UA125501C2 - Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії - Google Patents

Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії Download PDF

Info

Publication number
UA125501C2
UA125501C2 UAA201800664A UAA201800664A UA125501C2 UA 125501 C2 UA125501 C2 UA 125501C2 UA A201800664 A UAA201800664 A UA A201800664A UA A201800664 A UAA201800664 A UA A201800664A UA 125501 C2 UA125501 C2 UA 125501C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
synuclein
alpha
antigen
antibody
binding fragment
Prior art date
Application number
UAA201800664A
Other languages
English (en)
Inventor
Пекка Каллункі
Пекка Каллунки
Каріна Фоґ
Карина Фог
Луїза Буур Вестераґер
Луиза Буур Вестерагер
Анн-Луїза Берґстрьом
Анн-Луиза Бергстрём
Флоренс Сотті
Флоренс Сотти
Давід Сатейн
Давид Сатейн
ден Брінк Едвард ван
Ден Бринк Эдвард Ван
Пауль Паррен
Рік Радемакер
Рик Радемакер
Том Вінк
Том Винк
Ібрагім Джон Малік
Ибрагим Джон МАЛИК
Ліліана Крістіна Перейра Монтезінхо
Лилиана Кристина Перейра Монтезинхо
Джеффрі Б Ставенхаген
Original Assignee
Х. Луннбек А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Х. Луннбек А/С filed Critical Х. Луннбек А/С
Publication of UA125501C2 publication Critical patent/UA125501C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)

