WO1995026414A1 - Melithiazole, herstellungsverfahren, mittel mit einem gehalt an melithiazol und melittangium lichenicola dsm 9004 mit der fähigkeit, melithiazole zu bilden - Google Patents

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WO1995026414A1
WO1995026414A1 PCT/EP1995/001129 EP9501129W WO9526414A1 WO 1995026414 A1 WO1995026414 A1 WO 1995026414A1 EP 9501129 W EP9501129 W EP 9501129W WO 9526414 A1 WO9526414 A1 WO 9526414A1
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melithiazole
methanol
eluted
dsm
vacuo
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PCT/EP1995/001129
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Gerhard Höfle
Hans Reichenbach
Bettina Böhlendorf
Florenz Sasse
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GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF)
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    • A01N43/72—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms
    • A01N43/74—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms five-membered rings with one nitrogen atom and either one oxygen atom or one sulfur atom in positions 1,3
    • A01N43/78—1,3-Thiazoles; Hydrogenated 1,3-thiazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/22—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/167—Heterorings having sulfur atoms as ring heteroatoms, e.g. vitamin B1, thiamine nucleus and open chain analogs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • Melithiazoles production processes, compositions containing melithiazole and melittangium lichenicola DSM 9004 with the ability to form melithiazoles.
  • the invention relates to a melithiazole of the formula
  • the invention further relates to a melithiazole of the formula
  • the invention further relates to a melithiazole, which is characterized in that
  • melithiazole can be obtained by chromatography at stages (g) and / or (h).
  • the invention further relates to a melithiazole of the empirical formula C20H26N2CMS2, which is characterized by the following strong bands:
  • the invention further relates to a melithiazole of the empirical formula C20H24 N2C S2, which is characterized by the following spectrum:
  • the invention further relates to a process for the preparation of melithiazole, which is characterized in that
  • the invention further relates to an agent with a content of methyl lithiazole for inhibiting the growth of yeasts and / or fungi in addition to a conventional carrier and / or diluent.
  • the invention relates to Melittangium lichenicola DSM 9004 or a strain derived therefrom with the ability to form methelithiazole.
  • the bacterium Melittangium lichenicola belongs to the order of the Myxococcales (Myxobacteria), suborder Cystobacterineae, family Cystobacteraceae.
  • Myxobacteria Myxococcales
  • Cystobacterineae family Cystobacteraceae.
  • the Me I26 production strain was isolated from rabbit manure from seekers at GBF in September 1988. It was deposited on .03.94 with the German Collection of Microorganisms (DSM) in Braunschweig under the number DSM.
  • the stock culture is carried out on agar plates, preferably on yeast agar (VY / 2 agar).
  • This medium contains 0.5% baker's yeast, 0.1% CaCl 2 * 2 H 2 0, 0.1 mg / l vitamin B 12 and 1.8% agar.
  • the strain also grows vigorously on glutamate agar (MYX agar: 0.5% Na glutamate, 0.2% glucose, 0.1% yeast extract, 0.1% MgSO 4 x 7 H 2 0, 1, 8% agar). The pH is adjusted to 7.2. The plates are incubated at 30 ° C.
  • the vegetative cells are slender, slightly boat-shaped rods 0.6 - 0.8 ⁇ m wide and 3 - 6 ⁇ m long. Due to the sliding movement of the bacteria, the colonies spread quickly over the culture plate. The swarm colony is thin and film-like on Hefeagar and shows reddish-brown radial folds. The yeast cells in the medium are completely degraded, as can be seen from the clarification center that is being built around the colonies.
  • the strain hydrolyzes milk casein in skim milk agar, unicellular protein (probion), chitin, starch and xylan.
  • the stem originally formed the fruiting bodies typical of the species: orange to brown spherical to kidney-shaped sporangioles with a diameter of 40 - 60 ⁇ m, which sit individually on short white stems (approx. 20 x 50 ⁇ m). With continued culture the fruiting bodies degenerate into fine ribs and knots or are completely lost. In the fruiting bodies, the vegetative cells transform into myxospores that refract strongly: short, thick, often C- or S-shaped rods of 0.9 - 1, 2 x 2 - 3 ⁇ m with an irregular outline.
