形成している、当該二価の基における遊離原子価の存在する炭素原子以外の炭素原子を、酸素、ィォゥ、又は窒素の何れかのへテロ原子で置き換えたものでもよい。なかでも、 R₃には、トリメチレン基、テトラメチレン基がより好ましレ、。

残る二つの α—アミノ酸は、天然に見出される α—アミノ酸と同じ程度の嵩を有する側鎖を持つものが一般には、好ましい。即ち、図 2に示すトラポキシン類縁体におけるチロシンの Ρ—ヒドロキシベンジル基、フエ二ルァラニンのベンジル基、あるいはトリブトファンの 3—インドリルメチル基程度の嵩を上限とするものである。特に好ましくは、ロイシン、イソロイシン、ノル口イシン、シクロへキシルァラニン、及び種々の環サイズを有する環状アミノカルボン酸が挙げられる。

本発明の一般式（ 1 ') の環状テトラペプチド誘導体は、一般式（ I ) の環状テトラべプチド誘導体における α炭素を含む環状構造を有するァミノ酸の位置を変更したものであり、一般式（ I ) の環状テトラペプチド誘導体において、好ましい一般式（Π)〜（V) のアミノ酸の選択は、一般式（ Γ) の環状テトラペプチド誘導体においても、同様に好ましいものである。また、一般式（Π)〜（V) のアミノ酸の立体配置に関しても、一般式（IV)の環状 α—アミノ酸並びに一般式（II)の α—アミノ酸を D—体に選択し、残りの 2種の α—ァミノ酸を L—体とする、あるいは、その鏡像体となるように選択するとより好ましい。

また、本発明の一般式（ ') の環状テトラペプチド誘導体は、一般式 ( I ) の環状テトラペプチド誘導体における一般式（ΙΠ) に示す α—ァミノ酸も α炭素を含む環状構造を有する αアミノ酸に変更したものである。従って、一般式（II)〜（IV)のアミノ酸の選択は、一般式（ I ) の環状テトラペプチド誘導体において好ましい一般式（II)のアミノ酸の選択は、一般式（ Γ') の環状テトラべプチド誘導体においても、同様に好ましいものである。

また、本発明の一般式（ Γ'') の環状テトラペプチド誘導体は、一般式 ( I ) の環状テトラペプチド誘導体における一般式（II) に示す α—アミノ酸を α炭素を含む環状構造を有さないアミノ酸に置き換えたものに相当する。従つて、一般式（ I ) の環状テトラペプチド誘導体において、好ましい一般式 ( I I I )のアミノ酸の選択は、一般式（ ' ) の環状テトラペプチド誘導体においても、同様に好ましいものである。

本発明の一般式（ I ) の環状テトラペプチド誘導体は、上述するとおリ、一般式（I I )〜（V)に示す 4種の α—アミノ酸を出発原料として、ぺプチド鎖の形成 ·環化の工程により製造することができる。その工程の一例に関して、以下に概説する。

(製造方法）

本発明の環状テトラペプチド誘導体は、一旦一般式（I I )〜（V)に示す 4種の α—アミノ酸がペプチド結合した鎖状のテトラペプチド中間体を調製し、しかる後に環状テトラペプチドとし、最終的に一般式（V) に示す α—アミノ酸の側鎖カルボキシル基をヒドロキサム酸構造に誘導することで製造することができる。以下のこの製造工程を概説する。なお、鎖状のテトラペプチド中間体は、目的とする環状テトラペプチド誘導体の何れのペプチド結合で開裂した構造を用いることができるが、以下の説明では、一般式（IV) で表される環状 α—ァミノ酸を C末に、一般式（V)で表される α—アミノ酸を Ν末とする鎖状のテトラペプチド中間体を経る合成経路を例にとり説明する。

(工程 1 ) 鎖状のジ、トリ、及びテトラペプチドの合成

まず、汎用のペプチド合成法に従い、一般式（I I I )及び一般式（I V)のァミノ酸を結合し、更に一般式（Π )のアミノ酸を結合し、最後に、側鎖カルボキシル基をべンジルエステル化して保護した一般式（V ) のアミノ酸を結合して鎖状テトラペプチドを形成する。

なお、この過程において、原料アミノ酸のァミノ保護基には Boc-基（te rt- ブトキシカルボニル基）または Z-基（ベンジルォキシカルボニル基）、また力ルボキシル基保護のためには tert-ブチルエステルを用い、 DCC/HOBt法により縮合する。また、 Z-基は酢酸中 Pd-C触媒によって接触還元的に除去し、酢酸を留去した後、フリーアミンとして重曹水を用いて酢酸ェチル中に抽出する。抽出液から回収した生成物の油状物を真空乾燥後の次の縮合に用いる。上記全保護鎖状テトラべプチドはシリ力ゲルカラムを用いるフラッシュクロマトグラフィ一によって精製する。

(工程 2) 高々度希釈法による環状ペプチドの合成

トリフルォロ酢酸を用いて、上記全保護鎖状テトラべプチドの Boc-基及び tert-ブチルエステルの除去（脱保護）を行う。生成物は、反応液からトリフルォロ酢酸を留去後、エーテル及び石油エーテルで固化し、真空乾燥する。一般式（VIII) で示されるペプチド使用予定量の 1 0量を DMFに溶解し 0. ImM の濃度になるように設定する。 DMF溶液に氷冷下、第三級ァミン、例えば、ジイソプロピルェチルアミン及び HATU (0- (7-Azabenzotriazol- 1 -yl)-l, 1， 3， 3- tetramethyluronium hexaf luorophosphate) をカロえ、室温で 30分間撹拌する。引き続き、前記の DMF溶液に、一般式（VIII) で示されるペプチド使用予定量の 1/10量とジイソプロピルェチルアミン及び HATUを追加し、室温で 30分間撹拌する。前記の操作を計 10回繰り返し環化反応を行う。反応終了後、反応生成物（環状ペプチド）を酢酸ェチル中に抽出し、シリカゲルカラムを用いるフラッシュクロマトグラフィ一によって精製する。

