JP2021184721A - 抗bcma抗体、bcma及びcd3に結合する二重特異性抗原結合分子、並びにそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
号の利益を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出済みの配列表を含み、当該配列表の
全体を参照により本明細書に援用するものである。当該ASCIIのコピーは、2016
年8月15日に作成され、ファイル名はPRD3383USNP_SL.txtであり、
そのサイズは87,341バイトである。
本明細書で提供される開示は、B細胞成熟抗原(BCMA)に免疫特異的に結合するモ
ノクローナル抗体、BCMA及びクラスター決定因子3(CD3)に免疫特異的に結合す
る多重特異性抗体、並びに当該抗体の産生及び使用方法に関する。
2223)としても周知であるが、分化形質細胞に優先的に発現される腫瘍壊死受容体ス
ーパーファミリーのメンバーである[Laabi et al.(1992)EMBO
J 11(11):3897〜3904;Madry et al.(1998)Int
Immunol 10(11):1693〜1702]。BCMAは、非グリコシル化
I型膜貫通タンパク質であり、B細胞の成熟、増殖、及び生存に関与する。BCMAは、
TNFスーパーファミリーの2つのリガンドの受容体であり、これらのリガンドは、BC
MAに対する高親和性リガンドであるAPRIL(増殖誘発リガンド、CD256、TN
FSF13)、及びBCMAに対する低親和性リガンドであるB細胞活性化因子BAFF
(THANK、BlyS、Bリンパ球刺激因子、TALL−1、及びzTNF4)である
。APRIL及びBAFFは、構造類似性と、重複するが異なる受容体結合特異性とを示
す。負の制御因子TACIもBAFF及びAPRILの両方に結合する。APRIL及び
BAFFのBCMA及び/又はTACIへの配位結合は、転写因子NF−κBを活性化し
、生存促進性Bcl−2ファミリーメンバー(例えば、Bcl−2、Bcl−xL、Bc
l−w、Mcl−1、A1)の発現を増加させ、アポトーシス促進因子(例えば、Bid
、Bad、Bik、Bimなど)の発現を減少させることにより、アポトーシスを阻害し
て生存を促進する。この複合作用は、B細胞の分化、増殖、生存、及び抗体産生を促進す
る(Rickert RC et al.,Immunol Rev(2011)244
(1):115〜133に概説されるように)。この発見と一致して、BCMAはまた、
多発性骨髄腫(MM)細胞などの悪性ヒトB細胞の増殖及び生存も支持する。Novak
らは、MM細胞株及び新鮮単離MM細胞が、それらの細胞表面上にBCMA及びTACI
タンパク質を発現し、それらの細胞表面上でのBAFF−Rタンパク質の発現にばらつき
があることを発見している(Novak et al.,(2004)Blood 10
3(2):689〜694)。
する。MMは、異質性疾患であり、多くは染色体転座、とりわけt(11;14)、t(
4;14)、t(8;14)、del(13)、del(17)により生じる(Drac
h et al.,(1998)Blood 92(3):802〜809;Gertz
et al.,(2005)Blood 106(8):2837〜2840;Fac
on et al.,(2001)Blood 97(6):1566〜1571)。M
M罹患患者は、骨髄浸潤、骨破壊、腎不全、免疫不全、及びがん診断の心理社会的負担の
ために、様々な疾患関連症状が現れ得る。2006年の時点で、MMの5年相対生存率は
約34%であり、MMが現在治療オプションのない治療の難しい疾患であることを浮き彫
りにした。
02066516号及び同第2010104949号で言及されている。BCMAに対す
る抗体は、例えば、Gras M−P.et al.Int Immunol.7(19
95)1093〜1106、国際公開第200124811号、及び同第2001248
12号に記載されている。
ーファミリーに属するB細胞受容体、並びにそれらのリガンドのBAFF及びAPRIL
は、がんとの闘いで治療の対象であるという事実にもかかわらず、依然としてこのような
病状の治療に使用可能な更なるオプションを有する必要がある。
トが提供される。また、提供されたBCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントをコー
ド可能な関連するポリヌクレオチド、提供された抗体及び抗原結合フラグメントを発現し
ている細胞、並びに関連するベクター、及び検出可能に標識された抗体及び抗原結合フラ
グメントも記載されている。加えて、提供された抗体及び抗原結合フラグメントを使用す
る方法が記載されている。例えば、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、B
CMA発現がんの進行、退行、又は安定性を診断若しくはモニタすること、患者ががんを
処置されるべきか否かを判定すること、又は対象がBCMA発現がんに苦しんでいるか否
かを判定することに使用でき、そのため、BCMA特異性抗がん治療剤、例えば、本明細
書に記載されたBCMA及びCD3に対する多重特異性抗体による処置に適し得る。
の多重特異性抗原結合フラグメントが更に提供される。また、提供されたBCMA×CD
3多重特異性抗体をコード可能な関連するポリヌクレオチド、提供された抗体を発現して
いる細胞、並びに関連するベクター、及び検出可能に標識された多重特異性抗体も記載さ
れている。加えて、提供された多重特異性抗体を使用する方法が記載されている。例えば
、BCMA×CD3多重特異性抗体は、BCMA発現がんの進行、退行、又は安定性を診
断若しくはモニタすること、患者ががんを処置されるべきか否かを判定すること、又は対
象がBCMA発現がんに苦しんでいるか否かを判定することに使用でき、そのため、BC
MA特異性抗がん治療剤、例えば、本明細書に記載されたBCMA×CD3多重特異性抗
体による処置に適し得る。
本明細書において、BCMAに特異的な組換え抗体及び抗原結合フラグメントが記載さ
れている。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、ヒト
BCMAに結合する。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメン
トは、ヒトBCMA及びカニクイザルBCMAに結合する。一部の実施形態では、BCM
A特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、BCMA細胞外ドメイン(ECD)からの1
つ又は2つ以上の残基を含むエピトープに結合する。このBCMA特異性抗体又は抗原結
合フラグメントは、ELISAにより測定するとき、少なくとも5.9nMのIC50で
APRIL結合を阻害し得る。
、及びCDR3を含む重鎖を含む、BCMA特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが
提供される。一部の実施形態では、表1に記載された抗体のうちいずれか1つのCDR1
、CDR2、及びCDR3を含む重鎖と、表1に記載された抗体のうちいずれか1つのC
DR1、CDR2、及びCDR3を含む軽鎖と、を含む、BCMA特異性抗体又はその抗
原結合フラグメントが提供される。
、及びIgG4に分割される。これらのアイソタイプは、Fc領域のアミノ酸配列におい
て、95%超の相同性を共有するが、ヒンジ領域のアミノ酸組成及び構造において、主な
差異を示す。Fc領域は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害(ADCC)
及び補体依存性細胞傷害(CDC)を媒介する。ADCCにおいて、抗体のFc領域は、
免疫エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー及びマクロファージの表面上のFc受
容体(FcgR)に結合する。同免疫エフェクター細胞は、標的細胞の貪食又は溶解をも
たらす。CDCにおいて、抗体は、標的細胞を、細胞表面における補体カスケードをトリ
ガーすることにより殺傷する。本明細書に記載された抗体は、IgGアイソタイプのいず
れかとの組み合わせで、可変ドメインの記載された特徴を有する抗体を含む。同IgGア
イソタイプは、Fc配列が異なるエフェクター機能をもたらすために改変されている改変
版を含む。
一部ではない。これらのFc媒介性エフェクター機能は、オフメカニズムの毒性を引き起
こすことにより、有害であるおそれがあり、安全性リスクを引き起こすおそれがある。エ
フェクター機能を改変することは、Fc領域を遺伝子操作して、FcgR又は補体因子へ
の結合性を低下させることにより達成され得る。活性化(FcgRI、FcgRIIa、
FcgRIIIa、及びFcgRIIIb)及び阻害性(FcgRIIb)FcgR又は
補体の第1のコンポーネント(C1q)へのIgGの結合性は、ヒンジ領域及びCH2ド
メイン中に位置する残基により決まる。IgG1、IgG2、及びIgG4に変異が導入
されて、Fc機能を低下又はサイレンシングさせる。本明細書に記載された抗体は、これ
らの改変を含んでもよい。
ェクター機能、(b)FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIb、FcgRIIIb
、及び/又はFcgRIIIaに対する低下した親和性、(c)FcgRIに対する低下
した親和性、(d)FcgRIIaに対する低下した親和性、(e)FcgRIIbに対
する低下した親和性、(f)FcgRIIIbに対する低下した親和性、又は(g)Fc
gRIIIaに対する低下した親和性のうち1つ又は2つ以上を有するFc領域を含む。
ば、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4のアイソタイプである。抗体がIgG
4アイソタイプを有する一部の実施形態では、抗体は、K409R、S228P、L23
4A、及びL235A置換を、そのFc領域中に含有する。本明細書に記載された抗体は
、これらの改変を含んでもよい。
のIC50でAPRIL結合を阻害することができる。
。
び抗原結合フラグメントをコード可能なポリヌクレオチド配列もまた提供される。記載さ
れたポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。同様に、本明細書で提供された
BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントを発現している細胞も提供される。また、
開示されたベクターを発現可能な細胞も記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞(例え
ば、293F細胞、CHO細胞)、昆虫細胞(例えば、Sf7細胞)、酵母細胞、植物細
胞、又は細菌細胞(例えば、E.coli)でもよい。記載された抗体はまた、ハイブリ
ドーマ細胞により生成することができる。
記載されたBCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメントを使用する方法もまた開示さ
れている。本項に記載の方法に使用するための特定の抗体としては、表1の抗体に関して
記載されたCDR一式を有するものが挙げられる。例えば、これらの抗体又は抗原結合フ
ラグメントは、BCMA受容体の相互作用を使用して阻害することにより、がんを処置す
るのに有用であり得る。すなわち、抗体が毒物に結合され、この毒物をBCMA発現がん
に標的化する。更に、これらの抗体又は抗原結合フラグメントは、生体サンプル、例えば
、血液又は血清中におけるBCMAの存在を検出するのに、生体サンプル、例えば、血液
又は血清中におけるBCMAの量を定量するのに、BCMA発現がんを診断するのに、が
んで苦しむ対象を処置する方法を決定するのに、又は対象におけるBCMA発現がんの進
行をモニタするのに、有用であり得る。一部の実施形態では、BCMA発現がんは、多発
性骨髄腫(MM)などのリンパ腫であり得る。記載された方法は、対象がBCMA発現が
んの処置、例えば、BCMA及びCD3に対する多重特異性抗体による処置を受ける前に
行われてもよい。更に、記載された方法は、対象がBCMA発現がんの処置、例えば、本
明細書に記載されたBCMA及びCD3に対する多重特異性抗体による処置を受けた後に
行われてもよい。
記載されたBCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメントのうち1つ又は2つ以上に曝す
ことを含む。
本明細書に記載されたBCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメントのうち1つ又は2つ
以上に曝すことを伴うが、この方法は、サンプル中に存在するBCMAの量を定量する工
程と、サンプル中に存在するBCMAの量を、既知の標準又は参照サンプルと比較する工
程と、対象のBCMAレベルががんに関連付けられるBCMAのレベル内に入るかどうか
を判定する工程と、を含む。
。記載された方法は、生体サンプルを、本明細書に記載されたBCMA特異性抗体又は抗
原結合フラグメントのうち1つ又は2つ以上に曝す工程と、抗体又はその抗原結合フラグ
メントに結合したサンプル中に存在するBCMAの量を定量する工程と、サンプル中に存
在するBCMAの量を、既知の標準若しくは参照サンプル、又は対象から以前に得られた
類似するサンプル中のBCMAの量のいずれか一方と比較する工程と、比較されたサンプ
ル中のBCMAの量における差異に基づいて、対象のBCMAレベルががんの進行、退行
、又は不変を示すかどうかを判定する工程と、を含む。
、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、組織会合していない循環腫瘍細胞、組織、外科手
術的に切除された腫瘍組織、生検、微小針吸引サンプル、又は組織学的調製物である。
者に既知の他の方法での使用のために標識されてもよい。例えば、本明細書に記載された
抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射線標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチ
ン、発色団標識、ECL標識、酵素、ルテニウム、111In−DOTA、111In−
ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、及びベータガラクトシダーゼ、若しくはポリヒスチジン、又は当技術分
野において既知の類似するこのような標識で標識されてもよい。
開示されたBCMA特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを含むキットが本明細書
において記載されている。記載されたキットを使用して、本明細書で提供されたBCMA
特異性抗体又は抗原結合フラグメントを使用する方法、又は当業者に既知の他の方法を行
うことができる。一部の実施形態では、記載されたキットは、本明細書に記載された抗体
又は抗原結合フラグメントと、生体サンプル中のBCMAの存在を検出する際の使用のた
めの試薬と、を含んでもよい。したがって、記載されたキットは、本明細書に記載された
抗体又はその抗原結合フラグメントのうち1つ又は2つ以上と、使用していないときに抗
体又はフラグメントを収容するための容器と、抗体又はフラグメントの使用のための取扱
説明書と、本明細書に記載されたとおり、固体支持体に固定された抗体若しくはフラグメ
ント及び/又は検出可能に標識された形態の抗体若しくはフラグメントを含んでもよい。
TCR/CD3複合体を介したBCMAを発現しているMM細胞へのTリンパ球のリダ
イレクトは、魅力的な別の方法を提示する。Tリンパ球のTCR/CD3複合体は、CD
3標識化ガンマ(γ)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ゼータ(ζ)、及びイータ(
η)の不変サブユニットを有する細胞表面で共発現されたTCRアルファ(α)/ベータ
(β)又はTCRガンマ(γ)/デルタ(δ)ヘテロ二量体のいずれかで構成される。ヒ
トCD3εは、UniProt P07766(CD3E_HUMAN)に記載されてい
る。現況技術に記載されている抗CD3ε抗体は、SP34である(Yang SJ,T
he Journal of Immunology(1986)137;1097〜1
100)。SP34は、霊長類及びヒトCD3の両方に反応する。SP34は、Phar
mingenから入手可能である。現況技術に記載されている更なる抗CD3抗体は、U
CHT−1である(国際公開第2000041474号参照)。現況技術に記載されてい
る更なる抗CD3抗体は、BC−3である(Fred Hutchinson Canc
er Research Institute;used in Phase I/II
trials of GvHD,Anasetti et al.,Transpla
ntation 54:844(1992))。SP34はCD3のε鎖だけに存在する
エピトープを認識するが(Salmeron et al.,(1991)J.Immu
nol.147:3047参照)、UCHT−1及びBC−3はε及びγ鎖の両方によっ
て与えられるエピトープを認識しており、この点でSP34はUCHT−1及びBC−3
とは異なる。抗体SP34と同じ配列を有する抗体の配列は、国際公開第2008119
565号、同第2008119566号、同第2008119567号、同第20100
37836号、同第2010037837号、及び同第2010037838号で言及さ
れている。抗体SP34の重鎖可変ドメイン(VH)と96%同じ配列は、米国特許第8
236308号(国際公開第2007042261号)で言及されている。
0号、同第2009132058号、同第2012066058号、同第2012143
498号、同第2013072406号、同第2013072415号、及び同第201
4122144号で言及されている。しかしながら、臨床への進展について述べているデ
ータは、現在のところ利用可能ではない。
A×CD3多重特異性抗体」)及びその多重特異性抗原結合フラグメントが記載されてい
る。一実施形態では、BCMAに免疫特異的に結合する組換え抗体又はその抗原結合フラ
グメントを提供する。
ニクイザルBCMAに結合する。一部の実施形態では、BCMA×CD3多重特異性抗体
又は抗原結合フラグメントのBCMA特異性アームは、ヒトBCMAの細胞外ドメインに
結合する。好ましい実施形態では、BCMA×CD3多重特異性抗体又は抗原結合フラグ
メントは、二重特異性抗体又は抗原結合フラグメントである。一部の実施形態では、a)
第1の重鎖(HC1)、b)第2の重鎖(HC2)、c)第1の軽鎖(LC1)、及びd
)第2の軽鎖(LC2)を含み、HC1とLC1とが対を成して、BCMAに免疫特異的
に結合する第1の抗原結合部位を形成し、HC2とLC2とが対を成して、CD3に免疫
特異的に結合する第2の抗原結合部位を形成する、組換えBCMA×CD3二重特異性抗
体、又はそのBCMA×CD3二重特異性結合フラグメントが提供される。別の実施形態
では、抗体又は二重特異性結合フラグメントを発現している組換え細胞が提供される。一
部の実施形態では、BCMA×CD3多重特異性抗体のBCMA結合アーム(又は「BC
MA特異性アーム」)は、本明細書に記載されたBCMA抗体から(例えば、表1で列記
されたCDR配列を有する抗体から)得られる。
CMA特異性アームは、IgG又はその誘導体である。一部の実施形態では、記載された
BCMA×CD3多重特異性抗体は、表面プラズモン共鳴により測定された場合、少なく
とも0.18nMの解離定数で、BCMAに結合可能である。一部の実施形態では、記載
されたBCMA×CD3多重特異性抗体は、アゴニストではない。一部の実施形態では、
記載されたBCMA×CD3多重特異性抗体は、10nM未満の濃度でNF−κB活性化
を変化させない。
D3特異性アーム」)は、マウスモノクローナル抗体SP34、マウスIgG3/ラムダ
アイソタイプから得られる。(K.R.Abhinandan and A.C.Mar
tin,2008.Mol.Immunol.45,3832〜3839)。一部の実施
形態では、BCMA×CD3多重特異性抗体のCD3結合アームは、表2から選択される
1つの重鎖及び1つの軽鎖を含む。
、及びIgG4に分割される。これらのアイソタイプは、Fc領域のアミノ酸配列におい
て、95%超の相同性を共有するが、ヒンジ領域のアミノ酸組成及び構造において、主な
差異を示す。Fc領域は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害(ADCC)
及び補体依存性細胞傷害(CDC)を媒介する。ADCCにおいて、抗体のFc領域は、
免疫エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー及びマクロファージの表面上のFc受
容体(FcgR)に結合する。同免疫エフェクター細胞は、標的細胞の貪食又は溶解をも
たらす。CDCにおいて、抗体は、標的細胞を、細胞表面における補体カスケードをトリ
ガーすることにより殺傷する。
一部ではない。これらのFc媒介性エフェクター機能は、オフメカニズムの毒性を引き起
こすことにより、有害であるおそれがあり、安全性リスクを引き起こすおそれがある。エ
フェクター機能を改変することは、Fc領域を遺伝子操作して、FcgR又は補体因子へ
の結合性を低下させることにより達成され得る。活性化(FcgRI、FcgRIIa、
FcgRIIIa、及びFcgRIIIb)及び阻害性(FcgRIIb)FcgR又は
補体の第1のコンポーネント(C1q)へのIgGの結合性は、ヒンジ領域及びCH2ド
メイン中に位置する残基により決まる。IgG1、IgG2、及びIgG4に変異が導入
されて、Fc機能を低下又はサイレンシングさせる。
ェクター機能、(b)FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIb、FcgRIIIb
、及び/又はFcgRIIIaに対する低下した親和性、(c)FcgRIに対する低下
した親和性、(d)FcgRIIaに対する低下した親和性、(e)FcgRIIbに対
する低下した親和性、(f)FcgRIIIbに対する低下した親和性、又は(g)Fc
gRIIIaに対する低下した親和性のうち1つ又は2つ以上を有するFc領域を含む。
体又は抗原結合フラグメントは、IgG又はその誘導体である。一部の実施形態では、多
重特異性抗体のCD3特異性アームが得られるCD3特異性抗体又は抗原結合フラグメン
トは、IgG1又はその誘導体である。一部の実施形態では、例えば、CD3結合アーム
が得られるCD3特異性IgG1抗体のFc領域は、そのFc領域中に、L234A、L
235A、及びF405L置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗体のCD3特
異性アームが得られるCD3特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、IgG4又はその
誘導体である。一部の実施形態では、例えば、CD3結合アームが得られるCD3特異性
IgG4抗体のFc領域は、そのFc領域中に、S228P、L234A、L235A、
F405L、及びR409K置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗体のCD3
特異性アームが得られるCD3特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトT細胞
及び/又は初代カニクイザルT細胞上のCD3εに結合する。一部の実施形態では、多重
特異性抗体のCD3特異性アームが得られるCD3特異性抗体又は抗原結合フラグメント
は、初代ヒトCD4+T細胞及び/又は初代カニクイザルCD4+T細胞を活性化する。
重特異性抗体をコード可能なポリヌクレオチド配列も提供される。一部の実施形態では、
BCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントのHC1、HC2、L
C1、又はLC2をコードする単離された合成ポリヌクレオチドが提供される。記載され
たポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供され、同様に、本明細書で提供されたBC
MA×CD3多重特異性抗体を発現している細胞も提供される。また、開示されたベクタ
ーを発現可能な細胞も記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞(例えば、293F細胞
、CHO細胞)、昆虫細胞(例えば、Sf7細胞)、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞
(例えば、E.coli)でもよい。記載された抗体はまた、ハイブリドーマ細胞により
生成することができる。一部の実施形態では、細胞を培養することにより、BCMA×C
D3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを生成するための方法が提供される
。
薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が更に提供される。
記載されたBCMA×CD3多重特異性抗体及びその多重特異性抗原結合フラグメント
を使用する方法もまた開示される。例えば、BCMA×CD3多重特異性抗体及びその多
重特異性抗原結合フラグメントは、それを必要とする対象における、BCMA発現がんの
処置に有用であり得る。一部の実施形態では、BCMA発現がんは、多発性骨髄腫などの
リンパ腫である。
の対象に、治療的に有効な量の記載されたBCMA×CD3多重特異性抗体又はその多重
特異性抗原結合フラグメントを投与する工程を含む。一部の実施形態では、対象は、哺乳
類、好ましくは、ヒトである。好ましい実施形態では、治療的に有効な量のBCMA×C
D3二重特異性抗体又は二重特異性抗原結合フラグメントを、それを必要とする患者に、
がんを処置するのに十分な時間投与することにより、がんを有する対象を処置するための
方法が提供される。
特異性抗体又は二重特異性抗原結合フラグメントを投与することにより、がん細胞の成長
又は増殖を阻害するための方法が更に提供される。
のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを投与することによ
り、T細胞をBCMA発現がん細胞にリダイレクトする方法も提供される。
本明細書において、開示されたBCMA×CD3多重特異性抗体を含むキットが記載さ
れている。記載されたキットを使用して、本明細書で提供されたBCMA×CD3多重特
異性抗体を使用する方法又は当業者に既知の他の方法を行うことができる。一部の実施形
態では、記載されたキットは、本明細書に記載された抗体と、BCMA発現がんを処置す
る際の使用のための試薬と、を含んでもよい。したがって、記載されたキットは、本明細
書に記載された多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントのうち1つ若し
くは2つ以上、使用していないときに抗体又はフラグメントを収容するための容器、並び
に/又は抗体若しくはフラグメントの使用のための取扱説明書、本明細書に記載されたと
おりの、固体支持体に固定された抗体若しくはフラグメント及び/若しくは検出可能に標
識された形態の抗体若しくはフラグメントを含んでもよい。
本明細書及び特許請求の範囲を通して本明細書の諸態様に関する様々な用語が使用され
る。別途記載のない限り、そのような用語には、当該技術分野におけるそれらの通常の意
味が与えられるものとする。その他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される
定義と一致する様式で解釈されるものとする。
n」及び「the」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象
を包含する。したがって、例えば、「細胞(a cell)」という言及には、2つ以上の細胞
の組み合わせ、及びこれに類するものなどを含む。
という用語は、指定された値から最大±10%の偏差を包含することを意味する。同様に
、このような偏差は、開示された方法を行うのに適している。別途記載のない限り、本明
細書及び特許請求の範囲において使用される成分、分子量、反応条件等の特性の量を表わ
す全ての数字は、「約」という用語により、全ての事例において修飾されていると理解さ
れたい。したがって、そうではないと示されない限り、下記明細書及び添付の特許請求の
範囲で説明された数値パラメータは、本発明により得られるのが求められる所望の特性に
応じて変動する場合がある近似値である。最低でも、特許請求の範囲の範囲に対して均等
論の適用を制限することを試みてはならず、各数値パラメータは、報告された有効桁の数
字を考慮し、通常の四捨五入の手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきで
ある。
中で説明された数値は、可能な限り正確に報告される。ただし、任意の数値は、各試験測