  • the Me I26 strain produces a substance, namely melithiazole, that inhibits the growth of yeasts and fungi.
  • the inhibitor can be isolated both from the cells and from the culture supernatant.
  • a typical fermentation proceeds as follows: A fermentor with a working volume of 100 L is filled with 70 L culture medium (composition: 0.7% soy flour (defatted); 0.3% baker's yeast; 0.1% CaCl 2 x 2 H 2 0; 0 , 1% MgS0 4 x 7 H 2 0; 0.2% glucose, 0.1 mg vitamin B 12 / l). The pH is adjusted to 7.2 with NaOH. To bind the inhibitor released into the medium, 1% (v / v) of an adsorber resin (Amberlite XAD-16, Rohm & Haas, Frankfurt) is added to the medium.
  • an adsorber resin Amberlite XAD-16, Rohm & Haas, Frankfurt
  • Inoculation is carried out with 10 L of a 3-day-old preculture which was produced in the same medium in a correspondingly smaller fermenter. Is fermented at 30 ° C with a stirring speed of 150 rpm and an aeration rate of 10 vol.% Air per min. Initial foam formation is prevented by adding 20 ml of silicone anti-foam (eg Tegosipon). The fermentation is ended after 4 days.
  • silicone anti-foam eg Tegosipon
  • Melithiazole has a very good fungicidal effect on yeasts and fungi (see table). It inhibits the NADH oxidation of submitochondrial bovine heart particles, but is relatively little toxic in the in wYro cell test with the L929 mouse cell line. A.7. Spectrum of activity
  • Melithiazole A 100ng / ml Melithiazole B 50ng / ml Elution of the adsorber resin and production of the raw product
  • the XAD adsorber resin is separated from the culture broth with a process filter, rinsed with water into a glass column (6-10 cm), washed with 1 bed volume of water and at a flow of 5 ml / min with 5 bed volumes of methanol and 2 bed volumes Acetone eluted.
  • the combined methanol and acetone eluates are concentrated in vacuo at a bath temperature of 35 ° C. until the water phase occurs (200 ml) and then extracted 5 times with 50 ml of ethyl acetate.
  • the organic phase is dried over sodium sulfate and the solvent distilled off in vacuo at 35 C bath temperature.
  • 200 ml of dichloromethane, 100 ml of dichloromethane / acetone 90:10 and 200 ml of methanol are eluted
  • the methanol fraction is evaporated to dryness in vacuo at a bath temperature of 35 ° C.
  • the residue (1.1 g) is then mixed with 100 ml of ethyl acetate and washed three times with in each case 50 ml of a dilute ammonia solution (pH 10) The organic phase is separated off, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo at a bath temperature of 35 ° C.
  • TLC aluminum foils with silica gel 60 F 254 , layer thickness 0.2 mm, Merck art. 5554
  • IR (KBr): v 3093 (w), 2980 (m, sh), 2931 (s), 2864 (w), 2822 (w, sh), 1711 (vs), 1624 (vs) 1582 (m), 1501 (f), 1449 (m), 1441 (m), 1383 (m), 1264 (m), 1281 (w, sh), 1195 (m), 1150 (vs), 1125 (w), 1091 (m ), 1056 (w), 973 (w), 925 (w), 828 (w), 804 cnY 1 (w).
  • UV (acetonitrile): ⁇ ma ⁇ (log ⁇ ) 211 (4.33, sh), 227 (4.47), 256 (4.28, sh), 263 (4.11, sh), 309 (3.27, sh), 311 (3.27, sh ), 327 (3.07, sh), 335 nm (2.83, sh).
  • TLC aluminum foils with silica gel 60 F 254 , layer thickness 0.2 mm, Merck art. 5554

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Abstract

Die Erfindung betrifft Melithiazol der Formel (I) oder (II), ein Herstellungsverfahren, ein Mittel mit einem Gehalt an Melithiazol sowie Melittangium lichenicola DSM 9004 mit der Fähigkeit, Melithiazol zu bilden.

Description

Melithiazole, Herstellungsverfahren, Mittel mit einem Gehalt an Melithiazol und Melittangium lichenicola DSM 9004 mit der Fähig¬ keit, Melithiazole zu bilden.
