CN114206929B - 一种抗tigit免疫抑制剂及应用 - Google Patents

Abstract

提供了一种抗TIGIT免疫抑制剂及应用。所述免疫抑制剂可以结合人TIGIT胞外区，该免疫抑制剂可以被用来治疗癌症等疾病。

Description

一种抗TIGIT免疫抑制剂及应用

技术领域

本发明涉及免疫学的技术领域。具体的说涉及免疫监测点抗体、其制备及免疫学方面的应用。

背景技术

TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)是一种具有免疫球蛋白(Ig)和酪氨酸抑制剂基序(ITIM)结构域的T细胞免疫受体，主要表达于激活的T细胞和NK细胞上(Yu，X.，et al.(2009).″The surface protein TIGIT suppresses T cellactivation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendriticcells.″Nature immunology 10(1)：48-57.)。TIGIT也称为VSIG9、VSTM3和WUCAM，其结构显示包含一个细胞外免疫球蛋白结构域，一个1型跨膜区和两个ITIM基序。TIGIT是共同刺激网络的一部分，这个共刺激网络主要由T细胞上的激活性受体CD226和抑制性受体TIGIT，以及在APC、肿瘤细胞、感染的细胞表面表达的配体CD155(也称为PVR，一种在人类中被PVR基因编码的脊髓灰质炎病毒受体蛋白质)和CD112组成。TIGIT与PVR或CD112结合后会引起TIGIT胞质内Tyr225被磷酸化，TIGIT和细胞自适应生长因子受体结合蛋白2(GRB2)进行结合。GRB2可以招募SHIP1抑制磷脂酰肌醇三激酶(PI3K)和促***原活化蛋白激酶(MAPK)信号。除此之外，磷酸化的TIGIT通过Beta抑制蛋白2(β-arrestin2)招募SHIP1和通过阻断TNF受体相关因子6(TRAF6)的自身泛素化破坏核因子KB(NF-KB)激活，一系列的信号传导最终导致T细胞或NK细胞的功能受到抑制，细胞因子的产生受到抑制。PVR既是TIGIT的配体，又是CD226分子的配体，CD226与PVR分子的亲和力为119nM。在和CD112或CD155结合之后，CD226的胞内结构域的Ser329和Tyr322被磷酸化。Ser329磷酸化促进蛋白激酶(PKC)的激活和CD226与淋巴细胞关联抗原1(LFA1)的相互结合。LFA1然后被用于TYN介导的Tyr322磷酸化和CD226介导的下游信号传导。一系列的信号传导最终导致T细胞或NK细胞的功能受到激活，促进细胞因子的产生。存在于T细胞或NK细胞表面的TIGIT分子与CD226分子之间也发生着相互作用，表现在TIGIT分子可以直接扰乱CD226形成正常的二聚体，从而破坏CD226的正常生理功能。由此可见，TIGIT和CD226如同天平的两端，通过PVR这个支点，通过共刺激和共抑制信号的传导巧妙的调节着机体的免疫功能。

TIGIT与自然杀伤(NK)细胞功能障碍的相关性研究表明，TIGIT与荷瘤小鼠以及结肠癌病人的NK细胞衰竭有关。在几个荷瘤小鼠模型中TIGIT被阻断可以阻止NK细胞衰亡并且促进NK细胞依赖的肿瘤免疫。此外，阻断TIGIT以一种NK细胞依赖的方式导致有效的肿瘤特异性T细胞免疫，在肿瘤再挑战模型中增强抗PD-L1抗体疗效和维持记忆免疫能力。这项工作表明，TIGIT构成了NK细胞表面以前未被重视的免疫检查点，并且单独或与其它检查点受体组合靶向TIGIT是一种有前景的抗癌治疗策略(Zhang，Q.，et al.(2018).″Blockadeof the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cell exhaustion and elicitspotent anti-tumor immunity.″Nature immunology.)。由于TIGIT既高表达于T细胞表面又高表达于NK细胞表面，而其它免疫检查点如：PD-1、CTLA-4仅表达于T细胞表面，这就决定了TIGIT靶点作为治疗靶点具有更大的优势，因此开发此靶点的抗体药物也许具有很光明的治疗前景和市场前景。

发明内容概述

本发明提供一种对人TIGIT蛋白具有高亲和力的抗TIGIT抗体。在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT抗体为分离的抗TIGIT抗体。在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT抗体可以有效阻断TIGIT与PVR结合、也可以有效激活淋巴细胞释放细胞因子。在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT抗体与人TIGIT的亲和力很高，并且有合适的ADCC(Antibody-dependent cellular cytotoxicity，抗体依赖的细胞毒性作用)活性。在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT抗体可用于治疗各种类型的癌症以及感染等治疗目的，也可用于诊断和预后。

在一些实施方案中，本发明提供了一种的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的T细胞免疫受体(TIGIT)蛋白，并且包含以下序列中的一个、两个、三个、四个、五个或全部：

(a)VH CDR1，含如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列；

(b)VH CDR2，含如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列；

(c)VH CDR3，含如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列；

(d)VL CDR1，含如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列；

(e)VLCDR2，含如SEQ ID NO：26或者43所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列；

(f)VL CDR3，含如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的T细胞免疫受体(TIGIT)蛋白，并且包含：

(a)VH CDR1，含如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列；

(b)VH CDR2，含如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列；

(c)VH CDR3，含如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列；

(d)VL CDR1，含如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列；

(e)VL CDR2，含如SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列；以及

(f)VL CDR3，含如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的T细胞免疫受体(TIGIT)蛋白，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO：21所示的VH CDR1、如SEQ ID NO：22所示的VH CDR2、如SEQ ID NO：23所示的VH CDR3、如SEQ ID NO：25所示的VL CDR1、如SEQ ID NO：26或者43所示的VL CDR2和如SEQ ID NO：27所示的VL CDR3中的一个、两个、三个、四个、五个或全部。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的T细胞免疫受体(TIGIT)蛋白，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO：21所示的VHCDR1、如SEQ ID NO：22所示的VH CDR2、如SEQ ID NO：23所示的VH CDR3、如SEQ ID NO：25所示的VL CDR1、如SEQ ID NO：26或者43所示的VL CDR2和如SEQ ID NO：27所示的VL CDR3。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的T细胞免疫受体(TIGIT)蛋白，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO：21所示的VHCDR1、如SEQ ID NO：22所示的VH CDR2、如SEQ ID NO：23所示的VH CDR3、如SEQ ID NO：25所示的VL CDR1、如SEQ ID NO：26所示的VLCDR2和如SEQ ID NO：27所示的VL CDR3。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的T细胞免疫受体(TIGIT)蛋白，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO：21所示的VH CDR1、如SEQ ID NO：22所示的VH CDR2、如SEQ ID NO：23所示的VH CDR3、如SEQ ID NO：25所示的VL CDR1、如SEQ ID NO：43所示的VLCDR2和如SEQ ID NO：27所示的VL CDR3。

在一些实施方案中，抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其组合。在一些实施方案中，轻链是κ或λ型。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ链恒定区。在一些实施方案中，轻链可变区是κ或λ链可变区。在一些实施方案中，轻链可变区是κ链可变区。在一些实施方案中，抗体或其片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD其中一种同种型。在一些实施方案中，同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，抗体或其片段是一种嵌合抗体、一种人源化抗体或是一种全人源抗体。在一些实施方案中，抗体或其片段是一种人源化抗体。

在一些实施方案中，所述抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其结合。在一些实施方案中，所述Fc区是人的Fc区。在一些实施方案中，所述人Fc区重链在356位(Eu编号)的氨基酸为E。在一些实施方案中，所述人Fc区重链在386位(Eu编号)的氨基酸为M。在一些实施方案中，所述重链包含如SEQ ID NO：28或者29所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述轻链包含如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述抗体或其片段包括重链可变区，所述重链可变区包含一条选自由SEQ ID NO：20、33、35、37、39、和41组成的组中的氨基酸序列，或一条与由SEQ IDNO：20、33、35、37、39、和41组成的组中的氨基酸序列至少有90％的序列同源性的肽链。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包括轻链可变区，所述轻链可变区包含一条选自由SEQID NO：24、34、36、38、40和42组成的组中的氨基酸序列，或一条与选自由SEQ ID NO：24、34、36、38、40和42组成的组中的氨基酸序列至少有90％的序列同源性的肽链。

在一些实施方案中，所述抗体或其片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述抗体或其片段可以有效阻断TIGIT与PVR结合。在一些实施方案中，所述抗体或其片段可以激活淋巴细胞释放细胞因子。

在一些实施方案中，所述抗体或其片段与人TIGIT的亲和力数值K_D≤100pM。在一些实施方案中，所述抗体或其片段与人TIGIT的亲和力数值K_D≤5nM。

在一些实施方案中，所述抗体或其片段具有ADCC活性。在一些实施方案中，所述抗体或其片段有结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。

另一方面，本发明还描述了一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含本发明所述的抗体片段和对免疫细胞上的分子具有特异性的第二抗原结合片段。所述分子包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、CD28、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM、BTLA、KIR和CD47。

另一方面，本发明还提供了包含本发明公开的抗体或其片段的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物中小于或等于50％的抗体或其片段结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述组合物中小于或等于30％的抗体或其片段结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述组合物中小于或等于20％的抗体或其片段结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述组合物中小于或等于10％的抗体或其片段结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述组合物中小于或等于5％的抗体或其片段结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述组合物中小于或等于1％的抗体或其片段结合岩藻糖。

另一方面，本发明还提供了一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸可编码所述的抗体或其片段。在一些实施方案中，编码抗体重链的多聚核苷酸的序列如SEQ ID NO：46所示；在一些实施方案中，编码抗体轻链的多聚核苷酸的序列如SEQ ID NO：47所示。

另一方面，本发明还提供了一种细胞，所述细胞包含编码本发明公开的抗体或其片段的一个或多个多聚核苷酸。

另一方面，本发明还提供了一种制备所述的抗体或其片段的方法，其特征在于，培养包含编码该抗体或其片段的多聚核苷酸的细胞以表达该抗体或其片段。在一些实施方案中，所述细胞为CHO细胞、HEK293细胞、Cos1细胞、Cos7细胞、CV1细胞或鼠L细胞。

另一方面，本发明还提供了治疗方法和用途。在一些实施方案中，本发明提供了在有需求的患者中治疗癌症或感染的方法，包括向患者施用有效剂量的本发明公开的抗体或其片段。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑色素瘤、***癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，所述癌症可以是膀胱癌、肝癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、结肠直肠癌、头颈癌、鳞状细胞癌、梅克尔细胞癌、胃肠癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌和小细胞肺癌。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用第二种癌症治疗剂。在一些实施方案中，所述感染是病毒感染，细菌感染，真菌感染或寄生虫感染。

在一些实施方案中，本发明提供了在有需求的患者中治疗癌症或感染的方法，包括：(a)在体外，用本发明公开的抗体或其片段处理细胞；和(b)将处理过的细胞施用到患者体内。在一些实施方案中，该方法进一步包括，在步骤(a)之前，从个体中分离细胞。在一些实施方案中，从患者体内分离细胞。在一些实施方案中，从区别于患者的供体个体分离细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞，其非限制性实例包括肿瘤浸润T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+ T细胞，或其组合。

在一些实施方案中，本发明还提供了抗TIGIT抗体或其片段在制备用于在有需要的患者中治疗癌症或感染的药物中的应用。在一些实施方案中，所述癌症为实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症选自膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、***癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，还包括向所述患者施用第二种癌症治疗剂。在一些实施方案中，感染是病毒感染、细菌感染、真菌感染或寄生虫感染。

在一些实施方案中，本发明还提供一种细胞在制备用于治疗癌症或感染的药物中的应用，所述应用包括：(a)在体外，用抗体或其片段处理所述细胞，和(b)将处理后的所述细胞施用于患者体内。在一些实施方案中，所述方法在步骤(a)之前还包括从个体分离出所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞从所述患者体内分离出来。在一些实施方案中，所述细胞从不同于所述患者的供体个体中分离出来。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是肿瘤浸润性T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。

另一方面，本发明还提供了诊断方法和用途。在一些实施方案中，本发明提供了检测样品中TIGIT的表达的方法，包括使样品与抗体或其片段在一定条件下接触，使得抗体或其片段与TIGIT结合，并检测其结合，即样品中TIGIT的表达。在一些实施方案中，所述样品包括肿瘤细胞、肿瘤组织、被感染的组织或血液样品。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，其中：

图1：PVR-FC融合蛋白构建示意图。

图2：TIGIT-FC融合蛋白构建示意图。

图3：m10D8抗体与人TIGIT ELISA实验结果。

图4：m10D8抗体与猴子TIGIT ELISA实验结果。

图5：m10D8与小鼠TIGIT ELISA实验结果。

图6：鼠抗人TIGIT阻断TIGIT与PVR结合实验结果，表示10A7，/>表示m10D8，/>表示无关抗体BAT5906，作为阴性对照。

图7：鼠抗人TIGIT抗体生物学活性检测结果，表示m10D8；/>表示无关抗体BAT5906，作为阴性对照；/>表示Tiragolumab，作为阳性对照。

图8：h10D8V1、h10D8V2、h10D8V3与TIGIT结合能力对比结果。表示h10D8V1，/>表示h10D8V2，/>表示h10D8V3。

图9：h10D8V1、h10D8V2、h10D8V3与TIGIT-his tag平衡解离常数测定结果。

图10：h10D8V1、h10D8V2、h10D8V3生物学活性对比结果，表示h10D8V1，/>表示h10D8V2，/>表示h10D8V3。

图11：h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5与TIGIT结合能力比较结果，表示h10D8OF，*表示h10D8V4，/>表示h10D8V5。

