UA127515C2 - Антитіло до всма, біспецифічна антигензв'язувальна молекула, що зв'язує всма і cd3, і їх використання - Google Patents

Антитіло до всма, біспецифічна антигензв'язувальна молекула, що зв'язує всма і cd3, і їх використання Download PDF

Info

Publication number
UA127515C2
UA127515C2 UAA201802674A UAA201802674A UA127515C2 UA 127515 C2 UA127515 C2 UA 127515C2 UA A201802674 A UAA201802674 A UA A201802674A UA A201802674 A UAA201802674 A UA A201802674A UA 127515 C2 UA127515 C2 UA 127515C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
vsma
antigen
binding fragment
cells
Prior art date
Application number
UAA201802674A
Other languages
English (en)
Inventor
Кодандарам Пілларісетті
Кодандарам Пилларисетти
Ерік Томас Болдуін
Эрик Томас Болдуин
Ґордон Д. Пауерс
Гордон Д. Пауерс
Роза Марія Фернандес Кардозу
Роза Мария Фернандес Кардозу
Рікардо Атар
Рикардо Атар
Франсуа Ґоде
Франсуа Годэ
Original Assignee
Янссен Байотек, Інк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек, Інк. filed Critical Янссен Байотек, Інк.
Publication of UA127515C2 publication Critical patent/UA127515C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Description

ВСМА, і, таким чином, чи може він відповідати на лікування специфічними до ВСМА протираковими лікарськими засобами, такими як мультиспецифічні антитіла до ВСМА і СОЗ.
Ця заявка заявляє про встановлення переваги попередньої заявки на патент США серійний
Мо 62/206,246, поданої 17 серпня 2015 р., яку в повному обсязі включено в цей документ шляхом посилання.
Перелік послідовностей
Ця заявка містить перелік послідовностей, який було подано в електронному вигляді у форматі АЗСІЇ, і який у повному обсязі включено в цей документ шляхом посилання. Вказана копія АЗСІЇ, створена 15 серпня 2016 р., має назву РКОЗЗ38ЗО5МР 5І Хі має розмір 87 341 байтів.
Галузь техніки, до якої належить винахід
Винахід, що пропонується в цьому документі, стосується моноклональних антитіл, які імуноспецифічно зв'язуються з антигеном дозрівання В-клітин (ВСМА), мультиспецифічних антитіл, які імуноспецифічно зв'язуються з ВСМА і кластерною детермінантою З (СО3), і способів отримання й використання описаних антитіл.
Рівень техніки
Антиген дозрівання В-клітин, також відомий як ВСМА, С0О269, ТМЕКЗЕ17 (піРгої 002223), є представником надродини рецептора некрозу пухлин, який переважно експресується в диференційованих плазматичних клітинах | аарбі єї а. (1992) ЕМВО у 11(11):3897 -3904; Маагу єї ам. (1998) Ійї Іттипої 10(11):11693-1702) ВСМА являє собою неглікозильований трансмембранний білок типу І, який задіяний у дозріванні, рості й виживанні В-клітин. ВСМА являє собою рецептор для двох лігандів надродини ТМЕ: АРКІЇ (ліганд, що індукує проліферацію, СО256, ТМЕЗЕ13), ліганд із високою афінністю до ВСМА ії фактора активації В- клітин ВАРЕ (ТНАМК, ВІуУ5, стимулятор В-лімфоцитів, ТАЇЇ-1 і 7ТМЕ4), ліганд із низькою афінністю до ВСМА. АРКІЇ і ВАРЕ демонструють структурну подібність і специфічність зв'язування з рецептором, яка перекривається, але все ж є відмінною. Негативний регулятор
ТАСІ також зв'язується як із ВАКЕЕ, так ї з АРКІЇ. Координоване зв'язування АРКІГ/. і ВАЕЕ із
ВСМА і/або ТАСІ активує фактор транскрипції МЕ-КкВ і збільшує експресію представників родини
Всі!-2, які сприяють виживанню (наприклад, Всі-2, Всі-х!, Всі-м, Мсе!-1, АТ) і пригнічує експресію проапоптозних факторів (наприклад, Віа, Вайд, ВІК, Віт тощо), таким чином інгібуючи апоптоз і сприяючи виживанню. Ця комбінована дія сприяє диференціації, проліферації, виживанню В-
Зо клітин і утворенню антитіл (як розглянуто в огляді Кіскегі КС еї аї., Іттипої! Кем (2011) 244 (1): 115-133). Відповідно до цих даних, ВСМА також підтримує ріст і виживання злоякісних В-клітин людини, включно з клітинами множинної мієломи (ММ). Момак еї аїЇ. виявили, що клітинні лінії
ММ і свіжовиділені клітини ММ на клітинних поверхнях експресують ВСМА і білок ТАСІ, і мають варіабельну експресію білка ВАРЕ-К на своїй клітинній поверхні (Момак еї аї., (2004) Віоса 103(2):689-694).
Множинна мієлома (ММ) є другим із найбільш поширених злоякісних гематологічних новоутворень і становить 2 95 усіх випадків смерті від раку. ММ є гетерогенним захворюванням, яке переважно викликають хромосомні транслокації, зокрема, К11; 14) 4; 14) (8:14) деК13),деК17) (Огаси еї аї., (1998) Віосй 92(3):802-809; Сеп єї аї., (2005) Віоса 106(8):2837-2840; Расоп еї аї., (2001) Віооа 97(6): 1566-1571). Пацієнти, уражені ММ, можуть мати різноманітні симптоми, пов'язані з захворюванням, через інфільтрацію кісткового мозку, руйнування кісток, ниркову недостатність, імунодефіцит і психосоціальне навантаження діагнозу «рак». Станом на 2006 р. показник відносного 5-річного виживання з діагнозом ММ становив приблизно 34 95, що підкреслює той факт, що ММ є захворюванням, яке важко піддається лікуванню, і для якого наразі відсутні можливості повного зцілення.
Використання антитіл до ВСМА для лікування лімфом і множинної мієломи згадано у
УО2002066516 і УМО2010104949. Антитіла до ВСМА описані, наприклад, у Сга5 М-Р. еї аї. Іпі
Ітітипої. 7 (1995) 1093-1106, МУМО200124811 ії М/О200124812. Однак незважаючи на існування лікарських засобів для боротьби з раком, націлених на ВСМА, ВАРЕР-ЕК і ТАСІ, тобто рецептори
В-клітин, що належать до надродини рецепторів ТМЕ, і їхні ліганди ВАЕЕ і АРКІЇ, усе ще залишається потреба в додаткових можливостях для лікування таких медичних станів.
Суть винаходу
У цьому винаході пропонуються антитіла, які імуноспецифічно зв'язуються з ВСМА, і їхні антигензв'язувальні фрагменти. Також описано споріднені полінуклеотиди, здатні кодувати запропоновані ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти, клітини, які експресують запропоновані антитіла й антигензв'язувальні фрагменти, а також пов'язані вектори й мічені з можливістю визначення антитіла й антигензв'язувальні фрагменти. Крім того, описано способи використання запропонованих антитіл і антигензв'язувальних фрагментів.
Наприклад, ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти можна 60 використовувати для діагностики або спостереження за прогресуванням, регресом або стабільністю раку, що експресує ВСМА; для визначення необхідності лікування раку в пацієнта; або для визначення того, чи має суб'єкт рак, що експресує ВСМА, і, таким чином, чи може він відповідати на лікування специфічними до ВСМА протираковими лікарськими засобами, такими як мультиспецифічні антитіла до ВСМА і СОЗ, описані в цьому документі.
У цьому винаході додатково пропонуються мультиспецифічні антитіла, які імуноспецифічно зв'язуються з ВСМА і СОЗ, і їхні мультиспецифічні антигензв'язувальні фрагменти. Також описано споріднені полінуклеотиди, здатні кодувати запропоновані мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЮЗ, клітини, які експресують запропоновані антитіла, а також пов'язані вектори й мічені з можливістю визначення мультиспецифічні антитіла. Крім того, описано способи використання запропонованих мультиспецифічних антитіл. Наприклад, мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ можна використовувати для діагностики або спостереження за прогресуванням, регресом або стабільністю раку, що експресує ВСМА; для визначення необхідності лікування раку в пацієнта; або для визначення того, чи має суб'єкт рак, що експресує ВСМА, і, таким чином, чи може він відповідати на лікування специфічними до ВСМА протираковими лікарськими засобами, такими як мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ, описані в цьому документі.
ВСМА-специфічні антитіла
У цьому документі описано рекомбінантні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти, специфічні до ВСМА. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з ВСМА людини. У деяких варіантах втілення
ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з ВСМА людини і
ВСМА яванського макака. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з епітопом, який включає в себе один або більше залишків із позаклітинного домену (ЕСО) ВСМА. Це ВСМА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може блокувати зв'язування з АРКІГ!. із показником ІСво, який за результатами аналізу ЕГІЗА становить принаймні 5,9 нМ.
У таблиці 1 наведено короткий перелік прикладів деяких ВСМА-специфічних антитіл, описаних у цьому документі.
Таблиця 1
Послідовності СОК тАб, створених проти ВСМА людини (ЗЕО ІО МО для кожної переліченої послідовності наведено в дужках)
Іденти- завугма!| 5БІМУБа!ТМ | НОСАМА | сСаММІаЗКеМ| ВОБОВРБ5 УМО восМв69 (4) УМРБІ КБ аг гру Н (25) ЗзБОНУМ 5 б 24 26 завугма!| 5БІМУБа!ТМ | НОСАМА | сСаММІаЗКеМ| ВОБОВРБ5 УМО
ВСМВ117 (4) УМРБІ КБ аг гру Н (25) ЗзБОНУМ 5 б 24 26 зо55УУУМОа| 5ІМУБИІТМ | НОСАМА | даМмМмІшеКкеМ| рОБОВРБ5 УМО восМВв123 (7) УМРБІ КБ аг гру Н (25) ЗзБОНУМ 5 б 24 26 завугма!| 5БІМУБа!ТМ | НОСАТА | сСаММІа5КеМ| ВОБОВРБ5 УМО восмМв128 (4) УМРБІ КБ аг гру Н (25) ЗзБОНУМ 5 19 24 26 завугма | 5іІМУБавзтм| НОСАМА | СаММІаЗКеМ| ВОБОВРБ5 УМО воМв129 (4) УМРБІ КБ аг гру Н (25) ЗзБОНУМ 8 б 24 26
Зз55УБМУС | 5ІМУБаІТМ | НОСАТА | ССаММІОКОМ| 0ОБОВРБО УМО всМВ176 (13) УМРБІ КБ аг гру Н (25) ЗзБОНУМ 5 19 24 26 з55УЕМа | БІМУБавГУ| НОСАТА | аССММІОКОМ| 0ОБОВРБО УМО
ВСМВ177 (13) УМРБІ КБ аг гру Н (25) ЗзБОНУМ 8 19 24 26
У деяких варіантах втілення запропоновано ВСМА-специфічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить важкий ланцюг, який містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ будь-якого з антитіл, представлених у таблиці 1. У деяких варіантах втілення запропоновано
ВСМА-специфічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить важкий ланцюг, який містить СОКІ, СОМК2 ії СОКЗ будь-якого з антитіл, представлених у таблиці 1, і легкий ланцюг, який містить СОК1І, СОМК2 і СОРЗ будь-якого з антитіл, представлених у таблиці 1.
У людей клас до ділиться на чотири ізотипи: Ідс1, Ідс2, дез і Іу04. Вони мають більше ніж 95 95 гомології амінокислотних послідовностей Ес-областей, але демонструють суттєві відмінності складу амінокислот і структури шарнірної ділянки. Ес-область опосередковує ефекторні функції, такі як антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АЗКЦ) (д комплементзалежна цитотоксичність (КЗЦ). Під час АЗКЦ Ес-область антитіла зв'язується з Ес- рецепторами (ЕсоК) на поверхні імунних ефекторних клітин, таких як натуральні кілери й макрофаги, що призводить до фагоцитозу або лізису клітин-мішеней. Під час КЗЦ антитіла знищують клітини-мішені, запускаючи на клітинній поверхні каскад комплементу. Антитіла, описані в цьому документі, включають антитіла з описаними характеристиками варіабельних доменів у комбінації з будь-яким з ізотипів (дб, включаючи модифіковані варіанти, в яких послідовність Ес була модифікована для виконання різних ефекторних функцій.
У багатьох видах застосувань терапевтичних антитіл Ес-опосередковані ефекторні функції не є частиною механізму дії. Ці Ес-опосередковані ефекторні функції можуть бути шкідливими й потенційно становлять ризик небезпеки, викликаючи токсичність, не пов'язану з механізмом дії.
Модифікації ефекторних функцій можна досягти за допомогою конструювання Ес-областей для зменшення їхнього зв'язування з ЕсуК або факторами комплементу. Зв'язування Ід з активуючими (ЕсоКІ, ЕсоКіІйа, ЕсокКІШа і Есо ШІ) і інгібуючими (ЕсоКІІБ) ЕсоК або першим компонентом комплементу (С1д) залежить від залишків, розташованих у шарнірній ділянці й домені СН2. У Ідс1, Ідс2 і Ід54 були введені мутації для зниження або сайленсингу функціональних властивостей Ес. Антитіла, описані в цьому документі, можуть містити такі модифікації.
В одному варіанті втілення антитіло містить Ес-область, яка має одну або більше з наступних властивостей: (а) знижену ефекторну функцію порівняно з батьківською Ес; (б) знижену афінність до Ес КІ, Есуд КПа, Есду КБ, Есуд КП і/або Есд «Ша; (с) знижену афінність до
Зо ЕсокіІ; (а) знижену афінність до Есо9КІПа; (е) знижену афінність до ЕсомІІбр; (ї) знижену афінність до Есо ЕШЬ або (9) знижену афінність до Есдк Па.
У деяких варіантах втілення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти являють собою
ІцО або його похідні, наприклад ізотипи ІдС1, Ідс2, доз і Ідс4. У деяких варіантах втілення, де антитіло має ізотип Ідсес4, це антитіло містить у своїй Ес-області заміщення К4А09К, 5228Р,
І 234А і І1235А. Антитіла, описані в цьому документі, можуть містити такі модифікації.
У деяких варіантах втілення описані антитіла здатні інгібувати зв'язування АРРБІЇ з показником ІСво, який за результатами аналізу ЕГІЗА становить 5,9 НМ.
У деяких варіантах втілення описані антитіла зв'язується з ВСМА-позитивними клітинними лініями множинної мієломи.
Крім описаних ВСМА-специфічних антитіл і антигензв'язувальних фрагментів, також пропонуються полінуклеотидні послідовності, здатні кодувати описані антитіла й антигензв'язувальні фрагменти. У цьому винаході пропонуються вектори, які містять описані полінуклеотиди, а також клітини, які експресують ВСМА-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, що пропонуються в цьому винаході. Також описано клітини, здатні експресувати описані вектори. Ці клітини можуть бути клітинами ссавців (такими як клітини 293Е, клітини СНО), клітинами комах (такими як клітини 517), дріжджовими клітинами, рослинними клітинами або клітинами бактерій (таких як Е. соїї). Описані антитіла можна також отримати за допомогою гібридомних клітин.
Способи використання ВСМА-специфічних антитіл
Також розкрито способи використання описаних ВСМА-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів. Конкретні антитіла для використання в способах, описаних у цьому розділі, включають антитіла з набором СОЕ, описаним для антитіл, наведених у таблиці 1. Наприклад, ці антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можна використовувати для лікування раку шляхом втручання у взаємодії ВСМА-рецептора або у випадках, де антитіло є кон'югованим із токсином, шляхом націлювання токсину на рак, що експресує ВСМА. Крім того, ці антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можна використовувати для виявлення наявності ВСМА у біологічному зразку, такому як кров або сироватка; для визначення кількості
ВСМА у біологічному зразку, такому як кров або сироватка; для діагностики раку, що експресує
ВСМА; для визначення способу лікування суб'єкта, хворого на рак; або для спостереження у бо суб'єкта за прогресуванням раку, що експресує ВСМА. У деяких варіантах втілення рак, що експресує ВСМА, може являти собою лімфому, таку як множинна мієлома (ММ). Описані способи можна здійснювати перед тим, як суб'єкт отримає лікування з приводу раку, що експресує ВСМА, наприклад лікування мультиспецифічним антитілом до ВСМА їі СОЗ. Крім того, описані способи можна здійснювати після того, як суб'єкт отримає лікування з приводу раку, що експресує ВСМА, наприклад лікування мультиспецифічним антитілом до ВСМА і СОЗ, описаним у цьому документі.
Описані способи виявлення ВСМА у біологічному зразку включають піддавання біологічного зразка впливу одного або більше ВСМА-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі.
Описані способи діагностування у суб'єкта раку, що експресує ВСМА, також включають піддавання біологічного зразка впливу одного або більше ВСМА-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі; однак способи також включають визначення кількості ВСМА, присутньої в зразку; порівняння кількості ВСМА, присутньої в зразку, з відомим стандартним або еталонним зразком; і визначення того, чи попадають рівні
ВСМА суб'єкта в діапазон рівнів ВСМА, пов'язаний із раком.
Також у цьому документі описано способи спостереження за раком, що експресує ВСМА, у суб'єкта. Описані способи включають піддавання біологічного зразка впливу одного або більше
ВСМА-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі; визначення кількості ВСМА, присутньої в зразку, яка зв'язана з антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом; порівняння кількості ВСМА, присутньої в зразку, з відомим стандартним або еталонним зразком або з кількістю ВСМА в аналогічному зразку, отриманому у суб'єкта раніше; і визначення на основі різниці рівнів ВСМА у зразках, що порівнюються, чи свідчать рівні ВСМА у суб'єкта про прогресування, регресом раку або стабільність захворювання.
Одержані у суб'єкта зразки являють собою біологічні зразки, такі як сеча, кров, сироватка, плазма, слина, асцитна рідина, циркулюючі клітини, циркулюючі пухлинні клітини, клітини, не пов'язані з тканинами, тканини, хірургічно видалена пухлинна тканина, біоптати, зразки тонкогольчатої аспіраційної біопсії або гістологічні препарати.
Для використання в описаних способах або в інших способах, відомих фахівцям у цій галузі,
Зо можна виконувати мічення описаних ВСМА-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів. Наприклад, антитіла, описані в цьому документі, або їхні антигензв'язувальні фрагменти можуть бути мічені радіоактивною міткою, флуоресцентною міткою, епітопною міткою, біотином, хромофорною міткою, електрохемілюмінесцентною міткою (ЕХЛ), ферментом, рутенієм, ""Пи-ДОТА, ПППІп-діетилентриамінпентаоцтовою кислотою (ДТПК), пероксидазою хрону, лужною фосфатазою й бета-галактозидазою, полігістидином або аналогічними мітками, відомими в цій галузі.
Набори ВСМА-специфічних антитіл
У цьому документі описано набори, які містять описані ВСМА-специфічні антитіла або їхні антигензв'язувальні фрагменти. Описані набори можна використовувати для здійснення способів використання ВСМА-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, які пропонуються в цьому винаході, або інших способів, відомих фахівцям у цій галузі. У деяких варіантах втілення описані набори можуть містити антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі, і реагенти для використання у виявленні в біологічному зразку наявності ВСМА. Відповідно, описані набори можуть включати одне або більше антитіл або їхніх антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі, і посудину, в якій міститься антитіло або фрагмент, коли його не використовують, інструкції з використання антитіла або фрагмента, антитіло або фрагмент, прикріплений до твердого носія, і/або мічені з можливістю визначення форми антитіла або фрагмента, як описано в цьому документі.
Мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ
Привабливий альтернативний підхід полягає у перенаправленні Т-лімфоцитів до клітин ММ, що експресують ВСМА, за допомогою комплексу ТСК/СО3. Комплекс Т-лімфоцитів ТСК/СОЗ складається або з гетеродимера ТСК-альфа (с)/бета (В), або ТСЕК-гамма (у)/дельта (б), який експресується на клітинній поверхні разом із незмінними субодиницями СОЗ, позначеними як гамма (у), дельта (б), епсилон (є), дзета (С) і ета (п). СОЗє людини описаний у базі даних ОпіРгої під номером доступу РО7766 (СОЗЕ НОМАМ). Антитіло до СЮОЗєЄ, описане на існуючому рівні техніки в цій галузі, являє собою 5Р34 (уапд 59, Те дошгпа! ої ІттипоїЇоду (1986) 137; 1097- 1100). 5РЗ34 реагує з СОЗ як приматів, так і людини. 5РЗ4 є доступним від компанії Рпагтіпдеп.
Додаткове антитіло до СОЗ, описане на існуючому рівні техніки в цій галузі, являє собою ОСНТ- 1 (див. МО2000041474). Додаткове антитіло до СОЗ, описане на існуючому рівні техніки в цій бо галузі, являє собою ВС-3 (ЕРтед Ниїспіпвоп Сапсег Незеагсі Іпбійше; яке використовували в дослідженнях реакції «трансплантат проти хазяїна» (ТПХ) фази ЛІ, описаних у Апазейі еї аї.,
Тгапоріапіайоп 54: 844 (1992)). 5РЗ4 відрізняється від ОСНТ-1 ії ВС-3 тим, що 5Р-34 розпізнає епітоп, присутній лише на є-ланцюгу СОЗ (див. ЗаІ/тегоп еї а!., (1991) 9. Іттипої. 147: 3047), тоді як ОСНТ-1 і ВС-3 розпізнають епітоп, у якому приймають участь обидва ланцюги: є і у.
Послідовність антитіла з такою ж послідовністю, як у антитіла 5Р34, описано у ММО2008119565,
МО2008119566, УМО2008119567, УМО2010037836, УУО2010037837 ії УУМО2010037838.
Послідовність, яка на 96 95 ідентична варіабельному домену важкого ланцюга (МН) антитіла
ЗРЗ4, описано в 58236308 (ММО2007042261).
Різні біспецифічні антитіла проти СОЗ ії ВСМА описані у ММО2007117600, УО2009132058,
УМО2012066058, УМО2012143498, УМО2013072406, УМО2013072415 ії УМО2014122144.. Однак наразі відсутні дані, що описують прогресування до використання в клінічній практиці.
У цьому документі описано рекомбінантні мультиспецифічні антитіла, які зв'язуються з
ВСМА ї СОЗ («мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СО3»), і їхні мультиспецифічні антигензв'язувальні фрагменти. У деяких варіантах втілення пропонується рекомбінантне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які імуноспецифічно зв'язуються з ВСМА.
У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічне плече мультиспецифічного антитіла зв'язується з ВСМА людини й ВСМА яванського макака. У деяких варіантах втілення ВСМА- специфічне плече мультиспецифічних антитіл до ВСМА х СОЗ або антигензв'язувальних фрагментів зв'язується з позаклітинним доменом ВСМА людини. У переважних варіантах втілення мультиспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або антигензв'язувальний фрагмент являє собою біспецифічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент. У деяких варіантах втілення пропонується рекомбінантне біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ, яке містить: а) перший важкий ланцюг (НС1); Б) другий важкий ланцюг (НС2); с) перший легкий ланцюг (ІС1); і а) другий легкий ланцюг (102), де НС1 і 1С1 спарюються з утворенням першого антигензв'язувального сайту, який імуноспецифічно зв'язується з ВСМА, а НС2 і 1 с2 спарюються з утворенням другого антигензв'язувального сайту, який імуноспецифічно зв'язується з СОЮЗ; або його біспецифічний зв'язувальний фрагмент, що зв'язується з ВСМА х
СО3. В іншому варіанті втілення пропонується рекомбінантна клітина, яка експресує антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент. У деяких варіантах втілення ВСМА-зв'язувальне
Зо плече (або «ВСМА-специфічне плече») мультиспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ3 отримують з антитіла до ВСМА, описаного в цьому документі (наприклад з антитіла, що має послідовності СОК, перераховані в таблиці 1).
У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічне плече мультиспецифічних антитіл до ВСМА х СОЗ3 або антигензв'язувальні фрагменти являють собою ІдсС або його похідні. У деяких варіантах втілення описані мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ, здатні зв'язуватися з
ВСМА із константою дисоціації принаймні 0,18 нМ, як визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. У деяких варіантах втілення описане мультиспецифічне антитіло до
ВСМА х СОЗ не є агоністичним. У деяких варіантах втілення описане мультиспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ у концентраціях до 10 нМ не впливає на активацію МЕ-кВ.
У деяких варіантах втілення СОЗ-зв'язувальне плече (або «СОЗ-специфічне плече») мультиспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ отримують із мишачого моноклонального антитіла 5РЗ34, мишачого ізотипу І(дсЗ/лямбда. (К.К. Абпіпапдап апа А. С. Магійп, 2008. МОЇ.
ІтітипоЇ. 45, 3832-3839). У деяких варіантах втілення СОЗ-зв'язувальне плече мультиспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ містить один важкий ланцюг і один легкий ланцюг, вибрані з таблиці 2.
Таблиця 2
Важкі ланцюги й легкі ланцюги СОЗ-специфічних антитіл і антигензв'язувальних Фрагментів.
ЕМО МЕЗО ВСІ МОРОСБІ ВІ БСААБСЕТЕМТУАМ ОТУММТОЕРБІ ТМ5РОСТМТІ ТСА5ЗТОАМТТЗМУА
МУМУУВОАРОаКагЕММАВІВЗКУММУАТУУААБУКОа МУМУМООКРООСОАРВС ІС ТМКААРСТРАВЕЗОИаБІ
ВЕТІБАВОБЗКМБЗІ МІ ОММ5ЗІ КТЕОТАМУУСАВНО СОКААГ ТІ ЗаМОРЕОЕАЕМУСАЇ М/УЗМІ МБ,
МЕеЕаМЗУУБУ РАМ ОСТІ МТМ5БАБТКОРОМЕР ТКІТМІ ООРКААРЗМТІ ЕРРЗЗЕЕЇ ОАМКАТІ МС І
ГАРСЗА5ЗТЗЕБЗТААГ ЯСІ МКОМЕРЕРУТУБУ МИ ЗОЕУРЕАМТМАМКАОЗЗРУКАСМЕТТТРУКОБМ
АЇ ТОУНТЕРАМІ О5БИЇ У5І 55УМТУРЗВЗБІИТК МКУААБЗМІ БІ ТРЕОМУКЗНАЗУЗСОУТНЕСЗТМУ
ТУТСММОНКРОЬМТКУМОКАМЕЗКУСРРОРРОРАР ЕКТУАРТЕС5
ЕААССОРОМРБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМУТСМУММОМ
ЗОБОРЕМОЕМУ УМОСМЕМНМАКТКРАЕЄОЕМ5
ТУАММБМІ ТМ НОБУЛ МОКЕУКСКУМКаїЇ РУБ
ІЕКТІЗКАКСООРАЕРОМУТІ РРЗОБЕМТКМОМ5І.
ТСГУКагуРБВІАМЕМЕЗМСОСОРЕММУКТТРРМ гора І УЗКІТМОК5АМОБамМмМЕЗо5УМН
ЕАЇНМНУТОКБІ 5І Гак
У людей клас до ділиться на чотири ізотипи: ІДС, Ідс2, ІдЗ і (у054. Вони мають більше ніж 95 95 гомології амінокислотних послідовностей Ес-областей, але демонструють суттєві відмінності складу амінокислот і структури шарнірної ділянки. Ес-область опосередковує ефекторні функції, такі як антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АЗКЦ) (і комплементзалежна цитотоксичність (КЗЦ). Під час АЗКЦ Ес-область антитіла зв'язується з Ес- рецепторами (ЕсоК) на поверхні імунних ефекторних клітин, таких як натуральні кілери й макрофаги, що призводить до фагоцитозу або лізису клітин-мішеней. Під час КЗЦ антитіла знищують клітини-мішені, запускаючи на клітинній поверхні каскад комплементу.
У багатьох видах застосувань терапевтичних антитіл Ес-опосередковані ефекторні функції не є частиною механізму дії. Ці Ес-опосередковані ефекторні функції можуть бути шкідливими й потенційно становлять ризик небезпеки, викликаючи токсичність, не пов'язану з механізмом дії.
Модифікації ефекторних функцій можна досягти за допомогою конструювання Ес-областей для зменшення їхнього зв'язування з ЕсодК або факторами комплементу. Зв'язування ІдсС «яз активуючими (ЕсоКІ, ЕсоКіІйа, ЕсокКШа і Есо ШІ) і інгібуючими (ЕСОКІІБ) Рсд або першим компонентом комплементу (С1д) залежить від залишків, розташованих у шарнірній ділянці й домені СН2. У Ідс1, Ідс2 і Ідб4 були введені мутації для зниження або сайленсингу функціональних властивостей Ес.
В одному варіанті втілення антитіло містить Ес-область, яка має одну або більше з наступних властивостей: (а) знижену ефекторну функцію порівняно з батьківською Ес; (Б) знижену афінність до Ес КІ, Есуд КІа, Есо ВІВ, Есуд КПЬ і/або Есд Ша; (с) знижену афінність до
ЕсСОКІ; (4) знижену афінність до ЕсоКІІа; (є) знижену афінність до ЕСОКІБ; (Ї) знижену афінність до Есо ЕШЬ або (9) знижену афінність до Есдк Па.
У деяких варіантах втілення СОЗ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, з якого отримано СЮОЗ-специфічне плече мультиспецифічного антитіла, являє собою до або його похідне. У деяких варіантах втілення СОЗ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, з якого отримано СОЗ-специфічне плече мультиспецифічного антитіла, являє собою 901 або його похідне. Наприклад, у деяких варіантах втілення Ес-область СЮОЗ-специфічного
Зо антитіла ІДС1, з якого отримано СОЗ-зв'язувальне плече, містить у своїй Ес-області заміщення
Ї234А, І235А і Б405І. У деяких варіантах втілення СОЗ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, з якого отримано СОЗ-специфічне плече мультиспецифічного антитіла, являє собою ІдсС4 або його похідне. Наприклад, у деяких варіантах втілення Ес- область СОЗ-специфічного антитіла Ідс4, з якого отримано СОЗ-зв'язувальне плече, містить у своїй Ес-області заміщення 5228Р, І 234А, 1235А, Е405І і К409К. У деяких варіантах втілення
СОЗ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, з якого отримано СО3- специфічне плече мультиспецифічного антитіла, зв'язується з СЮОЗЄ на первинних Т-клітинах людини й/або первинних Т-клітинах яванського макака. У деяких варіантах втілення СОЗ3- специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, з якого отримано СОЗ-специфічне плече мультиспецифічного антитіла, активує первинні Т-клітини СО4-- людини й/або первинні Т- клітини СО4-- яванського макака.
Крім описаних мультиспецифічних антитіл до ВСМА х СОЗ також пропонуються полінуклеотидні послідовності, здатні кодувати описані мультиспецифічні антитіла до ВСМА х
СО3. У деяких варіантах втілення пропонується виділений синтетичний полінуклеотид, який кодує НС1, НС2, І С1 або І С2 біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента. У цьому винаході також пропонуються вектори, які містять описані полінуклеотиди, а також клітини, які експресують мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ3.
Також описано клітини, здатні експресувати описані вектори. Ці клітини можуть бути клітинами ссавців (такими як клітини 293Е, клітини СНО), клітинами комах (такими як клітини 517), дріжджовими клітинами, рослинними клітинами або клітинами бактерій (таких як Е. соїї). Описані антитіла можна також отримати за допомогою гібридомних клітин. У деяких варіантах втілення пропонуються способи отримання біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента шляхом культивування клітин.
У цьому винаході додатково пропонуються фармацевтичні композиції, які містять мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ або антигензв'язувальні фрагменти, і фармацевтично прийнятний носій.
Способи використання мультиспецифічних антитіл до ВСМА х СОЗ
Також розкрито способи використання описаних мультиспецифічних антитіл до ВСМА х СОЗ і їхніх мультиспецифічних антигензв'язувальних фрагментів. Наприклад, мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ і їхні мультиспецифічні антигензв'язувальні фрагменти можна застосовувати для лікування раку, що експресує ВСМА, у суб'єкта, який цього потребує. У деяких варіантах втілення рак, що експресує ВСМА, являє собою лімфому, таку як множинна мієлома.
Описані способи лікування раку, що експресує ВСМА, у суб'єкта, який цього потребує, включають введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості описаного мультиспецифічного антитіла до ВСМА ох СОЗ або його мультиспецифічного антигензв'язувального фрагмента. У деяких варіантах втілення суб'єкт є ссавцем, переважно людиною. У переважних варіантах втілення пропонуються способи лікування суб'єкта, який має
Зо ракове захворювання, шляхом введення терапевтично ефективної кількості біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного антигензв'язувального фрагмента пацієнтові, який цього потребує, протягом часу, достатнього для лікування раку.
У цьому винаході додатково пропонуються способи інгібування росту або проліферації ракових клітин шляхом введення терапевтично ефективної кількості біспецифічного антитіла до
ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента для інгібування росту або проліферації ракових клітин.
У цьому винаході також пропонуються способи перенаправлення Т-клітини до ракової клітини, що експресує ВСМА, шляхом введення терапевтично ефективної кількості біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента для перенаправлення Т-клітини до ракового ураження.
Набори антитіл, специфічних до ВСМА х СОЗ
У цьому документі описано набори, які містять розкриті мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СО3. Описані набори можна використовувати для здійснення способів використання мультиспецифічних антитіл до ВСМА х СОЗ, які пропонуються в цьому винаході, або інших способів, відомих фахівцям у цій галузі. У деяких варіантах втілення описані набори можуть містити антитіла, описані в цьому документі, і реагенти для використання в лікуванні раку, що експресує ВСМА. Відповідно, описані набори можуть містити одне або більше мультиспецифічних антитіл або їхніх мультиспецифічних антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі, і посудину, в якій міститься антитіло або фрагмент, коли його не використовують, і/або інструкції з використання антитіла або фрагмента, антитіло або фрагмент, прикріплений до твердого носія, або мічені з можливістю визначення форми антитіла або фрагмента, описані в цьому документі.
Детальний опис ілюстративних варіантів втілення
Визначення
В описі й формулі винаходу використовуються різні терміни, які стосуються аспектів опису.
Такі терміни мають своє звичайне значення в цій галузі, якщо не вказано інше. Інші спеціально визначені терміни необхідно інтерпретувати відповідно до визначень, що передбачаються в цьому документі.
У цьому описі й у формулі винаходу форми однини включають у себе форми множини, крім випадків, коли контекст чітко вимагає іншого тлумачення. Таким чином, наприклад, посилання на «клітину» включає в себе комбінацію з двох або більше клітин тощо.
У контексті цього документа термін «приблизно», який використовується в разі посилання на вимірюване значення, таке як кількість, тривалість часу тощо, призначено для охоплення коливань до х10 95 від конкретно вказаного значення, оскільки такі коливання є придатними для реалізації описаних способів. Якщо не вказано інше, усі числа, які виражають кількості інгредієнтів, властивості, такі як молекулярна маса, умови реакції тощо, які використовуються в описі й у формулі винаходу, необхідно розуміти як модифіковані в усіх випадках терміном «приблизно». Відповідно, якщо не вказано інше, числові параметри, наведені в описі й формулі винаходу, є наближеними значеннями, які можуть змінюватися залежно від бажаних властивостей, які бажано досягти за допомогою цього винаходу. В усякому разі, без спроби обмежити застосування доктрини еквівалентів об'ємом формули винаходу, кожен числовий параметр повинен розглядатися принаймні в світлі кількості зазначених значущих цифр із застосуванням звичайних методів округлення.
Незважаючи на те що числові діапазони й параметри, що відображають широкий об'єм винаходу, є приблизними, числові значення, наведені в конкретних прикладах, зазначаються якомога точніше. Однак будь-яке числове значення неминуче містить певні помилки, які обов'язково є результатом стандартного відхилення, що виявляється у відповідних тестових вимірюваннях.
Термін «виділений» означає біологічний компонент (такий як нуклеїнова кислота, пептид або білок), який був по суті відділений, отриманий окремо від або очищений від інших біологічних компонентів організму, в якому компонент зустрічається в природі, тобто від інших хромосомних і позахромосомних ДНК і РНК і білків. Таким чином, нуклеїнові кислоти, пептиди й білки, які були «виділені», включають нуклеїнові кислоти й білки, очищені стандартними способами очищення. «Виділені» нуклеїнові кислоти, пептиди й білки можуть бути частиною композиції і все ще бути виділеними, якщо така композиція не є частиною нативного середовища нуклеїнової кислоти, пептиду або білка. Термін також охоплює нуклеїнові кислоти, пептиди й білки, отримані за допомогою рекомбінантної експресії в клітині-хазяїні, а також хімічно синтезовані нуклеїнові
Зо кислоти. У контексті цього документа «виділене» антитіло або антигензв'язувальний фрагмент означає антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, який є по суті вільним від інших антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, які мають відмінні антигенні специфічності (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з ВСМА, є по суті вільним від антитіл, які специфічно зв'язуються з іншими антигенами крім ВСМА). Однак виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом, ізоформою або різновидом ВСМА, може мати перехресну реактивність з іншими спорідненими антигенами, наприклад, отриманими від інших видів (наприклад гомологами видів ВСМА).
Термін «полінуклеотид» і його синоніми «молекула нуклеїнової кислоти», «нуклеотиди» або «нуклеїнові кислоти» відносяться до будь-якого полірибонуклеотиду або полідезоксирибонуклеотиду, який може являти собою немодифіковану РНК або ДНК або модифіковану РНК або ДНК. «Полінуклеотиди» включають, без обмеження, одно- і дволанцюгову ДНК, ДНК, яка є сумішшю одно- і дволанцюгових областей, одно- і дволанцюгову
РНК і РНК, яка є сумішшю одно- і дволанцюгових областей, гібридні молекули, що містять ДНК і
РНК, які можуть бути одноланцюговими або, більш типово, дволанцюговими або сумішшю одно- і дволанцюгових областей. Крім того, «полінуклеотид» відноситься до триланцюгових областей, які містять РНК або ДНК або РНК і ДНК. Термін «полінуклеотид» також включає ДНК або РНК, які містять одну або більше модифікованих основ, і ДНК або РНК з основними ланцюгами, які були модифіковані з міркувань стабільності або з інших причин. «Модифіковані» основи включають, наприклад, тритильовані основи й незвичайні основи, такі як інозин. У ДНК і РНК можна вносити різні модифікації; таким чином, термін «полінуклеотид» охоплює хімічно, ферментативно або метаболічно модифіковані форми полінуклеотидів, які зазвичай зустрічаються в природі, а також хімічні форми ДНК і РНК, характерні для вірусів і клітин. Термін «полінуклеотид» також охоплює відносно короткі ланцюги нуклеїнових кислот, які часто називають олігонуклеотидами.
Значення виразу «по суті однакові» може відрізнятися залежно від контексту, в якому використовується термін. Оскільки серед важких і легких ланцюгів і генів, що їх кодують, існує природна мінливість послідовності, можна було б очікувати виявлення певного рівня мінливості в межах амінокислотних послідовностей або генів, що кодують антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі, з незначним або відсутнім впливом на їхні унікальні бо властивості зв'язування (наприклад, специфічність і афінність). Таке очікування існує частково через виродженість генетичного коду, а також через еволюційний успіх варіацій консервативних амінокислотних послідовностей, які непомітно змінюють природу кодованого білка. Відповідно, в контексті послідовностей нуклеїнових кислот термін «по суті однакові» означає принаймні 65 90 ідентичності між двома або більше послідовностями. Переважно термін стосується принаймні 70 95 ідентичності між двома або більше послідовностями, більш переважно принаймні 75 95 ідентичності, більш переважно принаймні 80 95 ідентичності, більш переважно принаймні 85 905 ідентичності, більш переважно принаймні 90 95 ідентичності, більш переважно принаймні 91 95 ідентичності, більш переважно принаймні 92 95 ідентичності, більш переважно принаймні 93 95 ідентичності, більш переважно принаймні 94 95 ідентичності, більш переважно принаймні 95 95 ідентичності, більш переважно принаймні 96 95 ідентичності, більш переважно принаймні 97 95 ідентичності, більш переважно принаймні 98 95 ідентичності і більш переважно принаймні 99 95 або більше ідентичності. Відсоток ідентичності між двома послідовностями залежить від кількості ідентичних положень, загальних для послідовностей (тобто 95 гомології - кількість ідентичних положень / загальна кількість положень х 100), з урахуванням кількості гепів і довжини кожного гепу, який необхідно ввести для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток ідентичності між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями можна, наприклад, визначити з використанням алгоритму, Е. Меуегз і МУ. МіПег, описаного в публікації Сотриї. Аррі. Віозсі 4, 11-17 (1988), який був введений у програму АГІСМ (версія 2.0) з використанням таблиці «ваги» залишків РАМ120, штрафу за продовження гепу 12 і штрафу за геп 4. Крім того, відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями можна визначити з використанням алгоритму Меедіетап і УуУсп5сі, описаного в публікації У. Мої.
Віо!. 48, 444-453 (1970).
Ступінь варіації, яка може зустрічатися в амінокислотній послідовності білка без істотного впливу на функцію білка є значно нижчою, ніж у нуклеотидній послідовності, оскільки до амінокислотних послідовностей не застосовуються ті самі принципи виродженості. Відповідно, у контексті антитіла або антигензв'язувального фрагмента термін «по суті однакові» означає антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, які мають 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 905, 95 95, 96
Фо, 97 95, 98 90 або 99 95 ідентичності з описаними антитілами або антигензв'язувальними фрагментами. Інші варіанти втілення включають ВСМА-специфічні антитіла або
Зо антигензв'язувальні фрагменти, які мають каркас, кістяк або інші незв'язувальні області, які не мають значної ідентичності з антитілами й антигензв'язувальними фрагментами, описаними в цьому документі, але включають в себе одну або більше СОК або інших послідовностей, необхідних для надання зв'язування, які є на 90 95, 91 95, 92 95, 93 905, 94 95, 95 905, 96 95, 97 95, 98
Фо або 99 95 ідентичними таким послідовностям, які описано в цьому документі.
Термін «вектор» означає реплікон, такий як плазміда, фаг, косміда або вірус, в який можна функціонально ввести інший сегмент нуклеїнової кислоти так, щоб викликати реплікацію або експресію сегмента. «Клон» означає популяцію клітин, що утворилися з однієї клітини або загального попередника в результаті мітозу. «Клітинна лінія» являє собою клон первинної клітини, який здатен до стабільного росту іп мйго протягом багатьох поколінь. У деяких прикладах, що пропонуються в цьому винаході, клітини трансформують шляхом трансфекції з використанням
ДНК.
Терміни «експресує» й «продукує» використовуються в цьому описі як синоніми й відносяться до біосинтезу генного продукту. Ці терміни охоплюють транскрипцію гена в РНК. Ці терміни також охоплюють трансляцію РНК в одному або більше поліпептидах і додатково охоплюють усі природні посттранскрипційні та посттрансляційні модифікації. Експресія або продукція антитіла або його антигензв'язувального фрагмента може відбуватися в цитоплазмі клітини або в позаклітинному середовищі, наприклад у живильному середовищі для культивування клітин.
Терміни «лікувати» або «лікування» відносяться до будь-якого успіху або ознаки успіху в полегшенні ураження, патології або стану, включаючи будь-який об'єктивний або суб'єктивний показник, такий як ослаблення болю, ремісія, ослаблення симптомів або доведення ураження, патології або стану до більш прийнятного для суб'єкта рівня, що дозволяє їх легше переносити, уповільнення швидкості погіршення або прогресування дегенерації; доведення фінального стану дегенерації до рівня, що є менш виснажливим, покращення фізичного або розумового стану або подовження періоду виживання. Лікування можна оцінювати з урахуванням об'єктивних або суб'єктивних показників; включаючи результати об'єктивного обстеження, неврологічного обстеження або психіатричних оцінок.
Термін «ефективна кількість» або «терапевтично ефективна кількість» стосується кількості, 60 ефективної в дозах і протягом періодів часу, необхідних для досягнення бажаного терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість антитіла до ВСМА х СОЗ може змінюватися залежно від таких факторів, як стан захворювання, вік, стать, маса тіла індивідуума і здатність антитіла викликати бажану відповідь у індивідуума. Терапевтично ефективна кількість також є такою кількістю, терапевтично сприятливі ефекти якої переважують будь-які токсичні або шкідливі ефекти антитіла або частини антитіла. «Антитіло» відноситься до всіх ізотипів імуноглобулінів (дос, ІА, ЧЕ, ІМ, дО ї Іди, включаючи різні мономерні, полімерні й химерні форми, якщо не вказано інше. Зокрема терміном «антитіло» охоплюються поліклональні антитіла, моноклональні антитіла (тАБ) і антитілоподібні поліпептиди, такі як химерні антитіла й гуманізовані антитіла. «Антигензв'язувальні фрагменти» являють собою будь-яку білкову структуру, яка може проявляти афінність зв'язування з конкретним антигеном. Антигензв'язувальні фрагменти включають ті, які забезпечуються будь-яким відомим способом, таким як ферментативне розщеплення, пептидний синтез і рекомбінантні методики. Деякі антигензв'язувальні фрагменти складаються з частин інтактних антитіл, які зберігають антигензв'язувальну специфічність молекули батьківського антитіла. Наприклад, антигензв'язувальні фрагменти можуть містити принаймні одну варіабельну область (варіабельну область важкого ланцюга або легкого ланцюга) або одну або більше СОМ антитіла, які, як відомо, зв'язуються з конкретним антигеном. Приклади відповідних антигензв'язувальних фрагментів включають, без обмежень, діатіла й одноланцюгові молекули, а також молекули Раб, Е(ар)2, Ес, Рабс і Ем, одноланцюгові (5с) антитіла, окремі легкі ланцюги антитіла, окремі важкі ланцюги антитіла, химерні злиття між ланцюгами антитіла або СОК і іншими білками, кістяки білків, мономери або димери важкого ланцюга, мономери або димери легкого ланцюга, димери, які складаються з одного важкого й одного легкого ланцюга, одновалентний Фрагмент, який складається з доменів МІ, УН, СІ і СНІ або одновалентне антитіло, описане в М/О2007059782, двовалентні фрагменти, які містять два
Еаб-фрагменти, з'єднані в шарнірній ділянці дисульфідним містком, Ба-фрагмент, який складається по суті з Мн і Сні-доменів; Ем-фрагмент, який складається по суті з МІ. ії МН-доменів одного плеча антитіла, ЗФАБ-фрагмент (Умага еї а!., Майшге 341, 544-546 (1989)), який складається по суті з домену МН і також називається доменним антитілом (Ної еї аї; Тгтепав Віоїесппої. 2003
Моум.; 21(11):484-90); камелід (верблюже антитіло) або нанотіла (Кемеїб5 еї а!; Ехрегі Оріп Віої
Зо ТНег. 2005 дап.; 5(1):111-24); виділену область, що визначає комплементарність (СОК) тощо. Усі ізотипи антитіл можна використовувати для отримання антигензв'язувальних фрагментів. Крім того, антигензв'язувальні фрагменти можуть включати в себе білкові каркаси, які не належать до антитіл, і в які можуть бути з успіхом включені сегменти поліпептидів у орієнтації, яка надає афінність до антигена, що становить інтерес, такі як білкові кістяки. Антигензв'язувальні фрагменти можна отримати рекомбінантними способами або шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. Фраза «антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент» може використовуватися для позначення того, що даний антигензв'язувальний фрагмент включає в себе один або більше амінокислотних сегментів антитіла, яке згадується в цій фразі.
Термін «епітоп» означає білкову детермінанту, здатну специфічно зв'язуватися з антитілом.
Епітопи зазвичай складаються з поверхневих скупчень молекул, таких як амінокислоти або бічні ланцюги цукрів, і зазвичай мають специфічні тривимірні структурні характеристики, а також специфічні характеристики зарядів. Конформаційні й неконформаційні епітопи розрізняються тим, що за присутності денатуруючих розчинників втрачається зв'язування з першим, але не з останнім. Епітоп може містити амінокислотні залишки, які безпосередньо беруть участь у зв'язуванні, і інші амінокислотні залишки, які безпосередньо не беруть участі у зв'язуванні, наприклад амінокислотні залишки, які ефективно заблоковані або покриті специфічним антигензв'язувальним пептидом (іншими словами, амінокислотний залишок перебуває в межах зони охоплення специфічного антигензв'язувального пептиду).
Використання термінів «специфічне зв'язування» або «імуноспецифічне зв'язування» або їхніх похідних у контексті антитіл або фрагментів антитіл, представляє зв'язування через домени, кодовані генами імуноглобуліну або фрагментами генів імуноглобуліну, з одним або більше епітопами білка, що становить інтерес, без переважного зв'язування з іншими молекулами в зразку, який містить змішану популяцію молекул. Зазвичай антитіло зв'язується зі спорідненим антигеном із Ка менше ніж приблизно 1 х 108 М, як визначено за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу або аналізу зв'язування клітин. Такі фрази як «Іантиген|-специфічне» антитіло (наприклад, ВСМА-специфічне антитіло) передають, що зазначене антитіло специфічно зв'язується з зазначеним антигеном.
У контексті цього документа термін «Ко» означає константу рівноваги дисоціації конкретної 60 взаємодії «антитіло-антиген».
Термін «суб'єкт» відноситься до людей і тварин не людського походження, включаючи всіх хребетних, наприклад ссавців і не ссавців, таких як примати не людського походження, миші, кролики, вівці, собаки, кішки, коні, корови, кури, амфібії, рептилії тощо. У багатьох варіантах втілення описаних способів суб'єкт є людиною.
У контексті цього документа термін «зразок» відноситься до сукупності подібних рідин, клітин або тканин (наприклад, отриманої шляхом хірургічної резекції пухлинної тканини, біоптатів, включаючи зразки тонкогольчатої аспіраційної біопсії), виділених у суб'єкта, а також рідин, клітин або тканин, присутніх у організмі суб'єкта. У деяких варіантах втілення зразок являє собою біологічну рідину. Біологічні рідини зазвичай є рідинами за фізіологічних температур і можуть являти собою природні рідини, присутні, зібрані, експресовані або іншим чином екстраговані з організму суб'єкта або біологічного джерела. Деякі біологічні рідини отримують із конкретних тканин, органів або локалізованих областей, а деякі інші біологічні рідини можуть бути розташовані в організмі суб'єкта або біологічному джерелі більш глобально або системно. Приклади біологічних рідин включають кров, сироватку й рідини слизових оболонок, плазму, лімфу, сечу, слину, кістозну рідину, краплі сліз, фекалії, мокротиння, слизові виділення секреторних тканин і органів, виділення з піхви, асцитні рідини, такі як ті, що не пов'язані з солідними пухлинами, рідини плевральної, перикардіальної, перитонеальної, черевної і інших порожнин тіла, рідини, зібрані під час промивання бронхів тощо. Біологічні рідини можуть також включати рідкі розчини, які контактували з суб'єктом або біологічним джерелом, наприклад, культуральне середовище клітин і органів, включаючи кондиціоноване середовище клітини або органа, промивні рідини тощо. У контексті цього документа термін «зразок» охоплює матеріали, видалені з організму суб'єкта, або матеріали, присутні в організмі суб'єкта. «Відомий стандарт» може являти собою розчин, який має відому кількість або концентрацію
ВСМА, причому розчин може бути природним розчином, таким як зразок, отриманий від пацієнта, у якого, як відомо, є ранній, помірний, пізній, прогресуючий або статичний рак, або розчин може бути синтетичним розчином, таким як забуферена вода, в якій міститься відома кількість розчиненого в ній ВСМА. Відомі стандарти, описані в цьому документі, можуть включати виділений у суб'єкта ВСМА, рекомбінантний або очищений білок ВСМА, або рівень
Зо концентрації ВСМА, пов'язаний зі станом захворювання.
У контексті цього документа термін «ВСМА» стосується антигена дозрівання В-клітин людини, також відомого як ВСМА, СО269, і ТМЕКЗЕ17 (піРгої 2002223), що є представником надродини рецепторів некрозу пухлин, який переважно експресується в диференційованих плазматичних клітинах. Позаклітинний домен ВСМА людини складається, відповідно до ОпіРгої, з амінокислот 1-54 (або 5-51). У контексті цього документа термін «антитіло проти ВСМА, антитіло до ВСМА» стосується антитіла, яке імуноспецифічно зв'язується з ВСМА.
Термін «СОЗ» відноситься до білкового комплексу СОЗ людини, який складається з множини субодиниць. До білкового комплексу СОЮЗ, який складається з множини субодиниць, входять 6 різних поліпептидних ланцюгів. Вони включають ланцюг СОЮЗУ (Зм/із55Ргої РО9693), ланцюг СЮОЗб (Зугіз5Ргої РО4234), два ланцюги СОЗе (Зм/із5Ргої РО7766) і один гетеродимерний ланцюг СОЗС (Зм/і55Ргої 20963), і причому вони пов'язані з с і ВД-ланцюгами рецептора Т-клітин. Термін «СОЮЗ» включає будь-який різновид, ізоформу й видовий гомолог СОЮЗ, який природно експресується клітинами (включаючи Т-клітини) або може експресуватися на клітинах, трансфікованих генами або кДНК, які кодують такі поліпептиди, якщо не вказано інше. «Антитіло до ВСМА х СОЗ» являє собою мультиспецифічне антитіло, необов'язково біспецифічне антитіло, яке містить дві різні антигензв'язувальні області, одна з яких специфічно зв'язується з антигеном ВСМА, а друга специфічно зв'язується з СОЮЗ. Мультиспецифічне антитіло може являти собою біспецифічне антитіло, діатіло або подібну молекулу (опис діатіл див., наприклад, у РМАБ ОБА 90(14), 6444-88 (1993)). Біспецифічні антитіла, діатіла тощо, які пропонуються в цьому винаході, на додачу до частини ВСМА, можуть зв'язуватися з будь-якою відповідною мішенню. Термін «біспецифічне антитіло» необхідно розуміти як антитіло, яке має дві різні антигензв'язувальні області, визначені різними послідовностями антитіла. Це можна розуміти як зв'язування з різними мішенями, але також це включає зв'язування з різними епітопами на одній мішені.