定において見出される標準偏差を必然的に生じる、一定の誤差を本質的に含有する。
れらの成分が本来存在する生物の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体及び染色体外
DNA及びRNA、並びにタンパク質から、実質的に分離され、同他の成分とは別に生成
され、又は同他の成分から離して精製されていることを意味する。このため、「単離」さ
れている核酸、ペプチド、及びタンパク質は、標準的な精製法により精製された核酸及び
タンパク質を含む。「単離された」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部で
あることができ、このような組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一
部ではない場合であっても単離されている。また、この用語は、宿主細胞中での組換え発
現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含
する。本明細書で使用されるとき、「単離された」抗体又は抗原結合フラグメントは、種
々の抗原特異性を有する他の抗体又は抗原結合フラグメントを実質的に含まない抗体又は
抗原結合フラグメントを意味することを意図している(例えば、BCMAに特異的に結合
する単離された抗体は、BCMA以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない
)。ただし、BCMAのエピトープ、アイソフォーム、又は変異体に特異的に結合する単
離された抗体は、例えば、他の種に由来する他の関連する抗原(例えば、BCMA種間ホ
モログ)に対する交差反応性を有してもよい。
呼ばれ、非修飾RNA若しくはDNA又は修飾RNA若しくはDNAでもよい、任意のポ
リリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド
」には、一本鎖及び二本鎖DNA、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるDNA、一本
鎖及び二本鎖RNA、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるRNA、DNA及び
RNAを含むハイブリッド分子(一本鎖、又はより典型的には、二本鎖、又は一本鎖及び
二本鎖の領域の混合物でもよい)が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポ
リヌクレオチド」は、RNA若しくはDNA又はRNA及びDNAの両方を含む三本鎖領
域を意味する。用語、ポリヌクレオチドには、1つ以上の修飾塩基を含有するDNA又は
RNA、及び安定性若しくは他の理由により修飾された主鎖を有するDNA又はRNAも
含む。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含
む。各種の修飾が、DNA及びRNAになされてもよい。したがって、「ポリヌクレオチ
ド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾
された形態、並びにウイルス及び細胞のDNA及びRNAの特徴を有する化学的形態を包
含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖(多くの場合、オリゴヌクレオ
チドと呼ばれる)も包含する。
然の配列バリエーションが重鎖及び軽鎖並びにこれらをコードする遺伝子中におそらく存
在するために、幾らかのレベルのバリエーションが本明細書に記載されたアミノ酸配列又
は抗体若しくは抗原結合フラグメントをコードする遺伝子内に見出されると予測されるで
あろう。ただし、固有の結合特性(例えば、特異性及び親和性)にはほとんど影響しない
か、又は影響しない。このような予測は、部分的には、遺伝暗号の縮重及び保存的アミノ
酸配列バリエーションの進化的成功による。同バリエーションは、コードされたタンパク
質の性質を認識できるほどには改変させない。したがって、核酸配列の文脈において、「
実質的に同じ」は、2つ以上の配列間での少なくとも65%の同一性を意味する。好まし
くは、この用語は、2つ以上の配列間での少なくとも70%の同一性、より好ましくは、
少なくとも75%の同一性、より好ましくは、少なくとも80%の同一性、より好ましく
は、少なくとも85%の同一性、より好ましくは、少なくとも90%の同一性、より好ま
しくは、少なくとも91%の同一性、より好ましくは、少なくとも92%の同一性、より
好ましくは、少なくとも93%の同一性、より好ましくは、少なくとも94%の同一性、
より好ましくは、少なくとも95%の同一性、より好ましくは、少なくとも96%の同一
性、より好ましくは、少なくとも97%の同一性、より好ましくは、少なくとも98%の
同一性、及びより好ましくは、少なくとも99%以上の同一性を意味する。2つの配列間
の同一性パーセントは、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、配列により共有さ
れる同一の位置の数の関数である(すなわち、相同性の割合(%)=同一位置数/位置の
総数×100)。同考慮は、2つの配列の最適なアライメントを導くのに必要である。2
つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えば、E.Meyers
and W.Miller,Comput.Appl.Biosci 4,11〜17
(1988)のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。同アルゴリズムは、ALIG
Nプログラム(バージョン2.0)に組み込まれており、PAM120重み付け残基テー
ブル、ギャップ長ペナルティ12、及びギャップペナルティ4を使用する。加えて、2つ
のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Needleman and Wunsch,
J.Mol.Biol.48,444〜453(1970)のアルゴリズムを使用して決
定されてもよい。
じ得るバリエーションの度合いは、核酸配列のバリエーションの度合いより非常に小さい
。これは、同じ縮重原理がアミノ酸配列には適用しないためである。したがって、抗体又
は抗原結合フラグメントの文脈において、「実質的に同じ」は、記載された抗体又は抗原
結合フラグメントに対して、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%
、97%、98%、又は99%の同一性を有する抗体又は抗原結合フラグメントを意味す
る。他の実施形態は、本明細書に記載された抗体及び抗原結合フラグメントと顕著な同一
性を共有しないが、1つ又は2つ以上のCDR又は結合性を付与するのに必要とされる他
の配列を組み込む、フレームワーク、スキャフォールド、又は他の非結合領域を有し、本
明細書に記載されたこのような配列に対して、90%、91%、92%、93%、94%
、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有する、BCMA特異性抗体
又は抗原結合フラグメントを含む。
を操作的に挿入可能な、レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド又はウイ
ルスのことである。
である。「細胞株」は、多くの世代の間、インビトロにおいて安定して増殖させることが
できる初代細胞のクローンである。本明細書で提供された一部の例では、細胞は、細胞を
DNAでトランスフェクションすることにより、形質転換される。
伝子産物の生合成を意味する。これらの用語は、遺伝子のRNAへの転写を包含する。ま
た、これらの用語は、RNAの1つ又は2つ以上のポリぺプチドへの翻訳を包含し、全て
の天然の転写後及び翻訳後修飾を更に包含する。抗体又はその抗原結合フラグメントの発
現又は生成は、細胞の細胞質内、又は細胞外環境、例えば、細胞培養の増殖培地内でもよ
い。
おける、何らかの成功又は成功の兆候を指し、これには、寛解、緩解、症状の減少、病状
を患者にとってより許容できるものにすること、変性又は低落速度を遅くすること、変性
による最終的な衰弱を和らげること、患者の肉体的又は精神的健康を改善すること、ある
いは生存期間の長さを延長することなどの、何らかの客観的又は主観的パラメータを含む
。治療は、客観的又は主観的なパラメータにより評価されてもよい。同パラメータには、
身体的検査、神経学的検査、又は精神医学評価の結果が挙げられる。
治療結果を達成するのに有効な量を意味する。治療的に有効な量のBCMA×CD3抗体
は、個体の病態、年齢、性別、及び体重、並びに個体における所望の応答を引き出す抗体
の能力等の要因に従って変動し得る。治療的に有効な量はまた、抗体又は抗体部分の任意
の毒性又は有害作用より、治療的に有益な作用が上回る量でもある。
A、IgE、IgM、IgD、及びIgY)を意味し、種々の単量体、多量体、及びキメ
ラ型を含む。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、及び抗体様ポリペプ
チド、例えば、キメラ抗体及びヒト化抗体が、「抗体」という用語に具体的に包含される
。
パク質性構造体である。抗原結合フラグメントは、任意の既知の手法、例えば、酵素開裂
、ペプチド合成、及び組換え手法により提供されたものを含む。一部の抗原結合フラグメ
ントは、親抗体分子の抗原結合特異性を保持しているインタクトな抗体の一部から構成さ
れる。例えば、抗原結合フラグメントは、特定の抗原に結合することが既知である抗体の
、少なくとも1つの可変領域(重鎖若しくは軽鎖の可変領域のいずれか一方)、又は1つ
若しくは2つ以上のCDRを含んでもよい。適切な抗原結合フラグメントの例には、ディ
アボディ及び一本鎖分子、並びにFab、F(ab’)2、Fc、Fabc、及びFv分
子、一本鎖(Sc)抗体、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖若しくはCDRと他
のタンパク質との間でのキメラ融合体、タンパク質スキャフォールド、重鎖単量体若しく
は二量体、軽鎖単量体若しくは二量体、1本の重鎖と1本の軽鎖とからなる二量体、VL
、VH、CL、及びCH1ドメインからなる一価フラグメント、国際公開第200705
9782号に記載された一価抗体、ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結され
た2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント、V.sub.H及びC.sub.
H1ドメインから本質的になるFdフラグメント、抗体の1つのアームのVL及びVHド
メインから本質的になるFvフラグメント、VHドメインから本質的になり、ドメイン抗
体とも呼ばれる(Holt et al、Trends Biotechnol.200
3 Nov.、21(11):484〜90)dAbフラグメント(Ward et a
l.,Nature 341,544〜546(1989))、ラクダ若しくはナノボデ
ィ(Revets et al、Expert Opin Biol Ther.200
5 Jan.、5(1):111〜24)、単離された相補性決定領域(CDR)等が挙
げられるが、これらに限定されない。全ての抗体アイソタイプが、抗原結合フラグメント
を生成するのに使用されてもよい。加えて、抗原結合フラグメントは、対象となる所与の
抗原に対する親和性を付与する方向にポリペプチドセグメントをうまく包含させ得る、非
抗体タンパク質性フレームワーク、例えば、タンパク質スキャフォールドを含んでもよい
。抗原結合フラグメントは、組換え的に生成されてもよく、又はインタクトな抗体の酵素
的若しくは化学的開裂により生成されてもよい。「抗体又はその抗原結合フラグメント」
という語句は、所与の抗原結合フラグメントが、語句内で言及された抗体の1つ又は2つ
以上のアミノ酸セグメントを包含することを意味するように使用され得る。
意味する。エピトープは、通常、分子の表面グルーピング、例えば、アミノ酸又は糖側鎖
からなり、通常、特定の三次元構造特性並びに特定の荷電特性を有する。構造的及び非構
造的エピトープは、後者ではなく前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で損失するとい
う点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基と、結合に直接関与
しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に抗原に結合するペプチドにより効果的にブロ
ックされるか、又は覆われるアミノ酸残基(すなわち、アミノ酸残基が、特異的に抗原に
結合するペプチドのフットプリント内にある)とを含んでもよい。
「免疫特異的な結合」又はそれらの派生語は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン
遺伝子のフラグメントによりコードされたドメインを介して、分子の混合集団を含有する
サンプル中の他の分子に優先的に結合することなく、対象となるタンパク質の1つ又は2
つ以上のエピトープに結合することを表わす。典型的には、抗体は、表面プラズモン共鳴
アッセイ又は細胞結合アッセイにより測定された場合、約1×10−8M未満のKdで、
同じ性質の抗原に結合する。「[抗原]特異性」抗体(例えば、BCMA特異性抗体)等
の表現は、列挙された抗体が列挙された抗原に特異的に結合することを伝達することを意
味する。
平衡定数を意味する。
類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、
ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を意味する。記載された方法の多くの実施形態にお
いて、対象はヒトである。
る流体、細胞、又は組織(例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む
生検)の収集物、並びに対象内に存在する流体、細胞、又は組織を意味する。一部の実施
形態では、サンプルは、体液である。体液は、典型的には、生理学的温度において液体で
あり、対象又は生物学的ソース中に存在し、これらから採取され、これらから外に出され
、又は他の方法で抽出された自然発生する流体を含んでもよい。特定の組織、臓器、又は
局所的な領域から得られた特定の体液及び特定の他の体液は、対象又は生物学的ソースに
おいて、より全体的に又は全身的に適していてもよい。体液の例には、血液、血清及び漿
膜液、血漿、リンパ、尿、唾液、嚢胞液、涙、糞、痰、分泌組織及び臓器の粘膜分泌物、
膣分泌物、腹水液、例えば、非固体腫瘍に関連するもの、肋膜、心膜、腹膜、腹部及び他
の体腔の流体、気管支洗浄により収集された流体等が挙げられる。体液はまた、対象又は
生物学的ソースと接触した溶液、例えば、細胞又は臓器順化培地を含む細胞及び臓器培養
培地、洗浄液等を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、「サンプル」という用語は
、対象から取り出された材料又は対象中に存在する材料を包含する。
の溶液は、自然発生する溶液、例えば、初期、中期、後期、進行性、又は静的がんを有す
ることが既知の患者からのサンプルでもよく、又はこの溶液は、希釈された既知の量のB
CMAを有する緩衝水等の合成溶液でもよい。本明細書に記載された既知の標準は、対象
から単離されたBCMA、組換え若しくは精製されたBCMAタンパク質、又は病態に関
連するBCMA濃度の値を含んでもよい。
、BCMA、CD269、及びTNFRSF17(UniProt Q02223)とし
ても周知であり、分化形質細胞に優先的に発現される腫瘍壊死受容体スーパーファミリー
のメンバーである。ヒトBCMAの細胞外ドメインは、UniProtのアミノ酸1〜5
4(又は5〜51)により構成される。本明細書で使用されるとき、「BCMAに対する
抗体、抗BCMA抗体」という用語は、BCMAに免疫特異的に結合する抗体を意味する
。
。CD3タンパク質マルチサブユニット複合体は、6つの区別できるポリペプチド鎖から
構成される。これらは、CD3γ鎖(SwissProt P09693)、CD3δ鎖
(SwissProt P04234)、2つのCD3ε鎖(SwissProt P0
7766)、及び1つのCD3ζ鎖ホモ二量体(SwissProt 20963)を含
み、T細胞受容体α及びβ鎖と会合する。「CD3」という用語は、特に断らない限り、
細胞(T細胞を含む)により本来発現されているか、又はそれらのポリペプチドをコード
する遺伝子若しくはcDNAによりトランスフェクションされた細胞上に発現され得る任
意のCD3変異体、アイソフォーム、及び種間ホモログを含む。
同二重特異性抗体は、2種類の異なる抗原結合領域を含み、一方の抗原結合領域は、抗原
BCMAに特異的に結合し、もう一方の抗原結合領域は、CD3に特異的に結合する。多
重特異性抗体は、二重特異性抗体、ディアボディ、又は類似する分子であり得る(ディア
ボディの説明については、例えば、PNAS USA 90(14),6444〜8(1
993)を参照のこと)。本明細書で提供された二重特異性抗体、ディアボディ等は、B
CMAの一部に加えて、任意の適切な標的に結合してもよい。「二重特異性抗体」という
用語は、異なる抗体配列により定義された、2種類の抗原結合領域を有する抗体と理解さ
れたい。これは、異なる標的結合と理解され得るが、1つの標的中の異なるエピトープに
十分結合することを含む。
れたサンプルの特徴を決定することができるサンプルである。参照サンプルは、試験サン
プルとの比較の基礎として機能する、いくつかの特徴付けられた特性を有するであろう。
例えば、参照サンプルは、がんを有する対象を示すBCMAレベルについてのベンチマー
クとして使用することができる。参照サンプルは、試験サンプルと平行して解析されるこ
とを必ずしも必要としない。このため、一部の例では、参照サンプルは、所与の条件を特
徴付けるために予め決定された数値又は範囲、例えば、対象中のがんを示すBCMAレベ
ルでもよい。この用語はまた、生理学的状態又は病態、例えば、BCMA発現がんに関連
することが周知であるが、未知量のBCMAを有する、比較目的で使用されるサンプルを
含む。
重篤でない状態からより重篤な状態へのがんの変化を含む。これは、腫瘍の数又は重症度
、転移の程度、がんが成長又は増殖する速度等の増大を含むことができる。例えば、「結
腸がんの進行」には、このようながんの、より重篤でない状態からより重篤な状態への進
行、例えば、ステージIからステージIIへ、ステージIIからステージIIIへ等の進
行が挙げられる。
重篤な状態からより重篤でない状態へのがんの変化を含む。これは、腫瘍の数又は重症度
、転移の程度、がんが成長又は増殖する速度等の低下を含むことができると考えられる。
例えば、「結腸がんの退行」には、このようながんの、より重篤な状態からより重篤でな
い状態への退行、例えば、ステージIIIからステージIIへ、ステージIIからステー
ジIへ等の進行が挙げられる。
、進行性がん又は退行性がんであるとみなすのに臨床的意義のある期間にわたり有意に十
分に変化しない、又は変化していなかった病態を説明することを意図している。
限定されるものではなく、当然、変動し得る。
本明細書において、BCMAに特異的に結合する、組換えモノクローナル抗体又は抗原
結合フラグメントが記載されている。抗体分子の全体的な構造は、抗原結合ドメインを含
む。同ドメインは、重鎖及び軽鎖並びにFcドメインを含み、補体固定及び結合抗体受容
体を含む各種の機能を果たす。
る、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgM、並びに4本鎖免疫グロブリン構造の
合成多量体を含む。記載された抗体又は抗原結合フラグメントはまた、雌鳥又はシチメン
チョウの血清及び雌鳥又はシチメンチョウの卵黄中に一般的に見出されるIgYアイソタ
イプも含む。
ことができる。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、マウス、ラット、ヤギ、ウマ
、ブタ、ウシ、ニワトリ、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヒト、又はそれらのキメラ版でもよい
。ヒトへの投与において使用するために、非ヒト由来の抗体又は抗原結合フラグメントは
、ヒトの患者への投与に基づいてほとんど抗原性がないように、遺伝的に又は構造的に改
変することができる。
されるとき、「キメラ」という用語は、非ヒト哺乳類、げっ歯類、又は爬虫類の抗体アミ
ノ酸配列に由来する少なくとも1つの可変ドメインの少なくとも一部の部分を有するが、
抗体又はその抗原結合フラグメントの残り部分がヒトに由来する、抗体又はその抗原結合
フラグメントを意味する。
ンから得られた最少配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖、又
はフラグメント(例えば、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、又は抗体の他の抗
原結合部分配列)でもよい。大部分は、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(
CDR)からの残基が所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)
、例えば、マウス、ラット、又はウサギからの残基により置き換えられているヒト免疫グ
ロブリン(レシピエント抗体)である。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典
型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むこととなる。同可変ドメイン中、全て
又は実質的に全てのCDR領域は、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、全て又
は実質的に全てのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域
である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的には、ヒト免疫グロブ
リンのうち少なくとも一部を含んでもよい。
表1に示された抗体CDRのうち1つ又は2つ以上を含むこととなる。
メントが記載されている。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体又は抗原結合フラグ
メントは、ヒトIgG又はその誘導体である。本明細書で例示されたBCMA特異性抗体
又は抗原結合フラグメントは、ヒトであるが、例示された抗体又は抗原結合フラグメント
は、キメラ化されてもよい。
、及びCDR3を含む重鎖を含む、BCMA特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが
提供される。一部の実施形態では、表1に記載された抗体のうちいずれか1つのCDR1
、CDR2、及びCDR3を含む重鎖と、表1に記載された抗体のうちいずれか1つのC
DR1、CDR2、及びCDR3を含む軽鎖と、を含む、BCMA特異性抗体又はその抗
原結合フラグメントが提供される。
含む重鎖CDR1、配列番号5を含む重鎖CDR2、及び配列番号6を含む重鎖CDR3
を含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番
号4を含む重鎖CDR1、配列番号5を含む重鎖CDR2、配列番号6を含む重鎖CDR
3、配列番号7を含む軽鎖CDR1、配列番号8を含む軽鎖CDR2、及び配列番号9を
含む軽鎖CDR3を含む。このBCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフ
レームワーク配列を含んでもよい。このBCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメントは
、少なくとも5.9nMのIC50でAPRIL結合を阻害し得る。一部の実施形態では
、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号10と実質的に同じか又は
同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合
フラグメントは、配列番号10と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番
号11と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討さ
れた抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、1つのアームが抗BCMAアーム
である、二重特異性構築物への包含に適している。
含む重鎖CDR1、配列番号5を含む重鎖CDR2、及び配列番号6を含む重鎖CDR3
を含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番
号7を含む重鎖CDR1、配列番号5を含む重鎖CDR2、配列番号6を含む重鎖CDR
3、配列番号24を含む軽鎖CDR1、配列番号25を含む軽鎖CDR2、及び配列番号
26を含む軽鎖CDR3を含む。このBCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、
ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び
抗原結合フラグメントは、配列番号57と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを
含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号
57と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号28と実質的に同じか又
は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイ
ン及び軽鎖可変ドメインは、1つのアームが抗BCMAアームである、二重特異性構築物
への包含に適している。
含む重鎖CDR1、配列番号5を含む重鎖CDR2、及び配列番号6を含む重鎖CDR3
を含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番
号7を含む重鎖CDR1、配列番号5を含む重鎖CDR2、配列番号6を含む重鎖CDR
3、配列番号24を含む軽鎖CDR1、配列番号25を含む軽鎖CDR2、及び配列番号
26を含む軽鎖CDR3を含む。このBCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、
ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び
抗原結合フラグメントは、配列番号34と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを
含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号
34と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号28と実質的に同じか又
は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイ
ン及び軽鎖可変ドメインは、1つのアームが抗BCMAアームである、二重特異性構築物
への包含に適している。
含む重鎖CDR1、配列番号5を含む重鎖CDR2、及び配列番号19を含む重鎖CDR
3を含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列
番号4を含む重鎖CDR1、配列番号5を含む重鎖CDR2、配列番号19を含む重鎖C
DR3、配列番号24を含む軽鎖CDR1、配列番号25を含む軽鎖CDR2、及び配列
番号26を含む軽鎖CDR3を含む。このBCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメント
は、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体
及び抗原結合フラグメントは、配列番号39と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメイ
ンを含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列
番号39と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号28と実質的に同じ
か又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ド
メイン及び軽鎖可変ドメインは、1つのアームが抗BCMAアームである、二重特異性構