图12：h10D8OF、h10D8V2与TIGIT结合能力比较结果，表示Tiragolumab，/>表示h10D8V2，/>表示h10D8OF。

图13：h10D8OF、h10D8V2与TIGIT-his tag抗原平衡解离常数检测结果。

图14：h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5生物学活性对比结果，表示h10D8OF，/>表示h10D8V4，/>表示h10D8V5，/>表示Tiragolumab。

图15：h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5阻断TIGIT与PVR结合实验结果，表示Tiragolumab，/>表示h10D8OF，*表示h10D8V4，/>表示h10D8V5，/>表示无关对照BAT5906。

图16：h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5阻断PVR与Jurkat细胞膜表面TIGIT结合能力比较结果，表示h10D8V4，/>表示h10D8V5，/>表示h10D8OF，/>表示无关对照BAT5906。

图17：h10D8OF、Tiragolumab阻断PVR与Jurkat细胞膜表面TIGIT结合能力比较结果，表示Tiragolumab，/>表示h10D8OF，/>表示无关对照BAT5906。

图18：h10D8OFADCC活性检测结果，表示h10D8OF，/>Tiragolumab，/>无关对照BAT5906。

图19：h10D8OF与h10D8OFKF ADCC活性对比结果。

图20：IFN-γ相对诱导倍数，10表示10μg/ml，25表示25μg/ml。

图21：IL-2相对诱导倍数，10表示10μg/ml，25表示25μg/ml。

图22：抗TIGIT抗体与B-hPD-1/hTIGIT双人源化小鼠T细胞表面hTIGIT结合实验结果，人源化抗体二抗为抗人(Anti-human)Fc，FITC；鼠源抗体二抗为抗小鼠(Anti-mouse)IgG，Alexa Fluor 647。

图23：h10D8OF与Tiragolumab与Jurkat-hTIGIT细胞表面TIGIT结合能力比较结果，表示h10D8OF，/>表示Tiragolumab。

图24：鼠源抗体单药药效，表示生理盐水(vehicle)，/>表示Pembrolizumab单药(0.1mg/kg)，/>表示Tiragolumab单药(20mg/kg)，/>表示m10D8。

图25：人源化抗体联合用药药效，表示生理盐水，/>表示Pembrolizumab单药(0.1mg/kg)，/>表示h10D8V2单药(20mg/kg)，/>表示Tiragolumab单药(20mg/kg)，*表示h10D8OF单药(20mg/kg)。

图26：人源化抗体联合用药药效，表示生理盐水，/>表示Pembrolizumab，/>表示h10D8V2(20mg/kg)和Pembrolizumab(01mg/kg)联合用药，*表示Tiragolumab(20mg/kg)和Pembrolizumab(0.1mg/kg)联合用药，/>表示h10D8OF(20mg/kg)和Pembrolizumab(0.1mg/kg)联合用药。

图27：MC38肿瘤浸润淋巴细胞中mCD45活细胞所占的比例。表示生理盐水，/>表示h10D8OF。

图28：CD4+T细胞占mCD45活细胞的比例。表示生理盐水，/>表示h10D8OF。

图29：CD8+T细胞占mCD45活细胞的比例。表示生理盐水，/>表示h10D8OF。

图30：TIGIT+CD4+T细胞占CD4+T活细胞的比例。表示生理盐水，/>表示h10D8OF。图31：TIGIT+CD8+T细胞占CD8+T活细胞的比例。/>表示生理盐水，/>表示h10D8OF。图32：体内药效学实验结果。/>表示生理盐水，*表示mTiragolumab(30mg/kg)，/>表示Atezolizumab(1mg/kg)，/>表示mh10D8OF(10mg/kg)，/>表示mh10D8OF(30mg/kg)，/>表示联合用药，mh10D8OF(30mg/kg)+Atezolizumab(1mg/kg)。

具体实施方式

定义

应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。

“氨基酸”是指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如α-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。天然氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：Ala，一字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。

“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似的侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般而言，保守氨基酸取代不大会在实质上改变蛋白质的功能性质。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括：1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸。

在本发明中，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸组成的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得。它可能以包括化学合成的任何方式产生。

本发明中关于抗体、细胞、核酸所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA或RNA是指分别与存在于大分子的天然来源中的其它DNA或RNA所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。

在本发明中，术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。术语“不相关的”或“非同源的”序列表示与本发明公开的序列之一有小于40％的同一性，如小于25％的同一性。

多聚核苷酸或多聚核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列有具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者99％)的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用本领域已知的软件程序来确定该比对和同源性百分比或序列同一性，比如Ausubel et al.eds.(2007)在Current Protocols in Molecular Biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST。特别地，程序是BLASTN和BLASTP，两者使用下列默认参数：Genetic code＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sort by＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同源性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。

术语“等价的核酸或多聚核苷酸”是指具有与核酸或其互补物的核苷酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物意指包括具有与其或其互补序列具有一定同源性的核苷酸序列的核酸。一方面，核酸的同源物能够与核酸或其互补物杂交。同样地，“等价的多肽”是指与参考多肽的氨基酸序列具有一定同源性或序列同一性的多肽。在某些方面，序列同一性为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些方面，与参考的多肽或多聚核苷酸相比，等价的多肽或多聚核苷酸具有1、2、3、4或5个添加、缺失、取代及其组合。在某些方面，等价的序列保留参考序列的活性(例如表位结合)或结构(例如盐桥)。

杂交反应可以在不同的“严谨性”条件下进行。通常在约40℃条件下，在约10×SSC或相同离子强度/温度的溶液中进行低严谨的杂交反应。通常在约50℃条件下，在约6×SSC中进行中度严谨的杂交反应，通常在约60℃条件下，在约1×SSC中进行高度严谨的杂交反应。杂交反应也可以在本领域技术人员熟知的“生理条件”下进行。不受限制的生理条件的实施例是在通常指在细胞中存在的温度、离子强度、pH和Mg²⁺浓度。

多聚核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、和当多聚核苷酸是RNA时胸腺嘧啶换为尿嘧啶(U)。因此，术语“多聚核苷酸序列”是多聚核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。术语“多态性”是指多于一种形式的基因或其一部分的共存，具有至少两种不同形式(即两种不同的核苷酸序列)的基因的一部分被称为“基因的多态性区域”。多态性区域可以是单核苷酸，在不同的等位基因中其具有不同的同一性。

术语“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是不受限制的多聚核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多聚核苷酸的实施方案包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。

术语“编码”应用于多核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，如果在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，其可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这种核酸的互补序列，其编码序列可以从中推导出来。

在本发明中，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。包括但不局限的该实施例包括重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)、重链恒定区(CH)或轻链恒定区(CL)、框架(FR)区或其任何部分、或结合蛋白的至少一部分。CDR区包括轻链的CDR区(LCDR)和重链的CDR区(HCDR)。

在本发明中，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab’)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗体片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。

“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域通过10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。本领域中已知的ScFv分子在例如美国专利5,892,019中有相关描述。

术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。本领域普通技术人员容易想到这些种类和同种型中的每一种改变形式，因此都在本发明公开的保护范围内，所有的免疫球蛋白种类都显然在本发明公开的保护范围内。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。这四条链通常通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”口开始并延续通过可变区包围重链。

本发明公开的抗体、抗原结合片段或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性，全人源、人源化、灵长类化，或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段例如Fab、Fab′和F(ab′)₂、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)，包含VK或VH结构域的片段，由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如本发明公开的LIGHT抗体的抗Id抗体)。本发明公开的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或者亚类。

轻链可以分为kappa或lambda(κ、λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为Vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为Vλ。

轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能被使用。就这点而言，应理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变区决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CL结构域分别包含重链和轻链的羧基端。

如上所述，可变区使得抗体能够选择性识别和特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的子集结合形成了限定三维抗原结合位点的可变区。该抗体四级结构形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由VH和VL链中各自的三个CDR定义(即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)。在某些情况下，例如某些来源于骆驼科动物的免疫球蛋白分子或基于骆驼科动物免疫球蛋白改造的免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，没有轻链。例如参见Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446-448(1993)。

在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是特异性地定位以形成抗原结合结构域的短的、非连续的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“构架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。构架区大部分采用β-折叠构象，CDR形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使CDR定位在正确的方位上。特定位置的CDR形成的抗原结合域界定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以根据常用定义(参见例如″Sequences ofProteins of Immunological Interest，″Kabat，E.，et al.，U.S.Department of Healthand Human Services，(1983)和Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987))鉴定出包含CDR和框架区的氨基酸。

根据Kabat和Chothia定义的CDR包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其抗原结合片段的CDR都在本发明所定义和使用的术语的范围内。包含特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员可以常规地根据抗体的可变区氨基酸序列确定出哪些残基包含特定的CDR。

Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号***。本领域普通技术人员可以毫无疑义地将该“Kabat编号”***应用到任何可变区序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。本发明所使用的“Kabat编号”是指由Kabat et al.，U.S.Dept.ofHealth and Human Services在″Sequence of Proteins of Immunological Interest″(1983)提出的编号***。

Kabat编号***如下述方式介绍CDR区：HCDR1在大约第31个氨基酸(即第一个半胱氨酸残基之后的大约9个残基)开始，包括大约5-7个氨基酸，并在下一个色氨酸残基处结束。HCDR2在HCDR1结束后的第15个残基处开始，包括大约16-19个氨基酸残基，并在下一个精氨酸或赖氨酸残基处结束。HCDR3从HCDR2结束后的大约第33个氨基酸残基开始；包括3-25个氨基酸；并以序列W-G-X-G结束，其中X指任何氨基酸。LCDR1大约从第24个残基开始(即在半胱氨酸残基之后)；包括约10-17个残基；并在下一个色氨酸残基处结束。LCDR2从LCDR1结束后的大约第16个残基开始，包括大约7个残基。LCDR3在LCDR2结束后的大约第33个残基(即在半胱氨酸残基之后)开始；包括大约7-11个残基并且以序列F或W-G-X-G结束，其中X指任何氨基酸。

本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、豚鼠源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施方案中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。

“轻链-重链对”是指可通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。

如上所述，各种免疫球蛋白种类的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。在本发明中，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(大部分氨基末端)恒定区。CH1结构域与VH结构域相邻，并且CH1结构域与免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基端相连。

在本发明中，术语“CH2结构域”包括使用常规编号方案时，从抗体的约第244个残基延伸至第360个残基的部分重链分子(第244至360个残基，Kabat编号***；第231-340个残基，EU编号***；参见Kabat et al.，U.S.Dept.of Health andHuman Services，“Sequence of Proteins of Immunological Interest″(1983))。CH2结构域是独特的，因为该结构域不与其它结构域紧密配对，而是在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间***两个N-连接的分支碳水化合物链。还有文献记载，CH3结构域从CH2结构域开始延伸到IgG分子的C-末端，大约包含108个残基。

在本发明中，术语“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的重链部分。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个N端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Roux et al.，J.Immunol 161：4083(1998))。

在本发明中，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸包含可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接的硫醇基团。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，两条重链通过两个二硫键在Kabat编号***中对应的位置239和242(位置226或229，EU编号***)处相连接。

在本发明中，术语“嵌合抗体”被认为是指其免疫反应性区域或位点从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(在本发明中可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。在一些实施方案中，靶结合区或位点来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区是人源。

“特异性结合”通常是指抗体通过其抗原结合结构域与抗原表位结合，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间具有互补性。根据这个定义，当抗体通过其抗原结合结构域与该表位结合时比它结合到随机的、不相关的表位更容易，其被称为“特异性结合”该表位。术语“特异性”在本发明中用于限定特定抗体与特定表位结合的相对亲和力。

在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不良的生理改变或紊乱，例如癌症的进程。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解或消除、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和，以及减轻或消除(无论是部分还是全部)。“治疗”还意指与不接受治疗时预期的生存期限相比所延长的生存期限。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”通常指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛等。

在本发明中，诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的受试者”等短语包括从施用本发明公开的抗体或组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的受试者，例如哺乳动物受试者。

抗TIGIT抗体

本发明提供了对人TIGIT蛋白具有高亲和力的抗TIGIT抗体。受测抗体表现出有效的结合和抑制活性，并可用于治疗和诊断用途。比如，如实施例显示，这些抗体可以有效阻断TIGIT与PVR结合、也可以有效激活淋巴细胞释放细胞因子。这些抗体与人TIGIT的亲和力很高，并且有合适的ADCC活性。

因此，本发明提供了抗TIGIT抗体或其片段，该抗体或其片段可以特异性结合TIGIT蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供了包含如表2.1显示的CDR区的重链和轻链可变结构域的抗体。如实施例中的实验所示，含有这些CDR区的抗体，无论是小鼠还是人源化，都具有有效的结合和抑制TIGIT的活性。