Термін «еталонний зразок» являє собою зразок, який можна порівняти з іншим зразком, наприклад, досліджуваним зразком, щоб забезпечити визначення характеристик порівнюваного зразка. Еталонний зразок матиме деякі характерні властивості, які слугуватимуть основою для порівняння з досліджуваним зразком. Наприклад, еталонний зразок можна використовувати як початок відліку рівнів ВСМА, що вказують на наявність у суб'єкта ракового захворювання. Не бо обов'язково паралельно з аналізом досліджуваного зразка проводити аналіз еталонного зразка,
таким чином, у деяких випадках еталонний зразок може являти собою числове значення або діапазон, визначений раніше для характеристики даного стану, наприклад рівні ВСМА, які свідчать про ракове захворювання у суб'єкта. Термін також включає зразки, які використовуються з метою порівняння, які, як відомо, пов'язані з фізіологічним станом або станом захворювання, такого як рак, що експресує ВСМА, але мають невідому кількість ВСМА.
Термін «прогресування» у контексті прогресування раку, що експресує ВСМА, включає зміну стану ракового захворювання з менш тяжкого на більш тяжкий. Прогресування може включати збільшення кількості або тяжкості пухлин, ступеня метастазування, швидкості росту або поширення раку тощо. Наприклад, «прогресування раку ободової кишки» включає прогресування ракового захворювання з менш тяжкого до більш тяжкого стану, наприклад прогресування з І стадії до ІІ стадії, з ІІ стадії до ІІЇ стадії тощо.
Термін «регрес» у контексті регресу раку, що експресує ВСМА, включає зміну стану ракового захворювання з більш тяжкого на менш тяжкий. Регрес може включати зменшення кількості або тяжкості пухлин, ступеня метастазування, швидкості росту або поширення раку тощо.
Наприклад, «регрес раку ободової кишки» включає регрес ракового захворювання з більш тяжкого до менш тяжкого стану, наприклад прогресування з ІІ стадії до ІІ стадії, з І! стадії до стадії тощо.
Термін «стабільний» у контексті стабільного раку, що експресує ВСМА, призначено для опису стану захворювання, яке протягом клінічно релевантного періоду часу не змінюється або не змінилося досить істотно, щоб вважати, що рак прогресує або регресує.
Варіанти втілення, описані в цьому документі, не обмежуються конкретними способами, реагентами, сполуками, композиціями або біологічними системами, які можуть, звичайно, змінюватися.
ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти
У цьому документі описано рекомбінантні моноклональні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з ВСМА. Загальна структура молекули антитіла містить антигензв'язувальний домен, який включає в себе важкі й легкі ланцюги, і Рс-домен, який виконує різні функції, включаючи фіксацію комплементу й зв'язування рецепторів антитіла.
Описані ВСМА-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти включають усі
Зо ізотипи ДА, 90, ІДЕ, доб і І9М ії синтетичні мультимери чотириланцюгових структур імуноглобулінів. Описані антитіла або антигензв'язувальні фрагменти також включають ізотип
Іду, який зазвичай зустрічається в сироватці курки або індички й у яєчному жовтку курки або індички.
ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти можна отримати від будь-яких видів за допомогою рекомбінантних способів. Наприклад, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можуть бути отримані від миші, щура, кози, коня, свині, корови, курки, кролика, верблюда, віслюка, людини, або вони можуть бути їхніми химерними варіантами. Для застосування з метою введення людям, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, отримані з організмів не людського походження, можуть бути генетично або структурно змінені, щоб мати меншу антигенність під час введення пацієнтові, що є людиною.
У деяких варіантах втілення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти є химерними. У контексті цього документа термін «химерний» відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, який має принаймні деяку частину принаймні одного варіабельного домену, отриманого з амінокислотної послідовності антитіла ссавця не людського походження, гризуна або рептилії, тоді як решта частин антитіла або його антигензв'язувального фрагмента отримана від людини.
У деяких варіантах втілення антитіла являють собою гуманізовані антитіла. Гуманізовані антитіла можуть являти собою химерні імуноглобуліни, ланцюги імуноглобулінів або їхні фрагменти (такі як Ем, Раб, Рабр', Е(ар)2 або інші антигензв'язувальні послідовності антитіл), які містять мінімальну послідовність, отриману з імуноглобуліну не людського походження.
Здебільшого, гуманізовані антитіла є імуноглобулінами людини (антитіло-реципієнт), в яких залишки з області, що визначає комплементарність (СОК), реціпієнта замінено залишками з
СОК виду не людського походження (антитіло-донор), такого як миша, щур або кролик, які володіють бажаною специфічністю, афінністю й здатністю. Загалом, гуманізоване антитіло міститиме по суті всі з принаймні одного, а зазвичай двох варіабельних доменів, в яких всі або по суті всі області СОК відповідають таким з імуноглобуліну не людського походження, а всі або по суті всі каркасні області є послідовностями імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло може включати принаймні частину константної області імуноглобуліну (Ес), зазвичай з імуноглобуліну людини.
Антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі, можуть зустрічатися в різних формах, але включатимуть у себе одну або більше СОК антитіл, представлених у таблиці 1.
У цьому документі описано рекомбінантні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти, які імуноспецифічно зв'язуються з ВСМА. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти являють собою ІдС людини або його похідні. Хоча ВСМА- специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, наведені в цьому документі як приклади, є людськими, наведені як приклади антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можуть бути химеризованими.
У деяких варіантах втілення запропоновано ВСМА-специфічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить важкий ланцюг, який містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ будь-якого з антитіл, представлених у таблиці 1. У деяких варіантах втілення запропоновано
ВСМА-специфічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить важкий ланцюг, який містить СОКІ, СОМК2 ії СОКЗ будь-якого з антитіл, представлених у таблиці 1, і легкий ланцюг, який містить СОКІ, СОМК2 і СОРЗ будь-якого з антитіл, представлених у таблиці 1.
У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІЮО МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 6. У деяких варіантах втілення
ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ1 важкого ланцюга, що містить 5ЕО І МО: 4, СОМК2 важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 5, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 6, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 7, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 8, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить 5БЕО ІЮ МО: 9.
Це ВСМА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це ВСМА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може блокувати зв'язування з АРКІГЇ. із показником ІСво принаймні 5,9 нМ. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із ЗЕО ІО МО: 10. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний
Зо домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із ЗЕО ІЮ МО: 10, і варіабельний домен легкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із ЗЕО ІЮ МО: 11. Варіабельний домен важкого ланцюга й варіабельний домен легкого ланцюга антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічну конструкцію, в якій одне плече є плечем антитіла до
ВСМА.
У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІЮО МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 6. У деяких варіантах втілення
ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ1 важкого ланцюга, що містить 5ЕО І МО: 7, СОК2 важкого ланцюга, що містить ЗЕО І МО: 5, СОКЗ важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 6, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 24, СОК2 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІО МО: 25, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 26.
Це ВСМА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із БЕО ІЮО МО: 57. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із 5ЕО ІЮ МО: 57, і варіабельний домен легкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із 5ЕО ІЮО МО: 28. Варіабельний домен важкого ланцюга й варіабельний домен легкого ланцюга антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічну конструкцію, в якій одне плече є плечем антитіла до ВСМА.
У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 7, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІЮО МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 6. У деяких варіантах втілення
ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОК1 важкого ланцюга, що містить 5ЕО І МО: 7, СОК2 важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 5, СОКЗ важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 6, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 24, СОК2 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІО МО: 25, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить хЕО ІЮ МО: 26.
Це ВСМА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й бо антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із БЕО ІЮО МО: 34. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із 5ЕО ІЮ МО: 34, і варіабельний домен легкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із БЕО ІЮО МО: 28. Варіабельний домен важкого ланцюга й варіабельний домен легкого ланцюга антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічну конструкцію, в якій одне плече є плечем антитіла до ВСМА.
У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІО МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 19. У деяких варіантах втілення
ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ1 важкого ланцюга, що містить 5ЕО І МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 5, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 19, СОК1 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 24, СОК2 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІО МО: 25, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 26.
Це ВСМА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із БЕО ІЮО МО: 39. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із 5ЕО ІЮ МО: 39, і варіабельний домен легкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із БЕО ІЮО МО: 28. Варіабельний домен важкого ланцюга й варіабельний домен легкого ланцюга антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічну конструкцію, в якій одне плече є плечем антитіла до ВСМА.
У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІЮ МО: 8, і СОКЗ важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 6. У деяких варіантах втілення
ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ1 важкого ланцюга, що містить 5ЕО І МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 8, СОКЗ важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 6, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 24, СОК2 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІО МО: 25, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 26.
Зо Це ВСМА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із БЕО ІЮО МО: 40. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із 5ЕО ІЮ МО: 40, і варіабельний домен легкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із БЕО І МО: 28. Варіабельний домен важкого ланцюга й варіабельний домен легкого ланцюга антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічну конструкцію, в якій одне плече є плечем антитіла до ВСМА.
У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОК1 важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 13, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІО МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІО МО: 19. У деяких варіантах втілення
ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ1 важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 13, СОМК2 важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 5, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 19, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 24, СОК2 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 25, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 26.
Це ВСМА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із БЕО ІЮО МО: 58. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із 5ЕО ІЮ МО: 58, і варіабельний домен легкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із БЕО ІЮО МО: 28. Варіабельний домен важкого ланцюга й варіабельний домен легкого ланцюга антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічну конструкцію, в якій одне плече є плечем антитіла до ВСМА.
У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОК1 важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 13, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІЮ МО: 8, і СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 19. У деяких варіантах втілення
ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ1 важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 13, СОМК2 важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 8, СОКЗ важкого 60 ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 19, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 24, СОК2 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІО МО: 25, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 26.
Це ВСМА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із БЕО ІЮО МО: 43. У деяких варіантах втілення ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із 5ЕО ІЮ МО: 43, і варіабельний домен легкого ланцюга по суті однаковий або ідентичний із 5ЕО ІЮО МО: 28. Варіабельний домен важкого ланцюга й варіабельний домен легкого ланцюга антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічну конструкцію, в якій одне плече є плечем антитіла до ВСМА.
У деяких варіантах втілення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти являють собою
ІцО або його похідні, наприклад ізотипи ІдС1, Ідс2, ІдОЗ і Ідс4. У деяких варіантах втілення, де антитіло є антитілом ізотипу ІДС, це антитіло містить Ес-область Їде1 (5ЕО ІЮО МО. 74).
ЗЕО І МО. 74
Авікарзміріарз5КвіздаїааідсімкаутрермімзмпздайзампирамідвздіузізвумімрзззідідіуіспипиКропік маккмеркзсакіпісрресраре дарзміїррокркайтізпремісуумамзпедреукіплмумхадмемппакікргеєдупвіугум зміміпдаміпаКеукскУзпКаіраріектізКакадргердамуйррегеетіКпадмзіїсімКотурзаіїахежезпадреппукйрру
ІіавадзтузкимакзпгидадпмізсзмтпеаІпппуїаквів Ірак
У деяких варіантах втілення, де антитіло є антитілом ізотипу ІдД04, це антитіло містить у своїй Ес-області заміщення 5228Р, І 234А і І 235А (ЗЕО ІЮ МО. 73).
ЗЕОІОМО.7ЗазікорзмріарсвзгвізезіааідсіикауїреруузмпздаїзаупНрамідззаувіззУумімирзззіаікіуї спуманкропікмакг"езкудрреррсрареаадоарзм Трркркайтівпремісуумамздедрехдїплумхадмемппакікрг еедіпеіугиивм м пдаміпуКеуксКизпКаїрззіектізКакадргердчуПррздеетікКпамвзїсімКкотурзаіїахемезпда реппукпиррміадзадзтузпмакзпидедпмізсзмтПпеаіІппруїаквівівІдк
Специфічні антитіла, визначені за СОК і/або послідовністю варіабельного домену, описані в абзацах вище, можуть включати в себе ці Ес-області Ід.
Також розкрито виділені синтетичні полінуклеотиди, які кодують антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, що імуноспецифічно зв'язуються з ВСМА. Для отримання антитіл або антигензв'язувальних фрагментів виділені полінуклеотиди, здатні кодувати сегменти варіабельного домену, що пропонуються в цьому винаході, можуть бути включені в той самий або в інший вектор.
Полінуклеотиди, які кодують рекомбінантні антигензв'язувальні білки, також входять в об'єм цього винаходу. У деяких варіантах втілення описані полінуклеотиди (і пептиди, які вони кодують) включають лідерну послідовність. Можна використовувати будь-яку лідерну послідовність, відому в цій галузі. Лідерна послідовність може включати, серед іншого, сайт рестрикції або сайт початку трансляції.
ВСМА-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі, включають різновиди, що мають одиночні або множинні амінокислотні заміщення, делеції або доповнення, які зберігають біологічні властивості (наприклад, афінність зв'язування або імуноефекторну активність) описаних ВСМА-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів. У контексті цього винаходу для опису мутації використовують такі умовні позначення (якщо не вказано інше): ї) заміщення амінокислоти в певному положенні записується, наприклад, у вигляді КА4О9К, що означає заміщення лізину в положенні 409 аргініном; і її) для позначення будь-якого амінокислотного залишку в специфічних різновидах використовуються конкретні три- або однобуквені коди, включаючи коди Хаа і Х. Таким чином, заміщення лізину на аргінін в положенні 409 позначається як: К4А09К, а заміщення лізину на будь-який амінокислотний залишок в положенні 409 позначається як К409Х. У випадку делеції лізину в положенні 409 це позначається як К409". Фахівець у цій галузі може отримати різновиди, які мають одиночні або множинні амінокислотні заміщення, делеції або доповнення.
Ці різновиди можуть включати: (а) різновиди, в яких один або більше амінокислотних залишків заміщені консервативними або неконсервативними амінокислотами, (Б) різновиди, в яких одна або більше амінокислот додані до поліпептиду або видалені з нього, (с) різновиди, в яких одна або більше амінокислот включають замісну групу, і (4) різновиди, в яких поліпептид злито з іншим пептидом або поліпептидом, таким як партнер для злиття, білюова мітка або інший хімічний фрагмент, який може надавати поліпептиду корисні властивості, такі як, наприклад, епітоп для антитіла, полігістидинова послідовність, фрагмент біотину тощо. Антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі, можуть включати різновиди, в яких амінокислотні залишки з одного виду заміщені відповідними залишками з іншого виду в консервативних або неконсервативних положеннях. В інших варіантах втілення амінокислотні 60 залишки в неконсервативних положеннях заміщені консервативними або неконсервативними залишками. Методи отримання цих різновидів, включаючи генетичні (делеції, мутації тощо), хімічні й ферментативні методи, відомі звичайним фахівцям у цій галузі.
ВСМА-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі, можуть об'єднувати декілька ізотипів антитіл, таких як ЯМ, ІД4О, Ідс, ІА і ІДЕ. У деяких варіантах втілення ізотип антитіла є ізотипом ІдДС1, Ідш2, ІдО3 або Ід04, переважно ізотипом 3901 або Ідс4. Специфічність антитіла або його антигензв'язувального фрагмента значною мірою визначається амінокислотною послідовністю й розташуванням СОК. Таким чином, СОК із одного ізотипу можна переносити в інший ізотип без зміни антигенної специфічності.
Альтернативно були розроблені методи, що спричиняють перемикання виробництва гібридомою одного ізотипу антитіла на інший (ізотипне перемикання) без зміни антигенної специфічності. Відповідно, такі ізотипи антитіл входять в об'єм описаних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів.
Описані в цьому документі ВСМА-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти мають значення ІСхо зв'язування АРКІЇ. принаймні 5,9 нМ. ІСсо описаних ВСМА-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів можна визначити за допомогою різних способів, відомих у цій галузі, наприклад, способів на основі аналізів ЕГІЗА або проточної цитометрії (ГАС5). В аналізах для вимірювання ІСво за допомогою ЕГІЗА використовують зв'язаний з планшетом ВСМА за присутності та за відсутності ВСМА-специфічного антитіла й різні концентрації АРКІЇ. Антитіло до ВСМА, яке блокує зв'язування АРКІЇ із ВСМА, буде «за результатами аналізу ЕГІ5А блокувати АРКІЇ ».
Також пропонуються вектори, які містять полінуклеотиди, описані в цьому документі.
Вектори можуть являти собою експресійні вектори. Таким чином, рекомбінантні експресійні вектори, які містять послідовність, яка кодує поліпептид, що становить інтерес, розглядаються як такі, що входять у об'єм винаходу. Експресійний вектор може містити одну або більше додаткових послідовностей, таких як, серед іншого, регуляторні послідовності (наприклад, промотор, енхансер), селективний маркер і сигнал поліаденілювання. Вектори для трансформації широкої різноманітності клітин-хазяїв є добре відомими й включають у себе, серед іншого, плазміди, фагеміди, косміди, бакуловіруси, бакміди, бактеріальні штучні хромосоми (ВАС), дріжджові штучні хромосоми (ХУАС), а також інші бактеріальні, дріжджові й
Зо вірусні вектори.
Рекомбінантні експресійні вектори, які входять в об'єм цього опису, включають синтетичні, геномні або отримані з КДНК фрагменти нуклеїнових кислот, які кодують принаймні один рекомбінантний білок, який може бути функціонально пов'язаний із відповідними регуляторними елементами. Такі регуляторні елементи можуть включати транскрипційний промотор, послідовності, які кодують відповідні рибосомні сайти зв'язування мРНК і послідовності, які керують термінацією транскрипції і трансляції. Експресійні вектори, особливо експресійні вектори ссавців, також можуть включати один або більше елементів, що не транскрибуються, таких як джерело реплікації, відповідний промотор і енхансер, зв'язані з геном, який експресується, інші 5'- або 3'-фланкуючі послідовності, що не транскрибуються, 5- або 3- послідовності, що не транслюються (такі як необхідні рибосомні сайти зв'язування), сайт поліаденілювання, донор сплайсингу й акцепторні сайти або послідовності термінації транскрипції. Можна вводити джерело реплікації, що надає здатність до реплікації в хазяїні.
Послідовності керування транскрипцією і трансляцією в експресійних векторах, які будуть використовуватися для трансформації клітин хребетних, можуть бути отримані з вірусних джерел. Ілюстративні вектори можуть бути сконструйовані так, як описано в ОКауата апа Вега,
З Мої. Сеї. Віо!. 280 (1983).
У деяких варіантах втілення послідовність, що кодує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, розміщена під керуванням потужного конститутивного промотора, такого як промотори для наступних генів: гіпоксантинфосфорибозилтрансфераза (НРКТ), аденозиндезаміназа, піруваткіназа, бета-актин, міозин людини, гемоглобін людини, креатин м'язів людини та інші. Крім того, багато вірусних промоторів функціонують у еукаріотичних клітинах конститутивно й придатні для використання з описаними варіантами втілення. Такі вірусні промотори включають, без обмежень, негайний ранній промотор цитомегаловірусу (СМУ), ранній і пізній промотори 5М40, промотор вірусу пухлини молочної залози мишей (ММТУ,), довгі кінцеві повтори (СТЕК) вірусу лейкозу Малоні, вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), вірусу Епштейна - Барр (ЕВМ), вірусу саркоми Рауса (К5М) і інших ретровірусів, і промотор тимідинкінази вірусу простого герпесу. В одному варіанті втілення послідовність, що кодує
ВСМА-специфічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, розміщена під керуванням індуцибельного промотора, такого як металотіонеїновий промотор, індукований бо тетрацикліном промотор, індукований доксицикліном промотор, промотори, які містять один або більше стимульованих інтерфероном елементів відповіді (ІЗЕКЕ), такі як протеїнкінази КК 2,5'- олігоаденілатсинтетази, Мх-гени, АБАК!Т тощо.
Вектори описані в цьому документі, можуть містити одну або більше ділянок внутрішньої посадки рибосоми (ІКЕ5). Включення послідовностей ІКЕЗ у вектори злиття може бути корисним для посилення експресії деяких білків. У деяких варіантах втілення векторна система включатиме в себе один або більше сайтів поліаденілювання (наприклад, 5М40), які можуть знаходитися вище або нижче від будь-якої з вищезазначених нуклеотидних послідовностей.
Векторні компоненти можуть бути суміжно зв'язані або розташовані таким чином, щоб забезпечити оптимальну відстань для експресії генних продуктів (тобто шляхом введення між відкритими рамками зчитування (ОКЕ) «спейсерних» нуклеотидів) або можуть розташовуватися по-іншому. Елементи регулювання, такі як мотив ІКЕ5, також можуть бути розташовані так, щоб забезпечити оптимальну відстань для експресії.
Вектори можуть містити селективні маркери, добре відомі в цій галузі. Селективні маркери включають позитивні й негативні селективні маркери, наприклад, гени резистентності до антибіотиків (наприклад, ген резистентності до неоміцину, ген резистентності до гігроміцину, ген резистентності до канаміцину, ген резистентності до тетрацикліну, ген резистентності до пеніциліну, ген резистентності до пуроміцину, ген резистентності до бластицидину), гени глутаматсинтази, НЗМУ-ТК, похідні НБМ-ТК для селекції ганцикловіром або ген бактеріальної пурин-нуклеозидфосфорилази для селекції б-метилпурином (Саді еї аї., 7 Сепе ТНег. 1738-1743 (2000)). Нуклеотидна послідовність, яка кодує селективний маркер або сайт клонування, може розташовуватися вище або нижче нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, що становить інтерес, або сайт клонування.
Вектори, описані в цьому документі, можуть використовуватися для трансформації різних клітин генами, що кодують описані антитіла або антигензв'язувальні фрагменти. Наприклад, вектори можна використовувати для створення клітин, які виробляють ВСМА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент. Таким чином, ще один аспект включає клітини- хазяїни, трансформовані векторами, що містять нуклеотидну послідовність, яка кодує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно зв'язується з ВСМА, наприклад, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані й проілюстровані в цьому документі.
Зо У цій галузі відомо багато способів введення чужорідних генів у клітини, і їх можна використовувати для конструювання рекомбінантних клітин з метою реалізації описаних способів згідно з різними варіантами втілення, описаними й проілюстрованими в цьому документі. Використовувана методика повинна забезпечувати стабільне перенесення послідовності гетерологічного гена в клітину-хазяїна так, щоб послідовність гетерологічного гена ставала наслідуваною й експресувалася потомством клітин і так, щоб не порушувалися необхідний розвиток і фізіологічні функції клітин-реципієнтів. Методики, які можуть бути використані, включають, серед іншого, перенесення хромосом (наприклад, злиття клітин, опосередковане хромосомами перенесення генів, опосередковане мікроклітинами перенесення генів), фізичні методи (наприклад, трансфекція, злиття сферопластів, мікроїін'єкція, електропорація, ліпосомний носій), перенесення вірусних векторів (наприклад, рекомбінантних
ДНК-вірусів, рекомбінантних РНК-вірусів) тощо (описано в Сіїіпе, 29 Рнаптас. Тег. 69-92 (1985)).
Для трансформації клітин також можуть бути використані осадження фосфатом кальцію й індуковане поліетиленгліколем (ПЕГ) злиття бактеріальних протопластів із клітинами ссавців.
Клітини, що підходять для використання для експресії ВСМА-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі, переважно являють собою еукаріотичні клітини, більш переважно клітини рослин, гризунів або клітини людського походження, наприклад, серед іншого, клітини МБО, СНО, СНОК'1, регО.6б, ТК-їі513, ВНК,
НЕК293, СО5-7, 980, СМ-1/ЕВМА, І -клітини, С127, 3Т3, Неї а, М51, 5рг2/0 мієломні клітини й клітинні лінії ВНК. Крім того, експресія антитіл може бути реалізована з використанням клітин гібридоми. Способи отримання гібридом є добре відомими в цій галузі.
Клітини, трансформовані експресійними векторами, описаними в цьому документі, можуть бути відібрані або перевірені на рекомбінантну експресію антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі. Рекомбінантно-позитивні клітини розмножують і піддають скринінгу на субклони, які демонструють бажаний фенотип, наприклад високий рівень експресії, покращені властивості росту або здатність надавати білки з бажаними біохімічними характеристиками, наприклад, внаслідок модифікації білка або зміни посттрансляційних модифікацій. Ці фенотипи можуть бути пов'язані з притаманними цьому субклону властивостями або з мутацією. Мутації можуть бути здійснені за допомогою використання хімічних речовин, ультрафіолетового світла, радіоактивного випромінювання, вірусів,
інсерційних мутагенів, інгібування відновлення невідповідності ДНК або комбінації таких способів.
Способи використання ВСМА-специфічних антитіл для лікування
У цьому винаході пропонуються ВСМА-специфічні антитіла або їхні антигензв'язувальні фрагменти для застосування в терапії. Зокрема ці антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можна використовувати для лікування раку, такого як рак, що експресує ВСМА. Відповідно, у винаході пропонується спосіб лікування раку, який включає введення антитіла, описаного в цьому документі, наприклад ВСМА-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів.
Наприклад, використання може відбуватися шляхом втручання у взаємодії ВСМА-рецептора або у випадках, де антитіло є кон'югованим із токсином, шляхом націлювання токсину на рак, що експресує ВСМА. У деяких варіантах втілення рак, що експресує ВСМА, включає лімфому, таку як множинна мієлома (ММ). Антитіла для застосування в цих способах включають антитіла, описані в цьому документі вище, наприклад ВСМА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент із характеристиками, наведеними в таблиці 1, наприклад послідовностями СОК або варіабельного домену, і в подальшому обговоренні цих антитіл.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, імунні ефекторні властивості
ВСМА-специфічних антитіл можна посилити або піддати сайленсингу через Ес-модифікації за допомогою способів, відомих фахівцям у цій галузі. Наприклад, Ес-ефекторні функції, такі як зв'язування Сід, комплементзалежна цитотоксичність (КЗ3Ц), антитілозалежна клітинноопосередкована цитотоксичність (АЗКЦ), антитілозалежний клітинний фагоцитоз (АЗКФ), негативна регуляція рецепторів клітинної поверхні (наприклад, рецептора В-клітин;
ВСЕ) тощо можна реалізувати й/(або контролювати шляхом модифікацій залишків у Ес, що відповідає за ці види активності. «Антитілозалежна клітинноопосередкована цитотоксичність» або «АЗКЦ» стосується клітинноопосередкованої реакції, в якій неспецифічні цитотоксичні клітини, що експресують Ес- рецептори (БСК) (наприклад клітини-натуральні кілери (НК), нейтрофіли й макрофаги), розпізнають зв'язане антитіло на клітині-мішені й згодом викликають лізис клітини-мішені.
Здатність моноклональних антитіл індукувати АЗКЦ може бути підвищена шляхом конструювання їхнього олігосахаридного компонента. дес! або ІдсЗз людини є М-
Зо глікозильованими на Аз5п297 з більшістю гліканів у добре відомих біантенарних формах 0,
СОР, 1, С1Е, 2 або С2Р. Антитіла, отримані за допомогою несконструйованих клітин СНО, як правило, мають вміст фукози гліканів приблизно принаймні 85 95. Видалення корової фукози з олігосахаридів типу біантенарних комплексів, приєднаних до Ес-областей, підвищує АЗКЦ антитіл через покращення зв'язування Ес.гамма.КШа без впливу на зв'язування антигена або активність КЗЦ. Такі тАб можна отримати з використанням різних способів, описаних як такі, що призводять до успішної експресії антитіл з відносно високим рівнем дефукозилування, які несуть Ес-олігосахариди типу біантенарного комплексу, наприклад контролю осмоляльності культури (Коппо еї аї., СуїтесппоІоду 64:249-65, 2012), застосування варіанта І ес13 клітинної лінії СНО як клітинної лінії-хазяїна (Зпієїа5 еї аїЇ., У Віої Спет 277:26733-26740, 2002), застосування варіанта ЕВб66 клітинної лінії СНО як клітинної лінії-хазяїна (Оїїмег еї аіІ., МАбБ5»; 2(4), 2010; електронна публікація до виходу з друку; РМІО:20562582), застосування щурячої гібридомної клітинної лінії УВ2/0 як клітинної лінії-хазяїна (ЗпіпКауча еї аї., У Віої Спет 278:3466- 3473, 2003), введення малих інтерферуючих РНК, зокрема проти гена альфа- 1,6- фукозилтрансферази (РТВ) (Могі еї а!., Віотесппо! Віоєпуд 88:901-908, 2004) або коекспресії ІД- 1,4-М-ацетилглюкозамінілтрансферази ПІ і а-манозидази ІЇ комплексу Гольджи або ефективного інгібітора альфа-манозидази | кіфунезину (Реггага еї аї.,, У Віої Спет 281:5032-5036, 2006,
Еегтага єї а)ї., Віотесппої! Віоепу 93:851-861, 2006; Хпои евї а!., Віоїтесппої Віоєпа 99:652-65, 2008).
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, АЗКЦ, викликана антитілами до
ВСМА, також може бути підвищена шляхом певних заміщень у Ес антитіла. Прикладами заміщень є, наприклад, заміщення в положеннях амінокислот 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 або 430 (нумерація залишків відповідає індексу Е)), як описано в патенті США Мо 6,737,056.
Способи виявлення ВСМА
У цьому винаході пропонуються способи виявлення ВСМА у біологічному зразку шляхом приведення в контакт зразка з антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, описаними в цьому документі. Як описано в цьому документі, зразок можна отримати з сечі, крові, сироватки, плазми, слини, асцитної рідини, циркулюючих клітин, циркулюючих пухлинних клітин, клітин, не пов'язаних із тканинами (тобто вільних клітин), тканин (наприклад, хірургічно видаленої пухлинної тканини, біоптатів, включаючи зразки тонкогольчатої аспіраційної біопсії), бо гістологічних препаратів тощо. У деяких варіантах втілення описані способи включають виявлення ВСМА у біологічному зразку шляхом приведення в контакт зразка з будь-яким із
ВСМА-специфічних антитіл або їхніх антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі.
У деяких варіантах втілення зразок можна приводити в контакт більше ніж з одним із ВСМА- специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі.
Наприклад, зразок можна приводити в контакт з першим ВСМА-специфічним антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, а потім приводити в контакт з другим ВСМА-специфічним антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, причому перше антитіло або антигензв'язувальний фрагмент і друге антитіло або антигензв'язувальний фрагмент є різними антитілами або антигензв'язувальними фрагментами. У деяких варіантах втілення перед контактуванням зі зразком перше антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент може бути прикріпленим до поверхні, наприклад, багатоямкового планшета, чипа або подібного субстрату.
В інших варіантах втілення перед контактуванням зі зразком перше антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент може не бути прикріпленим або приєднаним до будь-чого.
Описані ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти можуть бути мічені з можливістю визначення. У деяких варіантах втілення мічені антитіла й антигензв'язувальні фрагменти можуть полегшувати виявлення ВСМА за допомогою способів, описаних у цьому документі. Фахівцям у цій галузі добре відомо багато таких міток. Наприклад, відповідні мітки включають, не обмежуючись перерахованим, радіоактивні мітки, флуоресцентні мітки, епітопні мітки, біотин, хромофорні мітки, ЕХЛ-мітки або ферменти. Більш конкретно, описані мітки включають рутеній, ""Іп-ДОТА, ""Іп-діетилентриамінпентаоцтову кислоту (ДТПК), пероксидазу хрону, лужну фосфатазу й бета-галактозидазу, полігістидин (НІ5-мітка), акридинові барвники, ціанінові барвники, флуоронові барвники, оксазинові барвники, фенантридинові барвники, родамінові барвники, барвники АіІехайцог? тощо.
Описані ВСМА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти можна використовувати в різних аналізах для виявлення ВСМА у біологічному зразку. Деякі відповідні аналізи включають, не обмежуючись перерахованим, аналіз вестерн-блот, радіоїмуноаналіз, поверхневий плазмонний резонанс, імунофлуориметрію, імунопреципітацію, рівноважний діаліз, імунодифузію, електрохемілюмінесцентний (ЕХЛ) імуноаналіз, імуногістохімічний аналіз,
Зо сортування клітин з активацією флуоресценції (ГАС) або аналіз ЕГІ5А.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, виявлення у суб'єкта клітин раку, що експресує ВСМА, можна використовувати для визначення того, що суб'єкта можна лікувати терапевтичним агентом, направленим проти ВСМА.
ВСМА є присутнім у зразках крові й сироватки у виявлюваних рівнях. Таким чином, у цьому винаході пропонуються способи виявлення ВСМА у зразку, отриманому з крові, такому як зразок сироватки, шляхом приведення в контакт зразка з оантитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, який специфічно зв'язується з ВСМА. Зразок крові або його похідне можна розводити, фракціонувати або обробляти іншим способом, щоб отримати зразок, на якому можна реалізувати описаний спосіб. У деяких варіантах втілення ВСМА можна виявляти в зразку крові або його похідному за допомогою різних аналізів, відомих у цій галузі, таких як, серед іншого, аналіз вестерн-блот, радіоїмуноаналіз, поверхневий плазмонний резонанс, імунофлуориметрія, імунопреципітація, рівноважний діаліз, імунодифузія, електрохемілюмінесцентний (ЕХЛ) імуноаналіз, імуногістохімічний аналіз, сортування клітин з активацією флуоресценції (ГАС) або аналіз ЕГІЗА.
Способи діагностики раку
У цьому винаході пропонуються способи діагностики у суб'єкта раку, що експресує ВСМА. У деяких варіантах втілення рак, що експресує ВСМА, включає лімфоми, такі як множинна мієлома (ММ). У деяких варіантах втілення, описаних вище, виявлення ВСМА у біологічному зразку, такому як зразок крові або зразок сироватки, забезпечує можливість діагностування раку у суб'єкта, від якого отримали зразок. Альтернативно, у деяких варіантах втілення для оцінки наявності раку у суб'єкта, від якого отримали зразок, можна також використовувати інші зразки, такі як гістологічний зразок, зразок тонкогольчатої аспіраційної біопсії, хірургічно видалену пухлинну тканину, циркулюючі клітини, циркулюючі пухлинні клітини тощо. У деяких варіантах втілення вже може бути відомо, що суб'єкт, від якого був отриманий зразок, має рак, але діагноз типу раку у суб'єкта може ще не бути встановлено, або попередній діагноз може бути неточним.
Таким чином, виявлення ВСМА у біологічному зразку, одержаному від суб'єкта, може допомогти встановити або прояснити діагноз раку. Наприклад, може бути відомо, що суб'єкт має рак, але може бути невідомо або незрозуміло, чи експресує рак суб'єкта ВСМА.
У деяких варіантах втілення описані способи включають оцінювання того, чи має суб'єкт рак, бо що експресує ВСМА, шляхом визначення кількості ВСМА, присутнього в біологічному зразку,
отриманому від суб'єкта; і порівняння спостережуваної кількості ВСМА з кількістю ВСМА у контрольному, або еталонному, зразку, причому різниця між кількістю ВСМА у зразку, отриманому від суб'єкта, і кількістю ВСМА у контрольному або еталонному зразку вказує на наявність у суб'єкта раку, що експресує ВСМА. В іншому варіанті втілення кількість ВСМА, спостережувану в біологічному зразку, отриманому від суб'єкта, можна порівнювати з рівнями
ВСМА, які, як відомо, пов'язані з певними формами або стадіями раку, для визначення форми або стадії раку у суб'єкта. У деяких варіантах втілення кількість ВСМА у зразку, отриманому від суб'єкта, оцінюють шляхом приведення зразка в контакт з оантитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, який імуноспецифічно зв'язується з ВСМА, таким як ВСМА- специфічні антитіла, описані в цьому документі. Зразки, які досліджують на наявність ВСМА, можна отримати з сечі, крові, сироватки, плазми, слини, асцитної рідини, циркулюючих клітин, циркулюючих пухлинних клітин, клітин, не пов'язаних із тканинами (тобто вільних клітин), тканин (наприклад, хірургічно видаленої пухлинної тканини, біоптатів, включаючи зразки тонкогольчатої аспіраційної біопсії), гістологічних препаратів тощо. У деяких варіантах втілення рак, що експресує ВСМА, включає гематологічне ракове захворювання, таке як множинна мієлома (ММ). У деяких варіантах втілення суб'єкт є людиною.
У деяких варіантах втілення спосіб діагностування у суб'єкта раку, що експресує ВСМА, включатиме: приведення в контакт біологічного зразка, отриманого у суб'єкта, з ВСМА- специфічним антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом (наприклад тими, які можна отримати з антитіл і фрагментів, представлених в таблиці 1), визначення кількості ВСМА, присутньої в зразку, яка зв'язується антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, порівняння кількості ВСМА, присутньої в зразку з відомим стандартним або еталонним зразком; і визначення того, чи попадають рівні ВСМА суб'єкта в діапазон рівнів ВСМА, пов'язаний із раком. У додатковому варіанті втілення після реалізації способу діагностики можна реалізувати додаткову стадію введення призначеного лікування, специфічного для ракового захворювання.
В іншому варіанті втілення після реалізації способу діагностики можна реалізувати додаткову стадію повідомлення результатів виявлення для сприяння лікуванню раку. У деяких варіантах втілення специфічне лікування раку може бути направленим проти видів раку, що експресують
ВСМА, як, наприклад мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ, описані в цьому документі.
Зо У деяких варіантах втілення описані способи включають оцінювання того, чи має суб'єкт рак, що експресує ВСМА, шляхом визначення кількості ВСМА, присутньої в зразку крові або сироватки, отриманому від суб'єкта; і порівняння спостережуваної кількості ВСМА з кількістю
ВСМА у контрольному, або еталонному, зразку, причому різниця між кількістю ВСМА у зразку, отриманому від суб'єкта, і кількістю ВСМА у контрольному або еталонному зразку вказує на наявність у суб'єкта раку, що експресує ВСМА.
У деяких варіантах втілення контрольний або еталонний зразок може бути отримано від суб'єкта, у якого немає раку, що експресує ВСМА. У деяких варіантах втілення контрольний або еталонний зразок може бути отримано від суб'єкта, у якого є рак, що експресує ВСМА. У деяких варіантах втілення, в яких контрольний або еталонний зразок отримано від суб'єкта, у якого немає раку, що експресує ВСМА, спостереження підвищення кількості ВСМА, присутньої в досліджуваному зразку, порівняно з кількістю в контрольному або еталонному зразку, вказує на наявність у досліджуваного суб'єкта раку, що експресує ВСМА. У деяких варіантах втілення, в яких контрольний зразок отримано від суб'єкта, у якого немає раку, що експресує ВСМА, спостереження зниження або схожості кількості ВСМА, присутньої в досліджуваному зразку, порівняно з кількістю в контрольному або еталонному зразку, вказує на відсутність. у досліджуваного суб'єкта раку, що експресує ВСМА. У деяких варіантах втілення, в яких контрольний або еталонний зразок отримано від суб'єкта, у якого є рак, що експресує ВСМА, спостереження схожості кількості ВСМА, присутньої в досліджуваному зразку, порівняно з кількістю в контрольному або еталонному зразку, вказує на наявність у досліджуваного суб'єкта раку, що експресує ВСМА. У деяких варіантах втілення, в яких контрольний або еталонний зразок отримано від суб'єкта, який має рак, що експресує ВСМА, спостереження зниження кількості ВСМА, присутньої в досліджуваному зразку, порівняно з кількістю в контрольному або еталонному зразку, вказує на відсутність у досліджуваного суб'єкта раку, що експресує ВСМА.
У деяких варіантах втілення кількість ВСМА в зразку, отриманому від суб'єкта, оцінюють шляхом приведення зразка в контакт з антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, який специфічно зв'язується з ВСМА, таким як антитіла, описані в цьому документі. Зразки, які досліджують на наявність ВСМА, можна отримати зі зразка крові, зразка сироватки, циркулюючих клітин, циркулюючих пухлинних клітин, клітин, не пов'язаних із тканинами (тобто вільних клітин), тканин (наприклад, хірургічно видаленої пухлинної тканини, біоптатів, бо включаючи зразки тонкогольчатої аспіраційної біопсії), гістологічних препаратів тощо.
У деяких аспектах кількість ВСМА визначають шляхом приведення в контакт зразка з антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, який специфічно зв'язується з ВСМА. У деяких варіантах втілення зразок можна приводити в контакт з більше ніж одним типом антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, який специфічно зв'язується з ВСМА. У деяких варіантах втілення зразок можна приводити в контакт з першим антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, який специфічно зв'язується з ВСМА, а потім приводити в контакт з другим антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, який специфічно зв'язується з ВСМА. З цією метою можна використовувати ВСМА-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі.
Різні комбінації ВСМА-специфічних антитіл і антигензв'язувальних фрагментів можна використовувати для забезпечення «першого» і «другого» антитіла або антигензв'язувального фрагмента для реалізації описаних діагностичних способів. У деяких варіантах втілення рак, що експресує ВСМА, включає лімфоми, такі як множинна мієлома (ММ).
У деяких варіантах втілення кількість ВСМА визначають за допомогою аналізу вестерн-блот, радіоїмуноаналізу, імунофлуориметрії, імунопреципітації, рівноважного діалізу, імунодифузії, електрохемілюмінесцентного (ЕХЛ) імуноаналізу, імуногістохімічного аналізу, сортування клітин з активацією флуоресценції (ГАС5) або аналізу ЕГІ5А.
У різних варіантах втілення описаних діагностичних способів використовують контрольний або еталонний зразок. Цей зразок може бути позитивним або негативним контролем аналізу, який гарантує, що використовуваний аналіз «працює» належним чином; наприклад, контроль для аналізу такого характеру може зазвичай використовуватися для імуногістохімічних аналізів.
Альтернативно, зразок може бути стандартизованим еталоном кількості ВСМА у біологічному зразку, отриманому від здорового суб'єкта. У деяких варіантах втілення спостережувані рівні
ВСМА у досліджуваного суб'єкта можна порівнювати з рівнями ВСМА, які спостерігаються в зразках, отриманих у суб'єктів з відомою наявністю раку, що експресує ВСМА. У деяких варіантах втілення контрольний суб'єкт може мати конкретний вид раку, що становить інтерес.
У деяких варіантах втілення контрольний суб'єкт може мати рак на ранній стадії, який може бути або не бути раком, що експресує ВСМА. У деяких варіантах втілення контрольний суб'єкт може мати рак на проміжній стадії, який може бути або не бути раком, що експресує ВСМА. У деяких
Зо варіантах втілення контрольний суб'єкт може мати рак на пізній стадії, який може бути або не бути раком, що експресує ВСМА.
Способи спостереження за раковим захворюванням
У цьому винаході пропонуються способи спостереження за раком, що експресує ВСМА, у суб'єкта. У деяких варіантах втілення рак, що експресує ВСМА, включає лімфоми, такі як множинна мієлома (ММ). У деяких варіантах втілення описані способи включають оцінювання того, чи відбувається прогресування, регрес або збереження стабільності раку, що експресує
ВСМА, шляхом визначення кількості ВСМА, присутньої в досліджуваному зразку, отриманому від суб'єкта; і порівняння спостережуваної кількості ВСМА із кількістю ВСМА у біологічному зразку, отриманому аналогічним чином у суб'єкта в більш ранній момент часу, причому різниця між кількістю ВСМА у досліджуваному зразку й отриманому раніше зразку свідчить про прогресування, регрес або стабільність раку. У зв'язку з цим досліджуваний зразок із підвищеною кількістю ВСМА порівняно з кількістю, спостережуваною в раніше отриманому зразку, може свідчити про прогресування раку, що експресує ВСМА. І навпаки, досліджуваний зразок зі зниженою кількістю ВСМА порівняно з кількістю, спостережуваною в раніше отриманому зразку, може свідчити про регрес раку, що експресує ВСМА.
Відповідно, досліджуваний зразок із незначною відмінністю кількості ВСМА порівняно з кількістю, спостережуваною в раніше отриманому зразку, може свідчити про стабільність ракового захворювання, що експресує ВСМА. У деяких варіантах втілення кількість ВСМА у біологічному зразку, отриманому від суб'єкта, оцінюють шляхом приведення зразка в контакт з антитілом або фрагментом антитіла, який специфічно зв'язується з ВСМА, таким як антитіла, описані в цьому документі. Зразки, які досліджують на наявність ВСМА, можна отримати з сечі, крові, сироватки, плазми, слини, асцитної рідини, циркулюючих клітин, циркулюючих пухлинних клітин, клітин, не пов'язаних із тканинами (тобто вільних клітин), тканин (наприклад, хірургічно видаленої пухлинної тканини, біоптатів, включаючи зразки тонкогольчатої аспіраційної біопсії), гістологічних препаратів тощо. У деяких варіантах втілення суб'єкт є людиною.
У деяких варіантах втілення способи спостереження за раком, що експресує ВСМА, включатимуть: контактування біологічного зразка, отриманого у суб'єкта, з ВСМА-специфічним антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом (наприклад тими, які можна отримати з антитіл і фрагментів, представлених в таблиці 1), визначення кількості ВСМА, присутньої в бо зразку, порівняння присутньої в зразку кількості ВСМА з кількістю ВСМА, визначеною в біологічному зразку, отриманому аналогічним чином у більш ранній момент часу у того самого суб'єкта; і визначення того, чи змінився у суб'єкта рівень ВСМА з плином часу. Досліджуваний зразок із підвищеною кількістю ВСМА порівняно з кількістю, спостережуваною в раніше отриманому зразку, може свідчити про прогресування раку. І навпаки, досліджуваний зразок зі зниженою кількістю ВСМА порівняно з кількістю, спостережуваною в раніше отриманому зразку, може свідчити про регрес раку, що експресує ВСМА. Відповідно, досліджуваний зразок із незначною відмінністю кількості ВСМА порівняно з кількістю, спостережуваною в раніше отриманому зразку, може свідчити про стабільність ракового захворювання, що експресує
ВСМА. У деяких варіантах втілення рівні ВСМА у зразку можна порівнювати з відомим стандартним або еталонним зразком окремо або додатково до порівняння з рівнями ВСМА, які спостерігалися в зразку, оцінюваному в більш ранній момент часу. У додатковому варіанті втілення після реалізації способу діагностики можна реалізувати додаткову стадію введення лікарських засобів, специфічних для ракового захворювання. У деяких варіантах втілення специфічне лікування раку може бути направленим проти видів раку, що експресують ВСМА, як, наприклад мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ, описані в цьому документі.
У деяких аспектах кількість ВСМА визначають шляхом приведення в контакт зразка з антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, який специфічно зв'язується з ВСМА. У деяких варіантах втілення зразок можна приводити в контакт з більше ніж одним типом антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, який специфічно зв'язується з ВСМА. У деяких варіантах втілення зразок можна приводити в контакт з першим антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, який специфічно зв'язується з ВСМА, а потім приводити в контакт з другим антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, який специфічно зв'язується з ВСМА. З цією метою можна використовувати антитіла, описані в цьому документі.
Різні комбінації антитіл і антигензв'язувальних фрагментів, описаних у таблиці 1, можна використовувати для забезпечення «першого» і «другого» антитіла або антигензв'язувального фрагмента для реалізації описаних способів спостереження. У деяких варіантах втілення рак, що експресує ВСМА, включає гематологічне ракове захворювання, таке як гострий мієлоїдний лейкоз (ГМЛ).
У деяких варіантах втілення кількість ВСМА визначають за допомогою аналізу вестерн-блот,
Зо радіоїмуноаналізу, імунофлуориметрії, імунопреципітації, рівноважного діалізу, імунодифузії, електрохемілюмінесцентного (ЕХЛ) імуноаналізу, імуногістохімічного аналізу, сортування клітин з активацією флуоресценції (ГАС5) або аналізу ЕГІ5А.
Набори для виявлення ВСМА
У цьому винаході пропонуються набори для виявлення ВСМА у біологічному зразку. Ці набори включають одне або більше ВСМА-специфічних антитіл, описаних у цьому документі, або їхніх антигензв'язувальних фрагментів, і інструкції з використання набору.
Запропоноване ВСМА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може знаходитися в розчині; бути ліофілізованим; прикріпленим до субстрату, носія або планшета; або міченим із можливістю визначення.
Описані набори можуть також включати в себе додаткові компоненти, які використовуються для реалізації способів, описаних у цьому документі. Як приклад, набори можуть містити засоби для отримання зразка у суб'єкта, контрольний або еталонний зразок, наприклад зразок, отриманий у суб'єкта, який має повільно прогресуючий рак і/або у суб'єкта, який не має ракового захворювання, одну або більше комірок для зразка і/або навчальні матеріали, в яких описано проведення способу за винаходом, і тканиноспецифічні контролі або стандарти.
Засоби для визначення рівня ВСМА можуть додатково включать, наприклад, буфери або інші реагенти для використання в аналізі визначення рівня ВСМА. Інструкції можуть являти собою, наприклад, друковані інструкції щодо проведення аналізу й/або інструкції щодо оцінки рівня експресії ВСМА.
Описані набори також можуть включати засоби для виділення зразка у суб'єкта. Ці засоби можуть містити один або більше окремих предметів обладнання або реагентів, які можуть бути використані для отримання рідини або тканини у суб'єкта. Засоби для отримання зразка у суб'єкта також можуть являти собою засоби для виділення із зразка крові її компонентів, таких як сироватка. Переважно набір призначено для використання у суб'єкта-людини.
Мультиспецифічні антитіла
Зв'язувальні домени антитіл до ВСМА, описаних у цьому документі, розпізнають клітини, які експресують на своїй поверхні ВСМА. Як було зазначено вище, експресія ВСМА може вказувати на ракову клітину. Більш специфічне націлювання на певні підмножини клітин може бути досягнуто шляхом створення біспецифічних молекул, таких як антитіла або фрагменти антитіл, бо які зв'язуються з ВСМА і з іншою мішенню, такою як СОЗ. Це досягається створенням молекули,
яка містить першу область, що зв'язується з ВСМА, і другу область зв'язування, що зв'язується з антигеном іншої мішені. Антигензв'язувальні області можуть приймати будь-яку форму, що уможливлює специфічне розпізнавання мішені, наприклад, область зв'язування може являти собою (або може включати в себе), варіабельний домен важкого ланцюга, Ем (комбінацію варіабельного домену важкого ланцюга і варіабельного домену легкого ланцюга), домен зв'язування на основі домену фібронектину типу ПІ (наприклад, із фібронектину або на основі консенсусу доменів типу ІІ з фібронектину, або з тенасцину, або на основі консенсусу доменів типу ПІ з тенасцину, наприклад, молекули центирину від ЧУапозеп Віоїесиі, Іпс., див., наприклад,
УММО2010/051274 і М/О2010/093627). Отже пропонуються біспецифічні молекули, які містять дві різні антигензв'язувальні області, які зв'язуються відповідно з ВСМА і іншим антигеном.
Деякі з мультиспецифічних антитіл, описаних у цьому документі, містять дві різні антигензв'язувальні області, які зв'язуються відповідно з ВСМА і СОЗ3. У переважних варіантах втілення пропонуються мультиспецифічні антитіла, які зв'язуються з ВСМА і СОЗ3 (мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ) і їхні мультиспецифічні антигензв'язувальні фрагменти. У деяких варіантах втілення мультиспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ містить перший важкий ланцюг (НС1) і перший легкий ланцюг (ІС1), які спарюються з утворенням першого антигензв'язувального сайту, який імуноспецифічно зв'язується з ВСМА, і другий важкий ланцюг (НС2) і другий легкий ланцюг (ЇС2), які спарюються з утворенням другого антигензв'язувального сайту, який імуноспецифічно зв'язується з СОЮЗ. У переважних варіантах втілення мультиспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ являє собою біспецифічне антитіло, яке має ВСМА-специфічне плече, яке містить перший важкий ланцюг (НС) і перший легкий ланцюг (/С1), які спарюються з утворенням першого антигензв'язувального сайту, який імуноспецифічно зв'язується з СОЮЗ, ії СОЗ-специфічне плече, яке містить другий важкий ланцюг (НС) і другий легкий ланцюг (І С2), які спарюються з утворенням другого антигензв'язувального сайту, який імуноспецифічно зв'язується з ВСМА. У деяких варіантах втілення біспецифічні антитіла згідно з цим винаходом являють собою антитіла, які мають структуру повнорозмірного антитіла. У контексті цього документа термін «повнорозмірне антитіло» стосується антитіла, що має два важкі ланцюги повнорозмірного антитіла й два легкі ланцюги повнорозмірного антитіла.
Важкий ланцюг (НС) повнорозмірного антитіла включає в себе варіабельні й константні домени
Зо важкого ланцюга УН, СНІ, СН2 їі СНЗ. Легкий ланцюг (Г.С) повнорозмірного антитіла включає в себе варіабельні й константні домени легкого ланцюга Мі і СІ. У повнорозмірному антитілі в одному або в обох важких ланцюгах може бути відсутнім С-кінцевий лізин (К). Термін «Рар- плече» або «напівмолекула» стосується однієї пари важкий ланцюг-легксий ланцюг, що специфічно зв'язується з антигеном. У деяких варіантах втілення один з антигензв'язувальних доменів являє собою домен зв'язування не на основі антитіл, наприклад, домен зв'язування на основі домену фібронектину типу 3, наприклад, центирину.