(工程 3) 側鎖ヒドロキサム酸構造の導入

上記環状べプチドの側鎖べンジルエステルは、メタノール中 Pd- C触媒によつて接触還元的に除去し、メタノールを留去した後、真空乾燥し、カルボン酸として油状物を得る。

前記の脱保護により得られた側鎖カルボン酸の環状べプチド化合物及び HOBt を DMFに溶解し、氷冷下ヒドロキシルァミン塩酸塩、トリェチルァミン、次いで B0P試薬を添加し 1時間撹拌した。反応終了後、 DMFを留去し、水でデカンテ —シヨンを行った後、凍結乾燥により、最終生成物の白色粉末を得る。この白色粉末を少量のメタノールに溶解し、 HPLCでセミ分取用カラムを用いて精製し、凍結乾燥により一般式（ I ) で示される目的物を得る。

本発明の一般式（1') 、（1") 、（1'") で示される環状テトラペプチド誘導体に関しても、上述する工程 1に準じて、鎖状のテトラペプチドの合成を行い、次いで、工程 2の条件を利用して環状テトラペプチドとし、さらに側鎖力ルボキシル基を工程 3に準じて、側鎖ヒドロキサム酸構造に変換することで調製することができる。

上記の合成法に加え、上記化合物は、実施例において、具体的に示す固相合成法を利用した方法により合成を行うことができる。

本発明の環状テトラべプチド誘導体の薬学的に許容される塩とは、例えば、塩基性を示す窒素原子を含む誘導体では、塩酸塩などの薬学的に許容される無機酸との塩、酢酸塩などの薬学的に許容される有機酸との塩を意味する。

本発明の MHC cl ass— I分子発現促進剤は、上で説明した側鎖末端にヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）を持つ環状テトラペプチド誘導体を有効成分とするものであり、試験例に示すとおり、優れた発現促進活性を有する。その MHC c l ass— I分子発現促進作用は、ヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害活性に付随するものであるが、ヒドロキサム酸構造を持つトリコスタチン Aと同じく、この阻害は可逆的なものである考えられる。また、高い濃度投与で顕著となるヒストンデァセチラーゼ酵素阻害自体に起因する細胞増殖阻害、細胞周期の阻害作用のみならず、促進された MHC class— I分子発現に起因する、細胞傷害性 T細胞の関与する癌細胞や癌化ウィルス感染細胞の排除作用の相補的な効果で、高い治療効果を発揮する利点を持つ。加えて、不可逆的な阻害剤であるトラポキシン類縁体と比較するとき、正常組織細胞に対する副作用等、生体に対する好ましからざる影響の残留が少なく、治療効果と対比するとき、相対的な副作用が大幅に低減された薬剤としての応用が期待される。更に、本発明において提示した芳香環を含まない α -アミノ酸を組み合わせてヒドロキサム酸側鎖を有する環状テトラべプチドを構成することにより、チトクローム Ρ-450等の代謝酵素によるアタックを受けにくい、生体内での安定性に優れた化合物となることが期待される。

本発明の医薬組成物は、前記の MHC c l ass— I分子発現促進作用を利用して治療効果を達成するものであるが、有効成分となる環状テトラペプチド誘導体の用量は、その治療目的、症状の程度、投与対象者の性別、年齢、体重等に応じて適宜決定されるものである。投与対象者が成人男子である場合、 1日当たりの用量を 0. 1〜 5 Om gZk gの範囲、好ましくは、 0. 5〜 1 0mg/k gの範囲内に選ぶのが一般的であり、数回に分けて投与すると好ましい。この医薬組成物は、有効成分となる環状テトラべプチド誘導体にこの種のぺプチド様化合物製剤に汎用される添加剤を加えて、投与経路に適する剤形とすることができる。細胞透過性に富むものであるので、多種の投与経路が利用することが可能であるが、ペプチドホルモンなどの投与に多様される投与形態、投与経路を取るのが好ましい。実施例

本発明の環状テトラペプチド誘導体とその製造方法、並びに、該環状テトラペプチド誘導体の有する優れた生理活性、即ち、 MHC class— I分子発現促進作用及びヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害活性に優れることを具体例により説明する。

なお、非天然型のアミノ酸残基の略号は、次のアミノ酸の残基を意味する。 Aib:2-アミノイソ酪酸、 Asu(NH0H):2-アミノ -8 -ヒドロキサミドオクタン二酸、 Acc5:卜アミノシクロペンタン-卜カルボン酸、 Acc6: 卜アミノシクロへキサン -卜カルボン酸、 Acc7: 卜アミノシクロヘプタン- 1-カルボン酸、 Acc8: 1-アミノシクロオクタン-卜カルボン酸、 lAin:卜アミノィンダン- 1-カルボン酸、 2Ain: 2-ァミノインダン- 2-カルボン酸、 Pip:ピペコリン酸、 Cha:アミノシク口へキシルァラニン