築物への包含に適している。
含む重鎖CDR1、配列番号8を含む重鎖CDR2、及び配列番号6を含む重鎖CDR3
を含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番
号4を含む重鎖CDR1、配列番号8を含む重鎖CDR2、配列番号6を含む重鎖CDR
3、配列番号24を含む軽鎖CDR1、配列番号25を含む軽鎖CDR2、及び配列番号
26を含む軽鎖CDR3を含む。このBCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、
ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び
抗原結合フラグメントは、配列番号40と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを
含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号
40と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号28と実質的に同じか又
は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイ
ン及び軽鎖可変ドメインは、1つのアームが抗BCMAアームである、二重特異性構築物
への包含に適している。
を含む重鎖CDR1、配列番号5を含む重鎖CDR2、及び配列番号19を含む重鎖CD
R3を含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配
列番号13を含む重鎖CDR1、配列番号5を含む重鎖CDR2、配列番号19を含む重
鎖CDR3、配列番号24を含む軽鎖CDR1、配列番号25を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号26を含む軽鎖CDR3を含む。このBCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメ
ントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。一部の実施形態では、BCMA特異性
抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号58と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ド
メインを含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、
配列番号58と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号28と実質的に
同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可
変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、1つのアームが抗BCMAアームである、二重特異
性構築物への包含に適している。
を含む重鎖CDR1、配列番号8を含む重鎖CDR2、及び配列番号19を含む重鎖CD
R3を含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配
列番号13を含む重鎖CDR1、配列番号8を含む重鎖CDR2、配列番号19を含む重
鎖CDR3、配列番号24を含む軽鎖CDR1、配列番号25を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号26を含む軽鎖CDR3を含む。このBCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメ
ントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。一部の実施形態では、BCMA特異性
抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号43と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ド
メインを含む。一部の実施形態では、BCMA特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、
配列番号43と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号28と実質的に
同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可
変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、1つのアームが抗BCMAアームである、二重特異
性構築物への包含に適している。
ば、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4のアイソタイプである。抗体がIgG
1アイソタイプからなる一部の実施形態では、抗体はIgG1 Fc領域(配列番号74
)を含む。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ
TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG
KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE
EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSPGK
34A、及びL235A置換を、そのFc領域(配列番号73)中に含有する。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK
TYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPS
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY
KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSLGK
異性抗体は、これらのIgG Fc領域を含んでもよい。
た合成ポリヌクレオチドもまた開示される。本明細書で提供された可変ドメインセグメン
トをコード可能な単離されたポリヌクレオチドは、抗体又は抗原結合フラグメントを生成
する同一の又は異なるベクターに含まれてもよい。
る。一部の実施形態では、記載されたポリヌクレオチド(及びこのポリヌクレオチドがコ
ードするペプチド)は、リーダー配列を含む。当技術分野において既知の任意のリーダー
配列を利用することができる。リーダー配列には、制限部位又は翻訳開始部位を挙げるこ
とができるが、これらに限定されない。
CMA特異性抗体又は抗原結合フラグメントの生物学的特性(例えば、結合親和性又は免
疫エフェクター活性)を保持している、1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を
有する変異体を含む。本発明の文脈において、下記注釈は、別途記載のない限り、変異を
説明するのに使用される。i)所与の位置におけるアミノ酸の置換は、例えば、K409
Rと記載される。K409Rは、409位におけるリジンのアルギニンによる置換を意味
する。ii)特定の変異体について、特定の三文字又は一文字コードは、コードXaa及
びXを含めて、アミノ酸残基を示すのに使用される。このため、409位におけるリジン
についてのアルギニンの置換は、K409Rと指定され、又は409位におけるリジンに
ついての任意のアミノ酸残基の置換は、K409Xと指定される。409位におけるリジ
ンの欠失の場合には、この欠失は、K409*により示される。当業者であれば、1つ又
は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有する変異体を生成することができる。
的アミノ酸により置換されている変異体、(b)1つ又は2つ以上のアミノ酸がポリペプ
チドに付加され、又は同ポリペプチドから欠失されている変異体、(c)1つ又は2つ以
上のアミノ酸が置換基を含む変異体、及び(d)ポリペプチドが別のペプチド又はポリペ
プチド、例えば、融合パートナー、タンパク質タグ、又は他の化学部分と融合した変異体
を挙げることができる。これらは、ポリペプチドに有用な特性、例えば、抗体についての
エピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分等を付与してもよい。本明細書に記載さ
れた抗体又は抗原結合フラグメントは、保存的又は非保存的位置のいずれかにおいてある
種からのアミノ酸残基が別の種における対応する残基に置換されている変異体を含んでも
よい。他の実施形態では、非保存的位置におけるアミノ酸残基は、保存的又は非保存的残
基により置換される。これらの変異体を得るための手法は、遺伝的(欠失、変異等)、化
学的、及び酵素的手法を含めて、当業者に既知である。
イソタイプ、例えば、IgM、IgD、IgG、IgA、及びIgEを具現化することが
できる。一部の実施形態では、抗体アイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3、又
はIgG4のアイソタイプ、好ましくは、IgG1又はIgG4のアイソタイプである。
抗体又はその抗原結合フラグメントの特異性は、CDRのアミノ酸配列及び配置により主
に決定される。したがって、あるアイソタイプのCDRは、抗原特異性を変化させること
なく、別のアイソタイプに変更することができる。あるいは、抗原特異性を変化させるこ
となく、ハイブリドーマに、ある抗体アイソタイプを別のものにスイッチさせる技術(ア
イソタイプスイッチング)が確立されてきた。したがって、このような抗体アイソタイプ
は、記載された抗体又は抗原結合フラグメントの範囲内にある。
合について少なくとも5.9nMのIC50値を有する。記載されたBCMA特異性抗体
又は抗原結合フラグメントのIC50は、当該技術分野において周知の種々の方法、例え
ば、ELISAに基づく方法又はフローサイトメトリー(FACS)により決定され得る
。ELISAによりIC50を測定するアッセイは、BCMA特異性抗体の存在下及び不
在下でBCMA結合プレートを有し、様々な濃度のAPRILを使用する。APRILの
BCMAへの結合を阻害するBCMA抗体は、「ELISAにより測定するとき、APR
ILを阻害する」ことができる。
、発現ベクターであり得る。このため、対象となるポリペプチドをコードする配列を含有
する組換え発現ベクターは、本開示の範囲内であると想到される。発現ベクターは、1つ
又は2つ以上の追加配列を含有してもよい。同追加配列には、例えば、制御配列(例えば
、プロモータ、エンハンサー)、選択マーカー、及びポリアデニル化シグナルが挙げられ
るが、これらに限定されない。広い各種の宿主細胞を形質転換するためのベクターは周知
であり、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工
染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、並びに、他の細菌、酵母、及びウイルス
のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
することができる少なくとも1つの組換えタンパク質をコードする、合成的、遺伝的、又
はcDNA由来の核酸フラグメントを含む。このような調節エレメントには、転写プロモ
ータ、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了
を制御する配列を挙げることができる。発現ベクター、特に、哺乳類の発現ベクターはま
た、1つ又は2つ以上の非転写エレメント、例えば、複製の起点、発現される遺伝子に連
結された適切なプロモータ及びエンハンサー、他の5’又は3’フランキング非転写配列
、5’又は3’非翻訳配列(例えば、必須リボソーム結合部位)、ポリアデニル化部位、
スプライスドナー及びアクセプター部位、又は転写終了配列を含んでもよい。宿主におい
て複製する能力を付与する複製の起点もまた包含されてもよい。
ル配列は、ウイルスソースにより提供することができる。例示的なベクターは、Okay
ama and Berg,3 Mol.Cell.Biol.280(1983)に記
載されたように構築されてもよい。
ロモータ、例えば、下記遺伝子:ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(H
PRT)、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシ
ン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン等のためのプロモータの制御下に置かれる。加
えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で構成的に機能し、記載された実施形態
での使用に適している。このようなウイルスプロモータには、サイトメガロウイルス(C
MV)中間初期プロモータ、SV40の初期及び後期プロモータ、マウス乳がんウイルス
(MMTV)プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、
エプスタインバーウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、及び他のレトロ
ウイルスの長端末反復配列(LTR)、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ
プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、BCMA特異
性抗体又はその抗原結合フラグメントのコード配列は、誘引性プロモータ、例えば、メタ
ロチオネインプロモータ、テトラサイクリン誘引性プロモータ、ドキシサイクリン誘引性
プロモータ、1つ又は2つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント(ISRE)、例
えば、プロテインキナーゼR 2’,5’−オリゴアデニレート合成酵素、MX遺伝子、
ADAR1等を含有するプロモータの制御下に置かれる。
RES)を含有してもよい。IRES配列の融合ベクター内への包含は、一部のタンパク
質の発現を向上させるのに有益であり得る。一部の実施形態では、ベクター系は、1つ又
は2つ以上のポリアデニル化部位(例えば、SV40)を含むこととなる。同部位は、前
述の核酸配列のうちいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターのコンポーネント
は、近接して連結されてもよく、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供する
ように(すなわち、ORF間に「スペーサ」ヌクレオチドを導入することにより)配置さ
れてもよく、若しくは別の方法で位置付けられてもよい。調節エレメント、例えば、IR
ESモチーフはまた、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
は、陽性及び陰性選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子(例えば、ネオマイシン
抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、テトラサイク
リン抵抗性遺伝子、ペニシリン抵抗性遺伝子、ピューロマイシン抵抗性遺伝子、ブラスト
サイジン抵抗性遺伝子)、グルタミン酸合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のHSV
−TK、HSV−TK誘導体、又は6−メチルプリン選択用の細菌のプリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ遺伝子(Gadi et al.,7 Gene Ther.1738〜
1743(2000))が挙げられる。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニ
ング部位は、対象となるポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流
又は下流にあってもよい。
をコードする遺伝子で、種々の細胞を形質転換することができる。例えば、ベクターを使
用して、BCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメントの生成細胞を生じさせることがで
きる。このため、別の態様は、BCMAに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグ
メント、例えば、本明細書に記載され、例示された抗体又は抗原結合フラグメントをコー
ドする核酸配列を含むベクターで形質転換された宿主細胞を特徴とする。
り、本明細書に記載され、例示された種々の実施形態に従って、記載された方法を行う目
的で組換え細胞を構築するのに使用することができる。使用される手法により、異種遺伝
子配列を宿主細胞に適切に形質転換されるべきであり、その結果、異種遺伝子配列は、細
胞の子孫により遺伝され、発現されることができ、レシピエント細胞の必須の成育及び生
理学的機能が損なわれない。使用することができる手法としては、染色体導入法(例えば
、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロ細胞媒介性遺伝子導入)、物理的方法(
例えば、トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エ
レクトロポレーション、リポソーム担体)、ウイルスベクター導入(例えば、組換えDN
Aウイルス、組換えRNAウイルス)等が挙げられる(Cline,29 Pharma
c.Ther.69〜92(1985)に記載)が、これらに限定されない。哺乳類細胞
による細菌プロトプラストのリン酸カルシウム沈殿及びポリエチレングリコール(PEG
)誘因融合を使用しても、細胞を形質転換することができる。
のに適した細胞は、好ましくは、真核細胞、より好ましくは、植物、げっ歯類、又はヒト
起源の細胞である。これらの細胞には、例えば、NSO、CHO、CHOK1、perC
.6、Tk−ts13、BHK、HEK293細胞、COS−7、T98G、CV−1/
EBNA、L細胞、C127、3T3、HeLa、NS1、Sp2/0骨髄腫細胞、及び
BHK細胞株等が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、抗体の発現は、ハイブ
リドーマ細胞を使用して達成されてもよい。ハイブリドーマを生成するための方法は、当
技術分野において十分確立されている。
た抗体又は抗原結合フラグメントの組換え発現について選択され、又はスクリーニングさ
れてもよい。組換え陽性細胞は、タンパク質改変又は変化させた翻訳後修飾により、所望
の表現型、例えば、高レベルの発現、向上した増殖特性、又は所望の生化学的特性を有す
るタンパク質を生成する能力を示すサブクローンについて、増殖され、スクリーニングさ
れる。これらの表現型は、所与のサブクローンの本来の特性又は変異により得る。変異は
、化学薬品、UV波長光、照射、ウイルス、挿入変異、DNAミスマッチ修復の阻害、又
はこのような方法の組み合わせにより得られる。
本明細書において、治療に使用するための、BCMA特異性抗体又はその抗原結合フラ
グメントが提供される。特に、これらの抗体又は抗原結合フラグメントは、がん、例えば
、BCMA発現がんを治療するのに有用であり得る。したがって、本発明は、本明細書に
記載されたとおりの抗体、例えば、BCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメントを投与
することを含むがんを治療する方法を提供する。例えば、この使用は、BCMA受容体の
相互作用を使用した阻害によるものであってよく、すなわち、抗体が毒物に結合され、こ
の毒物をBCMA発現がんに標的化する。一部の実施形態では、BCMA発現がんは、多
発性骨髄腫(MM)などのリンパ腫を含む。これらの方法に使用するための抗体としては
、本明細書で上述されたもの、例えば、表1に列記された特徴(例えば、CDR又は可変
ドメイン配列)及びこれらの抗体の更なる検討において列記された特徴を有する、BCM
A特異性抗体又は抗原結合フラグメントが挙げられる。
性は、当業者に既知の技術によるFc改変によって向上するか、又はサイレンシングされ
ることができる。例えば、Fcエフェクター機能、例えば、C1q結合、補体依存性細胞
毒性(CDC)、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)、抗体依存性細胞媒介性貪
食(ADCP)、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体、BCR)のダウンレギュレー
ション等が、これらの活性を担うFc中の残基を改変することにより提供され、かつ/又
は制御され得る。
している非特異的細胞毒性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及び
マクロファージ)が標的細胞上に結合した抗体を認識し、続けて、標的細胞の溶解を引き
起こす、細胞媒介性反応を意味する。
より向上され得る。ヒトIgG1又はIgG3は、Asn297において、N−グリコシ
ル化される。ここで、グリカンの大部分は、周知の二分岐G0、G0F、G1、G1F、
G2、又はG2Fの形態にある。遺伝子操作されていないCHO細胞により生成される抗
体は、典型的には、少なくとも約85%のグリカンフコース含量を有する。Fc領域に付
着した二分岐の複雑なタイプのオリゴ糖からのコアフコースの除去により、改善されたF
c.ガンマ.RIIIa結合を介して、抗原結合性又はCDC活性を変化させることなく
、抗体のADCCが向上される。このようなmAbは、二分岐の複雑なタイプのFcオリ
ゴ糖を有する、比較的高い脱フコシル化抗体の成功した発現をもたらすことが報告された
種々の方法、例えば、培養浸透圧の制御(Konno et al.,Cytotech
nology 64:249〜65,2012)、宿主細胞株としての変異体CHO株L
ec13の適用(Shields et al.,J Biol Chem 277:2
6733〜26740,2002)、宿主細胞株としての変異体CHO株EB66の適用
(Olivier et al.,MAbs;2(4),2010、Epub ahea
d of print、PMID:20562582)、宿主細胞株としてのラットハイ
ブリドーマ細胞株YB2/0の適用(Shinkawa et al.,J Biol
Chem 278:3466〜3473,2003)、アルファ.1,6−フコシルトラ
ンスフェラーゼ(FUT8)遺伝子に対して特異的な低分子干渉RNAの導入(Mori
et al.,Biotechnol Bioeng 88:901〜908,200
4)、又はベータ−1,4−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIIとゴ
ルジアルファ−マンノシダーゼIIとの共発現又は強力なアルファ−マンノシダーゼI阻
害剤であるキフネンシン(Ferrara et al.,J Biol Chem 2
81:5032〜5036;2006、Ferrara et al.,Biotech
nol Bioeng 93:851〜861,2006;Xhou et al.,B
iotechnol Bioeng 99:652〜65,2008)を使用して達成さ
れ得る。
DCCはまた、抗体Fc中の特定の置換によって向上され得る。例示的な置換は、例えば
、米国特許第6,737,056号に記載されたように、アミノ酸位置256、290、
298、312、356、330、333、334、360、378、又は430(EU
インデックスに従った残基番号付け)における置換である。
本明細書において、サンプルを、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメ
ントと接触させることにより、生体サンプル中のBCMAを検出するための方法が提供さ
れる。本明細書に記載されたように、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、
循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞(すなわち、遊離細胞)、組織(例え
ば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検)、組織学的調製物等から
得ることができる。一部の実施形態では、記載された方法は、サンプルを、本明細書に記
載されたBCMA特異性抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれかと接触させること
により、生体サンプル中のBCMAを検出することを含む。
結合フラグメントの2つ以上と接触させてもよい。例えば、サンプルを、第1のBCMA
特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させ、ついで、第2のBCMA特異性抗
体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよく、この場合、第1の抗体又は抗原結
合フラグメントと第2の抗体又は抗原結合フラグメントとは、同じ抗体又は抗原結合フラ
グメントではない。一部の実施形態では、第1の抗体又はその抗原結合フラグメントは、
サンプルと接触させる前に、表面、例えば、マルチウェルプレート、チップ又は類似する
基材に固定されてもよい。他の実施形態では、第1の抗体又はその抗原結合フラグメント
は、サンプルと接触させる前に、全く固定されず又は付着されなくてもよい。
よい。一部の実施形態では、標識された抗体及び抗原結合フラグメントは、本明細書に記
載された方法により、BCMAの検出を容易にし得る。多くのこのような標識が、当業者
に容易に既知である。例えば、適切な標識には、放射線標識、蛍光標識、エピトープタグ
、ビオチン、発色団標識、ECL標識、又は酵素が挙げられるが、これらに限定されると
考えられるべきではない。より具体的には、記載された標識には、ルテニウム、111I
n−DOTA、111In−ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、西洋わさびペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータガラクトシダーゼ、ポリヒスチジン
(HISタグ)、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フ
ェナントリジン染料、ローダミン染料、Alexafluor(登録商標)染料等が挙げ
られる。
Aを検出するための各種のアッセイに使用されてもよい。一部の適切なアッセイには、ウ
ェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫蛍光測定法、
免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光(ECL)免疫アッセイ、免疫組織
化学法、蛍光発色細胞選別(FACS)又はELISAアッセイが挙げられるが、これら
に限定されると考えられるべきではない。
を使用して、対象がBCMAに向けられる治療剤により処置されてもよいことを判定する
ことができる。
明細書において、サンプルを、BCMAに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグ
メントと接触させることにより、血液から得られたサンプル、例えば、血清サンプル中の
BCMAを検出するための方法が提供される。血液サンプル又はその派生物は、希釈され
、画分され、又は他の方法で処理されて、記載された方法が行われ得るサンプルを生成す
ることができる。一部の実施形態では、BCMAは、当技術分野において既知の任意の回
数のアッセイにより、血液サンプル又はその派生物中で検出することができる。例えば、
同アッセイには、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴
、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光(ECL)免疫
アッセイ、免疫組織化学法、蛍光発色細胞選別(FACS)又はELISAアッセイが挙
げられるが、これらに限定されない。
本明細書において、対象におけるBCMA発現がんを診断するための方法が提供される
。一部の実施形態では、BCMA発現がんは、多発性骨髄腫(MM)などのリンパ腫を含
む。一部の実施形態では、上記されたように、生体サンプル、例えば、血液サンプル又は
血清サンプル中のBCMAを検出することは、サンプルが得られた対象中のがんを診断す