ВСМА-зв'язувальне плече мультиспецифічних антитіл, що пропонуються в цьому винаході, можна отримати з будь-якого з ВСМА-специфічних антитіл, описаних вище. У деяких прикладах втілення таких ВСМА-зв'язувальних плечей перша антигензв'язувальна область, яка зв'язується з ВСМА, містить СОКІТ, СОК2 ї СОКЗ важкого ланцюга, отримані з клону антитіла, як описано в таблиці 1. У деяких прикладах втілення таких ВСМА-зв'язувальних плечей перша антигензв'язувальна область, яка зв'язується з ВСМА, містить СОКІ, СОМК2 і СОКЗ важкого ланцюга й СОКІ, СОК2 і СОКЗ легкого ланцюга, отримані з клону антитіла, як описано в таблиці 1. У деяких прикладах втілення таких ВСМА-зв'язувальних плечей перша антигензв'язувальна область, яка зв'язується з ВСМА, містить СОКІ, СОМК2 і СОКЗ важкого ланцюга клону ВСМВ69, ВСМВ117, ВСМВ123, ВСМВ128, ВСМВ129, ВСМВ176 або ВСМВ177. У деяких прикладах втілення таких ВСМА-зв'язувальних плечей перша антигензв'язувальна область, яка зв'язується з ВСМА, містить СОК1, СОМ2 і СОКЗ важкого ланцюга й СОМКІ1, СОР і
СОМЗ легкого ланцюга клону ВСМОб69, ВСМВ117, ВСМВ123, ВСМВ128, ВСМВ129, ВСМВ176 або ВСМВ177. У деяких прикладах втілення таких ВСМА-зв'язувальних плечей перша антигензв'язувальна область, яка зв'язується з ВСМА, містить варіабельний домен важкого ланцюга, отриманий із клону антитіла, як описано в таблиці 1. У деяких прикладах втілення таких ВСМА-зв'язувальних плечей перша антигензв'язувальна область, яка зв'язується з ВСМА, містить варіабельний домен важкого ланцюга й варіабельний домен легкого ланцюга, отримані з клону антитіла, як описано в таблиці 1. У деяких прикладах втілення таких ВСМА- зв'язувальних плечей перша антигензв'язувальна область, яка зв'язується з ВСМА, містить варіабельний домен важкого ланцюга клону ВСМВб9, ВСМВ117, ВСМВ123, ВСМВ128,
ВСМВ129, ВСМВ176 або ВСМВ177. У деяких прикладах втілення таких ВСМА-зв'язувальних плечей перша антигензв'язувальна область, яка зв'язується з ВСМА, містить варіабельний домен важкого ланцюга й варіабельний домен легкого ланцюга клону ВСМВб69, ВСМВ117, всмМВв123, ВСМВ128, ВСМВ129, ВСМВ176 або ВСМВІ1 77.
У таблиці З наведено перелік біспецифічних антитіл до ВСМА х СО3, які мають одну пару важкого й легкого ланцюгів, специфічних до ВСМА, і іншу пару важкого й легкого ланцюгів, специфічних до СОЗ, де для опису антиген-специфічних плечей антитіла, використаних для отримання описаного варіанта втілення, наведено ІО конкретного антитіла.
Таблиця З
У деяких варіантах втілення біспецифічних антитіл ВСМА-зв'язувальне плече також зв'язується з ВСМА яванського макака, переважно з його позаклітинним доменом.
У деяких варіантах втілення ВСМА-зв'язувальне плече мультиспецифічного антитіла являє собою ІдсС або його похідне, наприклад, ізотипи Ідс1, Ідс2, доз і Ід54. У деяких варіантах втілення, де ВСМА-зв'язувальне плече має ізотип Ідс4, воно містить заміщення 5228Р, І 234А і
Ї235А у області Ес.
У деяких варіантах втілення біспецифічних антитіл друге антигензв'язувальне плече зв'язується з СЮОЗ людини. У деяких переважних варіантах втілення СЮОЗ-специфічне плече біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ отримують із СЮОЗ-специфічного антитіла, яке зв'язується з первинними Т-клітинами людини й/або первинними Т-клітинами яванського макака й активує їх. У деяких варіантах втілення СОЗ-зв'язувальне плече зв'язується з епітопом на М- кінці СЮОЗєЄ. У деяких варіантах втілення СОЗ-зв'язувальне плече контактує з епітопом, який включає в себе шість М-кінцевих амінокислот СОЗє. У деяких варіантах втілення. СОЗ3- специфічне зв'язувальне плече біспецифічного антитіла отримують із мишачого моноклонального антитіла 5РЗ34, мишачого ізотипу (дсЗ/лямбда. У деяких варіантах втілення
СОЗ-зв'язувальне плече містить СОМ антитіла 5РЗ4. Такі СОЗ-зв'язувальні плечі можуть зв'язуватися з СОЗ з афінністю 5 х 1077 М або менше, наприклад 1 х 107 М або менше, 5 х 109 М або менше, 1 х 108 М або менше, 5 х 109 М або менше або 1 х 109 М або менше. СОЗ3- специфічне зв'язувальне плече може бути гуманізованим варіантом плеча моноклонального антитіла 5РЗ4. Для гуманізації антитіла до СОЗ, із якого отримали СОЗ-специфічне плече, можна використовувати адаптацію до каркаса людського походження (НЕА). У деяких варіантах
Зо втілення біспецифічних антитіл СОЗ-зв'язувальне плече містить пару з важкого ланцюга й легкого ланцюга, вибрану з таблиці 2. В інших варіантах втілення біспецифічних антитіл СОЗ- зв'язувальне плече містить послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга і СОКІ, СОК2 і
СОКЗ легкого ланцюга, наведені в таблиці 2. Наприклад, послідовності СОК важкого ланцюга і легкого ланцюга деяких варіантів втілення СОЗ-зв'язувального плеча біспецифічних антитіл, описаних в цьому документі, можуть включати наступні амінокислотні послідовності: Не СОК'І,
ЗЕО І МО: 59; Не СОВ2: ЗЕО І МО: 60; Не СОВЗ, 5ЕОІО МО: 61;1с СОВА, 5ЕО ІЮ МО: 62;1с
СОР2:5ЕОІЮ МО: 63; ії с СОВЗ, ЗЕО ІЮ МО: 64.
У деяких варіантах втілення СОЗ-зв'язувальне плече являє собою Ідс або його похідне. У деяких варіантах втілення СОЗ-зв'язувальне плече являє собою Ідс1, Ідс2, доз або Ідсі. У деяких варіантах втілення, де СЮОЗ-зв'язувальне плече має ізотип Ідо4, воно містить заміщення 5228Р, 1234А, 1235А, Е405І і К409К у області Ес. У деяких варіантах втілення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з СЮОЗє на первинних Т-клітинах людини. У деяких варіантах втілення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з СОЗє на первинних Т-клітинах яванського макака. У деяких варіантах втілення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з СОЗє на первинних Т-клітинах людини і яванського макака. У деяких варіантах втілення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти активують первинні Т-клітини СО4- людини. У деяких варіантах втілення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти активують первинні Т-клітини СО4-- яванського макака.
У деяких варіантах втілення пропонується біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ, що має
ВСМА-зв'язувальне плече, яке містить важкий ланцюг клону антитіла ВСМВб69, ВСМВ117,
вСМВ123, ВСМВ128, ВСМВ129, ВСМВ176 або ВСМВ177. У деяких варіантах втілення пропонується біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ, що має ВСМА-зв'язувальне плече, яке містить важкий ланцюг і легкий ланцюг клону антитіла ВСМВ69, ВСМВ117, ВСМВ123, ВСМВ128, вВСМВ129, ВСМВ176 або ВСМВ177. У деяких варіантах втілення пропонується біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ, що має СОЗ-зв'язувальне плече, яке містить важкий ланцюг клону антитіла СОЗВ219. У деяких варіантах втілення пропонується біспецифічне антитіло до ВСМА х
СОЗ, що має СОЗ-зв'язувальне плече, яке містить важкий ланцюг і легкий ланцюг клону антитіла СОЗВ219. У деяких варіантах втілення пропонується біспецифічне антитіло до ВСМА х
СОЗ, що має ВСМА-зв'язувальне плече, яке містить важкий ланцюг клону антитіла ВСМВб69, вВСМВ117, ВСМВ123, ВСМВ128, ВСМВ129, ВСМВ176 або ВСМВ177, і СОЗ-зв'язувальне плече, яке містить важкий ланцюг клону антитіла СОЗ3ЗВ219. У деяких варіантах втілення пропонується біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ, що має ВСМА-зв'язувальне плече, яке містить важкий ланцюг і легкий ланцюг клону антитіла ВСМВб69, ВСМВ117, ВСМВ123, ВСМВ128, ВСМВ129,
ВСМВ176 або ВСМВ177, і СОЗ3-зв'язувальне плече, яке містить важкий ланцюг і легкий ланцюг клону антитіла СОЗВ219.
Ілюстративний приклад біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ наведено в таблиці 9.
Були описані різні формати біспецифічних антитіл, і нещодавно вони були розглянуті в публікації Спатез апа Вагу (2009) Сиг Оріп Огид рібзс ЮОем 12: 276.
У деяких варіантах втілення біспецифічне антитіло за цим винаходом являє собою діатіло, крос-тіло, або біспецифічне антитіло, отримане шляхом контрольованого обміну РГар-плечей, як описано в цьому винаході.
У деяких варіантах втілення біспецифічні антитіла включають у себе Ідо-подібні молекули з комплементарними СНЗ-доменами для посилення гетеродимеризації; рекомбінантні Ідс-подібні молекули для подвійного націлювання, де кожна з двох сторін молекули містить Гар-фрагмент або частину Раб-фрагмента принаймні з двох різних антитіл; злиті молекули ІДС, в яких повнорозмірні антитіла (ДС злиті для включення додаткового Гар-фрагмента або частин Еар- фрагмента; злиті молекули Ес, в яких одноланцюгові молекули Ем або стабілізовані діатіла злиті з константними доменами важкого ланцюга, Ес-ділянками або їхніми частинами; злиті молекули
Еар, в яких разом злиті різні Рар-фрагменти; антитіла на основі 5сСЕм, діатіл і важких ланцюгів (наприклад, доменні антитіла, нанотіла), в яких різні молекули одноланцюгових Ем різних діатіл або різних антитіл з важкими ланцюгами (наприклад, доменних антитіл, нанотіл) зливають один з одним або з іншим білком або молекулою-носієм.
У деяких варіантах втілення Ідс-подібні молекули з комплементарними СНЗ-доменами включають молекули Тгіотар/оОцадгота (Тгіоп Рпапта/Егезепіи5 Віоїесі), «виступи-в-западини» (Сепепієсн), Сто55МАБ (Коспе) і електростатично відповідні антитіла (Атдеп), Г02-У (Сепепіесії), доменне антитіло сконструйоване за допомогою обміну ланцюгів (ЗЕЕ»Ороду) (ЕМО зегопо), Вісіопіс (Мегих) і ОиоВодуф (Септаб А/5).
У деяких варіантах втілення рекомбінантні ІдсС-подібні молекули для подвійного націлювання включають (0Т)-Ід для подвійного націлювання (з5К«К/Оотапії5), антитіло «два в одному» (Сепепіесії), перехресно-зв'язані Маб (Каппапо5 Сапсег Сепіег), тАба2 (Е-іаї) і Сомх- роду (СоуХх/Рії2ег).
У деяких варіантах втілення злиті молекули Ідс включають (0МО)-ІЩ із подвійним варіабельним доменом (АБбБої), ІдсС-подібне біспецифічне антитіло (ІппСіопе/ЕїЇї І Шу), т52АБ (Медіттипе/А7), В5АБ (7утодепеїйс5), НЕКСИОГЕ5 (Віодеп Ідес) і ТмАБ (Коспе).
У деяких варіантах втілення злиті молекули Ес включають гібриди ЗсЕмМ/Ес (Асадетіс
Іпзійшіоп), ЗСОКРІОМ (Етегдепі Віозоїшіоп5/Тгиріоп, 2утодепеїіс5/ВМ5), антитіло за технологією перенацілювання на основі подвійної афінності (БЕс-ОАКТ) (МасгосСепісв5) і
Оиа(ЗсеЕм)2-Раб (Національний медичний дослідницький центр антитіл, Китай).
У деяких варіантах втілення біспецифічні антитіла з ЕРар-злиттям включають Е(ар)2 (Медагех/"АМОЕМ), антитіла «подвійної дії» або Віх-Раб (Сепепіесі), антитіло типу «причал на замку» (ОМ) (ІттипоМеаїс5), двовалентне біспецифічне (Віоїеспої) і Еаб-Ем (СВ-СеїПпеспн).
Антитіла на основі 5СЕм, діатіл і доменні антитіла включають, серед іншого, біспецифічний енгейджер Т-клітин (ВІТЕ) (Місготею), тандемне діатіло (Тапдар) (Айітей), антитіло за технологією перенацілювання на основі подвійної афінності (ОАКТ) (Масгосепісв5), одноланцюгове діатіло (Асадетіс), ТСК-подібні антитіла (АТ, Кесеріогі одіс5), злиття ЗСЕмМ людського сироваткового альбуміну людини (Меїтітаск) і СОМВООУ (Ерідеп Віоїесі)), нанотіла подвійного націлювання (Абіупх), доменні антитіла подвійного націлювання тільки з важким ланцюгом.
Повнорозмірні біспецифічні антитіла згідно з цим винаходом можуть бути отримані, 60 наприклад, з використанням обміну Еаб-плечей (або обміну напівмолекул) між двома моноспецифічними двовалентними антитілами шляхом введення заміщень у інтерфейс СНЗ важкого ланцюга в кожній напівмолекулі для сприяння утворенню гетеродимера з двох напівмолекул антитіл, що мають чітку специфічність у безклітинному середовищі іп міго, або за допомогою коекспресії. Реакція обміну Рар-плечей є результатом реакції ізомеризації дисульфідного зв'язку й дисоціації-асоціації доменів СНЗ. Дисульфідні зв'язки важких ланцюгів у шарнірних ділянках батьківських моноспецифічних антитіл відновлюються. Отримані вільні залишки цистеїну одного з батьківських моноспецифічних антитіл утворюють із залишками цистеїну другої батьківської молекули моноспецифічного антитіла дисульфідний зв'язок між важкими ланцюгами, і одночасно за допомогою дисоціації-асоціації відбувається вивільнення й реорганізація доменів СНЗ батьківських антитіл. Домени СНЗ Раб-плечей можуть бути сконструйовані для більшого сприяння гетеродимеризації порівняно з гомодимеризацією.
Отриманий продукт являє собою біспецифічне антитіло, що має два ЕРар-фрагменти або половини молекул, кожна з яких зв'язує окремий епітоп, тобто епітоп на ВСМА і епітоп на СОЗ.
У контексті цього документа термін «гомодимеризація» стосується взаємодії двох важких ланцюгів, які мають ідентичні амінокислотні послідовності СНЗ. У контексті цього документа термін «гомодимер» стосується антитіла, яке має два важкі ланцюги з ідентичними амінокислотними послідовностями СНЗ.
У контексті цього документа термін «гетеродимеризація» стосується взаємодії двох важких ланцюгів, які мають неідентичні амінокислотні послідовності СНЗ. У контексті цього документа термін «гетеродимер» стосується антитіла, яке має два важкі ланцюги з неідентичними амінокислотними послідовностями СНЗ.
Стратегію «виступ-у-западину» (див., наприклад, міжнародну публікацію Мо М/о 2006/028936) можна використовувати для створення повнорозмірних біспецифічних антитіл.
Коротко, вибрані амінокислоти, що утворюють інтерфейс доменів СНЗ у ЇДО людини, можуть бути мутовані в позиціях, що впливають на взаємодію доменів СНЗ, щоб стимулювати утворення гетеродимера. Амінокислоту з малим бічним ланцюгом (западина) вводять у важкий ланцюг антитіла, що специфічно зв'язує перший антиген, а амінокислоту з великим бічним ланцюгом (виступ) вводять у важкий ланцюг антитіла, що специфічно зв'язує другий антиген.
Після коекспресії двох антитіл, у результаті переважної взаємодії важкого ланцюга з
Зо «западиною» з важким ланцюгом з «виступом», утворюється гетеродимер. Прикладами пар заміщень СНЗ, що утворюють виступ і западину, є (визначені як модифіковане положення в першому домені СНЗ першого важкого ланцюга/модифіковане положення в другому домені СНЗ другого важкого ланцюга): Т366У/Р405А, Т366бУМ/Е40О5УМ, Е405МУ/у407А, Т394М//у407Т, т3945/у7407А, Т366МУ/13945, Е405У/13945 і Т366УМ/136651368А У407У.
Можна застосовувати інші стратегії, такі як стимулювання гетеродимеризації важкого ланцюга з використанням електростатичних взаємодій шляхом заміщення позитивно заряджених залишків на одній поверхні СНЗ і негативно заряджених залишків на другій поверхні
СНЗ, як описано в публікації патенту США Мо 052010/0015133; публікації патенту США Мо 052009/0182127; публікації патенту США Мо ОШ52010/028637 або в публікації патенту США Мо 0О52011/0123532. В інших стратегіях гетеродимеризацію можна стимулювати шляхом наступних заміщень (визначені як модифіковане положення в першому домені СНЗ першого важкого ланцюга/модифіковане положення вв другому домені СНЗ другого важкого ланцюга):
ІЇЗ51У ЕГ405АУ407М/ТЗ94МУ, ТЗ6бІ К392М Т394МУ/г405А У407МУ,
ТЗ6бІ КЗ392М Т394МУ/Р405А У407М, 1351 У407А/1З6бА К409Б, 1351 У407А/1366М КаОЗг
М407А/1366А К409Е або Т350М 1351 ЕГ405А У407У/1350У 13661 КЗ3921 Т394МУ, як описано в публікації патенту США Мо О52012/0149876 або в публікації патенту США Мо 05201 3/0195849.
На додаток до способів, описаних вище, біспецифічні антитіла згідно 3 цим винаходом можна отримувати іп міго у безклітинному середовищі шляхом введення асиметричних мутацій у області СНЗ3 двох моноспецифічних гомодимерних антитіл і утворення біспецифічного гетеродимерного антитіла з двох батьківських моноспецифічних гомодимерних антитіл у відновних умовах, щоб забезпечити ізомеризацію дисульфідного зв'язку відповідно до способів, описаних у міжнародній патентній публікації Ме УМ02011/131746. У цих способах перше моноспецифічне двовалентне антитіло (наприклад, антитіло до ВСМА) і друге моноспецифічне двовалентне антитіло (наприклад, антитіло до СОЮЗ) сконструйовані так, щоб мати певні заміщення в домені СНЗ, які сприяють стабільності гетеродимера; антитіла інкубують разом у відновних умовах, необхідних для забезпечення ізомеризації дисульфідного зв'язку в залишках цистеїну в шарнірній ділянці; таким чином створюють біспецифічне антитіло шляхом обміну
Еаб-плечей. Умови інкубації оптимально можуть бути відновлені до невідновних умов.
Прикладами відновлюючих агентів, що можуть використовуватися, є 2-меркаптоетиламін (2- бо МЕА), дитіотреїтол (ОТ), дитіоеритритол (ОТЕ), глутатіон, трис(2-карбоксіетилуфосфін (ТСЕР),
І -цистеїн і бета-меркаптоетанол, переважно відновлювальний агент вибирають із групи, що складається з: 2-меркаптоетиламіну, дитіотреїтолу й трис(2-карбоксіетил)уфосфіну. Наприклад, можна використовувати інкубування протягом принаймні 90 хв за температури принаймні 20 "С за присутності принаймні 25 мМ 2-МЕА або за присутності принаймні 0,5 мМ дитіотреїтолу за рН у діапазоні 5-8, наприклад за рН 7,0 або за рн 74.
Крім описаних мультиспецифічних антитіл до ВСМА х СОЗ також пропонуються полінуклеотидні послідовності, здатні кодувати описані мультиспецифічні антитіла до ВСМА х
СО3. У цьому винаході також пропонуються вектори, які містять описані полінуклеотиди, а також клітини, які експресують мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ3. Також описано клітини, здатні експресувати описані вектори. Ці клітини можуть бути клітинами ссавців (такими як клітини 293Е, клітини СНО), клітинами комах (такими як клітини 517), дріжджовими клітинами, рослинними клітинами або клітинами бактерій (таких як Е. сої). Описані антитіла можна також отримати за допомогою гібридомних клітин.
Терапевтична композиція і способи лікування з застосуванням мультиспецифічних антитіл і їхніх мультиспецифічних антигензв'язувальних фрагментів
Описані вище біспецифічні антитіла до ВСМА, наприклад описані вище біспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ, застосовуються для терапії. Зокрема біспецифічні антитіла до ВСМА застосовуються для лікування раку. У цьому винаході також пропонуються терапевтичні композиції для лікування гіперпроліферативного порушення у ссавців, які містять терапевтично ефективну кількість мультиспецифічного антитіла або мультиспецифічного антигензв'язувального фрагмента, описаного в цьому документі, і фармацевтично прийнятний носій. У переважних варіантах втілення мультиспецифічне антитіло являє собою мультиспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ, описане в цьому документі, або його мультиспецифічний антигензв'язувальний фрагмент, і більш переважно біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЮЗ, описане в цьому документі або його ВСМА х СО3-біспецифічний антигензв'язувальний фрагмент. В одному варіанті втілення вказана фармацевтична композиція призначена для лікування раку, що експресує ВСМА, включаючи (серед іншого) наступні види раку: ракові захворювання В-клітин, що експресують ВСМА, такі як множинна мієлома (ММ); і інші види раку з експресією ВСМА, які ще будуть визначені згодом. Конкретні
Зо біспецифічні антитіла, які можна застосовувати для лікування раку, такого як гематологічний рак, включаючи описані вище конкретні види, включають антитіла ВСМВ69, ВСМВ117, вСМВ123, ВСМВ128, ВСМВ129, ВСМВ176, або ВСМВ177, або СО3В219. Одним прикладом біспецифічного антитіла, яке застосовується для лікування раку, такого як гематологічний рак, включаючи наведені конкретні види цього раку, є ВСМВ72.
Фармацевтичні композиції що пропонуються в цьому винаході, містять: а) ефективну кількість мультиспецифічного антитіла або фрагмента антитіла за цим винаходом і б) фармацевтично прийнятний носій, який може бути інертним або фізіологічно активним. У переважних варіантах втілення мультиспецифічне антитіло являє собою мультиспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ3, описане в цьому документі, або його мультиспецифічний антигензв'язувальний фрагмент, і більш переважно біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ3, описане в цьому документі, або його ВСМА х СОЗ3-біспецифічний антигензв'язувальний фрагмент. У контексті цього документа термін «фармацевтично прийнятні носії» включає всі без винятку розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні й протигрибкові агенти тощо, які є фізіологічно сумісними. Приклади відповідних носіїв, розріджувачів і/або допоміжних речовин включають одне або більше з води, фізіологічного розчину, фосфатного буферного сольового розчину, декстрози, гліцерину, етанолу тощо, а також будь-які їхні комбінації. У багатьох випадках до композиції переважно включати ізотонічні агенти, такі як цукри, поліспирти або хлорид натрію. Зокрема, відповідні приклади придатного носія включають: (1) фосфатний буферний сольовий розчин Дульбекко, рН приблизно 7,4, який містить або не містить приблизно від 1 мг/мл до 25 мг/мл сироваткового альбуміну людини, (2) 0,9 95 фізіологічний розчин (0,9 95 мас./об. хлориду натрію (масі)) і (3) 5 95 (мас./об.) декстрози; і може також містити антиоксидант, такий як триптамін, і стабілізатор, такий як Твін-20Ф).
Композиції, описані в цьому документі, можуть також містити додатковий терапевтичний агент, необхідний для лікування конкретного порушення. Переважно, мультиспецифічне антитіло або фрагмент антитіла й додаткова активна сполука матимуть комплементарні види дії і не будуть несприятливо впливати один на інший. У переважному варіанті втілення додатковий терапевтичний агент являє собою цитарабін, антрациклін, дигідрохлорид гістаміну або інтерлейкін 2. У переважному варіанті втілення додатковий терапевтичний агент являє собою хіміотерапевтичний агент.
Композиції за цим винаходом можуть бути в різних формах. Такі форми включають, наприклад, рідкі, напівтверді й тверді лікарські форми, але переважна форма залежить від передбачуваного шляху введення й терапевтичного застосування. Типові переважні композиції перебувають у вигляді розчинів для ін'єкцій або інфузій. Переважним шляхом введення є парентеральний (наприклад внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньочеревний, підшкірний). У переважному варіанті втілення композиції за цим винаходом вводять внутрішньовенно у вигляді болюса або шляхом безперервної інфузії протягом певного періоду часу. В іншому переважному варіанті втілення їх вводять шляхом внутрішньом'язової, підшкірної, внутрішньосуглобової, інтрасиновіальної, внутрішньопухлинної, навколопухлинної, внутрішньовогнищевої або навколовогнищевої ін'єкції щоб забезпечити місцеву й системну терапевтичну дію.
Стерильні композиції для парентерального введення можуть бути отримані шляхом включення до них антитіла, фрагмента антитіла або кон'югату антитіла за цим винаходом у необхідній кількості у відповідному розчиннику з подальшою стерилізацією за допомогою мікрофільтрації. Як розчинник або носій можна використовувати воду, фізіологічний розчин, фосфатний буферний сольовий розчин, декстрозу, гліцерин, етанол тощо, а також будь-які їхні комбінації. У багатьох випадках до композиції переважно включати ізотонічні агенти, такі як цукри, поліспирти або хлорид натрію. Ці композиції можуть також містити ад'юванти, зокрема агенти для змочування, ізотонічності, емульгації, диспергування й стабілізації. Стерильні композиції для парентерального введення можуть бути також отримані у вигляді стерильних твердих композицій, які можуть бути розчинені під час застосування в стерильній воді або будь- якому іншому стерильному середовищі, придатному для ін'єкцій.
Мультиспецифічне антитіло або фрагмент антитіла можна також вводити перорально.
Таблетки, пігулки, порошки (желатинові капсули, саше) або гранули можуть використовуватися як тверді композицій для прийому всередину. У цих композиціях активний інгредієнт за цим винаходом змішують у атмосфері аргону з одним або більше інертними розріджувачами, такими як крохмаль, целюлоза, сахароза, лактоза або діоксид кремнію. Крім розріджувачів, ці композиції можуть також містити інші речовини, наприклад, одну або більше ковзних речовин, таких як стеарат магнію або тальк, барвник, покриття (драже) або лак.
Зо Як рідкі композиції для прийому всередину можна використовувати фармацевтично прийнятні розчини, суспензії, емульсії, сиропи й еліксири, які містять інертні розріджувачі, такі як вода, етанол, гліцерин, рослинні олії або парафінове масло. Крім розріджувачів, ці композиції можуть містити інші речовини, наприклад, зволожуючі речовини, підсолоджувачі, загусники, смако-ароматичні речовини або стабілізатори.
Дози залежать від бажаного ефекту, тривалості лікування й використовуваного шляху введення; зазвичай вони становлять від 5 мг до 1000 мг на добу перорально для дорослих, причому однократні дози перебувають у діапазоні від 1 мг до 250 мг активної речовини.
Зазвичай лікар визначає відповідне дозування залежно від віку, маси тіла й будь-яких інших чинників, характерних для суб'єкта, якому призначають лікування.
У цьому винаході також пропонуються способи знищення клітини ВСМАж шляхом введення пацієнтові, який цього потребує, мультиспецифічного антитіла, яке зв'язується з вказаним
ВСМА ії має здатність рекрутувати Т-клітини для знищення вказаної клітини ВСМАх (тобто перенаправлення Т-клітин). Будь-які мультиспецифічні антитіла або фрагменти антитіл за цим винаходом можна застосовувати терапевтично. Наприклад, в одному варіанті втілення мультиспецифічне антитіло ВСМВ72 до ВСМА х СОЗ можна використовувати терапевтично для лікування раку у суб'єкта.
У переважному варіанті втілення мультиспецифічні антитіла або фрагменти антитіл за цим винаходом застосовують для лікування гіперпроліферативного порушення у ссавців. У більш переважному варіанті втілення для лікування гіперпроліферативного порушення у ссавців застосовують одну з фармацевтичних композицій, описаних вище, яка містить мультиспецифічне антитіло або фрагмент антитіла за цим винаходом. В одному варіанті втілення порушення являє собою рак. Зокрема, рак являє собою рак, що експресує ВСМА, включаючи (серед іншого) наступні види раку: ракові захворювання В-клітин, що експресують
ВСМА, такі як множинна мієлома (ММ); і інші види раку з експресією ВСМА, які ще будуть визначені згодом. У переважних варіантах втілення мультиспецифічне антитіло являє собою мультиспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ, описане в цьому документі, або його мультиспецифічний антигензв'язувальний Фрагмент, і більш переважно біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ3, описане в цьому документі, або його ВСМА х СО3-біспецифічний антигензв'язувальний фрагмент.
Відповідно, фармацевтичні композиції за цим винаходом застосовують для лікування або профілактики різних видів раку, включаючи (серед іншого) наступні: рак, що експресує ВСМА, включаючи (серед іншого) наступні види раку: ракові захворювання В-клітин, що експресують
ВСМА, такі як гостра множинна мієлома (ММ); і інші види раку з експресією ВСМА, які ще будуть визначені згодом.
Аналогічно, у цьому винаході додатково пропонується спосіб інгібування росту вибраних популяцій клітин, який включає приведення в контакт клітин-мішеней, що експресують ВСМА, або тканини, яка містить такі клітини-мішені, з ефективною кількістю мультиспецифічного антитіла або фрагмента антитіла за цим винаходом, окремо або в комбінації з іншими цитотоксичними або терапевтичними агентами, за присутності мононуклеарної клітини периферичної крові (МКПК). У переважних варіантах втілення мультиспецифічне антитіло являє собою мультиспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ, описане в цьому документі, або його мультиспецифічний антигензв'язувальний фрагмент, і більш переважно біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ3, описане в цьому документі, або його ВСМА х СО3-біспецифічний антигензв'язувальний фрагмент. У переважному варіанті втілення додатковий терапевтичний агент являє собою цитарабін, антрациклін, дигідрохлорид гістаміну або інтерлейкін 2. У переважному варіанті втілення додатковий терапевтичний агент являє собою хіміотерапевтичний агент. Практичну реалізацію способу інгібування росту вибраних популяцій клітин можна здійснювати іп міїко, іп мімо або ех мімо.
Приклади застосування іп міо включають обробку аутологічного кісткового мозку до його трансплантації тому самому пацієнтові, щоб знищити уражені захворюванням або злоякісні клітини; обробки кісткового мозку перед його трансплантацією, щоб знищити компетентні Т- клітини й попередити реакцію «трансплантат проти хазяїна» (РТПХ); обробки клітинних культур, щоб знищити всі клітини, крім бажаних різновидів, які не експресують цільовий антиген; або для знищення різновидів, які експресують небажаний антиген. Звичайний фахівець у цій галузі може легко визначити умови неклінічного використання іп міо.
Приклади клінічного застосування ех мімо для видалення пухлинних клітин з кісткового мозку перед аутологічною трансплантацією під час лікування раку. Лікування можна проводити так, як описано нижче. У пацієнта або іншого індивідуума отримують кістковий мозок, після чого
Зо інкубують у середовищі, яке містить сироватку з додаванням цитотоксичного агента за цим винаходом. Діапазони концентрацій від приблизно 10 мкМ до 1 мкМ, від приблизно 30 хв до приблизно 48 год за приблизно 37 "С. Звичайний фахівець у цій галузі може легко визначити точні умови концентрації й часу інкубації, тобто дозу. Після інкубації клітини кісткового мозку промивають середовищем, яке містить сироватку, і повертають пацієнтові шляхом в/в інфузії відповідно до відомих способів. У тих випадках, коли між часом відбору кісткового мозку й повторною інфузією оброблених клітин пацієнт отримує інше лікування, таке як курс аблятивної хіміотерапії або загальне опромінення тіла, оброблені клітини кісткового мозку зберігають замороженими в рідкому азоті з використанням стандартного медичного обладнання.
Під час клінічного застосування іп мімо суб'єктові який цього потребує, вводять терапевтично ефективну кількість мультиспецифічного антитіла або антигензв'язувального фрагмента. Наприклад, мультиспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ і їхні мультиспецифічні антигензв'язувальні фрагменти можна застосовувати для лікування раку, що експресує ВСМА, у суб'єкта, який цього потребує. У деяких варіантах втілення рак, що експресує ВСМА, являє собою ракове захворювання В-клітин, таке як множинна мієлома (ММ). У переважних варіантах втілення мультиспецифічне антитіло являє собою мультиспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ, описане в цьому документі, або його мультиспецифічний антигензв'язувальний фрагмент, і більш переважно біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ, описане в цьому документі, або його
ВСМА х СОЗ-біспецифічний антигензв'язувальний фрагмент. У деяких варіантах втілення суб'єкт є ссавцем, переважно людиною. У деяких варіантах втілення мультиспецифічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент вводитимуть у вигляді розчину, який було перевірено на стерильність.
Схеми дозування в описаних вище способах лікування й застосування скориговані для забезпечення оптимальної бажаної відповіді (наприклад, терапевтичної відповіді). Наприклад, можна вводити один болюс, можна вводити декілька роздільних доз через певні інтервали часу, або дозу можна пропорційно зменшувати або збільшувати, залежно від показань для конкретних умов терапевтичної ситуації. Парентеральні композиції можуть бути складені у вигляді стандартної лікарської форми для простоти введення та однаковості дозування.
Ефективні дози й схеми лікування мультиспецифічними антитілами й фрагментами залежать від захворювання або стану, що підлягає лікуванню, і можуть бути визначені фахівцем бо у цій галузі. Ілюстративний необмежувальний діапазон терапевтично ефективної кількості сполуки за цим винаходом становить приблизно 0,001-10 мг/кг, наприклад, приблизно 0,001-5 мг/кг, наприклад, приблизно 0,001-2 мг/кг, наприклад, приблизно 0,001-1 мг/кг, наприклад, приблизно 0,001, приблизно 0,01, приблизно 0,1, приблизно 1 або приблизно 10 мг/кг.
Лікар або ветеринар зі звичайною кваліфікацією в цій галузі може легко визначити й призначити необхідну ефективну кількість фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар або ветеринар може почати з призначення нижчої дози мультиспецифічного антитіла або фрагмента, що міститься у фармацевтичній композиції, ніж необхідно для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступово підвищувати дозу до досягнення бажаного ефекту.
Загалом, відповідна добова доза біспецифічного антитіла за цим винаходом буде являти собою кількість сполуки, яка є найменшою дозою, ефективною для отримання терапевтичного ефекту.
Введення може бути, наприклад, парентеральним, таким як внутрішньовенне, внутрішньом'язове або підшкірне. В одному варіанті втілення мультиспецифічне антитіло або фрагмент можна вводити шляхом інфузії у щотижневій дозі, яка розраховується як мг/м. Такі дози, наприклад, можуть бути розраховані на основі доз у мг/кг, запропонованих вище, згідно з наступним рівнянням: доза (мг/кг) х 70 : 1,8. Таке введення можна повторювати, наприклад, від 1 до 8 разів, наприклад, від З до 5 разів. Введення може виконуватися шляхом безперервної інфузії протягом періоду від 2 до 24 год, наприклад, від 2 до 12 год. В одному варіанті втілення для зменшення токсичних побічних ефектів мультиспецифічне антитіло або фрагмент можна вводити шляхом повільної безперервної інфузії протягом тривалого періоду часу, наприклад, більше ніж 24 години.
В одному варіанті втілення мультиспецифічне антитіло або фрагмент можна вводити в тижневій дозі, розрахованій як фіксована доза для введень до восьми разів, наприклад, від чотирьох до шести разів, яка дається один раз на тиждень. Таку схему можна повторювати за необхідності один або більше разів, наприклад, через шість місяців або дванадцять місяців. Такі фіксовані дози, наприклад, можуть бути розраховані на основі доз у мг/кг, запропонованих вище, приймаючи масу тіла за 70 кг. Дозу можна визначити або скоригувати шляхом вимірювання кількості біспецифічного антитіла за цим винаходом у крові після введення, наприклад, шляхом відбору біологічного зразка й використання антиідіотипічних антитіл, мішенню для яких є антигензв'язувальна область мультиспецифічних антитіл до ВСМА за цим винаходом.
В одному варіанті втілення мультиспецифічне антитіло або фрагмент можна вводити як підтримувальну терапію, наприклад, один раз на тиждень протягом періоду шість місяців або більше.
Мультиспецифічне антитіло або фрагмент також можна вводити профілактично з метою зниження ризику розвитку раку, затримки початку наступного виникнення події прогресування раку й/(або зменшення ризику рецидиву раку на стадії ремісії.
Мультиспецифічні антитіла і їхні фрагменти, описані в цьому документі, також можна вводити у складі комбінованої терапії, тобто в комбінації з іншими терапевтичними агентами, що відповідають захворюванню або стану, який лікують. Відповідно, в одному варіанті втілення лікарський засіб, що містить антитіло, призначено для комбінації з одним або більше додаткових терапевтичних агентів, наприклад, хіміотерапевтичним агентом. У деяких варіантах втілення терапевтичний агент являє собою цитарабін, антрациклін, дигідрохлорид гістаміну або інтерлейкін 2. Таке комбіноване введення може бути одночасним, окремим або послідовним (у будь-якому порядку). Для одночасного введення агенти можна вводити як одну композицію або як окремі композиції, залежно від обставин.
В одному варіанті втілення пропонується спосіб лікування у суб'єкта порушення з залученням клітин, що експресують ВСМА, причому цей спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості мультиспецифічного антитіла або фрагмента, такого як біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ, описане в цьому документі, і проведення суб'єктові, який цього потребує, променевої терапії. В одному варіанті втілення пропонується спосіб лікування або профілактики раку, причому цей спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості мультиспецифічного антитіла або фрагмента, такого як антитілло до ВСМА х СОЗ, описане в цьому документі, і проведення суб'єктові, який цього потребує, променевої терапії. Променева терапія може включати опромінення або її поєднання з введенням пацієнтові радіофармацевтичних препаратів. Джерело випромінення може бути зовнішнім або внутрішнім для пацієнта, якого лікують (лікування опроміненням, наприклад, може здійснюватися у вигляді зовнішньої променевої терапії (ЕВКТ) або брахітерапії (ВТ)). Радіоактивні елементи, які можна використовувати для практичної реалізації таких способів, включають наприклад, радій, цезій- 137, іридій-192, америцій-241, золото-198, кобальт-57, мідь-67, технецій-99, йодид-123, йодид- 60 131 ї індій-111.
Зо
Набори
У цьому винаході також пропонуються набори, наприклад такі, що містять мультиспецифічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент і інструкції з використання антитіла або фрагмента для знищення конкретних типів клітин. У переважних варіантах втілення мультиспецифічне антитіло являє собою мультиспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ, описане в цьому документі, або його мультиспецифічний антигензв'язувальний фрагмент, і більш переважно біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЮЗ, описане в цьому документі, або його
ВСМА х СОЗ-біспецифічний антигензв'язувальний фрагмент. Інструкції можуть включати вказівки щодо використання мультиспецифічного антитіла або його антигензв'язувального фрагмента іп міїго, іп мімо або ех мімо.
Звичайно набір матиме комірку, що містить мультиспецифічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент. Мультиспецифічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент може бути в ліофілізованій формі, рідкій формі або в іншій формі, яку можна коригувати для включення в набір. Набір може також містити додаткові елементи, необхідні для практичної реалізації способу, описаного в інструкціях до набору, такі як стерильний розчин для розведення ліофілізованого порошку, додаткові агенти для комбінації з мультиспецифічним антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом перед введенням пацієнтові і інструменти, які допомагають вводити мультиспецифічне антитіло або його антигензв'язувальний Фрагмент пацієнтові.
Діагностичні види використання
Мультиспецифічні антитіла й фрагменти, описані в цьому документі, можна також використовувати з діагностичною метою. Таким чином, також пропонуються діагностичні композиції, які містять мультиспецифічне антитіло або фрагменти, визначені в цьому описі, і їхнє використання. У переважних варіантах втілення мультиспецифічне антитіло являє собою мультиспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ3, описане в цьому документі, або його мультиспецифічний антигензв'язувальний фрагмент, і більш переважно біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ3, описане в цьому документі, або його ВСМА х СО3-біспецифічний антигензв'язувальний фрагмент. В одному варіанті втілення цього винаходу пропонується набір для діагностики раку, який містить контейнер із біспецифічним антитілом до ВСМА х СОЗ, і один
Зо або більше реагентів для виявлення зв'язування антитіла з ВСМА. Реагенти можуть включати, наприклад, флуоресцентні мітки, ферментні мітки або інші виявлювані мітки. Реагенти можуть також включати вторинні або третинні антитіла або реагенти для ферментативних реакцій, причому в ході ферментативних реакцій отримують продукт, який можна візуалізувати.
Наприклад, мультиспецифічні антитіла, описані в цьому документі, або їхні антигензв'язувальні фрагменти можуть бути мічені радіоактивною міткою, флуоресцентною міткою, епітопною міткою, біотином, хромофорною міткою, електрохемілюмінесцентною міткою (ЕХЛ), ферментом, рутенієм, ""Пи-ДОТА, ПП ППІп-діетилентриамінпентаоцтовою кислотою (ДТПК), пероксидазою хрону, лужною фосфатазою й бета-галактозидазою, полігістидином або аналогічними мітками, відомими в цій галузі.
Приклади втілення описаного об'єкта винаходу
Для кращого й більш повного описання об'єкта винаходу в цьому розділі наведено пронумеровані приклади втілення представленого об'єкта винаходу.
Пронумеровані варіанти втілення: 1. Рекомбінантне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що імуноспецифічно зв'язуються з ВСМА, причому антитіло має важкий ланцюг і легкий ланцюг, при цьому вказаний важкий ланцюг містить: а. область 1, що визначає комплементарність, важкого ланцюга (СОКІ), що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5260 ІЮ МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність з»ЕО
БО ІО МО: 6; р. СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЕС ІО МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 6; с. СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 7, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЕС ІО МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 6; а. СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ХЕО ІЮО МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЕС ІО МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 19;
е. СОК!Т важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО ІЮО МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЕС ІО МО: 8, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 6;
Її. СОК! важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 13, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 19; 9. СОКІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 13, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 8, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 19. 2. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1, які відрізняються тим, що вказане антитіло додатково містить СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 24, СОМК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮО МО: 25, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕЮ
ІО МО: 26. 3. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1, які відрізняються тим, що важкий ланцюг антитіла за п. (а) містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 27; важкий ланцюг антитіла за п. (Б) містить амінокислотну послідовність «ЕС ІЮ МО: 57; важкий ланцюг антитіла за п. (Її) містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 34; важкий ланцюг антитіла за п. (К) містить амінокислотну послідовність ХЕ ІЮО МО: 39; важкий ланцюг антитіла за п. (І) містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 40; важкий ланцюг антитіла за п. (т) містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 58 або важкий ланцюг антитіла за п. (п) містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 43. 4. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 2 або варіантом втілення З, які відрізняються тим, що легкий ланцюг антитіла містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 28. 5. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіантів втілення 1-4, які відрізняються тим, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язується з позаклітинним доменом ВСМА людини. 6. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіантів втілення 1-5, які
Зо відрізняються тим, що антитіло або антигензв'язувальний фрагмент являють собою антитіло або антигензв'язувальний фрагмент людини. 7. Антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіантів втілення 1-6, який відрізняється тим, що антигензв'язувальний фрагмент являє собою Рар-фрагмент, Рар2-фрагмент або одноланцюгове антитіло. 8. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіантів втілення 1-7, які відрізняються тим, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент інгібує взаємодію
ВСМА їі АРРІГ.. 9. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 8, які відрізняються тим, що за результатами аналізу ЕГІ5БА антитіло або антигензв'язувальний фрагмент демонструє значення ІС50О для взаємодії ВСМА і АРКІ!. на рівні приблизно 5,9 нМ. 10. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіантів втілення 1-9, які відрізняються тим, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент являє собою Ід. 11. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіантів втілення 1-10, що має ізотип Ідоа4. 12. Антитіло за варіантом втілення 11, яке відрізняється тим, що Ід04 має у своїй Ес-області заміщення 5228Р, заміщення 1 234А і заміщення 1 235А. 13. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіантів втілення 1-12, які відрізняються тим, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент імуноспецифічно зв'язується з ВСМА людини й перехресно реагує з ВСМА яванського макака. 14. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіантів втілення 1-13, які відрізняються тим, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язується з ВСМА на поверхні клітин мієломи людини. 15. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіантів втілення 1-14, які відрізняються тим, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язується з ВСМА на поверхні клітин множинної мієломи людини. 16. Рекомбінантна клітина, яка експресує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіантів втілення 1-15. 17. Клітина за варіантом втілення 16, яка відрізняється тим, що ця клітина являє собою гібридому.
18. Клітина за варіантом втілення 16, яка відрізняється тим, що антитіло отримують рекомбінантним способом. 19. Рекомбінантне біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або його біспецифічний фрагмент, який зв'язує ВСМА х СОЗ, що містить: а) перший важкий ланцюг (НС);
Юр) другий важкий ланцюг (НС); с) перший легкий ланцюг (І С1); і а) другий легкий ланцюг (І Сг), де НС1 пов'язаний із І С1, а НС2 пов'язаний із І С2, і де НС1 містить 5ЕО ІЮ МО: 59, 5ЕО ІЮ
МО: 60 ії 5ЕО ІЮО МО: 61, а ГС1 містить БЕО ІЮ МО: 62, 5БО ІО МО: 63 і 5ЕО ІО МО: 64 з утворенням першого антигензв'язувального сайту, який імуноспецифічно зв'язує СОЗ, і де НС2 містить ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5 і БЕО ІЮ МО: б а, а І! С2 містить 5ЕО ІЮ МО: 24, 5ЕО ІЮО МО: 251 5ЕО ІО МО: 26 з утворенням другого антигензв'язувального сайту, який імуноспецифічно зв'язує ВСМА. 20. Рекомбінантне біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або його фрагмент за варіантом втілення 19, що містить НС1, який містить 5ЕО ІЮ МО: 55, І С1, який містить ЗЕО ІО МО: 56,
НС2, який містить ЗЕО ІЮ МО: 65, і І С2, який містить: а) ЗЕО ІЮ МО: 66 або 5) ЗЕО І МО: 76. 21. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 20, які відрізняються тим, що антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент являє собою до. 22. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіанта втілення 19, варіанта втілення 20 або варіанта втілення 21, які відрізняються тим, що антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент має ізотип досі. 23. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за варіантами втілення 19-22, які відрізняються тим, що антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент імуноспецифічно зв'язується з ВСМА людини з афінністю принаймні 0,22 нМ, як визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. 24. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за варіантами втілення 19-23, які відрізняються тим, що антитіло або його біспецифічний
Зо зв'язувальний фрагмент зв'язується з ВСМА на поверхні клітин мієломи людини. 25. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за варіантами втілення 19-24, які відрізняються тим, що антитіло або його біспецифічний зв'язувальний фрагмент зв'язується з ВСМА на поверхні клітин множинної мієломи людини. 26. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за варіантами втілення 19-25, які відрізняються тим, що антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент індукує іп міго активацію Т-клітин з ЕСво менше ніж приблизно 0,37 нМ. 27. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за варіантами втілення 19-26, які відрізняються тим, що антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент індукує іп міго цитотоксичність клітин, що експресують ВСМА, опосередковану Т- клітинами, з ЕСзо менше ніж приблизно 0,45 НМ. 28. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за варіантами втілення 19-27, які відрізняються тим, що антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент не є агоністом ВСМА. 29. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за варіантами втілення 19-28, які відрізняються тим, що антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент у концентраціях до 10 нМ не впливає на активацію МЕ-кВ. 30. Рекомбінантна клітина, яка експресує антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіантів втілення 19-29. 31. Клітина за варіантом втілення 30, яка відрізняється тим, що ця клітина являє собою гібридому. 32. Спосіб лікування суб'єкта, який має ракове захворювання, причому вказаний спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента за будь-яким із варіантів втілення 19-29 суб'єктові, який цього потребує, протягом часу, достатнього для лікування раку. 33. Спосіб інгібування росту або проліферації ракових клітин, причому вказаний спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента за будь-яким із варіантів втілення 19-29 для інгібування росту або проліферації ракових клітин. 34. Спосіб перенаправлення Т-клітини до ракової клітини, що експресує ВСМА, причому бо вказаний спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента за будь-яким із варіантів втілення 19-29 для перенаправлення Т-клітини до ракового ураження. 35. Спосіб за варіантом втілення 32, 33 або 34, який відрізняється тим, що рак являє собою гематологічний рак. 36. Спосіб за варіантом втілення 35, який відрізняється тим, що гематологічний рак являє собою В-клітинний рак, що експресує ВСМА. 37. Спосіб за варіантом втілення 36, який відрізняється тим, що В-клітинний рак, що експресує ВСМА, являє собою множинну мієлому. 38. Спосіб за варіантом втілення 32, який додатково включає введення другого терапевтичного агента. 39. Спосіб за варіантом втілення 38, який відрізняється тим, що другий терапевтичний агент являє собою хіміотерапевтичний агент або націлений протираковий терапевтичний засіб. 40. Спосіб за варіантом втілення 39, який відрізняється тим, що хіміотерапевтичний агент являє собою цитарабін, антрациклін, дигідрохлорид гістаміну або інтерлейкін 2. 41. Фармацевтична композиція, яка містить біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь-яким із варіантів втілення 19-29 і фармацевтично прийнятний носій. 42. Спосіб створення біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента за будь-яким із варіантів втілення 19-29 шляхом культивування клітини за будь-яким із варіантів втілення 30-31. 43. Виділений синтетичний полінуклеотид, який кодує НС1, НС2, І1ІС1 або 1с2 біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента за будь- яким із варіантів втілення 19-29. 44. Набір, який містить біспецифічне антитілло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент, як визначено в будь-якому з варіантів втілення 19-29 і/або полінуклеотид, як визначено в пункті 44 формули винаходу, і упаковку для них.
Короткий опис рисунків
Фіг. 1А і 18. Вектори, використані для клонування ВСМА людини (Фіг. 1А) і ВСМА яванського макака (Фіг. 18).
Зо Фіг. 2А-20.. Локалізація епітопів ВСМВб9 і взаємодії між ВСМА людини й ВСМВбО. (Фіг. 2А).
Огляд локалізації епітопів. ВСМВб69 зв'язується з увігнутою поверхнею ВСМА (області, виділені чорним кольором). (Фіг. 28). Мапа взаємодій, на якій показані прямі контакти між ВСМА і
ВСМВб69. З ВСМА контактують залишки усіх СОК, за виключенням СОК-1 1. Ван-дер-Ваальсові взаємодії показано пунктирними лініями, водневі зв'язки показано суцільними лініями зі стрілками, які позначають водневі зв'язки основного ланцюга й вказують на атоми в основному ланцюзі. Залишки ВСМА, що контактують як з ВСМВБб9, так і з АРКІГ,, обведені чорною рамкою.
Для виявлення контактних залишків використовували граничне значення відстані у 4 А (порогова відстань 3,5 А для Н-зв'язків). (Фі. 2С і Фіг. 20). Зображення крупним планом основних взаємодій ВСМА з легким (Фіг. 2С) і важким (Фіг. 20) ланцюгами ВСМВб9. Н-зв'язки показано у вигляді пунктирних ліній із відстанями в ангстремах.
Фіг. 3. Епітопні й паратопні залишки ВСМВб69. Епітопні й паратопні залишки затемнено, області СОК підкреслено (визначення Кабаї), а залишки ВСМА, що відрізняються від людських, виділені жирним шрифтом і курсивом. Показано лише послідовності гар ВСМВб9 і позаклітинні послідовності ВСМА.
Фіг. 4А і 4В. Області зіткнень між Раб ВСМВб9 і АРКІЇ. (Фіг. 4А) і баб ВСМВб69 ВАЕБЕ (Фіг. 4В).
Структурне перекривання комплексу ВСМА/ВСМВб69 з комплексами ВСМА/АРКІГЇ і ВСМА/ВАЕЕ демонструє області зіткнень між Рабр і лігандом. Показано поверхню ВСМА, яка доступна для розчинника. Молекули Бар і ліганду показано у вигляді сірих і чорних стрічок, відповідно.
Перекривання досягали накладенням еквівалентних атомів Са ВСМА в обох комплексах (ЕМ5О 5О становить 0,9 А для комплексу АРРВІЇ! і 1,2 А для ВАЕРБ).
Фіг. 5. Дані ППР для ВСМВ72 демонструють, що ця молекула має зв'язування з ВСМА людини, яванського макака і миші. Середня Ко для ВСМА яванського макака й миші приблизно у 36 і 402 рази перевищує цей показник для ВСМА людини.
