JP5433586B2 - ペプチド修飾の方法 - Google Patents
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Description
式(I)のC末端キャッピング基をペプチドに組み込むことを含む、ペプチドのトリプシンによる分解に対する耐性を向上させる方法を提供する:
X−Y−Z (I)
式中、
XはN原子であり、置換されていないことが好ましいが、分岐したまたは分岐していないC1〜C10アルキルまたはアリール基、例えばメチル、エチルまたはフェニル基により置換されていてもよく、この基はN、OおよびSから選択される2個までのヘテロ原子が組み込まれていてもよい;
Yは、−Ra−Rb−、−Ra−Rb−Rb−および−Rb−Rb−Ra−から選ばれる基を表し、
RaはC、O、SまたはN、好ましくはCであり、
RbはCである;
RaおよびRbの各々は、C1〜C4アルキル基により置換されていても、非置換であってもよく、好ましくはYは−Ra−Rb−(ここでRa−は好ましくはCである)であり、好ましくはこの基は非置換であり、Yが−Ra−Rb−Rb−または−Rb−Rb−Ra−である場合は一以上のRaおよびRbは置換されている;
Zは、各々5個もしくは6個の非水素原子(好ましくはC原子)の環状基を1〜3個含み、2個以上の環状基が融合していてもよい基である;1個以上の環は置換されていてもよく、これらの置換は、典型的には含まないが、極性基を含んでいてもよく、適切な置換基としてはハロゲン、好ましくはフッ素もしくは臭素およびC1〜C4アルキル基が挙げられる;
Z部分には最高15個、好ましくは5〜12個の非水素原子が組み込まれていてもよく、最も好ましくはその部分はフェニル基であるかそれを含む;
YとZとの間の結合は、YのRaもしくはRbとZの環状基のうちの一つの非水素原子との間の共有結合である。
X−Y−Z (I)
式中、
XはNH基である;
Yは、−Ra−Rbであり、ここで、
RaはC、O、SまたはN、好ましくはCであり、
RbはCである;
RaおよびRbの各々は、C1〜C4アルキル基により置換されていてもよく、非置換であってもよい;
Zは、上で定義した通りである。
(a)興味があるペプチドのトリプシンによる分解に対する感受性を測定すること、
(b)上で定義した式(I)のC末端キャッピング基の前記ペプチドへの組み込みにより、前記ペプチドを修飾すること、および任意で
(c)前記修飾されたペプチドのトリプシンによる分解に対する感受性を測定すること。
本発明のC末端キャッピング基は親油性部分を含んでいるが、このことは、修飾されるペプチドの親油的な特性を保持するないし向上させることが望まれている場合に有利である。例えば、抗菌ペプチドは、典型的には親油基を組み込んでいることが有利である。
化学薬品
ウシ膵臓由来の基本的に無塩のトリプシン(T8802、10000〜15000BAEEユニット/mgタンパク質)はSigma−Aldrichから供給された。保護アミノ酸はBachem AGまたはAldrichから購入した。化学薬品はFluka Acros. Merck, Riedel−de HaenまたはAldrichから購入した。
非市販のアミノ酸誘導体を、図1(スキーム1)に概説した一般的なスキームに従って調製した。
Boc−4−ヨードフェニルアラニン(1、1当量)を90%メタノール水溶液に溶解し、それが弱アルカリ性になるまで(リトマス試験紙により判定した)炭酸セシウムを添加して中和した。溶媒をロータリーエバポレーションにより除去し、トルエンとの共沸蒸留を繰り返すことでBoc−4−ヨードフェニルアラニンのセシウム塩に残存している水をさらに減少させた。できた乾燥塩をジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。臭化ベンジル(1.2当量)を添加し、できた混合液を6〜8時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、油状物を生じさせ、それは標記化合物(2)を含んでいた。油状物を酢酸エチルと酢酸(15%v/v)の間で分離し、有機相を同量のクエン酸溶液(5%v/v、2回)、NaHCO3の飽和溶液および塩水で洗浄した。溶出剤としてCH2Cl2:酢酸エチル(95:5v/v)を用いたフラッシュクロマトグラフィによる精製後、標記化合物を淡黄色の油状物として85%の収率で単離した。結晶のベンジルBoc−4−ヨードフェニルアラニンは、再結晶によってn−ヘプタンから得ることが可能だった。
ベンジルBoc−4−ヨードフェニルアラニン(1当量)、アリールボロン酸(1.5当量)、炭酸ナトリウム(2当量)、パラジウム酢酸塩(0.05当量)およびトリオルト−トリルホスフィン(0.1当量)を、ジメトキシエタン(6ml/mmolアミノ酸)および水(1ml/mmolアミノ酸)の脱気した混合液に添加した。反応混合液をアルゴン下に保持し、4〜6時間、80度℃に加熱した。室温に冷却後、混合液をシリカゲルおよび炭酸ナトリウムの短いパッドでろ過した。フィルターケークを酢酸エチルでさらに洗浄し、他の画分とあわせてから減圧下で溶媒を除去した。生成物を、溶出剤として酢酸エチルおよびn−ヘキサンの混合液を用いたフラッシュクロマトグラフィにより精製した。