(参考例 1 ) CHAP- 15; cyclo ( - L- Asu(NHOH)- Aib- L- Phe-D-Pro- ；)の合成 CHAP15

工程 1 Z- L- Phe- D- Pro-OtBu

Z-L-Phe-OH ( 2.25 g, 7.5 mmol ), H-D-Pro-OtBu ( 0.862 g, 5.0 mmol ) を DMF ( 10 mL ) に溶解し、氷冷下 HOBt H₂0 ( 766 mg, 5.0 mmol )， BOP ( 3.3 g, 7.5 mmol ), トリェチルァミン（ 1.75 mL， 12.5 mmol )を加え、 2時間撹拌した。反応液を濃縮後、酢酸ェチルに溶解し、 10%クェン酸、 4% NaHC0₃および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄ で乾燥後、濃縮、油状物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ CHC1₃ I MeOH=99 I 1)で精製し、標記化合物 1.403 g ( 62% )を油状物質として得た。

Rf= 0.83 ( CHC1₃ I Me0H= 9 / 1) 工程 2 H-L- Phe-D- Pro- OtBu

Z-L- Phe-D- Pro- OtBu (1.403 g， 3.1 mmol )を Pd- Cを用いて酢酸中、接触還元により Z基を除去した。 10時間反応を行い、 Pd-Cを濾過し酢酸を濃縮後、 4% NaHC0₃で中和し酢酸ェチルに抽出した。抽出液を Na₂C0₃で乾燥後、濃縮、標記化合物 0.853 g, ( 86% )を得た。

Rf= 0.50 ( CHC1₃ I MeOH= 9 / 1) 工程 3 Z-Aib- L-Phe- D-Pro- OtBu

H-L-Phe-D-Pro-OtBu ( 0.853 g、 2.68 ramol )と Z- Aib- OH ( 954 mg、 4.02 mmol )を上記工程 1の方法に準じ縮合した。油状物をフラッシュシリカゲルク口マトグラフィ一（ CHC1₃ I Me0H= 99 / 1)で精製し、標記化合物 1.23 g ( 85% )を得た。

工程 4 H-Aib-L-Phe-D-Pro-0tBu

Z- Aib- L- Phe- D-Pro-0tBu ( 1.23 g， 2.28 mmol )を Pd-Cを用いて酢酸中、接触還元により Z基を除去した。 10時間反応を行い、 Pd-Cを濾過し酢酸を濃縮後、 4%NaHC0₃で中和し酢酸ェチルに抽出した。抽出液を Na₂C0₃で乾燥後、濃縮、標記化合物 0.726 g、 1.80 mmol ( 79% )を得た。

工程 5 Boc-L-Asu(0Bzl)-Aib-L-Phe-D-Pro-0tBu

H-Aib-L-Phe-D-Pro-OtBu ( 0.726 g, 1.80 mmol )と Boc- L-Asu(0Bzl)_0H (1.02 g, 2.70 mmol ) を上記工程 1の方法により縮合した。油状物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ CHC1₃ I Me0H= 49 / 1)で精製し、標記化合物 993 mg (72%)を得た。

工程 6 H- L- Asu(OBzl)- Aib- L-Phe-D- Pro- OH. TFA

Boc-L-Asu(0Bzl)-Aib-L-Phe-D-Pro-0tBu ( 993 mg、 1.30 mmol ) にトリフルォロ酢酸（3 mL) を氷冷下で加え、 Boc基および第三ブチルエステルの除去を 2時間室温で行った。トリフルォロ酢酸留去後、エーテルおよび石油ェ一テル（1:5)で固化し、真空乾燥した。標記化合物 737mg， (78%) を得た。

HPLC: Rt=8.66 min (column: Wako pak C4， 4.6x150 mm, 30-100% linear gradient

CH₃CN I 0.1% TFA over 30min, flow rate 1.0 mL / min ) 工程 7 cyclo (-L-Asu ( OBz 1 ) -A i b-L-Phe-D-P ro- )

H-L- Asu(0Bzl)-Aib- L- Phe-D- Pro - OH TFA ( 30 tng, 0.042 mmol )を DMF ( 400 mL) に溶解させ， 0.1 mMの濃度になるよう設定した。 DMF溶液に 10% DIEA/DMF ( 0.3 mL, 0.17匪 ol )および HATU (25 mg, 0.066 mmol ) を加え、室温で 30分間撹拌した。この操作を計回 10繰り返し環化反応を行った。反応終了後反応液を濃縮し、酢酸ェチルに溶解させ、 10%クェン酸、 4%NaHC0₃および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄ で乾燥後、濃縮、油状物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ CHC1₃ /MeOH=99 / 1)で精製し、標記化合物 151 mg (61%) を得た。

Rf=0.78 ( CHC1₃ I MeOH=9 I 1)

HPLC: Rt=18.15 min (column: MS GEL C18, 4.6x150 mm 30-100% linear gradient

CH₃CN I 0.1% TFA over 30 rain, flow rate 1.0 mL / min ) 工程 8 cyclo (-L-Asu- Aib- L- Phe-D-Pro - )

cyclo ( -L-Asu (OBz 1 ) -Ai b-L-Phe-D-Pro- ) ( 151 mg, 0.256 mmol )をメタノ一ル 5 mLに溶解させ、 Pd-Cを用いて接触還元によリベンジルエステル基を除去した。 5時間反応を行い、 Pd-Cを濾過しメタノールを濃縮し，標記化合物 124 mg (97%) を得た。

HPLC： Rt=6.32 min (column: Wako pak C4, 4.6x150 腿， 30-100% linear gradient

CH₃CN I 0, 1% TFA over 30min， flow rate 1.0 mL / min ) 工程 9 cyclo (- L- Asu(NHOH)- Aib- L- Phe- D- Pro- )

cyclo ( - L-Asu- Aib-L - Phe - D-Pro - ) ( 124 mg, 0.248匪 ol ) を DMF (3 mL ) に溶解し氷冷下、ヒドロキシルァミン塩酸塩（ 86 mg, 1.24腿 ol ), HOBt H₂0 ( 57 mg, 0.372匪 ol )， BOP (165 mg, 0.372匪 ol )を加え、トリェチルァミン（ 0.24 mL， 1.74 nunol )を添加した。 2時間撹拌後、反応液を濃縮し lmLとしたのち、 LH- 20 (2x85cm)カラム（溶出液 DMF) により精製した。凍結乾燥により標記化合物 95 mg (74%) を得た。