Description

Винахід стосується моноклонального антитіла до альфа-синуклеїну для застосування при лікуванні синуклеопатії, такої як хвороба Паркінсона (включаючи ідіопатичну і спадкову форми хвороби Паркінсона), хвороба дифузних тілець Леві (0І ВО), варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ВМ), комбінована хвороба Альцгеймера і Паркінсона, дійсна вегетативна недостатність і множинна системна атрофія.
Даний винахід відноситься до нового класу моноклонального антитіла, яке специфічно зв'язується з альфа-синуклеїном, а також до способів використання цих молекул і їх фрагментів, що зв'язують альфа-синуклеїн, для лікування і діагностики синуклеопатій.
Посилання на перелік послідовностей
Ця заявка містить один або декілька переліків послідовностей згідно з параграфами 1.821 і наступними розділу 37 С.Р.К., які розкриті на машинопрочитуваних носіях (назва файлу: 0992
ЗІ25.1ХІ, створений 22 червня 2016 року і має розмір 44 кБ), при цьому даний файл у його повному обсязі включений в даний опис шляхом посилання.
Рівень техніки
Синуклеопатії, також відомі як хвороби тілець Леві (І ВО), характеризуються відкладенням внутріклітинних білкових агрегатів, які видно під мікроскопом у вигляді тілець Леві (І.В) і/або нейритів Леві, де основним компонентом є білок альфа-синуклеїн (УеїЇйїпдег, Мом Оізога. 2012
Уап;27(1):8-30; МеКейй еї аї., Мешгоіоду (1996) 47:1113-24). Синуклеопатії включають хворобу
Паркінсона (РО) (включаючи ідіопатичну і спадкову форми хвороби Паркінсона) і хворобу дифузних тілець Леві (01 В) (також відому як деменція з тільцями Леві (0 В), варіант хвороби
Альцгеймера з тільцями Леві (ВМ), комбінована хвороба Альцгеймера і Паркінсона (САРБ), дійсна вегетативна недостатність (РАБ) і множинна системна атрофія (М5А, наприклад, оливопонтоцеребелярна атрофія, стріонігральна дегенерація і синдром Шая- Дрейджера)).
Синуклеопатії часто характеризуються дегенерацією дофамінергічної нігростріарної системи, відповідальної за основні рухові порушення при паркінсонізмі (ригідність, брадикінезія, тремор у спокої), але також широко поширено виникнення тілець Леві і дистрофічних нейритів Леві в центральній, периферичній і вегетативній нервовій системі і ділянках головного мозку, і інших органах, що асоціюються з функціональними порушеннями, відмінними від рухових, наприклад, при деменції і порушеннях вегетативної нервової системи. Вважають, що деякі з ознак і симптомів, відмінних від рухових, передують руховим симптомам при хворобі Паркінсона і інших синуклеопатіях. Такі ранні ознаки включають, наприклад, поведінковий розлад фази швидкого сну (КВО) і втрату нюху і обстипацію (Мапоугаїй еї аїЇ., Меигоїюду (2010) 75:488-489).
Синуклеопатії продовжують бути загальною причиною рухових порушень і порушень
Зо когнітивних функцій у старіючого населення (Саїазко еї а!., Агоп. Меигої. (1994) 51:888-95).
Альфа-синуклеїн є членом сімейства білків, в яке входить бета- і гамма-синуклеїн і синоретин. У нормальному стані альфа-синуклеїн експресується у зв'язку з синапсами, і вважають, що він грає деяку роль в регуляції вивільнення синаптичних везикул і за рахунок цього впливає на нейронний зв'язок, пластичність, здатність до навчання і пам'ять.
У декількох дослідженнях було показано, що альфа-синуклеїн задіяний в патогенезі РО і грає в ньому центральну роль. При патологічних станах цей білок може агрегуватися з утворенням внутріклітинних нерозчинних фібрил. Наприклад, синуклеїн накопичується в ІВ (Зрійапіїпі єї аїЇ., Маїште (1997) 388:839-40; ТаКеда єї аї., 9. РаїнпоїЇ. (1998) 152:367-72;
Макабауаєзні еї аї., Мешговсі. Гей. (1997) 239:45-8). Мутації в гені альфа-синуклеїну, а також дуплікації і триплікації цього гена, спільно сегрегують з рідкісними спадковими формами паркінсонізму (Кгидег еї аїЇ., Маїиге Сеп. (1998) 18:106-8; Роіїутегороціов, єї аї., 5сіепсе (1997) 276:2045-7). Важливим відкриттям було те, що альфа-синуклеїн може секретуватися в позаклітинну рідину і бути присутнім в плазмі крові і спинномозковій рідині (С5Е). За результатами декількох досліджень, наприклад, проведених Распесо зі співавторами (2015) та іншими (Распесо еї аїЇ У Меигоспет. 2015 Маг;132(6):731-4; Сопугау єї аї., Ргос Маї! Асай 5сі ОБА (2000) 97:571-576; Моез еї аї., У. Віоснет. 42:7871-7878, 2003), було зроблено припущення, що позаклітинний синуклеїн грає патогенну роль в головному мозку. Вони продемонстрували, що позаклітинні олігомери альфа-синуклетну мають нейротоксичність по відношенню до плазматичних мембран нейронів головного мозку. Інша цікава гіпотеза, заснована на даних з секреції синуклеїну, полягає в тому, що в основі прогресу хвороби Паркінсона і інших синуклеопатій лежить пріоноподібне розповсюдження альфа-синуклеїну (ІГее еї аЇ. 2014, Маї
Вем Мешгої. 2014 Бер 9(2):92-8; Напзеп апа Гі 2012, Ттепаз Мої Меса. 2012 Мау;18(5):248-55). Ці результати дали надію на те, що позаклітинний синуклеїн може виступати як мішень для імунотерапії (Мекгеїїїз еї а. 2011, Гапсеї Меншигої. 2011 Мом;10(11):1015-25).
Було показано, що аутоантитіла до альфа-синуклеїну, що зустрічаються в природі, присутні як у пацієнтів з РО, так і у здорових контрольних пацієнтів (Зтійй еї аІ. 2012, РГо5 Опе. 2012:77(12)е52285; Мавілієг єї а. 2014, Р о5 Опе. 2014 Рер 21:9(2)х:е88604, Рараснгопі еї аї. 2007 У Мешйгоспет. 2007 Мау;101(3):749-56 і УмМоиМе еї а). 2002, Мецгооду. 2002 Мау 14:58(9):1435-6), іноді повідомлялося про підвищені рівні аутоантитіл до альфа-синуклеїну при (510) РО (Стодеп о оеї а». 2011, 9 МешйгоіїттипоЇ. 2011 Арг233(1-2):221-7, Ситидеп еї аї.
