UA126115C2 - Антитіло до gitr - Google Patents

Антитіло до gitr Download PDF

Info

Publication number
UA126115C2
UA126115C2 UAA201809891A UAA201809891A UA126115C2 UA 126115 C2 UA126115 C2 UA 126115C2 UA A201809891 A UAA201809891 A UA A201809891A UA A201809891 A UAA201809891 A UA A201809891A UA 126115 C2 UA126115 C2 UA 126115C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
antigen
shi
antibodies
cells
Prior art date
Application number
UAA201809891A
Other languages
English (en)
Inventor
Кам Голланд
Джон Кіхо
Джон Кихо
Лінда Снайдер
Линда Снайдер
Алехандро Сепульведа
Даніель Вільяреаль
Даниель Вильяреаль
Original Assignee
Янссен Байотек, Інк.
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек, Інк., Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Інк.
Publication of UA126115C2 publication Critical patent/UA126115C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

Винахід стосується антитіла, яке специфічно зв'язується з GITR людини. Також винахід стосується полінуклеотиду, вектора, клітини-хазяїна, способу одержання антитіла, фармацевтичної композиції та набору.

Description

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
У цій заявці заявлено про встановлення переваги щодо попередньої заявки США, серійний номер 62/305,270, поданої 8 березня 2016 р., і попередньої заявки США, серійний номер 62/407,106, поданої 12 жовтня 2016 р. Повний зміст вищезгаданих заявок в повному обсязі включено в цей документ шляхом посилання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Ця заявка містить перелік послідовностей, який було подано в електронному вигляді у форматі АЗСІЇ, і який у повному обсязі включено в цей документ шляхом посилання. Вказана копія АЗСІЇ, створена 21 лютого 2017 р., має назву УВІБО82О5МР І Хі їі має розмір 92 231 байтів.
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД
Винахід, що пропонується в цьому документі, стосується моноклональних антитіл, які специфічно зв'язують рецептор фактора некрозу пухлини, який індукується глюкокортикоїдами (СІТЕ), і способів отримання й застосування описаних антитіл.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
ТМЕВ-споріднений білок, що індукується глюкокортикоїдами (СІТЕК; а також АІТЕ, ТМЕК5Е18 або СО357), представник надродини ТМЕК, експресується у багатьох компонентах вродженої й адаптивної імунної системи та стимулює як набутий, так і вроджений імунітет (Мосепіїпі с еї аї., (1994) РМАБ 94: 6216-6221; Напарисні 5 еї аї., (2006) Віоой 107:3617-3623; Мосепійпі с 8
Віссагаї С (2005) Єшиг У Іттипої 35: 1016-1022; Мосепіїпі С єї аї., (2007) Єшиг У Іттипої 37: 1165- 1169). Він експресується в декількох клітинах і тканинах, включно з Т-, В-, дендритними (ДК) клітинами й клітинами-натуральними кілерами (НК), і активується своїм лігандом, СІТК-Ї., що переважно експресується на антигенпрезентувальних клітинах (АПК), на ендотеліальних клітинах, а також на пухлинних клітинах.
Система СІТК-СІТКІЇ приймає участь у розвитку аутоіїмунних/запальних відповідей і посилює відповідь на інфекції й пухлини. Наприклад, введення тваринам гібридного білка СІТЕ-
Ес полегшує аутоімунні/запальні захворювання, а ініціювання СІТК є ефективним у лікуванні вірусних, бактеріальних і паразитарних інфекцій, а також у посиленні імунної відповіді проти пухлин (Мосепіїйпі о еї аї!., (2012) Вг ) Рпагтасої 165: 2089-99). Ці ефекти спричинені декількома
Зо одночасними механізмами, які включають: співактивацію ефекторних Т-клітин, інгібування регуляторних Т-клітин (Тгед), модуляцію функції НК і дендритних клітин, активацію макрофагів і регуляцію процесу екстравазації. Мембранна експресія СІТК посилюється після активації Т- клітин (Напарвиспі 5 еї аї, (2006) зирга; Мосепіїпі С 4. Віссагаї С 5ирга). Її ініціювання співактивує ефекторні Т-лімфоцити (МеНидії 25 еї аї, (2002) Ітптипйцу 16: 311-323; ЗПіті?и У еї аї, (2002) Маї
Іттипої 3: 135-142; Вопсенеїї 5 евї аї, (2004) Єик ) Іттипої 34: 613-622; Топе М еї аї, (2003) РМА5 100: 15059-15064). Активація СІТК підвищує резистентність до пухлин і вірусних інфекцій, вона залучена в аутоіїмунні/запальні процеси й регулює екстравазацію лейкоцитів (Мосепііпі с 85
Віссагаї С (2005) вирга; Сиг2остєа 5 еї аї, (2004) ) ГеиКос Віої 76: 933-940; 5пемасі! ЕМ 8 зерпеп5 СІ (2006) Маї Вем Іттипої! 6: 613-618; Си2лостєа 5 6вї аї, (2006) У Іттипої! 177: 631- 641; би27оства 5 ві а), (2007) ЕАЗЕВ У 21: 117-129).
СІТК людини експресується на дуже низьких рівнях у периферичних (неактивованих) Т- клітинах. Після активації Т-клітин СІТК потужно стимулюється протягом декількох діб як у клітинах СО4», так і в клітинах СО8: (Кмоп В еї аї, (1999) у Віої Спет 274: 6056-6061; Ситпеу АГ. еї а), (1999) Си Віо! 9: 215-218; Вопеспейі 5 евї аї, (2004) вирга; Зпіті?и . єї аї, (2002) зирга; ді НВ еї аї, (2004) зирга; Вопспейі 5 евї аї, (2002) Віоса 100: 350-352; 1 7 еї аї, (2003) У Ашоіїттип 21: 83-92), причому клітини СО4- мають вищу експресію СІТК, ніж клітини СО8- (Кобег У єї аї, (2008)
Ешг У Ітітипої 38(10): 2678-88; Віапспіпі Я еї аї, (2011) Єик У Іттипої 41(8): 2269-78).
Роль СІТК людини у модуляції імунних відповідей свідчить про те, що він може бути придатною мішенню для терапії на основі антитіл проти захворювань, таких як рак. Антитіла до
СІТК описані (наприклад, у УМО200610502, УМО2011028683, УМО2015031667, УМО20150353637,
УМО2015187835, ММО2015184099, 59255151 і 59255152), але залишається потреба в нових агентах і способах модуляції активності СІТЕ. проти захворювань, таких як рак.
СУТЬ ВИНАХОДУ
У цьому документі пропонуються антитіла, які специфічно зв'язують СІТК, і їхні антигензв'язувальні фрагменти. Також описано споріднені полінуклеотиди, здатні кодувати запропоновані (сІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти, клітини, які експресують запропоновані антитіла й антигензв'язувальні фрагменти, а також пов'язані вектори й мічені з можливістю виявлення антитіла й антигензв'язувальні фрагменти. Крім того, описано способи використання запропонованих антитіл і антигензв'язувальних фрагментів. бо Наприклад, з урахуванням тієї ролі, яку відіграє СІТК у модуляції імунної відповіді, ІТК-
специфічні антитіла можна використовувати в лікуванні різних захворювань або порушень, пов'язаних із СІТЕ, для лікування яких є бажаною модуляція імунної відповіді. Наприклад, СІТК- специфічні антитіла можна використовувати для різних імунотерапевтичних застосувань, таких як лікування різних видів раку.
СІТВА-специфічні антитіла
У цьому документі описано виділені антитіла й антигензв'язувальні фрагменти, специфічні до СІТК. У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з СІТК людини. У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з СІТК людини і СІТК яванського макака. У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з епітопом, який включає в себе один або більше залишків із позаклітинного домену (ЕСО) СІТЕ, як визначено у ЗЕО ІЮ МО:59. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТЕ. з афінністю зв'язування 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСзо 67 нг/мл або менше.
У таблиці 1 наведено короткий перелік прикладів деяких СІТК-специфічних антитіл, описаних у цьому документі.
Таблиця 1
Послідовності СОР тАБб, створених проти СІТЕ людини (ЗЕО ІЮ МО)
Ідентифіка Но- І б- сим (1 Т (5 12 28 32 РІ.Т (35 сСЕТЕ55 ІЗОВИСО ОБМММЕ рд5 оОагмМА сим (1 К (6 14 30 З РІ Т (37
ОЗУА (З 7 15 28 32 РІ.Т (35
Твав190 ІБМА (З 7 16 28 32 РІ.Т (35
УМ (4 т (8 17 28 32 РІ.Т (35
УМ (4 т (9 18 28 32 РІ.Т (35
УМ (4 т (10 19 28 32 РІ.Т (35
ОЗУА (З 7 20 З 34 РІ-Т (38
ОЗУА (З 11 21 З 34 РІ-Т (38
ОМА (З 7 22 28 32 РІТ (35
ОЗУА (З 7 23 28 32 РІ.Т (35
ОЗУА (З 7 24 28 32 РІ.Т (35
ОЗУА (З 7 25 28 32 РІ.Т (35 твав16о твав191 сСЕТЕ5 ІБавасе АКОРУМОБЕОУ Оо5БУ5БУ рд5 ООАБММУ твавт1т91. ММ (27) (5) (26) (28) (32) РІ Т (35)
СІ
ОМА (З 11 21 28 32 РІ.Т (35
У деяких варіантах втілення запропоновано (ІТК-специфічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить важкий ланцюг, який містить СОКІ, СОК2 ії СОКЗ будь-якого з антитіл, представлених у таблиці 1, і легкий ланцюг, який містить СОМК1, СОК2 і
СОМЗ будь-якого з антитіл, представлених у таблиці 1.
У людей клас до ділиться на чотири ізотипи: Ідс1, Ідс2, дез і Іу4. Вони мають більше ніж 95595 гомології амінокислотних послідовностей Ес-областей, але демонструють суттєві відмінності складу амінокислот і структури шарнірної ділянки. Ес-область опосередковує ефекторні функції, такі як антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АЗКЦ) Фї комплементзалежна цитотоксичність (КЗЦ). Під час АЗКЦ і антитілозалежного клітинного фагоцитозу (АЗКФ) Ес-область антитіла зв'язується з Ес-рецепторами (Бсо9) на поверхні імунних ефекторних клітин, таких як натуральні кілери й макрофаги, що призводить до лізису або фагоцитозу клітин-мішеней. Під час КЗЦ антитіла знищують клітини-мішені, запускаючи на клітинній поверхні каскад комплементу. Антитіла, описані в цьому документі, включають антитіла з описаними характеристиками варіабельних доменів у комбінації з будь-яким з ізотипів ЇдД, включаючи модифіковані варіанти, у яких послідовність Ес була модифікована для виконання різних ефекторних функцій.
У деяких варіантах втілення антитіла містять СОК антитіл, представлених у таблиці 1 вище.
У деяких варіантах втілення описані антитіла здатні зв'язуватися з СІТК із константою дисоціації 30 НМ або менше, як визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ППР). У деяких варіантах втілення описані антитіла здатні індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-КВ люциферази. У деяких варіантах втілення описані антитіла здатні індукувати АЗКЦ іп міїго зі значенням ЕСзхо 67 нг/мл або менше.
Крім описаних (СІТК-специфічних антитіл і антигензв'язувальних фрагментів, також пропонуються полінуклеотидні послідовності, здатні кодувати описані антитіла й антигензв'язувальні фрагменти. У цьому винаході пропонуються вектори, які містять описані полінуклеотиди, а також клітини, які експресують СІТК-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, що пропонуються в цьому документі. Також описано клітини, здатні експресувати описані вектори. Ці клітини можуть бути клітинами ссавців (такими як клітини 293Е, клітини СНО), клітинами комах (такими як клітини 517), дріжджовими клітинами, рослинними клітинами або клітинами бактерій (таких як Е. соїї). Також пропонується спосіб отримання описаних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів.
Способи використання сІТК-специфічних антитіл
Також розкрито способи використання описаних СІТК-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів. Конкретні антитіла для використання в способах, описаних у цьому розділі, включають антитіла з набором СОК, описаним для антитіл, наведених у таблиці 1. Наприклад, ключова роль, яку відіграє СІТК в імунній відповіді, робить його привабливою мішенню для імунотерапії, включно з індукуванням або посиленням імунної відповіді проти бажаних пухлинних антигенів або патогенних антигенів (наприклад, вірусів й інших патогенних організмів). У зв'язку з цим сІТК-специфічні антитіла можна використовувати для лікування різних видів раку й інфекційного захворювання.
Як вказано вище, активація СІТК надсилає співактивувальний сигнал Т-клітинам СО4ч5 і сов і запобігає супресії імунної відповіді регуляторними Т-клітинами. Таким чином, в одному варіанті втілення (СІТК-специфічне антитіло вводять для інгібування супресії активності ефекторної Т-клітини регуляторними Т-клітинами. Таке інгібування можна аналізувати з використанням різних способів, відомих у цій галузі, включаючи, наприклад, моніторинг проліферації Т-клітин, експресії відомих маркерів активації або секреції цитокінів. В іншому варіанті втілення СІТК-специфічне антитіло вводять суб'єктові для зменшення рівня регуляторних Т-клітин, наприклад, рівня пухлинних регуляторних Т-клітин. В іншому варіанті втілення активність ефекторних Т-клітин індукується або посилюється шляхом введення СІТК- специфічного антитіла, як пропонується в цьому документі. Специфічні аналізи для кожного з цих способів наведено у ПРИКЛАДАХ.
Набори СІТК-специфічних антитіл
У цьому документі описано набори, які включають описані СІТК-специфічні антитіла або їхні антигензв'язувальні фрагменти. Описані набори можна використовувати для здійснення способів використання СІТК-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, які пропонуються в цьому винаході, або інших способів, відомих фахівцям у цій галузі. У деяких варіантах втілення описані набори можуть містити антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі, і реагенти для використання у виявленні в біологічному зразку 60 наявності СІТЕ. Відповідно, описані набори можуть включати одне або більше антитіл або їхніх антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі, і посудину, у якій міститься антитіло або фрагмент, коли його не використовують, інструкції з використання антитіла або фрагмента, антитіло або фрагмент, прикріплений до твердого носія, і/або мічені з можливістю виявлення форми антитіла або фрагмента, як описано в цьому документі.
Короткий опис графічних зображень
Фіг Л1А-1С0. Агоністична активність, що демонструється тАр до СІТК із традиційної скринінгової панелі. Наведені дані являють собою люмінесцентний сигнал в аналізі Се-Тег Спо від клітин, які обробляли вказаним реагентом після трансфекції або лише репортерним геном
МЕ-КВ люциферази (І ис), або як експресійним вектором СІТЕ, так і репортерним геном МЕ-КВ люциферази (СІТК-І ис). Антитіла, які продукували сигнал, що перевищував сигнал, отриманий у разі обробки фосфатно-сольовим буферним розчином (ФБР), попередньо відносили до агоністів.
Фіг. 2А-2Е. Агоністична активність, що демонструється тАб до СІТК з панелі на основі секвенування нового покоління. Наведені дані являють собою люмінесцентний сигнал в аналізі
Се-Тйег сСіо від клітин, які обробляли вказаним реагентом після трансфекції або лише репортерним геном МЕ-КВ люциферази, або як експресійним вектором СІТЕ, так і репортерним геном МЕ-КВ люциферази.
Фіг. ЗА-30. Вплив лігування антитіла до СІТК на активність МЕ-кВ. Наведені результати являють собою репрезентативні значення активності ЗЕАР як показника активації МЕ-кВ у клітинах НЕК-Віне МЕ-кВ, стабільно трансфікованих СІТК. Клітини обробляли різними концентраціями антитіла до СІТК за відсутності (ЗА, ЗВ) або за присутності (ЗС, 30) 25 нг/мл розчинного ліганду СІТК. Як контролі без антитіла та з ізотипними антитілами використовували середовища й СМТОЗ3930.
Фіг. 4А і 4В. Вплив антитіл до СІТК на відповіді Т-клітин пам'яті на СММ і ТТ. Серореактивні мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК) піддавали імпульсній дії антигена СММ і ТТ за відсутності або за присутності антитіл до СІТЕ, антитіла ізотипного контролю СМТО3930 або без антитіла. Супернатант збирали й визначали присутність у ньому ІЕМУу.
Фіг. 5А і 58. Протипухлинна активність у разі обробки єдиним агентом у вигляді сурогатного антитіла до СІТК (ОТА-1) у сингенній моделі карциноми товстого кишечнику МСЗ38. ОТА-1 або
Зо ізотипний Іде2Б щура вводили тваринам у дозі 200 мкг/миша в дні, позначені чорними стрілками (п-10 на групу) починаючи з моменту, коли об'єми пухлин досягали 100 мм3. Введення ОТА-1 призводило до повної регресії пухлини у 5 з 10 тварин.
Фіг. бА-60. Комбінація сурогатного антитіла до СІТА (ОТА-1) і антитіла до РО-1 (ВМР1-14) призводить до синергічної протипухлинної активності в сингенній моделі карциноми товстого кишечнику МСОСЗ38. Ізотипний Ідсе2Б5 щура (6бА), ОТА-1 (68) або ЮОТА-1-48МРІ1-14 (6С) вводили тваринам у дозі 100 мкг/антитілолмиша в дні, позначені чорними стрілками (п-10 на групу), починаючи з моменту, коли об'єми пухлин досягали 200 мм3. Комбіноване лікування призводило до регресії пухлини у 5 з 10 тварин.
Фіг. 7А-70. Комбінація сурогатного антитіла до СІТК (ОТА-1) і антитіла до СТІ А-4 (909) призводить до синергічної протипухлинної активності в сингенній моделі карциноми товстого кишечнику МСОЗ8. Ізотипний ЇдД25 щура (7А), ОТА-1 (78) або ОТА-1-909 (7С) вводили тваринам у дозі 100 мкг/антитіло/миша в дні, позначені чорними стрілками (п-10 на групу), починаючи з моменту, коли об'єми пухлин досягали 200 мм3. Комбіноване лікування призводило до регресії пухлини у З із 10 тварин.
Фіг. вВА-80. Комбінація сурогатного антитіла до СІТК (ОТА-1) і антитіла до ОХ-40 (ОХ-86) є кращою за монотерапію антитілом ОХ-86 у сингенній моделі карциноми товстого кишечнику
МСЗ38. Три ін'єкції ізотипного Їде25 щура (8А) або ОТА-1 (88) вводили тваринам у дозі 100 мкг/антитіло/умиша в дні, позначені чорними стрілками (п-10 на групу) починаючи з моменту, коли об'єми пухлин досягали 200 мм3. Послідовність введення ОТА-1 (д 1) з наступним ОХ-86 (д 5, д 9, Фіг. 70) була кращою, ніж введення ізотипного антитіла з наступним ОХ-86 (70).
Фіг. 9А-9Е. Комбінована терапія антитілом до СІТК/антитілом до РО-1 разом із вакцинацією призводила до форсування росту, функціонування й диференціації антигенспецифічних Т- клітин СО8:. Інтактних мишей Вб, що не мали пухлин (п-5/група), імунізували один раз з використанням пептиду ОМАг57-64 (день 0), разом із застосуванням монотерапії або комбінованої терапії: 200 мкг антитіла до СІТЕ або контрольного (До щура надніб, Зб, і 200 мкг антитіла до РО-1 на дні 3, 6, 9 і 12. Бажані імунні відповіді відстежували на день 7 (д 7)і день 14 (д 14) у крові й/або селезінці. А -- аналіз ЕІ ІЗрої ІЕМу-секретуючих Т-клітин селезінок мишей, стимульованих ОМАг257-264-СПецифічним пептидом (д 7). В -- стовпчасті діаграми ілюструють поліфункціональні субпопуляції одно-, подвійно- і потрійнопозитивних Т-клітин СОВ8", 60 які вивільняють ефекторні цитокіни ІЕМу, ТМЕа і ІЇ-2 на стимуляцію ОМА»57-2в4 у селезінці (д 7). С
- профіль цитолітичного фенотипу (д 7). ОО - ОМА-специфічні Т-клітини СО8: у периферичній крові на д 7. Точкові діаграми, репрезентативні для 5 мишей, показані на Ю. Е - ОМА- специфічні Т-клітини СО8" у периферичній крові на д 14. Е-Е -- диференціація Т-клітин пам'яті
СОр8", специфічних до тетрамера ОМА, у крові пролікованих мишей на д 14 після імунізації.
Кожен з описаних вище експериментів повторювали принаймні двічі з отриманням схожих результатів. "7 Р « 0,05; Р ок 001; и Р « 0,001. Планки похибок вказують на стандартну похибку середнього (СПС). ЕМ: ефекторні клітини пам'яті; СМ: центральні клітини пам'яті.
Фіг. 1Т0А-100. Комбінована терапія іп мімо з вакцинацією стимулює відторгнення пухлини
В16-ОМА у мишей. А -- встановлені пухлини В16-ОМА (- 30-40 ммУ) лікували вказаними видами лікування. В -- відстежували з плином часу індивідуальні відповіді пухлин, проводили вимірювання розміру пухлин у групі (середнє ж/- СПС, С) і виживання (0). Графік являє собою середній об'єм пухлини на групу досліджуваних тварин, а на схемі вказано кількість тварин без пухлин/загальну кількість (С). Графіки являють собою репрезентативні результати, отримані в 1 із З незалежних експериментів. "Р .«0,05; РО рР«О,001.
Фіг. 11А-110. Комбінована терапія Мах/антитілом до сСІТК/антитілом до РО-1 діє синергічно з посиленням частоти й функції індукованих вакциною антигенспецифічних відповідей ТІЇ СО8».
Наведено підсумкові дані для внутрішньоклітинного забарвлення на цитокіни для ІЕМу, ТМЕа,
ІМЕуУ/ТМЕса ії СО107алеМу у ТІ. СО8: після обмеженої (СО8) стимуляції пептидом ОМА»257-264 (А-В) або стимуляції з використанням РМАЛОМ (0) через 12-15 днів після імплантації пухлини. С -- стовпчаста діаграма демонструє відсоток обмежених Н2-Ке-5ІМЕЕКІ. ТІЇ. СО8»7, специфічних до тетрамера ОМА, від загальної кількості клітин СО45: у пухлині. Експерименти повторювали принаймні двічі з отриманням схожих результатів. "Р «0,05; Р 001 Р « 0,001. Планки похибок відображають СПС для п--4-5/група.
Фіг. 12А-120. Комбінована терапія посилює інфільтрацію Т-клітин СО8: і знижує частоту
Тгед у пухлинах ВІ6-ОМА. А -- відсоток Тгед, виявлених у селезінках мишей, що не мають пухлин, показаних на Фіг. 98-О, когорти мишей, що мали пухлини В1І6-ОМА, яким вводили комбінації Мах, антитіла до СІТК і/або РО-1 (як на Фіг. 10). В -- ТІЇ СО8: як відсоток від загальної кількості клітин СО45: через 15 днів після імплантації пухлини. С-О0 -- на репрезентативних потокових точкових діаграмах й підсумкових даних наведено відсоток Тгед
Зо від ТІ- СО45: і співвідношення ефекторних Т-клітин СОВ8: і Тгед у пухлинах пролікованих мишей через 15 днів після імплантації пухлини. Статистичні аналізи порівнюються з Мах/антитілом до
СІТК/антитілом до РО-1. Результати є репрезентативними даними 2-3 незалежних експериментів з використанням 4-5 мишей на групу. "Р «0,05; Р «0001; Р « 0,001. Планки похибок вказують на СПС.
Фіг. 13А-130. Ефективність Мах/антитіла до СІТК/антитіла до РО-1 залежить від Т-клітин
СО8:, а лікування індукує довготривалу пам'ять. А. Схема дозування для досліджень терапевтичного виснаження. Мишам Вб (п-10/група) вводили підшкірно (п/ш) 4 х 105 пухлинних клітин В16-ОМА, і коли діаметри пухлин досягали «- 40 мм", пригнічували клітини СО8, клітини
СО4 або клітини НК шляхом додавання 200 мкг кожного тАБ/миша на дні 7, 8, 9, 11, 14, 17; день 8 - це день початку лікування з введенням Мах/антитіла до СІТК/антитіла до РО-1 або Ід.
Дозу вакцини вводили на день 8; антитіло до ІТК -- на дні 8 і 14; антитіло до РО-1 вводили на дні 10, 13, 16 і 19 після імплантації пухлини. В -- спостерігали за об'ємом пухлини двічі на тиждень (середнє я/- СПО). С-О0 - мишам без пухлин (п-6-9 на групу), після комбінованого лікування повторно вводили клітини В16-ОМА (2 х 105; С) або В16.Е10 (1,5 х 105; О) у той самий бік через шість місяців після первинного відторгнення пухлини. Для контролю з повторним навантаженням використовували мишей, підібраних за віком. Наведені результати відображають результати 2-3 незалежних експериментів.
Фіг. 14А-140. Комбінована терапія Мах/антитілом до сІТК/антитілом до РО-1 збільшує кількість пухлиноспецифічних ТІ СО8" і індукує очищення від пухлини, опосередковане ефекторними Т-клітинами пам'яті СО8КІ ВАСІ. А -- на репрезентативних діаграмах з розсіяними точками показано відсотки Н2-К»-5ІИМЕЕКІ -обмежених ОМА-специфічних Т-клітин
СО8», (В) відсотки ТІ СО8-КІ Ват: і (С) відсотки тетрамер-зв'язувальних ТІЇ СО8-КІ Ват: через 15 днів після інокуляції пухлини (4-5 мишей/група). Ю -- мишам Вб (10 на групу) вводили шляхом п/ш ін'єкції 4 х 105 пухлинних клітин В16-ОМА, і на день 8, коли діаметр пухлин досягав - 50 мм3, починали терапію, як показано на Фіг. 13. 200 мкг тАБб акі КОї1 вводили на дні 7, 8, 9, 11, 14, 17, 20; причому день 8 був днем початку лікування. Об'єм пухлини і виживання відстежували двічі на тиждень. На загальних графіках показано середнє ч/- СПС для принаймні двох незалежних експериментів. "Р«0,05; РО рР«О001.
Фіг. 15А і 158. Подвійна комбінація антитіло до сСІТК/антитіло до РО-1 призводить до бо синергізму з вакциною на основі пептиду ТКРА в індукуванні регресії встановлених пухлин В16-
ОМА. Мишам Вб (10 на групу) вводили шляхом п/ш ін'єкції 4 х 105 пухлинних клітин В16-ОМА; коли пухлини досягали х- 50 ммУ, розпочинали лікування. А -- схематична ілюстрація схеми введення вакцини ТКРА2 окремо або у комбінації з терапією антитілом до СІТК/антитілом до РО- 1 (або відповідними ізотипними Ід) мишам з пухлиною В16-ОМА. В -- ріст пухлин відстежували з плином часу в групах (середнє я/- СПС) і в окремих особин. Експерименти проводили принаймні двічі з отриманням схожих результатів. "Р « 0,01
Фіг. 16. Виснаження СО257 комбінованою терапією Мах/антитілом до СІТК/антитілом до РО- 1 не анулює і не посилює пухлинну ефективність. Комбіноване лікування й введення дози 200 мкг антитіла до СО25 виконували, як показано на фіг. БА. Спостерігали за об'ємом пухлини двічі на тиждень (на графік нанесено середнє яж/- СПС). Результати є репрезентативними даними двох незалежних експериментів з використанням 10 мишей на групу.
Фіг 17А-170. Антитіло до КІКОС1 виснажує цільову популяцію КІ КОС1-0508:. А-В -- інтактним мишам, що не мали пухлини, вводили дозу комбінації Мах/антитіло до сСІТК/антитіло до РО-1 і ізотип, як показано на Фіг. 9. Мишам, яких лікували антитілом до КІ КО1, вводили 100 мкг тАб до КІКО на дні 2, 4 і 6 після вакцинації. Мишей умертвляли на день 7 після вакцинації і брали лімфоцити як з крові, так і з селезінок, для оцінки експресії СО8, КІКО1 і С044. А -- відсоток Т-клітин СО8-- у селезінці після лікування антитілом до КІ КО-1. В -- репрезентативні потокові діаграми, які демонструють відсоток КІ КОС1-008: у крові й селезінці, і (С) -- скомпільовані дані щодо частоти й/або загальної кількості клітин СО44-СО8-КІ ВИ: і
ТегСбОр8 КІ ВОИ1: (панелі ліворуч і праворуч, відповідно) в крові й селезінці. Результати є репрезентативними даними 2 незалежних експериментів з використанням 5 мишей на групу. 7" Р «005; Рак 001; Р «0,001. Планки похибок вказують на СПС.
На Фіг. 18А ї 188 показано ріст пухлин (Фіг. 12А) і виживання мишей (п-10 на групу) (Фіг. 128), яким імплантували клітини В16-ОМА (400 000), з наступним введенням на день 7 після імплантації або тАБб 5Н4 до СО122 (яке вводять 5 разів з інтервалами 2-3 дні), або комплексу пептидної вакцини (1 доза), або комбінації, як вказано.
Фіг. 19А-190. Ілюструє частоту ТІЇ, зібраних на день 16 після імплантації В16-ОМА (400 000 клітин) і відсоток 6-МО5Св (СО116 убси убсу, що інфільтрують пухлину, (Фіг. 13А), Т-клітин
СО8ЧЕМУТМЕа:, що секретують цитокіни, після стимуляції ех-мімо пептидом ОМАргв7-2в4 (Фіг.
Зо 138), Н2-К»-5ИМЕЕКІ. ОМА-специфічними ТІЇ. СО8: (Фіг. 13С), і Ттед (СО4-СО44АГОХРЗСО257), що інфільтрують пухлину, (Фіг. 130). асор122: моноклональне антитіло до СО122. я Раб ОБ р «0,01; Р-0,001; и Р « 0,0001.
Фіг. 20А-20О. Ілюструє, що терапія антитілом до СО122 посилює індуковані вакциною антигенспецифічні відповіді Т-клітин СО8- на периферії у мишей, що не мають пухлин: відсоток
Н2г-Ке5БИМЕЕКІ -обмежених ОМА-специфічних Т-клітин СО8: (Фіг. З1А); відсоток популяції Т- клітин СО8-СО122: після лікування антитілом до СО122 в крові у мишей, що не мають пухлин (Фіг. 318), відсоток популяції Т-клітин СО8-С0122-- після терапевтичного лікування у пухлинах мишей з пухлинами (Фіг. 31С). або122: моноклональне антитіло до СО122; Мах: вакцина. " Р « 005; Р «001; Р «0001; р о « 0,0001. Планки похибок вказують на СПО.
Фіг. 21А і 218. Ілюструє виживання мишей, яким імплантовано клітини В16-ОМА (400 000), з наступним лікуванням антитілом до СО122 у комбінації з пептгидною вакциною (3 дози) (Фіг.
З2А). Мишей, яких лікували вакциною/антитілом до СО122, показаних на Фіг. З2А, які вижили без пухлини, повторно піддавали впливу клітин В16-ОМА; на діаграмі наведено відсоток мишей, у яких спостерігалося відторгнення другого навантаження пухлинами (Фіг. 32В).
Фіг. 22А і 228. Ілюструє ріст пухлин і виживання інтактних мишей (п-10 на групу), яким імплантували клітини В16-ОМА (400 000), з наступним лікуванням на день 4 після імплантації або антитілом до СО122, або антитілом до СІТК, або комбінацією антитіла СО122 і антитіла до
СІТЕК, яквказано. "Ре; РО ОТ Р «0 О01 их р «00001.
Фіг. 23. Різниця у рівнях дейтерування для кожного сегмента СІТК-СЕО за присутності або за відсутності ТКОВ191.СІ Є. Кожен блок представляє пептиди, які можна нанести на мапу та ступінь обміну порівняно з контролем через 60, 600, 3600 і 14 400 с. Сірий колір: захист від дейтерію відсутній; темно-сірий колір: сильний захист після зв'язування з тАб; світло-сірий колір: помірний захист після зв'язування зв'язування з тАрб.
Фіг. 24. Просторова модель мономера ЕСО СІТЕ, у якій епітоп ТКОВ191 позначено чорним кольором.
Фіг. 25А і 258. Активність АЗКЦ для ТКОВ191.СІ Е на первинних Т-клітинах СО4: і СО8-, які перебувають у стані спокою, і на активованих. Оцінювали ТЕСВ191.СІ Е ї СМТОЗ3930 (антитіло ізотипного контролю) на активність АЗКЦ щодо Т-клітин СО4-, які перебувають у стані спокою (А, ліва панель), і Т-клітин СО8:", які перебувають у стані спокою (В, права панель), або бо активованих Т-клітин СО4- (А, ліва панель) і Т-клітин СО8: (В, права панель). Відсоток специфічного лізису показано як середнє - стандартна похибка середнього (СПО).
Співвідношення Е: Т вказані в підпису до фігури. М-З3 повторення експерименту, п-12 на точку даних. (АБ) - концентрація антитіла.
Фіг. 26. Активність АЗКЦ ТКОВ191.СІ Е щодо клітинної лінії У9УМ-3. Оцінювали ТКОВ191.СІ Е і СМТО3930 (антитіло ізотипного контролю) на активність АЗКЦ з використанням клітин-мішеней
У0М-3 і ефекторних клітин МК-92 158 М//. Відсоток специфічного лізису показано як середнє ж стандартна похибка середнього (СПС). М-6 повторення експерименту, п-12-24 на точку даних.
ІАБІ - концентрація антитіла.
Фіг. 27. Тестували ТКОВ191.СІ Е ї антитіло ізотипного контролю СМТОЗ3930 на активність
АЗКЦ на клітинах-мішенях 9УОМ-3 і диференційованих іп міо Тео як клітинах-мішенях, з використанням ефекторних клітин МК-92 158 М/Л/. Відсоток специфічного лізису показано як середнє х стандартна похибка середнього (СПО). М-З3 повторення експерименту, п-12 на точку даних. ІАБІ) - концентрація антитіла, ЕСво - половина максимальної ефективної концентрації,
Втах - максимальний лізис.
Фіг. 28А їі 288. Активність АЗКЦ у ТКОВ191.СІ ЕЕ з використанням ефекторних клітин з високо- і низькоафінним поліморфізмами ЕсукІША. Тестували ТКОВ191.СІЕ ї СМТО3930 на активність АЗКЦ на клітинах-мішенях 9УМ-3 з використанням ефекторних клітин МК-92, які експресують (А) високоафінний варіант 158У// або (В) низькоафінний варіант 158Б/Р. Відсоток специфічного лізису показано як середнє ж стандартна похибка середнього (СПС). М-З3 повторення експерименту, п--12 на точку даних. ІАБІ - концентрація антитіла, ЕСво - половина максимальної ефективної концентрації, Втах - максимальний лізис.
Фіг. 29. Введення ЮОТА-14ЕОК4.5 у моделі МС38, розпочате за об'ємів пухлин 100 мму, призводить до більш повної регресії пухлини.
Фіг. 30. Введення ОЮОТА-14ЕОК4.5 у моделі МС38, розпочате за об'ємів пухлин 230 мму, призводить до більш повної регресії пухлини.
Фіг. 31. Введення ЮТА-14ОХ86 у моделі МС38, розпочате за об'ємів пухлин 100 ммуУ, призводить до більш повної регресії пухлини.
Фіг. 32. Введення ОТА-1-4А8МРІ1-14 у моделі МСЗ8, розпочате за об'ємів пухлин 100 мм3у, призводить до більш повної регресії пухлини.
Зо Детальний опис ілюстративних варіантів втілення
Визначення
В описі й формулі винаходу використовуються різні терміни, які стосуються аспектів опису.
Такі терміни мають своє звичайне значення в цій галузі, якщо не вказано інше. Інші спеціально визначені терміни необхідно інтерпретувати відповідно до визначень, що пропонуються в цьому документі.
У цьому описі й у формулі винаходу форми однини включають у себе форми множини, крім випадків, коли контекст чітко вимагає іншого тлумачення. Таким чином, наприклад, посилання на "клітину" включає в себе комбінацію з двох або більше клітин тощо.
У контексті цього документа термін "приблизно", який використовується в разі посилання на вимірюване значення, таке як кількість, тривалість часу тощо, призначено для охоплення коливань дож10 95 від конкретно вказаного значення, оскільки такі коливання є придатними для реалізації описаних способів. Якщо не вказано інше, усі числа, які виражають кількості інгредієнтів, властивості, такі як молекулярна маса, умови реакції тощо, які використовуються в описі й у формулі винаходу, необхідно розуміти як модифіковані в усіх випадках терміном "приблизно". Відповідно, якщо не вказано інше, числові параметри, наведені в описі й формулі винаходу, є наближеними значеннями, які можуть змінюватися залежно від бажаних властивостей, які бажано досягти за допомогою цього винаходу. В усякому разі, без спроби обмежити застосування доктрини еквівалентів об'ємом формули винаходу, кожен числовий параметр повинен розглядатися принаймні в світлі кількості зазначених значущих цифр із застосуванням звичайних методів округлення.
Незважаючи на те що числові діапазони й параметри, що відображають широкий обсяг винаходу, є приблизними, числові значення, наведені в конкретних прикладах, зазначаються якомога точніше. Однак будь-яке числове значення неминуче містить певні помилки, які обов'язково є результатом стандартного відхилення, що виявляється у відповідних тестових вимірюваннях.
Термін "виділений" означає біологічний компонент (такий як нуклеїнова кислота, пептид або білок), який був по суті відділений, отриманий окремо від або очищений від інших біологічних компонентів організму, у якому компонент зустрічається в природі, тобто від інших хромосомних і позахромосомних ДНК і РНК і білків. Таким чином, нуклеїнові кислоти, пептиди й білки, які були 60 "виділені", включають нуклеїнові кислоти й білки, очищені стандартними способами очищення.
"Виділені" нуклеїнові кислоти, пептиди й білки можуть бути частиною композиції і все ще бути виділеними, якщо така композиція не є частиною нативного середовища нуклеїнової кислоти, пептиду або білка. Термін також охоплює нуклеїнові кислоти, пептиди й білки, отримані за допомогою рекомбінантної експресії в клітині-хазяїні, а також хімічно синтезовані нуклеїнові кислоти. У контексті цього документа "виділене" антитіло або антигензв'язувальний фрагмент означає антитіло або антигензв'язувальний Фрагмент, який по суті не містить інших антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, які мають відмінні антигенні специфічності (наприклад, виділене антитіло, що специфічно зв'язує СІТК, по суті не містить антитіл, що специфічно зв'язують інші антигени, крім СЗІТК). Однак виділене антитіло, що специфічно зв'язує епітоп, ізоформу або різновид СІТК, може мати перехресну реактивність з іншими спорідненими антигенами, наприклад, отриманими від інших видів (наприклад гомологами видів СІТК).
Використовувані в цьому документі терміни "Ііндукований глюкокортикоїдами ТМЕК-подібний білок" і "СІТЕ" конкретно включають людський білок СІТЕ, наприклад, як описаний в каталозі
СепВапК під Мо доступу АБЕ241229, еталонна послідовність МСВІ: МР 0041861 і
ОпіРтоїкВ/обліковий номер Зм/і55-Ргої 09505 (див. також Куоп еї аї. 1999, 9. ВіоЇ. Спет. 274, 6056-6061). У науковій літературі СІТК також відомий як АЇТК, СО357, ТМЕКЗЕ18 і СІТК-О.
Використовувані в цьому документі терміни "ліганд СІТК", "СІТКІ" ії "СВІТК-Г" стосуються індукованого глюкокортикоїдами ТМЕК-подібного білкового ліганду. ІТК. також відомий як активаційно-індукований ТМЕ-споріднений ліганд (АЇІТКІ) і представник 18 надродини лігандів фактора некрозу пухлин (ТМЕ5Е18). За номером доступу СепВапк АР125303 надано приклад послідовності нуклеїнових кислот СІТКІ людини. За номером доступу зепВапк"м МР 005083 і номером доступу Бм/і55-Ргої О9О0МО2 надано приклади амінокислотних послідовностей СІТІ. людини. У конкретному варіанті втілення СІТКІ. являє собою СІТКІ. із БЕО ІЮ МО: 65. "Антитіло" відноситься до всіх ізотипів імуноглобулінів (Іде, ІА, ЧЕ, І9М, до і Іди), включно з різними мономерними, полімерними й химерними формами, якщо не вказано інше. Зокрема терміном "антитіло" охоплюються поліклональні антитіла, моноклональні антитіла (тАБб) і антитілоподібні поліпептиди, такі як химерні антитіла й гуманізовані антитіла. "Антигензв'язувальні фрагменти" являють собою будь-яку білкову структуру, яка може проявляти афінність зв'язування з конкретним антигеном. Антигензв'язувальні фрагменти включають ті, які забезпечуються будь-яким відомим способом, таким як ферментативне розщеплення, пептидний синтез і рекомбінантні методики. Деякі антигензв'язувальні фрагменти складаються з частин інтактних антитіл, які зберігають антигензв'язувальну специфічність молекули батьківського антитіла. Наприклад, антигензв'язувальні фрагменти можуть містити принаймні одну варіабельну область (варіабельну область важкого ланцюга або легкого ланцюга) або одну або більше СОЖК антитіла, які, як відомо, зв'язуються з конкретним антигеном. Приклади відповідних антигензв'язувальних фрагментів включають, без обмежень, діатіла й одноланцюгові молекули, а також молекули Раб, Е(ар")2, Ес, Рабс і Ем, одноланцюгові (5с) антитіла, окремі легкі ланцюги антитіла, окремі важкі ланцюги антитіла, химерні злиття між ланцюгами антитіла або СОК і іншими білками, кістяки білків, мономери або димери важкого ланцюга, мономери або димери легкого ланцюга, димери, які складаються з одного важкого й одного легкого ланцюга, одновалентний Фрагмент, який складається з доменів МІ, УН, СІ і СНІ або одновалентне антитіло, описане в М/О2007059782, двовалентні фрагменти, які містять два
Еаб-фрагменти, з'єднані в шарнірній ділянці дисульфідним містком, Еа-фрагмент, який складається по суті з Мн і Сні-доменів; Ем-фрагмент, який складається по суті з МІ. ї МН-доменів одного плеча антитіла, ЗФАБ-фрагмент (Умага еї а!., Майшге 341, 544-546 (1989)), який складається по суті з домену МН і також називається доменним антитілом (Ної еї аї; Тгтепаз Віоїесппої. 2003
Моум.; 21(11):484-90); камелід (верблюже антитіло) або нанотіла (Кемеїб5 еї а! Ехрегі Оріп Віої
ТНнег. 2005 дап.; 5(1):111-24); виділену область, що визначає комплементарність (СОК) тощо. Усі ізотипи антитіл можна використовувати для отримання антигензв'язувальних фрагментів. Крім того, антигензв'язувальні фрагменти можуть включати в себе білкові каркаси, які не належать до антитіл, і в які можуть бути з успіхом включені сегменти поліпептидів у орієнтації, яка надає афінність до антигена, що становить інтерес, такі як білкові кістяки. Антигензв'язувальні фрагменти можна отримати рекомбінантними способами або шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. Фраза "антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент" може використовуватися для позначення того, що цей антигензв'язувальний фрагмент включає в себе один або більше амінокислотних сегментів антитіла, яке згадується в цій фразі.
Терміни "СОМ" в однині і множині стосуються області, що визначає комплементарність (СОК), три з яких визначають характер зв'язування варіабельної області легкого ланцюга бо (СОКІЛ, СОКІ2 ї СОКІ 3), і три з яких визначають характер зв'язування варіабельної області важкого ланцюга (СОКНІ, СОКН2 і СОКНЗ). СОК роблять внесок у функціональну активність молекули антитіла, і вони розділені амінокислотними послідовностями, які складають області кістяка, або каркаса. Точне визначення границь і довжин СОК залежить від різних систем класифікації і нумерації. Таким чином, посилання на СОК можна робити відповідно до Кабаї,
Споїйіа, контакту або будь-якого іншого визначення границь. Незважаючи на відмінності у границях, кожна з цих систем має певний рівень накладення, же утворює так звані "гіперваріабельні області" в межах варіабельних послідовностей. Таким чином, визначення СОМ відповідно до цих систем можуть відрізнятися за довжиною й граничними областями по відношенню до суміжної каркасної області. Див., наприклад, Кабаї єї аІ., Зедиепсевз ої Ргоївїнпв5 ої
Іттипоїодіса! Іпіегеві, Бій ей. МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242 (1991); Споїніа єї аї., Сапопіса! зігисішге5 Бог Ше Нурегмапаріє Кедіоп5 ої Іттиподіобийп5, У. Мої. Віої. 196:901 (1987); і
Массаїйшт еї аї., Апіїроду-Апіїдеп Іпіегасіюп5: Сопіасі Апаїузіз апа Віпаїпоа 5іїе Тородгарну, «.
Мої. ВіоІ. 262:732 (1996)), кожну з яких у повному обсязі включено в цей документ шляхом посилання.
Зазвичай СОК утворюють петльову структуру, яку можна класифікувати як канонічну структуру. Термін "канонічна структура" стосується конформації основного ланцюга, яку приймають антигензв'язувальні (СОК) петлі. На основі порівняльних досліджень структури було встановлено, що п'ять із шести антигензв'язувальних петель мають лише обмежений репертуар доступних конформацій. Кожну канонічну структуру можна охарактеризувати за кутами кручення поліпептидного каркаса. Однак відповідні петлі між антитілами можуть мати дуже подібні тривимірні структури, незважаючи на високу варіабельність амінокислотних послідовностей у більшості ділянок петель (Споїпйіа еї аіІ., Сапопіса! Зігисіиге5 Бог Те Нурегмагіабіе Кедіопе ої
Ітітиподіобиїйпе, У. Мої. Віої. 196:901 (1987); Споїйтіа еї аї., Сопіоптаїййоп5 ої Іттиподіориїйїп
Нурегмагіаріє Недіоп5, І 342:877 (1989); Мапіп апа Тпогпіоп, бігисіига! Ратіїйев іп Гоорв ої
Нотоіодоиз Ргоївїп5: Ашотаїйїс Сіаззіїісаноп, Моаеїйїпд апа Арріїсайоп о Апііродієв, у. Мої. Віої. 263:800 (1996), кожну з яких у повному обсязі включено в цей документ шляхом посилання).
Більш того, існує зв'язок між прийнятою структурою петлі й амінокислотними послідовностями, що її оточують. Конформація певного канонічного класу визначається довжиною петлі й амінокислотними залишками, які розташовані в ключових положеннях у межах петлі, а також
Зо всередині консервативного каркаса (тобто поза межами петлі). Таким чином, віднесення до певного канонічного класу можна здійснити на основі присутності цих ключових амінокислотних залишків.
Термін "поліпептид" використовується як взаємозамінний із терміном "білок", ії у своєму найширшому сенсі стосується сполуки, що складається з двох або більше амінокислотних субодиниць, амінокислотних аналогів або пептидоміметиків. Субодиниці можуть бути зв'язані пептидними зв'язками. В іншому варіанті втілення субодиниця може бути зв'язана іншими зв'язками, наприклад, естерними, етерними тощо. У контексті цього документа термін "амінокислота" стосується або природних, або неприродних, або синтетичних амінокислот, включно з гліцином у вигляді як Ю-, так і Г-оптичних ізомерів, аналогами амінокислот і пептидоміметиками. Пептид, що складається з трьох або більше амінокислот, зазвичай називають олігопептидом, якщо пептидний ланцюг є коротким. Якщо пептидний ланцюг є довгим, пептид зазвичай називають поліпептидом або білком. Використання термінів "специфічно зв'язує" або "зв'язує специфічно" або їхніх похідних у контексті антитіл або фрагментів антитіл, являє собою зв'язування через домени, кодовані генами імуноглобуліну або фрагментами генів імуноглобуліну, з одним або більше епітопами білка, що становить інтерес, без переважного зв'язування з іншими молекулами в зразку, який містить змішану популяцію молекул. Зазвичай антитіло зв'язується зі спорідненим антигеном із Ка менше ніж приблизно 1 х 108 М, як визначено за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу або аналізу зв'язування клітин. Такі фрази як «І(антиген|-специфічне" антитіло (наприклад, СІТК-специфічне антитіло) передають, що зазначене антитіло специфічно зв'язується з зазначеним антигеном.
Термін "полінуклеотид" і його синоніми "молекула нуклеїнової кислоти", "нуклеотиди" або "нуклеїнові кислоти" відносяться до будь-якого полірибонуклеотиду або полідезоксирибонуклеотиду, який може являти собою немодифіковану РНК або ДНК або модифіковану РНК або ДНК. "Полінуклеотиди" включають, без обмеження, одно- і дволанцюгову ДНК, ДНК, яка є сумішшю одно- і дволанцюгових областей, одно- і дволанцюгову
РНК і РНК, яка є сумішшю одно- і дволанцюгових областей, гібридні молекули, що містять ДНК і
РНК, які можуть бути одноланцюговими або, більш типово, дволанцюговими або сумішшю одно- і дволанцюгових областей. Крім того, "полінуклеотид" відноситься до триланцюгових областей, які містять РНК або ДНК або РНК і ДНК. Термін "полінуклеотид" також включає ДНК або РНК, які 60 містять одну або більше модифікованих основ, і ДНК або РНК з основними ланцюгами, які були модифіковані з міркувань стабільності або з інших причин. "Модифіковані" основи включають, наприклад, тритильовані основи й незвичайні основи, такі як інозин. У ДНК і РНК можна вносити різні модифікації; таким чином, термін "полінуклеотид" охоплює хімічно, ферментативно або метаболічно модифіковані форми полінуклеотидів, які зазвичай зустрічаються в природі, а також хімічні форми ДНК і РНК, характерні для вірусів і клітин. Термін "полінуклеотид" також охоплює відносно короткі ланцюги нуклеїнових кислот, які часто називають олігонуклеотидами.
Термін "вектор" означає реплікон, такий як плазміда, фаг, косміда або вірус, у який можна функціонально ввести інший сегмент нуклеїнової кислоти так, щоб викликати реплікацію або експресію сегмента.
У контексті цього документа термін "клітина-хазяїн" може являти собою будь-який тип клітини, наприклад первинну клітину, клітину в культурі або клітину з клітинної лінії. У конкретних варіантах втілення термін "клітина-хазяїн" стосується клітини, трансфікованої молекулою нуклеїнової кислоти, і потомство або потенційне потомство такої клітини. Потомство такої клітини може не бути ідентичним батьківській клітині, трансфікованій молекулою нуклеїнової кислоти, наприклад, через мутації або впливи навколишнього середовища, які можуть мати місце у наступних поколіннях, або інтеграції молекули нуклеїнової кислоти в геном клітини-хазяїна. Терміни "експресія" й "продукування" використовуються в цьому документі як синоніми і стосуються біосинтезу генного продукту. Ці терміни охоплюють транскрипцію гена в
РНК. Ці терміни також охоплюють трансляцію РНК в одному або більше поліпептидах і додатково охоплюють усі природні посттранскрипційні та посттрансляційні модифікації.
Експресія або продукція антитіла або його антигензв'язувального фрагмента може відбуватися в цитоплазмі клітини або в позаклітинному середовищі, наприклад у живильному середовищі для культивування клітин. Значення виразу "по суті однакові" може відрізнятися залежно від контексту, у якому використовується термін. Оскільки серед важких і легких ланцюгів і генів, що їх кодують, існує природна мінливість послідовності, можна було б очікувати виявлення певного рівня мінливості в межах амінокислотних послідовностей або генів, що кодують антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі, з незначним або відсутнім впливом на їхні унікальні властивості зв'язування (наприклад, специфічність і афінність). Таке очікування існує частково через виродженість генетичного коду, а також через еволюційний успіх варіацій консервативних амінокислотних послідовностей, які непомітно змінюють природу кодованого білка. Відповідно, в контексті послідовностей нуклеїнових кислот термін "по суті однакові" означає принаймні 65 95 ідентичності між двома або більше послідовностями. Переважно термін стосується принаймні 70 95 ідентичності між двома або більше послідовностями, більш переважно принаймні 75 95 ідентичності, більш переважно принаймні 80 95 ідентичності, більш переважно принаймні 85 95 ідентичності, більш переважно принаймні 90 95 ідентичності, більш переважно принаймні 91 95 ідентичності, більш переважно принаймні 92 95 ідентичності, більш переважно принаймні 93 95 ідентичності, більш переважно принаймні 94 95 ідентичності, більш переважно принаймні 95 95 ідентичності, більш переважно принаймні 96 95 ідентичності, більш переважно принаймні 97 95 ідентичності, більш переважно принаймні 98 95 ідентичності і більш переважно принаймні 99595 або більше ідентичності. Відсоток ідентичності між двома послідовностями залежить від кількості ідентичних положень, загальних для послідовностей (тобто 95 гомології - кількість ідентичних положень / загальна кількість положень х 100), з урахуванням кількості гепів і довжини кожного гепу, який необхідно ввести для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток ідентичності між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями можна, наприклад, визначити з використанням алгоритму Е.
Меуегз і МУ. МіШег, описаного в публікації Сотриї. Аррі. Віозсі 4, 11-17 (1988), який був введений у програму АГІСМ (версія 2.0) з використанням таблиці "ваги" залишків РАМ120, штрафу за продовження гепу 12 і штрафу за геп 4. Крім того, відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями можна визначити з використанням алгоритму Меедіетап і умуип5сй, описаного в публікації У. Мої. Віої. 48, 444-453 (1970).
Ступінь варіації, яка може зустрічатися в амінокислотній послідовності білка без істотного впливу на функцію білка є значно нижчою, ніж у нуклеотидній послідовності, оскільки до амінокислотних послідовностей не застосовуються ті самі принципи виродженості. Відповідно, у контексті антитіла або антигензв'язувального фрагмента термін "по суті однакові" означає антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, які мають 90 95, 91 95, 92 95, 9395, 94 9о, 95 95, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичності з описаними антитілами або антигензв'язувальними фрагментами. Інші варіанти втілення включають СІТК-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, які мають каркас, кістяк або інші незв'язувальні області, які не мають значної ідентичності з антитілами й антигензв'язувальними фрагментами, описаними в 60 цьому документі, але включають в себе одну або більше СОК або інших послідовностей,
необхідних для надання зв'язування, які є на 90 9», 91 Фо, 92 У, 93 У, 94 9о, 95 95, 96 95, 97 Ор, 98 95 або 99 95 ідентичними таким послідовностям, які описано в цьому документі.
Термін "афінність зв'язування" зазвичай стосується суми загальних нековалентних взаємодій між єдиним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитіла) і її партнера по зв'язуванню (наприклад, антигена) Якщо не вказано інше, у контексті цього документа "афінність зв'язування" стосується власної афінності зв'язування, яка відображає взаємодію 1: 1 між представниками пари зв'язування (тобто антитілом і антигеном). Афінність молекули Х щодо її партнера У можна по суті представити константою дисоціації (Ко). Афінність можна виміряти й/або виразити декількома способами, відомими в цій галузі, включно з рівноважною константою дисоціації (Ко) і рівноважною константою асоціації (Ка), але не обмежуючись цим.
Ко розраховують за співвідношенням Кок/Коп, тоді як Кл розраховують за співвідношенням Коп/Кон.