Die Erfindung betrifft ein Melithiazol der Formel
Figure imgf000003_0001
Ferner betrifft die Erfindung ein Melithiazol der Formel
Figure imgf000003_0002
Ferner betrifft die Erfindung ein Melithiazol, das dadurch ge¬ kennzeichnet ist, daß man
(a) Melittangium lichenicola DSM 9004 in einem Kohlenstoff¬ quellen, Stickstoffquellen, Vitamin B12 und Mineralsalze enthaltenden Medium aerob in Gegenwart eines Adsorber- harzes kultiviert,
(b) das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit einem Methanol/Aceton-Gemiseh eluiert,
(c) das Eluat bis zum Auftreten einer Wasserphase einengt und die Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert,
' (d) den Extrakt trocknet und das Extraktionsmittel im Vakuum entfernt,
(e) den Rückstand in Ethylacetat aufnimmt und mit einer wä߬ rigen NaHCC*3-Lösung wäscht,
(f) die organische Phase abtrennt, trocknet und im Vakuum einengt,
(g) den Rückstand an einer RP-18 Kieselgelsäule mit einem Methanol/Wasser-Gemisch als Laufmittel chromatographiert und eine Melithiazol enthaltende Fraktion eluiert und das Melithiazol gegebenenfalls isoliert und/oder
(h) eine ein weiteres Melithiazol enthaltende Fraktion elu¬ iert und die Fraktion an einem RP-18 Kieselgel mit einem Methanol/Wasser-Gemisch als Laufmittel chromatographiert und das Melithiazol gegebenenfalls isoliert.
Erfindungsgemäß ist Melithiazol dadurch gewinnbar, daß man bei den Stufen (g) und/oder (h) chromatographiert.
Ferner betrifft die Erfindung ein Melithiazol der Summenformel C20H26N2CMS2 , daß durch folgende starke Banden gekennzeichnet ist:
IR (KBr) ny = 2.931, 1.711, 1.624, 1.150 cm" ■
UV (Acetonitri 1 ) lambdamax (log epsilon) = 227 (4,47) nm Ferner betrifft die Erfindung ein Melithiazol der Summenformel C20H24 N2C S2 , das durch folgendes Spektrum gekennzeichnet ist:
UV (Acetonitri 1 ) lambdamax (log epsilon) = 235, 307 nm
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Melithiazol, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) Melittangium lichenicola DSM 9004 in einem Kohlenstoff- quellen, Stickstoffquellen, Vitamin B12 und Mineralsalze enthaltenden Medium aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes
' kultiviert,
(b) das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit einem Me¬ thanol/Aceton-Ge iseh eluiert,
(c) das Eluat bis zum Auftreten einer Wasserpahse einengt und die Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert,
(d) den Extrakt trocknet und das Extraktionsmittel im Vakuum entfernt,
(e) den Rückstand in Ethylacetat aufnimmt und mit einer wäßrigen NaHCθ3-Lösung wäscht,
(f) die organische Phase abtrennt, trocknet und im Vakuum einengt,
(g) den Rückstand an einer RP-18 Kieselgelsäule mit einem Metha¬ nol/Wasser-Gemisch als Laufmittel chromatographiert und eine Melithiazol enthaltende Fraktion eluiert und das Melithiazol gegebenenfalls isoliert und/oder
(h) eine ein weiteres Melithiazol enthaltende Fraktion eluiert und die Fraktion an einem RP-18 Kieselgel mit einem Metha¬ nol/Wasser-Gemisch als Laufmittel chromatographiert und das Melithiazol gegebenenfalls isoliert.
Ferner betrifft die Erfindung ein Mittel mit einem Gehalt an Me¬ lithiazol zur Wachstumsinhibierung von Hefen und/oder Pilzen ne¬ ben einem üblichen Träger und/oder Verdünnungsmittel. Schließlich betrifft die Erfindung Melittangium lichenicola DSM 9004 oder einen davon abgeleiteten Stamm mit der Fähigkeit, Me¬ lithiazol zu bilden.