在一些实施例中，本发明公开的抗TIGIT抗体包含如SEQ ID NO：20、33、35、37、39、和/或41所示的VH或与其各自具有80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的序列，如SEQ ID NO：24、34、36、38、40和/或42所示的VL或与其各自具有80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的序列。在一些实施方案中，具有总体80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的VH保留CDR(SEQ ID NO：21-23、25-27、43或其有单一位点的取代、缺失或***的氨基酸序列)。在一个实施例中，VH具有如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列，VL具有如SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，本发明公开的抗TIGIT抗体包含人的Fc区。重链和轻链的恒定区序列比如可以有SEQ ID NO：28(或者29)和30。比较起SEQ ID NO：28来说，SEQ ID NO：29在第239位的氨基酸以E替代了D(根据Eu编码是第356位，Kabat的编码是第377位)，在第241位的氨基酸以M替代了L(根据Eu编码是第358位，Kabat的编码是第381位)。

在一些实施例中，本发明公开的抗TIGTI抗体的重链的序列如SEQ ID NO：44所示；轻链的序列如SEQ ID NO：45所示。

本领域普通技术人员还应当理解，本发明所公开的抗体是可以被修饰的，修饰后其氨基酸序列不同于衍生出该抗体的天然存在的结合多肽的氨基酸序列。例如，衍生自同一指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可以是与起始序列相似的，比如与起始序列具有一定比例的同一性，比如它可以与起始序列的同一性是60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。

在一些实施方案中，抗体包含氨基酸序列或一个或多个通常与抗体无关的基团。下面更详细地描述了代表性修饰。例如，本发明公开的抗体可以包含有韧性的接头序列，或者可以被修饰以添加功能性基团(例如PEG、药物、毒素或标签)。

在一些实施方案中，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述抗体或其片段最多有三个(或者最多两个，一个)氨基酸残基被岩藻糖修饰。在一些实施方案中，包含所述抗体或其片段的制剂里面最多有不到0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％或5％的蛋白分子被岩藻糖修饰。在一些实施方案中，减低或者去除岩藻糖修饰的抗体有更强的ADCC，适合于某些治疗用途。

本发明公开的抗体、变体或衍生物包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体与表位结合。包括但不限制以下实例，抗体可以通过例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，抗体可以含有一个或多个非经典的氨基酸。

在一些实施方案中，抗体可以与治疗剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或PEG缀合。

抗体可以与治疗剂缀合或融合，所述治疗剂可包括可检测标记，如放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂或诊断剂、可以是药物或毒素的细胞毒性剂、超声增强剂、非放射性标记物及其组合物，和本领域已知的其它此类试剂。

抗体可通过将其偶联至化学发光化合物来被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光从而确定化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

双功能分子

TIGIT是个免疫受体，也是肿瘤抗原。作为肿瘤抗原靶向分子，可将特异性结合TIGIT的抗体或抗原结合片段与具有免疫细胞特异性的另一种抗原结合片段组合以产生双特异性抗体。

在一些实施方案中，所述免疫细胞选自由T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、吞噬细胞、天然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞组成的组。免疫细胞上的靶向分子包括例如CD3、CD16、CD19、CD28和CD64。以及其他例子包括PD-1、CTLA-4、LAG-3(也称CD223)、CD28、CD122、4-1BB(也称CD137)、TIM3、OX-40或OX40L、CD40或CD40L、LIGHT、ICOS/ICOSL、GITR/GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM或BTLA(也称CD272)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)和CD47。双特异性的具体实例包括但不限于TIGIT/PD-1、TIGIT/LAG3和TIGIT/CD47。如实施例所示，本发明的TIGIT抗体和PD-L1抗体具有协同效应。

在一些实施方案中，也可将特异性结合TIGIT的抗体或抗原结合片段与具有肿瘤抗原特异性的另一种抗原结合片段组合以产生双特异性抗体。“肿瘤抗原”是肿瘤细胞产生的一种抗原物质，即在宿主中引发免疫应答。肿瘤抗原可用于肿瘤细胞的鉴定，可作为癌症治疗的候选药物。体内的正常蛋白质不是抗原性的，而在肿瘤发生过程中会产生或过度表达某些蛋白质，因此其对身体来说是“外来的”。这些蛋白质可能包括被免疫***很好地隔离的正常蛋白质、通常以极小量生成的蛋白质、通常仅在发育的某些阶段中产生的蛋白质，或者由于突变而结构被修饰的蛋白质。

本领域中大量的肿瘤抗原已被发现，并且通过筛选可以容易地鉴定出新的肿瘤抗原。肿瘤抗原非限制性的实例包括：EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CD73、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整合蛋白、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和细胞粘合素。

在某些方面，与相应的非肿瘤细胞相比，单价单元对肿瘤细胞上过度表达的蛋白质具有特异性。这里使用的“相应的非肿瘤细胞”是指与肿瘤细胞的起源为相同细胞类型的非肿瘤细胞。值得注意的是，此类蛋白质并非一定不同于肿瘤抗原，非限制性实例包括：癌胚抗原(CEA)，其在大多数结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃肠道癌中过表达；神经调节蛋白受体(HER-2、neu或c-erbB-2)，其经常在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、***癌和***中过表达；表皮生长因子受体(EGFR)，其在包括乳腺癌、头颈癌、非小细胞肺癌和***癌的一系列实体瘤中高表达；去唾液酸糖蛋白受体；转铁蛋白受体；丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物受体，其在肝细胞上表达；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)，其在胰腺导管腺癌细胞上过表达；用于抗血管生成基因治疗的血管内皮生长因子受体(VEGFR)；叶酸受体，其在90％的非粘性卵巢癌中选择性过表达；细胞表面糖萼；碳水化合物受体；以及聚合免疫球蛋白受体，其主要将基因递送至呼吸道上皮细胞，并且对于治疗如囊性纤维化之类的有潜在吸引力。在这方面的双特异性的非限制性实例包括：TIGIT/EGFR、TIGIT/Her2、TIGIT/CD33、TIGIT/CD133、TIGIT/CEA和TIGIT/VEGF。

本发明还公开了不同形式的双特异性抗体。在一些实施例中，抗TIGIT片段和另一片段分别选自Fab片段、单链可变片段(scFv)或单域抗体。在一些实施例中，双特异性抗体还包括Fc片段。

本发明还公开了除抗体或抗原结合片段以外的双功能分子。作为肿瘤抗原靶向分子，可以将本发明所述的特异性结合TIGIT的抗体或抗原结合片段与免疫细胞因子或配体通过肽接头选择性地连接。所述被连接的免疫细胞因子或配体包括但不限于：IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、GM-CSF、TNF-α、CD40L、OX40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、LIGHT和GITRL。此类双功能分子可以将免疫检查点阻断效应与肿瘤部位局部免疫调节结合起来。

编码抗体的多聚核苷酸和制备抗体的方法

本发明还公开了编码本发明所述抗体及其抗原结合片段或衍生物的分离的多核苷酸或核酸分子。本发明公开的多聚核苷酸可以编码上述抗体或抗原结合片段或衍生物的整个重链和轻链可变区。此外，本发明公开的多聚核苷酸可以编码在上述抗体或抗原结合片段或衍生物的部分重链和轻链可变区。

在一些实施方案中，编码抗TIGIT抗体h10D8OF的多聚核苷酸的序列如SEQ ID NO：46和47所示；其中序列SEQ ID NO：46可编码产生抗TIGIT抗体h10D8OF的重链；序列SEQ IDNO：47可编码产生抗TIGIT抗体h10D8OF的轻链。

SEQ ID NO：46的序列如下：

SEQ ID NO：47的序列如下：

在一些实施方案中，采用杂交瘤技术来制备以产生本发明的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段。使用例如杂交瘤方法来制备单克隆抗体，诸如Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)所述的那些。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物，以引起淋巴细胞产生或能产生特异性结合免疫剂的抗体。

免疫剂将通常包括蛋白抗原、其片段、或其融合蛋白。通常，如果期望人源细胞，则使用外周血淋巴细胞；如果期望非人哺乳动物源，则使用脾淋巴细胞或***细胞。在一些实施方案中，采用脾淋巴细胞。然后用适合的融合剂，例如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，Academic Press，(1986)第59-103页)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。在一些实施方案中，采用脾淋巴细胞和小鼠的骨髓瘤细胞进行融合。杂交瘤细胞可在适当的培养基中培养，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)，所述物质防止HGPRT-缺陷的细胞生长。在一些实施方案中，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定，如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。此类技术和测定是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Munson和Pollard，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来测定。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，鉴定对靶抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体是重要的。

在鉴定出期望的杂交瘤细胞之后，可用有限稀释步骤将所述克隆进行亚克隆并用标准方法使其生长。(参见Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，(1986)第59-103页)。适用于该目的的培养基包括例如Dulbecco改良的Eagle培养基和RPMI-1640培养基等。

在一些实施方案中，可通过常规技术手段分离或纯化由亚克隆分泌的单克隆抗体，如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析。

单克隆抗体还可通过重组DNA方法制备，例如美国专利No.4,816,567中所述的那些。编码本文所述单克隆抗体的DNA可容易地使用常规方法来分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。本文所述杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。编码本文所述抗体的DNA还可以按常规方法根据抗体序列设计合成。将分离或合成的DNA置入表达载体中，然后将其转染到宿主细胞例如不另外产生免疫球蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾(HEK)293细胞、猿COS细胞、PER.NS0细胞、SP2/0、YB2/0、或骨髓瘤细胞中，从而在重组宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。

在一些实施方案中，采用杂交瘤技术来制备以产生本发明的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，使用含有TIGIT胞外区的融合蛋白免疫小鼠，免疫后去小鼠的脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，通过含有TIGIT胞外区的融合蛋白对杂交瘤进行筛选，并对阳性的杂交瘤进行有限稀释，进一步亚克隆，再次鉴定杂交瘤株与含有TIGIT胞外区的融合蛋白的结合能力，以制备产生抗TIGIT抗体。在一些实施方案中，含有TIGIT胞外区的融合蛋白为TIGIT-Fc。在一些实施方案中，小鼠为6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。

制备抗体的方法是本领域公知的并且在本发明中有所描述。在一些实施方案中，本发明公开的抗体或其抗原结合片段的可变区和恒定区都是全人源的。可以使用本领域中公开的技术和本发明所述的技术制备全人源抗体。例如，针对特定抗原的全人源抗体可以通过将抗原施用于转基因动物中来制备，所述转基因动物已经被改良过以响应抗原攻击而产生此类抗体，但其内源基因座已被禁用。可用于制备这种抗体的示例性技术参见美国专利6,150,584、6,458,592、6,420,140，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，制备的抗体不会在待治疗的动物，例如人类中引起有害的免疫应答。在一些实施方案中，本发明公开的抗体或其抗原结合片段或衍生物使用本领域公认的技术修饰以降低其免疫原性。例如，抗体可以被人源化、灵长类化、去免疫化或者可以制备嵌合抗体。这些类型的抗体来源于非人抗体，通常是鼠类或灵长类抗体，其保留或基本保留亲本抗体的抗原结合特性但在人体中免疫原性较低。其可以通过多种方法来实现，包括(a)将整个非人源的可变区移植到人源的恒定区以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(CDR)的至少一部分移植到人源的框架和恒定区中，保留或不保留关键的框架残基；或(c)移植整个非人源的可变区，但通过用类人源的部分置换表面残基从而“隐藏”它们。

去免疫化也可用于降低抗体的免疫原性。“去免疫化”包括改变抗体以修饰T细胞表位(参见例如国际申请公开号：WO/9852976A1和WO/0034317A2)。例如，分析来自起始抗体的可变重链和可变轻链的序列，并产生来自每个V区的人T细胞表位“图谱”，其显示表位相对于互补决定区(CDRs)和序列内其它关键残基的位置。分析来自T细胞表位图的单个T细胞表位，以鉴定具有较低风险改变最终抗体活性的可选择的氨基酸取代。设计包含氨基酸取代组合的一系列可选的可变重链和可变轻链序列，随后将这些序列掺入到一系列结合多肽中。典型地，产生12至24种抗体的变体，并检测其结合能力和/或功能。然后将包含修饰过的可变区和人类恒定区的完整重链和轻链的基因克隆到表达载体中，随后将质粒转入细胞系以产生完整的抗体。然后利用合适的生物化学和生物学实验中比较抗体，鉴定出最佳的变体。

本发明公开的抗体或抗原结合片段的结合特异性可以通过体外实验，例如免疫共沉淀、放射免疫实验(RIA)或酶联免疫吸附实验(ELISA)来检测。

可用于生产单链Fv(scFv)和抗体的技术的实例包括如美国专利4,946,778和5,258,498，以及Huston et al.，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)、Shu et al.，Proc.Natl.Sci.USA 90：1995-1999(1993)和Skerra et al.，Science 240：1038-1040(1988)中所述及其他已知方法。

对于包括在人体内使用抗体和体外检测实验的某些用途，可以优选使用嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物物种的一类分子，例如具有鼠源单克隆抗体的可变区和人源免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi et al.，BioTechniques 4：214(1986)、Gillies et al.，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)和美国专利5,807,715、4,816,567和4,816397，其全部内容通过引用并入本文。