HPLC: Rt=16.32 min (column: Wako pak C18, 4.6x150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1%TFA over 30min, .flow rate 1.0 mL / min )

FAB-MS: m/z=516 ( M+H )+

(実施例 1 ) CHAP -54; cyclo ( - L- Asu(NHOH)- Acc5- L- Phe- D- Pro- )の合成

上記 CHAP- 15の合成法に準じ合成した。

HPLC: Rt=17.04 min ( column: MS GEL C18， 4.6x150 mm, 0-100% linear gradient CH₃CN/0.1%TFA over 30min, . flow rate 1.0 mL / min ) FAB-MS: m/z=542 ( M+H )+

(実施例 2) CHAP -55; cyclo ( -L- Asu(NHOH)- Acc6-L- Phe- D- Pro - ) の合成

上記 CHAP- 15の合成法に準じ合成した。

HPLC: Rt-18.25 min ( column: MS GEL C18， 4.6x150 mm, 0-100% linear gradient CH₃CN/0.1%TFA over 30min, . flow rate 1.0 mL / rain )

FAB-MS: m/z=556 ( M+H )+

(実施例 3) CHAP -71; cyclo ( -L-Asu(NH0H)-Acc7-L-Phe-D-Pro- ) の合成

上記 CHAP- 15の合成法に準じ合成した。

HPLC: Rt=19.24 min ( column: Wako pak C18， 4.6x150 mm, 0-100% linear gradient CH₃CN / 0.1%TFA over 30 min, flow rate 1.0 mL I min ) FAB-MS： ra/z=570 ( M+H )+

(実施例 4) CHAP -76; cyclo ( -L-Asu(NH0H)-Acc8-L-Phe-D-Pro- ) の合成

上記 CHAP-15の合成法に準じ合成した。

HPLC: Rt=18.72 min ( column: Wako pak C18, 4.6x150 mm, 0-100% linear gradient CH₃CN / 0.1%TFA over 30 min, flow rate 1.0 mL / min ) FAB-MS: m/z=584 ( M+H )+

(実施例 5) CHAP -81; cyclo ( -L-Asu(NH0H)-2Ain-L-Phe-D-Pro- ) の合成

上記 CHAP- 15の合成法に準じ合成した。

HPLC: Rt-18.20 min ( column: Wako pak C18, 4.6x150 mm, 0-100% linear gradient CH₃CN / 0.1%TFA over 30 min, flow rate 1.0 mL / rain )

FAB-MS： m/z-590 ( M+H )+

(実施例 6) CHAP -82; cyclo ( -L-Asu(NHOH)-lAin(f )-L-Phe-D-Pro- )の合成

又は上記 CHAP- の合成法に準じ合成した。（lAin(f)は、実施例 7の lAin(s)と同様に、 2-ァミノインダンカルボン酸で、 HPLCで前者は速く、後者は遅く溶出されるもので、立体構造に差異があることは判明しているが、立体の構造は特定できていない）

HPLC: Rt=16.26 min ( column: Wako pak C18, 4.6x150 mm, 0-100% linear gradient CH₃CN / 0.1%TFA over 30 min, flow rate 1.0 mL / min )

FAB-MS： m/z=590 ( M+H )+

(実施例 7) CHAP -83; cyclo ( -L - Asu(NHOH)- lAin(s)- L- Phe- D-Pro - )の合成

又は

上記 CHAP-15の合成法に準じ合成した。

HPLC: Rt=17.13 rain ( column: Wako pak C18， 4.6x150 ram, 0-100% linear gradient CH₃CN / 0.1%TFA over 30 min, flow rate 1.0 mL / min ) FAB-MS: m/z=590 ( M+H )+

(実施例 8) CHAP - 91; cyclo ( -L-Asu(NHOH)- 2Ain- L- Phe- D-Pip- )の合成

上記 CHAP-15の合成法に準じ合成した。

HPLC: Rt=19.07 min ( column: Wako pak C18， 4.6x150 mm, 0-100% linear gradient CH₃CN / 0.1%TFA over 30 min, flow rate 1.0 mL / min ) FAB-MS: m/z=604 ( M+H )+

(実施例 9) CHAP -90; cyclo ( -L-Asu(NHOH)- Acc8- L-Phe- D- Pip-)の合成

上記 CHAP- 15の合成法に準じ合成した ₍ HPLC: Rt=20.08 min ( column: Wako pak C18， 4.6x150 mm, 0-100% linear gradient CH₃CN / 0.1%TFA over 30 min, flow rate 1.0 mL / min )

FAB-MS: m/z=598 ( M+H )+

(実施例 1 O) CHAP-86； eye 1 o ( -L-Asu (NH0H) -D-Cha-L- 11 e-D-P i p-) .