る能力を提供する。あるいは、一部の実施形態では、他のサンプル、例えば、組織学的サ
ンプル、微小針吸引サンプル、切除された腫瘍組織、循環細胞、循環腫瘍細胞等もまた、
サンプルが得られた対象ががんを有するかどうかを評価するのに使用されてもよい。一部
の実施形態では、サンプルが得られた対象ががんを有することが既に分かっていてもよい
が、対象を苦しめているがんの種類は、未だに診断されていなくてもよく、又は予備的診
断では未知であるため、対象から得られた生体サンプル中のBCMAを検出することによ
り、がんの診断を可能にし、又は明確にすることができる。例えば、対象ががんを有する
ことが分かっていてもよいが、分かっていなくてもよく、又は、対象のがんがBCMAを
発現しているかどうかが、不明であってもよい。
BCMAの量を決定し、観察されたBCMAの量をコントロール又は参照サンプル中のB
CMAの量と比較することにより、対象がBCMA発現がんに苦しんでいるどうかを評価
することを含む。この場合、対象から得られたサンプル中のBCMAの量とコントロール
又は参照サンプル中のBCMAの量との間の差は、対象がBCMA発現がんに苦しんでい
ることの指標である。別の実施形態では、対象から得られた生体サンプル中に観察された
BCMAの量は、特定の形態又はステージのがんに関連することが既知のBCMAのレベ
ルと比較されて、対象のがんの形態又はステージを決定することができる。一部の実施形
態では、対象から得られたサンプル中のBCMAの量は、サンプルを、BCMAに免疫特
異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、本明細書に記載されたBC
MA特異性抗体と接触させることにより評価される。BCMAの存在について評価される
サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合し
ていない細胞(すなわち、遊離細胞)、組織(例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織
、微小針吸引を含む生検)、組織学的調製物等から得られてもよい。一部の実施形態では
、BCMA発現がんは、多発性骨髄腫(MM)などの血液がんを含む。一部の実施形態で
は、対象は、ヒトである。
CMA特異性抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば、表1で提供された抗体及びフ
ラグメントから得られたもの)と接触させること、抗体又はその抗原結合フラグメントに
よって結合したサンプル中に存在するBCMAの量を定量すること、サンプル中に存在す
るBCMAの量を既知の標準又は参照サンプルと比較すること、及び対象のBCMAレベ
ルががんに関連するBCMAのレベル内に入るかどうかを判定することを含むであろう。
更なる実施形態では、診断方法は、がん特異的処置を投与又は処方する更なる工程が続き
得る。別の実施形態では、診断方法は、がんの処置を容易にするために、判定の結果を伝
送する更なる工程が続き得る。一部の実施形態では、がん特異的処置は、例えば、本明細
書に記載されたBCMA×CD3多重特異性抗体などのBCMA発現がんに対して向けら
れてもよい。
存在するBCMAの量を決定することと、観察されたBCMAの量をコントロール又は参
照サンプル中のBCMAの量と比較することと、により、対象がBCMA発現がんに苦し
んでいるかどうかを評価することを含む。この場合、対象から得られたサンプル中のBC
MAの量とコントロール又は参照サンプル中のBCMAの量との間の差は、対象がBCM
A発現がんに苦しんでいることの指標である。
いない対象から得られてもよい。一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルは
、BCMA発現がんに苦しんでいる対象から得られてもよい。コントロール又は参照サン
プルがBCMA発現がんに苦しんでいない対象から得られる一部の実施形態では、コント
ロール又は参照サンプルについて観察されたBCMAの量に対して、試験サンプル中に存
在するBCMAの量における観察された増大は、評価された対象がBCMA発現がんに苦
しんでいることの指標である。コントロールサンプルがBCMA発現がんに苦しんでいな
い対象から得られる一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルについて観察さ
れたBCMAの量に対して、試験サンプル中に存在するBCMAの量における観察された
減少又は類似性は、評価された対象がBCMA発現がんに苦しんでいないことの指標であ
る。コントロール又は参照サンプルがBCMA発現がんに苦しんでいる対象から得られる
一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルについて観察されたBCMAの量に
対して、試験サンプル中に存在するBCMAの量における観察された類似性は、評価され
た対象がBCMA発現がんに苦しんでいることの指標である。コントロール又は参照サン
プルがBCMA発現がんに苦しんでいる対象から得られる一部の実施形態では、コントロ
ール又は参照サンプルについて観察されたBCMAの量に対して、試験サンプル中に存在
するBCMAの量における観察された減少は、評価された対象がBCMA発現がんに苦し
んでいないことの指標である。
CMAに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、本明細書に記載
された抗体と接触させることにより評価される。BCMAの存在について評価されるサン
プルは、血液サンプル、血清サンプル、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細
胞(すなわち、遊離細胞)、組織(例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸
引を含む生検)、組織学的調製物等から得られてもよい。
又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより決定される。一部の実施形態では
、サンプルを、BCMAに特異的に結合する2つ以上の種類の抗体又はその抗原結合フラ
グメントと接触させてもよい。一部の実施形態では、サンプルを、BCMAに特異的に結
合する第1の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させ、ついで、BCMAに特異的
に結合する第2の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよい。本明細書に記
載されたものなどのBCMA特異性抗体又は抗原結合フラグメントを、この能力において
使用してもよい。
れた診断方法を行うための「第1」及び「第2」の抗体又は抗原結合フラグメントを提供
することができる。一部の実施形態では、BCMA発現がんは、多発性骨髄腫(MM)な
どのリンパ腫を含む。
イ、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光(ECL)免
疫アッセイ、免疫組織化学法、蛍光発色細胞選別(FACS)又はELISAアッセイに
より決定される。
る。このサンプルは、使用されるアッセイが適切に機能していることを保証する陽性又は
陰性のアッセイコントロールでもよい。例えば、この性質のアッセイコントロールは、免
疫組織化学アッセイに一般的に使用されてもよいと考えられる。あるいは、サンプルは、
健康な対象からの生体サンプル中のBCMAの量について標準化された参照であってもよ
い。一部の実施形態では、試験された対象の観察されたBCMAレベルは、BCMA発現
がんを有することが分かっている対象からのサンプル中に観察されたBCMAレベルと比
較されてもよい。一部の実施形態では、コントロール対象は、対象となる特定のがんに苦
しんでいてもよい。一部の実施形態では、コントロール対象は、初期段階のがんを有する
ことが既知であり、同初期段階のがんは、BCMA発現がんであってもよく、又はBCM
A発現がんでなくてもよい。一部の実施形態では、コントロール対象は、中間段階のがん
を有することが既知であり、同中間段階のがんは、BCMA発現がんであってもよく、又
はBCMA発現がんでなくてもよい。一部の実施形態では、コントロール対象は、後期段
階を有することが既知であり、同後期段階は、BCMA発現がんであってもよく、又はB
CMA発現がんでなくてもよい。
本明細書において、対象におけるBCMA発現がんをモニタするための方法が提供され
る。一部の実施形態では、BCMA発現がんは、多発性骨髄腫(MM)などのリンパ腫を
含む。一部の実施形態では、記載された方法は、対象から得られた試験サンプル中に存在
するBCMAの量を決定することと、観察されたBCMAの量をより早い時点で対象から
同様にして得られた生体サンプル中のBCMAの量と比較することと、により、BCMA
発現がんが進行性、退行性、又は不変なままであるかどうかを評価することを含む。この
場合、試験サンプル中のBCMAの量とより早期のサンプル中のBCMAの量との間の差
は、がんが、進行性、退行性、又は不変なままであるかどうかの指標を提供する。これに
関して、より早期のサンプルについて観察された量に対して増大した量のBCMAを含む
試験サンプルは、BCMA発現がんの進行を示すことができる。逆に、より早期のサンプ
ルについて観察された量に対して減少した量のBCMAを含む試験サンプルは、BCMA
発現がんの退行を示すことができる。
わずかな差しか有さない試験サンプルは、BCMA発現がんについて不変の病態を示すこ
とができる。一部の実施形態では、対象から得られた生体サンプル中のBCMAの量は、
サンプルを、BCMAに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、
本明細書に記載された抗体と接触させることにより評価される。BCMAの存在について
評価されるサンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、
組織会合していない細胞(すなわち、遊離細胞)、組織(例えば、外科手術的に切除され
た腫瘍組織、微小針吸引を含む生検)、組織学的調製物等から得られてもよい。一部の実
施形態では、対象は、ヒトである。
BCMA特異性抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば、表1で提供された抗体及び
フラグメントから得られたもの)と接触させることと、サンプル中に存在するBCMAの
量を定量することと、サンプル中に存在するBCMAの量をより早い時点において同じ対
象から同様にして得られた生体サンプル中に存在することが決定されたBCMAの量と比
較することと、対象のBCMAレベルが経時的に変化していたかどうかを判定することと
、を含むであろう。より早期のサンプルについて観察された量に対して増大した量のBC
MAを含む試験サンプルは、がんの進行を示すことができる。逆に、より早期のサンプル
について観察された量に対して減少した量のBCMAを含む試験サンプルは、BCMA発
現がんの退行を示すことができる。したがって、より早期のサンプルについて観察された
量に対してBCMAの量におけるわずかな差しか有さない試験サンプルは、BCMA発現
がんについて不変の病態を示すことができる。一部の実施形態では、サンプルのBCMA
レベルは、単独で、又はより早い時点において評価されたサンプルについて観察されたB
CMAレベルに加えて、既知の標準又は参照サンプルと比較されてもよい。更なる実施形
態では、診断方法は、がん特異的処置を投与する更なる工程が続き得る。一部の実施形態
では、がん特異的処置は、例えば、本明細書に記載されたBCMA×CD3多重特異性抗
体などのBCMA発現がんに対して向けられてもよい。
又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより決定される。一部の実施形態では
、サンプルを、BCMAに特異的に結合する2つ以上の種類の抗体又はその抗原結合フラ
グメントと接触させてもよい。一部の実施形態では、サンプルを、BCMAに特異的に結
合する第1の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させ、ついで、BCMAに特異的
に結合する第2の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよい。本明細書に記
載されたもの等の抗体を、この能力において使用されてもよい。
されたモニタ方法を行うための「第1」及び「第2」の抗体又は抗原結合フラグメントを
提供することができる。一部の実施形態では、BCMA発現がんは、急性骨髄性白血病(
AML)などの血液がんを含む。
イ、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光(ECL)免
疫アッセイ、免疫組織化学法、蛍光発色細胞選別(FACS)又はELISAアッセイに
より決定される。
本明細書において、生体サンプル中のBCMAを検出するためのキットが提供される。
これらのキットは、本明細書に記載されたBCMA特異性抗体又はその抗原結合フラグメ
ントのうち1つ又は2つ以上と、このキットを使用するための取扱説明書とを含む。
く、凍結乾燥されていてもよく、基材、キャリア、又はプレートに固着されていてもよく
、又は検出可能に標識化されていてもよい。
を含んでもよい。例として、キットは、対象からサンプルを得るための手段、コントロー
ル若しくは参照サンプル、例えば、ゆっくり進行するがんを有する対象及び/若しくはが
んを有さない対象からのサンプル、1つ若しくはそれ以上のサンプル区画、及び/又は本
発明の方法の実施を説明する取扱説明書、並びに組織特異的コントロール若しくは標準を
も含んでもよい。
のアッセイに使用するためのバッファ又は他の試薬を更に含み得る。取扱説明書は、例え
ば、アッセイを行うための印刷された取扱説明書及び/又はBCMAの発現レベルを評価
するための取扱説明書であり得る。
れらの手段は、対象から流体又は組織を得るのに使用され得る機器又は試薬のうち1つ又
は2つ以上の品目を含み得る。対象からサンプルを得るための手段はまた、血液サンプル
から血液成分、例えば、血清を単離するための手段を含んでもよい。好ましくは、キット
は、ヒト対象で使用するために設計されている。
本明細書に記載された抗BCMA抗体の結合ドメインは、その表面上にBCMAを発現
している細胞を認識する。上記されたように、BCMAの発現は、がん細胞を示し得る。
特定の部分集合の細胞に対するより特異的な標的化は、二重特異性分子、例えば、BCM
A及び別の標的(CD3など)に結合する抗体又は抗体フラグメントを作製することによ
り達成され得る。これは、BCMAに結合する第1の領域及び他の標的抗原に結合する第
2の結合領域を含む分子を作製することにより達成される。抗原結合領域は、標的の特異
的認識を可能にするいずれの形態もとることができ、例えば、結合領域は、重鎖可変ドメ
イン、Fv(重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの組み合わせ)、フィブロネクチン
III型ドメインに基づく結合ドメイン(例えば、フィブロネクチン由来、若しくはフィ
ブロネクチン由来のIII型ドメインのコンセンサスに基づく、又はテネイシン由来、若
しくはテネイシン由来のIII型ドメインのコンセンサスに基づく、例えば、Janss
en Biotech,Inc.から得られるCentyrin分子、例えば、国際公開
第2010/051274号及び同第2010/093627号を参照のこと)であって
よく、又はこれらを含んでよい。したがって、BCMA及び別の抗原にそれぞれに結合す
る2種類の異なる抗原結合領域を含む二重特異性分子が提供される。
る2種類の異なる抗原結合領域を含む。好ましい実施形態では、BCMA及びCD3に結
合する多重特異性抗体(BCMA×CD3多重特異性抗体)及びその多重特異性抗原結合
フラグメントが提供される。一部の実施形態では、BCMA×CD3多重特異性抗体は、
BCMAに免疫特異的に結合する第1の抗原結合部位を形成するために対を成す第1の重
鎖(HC1)及び第1の軽鎖(LC1)と、CD3に免疫特異的に結合する第2の抗原結
合部位を形成するために対を成す第2の重鎖(HC2)及び第2の軽鎖(LC2)と、を
含む。好ましい実施形態では、BCMA×CD3多重特異性抗体は、CD3に免疫特異的
に結合する第1の抗原結合部位を形成するために対を成す第1の重鎖(HC1)及び第1
の軽鎖(LC1)を含むBCMA特異性アームと、BCMAに免疫特異的に結合する第2
の抗原結合部位を形成するために対を成す第2の重鎖(HC2)及び第2の軽鎖(LC2
)を含むCD3特異性アームと、を含む二重特異性抗体である。一部の実施形態では、本
発明の二重特異性抗体は、全長抗体構造を有する抗体を含む。本明細書で使用されるとき
、「全長抗体」は、2本の全長抗体重鎖と2本の全長抗体軽鎖とを有する抗体を意味する
。全長抗体重鎖(HC)は、重鎖可変ドメイン及び定常ドメイン、VH、CH1、CH2
、及びCH3を含む。全長抗体重鎖(LC)は、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメイン、V
L及びCLを含む。全長抗体は、一方又は両方の重鎖のいずれかにおいて、C末端リジン
(K)を欠いていてもよい。「Fabアーム」又は「半分子」という用語は、抗原に特異
的に結合する一対の重鎖−軽鎖を意味する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインのう
ちの1つは、非抗体ベースの結合ドメイン、例えば、フィブロネクチン3型ドメインに基
づく結合ドメイン、例えば、Centyrinである。
異性抗体のいずれかから得られてもよい。このようなBCMA結合アームの一部の例示的
な実施形態では、BCMAに結合する第1の抗原結合領域は、表1で記載された抗体クロ
ーンから得られた重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3を含む。このようなBCMA結
合アームの一部の例示的な実施形態では、BCMAに結合する第1の抗原結合領域は、表
1で記載された抗体クローンから得られた重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3と、軽
鎖CDR1、CDR2、及びCDR3とを含む。このようなBCMA結合アームの一部の
例示的な実施形態では、BCMAに結合する第1の抗原結合領域は、クローンBCMB6
9、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB17
6、又はBCMB177の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3を含む。このようなB
CMA結合アームの一部の例示的な実施形態では、BCMAに結合する第1の抗原結合領
域は、クローンBCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BC
MB129、BCMB176、又はBCMB177の重鎖CDR1、CDR2、及びCD
R3と、軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3とを含む。このようなBCMA結合アー
ムの一部の例示的な実施形態では、BCMAに結合する第1の抗原結合領域は、表1に記
載された抗体クローンから得られた重鎖可変ドメインを含む。このようなBCMA結合ア
ームの一部の例示的な実施形態では、BCMAに結合する第1の抗原結合領域は、表1に
記載された抗体クローンから得られた重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。こ
のようなBCMA結合アームの一部の例示的な実施形態では、BCMAに結合する第1の
抗原結合領域は、クローンBCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB1
28、BCMB129、BCMB176、又はBCMB177の重鎖可変ドメインを含む
。このようなBCMA結合アームの一部の例示的な実施形態では、BCMAに結合する第
1の抗原結合領域は、クローンBCMB69、BCMB117、BCMB123、BCM
B128、BCMB129、BCMB176、又はBCMB177の重鎖可変ドメイン及
び軽鎖可変ドメインを含む。
鎖対とを有するBCMA×CD3二重特異性抗体のリストを提供し、特定の抗体IDを列
記して、記載された実施形態を産生するために使用される抗原特異性抗体アームを説明す
る。
、好ましくは、その細胞外ドメインにも結合する。
、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4のアイソタイプである。BCM
A結合アームがIgG4アイソタイプを有する一部の実施形態では、BCMA結合アーム
は、S228P、L234A、及びL235A置換を、そのFc領域中に含有する。
る。一部の好ましい実施形態では、BCMA×CD3二重特異性抗体のCD3特異性アー
ムは、ヒト初代T細胞及び/又はカニクイザル初代T細胞に結合し、これらを活性化する
CD3特異性抗体から得られる。一部の実施形態では、CD3結合アームは、CD3εの
N末端において、エピトープに結合する。一部の実施形態では、CD3結合アームは、C
D3εの6つのN末端アミノ酸を含むエピトープと接触する。一部の実施形態では、二重
特異性抗体のCD3特異性結合アームは、マウスモノクローナル抗体SP34、マウスI
gG3/ラムダアイソタイプから得られる。一部の実施形態では、CD3結合アームは、
抗体SP34のCDRを含む。このようなCD3結合アームは、5×10−7M以下、例
えば、1×10−7M以下、5×10−8M以下、1×10−8M以下、5×10−9M
以下、又は1×10−9M以下の親和性で、CD3に結合し得る。CD3特異性結合アー
ムは、マウスモノクローナル抗体SP34のヒト化版のアームでもよい。ヒトフレームワ
ーク適合(HFA)は、CD3特異性アームが得られる抗CD3抗体をヒト化するのに使
用されてもよい。二重特異性抗体の一部の実施形態では、CD3結合アームは、表2から
選択される重鎖と軽鎖とのペアを含む。二重特異性抗体の他の実施形態では、CD3結合
アームは、表2に記載した重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、並びに軽鎖CDR1
、CDR2、及びCDR3配列を含む。例えば、本明細書に記載された二重特異性抗体の
CD3結合アームの一部の実施形態の重鎖及び軽鎖CDR配列は、以下のアミノ酸配列を
含み得る:Hc CDR1、配列番号59;Hc CDR2、配列番号60;Hc CD
R3、配列番号61;Lc CDR1、配列番号62;Lc CDR2、配列番号63;
及びLc CDR3、配列番号64。
形態では、CD3結合アームは、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4である。
CD3結合アームがIgG4アイソタイプを有する一部の実施形態では、CD3結合アー
ムは、S228P、L234A、L235A、F405L、及びR409K置換を、その
Fc領域中に含有する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒ
トT細胞上のCD3εに結合する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメント
は、初代カニクイザルT細胞上のCD3εに結合する。一部の実施形態では、抗体又は抗
原結合フラグメントは、初代ヒト及びカニクイザルT細胞上のCD3εに結合する。一部
の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトCD4+T細胞を活性化す
る。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代カニクイザルCD4+
T細胞を活性化する。
BCMB128、BCMB129、BCMB176、又はBCMB177の重鎖を含むB
CMA結合アームを有するBCMA×CD3二重特異性抗体が提供される。一部の実施形
態では、抗体クローンBCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128
、BCMB129、BCMB176、又はBCMB177の重鎖及び軽鎖を含むBCMA
結合アームを有するBCMA×CD3二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では
、抗体クローンCD3B219の重鎖を含むCD3結合アームを有するBCMA×CD3
二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体クローンCD3B219の重鎖
及び軽鎖を含むCD3結合アームを有するBCMA×CD3二重特異性抗体が提供される
。一部の実施形態では、抗体クローンBCMB69、BCMB117、BCMB123、
BCMB128、BCMB129、BCMB176、又はBCMB177の重鎖を含むB
CMA結合アームと、抗体クローンCD3B219の重鎖を含むCD3結合アームとを有
する、BCMA×CD3二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体クロー
ンBCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、
BCMB176、又はBCMB177の重鎖及び軽鎖を含むBCMA結合アームと、抗体
クローンCD3B219の重鎖及び軽鎖を含むCD3結合アームとを有する、BCMA×
CD3二重特異性抗体が提供される。
Baty(2009)Curr Opin Drug Disc Dev 12:276
に近年レビューされた。
制御されたFabアーム交換により得られたディアボディ、クロスボディ、又は二重特異
性抗体である。
を有するIgG様分子、組換えIgG様デュアル標的化分子(この分子の2つの側面はそ
れぞれ少なくとも2種類の抗体のFabフラグメント又はFabフラグメントの一部を含
有する)、IgG融合分子(全長IgG抗体がエクストラFabフラグメント又はFab
フラグメントの一部に融合されている)、Fc融合分子(一本鎖Fv分子又は安定化ディ
アボディが重鎖定常ドメイン、Fc領域又はその一部に融合されている)、Fab融合分
子(異なるFabフラグメントが互いに融合されている)、ScFv−及びディアボディ
−ベース及び重鎖抗体(例えば、ドメイン抗体、ナノボディ)(異なる一本鎖Fv分子又
は異なるディアボディ若しくは異なる重鎖抗体(例えば、ドメイン抗体、ナノボディ)が
互いに又は別のタンパク質若しくは担体分子に融合されている)が挙げられる。
mab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biot
ech)、Knobs−into−Holes(Genentech)、CrossMA
bs(Roche)及び静電的マッチされた抗体(Amgen)、LUZ−Y(Gene
ntech)、ストランド交換操作ドメインボディ(SEEDbody)(EMD Se
rono)、Biclonic(Merus)、並びにDuoBody(登録商標)(G
enmab A/S)が挙げられる。
ting(DT)−Ig (GSK/Domantis)、Two−in−one An
tibody(Genentech)、Cross−linked Mabs(Karm
anos Cancer Center)、mAb2(F−Star)、及びCovX−
body(CovX/Pfizer)が挙げられる。
n(DVD)−Ig(Abbott)、IgG−like Bispecific(In
nClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)、及び
BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)
、並びにTvAb(Roche)が挙げられる。
emic Institution)、SCORPION(Emergent BioS
olutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、Dual
Affinity Retargeting Technology(Fc−DART)
(MacroGenics)、及びDual(ScFv).sub.2−Fab(Nat
ional Research Center for Antibody Medic
ine−−China)が挙げられる。
/AMGEN)、Dual−Action or Bis−Fab(Genentech
)、Dock−and−Lock(DNL)(ImmunoMedics)、Bival
ent Bispecific(Biotecnol)、及びFab−Fv(UCB−C
elltech)が挙げられる。ScFv−、ディアボディ−ベース及びドメイン抗体に
は、Bispecific T Cell Engager(BITE)(Microm