鈴木カップリングのための一般的な手順を用いて、4−t−ブチルフェニルボロン酸から標記化合物を79%の収率で調製した。溶出剤として酢酸エチル:n−ヘキサン溶出剤(80:20v/v)を採用したフラッシュクロマトグラフィの後に、3aを単離した。
鈴木カップリングのための一般的な手順を用いて、4−ビフェニルボロン酸から標記化合物を61%の収率で調製した。粗生成物の再結晶によりn−ヘプタンから3bを単離した。
鈴木カップリングのための一般的な手順を用いて、4−n−ブチルフェニルボロン酸から標記化合物を53%の収率で調製した。80:20の酢酸エチル:n−ヘキサンを溶出剤として用いて3cを精製した。
鈴木カップリングのための一般的な手順を用いて、2−ナフチルボロン酸から標記化合物を68%の収率で調製した。粗生成物の再結晶によりn−ヘプタンから3dを単離した。
ベンジルエステルをDMFに溶解し、雰囲気圧および雰囲気温度で2日間、触媒として10%パラジウム−炭素を用いて水素化した。反応終了時に濾過により触媒を除去し、減圧下で溶媒を除去した。再結晶によりジエチルエーテルから遊離酸を単離した。
エステル分解のための一般的な手順を用いて、3aから標記化合物を65%の収率で調製した。
エステル分解のための一般的な手順を用いて、3bから標記化合物を61%の収率で調製した。
エステル分解のための一般的な手順を用いて、3cから標記化合物を61%の収率で調製した。
エステル分解のための一般的な手順を用いて、3dから標記化合物を68%の収率で調製した。
以下の一般的な手順に従って、Boc保護戦略を用いた段階的アミノ酸カップリングにより、ペプチドを溶液中で調製した。遊離アミノ基のあるC末端ペプチド部(1当量)、Boc保護アミノ酸(1.05当量)および1−HOBt(1.8当量)をDMF(アミノ成分2〜4ml/mmol)に溶解してから、DIPEA(4.8当量)を添加した。反応混合液を氷冷してからHBTU(1.2当量)を添加し、1〜2時間周囲温度で反応混合液を撹拌した。反応混合液を酢酸エチルで希釈し、クエン酸溶液(5%v/v)、NaHCO3の飽和溶液および塩水で洗浄した。真空下で溶媒を除去し、できたペプチドのBoc保護基を、無水メタノール中の95%TFAまたは塩化アセチルを用いて暗所で脱保護した。
詳細は、Coste, J., Frerot, E., and Jouin, P. (1994) Coupling N-Methylated Amino-Acids Using Pybrop and Pyclop Halogenophosphonium Salts - Mechanism and Fields of Application. J. Org. Chem. 59, 2437−2446)を参照のこと。乾燥したCH2Cl2(2ml)およびDMF(1ml)にBoc−Arg−OH(1当量)、NH(CH2Ph)2(1.1当量)およびPyCloP(1当量)が溶解した溶液。その溶液を氷冷し、撹拌しながらDIPEA(2当量)を添加した。室温で1時間溶液を撹拌した。反応混合液を蒸発させ、酢酸エチルに再溶解し、クエン酸溶液(5%v/v)、NaHCO3の飽和溶液および塩水で洗浄した。真空下で溶媒を除去し、できたアミノ酸誘導体のBoc保護基を95%TFAを用いて暗所で脱保護した。
水およびアセトニトリル(どちらも0.1%のTFAを含んでいる)の混合液を溶出剤とする、Delta−Pak(Waters社)C18カラム(100Å、15μm、25×100mm)での逆相HPLCを用いて、ペプチドを精製した。さらに、分析用Delta−Pak(Waters社)C18カラム(100Å、5μm、3.9×150mm)を用いたRP−HPLC、およびVG Quattro四重極質量分析計(VG Instruments社、アルトリンガム、英国)での正イオン・エレクトロスプレー・マススペクトル分析により、ペプチドの純度を分析した。
最終的なペプチド濃度が1mg/mlになるよう、各ペプチドを0.1MのNH4HCO3緩衝液(pH6.5)に溶解した。0.1MのNH4HCO3緩衝液(pH8.2)50mlにトリプシン1mgを溶解して、トリプシン溶液を調製した。安定性の定量のため、できて間もないトリプシン溶液250μlおよびペプチド溶液250μlを、浸透台上、37℃で、0.1MのNH4HCO3緩衝液(pH8.6)2ml中でインキュベートした。0.5mlのアリコートを異なる時間間隔でサンプリングし、1%のTFAを含む、水:アセトニトリル(60:40v/v)0.5mlで希釈し、上記のようにRP−HPLCで分析した。37℃で0時間および20時間後に採られたトリプシン無添加のサンプルをネガティブコントロールとして用いた。アッセイの始めの5時間の間に採られたサンプルの、254nmのピーク面積の積分値を、コーネル大学からのMedical Calculatorを用いてt1/2を生成するために用いた。GraphPad Prism 4cで動態学的プロファイルのプロットを作成した。
更なる化合物を本発明の方法に従って調製し、さまざまな細菌に対する最小阻止濃度(MIC)値を得た。