Коп стосується, наприклад, константи швидкості асоціації антитіла з антигеном, а Кох стосується, наприклад, дисоціації антитіла з антигеном. Коп Її Ков можна визначати згідно з методиками, відомими звичайному фахівцеві в цій галузі, наприклад, шляхом поверхневого плазмонного резонансу.
Термін "суб'єкт" відноситься до людей і тварин не людського походження, включаючи всіх хребетних, наприклад ссавців і не ссавців, таких як примати не людського походження, миші, кролики, вівці, собаки, кішки, коні, корови, кури, амфібії, рептилії тощо. У багатьох варіантах втілення описаних способів суб'єкт є людиною.
СІТВА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти
У цьому документі описано виділені моноклональні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з СІТК. Загальна структура молекули антитіла містить антигензв'язувальний домен, який включає в себе важкі й легкі ланцюги, і Ес-домен, який виконує різні функції, включно з фіксацією комплементу й зв'язуванням рецепторів антитіла.
Описані СІТК-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти включають усі ізотипи
ІЧА, дО, ЧЕ, дос і ІдМ ї синтетичні мультимери чотириланцюгових структур імуноглобулінів.
Описані антитіла або антигензв'язувальні фрагменти також включають ізотип Іду, який зазвичай зустрічається в сироватці курки або індички й у яєчному жовтку курки або індички.
СІТВА-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти можна отримати від будь-яких видів за допомогою рекомбінантних способів. Наприклад, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можуть бути отримані від миші, щура, кози, коня, свині, корови, курки, кролика, верблюда, віслюка, людини, або вони можуть бути їхніми химерними варіантами. Для застосування з метою введення людям, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, отримані з організмів не людського походження, можуть бути генетично або структурно змінені, щоб мати меншу антигенність під час введення пацієнтові, що є людиною.
У деяких варіантах втілення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти є химерними. У контексті цього документа термін "химерний" відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, які мають принаймні деяку частину принаймні одного варіабельного домену, отриманого з амінокислотної послідовності антитіла ссавця не людського походження, гризуна або рептилії, тоді як решта частин антитіла або його антигензв'язувального фрагмента отримана від людини.
У деяких варіантах втілення антитіла являють собою гуманізовані антитіла. Гуманізовані антитіла можуть являти собою химерні імуноглобуліни, ланцюги імуноглобулінів або їхні фрагменти (такі як Ем, Раб, Бар", Е(ар")2 або інші антигензв'язувальні послідовності антитіл), які містять мінімальну послідовність, отриману з імуноглобуліну не людського походження.
Здебільшого, гуманізовані антитіла є імуноглобулінами людини (антитіло-реципієнт), у яких залишки з області, що визначає комплементарність (СОК), реципієнта замінено залишками з
СОК виду не людського походження (антитіло-донор), такого як миша, щур або кролик, які володіють бажаною специфічністю, афінністю й здатністю. Загалом, гуманізоване антитіло міститиме по суті всі з принаймні одного, а зазвичай двох варіабельних доменів, у яких всі або по суті всі області СОК відповідають таким з імуноглобуліну не людського походження, а всі або по суті всі каркасні області є послідовностями імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло може включати принаймні частину константної області імуноглобуліну (Ес), зазвичай з імуноглобуліну людини.
Антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі, можуть зустрічатися в різних формах, але включатимуть у себе одну або більше СОК антитіл, представлених у таблиці 1.
У цьому документі описано виділені антитіла й антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з СІТК. У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла або бо антигензв'язувальні фрагменти являють собою дб людини або його похідні. Хоча СІТЕ-
специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, наведені в цьому документі як приклади, є людськими, наведені як приклади антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можуть бути химеризованими.
У деяких варіантах втілення запропоновано (ІТК-специфічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить важкий ланцюг, який містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ будь-якого з антитіл, представлених у таблиці 1, і легкий ланцюг, який містить СОМК1, СОК2 і
СОКЗ будь-якого з антитіл, представлених у таблиці 1.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 1, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІО МО: 5, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 12, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТЕ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТК з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення ІТ В-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із зЗЕО ІЮО МО: 39, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із «ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 2, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІО МО: 5, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 13, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 29, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і СОМЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 36. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТЕ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТК з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може
Зо індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТЕ-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із БЗЕО ІЮ МО: 40, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із БЕО ІЮ МО: 56. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 1, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІО МО: 6, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 14, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 30, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 33, ії СОРЗ легкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 37. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТК з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп мійго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із БЗЕО ІЮО МО: 41, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із ЗЕО ІЮ МО: 57. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО І МО: 7, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 15, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОМК2 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТЕ з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТЕ-специфічні антитіла й антигензв'язувальні 60 фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із БЗЕО ІО МО: 42, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із «ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО І МО: 7, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 16, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і СОМЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТЕ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТЕ з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТЕ-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із зЗЕО ІЮ МО: 43, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із «ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІЮ МО: 8, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 17, СОК1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і СОМЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТК з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТЕ-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із БЗЕО ІО МО: 44, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із ЗЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг
Зо антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІО МО: 9, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 18, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТЕ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТЕ з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТЕ-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із БЗЕО ІО МО: 45, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із «ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІЮ МО: 10, СОКЗ важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 19, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і СОМЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТА-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТЕ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТК з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із зЗЕО ІЮ МО: 46, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із «ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО І МО: 7, СОКЗ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 20, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 31, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 34, і СОРМЗ легкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 38. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТК з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із БЗЕО ІО МО: 47, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із 5ЕО ІЮ МО: 58. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІЮ МО: 11, СОКЗ важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 21, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 31, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 34, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 38. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТЕ з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТЕ-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із БЗЕО ІО МО: 48, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із БЕО ІЮ МО: 58. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти
Зо містять СОКІ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО І МО: 7, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 22, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і СОМЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТЕ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТЕ з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТЕ-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із ЗЕО ІО МО: 49, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із «ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО І МО: 7, СОКЗ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 23, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і СОМЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТК з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТЕ-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із зЗЕО ІЮО МО: 50, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із «ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО І МО: 7, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 24, СОКІ1 легкого ланцюга, що 60 містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТЕ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТЕ з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТЕ-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із БЗЕО ІЮО МО: 51, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із «ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО І МО: 7, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 25, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і СОМЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТЕ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТК з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із 5ЕО ІЮ МО: 52, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із 5ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до ІТ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОК1 важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 27, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІО МО: 5, СОКЗ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 26, СОК1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і СОМЗ легкого
Зо ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТЕ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТК з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп мійго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із зЗЕО ІЮО МО: 53, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із «ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІЮ МО: 11, СОКЗ важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 21, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТК з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТЕ-специфічні антитіла й антигензв'язувальні
БО фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із БЗЕО ІО МО: 54, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із «ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОКІ важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО І МО: 7, СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 16, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і СОМЗ легкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТЕ-специфічне антитіло або бо антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТЕ з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп міго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТЕ-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із БЗЕО ІО МО: 63, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із «ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
У деяких варіантах втілення СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять СОК1 важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 27, СОК2 важкого ланцюга, що містить
ЗЕО ІЮ МО: 5, СОКЗ важкого ланцюга, що містить 5ХЕО ІЮО МО: 26, СОКІ1 легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і СОМЗ легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 35. Це СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити людські каркасні послідовності. Це СІТЕ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з СІТК з афінністю 30 нМ або менше, може індукувати підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-кВ люциферази й може індукувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЗКЦ) іп мійго з ЕСво 67 нг/мл або менше. У деяких варіантах втілення СІТЕ-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти містять важкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із зЗЕО ІО МО: 64, і легкий ланцюг, по суті однаковий або ідентичний із «ЕО ІЮ МО: 55. Важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, описаних у цьому абзаці, підходять для включення в біспецифічні конструкції, у яких одне плече являє собою плече антитіла до СІТЕ.
Також розкрито виділені полінуклеотиди, які кодують антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, що специфічно зв'язуються 3 СІТЖК. Для отримання антитіл або антигензв'язувальних фрагментів виділені полінуклеотиди, здатні кодувати сегменти варіабельного домену, що пропонуються в цьому винаході, можуть бути включені в той самий або в інший вектор.
Полінуклеотиди, які кодують рекомбінантні антигензв'язувальні білки, також входять в обсяг цього винаходу. У деяких варіантах втілення описані полінуклеотиди (і пептиди, які вони кодують) включають лідерну послідовність. Можна використовувати будь-яку лідерну послідовність, відому в цій галузі. Лідерна послідовність може включати, серед іншого, сайт рестрикції або сайт початку трансляції.
СІТВА-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі, включають різновиди, що мають одиночні або множинні амінокислотні заміщення, делеції або додавання, які зберігають біологічні властивості (наприклад, афінність зв'язування або імуноефекторну активність) описаних СІТА-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів. Ці різновиди можуть включати: (а) різновиди, у яких один або більше амінокислотних залишків заміщені консервативними або неконсервативними амінокислотами, (Б) різновиди, у яких одна або більше амінокислот додані до поліпептиду або видалені з нього, (с) різновиди, у яких одна або більше амінокислот включають замісну групу, їі (4) різновиди, у яких поліпептид злито з іншим пептидом або поліпептидом, таким як партнер для злиття, білкова мітка або інший хімічний фрагмент, який може надавати поліпептиду корисні властивості, такі як, наприклад, епітоп для антитіла, полігістидинова послідовність, фрагмент біотину тощо. Антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі, можуть включати різновиди, у яких амінокислотні залишки з одного виду заміщені відповідними залишками з іншого виду в консервативних або неконсервативних положеннях. В інших варіантах втілення амінокислотні залишки в неконсервативних положеннях заміщені консервативними або неконсервативними залишками. Методи отримання цих різновидів, включно з генетичними (делеції, мутації тощо), хімічними й ферментативними методами, відомі звичайним фахівцям у цій галузі.
СІТВА-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в цьому документі, можуть об'єднувати декілька ізотипів антитіл, таких як ІМ, до, дос, ІдА і ІДЕ. У деяких варіантах втілення ізотип антитіла є ізотипом ІДС1, Ідс2, ІдсЗ або ІдсС4, переважно ізотипом Ідс1.
Специфічність антитіла або його антигензв'язувального фрагмента значною мірою визначається амінокислотною послідовністю й розташуванням СОК. Таким чином, СОК із одного ізотипу можна переносити в інший ізотип без зміни антигенної специфічності.
Альтернативно були розроблені методи, що спричиняють перемикання виробництва гібридомою одного ізотипу антитіла на інший (ізотипне перемикання) без зміни антигенної специфічності. Відповідно, такі ізотипи антитіл входять в об'єм описаних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів.
Описані в цьому документі СІТК-специфічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти мають афінності зв'язування до СІТЕ, які мають константу дисоціації (Ко) меншу ніж приблизно 30 НМ. Афінність описаних СІТК-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів можна визначити за допомогою різних способів, відомих у цій галузі, таких як метод поверхневого плазмонного резонансу або способи, засновані на аналізі ЕГІ5А. Аналізи вимірювання афінності за допомогою ППР включають аналізи, які виконують з використанням апарата ВІАсоге 3000, причому аналіз виконують за кімнатної температури (наприклад, за температури, що дорівнює або приблизно дорівнює 25 С), причому антитіло, здатне до зв'язування з СІТК, захоплюється на сенсорному чипі ВіАсоге антитілом до Ес (наприклад, специфічним козячим антитілом до людської Ес-області (ДС від ЧУаскбоп Іттипо Кезеагсп
Іабогаїогіез продукт Мо 109-005-098) до рівня приблизно 75 ОВ, з наступним збиранням даних асоціації й дисоціації за швидкості потоку 40 мкл/хв.
Також пропонуються вектори, які містять полінуклеотиди, описані в цьому документі.
Вектори можуть являти собою експресійні вектори. Таким чином, рекомбінантні експресійні вектори, які містять послідовність, яка кодує поліпептид, що становить інтерес, розглядаються як такі, що входять у об'єм винаходу. Експресійний вектор може містити одну або більше додаткових послідовностей, таких як, серед іншого, регуляторні послідовності (наприклад, промотор, енхансер), селективний маркер і сигнал поліаденілювання. Вектори для трансформації широкої різноманітності клітин-хазяїв є добре відомими й включають у себе, серед іншого, плазміди, фагеміди, косміди, бакуловіруси, бакміди, бактеріальні штучні хромосоми (ВАС), дріжджові штучні хромосоми (УАС), а також інші бактеріальні, дріжджові й вірусні вектори.
Рекомбінантні експресійні вектори, які входять в об'єм цього опису, включають синтетичні, геномні або отримані з КДНК фрагменти нуклеїнових кислот, які кодують принаймні один рекомбінантний білок, який може бути функціонально пов'язаний із відповідними регуляторними елементами. Такі регуляторні елементи можуть включати транскрипційний промотор, послідовності, які кодують відповідні рибосомні сайти зв'язування мРНК і послідовності, які керують термінацією транскрипції і трансляції. Експресійні вектори, особливо експресійні вектори ссавців, також можуть включати один або більше елементів, що не транскрибуються, таких як джерело реплікації, відповідний промотор і енхансер, зв'язані з геном, який експресується, інші 5'- або 3'-фланкуючі послідовності, що не транскрибуються, 5- або 3- послідовності, що не транслюються (такі як необхідні рибосомні сайти зв'язування), сайт поліаденілювання, донор сплайсингу й акцепторні сайти або послідовності термінації транскрипції. Можна вводити джерело реплікації, що надає здатність до реплікації в хазяїні.
Послідовності керування транскрипцією і трансляцією в експресійних векторах, які будуть використовуватися для трансформації клітин хребетних, можуть бути отримані з вірусних джерел. Ілюстративні вектори можуть бути сконструйовані так, як описано в ОКауата апа Вего, З
МОЇ. Сеї. Віо!. 280 (1983).
У деяких варіантах втілення послідовність, що кодує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, розміщена під керуванням потужного конститутивного промотора, такого як промотори для наступних генів: гіпоксантинфосфорибозилтрансфераза (НРКТ), аденозиндезаміназа, піруваткіназа, бета-актин, міозин людини, гемоглобін людини, креатин м'язів людини та інші. Крім того, багато вірусних промоторів функціонують у еукаріотичних клітинах конститутивно й придатні для використання з описаними варіантами втілення. Такі вірусні промотори включають, без обмежень, негайний ранній промотор цитомегаловірусу (СМУМ), ранній і пізній промотори 540, промотор вірусу пухлини молочної залози мишей (ММТУ), довгі кінцеві повтори (ІТК) вірусу лейкозу Малоні, вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), вірусу Епштейна -- Барр (ЕВМ), вірусу саркоми Рауса (К5М) і інших ретровірусів, і промотор тимідинкінази вірусу простого герпесу. В одному варіанті втілення послідовність, що кодує
СІТВА-специфічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, розміщена під керуванням індуцибельного промотора, такого як металотіонеїновий промотор, індукований тетрацикліном промотор, індукований доксицикліном промотор, промотори, які містять один або більше стимульованих інтерфероном елементів відповіді (5КЕ), такі як протеїнкінази К 2",5- олігоаденілатсинтетази, Мх-гени, АБАКТ тощо.
Вектори описані в цьому документі, можуть містити одну або більше ділянок внутрішньої посадки рибосоми (ІКЕ5). Включення послідовностей ІКЕ5 у вектори злиття може бути корисним для посилення експресії деяких білків. У деяких варіантах втілення векторна система включатиме в себе один або більше сайтів поліаденілювання (наприклад, 5М40), які можуть знаходитися вище або нижче від будь-якої з вищезазначених нуклеотидних послідовностей. 60 Векторні компоненти можуть бути суміжно зв'язані або розташовані таким чином, щоб забезпечити оптимальну відстань для експресії генних продуктів (тобто шляхом введення між відкритими рамками зчитування (ОКР) "спейсерних" нуклеотидів) або можуть розташовуватися по-іншому. Елементи регулювання, такі як мотив ІКЕ5, також можуть бути розташовані так, щоб забезпечити оптимальну відстань для експресії.
Вектори можуть містити селективні маркери, добре відомі в цій галузі. Селективні маркери включають позитивні й негативні селективні маркери, наприклад, гени резистентності до антибіотиків (наприклад, ген резистентності до неоміцину, ген резистентності до гігроміцину, ген резистентності до канаміцину, ген резистентності до тетрацикліну, ген резистентності до пеніциліну), гени глутаматсинтази, НЗМ-ТК, похідні Н5М-ТК для селекції ганцикловіру або ген бактеріальної пурин-нуклеозидфосфорилази для селекції б-метилпурину (Заді еї аї.,, 7 Сепе
ТНег. 1738-1743 (2000)). Нуклеотидна послідовність, яка кодує селективний маркер або сайт клонування, може розташовуватися вище або нижче нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, що становить інтерес, або сайт клонування.
Вектори, описані в цьому документі, можуть використовуватися для трансформації різних клітин генами, що кодують описані антитіла або антигензв'язувальні фрагменти. Наприклад, вектори можна використовувати для створення клітин, які виробляють СІТЕ-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент. Таким чином, ще один аспект включає клітини- хазяїни, трансформовані векторами, що містять нуклеотидну послідовність, яка кодує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно зв'язується з СТЕ, наприклад, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані й проілюстровані в цьому документі.
У цій галузі відомо багато способів введення чужорідних генів у клітини, і їх можна використовувати для конструювання рекомбінантних клітин з метою реалізації описаних способів згідно з різними варіантами втілення, описаними й проілюстрованими в цьому документі. Використовувана методика повинна забезпечувати стабільне перенесення послідовності гетерологічного гена в клітину-хазяїна так, щоб послідовність гетерологічного гена ставала наслідуваною й експресувалася потомством клітин і так, щоб не порушувалися необхідний розвиток і фізіологічні функції клітин-реципієнтів. Методики, які можуть бути використані, включають, серед іншого, перенесення хромосом (наприклад, злиття клітин, опосередковане хромосомами перенесення генів, опосередковане мікроклітинами перенесення
Зо генів), фізичні методи (наприклад, трансфекція, злиття сферопластів, мікроїн'єкція, електропорація, ліпосомний носій), перенесення вірусних векторів (наприклад, рекомбінантних
ДНК-вірусів, рекомбінантних РНК-вірусів) тощо (описано в Сіїіпе, 29 Рнаптас. Тег. 69-92 (1985)).
Для трансформації клітин також можуть бути використані осадження фосфатом кальцію й індуковане поліетиленгліколем (ПЕГ,) злиття бактеріальних протопластів із клітинами ссавців.
Клітини, що підходять для використання для експресії сІТК-специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі, переважно являють собою еукаріотичні клітини, більш переважно клітини рослин, гризунів або клітини людського походження, наприклад, серед іншого, клітини МБО, СНО, СНОК', регО.6, ТК-їі513, ВНК,
НЕК293, СО5-7, 980, СМ-1/ЕВМА, І -клітини, С127, 3Т3, Неї а, М51, Зрг2/0 мієломні клітини й клітинні лінії ВНК. Крім того, експресія антитіл може бути реалізована з використанням клітин гібридоми. Способи отримання гібридом є добре відомими в цій галузі.
Клітини, трансформовані експресійними векторами, описаними в цьому документі, можуть бути відібрані або перевірені на рекомбінантну експресію антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі. Рекомбінантно-позитивні клітини розмножують і піддають скринінгу на субклони, які демонструють бажаний фенотип, наприклад високий рівень експресії, покращені властивості росту або здатність надавати білки з бажаними біохімічними характеристиками, наприклад, внаслідок модифікації білка або зміни посттрансляційних модифікацій. Ці о фенотипи можуть бути пов'язані з притаманними цьому субклону властивостями або з мутацією. Мутації можуть бути здійснені за допомогою використання хімічних речовин, ультрафіолетового світла, радіоактивного випромінювання, вірусів, інсерційних мутагенів, інгібування відновлення невідповідності ДНК або комбінації таких способів.
Способи використання сСІТК-специфічних антитіл для лікування
У цьому винаході пропонуються С1ІТА-специфічні антитіла або їхні антигензв'язувальні фрагменти для застосування в терапії. Зокрема ці антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можна використовувати для лікування раку. Відповідно, у винаході пропонується спосіб лікування раку, який включає введення антитіла, описаного в цьому документі, наприклад СІТК- специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів. Декілька аспектів біології ІТК роблять його потенційною мішенню для лікування різних видів раку. Перший з них полягає в бо тому, що активація СІТК, як описано вище, активує імунну систему. Крім того, ефекторні Т-
клітини і регуляторні Т-клітини, що експресують СТЕ, інфільтрують багато типів пухлин, хоча на негематопоетичних клітинах експресія СІТЕ є незначною або відсутня. Цей профіль розподілення означає, що клітини, які експресують СІТК, можуть концентруватися в пухлинах.
Ця комбінація активностей і розподілу разом робить СІТК-націлювання перспективним підходом лікування різних видів раку. Антигензв'язувальниї білки можна використовувати для лікування як солідних пухлин, так і гематологічних видів раку, включно з лейкозом.
Антитіла для застосування в цих способах включають антитіла, описані в цьому документі вище, наприклад СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент (із характеристиками, наведеними в таблиці 1, наприклад послідовностями СОК або варіабельного домену, і в подальшому обговоренні цих антитіл.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, імуноефекторні властивості СІТК- специфічних антитіл можна модулювати через Ес-модифікації за допомогою способів, відомих фахівцям у цій галузі. Наприклад, Ес-ефекторні функції, такі як зв'язування Сід, комплементзалежна цитотоксичність (КЗЦ), антитілозалежна клітинноопосередкована цитотоксичність (АЗКЦ), антитілозалежний клітинний фагоцитоз (АЗКФ), негативна регуляція рецепторів клітинної поверхні (наприклад, рецептора В-клітин; ВСК) тощо можна реалізувати й/"або контролювати шляхом модифікацій залишків у Ес, що відповідає за ці види активності. "Антитілозалежна клітинноопосередкована цитотоксичність" або "АЗКЦ" стосується клітинноопосередкованої реакції, у якій неспецифічні цитотоксичні клітини, що експресують Ес- рецептори (БСК) (наприклад клітини-натуральні кілери (НК), нейтрофіли й макрофаги), розпізнають зв'язане антитіло на клітині-мішені й згодом викликають лізис клітини-мішені.
Здатність моноклональних антитіл індукувати АЗКЦ може бути підвищена шляхом конструювання їхнього олігосахаридного компонента. дес! або ідсЗз людини є М- глікозильованими на Авбп297 з більшістю гліканів у добре відомих біантенарних формах 0,
СОР, С1, С1Р, 52 або с2Р. Антитіла, отримані за допомогою несконструйованих клітин СНО, зазвичай мають вміст фукози гліканів приблизно принаймні 85 95. Видалення корової фукози з олігосахаридів типу біантенарних комплексів, приєднаних до Ес-областей, підвищує АЗКЦ антитіл через покращення зв'язування Ес.гамма.КІПа без впливу на зв'язування антигена або активність КЗЦ. Такі тАБб можна отримати з використанням різних способів, описаних як такі, що
Зо призводять до успішної експресії антитіл з відносно високим рівнем дефукозилування, які несуть Ес-олігосахариди типу біантенарного комплексу, наприклад контролю осмоляльності культури (Коппо еї аї., СуїтесппоЇоду 64:249-65, 2012), застосування варіанта І ес13 клітинної лінії СНО як клітинної лінії-хазяїна (Зпієїа5 еї а, У Віої Спет 277:26733-26740, 2002), застосування варіанта ЕВ66 клітинної лінії СНО як клітинної лінії-хазяїна (Оїїміег еї аЇІ., МАбБ5; 2(4), 2010; електронна публікація до виходу з друку; РМІЮО:20562582), застосування щурячої гібридомної клітинної лінії УВ2/0 як клітинної лінії-хазяїна (ЗпіпКауча еї аї., У Віої Спет 278:3466- 3473, 2003), введення малих інтерферуючих РНК, зокрема проти гена альфа. 1,6- фукозилтрансферази (БОТ8) (Могі еї а!., Віотесппо! Віоепд 88:901-908, 2004) або коекспресії бета-1,4-М-ацетилглюкозамінілтрансферази І ії альфа-манозидази Ії комплексу Гольджи або ефективного інгібітора альфа-манозидази | кіфунезину (Реїтага еї аї., ) Віої Спет 281:5032- 5036, 2006, Ретага єї аї., Віотесппої Віоепуд 93:851-861, 2006; Хпои еї аї., Віотесппо!ї Віоєпд 99:652-65, 2008).
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, АЗКЦ, викликана антитілами до
СІТЕ, також може бути підвищена шляхом певних заміщень у Ес антитіла. Прикладами заміщень є, наприклад, заміщення в положеннях амінокислот 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 або 430 (нумерація залишків відповідає індексу Е)), як описано в патенті США Мо 6,737,056.
Фармацевтичні композиції і застосування
Фармацевтичні композиції, що пропонуються в цьому винаході, містять: а) ефективну кількість СІТК-специфічного антитіла або фрагмента антитіла за цим винаходом і б) фармацевтично прийнятний носій, який може бути інертним або фізіологічно активним. У переважних варіантах втілення СІТК-специфічне антитіло являє собою (сІТК-специфічне антитіло, описане в цьому документі, або його антигензв'язувальний фрагмент. У контексті цього документа термін "фармацевтично прийнятні носії" включає всі без винятку розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні й протигрибкові агенти тощо, які є фізіологічно сумісними. Приклади відповідних носіїв, розріджувачів і/або допоміжних речовин включають одне або більше з води, фізіологічного розчину, фосфатного буферного сольового розчину, декстрози, гліцерину, етанолу тощо, а також будь-які їхні комбінації. У багатьох випадках до композиції переважно включати ізотонічні агенти, такі як цукри, поліспирти або бо хлорид натрію. Зокрема, відповідні приклади придатного носія включають: (1) фосфатний буферний сольовий розчин Дульбекко, рН приблизно 7,4, який містить або не містить приблизно від 1 мг/мл до 25 мг/мл сироваткового альбуміну людини, (2) 0,9 95 фізіологічний розчин (0,9 95 мас./об. хлориду натрію (Масі)) ї (3) 5 95 (мас./об.) декстрози; і може також містити антиоксидант, такий як триптамін, і стабілізатор, такий як Твін-20Ф).
Композиції, описані в цьому документі, можуть також містити додатковий терапевтичний агент, необхідний для лікування конкретного порушення. Переважно, СІТЕ-специфічне антитіло або фрагмент антитіла й додаткова активна сполука матимуть комплементарні види дії і не будуть мати взаємний несприятливий вплив. У переважному варіанті втілення додатковий терапевтичний агент являє собою цитарабін, антрациклін, дигідрохлорид гістаміну або інтерлейкін 2. У переважному варіанті втілення додатковий терапевтичний агент являє собою хіміотерапевтичний агент.
Композиції за цим винаходом можуть бути в різних формах. Такі форми включають, наприклад, рідкі, напівтверді й тверді лікарські форми, але переважна форма залежить від передбачуваного шляху введення й терапевтичного застосування. Типові переважні композиції перебувають у вигляді розчинів для ін'єкцій або інфузій. Переважним шляхом введення є парентеральний (наприклад внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньочеревний, підшкірний). У переважному варіанті втілення композиції за цим винаходом вводять внутрішньовенно у вигляді болюса або шляхом безперервної інфузії протягом певного періоду часу. В іншому переважному варіанті втілення їх вводять шляхом внутрішньом'язової, підшкірної, внутрішньосуглобової, інтрасиновіальної, внутрішньопухлинної, навколопухлинної, внутрішньовогнищевої або навколовогнищевої ін'єкції щоб забезпечити місцеву й системну терапевтичну дію.
Стерильні композиції для парентерального введення можуть бути отримані шляхом включення до них антитіла, фрагмента антитіла або кон'югата антитіла за цим винаходом у необхідній кількості у відповідному розчиннику з подальшою стерилізацією за допомогою мікрофільтрації. Як розчинник або носій можна використовувати воду, фізіологічний розчин, фосфатний буферний сольовий розчин, декстрозу, гліцерин, етанол тощо, а також будь-які їхні комбінації. У багатьох випадках до композиції переважно включати ізотонічні агенти, такі як цукри, поліспирти або хлорид натрію. Ці композиції можуть також містити ад'юванти, зокрема
Зо агенти для змочування, ізотонічності, емульгації, диспергування й стабілізації. Стерильні композиції для парентерального введення можуть бути також отримані у вигляді стерильних твердих композицій, які можуть бути розчинені під час застосування в стерильній воді або будь- якому іншому стерильному середовищі, придатному для ін'єкцій.
СІТА-специфічне антитіло або фрагмент антитіла можна також вводити перорально.
Таблетки, пігулки, порошки (желатинові капсули, саше) або гранули можуть використовуватися як тверді композицій для прийому всередину. У цих композиціях активний інгредієнт за цим винаходом змішують у атмосфері аргону з одним або більше інертними розріджувачами, такими як крохмаль, целюлоза, сахароза, лактоза або діоксид кремнію. Крім розріджувачів, ці композиції можуть також містити інші речовини, наприклад, одну або більше ковзних речовин, таких як стеарат магнію або тальк, барвник, покриття (драже) або лак.
Як рідкі композиції для прийому всередину можна використовувати фармацевтично прийнятні розчини, суспензії, емульсії, сиропи й еліксири, які містять інертні розріджувачі, такі як вода, етанол, гліцерин, рослинні олії або парафінове масло. Крім розріджувачів, ці композиції можуть містити інші речовини, наприклад, зволожуючі речовини, підсолоджувачі, загусники, смако-ароматичні речовини або стабілізатори.
Дози залежать від бажаного ефекту, тривалості лікування й використовуваного шляху введення; зазвичай вони становлять від 5 мг до 1000 мг на добу перорально для дорослих, причому однократні дози перебувають у діапазоні від 1 мг до 250 мг активної речовини.
Зазвичай лікар визначає відповідне дозування залежно від віку, маси тіла й будь-яких інших чинників, характерних для суб'єкта, якому призначають лікування.
У цьому винаході також пропонуються способи знищення клітини Тгед шляхом введення пацієнтові, який цього потребує, СІТК-специфічного антитіла з активністю АЗКЦ, яке здатне рекрутувати імунні клітини для знищення клітин Тгед, які експресують СІТК. Будь-які СІТК- специфічні антитіла або фрагменти антитіл за цим винаходом можна застосовувати терапевтично. У переважних варіантах втілення СІТК-специфічне антитіло являє собою СІТЕ- специфічне антитіло, описане в цьому документі, або його антигензв'язувальний фрагмент.
У переважному варіанті втілення СІТК-специфічні антитіла або фрагменти антитіл за цим винаходом застосовують для лікування гіперпроліферативного порушення у ссавців. У більш переважному варіанті втілення для лікування гіперпроліферативного порушення у ссавців бо застосовують одну з фармацевтичних композицій, описаних вище, яка містить бІТК-специфічне антитіло або фрагмент антитіла за цим винаходом. В одному варіанті втілення порушення являє собою рак. Було показано, що низка різних ракових пухлин містить СІТК-позитивні імунні клітини. Відповідно, ці пухлини є особливо привабливими мішенями. Такі пухлини включають, наприклад, меланому (включно зі злоякісною меланомою ІІ і ІМ стадії), рак легенів (наприклад, недрібноклітинний рак легенів -- НДКРЛ), рак голови і шиї, рак передміхурової залози, нирковоклітинну карциному й колоректальний рак. У переважних варіантах втілення СІТК- специфічне антитіло являє собою СІТЕ-специфічне антитіло, описане в цьому документі, або його антигензв'язувальний фрагмент.
Інші види раку, які можна лікувати антигензв'язувальними білками, включають, але не обмежуючись цим, рак молочної залози, передміхурової залози, ендометрію, сечового міхура, нирки, стравоходу, яєчка, яєчника, сечового міхура, плоскоклітинну карциному (наприклад, плоскоклітинну карциному голови й шиї -- ПККГШ), увеальну меланому, фолікулярну лімфому, рак шийки матки, головного мозку, підшлункової залози, печінки, лімфому, хворобу Ходжкіна, множинну мієлому, рак шлунка й астроцитарний рак.
У лікуванні будь-якого з вищезгаданих видів раку можна використовувати запропоновані способи лікування для інгібування подальшого росту пухлини, індукування регресії пухлини, підвищення рівня виживання без прогресування й/або загального виживання індивідуума, що має пухлину. У деяких варіантах втілення СЗІТК-специфічне антитіло може також затримувати або запобігати початку метастазування. Прогрес у лікуванні можна відстежувати з використанням різноманітних способів. Наприклад, інгібування може призводити до зменшення розміру пухлини й/або зниження метаболічної активності всередині пухлини. Обидва ці параметри можна вимірювати з використанням, наприклад, магнітно-резонансної томографії (МРТ) або позитронно-емісійної томографії (ПЕТ). Інгібування можна також відстежувати з використанням біопсії для з'ясування рівня некрозу, загибелі пухлинних клітин і рівня васкуляризації всередині пухлини. Поширення метастазів можна відстежувати з використанням відомих способів. Відповідно, фармацевтичні композиції за цим винаходом можна використовувати для лікування або профілактики метастазування різних видів раку, включно з наступними (але не обмежуючись ними): меланома, рак легенів, голови й шиї, ниркових клітин, колоректальний рак, рак молочної залози, передміхурової залози, ендометрію, сечового міхура, нирки, стравоходу, яєчка, яєчників, плоскоклітинна карцинома (наприклад, плоскоклітинна карцинома голови й шиї -- ПККГШ), увеальна меланома, фолікулярна лімфома, рак шийки матки, головного мозку, підшлункової залози, печінки, лімфома, хвороба Ходжкіна, множинна мієлома, рак шлунка й астроцитарний рак.
Аналогічно, у цьому винаході додатково пропонується спосіб інгібування росту вибраних популяцій клітин, який включає приведення в контакт імунних клітин, що експресують СІТЕК, з ефективною кількістю СІТК-специфічного антитіла або фрагмента антитіла за цим винаходом, окремо або в комбінації з іншими терапевтичними агентами. У переважних варіантах втілення
СІТВА-специфічне антитіло являє собою СІТК-специфічне антитіло, описане в цьому документі, або його антигензв'язувальний фрагмент. У переважному варіанті втілення додатковий терапевтичний агент являє собою імунотерапевтичний препарат, тобто, імуностимулюючий агент, який індукує або посилює імунну відповідь. Такі агенти можуть включати, наприклад: 1) активатори дендритних клітин, 2) ад'юванти вакцин, 3) стимулятори Т-клітин, 4) інгібітори імунних контрольних точок і 5) інгібітори супресивних клітин, цитокіни й/або ферменти.
В одному варіанті втілення імуностимулюючий агент являє собою вакцину проти раку. Крім вакцин проти раку, які складаються з пов'язаних з раком антигенів, вакцини, які можна використовувати в комбінації з ЗІТЕ-специфічнимантитілом, включають, без обмежень, вакцини на основі клітин і ДНК гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора (ЗМ-
С5Е), вакцини на основі дендритних клітин, рекомбінантні вірусні вакцини (наприклад, вірус кров'ячої віспи) і вакцини на основі білків теплового шоку (БТШ). Придатні вакцини також включають вакцини проти пухлин, наприклад утворені клітинами меланоми; і можуть бути аутологічними або алогенними. Вакцини можуть бути, наприклад, пептидними, створеними на основі ДНК або клітин. В одному варіанті втілення СІТЕ-специфічне антитіло вводять у комбінації з СО8/С04 антигенспецифічною пептидною вакциною.
Під час клінічного застосування суб'єктові, який цього потребує, вводять терапевтично ефективну кількість (ІТЕ-специфічного антитіла або антигензв'язувального фрагмента.
Наприклад, СІТК-специфічні антитіла та їхні антигензв'язувальні фрагменти можна застосовувати в лікуванні ракових пухлин, що містять СІТК-позитивні імунні клітини. У переважних варіантах втілення СІТК-специфічне антитіло являє собою сСІТК-специфічне антитіло, описане в цьому документі, або його антигензв'язувальний фрагмент. У деяких бо варіантах втілення суб'єкт є ссавцем, переважно людиною. У деяких варіантах втілення СІТЕ-
специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент вводитимуть у вигляді розчину, який було перевірено на стерильність.
Схеми дозування в описаних вище способах лікування й застосування скориговані для забезпечення оптимальної бажаної відповіді (наприклад, терапевтичної відповіді). Наприклад, можна вводити один болюс, можна вводити декілька роздільних доз через певні інтервали часу, або дозу можна пропорційно зменшувати або збільшувати, залежно від показань для конкретних умов терапевтичної ситуації. Парентеральні композиції можуть бути складені у вигляді одиничної дозованої форми для простоти введення та однаковості дозування.
Ефективні дози й схеми лікування ІТ В-специфічними антитілами й фрагментами залежать від захворювання або стану, що підлягає лікуванню, і можуть бути визначені фахівцем у цій галузі. Ілюстративний необмежувальний діапазон терапевтично ефективної кількості сполуки за цим винаходом становить приблизно 0,001-10 мг/кг, наприклад, приблизно 0,001-5 мг/кг, наприклад, приблизно 0,001-2 мг/кг, наприклад, приблизно 0,001-1 мг/кг, наприклад, приблизно 0,001, приблизно 0,01, приблизно 0,1, приблизно 1 або приблизно 10 мг/кг.
Лікар або ветеринар зі звичайною кваліфікацією в цій галузі може легко визначити й призначити необхідну ефективну кількість фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар або ветеринар може почати з призначення нижчої дози бІТК-специфічного антитіла або фрагмента, що міститься у фармацевтичній композиції, ніж необхідно для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступово підвищувати дозу до досягнення бажаного ефекту.
Загалом, відповідна добова доза сІТК-специфічного антитіла за цим винаходом буде являти собою кількість сполуки, яка є найменшою дозою, ефективною для отримання терапевтичного ефекту. Введення може бути, наприклад, парентеральним, таким як внутрішньовенне, внутрішньом'язове або підшкірне. В одному варіанті втілення СІТЕ-специфічне антитіло або фрагмент можна вводити шляхом інфузії у щотижневій дозі, яка розраховується як мг/м. Такі дози, наприклад, можуть бути розраховані на основі доз у мг/кг, запропонованих вище, згідно з наступним рівнянням: доза (мг/кг) х 70. Таке введення можна повторювати, наприклад, від 1 до 8 разів, наприклад, від З до 5 разів. Введення може виконуватися шляхом безперервної інфузії протягом періоду від 2 до 24 год., наприклад, від 2 до 12 год. В одному варіанті втілення для зменшення токсичних побічних ефектів сІТК-специфічне антитіло або фрагмент можна вводити
Зо шляхом повільної безперервної інфузії протягом тривалого періоду часу, наприклад, більше ніж 24 години.
В одному варіанті втілення зІТК-специфічне антитіло або фрагмент можна вводити в тижневій дозі, розрахованій як фіксована доза для введень до восьми разів, наприклад, від чотирьох до шести разів, яку вводять один раз на тиждень. Таку схему можна повторювати за необхідності один або більше разів, наприклад, через шість місяців або дванадцять місяців. Такі фіксовані дози, наприклад, можуть бути розраховані на основі доз у мг/кг, запропонованих вище, приймаючи масу тіла за 70 кг. Дозу можна визначити або скоригувати шляхом вимірювання кількості ЗІТК-специфічного антитіла за цим винаходом у крові після введення, наприклад, шляхом відбору біологічного зразка й використання антиідіотипічних антитіл, мішенню для яких є антигензв'язувальна область бІТК-специфічних антитіл до СІТЕ за цим винаходом.
В одному варіанті втілення СІТК-специфічне антитіло або фрагмент можна вводити як підтримувальну терапію, наприклад, один раз на тиждень протягом періоду шість місяців або більше.
СІТА-специфічне антитіло або фрагмент також можна вводити профілактично з метою зниження ризику розвитку раку, затримки початку наступного виникнення події прогресування раку й/(або зменшення ризику рецидиву раку на стадії ремісії.
СІТВА-специфічні антитіла і їхні фрагменти, описані в цьому документі, також можна вводити у складі комбінованої терапії, тобто в комбінації з іншими терапевтичними агентами, що відповідають захворюванню або стану, який лікують. Відповідно, в одному варіанті втілення лікарський засіб, що містить антитіло, призначено для комбінації з одним або більше додаткових терапевтичних агентів, наприклад, хіміотерапевтичним агентом. У деяких варіантах втілення інші терапевтичні агенти включають, але не обмежуючись цим, антинеопластичні агенти, включно з алкілувальними агентами, які включають азотисті іприти, такі як мехлоретамін, циклофосфамін, іфосфамід, мелфалан і хлорамбуцил; нітрозосечовини, такі як кармустин (ВСМО), ломустин (ССМО) ії семустин (метил-ССМО); Тетоада!"мМ (темозоламід), етиленіміни/метиленамін, такі як триетиленмеламін (ТЕМ), триетилен, тіофосфорамід (тіотепа), гексаметилмеламін (НММ, алтретамін); алкілсульфонати, такі як бусульфан; триазини, такі як дакарбазин (ОТІС); антиметаболіти, включно з аналогами фолієвої кислоти, такими як бо метотрексат і триметрексат, аналогами ппіримідину, такими як 5-фторурацил (5-ФУ),
фтордезоксіуридин, гемцитабін, цитозинарабінозид (АгасС, цитарабін), 5-азацитидин, 2,2- дифтордіоксицитидин, аналогами пурину, такими як б-меркаптопурин, 6-тіогуанін, азатіоприн, 2'- дезоксикоформіцин (пентостатин), еритрогідроксиноніладенін (ЕНМА), флударабіну фосфат і 2- хлордезоксіаденозин (кладрибін, 2-СаА); натуральні продукти, включно з антимітотичними лікарськими засобами, такими як паклітаксел, алкалоїди барвінку, включно з вінбластином (МІВ), вінкристином і вінорелбіном, таксотер, естрамустин і естрамустину фосфат; піподофілотоксини, такі як етопозид і теніпозид; антибіотики, такі як актимоміцин 0, дауноміцин (рубідоміцин), доксорубіцин, мітоксантрон, ідарубіцин, блеоміцини, плікаміцин (мітраміцин), мітоміцин С і актиноміцин; ферменти, такі як І -аспарагіназа; модифікатори біологічної відповіді, такі як інтерферон альфа, І/-2, й-С5ЗЕ і М-С5БЕ; різні агенти, включно з координаційними комплексами платини, такими як цисплатин і карбоплатин, антрацендіонами, такими як мітоксантрон, заміщеною сечовиною, такою як гідроксисечовина, похідними метилгідразину, включно з М-метилгідразином (МІН) і прокарбазином, адренокортикальними супресантами, такими як мітотан (0, р-ООО) і аміноглютетимід; гормони й антагоністи, включно з адренокортикостероїдними антагоністами, такими як преднізолон і еквіваленти, дексаметазон і аміноглютетимід; Сетлаг "мМ (гемцитабін), прогестин, наприклад гідроксипрогестерону капронат, медроксипрогестерону ацетат і мегестролу ацетат; естроген, наприклад діетилстильбестрол і еквіваленти етинілестрадіолу; антиестроген, наприклад тамоксифен; андрогени, включно з тестостерону пропіонатом і флуоксиместероном/еквівалентами; антиандрогени, такі як флутамід, аналоги гонадотропін-рилізинг гормону й лейпролід; і нестероїдні антиандрогени, наприклад флутамід. Види лікування, націлені на епігенетичні механізми, включають, але не обмежуючись цим, інгібітори гістондеацетилази, агенти для деметилювання (наприклад, відаза) і види терапії на основі вивільнення транскрипційної репресії (АТКА) також можна комбінувати з антитілами до СІТЕ.
Додаткові специфічні приклади хіміотерапевтичних агентів включають таксол, таксени (наприклад, доцетаксел і таксотер), модифікований паклітаксел (наприклад, абраксан і опаксіо), доксорубіцин, АмабвіїпФ, сутент, нексавар та інші інгібітори мультикінази, цисплатин і карбоплатин, етопозид, гемцитабін і вінбластин. У комбінації з антитілами до СІТЕ можна використовувати інгібітори інших кіназ, включно з інгібіторами шляху МАРК (наприклад, ЕКК,
Зо УМК і р38), інгібіторами РіЗкінази/нгібіторами АКТ і інгібіторами Ріт, але не обмежуючись цим.
Інші інгібітори включають інгібітори Нероб0, інгібітори протеасом (наприклад, МеїЇсаде) тай інгібітори множинних механізмів дії, наприклад, Тгізхепох.
Таке комбіноване введення може бути одночасним, окремим або послідовним (у будь-якому порядку). Для одночасного введення агенти можна вводити як одну композицію або як окремі композиції, залежно від обставин.
В одному варіанті втілення сІТК-специфічне антитіло або його фрагмент вводять у комбінації з іншим агентом-імуномодулятором, причому агент-імуномодулятор може бути вибраним, наприклад, із групи, що складається з активатора дендритних клітин, наприклад, ліганду СО40 і агоністичного антитіла до СО40, а також енхансерів презентування антигена, енхансерів тропізму Т-клітин, інгібіторів імуносупресивних факторів, пов'язаних із пухлиною, наприклад, ТОЕ-В (трансформувальний фактор росту бета) та ІІ -10.
Деякі способи включають введення СІТК-специфічного антитіла або його фрагмента з вакцинальним ад'ювантом. Такі ад'юванти включають, наприклад, 1-12, і різноманітні агоністи
ТоіІ-подібних рецепторів (ТІК), включно з Сро (агоніст ТІ К 9), монофосфорил-ліпідом А (МР. - агоніст ТІ 4), РоїМмІ:С або РоїмМІСІ С (агоніст ТІ КЗ), резиквімодом і 852А (агоністи ТІ К 7/8).
В інших терапевтичних підходах сІТК-специфічне антитіло вводять у комбінації з фактором росту Т-клітин, наприклад, І--15 і/або 1-17, або активаторами цих молекул. У споріднених способах стимулятор Т-клітин комбінують з антитілом до СІТЕ. Такі стимулятори включають агоністи 4-188, такі як агоністичні антитіла до 4-188 і 4-1881.
В одному варіанті втілення СІТК-специфічне антитіло або його фрагмент вводять разом із інгібітором контрольної точки Т-клітин, наприклад молекулами, які надсилають інгібувальний сигнал до імунної системи. Приклади таких агентів включають інгібітори РО-1 або РО-І 1 (87-
НІ), наприклад антитіла до РО-1ї, включно з ніволумабом (ВгізіоІі-Муег5 бБацібб) і пембролізумабом, також відомим як МК-3475 (МегсК), підилізумабом (Сигеїесі), АМР-224 (Атріїйттипе) і антитіла до РО-Ї1, включно з МРОГ З3280А (Коспе), МОХ-1105 (Вгівю! Муеє"г заці), МЕОІ-4736 (Авіга/епеса) і М5В-0010718С (МегсК). Інші інгібітори контрольних точок включають антагоністи СТІ А-4, наприклад антитіла до СТІ А-4. Прикладом антитіла до СТІ А4 є
УХегиоуфФ (іпілімумаб), доступний у продажу від компанії ВгібіоІ-Муег5 Занцірб. Інші приклади антитіл до СТІ А-4 включають тремелімумаб (Ріїгег), тицилімумаб (Азігагепеса) і АМОР-224 60 (Спіахо Зтійй Кіїпе).
В інших способах СІТК-специфічне антитіло або його фрагмент вводять у комбінації з інгібітором ферменту, який має імуносупресивний ефект. Прикладом є 1-метилтриптофан (ІМТ), який є низькомолекулярним інгібітором індоламін-2,3-діоксигенази.
СІТВА-специфічне антитіло або його фрагмент також можна використовувати в комбінації з
Т-МЕС (талімоген лагерпарепвек) виробництва компанії Атдеп.
У певних варіантах втілення СІТК-специфічне антитіло або його фрагмент вводять у комбінації з біспецифічним антитілом. Біспецифічне антитіло може скеровувати імунну систему хазяїна, зокрема цитотоксичну активність Т-клітин, проти ракових клітин.
СІТА-специфічне антитіло або його фрагмент також можна використовувати в комбінації з різними видами націленої терапії. Приклади видів націленої терапії включають, але не обмежуючись цим, використання терапевтичних антитіл. Приклади антитіл включають, але не обмежуючись цим, антитіла, які зв'язуються з білками клітинної поверхні Нег2, СОС20, СОСЗ33, муцин-подібним глікопротеїном і рецептором епідермального фактора росту (ЕСЕК), присутнім на пухлинних клітинах, ОХ40, РО-1, СО122, СО040, СТІ А-4 і необов'язково індукують цитостатичний і/або цитотоксичний ефект щодо пухлинних клітин, які містять ці білки. Приклади антитіл також включають НЕКСЕРТІМЕ'Е (трастузумаб), який можна використовувати для лікування раку молочної залози й інших форм раку, а також КІТОХАМФ (ритуксимаб), 2ЕМАГІМ М (ібритумомаб тіуксетан) і ГММРНОСІОЕ "М (епратузумаб), які можна використовувати для лікування неходжкінської лімфоми та інших форм раку. Конкретні приклади антитіл також включають панітумумаб (МЕСТІВІХФ), ЕВВІТОХФ (ІМО-С225);; ВЕХХАВ "(йод-131 тозитумомаб); інгібітори КОК (рецептора кіназного домену); антитіла до МЕСЕ і антагоністи (наприклад, Амабіїп?б і МЕСАБЕ-ТКАР); антитіла до рецептора МЕСЕ і антигензв'язувальні області; антитіла до Апд-1 і Апд-2 й антигензв'язувальні області; антитіла до Тіе-2 та інших рецепторів Апод-1 і Апд-2; ліганди Тіе-2; антитіла до інгібіторів Тіе-2-кінази; інгібітори Ніг-1а і
Сатрац мМ (алемтузумаб). У певних варіантах втілення агенти для протиракової терапії являють собою поліпептиди, які селективно індукують апоптоз у пухлинних клітинах, включно з
ТМЕ-спорідненим поліпептидом ТКАЇЇ,, але не обмежуючись цим.
В одному варіанті втілення СІТК-специфічне антитіло або його фрагмент, що пропонується в цьому документі, використовують у комбінації з одним або більше антиангіогенних агентів, які
Зо пригнічують ангіогенез. Конкретні такі агенти включають, але не обмежуючись цим, антагоністи
І/-8; Сатрайй, В-ЕСЕ; антагоністи ЕСЕ; антагоністи Тек (Сегтейці еї аїЇ., публікація США Мо 2003/0162712; Сеїтецйі єї аІ., патент США Мо 6,413,932 і Сеїтецйі еї аІ., патент США Мо 6,521,424); агенти-антитіла до ТМУБЕАК (які включають, але не обмежуючись цим, антитіла й антигензв'язувальні області); розчинні антагоністи рецептора ТУУЕАК (У/іеу, патент США Мо 6,727,225); домен дизінтегрину АСАМ для антагоністичного впливу на зв'язування інтегрину зі своїми лігандами (Рапзіому еї а!., публікація США Мо 2002/0042368); антитіло до рецептора ері й антитіла до ефрину; антигензв'язувальні області або антагоністи (патент США Мо 5,981,245; 5,728,813; 5,969,110; 6,596,852; 6,232,447; 6,057,124); агенти-антитіла до МЕСЕ (наприклад, антитіла або антигензв'язувальні області, які специфічно зв'язують МЕСЕ або розчинні рецептори МЕСЕ або їхні лігандзв'язувальні області), наприклад АмавііїпФ або МЕСЕ-ТКАР "М, і агенти-антитіла до рецептора МЕСЕ (наприклад, антитіла або антигензв'язувальні області, які специфічно з ним зв'язуються), ЕСЕК-інгібувальні агенти (наприклад, антитіла або антигензв'язувальні області, які специфічно з ним зв'язуються) такі як панітумумаб, ІКЕЗББА "М (гефітиніб), ТАКСЕМА мМ (ерлотиніб), агенти у вигляді антитіла до Апд-1 і антитіла до Апд-2 (наприклад, антитіла або антигензв'язувальні області, які специфічно зв'язуються з ними або їхніми рецепторами, наприклад, Тіе-2/ТЕК), і інгібувальні агенти проти Тіе-2-кінази (наприклад, антитіла або антгензв'язувальні області, які специфічно зв'язують і інгібують активність факторів росту, наприклад, антагоністи фактора росту гепатоцитів (НОБЕ, також відомий як розсіювальний фактор), і антитіла або антгензв'язувальні області, які специфічно зв'язують його рецептор "с- те?" (наприклад, рилотумумаб і АМО 337, Атдеп); антагоністи антитіл до РОСЕ-ВВ; антитіла й антигензв'язувальні області до лігандів РОСЕ-ВВ; і інгібітори РОСЕРК-кінази.
Інші антиангіогенні агенти, які можна використовувати у комбінаціях з зІТК-специфічним антитілом або його фрагментом, включають такі агенти, як інгібітори ММР-2 (матрикс- металопротеїназа 2), інгібітори ММР-9 (матрикс-металопротеїназа 9) і інгібітори СОХ-Ї (циклооксигеназа І). Приклади придатних інгібіторів СОХ-І включають СЕГЕВКЕХ М (целекоксиб), валдекоксиб і рофекоксиб.
СІТВА-специфічне антитіло або його фрагмент, що пропонуються в цьому документі, можна також використовувати в комбінації з інгібітором фактора росту. Приклади таких агентів включають, але не обмежуючись цим, агенти, які можуть інгібувати відповіді ЕСЕ-К (рецептор бо епідермального фактора росту), наприклад антитіла до ЕСБЕ-К (наприклад, панітумумаб
(УЕСТІВІХФ))), антитіла до ЕСЕ і молекули, які являють собою інгібітори ЕСБ-К; інгібітори МЕСЕ (фактор росту судинного ендотелію), наприклад, рецептори МЕСЕ і молекули, які можуть інгібувати МЕСБЕ; і інгібітори рецептора егрВ2, наприклад органічні молекули або антитіла, які зв'язуються з рецептором егбВ2, наприклад, НЕЕСЕРТІМО (Сепепіесі, Іпс.). Інгібітори ЕСБЕ-В описано, наприклад, у патенті США Мо 5,747 498, МО 98/14451, МО 95/19970, і УМО 98/02434.