et)、Tandem Diabody(Tandab)(Affimed)、Dual
Affinity Retargeting Technology(DART)(M
acroGenics)、Single−chain Diabody(Academi
c)、TCR−like Antibodies(AIT,ReceptorLogic
s)、Human Serum Albumin ScFv Fusion(Merri
mack)、及びCOMBODY(Epigen Biotech)、二重標的指向性ナ
ノボディ(dual targeting nanobody)(Ablynx)、二重標的指向性の重鎖のみの
ドメイン抗体(dual targeting heavy chain only domain antibody)が挙げられるが、
これらに限定されない。
交換(又は半分子交換)を使用して、インビトロでのセルフリー環境において又は共発現
を使用するかのいずれか一方において、異なる特異性を有する2つの抗体半分子の好まし
いヘテロ二量体形成のために、各半分子における重鎖CH3界面に置換を導入することに
より生成されてもよい。Fabアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びCH
3ドメインの解離−会合の結果である。親単特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスル
フィド結合は減少する。親単特異性抗体のうち1つの得られた遊離システインは、第2の
親単特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗
体のCH3ドメインは、解離−会合により開放及び再形成する。FabアームのCH3ド
メインは、ホモ二量体化より好ましいヘテロ二量体化に操作されてもよい。得られた生成
物は、それぞれ異なるエピトープ、すなわち、BCMA上のエピトープ及びCD3上のエ
ピトープに結合する、2つのFabアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
2本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体」は、同一
のCH3アミノ酸配列を有する2本の重鎖を有する抗体を意味する。
有する2本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体」
は、同一でないCH3アミノ酸配列を有する2本の重鎖を有する抗体を意味する。
こと)が、全長二重特異性抗体を生成するのに使用されてもよい。簡潔に、ヒトIgGに
おけるCH3ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進
するために、CH3ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さな
側鎖を有するアミノ酸(ホール)が、第1の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入
され、大きな側鎖を有するアミノ酸(ノブ)が、第2の抗原に特異的に結合する抗体の重
鎖内に導入される。2つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖
と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホール
を形成する例示的なCH3置換ペアは、T366Y/F405A、T366W/F405
W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T3
66W/T394S、F405W/T394S、及びT366W/T366S_L368
A_Y407Vである(第1の重鎖の第1のCH3ドメインにおける改変位置/第2の重
鎖の第2のCH3ドメインにおける改変位置として表現)。
おける負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量
体化の促進が、米国特許出願公開第2010/0015133号、米国特許出願公開第2
009/0182127号、米国特許出願公開第2010/028637号、又は米国特
許出願公開第2011/0123532号に記載されたように使用されてもよい。他の戦
略では、ヘテロ二量体化は、米国特許出願公開第2012/0149876号又は米国特
許出願公開第2013/0195849号に記載されたように、下記置換:L351Y_
F405A Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405
A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L3
51Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V
K409F Y407A/T366A_K409F、又はT350V_L351Y_F4
05A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W(第1の重鎖の
第1のCH3ドメインにおける改変位置/第2の重鎖の第2のCH3ドメインにおける改
変位置として表現)により促進されてもよい。
46号に記載された方法に従って、セルフリー環境でのインビトロにおいて、2つの単特
異性ホモ二量体抗体のCH3領域中に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化
させる還元条件下において、2つの親単特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量
体抗体を形成することにより生成されてもよい。この方法において、第1の単特異性二価
抗体(例えば、抗BCMA抗体)及び第2の単特異性二価抗体(例えば、抗CD3抗体)
は、ヘテロ二量体の安定性を促進するCH3ドメインにおける特定の置換を有するように
操作される。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合異性化
を受けるのに十分な還元条件下において共にインキュベートされ、これにより、Fabア
ーム交換による二重特異性抗体が生成される。インキュベーション条件は、最適には、非
還元条件に戻されてもよい。使用されてもよい例示的な還元剤は、2−メルカプトエチル
アミン(2−MEA)、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスリトール(DTE
)、グルタチオン、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、L−シス
テイン、及びベータ−メルカプトエタノール、好ましくは、2−メルカプトエチルアミン
、ジチオスレイトール、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンからなる群から
選択される還元剤である。例えば、少なくとも20℃の温度において、少なくとも25m
M 2−MEAの存在下又は少なくとも0.5mMジチオスレイトールの存在下で、pH
5〜8、例えば、pH7.0又はpH7.4において、少なくとも90分のインキュベー
ションが使用されてもよい。
重特異性抗体をコード可能なポリヌクレオチド配列も提供される。記載されたポリヌクレ
オチドを含むベクターもまた提供され、同様に、本明細書で提供されたBCMA×CD3
多重特異性抗体を発現している細胞も提供される。また、開示されたベクターを発現可能
な細胞も記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞(例えば、293F細胞、CHO細胞
)、昆虫細胞(例えば、Sf7細胞)、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞(例えば、E
.coli)でもよい。記載された抗体はまた、ハイブリドーマ細胞により生成すること
ができる。
置方法
上記で検討されたBCMA二重特異性抗体、例えば、上記で検討されたBCMA×CD
3二重特異性抗体は、治療に有用である。特に、BCMA二重特異性抗体は、がんを処置
するのに有用である。また、本明細書において、治療的に有効な量の、本明細書に記載さ
れた多重特異性抗体又は多重特異性抗原結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体
とを含む、哺乳類における過剰増殖性障害を処置するための治療組成物が提供される。好
ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなBCMA×CD3
多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明
細書に記載されたようなBCMA×CD3二重特異性抗体又はそのBCMA×CD3二重
特異性抗原結合フラグメントである。一実施形態では、当該医薬組成物は、BCMA発現
がんの治療用であり、BCMA発現がんとしては、多発性骨髄腫(MM)などのBCMA
発現B細胞がん、及びBCMAが発現していると今のところ判定される他のがんが挙げら
れる(ただし、これらに限定されない)。がん、例えば、上記で検討された特定のがんを
含む血液がんを処置するのに使用されてもよい特定の二重特異性抗体には、抗体BCMB
69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB1
76、若しくはBCMB177、又はCD3B219が挙げられる。がん、例えば、これ
らの特定のがんを含む血液がんを処置するのに有用な二重特異性抗体の一例は、BCMB
72である。
ラグメントと、b)不活性でも又は生理学的に活性でもよい医薬的に許容され得る担体と
を含む。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなBCM
A×CD3多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好まし
くは、本明細書に記載されたようなBCMA×CD3二重特異性抗体又はそのBCMA×
CD3二重特異性抗原結合フラグメントである。本明細書で使用されるとき、「医薬的に
許容され得る担体」という用語は、生理学的に適合性である、任意かつ全ての溶媒、分散
媒体、コーティング、抗菌剤、及び抗真菌剤等を含む。適切な担体、希釈剤、及び/又は
賦形剤の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロー
ル、エタノール等のうち1種又は2種以上、並びにそれらの任意の組み合わせが挙げられ
る。多くの場合には、等張性剤、例えば、糖、ポリアルコール、又は塩化ナトリウムを組
成物中に含むのが好ましいであろう。特に、適切な担体の関連する例には、(1)ダルベ
ッコリン酸緩衝生理食塩水、pH約7.4、約1mg/mL〜25mg/mLヒト血清ア
ルブミンを含有又は非含有、(2)0.9%生理食塩水(0.9%w/v塩化ナトリウム
(NaCl))、及び(3)5%(w/v)デキストロースが挙げられ、抗酸化剤、例え
ば、トリプタミン及び安定化剤、例えば、Tween 20(登録商標)をも含有しても
よい。
してもよい。好ましくは、多重特異性抗体又は抗体フラグメントと補助的な活性化合物と
は、互いに有害に影響を及ぼさない補完的な活性を有するであろう。好ましい実施形態で
は、更なる治療剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はイン
ターロイキン2である。好ましい実施形態では、更なる治療剤は、化学療法剤である。
体の剤形が挙げられるが、好ましい形態は、意図された投与方式及び治療用途により決ま
る。典型的に好ましい組成物は、注射用液又は注入用液の形態である。好ましい投与方式
は、非経口(例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下)である。好ましい実施形態では、
本発明の組成物は、静脈内に、ボーラスとして又は一定期間にわたる連続的な注入により
投与される。別の好ましい実施形態では、本組成物は、局所及び全身性の治療効果を発揮
するために、筋肉内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、又は病
巣周囲の経路により投与される。
ートを、必要とされる量で適切な溶媒に包含させ、続けて、マイクロフィルター法により
滅菌することにより調製され得る。溶媒又は媒体として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生
理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにこれらの組み合わせを
使用することができる。多くの場合には、等張性剤、例えば、糖、ポリアルコール、又は
塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましいであろう。これらの組成物はまた、補助剤
、特に、湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤、及び安定化剤を含有してもよい。非経口投
与用の無菌組成物はまた、使用時に滅菌水又は任意の他の注射用無菌媒体中に溶解されて
もよい、無菌の固体組成物の形態に調製されてもよい。
体組成物として、錠剤、丸剤、粉末剤(ゼラチンカプセル剤、サッシェ剤)、又は顆粒剤
が使用されてもよい。これらの組成物において、本発明による活性成分は、1つ又は2つ
以上の不活性な希釈剤、例えば、デンプン、セルロース、スクロース、ラクトース、又は
シリカと、アルゴン流下において混合される。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質
、例えば、1つ又は2つ以上の滑材、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はタルク、着
色剤、コーティング(糖衣錠)、又はグレーズを含んでもよい。
ール、植物油、又はパラフィンオイルを含有する、医薬的に許容され得る液剤、懸濁剤、
乳剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が使用されてもよい。これらの組成物は、希釈剤以
外の物質、例えば、湿潤剤、甘味料、増粘剤、着香剤、又は安定化製品を含んでもよい。
、一般的には、成人1日あたりに経口で5mg〜1000mgであり、単位用量は、活性
物質1mg〜250mgの範囲である。一般的には、医師は、適切な用量を、処置される
対象の年齢、体重、及び同対象に固有の任意の他の要因に応じて決定するであろう。
細胞を殺傷すること(すなわち、T細胞のリダイレクト)が可能な多重特異性抗体を、そ
れを必要とする患者に投与することにより、BCMA+細胞を殺傷するための方法が提供
される。本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグメントのいずれかは、治療的に使用され
てもよい。例えば、一実施形態では、BCMA×CD3多重特異性抗体のBCMB72を
治療的に使用して、対象においてがんを治療してもよい。
ける過剰増殖性障害を処置するために使用される。より好ましい実施形態では、本発明の
多重特異性抗体又は抗体フラグメントを含有する、上記で開示された医薬組成物のうち1
つは、哺乳類における過剰増殖性障害を処置するために使用される。一実施形態において
、この障害は、がんである。特に、がんはBCMA発現がんであり、BCMA発現がんと
しては、多発性骨髄腫(MM)などのBCMA発現B細胞がん、及びBCMAが発現して
いると今のところ判定される他のがんが挙げられる(ただし、これらに限定されない)。
好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなBCMA×CD
3多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本
明細書に記載されたようなBCMA×CD3二重特異性抗体又はそのBCMA×CD3二
重特異性抗原結合フラグメントである。
しては、BCMA発現がんが挙げられ(ただし、これらに限定されない)、BCMA発現
がんとしては、急性多発性骨髄腫(MM)などのBCMA発現B細胞がん、及びBCMA
が発現していると今のところ判定される他のがんが挙げられる(ただし、これらに限定さ
れない)。
、BCMA発現標的細胞又はこのような標的細胞を含有する組織を、有効量の本発明の多
重特異性抗体又は抗体フラグメントと、単独で、又は他の細胞毒性剤若しくは治療剤との
組み合わせにおいてかのいずれか一方で、末梢血単核球(PBMC)の存在下で接触させ
ることを含む、方法が更に提供される。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明
細書に記載されたようなBCMA×CD3多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フ
ラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなBCMA×CD3二重
特異性抗体又はそのBCMA×CD3二重特異性抗原結合フラグメントである。好ましい
実施形態では、更なる治療剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩
、又はインターロイキン2である。好ましい実施形態では、更なる治療剤は、化学療法剤
である。選択された細胞集団の成長を阻害するための方法は、インビトロ、インビボ、又
はエクスビボにおいて実施され得る。
前の自家骨髄の処理、適格性T細胞を殺傷し、移植片対宿主病(GVHD)を防止するた
めの移植前の骨髄の処理、標的抗原を発現していない所望の変異体を除く全ての細胞を殺
傷し、又は不要な抗原を発現している変異体を殺傷するための細胞培養物の処理が挙げら
れる。非臨床的なインビトロでの使用条件は、当業者により容易に決定される。
胞を除去することである。処置は、下記のように行われ得る。骨髄を、患者又は他の個体
から収集し、ついで、本発明の細胞毒性剤を添加された血清含有培地中でインキュベート
する。濃度は、約30分〜約48時間、約37℃において、約10μM〜1μMの範囲で
ある。インキュベーションの濃度及び時間の正確な条件、すなわち用量は、当業者により
容易に決定される。インキュベーション後、骨髄細胞を、血清含有培地で洗浄し、既知の
方法に従って、i.v.注入により患者に戻す。患者が他の処置、例えば、一連の骨髄破
壊的化学療法又は全身照射を受けている状況において、骨髄の収集と処理された細胞の再
注入との時間の間、処理された骨髄細胞は、標準的な医療機器を使用して、液体窒素中で
凍結保存される。
フラグメントがそれを必要とする対象に投与される。例えば、BCMA×CD3多重特異
性抗体及びその多重特異性抗原結合フラグメントは、それを必要とする対象における、B
CMA発現がんの処置に有用であり得る。一部の実施形態では、BCMA発現がんは、多
発性骨髄腫(MM)などのB細胞がんである。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は
、本明細書に記載されたようなBCMA×CD3多重特異性抗体又はその多重特異性抗原
結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなBCMA×CD
3二重特異性抗体又はそのBCMA×CD3二重特異性抗原結合フラグメントである。一
部の実施形態では、対象は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。一部の実施形態では、多
重特異性抗体又は多重特異性抗原結合フラグメントは、無菌試験済みの溶液として投与さ
れるであろう。
を提供するように調節される。例えば、単一ボーラスを投与してもよく、いくつかの分離
用量を、時間をかけて投与してもよく、又は用量を治療状況の緊急性によって示されるよ
うに、比例して減少又は増加させてよい。非経口組成物は、投与の容易性及び用量の均一
性のための投与形態に製剤化されてもよい。
状態により決まり、当業者により決定されてもよい。本発明の化合物の治療的に有効な量
の例示的で非限定的な範囲は、約0.001〜10mg/kg、例えば、約0.001〜
5mg/kg、例えば、約0.001〜2mg/kg、例えば、約0.001〜1mg/
kg、例えば、約0.001、約0.01、約0.1、約1、又は約10mg/kgであ
る。
有効量を、容易に決定し、処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治
療効果を達成するのに必要されるより少ないレベルで医薬組成物中に利用される多重特異
性抗体又はフラグメントの用量で開始し、所望の効果が達成されるまで、用量を徐々に増
大させることができる。一般的には、本発明の二重特異性抗体の適切な日量は、治療効果
を生じさせるのに有効な最も少ない用量である化合物量であろう。投与は、例えば、非経
口、例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下でもよい。一実施形態において、多重特異性抗体
又はフラグメントは、mg/m2で算出された毎週投与での注入により投与されてもよい
。このような用量は、例えば、下記:用量(mg/kg)×70:1.8に従って、上記
で提供されたmg/kg用量に基づくことができる。このような投与は、例えば、1〜8
回、例えば、3〜5回繰り返されてもよい。投与は、2〜24時間、例えば、2〜12時
間の期間にわたる連続的な注入により行われてもよい。一実施形態において、多重特異性
抗体又はフラグメントは、毒性の副作用を減少させるために、長期間、例えば、24時間
超にわたるゆっくりとした連続的な注入により投与されてもよい。
場合、最大8回、例えば、4〜6回の固定用量として算出された毎週投与において投与さ
れてもよい。このような計画は、例えば、6ケ月又は12ケ月後に、必要に応じて1回又
は2回以上の回数繰り返されてもよい。このような固定用量は、例えば、上記で提供され
たmg/kg用量に基づくことができるが、このとき体重は、70kgと仮定する。用量
は、例えば、生体サンプルを採取し、本発明の多重特異性抗体のBCMA抗原結合領域を
標的にする抗イディオタイプ抗体を使用することによって、本発明の二重特異性抗体の投
与時の血中量を測定することにより、決定又は調節されてもよい。
以上の期間に週一回等により投与されてもよい。
おけるイベントの発生の開始を遅延させ、かつ/又はがんが緩解した際の再発リスクを低
下させるために、予防的に投与されてもよい。
おいて投与されてもよい、すなわち、処置される疾患又は状態に関連する他の治療剤と組
み合わせられてもよい。したがって、一実施形態において、抗体含有医薬は、1種又は2
種以上の他の治療剤、例えば、化学療法剤と組み合わせるためのものである。一部の実施
形態では、他の治療剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又は
インターロイキン2である。このような組み合わせ投与は、同時、任意の順序において、
別々又は連続的でもよい。同時投与について、薬剤は、必要に応じて、1つの組成物又は
別々の組成物として投与されてもよい。
するための方法であって、それを必要とする対象に、治療的に有効な量の、本明細書に記
載された多重特異性抗体又はフラグメント、例えば、BCMA×CD3二重特異性抗体を
投与し、かつ放射線治療を行うことを含む方法が提供される。一実施形態において、がん
を治療又は予防するための方法であって、それを必要とする対象に、治療的に有効な量の
、本明細書に記載された多重特異性抗体又はフラグメント、例えば、BCMA×CD3抗
体を投与し、かつ放射線治療を行うことを含む方法が提供される。放射線治療としては、
提供される患者に対する、放射線又は放射性医薬の関連する投与を含んでもよい。放射線
源は、処置される患者の外側又は内側のいずれか一方であってもよい(放射線処置は、例
えば、放射線外部照射(EBRT)又は組織内照射療法(BT)の形態でもよい)。この
ような方法を実施するのに使用されてもよい放射性元素には、例えば、ラジウム、セシウ
ム−137、イリジウム−192、アメリシウム−241、金−198、コバルト−57
、銅−67、テクネチウム−99、ヨウ素−123、ヨウ素−131、及びインジウム−
111が挙げられる。
また、本明細書において、例えば、記載された多重特異性抗体又はその抗原結合フラグ
メントと、特定の細胞種を殺傷するための抗体又はフラグメントを使用するための取扱説
明書と、を含むキットも提供される。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細
書に記載されたようなBCMA×CD3多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラ
グメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなBCMA×CD3二重特
異性抗体又はそのBCMA×CD3二重特異性抗原結合フラグメントである。取扱説明書
は、多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを、インビトロ、インビボ、又はエク
スビボにおいて使用するための指示を含んでもよい。
を有するであろう。多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、凍結乾燥状態、液
状、又はキットに含ませるのに修正可能な他の形態でもよい。キットはまた、キットの取
扱説明書に記載された方法を実施するのに必要とされる、更なる要素を含有してもよい。
同要素は、例えば、凍結乾燥粉末を再構成するための滅菌溶液、患者への投与の前に多重
特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと組み合わせるための更なる薬剤、及び多重特
異性抗体又はその抗原結合フラグメントを患者に投与するのを支援するツールである。
本明細書に記載された多重特異性抗体及びフラグメントはまた、診断目的に使用されて
もよい。このため、本明細書で定義されたような多重特異性抗体又はフラグメントを含む
診断組成物及びその使用もまた提供される。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、
本明細書に記載されたようなBCMA×CD3多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結
合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなBCMA×CD3
二重特異性抗体又はそのBCMA×CD3二重特異性抗原結合フラグメントである。一実
施形態において、本発明は、二重特異性BCMA×CD3抗体と、BCMAに対する抗体
の結合を検出するための1種又は2種以上の試薬と、を含む容器を含む、がんを診断する
ためのキットを提供する。試薬には、例えば、蛍光タグ、酵素タグ、又は他の検出可能な
タグを挙げることができる。試薬はまた、酵素反応のための二次若しくは三次抗体又は試
薬を含んでもよい。この場合、酵素反応は、可視化することができる生成物を生じる。例
えば、本明細書に記載された多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射線標
識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ECL標識、酵素、ルテニウム
、111In−DOTA、111In−ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、
西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータガラクトシダーゼ、
若しくはポリヒスチジン、又は、当技術分野において公知の類似するこのような標識で標
識されてもよい。
本明細書における主題をより良くより完全に説明するために、本項は提示された主題の
例示的な実施形態の列挙を提供する。
1.BCMAに免疫特異的に結合する組換え抗体、又はその抗原結合フラグメントであ
って、抗体は重鎖及び軽鎖を有し、当該重鎖は、
a.配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域1(CDR1)、配列番
号5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖
CDR3、
b.配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を
有する重鎖CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
c.配列番号7のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を
有する重鎖CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