Фіг. 6. Визначення ЕСво для зв'язування ВСМВ72 на клітинних лініях ВСМА". Клітинні лінії забарвлювали щодо ВСМА з використанням ВСМВ72. Наведено геометричні середні інтенсивності флуоресценції зв'язування ВСМВ72 з клітинами. Значення ЕСзо вказані у підпису до фігури. Насичення досягалося за концентрації приблизно 100 нМ. Вважали, що середня інтенсивність флуоресценції має значення ЕСво для клітин Ш2932 (ЕСво - 7,92 нм), ММК (ЕСво т 8,74 НМ), НУО29 (ЕСво - 14,7 нМ), ЕОМ (ЕСво х 17,5 нМ) і ГРІ (ЕСво - 22,3 нМ). Побудову бо графіків і апроксимацію даних виконували в програмному забезпеченні сгарпРай Ргіхт 6 із використанням нелінійної регресії на основі функції з варіабельним кутом нахилу кривої (чотири параметри).
Фіг. 7. Профіль зв'язування ВСМВ72 у цільній крові. Цільну кров від трьох нормальних донорів-людей забарвлювали моноклональними або поліклональними антитілами до ВСМА або
ВСМВ72. Виконували стробування для виявлення лімфоцитів у популяції лейкоцитів з використанням стандартних специфічних щодо клітин маркерів. На панелях наведено інтенсивність забарвлення для одного репрезентативного донора, де суцільні чорні лінії представляють антитіла, що становлять інтерес, а пунктирні лінії з сірим наповненням представляють відповідні ізотипи. У трьох нормальних донорів не спостерігали експресії ВМСА у лімфоцитах, моноцитах, гранулоцитах або плазмоцитоїдних дендритних клітинах. ВСМВ72 демонстрував зв'язування з Т-клітинами СОЗ-- у трьох донорів зі змінною інтенсивністю у різних донорів. ВСМВ?72 не зв'язувався з жодними іншими типами клітин у цьому аналізі.
Фіг. ВА-ВЕ. ВСМВ72-залежна активація Т-клітин за присутності різних клітинних ліній ММ.
Клітини НО29 (Фіг. 9А), ММ.1Е. (Фіг. 98), ЕРМІ 8226 (Фіг. 9С), 0266 (Фіг. 903) і Мм4-11 (Фіг. 9Е) піддавали впливу вказаних антитіл за присутності Т-клітин від шести нормальних донорів (наведено середнє для донора х СПО) і блокатора Ес (2 мг/мл) протягом 48 годин. На графіках наведено значення ЕСв5о. Статистичний аналіз. Для оцінки адекватності відповідності використовували, крім простого факту збіжності моделі, ширину 95 95 довірчого інтервалу навколо ІГодЕСвзо. (Довірчий інтервал навколо ГодЕСвзо використовували тому що він є симетричним; а довірчі інтервали навколо власне ЕСво - ні). Інтервал менше ніж ж/- 2 (або з загальною шириною 95 95 довірчого інтервалу менше 4) вважали адекватним.
Фіг. 9. Зведені дані для значень ЕсСбо і максимальної активації Т-клітин із двох незалежних експериментів із використанням Т-клітин від декількох нормальних донорів. Для кожної клітинної лінії і для кожного експерименту наведено значення окремих донорів і середні значення донорів. Немає даних - аналіз не проводився; відсутність відповідності - програма не може створити криву; « значення - апроксимація на основі ексраполяції за моделлю.
Фіг. Т0А-10Е. ВСМВ72-залежна токсичність, опосередкована Т-клітинами, різних клітинних ліній множинної мієломи. Клітини НО29 (Фіг. 11А), ММ.1К (Фіг. 118), ЕРМІ 8226 (Фіг. 110), 0266 (Фіг. 110)) і Мм4-11 (Фіг. 11ЄЕ) піддавали впливу вказаних концентрацій антитіл за присутності Т-
Зо клітин від шести нормальних донорів (наведено середнє для донора х СПС) і блокатора Ес (2 мг/мл) протягом 48 годин. На графіках наведено значення ЕС»о. Статистичний аналіз. Для оцінки адекватності відповідності використовували, крім простого факту збіжності моделі, ширину 95 95 довірчого інтервалу навколо ГодЕСвзо. (Довірчий інтервал навколо ІодЕсСво використовували тому що він є симетричним; а довірчі інтервали навколо власне ЕСбво - ні).
Інтервал менше ніж ж/- 2 (або з загальною шириною 95 95 довірчого інтервалу менше 4) вважали адекватним.
Фіг. 11. Зведені дані для значень ЕС5о і максимального лізису із двох незалежних експериментів із використанням Т-клітин від декількох нормальних донорів. Для кожної клітинної лінії і для кожного експерименту наведено значення окремих донорів і середні значення донорів. Немає даних - аналіз не проводився; відсутність відповідності - програма не може створити криву; « значення - апроксимація на основі ексраполяції за моделлю.
Фіг. 12. Цитотоксичність і активація Т-клітин у клітинах НОг29. Випробовували біспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ (мутантні молекули ВСМВ72) в аналізі цитотоксичності, опосередкованої Т-клітинами. ВСМА-позитивну клітинну лінію (НО29) інкубували з різними концентраціями антитіл протягом 48 годин за присутності екзогенних Т-клітин людини від нормальних донорів (ІО донорів: М5763 і М6576). Після 48 годин інкубації визначали знищення клітин за допомогою підходу на основі проточної цитометрії (БАС5) і виражали як 905 цитотоксичності на Фіг. 12А. На Фіг. 128 показано активацію Т-клітин, визначену за допомогою посилення експресії СО25 на поверхні Т-клітин. У цілому точки даних тісно суміщені вздовж побудованої кривої відповідності, і варіабельність між донорами Т-клітин і повторними експериментами була незначною.
Фіг. 13. Зведені дані значень ЕС5о для ВСМВ72-опосередкованого вивільнення цитокінів.
Збирали супернатанти клітин ЕРМІ 8226 у експериментах з визначення цитотоксичності (див. приклад 12, Фіг. 8) і аналізували їх на наявність рівнів шести різних цитокінів із використанням мультиплексного аналізу на основі методу М50О. Використовували різні концентрації антитіла
ВСМВ72 (ВСМА х СО3) і контрольних антитіл (ВСМА х нуль і нуль х СОЮЗ).
Фіг. 14А і 148. Аналіз ВСМВ72-залежної цитотоксичності, опосередкованої Т-клітинами, виконували з використанням ВСМА-позитивної клітинної лінії Н9О29. Клітини піддавали впливу різних концентрацій ВСМВ72 за присутності Т-клітин від декількох нормальних донорів (зведені бо дані для трьох донорів М7197, М5137 і Мб457 наведено як репрезентативні) і блокатора Ес (2 мг/мл) протягом 48 годин. Співвідношення ефектор / мішень (Е / Т) становило 5 : 1. На Фіг. 14А наведено потенціал цитотоксичності, а на Фіг. 148 праворуч наведено криві активації Т-клітин, які були подібними для різних серій ВСМВ72.
Фіг. 15. Клітини НО29 обробляли ВСМВ72 (ВСМА х СОЗ3) і контрольними антитілами (ВСМА х нуль і нуль х СОЗ) протягом 30 хвилин у концентраціях, вказаних на Х-осі на верхньому графіку, а загальний білок аналізували з використанням методу простого вестерн-блоту відповідно до стандартного протоколу, як наведено в посібнику споживача Ргоїеіпбітріє. Дані нормалізували з використанням актину як конститутивного гена, а відношення наносили на У-вісь. АРКІЇ і
ВАРЕ індукували фосфорилювання РЗ8, як очікувалося, а антитіла не мали стимулювального впливу за жодної з випробуваних концентрацій.
Фіг. 16А-16Р. Клітини НЕК-МЕКкВ, що експресують ВСМА (Фіг. 16А, Фіг. 16С і Фіг. 16Е) або батьківські клітини (Фіг. 168, Фіг. 160 і Фіг. 16Е) стимулювали ТМЕа і різними концентраціями
АРКІЇ. або ВСМВ72. Аналізували три часові точки: 16 годин (Фіг. 16А і Фіг. 16В), 24 години (Фіг. 16сС і Фіг. 160) і 48 годин (Фіг. 16Е і Фіг. 16Е). ТМЕс індукував активацію МЕ-КВ як у батьківських клітинах НЕК- МІ-КВ, так і в клітинах НЕК-МЕ-КВ-ВСМА, тоді як індукцію АРКІЇ спостерігали лише в ВСМА-специфічному типі клітин. ВСМВ72 не впливало на батьківську клітинну лінію і демонструвало активацію лише за високих концентрацій у клітинах, що експресують ВСМА.
Фіг. 17А і 17В. Т-клітини не демонструють опосередкованої ХЗВСМА і ВСМВ72-залежної активації. ВСМВ?72 (Фіг. 17А) і контрольне антитіло нуль х СОЗ (Фіг. 17В) титрували Т-клітинами від двох нормальних донорів (М7077 і М5137) за присутності різних доз розчинного ЕСО ВСМА.
Дані: середнє х СПО.
Фіг. 18А-18Е. Вплив розчинних факторів 57ВСМА, АРКІЇ і ВАЕРЕ на активацію Т-клітин і опосередкований активацією Т-клітин потенціал цитотоксичності ВСМВ72 у клітинах НеО29.
Клітини піддавали аналізу на знищення протягом 48 годин із використанням донорських Т- клітин (М7077 і М6521) і ВСМВ72. Цільова цитотоксичність зображена на графіках ліворуч, а активація Т-клітин показана праворуч (п - 2). У підписах до фігур наведено значення ЕС5о для кожної обробки. Показано клітинну цитотоксичність за присутності 5ВСМА (Фіг. 18А), АРКІЇ. (Фіг. 188) і ВАЕЕ (Фіг. 18С). Показано активацію Т-клітин за присутності 5ЗВСМА (Фіг. 180), АРКІ!. (Фіг. 187Т) і ВАЕЕ (Фіг. 18Е). Дані: середнє х СПС.
Зо Фіг. 19А і 198. Сигнали з двох незалежних експериментів нормалізували за максимальним сигналом ВСМА-Ес зв'язування з АРКІЇ і ВАЕЕ за відсутності конкуруючих антитіл. Зв'язування
ВСМА з АРКІ!. (Фіг. 194А) і ВАЕЕ (Фіг. 198) зображено графічно як залежність від концентрації
ВСМВТ2 і контрольного антитіла (нуль х СОЮЗ).
Фіг. 20А-20Е. Ефективність цитотоксичності ВСМВ72 проти плазматичних клітин первинної
ММ людини. Заморожені мононуклеарні клітини, отримані з кісткового мозку п'яти різних пацієнтів (ММ240ОВМ (Фіг. 20А), ММ259ВМ (Фіг. 208), ММ27ОВМ (Фіг. 2 "С), ММ276ВМ (Фіг. 200) і
ММ277ВМ (Фіг. 20ЄЕ)) використовували для оцінки зв'язування ВСМВ72 порівняно з контрольним ізотипом Ід(84 (СМТО 9412, ліва панель), цитотоксичності щодо плазматичних клітин (середня панель) і активації Т-клітин (права панель). Для аналізу цитотоксичності Т- клітини від нормального здорового донора М7077 екзогенно додавали до мононуклеарні клітини, отримані з кісткового мозку (ВММС) до зразків пацієнта й інкубували з ВСМВ72 (ВСМА х
СсО3) вС384 (ВСМА х нуль) або СМТО 7008 (нуль х СОЗ3) протягом 48 годин. ВСМВ72 зв'язується з плазматичними клітинами в усіх зразках від донорів у дозозалежний спосіб; середні інтенсивності флуоресценції наносили на МУ-вісь. Слід відзначити втрату живих плазматичних клітин (СО138) і супутнє посилення експресії СО25 на Т-клітинах у відповідь на обробку ВСМВ72. На графіках наведено значення ЕСозхо для активації Т-клітин.
Фіг. 21. Ефективність ВСМВ?72 іп мімо у профілактичній моделі НО2г9.
Фіг. 22. Рівні розчинного ВСМА у сироватці мишей лінії НО29 із ксенотрансплантатом.
Концентрації розчинного ВСМА в сироватці виявляли з використанням набору для ЕГІ5А з
ВСМА людини (КУО Зувіетв5). Рівні розчинного ВСМА були значно нижчими у мишей, яким вводили ВСМВ72 у кількості 1 мкг Її 0,5 мкг/миша, порівняно з ФБР-контролем, що добре корелює з пухлинним навантаженням у цих тварин. Більш низькі дози ВСМВ72 (0,1 мкг/миша) не мали впливу на рівні 5ВСМА або розмір пухлин.
Приклади
Наступні приклади наведені для доповнення попереднього опису винаходу й для кращого розуміння об'єкта винаходу, описаного в цьому документі. Ці приклади не слід розглядати як обмеження описаного об'єкта винаходу. Необхідно розуміти, що приклади й варіанти втілення, описані в цьому документі, наведені тільки з метою ілюстрації, і що для фахівця в цій галузі в світлі цього опису будуть очевидні різні модифікації або зміни, які повинні вважатися включеними до істинного об'єму винаходу, і які можуть бути реалізовані без відхилення від цього об'єму.
Приклад 1. Матеріали
Молекули ЕСО ВСМА
Рекомбінантний людський (п) злитий білок ВСМА-Рс (Ме за каталогом 193-80-050), що відповідає амінокислотам 1-54 НВСМА (ЗЕО ІЮО МО: 1) і рекомбінантний мишачий (т) злитий білок ВСМА-Ес (Мо за каталогом 593-80-050), що відповідає амінокислотам 1-49 тВСМА (5ЕО
ІЮ МО: 2) отримували від компанії КУО Зувхіет5. Рекомбінантний білок ВСМА яванського макака, який готували з кКДНК, отриманої за допомогою методів генного синтезу (патент США Мо 6,670,127; патент США Мо 6,521,427). Перед використанням усі білки тестували на наявність ендотоксинів, а для досліджень фагового пеннінгу біотинілювали. Ці матеріали також використовували для вимірювання зв'язування й афінності.
Розчинний ВСМА людини отримували від АВ Віозсіеєпсе5 (Мо за каталогом РО11Хр, серія Мо 033-013) і використовували в дослідженнях із визначення характеристик.
Молекули АРКІГЇ, ВАЕРЕ, ВАРРЕ-К і ТАСІ
Розчинний ПАРКІ!. (Ме за каталогом 0ОУ884), НВАЕРЕ (Ме за каталогом 2149-ВЕ), НВАБР-К (Мо за каталогом 1162-ВК), що відповідають амінокислотам 7-71 НВАЕРЕ-К, і пТАС1, що відповідає амінокислотам 2-166 ТАСІ, отримували від компанії КО Зузіет5. Для досліджень ППР проводили біотинілювання ВАЕР-К і ТАС1.
Отримання клітинних ліній ВСМА
У клітини ехрі НЕК293 тимчасово трансфікували вектори, що презентували ВСМА людини (Фі. 1А) ії ВСМА яванського макака (Фіг. 18) з використанням стандартних методів. Для стабільної інтеграції плазміди вибрали трансфіковані адгезивні клітини 293, після цього сортували одиночні клітини, і за допомогою ЕАС5 виконували кількісне визначення експресії поверхневого рецептора ВСМА, використовуючи мічене фікоеритрином антитілло ВСМА-РЕ (ЕАВ19ЗР НО Зувієтв).
Приклад 2. Виділення гібридом, що експресують людське моноклональне антитіло до ВСМА
Трансгенну лінію щура з людським імуноглобуліном (Отпікаї Ф; ОМТ, Іпс.) використовували для отримання гібридомних клітин, що експресують людське моноклональне антитіло до ВСМА.
Зо ОтпікКкак» містить химерний людський/щурячий локус ІДН (що включає 22 людські сегменти Мн, усі людські сегменти О ії Он у природній конфігурації, з'єднані з щурячим локусом Сн) разом із повністю людськими локусами Ід (12 Мк, з'єднаних із )к-Ск і 16 МА, з'єднаних з ОА-СХ). (Див., наприклад, О5бропт, еї аї. (2013) У Іттипої! 190(4): 1481-1490). Відповідно, щури демонструють знижену експресію щурячого ІДМ або к, і у відповідь на імунізацію введені людські трансгени важкого й легкого ланцюгів піддаються класовому перемиканню й соматичній мутації з продукуванням високоафінних людських моноклональних антитіл /дс. Отримання й використання ОтпікКаке і геномні модифікації, які несуть такі щури, описано в публікації РСТ
УМО 14/093908 авторів Вгиддетапп еї аї.
Після імунізації рекомбінантним людським ВСМА (ПВСМА) цей трансгенний щур продукує людські антитіла Ід, специфічні до людського ВСМА.
Схему імунізації виконували наступним чином: шістьох щурів імунізували злиттям АВСМА-
Ес. Після 21 діб виконання схеми імунізації у імунізованих щурів збирали лімфатичні вузли, які використовували для отримання чотирьох загальних гібридомних бібліотек. Для ідентифікації тАб, які демонстрували зв'язування з біотинілюьованим ПВСМА, бібліотеки титрували й аналізували з використанням аналізу ЕІ ІЗА. тАбр збирали на М5О планшеті зі стрептавідином.
Після додаткових підтверджуючих скринінгів супернатанти гібридом, що демонстрували зв'язування, специфічне до ВСМА людини і ВСМА яванського макака, секвенували, клонували, експресували й конвертували як у людські ІДС, так і в ЇЧО4.
Приклад 3. Очищення антитіл до ВСМА
Антитіла до ВСМА у просвітлених культуральних супернатантах захоплювали з використанням смоли Марзеїесі ЗиКе з використанням білку А, і елюювали з використанням 100 мМ ацетату натрію (рН 3,5). Фракції, що містять антитіла, об'єднували й швидко нейтралізували з використанням 2,5 М трис НСЇІ (рН 7,2), потім буфер замінювали на 1хО-ФБР або інші бажані буфери, якщо вказано. Концентрацію білка визначали за вимірами оптичної густини ОГ280 на спектрофотометрі МапоОгор і розраховували з використанням його коефіцієнту поглинання. Чистоту й гомогенність антитіла оцінювали з використанням електрофорезу в поліакриламідному гелі за присутності додецилсульфату натрію (ДСН-ПААГ) і ексклюзійної ВЕРХ. Якщо для ексклюзійної ВЕРХ мономер знаходився на рівні нижче 95 95, виконували етап фінального очищення ексклюзійної хроматографії (ЗЕС) з використанням бо колонки Зирегаєх 200.
Приклад 4. Визначення характеристик зв'язування антитіл до ВСМА з ВСМА
Зв'язування антитіл до ВСМА із сконструйованими клітинами, що експресують ВСМА, і раковими клітинними лініями 02392, ЕОМ, ММІК, 00266, ОРМ2 і КРМІ-18226 оцінювали з використанням аналізу зв'язування клітин М5О (МезовзсаІє) і проточної цитометрії. Метою скринінгового аналізу була ідентифікація антитіл, які зв'язуються з клітинами, що експресують
ВСМА, а також перехресної реактивності з клітинами, що експресують ВСМА яванського макака.
В аналізі зв'язування клітин МОЮ клітини іммобілізували, а зразки антитіл до ВСМА аналізували в трикратній повторності. Коротко, експресійні супернатанти очищених антитіл до
ВСМА нормалізували до 10 мкг/мл. Висівали 5000 клітин на ямку в 384-ямковий планшет (МАбО0О0, Мо за каталогом І 21ХВ, М50) і залишали для адгезії на 2 год. Потім клітини блокували з використанням 20 95 фетальної бичачої сироватки (ФБС) у ФБР (сСірсо) протягом 15 хв. Після цього додавали супернатанти антитіл і залишали за КТ на 1 год. Клітини З рази промивали ФБР, після чого додавали 1 мкг/мл вторинного антитіла, міченого рутенієм (Часкбзоп Іттипо
Кезеагсі), і інкубували протягом 1 год за кімнатної температури. Застосовували додаткову стадію промивання, після чого додавали 35 мкл на ямку буфера для зчитування М5О Кеай рийег Т (без поверхнево-активних речовин) і інкубували протягом 30 хв для виявлення. Після цього планшети зчитували з використанням спектрофотометра Зесіог 6000 М50. Дані були нормалізовані до контролів і представлені у вигляді графіків за допомогою програмного забезпечення СгарпРай Ргізт версії 5. Позитивну зв'язувальну речовину з сигналом у З рази більшим ніж фоновий визначали як хіт. Аналіз повторювали для узгодженості даних, і вибирали кращі зв'язувальні речовини для додаткового розвитку.
Для проточної цитометрії клітини інкубували з барвником виявлення життєздатності й 100 000 клітин додавали до планшета з О-подібним дном і центрифугували для осадження клітин.
До клітин додавали титровані антитіла до ВСМА. Після періоду інкубації клітини осаджували й промивали. До клітин додавали видоспецифічні вторинні антитіла, мічені АїІехаРіног 647, і залишали для інкубації. Клітини оосаджували й декілька разів промивали. Клітини ресуспендували у відповідній кількості рухомого буфера й аналізували з використанням ЕАС5
Сапюої!І. Клітини стробували з використанням ЕЗС-А проти 55С-А для визначення розміру, і
Зо З50-А проти 550С-Н для визначення синглетів і для забарвлення на життєздатність. Значення геометричної середньої інтенсивності флуоресценції (СІФ) популяції живих клітин за можливості наносили на графік і використовували для розрахунку значень ЕСзхо, тобто у разі, якщо криві були повністю сигмоїдальними.
Інгібування зв'язування ліганду АРКІЇ.
Проводили скринінг панелі антитіл до ВСМА в аналізі ЕГІЗА конкурентного зв'язування з
АРКІГ. З використанням розчинного Аргі! людини, придбаного в компанії КУО 5убієет»5 (Мо за каталогом ЮУ884), визначали здатність антитіл до ВСМА блокувати зв'язування Аргії з іммобілізованим ВСМА.
Коротко, 96-ямкові прозорі планшети Махізогр обробляли 100 мкл 0,5 мкг/мл ВСМА-ЕСО, приготованого у ФБР, і інкубували за кімнатної температури протягом ночі. Після цього планшети тричі промивали промивним буфером для аналізу ЕГІ5А, що містив 0,05 95 твін-20 п
ФБР (Мо за каталогом КО Зузіет5 УМА126), а потім блокували 300 мкл/ямка реагентом для розведення, що містив 1 956 ВБА5 у ФБР (Мо за каталогом КО Зузіет5 0У995).). Для конкурентного зв'язування до планшетів додавали антитіла до ВСМА в об'ємах 100 мкл, і інкубували протягом 30 хвилин перед додаванням АРКІГ. Після 30 хвилин додавали 1 нг АРКІЇ. на ямку, і планшети інкубували протягом ночі за 4 "С. Незв'язаний АРКІЇ. змивали промивним буфером для аналізу ЕГІ5А, а зв'язаний біотинільований АРКІЇ. виявляли з використанням кон'югату ЗБА-НЕР за оптичної густини 450 нм.
Приклад 5. Оцінка й відбір хітів
Після завершення експериментів із визначення характеристик, антитіла, що походять від гібридоми М2, названі ВСМВб9, досліджували на наявність наступних характеристик: - зв'язування з рекомбінантним ВСМА людини; - зв'язування з рекомбінантним ВСМА яванського макака; - демонстрація слабкого зв'язування з ВСМА миші; - зв'язування як з ВСМА людини, що експресує НЕК, так і з ВСМА яванського макака, що експресує НЕК, як визначено за допомогою проточної цитометрії; - зв'язування з клітинними лініями раку людини, що експресують ВСМА (02392, ЕОМ, ММІК, 0266, ОРМ2 їі КРМІ-18226); - блокування зв'язування АРКІЇ. зі значенням ІСво - 5,9 нМ.
У результаті експресували ВСМВб9 (таблиця 4 і таблиця 5) і очищали його для створення біспецифічних антитіл до ВСМА х СОЗ.
Таблиця 4
Послідовності СОК ВСМВб9 (відповідний ЗЕО ІЮО МО наведено в дужках) всМве вОБУРМ УМре ке НОСАМАСІ РО | ОСММІСЗКМ ООБОВР СОЛИЮ а (4) Б У (6) Н (24) З (25) 26
Таблиця 5
Послідовності Мн і М. ВСМВб69 сову Ре КО ЗУМІ ТОРРЗУЗУАРСОТАВІТССОМ
МИавкЗУнНУМООРРЕОАРМУУМУМО
ЕМИа5БІМУБСИаптУмММРБІ КЗАМТІВ восМв69 МОТеКМОЕСІКІ 5МУТААОТАМУУ 27 | ООББОАВРБОЗаІРЕНЕЗИЗМЗОИМТАТІ ТІ 28
ЗАМЕАВОЕАУУУСОУМ О5550НМ
САВНОСАМАСІ ЕО УМ СОИ,ТІ МТ
МевА УгвааЙткі тм.
Приклад 6. Кристалічна структура Раб антитіла до ВСМА
Кристалічну структуру одного антитіла до ВСМА (ВСМВб69) визначали у вільній формі Раб, а також під час зв'язування з ВСМА людини, щоб охарактеризувати взаємодії антитіло/антиген за атомними деталями, покращити розуміння механізму дії антитіл і підтримати будь-які зусилля з конструювання антитіл.
Матеріали
Раб-домен ВСМА, мічений гістидином (ЗЕО ІЮО МО: 75 і 76; далі просто бар ВСМВб9), експресували в клітинах НЕК293 і очищали з використанням афінної та ексклюзійної хроматографій. Раб отримували в 130 мМ Масі, 20 мМ буфера МЕЗ5, рН 7,4.
Позаклітинна область ВСМА людини (залишки 5-51 5ЕО ІО МО: 1; далі просто ВСМА) з С- кінцевою Нібз-міткою експресували з використанням бакуловірусної системи й очищали з використанням афінної та ексклюзійної хроматографії. Білок отримували в 50 мМ Масі, 20 мМ буфера трис, рН 8.
Кристалізація
Рар-комплекс ВСМА/ВСМВ69
Комплекс Рар/антиген отримували перемішуванням ВСМА з Бар ВСМВб69 за молярного співвідношення 3,8 : 1 (надлишок ВСМА) протягом приблизно 16 годин за 4 "С за одночасної заміни буфера на 20 мМ Нерез рН 7,5. Після цього комплекс елюювали з колонки топоз5 5/50 з градієнтом масі 51-63 мМ у 20 мМ Нерезх рН 7,5 і концентрували до 17 мг/мл. Кристали, які підходять для рентгенівської дифракції, отримували в 25 95 РЕС З кДа, 0,2 М Мосі», 0,1 М Мев, рН 6,5 з використанням методу дифузії пари в сидячій краплі за температури 20"7С за допомогою запалювання мікрокристалом.
Еаб5 ВСМВб69
Раб ВСМВб9 концентрували до 9 мг/мл без подальшого очищення. Кристали, які підходять
Зо для рентгенівської дифракції, отримували в 2 М (МНа)»5О4, 5 956 МРО, 0,1 М Ме», рН 6,5 з використанням методу дифузії пари в сидячій краплі за температури 20 "С.
Збір даних рентгеноструктурного аналізу й визначення структури
Для збору даних рентгеноструктурного аналізу кристали протягом декількох секунд просочували у розчині кріопротектора, що містив відповідний маточний розчин з додаванням 20
Фо гліцерину, і після цього миттєво заморожували в рідкому азоті. Дані рентгенівської дифракції комплексу ВСМА/ВСМВб6У отримували з використанням ПЗЗ-детектора Кауопіх ЗООНЗ5 і джерела випромінення СМСЕ-08ІЮО компанії Сападіап Гід Боцгсе (СІ5), а дані рентгеноструктурного аналізу вільного бар ВСМВб69 отримували з використанням матричного детектора Оесігі5 Рііїаїи5 6М Ріхеї! і джерела випромінення 17-ІО від компанії Адмапсей Рпоїоп
Зоигсе (АРБ) у Аргонській національній лабораторії. Дані дифракції обробляли з використанням програми НК. (Оїм/іпому5Кі, 2. 5 Міпог, ММ. (1997). Ргосезвіпу ої Х-тау аїйтасіоп даїа соїІесієй іп о5сіПайоп тоде. Меїнодз іп Епгутоїіоду 276: 307-326).
Структури визначали з використанням методу молекулярного заміщення (МЕ), описаного у
Рпазег (Неай, А. 9. (2001). Рибпіпд Ше Бошипадагіє5 ої тоїесшаг гтеріасетепі мйй тахітит
ІКеїНооа. Асіа Стгувіайодг О Віо! Стузіайодг 57: 1373-82). У випадку вільної структури Бар моделлю пошуку для МК слугував Рар-фрагмент антитіла до гемаглютиніну вірусу грипу 5)8 (код РОВ: 4М5У). У випадку вільної структури комплексу ВСМА/Рар моделями пошуку для МК слугували кристалічні структури ВСМА (код РОВ: 1ХО2) і вільна Рар-структура ВСМВб9.
Структури уточнювали з використанням програмного забезпечення РНЕМІХ (Адатве, Р. 0.,
Сораї, К., Сго55е-КипвіІеме, В. МУ., Нипо, І. МУ/., Іоегдег, Т. В., МеСоу, А. у., Могіапу, М. МУ., Раї, В.
К., Веаад, В. ., ВКото, Т. О., ЗассНеціпі, у. С., Зашіег, М. К., Є(огопі, Ї.. С. і Тегуміїїдег, Т. С. (2004).
Весепі демеІортепів іп Ше РНЕМІХ 5оймаге г ашотаїеа сгузіаПодгарніс вігисіиге дегептіпайоп.
У Зупспгоїгоп Вайдіаї 11: 53-55), а налаштування моделей виконували з використанням програмного забезпечення СООТ (Етвіеєу Р. 5 Соулап, К. (2004). Соої: Моаеї риїйаіпд 10015 Тог тоіІесшіаг дгарнісвх. Асіа Стгузіайодго 060: 2126-2132). Усі інші кристалографічні розрахунки виконували з використанням набору програм ССРА (СоїІарогайме Сотриайопаї! Ргоіїесі Митбег 4, 1994). Усі молекулярні графіки були отримані з використанням програми РУМО!. (Оеї апо, МУ. (2002). Тне РУМОЇ. тоїіесшіаг агарнісв зузіет. Раїо АМпо, СА, ОБА; Оеіапо 5сіепійіс).
Статистична обробка даних як для вільної Гар-структури ВСМВб9, так і для комплексу, наведена в таблиці 6.
Таблиця 6
Кристалографічні дані для комплексу ВСМА/Рар ВСМВВб9 і вільного Раб ВСМВ69 11111111 Комплекс | Вільнийбаб оДанікристалад///7771111111111111111 оРозчиндля кристалізації 77771111 оЕлементарнакомркаї 11111 оДанірентгеноструктурногоаналізуєуЗ//|//77СССгИгИггї бУточженняд 11 (Кількістьмолекулводи. //-/-:/77777171111111111118911111111Ї1111111о1С оМоїрорйудГ 1111 о
Таблиця 6
Кристалографічні дані для комплексу ВСМА/Рар ВСМВВб9 і вільного Раб ВСМВ69 01111111 Комплекс | Вільнийбаб о пентенк1т о
Епітоп, паратоп і взаємодії
ВСМВб69 розпізнає конформаційний епітоп, що складається із залишків в областях В- шпильки (залишки ХУ13-НІ19) і структури спіраль-петля-спіраль (залишки І 26, К27 і М31-І 35)
ВСМА (Фіг. З і 4). Епітоп ВСМВ69 включає ділянку на ВСМА приблизно 830 А? і містить ліганд- зв'язувальний мотив ЮХІ (залишки 015-118 у повороті | типу В-шпильки), який виступає у неглибоку порожнину, окреслену областями (СОЕ), що визначають комплементарність антитіла.
Лейцин 17 на кінчику повороту ЮОХІ. повністю похований у порожнині антитіла й має сильні взаємодії з ВСМВб69. Іншим переважним епітопним залишком є Агд27, який розташований на
З1о-петлі П1 і утворює декілька контактів у вигляді водневих зв'язків із СОК важких ланцюгів.
Паратоп ВСМВб9 складається із залишків усіх СОК за винятком СОК-1 1 (Фіг. 2 і 3). Важкий ланцюг має вдвічі більшу кількість контактів із ВСМА порівняно з легким ланцюгом. Малі бічні ланцюги в кінчику петлі СОК-НЗ (102-ПИ4АМАС-106) (5ЕО ІЮ МО: 77) сприяють проникненню СОК-
НЗ у ВСМА ії утворенню численних контактів антитілолєантиген (40 95 від загального числа контактів створюються СОК-НЗ) СОК ВСМВбУ упаковується в увігнуту поверхню ВСМА стільцеподібної структури, причому СОНК-12 (залишки У48, 052, РБ4, 555), СОК-НІ1 (залишки с32-у34) і СОК-НЗ (0101, АТО3, М104, 110) контактують із «сидінням», утвореним спіраллю п1 і петлею 102, тоді як СОК-ІЇ З (залишки УУ90, 592, 0095), СОК-НІ (ЕЗ35), СОВ-Н2 (У54, У60) і
СОВ-НЗ (НІТО00, 5102, А103, АТ05) взаємодіють зі «спинкою», що утворена В-шпилькою ВСМА.
Г еи35, єдиний епітопний залишок у «ніжці стільця» (спіраль 2) має Ван-дер-Ваальсові контакти із залишком 052 СОК-1 2.
ВСМА має малий (приблизно 50 залишків) і компактний позаклітинний домен. Існує обмежена поверхня, доступна для зв'язування неконкурентних антитіл або лігандів з ВСМА.
Більшість епітопних залишків ВСМВ69У також є залишками зв'язування для АРКІЇ. (12 із 14 епітопних залишків) і ВАЕЕ (9 із 14 залишків). У випадку АРКІГЇ,, який являє собою ліганд ВСМА з найвищою афінністю, єдиними епітопними залишками, які не є спільними, є Е14 і 516 (Фіг. 2В), тоді як для ВАЕРЕ залишки, що не є спільними, являють собою Е14, І 26, Т32, РЗЗ і 135. Петля рхіІ. заглиблена як під лігандами, так і ВСМВ69.
Пропонований механізми дії ВСМВб69
ВСМВб69 є кандидатом для перенаправлення Т-клітин до клітин раку ММ. Вважають, що загибель ракових клітин, опосередкована біспецифічним антитілом до ВСМВб69 х СОЗ, не буде порушена структурою і розміщенням епітопа ВСМВб9. Локалізація цього епітопа з можливістю доступу дозволяє зв'язування Габ-плеча ВСМВбО зі зв'язаним з мембраною ВСМА, тоді як інше
Еар-плече залишається зв'язаним з СОЗ на мембрані Т-клітини.
ВСМВб69 також може руйнувати сигнальні шляхи АРКІЇ. і ВАЕРЕ у плазматичних клітинах через стеричну перешкоду й пряму конкуренцію за сайти зв'язування ВСМА. Перекривання структури ВСМА/ВСМВб9 зі структурами ВСМА/АРКІГЇ. і ВСМА/ВАЕЕ (ій, У., Нопо, Х., Карріег,
У., Лапо, Г., 7Напо, В., Хи, Г., Рап, С.Н., Мапіп, МУ.Е., Митрпу, В.С., Зпи, Н.В., ВОаї, 5. 6. 7Напо, В. (2003). Маїиге 423: 49-56; Нутом/ї», 5.(3., Раїєї, О.В., УМаїмеретг, Н.О.А., Випуоп, 5., Мап, М., Міп, 9., ЗПгмег, 5.К., Согдоп, М.С., Рап, В., 5Кепоп, М.у., КеїІеу, А.Р. б ЗагомазпікК, М.А. (2005). у. Віо!.
Сет. 280: 7218-7227 3 демонструє області зіткнень між ВСМВб9 і АРКІЇ,, ВАЕЕ (Фіг. 2В і Фіг. 4А і 4В), що робить неможливим одночасне зв'язування ВСМА з антитілом і природним лігандом.
АРКІЇГЇ. і ВАЕЕ можуть сигналізувати з використанням інших рецепторів, таких як ТАСІ і ВАЕР-ЕК, і
ВСМА-нокаутні миші залишаються життєздатними. Таким чином, блокування активності АРКІЇ. і
ВАРЕЕ через перешкоду ВСМА може не бути критично токсичним для пацієнтів із ММ.
Приклад 7. Дизайн ВСМВб9 мутантів на основі структури
Обчислювальне оцінювання мотивів посттрансляційної модифікації й ризику агрегації варіабельного домену незв'язаного ВСМВб6ОУ свідчить про середній ризик ізомеризації для залишків 0101-2102 (СОВ-НЗ) і про гідрофобну ділянку в області СОВ розміром 486 Аг, що може спричиняти ризик агрегації. Залишками, що найбільш піддаються експозиції у цій ділянці, є І58 (СОБ-Н2), Е35 (СОВ-НІ) і М104 (СОБ-НЗ; М104 був релевантним у гомологічній моделі Ем, але не в кристалічній структурі Бар). Для виключення ризиків ізомеризації й агрегації у варіабельному домені ВСМВб69, було раціонально сконструйовано різні мутації (таблиця 7).
Таблиця 7
Панель мутантів ВСМВб69 - | Ідентифікатор .
Позбутися ізомеризації й знизити
І
1 ВСМВ117 с152А гідрофобність 1 | всмвіїв СТО2АН, ЕЗ5УМ, М104ТН Позбутися ізомеризації й знизити гідрофобність 1 | всмвіл9 О1О1ЕЧ, ЕЗ5УМ, М104ТН Позбутися ізомеризації й знизити гідрофобність 1 | всмвіго 010158, ЕЗ5УМ, М104ТН Позбутися ізомеризації й знизити гідрофобність 4 вВсМВ121 2325Н, ЕЗБУН, І585Н, РЗ7КУ, Генеративні мутації МН і МІ. для
У441 1, М830 зниження гідрофобності
Генеративна мутація УН для зниження н н н
Оцінити вплив однієї мутації, знизити
Н
1 восМВв123 ас325 гідрофобність
Оцінити вплив однієї мутації, знизити
Н
1 восМВв124 ЕЗБУ гідрофобність
ВСМВІ125 О101ЕЧ Оцінити вплив однієї мутації, позбутися ізомеризації
Оцінити вплив однієї мутації,
Н
! ВСМВ126 р1015 позбутися ізомеризації
ВСМВІ127 СТОгАН Оцінити вплив однієї мутації, позбутися ізомеризації
Оцінити вплив однієї мутації, знизити
Н
1 восмМв128 У1047Т гідрофобність
Оцінити вплив однієї мутації, знизити
Н
1 воМв129 ІБ85 гідрофобність 4 всМВв130 СТОгАН, ЕЗБУН, І585Н Позбутися ізомеризації й знизити гідрофобність
Позбутися ізомеризації й знизити н н н 1 ВСМВ131 ОТОТЕН, ЕЗБУН, І585 гідрофобність
Генеративні мутації МН і МІ. для н н І.
Генеративні мутації МН і МІ. для н н н І.
Генеративні мутації УН і МІ. для н н н І.
Зруйнувати ізомеризацію і н н н І. 2 восМВв179 ртотон, 325, М104Ти, 2152А гідрофобність
ВСМВІ80 | рт0їНН, с3258, М104тн, Сі5од.. | Зруйнувати іІзомеризацію і гідрофобність
Генеративні мутації МН і МІ. для того, 2 ВСМВ181 рТОтТМУн, 23258, М104ТН, 3152А | щоб знизити гідрофобність і позбутися ізомеризації
Генеративні мутації МН і МІ. для того, 2 воМВв182 ртТот1мн, 2325Н, М104ТН, 1152АЧ | щоб знизити гідрофобність і позбутися ізомеризації
Таблиця 7
Панель мутантів ВСМВб69 - | Ідентифікатор .
Генеративні мутації МН і МІ. для того,
Н Н Н Н
2 всМВв183 ІзВН, тво "УтоаТ, щоб знизити гідрофобність і позбутися ізомеризації
Генеративні мутації МН і МІ. для того,
Н Н Н Н
2 восМВв184 ІзВН, тва "Утоат, щоб знизити гідрофобність і позбутися ізомеризації
Генеративні мутації МН і МІ. для того,
Н Н Н Н
2 восМВв185 ВА потва ;Утоат, щоб знизити гідрофобність і позбутися ізомеризації
Генеративні мутації МН і МІ. для того,
Н Н Н Н
2 воМВв186 ВМ, оте, ве ;Утоат, щоб знизити гідрофобність і позбутися ізомеризації
Генеративні мутації МН і МІ. для того,
Н Н Н Н
2 вВСМВ187 ВМ, твоя ;Утоат, щоб знизити гідрофобність і позбутися ізомеризації
Генеративні мутації МН і МІ. для того,
Н Н Н Н
2 восМВв188 ВМ, шу ва ;Утоат, щоб знизити гідрофобність і позбутися ізомеризації
Послідовності СОК і послідовності МН і МІ для структурних мутантів ВСМВб69 наведено в таблицях 8 і 9 відповідно.
Таблиця 8
Послідовності СОР. мутантів ВСМВб69 (відповідний 5ЕО ІЮ МО наведено в дужках) но-сСОовВв1| но-СОоВ2 но-СоВЗ (о-СОВ1 іїо-сСо82 | О-СОВЗ завуУвема| 5іМУБИТМ | НОСАМАаІ о | сс ММІШеКОМ| ВОБОВРО | ОУМ/О5
ВСМВ117 (4) УМРБІ КБ У (6) Н (24) (25) ЗзБОНУМ 26 завуУвгма| віМУБИТМ ІНСААТАСІ ЕОМ СОеММІВеКОМ| ВОБОВРО | ОУМ/О5 всМВв118 (4) УМРБІ КБ (9) Н (24) (25) ЗзБОНУМ 5 26 зазуУвма| 5ІМУБИІТМ | НЕСАТАСІ БО | са ММІШеКОМ| ВОБОВРО | ОУМ/О5 всМВ119 (4) УМРБІ КБ М (12) Н (24) (25) ЗзБОНУМ 5 26 зазуУвма| 5ІУБаИтм | НВаАТАСІ БО | самММмІаеКеМ| ВОБОВРО | ОУМ/О5 восМВв120 (4) УМРБІ КБ М (15) Н (24) (25) ЗзБОНУМ 5 26 звБУУМаї! БІМУБазТУ |нОсСАМАДа Ер СсаемММмеКкеМ| СОБОВРЗ | ОУМО5 всМВв121 (7) УМРБІ КБ У (6) Н (24) (25) ЗзБОНУМ 8 26 звБУУМаї! БІМУБазТУ |нОсСАМАДа Ер СсаемММмеКкеМ| СОБОВРЗ | ОУМО5 восМв122 (7) УМРБІ КБ У (6) Н (24) (25) ЗзБОНУМ 8 26 звБУУМа! БІМУБИЇТМ | НОСАМУАДаї Ер | саМмМміаекКеМ| СОБОВРЗ | ОУМО5 восМВв123 (7) УМРБІ КБ У (6) Н (24) (25) ЗзБОНУМ 5 26 завзУуУма 5ІМУБаїтМ |нНОсСАМУДаїврІСсаМмМмІаеКкеМ| СОБОВРЗ | ОУМО5 восМВв124 (10) УМРБІ КБ У (6) Н (24) (25) ЗзБОНУМ 5 26 зазчуУвма| 5ІМУБаИТму | НЕЗАМАаї Ер | са ММмІШеКеМ| ВОБОВРЗ | ОУМ/О5 восМВв125 (4) УМРБІ КБ М (16) Н (24) (25) ЗзБОНУМ 5 26
Таблиця 8
Послідовності СОР. мутантів ВСМВб69 (відповідний 5ЕО ІЮ МО наведено в дужках)
Ідентифікатор! НС-СОВІ | НО-СОВ2 но-СоВЗ (о-СОВ1 іїо-сСо82 | О-СОВЗ
БОБУЕМИ| БІУМУВаїТУ | НВ1ЖАМАСІ БО | ФОММІСОКОМ| СОБОВРБО | ОУМ/О5 восМВв126 (4) УМРБІ КБ У (17) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 26
БОБМУЕМИ| БІУМУБВИЇТУ | НННААМАСІ РО | ЧОММІСОКОМ| ЮОБОВРБО | ОУМ/О5 вСсМВ127 (4) УМРБІ КБ У (18) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 5 26
БОБУЕМИ| БІУМУВаї!ТУ | НОСАТАСІ БО | ФОММІСОКОМ| ЮОБОВРБО | ОУМ/О5 восмМв128 (4) УМРБІ КБ У (19) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 5 26
ОБУРМИ|БІМУвавтм |НОСАМАСІ БО | Ч(ОММІаОКОМ| СОБОВРБО | ОУМ/О5 восМВв129 (4) УМРБІ КБ У (6) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 8 26 5аБУУМИ БІУУБОаБТУ | НОНААМАСІ ЕО | ФдуамміавкемМ| СОБОВРБ5 | ОУМО5 воМВв130 (10) УМРБІ КБ У (18) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 8 26 5аБУУМИ БІУУБОаБТУ | НЕСБАМАСІ БО | сСаММмІСеКОеМ | СОБОВРБ5 | ОУМО5
ВСМВ131 (10) УМРБІ КБ У (16) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 8 26 5ЗБУРМИ| БІМУБаИЇТУ | НООАТАСІ БО | СОММІСОКОМ| ЮОБОВРБО | ОУМ/О5 вСсМВ176 (13) УМРБІ КБ У (19) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 5 26
ЗБУРМИІ| 5БІМУБавту | НОСАТАСІ БО | ФЧОММІСОКОМ| СОБОВРБО | ОУМ/О5
ВСМВ177 (13) УМРБІ КБ У (19) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 8 26 5ЗБУРМИ|5БІМУБОамМТмУ| НОСАТАСІ БО | ФЧОММІСОКОМ| СОБОВРБО | ОУМ/О5 воМВв178 (13) УМРБІ КБ У (19) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 11 26 5ЗБУРМИ| БІМУБИЇТУ | НОСАТАСІ ГО | ЧССММІСОКОМ| ЮОБОВРБО | ОУМ/О5 воМВв179 (13) УМРБІ КБ У (20) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 5 26 5ЗБУРМИ| БІМУБИЇТУ | ННОАТАСІ БО | ЧОММІСОКОМ| ЮОБОВРБО | ОУМ/О5 воМВв180 (13) УМРБІ КБ У (21) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 5 26 5ЗБУРМИ| БІМУБаИЇТУ |ІНУСАТАСІ ЕО| СОММІСОКОМ| ЮОБОВРБО | ОУМ/О5 вВСМВ181 (13) УМРБІ КБ У (22) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 5 26 5ЗБУРМИ| БІМУБИЇТУ | НУИСАТАСІ ГО | ЧСММІСОКОМ| ЮОБОВРБО | ОУМ/О5 воМВв182 (13) УМРБІ КБ У (23) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 5 26 5ЗБУРМИІ| БІМУБИаВТтУ | НОСАТАСІ ГО | ЧССММІСОКОМ| ЮОБОВРБО | ОУМ/О5 восМВв183 (13) УМРБІ КБ У (20) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 14 26 5ЗБУРМИІ| БІМУБаИаВТтУ | ННОАТАСІ БО | ЧОММІСОКОМ| ЮОБОВРБО | ОУМ/О5 восМВв184 (13) УМРБІ КБ У (21) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 14 26 5ЗБУРМИІ| БІМУБаИаВТтУ | НУИСАТАСІ БО | ЧОММІСОКОМ| ЮОБОВРБО | ОУМ/О5 воМВв185 (13) УМРБІ КБ У (23) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 14 26 5ЗБУРМИ|5БІМУБОМТУ| НОСАТАСІ ГО | ЧССММІСОКОМ| ЮОБОВРБО | ОУМ/О5 воМВв186 (13) УМРБІ КБ У (20) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 11 26 5ЗБУРМИ|5БІМУБОМуТУ| ННОАТАСІ БО | ФЧОММІСОКОМ| ЮОБОВРБО | ОУМ/О5
ВСМВ187 (13) УМРБІ КБ У (21) Н (24) (25) ЗЗОНМУМ 11 26
Таблиця 8
Послідовності СОР. мутантів ВСМВб69 (відповідний 5ЕО ІЮ МО наведено в дужках) но-сСОовВв1| но-СОоВ2 но-СоВЗ (о-СОВ1 іїо-сСо82 | О-СОВЗ 5ОБУРМИ|БІМУБИТмТУ| НУСАТАСІ БО | ас ММ еКеМ| РОБОВРО | ОУМО5 восМВв188 (13) МУМРБІ Кк М (23) Н (24) (25) З5ОНУМ 11 26
Таблиця 9
Послідовності МА і МІ мутантів ВСМВб69 оре ше км
ОГОЇ ОЕБОаРОЇ МКРОЕТІ БІ ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУМ5МАРООТАНІТС заабвізБавуУгмМмаУвВОРРИаКОИї. СамМмМма5к5УНУМООРРОаОАР вВсМВ117 ЕУМОаБІМУВСІ ГТИММРБІ КОАМТІВМ 57 МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М 28
ОТ5КМОНЕ5І КІ 55МТААОТАУМУС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАССЕАММ УС
АВН о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ. раАМАаІ ЕрМУсаОсСТтІ МГМО5А
ОГОЇ ОЕБОаРОЇ МКРОЕТІ БІ ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУМ5МАРООТАНІТС заабвізБавуУмМсУМАОРРаОаКОИЇї. СамМмМма5к5УНУМООРРОаОАР
ВсМВІ18 ЕУМОаБІМУВСІ ГТИММРБІ КОАМТІВМ 29 МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М 28
ОТ5КМОНЕ5І КІ 55МТААОТАУМУС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАССЕАММ УС
АВНОСААТАСІ ЕОУМСОСТІ МТУ о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОЇ ОЕБОаРОЇ МКРОЕТІ БІ ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУМ5МАРООТАНІТС заабвізБавуУмМсУМАОРРаОаКОИЇї. СамМмМма5к5УНУМООРРОаОАР всМВІ119 ЕУМОаБІМУВСІ ГТИММРБІ КОАМТІВМ 81 МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М 28
ОТ5КМОНЕ5БІ КІ 55МТААОТАУМУС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАССЕАММ УС
АВНЕСАТАСІ ЕВУМС,ОСТІ МТМ о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОЇ ОЕБОаРОЇ МКРОЕТІ БІ ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУМ5МАРООТАНІТС заабвізБавуУмМсУМАОРРаОаКОИЇї. СамМмМма5к5УНУМООРРОаОАР всМВІ12о ЕУМОаБІМУВСІ ГТИММРБІ КОАМТІВМ 32 МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М 28
ОТ5КМОН5БІ КІ 55М ТААОТАММУС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАССЕАММ УС
АВНБОаАТАСІ ЕВУМС,ОСТІ МТМ о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОЇ ОЕБОаРОЇ МКРОЕТІ БІ ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУМ5МАРООТАНІТС 5аа5бІЗБОБУММСУММІВОРРОКИЇ. вамМмМмавк5УНУМОСОКРИаОАР
ЕУМОаБІМУБИаТУММРБІ КЗАМТІВ МГ МММБОБОВАРБЗОІРЕНЕБОа5М
ВСМВ121| М З ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАВСЕАОМУС 30
ОТ5КМОН5І КІ 55М ТААОТАМУУС о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
АВНОСАМАСІ ЕОМ СОСТІ МТМ5
ЗА
ОГОЇ ОЕБОаРОЇ МКРОЕТІ БІ ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУМ5МАРООТАНІТС 5аа5бІЗБОБУММСУММІВОРРОКИЇ. СамМмМма5к5УНУМООРРОаОАР вВсМВІ122 ЕУМОаБІМУБИаТУММРБІ КЗАМТІВ 33 МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М 28
МОТ5КМОРГ5І КІ Б5МТААОТАМУМУ ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАССЕАММ УС
САВНОСАМАСІ ЕОМ СОСТІ МТМ о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОЇ ОЕБОаРОЇ МКРОЕТІ БІ ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУМ5МАРООТАНІТС заа5бБІЗЗОЗУРМСМІВОРРИаКаї. СамМмМма5к5УНУМООРРОаОАР вВсМВІ123 ЕУМОаБІМУВСІ ГТИММРБІ КОАМТІВМ з4 МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М 28
ОТ5КМОН5І КІ 55М ТААОТАМУУС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАССЕАММ УС
АВНОСАМАСІ ЕОМ СОСТІ МТМ5 о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
Таблиця 9
Послідовності МА і МІ мутантів ВСМВб69 сне сн че
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заабвізБавуУмМсУМАОРРаОаКОИЇї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР всМВ124 ЕУМмавІМУвБИатмМУМРБОІ КОАМТІВМ 35 МУМММПрОБОВРБОИІРЕВЕ5Иа5М 28
ОТ5КМОЕ5БІ КІ Б5МТААОТАМУМС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС
АВНОСАМАСІ ЕВУМ/СОСТІ МТУ5 о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заабвізБавуУгмМмаУвВОРРИаКОИї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР
ВСМВ125 ЕУМмавІМУвБИатмМУМРБОІ КОАМТІВМ зв МУМММПрОБОВРБОИІРЕВЕ5Иа5М 28
ОТ5КМОЕ5БІ КІ 55 ТААОТАМУМС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС
АВНЕСАМАСІ ЕОММУСОСТІ МТУ5 о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заабвізБавуУгмМмаУвВОРРИаКОИї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР вВсМВ126 ЕУМмавІМУвБИатмМУМРБОІ КОАМТІВМ 37 МУМММПрОБОВРБОИІРЕВЕ5Иа5М 28
ОТ5КМОЕ5БІ КІ 55 ТААОТАМУМС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС
АВНБОАМАСІ ЕОММУСОСТІ МТУ5 о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заабвізБавуУгмМмаУвВОРРИаКОИї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР всМВ127 ЕУМмавІМУвБИатмМУМРБОІ КОАМТІВМ з8 МУМММПрОБОВРБОИІРЕВЕ5Иа5М 28
ОТ5КМОЕ5БІ КІ 55 ТААОТАМУМС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС
АВНОААМАСІ ЕОМ СОСТІ МТУ о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заабвізБавуУгмМмаУвВОРРИаКОИї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР всМВ128 ЕУМмавІМУвБИатмМУМРБОІ КОАМТІВМ 39 МУМММПрОБОВРБОИІРЕВЕ5Иа5М 28
ОТ5КМОЕ5І КІ Б5МТААОТАМУМС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС
АВНОСАТАСІ ЕОМ СОСсТІ МТУ5 о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заабвізБавуУгмМмаУвВОРРИаКОИї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР всМВ129 ЕмавІБавтТМУМРБІ КОАМТІВ 40 МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М 28
М ОТ5КМОНЕ5І КІ ББМТААОТАМУМУ ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС
САВНОСАМАСІ ЕОУМ/СОСТІ МТМ о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заабвізБавуУмМсУМАОРРаОаКОИЇї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР всМВ130 ЕмавІБавтТМУМРБІ КОАМТІВ у МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М
М ОТ5КМОНЕ5І КІ ББМТААОТАМУМУ ЗОМТАТІ ТІЗАВМЕАСОРЕАМУМУМОС | 28
САВНОАДАМАСІ ЕОМ ОСТІ МТМ о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заабвізБавуУмМсУМАОРРаОаКОИЇї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР всМВ131 ЕмавІБавтТМУМРБІ КОАМТІВ до МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М 28
М ОТ5КМОНЕ5І КІ ББМТААОТАМУМУ ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС
САВНЕСАМАСІ ЕОМ СОСТІ МТМ о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заа5бБІЗЗОЗУРМСМІВОРРИаКаї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР вВсМВ176 ЕУМмавІМУвБИатмМУМРБОІ КОАМТІВМ 58 МУМММПрОБОВРБОИІРЕВЕ5Иа5М 28
ОТ5КМОЕ5І КІ Б5МТААОТАМУУ ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС
САВНОСАТАСІ ЕОМ СОСТІ МТМ о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
Таблиця 9
Послідовності МА і МІ мутантів ВСМВб69 бдде о яд
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заа5бБІЗЗОЗУРМСМІВОРРИаКаї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР
ЕУМмавБІМУвавВТуУММРБІ КОАВМТІ5 МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М всМВ177 У 43 ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС 28
ОТ5КМОНЕ5І КІ 55МТААОТАМУУС о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
А
ВНОСАТАСІ ЕОМ СОСТІ МТУ55
А
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заа5бБІЗЗОЗУРМСМІВОРРИаКаї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР
ЕУМЛавІвИаумТМУМРБІ КОАМТІ5 МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М всМВ178 У 44 ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС 28
ОТ5КМОНЕ5І КІ 55МТААОТАМУУС о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
А
ВНОСАТАСІ ЕОМ СОСТІ МТУ55
А
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заа5бБІЗЗОЗУРМСМІВОРРИаКаї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР всМВ179 ЕУМмавІМУвБИатмМУМРБОІ КОАМТІВМ 45 МУМММПрОБОВРБОИІРЕВЕ5Иа5М 28
ОТ5КМОЕ5І КІ Б5МТААОТАМУМС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС
АВНОСАТАСІ ЕВУМ/СОСТІ МТУ5 о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заа5бБІЗЗОЗУРМСМІВОРРИаКаї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР всМвів8о ЕУМмавІМУвБИатмМУМРБОІ КОАМТІВМ 46 МУМММПрОБОВРБОИІРЕВЕ5Иа5М 28
ОТ5КМОЕ5І КІ Б5МТААОТАМУМС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС
АВННОАТАСІ ЕОМ СОСсТІ МТУ5 о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заа5бБІЗЗОЗУРМСМІВОРРИаКаї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР всМВвІ1вВі ЕУМмавІМУвБИатмМУМРБОІ КОАМТІВМ 47 МУМММПрОБОВРБОИІРЕВЕ5Иа5М 28
ОТ5КМОЕ5І КІ Б5МТААОТАМУМС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС
АВНМ/САТАСІ ЕОМ СОСТІ МТУ о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заа5бБІЗЗОЗУРМСМІВОРРИаКаї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР всМвт82 ЕУМмавІМУвБИатмМУМРБОІ КОАМТІВМ 48 МУМММПрОБОВРБОИІРЕВЕ5Иа5М 28
ОТ5КМОЕ5І КІ Б5МТААОТАМУМС ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС
АВНУСАТАСІ ЕОМ СОСТІ МТУ о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заа5бБІЗЗОЗУРМСМІВОРРИаКаї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР
ЕУМмавБІМУвавВТуУММРБІ КОАВМТІ5 МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М вСМВ183| М 49 ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС 28
ОТ5КМОНЕ5І КІ 55МТААОТАУМУС о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
АВНОСАТАСІ ЕВУМ/СОСТІ МТУ5
ЗА
ОГОГОЕБИаРИЇ МКРОЕТІ 5І1ТСТМ ЗУМІ ТОРРОУБМАРООТАВІТС заа5бБІЗЗОЗУРМСМІВОРРИаКаї. СаММа5кКОУНУМООРРИаОСАР
ЕУМмавБІМУвавВТуУММРБІ КОАВМТІ5 МУУМУроБОВРБаРЕВЕЗО5М всМВ184| М 50 ЗОМТАТІ ТІЗВМЕАХИОЕАМУМ УС 28
ОТ5КМОНЕ5І КІ 55МТААОТАУМУС о Ум Оо555ОоНУМгасаТткКІ ТМ.