A. Produktionsbedingungen
A.1. Produktionsstamm
Das Bakterium Melittangium lichenicola gehört zur Ordnung der Myxococcales (Myxobakterien), Unterordnung Cystobacterineae, Familie Cystobacteraceae. Der Produktionsstamm Me I26 wurde im September 1988 an der GBF von Kaninchenmist aus Mallorca isoliert. Er wurde am .03.94 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig unter der Nr. DSM hinterlegt.
A.2. Stammkultur
Die Stammkultur erfolgt auf Agarplatten, bevorzugt auf Hefe-Agar (VY/2-Agar). Dieses Medium enthält 0,5 % Bäckerhefe, 0,1 % CaCI2* 2 H20, 0,1 mg/l Vitamin B12 und 1 ,8 % Agar. Der Stamm wächst auch kräftig auf Glutamat-Agar (MYX-Agar: 0,5 % Na- Glutamat, 0,2 % Glucose, 0,1 % Hefe-Extrakt, 0,1 % MgS04 x 7 H20, 1 ,8 % Agar). Der pH-Wert wird auf 7,2 eingestellt. Die Platten werden bei 30° C bebrütet.
A.3. Morphologische Beschreibung
Die vegetativen Zellen sind schlanke, leicht bootsförmige Stäbchen von 0,6 - 0,8 μm Breite und 3 - 6 μm Länge. Bedingt durch die Gleitbewegung der Bakterien, breiten sich die Kolonien rasch über die Kulturplatte aus. Die Schwarmkolonie ist auf Hefeagar dünn und filmartig und zeigt rötlich-braune radiale Falten. Wie an dem um die Kolonien entstehenden Klärhof zu erkennen, werden die Hefezellen im Medium vollständig abgebaut. Der Stamm hydrolysiert Milchcasein in Magermilchagar, Einzellerprotein (Probion), Chitin, Stärke und Xylan.
Ursprünglich bildete der Stamm die für die Art typischen Fruchtkörper: orange bis braune kugelige bis nierenförmige Sporangiolen von 40 - 60 μm Durchmesser, die einzeln auf kurzen weißen Stielchen (etwa 20 x 50 μm) sitzen. Bei fortdauernder Kultur degenerieren die Fruchtkörper zu feinen Rippen und Knoten oder gehen ganz verloren. In den Fruchtkörpern wandeln sich die vegetativen Zellen um zu stark lichtbrechenden Myxosporen: kurze, dicke, oft C- oder S-förmig gekrümmte Stäbchen von 0,9 - 1 ,2 x 2 - 3 μm mit unregelmäßigem Umriß.
A.4. Leistungen
Der Stamm Me I26 produziert eine Substanz, nämlich Melithiazol, die das Wachstum von Hefen und Pilzen hemmt. Der Hemmstoff kann sowohl aus den Zellen wie auch aus dem Kulturüberstand isoliert werden.
A.5. Produktion von Melithiazol
Die Substanz wird während der logarithmischen bis hin zur stationären Wachstumsphase produziert. Eine typische Fermentation verläuft wie folgt: Ein Fermentor mit 100 L Arbeitsvolumen wird mit 70 L Kulturmedium gefüllt (Zusammensetzung: 0,7 % Sojamehl (entfettet); 0,3 % Bäckerhefe; 0,1 % CaCI2 x 2 H20; 0,1 % MgS04 x 7 H20; 0,2 % Glucose, 0,1 mg Vitamin B12/l). Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 eingestellt. Zur Bindung des ins Medium freigesetzten Hemmstoffes wird dem Medium 1 % (V/V) eines Adsorberharzes (Amberlite XAD-16, Rohm & Haas, Frankfurt) zugesetzt. Beimpft wird mit 10 L einer 3 Tage alten Vorkultur, die im gleichen Medium in einem entsprechend kleineren Fermentor erzeugt wurde. Fermentiert wird bei 30° C mit einer Rührgeschwindigkeit von 150 Upm und einer Belüftungsrate von 10 Vol. % Luft pro min. Anfängliche Schaumbildung wird durch Zugabe von 20 ml Silikon- Antischaum (z.B. Tegosipon) verhindert. Die Fermentation wird nach 4 Tagen beendet.