d.配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を
有する重鎖CDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
e.配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号8のアミノ酸配列を
有する重鎖CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
f.配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列
を有する重鎖CDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
g.配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号8のアミノ酸配列
を有する重鎖CDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、を含む
、組換え抗体、又はその抗原結合フラグメント。
2.当該抗体は、配列番号24のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号25の
アミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号26のアミノ酸配列を有する軽鎖CD
R3、を更に含む、実施形態1に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
3.(a)の抗体の重鎖は、配列番号27のアミノ酸配列を含み、(b)の抗体の重鎖
は、配列番号57のアミノ酸配列を含み、(f)の抗体の重鎖は、配列番号34のアミノ
酸配列を含み、(k)の抗体の重鎖は、配列番号39のアミノ酸配列を含み、(l)の抗
体の重鎖は、配列番号40のアミノ酸配列を含み、(m)の抗体の重鎖は、配列番号58
のアミノ酸配列を含み、又は(n)の抗体の重鎖は、配列番号43のアミノ酸配列を含む
、実施形態1に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
4.抗体の軽鎖は、配列番号28のアミノ酸配列を含む、実施形態2又は3に記載の抗
体又は抗原結合フラグメント。
5.抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトBCMAの細胞外ドメインに結合する
、実施形態1〜4のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
6.抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトの抗体又は抗原結合フラグメントである、
実施形態1〜5のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
7.抗原結合フラグメントは、Fabフラグメント、Fab2フラグメント、又は一本
鎖抗体である、実施形態1〜6のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント。
8.抗体又はその抗原結合フラグメントは、BCMA及びAPRILの相互作用を阻害
する、実施形態1〜7のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
9.抗体又は抗原結合フラグメントは、ELISAにより測定するとき、BCMA及び
APRILの相互作用について約5.9nMのIC50を示す、実施形態8に記載の抗体
又は抗原結合フラグメント。
10.抗体又はその抗原結合フラグメントはIgGである、実施形態1〜9のいずれか
一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
11.IgG4アイソタイプである、実施形態1〜10のいずれか一項に記載の抗体又
は抗原結合フラグメント。
12.IgG4は、そのFc領域中に、S228P置換、L234A置換、及びL23
5A置換を有する、実施形態11に記載の抗体。
13.抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトBCMAに免疫特異的に結合し、カ
ニクイザルBCMAに交差反応する、実施形態1〜12のいずれか一項に記載の抗体又は
抗原結合フラグメント。
14.抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト骨髄腫細胞の表面上のBCMAに結
合する、実施形態1〜13のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
15.抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト多発性骨髄腫細胞の表面上のBCM
Aに結合する、実施形態1〜14のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント
。
16.実施形態1〜15のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを発現
している、組換え細胞。
17.細胞はハイブリドーマである、実施形態16に記載の細胞。
18.抗体は組換え的に生成される、実施形態16に記載の細胞。
19.組換えBCMA×CD3二重特異性抗体又はそのBCMA×CD3二重特異性結
合フラグメントであって、
a)第1の重鎖(HC1)、
b)第2の重鎖(HC2)、
c)第1の軽鎖(LC1)、と、
d)第2の軽鎖(LC2)を含み、
HC1はLC1と結合され、HC2はLC2と結合され、CD3に免疫特異的に結合す
る第1の抗原結合部位を形成するために、HC1は配列番号59、配列番号60、及び配
列番号61を含み、LC1は配列番号62、配列番号63、及び配列番号64を含み、ま
たBCMAに免疫特異的に結合する第2の抗原結合部位を形成するために、HC2は配列
番号4、配列番号5、及び配列番号6を含み、LC2は配列番号24、配列番号25、及
び配列番号26を含む、組換えBCMA×CD3二重特異性抗体又はそのBCMA×CD
3二重特異性結合フラグメント。
20.配列番号55を含むHC1と、配列番号56を含むLC1と、配列番号65を含
むHC2と、a)配列番号66又はb)配列番号76を含むLC2と、を含む、実施形態
19に記載の組換えBCMA×CD3二重特異性抗体又はそのフラグメント。
21.抗体又は二重特異性結合フラグメントはIgGである、実施形態20に記載のB
CMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
22.抗体又は二重特異性結合フラグメントはIgG4アイソタイプである、実施形態
19、20、又は21のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重
特異性結合フラグメント。
23.抗体又は二重特異性結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴により測定すると
き、少なくとも0.22nMの親和性でヒトBCMAに免疫特異的に結合する、実施形態
19〜22に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
24.抗体又はその二重特異性結合フラグメントは、ヒト骨髄腫細胞の表面上のBCM
Aに結合する、実施形態19〜23に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特
異性結合フラグメント。
25.抗体又はその二重特異性結合フラグメントは、ヒト多発性骨髄腫細胞の表面上の
BCMAに結合する、実施形態19〜24に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は
二重特異性結合フラグメント。
26.抗体又は二重特異性結合フラグメントは、約0.37nM未満のEC50でイン
ビトロでヒトT細胞活性化を誘発する、実施形態19〜25に記載のBCMA×CD3二
重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
27.抗体又は二重特異性結合フラグメントは、約0.45nM未満のEC50でイン
ビトロでBCMA発現細胞のT細胞依存性細胞傷害を誘発する、実施形態19〜26に記
載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
28.抗体又は二重特異性結合フラグメントは、BCMAアゴニストではない、実施形
態19〜27に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント
。
29.抗体又は二重特異性結合フラグメントは、10nM未満の濃度でNF−κB活性
化を変化させない、実施形態19〜28に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二
重特異性結合フラグメント。
30.実施形態19〜29のいずれか一項に記載の抗体又は二重特異性結合フラグメン
トを発現している、組換え細胞。
31.細胞はハイブリドーマである、実施形態30に記載の細胞。
32.がんを有する対象を処置するための方法であって、実施形態19〜29のいずれ
か一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの治療
的に有効な量を、それを必要とする対象に、がんを処置するのに十分な時間投与すること
を含む、方法。
33.がん細胞の成長又は増殖を阻害するための方法であって、実施形態19〜29の
いずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント
の治療的に有効な量を投与し、がん細胞の成長又は増殖を阻害することを含む、方法。
34.T細胞をBCMA発現がん細胞にリダイレクトする方法であって、実施形態19
〜29のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラ
グメントの治療的に有効な量を投与し、T細胞をがんにリダイレクトすることを含む、方
法。
35.がんは血液がんである、実施形態32、33、又は34に記載の方法。
36.血液がんはBCMA発現B細胞がんである、実施形態35に記載の方法。
37.BCMA発現B細胞がんは多発性骨髄腫である、実施形態36に記載の方法。
38.第2の治療剤を投与することを更に含む、実施形態32に記載の方法。
39.第2の治療剤は、化学療法剤又は標的化抗がん治療剤である、実施形態38に記
載の方法。
40.化学療法剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はイ
ンターロイキン2である、実施形態39に記載の方法。
41.実施形態19〜29のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又
は二重特異性結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体と、を含む、医薬組成物。
42.実施形態30〜31のいずれか一項に記載の細胞を培養することにより、実施形
態19〜29のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結
合フラグメントを生成するための方法。
43.実施形態19〜29のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又
は二重特異性結合フラグメントのHC1、HC2、LC1、又はLC2をコードする、単
離された合成ポリヌクレオチド。
44.実施形態19〜29のいずれか一項に定義されるようなBCMA×CD3二重特
異性抗体又は二重特異性結合フラグメント、及び/又は請求項44に定義されるようなポ
リヌクレオチド、及びこれらのための包装、を含む、キット。
るために提供される。これらの実施例は、記載された主題を限定すると解釈されるべきで
ない。本明細書に記載された実施例及び実施形態は、例示のみを目的とするものであり、
それらを考慮して種々の改変又は変更が、当業者に明らかであろう。また、本明細書に記
載された実施例及び実施形態は、本発明の真の範囲内に含まれ、本発明の真の範囲を逸脱
することなくなされ得ることが理解される。
BCMA ECD分子
組換えヒト(h)BCMA−Fc融合タンパク質(カタログ#193−BC−050、
hBCMA(配列番号1)のアミノ酸1〜54に相当する)及び組換えマウス(m)BC
MA−Fc融合タンパク質(カタログ#593−BC−050、mBCMA(配列番号2
)のアミノ酸1〜49に相当する)をR&D Systemsから入手した。組換えカニ
クイザルBCMAタンパク質は、遺伝子合成技術(米国特許第6,670,127号、同
第6,521,427号)から得たcDNAから調製した。全てのタンパク質を、使用前
にエンドトキシンについて検査し、ファージパニング試験のためにビオチン化した。これ
らの材料を結合性及び親和性の測定にも使用した。
ット番号033−013)から入手し、特性試験に使用した。
可溶性hAPRIL(カタログ#DY884)、hBAFF(カタログ#2149−B
F)、hBAFF−R(カタログ#1162−BR、hBAFF−Rのアミノ酸7〜71
に相当する)、及びhTAC1(TACIのアミノ酸2〜166に相当する)をR&D
Systemsから入手した。BAFF−R及びTAC1をSPR試験のためにビオチン
化した。
ヒトBCMA(図1A)及びカニクイザルBCMA(図1B)を提供するベクターを、
標準的な方法を使用してHEK293 expi細胞に一次的にトランスフェクションし
た。トランスフェクションされた293F付着細胞を、安定したプラスミド組込み用に選
択した。ついで、単一細胞を選別し、BCMA表面受容体発現を、抗ヒトBCMA−PE
標識抗体(R&D Systems FAB193P)を使用するFACSにより定量し
た。
ヒト免疫グロブリントランスジェニックラット株(OmniRat(登録商標)、OM
T,Inc.)を使用して、ヒトBCMAモノクローナル抗体発現ハイブリドーマ細胞を
発生させた。OmniRat(登録商標)は、完全なヒトIgL座(Jκ−Cκに結合し
た12のVκ及びJλ−Cλに結合した16のVλ)と共に、キメラヒト/ラットIgH
座(ラットCH座に結合した自然構成での22のヒトVHセグメント、全てのヒトD及び
JHセグメントからなる)を含む。(例えば、Osborn,et al.(2013)
J Immunol 190(4):1481〜1490を参照のこと)。したがって、
ラットは、ラットIgM又はκの発現の減少を示し、免疫付与に応じて、導入されたヒト
重鎖及び軽鎖導入遺伝子がクラススイッチ及び体細胞突然変異を受け、高親和性ヒトIg
Gモノクローナル抗体を生成する。OmniRat(登録商標)の調製及び使用、並びに
このようなラットにより生じるゲノム修飾は、国際公開第14/093908号(Bru
ggemannら)に記載されている。
ットは、ヒトBCMAに特異的なヒトIgG抗体を産生する。
た。21日間の免疫規制飼育の後、免疫化ラットから脾臓及びリンパ節を採取し、これら
を使用して合計4つのハイブリドーマライブラリを生成した。ライブラリを滴定し、EL
ISAでアッセイし、ビオチン化hBCMAに結合性を示すmAbを同定した。mAbを
MSD Streptavidinプレート上に捕捉した。更なる確認スクリーニングの
後、ヒトBCMA及びカニクイザルBCMAに特異的な結合性を示したハイブリドーマ上
清を、配列決定し、クローンし、発現させ、ヒトIgG1及びIgG4の両方に変換した
。
清澄化した培養上清中のBCMA抗体を、MabSelect SuRe Prote
in A樹脂により捕捉し、100mM酢酸ナトリウム(pH3.5)で溶出した。抗体
を含む画分をプールし、2.5M Tris HCl(pH 7.2)で直ちに中和し、
ついで1×D−PBS又は指定がある場合は他の所望のバッファにバッファ交換した。タ
ンパク質濃度を、NanoDrop分光光度計でOD280を測定して決定し、その吸光
係数を用いて計算した。抗体の純度及び均質性をSDS−PAGE及びSE−HPLCに
より評価した。単量体がSE−HPLCにより95%未満であった場合、Superde
x 200を用いたSECポリッシュ工程を行った。
操作されたBCMA発現細胞並びにがん細胞株U2392、EJM、MMIR、U26
6、OPM2、及びRPMI−18226に対するBCMA抗体の結合性を、MSD(M
esoscale)細胞結合アッセイ及びフローサイトメトリーを使用して評価した。ス
クリーニングアッセイの目的は、BCMAを発現している細胞に結合した抗体を特定する
こと、並びにカニクイザルBCMAを発現している細胞との交差反応性を特定することで
あった。
セイした。簡潔に言えば、精製BCMA抗体の発現上清を10μg/mLに正規化した。
ウェルあたりに5000個の細胞を、384ウェルプレート(MA6000,cat.L
21XB,MSD)に播種し、2時間付着させた。ついで、細胞を、PBS中の20%F
BS(Gibco)で、15分間ブロッキングした。ついで、抗体上清を加え、RTで1
時間放置した。細胞を、PBSで3回洗浄し、ついで、ルテニウム標識化二次抗体(Ja
ckson Immuno Research)を、1μg/mLで加え、室温において
1時間インキュベートした。ついで、更なる洗浄工程を適用し、ついで、ウェルあたり3
5μLの(界面活性剤を含まない)MSDリードバッファTを加え、検出のために、30
分間インキュベートした。ついで、MSD Sector 6000を使用して、プレー
トを読み取った。データを、コントロールに対して正規化し、GraphPad Pri
sm Version 5を使用してグラフ化した。陽性のバインダーを、バックグラウ
ンドより3倍高いシグナルを有するヒットであると決定した。アッセイを、データ整合性
のために繰り返し、トップバインダーを、更なる開発のために選択した。
,000個の細胞をU底プレートに添加し、遠心分離して細胞をペレット状にした。滴定
したBCMA抗体を細胞に添加した。インキュベーション期間の後、細胞をペレット状に
し、洗浄した。二次抗体に特異的なAlexaFluor 647標識種を細胞に添加し
、インキュベートした。細胞をペレット状にし、7回洗浄した。細胞を適量のランニング
バッファで再懸濁し、FACS CantoIIを使用して分析した。細胞を、サイズに
ついてはFSC−A対SSC−A、一重線及び生存性染料についてはSSC−A対SSC
−Hによりゲート開閉した。生細胞集団のgeoMFI値をグラフ化し、可能であれば、
すなわち曲線が十分にS字状であれば、EC50値の計算に使用した。
BCMA抗体パネルを、APRIL結合競合ELISAにおいてスクリーニングした。
可溶性ヒトAprilをR&D systemsから購入し(カタログ#DY884)、
固定されたBCMAへのAPRILの結合を阻害する抗BCMA抗体の能力を評価した。
/mL BCMA−ECDの100μLで処理し、室温で一晩インキュベートした。つい
でプレートを、PBS中に0.05% Tween−20を含むELISA洗浄バッファ
(R&D Systems、カタログ#WA126)で3回洗浄した後、PBS中に1%
BSA5を含むReagent Diluent(R&D Systems、カタログ
#DY995)の300μL/ウェルで阻害した。)。競合結合については、BCMA抗
体を100μmの容量でプレートに添加し、APRIL添加前に30分間インキュベート
した。30分後、ウェルあたり1ngのAPRILを添加し、プレートを4℃で一晩イン
キュベートした。未結合のAPRILをELISA洗浄バッファで洗浄し、結合したビオ
チン化APRILを、SA−HRP複合体を用いて450nMの光学濃度で検出した。
特性試験の完了後、以下の特徴を有するように、M2ハイブリドーマから得られた抗体
(BCMB69と命名)を決定した。
・組換えヒトBCMAに結合する
・組換えカニクイザルBCMAに結合する
・マウスBCMAへの弱い結合性を示す
・フローサイトメトリーにより測定するとき、HEK発現ヒトBCMA及びHEK発現
カニクイザルBCMAの両方に結合する
・BCMA(U2392、EJM、MMIR、U266、OPM2、及びRPMI−1
8226)を発現するヒトがん株に結合する
・IC50=5.9nMでAPRIL結合を阻害する
結果として、BCMA×CD3二重特異性抗体を作製するために、BCMB69(表4
及び表5)を発現させ、精製した。
抗体/抗原相互作用を原子的詳細において特徴付け、抗体の作用機序の理解を深め、い
ずれか必要な抗体操作の試行を支持するために、1つの抗BCMA抗体(BCMB69)
の結晶構造を遊離Fab形態並びにヒトBCMAに結合した場合において決定した。
Hisタグを付けたBCMA Fab(配列番号75及び76、以降は単にBCMB6
9 Fabとする)をHEK293細胞で発現させ、親和性及びサイズ排除クロマトグラ
フィーを使用して精製した。Fabを130mM NaCl、20mM MES(pH7
.4)中に得た。
降は単にBCMAとする)をバキュロウイルス系を用いて発現させ、親和性及びサイズ排
除クロマトグラフィーにより精製した。タンパク質を50mM NaCl、20mM T
ris(pH8)中に得た。
BCMA/BCMB69 Fab複合体
BCMAとBCMB69 Fabとを3.8:1のモル比(BCMA過剰)で4℃で約
16時間混合し、一方で20mM Hepes(pH7.5)にバッファ交換することに
より、Fab/抗原複合体を調製した。°その後、20mM Hepes(pH7.5)
中で51〜63mM NaClのグラジエントを用いて複合体をモノS 5/50カラム
から溶出させ、17mg/mLに濃縮した。X線回折に適した結晶を、マイクロ播種を用
いたシッティングドロップ蒸気拡散法を20℃で使用して、25%PEG 3kDa、0
.2M MgCl2、0.1M Mes(pH6.5)から得られた。
BCMB69 Fabを更に精製することなく9mg/mLに濃縮した。X線回折に適
した結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散法を20℃で用いて、2M(NH4)2SO
4、5%MPD、0.1M Mes(pH6.5)から得た。
X線データ収集のため、結晶を、20%グリセロールを添加した対応する母液を含むク
ライオプロテクタント溶液中に数秒間浸漬した後、液体窒素中で瞬間凍結した。BCMA
/BCMB69複合体のX線回析データは、Canadian Light Sourc
e(CLS)のビームラインCMCF−08IDでRayonix 300HS CCD
検出器を使用して収集したが、遊離BCMB69 FabのX線データは、Argonn
e National LaboratoryのAdvanced Photon So
urce(APS)のビームライン17−IDでDectris Pilatus 6M
Pixel Array検出器を使用して収集した。回折データをプログラムHKLで
処理した(Otwinowski,Z.& Minor,W.(1997).Proce
ssing of X−ray diffraction data collecte
d in oscillation mode.Methods in Enzymol
ogy 276:307〜326.)。
.(2001).Pushing the boundaries of molecu
lar replacement with maximum likelihood.
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57:1
373〜82)。遊離Fab構造の場合、MRの探索モデルは、抗インフルエンザヘマグ
ルチニン5j8 Fab(PDBコード:4M5Y)であった。BCMA/Fab複合体
の場合、MRの探索モデルは、BCMAの結晶構造(PDBコード:1XU2)及びBC
MB69遊離Fab構造であった。構造を、PHENIXを用いて微細化し(Adams
,P.D.,Gopal,K.,Grosse−Kunstleve,R.W.,Hun
g,L.W.,Ioerger,T.R.,McCoy,A.J.,Moriarty,
N.W.,Pai,R.K.,Read,R.J.,Romo,T.D.,Sacche
ttini,J.C.,Sauter,N.K.,Storoni,L.C.& Ter
williger,T.C.(2004).Recent developments
in the PHENIX software for automated cry
stallographic structure determination.J
Synchrotron Radiat 11:53〜5.)、COOTを使用してモデ
ル調整を行った(Emsley P.& Cowtan,K.(2004).Coot:
Model building tools for molecular graph
ics.Acta Crystallogr.D60:2126〜2132)。他の全て
の結晶学的計算は、CCP4のプログラムスイートを用いて行った(Collabora
tive Computational Project Number 4,1994
)。全ての分子グラフィックはPyMolを用いて生成した(DeLano,W.(20
02).The PyMOL molecular graphics system.
Palo Alto,CA,USA;Delano Scientific)。
BCMB69は、BCMAのβ−ヘアピン領域内の残基(残基Y13−H19)及びヘ
リックス−ループ−ヘリックス領域内の残基(残基L26、R27、及びN31−L35
)から構成される立体構造エピトープを認識する(図3及び4)。BCMB69エピトー
プは、BCMA上の約830Å2の面積からなり、リガンド結合DXLモチーフ(β−ヘ
アピンのI型ターン内の残基D15−L18)を含み、これは抗体の相補性決定領域(C
DR)に覆われた浅い空洞内に突き出している。DXLターンの先端にあるロイシン17
は、抗体の空洞内に完全に埋没し、BCMB69との広範な相互作用を有する。別の主要
なエピトープ残基はArg27であり、これは310−ヘリックスh1上にあり、重鎖C
DRといくつかの水素結合接触を形成する。
(図2及び3)。重鎖は、軽鎖と比較して2倍のBCMAとの接触数を有する。CDR−
H3のループ先端にある小さな側鎖(102−GAVAG−106)(配列番号77)は
、CDR−H3のBCMAへの挿入と、広範な抗体/抗原接触の達成とに役立つ(CDR
−H3により全接触の40%が形成される)。BCMB69 CDRは、BCMAの椅子
状構造の凹状表面上に集まっており、CDR−L2(残基Y48、D52、P54、S5
5)、CDR−H1(残基G32−Y34)、及びCDR−H3(D101、A103、
V104、Y110)は、h1ヘリックス及びh1h2ループにより形成される「シート
」に接触しているが、CDR−L3(残基W90、S92、D95)、CDR−H1(F
35)、CDR−H2(Y54、Y60)、及びCDR−H3(H100、G102、A
103、A105)は、BCMAのβ−ヘアピンにより形成される「バック」と相互作用
する。「椅子の脚」(h2ヘリックス)にある唯一のエピトープ残基であるLeu35は
、CDR−L2の残基D52とのファンデルワールス接触を有する。
抗体又はリガンドがBCMAに結合するのに利用できる表面は限られている。BCMB6
9エピトープ残基のほとんどは、APRIL(14のエピトープ残基のうちの12)及び
BAFF(14の残基のうちの9)にも結合する残基である。BCMAの最も高親和性の
リガンドであるAPRILの場合、共用されないエピトープ残基はF14及びS16だけ
であるが(図2B)、BAFFでは、非共用残基はF14、L26、T32、P33、及
びL35である。DXLループは、リガンド及びBCMB69の両方により埋没される。
BCMB69は、MMがん細胞に対するT細胞のリダイレクトに関する候補である。B
CMB69×抗CD3二重特異性抗体により媒介されるがん細胞の殺傷は、BCMB69
エピトープの構造及び位置により弱められるとは推測されない。エピトープの接触可能位
置は、BCMB69 Fabアームを膜結合型BCMAに結合させるが、他方のFabア
ームは、依然としてT細胞膜内のCD3に結合している。
のAPRIL及びBAFFシグナル伝達経路を途絶させることもできる。BCMA/BC
MB69構造のBCMA/APRIL及びBCMA/BAFF構造へのオーバーレイ(L
iu,Y.,Hong,X.,Kappler,J.,Jiang,L.,Zhang,
R.,Xu,L.,Pan,C.H.,Martin,W.E.,Murphy,R.C
.,Shu,H.B.,Dai,S.& Zhang,G.(2003).Nature
423:49〜56;Hymowitz,S.G.,Patel,D.R.,Wall
weber,H.J.A.,Runyon,S.,Yan,M.,Yin,J.,Shr
iver,S.K.,Gordon,N.C.,Pan,B.,Skelton,N.J
.,Kelley,R.F.& Starovasnik,M.A.(2005).J.