CHAP-87;cyclo(-L-Asu(NH0H)-D-Cha - L- 1 le-L- Pip-)の合成

CHAP86 CHAP87 工程 1 Boc-L- Ile-D，L- Pip-OBzl

Boc-L-Ile-0H 1/2 H₂0 (3.92 g, 16.8 腿 ol)、 H-D, L-Pip-OBzl HC1 (3.57 g, 12 mmol)および HATU (7.75 g， 18 mmol)を DMF (15 raL)に溶解させ、氷冷下 Et₃N (4.76 mL, 30匪 ol)を加え、終夜室温で撹拌した。反応液を濃縮後、酢酸ェチル（120 mL)で抽出し、 10%クェン酸水溶液、 4%NaHC0₃水溶液、飽和食塩水でそれぞれ 2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、酢酸ェチルを留去した。真空乾燥後、フラッシュクロマトグラフィー（3.5 X 20 cm、展開溶媒 CHC1₃ / MeOH = 99 / 1)によって精製し Boc- L-I le- D，い Pip- OBzl (5.90 g, 13.8 mmol, 収率 97%)油状物を得た。

Rf = 0.50 (CHCI3 I MeOH = 49 I 1) 工程 2 Boc-D-Cha-L-Ile-D, L-Pip-OBzl

Boc-L-Ile-D,L-Pip-OBzl (432 mg, l mmol)を TFA (3 mいに溶解し、氷冷下 30分放置した。反応液を留去後、減圧下乾燥し H- L- lie- D，L-Pip- OBzl TFA (638 mg, 収率 144%)を得た。これを、 DMF (5 mL)に溶解させ、 Boc- D- Cha-OH (326 mg, 1.2 mmol)を加え、続いて氷冷下 HOBt H₂0 (230 mg, 1.5 mmol, 1.5 当量）， Et₃N (0.52 mL, 3.7 mmol, 3.7 当量）， BOP (663 mg, 1.5mmol, 1.5当量）を加え、室温で 15時間撹拌した。反応液を濃縮した後、酢酸ェチル（100 mL)で抽出し、 10%クェン酸水溶液、 4%NaHC0₃水溶液、飽和食塩水でそれぞれ 2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、酢酸ェチルを留去した。真空乾燥後、フラッシュクロマトグラフィー（2.4 X 14 cm、展開溶媒 CHC1₃ / MeOH = 99 / 1)によって精製し Boc-D-Cha-L- lie- D，L-Pip-0Bzl (565 mg, 0.96 mmol，収率 96%)フォーム状物を得た。

Rf = 0.27 (CHCI3 I MeOH = 49 I 1) 工程 3 Boc-D-Cha-L- 11 e-D, L- P i p-0H

Boc-D-Cha-L-I le-D, L-Pip-OBzl (565 mg, 0.96 mmol)を MeOH (10 mL)に溶解し、 Pd- C触媒（250 mg)を加え、水素気流下で 15時間撹拌しベンジルエステル基を除去した。 Pd-C触媒を濾過した後、 MeOHを留去し真空乾燥して、 Boc-D- Cha- L-Ile- D，L- Pip-0H (459 mg, 0.93匪 ol，収率 97%)フォーム状物を得た。工程 4 Boc-D-Cha-L-I le-D, L-Pip-L-Asu(0Bzl)-0Tmse

Boc-L-Asu(0Bzl)-0Tmse (535 mg, 1.1 mmol, 1.2当量）に氷冷下 TFA (3 mL) を加え、 30分間室温で放置し Boc基の除去をおこなった。 TFA留去後、減圧下乾燥し H- L- Asu(0Bzl)-0Tmse TFA 油状物を得た。これを DMF (5 mL)に溶解させ、 Boc-D-Cha-L-I le-D, L-Pip-0H (459 mg, 0.93 mmol)を加え、続いて氷冷下 HOBt H₂0 (213 mg, 1.4 mmol, 1.5 当量）， BOP (616 mg, 1.4 mraol, 1.5 当量）， Et₃N (0.48 mL, 3.5 mmol, 3.7 当量）を加え、室温で 15時間撹拌した。反応液を濃縮した後、酢酸ェチル（100 mL)で抽出し、 10%クェン酸水溶液、 4% NaHC0₃水溶液、飽和食塩水でそれぞれ 2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、酢酸ェチルを留去した。真空乾燥後、フラッシュクロマトグラフィー（ 2.4 x 20 cm、展開溶媒 CHC1₃ / MeOH = 99 / 1)によって精製し Boc- D- Cha- L- 1 le- D，L- Pip-L- Asu(OBzl)- OTmse (813 mg, 0.93 mmol, 収率 100%)油状物を得た。 Rf = 0.20 (CHC1₃ I MeOH = 49 / 1) 工程 5 H-D-Cha-L-I le-D, L-Pip-L-Asu(0Bzl)-0H TFA

Boc-D- Cha- L- lie- D，L- Pip- L-Asu(0Bzl)- OTmse (813 mg, 0.95 匪 ol)を DMF (2 m に溶解し、 1M tetrabutylamraonium fluoride THF溶液（4 mL, 4 mmol, 4当量）を加え室温で 30分放置した。反応液を濃縮した後、 10%クェン酸水溶液を加えて、酸性にした後、酢酸ェチル（100 mL)で抽出した。酢酸ェチル層を飽和食塩水で 2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸ェチルを留去した。真空乾燥後、 Boc-D-Cha-L-I le-D, L-Pip-L-Asu(0Bzl)-0H (696 mg, 0.91 mmol, 収率 97%)を得た。 Boc-D-Cha-L-1 le-D, L-Pip-L-Asu(0Bzl)-0H (696 mg, 0.91 mmol)に氷冷下 TFA (5 mL)を加え、 30分間室温で放置し Boc基の除去をおこなつた。 TFA留去後、エーテル-石油エーテル（1 ： 10)を加え固化させ、濾取、減圧下乾燥し、 H-D-Cha-L-Ile-D,L-Pip-L-Asu(0Bzl)-0H TFA (752 mg, 0.91 mmol, 収率 100%)を得た。工程 6 eye 10 (- L-Asu (OBz 1 ) -D-Cha-L- 1 le-D, L-P i p-)