A.6. Wirkung
Melithiazol hat eine senr gute fungizide Wirkung auf Hefen und Pilze (vgl. Tabelle). Es hemmt die NADH-Oxidation von submitochondrialen Rinderherzpartikeln, ist aber im in wYro-Zellentest mit der Mauszellinie L929 relativ wenig toxisch. A.7. Wirkungsspektrum
Melithiazol A Melithiazol B
Hemmhof* MIC Hemmhof* MIC
[mm] [μg/ml] [mm] [μg/ml]
Hefen:
Candida albicans 30 0,06 26 0,1
Hansenula anomala 28 0,1 23 0,06
Lipomyces lipofer 27 19
Metschnikowia pulcherrima 33 0,1 22 0,1
Pichia membranaefaciens 25 22
Saccharomyces cerevisiae 31 0,01 28 0,02
Torulopsis glabrata 30 25
Andere Pilze:
Botrytis cinerea 38 0,1 30 0,1
Coprinus cinereus 60 40
Fusarium oxysporum 26 17
Pythium debaryanum 50 0,06 32 0,1
Trichoderma koningii 17 18
Ustilago zeae 20
*Agardiffusionstest: 2 μg pro Testblättchen von 6 mm Durchmesser
Alle Tests wurden in einem Peptonmedium (1 %) mit dem Zusatz von 1 % Hefeextrakt und 2 % Glycerin durchgeführt.
Toxizitätstest mit Mausfibroblastenkultur (L929):
Melithiazol A 100 ng/ml Melithiazol B 50 ng/ml Elution des Adsorberharzes und Herstellung des Rohproduktes
Das XAD-Adsorberharz wird mit einem Prozeßfilter von der Kulturbrühe abgetrennt, mit Wasser in eine Glassäule (6 10 cm) gespült, mit 1 Bettvolumen Wasser ge¬ waschen und bei einem Fluß von 5 ml/min mit 5 Bettvolumen Methanol und 2 Bett¬ volumen Aceton eluiert. Die vereinigten Methanol- und Acetoneluate werden im Vakuum bei 35 °C Badtemperatur bis zum Auftreten der Wasserphase (200 ml) eingeengt und dann 5 mal mit 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum bei 35CC Badtemperatur abdestilliert. Der Rückstand (24 g) wird mit 200 ml Ethylacetat versetzt und dreimal mit jeweils 50 ml einer 5%igen Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die organische Phase wird abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum bei 35CC Badtemperatur bis zur Trockene eingeengt. Es werden 3.8 g des Rohproduktes erhalten. Reinigung des Rohproduktes
Das Rohprodukt wird durch Filtrieren über eine Kieselgelsäule (ό 10 cm, (.= 7 cm, Kieselgel 60, Korngröße 0.063 - 0.200 mm, Merck Art. 7734) gereinigt. Nacheinander wird mit 200 ml Dichlormethan, 100 ml Dichlormethan/Aceton 90:10 und 200 ml Methanol eluiert. Die Methanolfraktion wird im Vakuum bei 35°C Badtemperatur bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand (1.1 g) wird anschließend mit 100 ml Ethyl¬ acetat versetzt und dreimal mit jeweils 50 ml einer verdünnten Ammoniaklösung (pH 10) gewaschen. Die organische Phase wird abgetrennt, über Natriumsulfat ge¬ trocknet und im Vakuum bei 35°C Badtemperatur bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand (680 mg) wird bei einem Fluß von 10 ml/min und einem Druck von 12 bar an HD-SIL- 18-20-60 (Labomatic, 6 6 cm, {= 54 cm) mit einem Laufmittelgemisch aus Methanol und Wasser im Volumenverhältnis von 75:25 chromatographiert. Nach 5.5 h eluieren 20 mg Melithiazol A. Die später eluierenden Fraktionen werden vereinigt und bei einem Fluß von 12 ml/min und einem Druck von 72 bar an Eurosphere 100-C18-10 (Knauer, έ 16 mm, {= 250 mm) mit einem Laufmittelgemisch aus Methanol und Wasser im Volumenverhältnis von 75:25 chromatographiert. Nach 40 min eluieren 0.7 mg Melithiazol B. 2. Physikalische Eigenschaften von Melithiazol A hellgelbes Öl
Summenformel C20H26N2O4S2 MG 422.56
DC: Aluminiumfolien mit Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.2 mm, Merck-Art. 5554
Detektion mit Vanillin/Schwefelsäure-Sprühreagenz (—*> Gelbfärbung) und
Erhitzen auf 120°C (→ Braunfärbung)
Laufmittel: Dichlormethan/Aceton 90:10, v/v
R,ι 0.55 HPLC: Säule: 6 4mm; 9= 250mm; Material: Nucleosil 18-100-7; Fluß: 1.5 ml/min; Laufmittel: Methanol/Wasser 75:25 Rt: 6.5 min
1H-NMR (CDC , 600 MHz): siehe Tabelle 1
13C-NMR (CDC 150 MHz): siehe Tabelle 1
IR (KBr): v= 3093 (w), 2980 (m, sh), 2931 (s), 2864 (w), 2822 (w, sh), 1711 (vs), 1624 (vs) 1582 (m), 1501 (w), 1449 (m), 1441 (m), 1383 (m), 1264 (m), 1281 (w, sh), 1195 (m), 1150 (vs), 1125 (w), 1091 (m), 1056 (w), 973 (w), 925 (w), 828 (w), 804 cnY1 (w).