АВННОАТАСІ ЕОМ СОСТІ МТУ5
ЗА
Таблиця 9
Послідовності МА і МІ мутантів ВСМВб69
ОГО ОЕБаРИОЇ МКРЗЕТІ Б ТСТМУ ЗУМІ ТОРРІУМЗМАРСООТАВІТС за,аавіз55ЗУРМСУМВОРРакКаї. СамМммМмазкЗУНУМООРРООАР
ЕУЛлОаБІУУБавТтуУММРБІ КЗАМТІВ МУУМУМрорБОВРБЗаІРЕВНЕЗИаЗМ
ВвСМВ185| У 51 ЗаМТАТІ ТІЗВМЕДИРЕАУМ УС 28
ОТ5КМОРЕ5ІКІ 55УТААОТАМУМО о УмрЗЗЗонУУвгасаткіІ ТМ
АВНУСАТАСІ ЕОМУУСОСТІ МТУ
ЗА
ОГО ОЕБаРИОЇ МКРЗЕТІ Б ТСТМУ ЗУМІ ТОРРІУМЗМАРСООТАВІТС за,аавіз55ЗУРМСУМВОРРакКаї. СамМммМмазкЗУНУМООРРООАР
ЕУЛОаБІУУБИМТМММРБІ КЗАМТІВ МУУМУМрорБОВРБЗаІРЕВНЕЗИаЗМ вСсМВв186| У 52 ЗаМТАТІ ТІЗВМЕДИРЕАУМ УС 28
ОТ5КМОРЕ5ІКІ 55УТААОТАМУМО о УмрЗЗЗонУУвгасаткіІ ТМ
АВНОСАТАСІ ЕОУУуУСОСТІ МТУ
ЗА
ОГО ОЕБаРИОЇ МКРЗЕТІ Б ТСТМУ ЗУМІ ТОРРІУМЗМАРСООТАВІТС за,аавіз55ЗУРМСУМВОРРакКаї. СамМммМмазкЗУНУМООРРООАР
ЕУЛОаБІУУБИМТМММРБІ КЗАМТІВ МУУМУМрорБОВРБЗаІРЕВНЕЗИаЗМ
ВСМВ187| У 53 ЗаМТАТІ ТІЗВМЕДИРЕАУМ УС 28
ОТ5КМОРЕ5ІКІ 55УТААОТАМУМО о УмрЗЗЗонУУвгасаткіІ ТМ
АВННОАТАСІ ЕОУМУСОСТІ МТУ
ЗА
ОГО ОЕБаРИОЇ МКРЗЕТІ Б ТСТМУ ЗУМІ ТОРРІУМЗМАРСООТАВІТС за,аавіз55ЗУРМСУМВОРРакКаї. СамМммМмазкЗУНУМООРРООАР
ЕУЛОаБІУУБИМТМММРБІ КЗАМТІВ МУУМУМрорБОВРБЗаІРЕВНЕЗИаЗМ всМВ188| У 54 ЗаМТАТІ ТІЗВМЕДИРЕАУМ УС 28
ОТ5КМОРЕ5ІКІ 55УТААОТАМУМО о УмрЗЗЗонУУвгасаткіІ ТМ
АВНУСАТАСІ ЕОМ СОСТІ МТУ
ЗА
Таким чином, крім ВСМВб9, було експресовано й очищено 28 мутантів, як описано в прикладі 3, і їх було охарактеризовано на предмет зв'язування з клітинами, що експресують
ВСМА, з використанням проточної цитометрії, як описано в прикладі 4. Сім із 28 мутантів зв'язувалися з клітинами, що експресують ВСМА, і їх використовували в подальшому для створення біспецифічної панелі ВСМА х СОЗ.
Приклад 8. Отримання антитіл до ВСМА ії СОЗ у біспецифічному форматі в Ідс4 5228Р,
І234А, 1 235А
Антитіла до ВСМА експресували як Ідс4, що мали Ес-заміщення 5228Р, 1234А і 1235А (нумерація згідно з індексом ЕШ). Також створили моноспецифічне антитілло СОЗВ19 до СОЗ, яке містить важкий і легкий ланцюги, що мають послідовності з«ЕО ІЮ МО: 55 ії 5ЕО ІЮ МО: 56 відповідно.
Моноспецифічні антитіла очищали з використанням стандартних способів з використанням колонки на основі білка А (колонка НіТгар Марзеїесї ЗиКе). Після елюювання пули піддавали діалізу в фосфатно-сольовому буферному розчині в модифікації Дульбекко (Д-ФБР), рН 7,2.
Біспецифічні антитіла до ВСМА х СОЗ створювали шляхом об'єднання моноспецифічного тАб до СОЗ і моноспецифічного тАб до ВСМА у реакції обміну Раб-плечей іп міїго (як описано в
ММО2011/131746). Коротко, приблизно 1-20 мг/мл антитіла до ВСМА/антитіла до СОЗ в молярному співвідношенні 1 : 1 (або, у деяких випадках, на 6 95 більше одного з батьківських антитіл для зменшення іншого) у ФБР, рН 7-7,4 ії 75 мМ 2-меркаптоетаноламіну (2-МЕА) змішували разом і інкубували за 31 "С протягом 5 годин із наступним видаленням 2-МЕА шляхом діалізу, діафільтрації, тангенційної потокової фільтрації й/або фільтрації клітин центрифугуванням з використанням стандартних способів. Утворення біспецифічних антитіл до
ВСМА х СОЗ аналізують з використанням або катіонообмінної (СЕХ) ВЕРХ, або ВЕРХ гідрофобної взаємодії (НІС). За необхідності біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ піддавали фінальному очищенню з використанням препаративної СЕХ або НІС для видалення залишкового батьківського антитіла (антитіл)
Важкі й легкі ланцюги для репрезентативних біспецифічних антитіл до ВСМА х СОЗ представлені нижче в таблиці 10. ВСМВ178 мало слабку експресію у комбінації з плечем СОЗ, тому в результаті його характеристики додатково не визначали.
Таблиця 10
Послідовності важких і легких ланцюгів для біспецифічних антитіл
АБО 77777711 Амінокислотнапослідовністьїд/////:/3С(
ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААЗСЕТЕМТ МАММУМУУВОАР
СКагеЕМУмМАВІВЗКУМММАТУМААВУКОаВЕТІЗАООКМБІ МІ ОО
ММ5ЗІ КТЕОТАУУУСАВНнСОМЕаМОУУБУ ЕАмМУусОоа,ТтІ МТУ
АЗБТКОаРБМЕРІ АРСЗАЗТЗЕЗТААЇ СІ МКОМЕРЕРУТУБУУМ
Важкий ланцюг 1 ЗаАІ Т5аУНТЕРАМІ О55ОИ:І 51 55 УРЗЗУ СТКТУТОММ
Сорз3в219 ОНКРУЬМТКУОКАМЕЗКУОРРОРРСОРАРЕААСОИРОМУРІ ЕРРКР (ЗЕО ІО МО: 55) КОТ МІЗВТРЕМУТСУУМОМЗБОЄОРЕМОЄМИМ МУрОаМЕМНМАКТ
КРАЕЕЄЕОЕЄМЗТУВУММІ ТМ НОМ МЕОКЕУКСКУЗМКаї РБЗБ
ІЕКТІЗКАКаОРАЕРОМУТІ РРЗОБЕМТКМОМІ ТС МКагМР
ЗБІАМЕМЕЗМООРЕММУКТТРРМ ОЗЕРІ МЗКІ ТМОКЗА
УМОБ,аММЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКБІ БІ БІ ЯК
ОТММТОЕРБІ ТУИ5РОСТМТІ ТСАЗЗТаАМТТЗММАМУМООКР
Легкий ланцюг 1 СОАРВС ІС, ТМКААРСТРАВЕЗОИа5БІ І ЧОКААЇ ТІ 5ИаМОРЕЮ соЗв219 ЕАЕМУСАЇ МУЗМІ МУРасаткІі ТМ аФОРКААРБЗМТІ ЕРРЗЗЕ (5ЕО ІО МО: 56) ЕГОАМКАТІ МСПІЗОЕМРЕАМТМАМУКАрЗЗРУКАСМЕТТТРОК
Ї ОБММКУААББЗМІ 5І ТРЕОМУКЗНАЗУЗСОМТНЕСЗТУЕКТМУАР восМВв72 ТЕС
ОГОГОЕБаРОЇ МКРЗЕТІ БІ ТСТУЗОаСОІЗБИаЗУЕМИ,МВОР
РОКаї єУЛОаБІУУБСИПУМУМРБІ КЗАМТІЗМОТЗКМОБІ КІ 55
МТААОТАМУУСАВНОСАМАИІ ЕО'МУУСОСТІ МТУЗБАЗТКаР
ЗМЕРІ АРСЗАЗТЗЕЗТААГ СІ МКОМЕРЕРУТУВУУМЗИАІ 5
Важкий ланцюг 2 СМНТЕРАМІ О55О01І. 51 55 УРЗБІ аТКТУТСОММОНКРОМ восМв69 ТКУОКАМЕЗКМОа РРСРРСОРАРЕААСІИРБЗУРІ ЕРРКРКОТІ МІЗ (ЗЕО ІО МО: 65) ВТРЕМТСУМУМОУ5ОЕОРЕМОЕМУУУрамМмЕМНМАКТКРАЕЕО
ЕМБТУВУУМІ ТМ НОВУ МЕОКЕУКСКУЗМКаї РЗБІЕКТІЗКА
КаОРВЕРОМУТІ РРЗОЄЕМТКМОМУБІ ТС УКИЕМРЗОІАМЕМУ
ЕЗМСООРЕММУКТТРРМІ ОБравзЕРІ ЗА ТМОКЗАУМОБамМУг5
СЗУМНЕАІ НМНУТОКБІ БІ І ак
ЗУМГТОРРБІБУЗБМАРЕИОТАВІТССЯСММІЗКЗУНМУМООРРООА
Легкий ланцюг 2 РУМУММрОБОВРБИОаІРЕВЕЗИаЗМЗОаМТАТІ ТІЗАМЕАСВОЕАМУ всМвбо УСОУМмОр55564НУМРааИТКІ ТМ ООРКААРБЗМТІ ЕРРББЕЕЇ. (БОЮ МО: 76) ОАМКАТІ МС І5ОГЕУРЕАУТМАМУКароРУКАСМЕТТТРОКО
І ЗММКМААББЗУІ 5І ТРЕОСМУКЗНАЗУЗСОМТНЕЗТМЕКТМУАР
ТЕС
ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААЗСЕТЕМТ МАММУМУУВОАР
СКагеЕМУмМАВІВЗКУМММАТУМААВУКОаВЕТІЗАООКМБІ МІ ОО
ММ5ЗІ КТЕОТАУУУСАВНСОМЕеаМОУУБУЕАмМУусОоаТтіІ МТУ
ЗАБТКОаРБЗМЕРІ АРСЗАЗТЗЕЗТААЇ СІ УКОМЕРЕРУТУБУУ
Важкий ланцюг 1 МЗаАГСТЗОаМНТЕРАМІ ОББЗИЇ М5І 55ММТУРЗЗБ'ЯТКТУТОМ во3в7 |СО38219 МОНКРОМТКУОКАМЕЗКМаРРСРРСОРАРЕААДСОРБЗУНБІ ЕРРК (ЗЕО ІО МО: 55) РКОТМІЗАТРЕУТСУУМОУМБОЕОРЕМОЄММУ У рамМЕМНМАК
ТКРАЕЕОЕЄМЗТУВУММІ ТМ НОМ МЕОКЕУКСКУЗМКаї РО
ЗІЕКТІЗКАКЕОРВЕРОМУТІ РРЗОЄЕМТКМОМУБІ ТС УКаБгМ
РЗБІАМЕМЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ ОБРСОаЗР І ЗК ТУКА
УМОБ,аММЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКБІ БІ БІ ЯК
Таблиця 10
Послідовності важких і легких ланцюгів для біспецифічних антитіл
АБО 77777711 Амінокислотнапослідовністьд//:/6///СС(/
ОТМУМТОЕРБІ ТУИ5РОС,ТМУТІ ТСАЗЗТаАУТТЗММАМУМООК
Легкий ланцюг 1 РаОАРВОа ІС ТМКААРСЕТРАВЕЗОаБі ЇЇ СсСОКААЇ ТІ БИМОРЕ соЗв219 РЕАЕМУСАЇ МУЗМІ МУРасаткіІ ТМ адФОРКААРЗМТІ ЕРРБЗБ (5ЕО ІО МО: 56) ЕЕГОАМКАТІ МСТПІЗВЕМРЕАМТМАМУКАОЗЗРУКАСМЕТТТР
І ЗКОЗММКУААБОМІ ЗІ ТРЕОСМУКЗНАЗУЗСОМТНЕСЗТМЕКТ
МАРТЕС5
ОГОГОЕБаРОЇ МКРЗЕТІ БІ ТСТУЗОаСОІЗБИаБЗУЕМИ,МВОР
РОКаї єУЛОаБІУУБСИПУМУМРБІ КЗАМТІЗМОТЗКМОБІ КІ 55
МТААОТАМУУСАВНОСАМАИІ ЕО'МУУСОСТІ МТУЗБАЗТКаР
ЗМЕРІ АРСЗАЗТЗЕЗТААГ СІ МКОМЕРЕРУТУВУУМЗИАІ 5
Важкий ланцюг 2 СМНТЕРАМІ О55О021І. У5І 55 УРЗБІІ ЕТКТУТСОМУМОНКРБ
ВСМВ117 МТКМОКАУЕЗКУИаРРСОРРСОРАРЕААСИРБЗУНІ ЕРРКРКОТІ М (ЗЕО ІО МО: 67) ІЗАТРЕУТСМУМОУБОЕОРЕМОЕМУУУраМЕМНМАКТКРАЕЕ
ОєМБТУАУМЗМІТМІ НОБУЛ МЕКЕУКСКУЗМКИТї РЗІЕКТІЗ
КАКСОРАЕРОММУТІ РРООБЄЕМТКМОМ5І ТС УКаЕМРЗОІАМЕ
МЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ ОБразЕРІ ВІ ТМОКЗАУМОваИмМ
МЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКБІ БІ Бі ак
ЗУМГТОРРБІБУЗБМАРЕИОТАВІТССЯСММІЗКЗУНУМУУООРРООА
Легкий ланцюг 2 РУМУММрОБОВРБИОаІРЕВЕЗИаЗМЗОаМТАТІ ТІЗАМЕАСВОЕАМУ вВСМВ117 УСОУМмОр55564НУМРааИТКІ ТМ ООРКААРБЗМТІ ЕРРББЕЕЇ. (5ЕО 1 МО: 66) ОАМКАТІ МС І5ОЕУРЕАМТМАМУКАОЗЗРУКАСМЕТТТРОУКО
І ЗММКМААББЗУІ 5І ТРЕОСМУКЗНАЗУЗСОМТНЕЗТМЕКТМУАР
ТЕС
ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААЗСЕТЕМТ МАММУМУУВОАР
СКагеЕМУмМАВІВЗКУМММАТУМААВУКОаВЕТІЗАООКМБІ МІ ОО
ММ5ЗІ КТЕОТАУУУСАВНСОМЕеаМОУУБУЕАмМУусОоаТтіІ МТУ
ЗАБТКОаРБЗМЕРІ АРСЗАЗТЗЕЗТААЇ СІ УКОМЕРЕРУТУБУУ
Важкий ланцюг 1 МЗаАГСТЗОаМНТЕРАМІ ОБИЇ М5І 55ММТУРЗБЗ ЯТКТУТо
Сорз3в219 МУМОНКРУЬМТКМОКАМЕЗКУИаРРСОРРСОРАРЕААСОИРБУНІ ЕРР (ЗЕО ІО МО: 55) КРКОТІ МІЗАТРЕУТГСМУУМОМ5БОЕОРЕМОЄММУ УМВИМЕМНМА
КТКРАЕЕОЕЄМЗТУВУУМІ ТМ НОВУ МЕКЕУКСКУЗМКаї Р
З9ІЕКТІЗКАКЕОРАЕРОММУТІ РРООБЄЕМТКМОМ5І ТС УКИаБгМ
РЗБІАМЕМЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ ОБРСОаЗР І ЗК ТУКА
УМОБ,аММЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКБІ БІ БІ ЯК
ОТМУМТОЕРБІ ТУИ5РОС,ТМУТІ ТСАЗЗТаАМТТЗММАМУМООК
Легкий ланцюг 1 РаОАРВОа ІС ТМКААРСЕТРАВЕЗОаБі ЇЇ СсСОКААЇ ТІ БИМОРЕ всзва | СОозв219 РЕАЕМУСАЇ МУЗМІ МУРасаткіІ ТМ аОРКААРЗМТІ ЕРРБ (БОЮ МО: 56) ЗЕЕГ ОАМКАТІ МСГ ІЗОЕМРЕАМТМАМУКАОЗЗРУКАСМЕТТТ
І РОКОЗММКУААБЗМІ 5І ТРЕОСМУКЗНАЗУЗСОМТНЕСЗТМЕК
ТМАРТЕСЗ
ОГОГОЕБаРОЇ МКРЗЕТІ БІ ТСТУЗСС5ІЗЗОЗМЕМСУВОР
РОКаї єУЛОаБІУУБСИПУМУМРБІ КЗАМТІЗМОТЗКМОБІ КІ 55
МТААОТАМУУСАВНОСАМАИІ ЕО'МУУСОСТІ МТУЗБАЗТКаР
ЗМЕРІ АРСЗАЗТЗЕЗТААГ СІ МКОМЕРЕРУТУВУУМЗИАІ 5
Важкий ланцюг 2 СМНТЕРАМІ О55О021І. У5І 55 УРЗБІІ ЕТКТУТСОМУМОНКРБ восМВв123 МТКМОКАУЕЗКУИаРРСОРРСОРАРЕААСИРБЗУНІ ЕРРКРКОТІ М (ЗЕО ІО МО: 68) ІЗАТРЕУТСМУМОУБОЕОРЕМОЕМУУУраМЕМНМАКТКРАЕЕ
ОєМБТУАУМЗМІТМІ НОБУЛ МЕКЕУКСКУЗМКИТї РЗІЕКТІЗ
КАКСОРАЕРОММУТІ РРООБЄЕМТКМОМ5І ТС УКаЕМРЗОІАМЕ
МЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ ОБразЕРІ У5ВІ ТУОКЗАУМОБамми
ЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКБІ БІ БІ СК
5О0
Таблиця 10
Послідовності важких і легких ланцюгів для біспецифічних антитіл
АБО 77777711 Амінокислотнапослідовністьд////:/38ОоОїС
ЗУМГТОРРБІБУЗБМАРЕИОТАВІТССЯСММІЗКЗУНУМУМООРРООА
Легкий ланцюг 2 РУМУММрОБОВРБИОаІРЕВЕЗИаЗМЗОаМТАТІ ТІЗАМЕАСВОЕАМУ вВСМВ123 УСОУМмОр55564НУМРааИТКІ ТМ ООРКААРБЗМТІ ЕРРББЕЕЇ. (5ЕО1О МО: 66) ОАМКАТІ МС І5ОЕМРЕАМТМАМУКАОЗЗРУКАСМЕТТТРУКО5
І ММКУААБЗМІ БІ. ТРЕОМКЗНАЗУЗСОМТНЕВЗТМЕКТМАРТЕС
З
ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААЗСЕТЕМТ МАММУУВОАР
СКагеЕМУмМАВІВЗКУМММАТУМААВУКОаВЕТІЗАООКМБІ МІ ОО
ММ5ЗІ КТЕОТАУУУСАВНСОМЕеаМОУУБУЕАмМУусОоаТтіІ МТУ
ЗАБТКОаРБЗМЕРІ АРСЗАЗТЗЕЗТААЇ СІ УКОМЕРЕРУТУБУУ
Важкий ланцюг 1 МЗаАГСТЗОаМНТЕРАМІ ОБИЇ М5І 55ММТУРЗБЗ ЯТКТУТо
Сорз3в219 МУМОНКРУЬМТКМОКАМЕЗКУИаРРСОРРСОРАРЕААСИаРБУНІ ЕР (ЗЕО ІО МО: 55) РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУУМОМЗБОЄОРЕМОЄМУМ УМОСМЕМНМА
КТКРАЕЕОЕЄМЗТУВУУМІ ТМ НОВУ МЕКЕУКСКУЗМКаї Р
З9ІЕКТІЗКАКЕОРАЕРОММУТІ РРООБЄЕМТКМОМ5І ТС УКаЕ
УРБЗВІАМЕМЕЗМИООРЕММУКТТРРМІ ОБСЯЗІ МЗКІ ТМОКЬ
ВУМОБЯММЕЗСЗУМНЕАСНМ НУТОКБІ БІ БІ ак
ОТМУМТОЕРБІ ТУИ5РОСТМУТІ ТСАЗЗТаАМТТЗММАМУМООКР
Легкий ланцюг 1 СОАРВС ІС, ТМКААРСТРАВЕЗОИа5БІ І ЧОКААЇ ТІ 5ИаМОРЕЮ соЗв219 ЕАЕМУСАЇ МУЗМІ МУРасаткІі ТМ аФОРКААРБЗМТІ ЕРРЗЗЕ (5ЕО ІО МО: 56) ЕГОАМКАТІ МСПІЗОЕМРЕАМТМАМУКАрЗЗРУКАСМЕТТТРОК
Ї ОБММКУААББЗМІ 5І ТРЕОМУКЗНАЗУЗСОМТНЕСЗТУЕКТМА всзво РТЕСЗ
ОГОГОЕБаРОЇ МКРЗЕТІ БІ ТСТУЗОСОІЗБаЗУЕМС,МВОРР скагемавімУваі иУМРБІКЗАМТІЗМОТ5КМО5І КІ 55МТ
ААОТАУУУСАВНОСАТАСІ ЕОМУСОСТІ МГУ55АВТКаРЗМЕ
РГАРСЗАЗТЗЕЗТААЇ аСІ УКОМЕРЕРУТУБМ МСА ТЗСИМУНТ
Важкий ланцюг 2 ЕРАМІ О5БаИЇ 5І 5БМУТУРБЗБЗІ ТК ИТОММОНКРЗОМТКМО восмМв128 КАУМЕЗКУИРРСОРРСОРАРЕАДАСОИРБЗУНБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕ (ЗЕО ІЮ МО: 69) МТСУММОУБОЕОРЕМОЕМУУУрамМЕМНМАКТКРАЕЄОЕМ5ЗТ
УВвУУБМІ ТМ НОМ МЕОКЕУКСКУЗМКаї РЗОБІЕКТІЗКАКОО
РВЕРОММТІ РРЗОБЕМТКМОМБІ ТОЇ МКОЕМРБОІАМЕМЕЗМОа
ОРЕММУКТТРРМІ ОБразЗЕРІ УВІ ТМОКЗАУМОБаМУЕ5ОБМ
МНЕАІНМНУТОКБІ БІ ЗІ ак
ЗУМГТОРРБІУЗБМАРСКОТАВІТСЯСММІСЗКОУНУМУМООРРООСАР
Легкий ланцюг 2 МУУУМрОоБОВРБЗаІРЕВЕЗавзмМЗамтТАТІТІЗАМЕАСОЕАМММС восмМв128 ОМ оБЗЗОНУМРасаткі ТМ ачоРКААРБМТІЕРРЗЗЕБ ОАМ (5ЕО ІО МО: 66) КАТ МСПІЗВЕМРЕАМТМАМКАОЗЗРУКАСМЕТТТРОКОЗММКУ
ААБЗМУІ ЗІ. ТРЕОМКЗНАЗУЗСОМТНЕСЗТМЕКТМАРТЕС5
ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААЗСЕТЕМТМАММУУВОАРаАа
КагеЕМУмМАВІВЗКУММУАТУУААБЗУКОаВЕТІЗАВОБКМ5І М ОММ
ЗІ КТЕОТАУУУСАВНОИа Ма МОУМЗУМ ГАМ ,ОСТІ МТУ5ЗА5Т
КаРБЗМУЕРІ АРСЗА5ЗТЗЕЗТАА СІ МУКОМЕРЕРУТУВУУМЗИАІ Т
Важкий ланцюг 1 ЗаМНТЕРАМІ О550І 51 55 УРЗББІ ТК ТСОММОНКРОМ возв1то | СозЗв219 ТКУОКАМЕЗБКМОа РРСРРСОРАРЕААДСІИРБЗУРІ ЕРРКРКОТІ МІЗА (ЗЕО ІО МО: 55) ТРЕМТСУМУМОУМ5ОЕОРЕМОЕЄЕМУ УМВИМЕМНМАКТКРАЕЄО ЕМ
ЗГУВУУБМІ ТМ НОМ МЕКЕУКСКУЗМКИї РЗОІЕКТІЗКАКОа
ОРАБЕРОММУТІ РРООЄЕМТКМОМ5І ТСІ УКЕЕМРЗОІАМЕМ ЕЗМ
СОРЕММУКТТРРМІ ОБравзЕГ І УЗКІ ТМОКЗАМОБаМУЕЗСОСВМ
МНЕАІНМНУТОКБІ БІ ЗІ ак
Таблиця 10
Послідовності важких і легких ланцюгів для біспецифічних антитіл
АБО 77777711 Амінокислотнапослідовністьд//:/6///СС
ОТММТОЕРБІ ТУИ5РОСТМУТІ ТСАЗЗТаАМТТЗММАМУМООКР
Легкий ланцюг 1 СОАРВС ІС, ТМКААРСТРАВЕЗОИа5БІ І ЧОКААЇ ТІ 5ИаМОРЕЮ соЗв219 ЕАЕМУСАЇ МУЗМІ МУРасаткІі ТМ аФОРКААРБЗМТІ ЕРРЗЗЕ (5ЕО ІО МО: 56) ЕГОАМКАТІ МСПІЗОЕМРЕАМТМАМУКАрЗЗРУКАСМЕТТТРОК
Ї ОБММКУААББЗМІ 5І ТРЕОМУКЗНАЗУЗСОМТНЕСЗТУЕКТМУАР
ТЕС
ОГОГОЕБаРОЇ МКРЗЕТІ БІ ТСТУЗОСОІЗБИаЗУЕМСУМІВОРР скагемавімУвавтМРБІ КЗАМТІЗМОТЗКМОЕ5І КІ 55МТ
ААОТАУУУСАВНОСАМАИІ ЕОММУСОСТІ МТУ55АВТКаРОЗМЕ
РГАРСЗАЗТЗЕЗТААЇ аСІ УКОМЕРЕРУТУБМ МСА ТЗСИМУНТ
Важкий ланцюг 2 ЕРАМІ О5БаИЇ 5І 5БМУТУРБЗБЗІ ТК ИТОММОНКРЗОМТКМО воМв129 КАУМЕЗКУИРРСОРРСОРАРЕАДАСОИРБЗУНБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕ (ЗЕО ІЮ МО: 70) МТСУММрУБОЕОРЕМОЕМУУУраМЕМНМАКТКРАЕЄОЕМЗ ТУ
ВУМЗМІ ТМЕНОБУ/ЛІ МСКЕУКСКУЗМКИаї РОБІЕКТІЗКАКООР
ВЕРОММУТІ РРЗАОБЕМТКМОМ5І ТС УКИОЕМРБЗОІАМЕМ ЕМО
РЕММУКТТРРМ' ОЗБравзЕРІ УЗА ТУОКЗАМОБаМУЕЗОСБУМ
НЕАСНМНУТОКБІ БІ Зі ИК
ЗУМГТОРРБІУЗБМАРСКОТАВІТСЯСММІЗКОУНУМУМООРРООСАР
Легкий ланцюг 2 МУУУМрОоБОВРБЗаІРЕВЕЗавзмМЗамтТАТІТІЗАМЕАСОЕАМММС воМв129 ОМ оБЗЗОНУМРасаткі ТМ ачоРКААРБМТІЕРРЗЗЕБ ОАМ (5ЕО ІО МО: 66) КАТІ МСПІЗВЕМРЕАМТМАМКАОЗЗРУКАСМЕТТТРОКОЗММК
МААБЗМІ ЗІ ТРЕОМКЗНАЗУЗСОМТНЕСЗТМЕКТМАРТЕС5
ЕМОЇ МЕЗО МОРССБІ ВІ БСААЗСЕТЕМТМАММУ УВОАРаа
КагеЕМУмМАВІВЗКУММУАТУУААБЗУКОаВЕТІЗАВОБКМ5І МОМ
М5О5І КТЕОТАМУУУСАВНИамМмеамМмОУУ5ЗУМУЕАУМУСОСТІ МТУЗБАБ
ТКаРЗМЕРІ АРСЗАЗТЗЕЗТААГ аСІ МКОУЕРЕРУТУБМУМЗИА
Важкий ланцюг 1 ТЗамНтТЕРАМІ О55О011 51 55 УРЗБІІ ЕТКТУТСОМУОНКР
Сорз3в219 ЗМ ТКУОКАМЕЗКУМОаРРСОРРСРАРЕААСИРБЗУРІ ЕРРКРКОТІ М (ЗЕО ІО МО: 55) ІЗАТРЕУТСМУМОУЗБОЕОРЕМОЕМУУУрОаМЕМНМАКТКРАЕЕ
ОєМБТУАУУМІТМІНОВУЛ МЕКЕУКСКУЗМКИТг РЗБІЕКТІЗК
АКОСОРВЕРОМУУТІ РРЗОБЕМТКМОМУБІ ТС УКа ЕМ РЗОІАМЕ
МЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ ОБразЕ І УЗКІ ТМОКкЗАМОБаМ
МЕЗСЗУММНЕАЇІ НМНУТОКБІ БІ БІ ак
ОТМУМТОЕРБІ ТУИ5РОСТМУТІ ТСАЗЗТаАМТТЗММАМУМООКР
Легкий ланцюг 1 СОАРВСГ ІДС ТМКААРСТРАВЕЗОИаБбБІ І ЧСОКААЇ ТІ ЗИМОРЕОЕ соЗв219 АЕМУСАЇ М/УЗМІ МУУРасаткіІ ТМ ФОРКААРБЗМТІ ЕРРБЗБЕЕЇ. (БОЮ МО: 56) ОАМКАТІ МС І5ОЕМРЕАМТМАМУКАОЗЗРУКАСМЕТТТРУКО5
І ММКУААБЗУІ ЗІ ТРЕОСМУКЗНАЗУЗСОМТНЕВЗТУЕКТМУАРТ восЗВ11 ЕС
ОГОГОЕБаРОЇ МКРОЕТІ БІ ТСТУЗОСОІ ЗОЗ ВОРР скагемавімУваі иУМРБІКЗАМТІЗМОТ5КМО5І КІ 55МТ
ААОТАУУУСАВНОСАТАСІ ЕОМУСОСТІ МГУ55АВТКаРЗМЕ
РГАРСЗАЗТЗЕЗТААЇ аСІ УКОМЕРЕРУТУБМ МСА ТЗСИМУНТ
Важкий ланцюг 2 ЕРАМІ О5БаИЇ 5І 5БМУТУРБЗБЗІ ТК ИТОММОНКРЗОМТКМО всМВ176 КАУМЕЗКУИРРСОРРСОРАРЕАДАСОИРБЗУНБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕ (ЗЕО ІЮ МО: 71) МТСУММрУЗОЕОРЕМОЕЄЕМУУУраМЕМНМАКТКРАЕЄОЕМЗ ТУ
ВУМ5МІ ТМЕНОВБУ/ЛІ МІКЕУКСКУЗМКИаї РОБІЕКТІЗКАКСОРА
ЕРОММТІ РРЗАОБЕМТКМОМ5І ТС УКИОЕМРБЗОІАМЕМ ЕМО
РЕММУКТТРРМ' ОЗБравзЕРІ УЗА ТУОКЗАМОБаМУЕЗОСБУМ
НЕАСНМНУТОКБІ БІГ ЗГИК
ЗУМГТОРРБІУЗБМАРСКОТАВІТСЯСММІЗКОУНУМУМООРРООСАР
Легкий ланцюг 2 МУУУМрОоБОВРБЗаІРЕВЕЗавзмМЗамтТАТІТІЗАМЕАСОЕАМММС всМВ176 ОМ оБЗЗОНУМРасаткі ТМ ачоРКААРБМТІЕРРЗЗЕБ ОАМ (5ЕО ІО МО: 66) КАТ МСПІЗВЕМРЕАМТМАМКАОЗЗРУКАСМЕТТТРОКОЗММКУ
ААБЗМУІ ЗІ. ТРЕОМКЗНАЗУЗСОМТНЕСЗТМЕКТМАРТЕС5
Таблиця 10
Послідовності важких і легких ланцюгів для біспецифічних антитіл
АБО 77777711 Амінокислотнапослідовністьїд/////:К//И/ у
ЕМОЇ МЕЗО МОРОСБІ ВІ БСААЗСЕТЕМТМАММУ УВОАРаа
КагеЕМУмМАВІВЗКУММУАТУУААБЗУКОаВЕТІЗАВОБКМ5І МОМ
М5О5І КТЕОТАМУУУСАВНИамМмеамМмОУУ5ЗУМУЕАУМУСОСТІ МТУЗБАБ
ТКаРЗМЕРІ АРСЗАЗТЗЕЗТААГ аСІ МКОУМЕРЕРУТУБМУМЗИаА
Важкий ланцюг 1 ГТЗамНтТЕРАМІ О55(01 51 55 УМГ УРЗБІІ ЕТКТУТСОММОНКР
Сорз3в219 ЗМ ТКУМОКАМЕЗКУМОаРРСОРРСОРАРЕААСИРБЗУРІ ЕРРКРКОТІ МІ (ЗЕО ІО МО: 55) ЗАТРЕМТСУММОУМЗОЕОРЕМОЕЄЕМУ УМВаМЕМНМАКТКРАЕЕО
ЕМБТУВУУМІ ТМ НОВУ МЕОКЕУКСКУЗМКаї РЗБІЕКТІЗКА
КаОРВЕРОМУТІ РРЗОЄЕМТКМОМУБІ ТС УКаЕМРЗОІАМЕМУ Е
ЗМаОРЕММУКТТРРМІ ОБОСОЗЕ І МК ТМОКЗАМОБаММУЕ5
СЗУМНЕАІ НМНУТОКБІ БІ І ак
ОТМУМТОЕРБІ ТУИ5РОСТМУТІ ТСАЗЗТаАМТТЗММАМУМООКР
Легкий ланцюг 1 СОАРВСГ ІДС ТМКААРСТРАВЕЗОИаБбБІ І ЧСОКААЇ ТІ ЗИМОРЕОЕ соЗв219 АЕМУСАЇ М/УЗМІ МУУРасаткіІ ТМ ФОРКААРБЗМТІ ЕРРБЗБЕЕЇ. (БОЮ МО: 56) ОАМКАТІ МС І5ОЕМРЕАМТМАМУКАОЗЗРУКАСМЕТТТРУКО5
І ММКУААБЗУІ ЗІ ТРЕОСМУКЗНАЗУЗСОМТНЕВЗТУЕКТУМАРТЕС восзв1і2 З
ОГОГОЕБаРОЇ МКРОЕТІ БІ ТСТУЗОСОІ ЗОЗ ВОРР скагемавімУвавтУМРБІКЗАМТІЗМОТ5КМО5І КІ 55
ТААОТАУУМСАВНОСАТАСІ ЕОМУУСОСТІ УТУ55АЗТКаРБУ
ЕРГАРСЗА5ТЗЕБЗТААЇ СІ МКОМЕРЕРУТУБУМЗОАІ ТВИМУН
Важкий ланцюг 2 ТЕРАМІ О5БЗОЇ У5І БУМ ТУРЗБІ ТКУ СММОНКРОМТКУ
ВСМВ177 ОКАУЕЗКМаРРСОРРОРАРЕААСИРБЗУНІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕ (ЗЕО ІО МО: 72) МТСУММрУЗОЕОРЕМОЕЄЕМУУУраМЕМНМАКТКРАЕЄОЕМЗ ТУ
ВУМЗМІ ТМЕНОБУ/ЛІ МСКЕУКСКУЗМКИаї РОБІЕКТІЗКАКООР
ВЕРОММУТІ РРЗАОБЕМТКМОМ5І ТС УКИОЕМРБЗОІАМЕМ ЕМО
ОРЕММУКТТРРМІ ОБразЗЕРІ УВІ ТМОКЗАУМОБаМУЕ5ОБМ
МНЕАІНМНУТОКБІ БІ ЗІ ак
ЗУМІ ТОРРІЗМЗ5МАРСОТАВІ ТССИММІЗКОЗУНМУ МООРРИаОСА
Легкий ланцюг 2 РУМУММрОБОВРБИОаІРЕВЕЗИаЗМЗОаМТАТІ ТІЗАМЕАСВОЕАМУ вВСМВ177 УСОУМмОр55564НУМРааИТКІ ТМ ООРКААРБЗМТІ ЕРРББЕЕЇ. (5ЕО1О МО: 66) ОАМКАТІ МС І5ОЕМРЕАМТМАМУКАОЗЗРУКАСМЕТТТРУКО5
І ММКУААБЗУІ ЗІ ТРЕОСМУКЗНАЗУЗСОМТНЕВЗТУЕКТУМАРТЕС
З
Приклад 9. Визначення афінності ВСМА до антитіл до ВСМА і біспецифічних антитіл до
ВСМА Х СОЗ
Для вимірювання значень афінності ВСМА людини до антитіл до ВСМА, які використовували для отримання біспецифічних антитіл до СОЗ, використовували поверхневий плазмонний резонанс (ППР). Протокол, який використовували для ППР був подібним до протоколу, описаного у прикладі 4. Результати, наведені в таблиці 11, свідчать про те, що всі зразки зв'язувалися з мономерним антигеном ВСМА з різною афінністю. Батьківські тА (ВСМВб69) мали афінність зв'язування -«- 1,4 нМ. ВСМВ117 і ВСМВ128 мали афінність у діапазоні
ВСМВ69, тоді як ВСМВ123, ВСМВ129, ВСМВ176 і ВСМВ177 мали відносно нижчу афінність (у 3- разів) через більш високу швидкість дисоціації. З метою оцінити відтворюваність даних проводили вимірювання для всіх зразків принаймні в трьох повторностях і реєстрували стандартні відхилення.
Таблиця 11
Афінність зв'язування тАБб до ВСМА з ВСМА людини згідно з методом ППР воМВв69 2,14 5 0,02 3,95 0,19 1,44 з 0,05
ВСМВ117 2,57 ж 0,21 3,42 5025 1,34 0,20 воМВв123 2,14 - 0,04 11,0 з 1,33 5,12 5 0,69 воМВв128 4,20 50,13 8,70 з 0,61 2,07 0,21 воМВв129 1,54 з 0,06 8,43 з 0,44 5,47 5013 вСМВ176 4,00 - 0,05 28,8 51,25 7,18 50,22 вВСМВ177 2,80 з 0,22 56,6 з 5,54 20,2 51,57
ППР також використовували для вимірювання значень афінності біспецифічних антитіл до
ВСМА х СОЗ для ВСМА людини і яванського макака. Результати, наведені в таблиці 12 свідчать про те, що всі зразки зв'язувалися з антигенами Ес-ВСМА з різною афінністю. ВСЗ3В7 і ВСЗВО мали афінність у діапазоні ВСМВ72 для ВСМА людини, тоді як решта біспецифічних антитіл мали афінність у 2-3 рази слабшу порівняно з ВСМВ72. Для Ес-ВСМА яванського макака ВС3В7 і ВС3ВУ мали у 2-3 рази сильнішу афінність, ніж ВСМВ72 (Ко 0,65-0,37 нМ, відповідно), тоді як решта тАБ мали зв'язування, подібне до ВСМВ72 (Ко З 0,8-1,2 НМ). З метою оцінити відтворюваність даних проводили вимірювання для всіх зразків принаймні в трьох повторностях і реєстрували стандартні відхилення.
Таблиця 12
Афінність зв'язування антитіл до ВСМА х СОЗ з Ес-ВСМА згідно з ППР
Кот Коні Кої Коп2 Конг - (869 х В219) (8117 х Вг19) (8123 х Вг19) (8128 х Вг19) (8129 х Вг19) (8176 х Вг19) (8177 х Вг19)
Афінність зв'язування біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ (ВСМВ72) із Ес-злитими білками ВСМА (людини, яванського макака і миші) вимірювали з використанням поверхневого плазмонного резонансу (ППР) з використанням системи Віасоге 1200 (СЕ Неайвсаге, МУ).
Проточні комірки 2, З і 4 модифікованого стрептавідином сенсорного чипа (СЕ Неаййсаге, Мо прод. ВА-1005-31) іммобілізували з біотинільованим Ес-злитим ВСМА людини, яванського макака або миші, відповідно (рівні іммобілізації ВСМА перебувають у діапазоні 12-16 одиниць відповіді (ОВ); Бс-ВСМА білки: людські (КО Зузіет5; Мо прод. 193-ЕС), яванського макака (власної розробки; Мо за кат. ВСММУУбЄ.О01) і мишачі (КО Зувіет5; Мо прод. 593-ВО) біотинілювали у власній дослідницькій лабораторії). На проточній комірці 1 білок не іммобілізували, і її використовували як еталонну поверхню. Експерименти дослідження кінетики зв'язування виконували за 25 "С у рухомому буфері (ФБР рН 7,4, 0,005 95 Р20, З мМ ЕДТК).
ВСМВТ72 готували в рухомому буфері, починаючи зі 100 нМ до 0,16 нМ у 5-кратних розведеннях.
Ці розчини вводили протягом 5 хв (фаза асоціації) зі швидкістю 50 мкл/хв, і відслідковували дисоціацію протягом 15 хв за рухомим буфером. Поверхню чипа регенерували короткими введеннями гліцину (рН 1,5) і рухомого буферу зі швидкістю 100 мкл/хв. Аналіз кінетики зв'язування взаємодій ВСМВ72 з ЕБо-ВСМА виконували з подвійною нормалізацією даних відносно еталонів, віднімаючи криві, отримані з використанням введення буфера від кривих введення аналітів, від яких віднято криві еталонів. Глобальну апроксимацію кінетичних даних сенсограм виконували з використанням двостадійної моделі зв'язування з використанням програмного забезпечення для оцінювання Віасоге 1200 (СЕ Неайсаге, МУ). Результати афінності зв'язування відповідно до двостадійної моделі зв'язування для різних видів ВСМА наведено у вигляді першого комплексу (Ко!) і кінцевого комплексу (Кб) (Фіг. 5).
Приклад 10. Мішень-специфічна активація Т-клітин і інтенсивність цитотоксичності антитіл до ВСМА х СОЗ за присутності імморталізованих клітинних ліній на фоні множинної мієломи
Оцінювали активацію Т-клітин, опосередковану антитілами до ВСМА х СО3. Коротко, антитіла ВСМВ72 (ВСМА х СО3) і контрольні антитіла (ВСМА х нуль і нуль х СОЮЗ) розводили до 800 мкг/мл у ФБР. Титрування здійснювали у 4-кратних послідовних розведеннях у ФБР у 96- ямковому планшеті з О-подібним дном. В останній колонці залишали лише ФБР (контроль у вигляді середовища-носія).
Клітини-мішені культивували в середовищі КРМІ 1640 без антибіотиків, з додаванням
СсІШамАХ, 10 95 ФБР і 25 мМ НЕРЕЗ (культуральне середовище). У день експерименту (день 1) клітини-мішені підраховували, і 10 мільйонів клітин центрифугували за швидкості 1350 об/хв протягом З хвилин, після чого супернатанти утилізували. Барвник для визначення проліферативної активності СеПТгасе ЕС5Е розводили у 18 мкл стерильного ОМ5О, і 1 мкл цього розчину розводили в 10 мл стерильного ФБР. Осади клітин ресуспендували в 1 мл розведення СЕБЕ й інкубували за кімнатної температури протягом 8 хвилин, уникаючи попадання прямого світла. Після інкубації до клітинної суспензії додавали 1 мл НІ ФБР для гасіння надлишку СЕБЕ. Клітини двічі промивали КРМІ-1640 з використанням 10 95 ФБР. Після розведення у 10 мл КРМІ клітини підраховували, і реєстрували життєздатність клітин у електронній таблиці. Клітини розводили до концентрації 2,2 х 1075/мл і інкубували за 37 "С до використання.
Зо Пан-Т-клітини від нормальних донорів розморожували на водяній бані за 37 "С, після чого вміст заморожених флаконів переносили до конічних флаконів на 50 мл і розводили в 15 мл холодного культурального середовища. Після цього клітини центрифугували за швидкості 1350 об/хв за температури 4 "С протягом З хвили. Супернатанти утилізували, і клітинний осад розводили в 5-10 мл культурального середовища. Т-клітини підраховували і реєстрували їхню життєздатність. Після цього клітини розводили в культуральному середовищі до концентрації 1,1 х 1076/мл. 2 х 1075 клітин-мішеней додавали до ямок 9б6-ямкового планшета з О-подібним дном з наступним додаванням блокатора Ес (до кінцевої концентрації 2 мг/мл). Усі клітинні лінії інкубували за кімнатної температури протягом 10 хвилин для блокування активності рецептора
Ес. До ямок додавали 1 х 1075 Т-клітин (співвідношення ефектор : мішень 5 : 1). Після змішування клітин-мішеней і Т-клітин до кожної ямки додавали 20 мкл антитіл до ВСМА х СОЗ3.
Планшети інкубували за 37 "С, з 5 95 СО» протягом 48 годин.
Через два дні планшети центрифугували за швидкості 1350 об/хв протягом З хвилин за 4 "С, і 100 мкл супернатантів переносили на окремий планшет і зберігали за -80 "С для аналізу на вивільнення цитокінів. Клітини промивали у 200 мкл ФБР і інкубували у 50 мкл барвника для визначення живих/мертвих клітин у близькому ІЧ-спектрі (розведення 1 : 200) і антитіла до СО25
РЕ (розведення 1 : 50) протягом 20 хвилин за кімнатної температури. Після цього клітини промивали один раз у 200 мкл буфера для ЕАСЗ і наприкінці розводили в 150 мкл буфера для
ЕАС5. Клітини аналізували з використанням БАСзЗСапіо 1 ії БРіомо 7.6 на цільову цитотоксичність (95 мішеней) і активацію Т-клітин СО25-- (95 живих Т-клітин). Побудову графіків і апроксимацію даних виконували в програмному забезпеченні СгарпРай Ргієт 6 із використанням нелінійної регресії на основі функції з варіабельним кутом нахилу кривої (чотири параметри) з використанням методу найменших квадратів.
На Фіг. 8 показано, що ВСМВ72 стимулює узгоджену активацію Т-клітин, визначену за допомогою посилення експресії СО25 на поверхні Т-клітин. Блокатор Ес використовували для попередження залежного від рецептора Ес зв'язування антитіл із клітинами-мішенями. У цілому точки даних тісно суміщені вздовж побудованої кривої відповідності, і варіабельність між донорами Т-клітин була незначною. Максимальну активацію на рівні 45-85 95 досягали для клітин ВСМА", ії 4-10 95 (еквівалентну фоновим рівням) для клітин ВСМА". Зведені дані для значень ЕСво і максимальної активації Т-клітин із двох незалежних експериментів із використанням Т-клітин від декількох нормальних донорів наведені на Фіг. 9.
На Фіг. 10 показано, що ВСМВ72 має узгоджену сильну цитотоксичність проти клітинних ліній ВСМА". Блокатор Ес використовували для попередження залежного від рецептора Ес зв'язування ВСМВ72 із клітинами-мішенями. У цілому точки даних тісно суміщені вздовж побудованої кривої відповідності, і варіабельність між донорами Т-клітин була незначною.
Максимальний лізис на рівні 62-97 95 досягали для клітин ВСМА", і 4-18 95 для клітин ВСМА".
Зведені дані для значень ЕСво і максимального лізису з двох незалежних експериментів із використанням Т-клітин від декількох нормальних донорів наведені на Фіг. 11.