人源化抗体是能够结合目标抗原的非人源抗体衍生的抗体分子，所述目标抗原具有非人源的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区结合。通常人框架区中的某些框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，优选能够改善抗原结合的残基。这些框架替换可以通过本领域公知的方法鉴定，例如通过模拟CDR和框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合起重要作用的框架残基和通过序列对比以鉴定特定位置上异常的框架残基。(参考Queen et al.，U.S.Pat.No.5,585,089；Riechmann et al.，Nature332：323(1988)，其全部内容通过引用并入本文)。可以使用本领域公知的多种技术使抗体人源化，例如CDR移植(EP239，400、PCT publication WO 91/09967、U.S.Pat.Nos.5,225,539、5,530,101和5,585,089)，修复或者表面重排(EP 592，106、EP 519，596、Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)、Studnicka et al.，ProteinEngineering 7(6)：805-814(1994)、Roguska.et al.，Proc.Natl.Sci.USA 91：969-973(1994))，以及链的重排(U.S.Pat.No.5,565,332)，其全部内容通过引用并入本文。

对于治疗人类患者来说，全人源抗体是特别理想的。全人源抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来自人免疫球蛋白序列的抗体文库进行的噬菌体展示方法。也可参考美国专利4,444,887和4,716,111，以及PCT公布文本WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，每个专利的全部内容通过引用并入本文。

还可以转基因小鼠来生产人源抗体，所述小鼠不能表达功能性内源性免疫球蛋白但能表达人类免疫球蛋白基因。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机引入或通过同源重组引入到小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链基因之外，还可以将人的可变区、恒定区和多样性区域引入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链的免疫球蛋白基因可以通过同源重组分别或同时通过引入人免疫球蛋白基因座而丧失功能。特别地，JH区域的纯合缺失可以防止内源抗体的产生。将修饰过的胚胎干细胞扩增并显微注射进囊胚中以产生嵌合小鼠。然后培育嵌合小鼠以产生表达人源抗体的纯合后代。用选择出的抗原例如全部或部分期望的多肽靶点以常规方式免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得靶向抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，随后发生类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术可以产生可用于治疗的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于这种生产全人源抗体的技术相关综述，可以参见Lonberg and HuszarInt.Rev.Immunol.73：65-93(1995)。关于生产全人源抗体和人单克隆抗体的该技术的详细讨论和生产这种抗体的步骤，参见PCT公布文本WO 98/24893、WO 96/34096、WO 96/33735，以及美国专利5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，其全部内容通过引用并入本文。此外，诸如Abgenix(Freemont，Calif.)和GenPharm(San Jose，Calif.)之类的公司，可以使用上述类似技术提供针对所选抗原的全人源抗体。

也可以使用被称为“引导选择”的技术来生产识别选择性表位的全人源抗体。在该方法中，使用选择的非人单克隆抗体、例如小鼠抗体来引导识别相同表位的全人源抗体的筛选。(Jespers et al.，Bio/Technology 72：899-903(1988)以及美国专利5,565,332，其全部内容通过引用并入本文)。

在另一些实施方案中，使用常规方法(例如使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以容易地分离编码所需单克隆抗体的DNA并对其进行测序。分离的和亚克隆的杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离出来，DNA可以被置于表达载体中，然后被转染到原核或真核宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中。更特别地，分离的DNA(如本文所述可以是合成的)可用于克隆用于制备抗体的恒定区和可变区的序列，如Newman et al和公布于1995年1月25日的美国专利5,658,570中所述，其全部内容通过引用并入本文。实质上，这需要从所选细胞中提取RNA并转化成cDNA，然后使用Ig特异性引物通过PCR技术进行扩增。适于此目的的合适的探针在美国专利5,658,570中也有所提及。如下面将更详细地讨论的，可以相对大批量培养表达所需抗体的转化细胞以提供免疫球蛋白的临床和商业需求。

此外，使用常规重组DNA技术，可将本发明的抗体或抗原结合片段的一个或多个CDR***框架区，例如***到人类框架区以构建人源化非全人源抗体。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，并且优选人类框架区(参见Chothia et al.，J.Mol.Biol.278：457-479(1998)，其列出一系列人类框架区)。优选地，用框架区和CDR组合产生的多核苷酸编码与所需多肽(例如LIGHT)的至少一个表位特异性结合的抗体。优选地，在框架区内进行一个或多个氨基酸取代，并且优选能够改善抗体与其抗原结合的氨基酸取代。另外，可用此法进行参与链间二硫键形成的一个或多个可变区中半胱氨酸残基的取代或缺失，从而产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。本领域技术范围内的对多核苷酸进行的其他改变也涵盖于本发明中。

此外，嵌合抗体技术(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：851-855(1984)、Neuberger et al.，Nature 372：604-608(1984)、Takeda et al.，Nature 314：452-454(1985))，通过剪接来自鼠抗分子、具有合适抗原特异性的基因，以及可以使用的来自具有合适生物学活性的人抗分子的基因。在本发明中，嵌合抗体是其不同部分来源于不同动物物种的分子，例如那些含有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的嵌合抗体。

此外，在Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)中公开了另一种生产重组抗体的高效方法，特别地，该技术能产生含有猴可变区和人恒定区序列的灵长类抗体，该参考文献的全部内容通过引用并入本文。此外，该技术也在共同转让的美国专利5,658,570、5,693,780和5,756,096中有所提及，每个专利的全部内容通过引用并入本文。

抗体可以通过使用常规重组DNA技术制备。使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体的载体及细胞系等。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如Recombinant DNA Technology for Production of ProteinTherapeutics in Cultured Mammalian Cells，D.L.Hacker，F.M.Wurm，in ReferenceModule in Life Sciences，2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。

在一些实施方案中，编码本文所述抗体的DNA可以按常规方法根据抗体氨基酸序列设计合成，置入表达载体中，然后将其转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生单克隆抗体。在一些实施方案中，表达抗体载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polyA尾。其他元件包括增强子，Kozak序列及***序列两侧RNA剪接的供体和受***点。可以通过SV40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN，或者Plncx，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro(+/-)，PSVL，PMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI和pCS2等。常使用的哺乳动物宿主细胞包括293细胞、Cos1细胞、Cos7细胞、CV1细胞、鼠L细胞和CHO细胞等。

在一些实施方案中，***基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、新霉素抗性、潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到无上述基因的宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。

此外，可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本发明所述抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点突变和PCR介导的突变。优选地，变体(包括衍生物)编码相对于参考的重链可变区HCDR1、HCDR2、HCDR3和轻链可变区LCDR1、LCDR2或LCDR3来说少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的取代、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、小于5个氨基酸的取代、小于4个氨基酸的取代、小于3个氨基酸的取代或小于2个氨基酸的取代。或者可以沿着全部或部分编码序列时随机引入突变，例如通过饱和突变，以及可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。

癌症治疗

在本发明中，本发明的抗体、抗原结合片段或衍生物可用于某些治疗和诊断方法中。

本发明将进一步描述基于抗体的疗法，将本发明所述的抗体施用于患者例如动物、哺乳动物和人，从而治疗本文所述的一种或多种紊乱或病症。本发明的治疗性化合物包括但不限于本发明所述抗体(包括本发明所述的抗原结合片段和衍生物)和编码本发明所述抗体(包括本发明所述的抗原结合片段和衍生物)的核酸或多聚核苷酸。

本发明所述抗体还可用于治疗或抑制癌症。TIGIT可以在肿瘤细胞中过表达。肿瘤来源的TIGIT可以结合免疫细胞上的PD-1，从而限制抗肿瘤T细胞的免疫。在小鼠肿瘤模型中使用靶向TIGIT的小分子抑制剂或单克隆抗体的结果表明，靶向TIGIT的疗法是有效控制肿瘤生长重要的替代方法和现实途径。正如在实施例中所证实的，抗TIGIT抗体能激活适应性免疫应答机制，从而提高癌症患者的存活率。

因此，在一些实施方案中，提供了用于治疗有此需要的患者的癌症的方法。在一个实施方案中，该方法需要向患者施用有效剂量的本发明所述抗体。在一些实施方案中，患者体内的至少一种癌细胞(例如基质细胞)会表达、过表达或诱导表达TIGIT。例如，TIGIT的诱导表达可以通过施用肿瘤疫苗或放射疗法来完成。

表达TIGIT蛋白的肿瘤包括膀胱癌、非小细胞肺癌、肾癌、乳腺癌、尿道癌、结肠癌、头颈癌、鳞状细胞癌、梅克尔(Merkel)细胞癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、和小细胞肺癌。因此，本发明公开的抗体可用于治疗任何一种或多种此类癌症。

在本发明中还提供了细胞疗法，例如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法。可以使用合适的细胞与本发明所述的抗TIGIT抗体接触(或者可选地，工程改造以表达本发明所述抗TIGIT抗体)。通过这样的接触或工程改造，细胞可以被引入需要治疗的癌症患者体内。癌症患者可能具有本文所述的任何类型的癌症。细胞(例如T细胞)包括但并不限制以下类型例如肿瘤浸润T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及其组合。

在一些实施方案中，细胞从癌症患者自身体内分离出来。在一些实施方案中，细胞由供体或细胞库提供。当细胞从癌症患者中分离出来时，可以将免疫反应不良反应降至最低。

可以用本发明所述抗体或抗原结合片段或其衍生物来治疗、预防、诊断和/或预测与细胞存活率增加相关的其他疾病或病症，包括但不限于恶性肿瘤和/或相关疾病紊乱的进程或转移，所述疾病紊乱包括白血病{包括急性白血病[例如急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病(包括成髓细胞性、早幼粒细胞性、粒单核细胞性、单核细胞性和红白血病)]和慢性白血病[例如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病]}、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病，以及实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌症如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、卵巢癌、***癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎癌、维尔姆斯氏瘤、***、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

联合疗法

在另一些实施方案中，本发明的组合物与抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗细菌剂或抗生素剂或抗真菌剂联合施用。本领域已知的任何这些药剂可以在本发明的组合物中施用。

在另一些实施方案中，本发明的组合物与化疗剂组合施用。可与本发明组合物一起施用的化疗剂包括但不限于抗生素衍生物(例如阿霉素、博来霉素、柔红霉素和放线菌素D)、抗***药(如他莫昔芬)、抗代谢物(如氟尿嘧啶、5-FU、甲氨蝶呤、氟尿苷、干扰素α-2b、谷氨酸、光神霉素，巯基嘌呤和6-硫基鸟嘌呤)、细胞毒性剂(如卡莫司汀、BCNU、洛莫司汀、CCNU、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、甲基苄肼、丝裂霉素、白消安、顺铂和硫酸长春新碱)、激素(如甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸钠、炔雌醇、***、醋酸甲地孕酮、***、己烯雌酚二磷酸、氯烯雌醚和睾内酯)、氮芥衍生物(例美法仑、苯丁酸氮芥、二氯甲基二乙铵(氮芥)和噻替哌)、类固醇及其组合(如倍他米松磷酸钠)，以及其它化合物(如氮烯唑胺、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱和依托泊苷)。

在一些实施方案中，本发明的组合物与细胞因子联合施用。可以与本发明组合物一起施用的细胞因子包括但不限于IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、抗CD40、CD40L和TNF-α。

在一些实施方案中，本发明的组合物与其它治疗或预防方案，例如放射性疗法联合施用。

本发明还提供了联合疗法，包括使用一种或多种本发明的抗TIGIT抗体以及第二抗癌剂(化疗剂)。化疗剂的实例包括免疫治疗剂，包括但不限于适用于治疗患者的治疗性抗体。治疗性抗体的一些实例包括辛妥珠单抗(simtuzumab)、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德卡妥姆单抗(adecatumumab)、阿富妥珠单抗(afutuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿马妥昔单抗(amatuximab)、阿纳妥姆单抗(anatumomab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、巴维妥昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝伐单抗(bevacizumab)、比伐单抗(bivatuzumab)、布莱纳妥姆单抗(blinatumomab)、布伦妥昔单抗(brentuximab)、坎妥珠单抗(cantuzumab)、卡妥马索单抗(catumaxomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、西妥珠单抗(citatuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、克里瓦妥珠单抗(clivatuzumab)、克那妥姆单抗(conatumumab)、达拉妥姆单抗(daratumumab)、乔奇妥单抗(drozitumab)、杜利戈妥单抗(duligotumab)、杜西吉妥单抗(dusigitumab)、地莫单抗(detumomab)、达塞妥珠单抗(dacetuzumab)、达洛妥珠单抗(dalotuzumab)、埃克洛莫昔单抗(ecromeximab)、埃洛妥珠单抗(elotuzumab)、恩西妥昔单抗(ensituximab)、厄妥马索单抗(ertumaxomab)、伊他拉昔珠单抗(etaracizumab)、法勒妥珠单抗(farletuzumab)、菲可拉妥珠单抗(ficlatuzumab)、菲吉妥姆单抗(figitumumab)、弗兰沃妥单抗(flanvotumab)、富妥昔单抗(futuximab)、加尼妥单抗(ganitumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、吉伦妥昔单抗(girentuximab)、格兰巴妥姆单抗(glembatumumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、伊戈伏单抗(igovomab)、伊姆加妥珠单抗(imgatuzumab)、英达妥昔单抗(indatuximab)、伊诺妥珠单抗(inotuzumab)、因替妥姆单抗(intetumumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊拉妥姆单抗(iratumumab)、拉贝妥珠单抗(labetuzumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab)、卢卡妥姆单抗(lucatumumab)、玛帕妥姆单抗(mapatumumab)、玛妥珠单抗(matuzumab)、米拉妥珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥姆单抗(mitumomab)、莫斜妥姆单抗(moxetumomab)、纳那妥单抗(narnatumab)、纳妥姆单抗(naptumomab)、内吉妥姆单抗(necitumumab)、尼莫妥珠单抗(nimotuzumab)、诺费妥单抗(nofetumomab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉妥珠单抗(olaratumab)、奥那妥珠单抗(onartuzumab)、奥泼妥珠单抗(oportuzumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕萨妥珠单抗(parsatuzumab)、帕崔妥单抗(patritumab)、彭妥姆单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、平妥姆单抗(pintumomab)、普拖木单抗(pritumumab)、拉蔻妥姆单抗(racotumomab)、拉吉妥姆单抗(radretumab)、里洛妥姆单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、洛巴妥姆单抗(robatumumab)、沙妥莫单抗(satumomab)、思布妥珠单抗(sibrotuzumab)、思妥昔单抗(siltuximab)、索力图单抗(solitomab)、塔卡妥珠单抗(tacatuzumab)、塔普利妥珠单抗(taplitumomab)、特纳妥姆单抗(tenatumomab)、特普洛妥姆单抗(teprotumumab)、提咖妥珠单抗(tigatuzumab)、拖西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、图库图珠单抗(tucotuzumab)、尤不理妥昔单抗(ublituximab)、维尔妥珠单抗(veltuzumab)、沃思妥珠单抗(vorsetuzumab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎鲁妥姆单抗(zalutumumab)、CC49和3F8。利妥昔单抗可用于治疗惰性B细胞癌，包括边缘区淋巴瘤、WM、CLL和小淋巴细胞性淋巴瘤。利妥昔单抗和化疗药物的组合是特别有效的。