UV (Acetonitril): λmaχ (log ε)= 211 (4.33, sh), 227 (4.47), 256 (4.28, sh), 263 (4.11, sh), 309 (3.27, sh), 311 (3.27, sh), 327 (3.07, sh), 335 nm (2.83, sh).
MS (El.70 eV): m/e (%)= 422 (2, M+), 407 (2), 375 (3), 359 (3), 279 (100), 180 (10).
MS (hochaufqelöst. M+): ber. 422.1334 gef. 422.1324
Figure imgf000012_0001
Tabelle 1: NMR-spektroskopische Daten (CDCI3, TMS als interner Standard)
# δ(C) δ(H) M J[Hz]
1 167.7
2 91.1 4.96 s
3 176.8
4 39.9 4.16 dq 6.9, 7.8
5 84.4 3.80 t 7.8
6 131.4 6.34 dd 15.7,7.8
7 125.6 6.52 d 15.7
8 153.8
9 114.7 7.00 s
10 171.2
11 78.2 5.93 dd 7.3, 8.8
12A 38.8 3.66 dd 11.2,7.3
12 B 3.82 dd 11.2,8.8
13 172.8
14 139.4
15 E 124.2 5.70 s, br
15Z 5.60 s, br
4-CH3 14.1 1.20 d 6.9
14-CHg 20.0 2.14 s, br
I-OCH3 50.8 3.66 s
3-OCH3 55.6 3.60 s
5-OCH3 57.0 3.32 s 2. Physikalische Eigenschaften von Melithiazol B hellgelbes Öl
Summenformel C20H22N2O4S2 MG 420.54
DC: Aluminiumfolien mit Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.2 mm, Merck-Art. 5554
Detektion mit Vanillin/Schwefelsäure-Sprühreagenz (—> Gelbfärbung) und
Erhitzen auf 120°C (→ Braunfärbung)
Laufmittel: Dichlormethan/Aceton 90:10, v/v
HPLC: Säule: 6 4mm; C= 250mm; Material: Nucleosil 18-100-7; Fluß: 1.5 ml/min; Laufmittel: Methanol/Wasser 75:25 Ri 11.6 min
1H-NMR (CDCL 300 MHz): siehe Tabelle 2 UV (Acetonitril): λmax= 235, 307 nm.
MS (El. 70 eV): m/e (%)= 420 (3, M+), 405 (3), 373 (3), 357 (4), 277 (100).