У деяких видах застосування для лікування, зокрема у разі метастазування в кістки, коли відбувається негативний вплив на кістки, можна вводити СІТК-специфічне антитіло або його фрагмент з терапевтичним агентом, який інгібує подальшу втрату кісткової маси або сприяє відновленню кістки після втрати кісткової маси. Відповідно, ІТ К-специфічне антитіло або його фрагмент можна вводити з терапевтично ефективною кількістю агента, що сприяє росту кістки (є анаболічним), або агентом, що пригнічує резорбцію кістки, включно з морфогенними кістковими факторами, що мають назву від ВМР-1 до ВМР-12, але не обмежуючись цим; трансформувальний фактор росту-ВД і представники родини ТОЕ-Д; фактори росту фібробластів від ЕСОЕ-1 до ЕОБЕ-10; інгібітори інтерлейкіну-1 (включно з ЇЇ-1га, антитілами до 1-1 і антитілами до рецепторів ІЇІ--1); інгібітори ТМЕа (включно з етанерцептом, адалібумабом і інфліксимабом); інгібітори ліганду КАМК (включно з розчинним КАМК, остеопротегерином і антагоністичними антитілами, що специфічно зв'язують КАМК або ліганд КАМК, наприклад денозумаб (ХОЕМАФ)), інгібітори ЮОКК-1 (наприклад, антитіла до ОКК-1), паратиреоїдний гормон, простагландини серії Е, бісфосфонати й мінерали, що посилюють кістку, наприклад фтор і кальцій. Анаболічні агенти, які можна використовувати в комбінації з антитілами до СІТК і їхніми функціональними агентами, включають паратиреоїдний гормон і інсуліноподібний фактор росту (ІСЕ), причому останній агент переважно входить до комплексу з ІСЕ-зв'язувальним білком.
Антагоніст рецептора 1-1, придатний для такого комбінованого лікування, описано в
УО89/11540, а придатний розчинний рецептор-1 ТМЕ описано в М/О98/01555. Приклади ліганду
КАМК описані, наприклад, у МО 03/086289, МО 03/002713, патенті США Мо 6,740,511 і 6б,479,635.
В одному варіанті втілення спосіб лікування раку включає введення суб'єктові, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості СІТЕ-специфічного антитіла, як описано в цьому документі, разом із променевою терапією. Променева терапія може включати опромінення або
Зо його поєднання з введенням пацієнтові радіофармацевтичних препаратів. Джерело випромінення може бути зовнішнім або внутрішнім для пацієнта, якого лікують (лікування опроміненням, наприклад, може здійснюватися у вигляді зовнішньої променевої терапії (ЕВКТ) або брахітерапії (ВТ)). Радіоактивні елементи, які можна використовувати для практичної реалізації таких способів, включають наприклад, радій, цезій-137, іридій-192, америцій-241, золото-198, кобальт-57, мідь-67, технецій-99, йодид-123, йодид-131 і індій-111.
Способи виявлення СІТЕ
У цьому винаході пропонуються способи виявлення СІТК у біологічному зразку шляхом приведення в контакт зразка з антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, описаними в цьому документі. Як описано в цьому документі, зразок можна отримати з сечі, крові, сироватки, плазми, слини, асцитної рідини, циркулюючих клітин, циркулюючих пухлинних клітин, клітин, не пов'язаних із тканинами (тобто вільних клітин), тканин (наприклад, хірургічно видаленої пухлинної тканини, біоптатів, включаючи зразки тонкогольчатої аспіраційної біопсії), гістологічних препаратів тощо. У деяких варіантах втілення описані способи включають виявлення ІТК у біологічному зразку шляхом приведення в контакт зразка з будь-яким із СІТЕ- специфічних антитіл або їхніх антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі.
У деяких варіантах втілення зразок можна приводити в контакт більше ніж з одним із сІТК- специфічних антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, описаних у цьому документі.
Наприклад, зразок можна приводити в контакт з першим СІТЕ-специфічним антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, а потім приводити в контакт з другим СІТК-специфічним антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, причому перше антитіло або антигензв'язувальний фрагмент і друге антитіло або антигензв'язувальний фрагмент є різними антитілами або антигензв'язувальними фрагментами. У деяких варіантах втілення перед контактуванням зі зразком перше антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент може бути прикріпленим до поверхні, наприклад, багатоямкового планшета, чипа або подібного субстрату.
В інших варіантах втілення перед контактуванням зі зразком перше антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент може не бути прикріпленим або приєднаним до будь-чого.
Описані СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти можуть бути мічені з можливістю визначення. У деяких варіантах втілення мічені антитіла й антигензв'язувальні фрагменти можуть полегшувати виявлення ІТК за допомогою способів, описаних у цьому 60 документі. Фахівцям у цій галузі добре відомо багато таких міток. Наприклад, відповідні мітки включають, не обмежуючись перерахованим, радіоактивні мітки, флуоресцентні мітки, епітопні мітки, біотин, хромофорні мітки, ЕХЛ-мітки або ферменти. Більш конкретно, описані мітки включають рутеній, ""Іп-ДОТА, ""Іп-діетилентриамінпентаоцтову кислоту (ДТПК), пероксидазу хрону, лужну фосфатазу й бета-галактозидазу, полігістидин (НІ5-мітка), акридинові барвники, ціанінові барвники, флуоронові барвники, оксазинові барвники, фенантридинові барвники, родамінові барвники, барвники АіІехайсого тощо.
Описані СІТК-специфічні антитіла й антигензв'язувальні фрагменти можна використовувати в різних аналізах для виявлення СТЕ у біологічному зразку. Деякі відповідні аналізи включають, не обмежуючись перерахованим, аналіз вестерн-блот, радіоімуноаналіз, поверхневий плазмонний резонанс, імунофлуориметрію, імунопреципітацію, рівноважний діаліз, імунодифузію, електрохемілюмінесцентний (ЕХЛ) імуноаналіз, імуногістохімічний аналіз, сортування клітин з активацією флуоресценції (ГАС5) або аналіз ЕГІЗА.
Набори для виявлення СІК
У цьому винаході пропонуються набори для виявлення СІТК у біологічному зразку. Ці набори включають одне або більше СІТК-специфічних антитіл, описаних у цьому документі, або їхніх антигензв'язувальних фрагментів, і інструкції з використання набору.
Запропоноване СІТК-специфічне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може знаходитися в розчині; бути ліофілізованим; прикріпленим до субстрату, носія або планшета; або міченим із можливістю визначення.
Описані набори можуть також включати в себе додаткові компоненти, які використовуються для реалізації способів, описаних у цьому документі. Як приклад, набори можуть містити засоби для отримання зразка у суб'єкта, контрольний або еталонний зразок, наприклад зразок, отриманий у суб'єкта, який має повільно прогресуючий рак і/або у суб'єкта, який не має ракового захворювання, одну або більше комірок для зразка і/або навчальні матеріали, у яких описано проведення способу за винаходом, і тканиноспецифічні контролі або стандарти.
Засоби для визначення рівня СІТЕ можуть додатково включать, наприклад, буфери або інші реагенти для використання в аналізі визначення рівня СІТК. Інструкції можуть являти собою, наприклад, друковані інструкції щодо проведення аналізу й/або інструкції щодо оцінки рівня експресії СІТК.
Зо Описані набори також можуть включати засоби для виділення зразка у суб'єкта. Ці засоби можуть містити один або більше окремих предметів обладнання або реагентів, які можуть бути використані для отримання рідини або тканини у суб'єкта. Засоби для отримання зразка у суб'єкта також можуть являти собою засоби для виділення із зразка крові її компонентів, таких як сироватка. Переважно набір призначено для використання в суб'єкта-людини.
ПРИКЛАДИ ВТІЛЕННЯ ОПИСАНОГО ОБ'ЄКТА ВИНАХОДУ
Для кращого й більш повного описання об'єкта винаходу в цьому розділі наведено пронумеровані приклади втілення представленого об'єкта винаходу.
Пронумеровані варіанти втілення:
ВАРІАНТИ ВТІЛЕННЯ
1. Виділене антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які специфічно зв'язують
СІТЕ людини й містять: а. СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 5, ії СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО
ІО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 35; р. СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 2, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 13, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 29, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО
ІО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 36; с. СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 6, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 14, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 30, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО
ІО МО: 33, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 37; а. СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 7, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 15, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність з«ЕО
ІО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 35; е. СОК!І важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 7, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 16, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО
ІО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 35;
Її. СОСОК важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 8, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 17, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО
ІО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 35; 9. СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 9, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 18, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО
ІО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 35; п. СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зБЕО ІО МО: 10, ї СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 19, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО
ІО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 35; і. СОКІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 7, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 20, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 31, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО
ІО МО: 34, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 38; . СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 11, і СОКЗ важкого ланцюга, що має
Зо амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 21, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 31, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО
ІО МО: 34, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 38;
К. СОКІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 7, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 22, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність «ЕФ
ІО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 35;
І. СОКІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 7, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 23, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО
ІО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 35; т. СОКІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО І МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ХЕО ІЮО МО: 7, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕБО ІЮ МО: 24, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕ
ІО МО: 35; п. СОК1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 7, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 25, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність «ЕС
ІО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 35; о. СОКІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 27, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 5, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕБО ІЮ МО: 26, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮ МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність з«»ЕО
ІО МО: 35; або р. СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 3, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 11, і СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО
ІО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 35. 2. Виділене антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які специфічно зв'язують
СІТЕ людини й містять область важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з 5ЗЕО ІЮ
МО: 39-54, 63 і 64.
З. Антитіло за варіантом втілення 2, яке відрізняється тим, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить область легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 55-58. 4. Антитіло за варіантом втілення 2, яке відрізняється тим, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить область важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 39-54, 63 і 64, і область легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 55-58. 5. Антитіло за варіантом втілення 4, у якому а. область важкого ланцюга містить ЗЕО ІЮ МО: 39, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 55; р. область важкого ланцюга містить 5ЕО ІЮ МО: 40, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зхЕО ІЮ МО: 56; с. область важкого ланцюга містить 5ЕО ІЮ МО: 41, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮО МО: 57; а. область важкого ланцюга містить ЗЕО ІО МО: 42, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 55; е. область важкого ланцюга містить ЗЕО ІЮ МО: 43, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 55;
Ї. область важкого ланцюга містить ЗЕО ІО МО: 44, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 55; д. область важкого ланцюга містить ЗЕО ІЮО МО: 45, спарену з областю легкого ланцюга, яка
Ко) містить зЕО ІЮ МО: 55;
І. область важкого ланцюга містить 5ЕО ІЮ МО: 46, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 55; і. область важкого ланцюга містить 5ЕО ІЮ МО: 47, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 58; | область важкого ланцюга містить ЗЕО ІЮ МО: 48, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 58;
К. область важкого ланцюга містить ЗЕО ІО МО: 49, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 55;
Ї. область важкого ланцюга містить 5ХЕО ІЮ МО: 50, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 55; т. область важкого ланцюга містить ЗЕО ІЮ МО: 51, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 55; п. область важкого ланцюга містить 5ЕО ІЮ МО: 52, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 55; о. область важкого ланцюга містить ЗЕО ІО МО: 53, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 55; р. область важкого ланцюга містить 5ЕО ІЮ МО: 54, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 55; д. область важкого ланцюга містить ЗЕО ІЮО МО: 63, спарену з областю легкого ланцюга, яка
БО містить 5ЕО ІЮ МО: 55; або г. область важкого ланцюга містить 5ЕО ІЮ МО: 64, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить БЕО ІЮ МО: 55. б. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 5, які відрізняються тим, що антитіло специфічно зв'язує СІТК людини шляхом взаємодії з СІТК (ЗЕО
ІО МО: 62 на амінокислотних залишках: а. 40-45; і р. 75-79.
7. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1, які відрізняються тим, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язує поліпептид, що має амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 59. 8. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1, які відрізняються тим, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент специфічно зв'язує СІТЕ людини з афінністю зв'язування принаймні 30 нМ, як визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, з використанням плану експерименту, описаного у прикладі 9. 9. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1, які відрізняються тим, що антитіло або антигензв'язувальний фрагмент індукує підвищення експресії люциферази в аналізі гена МЕ-КВ люциферази. 10. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1, які відрізняються тим, що антитіло або антигензв'язувальний фрагмент індукує АЗКЦ іп міїго зі значенням ЕСзо менше ніж приблизно 67 нг/мл. 11. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1, які відрізняються тим, що антитіло або антигензв'язувальний фрагмент являє собою антитіло або антигензв'язувальний фрагмент людини. 12. Антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1, який відрізняється тим, що антигензв'язувальний фрагмент являє собою Рар-фрагмент, Рар2-фрагмент або одноланцюгове антитіло. 13. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1, які відрізняються тим, що антитіло або антигензв'язувальний фрагмент є рекомбінантним. 14. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1, які відрізняються тим, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент має ізотип Ід, Ідс2, ІдеЗ або Ідсаі. 15. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1 має ізотип Їдс1. 16. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким одним із варіантів втілення 1, які відрізняються тим, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент специфічно зв'язує
СІТЕ людини й СІТЕ яванського макака. 17. Полінуклеотид, що кодує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким одним із варіанта втілення 1.
Зо 18. Вектор, який містить полінуклеотид за варіантом втілення 17. 19. Клітина-хазяїн, яка містить вектор за варіантом втілення 18. 20. Спосіб отримання описаного антитіла або антигензв'язувального фрагмента, який включає: культивування клітини-хазяїна, як визначено у варіанті втілення 19, в умовах, що дозволяють експресію антитіла або антигензв'язувального фрагмента, і виділення молекули антитіла або антигензв'язувального фрагмента з культури. 21. Спосіб полегшення симптому раку або іншого стану, пов'язаного з новоутворенням, причому спосіб включає введення суб'єктові який цього потребує, антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за варіантом втілення 1 у кількості, достатній для полегшення в суб'єкта симптому раку або іншого стану, пов'язаного з новоутворенням. 22. Спосіб за варіантом втілення 21, який відрізняється тим, що суб'єкт є людиною. 23. Спосіб за варіантом втілення 21, який додатково включає одне або більше з наступного: а. застосування хіміотерапії р. застосування променевої терапії; або с. застосування одного або більше додаткових терапевтичних агентів. 24. Спосіб за варіантом втілення 23, який відрізняється тим, що додатковий терапевтичний агент являє собою імуностимулюючий агент. 25. Спосіб за варіантом втілення 24, який відрізняється тим, що імуностимулюючий агент вибирають із групи, що складається з антитіла до РО-1, антитіла до СТІ А-4, антитіла до СО122, антитіла до СО40, антитіла до ОХ40 і специфічної до антигена СО8 вакцини на основі пептиду
ОМА. 26. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1 і фармацевтично прийнятний носій. 27. Набір, що містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за варіантом втілення 1 і упаковку для них.
ПРИКЛАДИ
Наступні приклади наведені для доповнення попереднього опису винаходу й для кращого розуміння об'єкта винаходу, описаного в цьому документі. Ці приклади не слід розглядати як обмеження описаного об'єкта винаходу. Необхідно розуміти, що приклади й варіанти втілення, бо описані в цьому документі, наведені тільки з метою ілюстрації, і що для фахівця в цій галузі в світлі цього опису будуть очевидні різні модифікації або зміни, які повинні вважатися включеними до істинного об'єму винаходу, і які можуть бути реалізовані без відхилення від цього об'єму.
ПРИКЛАД 1. МАТЕРІАЛИ
МОЛЕКУЛИ ЕСО ІТК
Рекомбінантний людський (Пп) гібридний білок ЗІТК-Ес (номер за каталогом КО Бубіет5 689-ОК), що відповідає амінокислотам 26-161 ПСІТК (ЗЕО ІЮ МО:59). Для досліджень фагового пенінгу білок біотинілювали. Цей білок також використовували для вимірювання зв'язування й афінності.
КЛІТИННІ ЛІНІЇ СІТВ
СІТЕ експресували в клітинах НЕК29З3Е шляхом трансфекції або лентивірусної трансдукції для підтвердження реактивності антитіла до СІТК, для фагового тестування й набору аналізів секвенування нового покоління, а також для перевірки перехресної реактивності хітів тАБб до
СІТК з СІТК яванського макака.
Трансфіковані клітини демонстрували наступні послідовності БІТ:
СІТК людини (5ЕО ІЮ МО: 60)
ОАєРТтааРєаСаРОаВ ат атрАВССАУНТТАССВОМРЕЕЕССЗЕМОСМСМОРЕЕНСИЯаОрРОС
ТТСАННРСРРОССМОБОСКЕЗеаРОСІОСАЗОИаТЕЗанЕСНСКРУТОСТОРИаРІ ТМЕРаМКТНМА
МСУРОБРРАЕРІ СУМІ ТММ ЇЇ АМААСУП І ТАС СІ НІММОЇ АВБОСМУУ РЕЕТО ШІ ЕМРРОТЕВАНЗС
ОРГРЕЕЕВНСЕНЗАЕЕКОВІ СІ ММ
СІТЕ яванського макака (ЗЕО ІЮ МО: 61)
ОАєРТтааРєРаСаРОаВ ат акрАВССВУНРТАССАОМОЗЕЕССЗЕМОСУСМОРЕЕНСОаМРОС
ТТСОННРСРІСОФДИаМОРОСКЕЗеРаЕВСУрСАГатЕЗванранскРУТОСТОРОРІ ТМЕРОМКТНМА
МСУРИаБРРАЕРРОМ/І ТІМ АМААСМИ ГІ ТАС СІ НІММО аЗОРТаРАВЕТО І ЕМРРОТЕВАЗЗСО
ЕРЕЕЕВСЕВІ АЕЕКОаВІ СІ ММ
Клітини, трансдуковані лентивірусом, демонстрували наступні послідовності СТЕ:
СІТК людини (5ЕО ІЮ МО: 62)
МАОНСаАМОИАРВА! Саї АГ СА 5 ОВРТаСРОИаСОРОВІ І СТатрААССсАУнТТАССАОХР
СЕЕССЗЕМОСМСМОРЕЕНСЯОРСОСТТСАННРСРРООССЯМОБОСКЕЗеИаРОСІОСАЗИТЕЗОСНЕС
Коо) НСКРИУТОСТОРОРІ ТМЕРОМКТНМАМСУРИЗРРАЕРІ СУМІ ТУМИЇ АМААСМІ ГІ ТБАОІ СІ НІМОЇ В
ЗОСМУМУРВЕТОП ГЕМРРЗТЕОАНЗСОБГРЕЕЕНСЕНЗАЕЕКОИ ВІ СОЇ ЛМИМ
СІТЕ яванського макака (ЗЕО ІЮ МО: 61)
ОАєРТтааРаСаРОаВ ат акрАВССВУНРТАССАОМОЗЕЕССЗЕМОСУСМОРЕЕНСОМРОС
ТТСОННРСРІСОФДИаМОРОСКЕЗеРаЕВСУрСАГатЕЗванранскРУТОСТОРОРІ ТМЕРОМКТНМА
МСУРИаБРРАЕРРОМ/І ТІМ АМААСМИ ГІ ТАС СІ НІММО аЗОРТаРАВЕТО І ЕМРРОТЕВАЗЗСО
ЕРЕЕЕВСЕВІ АЕЕКОаВІ СІ ММ
Транзиторну експресію клітин НЕК 293Е здійснювали за 24 години до трансфекції шляхом розміщення клітин у середовищі Егеезіуетм 293 ((ірсо Мо 12338) зі щільністю Те? клітин/мл у об'ємі 30 мл у флаконах для струшування об'ємом 125 мл із кришкою з отвором під час струшування зі швидкістю 130 об/хв. Трансфекцію виконували з використанням реагенту
Егеевіуе тах (Іпмйгодеп Мо 16447). Для одиночної трансфекції в 30 мл, в одній пробірці розводили 37,5 мкл реагнта Егеезіуїе тах у 1 мл середовища ОріМЕМ (Сірсо Ме31985). В окремій пробірці змішували 37,5 мкг ДНК (300 нанограмів мішені й 37,2 мкг неспорідненої плазміди-носія) в 1 мл ОріїМЕМ. Потім дві пробірки змішували разом, інкубували в біологічно безпечній шафі протягом 1 хвилини, після чого суміш додавали безпосередньо до флаконів з клітинами НЕК29ЗР. Після 48 годин росту клітини були готові для використання в указаних аналізах.
Відповідно до протоколу виробника виконували трансдукцію лентивірусних частинок, які презентували повнорозмірний СІТК, виготовлених компанією Сепесороеїа (каталожний Мо ГРР-
БО цо202-ІМ105-200-5 компанії Сепесороєїа для СІТЕ людини і каталожний Ме І РР-Ш0202-І М105- 200-5 компанії Сбепесоровіа для СІТК яванського макака), в клітини. Трансдуковані клітини відбирали за стабільною інтеграцією плазміди, а потім сортували окремі клітини з використанням сортера клітин да77 для ЕАС5 виробництва компанії ВО Віозсіепсе5. Поверхневу експресію СІТК визначали кількісно з використанням проточної цитометрії з забарвленням антитілом ЕАВб68О9Р до пПисіІТЕ від компанії КО 5Зузіетв і аналізували на приладі Ассигі Сб від компанії ВО Віозсіепсев.
ПРИКЛАД 2. ВИЯВЛЕННЯ АНТИТІЛ ДО ІТ ІЗ ВИКОРИСТАННЯМ ТЕХНОЛОГІЇ
ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ
Проводили пенінг де помо бібліотек Раб-ріХ (Ні, Ї., еї а! У Мої Віої, 2010. 397(2):р. 385-396. 60 МО 2009/085462), що складалися з бібліотек Мні-69, 3-23 і 5-51 важкого ланцюга, спарованих із
Зо бібліотеками Мк МІ КЗ3-20, МІ К4-1, МІ КЗ-11 і МІ К1-39 легкого ланцюга, щодо біотинільованого людського гібриду СІТК-ЕСО Ес у концентрації 100 нМ (раунди 1-3) або 10 нМ (раунд 4) за допомогою способу селекції, подібного до описаного у Коїе еї аї, ) Мої! Віо! 376:1182-1200, 2008 і ееїд| еї аї, Мої Іттипої. 46: 135-144, 2008.
Ген ріХ вирізали з фагемідної ДНК після четвертого раунду пеннінгу з отриманням розчинних кодувальних областей Раб з Ніз-міткою. Раб-фрагменти експресували в Е. сої, і проводили їх скринінг на зв'язування з СІТК методом ЕГІЗА. Коротко, 96-ямкові планшети Мипс
Махізогр Ріаїез (Мипс Мо 437111) покривали або стрептавідином (Рготеда), або овечими антитілами до Ба людини (сайт зв'язування Мо РСО75) у ФБР у концентрації 5 мкг/мл протягом ночі за 4 "С. Бактеріальні культури, що містять експресійний вектор Раб, вирощували в 1 мл 2ХТ (карбенецилін)у у культуральних планшетах з глибокими ямками до утворення каламутності (ОГбО0 - 0,6). Після цього експресію Бар стимулювали додаванням ізопропілтіогалактозиду (ІПТГ) до концентрації 1 мМ. Культури вирощували протягом ночі за
З0"С, а потім на наступний день освітлювали центрифугуванням. Планшети, покриті стрептавідином, промивали тричі трис-буферним розчином (ТБР), 0,5 95 твін-20 (Зідта Мо 79039-10РАК), завантажували біотинільованим СІТК-Ес у концентрації 5 мкг/мл і витримували за кімнатної температури протягом 30 хвилин. З використанням робота Віотек для роботи з рідинами (ВесКтап Сошкег) планшети Махізогр, покриті антитілом до Ка, і планшети, покриті стрептавідином, тричі промивали ТБР, 0,5 95 твіном-20 (Зідта Мо 79039-10ОРАК) і блокували з використанням 200 мкл ФБР-твін (0,5 90) ї- знежирене сухе молоко (З Фо) на ямку протягом однієї години за кімнатної температури. На цій стадії і всіх наступних стадіях планшети промивали тричі з використанням ТБР, 0,5 95 твін-20 (Зідта Мо 79039-10РАК). У кожну ямку додавали 50 мкл супернатанта Раб з наступною інкубацією протягом однієї години за кімнатної температури.
Після промивання додавали 50 мкл козячих антитіл до людського легкого ланцюга каппа, кон'югованого з пероксидазою хрону (НКР) (Зошіпегп Віоїесі), у розведені 1: 5000 у ТВ51Т з 0,3 96 молоком, і інкубували планшети протягом однієї години за кімнатної температури.
Промивали планшети, і відповідно до інструкцій виробника додавали 50 мкл хемілюмінесцентного субстрату Роб (Коспе Мо 121-5829500001). Зчитували люмінесценцію планшетів на спектрофотометрі для зчитування планшетів ЕпМібіоп (РегКіп ЕІтег). Для ДНК-
Зо секвенування відбирали клони, які були позитивними як у аналізі ЕІ ІЗА на експресію таб, такі в аналізі ЕГІЗА на зв'язування СІТК. Загалом в цьому процесі пенінгу було встановлено 50 унікальних послідовностей Раб. Унікальні М-області важкого ланцюга клонували в експресійних векторах людського їдДС1 с1т(17,1), унікальні легкі ланцюги клонували в експресійних векторах людського легкого ланцюга каппа, а отримані антитіла знову тестували на зв'язувальну активність у аналізі ЕГІЗА.
ПРИКЛАД 3. ПОЧАТКОВЕ ВИЗНАЧЕННЯ ХАРАКТЕРИСТИК АНТИТІЛ ДО ІТК,
ОТРИМАНИХ ШЛЯХОМ ТЕХНОЛОГІЇ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ
АНАЛІЗ ЗВ'ЯЗУВАННЯ З СІТКЕ ЛЮДИНИ
Зв'язування антитіл до ЗІТК зі сконструйованими клітинами оцінювали з використанням
ЕАС5. Метою скринінгового аналізу була ідентифікація антитіл, які зв'язуються з клітинами, що експресують ПОСТ.
Коротко, у 96-ямкові планшети (Сгеїпег Біо опе, кат. Мо 651261) вносили по 300 000 клітин на ямку, і осаджували клітини. Клітини промивали 100 мкл буфера для забарвлення для ЕАСЗ (ВО
Ріпаптіпдеп Зіаіїп Вийег (ВА), кат. Мо 554657), інкубували за 4 "С протягом 30 хвилин із сумішшю з 50 мкл буфера для забарвлення для БАСЗ і 20 мкл на ямку неочищених супернатантів антитіл, і промивали один раз з використанням 200 мкл буфера для забарвлення для ЕАС5. Для виявлення клітини піддавали 30-хвилинній інкубації за 4 "С з 50 мкл на ямку козячих антитіл до людського дО АїЇеха Рішог 488 (НІ) (МоїІесшаг Ргобев5, кат. Мо А11013) у концентрації 2 мкг на мл у буфері для забарвлення для ЕАС5. Клітини промивали один раз з використанням 200 мкл на ямку буфера для забарвлення для ГАС5, ресуспендували у 150 мкл на ямку буфера для забарвлення для БАС5, а потім переносили в пробірки для ЕГАС5, які містили 200 мкл на ямку буфера для забарвлення для РАС5. Після цього проводили аналіз
ЕАС5. Аналіз повторювали для узгодженості даних, і вибирали кращі зв'язувальні речовини для додаткового розроблення.
АНАЛІЗ ГЕНА МЕ-КкКВ ЛЮЦИФЕРАЗИ
Для оцінки агоністичної активності антитіл до (ІТК проводили скринінг панелі з використанням аналізу гена МЕ-КВ люциферази. Коротко, транзиторно трансфікували клітини
НЕК293 репортерною плазмідою, яка кодує ген люциферази під контролем промотора МЕ-кВ разом із експресійною плазмідою людського СІТК. Клітини залишали відновитися після бо трансфекції та протягом чотирьох годин експресувати людський СІТК за 37 "С, у цей момент часу можна було виконувати аналіз. Для підтвердження того, що аналіз працює належним чином, до ямок з позитивним контролем додавали рекомбінантний людський ліганд СІТЕ (К80
Зузієте 6987-СІ/СЕ) у кінцевій концентрації 2,5 мікрограма на мл. Антитіла до СТЕ, які тестували, додавали до експериментальних ямок у кінцевій концентрації 5 мікрограмів на мл.
Потім планшети інкубували за температури 37 "С протягом чотирьох годин. Очікували, що успішна сигналізація СІТЕ буде активувати шлях МЕ-КВ з наступною експресією люциферази, яку можна виявити шляхом додавання реагенту 5іеаду Сіо, відповідно до вказівок виробника (Рготеда, кат. Ме Е2550), і вимірювання отриманої люмінесценції на спектрофотометрі для зчитування планшетів Епмізіоп (Регкіп ЕІтег).
П'ятнадцять антитіл індукували експресію люциферази порівняно з обробкою лише ФБР (Фіг. 1). Антитіла, які призводили до підвищення експресії люциферази порівняно з обробкою лише ФБР попередньо класифікували як агоністів, тоді як решта антитіл може бути антагоністами або може просто зв'язуватися з СІТК без впливу на сигналінг.
ПРИКЛАД 4. ВИЯВЛЕННЯ АНТИТІЛ ДО СІК ШЛЯХОМ СЕКВЕНУВАННЯ НОВОГО
ПОКОЛІННЯ
Після виявлення першого набору антитіл до СІТК зразки ДНК з кінцевого раунду фагової селекції передавали до ВесКтап СоциМег (зепотісх для проведення секвенування нового покоління М-областей важкого ланцюга з використанням платформи для секвенування Коспе 454. Необроблені дані від Весктап Сошег Сепотіс5 піддавали початковому аналізу у програмі
ІМОТ, а потім більш детально перевіряли самостійно з використанням власної комп'ютерної програми дапозеп ЗОХ. Ідея використання секвенування нового покоління для більш детальної перевірки результатів фагової селекції була розроблена нещодавно як спосіб збільшення числа і якості виявлених антитіл (Камп еї аї, Меїйод5 60 (2013) ра 99-110).
З послідовностей, наданих ІМОТ, відфільтровували зразки, які мали недостатню якість або які містили стоп-кодони, а потім решту послідовностей сортували за СОКЗ важкого ланцюга.
Цей підхід обирали тому, що очікується, що СОКЗ відповідає за основну енергію зв'язування з антигеном, і основне різноманіття у фагових бібліотеках зосереджено в СОКЗ важкого ланцюга.
Для ДНК-синтезу й клонування у вектор людського дсСї с1т(17) було обрано вісімдесят сім М- областей на основі як частоти, з якою вони зустрічаються, так і відсутності залишків цистеїну,
Зо метіоніну або високогідрофобних послідовностей.
Після синтезу ймовірні важкі ланцюги антитіл до СІТК тестували на зв'язування з СІТК, як описано вище. Оскільки набір даних після секвенування нового покоління не містив інформації про відповідні партнери-легкі ланцюги для цих М-областей важких ланцюгів, важкі ланцюги піддавали спільній трансфекції з кожним із 4 зародкових генів легкого ланцюга, знайдених у фагових бібліотеках: МК3-20, МК4-1, МКЗ-11 ії МК1-39. Неочищені супернатанти антитіл від цих чотирьох стандартних трансфекцій тестували в аналізі ЕГІ5БА на здатність зв'язуватися з рекомбінантним людським гібридним білком СІТЕ ЕСО-Ес. Сполуки з найкращим зв'язуванням за цим аналізом відбирали для подальшої розробки.
ПРИКЛАД 5. ПОЧАТКОВЕ ВИЗНАЧЕННЯ ХАРАКТЕРИСТИК АНТИТІЛ ДО ІТК,
ОТРИМАНИХ ШЛЯХОМ СЕКВЕНУВАННЯ НОВОГО ПОКОЛІННЯ
Після того, як у наборі даних, отриманих у секвенуванні нового покоління, було продемонстровано, що тАб до СІТК зв'язуються з гібридним білюом СІТК ЕСО-Ес в аналізі
ЕГПІЗА, підмножину тестували на зв'язування з СІТК клітинної поверхні, як описано в ПРИКЛАДІ
З. Сполуки, які були позитивними щодо зв'язування тестували на агоністичну активність з використанням аналізу гена на МЕ-кВ-люциферази, як описано в ПРИКЛАДІ 3. Вважали, що антитіла, які в концентрації 40 мікрограмів на мл індукували підвищення експресії люциферази, яке дорівнювало принаймні 20 95 підвищення порівняно з фоновим рівнем, яке спостерігали після обробки природним лігандом, мають агоністичну активність (Фіг. 2).
ПРИКЛАД 6. ПЕРЕХРЕСНА РЕАКТИВНІСТЬ З МОЛЕКУЛАМИ ЯВАНСЬКОГО МАКАКА
Очищені антитіла, отримані після фагового дисплея та після секвенування нового покоління, тестували на зв'язування з СЗІТК яванського макака з використанням проточної цитометрії.
Транзиторно трансфіковані клітини інкубували за 2-8 "С протягом 30 хвилин з 0,1 мг/мл досліджуваних антитіл, промивали й інкубували за 2-8 "С протягом 30 хвилин з міченими фікоеритрином (ФЕ) козячими антитілами до людського Ідс. Потім клітини промивали й аналізували на проточному цитометрі МАСБО мапі. Антитіла, ідентифіковані як такі, що є позитивними щодо зв'язування, демонстрували 1,5-2-кратний логарифмічний зсув середньої інтенсивності флуоресценції у клітинах, трансфікованих СІТЕ людини або яванського макака, порівняно з середньою інтенсивністю флуоресценції у клітинах, трансфікованих порожнім вектором. Результати щодо зв'язування зведено в таблиці 2.
Зв'язування антитіл до СЗІТК з клітинами НЕК293ЗЇ, транзиторно трансфікованими СІТК людини або яванського макака. Слід відзначити, що в цій таблиці наведено лише антитіла, які демонстрували зв'язування з клітинами СІТК яванського макака -- антитіла, які тестували, але які не показані, не демонстрували зв'язування з СІТК яванського макака. Антитіла, які призводили до сильного зсуву кривої зв'язування, позначали «жк», а антитіла, які призводили до помірного зсуву зв'язування, позначили «ж».
Таблиця 2
Зв'язування з Зв'язування з
СІТЕ людини СТЕ яванського макака твОВБ твОВІ4 твОвго тво твОв25 твОВЗІ твОВв34 твОВ35 твОВІго твавіг7 твавіза твОВ144
ТВОВІБЗ
ТВОВІ159 твОВІбо твавів2
Таким чином, встановлено, що вся панель із 16 антитіл, усі з яких наведено в таблиці 3, зв'язується з СІТК людини і яванського макака.
Таблиця З
Послідовності СОК для 16 кандидатів тАБр до СІТК, для яких показано зв'язування з СІТК людини і яванського макака (5ЕО І МО)
Ідентиф Но- Но- Но- І б- І б- ати Ви сов2 сов сові сов іо-сонЗ
АКОЕУ
СЕТЕ5 ІБ ВО Оо5УБ5 ра твНавь су (1) 5 (5) ТрАгоу У (28) (32) ОСООВ5ММУ РІ Т (35) твав!1 СЕТЕ5 ІБ ВО АКРІВО ОБУММ ра
ОР уд 2) вт) |оМ(ИЗ ООСЕМАІ-Т (86)
АКЕММУ твНав2 СЕТЕ5 ІБЗОС О5БУМ5 УА отого (1). ІвеК в) пинни Е (30) (33) ОСООМІВМУРІ Т (37)
АВНОМ твНав2 аатЕ5 ПРІРСТ Оо5УБ5 ра
АВНАВ твНав2 аатЕ5 ПРІРСТ Оо5УБ5 ра
АВМЕР твНавз аУБЕТ ІОРБО5 Оо5УБ5 ра ово (4) рт (8) ТУ у У (28) (32) ОСООВ5ММУ РІ Т (35)
АНУС твНавз аУБЕТ ІМРОЮО5 Оо5УБ5 ра котнова с (4) рт (9) ТБОгоу У (28) (32) ОСООВ5ММУ РІ Т (35)
АВНЕМ/ твавз аМ5ЕТ ІОРОО5 Оо5УБ5 рад во тнова с (4) рт (10) вин У (28) (32) ОСООВ5ММУ РІ Т (35)
АВРВАН твав!1 аатТЕ5 ПРІЄСТ О5І55У ААД5
АВНМУ твав!1 аатТЕ5 ПРІБОМ О5І55У ААД5 ще (3) А (11) ему (31) (34) ОО5УБЗТРІ Т (38)
АВНЕМ/ твав!1 аатТЕ5 ПРІЄСТ Оо5УБ5 рад
АВНОЕ твав!1 аатТЕ5 ПРІЄСТ Оо5УБ5 рад
АВНАМ/ твав!1 аатТЕ5 ПРІЄСТ Оо5УБ5 рад
АВНОВ твав!1 аатТЕ5 ПРІЄСТ Оо5УБ5 рад
АКОЕУ твав!1 СЕТЕ5 ІБ ВО Оо5УБ5 рад
ЩО (27). (зт (5) мав У (28) (32) ОСООВ5ММУ РІ Т (35)
АВНМУ твав!1 аатТЕ5 ПРІБОМ Оо5УБ5 рад ще (3) А (11) ему У (28) (32) ОСООВ5ММУ РІ Т (35)
Області МН і Мі. для 16 тАБ до СТЕК показані нижче в таблиці 4.
Таблиця 4
Послідовності важкого ланцюга й легкого ланцюга для 16 кандидатів тАбр до СІТК, для яких показано зв'язування з СІТК людини і яванського макака
Ідентифікато Амінокислотна Амінокислотна
ПАБ р послідовність ЗЕО ІЮ МО: послідовність ЗЕО ІЮ МО: важкого ланцюга егкого ланцюга
ЕМО ЕЗОССО
І МОРОСБІ ВІ 5СА
АБИЕЄТЕЗОаММУМ5 ЕЇМІ ТОФРАТІ.
М УВОАРИаИКаї ЕМ о 5РОЕВАТІ СВ
БАЗОВИМ
АБОБУБОМУЇ АМУМО
АОЮБУКОВЕТІЗНО
ОКРООАРВІ МО
МОКМТІ МІОМІ.
АдБ5МАВАТОаІРАНЕ5
ВАЕОТАМУМСАКО п5абБатовТІТІЗ5
ЕУМОАгрРУМ СОС
І ЕРЕОБАУМУСОО
ТІ МТУ5БАБТКОаР
ЗМЕРІ АРЗЗКОТ5 вЗМмУуРТРООСТ твавь 39 КМЕІКАТМААРОМЕ 55
СОТААГасіУкКОУ
ІЕРРБ5ОЕОЇ КБатА
ЕРЕРУТУБМУМБИад
ЗУМСГ ММЕМРАЕ
І Т5аОМНТЕРАМ О
АКМОМ/КМОМАГО 55аІ мі 55
ЗаМООЕЗУТЕОО5
РІ аТтОТмМІСММ
КОМБІ 55ТІ ТІ 5
МНКРОЬМТКМОККМ
КАЮОМЕКНКУМАСЕ
ЕРКЗСОКТНТСРР ТНОСІ ЗеРУТКУ
СРАРЕ ЧаРБОМЕ ЕМВСЕС
ІГЕРРКРКОТІ МІЗА
ТРЕМТСУМУРрУБНн
ЕОРЕМКЕМУМУ УМО
СМЕМНМАКТКРВЕ
ЕОУМ5ТУВУУЗМІ.
ТМІ НОМ МСКЕХ
КСКУ5ЗМКАЇ РАРІЕ
КТІЗКАКООРВЕР
ОМУТІ РРУЗВОЕІ Т
КМОУЗІ ТС УКСЕ
УРЗОТАМЕМ'ЕЗМО
ОРЕММУКТТРРМІ.
О5ОС5ЕНІУ5КІТ
УОКЗВМООСММЕ
ОС5УМНЕАІ НМНУ
ТОК ЗІРОК
ЕМОПЕБОСО
І УОРОСБІ ВІ 5СА
АЗСЕТЕЗ5УАМОМУ
УВОАРОКСІ ЕМ/У
ЗАІЗС5ОСЗТУХА
О5УКСВЕТІЗНОМ
ОКМТІ МІОМІ В
АЕОТАУУУСАКРІВ
СІГОУМСОСТІ УТ
М55А5ТКОРОМЕР ЕМІ ТО9РАТІ.
І АРОЄКОТЗССТА сі 5РСЕВАТІ 5СВ
ДІ СС УКОУЕРЕР АЗОБУММЕЇ АМ/У
УТУ5М/М5САІ ТО ООКРООАРА У
УНТЕРАМІ О55С1. ПАЗМААТСІРАВЕ
УЗІ З5УУТУРЕБВЇ. СС5О5СТОЕтІ ТІВ
СТОТМУІСМУМНКР ЗІ ЕРЕОБАУУУСО
ОМТКУОККУЕРКО ОСЕМАРІ ТЕСОСТ твові4 СОКТНТСРРСРАР 40 КУЕІКВТМААРЯМЕ 56
ЕП ССРЗУБІЕРР ІЕРРЗОЕОЇ КЗСТА
КРКОТІ МІЗВТРЕМ СОУСИ ММЕУРВЕ
ТСУМУРУЗНЕОРЕ АКУОМУКУОМАГО
УКЕММ/УМОСУЕМ СМ5ОЕВУТЕОЮ5
НМАКТКРВЕЕОМУМ КОТУ 55ТІТІ5
СТУВМУУЗМІ ТМІ Н КАОУЕКНКУХАСЕ
ОУМІ МСКЕУКСК ТНОСІ55РУТК5
МОМКАЇ РАРІЕКТІ ЕМАСЕС
ЗКАКСОРВЕРОМУ
ТІ РРОВОЕІ ТКМО
УВІ ТС УКСЕУРУ
ОІАУЕМ/ЕЗМСОРЕ
ММУКТТРРМІ ОО
СЕР УЗКІ ТУОК
ЗВМ/ООСММУЕ5СЗ
ММНЕАІ НМНУТОК сі ЗІРОК
ЕМО ЕБОСО ЕІМІ-ТОБРАТІ.
І УОРСОС5І ВІ СА сі 5РСЕВАТІ 5СВ
АЗСЕТЕЗСУМММ АЗОБУМОЕІ АМ/УО
УУУВОАРСКСІ ЕМ ОКРООАРВІ ПУУ
У5СІ550СО9КУУ ДЗМАВАТСІРАВЕЗ
АОЗУКСВЕТІЗВО СеССТОЕТІ ТІ тНОВго мекмті м оММе 00 ІГЕРЕОБАУУУСОО! 7
ВАЕОТАУУУСАКЕ ІВМ/РІ ТЕСОСТК
УУУОНУАА! ОУМУ ЕІКВТУААРЗМУЕЇ
СОСТІ УТУЗЗАСТ ЕРРЗОЕОЇ К5СТА
КОРОМЕРІ АРЗОК ЗУУСИ ММЕУРВЕ
СТЗССТААІ СС М АКУОМУКУОМАГО
КОМЕРЕРУТУБУУМ ЗаМЗОєЗМТЕОр5
ЗаАІ Т5амНТЕРА КОБТУБІ З5ТІ ТІ 5 м ОББЗИЇ МБІ 5ЗМ КАОМЕКНКУМАСЕ
МТУРББЗБІ ТОМІ тТнОаІ 55РУТК5
СМУМНКРЗМТКМО ЕМАСЕС
ККУЕРКЗСОКТНТ
СРРСОРАРЕ СИР
ЗМЕГЕРРКРКОТІ.
МІЗАТРЕМТСУММ
ОМЗНЕОРЕМКЕМ
УМ УУрамЕМНМАК
ТКРАЕЕЄОММЗТУН
МУЗМІТМ НОМ.
МОаКЕУКСКМУЗМКА
ГРАРІЕКТІЗКАКИ
ОРАВЕРОМУТІ РРБ вАОЕСТКМОМБІ То
ГУКагмРЗОІАМЕ
УМЕЗМСОРЕММУК
ГТРРМІ ОБОСЗЕЕ
ГКІ ТУоКЗАМО
ОСММЕЗСЗММНЕ
А НМНУТОКБІ БІ. оРаК
ОМО МОБОАЕ
УккКРСОаБЗУКУЗОСК двастТЕЗЗМАЇБМУ
УВОАРООСІ ЕМ/М
ССПРІРГИТАММАЮО
КРОСВМТІТАОЕ5Т)
ЗГАММЕЇ З5І АЗЕ
ОТАМУУСАННОМ
УМ НЕМ ОМ аОС
ТІ МТУББЗАЗТКаР ЕІМГТО5РАТІ.
ЗМЕРІГАРЗЗКЗТО ЗІ 5РОЕВАТІ СВ
СОаТААГасСІ УКОУ АБОВУЗЗМУ АМ/ МО
ЕРЕРМТУБМУМЗОА ОКРООАРАСИМО
І Т5аМНТЕРАМГО А5МААТИаІРАНЕЗ зе мБІЗЗУМТМ севаватогтІтІЗ5
РБББІ ЕТОТМІСММ І ЕРЕОРАМУУСОЮ
МН!НКРОМТКМОККМ АЗМУМРІГ ТРОСОСТ тнОова2гЗ ЕРКЗСОКТНТСРР 42 КМЕІКАТМААРЗМЕ 55
СРАРЕ сОаРБМЕ ІЕГРРБОЕБОЇ КИТА
ГЕРРКРКОТІ МІЗА ЗММСІ І ММЕМРАЕ
ТРЕМТСУМУММОУЗН АКМОМ/КМОМАГО)
ЕОРЕУКЕММУ УМО ЗаМЗОєЗМТЕОр5
СМЕУНМАКТКРАЕ КОБТУБІ З5ТІ ТІ 5
ЕОУМБТУАМУМУБМІ. КАОМЕКНКУМАСЕ
ТМ НОВУЛ МОаКЕМ тТнОаІ 55РУТК5
КСКМЗМКАЇ РАРІЕ ЕМАСЕС
КТІЗКАКИаОРВЕР
ОМУТІ РРЗАВОБЇ Т кМмОМБІ ТС Как
УРЗОІАМЕМЕЗМИ
ОРЕММУКТТРРМІ. рЗрОаЗЕРІУЗКІ Т
УоКкЗАМООСММЕ
ЗСЗУММНЕАІ НМНУ
ТОК І Рак
УккКРСОаБЗУКУЗОСК ЗІ 5РОЕВАТІ СВ двастТЕЗЗМАЇБМУ АБОВУЗЗМУ АМ/ МО
УВОАРООСІ ЕМ/М ОКРООАРАСИМО
ССПРІРГИТАММАЮО А5МААТИаІРАНЕЗ
КРОСВМТІТАОЕ5Т) севаватогтІтІЗ5
ЗГАММЕЇ З5І АЗЕ І ЕРЕОРАМУУСОЮ
ОТАМУУСАВНАНЕ АЗМУМРІГ ТРОСОСТ м роУМУусОсТтІ МТ КМЕІКАТМААРЗМЕ
УЗЗАЗТКаРЗМЕР ІЕГРРБОЕБОЇ КИТА
ГАРЗЗКЗТБИСТА ЗММСІ І ММЕМРАЕ
А СС МКОМЕРЕР АКМОМ/КМОМАГО)
УтУБМУМЗаАІ ТО ЗаМЗОєЗМТЕОр5
МНТЕРАМГОЗИЇ. КОБТУБІ З5ТІ ТІ 5
ЗІ БУМ ТУРБББ КАОМЕКНКУМАСЕ
СТО МІСМММНКР тТнОаІ 55РУТК5
ЗМТКМОККМЕРКЬ ЕМАСЕС
СОКТНТСРРОРАР
ЕП асаРБЗМЕГЕРР
КРКОТІ МІЗАТРЕМ
ТСМММОУЗНЕОРЕ
УКЕМУУУрамЕмМ
НМАКТКРАЕЄОММ
ЗГУАМУБМІ ТМ Н
ОМ МакЕМКОК
МЗМКАЇ РАРІЕКТІ
ЗКАКСОРВЕРОММ
ТГРРОВОЄСТКМО
МІ ТС! МКОагЕМРБ
ПІАМЕЖМЕЗМИООРЕ
ММУКТТРРМІ ОБО аЗЕРУЗКІТУОК
АМмООСМУЕО5
ММНЕАГНМНУТОК
ЗІ БІ 5РОК
ЕМО МОБИАЕ
УККРОЕБІ КІЗСК аЗаУБЕТЗУУМИМ
УВОМРОКОаГЕМУМ
СПОРЗОБОТАМ5Р ЕЇМІ ТОФРАТІ.
ЗРОСОМТІЗАОКОЇІ
ЗІ 5РОЕВАТІ СВ
ЗТАМІ ОМУ55І КАБ
АБОВУЗЗМУ АМ/ МО
ОТАМУУСАВМЕРУ
ОКРООАРАСИМО агм'юмуаостиу
А5МААТИаІРАНЕЗ
УТУБЗАЗБТКарРмМ севаватогтІтІЗ5
ЕРГАРББКЗТВОСС
І ЕРЕОРАМУУСОЮ
ТААГасі МкОМЕР
ЕРМТУБМУМЗОАТ пзмуР-товат тнавзі1 44 КМЕІКАТМААРЗМЕ 55
ЗИУНТЕРАМ О55
ІЕГРРБОЕБОЇ КИТА
СІ БІ 55ММТУРБ
ЗММСІ І ММЕМРАЕ
ЗО аТОгМІСМУМ
АКМОМ/КМОМАГО)
НКРУЬМТКМОККМЕ
ЗаМЗОєЗМТЕОр5
РКЗСОКТНТСРРС
КОБТУБІ З5ТІ ТІ 5
РАРЕГ аСаРБМРІ.
КАОМЕКНКУМАСЕ
ЕРРКРКОТІ МІЗАТ ТНОСІ Є5РУТКе
РЕМТСУМММОМЗНЕ ЕМВСЕС
ОРЕМКЕММ МОСС
МЕМНМАКТКРНАЕЕ
ОМ УАУМБМІТ
МІ НО МОКЕМ
КСКУЗМКАЇ РАРІЕ
КТІЗКАКСОРВЕР
ОМУТІ РРОВОЕЇ Т
КМОУЗІ ТС УКСЕ
УРЗОТАМЕМ'ЕЗМО
ОРЕММУКТТРРМІ.
О5ОС5ЕНІУ5КІТ
УОКЗВМООСММЕ
ОС5УМНЕАІ НМНУ
ТОК ЗІРОК
ЕМОГУО5САЕ
УККРСЕВІКІЗСК
СЗСУЗЕТЗУУЛСМУ
МВОМРОКСІ ЕМ/М
СІПУРСОЗОТВУР
СЕОСОМТІЗАОКЗВІ
СТАХІ ОМ/55І КАБ
ОТАМУУСАНОУС
УУНОЕОУМСОСТІ.
УТУЗ5АЄТКОРЗУ ЕМІ ТО9РАТІ.
ЕРІ АРЗЗКОТЗСС сі 5РСЕВАТІ 5СВ
ТААІССІУКОХЕР АЗО5У55У І АМ/УО
ЕРУТУЗМ/М5САЇ т ОКРООАРВІ ПУО
ОСУНТЕРАМІ 055 ДЗМАВАТСІРАВЕВ
СІ УВІ З5УУТУР СеССТОЕТІ ТІ
ЗІ СТОТМІСММУМ | ЕРЕОЕАУУУСОО
НКРОМТКУОККУЕ В5ММ/РІ ТЕСОСТ твовЗаА РКОСОКТНТСРРСІ 45 КУЕІКВТУААРЯУЕ 55
РАРЕГІ СОРБМУНІ. ІЕРРЗОЕОЇ КЗСТА
ЕРРКРКОТІ МІ5ВТ СОУСИ ММЕУРВЕ
РЕУТСУУУОМ5НЕ АКУОМУКУОМАГО
ОРЕУКЕММ/УУОС СМ5ОЕВУТЕОЮ5
МЕМНМАКТКРВЕЕ КОТУ 55ТІТІ5
ОУМеТУВУУЗМІ Т КАОУЕКНКУХАСЕ
МІ НОМ МСКЕХ ТНОСІ55РУТК5
КСКУ5МКАЇ РАРІЕ ЕМАСЕС
КТІЗКАКООРВЕР
ОМУТІ РРОВОЕЇ Т
КМОУЗІ ТС УКСЕ
УРЗОТАМЕМ'ЕЗМО
ОРЕММУКТТРРМІ.
О5ОС5ЕНІУ5КІТ
УОКЗВМООСММЕ
ОС5УМНЕАІ НМНУ
ТОК ЗІРОК
ЕМОГУО5САЕ ЕМІГТОБРАТІ.
УККРСЕВІКІЗСК сі 5РСЕВАТІ 5СВ
СЗСУЗЕТ5УУЛОМУ АЗО5У55У І АМ/УО
МВОМРОКСІ ЕМ/М ОКРООАРВІ ПУО
СПОРСО5ОТНУ5Р ДЗМАВАТСІРАВЕВ
ЗРОСОМТІЗАОКЗІ СеССТОЕТІ ТІ
СТА ОМУ55ІКАВ | ЕРЕОЕАУУУСОЮ
ОТАМУУСАВНВМУ В5ММ/РІ ТЕСОСТ тневз5 степ румсОост| 75 КУЕІКВТУААРЯМЕЇ 9
І УТУЗ9АЗТКСРО ІЕРРЗОЕОЇ КЗСТА
МЕРІ АРЗУК5ТС СОУСИ ММЕУРВЕ
СТАЛІ СС УКОУЕ АКУОМУКУОМАГО
РЕРУТУЗМУМ5СА!. СМ5ОЕВУТЕОЮ5
Т9СУНТЕРАМІ О5 КОТУ 5575
ОСІ У5І 55УМУТУР КАОУЕКНКУХАСЕ 5551 СТОТМІСММ ТНОСІ55РУТК5
Зв
МА;КРОМТКУОККУ ЕМАСЕС
ЕРКЗСОКТНТСРР
СРАРЕГ І ССРОМЕ
ГЕРРКРКОТІ МІ5А
ТРЕУТСУУМУОУН
ЕОРЕУКЕММ/УМО
СУЕМНМАКТКРВЕ
ЕОУМ5ТУВУУЗМІ.
ТМІ НОМ МСКЕХ
КСКУ5ЗМКАЇ РАРІЕ
КТІЗКАКООРВЕР
ОМУТІ РРОВОЕЇ Т
КМОУЗІ ТС УКСЕ
УРЗОТАМЕМ'ЕЗМО
ОРЕММУКТТРРМІ.
О5ОС5ЕНІУ5КІТ
УОКЗВМООСММЕ
ОС5УМНЕАІ НМНУ
ТОК ЗІРОК
ОМОГМУОЗСАЕ
УККРОЗ5УКУЗСК
АЗССТЕЗОУАЇВМІ
УВОАРСОСІ ЕМ/М
ССПРІЕЄСТАМУАО
КЕОСВУТІТАОЕСТ
СТАУМЕ! 551 В5Е
ОТАУУУСАВРАНМ
ТМЕ ОММ/СОСТІ М
ТУ55АЗТКОРОМЕ ОІОМТОеРУВІ.
РІ АРОЗКУТЗССТ ЗАЗУСОВУТІТСВ
ДАІ СІ УКОУЕРЕ АЗОВІЗЗУ МО
РУТУЄУУМУСА! Т5 ОКРОКАРКІ ПУАА
СУНТЕРАМІ О55С 51 О5СУРЗНЕ5О
І У5І 55УУТУРІ5У ОС5СТОЕТтІ ТІВ.