在一些实施方案中，本文所述化合物和组合物可以与一种或多种其它治疗剂一起使用或组合。所述一种或多种治疗剂包括但不限于Abl抑制剂、激活的CDC激酶(ACK)、腺苷A2B受体(A2B)、凋亡信号调节激酶(ASK)、Auroa激酶、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)、BET-溴结构域(BRD)如BRD4、c-Kit、c-Met、CDK激活激酶(CAK)、钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、酪蛋白激酶(CK)、盘状结构域受体(DDR)、表皮生长因子受体(EGFR)、粘着斑激酶(FAK)、Flt-3、FYN、糖原合酶激酶(GSK)、HCK、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、IKK如IKKβε、异柠檬酸脱氢酶(IDH)如IDH1、Janus激酶(JAK)、KDR、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、赖氨酰氧化酶蛋白质、赖氨酰氧化酶样蛋白(LOXL)、LYN、基质金属蛋白酶(MMP)、MEK、有丝***原激活蛋白激酶(MAPK)、NEK9、NPM-ALK、p38激酶、血小板衍生生长因子(PDGF)、磷酸化酶激酶(PK)、polo样激酶(PLK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶(PK)如蛋白激酶A，B和/或C、PYK、脾酪氨酸激酶(SYK)、丝氨酸/苏氨酸激酶TPL2、丝氨酸/苏氨酸激酶STK、信号转导和转录(STAT)、SRC、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(TBK)如TBK1、TIE、酪氨酸激酶(TK)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)或以上任何组合。

在一些实施方案中，本发明的抗TIGIT抗体可以与免疫检查点抑制剂一起使用。免疫检查点是免疫***中的一类分子，其可以是一种上调信号(共刺激分子)或是一种下调信号(共抑制分子)。许多癌症通过共抑制分子的激动剂或共刺激分子的拮抗剂来抑制T细胞信号，从而保护自己免受免疫***的攻击。免疫检查点激动剂或拮抗剂可以帮助阻止这种保护机制。免疫检查点激动剂或拮抗剂可以靶向以下检查点分子中的任何一个或多个：PD-L1、PD-1、CTLA-4、LAG-3(也称为CD223)、CD28、CD122、4-1BB(也称为CD137)、TIM3、OX-40/OX40L、CD40/CD40L、LIGHT、ICOS/ICOSL、GITR/GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM或BTLA(也称为CD272)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体为Pembrolizumab、Nivolumab、Toripalimab、Sintilimab、Tislelizumab、Camrelizumab和Genolimzumab中的一种或多种。在一些实施方案中，抗PD-1抗体为Pembrolizumab。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体为Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab、Envafolimab和Cosibelimab中的一种或多种。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体为Atezolizumab。

对于任何上述组合治疗，抗TIGIT抗体可以与另一种抗癌剂同时或分开施用。当单独施用时，可以在施用另一种抗癌剂之前或之后施用抗TIGIT抗体。

治疗感染

如在实验实施例中所证实的，本发明的抗体可以激活免疫应答，从而用于治疗感染。

感染是由致病因子侵入生物体组织、它们的繁殖以及宿主组织对这些生物体及它们产生的毒素的反应。感染可能由传染原引起，例如病毒、类病毒、朊病毒、细菌、线虫如寄生性蛔虫和蛲虫、节肢动物如蜱、螨虫、跳蚤和虱子、真菌如癣以及其他大寄生物如绦虫和其他蠕虫。在某一方面，传染原是细菌，如革兰氏阴性细菌。在某一方面，传染原是病毒，例如DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒。病毒的非限制性实例包括腺病毒、柯萨奇病毒、EB病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、HIV、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人***瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒。

本发明的抗体还可以用于治疗由微生物引起的传染病，或者通过靶向结合微生物和免疫细胞杀灭微生物以实现消除微生物的目的。在某一方面，微生物是包括RNA和DNA病毒的病毒、***、革兰氏阴性细菌、原生动物或真菌。表4提供了传染性疾病和相关微生物的非限制性实例。

治疗方法

对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定抗体及其抗原结合片段或衍生物、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、***频率、药物组合，以及所治疗的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所述剂量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度以及所需的效果。所用剂量可以通过本领域熟知的药理学和药代动力学原理确定。

抗体及其抗原结合片段的施用方法包括但不限于真皮内、肌肉、腹腔、静脉、皮下、鼻腔、硬脊膜外注射和口服。抗体或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，含有本发明的抗体的药物组合物可以口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、***内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾给药。

本发明使用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。

施用方式可以是全身施用或局部施用。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的抗体引入中枢神经***，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管连接到如贮液囊(可以是Ommaya贮液囊)来辅助注射。也可以通过肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及使用雾化的制剂。

可能需要将本发明的抗体多肽或组合物局部施用于需要治疗的区域；可以通过但不限于以下方式：手术期间局部输注，例如与手术后伤口敷料联合的局部应用，通过注射，通过导管，借助栓剂或借助植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜(例如硅橡胶膜)或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。

在一些实施方案中，本发明组合物包含编码蛋白质的核酸或多聚核苷酸，可以通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分来体内施用所述核酸以促进其编码的蛋白质的表达，然后通过下述方式施用上述部分载体使其变为胞内部分，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或者通过与已知进入细胞核的同源异型盒类肽连接施用(参见例如Joliot et al.，1991，Proc.Natl.A cad.Sci.USA88：1864-1868)等等。可选地，核酸可以通过同源重组在引入细胞内并整合至宿主细胞DNA中用于表达。

可以通过标准的临床技术确定本发明抗体的剂量，该剂量将有效治疗、抑制和预防炎症、免疫或恶性疾病、紊乱或病症。此外，可以任选地采用体外实验来帮助确定最佳剂量范围。制剂使用的准确剂量也取决于给药途径和疾病、紊乱或病症的严重程度，且应根据医师的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可以从体外或动物模型测试***得到的剂量反应曲线推测出来。

在一些实施方案中，本发明的抗体施用于患者的剂量通常为0.1mg/kg至100mg/kg，0.1mg/kg至20mg/kg，或1mg/kg到10mg/kg。通常，由于对外源多肽的免疫应答，人抗体在人体内的半衰期比其他物种的抗体长。因此，较低剂量的人抗体和较少的给药频率通常是可行的。此外，可以通过例如脂质化等修饰来增强抗体的摄取和组织穿透能力(例如进入脑内)，从而减少本发明抗体的施用的剂量和频率。

通常在进行体外测试用于治疗感染性或恶性疾病、紊乱或病症的方法，包括施用本发明所述抗体、抗原结合片段或衍生物，然后在可接受的动物模型中体内测试期望的治疗性或预防性活性，最后施用于人体。合适的动物模型(包括转基因动物)是本领域普通技术人员所公知的。例如，用于证明本发明所述抗体或抗原结合片段的治疗用途的体外测定包括抗体或抗原结合片段对细胞系或患者组织样品的影响。抗体或抗原结合片段对细胞系和/或组织样品的作用可以利用本领域技术人员已知的技术进行检测，例如本发明其他部分公开的技术。根据本发明的内容，可用于确定是否施用特异性抗体或抗原结合片段的体外测定实验包括体外细胞培养实验，其中患者组织样品在培养物中培养，并暴露于或以其他方式施用化合物，并观察这种化合物对组织样品的影响。

各种输送***是已知的，并且可用于施用本发明抗体或编码本发明抗体的多核苷酸，例如包封于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu and Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。

诊断方法

在某些肿瘤样品中观察到TIGIT的过表达，并且具有TIGIT过表达的细胞的患者可能对使用本发明的抗TIGIT抗体的治疗有响应。因此，本发明的抗体也可以用于诊断和预后。

优选包含细胞的样品可以从患者体内获得，该患者可以是癌症患者或待诊断的患者。细胞是肿瘤组织或肿瘤块、血液样本、尿液样本或来自患者的任何样本的细胞。在选择性地对样品进行预处理之后，可以在允许抗体与可能存在于样品中的TIGIT蛋白相互作用的条件下，将样品与本发明的抗体一起孵育。可以使用诸如ELISA的方法，利用抗TIGIT抗体来检测样品中TIGIT蛋白的存在。

样品中TIGIT蛋白的存在(任意的含量或浓度)可以用于诊断癌症，其可以作为患者适用抗体治疗的指示，或作为患者已经(或没有)对癌症治疗作出反应的指示。对于预后方法，可以在开始癌症治疗时在特定阶段进行一次、两次或更多次地检测，以指示治疗的进展。

组合物

本发明还提供了药物组合物。这样的组合物包含有效剂量的抗体和可接受的载体。在一些实施方案中，组合物还包含第二抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂)。

在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”是指药典中列出的用于动物、特别是用于人类的物料。此外，“药学上可接受的载体”通常将是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。

术语“载体”是指施用于治疗的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸，以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖也是可以预见的。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences中有描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。亲本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

在一些实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。具有代表性地是，用于静脉内给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。

本发明的化合物可以配制成中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括与衍生自如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐，以及与衍生自如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成的盐。

下述实施例中，如无明确说明，所使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得；所使用的方法均为本领域常规技术，本领域技术人员根据实施例描述的内容可以毫无疑问地实施所述实施例并获得相应的结果。

部分细胞的构建：

参考文献：Yu，X.，et al.(2009).″The surface protein TIGIT suppresses Tcell ac tivation by promoting the generation of mature immunoregulatorydendritic cells.″Nat ure immunology 10(1)：48-57.和Neumann，F.，et al.(1995).″Human ribosomal protein L7inhibits cell-free translation in reticulocytelysates and affects the expression of nuclear proteins upon stabletransfection into Jurkat T-lymphoma cells.″Nucleic acids research 23(2)：195-202.的技术，构建过表达人TIGIT的Jurkat细胞、sAPC细胞和CTI-Jurkat细胞。

sAPC细胞的构建：将编码鼠抗人CD3单链抗体的重链可变区核苷酸序列(SEQ IDNO.51)、连接子(SEQ ID NO.52)、鼠抗人CD3单链抗体的轻链可变区核苷酸序列(SEQ IDNO.53)和编码PVR的核苷酸序列(SEQ ID NO.54)转染入CHO-K1细胞(ATCC，CCL-61)中，得到在细胞膜稳定表达人PVR和鼠抗人CD3单链抗体的细胞系sAPC。

CTI-Jurkat细胞的构建：将人全长TIGIT基因(SEQ ID NO.55)、人全长CD226基因(SEQ ID NO.56)、IL-2响应元件(SEQ ID NO.57)、荧光素酶报告基因质粒pNF_KB-TA-luc(碧云天，D2207)转染入Jurkat细胞系(ATCC，Clone E6-1，TIB-152^TM)中，得到可以稳定表达人TIGIT和人CD226分子的细胞系CTI-Jurkat。

过表达人TIGIT的Jurkat细胞的构建：将人全长TIGIT基因(SEQ ID NO.55)转染入Jurkat细胞系(ATCC，Clone E6-1，TIB-152^TM)中，得到可以稳定表达人TIGIT细胞系Jurkat-hTIGIT 2E6。

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实施例

实施例1 PVR-Fc和TIGIT-Fc融合蛋白的表达与纯化

PVR胞外区氨基酸残基序列(SEQ ID NO：1)，按照人密码子偏爱性特征进行序列优化，优化后得到核苷酸序列SEQ ID NO：2。添加酶切位点，通过链接子(linker，SEQ ID NO：6和7)，与人IgG1恒定区序列(SEQ ID NO：28，核苷酸序列见SEQ ID NO：46下划线部分)进行融合，见示意图(图1)，融合之后的序列被***到pCDNA3.1+载体(Invitrogen，V790-20)中，然后瞬时转染293F细胞。培养完成的细胞上清通过ProteinA亲和层析纯化，纯化得到的融合蛋白命名为PVR-Fc。