Інші шість антитіл до ВСМА Х СОЗ демонстрували максимальну цитотоксичність на рівні 83- 93 90 (Фіг. 12 А) і активацію Т-клітин у діапазоні 74-83 906 для клітин НО29 ВСМА":" з використанням двох різних донорських Т-клітин (Фіг. 128). Ці шість молекул антитіл до ВСМА х
СОЗ здатні ефективно знищувати клітини-мішені ВСМА- за значень ЕСбо у діапазоні 0,04-0,09
НМ.
Приклад 11. Ефективність зв'язування ВСМВ?72 на клітинних лініях ВСМАчхж
Оцінювали значення ЕСбхо для зв'язування ВСМВ?72 з різними клітинними лініями ВСМА»х зі злоякісним фоном. Коротко, біспецифічне антитілло ВСМВ72 (ВСМА х СО3) розводили до 750 мкг/мл у ФБР. Титрування здійснювали у З-кратних послідовних розведеннях у ФБР у 96- ямковому планшеті з О-подібним дном. В останній колонці залишали лише ФБР (контроль у вигляді середовища-носія).
Клітини-мішені НО29 культивували в середовищі ЕРМІ 1640 без антибіотиків з додаванням сСІШамАХ, 10 95 ФБР ї 25 мМ НЕРЕЗ (культуральне середовище). Для аналізу вимірювали щільність і життєздатність клітин-мішеней, після чого клітини центрифугували за швидкості 1000 об/хв протягом 5 хвилин за 4 "С. Після цього клітинний осад промивали 10 мл ФБР і знову центрифугували за 1000 об/хв протягом 5 хвилин. Клітини ресуспендували у ФБР до 5,5 х 105 клітин/мл, і аліквоти клітинної суспензії вносили в 96-ямковий планшет з О-подібним дном по 90 мкл на ямку з наступним додаванням розведень ВСМВ72 10 мкл/ямку. Планшети інкубували за 4 "С протягом 1 години в темряві, потім центрифугували за 1000 об/хв протягом 5 хвилин, і утилізували супернатанти. Клітині осади двічі промивали у 200 мкл буфера для ГАС5. Вторинні
Зо антитіла проти Ес Ідс4 людини, мічені РЕ, розчиняли у буфері для ГАС5 у співвідношенні 1 : 25, і 50 мкл цієї суміші додавали до відповідних ямок. Зразки інкубували протягом 20 хвилин за температури 4 "С, промивали у буфері для ЕАС5, як описано вище, і розводили в 150 мкл буфера для ГАС5 для проведення аналізу на ЕАС5Сапіо ІІ. Дані аналізували з використанням
Ріомлдо 7.6 щодо зв'язування з ВСМВ72, а побудову графіків і апроксимацію даних виконували у програмному забезпеченні СгарпРайд Ргізт б з використанням нелінійної регресії на основі функції з варіабельним кутом нахилу кривої з використанням методу найменших квадратів.
Як показано на Фіг. 6, ВСМВ72 здатен зв'язуватися з усіма досліджуваними клітинними лініями ВСМАх. Значення ЕСв5о для зв'язування з клітинами НО29 становило 14,7 НМ, з клітинами ММ.1К становило 9,74 нМ, з клітинами ЕОМ становило 17,5 нМ, з клітинами ГР1 становило 22,3 НМ і з клітинами О-2932 становило 7,92 НМ.
Приклад 12. Аналіз експресії ВСМА і зв'язування ВСМВ?72 ех мімо в цільній крові донорів- людей
Експресію ВСМА і зв'язування ВСМВ72 на лейкоцитах оцінювали ех мімо в цільній крові від трьох нормальних донорів-людей. Коротко, перед експериментом свіжу периферичну кров від нормальних донорів-людей брали в гепаринізовані пробірки. Кров переносили піпеткою в 96- ямковий планшет з О-подібним дном аліквотами по 100 мкл. Забарвлювані антитіла готували у майстер-міксі, як вказано в інструкції з проведення експерименту. Майстер-мікс додавали безпосередньо до крові разом з антитілами до ВСМА або ВСМВ?72. Після 30 хвилин інкубації за кімнатної температури планшет із кров'ю центрифугували за 1350 об/хв протягом З хвилин за 4 "С. Супернатантну плазму утилізували, і осади піддавали чотирьом послідовним раундам лізису еритроцитів, з 5-хвилинними періодами інкубації між кожним промиванням. Після завершення лізису осади промивали один раз ФБР, а потім забарвлювали у ФБР з барвника для визначення живих/мертвих клітин у близькому ІЧ-спектрі (розведення 1 : 200) і антитіла до
І354 РЕ у розведенні 1 : 50 (тільки для ямок з ВСМВ72). Планшети додатково інкубували протягом 15 хвилин за кімнатної температури. Після цього зразки промивали у 200 мкл буфера для ЕАС5 і наприкінці розводили в 150 мкл буфера для РГАС5З для проведення аналізу на
ЗЕгопезза. З кожної ямки збирали приблизно 100 000 подій. Аналіз виконували у Ріомлудо 7.6.
Як показано на Фіг. 7, у трьох нормальних донорів не спостерігали експресії ВМСА у лімфоцитах, моноцитах, гранулоцитах або плазмоцитоїдних дендритних клітинах. ВСМВ72 демонстрував зв'язування з Т-клітинами СОЗ-- у трьох донорів зі змінною інтенсивністю у різних донорів. ВСМВ?72 не зв'язувався з жодними іншими типами клітин у цьому аналізі.
Приклад 13. Вплив ВСМВ72 на профіль цитокінів
Профіль цитокінів у супернатанті від аналізів опосередкованого Т-клітинами знищення оцінювали з використанням ВСМВ?72 ії контрольних антитіл. Т-клітини й антитіла наносили на планшет, як в аналізі опосередкованої Т-клітинами цитотоксичності (приклад 10). Після 48 годин інкубації клітинні супернатанти збирали й вимірювали різні цитокіни (10/30 Ріех) з використанням аналізу ЕГІЗА на основі методу М50О. Рівні цитокінів виражали у пг/мл, а побудову графіків і апроксимацію даних виконували в програмному забезпеченні сгарпРаа
Ргізт 6 із використанням нелінійної регресії на основі функції з варіабельним кутом нахилу кривої (чотири параметри). Значення ЕСво шести цитокінів клітинної лінії КРМІ8226б з використанням шести донорів Т-клітин наведено на Фіг. 13. Дані демонструють значне вивільнення цитокінів у результаті активації Т-клітин. Для контрольних антитілах спостерігалося низьке вивільнення цитокінів або його відсутність (дані не показані).
Приклад 14. Функціональне порівняння ВСМВ72, отриманих у клітинах НЕК ії СНО (транзієнтних і стабільних клітинних лініях), щодо активації Т-клітин і опосередкованого Т- клітинами націленого знищення клітин
Біспецифічні антитіла, отримані в різних клітинах і в різних режимах експресії можуть відрізнятися за активністю. Таким чином, оцінювали іп міто ефективність ВСМВ72, отриманих у клітинах НЕК (тимчасова експресія) або СНО (тимчасова або стабільна експресія).
ВСМВ72 розводили до 800 мкг/мл у ФБР. Як вказано в кожному експерименті, титрування здійснювали або у З3-кратних, або у 4-кратних послідовних розведеннях у ФБР у 96-ямковому планшеті з О-подібним дном. В останній колонці залишали лише ФБР (контроль у вигляді середовища-носія).
Клітини-мішені Но29 культивували в середовищі ЕРМІ 1640 без антибіотиків з додаванням
СсІШамАХ, 10 95 ФБР і 25 мМ НЕРЕЗ (культуральне середовище). У день експерименту (день 1) клітини підраховували, і 10 мільйонів клітин центрифугували за швидкості 1350 об/хв протягом З хвилин, і утилізували супернатанти. Барвник для визначення проліферативної активності
СеПтасе ЕС5Е розводили у 18 мкл стерильного ОМ5О, і 1 мкл цього розчину розводили в 10
Зо мл стерильного ФБР. Осад клітин НеО29 ресуспендували в 1 мл розведення СЕЗЕ й інкубували за кімнатної температури протягом 8 хвилин, уникаючи попадання прямого світла. Після інкубації до клітинної суспензії додавали 1 мл НІ ФБР для гасіння надлишку СЕЗЕ. Клітини двічі промивали КРМІ-1640 з використанням 10 95 ФБР. Після розведення у 10 мл КРМІ клітини підраховували, і реєстрували життєздатність клітин у електронній таблиці. Клітини розводили до вказаної концентрації й інкубували за 37 "С до використання.
Т-клітини від нормальних донорів розморожували на водяній бані за 37 "С, після чого вміст флакона переносили до конічного флакона на 50 мл і розводили в 15 мл холодного культурального середовища. Після цього клітини центрифугували за швидкості 1350 об/хв за температури 4 "С протягом З хвили. Супернатанти утилізували, і клітинний осад розводили в 5- 10 мл культурального середовища. Т-клітини підраховували і розводили в культуральному середовищі до відповідної концентрації (див. інструкцію до кожного експерименту).
До ямок додавали клітини НО29 з наступним додаванням Т-клітин (співвідношення ефектор: мішень 5 : 1). У цій серії дослідів блокатор Ес не використовували. Після змішування клітин- мішеней і Т-клітин до кожної ямки додавали 20 мкл розведень ВСМВ72. Планшети інкубували за 37 "С, з 5 95 СО» протягом 48 годин.
Після 2 днів планшети, що містили клітини, центрифугували, а супернатанти утилізували або зберігали для аналізу на вивільнення цитокінів. Клітини промивали у 200 мкл ФБР і інкубували у 50 мкл барвника для визначення живих/мертвих клітин у близькому ІЧ-спектрі (розведення 1 : 200) і антитіла до СО25 РЕ (розведення 1 : 50) протягом 20 хвилин за кімнатної температури. Після цього клітини промивали один раз у 200 мкл буфера для ЕГАСЗ і наприкінці розводили в 150 мкл буфера для РАС5. Клітини вимірювали методом проточної цитометрії в той же день з використанням ЕБАСзЗСапіо І і аналізували у РіІомл)о 7.6 на цільову цитотоксичність (95 мішеней) і активацію Т-клітин СО25-- (95 живих Т-клітин). Побудову графіків і апроксимацію даних виконували в програмному забезпеченні СгарпРай Ргієт 6 із використанням нелінійної регресії на основі функції з варіабельним кутом нахилу кривої (чотири параметри) і методу найменших квадратів.
Як показано на Фіг. 14, ВСМВ72, отримане в клітинах НЕК, і ВСМВ72, отримане в клітинах
СНО, продемонстрували майже ідентичну ефективність у аналізі перенаправлення Т-клітин щодо цитотоксичності для клітин-мішеней і стимуляції Т-клітин. Загалом, було досягнуто бо максимальне знищення на рівні 85 95 і активація Т-клітин на рівні 80 95. Середні значення ЕСво для цитотоксичності становили 0,29 нМ для ВСМВ72, отриманого в клітинах НЕК, і 0,42-0,47 нм для ВСМВ72, отриманого в клітинах СНО. Середні значення ЕСб5о для активації Т-клітин становили 0,28 нМ для ВСМВ72, отриманого у клітинах НЕК, і 0,37-0,41 нМ для ВСМВ72, отриманого у клітинах СНО. Порівняльний аналіз з використанням Т-критерію Стьюдента не показав статистичної значущості між значеннями ЕСзо.
Приклад 15. Активація ВСМВ72 РЗ8-сигналінгу
Як ВАЕР, так їі АРКІГЇ. зв'язуються з двома рецепторами ВСМА (антиген дозрівання В-клітин,
ТМЕНЗЕ 17) ії ТАСІ (трансмембранний активатор і інтеркалятор САМІ, ТМЕКЗЕ 135). Залучення
ВСМА активує сигнальні шляхи УМК і РЗВ МАРК. Можливо, біспецифічне антитіло до ВСМА Х сСОоз3, ВСМВ72, може проявляти агоністичний вплив на ВСМА. Це дослідження включало дві частини. 1. Розробка простого вестерн-блоту для спостереження змін Р3ва МАРК у клітинах
Нег9 або ММ'І.А після обробки АРКІЇ. або ВАЕРЕ. 2. Використання цього заново розробленого аналізу для перевірки того, чи має ВСМВ?72 агоністичний вплив на ВСМА.
Обробка клітин
Перед обробкою клітини НО29 або ММ'І.К висівали в кількості 1,5еб/мл у безсироваткове середовище КРМІ на 24 години за 37 "С у присутності 5 95 СО». У день обробки клітини осаджували й ресуспендували в безсироватковому середовищі КРМІ в кількості 1,5еб/мл. Для аналізу з плином часу клітини розділяли на аліквоти в 10 пробірок на 5 мл. Кожну пробірку з клітинами обробляли 1000 нг/мл АРРЕІЇ (КО Бувіет»5 Мо за кат. 5860-АР-010) або 1000 нг/мл
ВАРЕ (КО Зузіет»5 Мо за кат. 2149-ВЕ-010) протягом 0, 5, 15, ЗО ї 60 хв відповідно, за 37 "С у присутності 5 956 СО». Після інкубації клітини негайно осаджували й заморожували за -80 "С для приготування клітинного лізату. Групи обробки клітин НО29 в аналізі агоністичного ефекту
ВСМВ72 наведено у таблиці 13. Аналіз агоністичного ефекту ВСМВ72 проводили двічі.
Таблиця 13
Групи обробки клітин в аналізі агоністичного ефекту ВСМВ72 11111116 11111111 1воМВ7Ла1онумМл7///////7711111111111С1С 71111118 11111111 1воМВ72л1о0бнумМми77/7////////777777777777111111111111СсС1С 771171717179 1111111 ІВСМВ/2л1Об00нумМи7///////111111СсС1С
Приготування клітинного лізату для простого вестерн-блоту
Виконували лізис клітин з використанням буфера КІРА, що містить інгібітори фосфатази і протеази. Концентрацію білків виміряли на спектрофотометрі для зчитування планшетів зресігаМах Ріиз 384 (МоїІесшаг Оемісе5, м. Санівейл, штат Каліфорнія, США) з використанням
Зо набору для аналізу білків ОС Ргоївіп Аззау від компанії Віокай (Ме Віокайд 500-0112) і стандартів бичачого сироваткового альбуміну.
Простий вестерн-блот
Простий вестерн-блот виконували з використанням майстер-набору Ууе5-Нарьїй (12-230 кДа) (Ргоївіпбітріє Мо РЗ-МКО1) відповідно до посібника споживача Ргоїеіпбітріє. Коротко, зразки клітинного лізату змішували з майстер-міксом до кінцевої концентрації буфера для зразків 1х, флуоресцентних міток молекулярної маси 1х і 40 мМ дитіотреїтолу (ОТ), їі потім нагрівали за 95"С протягом 5 хв. У потрібні ямки мікропланшетів Зітріе М/е5 також розподіляли зразки, блокувальний реагент, первинні антитіла фосфор-р38 МАРК (Тпептовїізпег: МУУКМо МА5-15182) або актин-бета (Се Зідпайпо, Ме 84575), вторинні антитіла, кон'юговані з НЕР, хемілюмінесцентний субстрат і розділювальні й стекінгові матриці, після завантаження планшетів у капілярній системі здійснювали розділювальний електрофорез і етапи імунодетекції, які були повністю автоматизованими. Під час електрофорезу білки розділяли на основі молекулярної маси через стекінгові й розділювальні матриці та іммобілізували на капілярній стінці з використанням власної хімічної системи фотоактивованого захоплення.
Первинні антитіла розводили в співвідношенні 1 : 50 розчином для розведення ІІ (Ргоїеіпбітріе
Мо 042-203). Цільові білки тестували імунним зондом з використанням первинного антитіла протягом 60 хв із наступною обробкою НЕР-кон'югованими вторинними антитілами. Виконували простий вестерн-блот аналіз Зітоп за кімнатної температури, в якому використовували налаштування приладу за замовчуванням. Цифрові зображення аналізували з використанням програмного забезпечення Сотрабз5 (Ргоїеіп5ітріе), і кількісні дані виявлених білків виражали у вигляді молекулярної маси, інтенсивності сигнал/пік і площі піку.
Результати
На основі інформації, отриманої у дослідженні з плином часу, проводили аналіз агоністичних властивостей ВСМВ?72 у клітинах НО29 з використанням кінцевої точки інкубації 15 хв. Сигнали рЗ8 МАРК нормалізували за сигналами бета-актину людини. Середні значення нормалізованих сигналів рЗ38 МАРК із двох аналізів наведено на Фіг. 15. Аналіз агоністичних властивостей ВСМВ72 продемонстрував, що ВСМВ72 не має агоністичного впливу на ВСМА у клітинах НО29.
Приклад 16. Сигналінг МЕКВ, викликаний ВСМВ72
ВСМА являє собою поверхневий рецептор, що може викликати сигналінг МЕ-кВ у відповідь на ендогенні ліганди. Ефект активації зв'язування ВСМВ72 з ВСМА на шляху МЕ-кВ оцінювали з використанням репортерної клітинної лінії що експресує ВСМА, яка експресує лужну фосфатазу (ЗЕАР) під дією промотора МЕКВ.
Клітини культивували в середовищі ОМЕМ з додаванням сСішамАХ і 10 95 ФБР (культуральні середовища). Увечері перед експериментом клітини збирали з використанням трипсинізації (5 хвилин у попередньо підігрітому 0,25 95 трипсині за 37 "С) і промивали в 30 мл культурального середовища. Потім клітини центрифугували за швидкості 1000 об/хв протягом 5 хвилин за 4 С і розбавляли в безсироватковому середовищі ЮОМЕМ (з Сішамах) до концентрації 2,5 х 1075 клітин/мл. До ямок 96-ямкового планшета з пласким дном додавали 5 х 1074 клітин й інкубували за 37 "С протягом 16 годин.
Наступного ранку до відповідних ямок (див. мапи експериментальних планшетів) додавали різні стимулювальні реагенти (ТМЕа, АРКІЇ, ВСМВ72), і планшети інкубували за 37 "С протягом додаткових 16 годин, 24 годин або 48 годин, що представляло ранню, середню й пізню часові точки сигналінгу відповідно. Після кожної часової точки з ямок відбирали 10 мкл підготовленого культурального середовища, переносили до 96-ямкового твердого планшета, що постачається
Зо в наборі БЕАР (Саутап, 600272) і накривали кришкою. Готували стандарти ЗЕАР шляхом розведення маточного стандарту (5 Од/мл) у співвідношенні 1 : 10 у безсироватковому середовищі ОМЕМ (з СсСішамах) і наступного отримання послідовних розведень 1 : 2; діапазон розведень становить 50-0,78 мОд/мл. Планшети зі зразками інкубували за 65 С протягом 30 хвилин для інактивації ендогенної лужної фосфатази; ЗЕАР, що експресується в цьому аналізі, є стабільною за цих умов інкубації. Після інкубації планшетів за кімнатної температури до відповідних ямок додавали 10 мкл розведень стандарту. До всіх ямок додавали 50 мкл розчину субстрату, і зразки коротко струшували для розподілення розчину в ямках. Зразки інкубували протягом 20-30 хвилин, і оцінювали хемілюмінесценцію з використанням спектрофотометра
РеїКіпЕітег ЕпМізіоп 2104 для визначення множини міток. Усі відліки люмінесценції перетворювали на одиниці активності на основі стандартної кривої, і ці значення аналізували у програмі Місго5ой Ехсеї 2010 і імпортували до Ссгарйі Ргізт 6 для графічного аналізу.
На Фіг. 16 показано, що тоді як АРКІЇ був здатен стимулювати ВСМА у концентраціях до 0,46 нМ, у ціллму ВСМВ72 не активував шлях МЕ-кВ у клітинах з трансдукованим ВСМА у концентраціях нижче 10 нМ. Незначну ВСМВ72-залежну активацію спостерігали за високих (44- 133 нМ) концентрацій ВСМВ72.
Приклад 17. Вплив екзогенного додавання позаклітинного домену ВСМА на активацію Т- клітин за відсутності клітин-мішеней
Позаклітинний домен ВСМА (ЕСО) у розчині може формувати тримери. Таким чином, існує можливість, що множинні біспецифічні антитіла можуть зв'язується з тримерами ЕСО ВСМА і перехресно зв'язувати комплекси ТОК за відсутності клітин-мішеней. Це, у свою чергу, може активувати Т-клітини в незалежний від мішені спосіб. У цьому досліді вивчали, чи може екзогенне додавання ЕСО ВСМА перемикати активацію Т-клітин на рівні експресії СО25 без взаємодії з клітинами-мішенями.
ВСМВ72 (ВСМА х СО3) і контроль (нуль х СОЗ) розводили до 800 мкг/мл у ФБР. Титрування здійснювали у 3-кратних послідовних розведеннях у ФБР у 96-ямковому планшеті з О-подібним дном. В останній колонці залишали лише ФБР (контроль у вигляді середовища-носія).
Розчинний ЕСО ВСМА (5ВСМА) розводили до 36 мкг/мл (6,67 мкМ) у ФБР. Титрування здійснювали у 3-кратних послідовних розведеннях у ФБР у 96-ямковому планшеті з О-подібним дном. У верхній ямці залишали лише ФБР (контроль у вигляді середовища-носія).
Пан-Т-клітини від нормальних донорів розморожували на водяній бані за 37 "С, після чого вміст заморожених флаконів переносили до конічних флаконів на 50 мл і розводили в 30 мл холодного культурального середовища. Після цього клітини центрифугували за швидкості 1350 об/хв за температури 4 "С протягом З хвили. Супернатанти утилізували, і клітинний осад розводили в 10 мл культурального середовища. Т-клітини підраховували і реєстрували їхню життєздатність. Після цього клітини розводили в культуральному середовищі до концентрації 0,525 х 107в/мл.
До ямок додавали 1 х 1075 Т-клітин (190 мкл), з наступним додаванням 5 мкл розведень 5ВСМА і 5 мкл розведень ВСМВ72. Планшети інкубували за 37 "С, з 5 95 СО» протягом 48 годин.
Після двох днів планшети центрифугували за швидкості 1500 об/хв протягом З хвилин за 4 "С, і утилізували супернатанти. Клітинні осади промивали у 200 мкл ФБР і інкубували у 50 мкл барвника для визначення живих/мертвих клітин у близькому ІЧ-спектрі (розведення 1 : 200) і антитіла до СО25 РЕ (розведення 1 : 50) протягом 20 хвилин за кімнатної температури. Після цього клітини промивали один раз у 200 мкл буфера для ЕАСЗ і наприкінці розводили в 150 мкл буфера для ЕАСЗ5. Клітини аналізували з використанням ЕАСзЗСанпіо ПІ і РІомщдо 7.6 на активацію
Т-клітин СО25-- (95 живих Т-клітин). Побудову графіків і апроксимацію даних виконували в програмному забезпеченні СгарпРай Ргіт б із використанням нелінійної регресії з апроксимацією за методом найменших квадратів.
Т-клітини від нормальних донорів не демонструють активації, опосередкованої ЕСО 5ВСМА, за присутності ВСМВ72. Слабку активацію незначного відсотка Т-клітин (10-15 95) спостерігали у високих концентраціях (? 40 нм) ВСМВ72 у незалежному від 5ВСМА режимі (Фіг. 17).
Приклад 18. Вплив розчинного ЕСО ВСМА, АРКІЇ. і ВАЕЕ на активацію Т-клітин і ВСМВ72- залежну цитотоксичність
Розчинний ЕСО ВСМА може слугувати стоком для антитіл до ВСМА х СОЗ3, тоді як АРКІЇ і
ВАРЕ можуть бути конкуруючими інгібіторами взаємодії між поверхневим рецептором і антитілами до ВСМА х СОЗ. Впливи розчинного ЕСО ВСМА ні ендогенних лігандів АРКІЇ. і ВАЕЕ на іп міго цитотоксичну здатність ВСМВ72-залежного знищення клітин оцінювали в аналізах перенаправлення Т-клітин з використанням імморталізованої клітинної лінії НО29 і пан-Т-клітин від нормального донора М7077.
Зо ВСМВ72 розводили до 800 мкг/мл у ФБР. Титрування здійснювали у 3З-кратних послідовних розведеннях у ФБР у 96-ямковому планшеті з О-подібним дном. В останній колонці залишали лише ФБР (контроль у вигляді середовища-носія). Розчисний ЕСО ВСМА розводили до 9 мкг/мл, а АРКІГ. і ВАЕРЕ розводили до 10 мкг/мл. Титрування для обох реагентів здійснювали у 3- кратних послідовних розведеннях у ФБР у 96-ямковому планшеті з О-подібним дном.
Клітини-мішені Но29 культивували в середовищі ЕРМІ 1640 без антибіотиків з додаванням
СсІШамАХ, 10 95 ФБР і 25 мМ НЕРЕЗ (культуральне середовище). У день експерименту (день 1) клітини-мішені підраховували, і 10 мільйонів клітин центрифугували за швидкості 1350 об/хв протягом З хвилин, після чого супернатанти утилізували. Барвник для визначення проліферативної активності СеПТгасе ЕС5Е розводили у 18 мкл стерильного ОМ5О, і 1 мкл цього розчину розводили в 10 мл стерильного ФБР. Осади клітин ресуспендували в 1 мл розведення СЕБЕ й інкубували за кімнатної температури протягом 8 хвилин, уникаючи попадання прямого світла. Після інкубації до клітинної суспензії додавали 1 мл НІ ФБР для гасіння надлишку СЕБЕ. Клітини двічі промивали КРМІ-1640 з використанням 10 95 ФБР. Після розведення у 10 мл КРМІ клітини підраховували, і реєстрували життєздатність клітин у електронній таблиці. Клітини розводили до концентрації 2,2 х 1075/мл і інкубували за 37 "С до використання.
Пан-Т-клітини від нормального донора розморожували на водяній бані за 37 "С, після чого вміст заморожених флаконів переносили до конічних флаконів на 50 мл і розводили в 30 мл холодного культурального середовища. Після цього клітини центрифугували за швидкості 1350 об/хв за температури 4 "С протягом З хвили. Супернатанти утилізували, і клітинний осад розводили в 10 мл культурального середовища. Т-клітини підраховували і реєстрували їхню життєздатність. Після цього клітини розводили в культуральному середовищі до концентрації 1,1 х 1076/мл.
До ямок 96-ямкового планшета з О-подібним дном додавали 2 х 1075 клітин Нег9; у цьому дослідженні не було необхідності в інкубації з Ес-блокатором. До ямок додавали 1 х 1075 Т- клітин (співвідношення ефектор : мішень 5 : 1). Після змішування клітин-мішеней і Т-клітин до ямок додавали 20 мл одного з 5ВСМА, АРМІЇ або ВАБРЕ з наступним додаванням 5 мл розведень антитіл. Планшети інкубували за 37 "С, з 5 95 СО» протягом 48 годин.
Після 2 днів планшети центрифугували за швидкості 1500 об/хв протягом З хвилин за 4 "С, і бо утилізували супернатанти. Клітини промивали у 200 мкл ФБР і інкубували у 50 мкл барвника для визначення живих/мертвих клітин у близькому ІЧ-спектрі (розведення 1 : 200) і антитіла до
СО025 РЕ (розведення 1 : 50) протягом 20 хвилин за кімнатної температури. Після цього клітини промивали один раз у 200 мкл буфера для ЕАСЗ і наприкінці розводили в 150 мкл буфера для
ЕАС5. Клітини аналізували з використанням БАСзЗСапіо 1 ії БРіомо 7.6 на цільову цитотоксичність (95 мішеней) і активацію Т-клітин СО25-- (95 живих Т-клітин). Побудову графіків і апроксимацію даних виконували в програмному забезпеченні СгарпРай Ргієт 6 із використанням нелінійної регресії на основі функції з варіабельним кутом нахилу кривої (чотири параметри) з використанням методу найменших квадратів.
ВСМВ?72 могло проявляти цитотоксичність на клітинах НО29 за присутності розчинного ЕСО
ВСМА, причому мало лише незначний вплив (2-кратне зростання) на ЕСоо за найвищих доз (» 160 нм) ЕСО 5ВСМА; активація Т-клітин змінювалася подібним чином (див. Фіг. 18А і 180).
АРКІГЇ. підвищував значення ЕСово для клітинної цитотоксичності й активації Т-клітин у шість разів за високих доз (46 нМ), при цьому викликав мінімальні зміни в аналізі за більш низьких доз (див.
Фіг. 188 і 18Е). Максимальні значення знищення не змінювалися під впливом 5ВСМА або АРНБІЇ..
На відміну від цього, екзогенний ВАБЕ не мав впливу на ВСМВ72-опосередковану цитотоксичність у концентраціях до 51 нМ (див. Фіг. 183). Потенціал активації Т-клітин в усіх випадках добре корелював з даними щодо знищення, як і очікувалось (див. Фіг. 181Е).
Приклад 19. Конкуренція ВСМВ72, АРКІ!. і ВАЕЕ за зв'язування з ВСМА іп міто
Обидва ліганди ТМЕ, АРКІЇ і ВАР, можуть зв'язуватися з ВСМА і індукувати каскад сигналінгу, що веде до виживання й проліферації клітини. Позаклітинний домен ВСМА являє собою короткий фрагмент із 54 амінокислот, який зв'язується з цими двома лігандами, а також з антитілами, отриманими проти цього мотиву. У цьому аналізі оцінювали конкурентну природу цих лігандів щодо ВСМВ72.
Аналіз проводили у форматі на основі ЕГІ5А. Під час підготовки до аналізу конкурентності слід було виконати мічення ВСМА-Бс з використанням З!йМоТад від компанії М5О. Вміст флаконів із 50 мкг ВСМА-Рс розводили в 500 мкл ФБР з отриманням 0,1 мг/мл (3,125 мкм мономера). 150 нмоль МН5З-5й Мо ТГад розчиняли у 50 мкл води з отриманням розчину З мМ. 5,2 мкл З мМ МНЗ-Зи,иПоТад (15,6 нмоль) додавали до 500 мкл ВСМА-Ес (1,56 нмоль мономера) для реакції мічення з 10-кратним надлишком. Реакційну суміш залишали на 2 години за КТ у
Зо темряві. Додавали 50 мкл 1 М трис для гасіння МН5, що не прореагував. Надлишок і трис видаляли за допомогою заміни буфера на 2 мл спін-колонці 7К ММ/СО 7ебва, урівноваженій
ФБР. Кінцевий об'єм становив - 630 мкл, таким чином, кінцевий ЗйиШоТад-ВСМА-Ес використовували як 2,5 мкМ.
Для аналізу конкурентності антитіла до ВАБЕ (100 мкг) і антитіла до АРКІЇ (100 мкг) розводили в 200 мкл ФБР з отриманням маточних розчинів з концентрацією 0,5 мг/мл. По 30 мкл (б мкг) кожного з антитіла до АРКІЇ і антитіла до ВАБЕ розводили в 2,97 мл ФБР з отриманням розчинів із концентраціями 2 мг/мл. До кожної ямки 96-ямкового планшета М5О з високим зв'язуванням додавали 25 мкл антитіла до АРКІГЇ. у концентрації 2 мкг/мл. До кожної ямки другого 96-ямкового планшета М50О з високим зв'язуванням додавали 25 мкл антитіла до
ВАРЕ у концентрації 2 мкг/мл. Планшети зберігали протягом ночі за температури 4 "С для іммобілізації антитіл. Вміст планшетів, покритих антитілами до АРКІЇ. і антитілами до ВАКЕЕ, викидали й додавали ЗирегВіосК по 300 мкл/ямку. Після блокування протягом 1 години за КТ планшети З рази промивали ФБР-Т. 10 мкг кожного з рекомбінантних АРРКІГЇ. і ВАРЕ розводили в 100 мкл ФБР з отриманням розчинів 0,1 мг/мл. Готували по З мл розчинів у концентрації 2 мкг/мл для кожного з АРРІЇ. і ВАЕРЕ шляхом розведення 60 мкл свіжовідновленого білка в 2,94 мл ЗирегВіоскК. До кожної ямки планшета, покритого антитілами до АРКІЇ, додавали 25 мкл
АРКІЇ. у концентрації 2 мкг/мл, а до кожної ямки планшета, покритого антитілами до ВАЕБЕ, додавали 25 мкл ВАЕРЕ у концентрації 2 мкг/мл. Після захоплення упродовж 1 години планшети
З рази промивали ФБР-Т. Розводили 500 мкг антитіл до ВСМА (КО Зуз Мабр193) в 1 мл ФБР з отриманням маточного розчину 0,5 мг/мл (3,3 мкМ). Антитіла до ВСМА Мар193, ВСМВ72.004 і контроль (нуль х СОЗ) розводили до 1 мкМ у ЗирегВіосК. Готували 11-точкові трикратні послідовні послідовності розведень шляхом змішування 100 мкл антитіла у 200 мкл ЗзирегВіоск.
Готували б мл 30 нМ ЗийоТад-ВСМА-ЕС шляхом розведення 72 мкл вищевказаного білка в 5,928 мл зирегВіосК. До кожної ямки планшетів із захопленими АРКІ/ВАЕЕ додавали 25 мкл кожного антитіла, отриманого на стадії 11, відповідно до мапи планшета, наведеній нижче на
Фіг. 1. До кожної ямки обох планшетів додавали 25 мкл 30 нМ З!йПМоїад-ВСМА-Ес. Після 1 години за КТ планшети З рази промивали ФБР-Т. До кожної ямки додавали 150 мкл їх буфера для зчитування Т М50, і планшети сканували на приладі бесіог 6000 ітадег. Експеримент повторювали точно так, як описано вище, для отримання другого незалежного набору бо результатів.
Як показано на Фіг. 19, при інкубації зі зростаючими кількостями ВСМВ72, але не контрольного антитіла (нуль х СОЗ), білок ВСМА-Ес не міг зв'язуватися зі зв'язаними на планшеті АРКІГЇ. і ВАЕРЕ. Це спостереження узгоджувалися для двох незалежних експериментів, кожен з яких проведено у трикратній повторності.
Приклад 20. Зв'язування й цитотоксичність ВСМВ72 для СО138-позитивних клітин кісткового мозку пацієнтів із множинною мієломою.
Для оцінки активності ВСМВ72 у первинних зразках від пацієнтів із множинною мієломою автори винаходу випробували це антитіло в аналізі цитотоксичного знищення з використанням заморожених зразків множинної мієломи з кісткового мозку від 5 пацієнтів і Т-клітин від здорових донорів. Також вимірювали зв'язування антитіл і потенціал активація Т-клітин.
Аналізи зв'язування з ВСМВ72
Клітинну суспензію розділяли на аліквоти по 100 мкл на ямку в 96-ямковому планшеті з О- подібним дном з наступним додаванням 95 мкл культурального середовища. Потім до ямок додавали 5 мкл послідовних розведень ВСМВ72 або контролів, і планшет інкубували протягом 1 години за 4 "С. Після забарвлення клітини центрифугували за швидкості 1200 об/хв протягом З хвилин і однократно промивали у 200 мкл ФБР. Клітини центрифугували ще раз; супернатанти утилізували, після чого осади розводили в 50 мкл барвника для визначення живих/мертвих клітин у близькому ІЧ-спектрі (розведення 1: 200), антитіла до Їд4 Ес РЕ людини (розведення 1 : 50), антитіла до СО138 (МІ15 розведення 1 : 50 ї 0І-101, розведення 1 : 50) і інкубували протягом 20 хвилин за кімнатної температури в темряві. Після цього клітини центрифугували й промивали у 200 мкл буфера для ЕРАСЗ5 і наприкінці розводили в 150 мкл буфера для ГАС5.
Зразки аналізували з використанням ЕАСзЗСанпіо Ії ії РІомлдо 7.6 щодо інтенсивності зв'язування
ВСМВ72 на мононуклеарах (ММС) СО138ж-. Апроксимацію даних виконували в програмному забезпеченні сСгарпРай Ргізт б із використанням нелінійної регресії на основі функції з варіабельним кутом нахилу кривої (чотири параметри) з використанням методу найменших квадратів.
Аналіз перенаправлення Т-клітин
До ямок 9б-ямкового планшета з О-подібним дном додавали 1 х 1075 клітин-мішеней із наступним додаванням 1 х 1075 Т-клітин (приблизне співвідношення ефектор : мішень 5 : 1, з
Зо урахуванням середньої кількості плазматичних клітин у мастоцитах, що походять з кісткового мозку, на рівні 20 95). Після змішування клітин-мішеней і Т-клітин до кожної ямки додавали 5 мкл розведень ВСМВ72. Планшети інкубували за 37 "С, з 5 95 СО» протягом 48 годин.
Через два дні планшети центрифугували, і утилізували супернатанти. Клітини промивали у 200 мкл ФБР і інкубували у 50 мкл ФБР з барвником для визначення живих/мертвих клітин у близькому ІЧ-спектрі (розведення 1 : 200), антитілом до СО138 (МІ15 розведення 1 : 50 і БІ -101 розведення 1 : 50), антитілом до ТСК а/В (розведення 1 : 50) і антитілом до СО25 РЕ (розведення 1 : 50) протягом 20 хвилин за кімнатної температури. Після цього клітини промивали один раз у 200 мкл буфера для ЕАСЗ і наприкінці розводили в 150 мкл буфера для
ЕАСЗБ. Клітини аналізували з використанням ЕАСзсСанпіо ІІ ії Ріомлюо 7.6 на цитотоксичність щодо плазматичних клітин (96 мертвих клітин СО138 к) і активацію Т-клітин СО25-- (96 живих Т-клітин).
Побудову графіків і апроксимацію даних виконували в програмному забезпеченні сгарпРаа
Ргізт 6 із використанням нелінійної регресії на основі функції з варіабельним кутом нахилу кривої (чотири параметри) з використанням методу найменших квадратів.
Результати
На Фіг. 20 показано, що ВСМВ72 зв'язується й індукує знищення у зразках усіх пацієнтів залежно від дози після 48 годин, що засвідчується втратою плазматичних клітин СО138:. Дані активації Т-клітин добре корелюють з даними щодо знищення, як і очікувалося. Середнє значення ЕСзхо для активації Т-клітин знаходилося в діапазоні 1 мМ. Ці дані підтверджують, що
ВСМВ72 може знищувати первинні клітини множинної мієломи кісткового мозку іп міо.
Приклад 21. Протипухлинна ефективність ВСМВ72 для попередження пухлиногенезу ксенотрансплантатів НО29 множинної мієломи людини у МКПК-гуманізованих мишах МО
В цьому дослідженні визначали ефективність ВСМВ72 для попередження пухлиногенезу ксенотрансплантатів НО29 множинної мієломи (ММ) людини у мишей МО (МОЮ СІЮ гамма), гуманізованих МКПК (мононуклеарними клітинами периферичної крові). Миша МО являє собою мишу лінії з імунною недостатністю, у якої відсутні зрілі функціональні клітини Т, В і натуральні кілери (НК). Підібраним за віком самкам мишей МО внутрішньовенно вводили 1 х 107 МКПК на 7 день дослідження. На 1 день після інокуляції МКПК кожній миші підшкірно (п/ш) імплантували клітини ММ НУО29 людини (5 х 105 клітин у 200 мкл ФБР) на правій задній спинній бічній ділянці, з наступним внутрішньовенним (в/в) введенням ФБР і ВСМВ72 у дозах 0,1 мкг бо (0,005 мг/кг), 0,5 мкг (0,025 мг/кг) і 1 мкг (0,05 мг/кг) на тварину. ФБР-контроль і ВСМВ72 вводили раз на два дні або раз на три дні, загалом п'ять введень. Введені п/ш НО29-пухлини можна було визначити в групах, яким вводили ФБР і 0,1 мкг ВСМВ72 вже на 8 день після імплантації пухлинних клітин. Пухлини в цих двох групах продовжували рости до середнього об'єму пухлин »500 мм3 на 22 день. На 24 день середній об'єм пухлини в контрольній групі введення ФБР перевищив 1000 мм3. Цікаво, що у мишей, яким вводили 0,5 мкг і 1 мкг ВСМВ?72 (Фіг. 21), п/ш пухлини НУО29 не росли. Таким чином, ВСМВ72 інгібував пухлиногенез ксенотрансплантатів
НУО29 ММ людини у всіх тварин, яким його вводили в дозі 0,5 мкг і 1 мкг/тварину.
Приклад 22. Кількісне визначення розчинного ВСМА у сироватці мишей з ксенотрансплантатами НО29 (клітин множинної мієломи людини) у МКПК-гуманізованих мишей
МО, яким вводили ВСМВ72
Це дослідження мало на меті кількісно визначити рівні ВМСА у сироватці від ксенотрансплантатних мишей НО29 і визначити кореляцію рівнів розчинного ВМСА з пухлинним навантаженням у цих тварин.
Коротко, сироватку від зразків ксенотрансплантатного дослідження аналізували з використанням твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА) ВСМА виробництва компанії
Ка ХО Зузіет5. Сироватку розморожували, розводили в розчині для розведення реагентів у співвідношенні 1 : 50 і інкубували протягом ночі за 4 "С. Виконували ЕГІЗА на ВСМА відповідно до протоколу виробника. Планшети ЕГІ5А аналізували з використанням планшетного рідера
МО ЗресігамМах М5 (МоїІесшаг Оемісе5, ЗиппумаІе СА), налаштованого на 450 нМ. Кожна ямка в
ЕСІЗА відповідає сироватці від однієї миші в оригінальному ксенотрансплантатному дослідженні.