І СТОТМІСМУМНК ОРЕОЄАТУУСОО8
РОМТКУОККУЕРК ЗТРІ ТЕСОСТКУ твовІго ОСОКТНТСРРСРА| 47 ЕІКВТУААРЗМЕІЕ | 58
РЕП ССРЗУБІ ЕР РРООЕОІ КУСТА5
РКРКОТІ МІ5ВТРЕ МСИ ММЕУРВЕА
УТСУМУУУ5НЕОР КУОМУКУОМА! О5
ЕУКЕММ/УУОСМЕ СМУОЄЗУТЕОЮ5К
МНМАКТКРВЕЕОУ О5ТУЗІ 55ТІТІ5К
МетУВМУВМІ ТМ. АОУЕКНКУУАСЕМ
НОРУУІ МОКЕУКС НОСІ 55РУТКОЕ
КУ5МКАЇ РАРІЕКТ МАСЕС
ІЗКАКСОРВЕРОУ
УТ РРОВЕЕМТКМ
ОМ5ІТСІУКСЕХУР
ЗПІАМЕМ/ЕЗМСОР
ЕММУКТТРРМІ 05
ОСО5ЕНІУЗКІ ТУО
КОВУМООСМУЕ5С
ЗУМНЕАІ НМНУТО
КІ 5І5РОК
ОМОГМУО5САЕ БПІОМТОРУБІ
УККРОЗ5УКУЗСК ЗАЗУСОВУТІТСВ
АЗССТЕЗОУАІВМІ АЗОВІЗЗУ МО тНОВ127 УВОАРСОСІЕМУМІ 79 ОКРОКАРКІ МАХ С
ССПРІЕЄСМАМУАО 51 О5СУРЗНЕ5О
КЕОСВУТІТАОЕСТ ОС5СТОЕТтІ ТІВ.
ЗГАММЕЇ З5І АЗЕ ОРЕОРАТУМСОО5
ОТАМУУСАВНУУК ЗзТРГТРООСТКМУ вам МиМусОаТтІ. БІКАТМААРБМУРІЄЕ
УТУБЗАЗБТКарРмМ РРБОЕОЇ КИТА
ЕРГАРБЗБКБТЗОС МСГ ММЕМРАЕА
ТААГасі МкОМЕР КМОМКМОМАГО5
ЕРМТУБМУМЗОАТ аМЗОЕЄЗМТЕООБК
ЗИУНТЕРАМ О55 рБТУБІ З5ТІ ТІ ЗК
СІ БІ 55ММТУРБ АОМЕКНКМУАСЕМ
ЗО аТОгМІСМУМ НОСІ 55РУТК5Е
НКРУЬМТКМОККМЕ МАСЕС
РКЗСОКТНТСРРС
РАРЕГ аСаРБМРІ.
ЕРРКРКОТІ МІЗАТ
РЕМТСУМММОМЗНЕ
ОРЕМКЕММ МОСС
МЕМНМАКТКРАЕЕ
ОМ УАУМБМІТ
МІ НО МОКЕМ
КСКМЗМКАЇ РАРІЕ
КТІЗКАКИаОРВЕР
ОМУТІ РРОВЕЕМТ
КМОМБІ ТС Ка
УРЗОІАМЕМЕЗМИ
ОРЕММУКТТРРМІ. рЗрОаЗЕРІУЗКІ Т
УоКкЗАМООСММЕ
ЗСЗУММНЕАІ НМНУ
ТОК І Рак
ОМО МОБОАЕ
УккКРСОаБЗУКУЗОСК двастТЕЗЗМАЇБМУ
УВОАРООСІ ЕМ/М
ССПРІРГИТАММАЮО
КРОСВМТІТАОЕ5Т)
ЗГАММЕЇ З5І АЗЕ
ОТАМУУСАВНАМ ЕІМГТО5РАТІ. сезеМм' осот ЗІ 5РОЕВАТІ СВ
І МТУ5БЗАЗТКаРБ АБОВУЗЗМУ АМ/ МО
МЕРІ АРББКЗТВОИ ОКРООАРАСИМО
СТААГгасі МмкКоОМЕ А5МААТИаІРАНЕЗ
РЕРМТУБМУМЗИАЇ. севаватогтІтІЗ5
Т5ОМНТЕРАМГ О5 І ЕРЕОРАМУУСОЮ за М5І З5ММТУР АЗМУМРІГ ТРОСОСТ т!ОВ134 зо атТОгМІСММ 49 КМЕІКАТМААРЗМЕ 55
МН!НКРОМТКМОККМ ІЕГРРБОЕБОЇ КИТА
ЕРКЗСОКТНТСРР ЗММСІ І ММЕМРАЕ
СРАРЕ сОаРБМЕ АКМОМ/КМОМАГО)
ГЕРРКРКОТІ МІЗА ЗаМЗОєЗМТЕОр5
ТРЕМТСУМУММОУЗН КОБТУБІ З5ТІ ТІ 5
ЕОРЕУКЕММУ УМО КАОМЕКНКУМАСЕ
СМЕУНМАКТКРАЕ тТнОаІ 55РУТК5
ЕОУМБТУАМУМУБМІ. ЕМАСЕС
ТМ НОВУЛ МОаКЕМ
КСКМЗМКАЇ РАРІЕ
КТІЗКАКИаОРВЕР
ОМУТІ РРОВЕЕМТ
КМОМБІ ТС Ка
УРЗОІАМЕМЕЗМИ
ОРЕММУКТТРРМІ.
О5РО5ЕРГУБКІТ
УОоКЗАМООСММУЕ
ЗС5УМНЕАІ НМНУ
ТОКБІ 5І РОК
ОМОІ МОБИаАЕ
УККРОБ55ЗУКУВСК
АБИСТЕББУАІБМУ
УВОАРООСІ ЕМУМ
СОПРІЕЄСТАМУАО
КЕООВМТІТАОЕ5Т
ЗТАУМЕЇ 551 В5Е
ОТАУУУСАВНОБО вом ОМУСОСТІ.
МУТУ55АЗТКарРБм ЕМІ ТО5РАТІ.
ЕРІ АРОЗКОУТВОО ЗІ 6РОЕВАТІ 5СВ
ТАЛА ОСІ УКОМЕР АЗОБУ5ЗМІ АМХО
ЕРУТУ5УУМ5САІТ ОКРООАРВІ МО
ОСУНТЕРАМІ 055 ДЗ5МАВАТОИаРАВЕ5
СІ У5І 55ММТМУР С5Оа5атоєті ТІб5 551 аТОТМУІСМУМ І ЕРЕОЕАМУУСОО
НКРОМТКМОККМУЕ ВОММУРІ ТЕСОСТ твОовІ144 РКЗ5СОКТНТСРРС|Ї 50 КМЕІКВТУААРОМЕ 55
РАРЕ І СОаРБЗМУБКІ. ІЕРРЗОЕОІ КЗатТА
ЕРРКРКОТІ МІЗВТ ОЗУМСИ ММЕМРВЕ
РЕУТСУМУМОМ5НЕ АКМОМ/КМОМАГО
ОРЕУКЕММ Ура 5ОМЗОЕЗУТЕОЮ5
МЕМНМАКТКРВЕЕ КО5ТУ5І 55ТІТІ 5
ОУМ5ТУВУУБМІТ КАОМЕКНКУХАСЕ
МІ НОТМІ МОКЕУ ТНОСІ 55РМУТК5
КСКУЗМКАЇ РАРІЕ ЕМВОЕС
КТІЗКАКООРВЕР
ОМУТІ РРОВЕЕМТ
КМОМ5І ТС УКОЕ
УРУЗОІАМЕМ ЕМО
ОРЕММУКТТРРМІ.
О50О5ЕБІ У5КІТ
УОоКЗАМООСММУЕ
ЗС5УМНЕАІ НМНУ
ТОКБІ 5І РОК
ОМОІ МОБИаАЕ
УККРОБ55ЗУКУВСК
АЗОСТЕ55УАІВМ ЕМІ ТО5РАТІ.
МВОАРООСІ ЕМ М ЗІ 6РОЕВАТІ 5СВ
СОПРІЕЄЙТАММАЮО АБОБУБОМУЇ АМУМО
КЕОСВМТІТАОЕ5Т ОКРООАРВІ МО
ЗТАУМЕЇ 551 В5Е ДЗ5МАВАТОИаРАВЕ5
ОТАМУУСАВНАУМІ. С5Оа5атоєті ТІб5
НІ ОУМУаОСсТтІ М І ЕРЕОЕАМУУСОО
ТУ55АБЗТКОаРБЗМУЕ ВОММУРІ ТЕСОСТ твав153 РІАРЗЗКОТОЗОСТ| 51 КМЕІКВТУААРОМЕ 55
АЛІ ОСІ УКОУЕРЕ ІЕРРЗОЕОІ КЗатТА
РУТУЗМУМ5аАІ Т5 ОЗУМСИ ММЕМРВЕ
СУНТЕРАМІ О5504 АКМОМ/КМОМАГО
ІЇ Х5І 55МУТУРБІББ5 ЗаМООЕЗУТЕОО5
І атотмісєМУМнК КО5ТУ5І 55ТІТІ 5
РОМТКМОККМЕРК КАОМЕКНКУХАСЕ
ЗСОКТНТСРРСРА ТНОСІ 55РМУТК5
РЕП ОССРОМБІ ЕР ЕМВОЕС
РКРКОТІ МІЗВТРЕ
МТОМУМОМЗНЕОР ді
ЕМКЕМУУУРраИТмЕ
МНМАКТКРАЕЄОУ
МЗТУАУУМІ ТМ.
НОРМІ МОКЕУКС
КУБМКАГРАРІЕКТ
ІЗКАКИООРАЕРОМ
УТ РРЗОВЕЄЕМТКМ
ОУБІ ТС Карр
ЗПІАМЕМ ЕБМСИОР
ЕММУКТТРРМІ О5 разеЕгі Укр кБАМООСМУЕЗО
ЗММНЕАЇ НМНУТО
КБ БІ ЗРак
ОМО МОБОАЕ
УккКРСОаБЗУКУЗОСК двастТЕЗЗМАЇБМУ
УВОАРООСІ ЕМ/М
ССПРІРГИТАММАЮО
КРОСВМТІТАОЕ5Т)
ЗГАММЕЇ З5І АЗЕ
ОТАМУУСАННОСАМ зав рмУуаоОстіІ.
УТУБЗАЗБТКарРмМ ЕІМГТО5РАТІ.
ЕРГАРББКЗТВОСС ЗІ 5РОЕВАТІ СВ
ТААГасі МкОМЕР АБОВУЗЗМУ АМ/ МО
ЕРМТУБМУМЗОАТ ОКРООАРАСИМО
ЗИУНТЕРАМ О55 А5МААТИаІРАНЕЗ
СІ БІ 55ММТУРБ севаватогтІтІЗ5
ЗО аТОгМІСМУМ І ЕРЕОРАМУУСОЮ
НКРУЬМТКМОККМЕ АЗМУМРІГ ТРОСОСТ тА!ОВ159 РКЗСОКТНТОСРРСОС 52 КМЕІКАТМААРЗМЕ 55
РАРЕГ аСаРБМРІ. ІЕГРРБОЕБОЇ КИТА
ЕРРКРКОТІ МІЗАТ ЗММСІ І ММЕМРАЕ
РЕМТСУМММОМЗНЕ АКМОМ/КМОМАГО)
ОРЕМКЕММ МОСС ЗаМЗОєЗМТЕОр5
МЕМНМАКТКРАЕЕ КОБТУБІ З5ТІ ТІ 5
ОМ УАУМБМІТ КАОМЕКНКУМАСЕ
МІ НО МОКЕМ тТнОаІ 55РУТК5
КСКМЗМКАЇ РАРІЕ ЕМАСЕС
КТІЗКАКИаОРВЕР
ОМУТІ РРОВЕЕМТ
КМОМБІ ТС Ка
УРЗОІАМЕМЕЗМИ
ОРЕММУКТТРРМІ. рЗрОаЗЕРІУЗКІ Т
УоКкЗАМООСММЕ
ЗСЗУММНЕАІ НМНУ
ТОК І Рак
ОМО г ЕЗОСО ЕІМГТО5РАТІ.
ГМОРОСБІ ВІ ЗСА ЗІ 5РОЕВАТІ СВ
АБОЄТЕЗМУММ5 АБОВУЗЗМУ АМ/ МО
УУНОАРИКаї ЕМ ОКРООАРАСИМО
УЗАІЗОЗИСОГИУ А5МААТИаІРАНЕЗ т!ОВ160 дрзУКангЕтІЗНо 53 сЗаЗатОгТІ ТІВ оОоО55
МКМ МІОМІ. І ЕРЕОРАМУУСОЮ
ВАЕОТАМУМСАКО АЗМУМРІГ ТРОСОСТ
РУМОБЕОУМСОС КМЕІКАТМААРЗМЕ
ТІ МТУББЗАЗТКаР ІЕГРРБОЕБОЇ КИТА
ЗМЕРІГАРЗЗКЗТ5 ЗММСІ І ММЕМРАЕ
ССТААГ СС УКрУ АКУОМ/КУОМА ГО
ЕРЕРУТУЗМ/М5СА СМ5ОЕВУТЕОЮ5
І ТСУНТЕРАМ О КОТУ 55ТІТІ5
С5СІУ8І З5УУТУ КАОУЕКНКУХАСЕ
РЗЗЗІ СТОТМІСМУ ТНОСІ55РУТК5
МА;АКРОМТКУОККУ ЕМАСЕС
ЕРКЗСОКТНТСРР
СРАРЕГ І ССРОМЕ
ГЕРРКРКОТІ МІ5А
ТРЕУТСУУМУОУН
ЕОРЕУКЕММ/УМО
СУЕМНМАКТКРВЕ
ЕОУМ5ТУВУУЗМІ.
ТМІ НОСОМ МСКЕ
КСКУ5ЗМКАЇ РАРІЕ
КТІЗКАКООРВЕР
ОМУТІРРОВЕЕМТ
КМОУЗІ ТС УКСЕ
УРЗОТАМЕМ'ЕЗМО
ОРЕММУКТТРРМІ.
О5ОС5ЕНІУ5КІТ
УОКОВМООСММЕ
ОС5УМНЕАІ НМНУ
ТОК ЗІРОК
ОМОГМУОЗСАЕ
УККРОЗ5УКУЗСК
АЗССТЕЗОУАІВМІ
УВОАРСОСІ ЕМ/М
ССПРІЕЄСМАМУАО
КЕОСВУТІТАОЕСТ
СТАУМЕ! 551 В5Е
ОТАУУУСАВНУУК
ВСУ! МУМСОСТІ. МІ ТОРАТІ.
УТУ5ЗАЄТКОРІУ сі 5РСЕВАТІ 5СВ
ЕРІ АРЗЗКОТЗСС
АЗО5У55У І АМ/УО
ТААІССІУКОУЕР
ОКРООАРВІ ПУО
ЕРУТУЗМ/М5САЇТ
ДЗМАВАТСІРАВЕВ
ОСУНТЕРАМІ 055
СОС5СТОЕТІ ТІ
СІ УВІ З5УУТУР
ЕРЕОЕАУУУСОЮ
ЗІ СТОТМІСММУМ
ВеММ/РІ ТЕСОСТ
НКРЗМТКМОККУЕ КУЕІКВТУААРЗУЕ твовІв2 РКОСОКТНТСРРСІ 54 ББ
ІЕРРЗОЕОЇ КЗСТА
РАРЕГІ СОРБМУНІ.
СОУСИ ММЕУРВЕ
ЕРРКРКОТІ МІ5ВТ
АКУОМУКУОМАГО
РЕУТСУУУОМ5НЕ
СМ5ОЕВУТЕОЮ5
ОРЕУКЕММ/УУОС
КОТУ 55ТІТІ5
МЕМНМАКТКРВЕЕ АОУЕКНКИАСЬ
ОУМеТУВУУЗМІ Т
ТНОСІ 55
МІ НОМ МСКЕХ УЛКОЕМВОЕ
КСКУ5МКАЇ РАРІЕ с
КТІЗКАКООРВЕР
ОМУТІРРОВЕЕМТ
КМОУЗІ ТС УКСЕ
УРЗОТАМЕМ'ЕЗМО
ОРЕММУКТТРРМІ.
О5ОС5ЕКІУ5КІТ
УОКОВМООСММЕ
ОС5УМНЕАІ НМНУ
ТОК ЗІРОК
ПРИКЛАД 7. ОЦІНЮВАННЯ АНТИТІЛ ДО ІТК У ФУНКЦІОНАЛЬНОМУ АНАЛІЗІ
ЗНИЩЕННЯ КЛІТИН
Антитіла, які зв'язувалися з СІТК як людини, так і яванського макака, тестували на активність в аналізах АЗКЦ ї КЗЦ. У ці аналізи включали для порівняння антитіло ізотипного контролю пиЇдо1. Аналіз АЗКЦ виконували для дослідження знищення клітин, яке здійснюється клітинами МК-92, генетично модифікованими для експресії високоафінного поліморфізму
ЕсукШа 176М//. Використовували три типи клітин-мішеней: клітини НиТ102, які ендогенно експресують людський СТЕК, об'єднані стабільні трансфектанти НТІ1080-писСІТА і клітини
НЕК293, які були транзиторно трансфіковані або СІТК людини, або СІТК яванського макака.
Для проведення аналізу АЗКЦ клітини-мішені мітили кальцевном АМ, промивали, ресуспендували в середовищі для аналізу й висівали в кількості 50 000 клітин/50 мікролітрів/'ямка в 96-ямкові планшети з М-подібним дном. До ямок додавали антитіла до пСІТК або контрольні антитіла в різних концентраціях (100 мікролітрів/ямку). Ефекторні клітини МК-92 176М промивали, ресуспендували в середовищі для аналізу й висівали в кількості 50 000 клітин/50 мікролітрів/'ямка або 100 000 клітин/50 мікролітрів/ямка разом із клітинами-мішенями й антитілами. Як контролі включали лише середовище (фоновий сигнал), лише клітини-мішені (сигнал спонтанного лізису), клітини, які потім обробляли тритоном Х-100 (сигнал максимального лізису), і антитіло ізотипного контролю в кінцевій концентрації 1 мікрограм/мл.
Після 1 години інкубації за 37 "С у ямках з максимальним сигналом індукували повний клітинний лізис шляхом додавання 20 мікролітрів 295 тритону Х-100, і планшети центрифугували.
Відбирали 100 мікролітрів супернатантів і додавали до чорних планшетів з прозорим дном.
Одиниці інтенсивності флуоресценції (ІФ) вимірювали з використанням приладу ЗресігаМах5 компанії МоїІесціаг ЮОемісез. Після віднімання від сигналів усіх ямок середньої ІФ, яка спостерігалася в ямках, що містили лише середовище, розраховували відсоток специфічного лізису. Використовували наступну формулу для визначення відсотка специфічного лізису: (Зразок - Спонтанний лізис) / (Максимальний лізис - Спонтанний лізис) " 100. Для кожного антитіла проводили аналіз напівмаксимального ефективної концентрації (ЕС5О) у програмі
Ріїзт.
У таблиці 5 наведено показники активності антитіл до СІТЕ у різних протестованих
Зо клітинних лініях.
Таблиця 5
Активність антитіл до СІТК в аналізах АЗКЦ вх твав2г й твавг5 твеВвЗя твовза,, Шия Шия твав1б
ЕСво ЕСво (не Як т (нг мл ЕСво ЕСво ЕСво (нг/мл) (нг/мл) (нг/мл) (нг/мл) (нг/мл) опо явлю) вве | 2ези | али ов нтто8 15,0- о-пСІТВ 0,9-4,5 2,0-42 2,4-9,8 0,01-1,2 4,2-26,6
НЕК2О9
НЕК2О9 . . -супо 102 465,9 Активніс| Активніс! 5 25,8 5б,7 сІТВ ь відсутня |гь відсутня
А ТКОВ23 являє собою ТЕОВ25, ТЕОВ25 являє собою ТКОВ19
ПРИКЛАД 8. КОНСТРУЮВАННЯ ПОДВІЙНОГО ГЕНА Й ОТРИМАННЯ МОЛЕКУЛ З
НИЗЬКИМ ВМІСТОМ ФУКОЗИ
У процесі підготовки до розробки клітинних ліній було розпочато конструювання подвійного гена для ТКОВ25, ТКОВ153, ТКОВІ159 і ТКОВІ160. Під час цього процесу було встановлено, що важкий ланцюг у ТКОВ25 знаходився у межах людського алотипу дДС1 б1т(17,1), а не переважного людського алотипу досі (1т(17). Важкий ланцюг М-області з ТКОВ25 перемикали на каркас людського алотипу дДС1 с1т(17) під час конструювання подвійного гена, таким чином створюючи новий білок ТЕОВ190. На цьому етапі також відзначали, що ТКОВ160 мав мутацію каркаса на амінокінці важкого ланцюга. Під час конструювання подвійного гена замінювали кінцевий амінокислотний залишок важкого ланцюга в ТКОВ160 з О на Е, таким чином створюючи новий білок ТКОВ191. Крім того, було прийнято рішення створити версію
ТКОВІ191 з низьким вмістом фукози, тобто ТЕОВ191.СІ РЕ. У таблиці 6 показані послідовності цих модифікованих антитіл до СІТЕК.
Таблиця 6
Послідовності Мн і Мі 2 кандидатів тАб до СІТЕК, які були модифіковані в каркасній області.
СОК залишалися ідентичними батьківській молекулі тАр послідовність МН І послідовність МІ. І
ОМОГ МОБИаАЕ
УККРОББЗУКУЗСК
АБааТЕЗЗМАЇБМУ
МАОАРООСІ ЕМУМ
СОПпРІБЄЕТАМУАО
КРОС,ВАМТІТАРЕЗТ
ЗТАУМЕЇ 551 В5Е рТтТАУМУУСАВНАВЕ м румуаоаті Мт
У5ЗАЗТКОаРБЗМЕР ЕІМГТО5РАТІ.
ГАРЗБЗКоЗТЗОИТА І 5РОЕВАТІ СВ
АГ аСІ МКОМЕРЕР АБОБУБЗУЇ АМчО
УТУБУМЗаИАІ Та ОКРООАРАТИМО
МНТЕРАМІ О55П1. А5МААТаІРАВЕ5 5 55УМТУРБББІ свБаватонтІТтІЗ5
СТОТМІСМУМНКР ГЕРЕОБАУУМСОЮ
ЗМТКМОККМЕРК5 ВвАВЗ5МУРІ ТГСЮОСТ твав19о0 СОКТНТСРРОРАР 63 КУЕІКАТМААРБЗМЕ 55
ЕП аСРБМУБІ ЕРР ІЕРРБОЕОЇ КБатА
КРКОТІ МІЗАТРЕМ ЗМУСІ І ММЕМРАЕ
ТСУММОУЗНЕОРЕ АКМОМ/КМОМАЇ О
МКЕМУуУМУрамЕМ ЗаМЗОЕЗУТЕОО5
НМАКТКРАЕЕОУМ КОБТУБІ З5ТІ ТІ 5
ЗГУвУУБМІ ТМ Н КАЮМЕКНКММАСЕ
ОМ МЕКЕУКСК ТНОСІ 55РУТКО
МЗМКАЇ РАРІЕКТІ ЕМАСЕС
ОКАКИОРВЕРОУМ
ТІ РРОВЕЕМТКМО
У5І ТС УКагМРБ
ПІАМЕМЕЗМООРЕ
ММУКТТРРМІ ОО аЗЕРМБКІТМОК земоОоаМУЕ5о5
ММНЕАЇ НМНУТОК
ОІ БІ Рак
ЕМО ГЕЗССС ЕІМГТО5РАТІ.
ГМОРОСБІ ВІ СА І 5РОЕВАТІ СВ
АБСЕТЕЗМУМУМ5 АБОБУБЗУЇ АМчО
МУВОАРаТка єму ОКРООАРАТИМО
УБАІВОаЗОСОГМУ А5МААТаІРАВЕ5
АрБУКОаВеЕТІЗАО свБаватонтІТтІЗ5
Ттвавт191. СІ є ІМ5КМТІ М ОММ5І 64 ГЕРЕОБАУУМСОЮ 55
ВАЕОТАУУУСАКО ВвАВЗ5МУРІ ТГСЮОСТ
ЕУМО5ЕрУМаОс КУЕІКАТМААРБЗМЕ
ТІ УТУ5БЗАВЗТКаР ІЕРРБОЕОЇ КБатА
ЗМЕРІ АРОК ЗМУСІ І ММЕМРАЕ сОетТААГасі УКОУ АКМОМ/КМОМАЇ О
ЕРЕРМТУБЗБУМЗИаА ЗаМЗОЕЗМТЕОО5
І Т5СУНТЕРАМІ О КОБТУБІ З5ТІ ТІ 5
За 5 55УМТУ КАЮМЕКНКММАСЕ
РЗББЗ аТОТМІСММ ТНОСІ 55РУТКО
МНКРОМТКМОККМ ЕМАСЕС
ЕРКЗСОКТНТСРР
СРАРЕ І! СОаРОМЕ
ІГЕРРКРКОТІ МІЗА
ТРЕМТСУМУрУЗН
ЕОРЕУКЕММУ МО
СМЕМНМАКТКРАЕ
ЕОУМО5ТУВУМУБМІ
ТМ НОСУМІ МОКЕМ
КСКУЗМКАЇ РАРІЕ
КТІЗКАКООРВЕР
ОМУТІРРЗОВЕЕМТ
КМОУБІ ТС Укакнг
УРЗОІАМЕМЕЗМОа
ОРЕММУКТТРРМІ. рзразеЕнізкІт
УокКЗАМмОСаММЕ
ЗСЗММНЕАЇ НМНУ
ТОК 5І Рак
ПРИКЛАД 9. ВИМІРЮВАННЯ АФІННОСТІ З ВИКОРИСТАННЯМ ППР
Афінності антитіл до СІТК до рекомбінантного людського ЕСО ІТК вимірювали за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ППР) з використанням матричної системи для аналізу білкових взаємодій РгоїеОп ХРЕЗ6 (ВіоКад).
Для кожного різновиду виміряли швидкості асоціації й дисоціації з СІТК ЕСО. Поверхню біосенсора приготували шляхом ковалентного з'єднання козячого антитіла до людського дО (Ес) із поверхнею сенсорного чипа ГРХ (ВіоКай) із використанням інструкцій виробника щодо хімічного амінозв'язування. Іммобілізували приблизно 8800 ОВ (одиниць відповіді) козячого антитіла до людського до (Ес) (Фаскбоп Іттипо Кезеагсі Іабогайїгіез продукт Мо 109-005-098).
Іммобілізовані ОВ також включали козяче антитіло до мишачого Ес, яке додавали для захоплення інших антитіл, не включених до описаних у цьому документі. Оскільки співвідношення у суміші становило 1: 1, очікувалося, що приблизно 50 95 цих іммобілізованих
ОВ будуть належати до козячого антитіла до людського Ес. Експерименти дослідження кінетики зв'язування виконували за 25 "С у рухомому буфері (ФБР рН 7,4, 0,005 95 Р2О, З мМ ЕДТК).
Готували чотирикратні (1: 3) послідовні розведення ЕСО СІТК людини або ЕСО сІТЕ яванського макака у рухомому буфері, починаючи зі 100 нМ. У середньому на кожному каналі сенсорного чипа захоплювалось 300 ОВ (174-600) тАБб. Як еталонну поверхню використовували еталонні плями (поверхня, модифікована козячим антитілом до людського дос (Ес)), які не містили захоплених кандидатів. Захоплення тАб супроводжувалося З-хвилинним введенням (фаза асоціації) антигена в концентрації 40 мкл/хв з наступним потоком буфера протягом 10 хв (фаза дисоціації). Поверхню чипа відновлювали шляхом введення 0,85 95 фосфорної кислоти зі швидкістю 100 мкл/хв. Дані обробляли за допомогою програмного забезпечення приладу.
Подвійне контрольне віднімання даних проводили шляхом віднімання кривих, згенерованих введенням буфера, від контрольних кривих введення аналіту. Кінетичний аналіз даних виконували з використанням моделі зв'язування Ленгмюра 1: 1 із груповою підгонкою.
Результати для кожного тАр реєстрували у форматі Коп або швидкість асоціації, Кої або швидкість дисоціації та Ко (рівноважна константа дисоціації) (таблиця 7).
Таблиця 7
Результати ППР-аналізу афінності зв'язування тАб до СІТЕ з білююм ЕСО СІТК людини і яванського макака
Середнє Коп Середнє Кон макака макака макака макака шен Птн) ініенн контроль яванського макака зв'язування відсутнє
Результати свідчать, що незначна кількість антитіл відповідала меті зв'язування з ЕСО ІТК яванського макака з афінністю зв'язування в межах п'ятикратного діапазону порівняно з ЕСО
СІТК людини. Цей результат, очевидно, конфліктує з даними щодо знищення клітин, описаними у ПРИКЛАДІ 7, де більшість з антитіл знищувала клітини, які експресували СІТЕ яванського макака з потужністю, лише трохи меншою за потужність, продемонстровану проти клітин, які експресували білок СІТК людини. Можливо, що усічені позаклітинні домени СІТЕ, які надмірно експресувалися в клітинах комах, можуть не бути відповідним чином укладені, що призводило до невідповідності між експериментами із знищення клітин і аналізом афінності. Крім того, можливо, що повнорозмірний ІТК, який експресується у клітинах людини, може з більшою вірогідністю бути укладеним правильно, і що вимірювання афінності зв'язування з клітинами, які експресують СІТЕ, може з більшою вірогідністю узгоджуватися із встановленою активністю знищення клітин. Для перевірки таких можливостей слід дослідити афінності цих антитіл до клітин, які експресують СІТК людини або яванського макака.
ПРИКЛАД 10. ВИМІРЮВАННЯ АФІННОСТІ З ВИКОРИСТАННЯМ М5О
Для оцінки зв'язування антитіл до ІТК з клітинними лініями НЕК293, трансфікованими
СІТК людини і яванського макака, виконували експерименти клітинної афінності з використанням методики визначення клітинної афінності МО (М50О-САТ) М50-САТ був розроблений як власний внутрішній метод визначення афінності без мічення з використанням інтактних клітин у форматі з високою продуктивністю. Як негативний контроль використовували батьківську клітинну лінію НЕК293 без експресії будь-якого ІТК.
З метою вимірювання афінності взаємодії за цією методикою готували серію розчинів з фіксованою концентрацією антитіла до СІТК (300, 60, 12, 2,4 пМ) їі різними концентраціями клітин, що експресують ІТК людини і яванського макака (2,0 х 107-1,0 х 103 клітин/мл), їм давали досягти рівноваги шляхом обертання планшетів протягом 18 годин за 4 "С. Ці зразки готували в середовищі ОМЕМ СіІшатах (Іпмігодеп, Мо продукту 10569-044) з додаванням 0,05 95 азиду, 195 бичачого сироваткового альбуміну (БСА), З мМ ЕДТК. Після врівноваження планшети центрифугували протягом 5 хв за швидкості 2000 об/хв, і в супернатанті виявляли вільні тАр до СІТК. Вільні тАБбБ до ІТК у суміші виявляли за допомогою електрохемілюмінесценції (ЕХЛ) з використанням спектрофотометра для зчитування компанії
М50. Для виявлення, планшети М5О-стрептавідин (Мезозсаїе Оізсомегу, Ме продукту Г115А-1) покривали 0,1 мкг/мл біотинільованого людського антигена СІТК у буфері для аналізу в кількості 50 мкл/ямка й врівноважували протягом ночі (х 16 годин за 4 "С). Після інкубування планшети блокували додаванням 150 мкл/ямка буфера для аналізу без видалення нанесеного як покриття антигена, інкубували протягом -- 1 год. за температури навколишнього середовища й промивали З рази буфером для промивання. Із віддентрифугованих планшетів супернатанти переносили до планшетів, покритих антигеном (50 мкл/ямка), інкубували протягом 60 хв, а потім тричі промивали буфером для промивання. Після цього додавали по 50 мкл/ямка кон'югованих з рутенієм антитіл Е(ар")2 віслюка до Ї90 людини (Неї) у концентрації 0,7 мкг/мл (Часкбоп
ІтітипоКезеагсії; Мо продукту 709-006-149) і інкубували протягом 1 год. Через 1 год. планшети тричі промивали буфером для промивання й додавали по 150 мкл буфера для зчитування МБО (МезозсаІе Оізсомегу кат. Мо К9У2ТС-1; приготованого шляхом розведення 1: З маточного розчину у а. Н2О) на ямку. Планшети негайно зчитували на рівні люмінесценції на приладі МБО зесіог Ітадег 6000 Кеадег. Сигнал ЕХЛ, виявлений за допомогою М50О, виражали як 95 вільного антитіла в суміші, і аналізували дані для визначення афінності, використовуючи визначене користувачем рівняння (випливає із закону дії мас), введене в програмне забезпечення Ргізт.
Для визначення афінності зв'язування концентрацію вільного тАБбБ залежно від концентрації рецептора піддавали нелінійному аналізу методом найменших квадратів з моделлю зв'язування 1: 1. У таблиці 8 зведено дані афінності клітинного зв'язування для всіх протестованих молекул.
Таблиця 8
Оцінка афінності тАбБ до СІТК до клітинних ліній НЕК293, що експресують СІТК людини і яванського макака на основі результатів М2О-САТ
Кратність разок макака В я (Ко, пмМ) (яванський (Ко, пМ) макак/людина) 1 .| 292 | 194... | 66.ЙДЙ.:К(:
Шини твОВІ191.СІЕ 4641244"
Значення афінності для СІТК, який експресується на клітинній поверхні, вимірювали з використанням М5О-САТ для ТКОВ25, ТКОВ190, ТКОВ160, ТЕОВ191.СІ РЕ ії ТКОВ153. Було проведено чотири дослідження, причому дані першого дослідження вважали попередніми, і його проводили лише з однією повторністю. Були проведені додаткові дослідження з більшим числом повторностей (дослідження 2 і 3). Дослідження 2 і З свідчать, що для ТКОВ190 афінність тАб до СІТЕ яванського макака у 1,5-1,6 разу слабша, ніж афінність до СІТЕ людини.
Дослідження 2 і З також свідчать, що для ТКОВ191.СІ Е афінність тАб до СІТК яванського макака у 1,5-3,2 разу слабша, ніж афінність до СІТК людини. Дослідження 4 було проведено пізніше для підтвердження даних щодо ТКОВ191.СІЕ з попередніх досліджень. Дані дослідження 4 свідчать, що для ТКОВ191.СІ Е афінність тАб до СІТК яванського макака у 2,0 разу слабша, ніж афінність до СІТК людини.
ПРИКЛАД 11. СІТЕ ЗДІЙСНЮЄ СИГНАЛІНГ ЧЕРЕЗ МЕ-КВ | ВПЛИВАЄ НА БЛОКАДУ СІТВІ.
СИГНАЛІНГА
Щоб забезпечувати адаптивний імунітет, Т-лімфоцитам, праймованим антигеном, необхідно поширюватися й виживати. Необхідні сигнали росту і виживання значною мірою забезпечуються шляхом МЕ-кВ в активованих Т-клітинах. Інтерферон гамма (ІЄМу), добре відомий ген-мішень
Зо транскрипційного фактора МЕ-КВ, є критичним цитокіном для імунітету проти чужорідних патогенних мікроорганізмів і продукується ефекторними Т-клітинами, цитотоксичними Т- лімфоцитами (СТІ), тп! СО04 і СО8 після розвинення антигенспецифічного імунітету (Зспоепрог В, М/їзоп СВ. Адм Іттипої. 2007:96:41-101).
Представники надродини рецепторів фактора некрозу пухлини (ТМЕК), членом якої є СІТЕК, можуть забезпечити співстимулювальний сигнал для Т-клітин. Це ініціюється зв'язуванням з їхнім відповідним лігандом шляхом рекрутування адапторних білків, відомих як ТЕАЕ (фактор,
асоційований із ТМЕ-рецептором), який може здійснювати сигналінг через шлях МЕ-кВ. Крім того, сила співстимулювального сигналінгу залежить від олігомеризації рецептора, якої можна досягти за допомогою тримерних або шестимерних розчинних лігандів або шляхом опосередкованого антитілом перехресного зшивання.
Для виявлення впливу лігування антитіл до СІТК на активність МЕ-кВ використовували модифіковану версію системи НЕК-Віне МЕ-кВ (Іпмімодеп). Ці клітини експресують репортерний ген ЗЕАР (секретованої ембріональної лужної фосфатази) під контролем мінімального промотора, злитого з п'ятьма сайтами зв'язування МЕ-кВ і АР-1. Їх стабільно трансфікували для експресії СІТК людини. Рецептор СІТЕК, перехресно зшитий у цій системі, керує активністю МЕ-
КВ, яку можна виявити за секрецією З5ЕАР у супернатанті Як позитивний контроль використовували тримерний розчинний химерний білок ліганду СІТК (К850О Зузіетв).
Для "агоністичного" тестування обробляли 25 000 клітин НЕК-Віпе-МЕ-кВ-СІТВ послідовними розведеннями 1: 2 розчинного СІТКІ. (починаючи з концентрації 100 нг/мл) або антитіла до ІТК (починаючи з концентрації 1 мкг/мл) за присутності 5-кратного надлишку поперечнозшивального антитіла (анти-НА або анти-Ес, відповідно) протягом 16-20 годин.
Супернатант (40 мкл) видаляли й змішували зі 160 мкл реагенту Оцапіі-Віце м, Колориметричну реакцію залишали для інкубації за 37 "Сб протягом часу до 1 год. перед зчитуванням на спектрофотометрі за ОГьево нм.
Для тестування антитіл у "антагоністичному" режимі клітини обробляли послідовними розведеннями 1: 2 антитіла до СІТК (починаючи з концентрації 2 мкг/мл) за присутності постійної концентрації розчинного СІТКІ. 25 мкг/мл. Антагоністів визначали як антитіла, що блокували зв'язування і МЕ-кВ-активність розчинного СІТКЇ. на більш ніж 50 95. Нижче наведено репрезентативні діаграми, які слугують для ілюстрації експериментальної варіабельності.
В агоністичному режимі антитіла до СІТК здатні перехресно зшивати СІТК на клітинах НЕК-
Віне-МЕ-кВ-СІТЕК, спричиняючи дозозалежне зростання активності МЕ-КВ, порівняно з антитілом ізотипного контролю, СМТО3930 (Фіг. 3). Було виявлено, що за присутності 5ОІТКІ деякі антитіла до СІТК знижують рівень 50ІТК-залежної активації МЕ-КкВ, тоді як інші антитіла -- ні, навіть у 400-кратній концентрації. Виявилося, що ТЕОВ191.СІ РЕ, СТЕВ45 і ЗТРЕВ49 не блокують взаємодію СІТЕ:СІТЕ більше ніж на 30 95, що може бути обумовлено варіабельністю аналізу.
Зо стТКВа45 і СТЕВ49 являють собою неохарактеризовані антитіла, які також зв'язуються з СІТЕ.
ПРИКЛАД 12. АНТИТІЛА ДО СІТК МОЖУТЬ ПОСИЛЮВАТИ ВІДПОВІДЬ Т-КЛІТИН ПАМ'ЯТІ
НА АНТИГЕН СММУ/ І ТТ
Характерною рисою імунітету є утворення Т-клітин пам'яті проти чужорідних антигенів так, що після повторного впливу імунна відповідь може розгортатися швидше.
Цитомегаловірус (СММ) являє собою герпесвірус і є поширеною інфекцією, перебіг якої у здорових дорослих і дітей є зазвичай безсимптомним. За оцінками, 50-80 95 дорослих інфіковано СММ до досягнення ними 40-річного віку. Токсин правця (ТТ) виробляється бактерією, що має назву Сіовітідіит етапі. Більшість дорослих у США вакциновані проти правця 5 разів до досягнення 6 років і отримують ревакцинації кожні 10 років після цього.
У разі впливу на серопозитивних осіб відповідними антигенами Т-клітини пам'яті можуть повторно активуватися для розвитку повторної відповіді. Було показано, що експресія СІК посилюється на Т-клітинах, а СІТКІ. на антигенпрезентувальних клітинах. Агоністичне антитіло до СІТК може посилювати активацію Т-клітин шляхом сигналінгу через СІТК і додаткового посилення антигенспецифічної імунної відповіді.
Інтерферон гамма (ІЄМу) є критичним цитокіном для імунітету проти чужорідних патогенних мікроорганізмів і продукується ефекторними Т-клітинами, цитотоксичними Т-лімфоцитами (СТУ), Тп1 С04 і СО8 після розвинення антигенспецифічного імунітету (Зспоепрогп УК, УМІ5Оп
СВ. Адм Іттипої. 2007 96:41-101).
У цьому документі автори винаходу розробили аналіз повторної відповіді на СММ і ТТ для характеристики своїх антитіл до СІТК щодо їхньої здатності посилювати активацію Т-клітин, що вимірюється за секрецією ІЄМу. Коротко, 150 000 МКПК, отриманих від донорів, серопозитивних щодо СММУ і ТТ, інкубували за присутності 0,1 мкг/мл антигена СММ або антигена ТТ (повний антиген СММУ, Авіаге Ме1004; антиген ТТ, Авіапе Ме1002) у ямках, які були попередньо покриті послідовними серійними 1: 2 розвденнями досліджуваних антитіл, починаючи з концентрації 5 мкг/мл до 156 нг/мл (зліва направо по осі х). Супернатанти збирали через 4-6 днів після того, і кількісно визначали рівні ІЕМу з використанням М5О. Щоб оцінити повторну активацію у донора, використовували контролі лише з антигеном, а СМТО3930 використовували як антитіло ізотипного контролю. Кожну концентрацію антитіла досліджували у повторностях (п-6).
ТКОВІ191.СІ Е посилює СММУ-залежну активацію Т-клітин пам'яті у дозозалежний спосіб, що бо визначено за секрецією ІЄМу, яка досягала максимуму за |АБІ| - 5 мкг/мл (Фіг. 4А). В аналізі повторної відповіді на ТТ, пікова співактивація Т-клітин спостерігалася за (АБ - 625 мкг/мл (Фіг.
АВ).
ПРИКЛАД 13. ІМУНОТЕРАПІЯ ОДНИМ АГЕНТОМ-АНТИТІЛОМ ДО СІТЕ ІНДУКУЄ СТІЙКИЙ
ПРОТИПУХЛИННИЙ ІМУНІТЕТ
Вплив антитіла до СІТК на протипухлинний імунітет може досліджуватися тільки в моделях пухлин, де хазяїн має інтактну імунну систему. З цієї причини сурогатне мишаче антитіло до
СІТА, ОТА-1, вивчалося в установлених сингенних моделях карциноми товстого кишечнику
СТ26 і МС38 у мишей лінії ВаІБ/С або С57/ВІ 6 відповідно
Мишам у правий бік імплантували підшкірно (п/ш) 5 х 105 пухлинних клітин СТ26 або МСЗ38.
На 7-й день після імплантації пухлинних клітин мишей рандомізували в експериментальні групи з середнім розміром пухлини приблизно 85 мм3 або 120 мм" відповідно.
Мишам внутрішньоочеревинно (в/о) вводили антитіло ЮТА-1 (ВіоХсе Мо ВЕО00О63) або ізотипний контроль Ідс2р щура (клон ГТЕ-2, ВіоХсеїї Ме ВЕ0090) у дозі 200 мкг/тварина кожні З дні або кожні 4 дні, загалом З дози на дні 7, 11 і 14 (п-10/група). Вимірювання розміру пухлини товщиноміром проводили двічі на тиждень до кінця дослідження. Об'єм пухлини розраховували з використанням формули: Об'єм пухлини (мм3) - (І х у/2 / 2); де І представляє довжину, а м -- ширину пухлини, визначену за допомогою товщиноміра, і вимірювану двічі на тиждень протягом усього дослідження. Відсоток інгібування росту пухлини (95 ІРП) визначали як різницю між середнім об'ємом пухлини в групі лікування й у контрольній групі, і розраховували як 95 ІРП -
І ТМо-ТМО/ТМс) " 100), де ТМс -- це середній об'єм пухлини в контрольній групі, а ТМ -- це середній об'єм пухлини в групі лікування. Як визначено критеріями Національного інституту раку
США (МС), ІРП 2» 60 95 вважається біологічно значущим.
У моделі МОС38 статистично значуще інгібування росту пухлини було досягнуто в разі введення ОТА-1 (80 95 ІРП на день 21 порівняно з ізотипним контролем, р « 0,0001), причому регресія пухлини спостерігалася вже на день 14 після початку лікування ОТА-1, а 5 з 10 тварин досягали повної відповіді (ПВ) до дня 28. ПВ здавалася стійкою, повторний ріст не спостерігався до 35 днів після введення останньої дози лікування.
У моделі СТ26 статистично значуще інгібування росту пухлини було досягнуто в разі лікування препаратом ОТА-1 порівняно з групою тварин, яким вводили ізотипний контроль (ІРП
Зо » 6595 на день 27, р « 0,0001), причому у половини групи (5 із 10 тварин) регресія пухлини спостерігалася вже на день 14, а повні відповіді (ПВ) спостерігалася до дня 31 (Фіг. 5). ПВ здавалася стійкою, повторний ріст не спостерігався до 42 днів після введення останньої дози лікування.
ПРИКЛАД 14. КОМБІНОВАНА ТЕРАПІЯ АНТИТІЛАМИ ДО СІТК І АНТИТІЛАМИ ДО
ІМУННИХ КОНТРОЛЬНИХ ТОЧОК ТА АНТИТІЛАМИ-АГОНІСТАМИ Т-КЛІТИН ПІДВИЩУЄ
ПРОТИПУХЛИННИЙ ІМУНІТЕТ
Сингенну модель карциноми товстого кишечнику МСОСЗ38 використовували для оцінки комбінації терапії антитілами до СІТК з терапією антитілом до РО-1, антитілом до СТІ А-4 з блокуванням контрольних точок або антитілом до ОХ-40.
Мишам у правий бік імплантували підшкірно (п/ш) 5 х 105 пухлинних клітин МСЗ38. На 14-21-й день після імплантації пухлинних клітин мишей рандомізували в експериментальні групи з середнім розміром пухлини приблизно 200 мм3. Мишам внутрішньоочеревинно вводили сурогатне антитіло до СІТК (ОТА-1, ВіоХсеї! Ме ВЕ0063), антитіло до РО-1 (АМР1-14, ВіоХсеї! Мо
ВЕО146), антитіло до СТІ А-4 (909, ВіоХсе!ї Мо ВРО164), антитіло до ОХ40 (ОХ-86, ВіоХсеї! Мо
ВЕО0О31) або ізотипний контроль Іде25 щура (ГТЕ-2, ВіоХсеїї Мо ВЕОО0О90) у дозі 100 мкг/тварина кожні 4 дні, загалом З дози на дні 1, 5 і 9 після рандомізації (п-10/ група). Вимірювання розміру пухлини товщиноміром проводили двічі на тиждень до кінця дослідження. Об'єм пухлини розраховували з використанням формули: Об'єм пухлини (мм3) - (І х м/2 / 2); де І представляє довжину, а м -- ширину пухлини, визначену за допомогою товщиноміра, і вимірювану двічі на тиждень протягом усього дослідження. Відсоток інгібування росту пухлини (95 ІРП) визначали як різницю між середнім об'ємом пухлини в групі лікування й у контрольній групі, і розраховували як 95 ІРП - (ТМо-ТМО//Мс) " 1001, де ТМсо -- це середній об'єм пухлини в контрольній групі, а ТМІ - це середній об'єм пухлини в групі лікування. Як визначено критеріями МСІ, ІРП 2 60 95 вважається біологічно значущим.
Статистично значуще інгібування росту пухлини було досягнуто в разі введення антитіла до
СІТК порівняно з когортою тварин, яким вводили ізотипний контроль, навіть якщо лікування розпочинали, коли пухлина мала більший розмір, і дозування зменшувалось від 200 мкг/миша до 100 мкг/миша. У групі застосування комбінації антитіло до СІТК ї- антитіло до РО-1 спостерігалася регресія пухлини у 5 з 10 тварин до дня 26 після рандомізації (Фіг. 6). У групі бо застосування комбінації антитіло до СІТЕ. ж антитіло до СТІ А-4 спостерігалася регресія пухлини 5О0 у З із 10 тварин, а у 2 із 10 тварин спостерігалася затримка прогресування пухлини (Фіг. 7).
Нарешті, комбінації антитіло до СІТЕ (д 1) ж антитіло до ОХ40 (д 5, д 9) продемонструвала кращий результат, ніж застосування тільки монотерапії антитілом до СІТК (д'ї, д 5, д 9) і монотерапії антитілом до ОХ40 (д 5, д 9) (Фіг. 8).
ПРИКЛАД 15. КОМБІНОВАНА ТЕРАПІЯ АНТИТІЛОМ ДО СІТК І АНТИТІЛОМ ДО РО1,
РАЗОМ ІЗ ПРОВЕДЕННЯМ ВАКЦИНАЦІЇ, ІНДУКУЄ СТІЙКЕ, АНТИГЕНСПЕЦИФІЧНЕ
ПОШИРЕННЯ, ФУНКЦІОНУВАННЯ Й ДИФЕРЕНЦІАЦІЮ Т-КЛІТИН СО8" У МИШЕЙ, ЩО НЕ
МАЛИ ПУХЛИН
Досліджували механізми, за допомогою яких комбінована терапія, спрямована на СІТК з блокадою РО-1, збільшує антигенспецифічні відповіді Т-клітин СО8" в умовах застосування вакцини. Для вирішення цього питання мишам що не мали пухлин, одноразово проводили вакцинацію пепгидною вакциною ОМА257-264, імунодомінантним СТІ -епітопом пептиду ОМА (далі в тексті називається Мах), і вводили 200 мкг антитіла до СІТК у дні 0, З та 6 та 200 мкг антитіла до РО-1 у дні 3, 6, 9 і 12. Комбінована терапія Мах/антитіло до СІТК/антитіло до РО-1 посилювала ефекторну функцію СО8" порівняно з контрольною групою, про що свідчили відповіді у вигляді підвищення рівнів антигенспецифічного ІЕМу в селезінці за результатами аналізу ЕГІЗРрої, відповіді поліфункціональних Т-клітин СО8-Т і підвищені рівні Т-клітин сСр107алемМму СО8", що демонструють цитолітичну активність (Фіг. ЗА, В, ії С відповідно).
Потрійна терапія викликала значне підвищення частоти відповіді поліфункціональних ефекторних Т-клітин СО87, що мають одиночну експресію ІЄМу, подвійну експресію ІЕМУу/Т Ма і потрійну експресію ІЕМУ/ТМЕа/-2 порівняно з іншими видами лікування й контрольними групами (Фіг. 98). Шляхом прямого забарвлення з використанням тетрамера ОМА267-264 Н-2КЬ-
ЗИМЕЕКІ було виявлено, що застосування Мах/антитіло до СІТК/антитіло до РО-1 значно посилювало частоту специфічних щодо тетрамера ОМА відповідей Т-клітин СО8: у периферичній крові на дні 7 і 14 (Фіг. 90 і 9Е), що означає направлену міграцію специфічних до мішені Т-клітин СО8»". Висока частота ефекторних клітин, які секретують запальні цитокіни ТА1, свідчать про те, що іп мімо комбінація антитіло до СІТК/антитіло до РО-1 може посилити індуковані вакциною антигенспецифічні відповіді Т-клітин СО8».
Визначали ступінь, до якого комбінована терапія змінювала антигенспецифічне
Зо диференціювання Т-клітин СО8" у бік ефекторного фенотипу порівняно з фенотипом пам'яті за допомогою поверхневої експресії СО44 ії СОб621І через 14 днів після первинної вакцинації.
Фенотипічний профіль для центральних клітин пам'яті (СМ) зазвичай являє собою СО44: і
СбОб217, а для ефекторних клітин пам'яті (ЕМ) - 0044: і СО621І. Спостерігали значуще збільшення специфічної для тетрамера ОМА популяції Т-клітин СО8"ЕМ і СМ у мишей, у яких застосовували потрійну комбіновану терапію, порівняно з мишами з інших груп (Фіг. 9Е). Крім того, було підкреслено, що переважна популяція Т-клітин КІ КС1-С008: є оптимальною підмножиною ефекторних клітин для захисного імунітету (25-27) і, ймовірно, життєво важливою підмножиною, яка корелює з ефективністю імунотерапевтичних препаратів для лікування раку (23, 28-29). Таким чином, фенотип популяції антигенспецифічних Т-клітин СО8: був охарактеризований як такий, що корелює з експресією на клітинній поверхні представника 1 лектиноподібного рецептора клітин-кілерів із підродини с (КІ КС1). Як показано на фіг. 9Е, відсоток тетрамер-специфічних ефекторних Т-клітин пам'яті СО8-КІ ВСИ1: був значно вищим у групі застосування потрійної комбінації порівняно з контрольними групами. Разом ці результати демонструють, що комбінація антитіло до сІТК/антитіло до РО-1 з вакцинацією може посилити поширення й функціонування потужних антигенспецифічних Т-клітин пам'яті СО8"Чіп мімо.
ПРИКЛАД 16. КОМБІНОВАНА ТЕРАПІЯ З ВАКЦИНАЦІЄЮ ІНДУКУЄ РЕГРЕСІЄЮ ПУХЛИН І
ПІДВИЩУЄ ЗДАТНІСТЬ ДО ВИЖИВАННЯ У МИШЕЙ ІЗ ПУХЛИНОЮ
Враховуючи підвищення відповідей антигенспецифічних ефекторних Т-клітин СО8», індукованих потрійною комбінованою терапією в умовах відсутності пухлин, наступне питання полягало в тому, чи може комбінація індукувати протипухлинну відповідь в умовах недостатньо імуногенної моделі меланоми В16-ОМА. Виконували імплантацію пухлинних клітин В16-ОМА в когорті інтактних мишей-реципієнтів Вб (п-10/група). Через сім днів після імплантації, коли пухлини досягли середнього розміру - 30-40 мм", мишей рандомізували та вводили їм терапевтичні засоби, показані на Фіг. 10А. Схеми застосування антитіл без вакцини помірно уповільнювали розвиток пухлини, але не призводили до зникнення пухлини, ймовірно, через слабку індукцію антигенспецифічних Т-клітин. Аналогічно, ані вакцинація сама по собі, ані її застосування в комбінації з тАб антитілом до ІТК або антитілом до РО-1 не призводила до виживання більше ніж 10-20 95. Проте пухлини у мишей, яким вводили Мах/антитіло до
СІТК/антитіло до РО-1, росли значно повільніше, ніж в усіх інших групах (Фіг. 108-10С). Цікаво, бо що комбінована терапія Мах/антитілом до СІТК/антитілом до РО-1 значно покращувала регресію пухлини й виживання у приблизно 5095 мишей порівняно з іншими видами комбінованої терапії або порівняно з застосуванням тільки вакцини (Фіг. 100-100). Сукупно ці дані показують, що комбінація націлювання антитілами до СІТЕ і блокада антитілами до РО-1 може діяти синергічно з вакциною для підвищення загального виживання.