Boc−Arg−Tbt−Arg−OMeの鹸化
LiOH・H2O(373mg、8.9mmol)を、BocArgTbtArg−OMe・2HCl(2.9mmol、2.5g、WO01/66147に記載されたようにして調製)がH2O(5ml)THF(20ml)混合液に溶解した無色の溶液に添加し、室温で30分間撹拌して反応させたところ、その間にそれは急速に黄色を発色した。希釈したHCl(52ml)および飽和塩水(35ml)を添加し、できた混合液をDCMで抽出した。DCMを蒸発させ、有機物質をDCMに再溶解し、Na2SO4で乾燥し、濾過して濃縮した。得られたBocArgTbtArg−OHのかたまり:2.45g、93%。
BocArgTbtArgCO2HのTFA塩(365mg、0.35mmol)をDMF(0.9ml)に溶解した2−ブロモフェニルエチルアミン(53μl)と混合し、DIPEA(120μl)を添加した。反応混合液を5分間室温で撹拌してからPyBOP(194mg、0.37mmol)を添加し、それから3時間放置した。精密検査の前に混合液をEtOAc(20ml)で希釈し、2×30mlの5%クエン酸溶液、2×30mlの5%NaHCO3溶液、30mlの飽和塩水で洗浄し、その後Na2SO4で乾燥し、濾過して濃縮した。カップリング試薬由来の副産物を含んでいる油状物(432mg)として粗生成物を単離した。粗精製物を1,4−ジオキサンに溶解した4MのHCl15mlに溶解し、濃縮および逆相クロマトグラフィによる最終的な精製の前に、それを室温で30分間撹拌することにより、Boc基を除去した。
純度:>95%、エレクトロスプレー・マススペクトル分析(m/z、プロトン化された分子イオン):866.48/868.56(計算値)、866.5/868,5(観測値)。
最小阻止濃度(mg/l)、H−Arg−Tbt−Arg−NH−Y−Z
Claims (14)
- 式(I)のC末端キャッピング基をペプチドまたはペプチドミメティックに組み込むことを含む、ペプチドまたはペプチドミメティックのトリプシンによる分解に対する耐性を向上させる方法:
X−Y−Z (I)
式中、
XはN原子であり、N、OおよびSから選択される2個までのヘテロ原子が組み込まれていてもよい、分岐したまたは分岐していないC1〜C10アルキルまたはアリール基により置換されていてもよい;
Yは、−Ra−Rb−、−Ra−Rb−Rb−および−Rb−Rb−Ra−から選ばれる基を表し、
RaはCであり、
RbはCである;RaおよびRbの各々は、C1〜C4アルキル基により置換されていても、非置換であってもよい;
Zは、各々5個もしくは6個の非水素原子の環状基を1〜3個含み、2個以上の環状基は融合していてもよく、1個以上の環状基は置換されていてもよい基である;Z部分には最高15個の非水素原子が組み込まれていてもよい;そして、
YとZとの間の結合は、YのRaもしくはRbとZの環状基のうちの一つの非水素原子との間の共有結合である。 - Xが非置換である、請求項1に記載の方法。
- Yが−Ra−Rb−であり非置換である、請求項1または2に記載の方法。
- Yが−CH2−CH2である、請求項3に記載の方法。
- Zがフェニル基である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- −X−Y−Zがまとめて−NHCH2CH2Phである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、前記キャッピングされたペプチドまたはペプチドミメティックのトリプシンによる分解に対する感受性を測定するステップを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- ペプチドがそのC末端にカチオン性アミノ酸を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- C末端アミノ酸に隣接したアミノ酸が少なくとも9個の非水素原子を有するものである親油性R基を有する、請求項8に記載の方法。
- 親油性R基が9〜20個の非水素原子を有する、請求項9に記載の方法。
- 親油性R基が2個以上の環状基を有する、請求項9または10に記載の方法。
- ペプチドが、長さが3〜18個のアミノ酸である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか一つで定義した式(I)の化学部分を含むまたはそれからなる化合物の、C末端キャッピング基として式(I)のその部分が組み込まれていない同じ分子と比較して、トリプシン分解に対する耐性が増加したペプチドまたはペプチドミメティックの調製における使用。
- 以下を含むペプチド生産の方法:
(a)興味があるペプチドのトリプシンによる分解に対する感受性を測定すること、
(b)請求項1〜6のいずれか一つで定義した式(I)のC末端キャッピング基の前記ペプチドへの組み込みにより、前記ペプチドを修飾すること、および任意で
(c)前記修飾されたペプチドのトリプシンによる分解に対する感受性を測定すること。
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