TIGIT胞外区氨基酸残基序列(SEQ ID NO：3)，按照人密码子偏爱性特征进行序列优化，优化后得到核苷酸序列SEQ ID NO：48。添加酶切位点，通过链接子(linker，SEQ IDNO：6和7)，与人IgG1恒定区序列(SEQ ID NO：28，核苷酸序列见SEQ ID NO：46下划线部分)进行融合，见示意图(图2)，融合之后的序列被***到pCDNA3.1+载体中，然后瞬时转染293F细胞。培养完成的细胞上清通过ProteinA亲和层析纯化，纯化得到的融合蛋白命名为TIGIT-Fc。

表1.1：获得抗体的相关序列

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实施例2产生鼠抗人TIGIT抗体

用人TIGIT胞外区与人IgG-Fc融合的蛋白即实施例1种所述的TIGIT-Fc免疫6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(广东省医学实验动物中心)，在初次免疫2-3周后进行再次免疫，然后约3周后进行加强免疫之后摘除脾脏制备脾淋巴细胞，将脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞(Sp2/0细胞，中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号TCM18)进行融合。通过和TIGIT-Fc是否有效结合的方式筛选杂交瘤，阳性的杂交瘤通过有限稀释进一步亚克隆，然后再次鉴定和TIGIT-Fc的结合能力，以及阻断TIGIT-Fc和PVR-Fc的结合能力，最终得到6株单克隆杂交瘤，其中有1株各方面特征表现较好，这株单克隆杂交瘤为10D8。

根据文献中提到的方法(Bradbury，A.(2010).Cloning Hybridoma cDNA byRACE.Antibody Engineering.R.Kontermann and S.Dübel.Berlin，Heidelberg，SpringerBerlin Heidelberg：15-20)，合成特异性引物，克隆杂交瘤细胞抗体目的基因。杂交瘤测序过程如下：1)复苏杂交瘤细胞，放入T25细胞培养瓶中，培养基为RPMI1640(10％FBS)，然后传2代；2)取500万杂交瘤细胞，使用EasyPure RNAkit(北京全式金生物技术有限公司，货号：ER101)抽提RNA；3)以抽提的RNA为模板，用反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，货号：AT321)合成cDNA；4)然后以cDNA为模板用合成的特异性引物扩增抗体序列的目的条带。为了保证扩增过程中不发生突变使用FastPfu(北京全式金生物技术有限公司，货号：AP221)；5)将扩增到的重链和轻链的目的片段分别克隆到平端克隆载体中(北京全式金生物技术有限公司，货号：CB111)，然后分别涂布平板；6)待克隆长出后，分别挑去5个重链克隆和5个轻链克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序；7)测序结果用NCBIblasttool、NCBI IGBlast Tool等分析程进行分析，找到抗体的重链可变区序列与轻链可变区序列；8)将鼠抗人TIGIT抗体可变区序列以小鼠密码子偏爱性为基础进行密码子优化，然后序列合成。合成的可变区序列和小鼠IgG2a重链恒定区框架(SEQ ID NO：31，SEQ IDNO：49)及小鼠kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：50)框架进行融合然后克隆入pCDNA3.1+载体，之后分别将重链质粒和轻链质粒按照1∶1的比例瞬时转染CHO-S细胞(Bibco，货号：A29133)，得到的抗体即为重组的鼠抗人TIGIT抗体，命名为m10D8。

m10D8重链V区的序列见SEQ ID NO：20，轻链V区序列见SEQ ID NO：24。m10D8抗体HCDR1序列为SSYGMS(SEQ ID NO：21)，HCDR2序列为TINSNGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO：22)，HCDR3序列为LGTGTLGFAY(SEQ ID NO：23)；LCDR1序列为KASQDVKTAVS(SEQ ID NO：25)，LCDR2序列为WASTRHT(SEQ ID NO：26)，LCDR3序列为QQHYSTPWT(SEQ ID NO：27)。

重组表达得到的抗体通过ELISA进一步验证其与人TIGIT(见图3)、猴子TIGIT(见图4)、小鼠TIGIT(见图5)的结合能力，阳性对照抗体为10A7抗体(仓鼠抗鼠TIGIT，见SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30)。结果表明m10D8可以很好的与人TIGIT以及猴子TIGIT结合，但是不和小鼠TIGIT结合。用Biacore-SPR仪器对这m10D8抗体进行亲和力测定，其结合常数为1.02E+06(1/Ms)，解离常数为2.00E-04(1/s)，平衡解离常数K_D为1.97E-10(M)。

表2.1：抗TIGIT抗体及相关CDR序列

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实施例3鼠抗人TIGIT抗体阻断TIGIT与其配体PVR的结合能力

众多研究表明，抗TIGIT抗体阻断TIGIT与其配体PVR的结合可以恢复效应T细胞及NK细胞的功能，因此通过体外实验研究筛选到的鼠抗人TIGIT能否阻断TIGIT与其配体PVR的结合很有必要。

从-80℃冰箱中取适量PVR-Fc蛋白，使用Thermo scientific公司的生物素标记试剂盒(HSulfo-NHS-LC-BiotinylationKit，货号：21435)，按照说明书中的操作步骤对PVR-Fc进行生物素化标记，标记后的蛋白命名为PVR-Fc-bio。实验操作过程如下：1)包被TIGIT-Fc(2μg/ml)，包被液为1×PBS(磷酸盐缓冲液)，4℃过夜包被；2)用3％BSA在37℃恒温箱中封闭2h；3)用PBS稀释PVR-Fc-bio，PVR-Fc-bio的终浓度为2μg/ml，此溶液作为抗体稀释液；4)将m10D8和阳性对照抗体10A7抗体(仓鼠抗鼠TIGIT，见SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30)、阴性无关对照抗体稀释液进行稀释，起始浓度为8μg/ml，对半稀释，每孔加100μl，37℃恒温箱中孵育2h后，用PBST(含0.05％吐温20的PBS)洗8次；5)加酶标二抗(Jackson Immuno Research Inc.，货号：016-030-084，1∶10000稀释)，每孔加100μl，在37℃恒温箱中孵育1h，然后用PBST洗8次；6)用TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)显色液显色，每孔100μl。7)加2MH₂SO₄终止显色，用酶标仪在450nm波长下读数。结果见图6所示，m10D8在同样条件下竞争抑制曲线处于阳性抗体10A7的曲线下方，表明相对于阳性抗体来说m10D8阻断TIGIT与其配体PVR的结合能力较强。

实施例4鼠抗人TIGIT抗体的生物学功能检测

模拟初始T细胞完全活化需要第一信号和第二信号的共同参与，依据此原理开发了抗TIGIT抗体的生物学活性检测方法。在此检测***中，有2种细胞，分别是人工构建的类似抗原递呈细胞(sAPC)，此细胞过表达鼠抗人CD3单链抗体，同时过表达PVR；另一种细胞过表达TIGIT和CD226的工程化Jurkat细胞(CTI-Jurkat)，另外此细胞还转染有依靠IL-2启动子启动转录翻译的荧光素酶报告基因检测元件。sAPC细胞膜上抗人CD3单链抗体与Jurkat细胞膜上的T细胞受体(T cell receptor，TCR)结合激活T细胞属于第一信号，sAPC细胞膜上PVR与Jurkat细胞上的激活受体CD226或抑制受体TIGIT相互作用引发的信号传导属于第二信号。在无抗TIGIT抗体参与的情况下，由于PVR与TIGIT亲和力远远高于PVR与CD226的亲和力，因此PVR与TIGIT优先结合引发TIGIT胞内结构域信号传导抑制T细胞的增殖与细胞因子释放，同时PVR阻挠同一细胞表面的CD226形成有功能的二聚体影响CD226的正常生理功能，另外由于CD226与PVR亲和力较弱，同样条件下竞争不过TIGIT与PVR的结果，因此无法有效激活T细胞，这样T细胞总体上处于抑制状态，IL-2启动子无法有效启动荧光素酶报告基因的转录翻译。相反，当检测***中有抗TIGIT抗体存在，高亲和力的抗TIGIT抗体可以结合TIGIT，从而阻止TIGIT与PVR的信号传导，同时TIGIT也无法阻挠CD226二聚体化，则CD226可以和PVR有效结合从而使CD226胞内结构域信号进行传导激活T细胞，IL-2启动子有效启动荧光素酶报告基因的转录翻译，在荧光素酶底物的参与下可以自发发射荧光信号被仪器捕捉到。

准备sAPC细胞。用CD CHO AGT^TM培养基(含25μM MSX和400μg/ml潮霉素)将sAPC培养至对数生长期，然后800rpm离心5分钟，用Ham’s F-12培养基(含10％FBS)将sAPC重悬至40万/ml，然后用排枪铺96孔板对应孔，每孔100μl，即每孔4万个细胞，然后放置于8％CO₂37℃培养箱中过夜培养，第二天将培养基倒掉，然后将细胞培养板倒扣在吸水纸上将残留的培养基吸干。

准备CTI-Jurkat细胞。用10％含FBS的1640培养基将CTI-Jurkat培养至对数期，然后用1640(1％FBS)培养基将CTI-Jurkat细胞重悬至500万/ml，然后用排枪铺将CTI-Jurkat细胞加入到sAPC的孔中，每孔40μl，即每孔20万个细胞。

准备抗体。将m10D8、阳性对照抗体Tiragolumab(见SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30)和阴性对照抗体BAT5906(见中国专利申请，CN110003328A)用1640(1％FBS)培养基进行稀释，设置3个浓度分别为64、32、16、0μg/ml。然后将稀释好的抗体加入到已铺好sAPC和CTI-Jurkat细胞的孔中，每孔40μl(即抗体终浓度为32、16、8、0μg/ml)。

将加完样的细胞培养板放置于8％CO₂37℃培养箱孵育4个小时后，取出放置于室温条件下10分钟，让细胞培养板恢复到室温温度。然后将荧光素酶底物(提前2小时从-20℃冰箱取出，放置于室温)加入到对应的样品孔中，每孔80μl。将培养板放入酶标仪，震荡5s中，然后10分钟后读取荧光值，见图7所示。结果表明Tiragolumab和m10D8都具有激活T细胞的功能，但是同样条件下m10D8激活T细胞功能的能力最强。

实施例5鼠抗人TIGIT抗体的人源化

将鼠抗人TIGIT抗体的重链可变区和轻链可变区与人抗体数据库中的序列进行比较，结果见表5.1所示。人源化过程要兼顾成药性和药物潜在的免疫原形，同时也要保证抗体的高亲和力，结合生物信息学建模计算，m10D8人源化抗体第一次人源化设计了3个突变子，分别是：h10D8V1(见SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30)、h10D8V2(见SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30)、h10D8V3(见SEQID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30)。h10D8V1和h10D8V2的轻链可变区框架为IGKV4-1*01，重链可变区框架为IGHV3-23*01。h10D8V3重链可变区框架为IGHV3-64*04，轻链可变区框架为IGKV1-NL1*01。将突变子蛋白与TIGIT进行结合实验，同时也检测生物学活性。将纯化好的h10D8V1、h10D8V2、h10D8V3与TIGIT进行结合实验，ELISA结果显示(见图8所示)，3者的EC50(能引起50％最大效应的浓度)分别为：0.07623μg/ml、0.09241μg/ml、0.05259μg/ml，从EC50上来看h10D8V3似乎与TIGIT的结合能力更强些，但是ELISA结果反应的静态的抗原与抗体结合情况，并不能动态的反应抗体与抗原的结合与解离情况，故此通过SPR-Biacore技术测定此3个抗体与TIGIT-histag抗原的平衡解离常数KD(见图9所示和表5.2所示)。在此结果中可以看到h10D8V3相对于另外2个抗体来说结合速率较慢，而解离速率较快，平衡解离常数数值大于另外2个抗体，即亲和力小于另外2个抗体。h10D8V1和h10D8V2的可变区完全一致，仅有的区别是恒定区区域356位(Eu编码，对应的kabat编码为：377位)和358位(Eu编码，对应的kabat编码为：381位)有2个氨基酸残基的区别，所以在亲和力上区别并不大。同时又对h10D8V1、h10D8V2、h10D8V3的生物学活性方法进行了对比(方法参考实施例4)，结果表明(见图10所示)h10D8V1、h10D8V2和h10D8V3激活T细胞的能力比较接近，表明3者的生物学活性接近。

表5.1鼠源抗体与人胚系基因数据库(IMGT Scientific Chart)比对结果

表5.2 h10D8V1、h10D8V2、h10D8V3、与TIGIT-his tag抗原的平衡解离常数测定

根据h10D8V1、h10D8V2、h10D8V3的结果，又对m10D8进行了第二次人源化设计，又得到了3个突变子，分别是h10D8OF(见SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30，即重链的序列为SEQ ID NO：44，轻链的序列为SEQ ID NO：45)、h10D8V4(见SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30)、h10D8V5(见SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30)。h10D8OF重链框架为IGHV3-64*04，轻链所用框架为IGKV3D-7*01。h10D8V4重链框架为IGHV3-64*04，轻链框架为IGKV4-1*01，主要特点是框架上一些氨基酸残基与鼠源抗体m10D8保持一致，h10D8V5重链框架和轻链框架与h10D8V4一样，主要特点是抗体和抗原的接触面(interface)尽量和鼠源抗体m10D8与TIGIT的接触面保持一致。对h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5结合TIGIT的能力进行了横向比较，见图11所示，结果表明h10D8OF、h10D8V4、h10D8V53者的结合曲线基本重合，EC50值分别为：0.02329μg/ml、0.02560μg/ml、0.02408μg/ml。