H-D-Cha-L-I le-D, L-Pip-L-Asu(0Bzl )-0H TFA (752 rag, 0.91 mmol)を DMF (5 mL)に溶解し、その内 1 mLを DMF (455mL， 0.4 mM)に入れ、 HATU (104 mg, 1.5 当量）， DIEA(0.63 mL, 4当量）の DMF (10 mL)溶液 1 mL を加え、室温で 1時間撹拌した。同様の操作を 5回繰り返し、環化反応を行った。反応液を濃縮した後、酢酸ェチル（100 mL)で抽出し、 10%クェン酸水溶液、 4%NaHC0₃水溶液、飽和食塩水でそれぞれ 2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、酢酸ェチルを留去した。真空乾燥後、フラッシュクロマトグラフィー（2.4 x 40 cm、展開溶媒 CHC1₃ I MeOH = 99 I 1)によって分離精製し cyclo(- L- Asu(OBzl)- D- Cha - L-Ile-D-Pip-) (90 rag, 0.14 mmol, 収率 18%)、 cyclo(-L-Asu(OBzl)-D-Cha- L- lie- D，L- Pip- ) (200 mg, 0.31 mmol.収率 40%)を得た。

cyclo(-L-Asu(OBzl)-D-Cha-L-Ile-D-Pip-)

Rf = 0.45 (CHC1₃ I MeOH = 9 I 1)

HPLC： Rt=19.40 min (column： wakosil 5C4, 4.5 x 150 mm, 37-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min)

eye 10 (-L- Asu ( OBz 1 ) -D-Cha-L- 11 e-L-P ip-)

Rf = 0.45 (CHCI3 I MeOH = 9 / 1)

HPLC： Rt=16.80 min (column： wakosil 5C4, 4.5 x 150 mm, 37-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min) 工程 7 eye 10 (-L-Asu (OH) - D- Cha- L- 11 e-D-P ip-),

cyclo(- L-Asu(OH)- D- Cha-L-I le-D， L-Pip -)

eye 10 (-L-Asu ( OBz 1 ) -D-Cha-L- 11 e-D-P i p-) (90 mg, 0.14 mmol), cyclo(-L- Asu(0Bzl)-D-Cha-L-I le-D, L-Pip-) (200 mg, 0.31 mmol)をそれぞれ MeOH (5 mL)、 MeOH-DMF (10： 1)に溶解し、 Pd-C触媒（250 rag)を加え、水素気流下で 15時間撹拌しベンジルエステル基を除去した。 Pd- C触媒を濾過した後、酢酸を留去し真空乾燥して、 cyclo(- L- Asu(0H)-D- Cha- L- lie- D- Pip -) (76 mg, 0.14 mmol，収率 85%)、 cyclo(-L-Asu(0H)-D-Cha-L-I le-D, L-Pip-) (170 mg, 0.31 匪 ol,収率 99%)を得た。

eye 1 o(-L-Asu( 0H)-D-Cha-L- 11 e-D-P i p- )

HPLC： Rt=12.64 min (column： wakosil 5C4, 4.5 x 150 mm, 37-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min)

cyclo(-L-Asu(0H)-D- Cha- L- lie- L-Pip-)

HPLC： Rt=9.48 min (column： wakosil 5C4, 4.5 x 150 mm, 37-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min) 工程 8 eye 1 o (- L-Asu (NHOH)-D-Cha-L- 11 e-D-P i p -），

eye 1 o (-L-Asu (NHOH) -D-Cha-L- 11 e-D, L - Pip- )

eye 1 o (-L-Asu (OH) -D-Cha-L- 11 e-D-P i p-) (76 mg, 0.14 mmol, )、 cyclo(-L- Asu(OH)-D-Cha-L-I le-D, L-Pip-) (170 mg, 0.31 mmol, )を、それぞれ DMF (3 mL)に溶解し、 HOBt H₂0 (LDLD体： 32 mg, 0.21 mmol, 1.5当量， LDLD, LDLL mixture体： 71 mg, 0.47 mmol, 1.5 当量）、 NH₂0H HC1 (LDLD体： 49 mg, 0.70 mmol, 5当量， LDLD, LDLL mixture体： 108 mg, 1.6 mmol, 5 当量）をカロえ、氷冷下 BOP (LDLD体： 93 mg, 0.21 mmol, 1.5当量， LDLD, LDLL mixture体： 206 mg, 0.47 mmol, 1.5当量）， Et₃N (LDLD体： 0.12 mL， 0.84 mmol, 6当量，

LDLD, LDLL mixture体： 0.20 mL， 1.86 mmol, 6 当量）を加え、 4時間撹拌した。反応終了後、生成した Et₃N HC1を濾過し DMFを留去した後、 LDLD体は Sephadex LH-20 (2.4 X 85 cm, DMF)ゲル濾過カラムにて精製、凍結乾燥し cyclo (- L- Asu(NHOH)-D-Cha-L-I le-D-Pip-) (20 mg, 0· 035 mraol)を得た。 LDLD, LDLL mixture体は、少量の MeOHに溶かし HPLC(column ： YMC-Pack C8 10 x 250 mm, 37% CH₃CN/ 0.1% TFA)を用いて精製し、凍結乾燥し cyclo(- L- Asu(NHOH)- D- Cha-L-I le-D-Pip-) (27 mg, 0.047 mmol, 純度 100%), cyclo(-L-Asu(NH0H)-D- Cha-L-Ile-L-Pip-)(51 mg, 0.090 mmol，純度 93%)を得た。

cyclo (-L-Asu(NHOH)-D-Cha-L-I le-D-Pip-)

HPLC： Rt=21.34 min (column： wakos i 1 II 5C18, 4.5 x 150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min)

eye 1 o(-L-Asu(NH0H)-D-Cha-L- 11 e-L-P i p-)