ПРИКЛАД 17. КОМБІНОВАНА ІМУНОТЕРАПІЯ МАХ/АНТИТІЛОМ ДО СІТАК/АНТИТІЛОМ ДО
РО-1 ІНДУКУЄ АНТИГЕНСПЕЦИФІЧНІ ПОЛІФУНКЦІОНАЛЬНІ Т-КЛІТИНИ СО08: І ЗМЕНШУЄ
ПОПУЛЯЦІЮ ТКЕС У ПУХЛИНАХ
Для розуміння механізму дії комбінованої терапії визначали характеристики антигенспецифічного фенотипу й функціонального відгуку ефекторних клітин СО8: і Тгед СОУ», виділених із пухлин після різних видів імунотерапії. Враховуючи важливість вкладу багатофункціонального імунітету ефекторних Т-клітин СО8: у протипухлинний імунітет (МіПагтгеаї ро, єї аЇ. Сапсег Вез 2014;74:1789-800; біапеу СУ, вї аІ. Сапсег Ве5 2014;74:7168-7174), через днів після імплантації пухлини визначали популяцію антигенспецифічних Т-клітин СО8- і експресію ними ІРМУу і ТМЕса у відповідь на ех мімо стимулювання пептидом ОМА257-264 15 ЗІМЕЕКІ. (Фіг. 11А). Комбінована терапія Мах/антитілом до СІТК/антитілом до РО-1 значно підвищувала вироблення ІЕМу ії Т МЕс ефекторними Т-клітинами СО8: у пухлинах порівняно з іншими групами (Фіг. 11А). Крім того, терапія Мах/антитілом до СІТК/антитілом до РО-1 показала синергічний ефект, що проілюстровано більш високою частотою наявності в пухлинах специфічних до ОМА подвійних позитивних Т-клітин СО8УЧЕМУ/ТМЕа (Фіг. 11А). Враховуючи, що цитолітичні СТІ СО8: є важливими компонентами захисту від пухлин (МіІПаїтеа! БО, еї аІ. Сапсег
Вез 2014;74:1789-800; біапеу СУ, єї аІ. Сапсег Ве5 2014;74:7168-7174), цитолітичний потенціал клітин щодо дегрануляції визначали за маркером експресії СО107а. Результати показують, що лімфоцити, які інфільтрують пухлину (ТІ) СО8"-, виділені від мишей з пухлинами, яким вводили
Мах/антитіло до СІТК/антитіло до РО-1, мали значно вищу частоту Т-клітин СО8: з літичною активністю проти ОМА257-264 порівняно з контрольною групою, що означає наявність у цих Т- клітин більшого потенціалу націлювання на пухлинні клітини (Фіг. 118). Потрійна комбінація також індукує більш високу частоту тетрамерних, специфічних до ОМА Т-клітин СО8" з направленою міграцією в пухлини (Фіг. 11С). Крім того, аналогічна тенденція спостерігалася з частотою Т-клітин СО8", які секретують ЕМу, ТМЕа і/або експресують СО107а у разі стимуляції
Зо РМАЛОМ, що вказує на те, що комбінація Мах/антитіло до СІТК/антитіло до РО-1 індукує загалом більше відповідей функціональних Т-клітин СО8- (Фіг. 1103). ТІЇ, стимульовані РМАЛОМ і оброблені комбінацією Мах/антитіло до сІТК/антитіло до РО-1, мали більшу кількість Т-клітин
СО8: зі співекспресією СО107ачеЕМу. Це корелює з істотним підвищенням цитолітичної активності з її значним контролем і/або регресією встановлених пухлин у мишей.
Враховуючи, що одним із механізмів дії тАб до СІТК є зменшення в пухлинах Тгед СО4- (Сонеп АБ, єї а). Ріо5 опе 2010;5:610436; 5спаєг БА, єї а. Си Оріп Іттипої 2012:24:217-224;
Зспаєт ОА, єї аЇ. ІттипоШег Сапсег 2014:15:2-7), оцінювали види впливу комбінованої імунотерапії Мах/антитілом до сСІТК/антитілом до РО-1 на ці клітини в пухлинах. Однак перед оцінюванням популяції Тгед в пухлинах проводили спостереження за популяцією Тгед селезінки на 14-й день у мишей, що не мали пухлин, відповідно до схеми, показаної на Фіг.10, але у інтактних мишей з пухлиною. Спостерігалося значне зниження рівня Тгед у групі, яка отримувала Мах/антитіло до СІТК/антитіло до РО-1, порівняно з групами, які отримували інші імунотерапевтичні засоби (Фіг. 12А). Тому, виходячи з цих результатів, передбачалося, що потрійна комбінована терапія призведе до зменшення рівня Тгед у пухлинах. Під час спостереження за популяцією Тгед на 15-й день після імплантації пухлин обидва види імунотерапії: антитіло до СІТК/антитіло до РО-1 і Мах/антитіло до СІТК/антитіло до РО-1, аналогічним чином і різко зменшували інфільтруючі Тгед у пухлинах (Фіг.12С-120)), що вказує на те, що комбінація з антитілом до СІТК в обох випадках може зменшити інфільтрацію пухлин клітинами Тгед. Потрійна комбінація продемонструвала краще зниження рівня Тгед у пухлинах порівняно з усіма іншими групами, які отримували лікування. Загальне скорочення популяції
Тгед у більшості вакцинованих груп було потенційно обумовлене сприятливою відповіддю ТА1 у
ТМЕ, зміщенням ТМЕ від супресивної до запальної (Таїзиті Т, еї аїЇ. У Ехр Меа 2002;196:619- 628; Егпідтап М/Н, еї а. Маї Рем Сапсег 2012; 12:298-306). Усі види імунотерапії, за винятком комбінації антитіло до СІТК/антитіло до РО-1, сильно збільшували інфільтрацію Т-клітин СО8- у пухлинах (Фіг. 12В), імовірно, через індукцію антигенспецифічних відповідей СТІ, індукованих пептидною вакциною, як показано на Фіг. 9 і Фіг. 11. У результаті співвідношення СО8/ЛІгед в пухлині помітно збільшилося, причому ефективність потрійної комбінованої терапії статистично перевищувала будь-яку іншу комбіновану терапію антитілами (Фіг. 120), відповідь була описана як така, що корелює з терапевтичною ефективністю в моделі меланоми (Оцеада 5А, еї аї. бо Сій Іпмеві 2006;116:1935-1945). Сукупно синергічні ефекти комбінації Мах/антитіло до
СІТК/антитіло до РО-1 у вигляді посилення реакцій СТІ на пухлину, зниження рівня Ттгед і збільшення співвідношення ефекторних Т-клітин до Тгед у пухлинах можуть являти собою більш антигенспецифічне запальне мікросередовище, більш здатне опосередковувати очищення від пухлини.
ПРИКЛАД 18. КОМБІНОВАНА ТЕРАПІЯ МАХ/АНТИТІЛОМ ДО СІТАК/АНТИТІЛОМ ДО РО-1
ІНДУКУЄ ВІДТОРГНЕННЯ ПУХЛИНИ В16-ОМА, ОПОСЕРЕДКОВАНЕ Т-КЛІТИНАМИ СО8У, І
ВИКЛИКАЄ ДОВГОТРИВАЛУ ПАМ'ЯТЬ
Т-клітини СО8», які інфільтрують пухлину, продемонстрували синергічне посилення дії проти пептиду для імунізації в разі застосування комбінованої терапії Мах/антитіло до СІТК/антитіло до РО-1, що вказує на те, що для ефективності комбінованої терапії найімовірніше було важливим краще індукування потужних відповідей СТІ. Тому була вивчена значущість ефекторних популяцій для відторгнення пухлини, викликаного комбінованою терапією. В умовах проведення терапії у мишей з пухлинами були виснажені Т-клітини СО8», Т-клітини СО4: і клітини НК (натуральні кілери), як показано на Фіг. 13А. Результати показують, що виснаження
СО8 повністю скасовує позитивні ефекти, забезпечувані введенням Мах/антитіло до
СІТК/антитіло до РО-1, оскільки миші не виживають довше 22 днів після імплантації (Фіг. 138).
Навпаки, виснаження СО4 і клітин НК не впливало на протипухлинну активність терапії
Мах/антитіло до СІТК/антитіло до РО-1 (Фіг. 13В), що вказує на те, що ці клітини не відіграють жодної ролі в спостережуваній ефективності. Загалом не спостерігалося статистичної різниці в пухлинах у контрольних мишей або тих мишей, яким вводили тільки антитіло до СОВ8 і тільки антитіло до МК1.1. Відповідно до результатів, отриманих у попередньому дослідженні (Ецімага
З, еї а). У Іпмезі Оєптайо! 2014:134:1884-92), спостерігалася затримка росту пухлини й значуща різниця у спостережуваному виживанні (р-0,0037; СО4-виснажені порівняно з ізотипом) у групі, у якій застосовували тільки антитіло до СО4 (фіг. 138). Однак введення асоа4 (Фіг. 13В) або асСорг5 (Фіг.16) разом із комбінованою терапією Мах/антитілом до СІТК/антитілом до РО-1 не надавало жодної додаткової користі, що означає, що комбінація може діяти незалежно від хелперних Т-клітин або виснаження регуляторних Т-клітин СО47. Загалом результати показують, що Т-клітини СО8: є основною ефекторною популяцією, відповідальною за продовження виживання й спричинення відторгнення пухлини.
Зо Кінцевою метою як вакцинації, так і активної імунотерапії проти раку є вироблення довговічних Т-клітин пам'яті, які можуть швидко реагувати на подальший вплив антигена. Для оцінки відповідей пам'яті, через 6 місяців після завершення лікування у тварин, що вижили без наявності пухлини, було проведено експерименти повторного навантаження. Усі миші, що вижили після першого пухлинного навантаження завдяки лікуванню Мах/антитілом до
СІТР/антитілом до РО-1, вижили й після другого пухлинного навантаження тією ж пухлиною через б місяців (Фіг. 13), що вказує на стійкий протипухлинний імунітет і індукцію довготривалих відповідей пам'яті. Крім того, коли мишей, вилікуваних завдяки лікуванню комбінацією Мах/антитіло до СІТК/антитіло до РО-1, повторно піддавали навантаженню з використанням батьківської лінії пухлини В16.Е1О0, яка не експресує ОМА, - 80 95 мишей залишаються без пухлин, причому під час повторного навантаження у них відбувалося відторгнення пухлини (Фіг. 130). Загалом ці дані свідчать про те, що комбінована терапія
Мах/антитілом до сСІТК/антитілом до РО-1 може викликати довготривалі реакції пам'яті, а також поширення епітопів проти інших антигенів, що експресуються пухлинними клітинами.
ПРИКЛАД 19. КОМБІНАЦІЯ МАХ/АНТИТІЛО ДО СІТК/АНТИТІЛО ДО РО-1 ВИКЛИКАЄ
ВИРОБЛЕННЯ ПОТУЖНИХ АНТИГЕНСПЕЦИФІЧНИХ ЕФЕКТОРНИХ Т-КЛІТИН СО КІ ВИ1»,
ЩО ІНФІЛЬТРУЮТЬ ПУХЛИНУ І Є ДУЖЕ ВАЖЛИВИМИ ДЛЯ КОНТРОЛЮ ПУХЛИНИ Й
ОЧИЩЕННЯ ВІД НЕЇ
Широкі дослідження в цій галузі показали, що СТІ. відіграють важливу роль у відторгненні пухлини, а кількість ефекторних Т-клітин СО8-, які інфільтрують пухлину, часто корелює з хорошим прогнозом (Віопт, Ш., еї аІ. Ешиг. У. Іпттипої. 2006; 36: 468-477; Воі55оппав, А. еї аї. У.
Ехр. Меа. 2007; 204:345-356; е1еег, Н. У., єї а. Опсодепе 2010; 29:6301-6313). Зовсім нещодавно було розпочато декілька досліджень на підтримку гіпотези про те, що на основі підмножини ефекторних Т-клітин пам'яті СО8"КІ ВС17 можна прогнозувати терапевтичну ефективність проти патогенних мікроорганізмів і пухлин (МіПагтеа! БО, еї аІ. МоїІесшаг Тнегару 2015; 10:1653-1662; Оівоп ЗА, вї аї. Іттипну 2013;38:1250-60; Сивпи 55, Ніапо Е. / Іттипої! 2011;186:4051-8; Ме Е, єї а). У Іттипої! 2012;:189:5206-11; мап ЮціКегеп 5, евї аї. У Іттипої 2012:189:3397-403; МІПаттєа! БО, еї аІ. Сапсег Ве5 2014;74:1789-800; біапеу СУ, єї аІ. Сапсег Ве5 2014;:74:7168-7174; Вишппег ЗМ, еії аі. Нераюіоду 2015;61:1957-67). Підвищення рівня Т-клітин СО8-КІ ВИ1: у периферичній крові мишей, що не мали пухлин, показане на Фіг. 9Е, означає, що ці клітини можуть бути імунним бо корелятом повної регресії пухлини, викликаної застосуванням потрійної комбінованої терапії
(Фіг. 10). Таким чином, було проведено перевірку того, чи пов'язана регресія пухлини з її здатністю давати стійкі відповіді антигенспецифічних ефекторних Т-клітин пам'яті СО8-КІ ВС1», що інфільтрують пухлину. Через дванадцять днів після імплантації пухлини (через 5 днів після початку терапії; Фіг. 10А) відзначали, що комбінована терапія Мах/антитілом до сІТК/антитілом до РО-1 спричиняла найбільше підвищення тетрамер-специфічних відповідей Т-клітин СО8: у пухлинах (Фіг. 14А). Після цього оцінювали підмножину ефекторних Т-клітин пам'яті СО8:" на основі маркера експресії КГ КО1. Цікаво, що терапія Мах/антитілом до сІТК/антитілом до РО-1 призводила до підвищення в - 2 рази рівнів ефекторних клітин СО8'КІ НС і клітин
ТеСракІ Ват, що інфільтрують пухлину, порівняно з усіма іншими групами (Фіг. 148-140), що означає, що антигенспецифічні ефекторні клітини СО8-КІ С: можуть мати направлену міграцію до місцезнаходження пухлини й викликати швидке здійснення ефекторної функції.
Загалом автори винаходу продемонстрували, що вироблення більшої кількості ефекторних Т- клітин СО8"КІ Ва: корелює з регресією встановлених пухлин, яка спостерігається в разі терапії комбінацією Мах/антитіло до СІТК/антитіло до РО-1.
Якщо в разі застосування комбінованої терапії Мах/(антитілом до СІТК/антитілом до РО-1 одним із механізмів, які допомагають встановити кращий контроль над ростом пухлини/регресію, є розширення популяції підмножини СО8- КІ В(С17, важливо визначити, чи буде виснаження субпопуляції ефекторних Т-клітин СО8-С0О44-КІ ВС1: призводити до втрати контролю над ростом пухлини. Спочатку була визначена здатність антитіла до КІ КС1 (акі КС1) виснажувати цільову популяцію. Щоб дослідити це, дві групи мишей, що не мали пухлин, були вакциновані з використанням комбінації Мах/антитіло до СІТК/антитіло до РО-1, а одній групі вводили 200 мкг тАбБ до КІ КО (200 мкг) на дні 0, 2, 4 і 6 після вакцинації, і на 7-й день після початку терапії відстежували експресію КІ КО1 на Т-клітинах СО8- із крові та селезінки (Фіг. 17).
Спостерігалося, що тАБб до КІ КО1 знижувало відсоткову частку Т-клітин СО8: (Фіг. 17А) і виснажувало цільову популяцію СО44-С0О8-КІ ВИ: (Фіг. 178-172). У мишей, яким вводили
Мах/антитіло до сСІТК/антитіло до РО-1, введення антитіла до КІ КО1 призводило до значущого зменшення рівня й/або абсолютної загальної кількості популяцій СО44-СО8'КІ ВИ: і
ТеСОра КІ Ват: у крові та селезінці порівняно з контрольною групою, якій не вводили КІ КО1 (Фіг. 178-17С). Потім оцінювали внесок популяції СО44-С08-КІ Ва1: у полегшення відторгнення
Зо пухлини, викликаного потрійною комбінованою терапією, за виснаженням клітин
Ср44А-СО8 КІ ВИ: у мишей з пухлинами. Результати показують, що виснаження КІ КО1 значно знижує захист, оскільки у мишей, яким проводили виснаження антитілом до КІКО1, спостерігали більш швидкий ріст пухлини, ніж у мишей, яким вводили комбінацію без виснаження КІ С1 (Фіг. 140). Ще більше вражає те, що комбінована терапія з виснаженням
ОК КО1 більше не виявляла переваги щодо регресії встановленої пухлини і довготривалого виживання порівняно з комбінованою терапією без введення акійкОо1 (095 проти 4095 відторгнення пухлини). Сукупно ці результати показують, що збільшення антигенспецифічних ефекторних Т-клітин СО8-КІ Ват», індуковане потрійною комбінацією, було механізмом, завдяки якому полегшувався контроль за ростом пухлини, регресія й довготривале виживання в цій терапевтичної моделі меланоми. Таким чином, розширення такої субпопуляції ефекторних Т- клітин СО8" може бути основною перевагою для майбутніх стратегій імунотерапії раку.
ПРИКЛАД 20. КОМБІНОВАНА ТЕРАПІЯ АНТИТІЛОМ ДО СІТК/"АНТИТІЛОМ ДО РО-1 МАЄ
СИНЕРГІЧНИЙ ЕФЕКТ 3 ВАКЦИНОЮ, ПОВ'ЯЗАНОЮ 3 АНТИГЕНОМ АУТОАНТИГЕННОЇ
ПУХЛИНИ, І ПІДВИЩУЄ ПРОТИПУХЛИННУ ЕФЕКТИВНІСТЬ
Найважливішим завданням для розробки ефективних протиракових імунотерапевтичних препаратів є стимулювання потужних протипухлинних відповідей на слабкоіїмуногенні антигени, пов'язані з пухлиною (ТАА), такі як аутоантигени. Результати, показані на Фіг. 130, означають, що комбіноване лікування Мах/антитілом до СІТК/антитілом до РО-1 імовірно індукує епітоп, що поширюється на інші ТАА меланоми за межами ОМА. Таким чином, це викликало питання про те, чи може комбінована терапія антитілом до (СІТК/антитілом до РО-1 підвищувати ефективність вакцини, що кодує аутоантиген, пов'язаний з пухлиною. Білок-2, споріднений з тирозиназою пухлинного антигена меланоми (ТРЕ-2), вибрали тому, що він є одним з найкраще вивчених слабкоїмуногенних пухлинних антигенів меланоми. Було показано, що в умовах профілактики в мишачій моделі меланоми В16 вакцинація одним агентом ТКР2 має потужні протипухлинні ефекти (Амодаагі Е, еї аІ. Сапсег Іттипо Вез 2014; 2:448-458; Редегзеп 5, вї аї.
У Іттипої 2013; 191:3955-3967). Однак в терапевтичних умовах ця активність є значно зниженою й обмеженою щодо контролю пухлин. Аналогічно, монотерапія антитілом до сІТР/антитілом до РО-1 має обмежену ефективність (Фіг. 10). Тому застосовували невідкладне терапевтичне втручання для 8-денних пухлин (із середнім діаметром пухлини - 50 мм) з 60 використанням терапії комбінацією антитіло до СІТК/антитіло до РО-1 з одночасною триразовою імунізацією мишей пептидною вакциною ТКР2, як показано на Фіг. 15А.
Комбіноване лікування встановлених пухлин продемонструвало значне пригнічення росту пухлини порівняно з контрольними групами (Фіг. 158), що означає, що лікування може порушити толерантність до аутоантигена. Що більш важливо те, що З-разове проведення комбінованої терапії ТКР2/антитілом до СІТКб/антитілом до РО-1 призвело до повної та стійкої регресії у 20 95 мишей, тоді як монотерапія не викликала повної регресії (Фіг. 158). Це спостереження підтверджує, що комбінація антитіло до СІТК/антитіло до РО-1 має синергічний ефект з пептидними вакцинами з посиленням протипухлинного імунітету. Загалом ці дослідження підтверджують концепцію про те, що комбінація антитіло до сІТК/антитіло до РО-1 може бути корисною імунотерапією для посилення індукованих вакциною відповідей проти пухлин з аутоантигенами і без аутоантигенів.
ПРИКЛАД 21. ЛІКУВАННЯ АНТИТІЛОМ ДО С0122 МАЄ СИНЕРГІЧНИЙ ЕФЕКТ З
ЗАСТОСУВАННЯМ ПРОТИПУХЛИННОЇ ВАКЦИНИ ТА МАВ ДО сСІТЕ, ЩО Дозволяє
ДОСЯГТИ ОПТИМАЛЬНОЇ ТЕРАПЕВТИЧНОЇ ЕФЕКТИВНОСТІ
Хоча монотерапія антитілом до СО122 сповільнювала прогресування пухлини, вона не була цілющою в разі більш невідкладного терапевтичного втручання за наявності 7-денних пухлин (із середнім діаметром пухлини «- 30 мму) в умовах випробування (Фіг. 18А-В). Тому, намагаючись збільшити величину специфічної до пухлини імунної відповіді, у комбінації з терапією антитілом до СО122 використовували протиракову пептидну вакцину, націлену на ОМА (БІИІМЕЕКИ), як на новий пухлинний антиген. Терапевтичне втручання за наявності 7-денних встановлених пухлин з використанням антитіла до СО122 і однієї дози пептидної вакцини показало значне пригнічення росту пухлини, що призвело до довготривалого виживання -- 10 95, тоді як жодна монотерапія практично не мала ефекту (Фіг. 18А-В). Аналіз ТІЇ показав, що у разі комбінації антитіла до СЮО122 з вакциною, спостерігалося значне зниження рівня 5-МО5С порівняно з кожним агентом окремо (Фіг. 19А-О3. Крім того, комбінована терапія також значно збільшувала подвійне продукування ІРМу/ТМЕс ефекторними ТІЇ СО8: і синергічно збільшувала в пухлинах рівень Т-клітин пам'яті СО8-0044:, специфічних до тетрамера ОМА (Фіг. 19А-О0). Збільшення рівня специфічних до тетрамера ОМА Т-клітин СО8" також відзначалося на периферії мишей, що не мали пухлин, які отримували комбіновану терапію вакциною та антитілом до СО122 (Фіг.
Зо 2гОА-С). Комбінована терапія помітно знижувала частку клітин Ттєд СО4: порівняно з монотерапією кожним агентом окремо (Фіг. 1903), що означає, що загальне покращення захисту, яке спостерігалося в групі застосування комбінованої терапії, було пов'язане: (1) зі збільшенням антигенспецифічних відповідей Т-клітин СО8:, (2) зі зниженням рівня О-МО5БС і (3) зі зменшенням популяцій Тгед СО4- у пухлині. Ці зміни можуть призвести до більш сприятливого середовища для відторгнення пухлини.
Стратегія застосування первинної вакцинації і ревакцинацій була здійснена на дні 7, 10 і 14 для лікування 7-денних встановлених пухлин, і в цих терапевтичних умовах вона показала більш тривале довготривале виживання (30 95), ніж у разі введення однієї дози вакцини (Фіг. 21А). З огляду на те, що Т-клітини СО122-С208 «ж були описані як такі, щоб мають властивості Т- клітин пам'яті СО8-- (Гі 5 еї аї., Сеї! Мої Іттипої 2014; 11:326-31; І іш У егаї., ЕгопіЕ Іттипо! 2015; 6:494), автори винаходу дослідили, чи може націлювання на таку популяцію впливати на вироблення довговічних Т-клітин пам'яті. Друге пухлинне навантаження у тварин, що вижили після застосування стратегії первинної вакцинації і ревакцинацій, проведене на 80-й день після лікування, не виявило росту пухлини, що вказує на те, що під час комбінованої терапії розвивалися й підтримувалися певні рівні Т-клітинної пам'яті (Фіг. 218).
Нарешті, з урахуванням покращеної ефективності завдяки додатковим перевагам зниження
Тгед у разі застосування комбінації Мах/антитіло до СО122 і комбінації антитіло до СО4/антитіло до СО122, автори винаходу визначили, чи може монотерапія антитілом до СО122 мати синергічний ефект з тАб до СІТЕ, імунотерапевтичним засобом для зниження кількості Тгед ср у пухлині (5спаєг БА еї аї., Сигг Оріп Іттипої! 2012; 24:217-224). Терапевтичне втручання під час 4-денних пухлин з використанням терапії комбінацією цільових тАб до СО122 і до СІТК продемонструвало синергію, демонструючи значне пригнічення росту пухлини, що дало -- 40 Фо довготривалого виживання порівняно з монотерапією антитілом до СО122 (Фіг. 22А-228В). Ці дослідження також створило додаткову основу для розробки підходів націлювання на сСІТК у поєднанні з додатковими протираковими імунотерапевтичними засобами.
ПРИКЛАД 22. МАПУВАННЯ ЗВ'ЯЗУВАЛЬНОГО ЕПІТОПА ТКОВ191
Для ідентифікації зв'язувальних епітопів для ТКОВ191 на позаклітинному домені СІТК людини проводили мас-спектрометрію на основі воднево-дейтерієвого обміну (ВДО-МС) у розчині. бо Розщеплення пепсином/протеазою ХІПІ і проведення РХ-МС
Для розщеплення пепсином/протеазою ХІЇ! проводили денатурацію 3,2 мкг СІТК людини в 133 мкл контрольного буфера (50 мМ фосфату, 100 мМ хлориду натрію за рН 7,4) шляхом додавання 135 мкл 4 М гідрохлориду гуанідину, 0,85 М буфера ТСЕР (кінцевий рівень рн дорівнює 2,5), і інкубували суміш протягом З хв за 25 "С. Потім суміш піддавали розщепленню пепсином/протеазою Хі, і отримані пептиди аналізували з використанням системи надефективної рідинної хроматографії й мас-спектроскопії НЕРХ-МС, що складається з апарату
НЕРХ Умаїег Асдиізйу, пов'язаного з гібридним мас-спектрометром С Ехасіїме"м НукБбгій
Огцаадгироіє-Огбйгар (Тпепгто). У зразках, що містять СІТЕ людини, пептиди розділяли на колонці
С8 50 мм х 1 мм протягом 19 хв з градієнтом розчинника В 2-28 95 (0,2 96 мурашина кислота в ацетонітрилі). Розчинник А являє собою 0,295 мурашину кислоту у воді. Впорскувальний клапан, колонка для пепсину/протеази Хі і пов'язані з ними сполучні трубки знаходяться всередині охолоджувальної касети з температурою, підтримуваною на рівні 11 "С. А другий перемикальний клапан, колонка С8 і відповідні сполучні трубки з нержавіючої сталі знаходяться всередині іншої охолоджуваної циркуляційної касети з температурою, підтримуваною на рівні 0 С. Ідентифікацію пептиду проводять шляхом пошуку даних МС/МС за послідовністю ІТК людини за допомогою програми Мавбсої. Допуск за масою для іонів-попередників і іонів- продуктів становить 10 ч/млн і 0,05 Да відповідно.
Ідентифікація маси гліцину 10 мкг ІТК людини піддавали деглікозилюванню шляхом інкубації з 1 мкл РМсСази Е за 37 "С протягом ночі. Потім зразок висушували, відновлювали глікан і інкубували з 5 мкл 400 мМ прокаїнаміду (приготований у суміші оцтової кислоти: ДМСО у співвідношенні 3: 7 (06./06.) і 1 М ціаноборгідриду натрію) за 65 "С протягом З год. Для видалення надлишкових реагентів для мічення зразок відновлювали в 90 95 ацетонітрилі (АЦН) до загального об'єму розчину 500 мкл.
Після кондиціонування планшетів для хроматографії гідрофільної взаємодії з твердофазною екстракцією (НІСІС-5РЕ) з 200 мкл води й 200 мкл 90 95 АЦН зразок завантажували в планшети
НІПІС-5РЕ, промивали 200 мкл 90 95 АЦН і елюювали з використанням 50 мкл 20 95 АЦН. Перед подальшим аналізом додавали 75 мкл АЦН. Маси глікану вимірювали за допомогою НЕРХ-МС з використанням апаратів УМаїег5 АСОШІТУ ОРІ Сі ВгиКег Місго ТОЕ ОЇ. вдо
Зо 8 мкл СІТК людини (3,2 мкг) або суміш із 8 мкл СБІТК людини та тАб (3,2 мкг: 24 мкг) інкубували зі 125 мкл буфера для мічення оксидом дейтерію (50 мМ фосфату натрію, 100 мМ хлориду натрію за рН 7,4) протягом 0 с, 60 с, 300 с, 1800 с, 7200 с і 14 400 с за 25 "С. Воднево- дейтерієвий обмін гасили додаванням 135 мкл 4 М гідрохлориду гуанідину, 0,85 М буфера
ТСЕР (кінцевий рівень рН дорівнює 2,5). Після цього погашені зразки піддавали розщепленню пепсином/протеазою ХІЇ! безпосередньо в хроматографічній колонці й проводили аналіз РХ-МС, як описано вище. Мас-спектри реєстрували тільки в режимі МС.
Попередні дані МС обробляють з використанням програмного забезпечення. НОХ
УумогкВепсії, призначеного для аналізу даних МС Н/О-обміну (). Ат. бос. Маз5 бЗресігот. 2012, 23 (9), 1512-1521). Рівні дейтерію розраховують із використанням середньої різниці мас між дейтерованим пептидом і його нативною формою (Іо).
Результати
Рівні дейтерію в ідентифікованих пептидах відстежували за зсувом маси з використанням
РХ-МСО. Нативний позаклітинний домен (ЕСО) СІТК демонструє значне зниження поглинання дейтерію після зв'язування з тар ТКОВ191.СІЕ на залишках 28-50 і 70-79 5ЕО ІЮО МО: 62.
Таким чином, ці області зі значним зниженням поглинання дейтерію після зв'язування з тАб визначаються як епітопні пептиди, на Фіг. 23 вони виділені темно-сірим або світло-сірим кольором.
Моделювання епітопа згідно зі структурою СІК
Вимірювання ВДО-МС зв'язування тАб ТКОВ191 з ЕСО СІТК людини показує, що епітоп зв'язування є переривчастим, і він розташований у межах двох пептидних областей СІТЕ: область 1 (залишки 28-50 5ЕО ІЮО МО: 62); область 2 (залишки 70-79 5ЕО ІЮО МО: 62).
Епітоп зв'язування таб ТКОВ191 був додатково уточнений шляхом мапування даних ВДО на З-вимірній моделі СІТК, отриманій з кристалічної структури ЕСО СІТК у комплексі з Бар
ТКОВ159. Відповідно до структури, більша частина двох пептидів є недоступною для розчинника. Відкриті частини пептидів розташовані в просторі проксимально й включають залишки 40-45 і 75-79 5ЕО ІЮ МО: 62 (виділені на Фіг. 24).
Структуру визначали наступним чином. Комплекс СІТК:ТКОВ159 отримували шляхом змішування Рабр із 25 у--ним молярним надлишком ЕСО СІТК у 20 мМ трис, рН 8,5, 250 мМ бо масі, ї інкубували суміш за 4 "С протягом ночі. За утворенням комплексу спостерігали на колонці Зирегаех 200. Кристалізацію комплексу здійснювали способом парової дифузії в сидячій краплі за 20 "С. Кристали, придатні для рентгеноструктурного аналізу, були отримані з 14 95
ПЕГ 3350 та 0,2 М Ма форміату в буфері 0,1 М НЕРЕ5, рН 7,5. Для збору даних рентгеноструктурного аналізу один кристал просочували протягом декількох секунд у кріозахисному розчині, що містив маточний розчин (з додаванням 24 9о гліцерину), і миттєво заморожували в рідкому азоті. Дані рентгенівської дифракції збирали на синхротроні Адмапсейд
Рпоїоп Зоцгсе (Агдоппе, І) із використанням детектора Маг225. Інтенсивність дифракції виявляли до роздільної здатності 2,8 ангстрема й обробляли за допомогою програмного забезпечення ХО5 (Карзс, МУ. (2010). ХО5. Асіа Сгувзі. Об6б, 125-132.). Структура була вирішена шляхом молекулярної заміни з використанням програмного забезпечення РІазег (МеСоу, А.).,
Сто55е-Кипвіеме, А.МУ., Адатв, Р.О., Міпп, М.О., еіогопі, І.С. 8. Веай, В.. (2007). У. Аррі. Стузі. 40, 658-674) з використанням як пошукової моделі структури 5116 з бази даних білків. Після розташування Раб у елементарній комірці вручну будували молекулу СІТК у електронній щільності за допомогою програмного забезпечення Соої (ЕІтпвіеєу, Р., ГопКатр, В., Зсой, У.О. 8. Соулап, К. (2010). Асіа Стгуві. О6б, 486-501).
ПРИКЛАД 23. АЗКЦ ТКОВ191.С1Е ЩОДО ПЕРВИННИХ АКТИВОВАНИХ Т-КЛІТИН І
КЛІТИННОЇ ЛІНІЇ 2УМ-3
Поліморфізм у гені ЕсуКкІША (г5396991) призводить до амінокислотної заміни валіну на фенілаланін у положенні 158 (М158Е), причому алотип 158М має високу афінність до Ідс1 людини та підвищену АЗКЦ; цей поліморфізм іноді позначається в літературі як М176Е (УМи У,
Едьегу УС, ВРедесна РВ, Вапзаї М, Сцуге РМ, Соіетап К, ЗаІтоп ЧЕ, Кітбрепу АР. У Сіїп Іпмеві; 1997; 100(5):1059-70). Сапгоп еї а. підтвердили, що гомозиготний генотип ЕсукША-158М є єдиним параметром, пов'язаним із позитивною клінічною відповіддю на ритуксимаб, тобто антитіло, механізми дії якого включають АЗКЦ пухлинних клітин (Сагігоп 5, ЮБаспеих Г, зайПез 0,
БоїаІ-Сеїїдпу Р, Вагдоз Р, Соіотьаї Р, УМаїіег Н. Віосд; 2002; 99(3):754-8).
ТКОВ191.СІЕ виготовляється як антитіло з низьким вмістом фукози та має згодом приблизно в 10 разів підвищену афінність до ЕСУКІПША, Ес-рецептора, присутнього на клітинах
НК, порівняно зі "звичайною" фукозильованою версією (КЕМ) того самого тАбБ (Ко становила "«- 37 НМ порівняно з - 370 нМ у високоафінного варіанта ЕсукША-158М ї - 180 нМ порівняно з
Зо 1750 нМ у низькоафінного варіанта ЕсукПА-158БЕ відповідно).
Було показано, що антитіла з підвищеною афінністю до ЕсукІША мають підвищену активність АЗКЦ (5ігопіІ УМ, БігоПІ С. Тнегарецшіїс Апіїбоду Епдіпеегіпа-Сштепі апа Ешитге Адмапсевз
Огіміпд Ше Зпнопдеві Столи Агеа іп Ше РПагптасешіїса! Іпдивігу. 151 ей. Замвіоп: М/ооднеай
Рибіїзпіпу; 2012). Активність АЗКЦ антитіла ТКОВ191.СІ Е оцінювали щодо декількох клітин- мішеней або клітинних ліній, що експресують різні рівні НСІТЕ. Наприклад, периферичні Т- клітини, що перебувають у стані спокою, експресують мінімальні рівні СІТК, але експресія СІТЕ підвищується в цих клітинах у разі активації іп міо. Клітинна лінія У)УМ-3 являє собою лінію плазмаклітинної лейкемії людини, яка експресує ендогенний ПОЇТК на більш фізіологічних рівнях порівняно з клітинами НиїТ102 та більш схожих з тими, що спостерігаються на активованих Т-клітинах та на диференційованих іп міїго Тед.
Активність АЗКЦ оаантитіла ТКОВ191.СІ1Е характеризували за широким діапазоном співвідношення клітин Е: Т у первинних Т-клітинах у стані спокою або в активованому стані (див.
Фіг. 25) та клітинах 9У)М-3 (див. Фіг. 26), використовуючи ефекторні клітини МК-92 158М/У.
ТКОВ191.СІ Е мало мінімальну активність АЗКЦ щодо неактивованих Т-клітин СО4», які перебувають у стані спокою (див. Фіг. 25А, ліва панель) і неактивованих Т-клітин СО8: (див. Фіг. 258, ліва панель). На активованих первинних Т-клітинах, які експресують СІТК, УМО-64164711 викликало потужну активність АЗКЦ зі значеннями ЕсСовбо від 11 нг/мл до 32 нг/мл за найвищого співвідношення Е: Т 5: 1; Значення коливалися залежно від співвідношень Е: Т (див. таблицю 9).
Значення Втлах також залежало від співвідношення Е: Т-клітин і підвищувалося разом із збільшенням кількості ефекторних клітин у системі. Антитіло ізотипного контролю (СМТО3930) не індукувало АЗКЦ.
Раніше клітини 9У)М-3 характеризувалися щодо експресії більш низьких рівнів СІТЕ, ніж клітини НиТ102, і в діапазоні, який був більш порівнянним з активованими первинними Т- клітинами і виробленими іп міїго Тео, хоча рівні були в декілька разів вище. Коли клітини )М-3 тестували з використанням високоафінних ефекторних клітин МК-92 158М у широкому діапазоні співвідношень Е: Т (див. Фіг. 26), індукована ТКОВ191.СІ Е активність АЗКЦ становила від 50 нг/мл до 130 нг/мл зі значеннями Влах, дуже схожими до значень, отриманих в аналізах АЗКС з активованими первинними Т-клітинами (див. таблицю 9). Ізотипний контроль (СМТО3930) не мав впливу. (510)
Таблиця 9
Короткий огляд ./МО-64164711-залежної МК-92-опосередкованої активності АЗКЦ залежно від співвідношення Е: Т
ПО Р іі Міні НИЗИН клітини СО4- клітини СО8- сення вхоровеою, вто ве відсутні відсутні відсутні відсутні відсутні відсутні відсутні відсутні
Дані відсутні; умови не досліджувалися. Дані щодо ізотипного контролю СМТО3930 та неактивованих первинних клітин-мішеней не показані, оскільки програмне забезпечення не могло створити надійну підгонку кривої. Е: ефекторні клітини МК-92 158М/У; Т: клітини-мішені (Т- клітини СО4-, Т-клітини СО8- або клітини «)М-3.
ПРИКЛАД 24. АКТИВНІСТЬ АЗКЦ ТЕСОВ191.СЕ ЩОДО ДИФЕРЕНЦІЙОВАНИХ ТЕЕС ІМ
МІТВО
Нещодавно опубліковані й внутрішні дані продемонстрували, що СІТЕ експресується на лімфоцитах, які інфільтрують пухлини, присутніх у мікросередовищі пухлини, як у мишей, так і у людей, причому найвищий рівень експресії спостерігається на Тео СО4- у солідних пухлинах.
Периферичні Т-клітини СО4- були диференційовані й розмножені до рівня функціонально супресивних Тед, які визначаються як СО4-Ср2г5гОХхРІЗ:. Ці Тео експресують схожі рівні СІТЕ порівняно з активованими первинними Т-клітинами СО4- і СОр8:. ТКОВ191.СІ1Е індукує антитілозалежне знищення клітин Тео, порівнянне за потужністю, спостережуваною в клітинах
У0М-3 (див. Фіг. 27). ІЗотипний контроль (СМТОЗ3930) не мав впливу.
ПРИКЛАД 25. АКТИВНІСТЬ АЗКЦ ТКОВ191.СІЕ З ВИКОРИСТАННЯМ ЕФЕКТОРНИХ
КЛІТИН З ПОЛІМОРФІЗМАМИ ЕСУВІІА ВИСОКОЇ Й НИЗЬКОЇ АФІННОСТІ
ТКОВІ91.СІ Е має приблизно в 10 разів підвищену афінність як до ЕсукША-158У//, так і до
ЕсСУКПША-158Р/Е порівняно з КЕМ такого ж тАБб; його значення Ко щодо низькоафінного ЕсукПША- 158Р/Е варіанта дорівнювало « 180 нМ, що приблизно у 2 рази більше афінності КЕМ щодо високоафінного варіанта рецептора (370 нМ).
Активність АЗКЦ ТКОВ191.СІ Е щодо клітин У)М-3 була порівнянною в разі застосування ефекторних клітин МК-92, які експресують високоафінний варіант ЕсукША-158М// або низькоафінний варіант ЕсСУКкПА-158БР/Е, причому значення ЕСзо змінювалося у - 2 рази (40,01 нг/мл і 87,44 нг/мл відповідно) (див. Фіг. 28).
ПРИКЛАД 26. КОМБІНАЦІЯ АНТИТІЛА ДО СІТЕК З АНТИТІЛОМ ДО СО040, АНТИТІЛОМ ДО
ОХ40 АБО АНТИТІЛОМ ДО РОЇ -1 ПРИЗВОДИТЬ ДО КРАЩОЇ ЗАТРИМКИ РОСТУ ПУХЛИНИ
У тварин із меншими початковими об'ємами пухлини (х- 100 мм3), яким вводили антитіла
Зо ізотипного контролю, медіанний час до кінцевої точки (МТЕ) наступав приблизно через 19 днів.
Введення ОТА-1 один раз у дозі 10 мг/кг на день 1 призводило до 2 випадків стійкої повної регресії (СК) і затримки МТЕ до 29,3 дня. Введення ЕОКа4.5, антитіла до СО40, у дозі 2 мг/кг на дні 1, 5 і 9 призводило до 6 СЕК і вимірюваної затримки МТЕ 60 днів. Комбінація однієї ін'єкції
ОТА-1 у дозі 10 мг/кг на день 1 разом із введенням ЕБОКА.5 (З рази кожні 4 дні), призводила до 8
СЕ до дня 40, причому в цей момент часу відбувалося 1 прогресування (Фіг. 29).
У тварин із білошими початковими об'ємами пухлини (х 230 мм3), яким вводили антитіла ізотипного контролю, медіанний час до кінцевої точки (МТЕ) наступав приблизно через 10,5 днів. Введення ЕОКА.5 у дозі 10 мг/кг на дні 1, 5 і 9 призводило до 1 повної відповіді (СК) і вимірюваної затримки МТЕ 33 дні. Комбінація однієї ін'єкції ОТА-1 у дозі 10 мг/кг на день 1 разом із введенням РОКа.5 (З рази кожні 4 дні), призводила до 4 стійких СК (Фіг. 30).
Одночасне введення комбінації антитіл ОТА-1 (10 мг/кг, 1 раз на день 1) і ОХ86 (антитіло до
ОХа40, 10 мг/кг, З рази кожні 4 дні, починаючи з дня 1) також призводило до кращих відповідей проти пухлинного росту зі збільшенням від 2 СЕ. у разі застосування ЮТА-1 до 5 СК у разі застосування комбінації ОТА-1 плюс ОХ86. Монотерапія ОХ86 не інгібувала прогресування пухлини (Фіг. 31).
Одночасне введення комбінації антитіл ОТА-1 (10 мг/кг, 1 раз на день 1) і ЕМР1-14 (антитіло до РО-1, 10 мг/кг, З рази кожні 4 дні) також було більш ефективним, ніж відстрочка введення одного з терапевтичних засобів через два дні після першого агента. Монотерапія антитілом до
РО-1 призводила до З СЕ, монотерапія антитілом до СІТК призводила до 2 СЕ, а комбінована терапія з одночасним введенням антитіла до СІТЕК і антитіла до РО-1 призводила до 8 СЕК. Ця ефективність знижувалася 4 або 5 СЕ у разі послідовного введення з введенням спочатку антитіла до РО-1 або антитіла до СІТК відповідно (Фіг. 32).
Короткий опис переліку послідовностей ви ва пен 00000000
ТЕОВ5 і
ТЕОВ14-
ТЕОВа23,
ЕеОВва25, гОаВв120, гОаВв127,
ЕеОВ134,
З РАТ Людина ЕОВ144, ватЕ55УА
ЕОВ153,
ЕеОВ159, вОоВв162 і дав190- неСОВІ1 твавзі1, 4 РВТ Людина кОоВвзЗ34 і СУБЕТ5УМ вавз35-ноОоВІ1 твавь, даві14, 5 РАТ | Людина (С В'ЄМТНОВІ 5с5ссвт ваВ191.СІ Б- ноерва2 твНавго- 6 | ват | ледиа ср | швовак тваваг3з, ваваг5, ваві120, дав134, 7 РВТ Людина дав144, ПРІБИТА дав153, вОоВ159 і дав190- ноорва2 твавз1- 8 | ват | ледиа ср | юевовот твНавза- се | оевт | людина фосодо | пРоовот 7 твНавзь- твавВ127. 11 РАТ Людина дав1ба2- ПРІГЕМА ноорва2 твНавб-
шини п пото шІІІІІнЬьтІІВИшш твНавго- твНавагз3- твНаваг5- твавз1- твНавза- твНавзь- твНав120-
ТКОВ127 (|і 21 РАТ Людина дав162- АВНМУКВОМІ МУ несоВвЗ тнНав134- твНавВ144- твНав153- твНав159- тваві1бо, давт191, 26 РАТ Людина ВСВІ191 СІ Е- АКОРУМ О5ЕОУ несоВвЗ тваві1бо, тТкКОоВ191ї 27 РАТ Людина ТвСВІ93. СЕТЕБМУМ
СІ Г-НСОВІ1 твавь, ваваг3, ваваг5, давз1, давза4, давзь, дав134, 28 РАТ Людина даві144, О5У5БУ дав153, даві159, ваві160, давт191,
КОВІ191.СІЕ і дав162- щеовікц) твав14- твНавго-
ТКОВ120 і 31 РАТ Людина дав127- О5І55У щеовікц) твавь, 32 РАТ Людина даві14, ра вавагз, бо ваваг5, давз1, давза4, давзь, дав134, даві144, дав153, даві159, ваві160, давт191,
КОВІ191.СІЕ і дав162- що віки твНавго-
ТКОВ120 і 34 РАТ Людина дав127- АА5 що віки твавь, ваваг3, ваваг5, давз1, давза4, давзь, дав134,
РАТ Людина даві144, ОООВБММ РІ Т дав153, даві159, ваві160, давт191,
КОВІ191.СІЕ і дав162- щеовік) твав14- твНавго-
ТКОВ120 і 38 РАТ Людина дав127- ОО5У5ТРІ Т щеовік)
ЕМО ЕЗОСИЇ МОРОСБІЇ ВІ БСААБаИавтТе
ОС М5УМУВОАРОКаї ЕМ МЗАІЗОБИСОГУ
УАрБУКОаВЕТІЗВОМ5КМТІ МІ ОММ5І ВАЕОТ
АМУУСАКОРУМ ОПАБОММСОСТІ МТ М5БАЗТК
СРОМЕРІ АРБЗ5КОТЗОСТАА аСІ МКОМЕРЕР
УМТУБМУМ5ОаАІ Т5аМУНТЕРАМІ О55(1І 51 55
Важкий МУМТУРБІББІ ато МміСМУМНнНкКРОЬМТКМОККМЕ 39 РАТ Людина анцюг ТЕСВ5 РКЗ5СОКТНТСРРСОРАРЕЇГЇ СОРБМГБІ ЕРРКРК
ОТ МІЗВТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕМКЕММУ ММ
РОМЕМНМАКТКРАЕЄОУМЗТУВММ5МІ ТМІ Н
ОМ МЕКЕМКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІБКАКОО
РАЕРОММТІ РРОВОЕЇТКМОМОІ ТС МКаєМР
ОПІАМЕМ ЕБЄМСОРЕММУКТТРРМІ ОБрОИБЕРЕ
ГМК ТУЮКЗАМОО,МУЕЗСЗУМНЕАЇІ НМН
ТОК БІ 5РаКк
ЕМО ЕЗОСИЇ МОРОСБІЇ ВІ БСААБаИавтТе
Важкий З5УАМ5ОМУНОАРОаКаї ЕМ/УБАІВИБЗОаОТУ
РАТ Людина анцюг ТЕСВІ14 УАрБУКОаВЕТІЗВОМ5КМТІ МІ ОММ5І ВАЕОТ
АМУМСАКРІВаї ОУМУСОСТІ МТМ55АЗБТКОаР
ЗМЕРІ АРЗБЗКОТОасаТтТААЇ ас МКкОМЕРЕРМТ
УЗМУМЗаАІТЗаИМНТЕРАМІ ОБОЇ БІ З5УМ
ТМРБББЗІ ОТО ГМІСМММНКРЗМТКМОККМЕРК
ЗСОКТНТСОРРСОРАРЕГ ССаРБЗМЕГЕРРКРКОТ
ГМІЗАТРЕМТСМУМОУЗНЕОРЕМКЕМУ УУОС
МЕМНМАКТКРАЕєЄОУМЗТУА!УММІТМІ НОЮ
У МаКЕМУКСКУЗМКАГ РАРІЕКТІЗКАКСОРА
ЕРОМУТГРРІАОЄСТКМОМБІ ТОЇ МКаРМРБЗО
ІАМЕМЕЗМИОРЕММУКТТРРМІ ОБравЗЕРІ 5
КсТМОКАУМООСММЕЗСЗММНЕАЇІ НМНУТО
КБІ І ЗРОК
ЕМО ЕЗОИаСІ МОРССБІ ВІ ЗСААБИБЕТЕ
За УМ ММ УВОАРОКИаГЕМ УЗОІЗЗОСОИЗК
УМАОЗУКОаАЕТІЗНОМКМТІ МІГОММ5І ВАЕО
ТАМУУСАКЕМУММОНУААЇ ОМ аОСТІ МТУ
АЗТКОаРБМЕРІ АРБЗКЗТЗОСТААГ СІ КОМ
ЕРЕРМУТУБУУМЗОАГТЗИМНТЕРАМ ОББИЇ М
Важкий 9 ЗМ МРЗЗБІ ЕТО ГМІСМУММНКРЗОМТКМО 1 РАТ Людина анцюг ТЕСВ2О ККУЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕГІ ССаРЗУБІ ЕР
РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСМУМОУМЗНЕОРЕМКЕМ
УМ УМраТамЕМНМАКТКРАЕЄОУМЗТУАМУМІ Т
МІ НОРІ МЕ КЕМКСКУЗМКАГ РАРІЕКТІЗКА
КаоРВАВЕРОММУТІ РРОНОЄЇ ТКМОМБІ ТС МК
СЕМРЗБІАМЕМЕБМСОРЕММУКТТРРМІ ОО
ЗЕ М5КІТМОКЗАМООСМУЕЗСЗУМНЕАЇ.
НМНУТОКБІ БІ РОК
СОМОЇ МОБЕАЕУККРОБЗУКУЗСКАВОИСТ
ЕЗБУАІБУУМВОАРООСІ ЕУМУМаспПРІРЕТАМУ
АОКРОСАМТІТАОЕБТЗТАММЕЇ 551 АЗЕОТА
МУМСАВНИТмУ НЕМІОМУУСОС,ТІ МТА
ТКаРЗМЕРІГАРЗБКЗТЗОСТААГ СІ МКОМЕР
ЕРМТУБМУМЗОАГТЗИИМНТЕРАМІ ОЗИМІ.
Важкий ЗОМ УРЗББІ ааТОТМІСМУММНКРЗОМТКМОКК 42 РАТ Людина анцюг ТЕСВ2З МЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇЇ СаРЗМЕГЕРРК
РКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОМЗНЕОРЕМКЕММУУ
УМрамЕУНМАКТКРАЕєОУМЗТУВУМЗМІ ТМ
ГНОрУ/ МакЕУКСКМУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАК
СОРАЕРОММТІ РРЗОАОЄЇ ТКМОМБІ ТС Ка
ЕУРБОІАМЕМЕЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ ОБОС
ЗЕРУЗКІТМОКЗАМООСМУЕЗСЗУМНЕАСН
МНУТОКБІ БІ РОК
СОМОЇ МОБЕАЕУККРОБЗУКУЗСКАВОИСТ
ЕЗБУАІБУУМВОАРООСІ ЕУМУМаспПРІРЕТАМУ
АОКРОСАМТІТАОЕБТЗТАММЕЇ 551 АЗЕОТА
УУУСААНААРМІ ОМ СОСТІ МТ МБЗАЗТКа
РЗМЕРІ АРББКЗТЗИасТААГ СІ МКОМЕРЕРМ
ТУБММЗИаАЇ ТЗОМНТЕРАМІ ОБОЇ МІ БМ
Важкий МТМРБББІ ВТОТГМІСМУМНКРЗМТКМОККМЕР
АЗ РАТ Людина анцюг ТЕСВ25 КЗСОКТНТСРРОРАРЕГ ЇЇ ССОРБМУБІ ЕРРКРКО
ТІ МІАТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕМКЕММ УМО
СМЕУНМАКТКРАЕєЄОММЗТУВМММІТМ НО
МІ МЕКЕМКОСКМУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООР
ВЕРОММУТІ РРЗВОБЇ ТКМОМБІ ТС МКакгмурР
ПІАМЕЖМЕЗМСОКОРЕММУКТТРРМІОБОСЗЕРІ.
УЗКІТМОКБАМООСММЕ5СЗУМНЕАСНМНУ
ТОК І Рак
ЕМОЇ МОБСЕАЕМККРОЕБІ КІЗСКОВИМБЕ
Важкий ТОУУМСММАОМРОКагі єУмМапоРЗОБОТАУ 44 РАТ Людина анцюг ТЕСВЗІ1 ЗРОРОСОМТІЗАОКВІЗТАМІ ОМ 5БІ КАБОТА
МУУСАВМЕРУМСІ М ОМ СОСТІ МТА
КаРЗМЕРГАРЗЗКЗТЗИасСТАА асі МКОМЕРЕ в2
РУТУБМУМБОАГТЗИМНТЕРАМ ОБОЇ БІ 5
ЗММТМРЗББ аТОГМІСМУММНКРЗОМТКМОККМ
ЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕГІ СОаРБЗМЕ ЕРРКР
КОТ МІЗАТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕМКЕММУ У
МраТмЕУНМАКТКРАЕЄОУМЗТУАММЗМІ ТМ.
НОРМ МЕКЕУКСКУЗМКАГРАРІЕКТІЗКАКИ
ОРАБЕРОММУТІ РРОВОБ! ТКМОМБІ ТС Кар
РЗБІАМЕМЕЗМСООРЕММУКТТРРМІ ОБОСЗЕ
ЕУЗКсТМОКБАМООСММЕ5СЗУМНЕАСНМН
УТОКБІ БІ Рак
ЕМОЇ МОБСЕАЕМККРОЕБІ КІЗСКОВИ МЕ
ТОУУМСММАОМРОаКагі єМУмМапмРарзотвУ
ЗРОРОСОМТІЗАОКВІЗТАМІ ОМ 5БІ КАБОТА
МУУСАНОМОУНОгОММСОСТІ МТМББАЗТК
СРЗМЕРГАРБЗКЗТЗСИСТААГ СІ МКОМЕРЕР
УТУБМУМЗОАГТЗОаМНТЕРАМІ ОБОЇ БІ 55
Важкий ММТМРБББІ ЕТО МІСМММНКРЗМТКМОККМЕ 45 РАТ Людина анцюг ТЕСВЗА РКЗСОКТНТСРРОРАРЕГІ СОСРБЗМРІ ЕРРКРК
ОТГ МІЗАТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕУКЕМУ УМ
РОМЕУМНМАКТКРАЕЄєОММЗТУАММЗМІ ТМ Н
ОМ МЕКЕУКСКУЗМКАГ РАРІЕКТІЗКАКОО
РВАЕРОМУТІ РРЗВОБ! ТКМОМБІ ТС МКагМР
ЗПІАМЕМ ЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ ОБОрИЗЕЕ
ГМ5КТУЮКЗАМООСМУЕЗСЗУМНЕАСНМН
УТОКБІ БІ Рак
ЕМОЇ МОБСЕАЕМККРОЕБІ КІЗСКОВИМБЕ
Т5УУМІЗУУВОМРОаКагЕМУМаИпоРєРИОЗОТАХ
ЗРОРОСОМТІЗАОКВІЗТАМІ ОМ 5БІ КАБОТА
МУУСАВНАМЗТИ ОМУСОСТІ МТМЗБАЗТ
КаРЗМЕРГАРЗЗКЗТБИСТАА асі МКОМЕРЕ
РУТУБМУМБОАГТЗИМНТЕРАМ ОБОЇ БІ 5
Важкий ЗММТМРЗББ аТОГМІСМУММНКРЗОМТКМОККМ 46 РАТ Людина анцюг ТЕСВЗ35 ЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕГІ СОаРБЗМЕ ЕРРКР
КОТ МІЗАТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕМКЕММУ У
МраТмЕУНМАКТКРАЕЄОУМЗТУАММЗМІ ТМ.