同时比较了h10D8OF和h10D8V2结合TIGIT的能力，两者结合曲线重合度较高，h10D8OF EC50值比h10D8V2稍小一些，仅从ELISA结果来看表明前者亲和力可能稍高一些(见图12所示)，h10D8OF、h10D8V2和Tiragolumab的EC50值分别为：0.04273μg/ml、0.05310μg/ml、0.05361μg/ml。又通过SPR-Biacore技术检测了h10D8OF、h10D8V2、Tiragolumab的与TIGIT-his tag抗原的平衡解离常数K_D(见图13所示和表5.3所示)，通过动态的亲和力检测可以发现h10D8V2与单价的TIGIT-his亲和力高于h10D8OF。同时又检测了h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5的生物学活性，检测方法与实施例4类似，结果表明(见图14所示)，在较高浓度(32μg/ml)时，h10D8OF恢复T细胞功能的能力较强，而h10D8V4、h10D8V5结果非常接近。

表5.3h10D8OF、h10D8V2与TIGIT-his tag抗原的平衡解离常数测定(a)

(a)注：本表格所用的TIGIT-his tag与表5.2中所用抗原批次不同，故结果有一定差异。

表5.4：人源化序列

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实施例6人源化抗体阻断TIGIT与PVR结合实验

鼠源抗体人源化之后理论上依旧保持鼠源抗体的一些功能，如阻断TIGIT与PVR结合。人源化抗体阻断TIGIT与PVR结合实验方法与实施例3方法类似。通过ELISA的方式，检测了h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5、Tiragolumab(阳性对照抗体)、无关抗体(Isotype control)BAT5906在同样条件下阻断TIGIT与PVR结合的能力。实验结果表明(见图15所示)，h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5、Tiragolumab都可以有效阻断TIGIT与PVR的结合，IC50值(导致50％抑制的浓度)分别为：0.1592μg/ml、0.2166μg/ml、0.2837μg/ml和0.4289μg/ml。从IC50值和4参数曲线的上下平台值来看，h10D8OF、h10D8V4阻断TIGIT与PVR结合的能力要强于阳性抗体Tiragolumab。

另外用过表达人TIGIT的Jurkat细胞(Jurkat-hTIGIT 2E6)再次验证了这些抗体阻断生物素化PVR与Jurkat细胞表面TIGIT的结合能力。反应体系如下：用PBS配制浓度为80nM的生物素化PVR-Fc蛋白溶液作为抗体稀释液稀释抗体。抗体起始浓度为15nM，对半稀释，共设置10个浓度梯度(包括0nM)，将10个浓度梯度抗体分别分装到10个分别含有100万Jurkat-hTIGIT细胞的离心管中，然后重悬细胞，放入4℃孵育1个小时。然后将每管细胞离心弃上清，用PBS洗2次。之后每管加入1∶2000稀释的StreptavidinPE(Thermo，货号：12-4317-87)100μl，重悬后放入4℃孵育40分钟。之后将每管细胞离心弃上清，用PBS洗2次后，用200μl PBS重悬，然后用流式分析仪检测细胞的荧光值(mean FL2-A)。最后将采集到的荧光值用4参数拟合作图分析，计算IC50值。h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5的IC50值(见图16所示)分别为：11.26nM、15.78nM、10.44nM，3个抗体都可以有效阻断生物素化PVR-FC与Jurkat-hTIGIT细胞膜表面的TIGIT结合，h10D8OF和h10D8V5阻断的效果更好些。同时又将h10D8OF与阳性抗体Tiragolumab阻断PVR与TIGIT的结合能力进行了对比(见图17所示)，h10D8OF阻断效果较强一些。

实施例7人源化抗体ADCC活性检测

在Jurkat细胞(ATCC，Clone E6-1，货号为：TIB-152^TM)中转染NFAT和荧光素酶报告基因(luciferase reporter gene)元件，以及FcγRIIIa(CD16)受体基因，此构建成功的稳定细胞系稳定表达FcγRIIIa受体，其是介导ADCC生物学活性的必要分子，通过单抗将效应细胞与靶细胞连接起来，激活NFAT通路，启动荧光素酶报告基因的表达。在Jurkat细胞(ATCC，Clone E6-1)中转染人TIGIT基因，使其过表达人TIGIT分子，此稳定细胞系为靶细胞。检测抗体ADCC活性的过程如下：1)根据细胞密度取适量的细胞，1200rpm 5min离心去除生长培养基，然后调整细胞密度。2)将2种细胞混匀铺细胞培养板(Corning，货号：3917)。效应细胞为8万个/孔，靶细胞为2万个/孔，每孔两种细胞总体积为50μl。3)用1％FBS 1640作为稀释培养基稀释抗体。h10D8OF、Tiragolumab和无关抗体(无ADCC活性)，起始浓度为1.8μg/ml(每孔50μl，终浓度为0.9μg/ml)，1/3稀释，每个浓度梯度设置3个复孔，最后一个浓度梯度为0μg/ml。4)将入抗体后轻轻拍打板子使样品混匀。然后至于37℃ 8％CO₂培养箱，孵育4个小时。5)孵育接收后之后室温放置10min，荧光素酶底物试剂也要提前平衡至室温条件。每孔加入100μl底物反应液，10min后开始读数。结果见图18所示，h10D8OF和Tiragolumab都具有ADCC活性，同样条件下h10D8OF ADCC活性稍好于Tiragolumab。

在另外一个实验中，对分泌h10D8OF的宿主细胞CHO进行改造(改造方法见专利CN107881160A和WO2019029713 A1)，去除h10D8OF抗体的岩藻糖，并将该抗体命名为h10D8OFKF。采用与上述类似的方法比较h10D8OFKF与h10D8OFADCC活性的差异。结果见图19所示，h10D8OFKF和h10D8OF都具有ADCC活性，EC50分别为0.0152nM和0.125nM，同样条件下h10D8OFKF ADCC活性是h10D8OF的8.8倍，更强的ADCC活性可能在体内具有更好的药效。

实施例8在人源化抗TIGIT抗体作用下细胞因子释放实验

TIGIT与表达于肿瘤细胞表面或者APC细胞表面的PVR(CD155)结合后会下调T细胞的效应功能和抑制抗肿瘤免疫响应。对抗TIGIT抗体阻断PVR介导抑制T细胞细胞因子释放的能力进行了检测。购买的人原代CD3+细胞(广州市雷德生物科技有限公司，货号：1507)用含PHA(2μg/ml)和IL-2(4ng/ml)的10％FBS 1640培养基中进行诱导培养10天，之后将细胞离心并重悬到无PHA和IL-2的培养基中，然后放置入5％CO237℃的细胞培养箱静息培养24小时。之后将细胞重悬到5×10^5个/ml，然后用无关抗体BAT5906(见中国专利申请，CN110003328A)、h10D8OF(25μg/ml和10μg/ml)、Tiragolumab(25μg/ml和10μg/ml)一起在室温下孵育30min。孵育完成之后将细胞接种到预包被有抗CD3抗体(10μg/ml)(BD生物科学公司，货号为555336)或PVR-Fc(10μg/ml)或抗CD3抗体(10μg/ml)和PVR-Fc(10μg/ml)细胞培养板中，然后置于细胞培养箱(37℃、5％CO₂)中培养48小时。最后将细胞培养板中的细胞取出，离心保留上清。将上清稀释一定倍数后检测细胞上清中IFN-γ和IL-2的细胞因子释放。

以单独用抗CD3抗体诱导淋巴细胞所产生的细胞因子为基准，其它处理诱导产生的细胞因子与其进行比值，前者设为1.0，后者以实际比值表示，结果见图20和21所示。结果表明：h10D8OF随着浓度的增加其诱导淋巴细胞产生更多的IFN-γ和IL-2。实施例9通过B-hPD-1/hTIGIT双人源化小鼠接种MC38肿瘤模型验证抗TIGIT抗体对肿瘤抑制的能力

由于人源化抗体不识别小鼠TIGIT，所以将C57BL/6背景的小鼠基因组中的PD-1和TIGIT分子的胞外区进行人源化改造替换为人PD-1和人TIGIT，即B-hPD-1/hTIGIT双人源化小鼠，小鼠品系为C57BL/6-Pdcd1tm1(hPDCD1)Tigit tm1(hTIGIT)/Bcgen(百奥赛图基因生物技术有限公司)。在B-hPD-1/hTIGIT纯合鼠脾细胞里，可检测到hTIGIT和hPD-1mRNA表达，未检测到mTIGIT和mPD-1mRNA表达(百奥赛图基因生物技术有限公司官网数据)。利用B-hPD-1/hTIGIT人源化小鼠建立MC38结肠癌动物模型，来验证抗TIGIT抗体的药效，以及抗TIGIT抗体和抗PD-1抗体联用药效。

在动物药效学实验之前，先进行预实验验证抗TIGIT抗体可以有效地与B-hPD-1/hTIGIT双人源化小鼠体内细胞表面的hTIGIT进行结合。将抗mCD3e抗体(Biolegend，货号：100301)11.5μg溶于300μl PBS中，然后抓取一只B-hPD-1/hTIGIT双人源化小鼠，腹腔注射200μl抗mCD3e抗体溶液。24h后，将小鼠脱颈处死，快速摘取小鼠脾脏，放入加有5ml PBS的15ml离心管中。之后将脾脏转移至6孔板，并放置在70μm的筛网上，加入1ml PBS，用无菌注射器尾部进行研磨，再用1-2ml PBS冲洗筛网。将过滤好的细胞悬液，3000rpm离心5min，弃上清，再瞬离去上清。然后每只脾加入1ml红细胞裂解液(碧云天，货号：C3702)，冰上裂解5min。最后，加入5ml PBS，混匀细胞，4℃离心3000rpm，3min，弃上清，再瞬离去上清。接下来进行流式分析仪检测，先用300μl PBS混悬细胞，并加入6μl抗mCD16/32抗体(Biolegend，#101310)和Human TruStrain FcX(Biolegend，货号：422302)混匀，冰上孵育15min。加入1.2ml PBS混匀细胞，调整细胞浓度至4×10^7/ml，在需染色的管中加入25μl细胞悬液在各管中加入对应抗体PerCP-抗mTcRβ(Biolegend，货号：109228)和APC-抗hTIGIT抗体APC-anti-hTIGIT(eBioscience，货号：17-9500-42)，鼠源抗TIGIT抗体二抗Anti-mouse IgG，Alexa Fluor 647为Goat Anti-Mouse IgG/Alexa Fluor 647(北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-0296G-AF647)，人源化抗TIGIT抗体二抗anti-human Fc，FITC为Goat anti-Human IgG Fc Secondary Antibody，FITC(Invitrogen，货号A18818)处理后上机检测。实验设计见表9.1所示，流式分析结果表明(见图22所示)，m10D8、h10D8V1、h10D8OF、Tiragolumab都可以有效地和B-hPD-1/hTIGIT双人源化小鼠T细胞表面的hTIGIT进行结合，其中相同条件下h10D8OF与hTIGIT的结合能力强于其它抗体。在h10D8OF、Tiragolumab与过表达人TIGIT的Jurkat细胞Jurkat-hTIGIT 2E6结合实验中也存在类似情况(见图23所示)，可能表明与Tiragolumab(EC50值为1.906nM)相比，h10D8OF(EC50值为0.6961nM)与生理状态下TIGIT或接近生理状态下的TIGIT具有更强的亲和力。

小鼠年龄为6-8周，全部选用雌鼠，每组小鼠n＝6只。在小鼠右腋皮下接种MC38细胞(百奥赛图基因生物技术有限公司)5×10⁵个/0.1ml/只，肿瘤体积长至150+50mm3时开始分组给药，荷瘤小鼠肿瘤体积过大或过小淘汰。每3天给药一次，每周测量两次肿瘤体积。每次给药Pembrolizumab剂量为0.1mg/kg，Tiragolumab、m10D8剂量均为20mg/kg。抗TIGIT抗体单药药效结果表明(见图24所示)，Tiragolumab和m10D8抗体均可以抑制肿瘤的生长，且m10D8与Tiragolumab单药药效比较接近。人源化抗TIGIT抗体单药药效结果表明(见图25所示)，h10D8V2抑制肿瘤的效果较差，h10D8OF与Tiragolumab抑制肿瘤的效果比较接近。抗TIGIT抗体与Pembrolizumab联合用药药效结果表明(见图26所示)，h10D8V2和Pembrolizumab联合用药抑制肿瘤的效果较差，h10D8OF和Pembrolizumab联合药效与Tiragolumab和Pembrolizumab联合用药药效比较接近。总体来说，从动物药效上来看，鼠源抗体和人源化抗体都具有抑制肿瘤增殖的效果，具有和Pembrolizumab联合用药的潜在效果。

表9.1抗TIGIT抗体与B-hPD-1/hTIGIT双人源化小鼠T细胞表面hTIGIT结合实验

a)为试剂抗体(eBioscience，货号：7-9500-42)