HPLC： Rt=18.79 min (column： wakos il II 5C18, 4.5 x 150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min)

FAB-MS (2,2' -dithiodiethanol) ： m/z=564 [M+H] + (実施例 1 1 ) CHAP- 84;cyclo(- L- Asu(NHOH)- D- Cha - L- Leu-L- Pip -)、 CHAP - 85； eye 1 o ( - L - Asu (NHOH) -D-Cha -L-Leu-D-P i p -）の合成

CHAP84 CHAP85

標記環状テトラペプチドの合成は、実施例 1 0 (CHAP86，CHAP87)に準じて行つた。ただし、 Boc-L- Leu- D，L- Pip- OBzlの合成については、 BOP試薬 (1.5 当量）、 HOBt H₂0 (1.5当量）を用いた。

eye 10 (-L-Asu (NHOH) -D-Cha-L-Leu-D-P i p-)

HPLC： Rt=20.89 min (column： wakosil II 5C18, 4.5 x 150 mm, 10 -100% lineargradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min)

eye 1 o (-L-Asu (NHOH) - D- Cha- L- Leu-L- P i p-)

HPLC： Rt=18.33 min (column： wakosil II 5C18, 4.5 x 150 mm, 10 -100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min)

FAB-MS (2，2，- dithiodiethanol) : m/z=564 [M+H] +

(実施例 1 2) CHAP-78； eye 1 o (-L-Asu (NHOH) -D-Cha-L-Cha-L-P i p-) , CHAP- 79;cyclo(- L- Asu(NHOH)- D- Cha-L-Cha-D-Pip- )の合成

CHAP78 CHAP79

標記環状テトラペプチドの合成は、実施例 1 0 (CHAP86,CHAP87)に準じて行つた。ただし、 Boc-L- Cha- D，L- Pip- OBzlの合成については、 DCC (1.3当量）、 HOBt H₂0 (1.3当量）を用いた。

cyclo(-L-Asu(NHOH)-D-Cha-L-Cha -D-Pip-)

HPLC： Rt-26.20 rain (column： wakosil II 5C18, 4.5 x 150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 rain)

eye 1 o (-L- Asu (NHOH) -D-Cha-L-Cha - L-P i p -）

HPLC： Rt=23.36 min (column： wakosil II 5C18, 4.5 x 150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min)

FAB-MS (2,2'-dithiodiethanol) ： m/z=604 [M+H] +

(試験例 1 ) MHC class— I分子発現促進活性

本発明の環状テトラペプチド誘導体の有する MHC class— I分子発現促進作用を以下の試験により検証した。即ち、本試験において、癌細胞を用いて、本発明の環状テトラペプチド誘導体を作用させることで、 MHC class— I分子発現が促進されることを検証した。試験法

用いた癌細胞は、米国国立癌研究所より分譲を受けたマウスメラノ一マ細胞である B16ZBL6細胞を使用した。該細胞の培養は、 10% FBSを添加した MEM培地を用い、 37° (：、 5%二酸化炭素存在下、水蒸気飽和したインキュベーターを用いて行った。

被験化合物は、予めジメチルスルホキシド（DMS0)に溶解し、濃度 100 πιΜ又は 10 mMの原溶液に調製した。また、ヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害活性を有することが判明しているトリコスタチン A市販品（和光純薬より購入）を、同じく DMS0に溶解し、濃度 5 mgZinl (16.54 mM) の原溶液に調製した。トリコスタチン Aは、ヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害活性に起因する MHC class— I分子発現促進作用の陽性対照化合物とした。なお、被験化合物原溶液の溶媒として用いる DMS0は、本試験において不可避的に培地中へ混入することになるが、試験に用いられる混入量の範囲では、試験結果に影響を及ぼさないことは別途確認した。

前記の B16ZBL6細胞を 5000個 wel 1の細胞密度で 96穴マイクロプレートに播種し、各 well当たり上記の培地 200μ 1中で、 24時間培養した後、被験化合物の原溶液所定量を培地に希釈した液 ΙΟμ Ιを添加し、引き続き 7 2時間培養した。その後、各 wellを PBS (リン酸緩衝液）で一回洗浄し、浮遊する細胞及び培地を除いた後、 0.1%ダルタルアルデヒド溶液で 3分間処理し、細胞の固定を行った。

固定した細胞表面に発現している MHC class— I分子の量は、以下の方法で測定した。一次抗体として、マウスの MHC class— I分子に対する抗体である抗 H - 2K^bD^bD^d抗体（市販品；明治乳業）を用い、二次抗体として、ピオチン化抗マウス IgG+M (市販品；ケミコン社）を用い、次いで、標識酵素として、ストレブトァビジン—^一ガラクトシダ一ゼコンジュゲ一ト（市販品； BRL社）を反応させた。上記の方法で標識された酵素^一ガラクトシダ一ゼ量を、基質として、 4-methylumbel 1 iferyl-/3 -D-galactoside (市販品：販売元ナカライテック) を用い、酵素反応の生成物に起因する蛍光強度（励起： 365nm、蛍光： 450nm) をマイクロプレートリーダーで測定した。なお、被験化合物の添加量を零とした別の wellに対して、前記の一次抗体を添加せずに、それ以降は同じ操作を施し、この別の wellにおいて測定される蛍光強度をバックグランドの水準とした。実際に測定される値（バックグラウンドを含んだ見掛けの値）から、前記のバックグランドの水準を差し引いた値を、発現している MHC class— I分子量を反映する真の測定値とした。

なお、被験化合物の添加量を零とした群を参照群とし、この群において発現している MHC class— I分子量の測定値を基準値とした。各被験化合物の添加濃度における、発現している MHC class— I分子量は、前記の基準値を 1 とする相対値で表し、被験化合物の活性強度は発現を二倍に促進する濃度（Cx2) で比較した。