НОРМ МЕКЕУКСКУЗМКАГРАРІЕКТІЗКАКИ
ОРАБЕРОММУТІ РРОВОБ! ТКМОМБІ ТС Кар
РЗБІАМЕМЕЗМСООРЕММУКТТРРМІ ОБОСЗЕ
ЕУЗКсТМОКБАМООСММЕ5СЗУМНЕАСНМН
УТОКБІ БІ Рак
СОМОЇ МОБЕАЕУККРОБЗУКУЗСКАВОИСТ
ЕЗБУАІБУУМВОАРООСІ ЕУМУМаспПРІРЕТАМУ
АОКРОСАМТІТАОЕБТЗТАММЕЇ 551 АЗЕОТА
МУУСАВРААМТМЕГ ОМ СОСТІ МТМЗБАЗТК
СРЗМЕРГАРБЗКЗТЗСИСТААГ СІ МКОМЕРЕР
УТУБМУМЗОАГТЗОаМНТЕРАМІ ОБОЇ БІ 55
Важкий ММТМРБББІ ЕТО МІСМММНКРЗМТКМОККМЕ 47 РАТ Людина анцюг РКЗСОКТНТСРРОРАРЕГІ СОСРБЗМРІ ЕРРКРК вав120 ОТГ МІЗАТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕУКЕМУ УМ
РОМЕУМНМАКТКРАЕЄєОММЗТУАММЗМІ ТМ Н
ОМ МЕКЕУКСКУЗМКАГ РАРІЕКТІЗКАКОО
РВАВЕРОМУТІ РРЗВЕЕМТКМОМБІ ТС МКОаГМ
РЗБІАМЕМЕЗМСООРЕММУКТТРРМІ ОБОСЗЕ
ЕУЗКсТМОКБАМООСММЕ5СЗУМНЕАСНМН
УТОКБІ БІ Рак
СОМОЇ МОБЕАЕУККРОБЗУКУЗСКАВОИСТ
Важкий ЕЗБУАІБУМУМВОАРООСІ ЕУМУМаспРІРБЕМАМУ 48 РАТ Людина анцюг АОКРОСАМТІТАОЕБТЗТАММЕЇ 551 АЗЕОТА вав127 МУУСАВНУУКВОИТМмІ МУМСОСТІ МТУББАЗТК
СРЗМЕРГАРБЗКЗТЗСИСТААГ асСІ МКОМЕРЕР
УТУБМУМЗОАГТЗОаМНТЕРАМІ ОБОЇ БІ 55
ММТМРБББІ ЕТО МІСМММНКРЗМТКМОККМЕ
РКЗСОКТНТСРРОРАРЕГІ СОСРБЗМРІ ЕРРКРК
ОТГ МІЗАТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕУКЕМУ УМ
РОМЕУМНМАКТКРАЕЄєОММЗТУАММЗМІ ТМ Н
ОМ МЕКЕУКСКУЗМКАГ РАРІЕКТІЗКАКОО
РВАВЕРОМУТІ РРЗВЕЕМТКМОМБІ ТО Кар
РЗБІАМЕМЕЗМСООРЕММУКТТРРМІ ОБОСЗЕ
ЕУЗКсТМОКБАМООСММЕ5СЗУМНЕАСНМН
УТОКБІ БІ Рак
СОМОЇ МОБЕАЕУККРОБЗУКУЗСКАВОИСТ
ЕЗБУАІБУУМВОАРООСІ ЕУМУМаспПРІРЕТАМУ
АОКРОСАМТІТАОЕБТЗТАММЕЇ 551 АЗЕОТА
УУУСсАвнАаМмазЗамі Ум сОстІ МГМЗЗАБТ
КаРЗМЕРГАРЗЗКЗТБИСТАА асі МКОМЕРЕ
РУТУБМУМБОАГТЗИМНТЕРАМ ОБОЇ БІ 5
Важкий ЗММТМРЗББ аТОГМІСМУММНКРЗОМТКМОККМ 49 РАТ Людина анцюг ЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕГІ СОаРБЗМЕ ЕРРКР вав134 КОТ МІЗАТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕМКЕММУ У
МраТмЕУНМАКТКРАЕЄОУМЗТУАММЗМІ ТМ.
НОРМ МЕКЕУКСКУЗМКАГРАРІЕКТІЗКАКИ
ОРРАБЕРОММУТІ РРІЗВЕЕМТКМОМБІ ТС КИ
УРЗОІАМЕМЕЗМООРЕММУКТТРРМІ ОБОЄ
ЕРГУБКІТМОКЗАМООСММЕЗСЗУМНЕАЇ НМ
НУТОКБІ 5І 5РОК
СОМОЇ МОБЕАЕУККРОБЗУКУЗСКАВОИСТ
ЕЗБУАІБУУМВОАРООСІ ЕУМУМаспПРІРЕТАМУ
АОКРОСАМТІТАОЕБТЗТАММЕЇ 551 АЗЕОТА
УУУСсААнаТгБоОопамі оммсОсатІ МГМЗБА5Т
КаРЗМЕРГАРЗЗКЗТБИСТАА асі МКОМЕРЕ
РУТУБМУМБОАГТЗИМНТЕРАМ ОБОЇ БІ 5
Важкий ЗММТМРЗББ аТОГМІСМУММНКРЗОМТКМОККМ
РАТ Людина анцюг ЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕГІ СОаРБЗМЕ ЕРРКР вав144 КОТ МІЗАТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕМКЕММУ У
МраТмЕУНМАКТКРАЕЄОУМЗТУАММЗМІ ТМ.
НОРМ МЕКЕУКСКУЗМКАГРАРІЕКТІЗКАКИ
ОРРАБЕРОММУТІ РРІЗВЕЕМТКМОМБІ ТС КИ
УРЗОІАМЕМЕЗМООРЕММУКТТРРМІ ОБОЄ
ЕРГУЗКІ ТМ КЗАМООСМУЕЗСЗУМНЕАЇ НМ
НУТОКБІ 5І 5РОК
СОМОЇ МОБЕАЕУККРОБЗУКУЗСКАВОИСТ
ЕЗБУАІБУУМВОАРООСІ ЕУМУМаспПРІРЕТАМУ
АОКРОСАМТІТАОЕБТЗТАММЕЇ 551 АЗЕОТА
МУУСАВНАУ ані оммусаоаті МгуББЗАВТК
СРЗМЕРГАРБЗКЗТЗСИСТААГ СІ МКОМЕРЕР
УТУБМУМЗОАГТЗОаМНТЕРАМІГ ОБОЇ БІ 55
Важкий ММТМРБББІ ЕТО МІСМММНКРЗМТКМОККМЕ 51 РАТ Людина анцюг РКЗСОКТНТСРРОРАРЕГІ СОСРБЗМРІ ЕРРКРК вав153 ОТГ МІЗАТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕУКЕМУ УМ
РОМЕУМНМАКТКРАЕЄєОММЗТУАММЗМІ ТМ Н
ОМ МЕКЕУКСКУЗМКАГ РАРІЕКТІЗКАКОО
РВАВЕРОМУТІ РРЗВЕЕМТКМОМБІ ТС МКОаГМ
РЗБІАМЕМЕЗМСООРЕММУКТТРРМІ ОБОСЗЕ
ЕУЗКсТМОКБАМООСММЕ5СЗУМНЕАНМН
УТОКБІ БІ Рак
СОМОЇ МОБЕАЕУККРОБЗУКУЗСКАВОИСТ
Важкий ЕЗБУАІБУУМВОАРООСІ ЕУМУМаспПРІРЕТАМУ 52 РАТ Людина анцюг АОКРОСАМТІТАОЕБТЗТАММЕЇ 551 АЗЕОТА вав159 УУУСАвНнанвнмМмзаніримаоОатІ МІГУБЗА5Т
КаРЗМЕРГАРЗЗКЗТЗИасСТАА асі МКОМЕРЕ
РУТУЗМ/МЗСАГТОСУНТЕРАМІО55СГУБІ5
ЗУМТУРЗУВІ СТОТУІСМУМНКРОМТКУОККУ
ЕРКЗСОКТНТОРРСОРАРЕН СОРОМУ ЕРРКР
КОТІ МІЗВТРЕУТСУУМОУЗНЕОРЕУКЕММ У
УОСУЕУНМАКТКРВЕЄОУМеТУВМУ МІ ТМІ.
НО МОКЕУКСКУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКО
ОРВЕРОМУТІ РРОВЕЕМТКМОМЗІ ТСІ УКСЕ
УРЗОІАУЕМ/ЕЗМСООРЕММУКТТРРМІ О50С5
ЕЕГУЗКІ ТУОКЗВУООСМУЄ5СЗУМНЕАІ НМ
НУТОКУІ 8І5РОК
ОМОЦП ЕЗСОСІУОРООБІ ВІ ЗСААБСЕТ
ЕЗМУМ/М5МУВОАРОКСІ ЕМ/У5АІЗО5СО5т
УУАОБУКОВЕТІЗВОМеКМТІ МОМ ВАЕО
ТАУУУСАКОЕУМ О5ЕОУМ ОСТІ УТУЗ5АСТ
КОРУУЕРІ АРЗЗКУТЗССТААІ ОСІ УКОУЕРЕ
РУТУЗМ/М5СА! ТЗСУНТЕРАМІ О55С1 У5І 5
Важкий ЗУМТУРЗУВІ СТОТУІСМУМНКРОМТКМОККУ 5З РВТ Людина ланцюг ЕРКЗСОКТНТОРРСОРАРЕН СОРОЗМУЕІ ЕРРКР воВіво КОТІ МІЗВТРЕУТСУУМОУЗНЕОРЕУКЕММ У
УОСУЕУНМАКТКРВЕЄОУМеТУВМУ МІ ТМІ.
НО МОКЕУКСКУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКО
ОРВЕРОМУТІ РРОВЕЕМТКМОМЗІ ТСІ УКСЕ
УРЗОІАУЕМ/ЕЗМСООРЕММУКТТРРМІ О50С5
ЕЕГУЗКІ ТУОКЗВУООСМУЄ5СЗУМНЕАІ НМ
НУТОКУІ 8І5РОК
ОМОЇ МО5САЕУККРОЗЗУКУЗСКАЗОСТ
ЕЗ5УАІЗМ/УВКОАРСОСІ ЕМ/МОСТПРІЕЄСМАМУ
ДОКЕОСВУТІТАОЕСТОТАУМЕЇ 551 85ЕОТА
УУУСАВНУУКВСМІ МУМСОСТІ УТУЗЗАВТК
СРОМЕРІ АРЗЗКОТЗОСТААГ ОСІ УКОУЕРЕР
МТУЄМ/МУСАЇ ТЗСУНТЕРАМІ О5501 51 55
Важкий УУТУРЗУВІ СТОТМІСМУМНКРОМТКУЮККУЕ
БА РВТ Людина ланцюг РКЗСОКТНТСРРОРАРЕ ССРЗУБІ ЕРРКРК воВІ62 ТІ МІЗВТРЕУТСУУУОУЗНЕОРЕУКЕММ УМ
ОСМЕУНМАКТКРАВЕЕОУМОТУВУУ МІ ТМІ Н
ОДУ МСКЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСО
РВЕРОМУТІ РРОВЕЕМТКМОМЗІ ТСІ УКСЕУ
РОПІАМЕМ ЕЗЄМСОРЕММУКТТРРМІ О50О5Е
РГУЗКІ ТУОКЗВУООСМУЕ5С5УМНЕАІ НН
УТОКЗІ І РОК
Тв, вовг, вОв25,
ВОЗІ, ново ЕІМІ ТО9РАТІ 8І ЗРСЕВАТІ ЗСВАЗОЗУВ
ПОВІЯ ЗМІ АМ/ХООКРООАРВИ ІУОАЗМААТСІРАВЕ пев О05С05СТОЕТІ ТІЗ8ІЕРЕОБАУУУСООВОМ
ББ РВТ Людина ГВС М/РІ ТЕСОСТКУЕІКВТУААРЗУЕІЕРРЗОЕОІ. пев К5СТАЗУМСИ ММЕУРНЕАКУСМКУОМА! О5 повів СМОЗОЕЗУТЕОО5КОТУВІ З5ТІ ТІ ЗКАОМЕК
НКУУАСЕУТНОСІ 55РУТКЗЕМВСЕС вОвІвг, вОВІ190, веВ191 і
ВОВІ191.СІЕ егкий ланцюг
ЕІМІ ТО5РАТІ БІГЗРСЕВАТІ ЗСВАБОБУМ вв щк людина Легкий МЕГАМ/ХООКРООАРВІИ УОАЗМВАТСІРАВЕ анцюг ТЕСВ14 6О5С5ОТОЕТІ ТІ ЕРЕОБАУУУСООСЕМА
РІ ТЕСОСТКУЕІКВТУААРЗУЕІЕРРЗОЕОІ КО
СТАЗМУСПЛІМЕУРВЕАКМОМ/КУРМАГОБОМ
ЗОЄЗУТЕОО9КОТУ ЗІ 55ТІ ТІ ЗКАОХЕКНК
МУАСЕМТНОСІ 55РУТКЗЕМВСЕС
ЕЇМІ ТО5РАТІ БІГ 5РСЕВАТІ ЗСВАБОБУМ
ЗЕ АМ/УООКРООАРВІ ПУУАЗМВАТСІРАВЕ пегкий З09С9СТОЕТІ ТІЗ9ІЕРЕОРАУУУСООМІВМ 57 РВТ Людина | анцюгТвовоо РІ.ТЕООСТКУВІКАТУААРВЗУРІЕРРБОБОЇ КО
СТАЗУУСИ ММЕУРВЕАКУСЄМКУОМАГ ОО
ЗОЄЗУТЕОО9КОСТУ ЗІ 5571 ТІ ЗКАОХЕКНК
МУАСЕУТНОСІ 55РУТКЗЕМВСОЕС
ПІОМТО5РУБІ ЗАЗУСОВУТІТСВАЗОБІВ
ЗУ ММ/УООКРОКАРКИ У ААУ О5СУРОВЕ
ТеОВІ2о і5О5О5ОТОЕТІ ТІЗ5ОРЕОБАТУУСООВУЗТ 58 РВТ Людина ІгВСВІ127 РІ ТЕСОСТКУЕІКАТУААРЗУЕІЕРРЗОБОЇ КО егкий ланцюг... СТАЗУУСИ ММЕУРВЕАКУОМКУОМАГ О5ОМ
ЗОЄЗУТЕОО9КОТУ ЗІ 55ТІ ТІ ЗКАОХЕКНК
МУАСЕМТНОСІ 55РУТКЗЕМВСЕС
ОВРТОСРОССРОВІ І СТСТОАВССВУН
ТТАССАРУРСОЕЕССЗЕМ ОСМСУОРЕЕНСОЮ
59 РВТ Людина СІТА 26-161 РССТТСВННРСРРООСУОЗОСКЕЗЕСЕОСІЮ
САЗСТЕЗОСНЕСНСКРМ/ТОСТОЕСЕЇ ТУЕР
СМКТНМАУСУРСОЗРРАЕ
ОВРТОСРОССРОВІ СТОТОАВССВУН
ТТАССАРУРСОЕЕССЗЕМ ОСМСУОРЕЕНСОЮ
РОССТТОВННРСРРСОСУО5ОСКЕВЕОРОСІЮ
САЗСТЕЗОСНЕСНСКРМ/ТОСТОЕСЕЇ ТУЕР
РА Людина ВІТА 26-21 |(СМКТНМАУСУРСЗРРАЕРІ СУ. ТУМИ АУАА
СМІТА СІ НІМ/ОЇ ВЗОСММ/РВЕТОЦШІ Е
МРРОТЕОАВЗСОЕРЕЕЕВСЕВЗАЕЕКОНВІ СО
ПММ
ОВРТОСРОСОРОВІ СТОКРАВССВУН
РТАВССВОУОЗЕЕССЗЕМОСУСМОРЕЕНСОМ
РССТТСОННРСРЗСОСУОРОСКЕЗЕСЕВСУ ві щк Яванський| сітв ОСА СТЕЗВСНОСНОКРМ/ТОСТОЕСЕЇ ТЕР макак СМКТНМАУСУРОЗРРАЕРРСУМ ТІМ АУААС
МІ ТАС СІ НІМ'ОЇ О5ОРТОРВЕТОШІ ЕМ
РРОТЕОАЗЗСОЕРЕЕЕВСЕВІ АЕЕКОВІ СОІ.
МУ
МАОНСАМСОАЕВА ССГАГІ СА ЗІГООВР
ТОСРОСОРОВЦІ СТСТОАВССВУНТТАСС
ВОУРСЕЕССЗЕМ/ ОСМСМОРЕЕНССОРОСТТ во РВТ Людина Повномірний САННРСРРООСМООСКЕЗЕааРОСІОСАВИ сітв ТЕЗОСНЕСНСКРМ/ТОСТОРОРІ ТУЕРСМКТН
МАУСУРСОЗРРАЕРІ СУ. ТУМИ АМААСУЦІ Т
ЗДОЇ СІ НІМ/ОІ ВОСММ/РВЕТОЦІ ЕУРРУТ
ЕОАВЗСОЕРЕЕЕНСЕВЗАЕЕКСВІ СОЇ МУ
ОМОГУО5САЕУККРОЗЗУКУЗСКАЗОСТ
ЕЗ5УАЛІЗМУВОАРСОСІ ЕМ/МОСТІРІЕСТАМУ
ДОКЕОСВУТІТАОЕЗТОТАУМЕ! 551 ВЗЕОТА
УУУСАВНАВЕМ/ СУМ СОСТІ УТУЗЗАЄТКО
РОМЕРІ АРЗЗКУТЗОСТААІ ОСІ УКОУЕРЕРУ
ТУ5М/М5ОА! ТОСУНТЕРАМІ 05501 51.55
МТУРУЗЗВІ СТОТУІСМУМНКРОМТКУОККУЕР
63 РА Людина ТАСВІТ90УН КСоКТНТСРРСРАРЕЦІ СОРБЗУБІ ЕРРКРКО
ТІ МІЗВТРЕУТСУУУОУЗНЕОРЕУКЕММ УМО
СМЕМНМАКТКРВЕЕОУМОТУВУУ МІ ТМ НО
ОМ МСКЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОР
ВЕРОМУТІ РРОВЕЕМТКМОУВІ ТСІ УКОЕУР
ЗПРІАУЕМ/ЕЗЄМСООРЕММУКТТРРМІ О50С5ЕЕ
І УЗКІ ТМОКЗВУООСМУєЗС5УМНЕАІ НН
11111111 МТОоКБІВІЗРОКЇЛ/7///7777
ЕМО ЕБОСИОЇ МОРОСБІ ВІ БСААБОЕТЕ
ОМУММ5УМАОАРОКаИЇ ЕМ У5АІЗОБИСТУ
УАОБУКОВЕТІЗАОМ5КМТІ МІ ОММ5І ВАЕОТ
АМУУСАКОРУМ ОЕМ ПОСТІ МТУ55АВТК
СРОМЕРІ АРЗБЗ5КОТЗОСТААІ СІ МКОМЕРЕР
МТУБУУМ5аИаАІ ТЗОМНТЕРАМІ 05501 М5І 55
ТВОВ191 ЇММТМРБУББІ аТтОТМІСМУМНКРОМТКМОККМЕ 64 РВАТ Людина вВОВ191.С1Е- ІРКОСОКТНТСРРОРАРЕЇ І СОРБМЕІ ЕРРКРК
Н РОТІ МІЗВТРЕУТСММУМОМЗ5НЕОРЕМКЕММ УМ
РОМЕМНМАКТКРАЕЕОСУМОТУВУМ5МІ ТМІ Н
ОМ МОКЕУКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООС
РВЕРОМУТІ РРОВЕЕМТКМОМ5І ТСІ УКа БУ
РБВІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ ОБРОаБЕ
ЕК ТМОКЗАМОСаММЕЗСОСЗУМНЕАСНМН
ТОК БІ РОК
МТІНР5ОРІТСЕРІ Е5ТАПІЗРКМСЇІ ЗНІ ЕМ
МРІ БНІААТОСАОН5ОБМУУКІ МІ ЕС5ІУМІ І БІ С
ЗЕМ ІРІБГ ОЇ ЕТАКЕРСМАКЕСОРІ РОКОМ
АЗББЗЕРРСУМКМ5ОМУКІ ЕП Ома МІС ОМАР 65 РАТО| Людина віТВ. МАМУМОМАРЕЕМВІ УКМКОМІОТІ ТМКОКІОМ
УаатмуЕІ НМаОТтІО ІЕМ ЕНОМ
КММТ УСП АМРОРІВ
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» "АМ55ЕМ ВІОТЕСН, ІМО.
НОМ АМО, САМ
КЕНОЕ, У«ОНМ
МІШ АВЕАЇ, ОАМІЕЇ.
ЗЕРИОГМЕВА, МАМИОЕЇ. АГ ЗЧАМОНО
ЗММУОЕВ, ПІМОА «120» АНТИТІЛА ДО СІТЕ, СПОСОБИ Й ЗАСТОСУВАННЯ «130» УВІБОВ2МОРСТ «140» Перевідступлення прав «1415 2017-03-08 -150» 62/407,106 -1515 2016-10-12 -150» 62/305,270 -1515 2016-03-08 -160» 66 «170» Раїепіп, версія 3.5 «-2105 1 «-2115 8 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 1
Сіу Рпе Тнг Рне 5ег Сіу Туг Тр 15 «-21052 «-2115 8 «2125» РВТ
Коо) «213» Ното зарієп5 «4005» 2
Сіу Рпе Тит Рне 5ег Зег Туг Аа 15 «2105 З «-2115 8 «2125» РВТ
«213» Ното зарієп5 «4005» З
Сіу Спу Тк Рне 5ег Зег Туг Аа 15 «2105 4 «2115 8 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 4
Сіу Туг Зег Ре Тнг Зег Туг Тр «21055 «2115 8 «212» РВТ 15 «213» Ното зарієп5 «4005» 5
Пе бЗег Спу Зег СПу Спу бег ТНг 15 «210556 «2115 8 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 6
Пе бег Зег Авр Спу Спу бег І ув 15 -2105 7 «2115 8 «212» РВТ «213» Ното зарієп5
Ко) «4005 7
Пе Пе Рго Пе РНе Сіу Тнг Аа 15 «2105 8 «2115 8 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 8
Пе Авр Рго бег Ар 5ег Авр ТНг 15 2105 9 «2115 8 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 9
Пе Туг Рго Спу Авр Зег Авр ТНг 15 «210510 «2115 8 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 10
Пе Ар Рго Су Авр 5ег Авр ТНг 15 -2105 11 «2115 8 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 11
Пе Пе Рго Пе РНе Сіу Авп Аїа (516) 15
«2105 12 «2115 11 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 12
Аа Гуз Азр РНе Туг Тгр Азр Аа Ре Азр Туг 1510 «210513 «21159 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 13
Аа Гуз Рго Пе Ага Су І єи Азр Туг 15 «2105 14 «2115 14 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 14
Ага Гуз Сім Маї Маї Туг Авр Ніз Туг Айа Аїа І єи Ар Туг 1510 «210515 «211513 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 15
Аа Агу Ніз Сіу Авп Тр Геи Нів Рне Авп Геи Азр Туг 1510 «210516
Зо «211510 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 16
Аа Агу Ні Агу Аг Рне Ттр І єи Азр Туг 1510 «210517 «211513 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 17
Аа Агу Маї РНе Рго Туг Туг Спу І еи Маї Геи Авр Туг 1510 «2105 18 «2115 11 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 18
Аа Агу Ар Туг Сту Ттр Ні Авр РНе Авр Туг 1510 «2105 19 «211513 «212» РВТ «213» Ното заріеп5 «4005» 19
Аа Аг Ніз Аго Ттр бег ТНиг Зегі еи ГГ еи І ви Авр Туг 1510 «2105» 20 «211512 «212» РВТ 60 «213» Ното зарієп5
«400» 20
Аа Агу Рго Агу Агу Авп ТНг Авп Си І єи Авр Туг 1510 «2105 21 «211512 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 21
Аа Аг Ні Маї Туг Гуз Агу Су Ма! І еи Авп Туг 1510 «2105 22 «211512 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 22
Аа Аг Ніз Агу Ттр Сіу бег Спу Авп ГІ еи Авр Туг 1510 «2105 23 «211512 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 23
Аа Аго Ніз Сіу Рне СіІп Ага Спіу ТугіІ єи Авр Туг 1510 «2105» 24 «2115 11 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 24
Зо Аа Аго Ні Аа Тр І єи Сту Нів І єи Авр Туг 1510 «2105 25 «211512 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 25
Аа Аго Ні Сіу Ага Авп 5ег Спу Агу І єи Авр Туг 1510 «2105» 26 «2115 11 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 26
Аа Гуз Авр РНе Туг Тгр Авр 5ег Рпеє Авр Туг 1510 «2105 27 «2115 8 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 27
Сіу Рпе Тиг Ре 5ег Авп Туг Тр 15 «2105» 28 «-211556 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 28
Сіп бег Ма! Зег Зег Туг 15 бо «2105» 29
«212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 29
Сп бег Маї Авп Авп Рпе 15 «210» 30 «-211556 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 30
Сп бег Маї Авп 5ег Рне -2105 31 15 «-211556 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 31
Сіп Зег Пе бег Зег Туг 15 «2105 32 -21153 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 32
Азр Аа 5ег 4 «2105» 33 -21153
Ко) «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 33
Туг Аіа Зег 4 «2105» 34 -21153 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 34
Аа Аа 5ег 1 «2105» 35 «21159 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 35
Сіп Сп Аго Зег Авп Тр Рго І єи ТНг 15 «2105» 36 «21159 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 36
Сп Суп Спіу Рне Авзп Аа Рго І єи ТНг 15 -2105 37 «21159 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 60 «4005» 37
Сіп Сп Туг Пе Аг Тгр Рго Геи Тиг «210» 38 «21159 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 38
Сіп Сп бег Туг Зег ТАг Рго І єи ТНг 15 «210» 39 «2115» 448 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 39
Сім Маї Сіп Г еи Геи Сі Зег Сіу Спу Спу Геи Маї Сип Рго Сіу Спу 151015 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа бег Спу Рпе Тиг Рпе Зег Сіу Туг
Тр Меї 5ег Тгр Маї Аго ап Аа Рго Стпу Гуз СПу Г еи Спи Тр Маї 20 35 40 45 зЗег Аа Пе б5ег Спу 5ег Спу Спу зег ТНг Туг Туг Аіа Азр 5ег Маї 50 55 60
Гуз Спіу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Авп з5ег І уз Азп ТНг Гей Туг 65 70 75 80 25 Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суб 85 90 95
Аа Гуз А5р РНе Туг Тгр Авр Аа Рне Авр Туг Ттр Сіу Сп СПУ ТАг 100 105 110
Ї еи Маї Тниг Маї Зег 5ег Аа 5ег ТНг І уз Сіу Рго 5ег Маї Рне Рго 30 115120 125
Ї еи Аа Рго 5ег 5ег Гуз бег ТНг Зег Спу Спіу Тнг Аїа Айа І єи Спу 130 135 140
Суз І єи Ма! Гуз Азр Туг РНе Рго Сіи Рго Маї Тнг Маї Зег Ттр Авп 145150 155160 зЗег Сіу Аа І еи ТАг Зег Сіу Маї Ні5 Тнг Ріє Рго Аа Маї І ви Сип 165 170 175
Зег Зег Сіу І ей Туг 5ег І єи Зег 5ег Маї Маї Тнг Маї Рго 5ег 5ег 180 185 190 зег І ви Спу Тиг Сп Тиг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нізв ГІ ув Рго Зег 195 200 205
Азп Тпг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сім Рго Гуз Зег Су Авр Гуз ТНг 210 215 220
Ні Тиг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сім І єи І єи Спу Спу Рго 5ег 225230 235 240
Маї Рне Геи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТАг І єи Меї Пе 5Зег Аг9 245250 255
ТАг Рго Си Маї Тиг Суз Маї Маї Ма! Азр Маї 5ег Ніз Спи Авр Рго 260 265 270
Сіи Ма! Гу Рне Азп Тгр Туг Маї Азр ау Маї Спи Маї Ні Азп Аа 275280 285
Гуз Тнг Гуз Рго Ага Спи См Сп Туг Авп Зег ТАг Туг Ага Маї Ма! 290 295 300 зег Ма! І єм Тниг Ма! І єи Ніз Сип Авр Тгр Геи Авп Сіу Гуз СІМ Туг 305 310 315 320
І уз Суз І уз Ма! Зег Авп І уз Аа І єм Рго Аа Рго Пе Спи Гуз ТНг 325 330 335
Пе Бег Гуз Аа Гуз СПу Сип Рго Ага Спи Рго Сп Маї Туг Тиг Гей 340 345 350
Рго Рго 5ег Агу Авр Си І єи Тпг Гуз Авп Сп Маї Зег І еи Тиг Сув бо 355 360 365
Ї еи Ма! Гуз Спу Ре Туг Рго Зег Авр Іе Аа Маї Спи Тгтр СІМ Зег 370 375 380
Азп сту Сп Рго См Авп Авп Туг Гуз ТНг Тйг Рго Рго Маї І єи А5р 385 390 395 400 зЗег Авр Сіу Зег РНе Ріє І єм Туг Зег І уз І еи Тнг Маї Авр Гуз Бег 405 410 415
Аг9 Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Рпе Зег Суз Зег Ма! Меї Ніз Сім Аа 420 425 430
Ї еи Нів Авп Ніз Тут Тиг Сп Гув Бег ГГ еи Зег І ви Зег Рго Спу Гув 435 440 445 2105» 40 «211» 446 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 40
Сім Маї Сіп Г еи Геи Сі Зег Сіу Спу Спу Геи Маї Сип Рго Сіу Спу 151015 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 Аа Меї 5ег Тгр Маї Ага Сп Аїйа Рго Су Гуз Спу І и Спи Тр Маї зЗег Аа Пе б5ег Спу 5ег Спу Спу зег ТНг Туг Туг Аіа Азр 5ег Маї 60
Гуз Спіу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Авп з5ег І уз Азп ТНг ГГ еи Туг 25 65 70 75 80
Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Ар ТНг АЇа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Аа Гуз Рго Ме Ага ау І еи Авр Туг Ттр Сіу Сіп Сіу Тнг Геи Маї 100 105 110
Коо) Тнг Маї Зег Зег Аіа Зег Ти Гуз Спу Рго Зег Маї РНе Рго Геи Аіа 115120 125
Рго бег Зег І уз Зег Тиг Зег Сіу Спу ТНг Аа Аа І еи Стпу Суз І еи 130 135 140 маї Гуз Ар Туг РНе Рго Сім Рго Маї Тнг Маї 5ег Тгтр Авзп Зег Спу 35 145150 155160
Аа Гей Тнг Зег Спу Маї Ні5 Тниг Рне Рго Аїа Маї І єи Сп Бег Зег 165 170 175
СІУ Г єи Туг Зег І еи Зег Зег Маї Ма! Тиг мМаї Рго Зег 5ег Зег І еи 180 185 190 40 сСіу Тиг Сп Тег Туг Пе Сув Авзп Маї Авп Нів Гуз Рго 5ег Авзп ТНг 195 200 205
Гуз Маї Азвр Гуз І уз Маї Спи Рго Гуз Зег Су Авр Гуз Тнг Ні Тиг 210 215 220
Сув Рго Рго Сузв Рго Аа Рго Сім І єи Гей Спу СПу Рго 5ег Ма! Рне 45 225230 235 240
І еи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТАг І ви Ме! Ше Зег Агу Тнг Рго 245250 255
Сіи Маї Тниг Суз Маї Маї Маї Азр Маї 5ег Ніз Си Авр Рго Сім Маї 260 265 270 50 Гуз Рпе Авп Тр Туг Маї Авр Су Маї Спи Маї Ні Авп Аїа Гуз ТНг 275280 285
Гуз Рго Агу Спи Спи Сіп Туг Авп Зег ТАг Туг Ага Маї Маї 5ег Маї 290 295 300
Ї єи ТНиг Маї І єи Ніз Сіп Авр Тр І єи Азп Су Гуз Спи Туг І уз Сув 55 305 310 315 320
Гуз Маї 5ег Авп І уз Аа І єи Рго Аїйа Рго Пе Сім Г ув Тк Пе Зег 325 330 335
Гуз Аа Гуз СпПу Сип Рго Агу Си Рго Сіп Маї Туг Тиг Г еи Рго Рго 340 345 350 60 зЗег Агу Азр Сі І єи ТНг Гуз Авп Сп Маї 5ег І єи Тнг Суз І еи Маї
355 360 365
Гуз Спу Ре Туг Рго Зег Авр Іе Аа Маї Сім Тгтр Спи Зег Азп Су 370 375 380
Сіп Рго Сім Авп Авп Туг Гуз Тпг ТНг Рго Рго Маї Г еи Авр 5ег Авр 385 390 395 400
Сіу Зег Рпе Рнве І єи Туг Зег Гуз Гей ТНг Маї Авр Гуз Зег Аг9 Тр 405 410 415
Сіп Сп су Авп Маї Рпе 5ег Суз Зег Ма! Меї Ніз Сім Аїа І еи Нів 420 425 430
Авп Ніз Туг Тиг ап Гуз Бег ГГ еи Зег ГГ еи Зег Рго Спіу Гуз 435 440 445 «2105» 41 «2115 451 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 41
Сім Маї Сіп Г еи Геи Сі Зег Сіу Спу Спу Геи Маї Сип Рго Сіу Спу 151015 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег Спу Рпе ТНиг Рне Зег Спу Туг 20 25 30
Тр Меї Авп Тр Маї Ага Сп Аа Рго Стпу Гуз СПу Г еи Стпи Тгр Маї 35 40 45 зЗег Спіу Пе Зег Зег Авр Спу Спу 5ег Гуз Туг Туг Аа Авр 5ег Маї 50 55 60
Гуз Спіу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Авп з5ег І уз Азп ТНг ГГ еи Туг 65 70 75 80
Ї еи Сп Меї Авп з5ег ГГ еи Аг Аїа Спи Ар ТНг Аа Маї Туг Туг Суб 85 90 95
Ага Гуз Сім Маї Маї Туг Авр Ніз Туг Аїа Аа І ви Авр Туг Тгтр Спу 100 105 110
Сіп СЧУу ТНг І єи Маї Тнг Маї Зег 5ег Аа 5ег ТНг І уз Спіу Рго 5ег 115120 125
Маї Рне Рго Гей Аїа Рго 5ег Бег Гуз Зег ТАг Зег Сіу Спу ТНг Аа 130 135 140
Аа І єи Стпу Суз І еи Ма! Гуз Азр Туг Рнє Рго Сі Рго Маї Тнг Ма! 145150 155160 зЗег Тр Азп 5ег Су Аа І еи Тнг бег Стпу Маї Ні Тнг Рне Рго Аїа 165 170 175 маї Геи СіІп Зег Зег Спу І еи Туг Зег І еи 5ег Зег Маї Ма! Тнг Маї 180 185 190
Рго бег Зег Зег І ви Спу ТАг Сп ТАг Туг Пе Суз Авп Маї Авп Ніб 195 200 205
Гуз Ро 5ег Азп ТНг Гуз Маї Азр І уз І уз Ма! Сім Рго І уз бег Суб 210 215 220
Ар Гуз ТНг Ні Тнг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Спи І ей Гей Спу 225230 235 240
Сіу Рго Зег Маї Рпе Геи РНе Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНг І еи Меї 245250 255
Пе Бег Агу Тниг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Нів 260 265 270
Сі Авр Рго Сііи Ма! Гуз Рне Авзп Тгр Туг Маї Азр Су Маї Сіи Маї 275280 285
Нів Авп Аа Гуз ТНг Гуз Рго Ага Спи СПми стіп Туг Авп 5ег ТАг Туг 290 295 300
Аг Маї Маї Зег Ма! І еєи Тиг Маї Геи Нів Сп Авр Тр Геи Авп Спу 305 310 315 320
Гуз Спи Туг Гуз Суз І уз Ма! бЗег Авп І уз Аа І еи Рго Аа Рго Ме 325 330 335 сій Суз ТАг Пе Зег Гуз Ага Гуз Спу Сп Рго Агу Сім Рго Сіп Маї бо 340 345 350
Туг ТигГ еи Рго Рго Зег Агу Авр Си І єи Тиг Гуз Авп ап Маї Зег 355 360 365
Ї еи Тиг Суз І еи Ма! Гуз Спу Рпе Туг Рго 5ег Ар Пе Аа Маї Сі 370 375 380
Тр Спи Бег Авп ау Сп Рго СІм Авп Авп Туг Гуз Тит Тнг Рго Рго 385 390 395 400 маї Геи Авр 5Зег Авр Су 5ег Рпе РНе Геи Туг Зег Гуз Геи ТНг Маї 405 410 415
Азр Гуз 5ег Агу Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Рне 5Зег Сув 5ег Ма! Меї 420 425 430
Ні Сі Аа Г єм Ні Авп Ні Туг ТНг Сип Гуз Зег І єи 5ег Гей 5ег 435 440 445
Рго сту Гув 450 «2105» 42 «2115 450 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 42
Сп Маї Сп І єи Маї Сіп бЗег Спіу Аа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу Бег 151015 зЗег Ма! І уз Ма! Зег Суз І уз Аа Зег Сіу СПУ ТНг Рне 5ег 5ег Туг 20 25 30
Аа Іе 5ег Ттр Маї Аг Сп Аа Рго Спу Сип СПу Гей Спи Тгр Меї 35 40 45 сСіу Спу Пе Пе Рго Пе РНе Стпу Тнг Аа Азп Туг Аа Сп Гу5 Ріе 50 55 60
Сіп Спу Аг Маї Тк Пе Тнг Аа Азвр Сім Бег Тнг 5ег Тнг Аа Туг 65 70 75 80
Меї Сі І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Тут Туг Суз 85 90 95
Аа Аго Ні Сіу Авп Ттгр І єи Нів Рнеє Азвп І єи Авр Туг Тр Сіу Сп 100 105 110
Спу ТНгІ єи Маї Тнг Маї Зег 5ег Аа 5ег ТНг Гуз Спу Рго 5ег Маї 115120 125
Рне Ро І єм Аа Рго 5ег 5ег І уз Зег Тиг Зег Сіу Спу ТНг Аа Аа 130 135 140
Ї ви Спу Суз І еи Ма! Гуз Авр Туг Ре Рго Сім Рго Маї Тиг Маї Зег 145150 155160
Тер Авзп 5ег Су Аа І єи Тнг Зег Спу Маї Ні Тнг Рне Рго Ага Маї 165 170 175
Ї єи Сп бег бег Спу І єи Туг 5ег І єи бег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Рго 180 185 190 зЗег Зег ЗегІ ей Спу Тиг Сп Тиг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нів ГГ ув 195 200 205
Рго бег Авп ТНг І уз Маї Авр Гуз І уз Маї Си Рго Гуз бЗег Суз Ар 210 215 220
Гуз Тнг Ні Тниг Суз Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сі ГГ еи Геи Спу Спу 225230 235 240
Рго Зег Маї Рпе Г еи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Ар ТАг ГГ еи Меї Пе 245250 255 зЗег Агу ТАг Рго Сіи Ма! Тнг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Ніб Си 260 265 270
Азр Рго Сіи Маї Гуз Рпе Авп Тр Туг Ма! Азр Сту Маї Спи Маї Нів 275280 285
Авзп Аа Гуз Тпг Гуз Рго Ага Сім Спи Сп Туг Авп бЗег ТНг Туг Ага 290 295 300 маї Маї Зег Ма! Гей Тнг Маї І єи Ніз Сіп Ар Тгр І єи Авзп ау І ув 305 310 315 320 60 Спи Туг Гуз Суз І уз Ма! бег Авп І уз Аа І еи Рго Аа Рго Ме Си
325 330 335
Гуз Тниг Пе 5ег Гуз Аа Гуз Спу Сіп Рго Агу Сім Рго Сіп Маї Туг 340 345 350
Тиг Ге Рго Рго 5ег Ага Ар Си І еи ТНг Гуз Авп ап Маї 5ег І ви 355 360 365
Тниг Суз І еи Маї Гуз Спу РНе Туг Рго Зег Азр Іе Аа Ма! Спи Тгтр 370 375 380 сій Зег Авп Спу Сіп Рго Спи Авп Авп Туг Гуз ТНг ТАг Рго Рго Маї 385 390 395 400
І еи Авр 5ег Авр Спу 5ег Ре Ре Г єи Туг Зег Гуз Геи Тнг Ма! Азр 405 410 415
Гуз 5ег Агу Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Рпе Зег Суз Зег Ма! Меї Нів 420 425 430
Сім Аа І єм Ні Авп Ні Туг Тиг Сп Гуз Зег І єи Зег ГГ еи 5ег Рго 435 440 445 сСіу Гуз 450 2105» 43 «2115 447 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 43
Сп Маї Сп І єи Маї Сіп бЗег Сіу АІа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спіу Зег 151015 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Сіу Су Тк Ріє 5ег Зег Туг 20 25 30
Аа Іе 5ег Тр Маї Агу Сіп Айїа Рго Спу Сіп Спу Ї и Сім Тур Меї 35 40 45 сСіу Спу Пе Пе Рго Пе РНе Стпу Тнг Аа Авзп Туг Аа Сп Гуз Рпе 50 55 60
Сіп Спу Аг Маї Тниг Пе Тниг Аа Азвр Сім Бег Тнг 5ег ТНиг Аа Туг 65 70 75 80
Меї Сі І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Тут Туг Суз 85 90 95
Аа Агу Ніз Агу Агу Рне Ттр І єи Ар Туг Ттр Спу Сип Спу Тиг Гей 100 105 110 маї Тнг Маї бЗег Зег Аа 5ег ТНг Гуз Спу Рго 5ег Маї РНе Рго І єи 115120 125
Аа Рго 5ег Зег І уз Зег Тиг Зег Сіу Спу ТНг Аа Аа І еи Спу Суз 130 135 140
Ї еи Маї Гу Авр Туг Рне Рго Сім Рго Маї Тнг Ма! Зег Ттр Авп Зег 145150 155160
Сіу Аа Геи ТАг Зег Спу Ма! Ніз Тнг Ріє Рго Аїа Маї І єи Сіп 5ег 165 170 175
Зег Су І єи Туг Зег І еи бег бег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег 5ег 5ег 180 185 190
Ї ви Спу Тнг Сп Тнг Туг Пе Сув Авзп Маї Авп Ніз Гуз Рго бег Авп 195 200 205
Тпиг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сіи Рго Гуз Зег Суз Авр Гуз Ти Нів 210 215 220
Тниг Суз Рго Рго Суз Рго Аїа Рго Сім І еи І еи СПу Спу Рго Зег Маї 225230 235 240
Рпє ГГ еи РнНе Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНг ГГ еи Меї Пе 5ег Ага ТНг 245250 255
Рго Стіи Маї Тнг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Ні5 Спи Авр Рго Сіи 260 265 270
Маї Гуз Рне Авп Тр Туг Маї Авр Сіу Маї Сім Маї Нів Авп Аа ГГ уз 275280 285
Тпиг Гуз Рго Агу Сім Спи Сп Туг Авп Зег ТАг Туг Агу Маї Ма! Зег бо 290 295 300 ма! І еи Тнг Маї І єи Ніз Сіп Авр Тр І єи Авп Су Гуз Спи Ту Гуз 305 310 315 320
Суз І уз Ма! Зег Авп І уз Аїа І єи Рго Аа Рго Пе Сім Гуз Тнг Пе 325 330 335 зЗег І уз АІа Гуз Спу Сп Рго Агу Спи Рго Сп Маї Туг ТНг І єи Рго 340 345 350
Рго Зег Агу Авр Си І єи ТАг Гуз Авп Сп Маї 5ег І єи ТАг Суз І єи 355 360 365 маї Гуз Спу РНе Туг Рго Зег Азр Іе Аа Маї Спи Тгтр Спи Зег Авп 370 375 380 сСіу Сип Рго Сім Авп Авп Туг Гуз ТНг ТАг Рго Рго Маї Г еи Авр 5ег 385 390 395 400
Азр Стпу 5ег Рпе РнНе ГГ еи Туг Бег Гуз І еи ТНиг Маї Ар Гуз 5ег Ага 405 410 415
Тер Сп Сп Спу Авп Маї Рне 5ег Суз 5ег Ма! Меї Ніз СіІим Аа І еи 420 425 430
Нів Авп Ні Туг ТАг Сп Г ув Зег І єи Зег І єи 5ег Рго Сіпу Гуз 435 440 445 «210» 44 «2115 450 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 44
Спи Маї Сп І єи Маї Сип бЗег Сіу АІа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спіу СПи 151015 зег І еи Гуз Пе 5ег Суз І уз Спу бег Спіу Туг Зег Рне Тнг Зег Туг 20 25 30
Тер Пе Сту Тр Маї Агу Сп Меї Рго Стпу Гуз СПУ Геи Спи Тгр Меї
Коо) Сіу Пе Пе Авр Рго Зег Ар 5ег Авр ТНг Агу Туг Зег Рго Зег Рпе 60
Сіп Сіу Сп Маї Тк Пе Зег Аа Авр Гуз Зег Пе Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї еи СіІп Тгтр 5ег 5ег І єи І уз АІа Зег Азр ТНг Аа Меї Туг Туг Сув 35 85 90 95
Аа Агу Маї Рне Рго Туг Туг Спу Геи Маї Геи Авр Туг Ттр Сіу Сп 100 105 110
Спу ТНгІ єи Маї Тнг Маї Зег 5ег Аа 5ег ТНг Гуз Спу Рго 5ег Маї 115120 125 40 Рпеє Рго І єи Аа Рго 5ег Зег І уз Зег Тиг Зег Сіу Спу Тнг Аа Аа 130 135 140
Ї ви Спу Суз І еи Ма! Гуз Авр Туг Ре Рго Сім Рго Маї Тиг Маї Зег 145150 155160
Тер Авп 5ег Сту Аа І єи ТАг Зег Спу Маї Ні Тиг Рне Рго Аїа Маї 45 165 170 175
Ї єи Сп бег бег Спу І єи Туг 5ег І єи бег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Рго 180 185 190 зЗег Зег ЗегІ ей Спу Тиг Сп Тиг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нів ГГ ув 195 200 205 50 Рго Зег Азп Тпг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Спи Рго Гуз Зег Суз Авр 210 215 220
Гуз Тнг Ні Тиг Суз Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сі І єи І еи Спіу Спу 225230 235 240
Рго бег Ма! Рне Геи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНг І єи Мей Пе 55 245250 255 зЗег Агу ТАг Рго Сіи Ма! Тнг Суз Маї Маї Маї Авр Маї Зег Нів Сі 260 265 270
Азр Рго Сіи Маї Гуз Рпе Авп Тр Туг Ма! Азр Сту Маї Спи Маї Нів 275280 285 (510) Авп Аа Гуз ТНг Гуз Рго Ага Сім Спи Сп Туг Авп Зег ТНг Туг Ага
290 295 300 маї Маї Зег Ма! Гей Тнг Маї І єи Ніз Сіп Ар Тгр І єи Авзп ау І ув 305 310 315 320
Сім Туг Гуз Суз Гуз Маї 5ег Авп Гуз Аа І єм Рго Айа Рго Пе Спи 325 330 335
Гуз Тниг Пе 5ег Гуз Аа Гуз Спу Сип Рго Аг Спи Рго Сп Маї Туг 340 345 350
Тиг Ге Рго Рго 5ег Ага Ар Си І еи ТНг Гуз Авп ап Маї 5ег І ви 355 360 365
Тниг Суз І еи Ма! Гуз Спу РНе Туг Рго 5ег Авр Іе Аа Маї Сіи Тгтр 370 375 380 сій Зег Авп Спу Сіп Рго Спи Авп Авп Туг Гуз ТАг Тнг Рго Рго Маї 385 390 395 400
І еи Авр 5ег Авр Спу 5ег Ре Ре Г єи Туг Зег Гуз Геи Тнг Ма! Азр 405 410 415
Гуз 5ег Агу Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Рпє 5Зег Суз Зег Ма! Меї Нів 420 425 430
Сім Аа І єм Ні Авп Ні Туг Тиг Сп Гуз Зег І єи Зег ГГ еи 5ег Рго 435 440 445 сСіу Гуз 450 2105» 45 «2115» 448 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 45
Спи Маї Сп І єи Маї Сип бЗег Сіу АІа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спіу СПи 151015 зЗег І ей Гуз Пе 5ег Суз І уз Спу бег Спу Туг Зег Рне Тнг 5ег Туг 20 25 30
Тер Пе Сту Тр Маї Ага Сп Меї Рго Стпу Гуз СПу Геи Спи Ттр Меї
СіуУ Пе Пе Тук Рго Спу Авр 5ег Авр ТНг Аго Туг Зег Рго Зег Рпе 60 35 Сіп Сіу Сп Маї Тк Пе Зег Аа Авр Гуз Зег Пе Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї еи СіІп Тгтр бег 5ег І єи І уз АІа Зег Азр ТНг Аа Меї Туг Туг Суб 85 90 95
Аа Агу Авр Туг Спу Тгтр Ні Авр РНе Авр Туг Ттр Су Сп Су ТАг 40 100 105 110
Ї еи Маї Тниг Маї Зег 5ег Аа 5ег ТНг І уз Сіу Рго 5ег Маї Рне Рго 115120 125
Ї еи Аа Рго 5ег 5ег Гуз бег ТНг Зег Спу Спіу Тнг Аїа Айа І єи Спу 130 135 140 45 Суз І єи Ма! Гуз Азр Туг РНе Рго Сіи Рго Маї Тнг Маї Зег Ттр Авп 145150 155160 зЗег Сіу Аа І еи ТАг Зег Сіу Маї Ні5 Тнг Ріє Рго Аа Маї І ви Сип 165 170 175
Зег Зег Сіу І ей Туг 5ег І ви бег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег 5ег 50 180 185 190 зег І ви Спу Тиг Сп Тиг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нів ГГ ув Рго 5ег 195 200 205
Азп Тпг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сім Рго Гуз Зег Су Авр Гуз ТНг 210 215 220 55 Ні5 Тниг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сім Геи І ви СПу Спу Рго Зег 225230 235 240
Маї Рне Геи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНг І еи Меї Пе Зег Аго 245250 255
ТАг Рго Си Маї Тиг Суз Маї Маї Ма! Азр Маї 5ег Ніз Спи Авр Рго бо 260 265 270
Сіи Ма! Гуз Рне Азп Тгр Туг Маї Азр ау Маї Спи Маї Ні Авп Аа 275280 285
Гуз Тнг Гуз Рго Ага Спи См Сп Туг Авп Зег ТАг Туг Ага Маї Маї 290 295 300 зег Ма! І єм Тниг Ма! І єи Ніз Сип Авр Тгр Геи Авп Сіу Гуз СІМ Туг 305 310 315 320
І уз Суз І уз Ма! Зег Авп І уз Аа І єм Рго Аа Рго Пе Спи Гуз ТНг 325 330 335
Пе Бег Гуз Аа Гуз СПу Сип Рго Ага Спи Рго Сп Маї Туг Тиг Гей 340 345 350
Рго Рго 5ег Агу Авр Си І єи Тпг Гуз Авп Сп Маї Зег І еи Тиг Сув 355 360 365
Ї еи Ма! Гуз Спу Ре Туг Рго Зег Авр Іе Аа Маї Спи Тгтр СІМ Зег 370 375 380
Азп Стпу Сп Рго См Авп Авп Туг Гуз Тег Тйг Рго Рго Ма! І еи Азр 385 390 395 400 зЗег Авр Сіу Зег Ре Ріє І єм Туг Зег Гуз І еи Тнг Маї Авр Гуз Бег 405 410 415
Аг9 Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Рпе Зег Суз Зег Ма! Меї Ніз Сім Аа 420 425 430
Ї еи Нів Авп Ніз Тут Тиг Сп Гув Бег ГГ еи Зег І еи Зег Рго Сіу Гув 435 440 445 «2105» 46 «2115 450 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 46
Спи Маї Сп І єи Маї Сип бЗег Сіу АІа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спіу СПи 151015 зЗег І ей Гуз Пе 5ег Суз І уз Спу бег Спу Туг Зег Рне Тнг 5ег Туг 20 25 30
Тер Пе 5ег Тгр Маї Аг Сп Меї Рго Су І уз СПУ Ї єи Спи Тур Меї
Су Пе Пе Ар Рго Стпу Авр 5ег Авр ТНг Аго Туг Зег Рго Зег Рпе 35 50 55 60
Сіп Сіу Сп Маї Тк Пе Зег Аа Авр Гуз Зег Пе Зег ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Ї еи СіІп Тгтр бег 5ег І єи І уз АІа Зег Азр ТНг Аа Меї Туг Туг Сув 85 90 95 40 Аа Аг Ніз Агу Ттр бег ТНг Зег І єи І еи І єи Авр Туг Ттр Су Сп 100 105 110
Спу ТНгІ єи Маї Тнг Маї Зег 5ег Аа 5ег ТНг Гуз Спу Рго 5ег Маї 115120 125
Рне Ро І єм Аа Рго 5ег 5ег І уз Зег Тиг Зег Сіу Спу ТНг Аа Аа 45 130 135 140
Ї ви Спу Сувз І еи Ма! Гуз Авр Туг Ре Рго Сім Рго Маї Тиг Ма! Зег 145150 155160
Тер Авп 5ег Сту Аа І єи ТАг Зег Спу Маї Ні Тиг Рне Рго Аїа Маї 165 170 175
Ї єи Сп бег бег Спу І єи Туг 5ег І єи бег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Рго 180 185 190 зЗег Зег ЗегІ ей Спу Тиг Сп Тиг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нів ГГ ув 195 200 205
Рго бег Авп ТНг І уз Маї Авр Гуз І уз Ма! Сім Рго Гуз бег Сувз Авзр 210 215 220
Гуз Тнг Ні Тиг Суз Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сі І єи І еи Спіу Спу 225230 235 240
Рго бег Ма! Рне Геи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНг І єи Мей Пе 245250 255 (510) зЗег Агу ТАг Рго Сіи Ма! Тнг Суз Маї Маї Маї Азр Маї Зег Ні Сі
260 265 270
Азр Рго Сіи Маї Гуз Рпе Авп Тр Туг Ма! Азр Сту Маї Спи Маї Нів 275280 285
Авзп Аа Гуз Тпг Гуз Рго Ага Сім Спи Сп Туг Авп бЗег ТНг Туг Ага 290 295 300 маї Маї Зег Ма! Гей Тнг Маї І єи Ніз Сіп Авр Тр І єи Авзп Су ГГ ув 305 310 315 320
Сім Туг Гуз Суз Гуз Маї 5ег Авп Гуз Аа І єм Рго Айа Рго Пе Спи 325 330 335
Гуз Тниг Пе 5ег Гуз Аа Гуз Спу Сіп Рго Агу Сім Рго Сіп Маї Туг 340 345 350
ТигГеи Рго Рго 5ег Ага Ар Си І еи ТНг Гуз Авп ап Маї 5ег І еи 355 360 365
Тниг Суз І еи Ма! Гуз Спу РНе Туг Рго 5ег Авр Іе Аа Маї Сіи Тгтр 370 375 380 сій Зег Авп Спу Сіп Рго Спи Авп Авп Туг Гуз ТНг ТАг Рго Рго Маї 385 390 395 400
І еи Авр 5ег Авр Спу 5ег Ре Ре Г єи Туг Зег Гуз Геи Тнг Ма! Азр 405 410 415
Гуз 5ег Агу Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Рпє 5Зег Суз Зег Ма! Меї Нів 420 425 430
Сім Аа І єм Ні Авп Ні Туг Тиг Сп Гуз Зег І єи Зег ГГ еи 5ег Рго 435 440 445 сСіу Гуз 450 «2105 47 «2115 449 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5
Зо «400» 47
Сп Маї Сп І єи Маї Сип бег Спу Аа Си Маї ГГ уз І ув Рго Спу Бег 151015 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Сіу Су Тк Ріє 5ег Зег Туг 20 25 30
Аа Іе 5ег Ттр Маї Аг Сп Аа Рго Спу Сип СПу Гей Спи Тгр Меї 35 40 45 сСіу Спу Пе Пе Рго Пе РНе Стпу Тнг Ага Авзп Туг Аа Сп Гуз Ріе 50 55 60
Сіп Спу Аг Маї Тк Пе Тнг Аа Азвр Сім Бег Тнг 5ег Тнг Аа Туг 65 70 75 80
Меї Сі І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Тут Туг Суз 85 90 95
Аа Агу Рго Агу Агу Авп ТНг Авп Си І єи Авр Туг Ттр Спу Сіп Спу 100 105 110
Тиг Геи Маї Тнг Ма! Зег 5ег Аіа Зег ТНг Гуз Спу Рго 5ег Ма! Рпе 115120 125
Рго І єи Айїа Рго 5ег 5ег І уз 5ег ТНг Зег Спіу Спу Тнг Аа Ага І єи 130 135 140
Спу Суз І еи Маї І уз Авр Туг Рне Рго Си Рго Маї Тнг Маї 5ег Тр 145150 155160
Азп Зег ау Аа І єи Тиг Зег Спу Маї Ні Тиг Рне Рго Аїйа Маї Гей 165 170 175