Biol.Chem.280:7218〜7227.)は、BCMB69及びAPRIL
、BAFF間のクラッシュ領域を示し(図2B並びに図4A及び4B)、BCMAが抗体
及び天然リガンドに同時に結合できなくする。APRIL及びBAFFは、TACI及び
BAFF−Rなどの他の受容体を使用してシグナルを送ることができ、BCMAノックア
ウトマウスは依然として生存することができる。したがって、BCMAの閉塞によるAP
RIL及びBAFF活性の阻害は、MM患者にとって決定的な毒性ではないことがある。
非結合BCMB69可変ドメインの翻訳後修飾モチーフ及び凝集リスクの計算評価は、
D101−G102残基(CDR−H3)の異性化の媒体リスクと、凝集リスクを有し得
るCDR領域内の486Å2の疎水性パッチとを示す。パッチ内で最も露出した疎水性残
基は、I58(CDR−H2)、F35(CDR−H1)、及びV104(CDR−H3
)である(V104は、Fv相同性モデルには関連したが、Fab結晶構造には関連しな
かった)。BCMB69可変ドメインにおける異性化及び凝集リスクを排除するために、
様々な突然変異を合理的に設計した(表7)。
び表9に示す。
うに精製し、実施例4に記載したようにフローサイトメトリーによりBCMA発現細胞へ
の結合性について特徴付けた。28の変異体のうちの7つは、BCMAを発現している細
胞に結合したことから、BCMA×CD3二重特異性パネルを作製するために先に進めた
。
におけるBCMA及びCD3抗体の調製
BCMA抗体は、Fc置換S228P、L234A、及びL235A(EUインデック
スによる番号付け)を有するIgG4として発現された。配列番号55及び配列番号56
の配列をそれぞれ有する重鎖及び軽鎖を含む、単特異性抗CD3抗体のCD3B19も生
成した。
る標準的な方法を使用して、単特異性抗体を精製した。溶出後、プールを、D−PBS、
pH7.2内へ透析した。
れたような)インビトロでのFabアーム交換において、単特異性CD3 mAbと単特
異性BCMA mAbとを組み合わせることにより生成した。簡潔に言えば、PBS(p
H7〜7.4)中の約1〜20mg/mLの抗BCMA/抗CD3抗体(モル比1:1)
(又は場合によっては、一方の親抗体を6%過剰にして、もう一方の抗体を激減させる)
と、75mM 2−メルカプトエタノールアミン(2−MEA)とを混合し、31℃で5
時間インキュベートし、ついで標準的な方法を使用して、透析、透析ろ過、タンジェント
流ろ過、及び/又は回転細胞ろ過により、2−MEAを除去した。カチオン交換(CEX
)HPLC又は疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)HPLCのいずれかにより
、二重特異性BCMA×CD3抗体の形成を分析する。望ましい場合には、二重特異性B
CMA×CD3抗体を分取CEX又はHICによりポリッシュし、残留親抗体を除去した
。
MB178は、CD3アームと組み合わせたときに発現が悪く、結果として、更なる特徴
付けを行わなかった。
表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して、CD3二重特異性抗体の生成に使用される
BCMA抗体のヒトBCMA親和性の値を測定した。SPRのために従ったプロトコルは
、実施例4に記載したプロトコルと同様であった。表11に示した結果は、全てのサンプ
ルが様々な親和性で単量体BCMA抗原に結合したことを示す。親mAb(BCMB69
)は、〜1.4nMの結合親和性を有した。BCMB117及びBCMB128は、BC
MB69の範囲内の親和性を有したが、BCMB123、BCMB129、BCMB17
6、及びBCMB177は、オフ速度が速いために比較的弱い親和性を有した(3〜15
倍)。データの再現性を評価するために、全てのサンプルを少なくとも3回実施し、標準
偏差を記録した。
重特異性抗体の親和性の値も測定した。表12の結果は、全てのサンプルが様々な親和性
でFc−BCMA抗原に結合したことを示す。BC3B7及びBC3B9は、ヒトBCM
Aに対してBCMB72の範囲内の親和性を有したが、残りの二重特異性抗体は、BCM
B72と比較すると2〜3倍弱い親和性を有した。カニクイザルFc−BCMAに対して
は、BC3B7及びBC3B9は、BCMB72より2〜3倍強い親和性を有したが(K
Dはそれぞれ0.65〜0.37nM)、残りのmAbは、BCMB72と同様の結合を
維持した(KDは〜0.8〜1.2nM)。データの再現性を評価するために、全てのサ
ンプルを少なくとも3回実施し、標準偏差を記録した。
(ヒト、カニクイザル、及びマウス)との結合親和性を、Biacore T200 s
ystem(GE Healthcare,NJ)を用いた表面プラズモン共鳴(SPR
)により測定した。
# BR−1005−31)のフローセル2、3、及び4を、それぞれビオチン化Fc−
融合ヒト、カニクイザル、又はマウスBCMAを用いて固定した(BCMA固定濃度は1
2〜16応答ユニット(RU);Fc−BCMAタンパク質:ヒト(R&D Syste
ms;Prod# 193−FC)、カニクイザル(自社製;Cat# BCMW6.0
01)、及びマウス(R&D Systems;Prod# 593−BC)を自社でビ
オチン化した)。フローセル1にはタンパク質を固定せず、参照表面として使用した。ラ
ンニングバッファ(PBS pH7.4、0.005%P20、3mM EDTA)で2
5℃において結合速度論試験を行った。BCMB72は、100nMから開始して5倍希
釈で0.16nMまでランニングバッファで調製した。これらの溶液を50μL/分で5
分間注入し(会合相)、ランニングバッファを流すことにより解離を15分間モニタした
。グリシン(pH1.5)の短時間注入及び100μL/分のランニングバッファにより
、チップ表面を再生した。BCMB72とFc−BCMAとの相互作用の結合速度論分析
は、検体注入の参照控除曲線からバッファ注入により作成された曲線を差し引くことによ
り、データの重複参照によって行った。センサーグラムの全体的速度論フィッティングは
、Two−State binding Model using Biacore T
200 Evaluation Software(GE Healthcare,NJ
)を使用して行った。異なるBCMA種のTwo−State結合モデルから得られた結
合親和性の結果を、最初の複合体(KD1)及び最終複合体(KD)として記録する(図
5)。
×CD3抗体の標的特異性T細胞活性化及び細胞傷害能
BCMA×CD3抗体により媒介されるT細胞の活性化を評価した。簡潔に言えば、B
CMB72(BCMA×CD3)及びコントロール抗体(BCMA×無及び無×CD3)
をPBSで800μg/mLに希釈した。96ウェルU底プレートにおいてPBSで4倍
系列希釈して用量設定を調製した。最後のカラムをPBSのみとして残した(溶媒コント
ロール)。
含まないRPMI 1640培地(培養培地)で、標的細胞を培養した。設定日(1日目
)には、標的細胞を計数し、1000万個の細胞を1350rpmで3分間遠心分離した
後、上清を捨てた。CellTrace FCSE増殖染料を18μLの無菌DMSOで
再構成し、この溶液の1μLを無菌PBSの10mLで希釈した。細胞ペレットを1mL
のCFSE希釈物で再懸濁し、直接光から覆って室温で8分間インキュベートした。イン
キュベーション後、1mLのHI FBSを細胞懸濁液に添加し、過剰なCFSEをクエ
ンチした。10%FBSを有するRPMI−1640で細胞を2回洗浄した。10mLの
RPMIで再構成した後、細胞を計数し、細胞生存性を集計表に記録した。細胞を2.2
×10^5/mLに希釈し、使用するまで37℃でインキュベートした。
L円錐バイアルに移し、15mLの低温培地で再構成した。ついで細胞を4℃において1
350rpmで3分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを5〜10mLの培地で
再構成した。T細胞を計数し、生存性を記録した。ついで細胞を培地で1.1×10^6
/mLに再構成した。
ロッカーを添加した(2mg/mLの最終濃度まで)。全ての細胞株を室温で10分間イ
ンキュベートし、Fc受容体活性を阻害した。1×10^5個のT細胞をウェルに添加し
た(5:1のエフェクター:標的比)。標的及びT細胞を混合した後、20μLのBCM
A×CD3抗体希釈物を各ウェルに添加した。プレートを37℃において5%CO2で4
8時間インキュベートした。
清を別のプレートに移し、サイトカイン放出アッセイ用に−80℃で保存した。細胞を2
00μLのPBSで洗浄し、50μLの近赤外Live/Dead染料(1:200希釈
物)及び抗CD25 PE抗体(1:50希釈物)で室温で20分間インキュベートした
。その後、細胞を200μLのFACSバッファで1回洗浄し、最後に150μLのFA
CSバッファで再構成した。標的細胞傷害性(標的%)及びT細胞活性化CD25+(生
存T細胞%)について、FACSCanto II及びFlowJo 7.6を使用して
細胞を分析した。データのグラフ化及びフィッティングは、最小2乗法を用いた可変勾配
(4パラメータ)関数を有する非線形回帰を使用してGraphPad Prism 6
で行った。
MB72が一貫して標的特異性T細胞活性化を促進することを示す。Fcブロッカーを使
用して、標的細胞への抗体のFc受容体依存性結合を防止した。概して、データ点は作成
したフィット曲線に沿ってぴったり並び、T細胞ドナー間のばらつきはほとんどなかった
。BCMA+細胞では45〜85%の最大活性化を達成し、BCMA−細胞では4〜10
%であった(バックグラウンド濃度に等しい)。複数の正常ドナー由来のT細胞を使用し
て2回の独立試験から得られたEC50及び最大T細胞活性化値の概要を図9に示す。
ことを示す。Fcブロッカーを使用して、標的細胞へのBCMB72のFc受容体依存性
結合を防止した。概して、データ点は作成したフィット曲線に沿ってぴったり並び、T細
胞ドナー間のばらつきはほとんどなかった。BCMA+細胞では62〜97%の最大溶解
を達成し、BCMA−細胞では4〜18%であった。複数の正常ドナー由来のT細胞を使
用して2回の独立試験から得られたEC50及び最大溶解値の概要を図11に示す。
2人の異なるドナーのT細胞を用いたBCMA+H929細胞での74〜83%のT細胞
活性化(図12B)とを示した。これらの6つのBCMA×CD3抗体分子は、0.04
〜0.09nMの範囲のEC50値でBCMA+標的細胞の殺傷に効力がある。
悪性バックグラウンドの種々のBCMA+細胞株に結合するBCMB72のEC50値
を評価した。簡潔に言えば、二重特異性抗体BCMB72(BCMA×CD3)をPBS
で750μg/mLに希釈した。96ウェルU底プレートにおいてPBSで3倍系列希釈
して用量設定を調製した。最後のカラムをPBSのみとして残した(溶媒コントロール)
。
含まないRPMI 1640培地(培養培地)で、H929標的細胞を培養した。アッセ
イについては、標的細胞の密度及び生存性を測定し、その後、細胞を4℃において100
0rpmで5分間遠心分離した。ついで細胞ペレットを10mLのPBSで洗浄し、再度
1000rpmで5分間遠心分離した。5.5×105細胞/mLで細胞をPBSで再懸
濁し、96ウェルU底プレートのウェルあたり90μLの細胞懸濁液を分取し、ついでB
CMB72希釈物の10μL/ウェルを分取した。プレートを4℃において暗所で1時間
インキュベートし、ついで1000rpmで5分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞ペレ
ットを200μLのFACSバッファで2回洗浄した。ヒトIgG4 Fcに対するPE
標識二次抗体をFACSバッファで1:25に溶解し、この混合液の50μLを対応する
ウェルに添加した。サンプルを4℃で20分間インキュベートし、上記のようにFACS
バッファで洗浄し、FACSCanto IIでの分析用に150μLのFACSバッフ
ァで再構成した。BCMB72の結合性についてFlowJo 7.6を使用してデータ
を分析し、データのグラフ化及びフィッティングは、最小2乗法を用いた可変勾配関数を
有する非線形回帰を使用してGraphPad Prism 6で行った。
ことができる。H929細胞に対する結合性のEC50は14.7nMであり、MM.1
R細胞に対しては9.74nM、EJM細胞に対しては17.5nM、LP1細胞に対し
ては22.3nM、及びU−2932細胞に対しては7.92nMであった。
CMB72の結合性の分析
白血球でのBCMAの発現及びBCMB72の結合性を、エクスビボで3人の正常ヒト
ドナー由来の全血において評価した。簡潔に言えば、正常ヒトドナー由来の新鮮末梢血を
試験前にヘパリン被覆管に保存した。血液を100μLの一定分量で96ウェルU底プレ
ートにピペットで移した。染色抗体を、試験の集計表に示したように、マスターミックス
で調製した。マスターミックスを、BCMAに対する抗体(すなわち、BCMB72)と
共に血液に直接添加した。室温で30分間のインキュベーション後、血液を有するプレー
トを4℃において1350rpmで3分間遠心分離した。上清血漿を捨て、ペレットを4
回連続繰り返して赤血球溶解に供し、各洗浄の間に5分間インキュベートした。溶解の完
了後、ペレットをPBSで1回洗浄し、ついで1:200のLive/Dead近赤外染
料及び1:50の抗IgG4 PE(BCMB72を有するウェルについてのみ)を有す
るPBSで染色した。プレートを更に室温で15分間インキュベートした。その後、サン
プルを200μLのFACSバッファで洗浄し、最後にLSRFortessaでの分析
用に150μLのFACSバッファで再構成した。各ウェルから約100,000のイベ
ントを収集した。分析をFlowJo 7.6で行った。
顆粒球、又は形質細胞様DCで観察された。BCMB72は、3人の全てのドナーでCD
3+T細胞に対する結合性を示したが、ドナー間で強度が異なった。BCMB72は、こ
のアッセイで試験した他のいずれの細胞種にも結合しなかった。
T細胞媒介性殺傷アッセイから得られた上清におけるサイトカインプロファイルを、B
CMB72及びコントロール抗体を使用して評価した。T細胞及び抗体を、T細胞媒介性
細胞傷害アッセイで行ったように播種した(実施例10参照)。48時間のインキュベー
ション後、細胞上清を採取し、MSDに基づくELISAを使用して異なる(10/30
Plex)サイトカインを測定した。サイトカイン濃度をpg/mLとして表し、データ
のグラフ化及びフィッティングは、可変勾配(4パラメータ)関数を有する非線形回帰を
使用してGraphPad Prism 6で行った。6人のT細胞ドナーを用いたRP
MI8226細胞株から得た6種類のサイトカインのEC50値を図13に示す。データ
は、T細胞の活性化から得られた有意なサイトカイン放出を示す。コントロール抗体では
、サイトカイン放出が少ない/ないことが観察された(データは示していない)。
生(一過性&安定細胞株)BCMB72の機能性比較
異なる細胞において及び異なる発現方式の下で産生された二重特異性抗体は、活性が異
なり得る。したがって、HEK細胞(一過性発現)又はCHO細胞(一過性若しくは安定
発現)で産生されたBCMB72のインビトロでの有効性を評価した。
ウェルU底プレートにおいてPBSで3倍又は4倍系列希釈のいずれかで用量設定を調製
した。最後のカラムをPBSのみとして残した(溶媒コントロール)。
含まないRPMI 1640培地(培養培地)で、H929標的細胞を培養した。設定日
(1日目)には、細胞を計数し、1000万個の細胞を1350rpmで3分間遠心分離
し、上清を捨てた。CellTrace FCSE増殖染料を18μLの無菌DMSOで
再構成し、この溶液の1μLを無菌PBSの10mLで希釈した。H929細胞ペレット
を1mLのCFSE希釈物で再懸濁し、直接光から覆って室温で8分間インキュベートし
た。インキュベーション後、1mLのHI FBSを細胞懸濁液に添加し、過剰なCFS
Eをクエンチした。10%FBSを有する1640 RPMIで細胞を2回洗浄した。1
0mLのRPMIで再構成した後、細胞を計数し、細胞生存性を集計表に記録した。細胞
を指示濃度に希釈し、使用するまで37℃でインキュベートした。
バイアルに移し、15mLの低温培地で再構成した。ついで細胞を4℃において1350
rpmで3分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを5〜10mLの培地で再構成
した。T細胞を計数し、適切な濃度に培地で再構成した(各試験の集計表参照)。
的比)。この試験一式では、Fcブロッカーは使用しなかった。標的及びT細胞を混合し
た後、20μLのBCMB72希釈物を各ウェルに添加した。プレートを37℃において
5%CO2で48時間インキュベートした。
セイ用に保存した。細胞を200μLのPBSで洗浄し、50μLの近赤外Live/D
ead染料(1:200希釈物)及び抗CD25 PE抗体(1:50希釈物)で室温で
20分間インキュベートした。その後、細胞を200μLのFACSバッファで1回洗浄
し、最後に150μLのFACSバッファで再構成した。細胞は、同日にFACSCan
to IIを使用してフローサイトメトリーを実施し、標的細胞傷害性(標的%)及びT
細胞活性化CD25+(生存T細胞%)についてFlowJo 7.6で分析した。デー
タのグラフ化及びフィッティングは、可変勾配(4パラメータ)関数及び最小2乗法を用
いた非線形回帰を使用してGraphPad Prism 6で行った。
されたBCMB72は、T細胞リダイレクトアッセイにおいて標的細胞に対する細胞障害
性及びT細胞に対する刺激の点で、実質的に同様に機能した。85%の最大殺傷及び80
%のT細胞活性化を概ね達成した。細胞傷害性の平均EC50値は、HEK細胞で産生さ
れたBCMB72では0.29nM、CHO細胞で産生されたBCMB72では0.42
〜0.47nMであった。T細胞活性化の平均EC50値は、HEK細胞で産生されたB
CMB72では0.28nM、CHO細胞で産生されたBCMB72では0.37〜0.
41nMであった。Student’s T−testを使用した比較分析は、EC50
値間に統計的有意性を示さなかった。
BAFF及びAPRILは共に、2つの受容体BCMA(B細胞成熟抗原、TNFRS
F 17)及びTACI(膜貫通活性化因子及びCAML相互作用体、TNFRSF 1
3b)に結合する。BCMAの結合は、JNK及びP38 MAPKシグナル伝達経路を
活性化する。BCMA×CD3二重特異性抗体のBCMB72は、BCMAに向けてアゴ
ニスト作用を及ぼし得る可能性がある。この試験は2つの部分を含んだ。1.APRIL
又はBAFF処理後のH929又はMM1.R細胞におけるP38a MAPKの変化を
モニタするために、簡単なウエスタン分析アッセイを開発すること。2.新たに開発され
たアッセイを使用して、BCMB72がBCMAに向けていずれかのアゴニスト作用を有
するかどうかを調べること。
H929又はMM1.R細胞を、処理前に37℃において5%CO2の存在下で24時
間、血清を含まないRPMI培地に1.5e6/mLで播種した。処理日に、細胞を遠沈
させ、血清を含まないRPMI中に1.5e6/mLで再懸濁した。経時変化アッセイで
は、細胞を10本の管に管あたり5mLを分取した。各管の細胞を、1000ng/mL
のAPRIL(R&D Systems、カタログ#5860−AP−010)又は10
00ng/mLのBAFF(R&D Systems、カタログ#2149−BF−01
0)を用いてそれぞれ0、5、15、30、及び60分間、37℃において5%CO2の
存在下で処理した。インキュベーション後、細胞を直ちにペレット状にし、細胞溶解物を
形成するために−80℃で凍結した。BCMB72のアゴニスト作用アッセイについて、
H929細胞処理群を表13に列記した。BCMB72のアゴニスト作用アッセイは2回
行った。
ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を含むRIPAバッファで細胞を溶解した。タ
ンパク質濃度を、BioRad DC Protein Assay(BioRad #
500−0112)及びウシ血清アルブミン標準を用いてSpectraMax Plu
s 384マイクロプレートリーダー(Molecular Devices,Sunn
yvale,CA,USA)で測定した。
Simple Western分析を、ProteinSimpleユーザーマニュア
ルに従ってWes−Rabbit(12−230KDa)Master kit(Pro
teinSimple #PS−MK01)を用いて行った。簡潔に言うと、細胞溶解物
サンプルをマスターミックスと混合して、1×サンプルバッファ、1×蛍光分子量マーク
、及び40mMジチオスレイトール(DTT)の最終濃度にし、ついで95℃で5分間加
熱した。サンプル、阻害試薬、一次抗体蛍光体−p38 MAPK(ThermoFis
her:VWR# MA5−15182)又はActin−beta(Cell Sig
naling,#8457S)、HRP結合二次抗体、化学発光基質、並びに分離及び積
層マトリックスを、Simple Wesマイクロプレート内の指定のウェルに分配し、
プレートの読み込み後、分離電気泳動及び免疫検出工程をキャピラリーシステムで実施し
たが、これらは完全自動化であった。電気泳動中、タンパク質は、積層及び分離マトリッ
クスにより分子量に基づいて分離され、独自の光活性化捕獲化学を用いてキャピラリー壁
に固定された。一次抗体を抗体希釈剤II(ProteinSimple #042−2
03)で1:50に希釈した。標的タンパク質を、一次抗体で60分間、ついでHRP結
合二次抗体を用いて免疫学的検出を行った。Simon−simple Western
分析を室温で行い、機器のデフォルト設定を使用した。デジタル画像をCompassソ
フトウェア(ProteinSimple)を用いて分析し、検出タンパク質の定量デー
タを分子量、シグナル/ピーク強度、及びピーク面積として記録した。
経時変化試験から得られた情報に基づいて、15分間のインキュベーション終点を使用
してH929細胞でBCMB72アゴニストアッセイを行った。p38 MAPKシグナ
ルをヒトベータアクチンシグナルにより正規化した。2つのアッセイから得られた正規化
p38 MAPKシグナルの平均を図15に示す。BCMB72アゴニストアッセイは、
BCMB72がH929細胞においてBCMAに向けたアゴニスト作用を有していないこ
とを実証した。
BCMAは、内因性リガンドに応答してNF−κBシグナル伝達を生じさせ得る表面受
容体である。NF−κB経路活性化におけるBCMAに結合したBCMB72の影響を、
NFκBプロモータの下でアルカリホスファターゼ(SEAP)を発現するBCMA発現
レポーター細胞株を使用して評価した。
した。試験前夜に、細胞をトリプシン処理(37℃に予め加温した0.25%トリプシン
中に5分)により採取し、30mLの培養培地で洗浄した。ついで細胞を4℃において1
000rpmで5分間遠心分離し、血清を含まないDMEM(GlutaMAX含有)で
2.5×10^5細胞/mLに再構成した。5×10^4個の細胞を96ウェル平底プレ
ートのウェルに添加し、37℃で16時間インキュベートした。
添加し(試験プレートマップ参照)、プレートを37℃で更に16、24、又は48時間
インキュベートし、これらはそれぞれ早期、中期、及び後期のシグナル伝達時点を表した
。各時点の後、10μLの馴化培養培地をウェルから収集し、SEAPキット(Caym
an,600272)内で提供される96ウェル固体プレートに移し、蓋で覆った。SE
AP標準は、バルク標準(5U/mL)を、血清を含まないDMEM(GlutaMAX
含有)で1:10に希釈することにより調製し、ついで1:2の系列希釈を調製した。希
釈範囲は50〜0.78mU/mLである。サンプルを有するプレートを65℃で30分
間インキュベートし、内因性アルカリホスファターゼを不活性化した。このアッセイで発
現されたSEAPは、これらのインキュベーション条件下で安定である。プレートを室温
でインキュベートした後、10μLの標準希釈物を適切なウェルに添加した。50μLの
基質溶液を全てのウェルに添加し、サンプルを軽く撹拌し、溶液をウェルに分配した。サ
ンプルを20〜30分間インキュベートし、PerkinElmer EnVision
2104 Multilabel Readerを使用して化学発光を評価した。化学
発光の読取値を標準曲線に基づいて活性単位濃度に変換し、値をMicrosoft E
xcel 2010で分析し、グラフ分析用にGraph Prism 6にインポート
した。
、概してBCMB72は10nM未満の濃度ではBCMA形質導入細胞でNF−κB経路
を活性化しなかったことを実証する。高BCMB72濃度(44〜133nM)では、中
程度のBCMB72依存性活性化が観察された。
外部添加の影響
BCMAの細胞外ドメイン(ECD)は、溶液中で三量体を形成し得る。したがって、
多数の二重特異性抗体が、標的細胞の不在下でBCMA ECD三量体及び架橋TCR複
合体に結合できる可能性がある。これは同様にして、標的非依存性でT細胞を活性化し得
る。この試験は、外部添加したBCMAのECDが、標的細胞との相互作用なしにCD2
5発現濃度でT細胞活性化を誘発し得るかどうかを調べた。
μg/mLに希釈した。96ウェルU底プレートにおいてPBSで3倍系列希釈して用量
設定を調製した。最後のカラムをPBSのみとして残した(溶媒コントロール)。
希釈した。96ウェルU底プレートにおいてPBSで3倍系列希釈して用量設定を調製し
た。上部のウェルをPBSのみとして残した(溶媒コントロール)。
L円錐バイアルに移し、30mLの低温培地で再構成した。ついで細胞を4℃において1
350rpmで3分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを10mLの培地で再構
成した。T細胞を計数し、生存性を記録した。ついで細胞を培地で0.525×10^6
/mLに再構成した。
希釈物及び5μLのBCMB72希釈物を添加した。プレートを37℃において5%CO
2で48時間インキュベートした。
細胞ペレットを200μLのPBSで洗浄し、50μLの近赤外Live/Dead染料
(1:200希釈物)及び抗CD25 PE抗体(1:50希釈物)で室温で20分間イ
ンキュベートした。その後、細胞を200μLのFACSバッファで1回洗浄し、最後に
150μLのFACSバッファで再構成した。T細胞活性化CD25+(生存T細胞%)
について、FACSCanto II及びFlowJo 7.6を使用して細胞を分析し
た。データのグラフ化及びフィッティングは、最小2乗フィッティング法を用いた非線形
回帰を使用してGraphPad Prism 6で行った。
を示さなかった。高濃度(>40nM)のBCMB72では、sBCMA非依存性におい
て、T細胞の低パーセンテージの弱い活性化(10〜15%)が観察された(図17)。
ECD、APRIL、及びBAFFの影響
可溶性BCMA ECDは、BCMA×CD3抗体のシンクとして働き得るが、APR
IL及びBAFFは、表面受容体とBCMA×CD3抗体との相互作用の競合的阻害剤で
あり得る。BCMB72依存性細胞殺傷のインビトロでの細胞傷害能における可溶性BC
MA ECD並びに内因性リガンドAPRIL及びBAFFの影響を、固定細胞株H92
9及び正常ドナーM7077由来の汎T細胞を用いたT細胞リダイレクトアッセイで評価
した。
てPBSで3倍系列希釈して用量設定を調製した。最後のカラムをPBSのみとして残し
た(溶媒コントロール)。可溶性BCMA ECDを9μg/mLに希釈し、APRIL
及びBAFFを10μg/mLに希釈した。96ウェルU底プレートにおいてPBSで3
倍系列希釈して、両方の試薬の用量設定を調製した。
含まないRPMI 1640培地(培養培地)で、H929標的細胞を培養した。設定日
(1日目)には、標的細胞を計数し、1000万個の細胞を1350rpmで3分間遠心
分離した後、上清を捨てた。CellTrace FCSE増殖染料を18μLの無菌D
MSOで再構成し、この溶液の1μLを無菌PBSの10mLで希釈した。細胞ペレット
を1mLのCFSE希釈物で再懸濁し、直接光から覆って室温で8分間インキュベートし
た。インキュベーション後、1mLのHI FBSを細胞懸濁液に添加し、過剰なCFS
Eをクエンチした。10%FBSを有するRPMI−1640で細胞を2回洗浄した。1
0mLのRPMIで再構成した後、細胞を計数し、細胞生存性を集計表に記録した。細胞
を2.2×10^5/mLに希釈し、使用するまで37℃でインキュベートした。
L円錐バイアルに移し、30mLの低温培地で再構成した。ついで細胞を4℃において1
350rpmで3分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを10mLの培地で再構
成した。T細胞を計数し、生存性を記録した。ついで細胞を培地で1.1×10^6/m
Lに再構成した。
験では、Fcブロッカーを用いたインキュベーションは必要なかった。1×10^5個の
T細胞をウェルに添加した(5:1のエフェクター:標的比)。標的及びT細胞を混合し
た後、20μLのsBCMA、APRIL、又はBAFFのいずれかをウェルに添加し、
ついで5μLの抗体希釈物を添加した。プレートを37℃において5%CO2で48時間
インキュベートした。
細胞を200μLのPBSで洗浄し、50μLの近赤外Live/Dead染料(1:2
00希釈物)及び抗CD25 PE抗体(1:50希釈物)で室温で20分間インキュベ
ートした。その後、細胞を200μLのFACSバッファで1回洗浄し、最後に150μ
LのFACSバッファで再構成した。標的細胞傷害性(標的%)及びT細胞活性化CD2
5+(生存T細胞%)について、FACSCanto II及びFlowJo 7.6を
使用して細胞を分析した。データのグラフ化及びフィッティングは、最小2乗法を用いた
可変勾配(4パラメータ)関数を有する非線形回帰を使用してGraphPad Pri
sm 6で行った。
すことができ、高用量(>160nM)のBCMA ECDでEC50にごくわずかな影
響(2倍上昇)があった。T細胞活性化も同様に影響を受けた(図18A及び18D参照
)。APRILは、細胞傷害性及びT細胞活性化のEC50値を高用量(46nM)で6
倍に上昇させたが、より低い用量ではアッセイに与えた影響は最小限であった(図18B
及び18E参照)。最大殺傷は、sBCMA又はAPRILにより影響を受けなかった。
対照的に、外因性BAFFは、51nM以下の濃度でBCMB72媒介性細胞傷害に影響
を与えなかった(図18C参照)。全ての事例におけるT細胞活性化能は、予想どおり殺
傷データとよく相関した(図18F参照)。
びBAFFの競合
2つのTNFリガンド、APRIL及びBAFFは、BCMAに結合し、シグナル伝達
カスケードを誘発し、細胞の生存及び増殖をもたらし得る。BCMAの細胞外ドメインは
、これら2つのリガンド、並びにこのモチーフに対して挙げられた抗体に結合する、短い
54個のアミノ酸フラグメントである。ここでは、これらのリガンドのBCMB72に対
する競合性を評価した。
、BCMA−FcをMSD SulfoTagで標識した。BCMA−Fcの50μgバ
イアルを500μLのPBSで再構成し、0.1mg/mL(3.125μMの単量体)
を得た。150nモルのNHS−sulfoTagを50μLの水に溶解し、3mMの溶
液を得た。10×過剰の標識反応のために、5.2μLの3mM NHS−SulfoT
ag(15.6nモル)を500uLのBCMA−Fc(1.56nモルの単量体)に添
加した。暗所において室温で2時間反応させた。50μLの1Mトリスを添加し、未反応
NHSをクエンチした。過剰なSulfotag及びトリスを、PBSで平衡化した2m
L 7k MWCO Zebaスピンカラム上でのバッファ交換により除去した。最終容
量は〜630μLであり、したがって最終SulfoTag−BCMA−Fcを2.5μ
Mとして使用した。
を200μLのPBSで再構成し、0.5mg/mLの原液を得た。30μL(6μg)
の抗APRIL及び抗BAFFを、2.97mLのPBSでそれぞれ希釈し、2μg/m
Lの溶液を得た。96ウェルMSD高結合プレートの各ウェルに、25μLの2μg/m
L抗APRILを添加した。第2の96ウェルMSD高結合プレートの各ウェルに、25
μLの2μg/mL抗BAFFを添加した。プレートを一晩、4℃に維持し、抗体を固定
した。抗APRIL及び抗BAFFで被覆されたプレートの中身を捨て、ウェルあたり3
00μLのSuperBlockを添加した。室温で1時間阻害後、プレートをPBS−
Tで3回洗浄した。10μgの各組換えAPRIL及びBAFFを100μLのPBSで
再懸濁し、0.1mg/mLの溶液を得た。各APRIL及びBAFFの3mLの2μg
/mL溶液を、新たに再構成したタンパク質の60μLを2.94mLのSuperBl
ockで希釈することにより作製した。25μLの2μg/mL APRILを抗APR
IL被覆プレートの各ウェルに添加し、25μLの2μg/mL BAFFを抗BAFF
被覆プレートの各ウェルに添加した。室温で1時間捕捉後、プレートをPBS−Tで3回
洗浄した。500μgの抗BCMA(R&D Sys Mab193)を1mLのPBS
で再構成し、0.5mg/mL(3.3μM)の原液を得た。抗BCMA Mab193
、BCMB72.004、及びコントロール抗体(無×CD3)をSuperBlock