本発明の環状テトラベプチド誘導体に対する評価結果の一例を表 1に示す。この表 1に示す環状テトラぺプチドは何れも MHC class- 1分子の発現促進活性に優れることが検証された。

表 1

被験化合物 2倍促進濃度 C_x2

CHAP 15 33.2 nM

CHAP54 5.67 nM

CHAP55 5.38 nM

CHAP71 2.76 nM

CHAP76 1.88 nM

CHAP78 2.35 nM

CHAP79 2.79 nM

CHAP81 1.29 nM

CHAP82 2.69 nM

CHAP83 2.29 nM

CHAP84 5.65 nM

CHAP85 2.26 nM

CHAP86 3.29 nM

CHAP87 5.39 nM

CHAP90 3.96 nM

CHAP91 2.48 nM (試験例 2 ) histone deacetylase酵素阻害活性

上述した試験例 1における細胞系における効果が、実際に本発明の環状テトラベプチド化合物によるヒストンデァセチラーゼの酵素活性を阻害によることの査証を得る目的で、本発明の環状テトラペプチド化合物が、 in vitroの系において、ヒストンデァセチラーゼの酵素活性を阻害することを以下の評価によリ検証した。

試験方法

ヒストンデァセチラ一ゼの調製は基本的には吉田ら（J. Biol. Chem.265， 17174-17179, 1990) の方法に従って行った。酵素は B16/BL6細胞から部分精製したものを使用した。細胞を HDA buffer (15 mM リン酸カリウム、 5%グリセ口 —ル、 0.2 mM EDTA、 1 mM 2-mercaptoethanol 、 pH 7.5) に懸濁し、ホモジナィズした後、遠心で核を集め（2500xg, 10 min) 、 1 M (NH₄)₂S0₄を含む同 buffer中で再びホモジナイズした。超音波破碎し遠心して、採取した上清中の (丽₄)^0₄濃度を3.5 Mまで上昇させ、ヒストンデァセチラーゼを沈殿させた。この沈殿物を HDA bufferに再溶解し、ゲル濾過で HDA bufferに溶媒交換し、粗 histone deacetylase酵素液として用いた。

基質として、合成基質ペプチド； [³H]acetylated histone H4 peptideを用いた。この [³H]acetylated histone H4 peptideは、ヒストン H4の N末ぺプチド； SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVC (C末にはシスティンをつけてある）を合成し、 3H-無水酢酸で放射ァセチル化し、基質として用いた。

アツセィは被験化合物の存在下、合成基質液と酵素液を 37°Cで 3時間インキュペートすることにより行った（反応容積 100 1) 。反応を 25μ 1の 1M HC1， 0.2 M酢酸を添加で止め、酵素反応で切り出された [³H]acetateを酢酸ェチルで抽出して放射活性を測定した。なお、参照群として、被験化合物を反応系添加せず、同じ操作を行った。阻害活性は、参照群における histone deacetylase 酵素活性を 50%阻害する濃度で表した（50%阻害濃度）。

評価結果の一例を表 2に示す。この表 2に示す環状テトラべプチドは何れもヒストンデァセチラーゼ酵素阻害活性に優れることが検証された。表 2

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考どして本明細書にとリ入れるものとする。産業上の利用可能性

本発明の環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩は、その優れたヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害活性に付随して、 MHC c l ass— I分子発現促進に優れた活性を有する。また、ヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害に由来する細胞増殖阻害、細胞周期の阻害作用も有しており、癌組織の拡大を抑制するので、前記の MHC c l ass— I分子発現促進作用を利用して、免疫系による癌細胞の排除を格段に促進することができ、抗癌剤として極めて有用である。その際、本発明の環状テトラペプチド誘導体のヒストンデァセチラーゼ酵素阻害は可逆的なものであるので、不可逆的な阻害剤と比較して、正常な組織に対しては、細胞増殖阻害、細胞周期の阻害作用などの好ましからざる副作用が格段に少ない利点を持つ。

Claims

請求の範囲一般式（ 1 ) 、（Ι') （1'，）又は（ 1 '，'）で示される環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩。

(式中、 R„、 R₁₂、 R₂₁及び R₂₂は、それぞれ独立して、水素、非芳香族環状ァルキル基若しくは置換基を有することもある芳香環が結合してもよい炭素数 1 〜 6の直鎖アルキル基、又は非芳香族環状アルキル基若しくは置換基を有することもある芳香環が結合してもよい炭素数 3〜 6の分岐のアルキル基を表し、 R„ R₂及び R₃は、それぞれ独立して、鎖上に炭素数 1〜6の分岐鎖を有してもよい鎖長炭素数 1〜 5の直鎖アルキレン基を表し、また前記直鎖アルキレン基上の分岐鎖は該アルキレン鎖上に縮合環構造を形成してもよい。但し、一般式 ( I "') においては、 Rい、 R_i2、 R₂₁及び R₂₂の少なくとも 1っはシクロへキシルメチル基である。）

2. 前記一般式（ I ) で示される請求項 1記載の環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩。

3. 前記一般式（ ) で示される請求項 1記載の環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩。

4. 前記一般式（ Γ') で示される請求項 1記載の環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩。

5. 前記一般式（ Γ'') で示される請求項 1記載の環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩。

6. 請求項 1〜 5の何れかに記載の環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するヒストンデァセチラーゼ阻害剤。

7. 請求項 1〜 5の何れかに記載の環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する MHC class— I分子発現促進剤。

8 . 請求項 1〜 5の何れかに記載の環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。

9 . 抗癌剤として使用される請求項 8記載の医薬組成物。