Сп бег бЗег СПУ І и Туг Зег І еи Зег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег 180 185 190 зЗег ЗегіІ еи Спу Тиг Сп ТНг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нів Гуз Рго 195 200 205 зЗег Авп ТНг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сіи Рго Гуз Зег Сувз Авр Гуз 210 215 220
ТА Ніз Тнг Суз Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сі І єи І еи Спу Спу Рго бо 225230 235 240 зЗег Ма! Рпє ГІ єи РнНе Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНиг Геи Ме! Пе Зег 245250 255
Агу Тиг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Ні Сіи Авр 260 265 270
Рго Ст Маї Гуз Рне Авзп Тр Туг Маї Авр Су Маї Си Ма! Ні Авп 275280 285
Аа Гуз Тиг Гуз Рго Ага Спи Спи Сп Туг Авп Зег ТНАг Туг Ага Маї 290 295 300 ма! Зег Ма! Геи Тнг Маї І єи Ніз Сип Авр Тр І єи Азп Су Гуз Спи 305 310 315 320
Туг Гуз Суз Гуз Ма! Зег Авп Гуз Аа ГІ еи Рго Аа Рго Пе Сім Гув 325 330 335
Ти Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Спп Рго Агу Сім Рго Сп Маї Туг ТНг 340 345 350
І еи Ро Рго 5ег Агу Сім Спи Меї Тнг Гуз Авп ап Маї 5ег І еи ТНг 355 360 365
Суз І єи Ма! Гуз Спу Рне Туг Рго 5ег Ар Іе Аа Маї Сім Тгр СПИ 370 375 380 зег Авп Сіу Сп Рго Сіи Авп Авзп Туг Гуз Тиг ТНг Рго Рго Маї І еи 385 390 395 400
Авр 5ег Авр Су бег Рпе РнНе ГГ еи Туг 5ег Гуз І єи Тнг Маї Авр І уз 405 410 415 зег Агу Ттр Сп Сп Спу Авп Маї РНе 5ег Сув 5ег Ма! Меї Нів Спи 420 425 430
Аа І еи Ні Авп Нів Тут ТНг Сп Гуз 5ег І еи 5ег І єи Зег Рго Спу 435 440 445
Гуз -2105» 48
Ко) «211» 449 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 48
Сп Маї Сп І єи Маї Сип бЗег Сіу АІа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спіу 5ег 151015 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Сіу Су Ти Ріє 5ег Зег Туг 20 25 30
Аа Іе 5ег Тр Маї Агу Сіп Айїа Рго Спу Сіп Спу Ї и Сім Тур Меї 35 40 45 сіу Спу Пе Пе Рго Пе Ре Стпу Авп Аа Авзп Туг Аа Сіп Гуз Рпе 50 55 60
Сіп Спу Аг Маї Тнг Пе Тнг Аа Авр Сім 5ег ТНг 5ег ТНиг Аа Туг 65 70 75 80
Меї Сі І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Тут Туг Суз 85 90 95
Аа Агу Ніз Маї Туг Гуз Агу Су Ма! Г еи Авп Туг Ттр Спу Сп Спу 100 105 110
Тип єи Маї Тнг Маї бЗег 5ег Аа 5ег ТНг Гуз Спу Рго бег Ма! Рне 115120 125
Рго І єи Аа Рго 5ег Зег І ув Зег ТАг Зег Сіу Спу ТНг Аа Аа І єи 130 135 140
Спу Суз І еи Маї І уз Авр Туг Рне Рго Си Рго Маї Тнг Маї 5ег Тр 145150 155160
Азп Зег ау Аа І єи Тиг Зег Спу Маї Ні Тнг Рне Рго Аїа Маї І єи 165 170 175
Сп бег бЗег СПУ І и Туг Зег І еи Зег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег 180 185 190 зЗег ЗегіІ еи Спу Тиг Сп ТНг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нів Гуз Рго 195 200 205 бо зЗег Авп ТНг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сіи Рго Гуз Зег Суз Авр Гуз
210 215 220
Тиг Ніз Тиг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сім ГГ еи І еи Спу СПу Рго 225230 235 240
Зег Ма! РНе І єи РнНе Рго Рго Гуз Рго І уз Авр ТНг І єи Меї Пе 5ег 245250 255
Агу Тиг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Ні Сіи Авр 260 265 270
Рго Сти Маї Гуз Рне Авзп Тр Туг Ма! А5р Сіу Ма! Спи Маї Ні Авп 275280 285
Аа Гуз Тиг Гуз Рго Ага Спи Спи Сп Туг Авп Зег ТНАг Туг Ага Маї 290 295 300 ма! Зег Ма! Геи Тнг Маї І єи Ніз Сип Авр Тр І єи Азп Су Гуз Спи 305 310 315 320
Туг Гуз Суз І уз Ма! Зег Азп Гуз Аа ГГ еи Рго Аа Рго Пе Спи Гув 325 330 335
Ти Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Спп Рго Агу Сім Рго Сп Маї Туг ТНг 340 345 350
І еи Ро Рго 5ег Агу Сім Спи Меї Тнг Гуз Авп ап Маї 5ег І еи ТНг 355 360 365
Суз І єи Ма! Гуз Спу Рне Туг Рго 5ег Азр Іе Аа Маї Спи Тр Сі 370 375 380 зег Авп Сіу Сп Рго Сіи Авп Авзп Туг Гуз Тиг ТНг Рго Рго Маї І еи 385 390 395 400
Авр 5ег Авр Су бег Рпе РнНе ГГ еи Туг 5ег Гуз І єи Тнг Маї Авр І уз 405 410 415 зег Агу Ттр Сп Сп Спу Авп Маї РНе 5ег Суз 5ег Ма! Меї Ні Спи 420 425 430
Аа І еи Ні Авп Нів Туг ТНг Сп Гуз 5ег І єи 5ег І ви 5ег Рго Спу 435 440 445
Зо Гуз «2105» 49 «2115 449 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 49
Сп Маї Сп І єи Маї Сип бЗег Сіу АІа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спіу 5ег 151015 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Сіу Спу Тк Ріє 5ег Зег Туг 20 25 30
Аа Іе 5ег Тр Маї Агу Сіп Айїа Рго Спу Сіп Спу Ї и Сім Тур Меї 35 40 45 сСіу Спу Пе Пе Рго Пе РНе Стпу Тнг Аа Авзп Туг Аа Сп Гуз Рпе 50 55 60
Сіп Спу Аг Маї Тк Пе Тнг Аа Азвр Сім Бег Тнг 5ег Тнг Аа Туг 65 70 75 80
Меї Сі І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Аа Аг Ні Аго Ттр Стіу бег Спу Авп Геи Авр Туг Тгр Сіу Сип Спу 100 105 110
ТА єи Маї Тнг Маї бЗег 5ег Аа 5ег ТНг Гуз Спу Рго бег Ма! Рпе 115120 125
Рго І єи Айїа Рго 5ег 5ег І уз 5ег ТНг Зег Спу Спу ТНг Аа Аа І єи 130 135 140
Спу Суз І еи Маї І уз Авр Туг Рне Рго Си Рго Маї Тнг Маї 5ег Тр 145150 155160
Азп Зег ау Аа І єи Тиг Зег Спу Маї Ні Тнг Рне Рго Аїа Маї І єи 165 170 175
Сп бег бЗег Су І и Туг Зег І еи Зег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Ро 5ег бо 180 185 190 зЗег ЗегіІ еи Спу Тиг Сп ТНг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нів Гуз Рго 195 200 205 зЗег Авп ТНг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сіи Рго Гуз Зег Суз Авр Гуз 210 215 220
ТА Ніз Тнг Суз Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сі І єи І еи Спу Спу Рго 225230 235 240 зЗег Ма! Рпє ГІ єи РнНе Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНиг Геи Ме! Пе Зег 245250 255
Агу Тиг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Ні Сіи Авр 260 265 270
Рго Ст Маї Гуз Рне Авзп Тр Туг Маї Авр Су Маї Си Ма! Ні Авп 275280 285
Аа Гуз Тиг Гуз Рго Ага Сім Спи Сп Туг Азп Зег ТНг Туг Ага Маї 290 295 300 маї Зег Ма! І єи Тнг Маї І еи Ніз Сіп Авр Тгр Геи Авп Стпу Гуз Си 305 310 315 320
Туг Гуз Суз Гуз Ма! Зег Азп Гуз Аа ГГ еи Рго Аа Рго ІПе Сім Гув 325 330 335
Ти Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Спп Рго Аг Сіи Рго Сіп Маї Туг ТНг 340 345 350
І еи Ро Рго 5ег Агу Сім Спи Меї Тнг Гуз Авп ап Маї 5ег І еи ТНг 355 360 365
Суз І єи Ма! Гуз Спу Рне Туг Рго 5ег Азр Пе Аа Ма! Спи Тер Си 370 375 380 зег Авп Сіу Сп Рго Сіи Авп Авп Туг Гуз Тиг ТНг Рго Рго Маї Гей 385 390 395 400
Авр 5ег Авр Су бег Рпе РнНе ГГ еи Туг 5ег Гуз І єи Тнг Маї Авр І уз 405 410 415 зег Агу Ттр Сп Сп Спу Авп Маї РНе 5ег Суз 5ег Ма! Меї Ні Спи
Ко) 420 425 430
Аа І еи Ні Авп Нів Тут ТНг Сп Гуз 5ег І еи 5ег І єи Зег Рго Спу 435 440 445
Гуз «210» 50 «2115 449 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 50
Сіп Маї Сип І єи Маї Сип Зег Спу АІа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спу зег 151015 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Сіу Су Тк Ріє 5ег Зег Туг 20 25 30
Аа Іе 5ег Тр Маї Агу Сіп Айїа Рго Спу Сп СпПу Її єи Спи Тер Меї 35 40 45 сСіу Спу Пе Пе Рго Пе РНе Стпу Тнг Аа Авзп Туг Аа Сп Гуз Рпе 60
Сіп Спу Аг Маї Тк Пе Тнг Аа Азвр Сім Бег Тнг 5ег Тнг Аа Туг 65 70 75 80 50 Меї Сі І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Тут Туг Суз 85 90 95
Аа Агу Ні Спіу РНеє Сіп Аго Сіу Туг ГГ еи Авр Туг Тгр Сіу Сип Спу 100 105 110
ТА єи Маї Тнг Маї бЗег 5ег Аа 5ег ТНг Гуз Спу Рго бег Ма! Рпе 55 115120 125
Рго І єи Айїа Рго 5ег 5ег І уз 5ег ТНг Зег Спіу Спу Тнг Аа Ага І єи 130 135 140
Спу Суз І еи Ма! Гуз Авр Туг Рнє Рго Сі Ро Маї Тнг Маї 5ег Тр 145150 155160 (510) Азп Зег ау Аа І єи Тиг Зег Спу Маї Ні Тнг Рне Рго Аїа Маї І єи
165 170 175
Сп бег бЗег СПУ І и Туг Зег І еи Зег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег 180 185 190 зЗег ЗегіІ еи Спу Тиг Сп ТНг Туг Пе Суз Авп Маї Авп Нів Гуз Рго 195 200 205 зЗег Авп ТНг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сіи Рго Гуз Зег Суз Авр Гуз 210 215 220
ТА Ніз Тнг Суз Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сі І єи І еи Спу Спу Рго 225230 235 240 зЗег Ма! Рпє ГІ єи РнНе Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНиг Гей Меї Пе Зег 245250 255
Агу Тиг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Ні Сіи Авр 260 265 270
Рго Ст Маї Гуз Рне Авзп Тр Туг Маї Авр Су Маї Си Ма! Ні Авп 275280 285
Аа Гуз Тиг Гуз Рго Ага Спи Спи Сп Туг Авп Зег ТНАг Туг Ага Маї 290 295 300 ма! Зег Ма! Геи Тнг Маї І єи Ніз Сип Авр Тр І єи Азп Су Гуз Спи 305 310 315 320
Туг Гуз Суз Гуз Ма! Зег Азп Гуз Аа ГГ еи Рго Аа Рго ІПе Сім Гув 325 330 335
Ти Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Спп Рго Агу Сім Рго Сп Маї Туг ТНг 340 345 350
І еи Ро Рго 5ег Агу Сім Спи Меї Тнг Гуз Авп ап Маї 5ег І ей ТНг 355 360 365
Суз І єи Ма! Гуз Спу Рне Туг Рго 5ег Азр Пе Аа Ма! Спи Тер Си 370 375 380 зег Авп Сіу Сп Рго Сіи Авп Авзп Туг Гуз Тиг ТНг Рго Рго Маї І еи 385 390 395 400
Ко) Азр Зег А5р Сіу 5ег Рпе Ре ГГ еи Туг 5ег Гуз Геи ТАг Маї Ар Гуз 405 410 415 зег Агу Ттр Сп Сп Спу Авп Маї РНе 5ег Суз 5ег Ма! Меї Ні Спи 420 425 430
Аа І еи Ні Авп Нів Тут ТНг Сп Гуз 5ег І еи 5ег І єи Зег Рго Спу 435 440 445
Гуз -2105 51 «2115 448 «2125» РВТ «213» Ното заріеп5 «4005 51
Сп Маї Сп І єи Маї Сип бЗег Сіу АІа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спіу 5ег 151015 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Сіу Су Тк Ріє 5ег Зег Туг 20 25 30
Аа Іе 5ег Тр Маї Агу Сіп Айїа Рго Спу Сіп Спу Ї и Сім Тур Меї 35 40 45 сСіу Спу Пе Пе Рго Пе Рне Сту ТНг Аа Авп Туг Аа Сіп ГГ ув Рпе 50 55 60
Сіп Спу Аг Маї Тк Пе Тнг Аа Азвр Сім Бег Тнг 5ег Тнг Аа Туг 65 70 75 80
Меї Сі І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Тут Туг Суз 85 90 95
Аа Агу Ні Ага Тр Геи Су Нів І еи Авр Туг Ттр Спу Сп СПУ ТАг 100 105 110
Ї еи Маї Тниг Маї Зег 5ег Аа 5ег ТНг І уз Сіу Рго 5ег Маї Рне Рго 115120 125
Ї еи Аа Рго 5ег 5ег Гуз бег ТНг Зег Спу Спіу Тнг Аїа Айа І єи Спу бо 130 135 140
Суз І єи Ма! Гуз Азр Туг РНе Рго Сіи Рго Маї Тнг Маї Зег Ттр Авп 145 150155160 зЗег Сіу Аа І еи ТАг Зег Сіу Маї Ні5 Тнг Ріє Рго Аа Маї І ви Сип 165 170 175
Зег Зег Сіу І ей Туг 5ег І ви бег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег 5ег 180 185 190 зег І ви Спу Тиг Сп Тиг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нізв ГІ ув Рго Зег 195 200 205
Азп Тпг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сім Рго Гуз Бег Су Авр Гуз ТНг 210 215 220
Ні5 Тниг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сім Геи І ви СПу Спу Рго Зег 225230 235 240
Маї Рне Геи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТАг І єи Меї Пе 5Зег Аг9 245250 255
Тиг Рго Си Маї Тнг Суз Маї Маї Ма! Авр Маї 5ег Ніз Спи Авр Рго 260 265 270
Сіи Ма! Гуз Рне Азп Тгр Туг Маї Азр ау Маї Спи Маї Ні Авп Аа 275280 285
Гуз Тнг Гуз Рго Ага Спи См Сп Туг Авп Зег ТАг Туг Ага Маї Ма! 290 295 300 зег Ма! І єм Тниг Ма! І єи Ніз Сип Авр Тгр Геи Авп Сту Гуз СПм Туг 305 310 315 320
І уз Суз І уз Ма! Зег Авп І уз Аа І єм Рго Аа Рго Пе Спи Гуз ТНг 325 330 335
Пе Бег Гуз Аа Гуз СПу Сип Рго Ага Спи Рго Сп Маї Туг Тиг Гей 340 345 350
Рго Рго 5Зег Агу Спи Спи Меї Тниг Гуз Авп Сп Ма! Зег І ви Тиг Сув 355 360 365
Ї еи Ма! Гуз Спу Ре Туг Рго Зег Авр Іе Аа Маї Спи Тгтр СІМ Зег 370 375 380
Азп Стпу Сп Рго См Авп Авп Туг Гуз Тег Тйг Рго Рго Ма! І еи Азр 385 390 395 400 зЗег Авр Сіу Зег РНе Ріє І єм Туг Зег І уз І еи Тнг Маї Авр Гуз Бег 405 410 415
Ага Тр Сп Сп Спу Азп Маї Рне 5ег Суз 5ег Ма! Меї Ніз Спи Аїа 420 425 430
Ї еи Нів Авп Ніз Тут Тиг Сп Гув Бег ГГ еи Зег І еи Зег Рго Сіу Гув 435 440 445 «-2105 52 «211» 449 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 52
Сп Маї Сп І єи Маї Сіп бЗег Сіу АІа Спи Маї Гуз І ув Рго Спу 5ег 151015 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Сіу Су Тк Ріє 5ег Зег Туг 20 25 30
Аа Іе 5ег Тр Маї Агу Сіп Айїа Рго Спу Сіп Спу Ї и Сім Тур Меї 35 40 45 сСіу Спу Пе Пе Рго Пе РНе Стпу Тнг Аа Авзп Туг Аа Сп Гуз Рпе 50 55 60
Сіп Спу Аг Маї Тк Пе Тнг Аа Азвр Сім Бег Тнг 5ег Тнг Айва Туг 65 70 75 80
Меї Сі І ви Зег Зег І еи Агу 5ег Сім Авр ТАг Аа Маї Туг Туг Сув 85 90 95
Аа Агу Ні Спіу Агу Авп 5ег Стпу Аго І еи Авр Туг Тгр Спу Сп Спу 100 105 110
Тиг Геи Маї Тнг Ма! Зег 5ег Аіа 5ег ТНиг Гуз Спу Рго 5ег Ма! Рне 115120 125 бо Рго І єи Аа Рго 5ег Зег І ув Зег ТАг Зег Сіу Спу ТНг Аа Аа І єи
130 135 140
Спу Суз І еи Маї І уз Авр Туг Рне Рго Си Рго Маї Тнг Маї 5ег Тр 145150 155160
Азп Зег ау Аа І єи Тиг Зег Сіпу Маї Ні Тнг Рне Рго Аїа Маї Гей 165 170 175
Сп бег бЗег СПУ І и Туг Зег І еи Зег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег 180 185 190 зЗег ЗегіІ еи Спу Тиг Сп ТНг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нів Гуз Рго 195 200 205 зЗег Авп ТНг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сіи Рго Гуз Зег Суз Авр Гуз 210 215 220
ТА Ніз Тнг Суз Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сі І єи І еи Спу Спу Рго 225230 235 240 зЗег Ма! Рпє ГІ єи РнНе Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНиг Геи Ме! Пе Зег 245250 255
Агу Тиг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Ні Сіи Авр 260 265 270
Рго Ст Маї Гуз Рне Авп Тр Туг Маї Авр Су Маї Си Маї Ніб Авп 275280 285
Аа Гуз Тиг Гуз Рго Ага Спи Спи Сп Туг Авп Зег ТНАг Туг Ага Маї 290 295 300 ма! Зег Ма! Геи Тнг Маї І єи Ніз Сип Авр Тр І єи Азп Су Гуз Спи 305 310 315 320
Туг Гуз Суз І уз Ма! Зег Авп Гуз Аа І еи Рго Аа Рго Пе Спи Гув 325 330 335
Ти Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Спп Рго Агу Сім Рго Сп Маї Туг ТНг 340 345 350
І еи Ро Рго 5ег Агу Сім Спи Меї Тнг Гуз Авп ап Маї 5ег І еи ТНг 355 360 365
Ко) Сув І єи Ма! Гуз Спу Рне Туг Рго 5ег Азр Іе Аа Ма! Спи Ттр Си 370 375 380 зег Авп Сіу Сп Рго Сіи Авп Авзп Туг Гуз Тиг ТНг Рго Рго Маї І еи 385 390 395 400
Авр 5ег Авр Су бег Рпе РнНе ГГ еи Туг 5ег Гуз І єи Тнг Маї Авр І уз 405 410 415 зег Агу Ттр Сп Сп Спу Авп Маї РНе 5ег Суз 5ег Ма! Меї Ні Спи 420 425 430
Аа І еи Ні Авп Нів Тут ТНг Сп Гуз 5ег І еи 5ег І єи Зег Рго Спу 435 440 445
Гуз «2105 53 «2115 448 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 53
Сп Маї Сій І єи Ї ви Сі Зег Сіу Спу Спу Гей Маї Сип Рго Спіу Спу 151015 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа бег Сіу Рпе Тиг Ріє 5ег Азп Туг 20 25 30
Тр Меї 5ег Тгр Маї Аго ап Аа Рго Стпу Гуз СПу Г еи Спи Тр Маї 35 40 45 зЗег Аа Пе б5ег Спу 5ег Спу Спу зег ТНг Туг Туг Аіа Азр 5ег Маї 50 55 60
Гуз Спіу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Авп з5ег І уз Азп ТНг ГГ еи Туг 65 70 75 80
Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суб 85 90 95
Аа Гуз А5р РНе Туг Тгр Авр 5ег Ріпе Авр Туг Тгтр Спу Сіп Спу ТНг бо 100 105 110
Ї еи мМаї Тнг Маї Зег Зег Аа Зег ТНг Гу Спу Рго Зег Маї Рне Рго 115120 125
Ї еи Аїа Рго 5ег Бег Гуз Бег Ти Бег Спу Спу ТНиг Аїа Аа І еи Су 130 135 140
Суз І єи Ма! Гуз Азр Туг РНе Рго Сіи Рго Маї Тнг Маї Зег Ттр Авп 145150 155160 зЗег Сіу Аа І еи ТАг Зег Сіу Маї Ні5 Тнг Ріє Рго Аа Маї І ви Сип 165 170 175
Зег Зег Сіу І ей Туг 5ег І єи Зег 5ег Маї Ма! Тиг Маї Рго 5ег 5ег 180 185 190 зег І ви Спу Тиг Сп Тиг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нізв ГІ ув Рго Зег 195 200 205
Азп Тпг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сім Рго Гуз Зег Су Авр Гуз ТНг 210 215 220
Ні5 Тниг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сім Гей І ви Спу Спу Рго Зег 225230 235 240
Маї Рне Геи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТАг І єи Меї Пе 5Зег Аг9 245250 255
ТАг Рго Си Маї Тиг Суз Маї Маї Ма! Азр Маї 5ег Ніз Спи Авр Рго 260 265 270
Сіи Ма! Гуз Рне Азп Тгр Туг Маї Азр ау Маї Спи Маї Ні Авп Аа 275280 285
Гуз Тнг Гуз Рго Ага Спи См Сп Туг Авп Зег ТАг Туг Ага Маї Ма! 290 295 300 зег Ма! І єм Тниг Ма! І єи Ніз Сип Авр Тгр Геи Авп Сіу Гуз СІМ Туг 305 310 315 320
І уз Суз І уз Ма! Зег Авп І уз Аа І єм Рго Аа Рго Пе Спи Гуз ТНг 325 330 335
Пе Бег Гуз Аа Гуз СПу Сип Рго Ага Спи Рго Сп Маї Туг Тиг Гей 340 345 350
Рго Рго 5Зег Агу Спи Спи Меї Тниг Гуз Авп Сп Ма! Зег І ви Тиг Сув 355 360 365
Ї еи Ма! Гуз Спу Ре Туг Рго Зег Авр Іе Аа Маї Спи Тгтр СІМ Зег 370 375 380
Азп сту Сп Рго См Авп Авп Тут Гуз ТНг Тйг Рго Рго Маї І єи А5р 385 390 395 400 зЗег Авр Сіу Зег РНе Ріє І єм Туг Зег І уз І еи Тнг Маї Авр Гуз Бег 405 410 415
Аг9 Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Рпе Зег Суз Зег Ма! Меї Ніз Сім Аа 420 425 430
І еи Нів Авп Ніз Тут Тиг Сп Гув Бег ГГ еи Зег І ви Зег Рго Спу Гув 435 440 445 «2105» 54 «211» 449 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 54
Сп Маї Сп І єи Маї Сип бЗег Сіу АІа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спіу 5ег 151015 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Сіу Су Тк Ріє 5ег Зег Туг 20 25 30
Аа Іе 5ег Тр Маї Агу Сіп Аа Рго Спу Сіп СПУ Ї еи Сім Тур Меї 35 40 45 сіу Спу Пе Пе Рго Пе Ре Стпу Авп Аа Авзп Туг Аа Сіп Гуз Рпе 50 55 60
Сіп Спу Аг Маї Тк Пе Тнг Аа Азвр Сім Бег Тнг 5ег Тнг Аа Туг 65 70 75 80
Меї Сі І ви Зег Зег І еи Агу 5ег Сім Авр ТАг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95 (510) Аа Агу Ніз Маї Туг Гуз Агу Су Ма! Г еи Авп Туг Ттр Спу Сп Спу
100 105 110
Тиг Геи Маї Тнг Ма! Зег 5ег Аіа Зег ТНг Гуз Спу Рго 5ег Ма! Рпе 115120 125
Рго І єи Аа Рго 5ег Зег І ув Зег ТАг Зег Сіу Спу ТНг Аа Аа І єи 130 135 140
Спу Суз І еи Маї І уз Авр Туг Рне Рго Си Рго Маї Тнг Маї 5ег Тр 145150 155160
Азп Зег ау Аа І єи Тиг Зег Спу Маї Ні Тнг Рне Рго Аїа Маї І єи 165 170 175
Сп бег бЗег СПУ І и Туг Зег І еи Зег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег 180 185 190 зЗег ЗегІ еи Спу Тиг Сп ТНг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нів Гуз Рго 195 200 205 зЗег Авп ТНг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сіи Рго Гуз Зег Суз Авр Гуз 210 215 220
Тиг Ніз ТАиг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сі І еи Гей Спу СПу Рго 225230 235 240 зЗег Ма! Рпє ГІ єи РнНе Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНг І ви Ме! Пе Зег 245250 255
Агу Тиг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Ні Сіи Авр 260 265 270
Рго Ст Маї Гуз Рне Авзп Тр Туг Маї Авр Су Маї Си Ма! Ні Авп 275280 285
Аа Гуз Тиг Гуз Рго Ага Спи Спи Сп Туг Абп Зег ТНг Туг Агу Маї 290 295 300 маї Зег Ма! І єи Тнг Маї І еи Ніз Сіп Авр Тгр Геи Авп Стпу Гуз Си 305 310 315 320
Туг Гуз Суз І уз Маї бег Авп І уз Аа І еи Рго Аа Рго Пе Спи І ув 325 330 335
Коо) Ти Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Спп Рго Агу Сім Рго Сп Маї Туг ТНг 340 345 350
І еи Ро Рго 5ег Агу Сім Спи Меї Тнг Гуз Авп ап Маї 5ег І еи ТНг 355 360 365
Суз І єи Ма! Гуз Спу Рне Туг Рго 5ег Азр Іе Аа Маї Спи Тр Сі 370 375 380 зег Авп Сіу Сп Рго Сіи Авп Авзп Туг Гуз Тиг ТНг Рго Рго Маї І еи 385 390 395 400
Авр 5ег Авр Су бег Рпе РнНе ГГ еи Туг 5ег Гуз І єи Тнг Маї Авр І уз 405 410 415 зЗег Агу Тгтр СіІп Сп Сіу Азп Маї Рне 5ег Суз 5ег Ма! Меї Ніз Спи 420 425 430
Аа І еи Ні Авп Нів Тут ТНг Сп Гуз 5ег І еи 5ег І єи Зег Рго Спу 435 440 445
Гуз «2105 55 «2115 214 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 55
Сі Пе Маї Геи Тит Сп Зег Рго Аа ТНг Гей Зег І ви Зег Рго Спу 151015
Сім Ага Аа Тпг І еи Зег Суз Агу Аїа 5ег Сп Зег Ма! Зег Зег Туг 20 25 30
Ї еи Ага Тр Туг СіІп Сп Гув Рго Слпу СіІп Айїа Рго Аго І єи Геи Іе 35 40 45
Туг Авр Аа 5ег Азп Аго Аа Тпг С1у Пе Рго Аїа Ага РНе 5ег Спу 50 55 60
Зег Сіу Зег Сіу ТНиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе бег 5ег І єи Спи Рго бо 65 70 75 80 сій Авр РНе Аїа Маї Туг Туг Суз Сип Сп Ага 5ег Авп Тгр Рго І єи 85 90 95
Тиг Ре Сатпу Сип Спу Тниг Гуз Маї Спи Пе Гуз Агу Тнг Маї Аа Аа 100 105 110
Рго Зег Маї Ре Пе Рне Рго Рго 5ег Авр Спи Сп Геи Гуз Зег СПу 115120 125
Тиг Айва 5ег Маї Маї Суз І ви І еи Авп Авп РнНе Туг Рго Агу Сім Аа 130 135 140
І уз Маї Сп Тр Гуз Маї Азр Авп Аа І єи Сіп бег Спіу Азп 5ег Сп 145150 155160
Сіи Зег Ма! Тиг Спи Стпп Авр Зег Гуз Авр Зег ТНиг Туг Зег І еи Зег 165 170 175 зЗег ТигІ єи ТигГеи Зег Гуз Аіа Авр Туг Си Гуз Нів Гуз Маї Туг 180 185 190
Аа Суз Спи Ма! Тнг Ні Сіп С1пу І еи бег Зег Рго Маї Тиг Гув Зег 195 200 205
Ре Азп Аг Спу Сіи Суз 210 «2105» 56 «2115 214 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 56
Сі Пе Маї Геи Тит Сп Зег Рго Аа ТНг Гей Зег І ви Зег Рго Спу 151015
Сім Ага Аа Тиг ГГ еи Зег Суз Агу Аїа Зег Сіп Зег Ма! Ап Авп Ре 20 25 30
Ї еи Ага Тр Туг Сп Сп Гув Рго Спу Сп Айа Рго Аго І єи Геи Пе
Коо) Туг Авр Аа 5ег Азп Аго Аа Тпг С1у Пе Рго Аїа Ага РНе 5ег Спу 60
Зег Сіу Зег Сіу ТНиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе бег 5ег І єи Спи Рго 65 70 75 80 сій Авр РНе Аїа Маї Туг Туг Суз Сп Суп Спіу РНеє Авп Аа Рго Гей 35 85 90 95
Тиг Ре Сатпу Сип Спу Тниг Гуз Маї Спи Пе Гуз Агу Тнг Маї Аїа Аа 100 105 110
Рго Зег Маї Ре Пе Рне Рго Рго 5ег Авр Спи Сп Геи Гуз Зег СПу 115120 125 40 Тиг Айва 5ег Маї Маї Суз І ви І еи Авп Авп РнНе Туг Рго Агу Сім Аа 130 135 140
І уз Маї Сп Тр Гуз Маї Азр Авп Аа І єи СіІп бег Сіу Авп 5ег Сп 145150 155160
Сіи Зег Ма! Тиг Спи Стпп Авр Зег Гуз Авр Зег ТНиг Туг Зег І еи Зег 45 165 170 175 зЗег ТигІ єи ТигГеи Зег Гуз Аіа Авр Туг Си Гуз Нів Гуз Маї Туг 180 185 190
Аа Суз Спи Ма! Тнг Ні Сіп С1пу І еи бег Зег Рго Маї Тиг Гув Зег 195 200 205 50 Ре Азп Аг Спу Сіи Суз 210 «2105 57 «2115 214 «2125» РВТ 55 «213» Ното зарієп5 «4005 57
Сі Пе Маї Геи Тит Сп Зег Рго Аа ТНг Гей Зег І ви Зег Рго Спу 151015
Сім Ага Аа Тнг ГГ еи Зег Суз Агу Аїа 5ег Сп бег Ма! А5п 5ег Рпе бо 20 25 30
Ї еи Ага Тр Туг СіІп Сп Гув Рго Слпу СіІп Айїа Рго Аго І єи Геи Іе 35 40 45
Туг Туг Аіа 5ег Азп Ага Аа Тпг Спу Пе Рго Аа Ага Рне 5ег Спу 50 55 60
Зег Сіу Зег Сіу ТНиг Азр Рне Тнг І єи Тнг Пе 5ег 5ег І еи Сім Рго 65 70 75 80 сій Авр РНе Аїа Маї Туг Туг Суз Сип Сп Туг Пе Аго Тр Рго І єи 85 90 95
Тиг Ре Сатпу Сип Спу Тниг Гуз Маї Спи Пе Гуз Агу Тнг Маї Аїа Аа 100 105 110
Рго Зег Маї Ре Пе Рне Рго Рго 5ег Авр Спи Сп Геи Гуз Зег СПу 115120 125
Тиг Айва 5ег Маї Маї Суз І ви І еи Авп Авп РнНе Туг Рго Агу Сім Аа 130 135 140
І уз Маї Сп Тр Гуз Маї Азр Авп Аа І єи СіІп бег Сіу Авп 5ег Сп 145150 155160
Сіи Зег Ма! Тиг Спи Стпп Авр Зег Гуз Авр Зег ТНиг Туг Зег І еи Зег 165 170 175 зЗег ТигІ єи ТигГеи Зег Гуз Аіа Авр Туг Си Гуз Нів Гуз Маї Туг 180 185 190
Аа Суз Спи Ма! Тнг Ні Сіп С1пу І еи бег Зег Рго Маї Тиг Гув Зег 195 200 205
Ре Азп Аг Спу Сіи Суз 210 «2105» 58 «2115 214 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 58
Ко) Азр Пе Сип Меї Тиг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа Зег Ма! Спу 151015
Азр Аг Маї Тпг Пе Тнг Суз Агу Аа бег Сп Зег Пе 5ег 5ег Туг 20 25 30
І ей Авзп Тгр Туг Сп Сп Гуз Рго Спу Гуз Аїйа Рго Гуз І еи І еи Пе 35 40 45
Туг Аа Ага 5ег Зег І єи Сп бег СпПу Маї Рго Зег Агу Рне Бег Спу 50 55 60
Зег Сіу Зег Сіу ТНиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе бЗег 5ег І єи Сп Рго 65 70 75 80 сій Авр РНе Аа Тнг Туг Туг Сув Сип Сп Зег Туг Зег ТНг Рго І єи 85 90 95
Тиг Ре Сатпу Сип Спу Тниг Гуз Маї Спи Пе Гуз Агу Тнг Маї Аїа Аа 100 105 110
Рго Зег Маї Ре Пе Рне Рго Рго 5ег Авр Спи Сп Геи Гуз Зег СПу 115120 125
Тиг Айва 5ег Маї Маї Суз І ви І еи Авп Авп РнНе Туг Рго Агу Сім Аа 130 135 140
І уз Маї Сп Тр Гуз Маї Азр Авп Аа І єи СіІп бег Сіу Авп 5ег Сп 145150 155160
Сіи Зег Ма! Тиг Спи Спп Авр Зег Гуз Авр Зег ТНиг Туг Зег І єи Зег 165 170 175 зЗег ТигІ єи ТигГеи Зег Гуз Аіа Авр Туг Си Гуз Нів Гуз Маї Туг 180 185 190
Аа Суз Спи Ма! Тнг Ні Сіп С1пу І еи бег Зег Рго Маї Тиг Гув Зег 195 200 205
Ре Азп Аг Спу Сіи Суз 210 «210» 59 «2115 136 бо «2125» РВТ
«213» Ното зарієп5 «400» 59
Сіп Ага Рго Тиг Сіу Спу Рго Сіу Сувз Спу Рго Спу Ага ГГ еи ГГ еи Ї є 151015 сСіу Тиг сту Тнг Авр Аа Аго Суз Суз Агу Маї Ні5 Тниг Тнг Ага Сувз 20 25 30
Суз Агу Азр Туг Рго Спіу Си Сшіи Суз Суз Зег Си Тр Азр Суз Меї 35 40 45
Суз Маї Сіп Рго Сіи РНе Ні Суз Спіу Авр Рго Суз Су Тиг Тиг Сув 50 55 60
Ага Нів Ні Рго Сув Рго Рго Стпу Сіп Спіу Ма! Спп бег Сп пу Гув 65 70 75 80
Ре 5ег Рпе Сіу Рнє Сіп Суз Пе Авр Суз Аа бег Сіу Тнг Рне 5ег 85 90 95 сСіу Спу Нів Спи С1пу Ні Сувз Гуз Рго Тгтр ТНиг Азр Суз ТНг Сп Рпе 100 105 110
Сіу РНе І єи Тнг Маї Ріє Рго Сіу Авп Гуз Тнг Ні Авп Аїа Маї Су 115120 125 маї Рго апу Зег Рго Рго Аіа Спи 130 135 «210» 60 «2115 216 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 60
Сіп Ага Рго Тиг Спіу Спу Рго Сіу Сувз СПу Рго Спу Ага Г еи І єи Гей 151015 сСіу Тиг сту Тнг Авр Аа Аго Суз Суз Агу Маї Ні5 Тниг Тнг Ага Сувз 20 25 30
Суз Агу Азр Туг Рго Спіу Си Сшіи Суз Суз Зег Си Ттр Азр Суз Меї
Суз Маї Сіп Рго Сіи РНе Ні Суз Спіу Авр Рго Суз Сув ТНг ТНг Суб 60
Ага Нів Ні Рго Сув Рго Рго Стпу Сіп Спіу Ма! Спп бег Сп пу Гув 35 65 70 75 80
Ре 5ег Рпе Сіу Рнє Сіп Суз Пе Авр Суз Аа бег Сіу Тнг Рне 5ег 85 90 95
Стпу Су Ніз Спи Спу Ні Суз ГГ уз Рго Тгр Тиг Азр Суз Тиг Сп Рпе 100 105 110 40 Сіу РНе І єи Тнг Маї Ріє Рго Сіу Авп Гуз Тнг Ні Авп Аїа Маї Су 115120 125 ма! Рго Су бЗег Рго Рго Аа Сі Рго І еи Слпу Тгр І єи Тнг Маї Ма! 130 135 140
Ї еи І єм Айа Маї Аа Аа Суз Маї І єм І єи І єи Тнг 5ег Аа Сіп І еи 45 145150 155160
СІУ Г єм Нів Пе Ттр Сп І єи Ага 5ег Сип Сувз Меї Тр Рго Агу Сіи 165 170 175
ТАг ап Гей Гей Гей Си Маї Рго Рго бег Тнг Сім Авр Аа Агу 5ег 180 185 190 50 Сув Сп Рне Рго Сіи Спи сти Агу Спу СпПи Ага 5ег Аа Спи Спи Гув 195 200 205
Сіу Ага І єи Стпу Авр ГГ єи Тр Маї 210 215 -2105 61 55 «2115 216 «2125» РВТ «213» Масаса їазсісціагів «400» 61
Сіп Ага Рго Тиг Сіу Спу Рго Сіу Сувз Спу Рго Спу Ага ГГ еи ГГ еи Ї є бо 151015 сСіу Тиг Су Гуз Азр Аа Агу Суз Суз Аго Маї Ні Рго Тнг Агу Сув 20 25 30
Суз Агу Азр Туг Сп бег Сім Сім Сув Су 5ег Си Ттр Азр Суз Маї 35 40 45
Суз Маї Сіп Рго Сіи РНе Ні Суз Спіу Авп Рго Суз Су Тиг Тиг Сув 50 55 60
Сп Нів Ні Рго Суз Рго бег Спіу СіІп Спу Ма! Сип Рго Сіп Спіу Гуз 65 70 75 80
Ре 5ег Рне Сіу Рнє Агу Суз Маї Азр Суз Аа І еи Спіу Тнг РНе 5ег 85 90 95
Ага Сіу Ні Авр Су Нів Суз І уз Рго Тр Тиг Азр Суз Тиг Сп Рпе 100 105 110
Сіу РНе І єи Тнг Маї Ріє Рго Сіу Авп Гуз Тнг Ні Авп Аїа Маї Су 115120 125 маї Рго сапу Зег Рго Рго Аа Спи Рго Рго Стпу Ттр І єи ТАг Пе Маї 130 135 140
Ї еи І єм Айа Маї Аа Аіа Суз Маї І єи І єи І єи Тнг бег Аа Сіп І еи 145150 155160
СІУ Г єм Нів Пе Тгр Сп ГГ еи СПу бег Сп Рго Тиг Спу Рго Агу Сі 165 170 175
ТАг ап Гей Гей Гей Си Маї Рго Рго бег Тиг Сім Авр Аа 5ег 5ег 180 185 190
Сув Сп Рпе Рго Спи Спи Спи Агу Спу Сім Агу Гей Аа Спи Спи Гув 195 200 205
Сіу Ага І єи Стпу Авр ГГ єи Тр Маї 210 215 «2105 62 «2115 241 «2125» РВТ
Коо) «213» Ното зарієп5 «4005» 62
Меї Аїа Сіп Ні Спіу Аа Меї Сіу Аа РНе Аг Аа І єи Суз СІу Ї еи 151015
Аа! ей І еи Суз Аа І єи 5ег І еи Спіу Сіп Агу Рго ТАг Спу Спу Рго 20 25 30 сСіу Суз Спу Рго Спу Ага Геи І еи Гей сту ТАг Спу Тнг Авр Аа Аг9 35 40 45
Суз Суз Агу Маї Ні5 Тиг Тнг Агу Суз Суз Ага Азвр Туг Рго Сіу Спи 50 55 60
Спи Суз Сув бег Сіи Тгтр Азр Суз Меї Суз Маї Сп Рго Спи РНе Ніб 65 70 75 80
Сувз Сіу Авр Рго Суз Суз Тиг ТНг Суз Ага Нів Ні Рго Суз Рго Рго 85 90 95
Сіу Сип Сіу Ма! Сп Бег СПп Спіу Гуз Рпе 5ег Рпе Спу РНе Сип Сув 100 105 110
Пе Азвр Суз Аа бег Сіу Тнг Рне 5ег Сіпу Сіу Ніз Спи Спу Ні Суз 115120 125
Гуз Рго Тр Тиг Авр Суз ТНиг Сп РНе Су Ріє Г еи ТАг Маї Рне Рго 130 135 140
Сіу Азп Гуз Тниг Нів Авп Аїа Маї Суз Маї Рго Спу Зег Рго Рго Аа 145150 155160
Сім Рго І еи Сіу Ттр Геи ТНг Маї Маї І єи Геи Аїйа Маї Аїа Аа Су 165 170 175
Ма Гей Гей си Тнг Зег Аа Сіп І єи Спу І ей Нів Пе Тгр Сіп І єи 180 185 190
Аг Зег Сіп Сув Меї Тр Рго Агу Сім ТНг Сп ГГ еи І єи ГГ еи Спи Маї 195 200 205
Рго Рго 5ег Тпг Спи Авр Аа Ага 5ег Суз СіІп РНе Рго Спи СПи СПИ 210 215 220 бо Агоу Стпу Сім Агу Зег Аа Спи Спи Гув Спу Агоу Гей Спу Авр Геи Тр
225230 235 240
Маї «210» 63 «2115 447 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 63
Сп Маї Сп І єи Маї Сип бЗег Сіу АІа Спи Маї Гуз Гуз Рго Спіу 5ег 151015 зЗег Ма! Гуз Маї Бег Суз Гуз Аа бег Сіу Су Тк Ріє 5ег Зег Туг 20 25 30
Аа Іе 5ег Тр Маї Агу Сіп Аа Рго Спу Сіп Спу Ї ви Сім Тур Меї 35 40 45 сСіу Спу Пе Пе Рго Пе РНе Стпу Тнг Аа Авзп Туг Аа Сп Гуз Рпе 50 55 60
Сіп Спу Аг Маї Тк Пе Тнг Аа Азвр Сім Бег Тнг 5ег Тнг Аа Туг 65 70 75 80
Меї Сі І єи Зег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Сув 85 90 95
Аа Агу Ніз Агу Агу Рне Ттр І єи Ар Туг Ттр Спу Сип Спу Тиг Гей 100 105 110 маї Тнг Маї бЗег Зег Аа 5ег ТНг Гуз Спу Рго 5ег Маї Рне Рго І еи 115120 125
Аа Рго 5ег Зег І уз Зег Тиг Зег Сіу СПУ ТНг Аа Аа І еи Сіу Сувз 130 135 140
Ї еи Маї Гу Авр Туг Рне Рго Сім Рго Маї Тнг Ма! Зег Ттр Авп Зег 145150 155160
Сіу Аа Геи Тпг Зег Спу Ма! Ні Тнг Ріє Рго Аїа Маї І єи Сіп Зег 165 170 175
Зег Су І єи Туг Зег І еи бег бег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег 5ег 5ег 180 185 190
Ї ви Спу Тнг Сп Тнг Туг Пе Сув Авзп Маї Авп Ніз Гуз Рго бег Авп 195 200 205
Тпиг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сіи Рго Гуз Зег Суз Авр Гуз Ти Нів 210 215 220
Тниг Суз Рго Рго Суз Рго Аїа Рго Сім І еи І еи СПу Спу Рго Зег Маї 225230 235 240
Рпє ГГ еи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Ар ТНг Геи Ме! Пе 5ег Ага ТНг 245250 255
Рго Сіш Маї Тнг Суз Маї Маї Маї Ар Маї 5ег Ніз Сіи Авр Рго Сіи 260 265 270 маї Гуз Рне Авп Тр Туг Маї Азр Сіу Маї Спи Маї Ні Авп Аа ГГ ув 275280 285
Тпиг Гуз Рго Агу Сім Спи Сіп Туг Азп Зег ТНг Туг Аго Маї Ма! Зег 290 295 300 ма! І еи Тнг Маї І єи Ніз Сіп Авр Тр І єи Авп Су Гуз Спи Ту Гуз 305 310 315 320
Суз І уз Ма! Зег Авп І уз Аїа І єи Рго Аа Рго Пе Спи Гув Тнк Пе 325 330 335 зЗег І уз АІа Гуз Спу Сп Рго Агу Спи Рго СіІп Маї Туг Тнг Гей Рго 340 345 350
Рго Зег Агу Спи Спи Меї Тнг Гуз Авп ап Маї Зег І еи Тнг Суз І єи 355 360 365 ма! Гуз Сіу Рне Туг Рго 5ег Авр Іе Аа Маї Спи Тгтр Си бЗег Авп 370 375 380 сСіу Сип Рго Сім Авп Авп Туг Гуз ТНг ТАг Рго Рго Маї Г еи Авр 5ег 385 390 395 400
Азр Стпу 5ег Рпе РнНе ГГ еи Туг Бег Гуз І еи ТНиг Маї Ар Гуз 5ег Ага бо 405 410 415
Тр Сп Сп Стпу Авп Маї РНе 5ег Сув Зег Ма! Меї Ні Сім Аа Гей 420 425 430
Нів Авп Ні Туг ТАг Сп Г ув Зег І єи Зег І єи 5ег Рго Сіпу Гуз 435 440 445 «2105» 64 «2115» 448 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 64
Сім Маї Сіп Г еи Геи Сі Зег Сіу Спу Спу Геи Маї Сип Рго Сіу Спу 151015 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНиг Рне Зег Авп Туг 20 25 30
Тр Меї 5ег Тгр Маї Аго ап Аа Рго Стпу Гуз СПу Г еи Спи Тр Маї 35 40 45 зЗег Аа Пе б5ег Спу 5ег Спу Спу зег ТНг Туг Туг Аіа Азр 5ег Маї 50 55 60
Гуз Спіу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Авп з5ег І уз Азп ТНг ГГ еи Туг 65 70 75 80
Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суб 85 90 95
Аа Гуз А5р РНе Туг Тгр Авр 5ег Рпе Авр Туг Тгтр Спу Сип СПу ТАг 100 105 110
Ї еи Маї Тниг Маї Зег 5ег Аа 5ег ТНг І уз Сіу Рго 5ег Маї Рне Рго 115120 125
Ї еи Аа Рго 5ег 5ег Гуз бег ТНг Зег Спу Спіу Тнг Аїа Айа І єи Спу 130 135 140
Суз І єи Ма! Гуз Азр Туг РНе Рго Сі Рго Маї Тнг Маї 5ег Тгтр Авп 145150 155160
Ко) зЗег Сіу Аа І еи ТАг Зег Сіу Маї Ні5 Тнг Ріє Рго Аа Маї І ви Сип 165 170 175
Зег Зег Сіу І ей Туг 5ег І ви бег 5ег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег 5ег 180 185 190 зег І ви Спу Тиг Сп Тиг Туг Пе Сув Авп Маї Авп Нізв ГІ ув Рго Зег 195 200 205
Азп Тпг Гуз Маї Авр Гуз Гуз Маї Сім Рго Гуз Зег Су Авр Гуз ТНг 210 215 220
Ні Тиг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сім І єи І єи Спіу Спу Рго 5ег 225230 235 240
Маї Рне Геи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТАг І єи Меї Пе 5Зег Аг9 245250 255
ТАг Рго Сі Маї Тиг Суз Маї Ма! Ма! Азр Маї 5ег Ніз Спи Авр Рго 260 265 270
Сіи Ма! Гуз Рне Азп Тгр Туг Маї Азр ау Маї Спи Маї Ні Авп Аа 275280 285
Гуз Тнг Гуз Рго Ага Спи См Сп Туг Авп Зег ТАг Туг Ага Маї Ма! 290 295 300 зег Ма! І єм Тниг Ма! І єи Ні Сип Авр Тгр Геи Авп Стпу Гуз Спи Туг 305 310 315 320
І уз Суз І уз Ма! Зег Авп І уз Аа І єм Рго Аа Рго Пе Спи Гуз ТНг 325 330 335
Пе Бег Гуз Аа Гуз СПу Сип Рго Ага Спи Рго Сп Маї Туг Тиг Гей 340 345 350
Рго Рго 5ег Агу Спи Спи Меї Тиг Гуз Авп Сп Маї Зег І еи Тиг Сувз 355 360 365
Ї еи Ма! Гуз Спу Ре Туг Рго Зег Авр Іе Аа Маї Спи Тгтр СІМ Зег 370 375 380
Азп Стпу Сп Рго См Авп Авп Туг Гуз Тег Тйг Рго Рго Ма! І еи Азр 385 390 395 400 бо зЗег Авр Сіу Зег РНе Ріє ГІ єм Туг Зег ГГ уз І еи Тнг Маї Авр Гуз Бег
405 410 415
Аг9 Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Рпе Зег Суз Зег Ма! Меї Ніз Сім Аа 420 425 430
Ї еи Нів Авп Ніз Тут Тиг Сп Гув Бег ГГ еи Зег І еи Зег Рго Сіу Гув 435 440 445 «210» 65 «2115 199 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 65
Меї Тит еи Ні Рго 5ег Рго Пе Тнг Сувз Сім Рпе Геи РНе 5ег ТНг 151015
Аа Геи Іе Бег Рго Гуз Меї Суз Геи Зег Нів І еи Сім Авп Меї Рго 20 25 30
Ї еи Зег Нів Зег Агу Тиг Сп Спу Аа Сп Агу 5ег Зег Тр Гуз І еи 35 40 45
Тр Геи РНе Суз Зег Пе Ма! Меї І еи І еи Рпе Геи Сув бег Рпе зЗег 5О 55 60
Тер еи Пе Рне Пе Рне І єи Сіп Ї єи Спи Тне Айва Гуз Сім Рго Суб 65 70 75 80
Меї Ага Гуз Ріє ау Рго ГГ еи Рго Зег Гуз Тгтр Сп Меї Ага 5ег Зег 85 90 95
Спи Рго Рго Суз Маї Авп І уз Ма! Зег Авр Тр Гуз І еи Сім Пе І ей 100 105 110
Сіп Авп Су І єи Туг І єи Пе Туг Сіу Сп Маї Аїа Рго Авп Аа Авп 115 120 125
Туг Азп Азр Маї Аа Рго РНе Сі Маї Аг І єи Туг І ув Авп І уз Ар 130 135 140
Мей Пе Сіп Тк Г еи ТНиг Авп Гуз Зег Гуз Пе Сіп Авп Маї Спу Су
Ко) 145150 155160
Тниг Туг См Гей Нів Маї Спіу Ар ТА Пе Азр ГГ єеи Пе РНе Авп 5ег 165 170 175
Сім Нів Сіп Ма! Геи Гуз Авп Азп Тнг Туг Тгтр Су Пе Пе Геиц І еи 180 185 190
Аа Авп Рго Сіп РНе Іе 5ег 195 «210» 66 «2115 8 «2125» РАТ «213» СаПив даи5 «400» 66 зЗег Пе Пе Азп РНе Си І уз І єи

Claims (8)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділене антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які специфічно зв'язують СІТК людини, що містять: СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 27, СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5БЕО ІЮ МО: 5, ії СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26, СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 28, СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність БЗЕО ІО МО: 32, і СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 35; та де область важкого ланцюга містить ЗЕО ІО МО: 64, спарену з областю легкого ланцюга, яка містить зЕО ІЮ МО: 55.
2. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, де антитіло специфічно зв'язує СІТК людини шляхом взаємодії з (ІТК (ЗЕО ІЮ МО: 62) на амінокислотних залишках: с) 40-45; і а) 75-79. 60 3. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за п. 1 або 2, де:
а) антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язує поліпептид, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 59; р) антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент специфічно зв'язує СІТЕ людини з афінністю зв'язування щонайменше 30 нМ, як визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу; с) антитіло або антигензв'язувальний фрагмент індукує підвищення експресії люоциферази в аналізі гена МЕ-КВ люциферази; а) антитіло або антигензв'язувальний фрагмент індукує АЗКЦ /пл умйго зі значенням ЕСвхо менше ніж приблизно 67 нг/мл; е) антитіло або антигензв'язувальний фрагмент являє собою антитіло або антигензв'язувальний фрагмент людини; ТУ антигензв'язувальний фрагмент являє собою Рар-фрагмент, Рар2-фрагмент або одноланцюгове антитіло; 9) антитіло або антигензв'язувальний фрагмент є рекомбінантним; Р) антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент має ізотип Їдс1, Ідс2, ІдСЗ або Ідса; ї) антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент має ізотип Їде1; та/або Ї) антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент специфічно зв'язує ІТК людини та СІТК яванського макака.
4. Полінуклеотид, який кодує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із попередніх пунктів.
5. Вектор, який містить полінуклеотид за п. 4.
6. Клітина-хазяїн, яка містить вектор за п. 5.
7. Спосіб одержання антитіла або антигензв'язувального фрагмента, який включає: культивування клітини-хазяїна, як визначено в п. б, в умовах, що дозволяють експресію антитіла або антигензв'язувального фрагмента, і виділення молекули антитіла або антигензв'язувального фрагмента із культури.
8. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-3 для застосування у способі полегшення симптому раку або іншого стану, пов'язаного з новоутворенням, причому спосіб включає введення суб'єктові, який цього потребує, антитіла Зо або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-3 у кількості, достатній для полегшення у суб'єкта симптому раку або іншого стану, пов'язаного з новоутворенням.
9. Антитіло або його антигензв'язувальний Фрагмент за п. 8, де суб'єкт є людиною.
10. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 8 або 9, що додатково включає одне або більше з наступного: а) застосування хіміотерапії; р) застосування променевої терапії; або с) застосування одного або більше додаткових терапевтичних агентів.
11. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 10, де додатковий терапевтичний агент являє собою імуностимулюючий агент, де імуностимулюючий агент вибирають із групи, що складається з антитіла до РО-Ї1, антитіла до СТІ А-4, антитіла до СО122, антитіла до СО40, антитіла до ОХ40 і Ад-специфічної до антигену СО8 вакцини на основі пептиду ОМА.
12. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-3 і фармацевтично прийнятний носій.
13. Набір, що містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-3 ії упаковку для нього.
Четверте зчитування планшета 1 ГОБООЮДЮ ння аю ши ши ї зако ГИ нн нн : а о «Кк Боже й й шк й й Ж й її Ме . Ки ие Я АКА КК АКА Я : і ВОопВає ші /
Фіг. 1А Четверте зчитування планшета 2 вв Шнетнннннннннннннн ОДОЮЮЮ рен нн се А С АНА ' м и ОО ! БО ВОЄ Біне
Фіг. 18 Четверте зчитування планшета 3 ОВКЮЮД нення аю ш є п пен ЗК КНХ є дя тят Щи ее ши и ис и НЯ а а В я же воПяє же Фіг 1С
. Планшет 1 (з-є зчитування ТОВ снення рн : : КЕ В В Ї Е ще ЕЕЗ с її ООЗОЖ в ; З з ; и ни ши ше нн НИ ШО НН Е ях Ки Ко Кк шк шк шк А М : ВЕТАДоє іс
Фіг. 2А " : План шет Кі 13-ж зчитування : вн : І р К- - - СЯ Н Н І Кк сх З Гора ода ОХ ва Ті вд ОК : : як Ех; еВ Уч ЯК. Я й й : : сша не ше ше ши ши ши ше ше : с -ї СА ше З ИН ЗМ Кз ШИ ЗИ : І ши ши нм а м м о З З З С : : ВЕНИ жих :
Фіг. 28
Планшет З (зе зчитування) ЕСЕ с нен : Есе Ж 2 п сх ж В : : ни ши: Не не: не НИ Ше НА А НН НН : «М є Мом Я : з и ІА За ЗІ х СИ : ї код з кох ще з а НН що Ся : : м м на п В В о м в З : КОВЕВута ВІК !
Фіг. 20 шк : Планшет 4 з зчитування) ї ди Гек) є ; : В З З 5 : я НА НН А А А А А А З НН А ПМК НН В ЯКЕ ї І х З «еВ Ге У Е : Кк ше Кн НИ Кк Шк НН НН ї у «Є сш Ши ши ше Шш ШУ кох : : ке ши ши а ши шк ШИ Ши ши НН І х у х ях Й і ож СМС а я Їж ї : ки а В с о с : : ЕК ВАює Біне :
Фіг. 20 й ". : Планшет 5 г3-є зчитування) : Н Я М ї ТОВОЮЮ пн ення : | ї . ! | . щВ : : іх КЕ ГЗЗ ї їх : ЕВ СЕ се м дк ГІ ї : ж Ну ШИ : СІК С ДИ ее : Н ЗМУ ЗНИЩ щи ЩІ в : : каш ши МИ НН «її ї нин НН ! : ВАЄ ВИ :
Фіг. 2Е
Умовні позначення да веж НУ ОРОВ : СТВО ШЕ КК я і кт ен ну нене пен МЕНЕ) ВЕК ОІЯЯ Те : ТВО | Овен НЕ : ОТВОВІВЯ 00 РОБ 00000 Бе МИ Ве ек ВИ СИГНАЛІНІ МЕ-кайпа В «в ТОВ 48 З я СВБ СЕ 2 Й к ев СМС Ф ; - ЗЄПВЕ що ; Фе че Середовніще Як со М
Ж п. " " " " Ще 1082 ча 405 405 4609 403 40 Днтитіпо або ліганд, ним ОБРОБКА,
Фіг. ЗА
СИГНАЛІНГ МЕ-каппа В 14 лай | че СТМКВИВ ж ! г ви ч-- СТКВеЗ і: | й -к- СМТОЗОО І Я са 0,54 д Б «ее СМТ. 0,0 ї 1 Ч и ТО ло 109 403 402 403 10 Антитіло або піанд, ними
Фіг. 3В ВПЛИВ БЛОКУВАННЯ СТВ а У «дн як ТОВ ЕН Ж за ОМТОЗаЗО - : я ме СНТН. 28 ними яко : ; З ї зн Ма 5 Яд» зо Не яв зо нео Яве Конкурентне антитею, мг ОЕРОБКА За прутки В
Фіг. 3С вила БЛОКУВАННЯ СІК. - м ж У «бро «ДІ КЕВ щі 5 К ее СИНА ж в яко ТЕЗ їа - МК рез: я ФИТКЬ, Я ними о ПУ 4 В фено розорення рову че не о Нор Канкугентне ет Е, МБ ОБРОБКА за присутност СТВ
Фіг. 30 Аналіз повторної відповіді на СМУ о - МО00У ії КЗ та З В ЕЕ ! .
й . кв й КУ вка М . 1 ! що, я ЦЕ. ВЕ ВЕК ВЕ ХЕ ; ЕІ ШЕНННиНи ШК ВК В - із с ї в їх е Кк Б ТЕ й о о 5 БЕ з ої. ЕЕ вне ОБРОБКА
Фіг. 4АА
Акаліз повторної відповід на її ховоч 2 18004 її 0005 і 500» й ; в ! е Я н ще же ОБРОБКА
Фіг. 48 отипний контроль 2000 "ще
З І. че Жоодже ТЕ : а ЩЕ В Ж 1000- / і кон БЕ Її, к й Боб. г о й Древня я т й 2 4б во Днів піспа імплантації
Фіг. ЗА
ОТАЛІСІТВ Он і ге , о Ї г/ - ЗВ. І Ї ; ХЕ г; БОБ ню /; ж й й й ї- г // Я г «бе ра й // М й ще й о й нн й и чо ва Днів піспя імплантації
Фіг. 5 ЕеегиниЙ кер ов» щи шин й ЩЙ; Мк я я | Па ї І и ШИ Й, М чюв- й Й ї Зк Є Я Я - Е Ко КЕ УК В | їх о Я си вух и о | нок 2 ра в- я з й 5 а я Боб з Див після їх
Фіг. БА
«ан
ЗК. ї / й . я УДК зв» мл р й Я й Бай УКВ х : я 5 ; їй л М зно Е й о, -щ с Я су х р /л р й -й и я В ша а и що. рай и Дане ста вн
В. пи мини пипнннннннн зпннннннннн зинннннннних пиннннннннн зинннннннння хіннннннннн нини З 5 й 38 5 9 02: 5 Днів після їх
Фіг. ЕЕ Ов овоч та 15004 х ї КУ ї же ї с . Б 004 ще ї я Е ї й х й
Ко . Ж з ї с ї тою я те й с ши -т з дет її 8 З їж зв м В Дн алла їх
Фіг. 6 ізетипний контр» Й 7 Ії; і; , Як / в він Й, / й / / Ж Я, Ж й , "Зк ИЙ | / у: Ме Зку Ж ї Ка З зе -х и В вини ние поонан за, не паром, пола пом а 4 З 7 ав в їй М з Днів після їх
Фіг. 7А тя ЗЕННКх і / / 7, ; воло / Н п / х й С Кі Її й ї че п ЛІ Г/л, 5 зво. ра ЛИ, Е : ко зе (у ра я Ж Я КУ - і г Ка Ки | р ій ес С уй ра 8 ше ША од й, дети і 3 7 ча 17 853 В Цналпкля їх
Фіг. 7В
СТА заст НН А Її х й й ! 7 1800 гй 4 ій й їх ра ов ї й ах К Де КО о ААЛАЛААКАКЯ Ди що КЗ З мо рами си сесхсссовЩІЙ й рам шк й не Я З З же з І Є З КД Я: ВИ ЗУ Днів після їх
Фіг. 7С отипний контроль зт щ . й Ше / ФігвА /// "ій вк вд це, м щи чи я в зе ІГ. ч І, ГИ це Фіг. ЗЕ й / ї Я Й і є Мт, Е Я т й М гу й х І Б ЇХ я МК Л/ 5 вав й ГИ м й є У ш СИХ Е; 2 їх я з х р и я й о ре 5 Я ; ВА М ; й Я.
зав. ща Я р ве иа 2 й ния о р й Бан оон делкнй шо шен й ввнни кни пики зник пиннннннни звик нн пивний В. палауааллаладаалалала дала ул лллалаладаалалалАд А алАлДАНАМХ З 5 8 13 ОО ЯЯ ж 5 5 Б ких Сл: ПИ НК Дена їх Див після їх Перекнна вакцинація і ревакцинація: Переннна вакцинація і ревакциная: Тзектить а пепім схо ОК, з потім ЯОхай гу Я / : ї ІЗ й Я Й КЙ и . ЯК ; Її я КК. КУ Й /й, - ЗО / Н 8 МД; о, ї ми А і ; ; Її я Ж м В Е / Я Ж і г ї ї х Е І Ка ра й ж яЙ т Н Б. 7 й Б кю. "А, х о Я Е м у / й ї Я Ї Е а - Й як й жи Й / х я ї дв Е и я її, й В я я й ях В Ан 8 їй оно ВВІВ. Оу й Я ВВ щ-й Миття З, Ки Дія ей я и он ооо Шев Й ЕВ! мин пн и ие пн по поп ва ай В. рф у фр І: КЕ я 32 Б З щш щ ї 5 І КН І: ЗИ З Днів післня їж Днів іст Тк р шк
Фіг. 8С Фіг. 80 щ й Я Е Ж киЖКККККККККККККККККККККККККККККККЖКККККККАЖКККА ТЕ ВО. п 85 о їв 8Фо 0 м : о кож ше Док ке юпдо З КИ вою ші шен ку ий. є ті и ЕВ Я 5555 БО Бо о ДЕН БОНН ЗБОЮ Вена яко-е Я: ЗБ БЕ БО ИІя М Б БО Б Ко й обоюкжкквс нн нен нен зання пжннн с щі м ях м «5 а Ж в У Ще «а ще -е Я Зо я МК я -
Фіг. ЗА
В ер ЗМОВ МОсУКИЧеННЯ До. стек живої дпа лракаье ж : ЗК вакцкаовцівю: ККЗ В Е З викмухщія: жкя З Н ЖЖ х Й ах 5 вакомвцію: Маювио- І с ща і З я Га У ВХ овкцівкнців: меси о, й ХЕ (а ЕНН ї Ба - Е Я вакемцію: Мах ние ї З ях Е Е 8 й ее Е шЕ ті о -- кі хом ї ШК. - ж З їх МОВ ї ЗА ї м І т ЩЕ й І хе ; ОКО ВЕ ї х -- Ще же У З с: ОВК ж Ето ще ні пе ш еч Меч ши ж х нен и КК КК Кк и ЖК Те я - х ж є - х ТМЕа Ех ж з е з ж -
Фіг. 986 Бе Дт З | ! - З і : бек В В х щ Я З й й Б З Ж жк ж НН - дю ПОВ ва З З ПО - В в ЩІ КО ша - й З сннрнн | КОВО Га : ї шини щи ши її с Еш и г Й Зона «НОВ -- вн зни -к ши ня -- ЯН ме ке т ще - в. де Кк м ж ня м с; ко «ЩЕ
Фіг. З3С
Е .
й Ж чні Кя ; мо г З а ще їн о ож мес их т Ж е пак піку У риб аик у рух угпу вАККЖУА ВМ. А І УЖ Как АММХ кВ ча а В» ТУ я х ВУХА, ЕН Я нин нн нн нн т нн и и вн і; : В ВЕ ЩІ ж х : и КА її її і : З гу тї ій Кн ї Кох В КУ : ї: в ЖІ - х ї й КВ х т. її В ТІ щі : ї Ж дух ще к зд ще КУ ще пу 1: гм ше ЖІ я як ї ГОрГоЯжк осо ТОК, Моя поко КД ТОВ, : Кї СИН . 1 Хо М СОН хІ ШТОК І ДОКИ ї КЕ по Бо ЯОЛИОХ ЕН ЕТО Ії ЖОеЕ Щ ВКА К : (У Ї Ж Ко т. ТИЛ, Ем ФІ ТУ. с ї ПЕМТХ ЖІ х ПИ ї її : же Щц Го ЕІ їт Ох. 1: КДЖ т КОД ї 5: Е "Ж 3 ї ПИТИ. Ки Ї ІЖК її ї Не КК УААН її : СІЮ І їх пІЖТ КА ХОМ ЕК 1: Коти Ж рт АЖИ ї ше КВ І ши 3 ки 1: А У К Еовоне ї : в Й " БК ЗИ М в м її КЗ ЩІ КК З ч ї Ж ЗИ ц М НЯ М ст: с ОЗ КН ве ї Сет. БИ В Бе Я їх Ж ЗУ с Б: З ЖІ Б ї ої ТАТ: ВН М ХА: КН ММ: : ВО її т За ЖІ ЕЛ ї щі А ВІЙ ц Бех : КН ХК. Й ХЕ о й ЩІ М. ї Е: ї МУХА. Б БОКЯ : в: 7 Н ЖЖ ЖІ М в НЕ ЕЕ сл Ох З Фф і 9 р
ФІГ. х й - свинини Бк С 5 ге БО «а е КОТИ ОС БО З п ОО Б ре ання з ше Б фев ооооадравоонс ння сс я ме В. Фо ж Ф Ся І ка т -й М З як «ее з тре Кві п яю ві - БЕ порно: ВВ и. шовк Моя х є ж ши и ЗК: Я А Ку В ж 8 пн ш --- ж зни 5 Б І я я ВВ. дани А ННО. ; ; м М "м щи и ЗН Ст НИ з з ке й «і
Фіг. ЗЕ
Я
У о. п па ПИ ШЕ ПО ов ка ше Я Х ек ПНО З ї зе НЯ Б е зо -- ЩВОВО Мі 5 І п Дебонюю ен вх вв -НЕЩеНН нн шани В щу ще М яд Б : ж ЗВ ВИ Я Ко Ей що ши шо. Ше: МИС я а
Фіг. ЗЕ Уах, пав. Днапіжн ТВ. п: НУгрупа Ніні пісвя зиповневуй пуклини Ф вв те юю міх що во Зо з ЗОТИ ее МК мин ВО Ве СепО мегменЗві, віз
Фіг. 10А во х) аівтвяеомя Знтоктмійз нт мо в І ЗЕ зв. , зх З , / у дю. і й ! / е У НЯ 5 ! Кі лк 3 Зч и нка і Хе /х Ж ле х і / жу Е Ти ЕН й р ЕЗ ЕЗ "Я г НК заві й цю дове Тр 7 де л ин й Я З 5 ще З гі і ко, Ж як В ке щ «й п й я -т, о. ня З ще сь В Ши га Зі астжй кв т. ; прин а моде: й фіни ер мин Че ша т 5 в зом м м в п СЕ вояж ди вовка ж які дні ; гаків тар чах увхіВРЕнї чав яке Маха тваеені хз д яко. І 7 яка, ,/ є у ів я й Ж і й Х ка Х тва ; -Я Бо. І / Я 8 Я х Б я Ех Ї г А х і Х вх : 5 ри пл т х я х і да. Х зе Довж ре бик Я яка я 5 з 8 й ай Б. - Б тай (І ие рин айелитя ШИ « очна Щі я т я т й ї саьК 7 Бі і » г Ч З вв ав лох 8 Бо жозкоО а яю юо 550 а м як Зоя дж ОН дк
Фіг. 108
Надень 28 пухлина відскуная г ; й що ча ! ре ве оо - 800 й о оавці вна с задо. в зн аатВ оме Е вич Ко кіз ї - ема -: Х ж ТО йояоо-же ТЕР вне 4 х ще г: КО К ї х ще сх М ва. ЛЕМ ваше їне : А ШИ ВЕНА й гав е ок м жа 0 мевоте чне В ян Ж НН : їй ри є Я и 000 Ж жахаРоя змо 85 ШЕ ов МНН нон. ЗИ го 5 15 15 КІ 25 30 Дні - Й х наве ДЕ в ЕД Я щ з ЖЕ во | і і ке ВТВВРОМІ ща ВО ж Яд з 5 вузу 5 ї : ї З е- МК Б «0- ге Ї; к ; -- Маківріні У Е де МВ Ь. 3 жечує ї щі . шк че як жк УдювсиТе о - Е ше. ЩЕ і шов | «М ще «ан УаюрситТвВавО-і со КЕ о КВ БІВ но що Днів пішла інекуляміє вухлення
Фіг. 100 І жМетТМЕа Юре РИ со ТМ" Сов" т хв зооіех ше вояж - щі Ї 5 Зх ге СХ ех яко т 1 УЮ ях 0 ВИН ж ПИШИ жо ох Бі вом» о» ВВ У шк Ей ! МБ г Ве СН КО ЗННЕХ ж: ПО і - З Ез - Ж В с 1 зве З ря вовзнав КО ЗННЕХ т ПО км - Ше 5 Ка -- Ж й | ше 1 ш-- БЕ 55. ж - Б | -. ве З зн ЕЕ, ВО о В В. ИН поні ВОНИ ЯН НЕ ЗБКВВК. БЕ. Яхдай зелдяяьск Й сх я ДН. КВ Я Я я Ка г я «Е Я о КЗ я ще же яко ше Є я х ОД х ЗИ ВИ ні хе "о НЕ ШЕ М ,Н 8 Я - МК гоча а ві я У Після стиму пептидним антулпеном ОА ЗИМ
Фіг. 11А світа СВ я - : шо З ШЕ х ши хз ши : о Я шт т «Є : я - | Кк в М; г «б ай . я КЗ
Фіг. 118 о в - ж ; п Ох - ВЕ : ДИ ННЯ ке М Кк чЕ
Фіг. 11С Інн дктах уке" од жнеумиюве вно ні ТЕТУ ху й птн мч п оно | « мн шоб яю З ср . - й З КАМ . . рж і-у с . В яю й Й Ж я КЗ я й є а Баня К Фоояк оо Ф вн і: я Й Шк Є й й й а Ж оо я А її й гіжачя пуер! СМАЛЕНМ
Фіг. 110 ку : повоосасось кккккккк нки Кк : ПИЛИ Чех : ІПТ нн я зе Я ПИ , їм ТО шен З месео ен
І . й
Ме. ІВ ех 5 хе НІВ ІК: СК СКК сь чЕ І БНООНОМЄ БЕН ББОНОН Зеннен вененек в І ВБННОМИ Зенене Бенея еенх иНее - и Б и 5 щі і й ШЕ (З ІБ Б Б ЗЕ 0 БО Ж ді не ннннн оой к ж о т у ї се щі я ще В щу й се де че чу Ку є Ки и МИ : ВИК ко ця КИ
Фіг. 12А " ї Й г важ пп АААААКААААААА АКА ААААААААААААКАААААААААААААААААААААААААААААААНЯ МИСОК КК ва і кенлтлллтннннннннллнннниннвннннннннннннннннй сте сих ВВЕ що пе всвс» Ме фот знання свое МНН ОНННОЮ ВОНО ке, ВІ с МБ НЕ БО БОЮ ща сення ЗНИК МНН ЗНО БВ гу Я ЗБЕ ЗБЕ БОЮ Бе ОО Я -. 5 М ЩО щи ЦІ ж М хз й ДОКИ ЗОНОЮ ЗБНННХ Ох БОБ БЕН і . . її пі нн ння Дно он Ге ік дк іі і - з Б; І дк се щи м М а Мом ща я ще ооо ШЕ ; ШЕ ще як МУ я
Фіг. 128 і . і С Б ВЕУ КЕХ як Ха пе ЖВ о ши ни ши ши ши ши: : : Е І СУ ї х 3 (У Н ї Е Н Е ; Ех : Х Н (У і І Е Е ї : Я Н х і У : : Н Й : Е х СУ ї х 3 (У : ї : побили вд тт Жди ВК В сем М ту Н їх СЕКТИ ІЕЕ МОСК МО и КО Мои З ЖК Зеров окмеітнтюєсюсеннооя ен нн ОО нини ння М нин нн х ин т А КМ г Кв и ДИКУ КК шт ї ВОЕКНН ОО ММА ДК МІНА ЗЕКОМЖК я І ВОЗ НШМННИ ДЕНО ШИК. ЗОН МИ ТКА З БЕК Клея ПО М ДНО р. ; ОТТО и Щи ОБ их Ол : МО пуЙ | ї Кн нн в НН м АН с ви в К де Й
Фіг. 19С жк Фр нин ння Фо 7 петненнетненя т
В. пен ко яз
В У. о ЩІ я ЕО| о
З м. Б І Р: М - В В ке ет Ес о. жо о с ш.
ші . . щ їЗ- ОО . й. й и. їз ши ні а сш ти. й. . . І Знання мання знання змен ванна внанннння манна б тн НН в и ши нн с ши а чани я б од м ж ча Кз «ще ще ве є че «о «Ж а | и є а Є є КИ М Ин Ей виш й ШЕ я ай ї Кк Ко І
Фіг. 120 Терапія Кінцева ге ЕЕ М: Мой оооваванісоосоовві С х х Биснажання п
Фіг. 13А ча0о- ти в т 1200 Ку -- ща і ЕЗЕ о Х де ку ї г -- НОМ - 1000 іт М сен ВОДА Ж 8004 ей ИЙ «к -- ВМКТ І Я во щи Ши ще ян МахіввлТтаРО-ї Е аж. жи в -к Уахазт варом кас и й й. «В УуаюастваРО нас о я са ке сет ча Уахасії КаРо-ії кам й-5 тонн и ИЙ о то 15 зо 2 Дні
Фіг. 138
Е ! Ж і Шо - зве Ток. Без обробки й бо-- УвхИЗТЕаРом а «б : Е ' ї Е г! ! а хо ' в ї о їв 2а за «во Днів після іарозантаці Б'Я«ОМА,
Фіг. 13 :
Е а. ' | ! ЩИ і. БО 5 78. Без обробки Н во-- УакйтваРОмі ва : 5 | : : 20 : ї ЕЕ зо 7 зо й БВ. Днів піст главами 81
Фіг. 130 ЩЕ нн ОТ : і | Ї ГЕ КО 2 і з» «е я" а ке у я" сх: щх дк де Я и СЯ КЗ Як а
Фіг. 14А с й Бех т ж й 1 я ож у Ек ян ОО вн ВИЩ ва Шо ж ВО БОБ Тр ре їх з я ж Ж їв и ше М ЕЕ З Кй вій Ксй х х СЯ Ой Ж я ух ее нини с ТОЖ сн з ще к Е г - ЕС ГНН нн за УНН ЗК ф їх Хе «У М є и ше и с я яе ЗД ас а ме їк хе Кй Ма день вв пухпина відсутня пе ав че ККУ МОУ 1880 - ВкАщо опе -що ше Маха аювси ЛО го 4 г хх ї ! «а УДюВСИТЕЧАВОМ амо я КО І й ЕЗ В Ж 4 є Ж. к ШЕ ЕЕ і з А т
В . ли я за Й жк й с ; в а ос ан сянн Й ЕН 5 їа 18 28 25 Дні
Фіг. 140 зак ЯР пох Нерлв ВІКА лав о во ШИ Я ЗИ Се З що що і в р Ж жа ж УМ ГУК: вели. Ж ЗЕ ЇДИЮУ реитмекцх Я
Фіг. 15А
На динь З но пехлима ВЖК ТКА що. -е ши ЕЗ Е ВО матТНРо ую о сій МКК МЕ зда ж НИ » ЖЕ : Е жк І й г ; ; о І Я к Н ї х вав ї пк Хай |! хе фі ЕВ В 5 3 чт 3 хв Дні ща чаю нрЕ зах квар Ка Ес гій тах за
Ф Т. ШЕ є
5 в. Ї ! Гая р; Ж зві Ж аю Ж Ж Її КІ Ех і в х і я Я. Ні їй й х кі їх Є Ше . МА сві дев тя Е т АЙ ї ще й Я, 5 ще Ен с МИ РН с о НЕ о В НИ Й З З З Зх хо 5 З 5 КК тк Ко ЖЕ г Кк ча ТЕ р5 зх Дн Дні Дя
Фіг. 158 4500 ен З ще -в- ВС Е зе -ке УМА ХАСТВУВЕСЯ асо з ю ад! -ее МАХОМ ВВРОМІ
Ж С. хх ся і А З / ж з / ї ти й КЕ Ко, й о ме С пон Й як й Кв коя Вк сзсввнй форту ВТ ЕЕ ря й 5 ЕЕ 15 2 5 дні
Вів КУ : Ек ві у е ж Як З З ж З зн З З ее ву нк хв З З З Ж ї г В З З З І х й - КВ щі З ІЗ ЕЗ ; т ШІ: 5 З З Х ИН ва о рЕЖЬУ Шк: ; ї З ЗЕ ї ШЕ: З ї Х З ї кВ З З х ї х Орнкднинй З Х Х ї х в х г и 7 кЙ г ее 8 8-х - КО ях
Фіг. 17Д
ІГ. о акне що ча аситкатю і змова гнаКог ЗЕ : : Х 8 ККУ - ї з КУ З Х Е 3: я З К З Е ї ї ї ї - ва 3 зда з З Пе ї Же НУ ї Ї ї У : : ї ї Ох ї ; і : З : 1 х Н ї т рев Н : 3: : у А Н В р. : року що : Н їх. ї Н -і р. У НИ З ї ої ї УХОеМИ З ек А З КЕ о ОХ же ОВ Х ОКО зе 0 Й ЦО ККУ хо РАЮ ВК в Б и ММ В нн - ! : ї ; Зк у ї - Н : В ї йо і « ЕЕ с : т Н хі ї ЗА щ ПВ З з Її З 3 в Н Фк 3 дит х ера гу Е ї ї ї : : я : т Х ех І Е Бо : ше і ше | Сепезінка Е ло ми т. щ НК Я Е : бе 5 Е пом кеВ х р З Е ШЕ ІАЕ ЖщтІ 5 ЕЯ ОЗ ІЗ МУК І ОК. 5 хх во З: 0 МН Е Кс КОН х ОО бе вн шик НО я о об с ; їЕ 5 ї ТЕЖ Я інн й Х ше ; і : Е ! ІЗ АК КН ВУ НК хохюкжхх - їх їх в п МОН
Фіг. 178
ФІГ.
хох з ще хх р. ІЗ - щ ь ке в їе з шен: шк кров 5 8" ! рент КОН ра счай ї Н т 3 шах е ї З їх І - 54 ї ІЗ ха а вне ши а х З ; Ж ї : ак В х І ен 3 ї Н іони ання р -ж 48 ч ЖЖ З Е й ГЕ Ж ек Селезінка а ан їй Ей У З З а росою їх З ш ї ; В НЕ Се З ї З Е Ф в тк З ї Е з соя : ши: ! З Ї ; й Е-я В ї шк 5 І : І й У М я Я ШК НИ Мн нан "ин ши шини ж У у Ж ВОЮ птн нн д ЗИ уугсссесееесссссо в Кеоссссссссссссв Ге х 2 Ж А І В Енн КЕНЕ КЗ а ІЗ Ж човном ж 5 вваве х і й «З МНК нн я В ВВЕ ЇЇ неї Сепезінки В с. фоинк і ї ї : а х : ї х з. Я ї й ї ж дов їх 3 Ї жк ЗИМОЮ ї я Ї вк х Н ї в 3 Е ї : гогогоресю Е и МЕ ї 5 ї : Е овен р : . ВО Н І Р РИ ЖК ї свв з Е В : 3 : їх щ с я М щі я в Ж Я го я й ях . же ях ще -е а в дя Ка Як К: че С КИ «УК Кк ки ох
Фіг. 170
«ве ЩО --е антитво до СС завая - Вакцина як оота- Вакцина ж антитіло до СО125 ШИ шт Я 15004 й Я ; ій ШЕ Е ; їі Е жк - 30805 Б ва. у ллиниш ш ; ; й 1 о | ШК, вия Но 5 З 15 Ко В кт Дні
Фіг. 18А З905 ерлтття «фе |нтактні
- . й пута тю 7 : ей: знтитіла ДО СТИ я е ве: І за: Вакцина 5 во о: Фо -к- Вакцина ж жнтитню до С ях 5 БО: фе Ж и о: жекжк, хо Ще Е. ї Ки ще ; 28 веж ; НД НН веяе ря йо Не 6; с дей - с о «й І: Двів піспя пухлинного навантаження
Фіг. 188 Хочу яких І ши я ши ШИ ЧИ й - Її дохо ; е са ж ж ш - (З | й ши ШИ сні її ! пре фебкефекн г ЯКУ Я х Х а ІЗ й КЗ Я й і ши РЕ ШИ КАК Ше с во ай уах Ух ас152
Фіг. 19д жижах З | скккккккккККККННТтКНННННнкккккккккккКККККККкккккккккнк ЩІ : жо 2 ЖИ: г: -- ЗД й | а Мк жи : В ш Кх ро Я ї Й ї ій : ; ме ї Е де ві НЕ: В не І х ї ї З Ше ШИ ЩІ ШЛЕ до | | Бін вав НЕ НИ НН ШИ ШЕ ЖИ Кк : і; я НИК НННЕЗ УМНЕЯ Я с ; З во ІЗ Ж : х й Х х ш ї З 10 Рч шини ще щі г Її : її є ШЕ : їі Ва З ШЕУ 5 : - : ЖЕ ад жненнй З ІЗ З НЯ Е за ж З Ж З ІЗ х ЕЗ х Х ї ї Ка, деібой х 5, вЯ ї їв аСот22 Уах Увх ов зе е
Фіг. 1983
ІГ. 1 НІ З а у Ес во я І и З у де ах УКХ Я чі я Е ! з Е г З у Вк х х У ДЕК їх х щи хЯ «Е зищ З ІЗ кХ х х х
- м. шк. ; . . Іо ШЕ: ї ї ї ре ШЕ: ї ї ї ШЕ: ї ї ї В З х Я ЕЗ Х г ШЕ: ї ї ї ШІ: ІЗ ї ї Увх Удх ж аСіах
Фіг. 190 І С ЗК я ї но х ; е в вн й й ЦІ мк ший Ж зо Ше и ШЕ ; Я а Х х До ояненяня Х ря ще я З ще х ЕЗ Я ЕЗ ; ЧУ щ х х ш З 3 З З З дек інфе ж он ВВ. хх ї У с ї иа ши ше ще шк Ши, т -Е ЕІ З Х У З : ек я їні З х 3 ЕЕ: 5 ї «ї 53 ЕЕ: ДЕ: хіх х дн ДЕ: х ШЕ ж У з ЩЕ ої ши ши ши ал Кк ЕЕ: ЕЕ: ж ї ШЕ: Х х Х Х І В ї ії її ШЕ її ї що всі уах Ух Вася
Фіг. 190
ФГ. )
яка Же зевавваввавваввввваввавввввавввввавваввввваввввваввавввввавввввввввава. : жк : енкккккккннккккккккннккккКккккннкк» ве ее Сея : КЗ ДК В. ве Х х КЗ ; : Й З З й З с, х ін жа її
8 н. з й і їх З х х х : з ї У уз У х КЗ х х хх з се Р, ЩЕ ! ж З 3 З ї : З КЗ В З З о ! Еш . й : міні ай їй З І Е; х ІЗ ів Уах Увк о асімох
Фіг. 20А і ". Б Е ; х ек х інн ннм нм КК К КК КК Кк ккккккккккнккннкнкю жа ж і ке
2 . Її со З ке за Б І й ї ГАК : сн ї : Х в і ї ї ще ша
3 . | ї ї п її 00 реенрка КК Ж: я ї х ЕЗ Ж і | ї : З ї щі і | ї і З ї і | ї З Е З З З х ї ЕЗ х ї | ї : З : де Увк Чах я ас0129
Фіг. 208 ч БЕ що я же Мн мМ М ММ М М м ММ ММ ММ Мінін ММ. х й вв : г Ж вд г «к 4 50» м ше ие ; Кс хз : зр З "ех Х їх ще ' ВО няно З Е | ж ще ЩЕ ! З Ба ж . . че с шк ще ее . ши ЇЗ ШЕ ши же ВШ ж: е х З ши з НЕ: ОО Ж ї ща ЖЕ ЕсЯ З ІЗ х 3 ї ї В ЩЕ : х х х х ї Ш - зп ; х ІЗ х х З ї ї зн ЩЕ З ІЗ З ї ї ї ЩЕ ; ІЗ Х х ї ї ї Ж х у х х х х ї Ш ЖЕ : ІЗ х ї х ї КУ ЖЕ : ІЗ х ї х ї КУ х ШЗ НЕ: : З во аж е Увх ух ок ас0125
Фіг. 20С " Мав те Зитактні же
109. г «а: витинло до СОНЯ Ї хх а сш що «й Вакцвна Е що вв- І; віх що лозіажіне на чн х ме -ж- Вакцина ж антито до Се Що «о ШЕ ї ро женя З і фе. що і вену -2 | оо Е ов аж ще
В. є: доля Й Як я 0 а «а 0 СЯ Днів після пухлинного навантаження
Фіг. ЛА Ж ге 400 ке нною зе кн їь Ж С ! БУ во | ! ЕЕ ! дк інтактні Е я вв. рон. Вакцина к антитіло до СЮ ВЕ к Б О0- ЩІ щожЖ 5 ! МОСС фронт фену БО ле зе НІ. то в Р за Днів піспя пухлинного навантаження
Фіг. 218 ко Тонее інтиктні ін То антимло до СОЯ і -- ОБО ейе Антнтілю до СТА щщ т Е фо антитіло до СОМ ІЯ з антитво до ЗНОС ра х ЕЕ й к з м ! ; Золя т ш НОЯ 4 з ж | з Км ! ; , 8 вва ІК я її ра аа ПН с пень мих й рент те а 4 в 42 48 20 24 Днів вішпя імплантації ВО УА
Фіг. 22А шк 77 Виактні во че Ж анувтвюо до СО 2 З дак й НК Й й Е оо Антитіло до НТК Ж ШЕ ; уже нтідни. м КЕ ; кати ри вм що Ж ко. довж ВНТИЙНО ДО СТЗ2 ж антитізо до СТА С: ШЕ ; Зк 3 не Кл Е і жк З і з о ую 3 ЖЕ за. а жен ше: фею Ії ЩЕ ще 2750- ! Ве ШЕ Днів теля пухлинного навантаження
Фіг. 228 й ". Е й сдтітхі літі Й З з ЗЕ -к т У нн нн нн нн и нн нн и и и ШМК УХСТКУХВЕЬІКУКТКХЗУХИХУХІХАСККИВХУУЕХСТКВУКВККИВИККЕВИХ ех ОК ВЕК ОК ОК ще ВК КВ о З пе с ОКУ БО Вокжую ох ВКА о ЕВ Мет ПО ОВВКНВУЄ се ж В, дим Я """Зв н БОШ ІОН т шо
- . ММК За же Б І БК з БІ ЗБ ана а а на сСЕІЕпСЕТсЕХХЕхХУКУЮІУВОКХУХЕСсКІГпІХЛИМЕІХУХУХКУХТІКХКОСХУМІВЕУХТКХТУХхІХІВХХКИКМХІХОСХСІКХВВИХИКММХ. п В НІ о о Я ЕЕЕОКО ВВ ВВЕ ВВЕ НН а я ККУ еВ а І НН ККОКНКК ВВВКК ДК БОНН НН НН Нав аня І о ВА ВК в МЛ КОКО КК З КВ Во в ОО В ИЙ КВК КВ ВВ КК ВЕК НЕ обов БО ВАН 5 М В Я М У в кн вепевВв вв ЕЕ я ДЕК В ши Я У КЕНЕ ЕК ВЕК НН ве оНоН ОВО пев Де ДЕК КЕ ВК КУН - я
Фіг. 25 и ЗО ех є ! ОО ОН З «5 ой С хх ши СО М М п НО ОА же М СО щи А С ЗВ В ОК У ро п - М КО З КОН Ох ОВ о ОЗ ВО кН МН СХ ДЖ Ко ОО а о м і" у ООН Ко в о ща Оси ек З ОО С З КО В Б МВ Ко У ес їв ще й ї КО М ВК ще ВО З Я ЗВ нн ва. Ко КО ше ВОК
Фіг. 24
К.Ї 5 5 ше я ТтВОоВІМ Кі: Мови СИ Ж як ТВОВІНСЬвИ: 3)
- Ж. Ам ев и 5 в уч ге щи: ши ле ТВі ЕР Є 5 ве Е що т Ж р як СМТОЗО305: ж Ж у, Ж а я ситозазо т) чо х. "ж-е Х я Ж пи НИ ке Кран В ЯКЕ «о В «в ,Г я як СОМТОЖН У ЕН 0 КОЖ Б не за ЖІ м У ч се їі КЗ й ще в х 8 Х сш й ш пров ві. й я нс кт .. з шк ера. . в т в ппінінінінінінінінінінінік інінініні пінні нінінінініні: чінінінінініпінінінінініні Яні ні нінініні пінні іні нінінінііннк З зас че це хи не че ще чк вк ще ви це АБЬ нгіми АВ, нем я Я
Фіг. 25А х ДЕД устя ут ит тити ут или хх хх КУ пляжна июня юки чл наука нколяяничник Е г -й я ТОВ КЕ ГА г т з й уро г Жов Ж. ре Я як повія СБ: 7) ве 8 ; як ТКОБНН ЯК: В) є о «в 5 що «в Кай з я ОМТОЗа05:
ЩОБ. Ж - ден теру ту от Е ЕН Її Кон з ло я о ща я Я ММ ТаИ Іо Во В з Йооодння її г Ш Х о й ну що е я Гоше З КЯ ще По б м А
ВЕ. - Фромкофдхоховідювоюі о Як Не ни ши вище ИН з ня щи й я панни нн коня тонн тин що їде че: че КІ як заз заг те че че зе ІАБі, нгімя (АВ), нумп
Фіг. 258 зк ре Я тнОовННЯ ЕВ: Ж в я ак Як ТАева ск: І па ши ше ке ва | и а й чека тя т ВН Аж | Я ТОВ ськ: 2) Ба г ШЕ як ТВОВННОЬК 8) І «84 к, гл 7 днів « смтозаз (в) БВ й й яко смТозезо(2: 1) Я в й Ки « сМТОоЗаЮ й дек М сМТОЗаИ 2 шичие (Щи чи чи не ек МЕМ зниннй нинни нини нний ей. МІМ.-ЙИ Як сМтОоЗаю 15) ще 1в2 и «- тез ів: ІАВ, шщмли
Фіг. 26 ШИ бони твовім ськ ДУМ-З с : й 4 ай Що «В З СЯ СУА Ж ЕСм: 68,83 нгймл ов яко АЯЄЗ) що Ж - «нок З -к еВ. ЗХ й іЧтре в 23 ва БВіидх - У в Е я Кс Тов СЕ НЕ щі в ех як СМТОжОо ЧА Же щи «в. СМТОЗ93О (Тева) ЕЕ ЩО ЕСеейоув? нумп В й гій Влях х ТЗ, З 2 КА ж ЖИ ех» В. с в КАК Р А ААН ВАЛААНК нин в... З май :--ЗНААННКНННИ. ЗНАКАННКННИК йо й ти 399 ще Не 183 щ-к ІАВІ, мгіми
Фіг. 27 нини : ші ши е о Есе вима й КЇ ЕСееву вени В бо М Ве зввин т Еш б одехеввиа 5 в й ВО єв лм -к тВДВІНІЗЕ ВЕ ї Ж х з пМТОВОВ «ке Б Ї і я Б Я а ше / яку М ОО : ЖЕ СН й г вв; ав й 5 ! х нак ув с де З й : ще п: т ЗВЕВТ одоиввруєтввеях ех... ще Бех МАМ Не ей ення ява яви 8 щи Я ою» о не о у З Яви ВХ вро 593 зв м» о У ІА, нем ТАБ, меми
Фіг. 28А Фіг. 288
Тимин ок ізо ОІВ (д т кізотикт ія, 5 Я ЗОВ кю. кв ІЗ жа,
8. з
З... 5 809 ; як ЗБЕ е І - ж І ні ЕЗ / "ях З КИ т ї МЛН З Ї ій; Ні Ж Ми / ВЕ | й / є дій ії ї І ? и на 5 ДІ - ВОВЯ ; Е в БЕ ча и льш Е діа у І її Кі Шик З ій ь о дісфтня 8 тек Бо й за ГА- І3Я хо вом ще Фів пішли реквідевженній Днів піспа рандомізації СВК у ді Я затіку їд З. 5, ЯК ізвя ма їд 3) ОК ід р СОЯ у доз; 2 зер/лкт (р ї. 8. У ОБ я І я Е їх Бо є І їж з 15004 ЗВО « І « І ЕЗ я ,' Ї 7 ЕХ -е І й р Е Е її ї г Г- ІЗ і у еЕ М Е і ї З Зк ІЗ І й я Е І Е р Е І: зо БО К, Е ях вка / З І З в х а 5 ї Е й ши сет ж й ріку За 5 в хо 45 во Деа яко рендоац Днів пісне рандазаізації кій у до 10 кепку З рам в Бод у лозі ій жоїку З рази сома м дозі ій мкіхе Я раси пдКхо у до 2 гак З паз СК У дез ій кююкх Я рази е ЕРА: у лаз ій кклке і раз Ов я с ів ВІ щи їв, в ід пе ом х зн і е ! 155 н ві Я Її і ія в и ! в : Фе її Ні Е АК, ЕМ ! ІЗ їх і ц Ж і Ех НИМ й і ІЗ ур ЩІ Х І 7 ,' ї 5 ГЩК ! : ТИ ШИ | І ги і : Пр тлу Ко. : їх Га х уся Ні х І ЩІ І щі : Е є" (Я й Б вв Ж ев йо і х й К її хо : У І М ів ц х й й Е і х жи ї й " / 2 са ж, щі ж ІЙ я М ра и: и ню їв х. й Б М І в «- г ь. шк З с ен М т 2 в чо з - КА в я щі г «2 їв вт я БЕ Де посже раедонкаї Зініх після вяскдомізяие Дяго пікунх згоюоюдоєкіовї
Фіг. 30
UAA201809891A 2016-03-08 2017-03-08 Антитіло до gitr UA126115C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662305270P 2016-03-08 2016-03-08
US201662407106P 2016-10-12 2016-10-12
PCT/US2017/021258 WO2017156058A1 (en) 2016-03-08 2017-03-08 Gitr antibodies, methods, and uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA126115C2 true UA126115C2 (uk) 2022-08-17

Family

ID=59789819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201809891A UA126115C2 (uk) 2016-03-08 2017-03-08 Антитіло до gitr

Country Status (18)

Country Link
US (1) US10730950B2 (uk)
EP (1) EP3426297A4 (uk)
JP (1) JP6976265B2 (uk)
KR (1) KR102380150B1 (uk)
CN (1) CN109069639B (uk)
AU (1) AU2017229575A1 (uk)
BR (1) BR112018068103A2 (uk)
CA (1) CA3016894A1 (uk)
CL (1) CL2018002543A1 (uk)
IL (1) IL261521A (uk)
MA (1) MA43814A (uk)
MX (1) MX2018010851A (uk)
PH (1) PH12018501902A1 (uk)
SG (1) SG11201807596YA (uk)
TW (1) TWI742054B (uk)
UA (1) UA126115C2 (uk)
WO (1) WO2017156058A1 (uk)
ZA (1) ZA201806640B (uk)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220106398A1 (en) * 2019-02-08 2022-04-07 Igm Biosciences, Inc. Anti-gitr antigen-binding domains and uses thereof
MX2021012171A (es) 2019-04-09 2021-12-10 Abcuro Inc Anticuerpos reductores del miembro 1 de la subfamilia g de receptores similares a la lectina de linfocitos citoliticos (klrg1).
US20220356259A1 (en) * 2019-07-17 2022-11-10 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Isolated antigen-binding protein and application thereof
CN114901695A (zh) * 2020-01-02 2022-08-12 南京金斯瑞生物科技有限公司 抗gitr抗体及其用途
KR20220133944A (ko) * 2020-01-28 2022-10-05 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 인간 혈액-뇌 장벽 표적화 항체
WO2022056289A1 (en) * 2020-09-11 2022-03-17 National Jewish Health Methods and compositions for treating respiratory diseases or conditions related to innate lymphoid cells
WO2022148279A1 (zh) * 2021-01-08 2022-07-14 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 药物产品及其用途
TW202246334A (zh) * 2021-02-02 2022-12-01 美商美國禮來大藥廠 Gitr拮抗劑及其使用方法
WO2023009891A2 (en) * 2021-07-30 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods of making or using il-23r binding proteins

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU9803037D0 (en) 1988-05-27 1999-11-29 Synergen Inc Interleukin-1 inhibitors
JP3560609B2 (ja) 1992-11-13 2004-09-02 イミュネックス・コーポレーション Ｅｌｋリガンドと呼ばれる新規なサイトカイン
US5516658A (en) 1993-08-20 1996-05-14 Immunex Corporation DNA encoding cytokines that bind the cell surface receptor hek
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
EP1464706A3 (en) 1994-04-15 2004-11-03 Amgen Inc., HEK5, HEK7, HEK8, HEK11, EPH-like receptor protein tyrosine kinases
US6303769B1 (en) 1994-07-08 2001-10-16 Immunex Corporation Lerk-5 dna
US5919905A (en) 1994-10-05 1999-07-06 Immunex Corporation Cytokine designated LERK-6
US6057124A (en) 1995-01-27 2000-05-02 Amgen Inc. Nucleic acids encoding ligands for HEK4 receptors
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
TW555765B (en) 1996-07-09 2003-10-01 Amgen Inc Low molecular weight soluble tumor necrosis factor type-I and type-II proteins
US6391874B1 (en) 1996-07-13 2002-05-21 Smithkline Beecham Corporation Fused heterocyclic compounds as protein tyrosine kinase inhibitors
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
AU713473B2 (en) 1996-12-23 1999-12-02 Immunex Corporation Receptor activator of NF-kappa B, receptor is member of TNF receptor superfamily
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6521424B2 (en) 1999-06-07 2003-02-18 Immunex Corporation Recombinant expression of Tek antagonists
DE60027564T3 (de) 1999-06-07 2009-07-23 Immunex Corp., Thousand Oaks Tek-antagonisten
WO2001016344A1 (fr) 1999-08-27 2001-03-08 Transgene S.A. Fibre adenovirale modifiee et utilisations
US6727225B2 (en) 1999-12-20 2004-04-27 Immunex Corporation TWEAK receptor
CA2400040A1 (en) 2000-02-25 2001-08-30 Immunex Corporation Integrin antagonists
TR201809678T4 (tr) 2001-06-26 2018-07-23 Amgen Fremont Inc Opgl ye karşi antikorlar.
US7718776B2 (en) 2002-04-05 2010-05-18 Amgen Inc. Human anti-OPGL neutralizing antibodies as selective OPGL pathway inhibitors
WO2005012360A2 (en) 2003-07-22 2005-02-10 Crucell Holland B.V. Binding molecules against sars-coronavirus and uses thereof
JP4712724B2 (ja) * 2003-12-23 2011-06-29 クルセル ホランド ベー ヴェー ＣＤ１ａに対するヒト結合分子
DE102004037487A1 (de) 2004-07-27 2006-03-23 Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt e.V. Strahlruder und Verfahren zur Herstellung eines Strahlruders
CA2592330A1 (en) * 2005-01-19 2006-07-27 Genzyme Corporation Gitr antibodies for the diagnosis of nsclc
DK2343320T3 (da) 2005-03-25 2018-01-29 Gitr Inc Anti-gitr-antistoffer og anvendelser deraf
EA016609B1 (ru) 2005-11-28 2012-06-29 Генмаб А/С Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения
WO2007133822A1 (en) * 2006-01-19 2007-11-22 Genzyme Corporation Gitr antibodies for the treatment of cancer
AU2008334912B8 (en) * 2007-12-12 2013-10-24 Pincell Srl Remedies for Pemphigus Containing Anti Fas Ligand antibodies
WO2009085462A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor, Inc. Design and generation of human de novo pix phage display libraries via fusion to pix or pvii, vectors, antibodies and methods
KR101790802B1 (ko) * 2009-09-03 2017-10-27 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 항-ｇｉｔｒ 항체
US20150337037A1 (en) 2012-06-05 2015-11-26 Msm Protein Technologies Human monoclonal antibodies against human chemokine receptor ccr6
KR101566539B1 (ko) 2012-06-08 2015-11-05 국립암센터 신규한 Ｔｈ2 세포 전환용 에피토프 및 이의 용도
US9260527B2 (en) 2013-03-15 2016-02-16 Sdix, Llc Anti-human CXCR4 antibodies and methods of making same
AR097306A1 (es) * 2013-08-20 2016-03-02 Merck Sharp & Dohme Modulación de la inmunidad tumoral
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
WO2015095186A2 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Koch Biological Solutions, Llc Nitrogen use efficiency in plants
US20150190506A1 (en) 2013-12-17 2015-07-09 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
SG11201609721WA (en) 2014-05-28 2016-12-29 Agenus Inc Anti-gitr antibodies and methods of use thereof
WO2015187835A2 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017229575A1 (en) 2018-09-27
JP6976265B2 (ja) 2021-12-08
MA43814A (fr) 2018-11-28
MX2018010851A (es) 2019-02-07
CN109069639A (zh) 2018-12-21
TW201805305A (zh) 2018-02-16
BR112018068103A2 (pt) 2019-01-15
EP3426297A4 (en) 2019-08-14
KR20180118220A (ko) 2018-10-30
US10730950B2 (en) 2020-08-04
CL2018002543A1 (es) 2019-01-11
SG11201807596YA (en) 2018-10-30
US20170260282A1 (en) 2017-09-14
CA3016894A1 (en) 2017-09-14
EP3426297A1 (en) 2019-01-16
WO2017156058A1 (en) 2017-09-14
CN109069639B (zh) 2022-07-08
TWI742054B (zh) 2021-10-11
PH12018501902A1 (en) 2019-05-15
KR102380150B1 (ko) 2022-03-29
JP2019512230A (ja) 2019-05-16
ZA201806640B (en) 2020-07-29
IL261521A (en) 2018-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA126115C2 (uk) Антитіло до gitr
AU2021269448B2 (en) Antibodies that bind CD39 and uses thereof
US9670287B2 (en) Anti-human TROP-2 antibody having anti-tumor activity in vivo
US20160368990A1 (en) Anti b7-h3 antibody
CN104619722B (zh) 新型vista-ig构建体和vista-ig用于治疗自身免疫性、过敏性和炎性疾病的用途
US8603466B2 (en) Agonist antibodies against TSHR
RU2520088C2 (ru) Антитела к ох-2/сd200 и их применение
UA125382C2 (uk) Антитіла проти людського vista та їх застосування
UA126802C2 (uk) Композиція, що містить антигензв’язуючий домен, який зв'язується з tigit людини
UA127515C2 (uk) Антитіло до всма, біспецифічна антигензв'язувальна молекула, що зв'язує всма і cd3, і їх використання
UA125818C2 (uk) Химерні рецептори антигенів на основі однодоменних антитіл і способи їх застосування
JP5380553B2 (ja) 放射性金属標識抗カドヘリン抗体
AU2016315873A1 (en) Humanized anti-CD40 antibodies and uses thereof
JP2015532587A (ja) Ｌｓｒ抗体およびがんの治療のためのその使用
US20230190796A1 (en) Engineered cells expressing prostate-specific membrane antigen (psma) or a modified form thereof and related methods
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
JP2016047835A (ja) カドヘリン−１７に特異的な抗体
KR102412805B1 (ko) 세포 면역 요법을 위한 조성물 및 방법
UA127731C2 (uk) Антитіло до імуноглобуліновидного транскрипту-7 (ilt7)
JP2014502955A (ja) 抗体
US11896619B2 (en) Compositions and methods for immunotherapy of NPM1c-positive cancer
UA116520C2 (uk) Антитіло проти cd38 для лікування множинної мієломи
UA99276C2 (uk) ВИДІЛЕНЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ErbB3, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