Спостерігалося значне зниження концентрації розчинного ВСМА у сироватці мишей, яким вводили 1 мкг і 0,5 мкг ВСМВ72 порівняно з введенням лише ФБР або ВСМВ72 у дозі 0,1 мкг/миша (Фіг. 22). Ці дані підтверджують результати ксенотрансплантатного дослідження, де у мишей, яким вводили дозу 1 мкг і 0,5 мкг ВСМВ72, не відбувалося росту пухлини або він був мінімальним. Ці дані дозволяють припустити, що ВСМА у зразках сироватки може мати цінність як потенційний біомаркер для оцінки ознак множинної мієломи; оцінка розчинного ВСМА може допомогти у спостереженні за навантаженням захворювання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 СТАМ5БЕМ РНАВМАСЕОТІСА МУ «1205 АНТТИТІЛА ДО ВСМА, БІСПЕЦИФІЧНІ АНТИГЕНЗВ'ЯЗУВАЛЬНІ МОЛЕКУЛИ, що
ЗВ'ЯЗУЮТЬ ВСМА І СО3, І ЇХ ВИКОРИСТАННЯ «1305 РВОРЗЗ8ЗО5МР «1405 «1415 «1505 62/206,246 «1515 2015-08-17 «1605 77 «1705 РагепетІпПп, версія 3.5
«2105 1 «2115» 184 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 1
Меє їец біп Меє Аза с1у біп Сув бек біп АвБп о біц Тук Рпе Авр бег 1 5 10 15 теп ге Нів АТїа Сув І1е Рго Сув сіп теп Агу Сув бек бек Авп о ТПг 20 25 Зо
Рго Рго Гей ТПг Сув біп Акуд Тук Сув Авп Аза бек Уа! ТПпг Авп б5ег 35 40 45
Уаї пув сб1у ТПг АБп Аїа Іїе Гей Тр ТПг Сув Те сіу Гецп бек Іец 50 55 бо
Іїе Іїе бек Гей Аза Уаї РпПе Уа! Іецп Меє Рпе Гей Гей Агуд пув Ше 65 70 75 80
Авпобек біц Рго Гей пув Авр о біц Рпе Гув Ап о ТПг сіу бек с1У Іецй 85 90 95
Зо
Тецп сі1у Меє Аза Авп Іїе АвБр їецп біц пув Бек Агуд ТпПг с1у АвБр сій 100 105 110
З5 Іїе Іїе Гей Рго Агуд сіу Пешп бій Тук ТПпг Уаі бій бі Сув ТПг Сув 115 120 125 сі Авр Сув І1е туз бек пув Рго Ппув Уаі1ї Авр Бек Авр Нів Сув РПе 130 135 140
Рго тей Рго Аїа Меє сіп біц с1іу Аїа ТПг І1е тей Уаї ТПг ТПг Гув 145 150 155 160
ТАК АвБп о Авр о Тук Сув Ппув бБетг Тей Рго Аїа Аза Іїец бБег Аїа ТПпг с1ц 165 170 175
Ії1е сі пуз Бек Іїе бБег Аїа Аг4д 180 «2105 2 «2115 185 «2125 РЕТ «2135 Мив5 вр. «4005 2
Меє АтТа сіп сіп Сув Рпе Нів бек бі Тук Рпе Авр бек Гецй Іецй Нівз 1 5 10 15
А1їа Сув Ппув Рго Сув Нів Гей Агуд Сув Бек Авп Рго Рго Аїа ТПг Сув 20 25 Зо
Зо сіп Рго Тук Сув Авр Рго бек Уа! ТПг бБетк бек Уаі1і туз с1у ТПг Туг 35
ТПЕ Уаї Геп Тгр Іїе Рпе Іецп сСіу Гецп ТПт Гей Уаі! Іец бек Іевцч Аза бо
Тецп Рпе ТПпг Іїе бек РПе Іецйп Тецп Акуд Пув Меє Авп Рго сбіц Аїа Іей 65 70 75 80
Гпув Авр сій Рго сбіп бек Рго сіу біп Гей Авр сіу Бек Аза сіп Іецй 85 90 95
Авр ув Аїа АБр ТПпПг бій теп ТПг Агуд Іїе Агуд Аїа с1у Авр Авр Агд 100 105 110
Іїе Рпе Рго Аг бек Гей сбіц Тук Тпг Уаї січ бі. Сув ТПг Сув бій 115 120 125
Авр о Сув Уаї Кпув бек їув Рго тув С1у Авр бБег Авр Ні Рпе РПе Рго 130 135 140
Тецп Рго Аї1а Меє сіц сіц сіу Аїа ТПг Іїе Гей Уа1і ТПг ТПг Ггув ТЕГ 145 150 155 160 сіу Авр Тук сі1у Гпув бек бек Уаії Ркго ТПтІ Аза Гей сбіп бек Уаі! Мес 165 170 175
Зо сіу Меє б1іш Ппув Рго ТПг Нів ТПг Агд 180 185 «2105 З «2115 183 «2125 РВТ
«213» Масаса Гавсіспіагів «4005 З
Меє їец біп Меє Аза Агуд сбіп Сув бек біп АвБп о біц Тук Рпе Авр бег 1 5 10 15
Тїецп Ггец Ні Авр Сув Пув Рго Сув сіп теп Агу Сув бек бек ТПг Рго 20 25 Зо
Рго теп ТПг Сув біп Акуд Тук Сув Авп Аза бек Меє ТПг Авп бек Уаї 35 40 45 пув сі1у Мем Азп Аза Іїе Іїейп Тгр ТПг Сув Гецп сіу Іевц бек Іецш Іе 50 55 бо
Іїе бек Гешп Аза Уаї Рпе Уаії теп ТПг Рпе Гецп тей Агуд Пув Меє бег 65 7о 75 80 зек біц Рго Тецшп Гув Авр біцп Рпе Пув Авзп ТПг сіу бек сі1Уу Гец Іецй 85 90 95 сіу Меє Аза Азп Іїе Авр теп біцш пув с1іу Акуд ТПпг с1у Авр сб1Ч Пе 100 105 110
Зо
Уаії теп Рго Агуд сіу Гец сі Тук ТП Уаії сбіц сі Сув ТПг Сув с1ц 115 120 125
Авр Сув І1ї1е їув Авп оТув Рго тув Уаі1ї1 Авр бБег Авр Нів Сув РПе Рго 130 135 140
Тецп Рго Аї1а Меє сіц сіц сіу Аїа ТПг Іїе Гей Уа1і ТПг ТПг Ггув ТЕГ 145 150 155 160
Авп о оАвр оТук Сув Авп бек Іевц бек Аїа Аза їецй бек Уаі ТП сбіш Ше 165 170 175 сі пув Бек Іїе бБег Аїа Аг4д 180 «2105 4 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 4 зек сіу бек Туг Рпе ТеЕр с1У 1 5 «2105 5 «2115 16 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз
Зо «4005 5 зек Іїе Тук Туг бек сіу Іїе ТПг Тук Тук Авп Рго бегт Гецп Ппув вег 1 5 10 15 «2105 6 «2115 11 «2125 РЕТ
«213» Ношто зарієпвз «4005 6
Нів Авр с1у Аї1а Уа1ї Аїа сС1у ТІец Робе Авр Туг 1 5 10 «2105 7 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 7 зек бек бек Туг Туг ТЕр 1У 1 5 «2105 8 «2115 16 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 8 зек Іїе Тук Туг бек біу Бек ТПг Тук Тук Авп Рго бегт Гецп Ппув вег 1 5 10 15 «2105 9 «2115 11
Зо «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 9
Нів Авр Ата Аза ТПг АтТа сС1у ТІец Ропе Авр Туг 1 5 10
«2105 10 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 10 зек сіу бек Туг Туг ТЕр 1У 1 5 «2105 11 «2115 16 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 11 зек Іїе Тук Туг бек С1і1у Тер ТПг Тук Тук Авп Рго бег Гецп Ппув вег 1 5 10 15 «2105 12 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 12
Нів сбіш с1у Аза ТПг Ата с1у Тїец Ропе Авр Туг 1 5 10
Зо «2105 13 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 13 зек бек бек Туг Рпе ТеЕр с1У
1 5 «2105 14 «2115 16 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 14 зекг І1е Тук Тук бек б1у Акуд ТПг Туг Тук Авп о Рго бБег Іецп Гув б5ег 1 5 10 15 «2105 15 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 15
Ніз бек с1у Аїа ТПг Атїа с1у Іїец РпПе Авр Туг 1 5 10 «2105 16 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 16
Зо Ніз сіц с1у АТїа Уаї Аїа с1у Іїец РпПе Авр Туг 1 5 10 «2105 17 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз
«4005 17
Нів бек с1у Аї1а Уа1ї Аїа с1у ТІец Робе Авр Туг 1 5 10 «2105 18 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 18
Нів Авр Атїа Аза Уаї Аїа сС1у ТІец Рібе Авр Туг 1 5 10 «2105 19 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 19
Нів Авр с1у Аза ТПг АтТїа с1у ТІец Ропе Авр Туг 1 5 10 «2105 20 «2115 11 «2125 РЕТ
Зо «213» Ношто зарієпвз «4005 20
Нів сбіп с1у Аїа ТПг Ата с1у Тїец Ропе Авр Туг 1 5 10 «2105 21
«2115 11 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 21
Нів Ніз сі1у Аза ТПг Ата с1у ТІец Ропе Авр Туг 1 5 10 «2105 22 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 22
Нів Тер с1у Аза ТПг АтТа сС1у ТІец Ропе Авр Туг 1 5 10 «2105 23 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 23
Нів Тук с1у Аїа ТПг Ата с1у ТІец Ропе Авр Туг 1 5 10 «2105 24 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 24 сіу с1у Авп Авп І1е сС1у Бек Кпув бек Уаї1ї Нівз 1 5 10
«2105 25 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 25
Авр Авр Бек Авр Агуд Рго 5ег 1 5 «2105 26 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 26 сіп Уаї Тер Авр бБег бек бек Авр Нів Уа1ї Уаї1ї 1 5 10 «2105 27 «2115 122 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 27 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій
Зо 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц
35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз Авр с1у Аїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1У 100 105 110 біп с1іу ТПпг теп Уа! ТПг Уаії бек б5егк Аїа 115 120 «2105 28 «2115 108 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 28
Зо зегк Тук УМа1і Гей ТПг о біп Рго Рго бБег Уаі! бек Уаі Аїа Рго с1у сіп 1 5 10 15
ТПЕ Аза Акуд Іїе ТПг Сув сіу б1у АвБп АБп о ТІ1е сіу бек Ггув бег Уаї 20 25 Зо
Нів Тер Тук біп с1іп Ркго Рго сіу біп АТїа Рго Уаї Уаї Уаї Уаї тус 35 40 45
Авр Авр бБег Авр Агуд Рго бек біу Іїе Рго сій Аку Рпе бБег сіу бег 50 55 бо
Авп обек б1і1у АБп ТПтІ Аза ТПг о Іїецп ТПг Іїе бег Акд Уаі сійп Азїа У 65 7о 75 80
Авр сі АтТа Уаї Тук Тук Сув біп Уаї Тгр Авр бек бек бек Авр Нівз 85 90 95
Уаї Маї Рпе сіу сіу сіу ТПпЕ Ппув Гей ТПг Уаї Іец 100 105 «2105 29 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 29 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
Зо
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У 20 25 Зо
З5 Ззег Тук Тук Тгр сі1у Тер Іїе Агуд сіп Рго Рго сб1іу Ппув бі1у тей б1ц
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек Гешп Гув Гей бег бек Уаі! ТПг Аїа Аза Авр ТПг Аїа Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз Авр АтТа АТїа ТП АтТа сі1у Гей Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 з0 «2115 108 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 з0 зек Тук Маї теп ТПг біп Рго Рго Бек Уаі бек Уаі Аза Рго с1у сіп 1 5 10 15
Зо
ТПЕ Аза Акуд Іїе ТПг Сув сіу б1у АвБп АБп о ТІ1е сіу бек Ггув бег Уаї 20 25 Зо
Нів Тер Тук біп с1іп ув Рго сі1іу біп АТїа Рго Уаї Іец Уаї Уаї тус 35 40 45
Авр АвБр бБег АБр Агкуд Рго бек с1іу Іїе Рго біц Акуд Рпе бек с1Уу бег 50 55 бо
Авп обек б1і1у АБп ТПтІ Аза ТПг о Іїецп ТПг Іїе бег Акд Уаі сійп Азїа У 65 70 75 80
Авр бі АтТа Авр Тук Тук Сув біп Уа1ї Тгр Авр бек бек бек Авр Нівз 85 90 95 уаї Уаї Рпе сіу сіу б1у ТпПг Ппув Гей ТПг Уаї ТІецй 100 105 «2105 31 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 з1 біп Гечп біп Гей біп сій бек б1іу Ркго сіу теп Уаії Ппув Рго бек б1іц 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У
Зо 20 25 Зо бзек Тук Тук Тгр с1у ТеЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег
50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 7о 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Ата Акуд Ніз сіц сС1у Атїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 32 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 32 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
Зо ТАК Гецп бек Гей ТПг о Сув ТПпг Уаї! бек сіу сіу бек І1їе бБег бек Ш1У 20 25 Зо бзек Тук Тук Тгр с1у ТеЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Те Ппув Бек Акуд Уаі ТПг І1їе бек Уаі Авр ТПг бек пув АвБп біп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув АтТїа Акуд Ніз бек С1у Аїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 Зз3 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 з3 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
Зо
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег 20 25 Зо
З5 Ззег Тук Тук Тгр сі1у Тер Іїе Агуд сіп Рго Рго сб1іу Ппув бі1у тей б1ц
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек біу Бек ТПпПг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек Гешп Гув Гей бег бек Уаі! ТПг Аїа Аза Авр ТПг Аїа Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз Авр с1у Аїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 34 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 34 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
Зо
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув АТїа Агуд Нів Авр с1у Аїа Уаії Аїа сС1і1у Гей Рпе Ар Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 з35 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 з35 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій
Зо 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У 20 25 Зо бзек Тук Тук Тгр с1у ТеЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц в2
35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз Авр с1у Аїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1У 100 105 110 біп с1іу ТПпг теп Уа! ТПг Уаії бек б5егк Аїа 115 120 «2105 36 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 36
Зо біп Гечп біп Гей біп сій бек б1іу Ркго сіу теп Уаії Ппув Рго бек б1іц 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
Тгр І1ї1е сб1у Бек Іїе Туг Тук Бек С1у Іїе ТП Тук Тук Авп Рго 5бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 7о 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз сіц с1у Аїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1Уу 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 37 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз
Зо «4005 37 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
З5 ТАК Гецп бек Гей ТПг о Сув ТПпг Уаї! бек сіу сіу бек І1їе бБег бек Ш1У 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Те Ппув Бек Акуд Уаі ТПг І1їе бек Уаі Авр ТПг бек пув АвБп біп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув АТїа Акуд Ніз бек С1у Аїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1Уу 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 38 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз
Зо «4005 з38 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек Гешп Гув Гей бег бек Уаі! ТПг Аїа Аза Авр ТПг Аїа Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз Авр Атїа АТїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 39 «2115 122 «2125 РВТ
Зо «213» Ношто зарієпвз «4005 39 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У
20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув АТїа Агкуд Нів Авр с1у Аїа ТПг АТа сС1і1іу Гей Рпе Ар Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 40 «2115 122
Зо «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 40 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У 20 25 Зо зекг Тук Рпе Тгр сіу Тер Іїе Агуд сіп Рго Рго біу Ппув бі1у тей с1ц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек біу Бек ТПпПг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз Авр с1у Аїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1У 100 105 110 біп с1іу ТПпг теп Уа! ТПг Уаії бек б5егк Аїа 115 120 «2105 41
Зо «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 41
З5 біп Гечп біп Гей біп сій бек б1іу Ркго сіу теп Уаії Ппув Рго бек б1іц 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У 20 25 Зо бзек Тук Тук Тгр с1у ТеЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
Тгр Ії1е сб1у Бек Іїе Туг Тук Бек С1іу бек ТПг Тук Тук Авп Рго 5бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 7о 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз Авр Атїа АТїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120
Зо «2105 42 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 42 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У 20 25 Зо бзек Тук Тук Тгр с1у ТеЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек біу Бек ТПпПг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Те Ппув Бек Акуд Уаі ТПг І1їе бек Уаі Авр ТПг бек пув АвБп біп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз сіц с1у Аїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1Уу 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120
Зо «2105 43 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 43 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій
1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек б1іу Акуд ТПг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек Гешп Гув Гей бег бек Уаі! ТПг Аїа Аза Авр ТПг Аїа Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Нівз Авр с1у Атїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120
Зо «2105 44 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 44 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТАК Гецп бек теп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сбіу Бек Іїе бБег бек 5бег 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек б1іу Тер ТПг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув АТїа Агкуд Нів Авр с1у Аїа ТПг АТа сС1і1іу Гей Рпе Ар Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа
Зо 115 120 «2105 45 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз
«4005 45 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег 20 25 Зо зекг Тук Рпе Тгр сіу Тер Іїе Агуд сіп Рго Рго біу Ппув бі1у тей с1ц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Ата Акуд Ніз сіп сС1у Атїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110
Зо біп с1іу ТПпг теп Уа! ТПг Уаії бек б5егк Аїа 115 120 «2105 46 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз
«4005 46 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
Тгр І1ї1е сб1у Бек Іїе Туг Тук Бек С1у Іїе ТП Тук Тук Авп Рго 5бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 7о 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув АТїа Акуд Нівз Нів С1у Аїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110
Зо сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 47 «2115 122 «2125 РЕТ
«213» Ношто зарієпвз «4005 47 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Те Ппув Бек Акуд Уаі ТПг І1їе бек Уаі Авр ТПг бек пув АвБп біп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Ата Акуд Ніз Тер С1у АТїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110
Зо сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 48 «2115 122
«2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 48 біп Гечп біп Гей біп сій бек б1іу Ркго сіу теп Уаії Ппув Рго бек б1іц 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек Гешп Гув Гей бег бек Уаі! ТПг Аїа Аза Авр ТПг Аїа Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув АТїа Акуд Ніз Тук С1у Атїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У
Зо 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 49
«2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 49 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТАК Гецп бек теп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сбіу Бек Іїе бБег бек 5бег 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек б1іу Акуд ТПг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Зо Сув АТїа Акуд Нів сіп сС1у Аїа ТПг АТа сС1і1у Гей Рпе Ар Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120
«2105 50 «2115 122 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 50 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег 20 25 Зо зекг Тук Рпе Тгр сіу Тер Іїе Агуд сіп Рго Рго біу Ппув бі1у тей с1ц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек б1іу Акуд ТПг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Зо
Сув АТїа Акуд Нівз Нів С1у Аїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110
З5 біп с1іу ТПпг теп Уа! ТПг Уаії бек б5егк Аїа 115 120
«2105 51 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 51 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
Тгр Ії1е сб1у Бек Іїе Туг Тук Бек С1у Акуд ТПг Тук Тук Авп Рго 5бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 7о 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Зо
Сув АТїа Акуд Ніз Тук С1у Атїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120
«2105 52 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 52 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек б1іу Тер ТПг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Те Ппув Бек Акуд Уаі ТПг І1їе бек Уаі Авр ТПг бек пув АвБп біп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг
Зо 85 90 95
Сув Ата Акуд Ніз сіп сС1у Атїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа
115 120 «2105 53 «2115 122 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 53 біп Гечп біп Гей біп сій бек б1іу Ркго сіу теп Уаії Ппув Рго бек б1іц 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег
Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 20
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек б1іу Тер ТПг Тук Тук Авп Рго бег бо 25
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80
Зо зек Гешп Гув Гей бег бек Уаі! ТПг Аїа Аза Авр ТПг Аїа Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув АТїа Акуд Нівз Нів С1у Аїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 35 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 54 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 54 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТАК Гецп бек теп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сбіу Бек Іїе бБег бек 5бег
Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 20 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек б1іу Тер ТПг Тук Тук Авп Рго бег бо 25
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80
Зо зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
З5 Сув АТїа Агуд Нів Туг сСі1у Аїа ТПг АТа сС1і1у Гей Рпе Ар Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 55 «2115 452 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 55 сі Уаії сіп Гей Уаї сіц бек сіу біу сіу Гей Уаі сбіп Рго сі1у 1У 1 5 10 15 зек Тец Агуд Іїецп бег Сув Аїа Аїа бек с1іу Рпе ТПг Рпе Ап ТПгЕ Туг
Зо 20 Аза Меєс АБп ТЕр Уаі Агу сіп Аза Рго сіу Пув сі1у Гей січ Тер Уаї
Аза Агуд І1е Агкуд бек Ппув Тук Авп АвБп Туг Аїа ТПг Тут Туг Азїа Аза 25 50 55 бо зек Уаї пув с1іу Агуд Рпе ТПт І1е Бек Агуд Авр Авр бег Гув Авп б5ег 65 70 75 80
Зо
Гецп Тук Гей біп Меє Авп бек Гецп пуб ТПтг сій Авр ТпПг Аїа Уаї Туг 85 90 95 35
Тук Сув Аза Агкгуд Нів С1у Авп Рпе с1у Авп бек Туг Уа1 бек Тгр Ріє 100 105 110
Аа Туг ТЕр сіу сіп с1у ТпПг Іец Уа! ТПг Уаї бек бБегт Аза бек ТПг 115 120 125 пув сі1у Рго Бек Уаії Ріе Рго Іїецп Аїа Рго Сувз Бек Агуд бек ТПг бег 130 135 140 сі Бек ТпПг Аза АТа теп сіу Сув Гецп Уаї Ппув Авр Тук Рпе Рго сій 145 150 155 160
Рго Уаї ТПг Уаї бек Тер Авп бек с1у Аїа Іец ТПг бек сС1і1у Уаї Нів 165 170 175
ТПЕ Рпе Рго Аза Уаї Іецп СсСіп бек бек сіу Гецп Тугк бек Гец бег бег 180 185 190
Уаії Маї ТПг Уаії Рго бек бек бек Гпецп с1у ТПг Ггув ТПг Тук ТПкгЕ Сув 195 200 205
Авзп оУаї Авр Ні Ппув Рго бек Авп ТПг о Ггпув Уаї Авр Туз Агуд Уаї С1и 210 215 220
Зо зек Гуз Тук сіу Рго Рго Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бі Аїа Аїа 225 230 235 240
З5 сіу сіу Рго бек Уаі Рпе Тейп Рпе Рго Рго Гуз Рго Пув Авр ТПг Іецй 245 250 255
Меєс Іїе Бек Агкуд ТПг Рго бій Уаї ТПг Сув Уаї Уаії Уаї Авр Уа1ї бег 260 265 270 сіп бій Авр Рго бі Уаії Ссіп Рпе АвБп Тер Тугк Уаі Азр с1у Уаї сій 275 280 285
Уаї Нів АвБп АТа їув ТПг пув Рго Агд бід бі сб1іп Рпе Авзп бБег ТПг 290 295 300
Тук Акуд Уаї Уа1 бек Уаї Гец ТПг Уаї теп Нів бі1іп Авр Тер еп Авп 305 310 315 320 сіу пув сі Тук пув Сув Ггув Уаії Бек АвБп о Пувз сіу Іецй Рго бег бег 325 330 335
Іїе сішп пув ТПпг о Іїе бек ув Аїа Гпув сіу сіп Рго Агд бід Рго сіп 340 345 350
Уа1ї Тук ТПг теп Рго Рго Бек сіп бі бі Меє ТПг Ггув Ап біп Уаї 355 З6о 365
Зо зек Геп ТПг Сув Гецп Уаї Гуз с1у Рпе Тугк Рго бек Авр І1е Аїа Уаї 370 375 380 сі Тер бій Бек Авп сбіу сбіп Рго біц АвБп Авп Туг Туз ТПг Тбг Рго 385 390 395 400
Рго Уаї Іїец Авр бег Авр сіу Бек Рпе Іїецй Іїецй Туг бек Кпув Гецп ТПг 405 410 415 уаї Авр Гуз бек Агуд Тер біп біц с1іу Авп Уаі1! Рпе бБег Сув бек Уаї 420 425 430
Меє Нів сіц АзТа Гец Нів Авп о Нів Тук ТПг сСіп пув бек Гей бБег Ієцй 435 440 445 зек Ге о1Уу Гуз 450 «2105 56 «2115 215 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 56 сіп Тпг Уа1 Уа1 ТпПг сіп сій Рго бек Гей ТПг Уаі Бек Рго с1у 1У 1 5 10 15
ТПЕ Уаї ТПпг гей ТПг Сув Агуд бег бек ТПт с1іу Аї1а Уаї ТПг ТПг бег 20 25 Зо
Зо
Авп о Туг Аза АвБп Тр Уаі сбіп сбіп Ггув Рго с1у біп Аїа Рго Агд щу
З5 Тецп Іїе б1у б1у ТПг АвБп Пув Агуд Аза Рго біу ТПг Рго Аїа Аг РПе бо зек сіу бек ІТецшп Іїец сіу сіу Пув Аза Азїа Іїецй ТПг Іецй бек с1іУу Уаї 65 70 75 80 сСіп Рго бі Азр бі Аза сій Туг Тук Сув Аїа Гей Тгр Тук бек Авп 85 90 95
Те Тер Уаі Рпе сіу сіу сбіу ТПпг Гуз Гей ТПпг Уаі! Іїец с1іу біп Рго 100 105 110 пув Аїа Аза Рго бек Уа! ТПг Гей Рпе Рго Рго Бек бек біц сіц Іецй 115 120 125 сіп Аїа Авзп Гуз АТа ТПг ІТецп Уаї Сув Гей І1е Бек Авр Ропе Туг Рго 130 135 140 сіу Аїа Уаі1і ТПпг Уаії Аїа Тгр ув Аза Авр бБег бек Рго Уаї Іув Аза 145 150 155 160 сіу Уаії сі. ТпПг ТК о Тбг Рго бег Ппув сіп Бек Авп Азп Гув Туг Аза 165 170 175
Зо А1їа бек бек Ту Гей бек Гей ТПг Рго сій Сбіп Тер пув бек Нів Агд 180 185 190 бЗек Тук бек Сув біп Уаї ТпкК Нів біц с1у Бек Тпг Уаї с1ш пув ТПг 195 200 205
Уаії Аза Рго ТПг бі Сув бБег 210 215 «2105 57 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 57 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТАК Гецп бек Гей ТПг о Сув ТПпг Уаї! бек сіу сіу бек І1їе бБег бек Ш1У
Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 20 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег бо 25
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80
Зо зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
З5 Сув АТїа Агуд Нів Авр с1у Аїа Уаії Аїа сС1і1у Гей Рпе Ар Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 58 «2115 122 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 58 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег
Зо 20 зекг Тук Рпе Тгр сіу Тер Іїе Агуд сіп Рго Рго біу Ппув бі1у тей с1ц
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 25 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80
Зо зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95 35
Сув Атїа Акуд Нівз Авр с1у Атїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг тей Уа ТПг Уаії бег бек Аїа 115 120 «2105 59 «2115 5 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 5
ТПпЕ Тут Аза Меє Авзп 1 5 «2105 60 «2115 19 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 60
Агуд Іїе Акуд Бек Ппув Туг Авп Авп Туг Аїа ТПг Ту Тут Аїа Аза бег 1 5 10 15
УуУаї тув ШУ
Зо «2105 61 «2115 14 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 61
Нів с1у Авп Рпе с1у Авп бек Туг Уаї Бек Тер Рпе А1тїа Туг
1 5 10 «2105 62 «2115 14 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 62
Аг бек бек ТПпг с1іу Аїа Уаі ТПпг ТПпг бек Авп Туг Аза Авп 1 5 10 «2105 63 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 63 соі1у ТПг Авп гув Агуд Аза Рго 1 5 «2105 64 «2115 9 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 64
Зо Аза теп Тер Тук Бек Авп Гец Тгр Уаї 1 5 «2105 65 «211» 448 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз
«4005 65 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
Тгр І1ї1е сб1у Бек Іїе Туг Тук Бек С1у Іїе ТП Тук Тук Авп Рго 5бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 7о 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз Авр с1у Аїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1У 100 105 110
Зо сіп сі1у ТПпг Ггецп Уаї ТПг Уаії бек бБег Аїа бек ТПпПг туз с1у Рго бег 115 120 125
З5 уаї Рпе Рго Гецй Аза Рго Сув бБег Агуд Бек ТПг бБег бій бек ТПг Аїа 130 135 140
Аїа теп сіу Сув Гей Уа1 їув Авр Ту Рпе Рго біц Рго Уаі1і ТПг Уаї 145 150 155 160
Зек Тер Авп бек сС1у АТїа Іецп ТПг бек сС1у Уаї Ніз ТПг Ропе Рго Аї1а 165 170 175 уаї теп біп бек бек біу Гей Тук бБег Іецйп бек бек Уаі! Уаії ТПкК Уаї 180 185 190
Рго Бек бек бек Ітецп с1у ТПг пув ТПг Тук ТПг Сув Авп Уаї Авр Ніз 195 200 205
Кпув Рго Бек Авп ТПг Ггув Маі Авр ув Акуд Уаї сій бек Гуз Тук 1У 210 215 220
Рго Рго Сув Рго Рго Суб Рго Аїа Рго бій Аза Аїа сіу с1у Рго 5ег 225 230 235 240
Уа1ї Рпе Гецп Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Іец Меєс Іїе б5ег Агд 245 250 255
Зо ТАК Рго біц Уаї Тпг Сув Уаії Уа1ї Уаії Авр Уаі бек біп с1іц Авр Рго 260 265 270 сі Уаї бі1іп Рбе Азп Тер Тук Уаї Ар сі1у Уаї біц Уа1ї Ні5в Авп А1а 275 280 285
Гпув ТПпЕ Пув Рго Агуд бід бій біп Рпе Авп бек ТПг Тугк Агу Уа1ї Уаї 290 295 300
Зек уаї Геп ТПг Уаї геп Нів Сбіп Авр Тер тей АвБп о с1у Тув с1ип Туг 305 310 315 320 пув Сув Пув Уа1 бек Авп гув с1іу Гецп Рго бек бек Іїе біц Ггув ТЕГ 325 330 335
Іїе бек пув Аза туз сіу біп Рго Агкуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Іецй 340 345 350
Рго Рго бек біп сбіц сі Меє ТП Гпув Авп біп Уа! бек Іец ТПг Сув 355 З6о 365
Тецп Уаї пув с1у Рпе Туг Рго бег АвБр І1їе Аїа Уаі бій Тер сіц бег 370 375 380
Авп о біу біп Рго бій Авп о Авп о Тугк Гуз ТПг о ТПг Рго Рго Уаії Геч Авр 385 390 395 400 век Авр сіу бБек Рпе Рпе Гей Туг бек Агуд їецп ТПг Уаії Авр ГПув б5ег
Зо 405 410 415
Агуд Тер сб1п бі с1у Авп Уа1! Рре бек Сув бекгк Уаї Меє Нів б1іцп Аї1а 420 425 430 теп Нів Авп Нів Ту Тпг сіп Ппув бек Іецй бек ІТецй бек Іец С1у Гув
435 440 445 «2105 66 «2115 214 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 66 зегк Тук УМа1і Гей ТПг о біп Рго Рго бБег Уаі! бек Уаі Аїа Рго с1у сіп 1 5 10 15
ТПЕ Аза Акуд Іїе ТПг Сув сіу б1у АвБп АБп о ТІ1е сіу бек Ггув бег Уаї
Зо
Нів Тер Тук біп с1іп Ркго Рго сіу біп АТїа Рго Уаї Уаї Уаї Уаї тус 20
Авр АвБр бБег АБр Агкуд Рго бек с1іу Іїе Рго біц Акуд Рпе бек с1Уу бег бо 25
Авп обек б1і1у АБп ТПтІ Аза ТПг о Іїецп ТПг Іїе бег Акд Уаі сійп Азїа У 65 70 75 80
Зо Авр січ Атїа Уаї Тук Тук Сув біп Уа1ї Тер Авр бек бБег бег Авр Ні 85 90 95
Уаії Маї Рпе сіу сіу сі1у ТПпЕ Ппув Геп ТПг Уаї Іеп с1іу біп Рго Гуз 35 100 105 110
Аза Аза Рго Бек Уа1і ТПг Гецй Рпе Рго Рго бБег бек бій сіцЧ Геч сіп 115 120 125
Аза Авп Гув Аїа ТПг Тец Уаї Сув Гей Іїе бБег Авр Рпе Туг Рго ШУ 130 135 140
А1їа Уаії ТПпг Уаі Аїа ТЕр уз Аза Авр бек бек Рго Уаі пуз Аїа щУ 145 150 155 160
Уаї бі ТПг Тбг о ТБг Рго Бек Ппув біп Бек Авп АвБп Гув Туг Аїа Аїа 165 170 175 бЗек бек Тук Пец бек Гецп ТПг Рго біц сіп Тер Ппувз бек Ні Агуд бег 180 185 190
Тук бек Сув біп Уаї Тпг Нів сіш сіу бек ТПг Уаї сій туз ТПг Уаї 195 200 205
Аза Рго ТПг біц Сув 5ег 210 «2105 67
Зо «2115» 448 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 67
З5 біп Гечп біп Гей біп сій бек б1іу Ркго сіу теп Уаії Ппув Рго бек б1іц 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
Тгр І1ї1е сб1у Бек Іїе Туг Тук Бек С1у Іїе ТП Тук Тук Авп Рго 5бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 7о 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз Авр с1у Аїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг Ггецп Уаї ТПг Уаії бек бБег Аїа бек ТПпПг туз с1у Рго бег 115 120 125
Зо уаї Рпе Рго Гецй Аза Рго Сув бБег Агуд Бек ТПг бБег бій бек ТПг Аїа 130 135 140
Аїа теп сіу Сув Гей Уа1 їув Авр Ту Рпе Рго біц Рго Уаі1і ТПг Уаї 145 150 155 160
Зек Тер Авп бек сС1у АТїа Іецп ТПг бек сС1у Уаї Ніз ТПг Ропе Рго Аї1а 165 170 175 уаї теп біп бек бек біу Гей Тук бБег Іецйп бек бек Уаі! Уаії ТПкК Уаї 180 185 190
Рго Бек бек бек Ітецп с1у ТПг пув ТПг Тук ТПг Сув Авп Уаї Авр Ніз 195 200 205
Кпув Рго Бек Авп ТПг Ггув Маі Авр ув Акуд Уаї сій бек Гуз Тук 1У 210 215 220
Рго Рго Сув Рго Рго Суб Рго Аїа Рго бій Аза Аїа сіу с1у Рго 5ег 225 230 235 240
Уа1ї Рпе Гецп Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Іец Меєс Іїе б5ег Агд 245 250 255
ТАК Рго біц Уаї Тпг Сув Уаії Уа1ї Уаії Авр Уаі бек біп с1іц Авр Рго 260 265 270 сі Уаї бі1іп Рбе Азп Тер Тук Уаї Ар сі1у Уаї біц Уа1ї Ні5в Авп А1а
Зо 275 280 285
Гпув ТПпЕ Пув Рго Агуд бід бій біп Рпе Авп бек ТПг Тугк Агу Уа1ї Уаї 290 295 300 бЗек Уаї теп ТПг Уаї гец Нібв сіп Авр Тгр тІец Авп сі1у Ппув сіц Туг
305 310 315 320 пув Сув Пув Уа1 бек Авп гув с1іу Гецп Рго бек бек Іїе біц Ггув ТЕГ 325 330 335
Іїе бек пув Аза туз сіу біп Рго Агкуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Іецй 340 345 350
Рго Рго бек біп сбіц сі Меє ТП Гпув Авп біп Уа! бек Іец ТПг Сув 355 З6о 365
Тецп Уаї пув с1у Рпе Туг Рго бег АвБр І1їе Аїа Уаі бій Тер сіц бег 370 375 380
Авп о біу біп Рго бій Авп о Авп о Тугк Гуз ТПг о ТПг Рго Рго Уаії Геч Авр 385 390 395 400 век Авр сіу бБек Рпе Рпе Гей Туг бек Агуд їецп ТПг Уаії Авр ГПув б5ег 405 410 415
Агуд Тер сб1п бі с1у Авп Уа1! Рре бек Сув бекгк Уаї Меє Нів б1іцп Аї1а 420 425 430
Зо теп Нів Авп Нів Ту Тпг сіп Ппув бек Іецй бек ІТецй бек Іец С1у Гув 435 440 445 «2105 68 «2115» 448
«2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 68 біп Гечп біп Гей біп сій бек б1іу Ркго сіу теп Уаії Ппув Рго бек б1іц 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек Гешп Гув Гей бег бек Уаі! ТПг Аїа Аза Авр ТПг Аїа Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз Авр с1у Аїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1У
Зо 100 105 110 сіп сі1у ТПпг Ггецп Уаї ТПг Уаії бек бБег Аїа бек ТПпПг туз с1у Рго бег 115 120 125
Уаі1і Рпе Рго Іецп Аїа Рго Сув Бек Агуд бек ТПг бек сій бег ТПг Аїа
130 135 140
Аїа теп сіу Сув Гей Уа1 їув Авр Ту Рпе Рго біц Рго Уаі1і ТПг Уаї 145 150 155 160
Зек Тер Авп бек сС1у АТїа Іецп ТПг бек сС1у Уаї Ніз ТПг Ропе Рго Аї1а 165 170 175
Уаії Те сіп бек бек сіу Гей Тук Бек Іевц бек бек Уаі! Уаї ТПг Уаї 180 185 190
Рго Бек бек бек Ітецп с1у ТПг пув ТПг Тук ТПг Сув Авп Уаї Авр Ніз 195 200 205
Тув Рго Бек Авп ТПг о пув Уаі Авр Гув Агуд Уаі бій бБег Пув Тує Щ1У 210 215 220
Рго Рго Сув Рго Рго Суб Рго Аїа Рго бій Аза Аїа сіу с1у Рго 5ег 225 230 235 240
Уа1ї Рпе Гецп Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Іец Меєс Іїе б5ег Агд 245 250 255
Зо
ТПЕ Рго сіц Уа1і ТПг Сув Уаії Уаї Уаії Авр Уаі Бек біп бій Авр Рго 260 265 270 сі Уаї бі1іп Рбе Азп Тер Тук Уаї Ар сі1у Уаї біц Уа1ї Ні5в Авп А1а 275 280 285
Гпув ТПпЕ Пув Рго Агуд бід бій біп Рпе Авп бек ТПг Тугк Агу Уа1ї Уаї 290 295 300 бЗек Уаї теп ТПг Уаї гец Нібв сіп Авр Тгр тІец Авп сі1у Ппув сіц Туг 305 310 315 320 пув Сув Пув Уа1 бек Авп гув с1іу Гецп Рго бек бек Іїе біц Ггув ТЕГ 325 330 335
Іїе бек Пув Аза Ппув сіу біп Рго Агуд сій Рго біп Уаї Туг ТПг Іей 340 345 350
Рго Рго бек біп сбіц сі Меє ТП Гпув Авп біп Уа! бек Іец ТПг Сув 355 3З6о 365
Тецп Уаї пув с1у Рпе Туг Рго бег АвБр І1їе Аїа Уаі бій Тер сіц бег 370 375 380
Авп о біу біп Рго сій Авп Азп Тугк Ггув ТПг о ТПг Рго Рго Уаії Геї Авр 385 390 395 400
Зо век Авр сіу бБек Рпе Рпе Гей Туг бек Агуд їецп ТПг Уаії Авр ГПув б5ег 405 410 415
З5 Агуд Тер біп сі с1у Авп о Уаї Ріпе бек Сув бек Уаї Меє Нів сій А1а 420 425 430 теп Нів Авп Нів Ту Тпг сіп Ппув бек Іецй бек ІТецй бек Іец С1у Гув 435 440 445 «2105 69 «2115» 448 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 69 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У
Зо 20 зекг Тук Рпе Тгр сіу Тер Іїе Агуд сіп Рго Рго біу Ппув бі1у тей с1ц
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 25 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80
Зо зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95 35
Сув Атїа Акуд Нівз Авр с1у Атїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг Ггецп Уаї ТПг Уаії бек бБег Аїа бек ТПпПг туз с1у Рго бег 115 120 125
Уаі1і Рпе Рго Іецп Аїа Рго Сув Бек Агуд бек ТПг бек сій бег ТПг Аїа 130 135 140
Аїа теп сіу Сув Гей Уа1 їув Авр Ту Рпе Рго біц Рго Уаі1і ТПг Уаї 145 150 155 160 ек Тер Авп бек С1іу АТїа їецй ТПг бек сСіу Уаї Нів ТПг Рпе Рго Аї1а 165 170 175
Уаії Те сіп бек бек сіу Гей Тук Бек Іевц бек бек Уаі! Уаї ТПг Уаї 180 185 190
Рго Бек бек бек Ітецп с1у ТПг пув ТПг Тук ТПг Сув Авп Уаї Авр Ніз 195 200 205
Кпув Рго Бек Авп ТПг Ггув Маі Авр ув Акуд Уаї сій бек Гуз Тук 1У 210 215 220
Зо
Рго Рго Сув Рго Рго Суб Рго Аїа Рго бій Аза Аїа сіу с1у Рго 5ег 225 230 235 240
З5 уаї Рпе Гей Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Гей Меє І1їе 5ег Агд 245 250 255
ТПЕ Рго сіц Уа1і ТПг Сув Уаії Уаї Уаії Авр Уаі Бек біп бій Авр Рго 260 265 270 сі Уаї бі1іп Рбе Азп Тер Тук Уаї Ар сі1у Уаї біц Уа1ї Ні5в Авп А1а 275 280 285
Тув ТПг о Пув Рго Агуд бій бій біп Рбе Авп бек ТПг Тугк Агу Уаї Уаї 290 295 300 бЗек Уаї теп ТПг Уаї гец Нібв сіп Авр Тгр тІец Авп сі1у Ппув сіц Туг 305 310 315 320 пув Сув Пув Уа1 бек Авп гув с1іу Гецп Рго бек бек Іїе біц Ггув ТЕГ 325 330 335
Іїе бек пув Аза туз сіу біп Рго Агкуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Іецй 340 345 350
Рго Рго бек біп сбіц сі Меє ТП Гпув Авп біп Уа! бек Іец ТПг Сув 355 З6о 365
Зо Те Уаії Ппув с1у Рпе Туг Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаі бій ТеЕр біц 5бег 370 375 380
Авп о біу біп Рго сій Авп Азп Тугк Ггув ТПг о ТПг Рго Рго Уаії Геї Авр 385 390 395 400 век Авр сіу бБек Рпе Рпе Гей Туг бек Агуд їецп ТПг Уаії Авр ГПув б5ег 405 410 415
Агуд Тер біп сі с1у Авп о Уаї Ріпе бек Сув бек Уаї Меє Нів сій А1а 420 425 430 теп Нів Авп Нів Ту Тпг сіп Ппув бек Іецй бек ІТецй бек Іец С1у Гув 435 440 445 «2105 70 «2115» 448 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 70 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц
Зо
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек біу Бек ТПпПг Тук Тук Авп Рго бег бо
З5 Те Ппув Бек Акуд Уаі ТПг І1їе бек Уаі Авр ТПг бек пув АвБп біп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз Авр с1у Аїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1У 100 105 110 біп с1у ТП теп Уаії ТПг Уаії бек бек Аїа бек ТПг Ппув с1іу Рго бег 115 120 125
Уаі1і Рпе Рго Іецп Аїа Рго Сув Бек Агуд бек ТПг бек сій бег ТПг Аїа 130 135 140
Аїа теп сіу Сув Гей Уа1 їув Авр Ту Рпе Рго біц Рго Уаі1і ТПг Уаї 145 150 155 160
Зек Тер Авп бек сС1у АТїа Іецп ТПг бек сС1у Уаї Ніз ТПг Ропе Рго Аї1а 165 170 175
Уаії Те сіп бек бек сіу Гей Тук Бек Іевц бек бек Уаі! Уаї ТПг Уаї 180 185 190
Зо Рго бек Бек бек Іец с1у ТПг Тув ТПг Тук ТПг Сув Авп Уаї Авр Ні 195 200 205
Кпув Рго Бек Авп ТПг Ггув Маі Авр ув Акуд Уаї сій бек Гуз Тук 1У 210 215 220
Рго Рго Сув Рго Рго Суб Рго Аїа Рго бій Аза Аїа сіу с1у Рго 5ег 225 230 235 240 уаї Рпе Гей Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Гей Меє І1їе 5ег Агд 245 250 255
ТПЕ Рго сіц Уа1і ТПг Сув Уаії Уаї Уаії Авр Уаі Бек біп бій Авр Рго 260 265 270 сі Уаї бі1іп Рбе Азп Тер Тук Уаї Ар сі1у Уаї біц Уа1ї Ні5в Авп А1а 275 280 285
Гпув ТПпЕ Пув Рго Агуд бід бій біп Рпе Авп бек ТПг Тугк Агу Уа1ї Уаї 290 295 300 бЗек Уаї теп ТПг Уаї гец Нібв сіп Авр Тгр тІец Авп сі1у Ппув сіц Туг 305 310 315 320 пув Сув Пув УМа1і бек Авп о Пув сі1у Гей Рго бек бек Іїе сіц Пув ТПг 325 330 335
Іїе бек пув Аза туз сіу біп Рго Агкуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Іецй
Зо 340 345 350
Рго Рго бек біп сбіц сі Меє ТП Гпув Авп біп Уа! бек Іец ТПг Сув 355 З6о 365
Тецп Уаї пув с1у Рпе Туг Рго бег АвБр І1їе Аїа Уаі бій Тер сіц бег
370 375 380
Авп о біу біп Рго сій Авп Азп Тугк Ггув ТПг о ТПг Рго Рго Уаії Геї Авр 385 390 395 400 век Авр сіу бБек Рпе Рпе Гей Туг бек Агуд їецп ТПг Уаії Авр ГПув б5ег 405 410 415
Агуд Тер сб1п бі с1у Авп Уа1! Рре бек Сув бекгк Уаї Меє Нів б1іцп Аї1а 420 425 430 теп Нів Авп Нів Ту Тпг сіп Ппув бек Іецй бек ІТецй бек Іец С1у Гув 435 440 445 «2105 71 «2115» 448 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз «4005 71 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
Зо ТАК Гецп бек теп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сбіу Бек Іїе бБег бек 5бег 20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Те Ппув Бек Акуд Уаі ТПг І1їе бек Уаі Авр ТПг бек пув АвБп біп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Нівз Авр с1у Атїа ТПг АтТа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг Ггецп Уаї ТПг Уаії бек бБег Аїа бек ТПпПг туз с1у Рго бег 115 120 125
Уаі1і Рпе Рго Іецп Аїа Рго Сув Бек Агуд бек ТПг бек сій бег ТПг Аїа 130 135 140
Аза Ітец сіу Сув теп Уаії Ппув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уаі! ТПг Уаї 145 150 155 160
Зек Тер Авп бек сС1у АТїа Іецп ТПг бек сС1у Уаї Ніз ТПг Ропе Рго Аї1а
Зо 165 170 175
Уаії Те сіп бек бек сіу Гей Тук Бек Іевц бек бек Уаі! Уаї ТПг Уаї 180 185 190
Рго Бек бек бек Ітецп с1у ТПг пув ТПг Тук ТПг Сув Авп Уаї Авр Ніз
195 200 205
Кпув Рго Бек Авп ТПг Ггув Маі Авр ув Акуд Уаї сій бек Гуз Тук 1У 210 215 220
Рго Рго Сув Рго Рго Суб Рго Аїа Рго бій Аза Аїа сіу с1у Рго 5ег 225 230 235 240
Уа1ї Рпе Гецп Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Іец Меєс Іїе б5ег Агд 245 250 255
ТПЕ Рго сіц Уа1і ТПг Сув Уаії Уаї Уаії Авр Уаі Бек біп бій Авр Рго 260 265 270
Сі Уаї сСіп Рпбе Авп о Тгр Тук Уаі Авр сСі1у Уаї1ї сіц Уаї Ні5 Авп А1а 275 280 285
Гпув ТПпЕ Пув Рго Агуд бід бій біп Рпе Авп бек ТПг Тугк Агу Уа1ї Уаї 290 295 300 бЗек Уаї теп ТПг Уаї гец Нібв сіп Авр Тгр тІец Авп сі1у Ппув сіц Туг 305 310 315 320
Зо пув Сув Пув Уа1 бек Авп гув с1іу Гецп Рго бек бек Іїе біц Ггув ТЕГ 325 330 335
Іїе бек пув Аза туз сіу біп Рго Агкуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Іецй 340 345 350
Рго Рго бек біп сбіц сі Меє ТП Гпув Авп біп Уа! бек Іец ТПг Сув 355 З6о 365
Тецп Уаї пув с1у Рпе Туг Рго бег АвБр І1їе Аїа Уаі бій Тер сіц бег 370 375 380
Авп о біу біп Рго сій Авп Азп Тугк Ггув ТПг о ТПг Рго Рго Уаії Геї Авр 385 390 395 400 зег Авр сіу бБек РПпе Рпе Те Туг бБег Агуд Гей ТПг Уаії Авр Гуз 5ег 405 410 415
Агуд Тер сб1п бі с1у Авп Уа1! Рре бек Сув бекгк Уаї Меє Нів б1іцп Аї1а 420 425 430 теп Нів Авп Нів Ту Тпг сіп Ппув бек Іецй бек ІТецй бек Іец С1у Гув 435 440 445 «2105 72 «2115» 448 «2125 РВТ
Зо «213» Ношто зарієпвз «4005 72 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг Сув ТПг Уаії бек сіу сіу Бек Іїе бБег бег бег
20 25 Зо зек Тук Рпе Тгр с1у ТгЕр І1ї1е Агкуд сіп Рго Рго сіу їтув С1у Гец сіц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек б1іу Акуд ТПг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув АТїа Агкуд Нів Авр с1у Аїа ТПг АТа сС1і1іу Гей Рпе Ар Туг Тер С1У 100 105 110 сіп сі1у ТПпг Ггецп Уаї ТПг Уаії бек бБег Аїа бек ТПпПг туз с1у Рго бег 115 120 125
Уаі1і Рпе Рго Іецп Аїа Рго Сув Бек Агуд бек ТПг бек сій бег ТПг Аїа 130 135 140
Зо
Аїа теп сіу Сув Гей Уа1 їув Авр Ту Рпе Рго біц Рго Уаі1і ТПг Уаї 145 150 155 160
Зек Тер Авп бек сС1у АТїа Іецп ТПг бек сС1у Уаї Ніз ТПг Ропе Рго Аї1а 165 170 175
Уаії Те сіп бек бек сіу Гей Тук Бек Іевц бек бек Уаі! Уаї ТПг Уаї 180 185 190
Рго Бек бек бек Ітецп с1у ТПг пув ТПг Тук ТПг Сув Авп Уаї Авр Ніз 195 200 205
Кпув Рго Бек Авп ТПг Ггув Маі Авр ув Акуд Уаї сій бек Гуз Тук 1У 210 215 220
Рго Рго Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Аза Аїа сіу сб1у Рго 5ег 225 230 235 240
Уа1ї Рпе Гецп Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Іец Меєс Іїе б5ег Агд 245 250 255
ТПЕ Рго сіц Уа1і ТПг Сув Уаії Уаї Уаії Авр Уаі Бек біп бій Авр Рго 260 265 270 сі Уаї бі1іп Рбе Азп Тер Тук Уаї Ар сі1у Уаї біц Уа1ї Ні5в Авп А1а 275 280 285
Зо
Гпув ТПпЕ Пув Рго Агуд бід бій біп Рпе Авп бек ТПг Тугк Агу Уа1ї Уаї 290 295 300
З5 Зек уаї Геп ТПг Уаї геп Нів Сбіп Авр Тер тей АвБп о с1у Тув с1ип Туг 305 310 315 320 пув Сув Пув Уа1 бек Авп гув с1іу Гецп Рго бек бек Іїе біц Ггув ТЕГ 325 330 335
Іїе бек пув Аза туз сіу біп Рго Агкуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Іецй 340 345 350
Рго Рго бек біп сій біп Меє ТПпг о Гпув Авп біп Уаї бек Іецп ТПкК Сув 355 З6о 365
Тецп Уаї пув с1у Рпе Туг Рго бег АвБр І1їе Аїа Уаі бій Тер сіц бег 370 375 380
Авп о біу біп Рго сій Авп Азп Тугк Ггув ТПг о ТПг Рго Рго Уаії Геї Авр 385 390 395 400 век Авр сіу бБек Рпе Рпе Гей Туг бек Агуд їецп ТПг Уаії Авр ГПув б5ег 405 410 415
Агуд Тер сб1п бі с1у Авп Уа1! Рре бек Сув бекгк Уаї Меє Нів б1іцп Аї1а 420 425 430
Зо Тец Нів Авп о Нів Туг ТПг Сіп пув бек Іец Бек Гей бек Гей сС1у Тув 435 440 445 «2105 7З «2115 327 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «4005 7З
Аа бек ТП Ппув с1іу Рго Бек Уаії РПе Рго Гей Аїа Рго Сув бБег Аг4д 1 5 10 15 зек ТПг бек біц бек ТПг Аїа Аїа Гей сіу Сув Ге Уаії Ггув Авр Туг 20 25 Зо
Рпе Рго бій Рго Уаі! ТПпг Уа1ї бек Тгр Авзп бек сб1у Аїа Іейп ТПг 5ег 35 40 45 сіу Уаї Нів Тпг Рре Рго Аїа Уаї Гец Сіп бек бек С1у Іец Тук бег 50 55 бо
ТГецп бек бек Уа1 Уаї ТПг Уаії Рго бек бБет бек Гей с1у ТПг Ггув ТЕГ 65 70 75 80
Тук ТПг Сув Авп Уаї Авр Нів пув Рго бек Абвп ТПг Ппув Уаї Авр Гуз 85 90 95
Зо
Агуд Уаї бі Бек Ппув Тук с1у Рго Рго Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго 100 105 110
З5 бі Аїа Аза сіу сбіу Рго Бек УМа1і Рпе Гей Рпе Рго Рго Пув Рго Гуз 115 120 125
Авр ТПг Гец Меє І1е Бек Агуд ТПг Рго сій Уаї! ТП Сув Уаі1ї Уа1ї! Уаї 130 135 140
Авр Уаі бек сіп сій Авр Рго біц Уаі! СсСіп Рпе АвБп Тгр Тук Уа1і Авр 145 150 155 160 сіу Уа1 сіц Уаї Нібз Авп Аза пувз ТПг Тув Рго Агд бі 011 біп Ре 165 170 175
Авп обет ТПг Тугк Агуд Уаї Уа1 бек Уаї їец ТПг Уаї теп Нів б1іп Авр 180 185 190
ТЕр гей Авп с1у пув бі Ту Кпув Сув Пув Уаії Бек Авп Ггув с1Уу Іецй 195 200 205
Рго бек бек Іїе сіцп Ппув ТПг І1е бек їув Аза гув сС1іу біп Рго Агд 210 215 220 сі Рго сіп Уа1і Тук ТПг Те Рго Рго бБет сіп бі бі Меє ТПг Гув 225 230 235 240
Зо Авп о біп Уаії бек теп ТПг Сув теп Уа1! Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр 245 250 255
Ії1е Аїа Уаі сі. Тер бій бек АвБп сбіу біп Ркго бій Авп Авп Тук Гуз 260 265 270
ТПЕ ТПпПЕ Рго Рго Уаї Іец Авр бег Авр сіу Бек Рпе Рпе Іец Туг бег 275 280 285
Ак Тецп ТПг о Уаії Авр Ппув бБег Агуд Тер біп сій сб1у Авп Уаії Рпе 5бег 290 295 300
Сув бек Уаї Меє Нів с1п АТа теп Нів Авп Нів Тук ТПг сіп Ппув бег 305 310 315 320
ТГецп бек Гей бек Іевц с1Уу Гув 325 «2105 74 «2115 330 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 74
Аа бек ТП Ппув с1іу Рго Бек Уаії РПе Рго Гецп Аїа Рго бек бек Гуз 1 5 10 15 зек ТПг бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гей сіу Сув Гей Уаії Ггув Авр Туг 20 25 Зо
Зо
Рпе Рго біц Рго Уа! ТПг Уаії Бек Тгр Азп бек сіу Аїа Гецп ТПгЕ 5ег
З5 сіу Уаї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї Іїец Сіп Бек бек біу Геп Тук бег бо
ТГецп бек бек Уа1 Уаї ТПг Уаії Рго бек бБет бек Гей с1у ТПг сіп ТПг 65 70 75 80
Тук І1е Сув Авп Уа1ї Авп о Нів Ппув Рго бек Абвп ТПг Ппув Уаї Авр Гуз 85 90 95
Ттув Уаї сі Ркго Ппув бек Сув Авр Гув ТПг Ні ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аза Рго сі ІТецп Гец сіу сіу Рго Бек Уаії РПіе Іецй РпПе Рго Рго 115 120 125 пув Рго Пув Авр ТПг Іецп Меєс Іїе бБег Агкуд ТПг Рго бі Уа! ТПг Сув 130 135 140 уа1ї уаї Уаї Авр Уаї бек Нібв сі Авр Рго біц Уаї пув РПпе Авзп Тгр 145 150 155 160
Тук Уаї Авр с1у уаї с1іш Уаї Нібз Абзп АтТа Ггув ТПг пув Рго Агд сті 165 170 175
Зо бі сіп Тук Авп о бек ТПг Тут Агуд Уаії Уаї бек Уаї Гецп ТПг Уаї Іецй 180 185 190
Нів сб1іп Авр Тер еп Авп с1у ув бі Тук пув Сув Туз Уаї Бек Авп 195 200 205 пув Аїа Гей Рго Аза Рго Іїе сіцп Гув ТПтг І1е Бек їувз Аза гув О1У 210 215 220 біп Рго Агуд бій Рго сіп Уаії Тук ТПг Гецп Рго Рго бБег Агд бій б1ц 225 230 235 240
Меє ТПпг пуб АвБп осіп Уа1! бек Гецй ТПг Сув Гецп Уаії Ппув с1у Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаії бі Тер сій Бек АвБп сб1іу сбіп Рго біц АвБпП 260 265 270
АвпоТук Ппув ТПЕ ТП о Рго Рго Уаї Іец Авр бег АвБр сіу Бек Рпе РПе 275 280 285
ТГецп Тук бБек Ппув їецй ТПг Уаі Авр ув бБег Агуд Тер біп сбіп с1у Авп 290 295 300
Уаї Рпе Бек Сув Бек Уаї Месє Нів сій АтТа Іец Ні Авп о Нів Туг ТПг 305 310 315 320 сіп Ппув бБек Гей бек Іецй бек Рго с1Уу Гуз
Зо 325 330 «2105 75 «2115 230 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз
«4005 75 сіп еп сіп Ге сбіп сбіц бек сіу Ркго сіу Гей Уа1і їув Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гецп ТПг о Сув ТПг Уа! бек сіу сіу Бек І1їе Бек бег б1У 20 25 Зо зекг Тук Рпе Тгр сіу Тер Іїе Агуд сіп Рго Рго біу Ппув бі1у тей с1ц 35 40 45
ТЕр І1е с1у Бек Іїе Туг Туг бек сіу Іїе ТПпг Тук Тук Авп Рго бег 50 55 бо
Тецп Ппув Бек Агуд Уаї ТПг Іїе бек Уаі АвБр ТПпПг бек ув Авп сбіп РПе 65 70 75 80 зек тец Ггув Іецп бек бек Уа! ТПпг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Туг 85 90 95
Сув Атїа Акуд Ніз Авр с1у Аїа Уаї Аїа сі1у Гец Рпе Авр Туг Тер с1У 100 105 110
Зо біп с1у ТП теп Уаії ТПг Уаії бек бек Аїа бек ТПг Ппув с1іу Рго бег 115 120 125
Уаі1і Рпе Рго Іецп Аїа Рго бБет бек Ппув бек ТПг бек сіу с1у ТПг Аїа 130 135 140
Аїа теп сіу Сув Гей Уа1 їув Авр Ту Рпе Рго біц Рго Уаі1і ТПг Уаї 145 150 155 160 ек Тер Авп бек С1іу АТїа їецй ТПг бек сСіу Уаї Нів ТПг Рпе Рго Аї1а 165 170 175
Уаії Те сіп бек бек сіу Гей Тук Бек Іевц бек бек Уаі! Уаї ТПг Уаї 180 185 190
Рго Бек бек бек Іїецп с1у ТПг сіп ТПг Тук І1е Сув Авп Уаї Авп Ніз 195 200 205
Кпув Рго Бек Авп ТПг Ггув Маі Авр Гпув Пув Уа1і бі Рго Гув бег Сув 210 215 220
Нівз Нів Нів Нів Нів Нів 225 230 «2105 76 «2115 214 «2125 РВТ «213» Ношто зарієпвз
Зо «4005 76 зек Тук Маї теп ТПг біп Рго Рго Бек Уаі бек Уаі Аза Рго с1у сіп 1 5 10 15
З5 ТАг Аїа Агкуд чІ1їе Тпг о Сув сбіу б1у Авп АБп о І1е сіу бек Ппув бек Уаї 20 25 Зо
Нів Тер Тук біп с1іп Ркго Рго сіу біп АТїа Рго Уаї Уаї Уаї Уаї тус 35 40 45
Авр АвБр бБег АБр Агкуд Рго бек с1іу Іїе Рго біц Акуд Рпе бек с1Уу бег 50 55 бо
Авп обек с1у Авп ТПг Аза ТПг Тейп ТПг Іїе бБег Акуд Уаі січ Аїа У 65 70 75 80
Авр сі АтТа Уаї Тук Тук Сув біп Уаї Тгр Авр бек бек бек Авр Нівз 85 90 95
Уаії Маї Рпе сіу сіу сі1у ТПпЕ Ппув Геп ТПг Уаї Іеп с1іу біп Рго Гуз 100 105 110
Аза Аза Рго Бек Уа1і ТПг Гецй Рпе Рго Рго бБег бек бій сіцЧ Геч сіп 115 120 125
Аза АБп пуб Аїа ТПт Гей Уаї Сув Тец Іїе бег АвБр Рпе Туг Рго щу 130 135 140
Зо Аза Уаії ТПпг Уаі АзТа Тер пув б1у Авр бек бек Рго Уаії Гув Аїа ШУ 145 150 155 160
Уаї бі ТПг Тбг о ТБг Рго Бек Ппув біп Бек Авп АвБп Гув Туг Аїа Аїа 165 170 175 бЗек бек Тук Пец бек Гецп ТПг Рго біц сіп Тер Ппувз бек Ні Агуд бег 180 185 190
Тук Бек Сув біп Уаї ТПг Нів сій с1у Бек ТПг Уаї Сі пув ТПг Уаї 195 200 205
Аза Рго ТПЕ сі Сув бБег 210 «2105 77 «2115 5 «2125 РЕТ «213» Ношто зарієпвз «4005 77 сіу Аїа Уаі Аїа щЩУ

Claims (46)

1 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Рекомбінантне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що імуноспецифічно зв'язується з антигеном дозрівання В-клітин (ВСМА), де антитіло має важкий ланцюг і легкий ланцюг, при цьому вказаний важкий ланцюг містить: а) ділянку 1, що визначає комплементарність, важкого ланцюга (СОК'І), що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО ІО МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 6; Зо БЮ) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5хЕО ІЮ МО: 7, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЕС ІО МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 6; с) СОКІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЕС ІО МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 19; 4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БХЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЕС ІО МО: 8, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 6; е) СОКІТ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність «ЕО ІО МО: 13, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5БЕО ІЮО МО: 5, ії СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 19; або У СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5620 ІЮ МО: 13, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЕС ІО МО: 8, ії СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 19, де вказане антитіло додатково містить СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 24, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО ІО МО: 25, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 26.
2. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, де важкий ланцюг антитіла за (а) містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 27; важкий ланцюг антитіла за (Б) містить амінокислотну послідовність 5ЕО ОО МО: 57; важкий ланцюг антитіла за (с) містить амінокислотну послідовність ЕС 10 МО: 39; важкий ланцюг антитіла за (а) містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 40; або важкий ланцюг антитіла за (е) містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 58.
3. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за п. 2, де легкий ланцюг антитіла містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 28.
4. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-3, де антитіло або його антигензв'язувальний Фрагмент зв'язується з позаклітинним доменом ВСМА людини.
5. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-4, де антитіло або антигензв'язувальний фрагмент являє собою антитіло або антигензв'язувальний фрагмент людини.
6. Антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-5, де антигензв'язувальний фрагмент являє собою Раб-фрагмент, Рар2-фрагмент або одноланцюгове антитіло.
7. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-6, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент інгібує взаємодію ВСМА і АРКІГ.
8. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за п. 7, де за результатами аналізу ЕГІЗА антитіло або антигензв'язувальний фрагмент демонструє значення ІС50 для взаємодії ВСМА і АРКІЇ на рівні приблизно 5,9 нМ.
9. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-8, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент являє собою Ід.
10. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-9, де антитіло або антигензв'язувальний фрагмент має ізотип Ід.
11. Антитіло за п. 10, де Ідс4 має у своїй Ес-ділянці заміщення 5228Р, заміщення 1234А і заміщення І 235А.
12. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-11, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент імуноспецифічно зв'язує ВСМА людини й перехресно реагує з ВСМА яванського макака. Зо
13. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-12, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язує ВСМА на поверхні клітин мієломи людини.
14. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-13, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язує ВСМА на поверхні клітин множинної мієломи людини.
15. Рекомбінантна клітина, яка експресує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь- яким із пп. 1-14.
16. Клітина за п. 15, де ця клітина являє собою гібридому.
17. Клітина за п. 15, де антитіло отримують рекомбінантним способом.