实施例10人源化抗TIGIT抗体对淋巴细胞亚群的影响

在体内药效学试验的治疗终点时，分析抗TIGIT抗体对小鼠MC38肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中CD4+T细胞和CD8+T细胞的影响。试验选取Vehicle对照组(注射用生理盐水)(n＝4)和h10D8OF(20mg/kg)单药治疗组(n＝5)小鼠的肿瘤，手术切除小鼠新鲜的肿瘤组织，PBS冲洗干净，置于冰上保存。之后用眼科剪反复剪切，再倒入IKA研磨器内，1200rpm，正反转10s，共研磨2min，将研磨好的肿瘤组织溶液，用70μm的筛网过滤至50mL离心管中，并重复洗涤组织一次，之后使用低温离心机4℃、2000rpm、离心5min，弃上清，再用适量的PBS重悬肿瘤细胞。

首先进行死/活细胞染色。取2μl Zombie NIR^TM染料(Biolegend#423106)加入到500μl PBS，制备2×的死/活细胞染色液。取一块96孔板，在实验组各孔中加入25μl的肿瘤细胞悬液，取25μl 2×的死/活细胞染色液加入到对应的含有肿瘤细胞悬浊液的孔中，然后在黑暗的室温环境中轻柔震荡孵育15min。接下来进行细胞表面染色，将上步骤中染色后的细胞用移液器转移25μl至新的96孔板中，在每孔中加入25μl细胞表面标记分子染色液，4℃，避光孵育30min。细胞表面标记分子染色液包括：抗CD45抗体(FITC，0.5μl，Biolegend#231092)、抗mCD4抗体(PE，0.5μl，Biolegend#248731)、抗mCD8抗体(BV510，0.5μl，Biolegend#248151)、抗hTIGIT抗体(APC，1μl，Biolegend#4272773)。孵育结束后，加入185μl PBS重悬细胞，混匀后，4℃，2000rpm，离心5min，弃上清，在吸水纸上轻轻扣板，把残液进一步弃除。然后每孔加入200μl固定液(1×)重悬细胞，混匀后，4℃过夜。固定结束后3000rpm，离心5min，弃上清，在吸水纸上轻轻扣板，弃残液。每孔加入200μl穿膜液，3000rpm，离心5min，弃上清，在吸水纸上轻轻扣板，弃残液。每孔加入25μl穿膜液重悬细胞，同时加入25μl配制好的胞内染液(Anti-Mouse/Rat Foxp3，APC)，4℃，避光孵育30min。每孔在加入200μl 1×穿膜液，混匀后，4℃，3000rpm，离心5min，弃上清，在吸水纸上轻轻扣板，弃残液。加入250μl PBS重悬细胞，按照Attune NXT流式细胞仪SOP，上机检测。

首先从制备的单细胞中分选出mCD45+的白细胞(见图27所示)，之后对mCD45+细胞中的CD4+ T(见图28所示)和CD8+T(见图29所示)细胞进行分析，结果表明两组小鼠TILs中mCD45+淋巴细胞没有显著性差异，进一步分析发现CD4+ T和CD8+ T细胞也无显著性差异。接下来对TIGIT+CD4+ T细胞和TIGIT+CD8+ T进一步分析(见图30和31所示)，发现相对于对照组，单药治疗组的TIGIT+CD4+ T和TIGIT+CD8+ T细胞比例都显著下降。这个结果说明在抗TIGIT抗体的作用下，小鼠结肠癌MC38肿瘤TILs的CD4+ T和CD8+ T细胞中TIGIT分子的表达很可能下调，同时也间接说明了CD8+ T细胞的功能得到了恢复。

实施例11通过B-hTIGIT人源化小鼠和hPD-L1 MC38肿瘤模型验证抗TIGIT人源化抗体对肿瘤抑制的能力

由于抗TIGIT人源化抗体不识别小鼠TIGIT，所以将C57BL/6背景的小鼠基因组中的TIGIT分子的胞外区进行人源化改造替换为人TIGIT，即B-hTIGIT人源化小鼠，小鼠品系为C57BL/6-Tigit^tm1(hTIGIT)/Bcgen(百奥赛图基因生物技术有限公司)。在B-hTIGIT纯合鼠脾细胞里，可检测到hTIGIT mRNA表达，未检测到mTIGIT mRNA表达(百奥赛图基因生物技术有限公司官网数据)。本实验通过B-hTIGIT人源化小鼠和过表达hPD-L1的MC38肿瘤模型验证抗TIGIT人源化抗体对肿瘤抑制的能力，及抗TIGIT抗体和抗PD-L1抗体联合给药潜在的协同作用。

为了使h10D8OF和Tiragolumab能在小鼠体内发挥最有效的ADCC功能，将h10D8OF和Tiragolumab的重链恒定区替换成小鼠抗体IgG2a的重链恒定区(SEQ ID NO：31)，将h10D8OF和Tiragolumab的轻链恒定区替换成小鼠抗体IgG2a的轻链恒定区(SEQ ID NO：32)，重组之后的抗体命名为mh10D8OF和mTiragolumab。

选取6-8周龄的B-hTIGIT人源化小鼠，将PBS重悬的MC38-hPD-L1细胞(MC38细胞，表达人PD-L1同时敲除鼠源PD-L1)(百奥赛图基因生物技术有限公司)以5×10⁵个/0.1mL浓度，0.1mL/只体积接种于B-hTIGIT人源化小鼠的右侧皮下。当平均肿瘤体积达到100-150mm³时，挑选肿瘤体积、体重适中的小鼠入组，平均分配到6个实验组中，每组10只。给药途径为腹腔注射。对照组为Vehicle(注射用生理盐水)、mh10D8OF有2组剂量分别为10mg/kg和30mg/kg，mTiragolumab剂量为30mg/kg，抗PD-L1抗体Atezolizumab剂量为1mg/kg，联合给药组剂量为mh10D8OF 30mg/kg和抗PD-L1抗体Atezolizumab 1mg/kg。实验结果见图32所示。

可以看到mh10D8OF和mTiragolumab都可以有效的抑制肿瘤的生长，抑制程度无统计学差异，TGI均为50％以上。TGI(The Tumor Growth Inhibition value)为肿瘤(体积)抑制率。用于评价体内(即动物实验)中测试药物对肿瘤生长的抑制作用。可使用公式(100-T/C×100)％进行计算，其中T是治疗后的平均相对肿瘤体积，C是治疗前的平均相对肿瘤体积。由于药物剂量设置的原因本试验中没有看到显著的协同作用，但是从生物学意义上来看，在该剂量条件下联合给药对肿瘤的抑制程度更加明显，肿瘤抑制率TGI为66％。

Claims (69)

1.一种抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的T细胞免疫受体(TIGIT)蛋白，所述抗体或其片段包含如SEQ IDNO：21所示的VH CDR1、如SEQ ID NO：22所示的VH CDR2、如SEQ ID NO：23所示的VH CDR3、如SEQ ID NO：25所示的VL CDR1、如SEQ ID NO：26或者43所示的VL CDR2和如SEQ ID NO：27所示的VL CDR3。

2.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的其中一种同种型。

3.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其结合。

4.如权利要求3所述的抗体或其片段，其特征在于，所述Fc区是人的Fc区。

5.如权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，按照Eu编号***，所述人Fc区重链在356位的氨基酸为E。

6.如权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，按照Eu编号***，所述人Fc区重链在386位的氨基酸为M。

7.如权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链包含如SEQ ID NO：28或者29所示的氨基酸序列。

8.如权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，所述轻链包含如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。

9.如权利要求1～8任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段是人源化抗体。

10.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO：20、33、35、37、39和/或41组成的组中的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：20、33、35、37、39和/或41组成的组中的氨基酸序列至少有90％序列同源性的肽。

11.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO：24、34、36、38、40和/或42组成的组中的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：24、34、36、38、40和/或42组成的组中的氨基酸序列至少有90％同源性的肽。

12.一种抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示的轻链可变区。

13.如权利要求10-12任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，重链部分包含如SEQID NO：28所示的氨基酸序列，轻链包含如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。

14.如权利要求10-12任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，重链部分包含如SEQID NO：29所示的氨基酸序列，轻链包含如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。

15.一种抗体或其片段，其特征在于，所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的重链，并且所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示的轻链。

16.如权利要求1～8、10～12、15任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段可以有效阻断TIGIT与PVR结合。

17.如权利要求9所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段可以有效阻断TIGIT与PVR结合。

18.如权利要求13所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段可以有效阻断TIGIT与PVR结合。

19.如权利要求14所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段可以有效阻断TIGIT与PVR结合。

20.如权利要求1～8、10～12、15任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段可以激活淋巴细胞释放细胞因子。

21.如权利要求9所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段可以激活淋巴细胞释放细胞因子。

22.如权利要求13所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段可以激活淋巴细胞释放细胞因子。

23.如权利要求14所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段可以激活淋巴细胞释放细胞因子。

24.如权利要求1～8、10～12、15任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段与人TIGIT的亲和力数值K_D≤100pM。

25.如权利要求9所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段与人TIGIT的亲和力数值K_D≤100pM。

26.如权利要求13所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段与人TIGIT的亲和力数值K_D≤100pM。

27.如权利要求14所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段与人TIGIT的亲和力数值K_D≤100pM。

28.如权利要求1～8、10～12、15任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段与人TIGIT的亲和力数值K_D≤5nM。

29.如权利要求9所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段与人TIGIT的亲和力数值K_D≤5nM。

30.如权利要求13所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段与人TIGIT的亲和力数值K_D≤5nM。

31.如权利要求14所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段与人TIGIT的亲和力数值K_D≤5nM。

32.如权利要求1～8、10～12、15、17～19、21～23、25～27、29～31任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段具有ADCC活性。

33.如权利要求9所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段具有ADCC活性。

34.如权利要求13所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段具有ADCC活性。

35.如权利要求14所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段具有ADCC活性。

36.如权利要求16所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段具有ADCC活性。

37.如权利要求20所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段具有ADCC活性。

38.如权利要求24所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段具有ADCC活性。

39.如权利要求28所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段具有ADCC活性。

40.如权利要求1～8、10～12、15、17～19、21～23、25～27、29～31、33～39任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。

41.如权利要求9所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。

42.如权利要求13所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。

43.如权利要求14所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。

44.如权利要求16所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。

45.如权利要求20所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。

46.如权利要求24所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。

47.如权利要求28所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。

48.如权利要求32所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。

49.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含权利要求1～48任一项所述的抗体片段和对免疫细胞上的分子具有特异性的第二抗原结合片段。

50.如权利要求49所述的双特异性抗体，其特征在于，所述分子包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、CD28、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM、BTLA、KIR或CD47。

51.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求1～48任一项所述的抗体或其片段或者权利要求49或50所述的双特异性抗体，以及药学上可接受的载体。

52.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含编码如权利要求1～48任一项所述的抗体或其片段或者权利要求49或50所述的双特异性抗体的一种或多种多聚核苷酸。

53.权利要求1～48任一项所述的抗体或其片段或者权利要求49或50所述的双特异性抗体在制备治疗癌症或感染的药物中的用途。

54.如权利要求53所述的用途，其特征在于，所述癌症是实体瘤。

55.如权利要求53所述的用途，其特征在于，所述癌症选自膀胱癌、肝癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、***癌和甲状腺癌。

56.如权利要求55所述的用途，其特征在于，所述胃肠癌是结肠癌、直肠癌或胃癌。

57.如权利要求53～56任一项所述的用途，其特征在于，所述治疗还包括向所述患者施用第二种癌症治疗剂。

58.如权利要求53所述的用途，其特征在于，所述感染是病毒感染、细菌感染、真菌感染或寄生虫感染。

59.权利要求1-48任一项所述的抗体或其片段或者权利要求49或50所述的双特异性抗体在制备治疗癌症或感染的药物中的用途，所述治疗包括：

(a)在体外，用所述的抗体或其片段或者所述双特异性抗体处理细胞，和

(b)将处理后的细胞施用于患者体内。

60.如权利要求59所述的用途，其特征在于，所述治疗在步骤(a)之前还包括从个体分离出所述细胞。

61.如权利要求60所述的用途，其特征在于，所述细胞从所述患者体内分离出来。

62.如权利要求60所述的用途，其特征在于，所述细胞从不同于所述患者的供体个体中分离出来。

63.如权利要求59～62任一项所述的用途，其特征在于，所述细胞是T细胞。

64.如权利要求63所述的用途，其特征在于，所述T细胞是肿瘤浸润性T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。

65.权利要求1～48任一项所述的抗体或其片段抗体或者权利要求49或50所述的双特异性抗体在制备用于检测样品中TIGIT表达的产品中的用途，所述产品用于如下方法，所述方法包括：使样品与权利要求1～48任一项所述的抗体或其片段或者权利要求49或50所述的双特异性抗体接触，使得所述抗体或其片段或者所述双特异性抗体结合TIGIT，并检测反映样品中TIGIT的表达量的所述结合。

66.如权利要求65所述的用途，其特征在于，所述样品包含肿瘤细胞、肿瘤组织、感染组织或血液样品。

67.一种多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸可编码如权利要求1～48任一项所述的抗体或其片段或者权利要求49或50所述的双特异性抗体。

68.一种制备权利要求1～48任一项所述的抗体或其片段或者权利要求49或50所述的双特异性抗体的方法，其特征在于，培养包含编码所述抗体或其片段或者所述双特异性抗体的多聚核苷酸的细胞以表达所述抗体或其片段或者所述双特异性抗体。

69.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述细胞为CHO细胞、HEK293细胞、Cos1细胞、Cos7细胞、CV1细胞或鼠L细胞。