MS (hochaufqelöst. M+): ber. 420.1178 gef. 420.1187
Figure imgf000014_0001
Tabelle 2: NMR-spektroskopische Daten (CDCI3, TMS als interner Standard)
# δ (H) M J [Hz]
1
2 4.97 s
3
4 4.18 dq 6.9, 7.6
5 3.82 t 7.6
6 6.42 dd 15.7, 7.6
7 6.58 d 15.7
8
9 7.10 s
10
1 1
12 7.89 s
13
14
15E,Z 5.36 s, br
5.92 s, br
4-CH3 1.22 d 6.9
14-CH3 2.28 s, br
I -OCH3 3.67 s
3-OCH3 3.61 s
5-OCH3 3.34 s
ERSATZBLAπ (REGEL 26)

Claims

Patentansprüche
1. Melithiazol der Formel
Figure imgf000015_0001
2. Melithiazol der Formel
C02Me
Figure imgf000015_0002
3. Melithiazol, dadurch gewinnbar, daß man
(a) Melittangium lichenicola DSM 9004 in einem Kohlenstoff¬ quellen, Stickstoffquel len, Vitamin B12 und Mineralsalze enthaltenden Medium aerob in Gegenwart eines Adsorber- harzes kultiviert,
(b) das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit einem Methanol/Aceton-Germseh eluiert,
(c) das Eluat bis zum Auftreten einer Wasserphase einengt und die Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert,
(d) den Extrakt trocknet und das Extraktlonsrrπttel im Vakuum entfernt,
(e) den Ruckstand in Ethylacetat aufnimmt und mit einer wä߬ rigen NaHCθ3-Losung wascht,
(f) die organische Phase abtrennt, trocknet und im Vakuum einengt,
(g) den Ruckstand an einer RP-18 Kieselgelsaule mit einem Methanol/Wasser-Germseh als Laufmittel chromatographiert und eine Melithiazol enthaltende Fraktion eluiert und das Melithiazol gegebenenfalls isoliert und/oder
(h) eine ein weiteres Melithiazol enthaltende Fraktion elu¬ iert und die Fraktion an einem RP-18 Kieselgel mit einem Methanol/Wasser-Gemisch als Laufmittel chromatographiert und das Melithiazol gegebenenfalls isoliert.
4. Melithiazol nach Anspruch 3, dadurch gewinnbar, daß man bei den Stufen (g) und/oder (h) gemäß Anspruch 3 chromatogra¬ phiert.
5. Melithiazol der Summenformel C20H26 N2θ4S2 und gekennzeichnet durch folgende starke Banden:
IR (KBr) ny = 2.931, 1.711, 1.624, 1.150 cm" ■
UV (Acetomtπ 1 ) lambdamax (log epsilon) = 227 (4,47) nm
6. Melithiazol der Summenformel C20H24N2O4S2 und gekennzeichnet durch folgendes Spektrum:
UV (Acetomtπ 1) lambda-t-ax (log epsilon) = 235, 307 nm
7. Verfahren zur Herstellung von Melithiazol, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß man
(a) Melittangium lichenicola DSM 9004 in einem Kohlenstoff¬ quellen, Stickstoffquellen, Vitamin B12 und Mineralsalze enthaltenden Medium aerob in Gegenwart eines Adsorber- harzes kultiviert,
(b) das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit einem Methanol/Acetaon-Germseh e1uiert,
(c) das Eluat bis zum Auftreten einer Wasserpahse einengt und die Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert,
(d) den Extrakt trocknet und das Extraktionsmittel im Vakuum entfernt,
(e) den Ruckstand in Ethylacetat aufnimmt und mit einer wä߬ rigen NaHCθ3-Losung wascht,
(f) die organische Phase abtrennt, trocknet und im Vakuum einengt,
(g) den Ruckstand an einer RP-18 Kieselgelsaule mit einem Methanol/Wasser-Germseh als Laufmittel chromatographiert und eine Melithiazol enthaltende Fraktion eluiert und das Melithiazol gegebenenfalls isoliert und/oder
(h) eine ein weiteres Melithiazol enthaltende Fraktion eluiert und die Fraktion an einem RP-18 Kieselgel mit einem Metha¬ nol/Wasser-Germseh als Laufmittel chromatographiert und das Melithiazol gegebenen alls isoliert.
8. Mittel mit einem Gehalt an Melithiazol gemäß einem der vor¬ hergehenden Ansprüche 1 bis 6 zur Wachstums!nhibierung von Hefen und/oder Pilzen neben einem üblichen Trager und/oder Verdünnungsmittel .
9. Melittangium lichenicola DSM 9004 oder davon abgeleiteter Stamm mit der Fähigkeit, Melithiazol gemäß einem der An¬ sprüche 1 bis 6 zu bilden.
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