で1μMに希釈した。100μLの抗体を200μLのSuperBlockに混合する
ことにより、11ptの3倍系列希釈系を調製した。6mLの30nM SulfoTa
g−BCMA−FCを、72μLの上記タンパク質を5.928mLのSuperBlo
ckで希釈することにより調製した。25μLのステップ11の各抗体を、以下の図1の
プレートマップに従ってAPRIL/BAFF捕捉プレートの各ウェルに添加した。25
μLの30nM SulfoTag−BCMA−Fcを両方のプレートの各ウェルに添加
した。室温で1時間後、プレートをPBS−Tで3回洗浄した。150μLの1×MSD
リードバッファTを各ウェルに添加し、プレートをセクタ6000イメージャでスキャン
した。上記のように正確に試験を繰り返し、第2の独立した一連の結果を得た。
ントロール抗体(無×CD3)では見られないが、BCMA−Fcタンパク質は、プレー
ト結合APRIL及びBAFFへの結合が妨げられた。観測結果は、それぞれ3回の繰り
返しを有する2回の独立試験で一致した。
び細胞傷害性
多発性骨髄腫患者由来の一次サンプルにおけるBCMB72の能力を評価するために、
5人の患者由来の凍結骨髄の多発性骨髄腫サンプル及び健康ドナー由来のT細胞を使用し
た細胞傷害性殺傷アッセイでこの抗体を試験した。抗体結合性及びT細胞活性化能も測定
した。
96ウェルU底プレートにおいてウェルあたり100μLの細胞懸濁液を分取し、つい
で95μLの培地を分取した。次に、5μLのBCMB72の系列希釈又はコントロール
をウェルに添加し、プレートを4℃で1時間インキュベートした。染色後、細胞を1,2
00rpmで3分間遠心分離し、200μLのPBSで1回洗浄した。細胞を再度遠心分
離し、上清を捨てた後、ペレットを50μLの近赤外Live/Dead染料(1:20
0希釈物)、抗ヒトIgG4 Fc PE抗体(1:50希釈物)、抗CD138(MI
15 1:50希釈物及びDL−101 1:50希釈物)で再構成し、暗所において室
温で20分間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離し、200μLのFACSバ
ッファで洗浄し、最後に150μLのFACSバッファで再構成した。CD138+ M
NCでのBCMB72の結合強度について、FACSCanto II及びFlowJo
7.6を使用してサンプルを分析した。データのフィッティングは、最小2乗法を用い
た可変勾配(4パラメータ)関数を有する非線形回帰を使用してGraphPad Pr
ism 6で行った。
1×10^5個の標的細胞を96ウェルU底プレートのウェルに添加し、ついで1×1
0^5個のT細胞を添加した(5:1のおよそのエフェクター:標的比、ただし、骨髄由
来の肥満細胞中の形質細胞計数を平均20%とする)。標的及びT細胞を混合した後、5
μLのBCMB72希釈物を各ウェルに添加した。プレートを37℃において5%CO2
で48時間インキュベートした。
50μLの近赤外Live/Dead染料(1:200希釈物)を有するPBS、抗CD
138(MI15 1:50希釈物及びDL−101 1:50希釈物)、抗TCR α
/β(1:50希釈物)、及び抗CD25 PE(1:50希釈物)で室温で20分間イ
ンキュベートした。その後、細胞を200μLのFACSバッファで1回洗浄し、最後に
150μLのFACSバッファで再構成した。形質細胞傷害性(死滅CD138+細胞%
)及びT細胞活性化CD25+(生存T細胞%)について、FACSCanto II及
びFlowJo 7.6を使用して細胞を分析した。データのグラフ化及びフィッティン
グは、最小2乗法を用いた可変勾配(4パラメータ)関数を有する非線形回帰を使用して
GraphPad Prism 6で行った。
図20は、CD138+形質細胞の喪失により立証されるように、BCMB72が48
時間後に用量依存的に全ての患者サンプルに結合し、その殺傷を誘発したことを示す。T
細胞活性化データは、予想どおり殺傷データとよく相関している。T細胞活性化の平均E
C50は、1nMの範囲内であった。これらのデータは、BCMB72がインビトロで原
発性多発性骨髄腫の骨髄細胞を殺傷できることを立証している。
腫瘍形成予防におけるBCMB72の抗腫瘍効果
この試験は、PBMC(末梢血単核球)ヒト化NSG(NOD SCID Gamma
)マウスでのH929ヒト多発性骨髄腫(MM)異種移植片の腫瘍形成予防におけるBC
MB72の効果を評価した。NSGマウスは、成熟機能性T細胞、B細胞、及びナチュラ
ルキラー(NK)細胞を欠失する免疫不全状態株である。試験7日前に、同齢雌NSGマ
ウスに1×107個のヒトPBMCを静脈内注射した。PBMC接種後1日目に、各マウ
スにH929ヒトMM細胞(200μLのPBS中に5×106個の細胞)を右後背面脇
腹に皮下移植し、ついでPBS並びにBCMB72 0.1μg(0.005mg/kg
)、0.5μg(0.025mg/kg)、及び1μg(0.05mg/kg)/動物を
静脈内(IV)投与した。合計5つの治療について、PBSコントロール及びBCMB7
2を1日おき又は2日おきに投与した。H929 sc腫瘍は、腫瘍細胞移植後、早けれ
ば8日目にPBS及び0.1μg BCMB72治療群で検出可能であった。これら2つ
の群の腫瘍は、22日目に平均腫瘍体積が>500mm3になるまで成長し続けた。24
日目までに、PBSコントロール群の平均腫瘍体積は1000mm3を超えていた。興味
深いことに、sc H929腫瘍は、0.5μg及び1μgのBCMB72で治療したマ
ウスでは成長しなかった(図21)。したがって、BCMB72は、0.5及び1μg/
動物で治療した全ての動物でH929ヒトMM異種移植片の腫瘍形成を阻害した。
ト多発性骨髄腫細胞)異種移植片由来のマウス血清中の可溶性BCMAの定量
この試験は、H929異種移植片マウス由来の血清中の可溶性BCMA濃度を定量する
ために、及び可溶性BCMA濃度をこれらの動物における腫瘍の負担に相関させるために
設計された。
得られるBCMA酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)により分析した。血清を解凍し
、希釈用試薬で1:50に希釈し、4℃で一晩インキュベートした。BCMA ELIS
Aを製造業者のプロトコルに従って実施した。ELISAプレートを、450nmに設定
したMD SpectraMaxプレートリーダーM5(Molecular Devi
ces,Sunnyvale CA)を使用して分析した。ELISA内の各ウェルは、
元の異種移植片試験の一匹のマウス由来の血清に対応する。
MA濃度は、PBSのみ又はBCMB72の0.1μg/マウスと比較するとき、有意な
低下があった(図22)。これらのデータは、BCMB72の1μg及び0.5μgで治
療されたマウスで腫瘍の成長がないか又は最小限であった、異種移植片試験を支持する。
これらのデータは、血清サンプル中の可溶性BCMAが、多発性骨髄腫の指標を評価する
ための潜在的バイオマーカーとして洞察力に優れ、生存可溶性BCMAが病気の負担をモ
ニタするのに役立ち得ることを示唆する。
[1] BCMAに免疫特異的に結合する組換え抗体、又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は重鎖及び軽鎖を有し、前記重鎖は、
a.配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域1(CDR1)、配列番号5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
b.配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
c.配列番号7のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
d.配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
e.配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号8のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
f.配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
g.配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号8のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、を含む、組換え抗体、又はその抗原結合フラグメント。
[2] 前記抗体は、配列番号24のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号26のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、を更に含む、上記[1]に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
[3] (a)の抗体の重鎖は、配列番号27のアミノ酸配列を含み、(b)の抗体の重鎖は、配列番号57のアミノ酸配列を含み、(f)の抗体の重鎖は、配列番号34のアミノ酸配列を含み、(k)の抗体の重鎖は、配列番号39のアミノ酸配列を含み、(l)の抗体の重鎖は、配列番号40のアミノ酸配列を含み、(m)の抗体の重鎖は、配列番号58のアミノ酸配列を含み、又は(n)の抗体の重鎖は、配列番号43のアミノ酸配列を含む、上記[1]に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[4] 前記抗体の軽鎖は、配列番号28のアミノ酸配列を含む、上記[2]又は[3]に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[5] 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトBCMAの細胞外ドメインに結合する、上記[1]〜[4]のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[6] 前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトの抗体又は抗原結合フラグメントである、上記[1]〜[5]のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[7] 前記抗原結合フラグメントは、Fabフラグメント、Fab2フラグメント、又は一本鎖抗体である、上記[1]〜[6]のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント。
[8] 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、BCMA及びAPRILの相互作用を阻害する、上記[1]〜[7]のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[9] 前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ELISAにより測定するとき、BCMA及びAPRILの相互作用について約5.9nMのIC 50 を示す、上記[8]に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[10] 前記抗体又はその抗原結合フラグメントはIgGである、上記[1]〜[9]のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[11] IgG4アイソタイプである、上記[1]〜[10]のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[12] 前記IgG4は、そのFc領域中にS228P置換、L234A置換、及びL235A置換を有する、上記[11]に記載の抗体。
[13] 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトBCMAに免疫特異的に結合し、カニクイザルBCMAに交差反応する、上記[1]〜[12]のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[14] 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト骨髄腫細胞の表面上のBCMAに結合する、上記[1]〜[13]のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[15] 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト多発性骨髄腫細胞の表面上のBCMAに結合する、上記[1]〜[14]のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[16] 上記[1]〜[15]のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを発現している、組換え細胞。
[17] 前記細胞はハイブリドーマである、上記[16]に記載の細胞。
[18] 前記抗体は組換え的に生成される、上記[16]に記載の細胞。
[19] 組換えBCMA×CD3二重特異性抗体又はそのBCMA×CD3二重特異性結合フラグメントであって、
a)第1の重鎖(HC1)と、
b)第2の重鎖(HC2)と、
c)第1の軽鎖(LC1)と、
d)第2の軽鎖(LC2)と、を含み、
HC1はLC1と結合され、HC2はLC2と結合され、CD3に免疫特異的に結合する第1の抗原結合部位を形成するために、HC1は配列番号59、配列番号60、及び配列番号61を含み、LC1は配列番号62、配列番号63、及び配列番号64を含み、またBCMAに免疫特異的に結合する第2の抗原結合部位を形成するために、HC2は配列番号4、配列番号5、及び配列番号6を含み、LC2は配列番号24、配列番号25、及び配列番号26を含む、組換えBCMA×CD3二重特異性抗体又はそのBCMA×CD3二重特異性結合フラグメント。
[20] 配列番号55を含むHC1と、配列番号56を含むLC1と、配列番号65を含むHC2と、配列番号76を含むLC2と、を含む、上記[19]に記載の組換えBCMA×CD3二重特異性抗体又はそのフラグメント。
[21] 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントはIgGである、上記[20]に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
[22] 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントはIgG4アイソタイプである、上記[19]、[20]、又は[21]のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
[23] 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴により測定するとき、少なくとも0.22nMの親和性でヒトBCMAに免疫特異的に結合する、上記[19]〜[22]に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
[24] 前記抗体又はその二重特異性結合フラグメントは、ヒト骨髄腫細胞の表面上のBCMAに結合する、上記[19]〜[23]に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
[25] 前記抗体又はその二重特異性結合フラグメントは、ヒト多発性骨髄腫細胞の表面上のBCMAに結合する、上記[19]〜[24]に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
[26] 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、約0.37nM未満のEC 50 でインビトロでヒトT細胞活性化を誘発する、上記[19]〜[25]に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
[27] 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、約0.45nM未満のEC 50 でインビトロでBCMA発現細胞のT細胞依存性細胞傷害を誘発する、上記[19]〜[26]に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
[28] 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、BCMAアゴニストではない、上記[19]〜[27]に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
[29] 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、10nM未満の濃度でNF−κB活性化を変化させない、上記[19]〜[28]に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
[30] 上記[19]〜[29]のいずれか一項に記載の抗体又は二重特異性結合フラグメントを発現している、組換え細胞。
[31] 前記細胞はハイブリドーマである、上記[30]に記載の細胞。
[32] がんを有する対象を処置するための方法であって、上記[19]〜[29]のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの治療的に有効な量を、それを必要とする対象に、がんを処置するのに十分な時間投与することを含む、方法。
[33] がん細胞の成長又は増殖を阻害するための方法であって、上記[19]〜[29]のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの治療的に有効な量を投与し、がん細胞の成長又は増殖を阻害することを含む、方法。
[34] T細胞をBCMA発現がん細胞にリダイレクトする方法であって、上記[19]〜[29]のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの治療的に有効な量を投与し、T細胞をがんにリダイレクトすることを含む、方法。
[35] 前記がんは血液がんである、上記[32]、[33]、又は[34]に記載の方法。
[36] 前記血液がんはBCMA発現B細胞がんである、上記[35]に記載の方法。
[37] 前記BCMA発現B細胞がんは多発性骨髄腫である、上記[36]に記載の方法。
[38] 第2の治療剤を投与することを更に含む、上記[32]に記載の方法。
[39] 前記第2の治療剤は、化学療法剤又は標的化抗がん治療剤である、上記[38]に記載の方法。
[40] 前記化学療法剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はインターロイキン2である、上記[39]に記載の方法。
[41] 上記[19]〜[29]のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体と、を含む、医薬組成物。
[42] 上記[30]〜[31]のいずれか一項に記載の細胞を培養することにより、上記[19]〜[29]のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを生成するための方法。
[43] 上記[19]〜[29]のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントのHC1、HC2、LC1、又はLC2をコードする、単離された合成ポリヌクレオチド。
[44] 上記[19]〜[29]のいずれか一項に定義されるようなBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント、及び/又は上記[44]に定義されるようなポリヌクレオチド、及びこれらのための包装、を含む、キット。
Claims (44)
- BCMAに免疫特異的に結合する組換え抗体、又はその抗原結合フラグメントであって
、前記抗体は重鎖及び軽鎖を有し、前記重鎖は、
a.配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域1(CDR1)、配列番号
5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖C
DR3、
b.配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有
する重鎖CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
c.配列番号7のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有
する重鎖CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
d.配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有
する重鎖CDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
e.配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号8のアミノ酸配列を有
する重鎖CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
f.配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を
有する重鎖CDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
g.配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号8のアミノ酸配列を
有する重鎖CDR2、及び配列番号19のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、を含む、
組換え抗体、又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体は、配列番号24のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号25のアミ
ノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号26のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
、を更に含む、請求項1に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。 - (a)の抗体の重鎖は、配列番号27のアミノ酸配列を含み、(b)の抗体の重鎖は、
配列番号57のアミノ酸配列を含み、(f)の抗体の重鎖は、配列番号34のアミノ酸配
列を含み、(k)の抗体の重鎖は、配列番号39のアミノ酸配列を含み、(l)の抗体の
重鎖は、配列番号40のアミノ酸配列を含み、(m)の抗体の重鎖は、配列番号58のア
ミノ酸配列を含み、又は(n)の抗体の重鎖は、配列番号43のアミノ酸配列を含む、請
求項1に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。 - 前記抗体の軽鎖は、配列番号28のアミノ酸配列を含む、請求項2又は3に記載の抗体
又は抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトBCMAの細胞外ドメインに結合する
、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトの抗体又は抗原結合フラグメントである、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。 - 前記抗原結合フラグメントは、Fabフラグメント、Fab2フラグメント、又は一本
鎖抗体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、BCMA及びAPRILの相互作用を阻害
する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ELISAにより測定するとき、BCMA及び
APRILの相互作用について約5.9nMのIC50を示す、請求項8に記載の抗体又
は抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントはIgGである、請求項1〜9のいずれか一項
に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。 - IgG4アイソタイプである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結
合フラグメント。 - 前記IgG4は、そのFc領域中にS228P置換、L234A置換、及びL235A
置換を有する、請求項11に記載の抗体。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトBCMAに免疫特異的に結合し、カニ
クイザルBCMAに交差反応する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体又は抗原
結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト骨髄腫細胞の表面上のBCMAに結合
する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト多発性骨髄腫細胞の表面上のBCMA
に結合する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。 - 請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを発現している
、組換え細胞。 - 前記細胞はハイブリドーマである、請求項16に記載の細胞。
- 前記抗体は組換え的に生成される、請求項16に記載の細胞。
- 組換えBCMA×CD3二重特異性抗体又はそのBCMA×CD3二重特異性結合フラ
グメントであって、
a)第1の重鎖(HC1)と、
b)第2の重鎖(HC2)と、
c)第1の軽鎖(LC1)と、
d)第2の軽鎖(LC2)と、を含み、
HC1はLC1と結合され、HC2はLC2と結合され、CD3に免疫特異的に結合す
る第1の抗原結合部位を形成するために、HC1は配列番号59、配列番号60、及び配
列番号61を含み、LC1は配列番号62、配列番号63、及び配列番号64を含み、ま
たBCMAに免疫特異的に結合する第2の抗原結合部位を形成するために、HC2は配列
番号4、配列番号5、及び配列番号6を含み、LC2は配列番号24、配列番号25、及
び配列番号26を含む、組換えBCMA×CD3二重特異性抗体又はそのBCMA×CD
3二重特異性結合フラグメント。 - 配列番号55を含むHC1と、配列番号56を含むLC1と、配列番号65を含むHC
2と、配列番号76を含むLC2と、を含む、請求項19に記載の組換えBCMA×CD
3二重特異性抗体又はそのフラグメント。 - 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントはIgGである、請求項20に記載のBCM
A×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。 - 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントはIgG4アイソタイプである、請求項19
、20、又は21のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異
性結合フラグメント。 - 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴により測定するとき
、少なくとも0.22nMの親和性でヒトBCMAに免疫特異的に結合する、請求項19
〜22に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。 - 前記抗体又はその二重特異性結合フラグメントは、ヒト骨髄腫細胞の表面上のBCMA
に結合する、請求項19〜23に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性
結合フラグメント。 - 前記抗体又はその二重特異性結合フラグメントは、ヒト多発性骨髄腫細胞の表面上のB
CMAに結合する、請求項19〜24に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重
特異性結合フラグメント。 - 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、約0.37nM未満のEC50でインビ
トロでヒトT細胞活性化を誘発する、請求項19〜25に記載のBCMA×CD3二重特
異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。 - 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、約0.45nM未満のEC50でインビ
トロでBCMA発現細胞のT細胞依存性細胞傷害を誘発する、請求項19〜26に記載の
BCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。 - 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、BCMAアゴニストではない、請求項1
9〜27に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。 - 前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、10nM未満の濃度でNF−κB活性化
を変化させない、請求項19〜28に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特
異性結合フラグメント。 - 請求項19〜29のいずれか一項に記載の抗体又は二重特異性結合フラグメントを発現
している、組換え細胞。 - 前記細胞はハイブリドーマである、請求項30に記載の細胞。
- がんを有する対象を処置するための方法であって、請求項19〜29のいずれか一項に
記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの治療的に有効
な量を、それを必要とする対象に、がんを処置するのに十分な時間投与することを含む、
方法。 - がん細胞の成長又は増殖を阻害するための方法であって、請求項19〜29のいずれか
一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの治療的
に有効な量を投与し、がん細胞の成長又は増殖を阻害することを含む、方法。 - T細胞をBCMA発現がん細胞にリダイレクトする方法であって、請求項19〜29の
いずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント
の治療的に有効な量を投与し、T細胞をがんにリダイレクトすることを含む、方法。 - 前記がんは血液がんである、請求項32、33、又は34に記載の方法。
- 前記血液がんはBCMA発現B細胞がんである、請求項35に記載の方法。
- 前記BCMA発現B細胞がんは多発性骨髄腫である、請求項36に記載の方法。
- 第2の治療剤を投与することを更に含む、請求項32に記載の方法。
- 前記第2の治療剤は、化学療法剤又は標的化抗がん治療剤である、請求項38に記載の
方法。 - 前記化学療法剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はイン
ターロイキン2である、請求項39に記載の方法。 - 請求項19〜29のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特
異性結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体と、を含む、医薬組成物。 - 請求項30〜31のいずれか一項に記載の細胞を培養することにより、請求項19〜2
9のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメ
ントを生成するための方法。 - 請求項19〜29のいずれか一項に記載のBCMA×CD3二重特異性抗体又は二重特
異性結合フラグメントのHC1、HC2、LC1、又はLC2をコードする、単離された
合成ポリヌクレオチド。 - 請求項19〜29のいずれか一項に定義されるようなBCMA×CD3二重特異性抗体
又は二重特異性結合フラグメント、及び/又は請求項44に定義されるようなポリヌクレ
オチド、及びこれらのための包装、を含む、キット。
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