18. Рекомбінантне біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або його біспецифічний зв'язувальний фрагмент, що містить: а) перший важкий ланцюг (НС); Юр) другий важкий ланцюг (НС); с) перший легкий ланцюг (І С1); і а) другий легкий ланцюг (І С2), де НС пов'язаний із І С1, а НС2 пов'язаний із І С2, і де НС1 містить ЗЕО ІЮО МО: 59, 5ЕО ІЮО МО: бої 5ЕО ІЮ МО: 61, а І С1 містить 5ЕО ІЮ МО: 62, 5ЕО ІЮО МО: 63 і 5ЕО ІО МО: 64 з утворенням першого антигензв'язувального сайта, який імуноспецифічно зв'язує СОЗ, і де НС2 містить ЗЕО ІО МО: 4, ЗЕО ІЮО МО: 5 і БЕО ІЮ МО: 6 а, а І С2 містить ЗЕО ІЮ МО: 24, ЗЕО ІЮО МО: 25 і ЗЕО ІЮ МО: 26 з утворенням другого антигензв'язувального сайта, який імуноспецифічно зв'язує ВСМА.
19. Рекомбінантне біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або його фрагмент за п. 18, що БО містить НС, який містить ЗЕО ІЮО МО: 55, І С1, який містить 5ЕО ІЮ МО: 56, НС2, який містить ЗЕО ІЮО МО: 65, і І С2, який містить 5ЕО І МО: 76.
20. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за п. 19, де антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент являє собою до.
21. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь- яким із пп. 18, 19 або 20, де антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент має ізотип
Іа.
22. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь- яким із пп. 18-21, де антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент імуноспецифічно зв'язує ВСМА людини з афінністю, що більше ніж або дорівнює 0,22 нМ, як визначено за 60 допомогою поверхневого плазмонного резонансу.
23. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь- яким із пп. 18-22, де антитіло або його біспецифічний зв'язувальний фрагмент зв'язує ВСМА на поверхні клітин мієломи людини.
24. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь- яким із пп. 18-23, де антитіло або його біспецифічний зв'язувальний фрагмент зв'язує ВСМА на поверхні клітин множинної мієломи людини.
25. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь- яким із пп. 18-24, де антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент індукує /п Мт активацію Т-клітин з ЕС5О менше ніж приблизно 0,37 нМ.
26. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь- яким із пп. 18-24, де антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент індукує /п Мт опосередковану Т-клітинами цитотоксичність клітин, що експресують ВСМА, з ЕС50О менше ніж приблизно 0,45 НМ.
27. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь- яким із пп. 18-26, де антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент не є агоністом ВСМА.
28. Біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь- яким із пп. 18-27, де антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент у концентраціях до 10 НМ не впливає на активацію МЕ-кВ.
29. Рекомбінантна клітина, яка експресує антитіло або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 18-28.
30. Клітина за п. 29, яка являє собою гібридому.
31. Спосіб лікування суб'єкта, який має ракове захворювання, причому вказаний спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента за будь-яким одним із пп. 18-28 суб'єктові, який цього потребує, протягом часу, достатнього для лікування раку.
32. Спосіб інгібування росту або проліферації ракових клітин, причому вказаний спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента за будь-яким одним із пп. 18-28 для інгібування росту або проліферації ракових клітин. Зо
33. Спосіб перенаправлення Т-клітини до ракової клітини, що експресує ВСМА, причому вказаний спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента за будь-яким одним із пп. 18-28 для перенаправлення Т-клітини до ракового ураження.
34. Спосіб за пп. 31, 32 або 33, який відрізняється тим, що рак являє собою гематологічний рак.
35. Спосіб за п. 34, який відрізняється тим, що гематологічний рак являє собою В-клітинний рак, що експресує ВСМА.
36. Спосіб за п. 35, який відрізняється тим, що В-клітинний рак, що експресує ВСМА, являє собою множинну мієлому.
37. Спосіб за п. 31, який додатково включає введення другого терапевтичного агента.
38. Спосіб за п. 37, який відрізняється тим, що другий терапевтичний агент являє собою хіміотерапевтичний агент або націлений протираковий терапевтичний засіб.
39. Спосіб за п. 38, який відрізняється тим, що хіміотерапевтичний агент являє собою цитарабін, антрациклін, дигідрохлорид гістаміну або інтерлейкін-2.
40. Фармацевтична композиція, яка містить біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 18-28 і фармацевтично прийнятний носій.
41. Спосіб створення біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента за будь-яким із пп. 18-28 шляхом культивування клітини за п. 29.
42. Виділений синтетичний полінуклеотид, який кодує біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 18-28.
43. Набір, який містить біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент, як визначено в будь-якому з пп. 18-28, і полінуклеотиди, як визначено в п. 42, і упаковку для них.
44. Набір, що містить біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент, як визначено в будь-якому із пп. 18-28, і упаковку для нього.
45. Набір, що містить виділений синтетичний полінуклеотид, який кодує біспецифічне антитіло до ВСМА х СОЗ або біспецифічний зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 18-28, і упаковку для нього.
46. Спосіб створення біспецифічного антитіла до ВСМА х СОЗ або біспецифічного зв'язувального фрагмента за будь-яким із пп. 18-28 шляхом культивування клітин за п. 30. ЗМ ОВ нти ТЕ: де: сх свой у Г поем, кг 4 ть я Промотор ОМУ з інтром о-пахтамаза. хі У ч СО вопоююем? А 7 і ді и -ї л бе 5 шу и -- Козак ор с ох удо рома, Х ВУТМЕНЕРІ; від старт. до стоп-кодона ЗУ Е Дегурефтовоюх нку со, є 7 шо А чу «Промотор СММ з інтров Енлахтамага., Й Ії ТО вопооююаме 1 . о Во Її. й УК Во й щі Є 3 тя ік: сни. Козак ЗМАЙ пОМА х ВСМА яванського макаюа "від старт- ДО стоп-кодона ВСАА Поворот ОХ. зовн С ВОМС Ні а ЕМО ск де Я с ВсМмвеЗ іс БО тю в ОВ ПОЧЕ АЮ я. Оу ВО. ее сл Я ак ов ОБ 5 Х гро й пою 2 УКХ щи ІБК сх те ЩО ; НЕД, ТЕО Ж Петля піва вро я 2 СЕ люд У щем (ВН ЧОЮ УМ Шк
ФІГ. 2с ФІГ. 20 а дек ке ня я х с ШИН ІОддввв НВ. «АМКУ ШИ ПИПЦИИНИХ б ПК К- Я У ке ДИНИ, ВШ тт ПММ ПМК р В я, п КД и ох Ям ДЕ У ОН НН У що ; КУ МК са.
Ж 58 ПИ Ж еВ Кр - хі ту - АК Ж Же ж ща с Що Б ея ше Е в де КЗ З з СОС МК, он В об ню ТО ве ме ей ко Її ше 7 0" У ви М с ОО 5 хи єння ху я Х ля Е й М в о В З іх че бю яву їх п ле в нена ЗУ охо Х со КВ А виз В ке ск а лк Жіах Ма ще щем МЕ УЕО За ко ще в її й З Ок кт я Що х хат во, К5 о ї, ЖИ о Я же я о В м БИ ще і ее У Б Б МН ПО унедн о Ме вежа З З ЗХ ще КК Же" зе пе Є їх т им КЗ с ще В Бе ов: ма щКсВЕА я що Хпітоя ВСАА мпюдичм МІЙ ОКХ НБУВ УСМАТИТНЕУКИТИХ (1-54 їз ВКФ ЩО МО: 1 ВОМ» явавського койаха МІДМАЖМЛКВОНІВ ВІЛЛ МВА ЩАТВВТсОх ТЛА КАВИ: 53-83 їв 859 ХВО: З, ВОМА миші пе КВ ОА АВТО М ЕЕ СОЮ ЕВ УКИТУТ (3-88 іа БО ХБОВОї 2) Паратай вм Я ії сов-ні спе-на т: всмвао но сід ЕДИ РТ УВІ АММУ ШИНКУ КМ КІ ВМТ ЕВ пп ВЕДЕ ВУОТВК ли сри-в3 м всмаба яс хотпнлодЕууаа тА ВЕНА КМТ ХВ ВДТ УЖЕ и АЛ вонвхе во ЕБЕРУТУЧНИАЦТНІУКТЕТВУ ВВП ЕМУ УКВ ВВ К УНК РЕМТКУККУЮВККОНЕНВННИ ВО Отш Ко: за 1 пЕКСЬА си ЬАХ ТЕ вони хо ПУПКОМ ЕМАР ХАКІ ТОНЕ ВУ НН ОМ Аг ОВК Ко ВІВ МК 73 соа-та та вБомеєз с ТІВМЖКАСОШАИТ Оу ОВ ик ТУКА ТІ КЕ В ЕІАХАНКА ВІСІ вснябв с РУЛИВЖМВИ ЕК АПЧКККК ОН НККТвВШ КВІТІВ ОТО их пт М ЧИ я я шк я т б ВО до и ще М ж Може вх Б Бе лих фо я я шен: Хе ША мий ОТАК ; Ди МК Я Зикнення «ЗК хо У 20 ЯБЖнення фе ту ЕТ КЛу т хобі КМ пе ЕМ Ох ши АВК ММ ДБК ОХ ХУ о ау дО В ОО ьо ЖЕ Де Б Ж ох Бас а ке ОК Ка ї о и В ЖЕ ОКО я ж Я ох о а С М В жа щи вом й КЗ як т М Перший комплнеят Кінцеввй комплекс піде КОВСМА ДІАПАЗОН ЇКуь НМ) (кр, НІМ; ВСМАТо венський уакаю орд во 538-727 Маце зва па 620-929 Афінності ВСМЕТ2: людина ? янанський макак »» музща
ФІГ. 6 Я зво сі ЗО о) з т К зб ли.
Б ооо. дах оо ДОВ. ї ОБО ; е - рік ОО под» . не - М Ми же Оси х я що ВОЗ й о В, я «т й Х доб стт ня пом бою юю Концентрація (НМ) Киїтини: ЕСЖНВМЕ -к НВО 147 -- ММК 574 тя ІМ 5 - ІВ 228 Це ТЕ В-клітнни МЕковики Зклітних ВК Телини СОЯ Тклижни З ту тт Кт Кит Кт . ї і Е її КЕ к Е А що Щ км ще 1 : д ро. йо и КОРА т ; 1:13 : В іх ік: й | ро Бех ; ня А А пе Бут ІА : г ІБ АЖ й Кб КОН х : це БО роя пи НА Б ЕР Еш пе і а і упо ром ії Кх х Цех і КО БЕХ ї ! КЗ А Од ОК Ух Гея ОХ у ї - ТЯ му 1 М ГК Я ' ГРА Е Панно мом те Мур Дена ту ікку й ай сстттонетття ТРК ідсектсот тю ериянююсинх я хо ди до чай зи пон дп зей ями Ах У Мол 3 за Б о не в ов ою де єю» ооо ною ово ой це Ммоцити Ненофям Еоінаофкня Бадедня НЗдазмацитунні ДК фттттттнтнининяянянтнтят флтттитититнннннняняняняннняну тт Мттттитннннннняняннкнянннняяу дттттттиннннннннянянннняняняя і ! А НН І що і і і р Ї рі ї ів ії ши! ік і ! 1 й ха і ' КІ ' й 1 Ох й і ! Р і г р гі ЕЕ і ; Ї ФК 5 р З НЯ НН : Н і ЕН в В і й. с 18 ши я Ой і ге Ш п 1 В я що Щи 1 ок Ж щі БО ок ї сх і ва дя ой і х дитя х пе апа «ий АВ рен дяки фенеюях с зни АВ ана х В рекет у в НИ ни ад біде сю ще зд ей пох зу чо во зай ве це і - о Е Месники Во а ск р о їх 5 о - во і-- вв хх ж 5 БО / х Бо дн доп й ш. б й . БО З ЕСрухогінм 5 Я ЕСвух 0 НМ 8 2 ання в 5 21 вання е Ба а те с На ей - пев, 0093 ; тки а Б55ащ' нив в Б БввБЕ КЕ З в боже що по Фо , з сла Концентрація (НМ) Концентрація (ВМ) - 1005 -10о- З і - ж 805 пах Е 80 Делі 5 і ди ло й ї 5 В 5 Її т пі / ой ,ЕСсаяа х 0,37 нм ЕТ /ЕСвребдвнМ 5 що І ва 52,25 ННБЕВавЕВ ах х 3 Я ВЕН - в-ва я з зв Б» Ви Ох ду -6 0 зд - с ре . . Концентрація (НМ) Концентрація (НМ г 1003 я 1 ж 801 си «- ВОМ872(ВСМА х СОЗ) - -ак- ВСМА х нуль 8 404 я Нульх СОЗ СК ве М 5 5 З д віл воава янь, а Б З гу - Ф «з тод чи Концентрація (НМ) «Коітинна Лінн ВВ ВМО ВВС МАЮВКВ . іДоної і ЕСБО(НМ) осбмехсоектлелц 000 ЕСБО(КМ) М мако, злива ІМ7197 і 0300 803 | 10880 лі ау ици ТА іТме575 і ОВ 8508 а 826 ІМонои і щАБгя ЗК по в ТМ? ! данівідсутні ї дані відсутні 1240 126 нееднезначенняї 2 008 86100 7165 отр тт Дт Кпинна лін 00 ММЛКІСМАООО 0000000 ММЛНІВСМАОЮРІВІ Донор : ЕСЗО НМ) рж макс. сктивацй 3 БЕСЗО(М) 15 макс. ахтивації І МЕ575 і 01173 БО пл твде Ма5ї 1 ОВ Т3ДО 1 денсвідсутн | дені відесні ОМТОТІ о денівідсуті о денівідсуті 00002750 о6КВ (середеєзначенняї 0000982 00005120 ов 78.25 ' 1 ' Клітинна лінія! ВРМІ 8226 (ВСМАДЮЇ | ВРМІ 8226 (ВСМАОЮ273І (Донор. 20202020 БОБОФНМ) бмаюоєкивац ЗоО0СБОБО ОМ Дб макс, аква 1М5137 і 02448 | нд. да 5043 Ми Ї З Біда | п3357 ІБ 00000068 000000 83094)0000003058 1МБі5у і 03041 8823 | ди КІВ ТМтат? : дамівідсутні ! данівідсутні З 04055 Біт Ісеряднс значекая! 0277 | 72.76 | 94923 819
(Копннналіня ВМ 10000 НВ ОВНА ЕІ | КУ 55 ПАВИЯ І Тл Токпедне знеюння! ВТ: М УМ І ді: ІКпінння лій 00000 ВОМ 000 МУ СМАКИ мив сс В ВОВНОЮ 3520 ХАЗЕІ ав 11 і В ТО | чад 55: МЕТ і В кенио: З МОЯ | МІ 107 1 дядя? і - тура --ДїВ інпрохоюмвніх зіддумя івпрокохмасія гідпуткя! КЕ і хЛтаехми Ва ід і БІБ НМдвї і -ВТЛУ І «МОЯ оданіовдоуті : дак відсутні ! іме ! давінідсуть ден вдо | с 2 ІСеродне нання БУМЕНІЇ: ЗМ ЗВ 55: - 196 --5 1005 денною Б Ще: дово і 0 Н х щої / де І - і г а» о Во Х шяоослаков Боб Ї ЕСда х 008 ВМ во, Ж ЕСкаеОМБНМ В хв Б 40. я ВОК ккд Же де ве 5 м ББЕВЕаВВЕВВ вроді Кк с щ шоодА! Ж дожов Змівеавнавяхйш 2 щ, й 05 20 ОБ ОБ -щ Б ОО БО Бо от щу оо-о са - с ж «В о я ос ж ки . ; - сов Конуентрація (НМ) Концентрація (НМ шт- кю ЕКО г песо Ба я 83 дО х Во дивна о 80. зі В во. Но В 9 Во / е а) ЛЕСво: 045 ям в'я Х ЕСху- 0 ЯМ А Х з Ж хм оо Ж жі в битви щеоя» овопавивсве що ВЕ ЯК е-Нв-я-я я дж що ло, т шосе о пе тяж же З щу бо Б шо ож в вав ож ов Фр я ре --
т . - -р вк Концентрація (НМ) Концентрація (НМ) д 300. І зе пе ре - дй - ВОМЕУСІВСМА х СОЮЗ) Ж дя ча ВСМА х нуль 3 Во- с во чї- МчохСОоЗ б ай в'я що щи й нев янв она подо що ух ОО ВВ В пл «т се ж 0 Кенцентрація (НМ)
ФІГ МА нев лНН РА МЕРА ІДоноро 00000100 ЕСБОСНМ) ї Збмако лізис ЕСБО(НМ 1 25 макс, лізис І МАВ; і пиві щ5 153501 Во еВ ІМ? І пра вав 07201 Бооа пн ши с и шт МБ | оду 927 данівдееля: дані влеулі ІМТ? с ванівідсутні! дані відсутні Середнє значення вл! СЕК і по свмо ее БАЛІ нку 1 Донор І ЕСХННМ) ї ббмахс, лізис ЕСООсМІ 1 З макс. лізису Імбі37 ! пово 82? Бе 2723 мл; | овоЯ. е6о і МаБтВ ! СМВОї що Ії Мелої І вані ат Данію: дані зшиті ІМ? іо дані відсут зн; вІдоутНі Ї Середке значенкя ПОВЕ; 835 і : 1 ї : І Клітинна лінія | КРУ 8228 ВСМАОЮТИИ Донор. 000000 ЕОМ) З маюлімсу, ІМБ137 | пра 52 ТОК, діло і мов | паз 8бо5 омвао ТД! ПЕК І 0,55 853 ПОВЕ: 5573
ІТИ... ВАН ВІДОЮТНИ Дан ВІДО 1 бередне зкачення! ді; 53,55 08543, 77,85 ФІГ Ів Ї Кітинналіня 00 МОБ ОВОМАМОМО 00000000 ПОЕМА іДочаво о 0002--2-- - 2 ОО (ВМ) 0 нако люнсу 0 БОБОЇНМ) 05 мак лізнсу ІМ ! ОО 83 ВК СО ЗМ додане ода ВВ 1 берядне значення, 37946. тва! зов: тА І МБО «ЗЕ. ТК І. С ІУДИ Нуннтти Он стннтнн А САНАХ 800... сво оон ніюутня ДЯМІБДОУТНЕ: МАМ ВІДСУТНІ
Аналіз опосередкованої клітинами цитотоксичності клітини НУ29 (48 год). Ю донора: М 5763 і 6575 100 ЕСБО (НМ) в г; ВМ -ВОЗВТЮЮ 005 БО Й ВОЗІ 007 5 Во 5 -е-ВОоЗВ3ХЮІ 005 Б ї А ВСЦ 005 о 45 -- во Є ж ї - ВОЗ 005 - ВЕ невеченнютьтрсудртнютн - - Концентрація (нМІ Аналіз активації Т-клітин клітини НУ29 148 год). Ю донора: М 57631 65576 1005 ж і свя ЕС5О (ЯМІ) 5 ВО Дод щі хе і й -- ВЗВОД г 50 й -- ВОЗА! 0 в 1 я -- ВС бив хо 305 В ее ВОЗВІВОВІ боб кі й - ВОЗВІО боб щи Я зе ВСЗВІ2ОВ 03 - п-о Концентрація (НІМ) ! Аналіз ВСМА х СОЗ, ЕС, (ЯМІ со ОМ ОМ ММ МИ ШЕМЕі За ЛА о, лева ав олМЕе зд | 3 037 00028630 1Ю: 0 вмВ Сова 809 0 я оса о їебу 0 ЯМООЯ1в РОВОМ О 155 УББ ФР - 0003 но; ли5а 0 -поаях 0 бтож 0 -бБНМ 0 -одо ї дощ
ФІГ. 14А пил, п пл - -- СМТ? 0О1 033 : 1 - пе пає 4 5 8 -к БОМБ? 003 048 З дя зе БОМБ 05 о 8504 : 1 с 4 Е 404 й щі ї -ал З 0 й ВВ чинни вл ж я 5 ро в. Конц. ВСМВ72 (НМ)
ФІГ. 148 се ТОЮ. Е во хх к 0С ВОМВАМХ 026 БЮ УЖЕ се овомв?оово 046 5 ЕХ ко б че БОМБА 038 х і щЩ чо і є / як ! о З я фе Ну ОропУ те «Ф Конц. ВСМВ75 (німі Актннація РЗВ у клітинах НОВ В- т с в. кА СУМ Що. КУ Ж ор СЯ шо ян щи В я м - я НН й я ОБ 5 Е я мя їх с Я а и А ще м п я ма і МОН Не ОА ка М Шо З У фу хм те 2 ії рот що І я ПУ ЄМ яко ові ож оті ов гі пі ооо ау Ві і і ї ші НІ і І
2. І и і Ї їі пі дику Тоня зму йо і БСМВ поВозБа ПОМТОЛЮВ; ї х і - Концентрація злі ще ФІГ. 16А ох : «ВСМАСВ тоді ки тя її їй ї с ро С ті Шкоу є 15 Ж - їй і КА Еко бу М г С ие х Б НЕ гл ОО їй Я щі х Код р М НО Е о щЕБЕ ей Ж аз Я М І Є ск х. юю з Ка а г ех тт о ж КочцінМ) ПО ВоТ0Е З «В Кт й па з т Я З т й етрх ВЕНЕ СМ вен Кл шо.
ФІГ. 168 Ж Ж . Батьків щ КЕ і тькіновки 16 годі «З їхї й м В ю жо, її що На Є Гео АК щі . Дей ну оКонціюМу 5 кт пд селен Стимуляція нуль ТМЕ М я ве до ВДоля О пев ни З уди Мега АРИ еВ ТИ Шк МО 4418 44 жи нн Ба МИТ 7 св ФІГ. 16С 40» Й СМАСМ ТОДІ їх п 2 їл о ш-ш ті Ма У т- ід и ви бує мМ їй 5 з її я г а Й» БУ ро НИ вд й г Не тв. ян БОС Се М о в-я в й п В мо Рг т ва г НЯ Монрінмо б 578 48 вве ПЕВ г тимуляція нуль Тукв АРКЕ але роє сів об ва Ям 944 - ве " - ФІГ, 160 в'я
Р.
шва. в і і даль 124 го; з пд г ській (оду Ок Е да г Е | ЩА я ха й З по ня Концінм; 5 ЗБЕ ЕЕ дп стання нтльтмка А Я ЗБ ооо п о вла упиція нульїМЕа АР. от ІюЯню Фіто ев лев Я ВОоМЕгЕ ши ше ЩО Е 8 ФІГ. 16Е З і КЗ ! ка нт Б Кк 285 2д . то л Те рі УВСМА В год) ГА Кк КО и ки я БЕ Азот менМ ; я я М в кож Б ка ок Ки З І ік ка Ще г й ж їх щі г ВО рома Ба Р Ло г х. НИ ОО МО я 1авпаа ло ВО ОБ БО рі КБ р ЯК. к Фа окр Мі ой Ко їі гя ОО г І т Но Хвацівм 2 Бо 46 і Ер ко о Кк стивутяя ОБРА 46 Я О0пеооют ов Я о Б-ка іимулеція муль Ма АРЕ же оленя мо Дема - ВОМ в ФІГ. 16Е Ві і ; 5 дк і ї зей мч Е 8 г Батьавовкий З ад) шо В І ща шо 5-1 й 5 ш Н в КЕ Н КУ Я для "З ее Концінмі З БР АЄ ет ! з? Є а ле ооо ОВо Є 0 Мотрони Стимуляція нульїк те прое пІюе Не Є о пФ о ВІ па «ція нульїмка РН БЛЕМ АИЛЕНЯ вом й
ВОМ; клітини; МТМ Есблокатор відгутній, (58 год) ще зВоМА: жо як ПМ БО -- КІМ я- В - БМ ЕЕ їж - 18 М Хо ск. ВЕБ НМ що -о- ВІ и оо по Конц. ВОМ (НМ Муль х СКУ Ткдітини: МІОУЯ МОУ? Кс брбкатоє відсутній. Вод Ес блокатоє відсутній, В годі ЗВоМА: вв, т В 1 --к- ТВ Ва да т ! - БМ ков - ЗА НМ що «04 - ВА НМ - м А х ЖоодАї - 186,5 М ої ой що о со» --й сх От то щ ж ОО Хо Коні. нуль х СО НМ ФІГ, 18А ФІГ. 1885 ФІГ. 180 ї Е о осів 5 о, подав З ї ВОК ї І т таЖЕт В Во. ! б Во ЗИ ш 604 В е Її З які І Е дві Я 8 404 Пи в 4 я - ай 1 в КЕ 4 й : 1 ї ода Е в в. ух Во | л в 2 Ї щ н т п ї що І вия 5 дів У оо тонн тетокя в - я В Яке етеннучеюттееттт ОО С и тож кто и пу «З у жи СУ У БО 00 що ОО ол ОО Ма кх "о ОЗ ЕІ: що т Е Конч. НОМ (НМ Конц. БСМЕТЯ (НМ Конц. ВСМАТ2 (НМ) ЗБСМА: ЕСецнМу БРА ЕС ем БАРЕКО саінМх 5 з З -анм щи -- ШНМ дае --е ОМ Без т НМ ОВ -- панМ Об --к ВЯНМ 03 --евМ 05 - ДЕНМ Ам -- ОДнМО пе -інУ ЩА ня ЗНМ 0 - і1йнМ Б --вв НМ п - вінм ВМ - НМ ОО - 5 НМ БД --е ЗБанМ А як ТЯМ о п35 -- 481 30 -о- ММ ОА
ЕН здано Ж вве Ох, пря г ! Х; ш І й я пі й БО я во 804 МА 5 5 і у шозаї Як 5 дв х і І І; ЩО Й Й й 2 с Ж за г ХОМ ней - и ден 8 З вх Ж діва їх в ччпечячндтнкнтюютю 0000 ОК тнтитнтестетютнм о п І К щ вол) б шф о ОВ З чиною ЮОІ и дО -- ха щ ШЮОСя не КОКО її «й ко Ф . - я мк 5 кону, ВОМ? нм) Конц. СМТ НМ Хону. ВСМИТ? (НМ) У 1 т т т зво пт зак ве оо ІНМЕ яВоМА: ЕС нім АР ЕС він ВАР ЕС ваінМЕ ВОМ Біо сА НМ х дамо па? ев ою зе обме зе НМ 5 тв пд - йІВНМ щ5 -к ВМ ОИЮ -- со п -к Дам 08 -е- ДБНМ ЗАЗ пе б м -тюМ 58 - 1дкМ. 648 -- 1ВакМ А тя ак ки ду ка кіме пк - вінМ ОТО -е НМ ОП - Ба НМ ПО е пе 47 хе ще г да -к БАН ПОВ я» ТМ БА е- Ба НМ 080 ' м «ек я 7 І - ВИ НМ 273 - МЕМ ОО 0 Зв'язування ВОМА з плзншетом, покритим АРК (пе 2 120- почав а -- ВОМВТ2 що Ек адежюкя -а- НулькСОЗ - Бо о й 5а- х яко х ГКУ ч,. 5 20 Я Боби, я в шо" ово 7 -- Антитло (М) Зв'язування ВСМА з пианічетом, покритим ВАБЕ ре й) 4385 БОЇ «541 щу ен ВОМА?И: ОМ рр. не Же .. я в. щ ау --- НулькСОЗ Щоод х ва- я о » ов сне вощ вт «і 7 . , кт щ- Антитіло (М тт Зв'язування Цитотокоичність ДАутивація Т-клітик х . річ пит ут. ї Геї Ж еВОМаЛоХ я К-Я випад п - ДеМД7 п кОИММКХ сто щі ОД Бема телюОЯ Обох Б ЕСоах І НМ п Їю Зотих ж МОЮ 2 о р хо 4ко63 ! КУ Оо4 а. о З / у 9 / щої Ед уж» Од і Фк і / о 33 ох що Я шо ОЗ; пу що х Ж і шо 4 моб Я шк я В 7 ше що з-асвювбячанья а І осв з поч ої і- . 2200 фену тече ЩО До онняярчннняечаятяе т нявдестінютттня Й оппадчтпотрталнле чел катет ка щоб Є с сао си хо су до су З щощохі сто хи є с - пас - З с с ОМ пд т щока МО с яви ша щожК" - ва лев Во о - Е Конувнтрація (М) Концентозція НМУ! Концентраців (НМ ФІГ, 2085 - ж Е - т о ге те х 4 ФО Бслуг ТМ в я Ж в. 5 жна ДоОжОНЯЮХ , ТЗ ежеейреи ув КН і 5-5 В 1 / о і і 5 і Я ще 0004 Х ща і Ж і ш 5 і Во 3 Е і тож ОБОЮ. м Б х т пежжайввая Ж і я с едюяня - т яні Шо ПЛЕД ОД сукачнтчееюттюєтуттю Ж енееучететеестеєтя - щу кох с С ДО т КО п ПУ яд ку хто СУ поп 2- ЩО ж сУ СУ сок и жи ОП ФО оду жо а оша Конувнтвація (НУ! Канцентрація (НК Концентрація (КМ) ФІГ, 200 ктиваія Ті ще Зв'язування х Цитотоксичнють Активація Т-клітим п мав. пр ли Як г КО вн тов ВОМВОМ 000 В оч БОво Сни ся «Б 20004 « Іжока у 5 Ббиведутячя 15 405 те до і под ад Й 3 я я І зла БоБОТЖК і Бо. ік а с 30 Н ОБ оїдпв і ревом, жі Й ОО ОН жо АР ВОМВО ж й ж МОЖ вл Я Я Лівою БО ев ячяся ш щой в В ! АЮ г в ОЇ прчоежнжеювтоскчтьи КЕ оо ТОВ ля Що й НН - - ЩО Др етююттттююттткюттттююттюкутттю - Дб етеккттекютттююттттюютттюютюх с Ух са ви пух ж Концентрація (НМ Концентрація (НМ) Канцентрація (НМ) -к Я х- 0 хі в І Бех оз нМ - й ші - ки Вк ОБ оди Й Не ан вд дю п ро ОК зад з в''і плн щ й БЕ з0о5 й Воді З 204 а арйочнистя - що Д. етно нуту 1 щ і Ес ЦО кжтттжутуу куту строю З пруежуттткжуттутжту утюжт кутя о й руку ктюут у улеют каються ; щдихошиш шд'лковшя ще отша 5 ваз БЕ БАЗ Б виє БВ о Є хи дк и Фк же Концентрація (Мі Концентовц НМ Комцентрація (НМ) ФІГ, 20Е Ф Зв'язування Е Цитотокоичність Активація Т-клітин я Є овила Бої ДЯ се п 3.74 НМ т ВИЩУ кати ж ВО ЕСвквх Той ні Б я вомвузоюм я БО дня да Е 600 як ОТИП Ж «піж ий Й. с ЩЕ Ї В о ніс вон: Й у т- ДН Го Н А «Ві ; кА Ж ККУ Є Е І ВсМВто й лм З шО я - г Во яМУНТАЦИВ Е 1 І их 5 ЕЮ ї БО я ВОНИ ня 0075 Ж вена айв» ї г о АСК Ту ї І Ж я всвлвнвев о 5 шоп СК яхе в 4 шо : БОВЖО дюн по рт ттюєтеттсн жІх Х 7 КІ Конуентрація (ММ Концентрація (нм) Концентрація (НМ)
UAA201802674A 2015-08-17 2016-08-16 Антитіло до всма, біспецифічна антигензв'язувальна молекула, що зв'язує всма і cd3, і їх використання UA127515C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562206246P 2015-08-17 2015-08-17
PCT/US2016/047146 WO2017031104A1 (en) 2015-08-17 2016-08-16 Anti-bcma antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind bcma and cd3, and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA127515C2 true UA127515C2 (uk) 2023-09-20

Family

ID=56740579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201802674A UA127515C2 (uk) 2015-08-17 2016-08-16 Антитіло до всма, біспецифічна антигензв'язувальна молекула, що зв'язує всма і cd3, і їх використання

Country Status (40)

Country Link
US (1) US10072088B2 (uk)
EP (2) EP3337824B1 (uk)
JP (3) JP2018525005A (uk)
KR (1) KR20180040671A (uk)
CN (1) CN108350076B (uk)
AR (1) AR105724A1 (uk)
AU (1) AU2016308567B2 (uk)
BR (1) BR112018003017A2 (uk)
CA (1) CA2995754A1 (uk)
CL (1) CL2018000431A1 (uk)
CO (1) CO2018001524A2 (uk)
CY (1) CY1123297T1 (uk)
DK (1) DK3337824T3 (uk)
EA (1) EA201890513A1 (uk)
EC (1) ECSP18019568A (uk)
ES (1) ES2814550T3 (uk)
FI (1) FIC20230012I1 (uk)
FR (2) FR23C1011I1 (uk)
HR (1) HRP20201375T1 (uk)
HU (2) HUE050556T2 (uk)
IL (2) IL298041A (uk)
JO (1) JO3799B1 (uk)
LT (2) LT3337824T (uk)
MA (1) MA53750A (uk)
MX (2) MX2018002043A (uk)
MY (1) MY191325A (uk)
NI (1) NI201800027A (uk)
NL (1) NL301219I2 (uk)
PE (1) PE20180795A1 (uk)
PH (1) PH12018500361A1 (uk)
PL (1) PL3337824T3 (uk)
PT (1) PT3337824T (uk)
RS (1) RS60755B1 (uk)
SI (1) SI3337824T1 (uk)
SV (1) SV2018005634A (uk)
TW (3) TWI811023B (uk)
UA (1) UA127515C2 (uk)
UY (1) UY36859A (uk)
WO (1) WO2017031104A1 (uk)
ZA (1) ZA201801789B (uk)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201317928D0 (en) * 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Molecule
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
ES2898329T3 (es) 2016-01-12 2022-03-07 Oncotracker Inc Métodos mejorados para supervisar el estado inmunitario de un sujeto
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
WO2017143069A1 (en) 2016-02-17 2017-08-24 Seattle Genetics, Inc. Bcma antibodies and use of same to treat cancer and immunological disorders
MX2018013072A (es) * 2016-05-09 2019-03-21 Squibb Bristol Myers Co Anticuerpos del ligando similar al factor de necrosis tumoral 1a (tl1a) y usos de los mismos.
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
WO2017201488A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
TWI781108B (zh) 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
KR20230035706A (ko) 2016-09-14 2023-03-14 테네오원, 인코포레이티드 Cd3 결합 항체
KR20230052309A (ko) 2016-12-21 2023-04-19 테네오바이오, 인코포레이티드 항-bcma 중쇄-단독 항체
EP3577134A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
US11535668B2 (en) 2017-02-28 2022-12-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
WO2018201051A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CN113896792A (zh) 2017-05-12 2022-01-07 哈普恩治疗公司 间皮素结合蛋白质
US11635435B2 (en) 2017-06-13 2023-04-25 Oncotracker, Inc. Diagnostic, prognostic, and monitoring methods for solid tumor cancers
CN117567624A (zh) 2017-06-20 2024-02-20 特纳奥尼股份有限公司 仅有重链的抗bcma抗体
SG11201912774RA (en) 2017-06-20 2020-01-30 Teneobio Inc Anti-bcma heavy chain-only antibodies
WO2019000223A1 (en) * 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
SG11202000499RA (en) * 2017-08-01 2020-02-27 Medimmune Llc Bcma monoclonal antibody-drug conjugate
WO2019035938A1 (en) * 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
AU2018326805B2 (en) * 2017-09-01 2023-11-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Immunogenic peptides specific to BCMA and TACI antigens for treatment of cancer
MX2020003915A (es) * 2017-10-13 2020-10-08 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas trispecificas y metodos de uso.
MX2020003856A (es) 2017-10-13 2020-08-13 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas de union a antigenos de maduracion de celulas b.
WO2019079569A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Novartis Ag COMPOSITIONS AND METHODS FOR SELECTIVE DEGRADATION OF A PROTEIN
MA49911A (fr) * 2017-11-01 2020-06-24 Juno Therapeutics Inc Anticorps et récepteurs antigéniques chimériques spécifiques de l'antigene de maturation des lymphocytes b
CA3088095A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, cd19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
JP2021509009A (ja) 2017-11-30 2021-03-18 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａターゲティングキメラ抗原受容体及びその使用
CN112218651A (zh) 2018-01-08 2021-01-12 诺华公司 用于与嵌合抗原受体疗法组合的免疫增强rna
WO2019152660A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
EP3774901A1 (en) * 2018-03-26 2021-02-17 Sutro Biopharma, Inc. Anti-bcma receptor antibodies, compositions comprising anti bcma receptor antibodies and methods of making and using anti-bcma antibodies
WO2019198051A2 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Affimed Gmbh Nk cell engaging antibody fusion constructs
JOP20200292A1 (ar) * 2018-05-16 2020-11-15 Stichting Vumc Bcma / cd3 و gprdc5d / cd3 مضادات غير محددة للاستخدام في علاج السرطان
CR20200571A (es) * 2018-06-01 2021-01-18 Novartis Ag Moléculas de únion contra bcma y usos de las mismas
BR112020025048A2 (pt) 2018-06-13 2021-04-06 Novartis Ag Receptores de antígeno quimérico de bcma e usos dos mesmos
US20210261689A1 (en) * 2018-06-14 2021-08-26 Bluebird Bio, Inc. Anti-bcma car antibodies, conjugates, and methods of use
KR102597053B1 (ko) * 2018-06-26 2023-11-02 에이비엘바이오 주식회사 항-bcma 항체 및 그 용도
AU2019297451A1 (en) 2018-07-03 2021-01-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
EP3823664A1 (en) * 2018-07-19 2021-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-bcma x anti-cd3 antibodies and uses thereof
EP3830122A1 (en) * 2018-07-31 2021-06-09 Amgen Research (Munich) GmbH Dosing regimen for bcma-cd3 bispecific antibodies
SG11202101825QA (en) 2018-08-31 2021-03-30 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3844265A2 (en) 2018-08-31 2021-07-07 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CA3114038A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
BR112021008486A2 (pt) * 2018-11-01 2021-10-26 Shandong New Time Pharmaceutical Co., Ltd Anticorpo biespecífico e seu uso
CN113412124A (zh) * 2018-12-19 2021-09-17 希望之城 Baff-r双特异性t细胞衔接子抗体
JP2022523100A (ja) * 2019-02-01 2022-04-21 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド ベランタマブマフォドチンおよび抗ｏｘ４０抗体を含むがんの併用治療ならびにその使用および方法
US20220152150A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
CA3130765A1 (en) * 2019-02-26 2020-09-03 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind bcma
WO2020191316A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
MX2021011141A (es) 2019-03-21 2022-01-19 Regeneron Pharma Combinacion de inhibidores de la via de il-4/il-13 y ablacion de celulas plasmaticas para el tratamiento de alergia.
US20220168389A1 (en) 2019-04-12 2022-06-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20220251152A1 (en) 2019-04-24 2022-08-11 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
EP3733707A1 (en) * 2019-04-30 2020-11-04 Celyad S.A. Car t-cells targeting bcma and uses thereof
AU2020270407A1 (en) * 2019-05-03 2021-12-02 Celgene Corporation Anti-BCMA antibody conjugate, compositions comprising the same, and methods of making and using the same
UY38748A (es) 2019-06-14 2021-01-29 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
CN110229232B (zh) * 2019-06-19 2020-05-19 北京智仁美博生物科技有限公司 双特异性抗体及其用途
CN112585168B (zh) * 2019-07-30 2022-04-15 上海翰森生物医药科技有限公司 抗bcma抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2021092060A1 (en) * 2019-11-05 2021-05-14 Engmab Sarl Methods of treatment
KR20220105664A (ko) 2019-11-26 2022-07-27 노파르티스 아게 Bcma 및 cd19에 결합하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
CA3160352A1 (en) * 2019-12-06 2021-06-10 Israel Lowy Methods of treating multiple myeloma with bispecific anti-bcma x anti-cd3 antibodies
WO2021132746A1 (en) * 2019-12-24 2021-07-01 Abl Bio, Inc. Anti-bcma/anti-4-1bb bispecific antibodies and uses thereof
JP2023506162A (ja) * 2019-12-10 2023-02-15 エービーエル バイオ インコーポレイテッド 抗ｂｃｍａ／抗４－１ｂｂ二重特異性抗体及びその用途
US20230030085A1 (en) * 2019-12-16 2023-02-02 2Seventy Bio, Inc. Anti-bcma car antibodies, conjugates, and methods of use
CN115175695A (zh) 2020-02-27 2022-10-11 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
MX2022010685A (es) 2020-02-27 2022-09-23 Novartis Ag Metodos de produccion de celulas que expresan receptores de antigeno quimericos.
KR20220154190A (ko) * 2020-03-13 2022-11-21 얀센 바이오테크 인코포레이티드 델타 사슬 매개 면역을 조절하기 위한 물질 및 방법
TW202144425A (zh) * 2020-04-17 2021-12-01 大陸商上海翰森生物醫藥科技有限公司 特異性抗原結合分子，其製備方法及醫藥用途
UY39191A (es) * 2020-04-29 2021-11-30 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada multiespecíficos con regiones constantes de cadena pesada modificadas
EP4186564A1 (en) 2020-04-29 2023-05-31 Teneoone, Inc. Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions
CN113637073B (zh) * 2020-05-11 2024-04-12 上海赛比曼生物科技有限公司 Bcma抗体及其制备和应用
WO2021228783A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Janssen Pharmaceutica Nv Methods for treating multiple myeloma
EP4153317A1 (en) 2020-05-19 2023-03-29 Janssen Biotech, Inc. Compositions comprising a t cell redirection therapeutic and a vla-4 adhesion pathway inhibitor
CA3185455A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Novartis Ag Zbtb32 inhibitors and uses thereof
US20230257473A1 (en) 2020-06-30 2023-08-17 Teneobio, Inc. Multi-specific antibodies binding to bcma
CN114075287B (zh) * 2020-08-18 2023-07-21 湖南远泰生物技术有限公司 人源化bcma抗体和bcma-car-t细胞
KR20230058427A (ko) 2020-08-21 2023-05-03 노파르티스 아게 Car 발현 세포의 생체내 생성을 위한 조성물 및 방법
CA3194771A1 (en) 2020-09-16 2022-03-24 Amgen Inc. Methods for administering therapeutic doses of bispecific t-cell engaging molecules for the treatment of cancer
WO2022098771A1 (en) * 2020-11-03 2022-05-12 Ab Studio Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
EP4240756A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods
WO2022135468A1 (zh) * 2020-12-23 2022-06-30 信达生物制药(苏州)有限公司 抗bcma×cd3双特异性抗体及其用途
CA3202891A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Kara Olson Compositions and methods for treating cytokine release syndrome
BR112023016121A2 (pt) 2021-02-16 2023-11-28 Janssen Pharmaceutica Nv Anticorpo triespecífico que direciona bcma, gprc5d e cd3
WO2022187710A1 (en) * 2021-03-05 2022-09-09 Atreca, Inc. Epha2 antibodies
TW202304988A (zh) 2021-03-24 2023-02-01 美商健生生物科技公司 靶向ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２０、及ＣＤ３之三特異性抗體
AU2022255506A1 (en) 2021-04-08 2023-11-09 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof
WO2022229853A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Novartis Ag Viral vector production system
KR20240004659A (ko) 2021-04-30 2024-01-11 셀진 코포레이션 감마 세크레타제 억제제(gsi)와 병용하여 항-bcma 항체-약물 접합체(adc)를 사용하는 병용 요법
TW202309522A (zh) 2021-05-11 2023-03-01 美商健生生物科技公司 用於監測復發性及／或難治性多發性骨髓瘤之治療的方法及組成物
EP4347039A1 (en) 2021-05-28 2024-04-10 Janssen Biotech, Inc. Bcma as a target for t cell redirecting antibodies in b cell lymphomas
CN115521381A (zh) * 2021-06-24 2022-12-27 益科思特(北京)医药科技发展有限公司 结合bcma和cd3的双特异性抗体及其制备方法与应用
CN115569191A (zh) * 2021-07-05 2023-01-06 山东新时代药业有限公司 一种重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体冻干制剂
AU2022330406A1 (en) 2021-08-20 2024-03-07 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
WO2023076921A1 (en) * 2021-10-27 2023-05-04 Janssen Biotech, Inc. Methods for enhanced bcma immunohistochemistry detection in human and monkey tissue
CA3237175A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Janssen Biotech, Inc. Corticosteriod reduction in treatment with anti-cd38 antibodies
TW202328209A (zh) * 2021-11-10 2023-07-16 美商健生生物科技公司 包含雙特異性ｂｃｍａ／ｃｄ３抗體之穩定配方
WO2023098846A1 (zh) * 2021-12-03 2023-06-08 江苏先声药业有限公司 抗bcma纳米抗体及其应用
US20230357446A1 (en) 2022-04-11 2023-11-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing
CN117003871A (zh) * 2022-04-28 2023-11-07 北京天广实生物技术股份有限公司 结合bcma和cd3的抗体及其用途
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations
CN117186228B (zh) * 2022-12-06 2024-03-22 成都赛恩吉诺生物科技有限公司 包含长cdr3序列的抗人bcma纳米抗体的双特异性抗体及应用

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2340857T3 (es) 1997-09-16 2010-06-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Metodo para la sintesis quimica completa y emsamblaje de genes y genomas.
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
US20020142000A1 (en) 1999-01-15 2002-10-03 Digan Mary Ellen Anti-CD3 immunotoxins and therapeutic uses therefor
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2001024812A1 (en) 1999-10-06 2001-04-12 N.V. Nutricia USE OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR β AND GROWTH FACTORS IN THE TREATMENT AND PREVENTION OF DISEASES OF THE INTESTINAL MUCOSA
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
CA2438682A1 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both bcma and taci
AU2005282700A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
DE102005028778A1 (de) 2005-06-22 2006-12-28 SUNJÜT Deutschland GmbH Mehrlagige Folie mit einer Barriere- und einer antistatischen Lage
JP5686953B2 (ja) 2005-10-11 2015-03-18 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 交差種特異的（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を含む組成物および該組成物の使用
US10155816B2 (en) 2005-11-28 2018-12-18 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2007117600A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Macrogenics, Inc. Combination therapy for treating autoimmune diseases
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
ES2695047T3 (es) 2007-04-03 2018-12-28 Amgen Research (Munich) Gmbh Dominio de unión específico entre especies
US20100183615A1 (en) 2007-04-03 2010-07-22 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
TR201816277T4 (tr) 2007-04-03 2018-11-21 Amgen Res Munich Gmbh Çapraz-tür-spesifik bağlama alanı.
AU2009239437B2 (en) 2008-04-25 2014-11-13 University Of Washington Levels of BCMA protein expression on B cells and use in diagnostic methods
CA2738565C (en) 2008-10-01 2023-10-10 Micromet Ag Cross-species-specific psmaxcd3 bispecific single chain antibody
PT2352763E (pt) 2008-10-01 2016-06-02 Amgen Res (Munich) Gmbh Anticorpos biespecíficos de cadeia única com especificidade para antigénios-alvo com elevado peso molecular
WO2010037838A2 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Micromet Ag Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
CN102307896B (zh) 2008-10-31 2016-10-12 森托科尔奥索生物科技公司 基于iii型纤连蛋白结构域的支架组合物、方法及用途
CN102596992B (zh) 2009-02-12 2015-09-09 詹森生物科技公司 基于ⅲ型纤连蛋白结构域的支架组合物、方法及用途
PL2406284T3 (pl) 2009-03-10 2017-09-29 Biogen Ma Inc. Przeciwciała anty-bcma
CA2759233C (en) 2009-04-27 2019-07-16 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
SG10201800757TA (en) 2010-04-20 2018-02-27 Genmab As Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
MX352929B (es) 2010-11-05 2017-12-13 Zymeworks Inc DISEÑO DE ANTICUERPOS HETERODIMÉRICOS ESTABLES CON MUTACIONES EN EL DOMINIO Fc.
WO2012066058A1 (en) 2010-11-16 2012-05-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
US20130101599A1 (en) 2011-04-21 2013-04-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bcma-based stratification and therapy for multiple myeloma patients
CN107936121B (zh) * 2011-05-16 2022-01-14 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
WO2013020074A2 (en) * 2011-08-03 2013-02-07 Children's Medical Center Corporation A broadly neutralizing human antibody that recognizes the receptor-binding pocket of influenza hemagglutinin
WO2013063702A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
TWI679212B (zh) * 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
PT3653049T (pt) 2012-12-14 2023-11-14 Omniab Inc Polinucleótidos que codificam anticorpos de roedores com idiótipos humanos e animais que os compreendem
EP2953972B1 (en) 2013-02-05 2020-07-08 EngMab Sàrl Method for the selection of antibodies against bcma
EP2762497A1 (en) * 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA

Also Published As

Publication number Publication date
ES2814550T3 (es) 2021-03-29
TW202307000A (zh) 2023-02-16
MY191325A (en) 2022-06-15
KR20180040671A (ko) 2018-04-20
EP3337824A1 (en) 2018-06-27
PT3337824T (pt) 2020-09-10
PL3337824T3 (pl) 2021-04-19
JP2018525005A (ja) 2018-09-06
ECSP18019568A (es) 2018-04-30
SV2018005634A (es) 2018-06-26
US20170051068A1 (en) 2017-02-23
CL2018000431A1 (es) 2018-11-23
ZA201801789B (en) 2019-10-30
TWI811023B (zh) 2023-08-01
LTPA2023509I1 (uk) 2023-03-10
DK3337824T3 (da) 2020-08-24
JP2021184721A (ja) 2021-12-09
IL257468A (en) 2018-04-30
EP3757131A1 (en) 2020-12-30
UY36859A (es) 2017-04-28
AU2016308567A1 (en) 2018-03-08
HUE050556T2 (hu) 2020-12-28
PH12018500361A1 (en) 2018-09-03
CN108350076B (zh) 2022-06-07
NI201800027A (es) 2018-08-30
SI3337824T1 (sl) 2020-10-30
JP2023027228A (ja) 2023-03-01
FIC20230012I1 (fi) 2023-02-22
AR105724A1 (es) 2017-11-01
MA53750A (fr) 2021-09-15
TWI777924B (zh) 2022-09-21
CN108350076A (zh) 2018-07-31
AU2016308567B2 (en) 2022-10-27
MX2022006650A (es) 2022-07-05
US10072088B2 (en) 2018-09-11
RS60755B1 (sr) 2020-10-30
EP3337824B1 (en) 2020-06-03
JO3799B1 (ar) 2021-01-31
NL301219I2 (nl) 2023-04-04
CY1123297T1 (el) 2021-12-31
TW202406935A (zh) 2024-02-16
HUS2300011I1 (hu) 2023-03-28
FR23C1011I1 (fr) 2023-04-14
BR112018003017A2 (pt) 2018-09-25
FR23C1012I1 (fr) 2023-04-14
JP7194240B2 (ja) 2022-12-21
IL257468B2 (en) 2023-06-01
EA201890513A1 (ru) 2018-11-30
TW201718651A (zh) 2017-06-01
CO2018001524A2 (es) 2018-07-10
MX2018002043A (es) 2018-07-06
PE20180795A1 (es) 2018-05-09
CA2995754A1 (en) 2017-02-23
IL298041A (en) 2023-01-01
WO2017031104A1 (en) 2017-02-23
NL301219I1 (uk) 2023-03-01
HRP20201375T1 (hr) 2020-11-27
LT3337824T (lt) 2020-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA127515C2 (uk) Антитіло до всма, біспецифічна антигензв'язувальна молекула, що зв'язує всма і cd3, і їх використання
CN108350082B (zh) Pd-l1抗体及其用途
KR102384845B1 (ko) 항-pd-l1 항체 및 그의 용도
KR101989134B1 (ko) 항―ｉｌ１ｒａｐ 항체 및 그의 인간 치료 용도
EP4186926A1 (en) Ccr8 antibody and application thereof
US7820174B2 (en) T cell receptors and related materials and methods of use
ES2539045T3 (es) Anticuerpos anti-KIR3D
UA126865C2 (uk) Антитіла проти ilt4 і антигензв'язувальні фрагменти
US11732044B2 (en) Anti-LAG-3 antibody and use thereof
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
KR101838310B1 (ko) 암의 치료를 위한 인간화 항-cxcr4 항체들
UA128035C2 (uk) Антитіло, що специфічно зв'язує pd-1, і спосіб його застосування
JP2008502597A (ja) Ｎｋ型ｌｄｇｌのような免疫増殖性障害を処置するための組成物および方法
KR20130028050A (ko) 유방암을 치료하는 방법
CN114206929B (zh) 一种抗tigit免疫抑制剂及应用
UA126115C2 (uk) Антитіло до gitr
EP3916016A1 (en) Novel bispecific antibody molecule and bispecific antibody simultaneously combining pd-l1 and lag-3
KR20140027051A (ko) 인간 프로스타글란딘 e2 수용체 ep4 에 대한 항체
CN113728008B (zh) 抗cd40抗体及其用途
MXPA05003440A (es) Uso de antigenos a33 y jam-it.
KR20220024211A (ko) 항-cd47 항체 및 그것의 사용
WO1999040118A1 (fr) Anticorps diriges contre le recepteur kdr humain du vegf
WO2005009363A2 (en) Treatment of pre-cancerous conditions and prevention of cancer using pcdgf-based therapies
CN111918878A (zh) 抗gitr抗体及其用途
EP4137154A1 (en) Therapeutic treatment for t-cell acute lymphoblastic leukemias using a monoclonal antibody against the pre-t cell receptor