2012,Мегоіттипотоамшіайоп. 2012:19(6):334-42 і Мапатапага 2011, РГо5 Опе. 2011 Арг 25;6(4):е18513) або про знижені рівні аутоантитіл до альфа-синуклеїну у пацієнтів з РО в порівнянні із здоровими контрольними пацієнтами (Везопд-Адро єї а! 2013, Меигоіоду. 2013 дап 8:80(2):169-75). Можливість того, що циркулюючі аутоантитіла до альфа-синуклеїну можуть виконувати захисну роль відносно агрегації альфа-синуклеїну, була припущена майже відразу після виявлення цих аутоантитіл (Умоше еї аІ. 2002, Мешгоіоду. 2002 Мау 14;58(9):1435-6).
Надекспресія альфа-синуклеїну у трансгенних мишей імітує деякі патологічні аспекти хвороби тілець Леві. За останні десять років було створено декілька різних трансгенних ліній мишей, надекспресуючих альфа-синуклеїн (описано в оглядах: Коепіег еї а! 2014, Рі о5 Опе. 2013 Мау 31;8(5) 664649; Ріетіпу апа СНнеззеїеї, 2006,Венам РНпапгтасої. 2006 Зер;17(5-6):383-91;
Зргіпдег апа Капіє 2006,Ситгт Мешгої! Мешговсі Нер. 2006 бер;6(5):432-6). У мишачих ліній з промоторами Тпу-ї і РОСЕ-бета розвиваються рухові порушення і когнітивні порушення, і вони були використані для демонстрації нейропротекторної дії антитіл до альфа-синуклеїну іп мімо. Проте, жодна з трансгенних ліній не характеризується робастною дегенерацією дофамінергічних нейронів, і часто рухові фенотипи управляються експресією в рухових нейронах, які звичайно не дегенерують при хворобі
Паркінсона. Тому неясно, чи опосередкується позитивний результат потенційної симптом- модифікуючої терапії діями на дофамінергічні нейрони або інші нейрони центральної нервової системи.
Одним із стійких результатів, отриманих на трансгенних мишачих моделях, було те, що постійна надекспресія альфа-синуклеїну людини погіршує синаптичну функцію. За допомогою досліджень як в іп мійго, так і в іп мімо системах було показано, що надекспресія альфа- синуклеїну дикого типу (м/) людини порушувала синаптичну передачу в гіпокампі (Метапгпі еї аї. 2010, Мешгоп. 2010 дап 14;65(1):66-79; Райтіевг єї аі. 2013, РГо5 Опе. 2013 Аца 1;8(8):670274).
Це було показано в ділянці САТ гіпокампу, де в обох дослідженнях була виявлена понижена базальна синаптична передача. Було зроблено припущення, що механізм, що лежить в основі цього, полягає у внутріклітинному накопиченні альфа-синуклеїну, що приводить до порушеного вивільнення в синапс. Проте, останні отримані результати щодо секреції альфа- синуклеїну в позаклітинний простір в синапсах і щодо токсичної дії олігомерів альфа-
Зо синуклеїну на функцію синапсу, відкривають можливість деякої ролі позаклітинного альфа- синуклеїну у функціональному порушенні синапсу і, відповідно, здатність терапевтичних антитіл усунути це порушення.
Застосування вірусних векторів для надекспресії альфа-синуклеїну є важливим способом моделювання РО у гризунів, оскільки за допомогою цього підходу отримують відносно швидку прогресуючу дегенерацію нігростріарних нейронів, ознаку, яка все ще не була відтворена за допомогою генетичних мутацій у мишей або щурів «(Кігік апа Віогкіспа, 2003, Тгепавз Меигобсоі. 2003 ди: 26(7):386-92). Крім того, вірусна доставка генів виявила здатність альфа-синуклеїну Ул індукувати розвиток нігростріарної патології (Кігік еї аі. 2002, У Меигов5сі. 2002 Арг 1;22(7):2780- 91) - результат, що узгоджується з даними, спостережуваними при спадкових формах РО з дуплікаціями або триплікаціями альфа-синуклеїну (І ее апа Тгозапому5Кі, 2006, Мецйгоп. 2006 Осі 5:52(1):33-8). У одному дослідженні було показано, що пул антитіл кози проти М-кінця альфа- синуклеїну захищав від загибелі дофамінергічні клітини і зменшував поведінкові порушення у щурячій моделі хвороби Паркінсона на основі ААМ-альфа-синуклеїну (Зпапади7латап еї аї 2015, РІ о5 Опе. 2015 Реб 610(2):60116841).
Недавно було показано, що пріоноподібне розповсюдження альфа-синуклеїнової патології приводить до розвитку альфа-синуклеїнової патології а також приводить до загибелі дофамінергічних клітин (І ик еї аї!. 2012, Зсіепсе. 2012 Мом 16;338(6109):949-53). Ця модель була використана для демонстрації того, що антитіла до альфа- синуклеїну здатні полегшувати цю патологію (Тгап еї а. 2014, СеїІ Вер. 2014 дип 26;7(6):2054-65). У цій моделі обробка антитілами дозволяла зменшити накопичення фосфорилованого альфа-синуклеїну в декількох ділянках головного мозку, зокрема в дофамінергічних нейронах в чорній субстанції, і зменшити розвиток рухового порушення.
Окрім мутацій, в результаті альтернативного сплайсингу гена альфа-синуклеїну і посттрансляційних модифікацій білка, таких як фосфорилування, убіквітинування, нітрування і усікання, можуть бути отримані форми білка альфа-синуклеїну, які мають підвищену здатність утворювати агреговані і/або токсичні форми альфа-синуклеїну (Веуег апа Агіла, Мої Меигорбіо)|. 2013 Арг47(2):509-24). Проте, конкретні патологічні різновиди альфа-синуклеїну залишаються невідомими. Була встановлена асоціація з токсичністю для різних агрегованих/виділених різновидів або різновидів з неправильною конформацією, що варіюються від олігомерів до бо фібрил, і для різних посттрансляційних модифікацій, але все ще відсутня єдина думка з питання, який з них є найбільш важливим, навіть якщо фактично є один єдиний токсичний різновид.
В цілому, накопичення альфа-синуклеїну із схожими морфологічними і неврологічними змінами в тваринних моделях, які характеризуються широкою різноманітністю, наприклад, люди, миші і мухи, дозволяє припустити, що ця молекула є центральною в патогенезі хвороб тілець Леві.
На доклінічних тваринних моделях було показано, що декілька різних антитіл до альфа- синуклеїну надають терапевтичний ефект. Було показано, що як антитіло, націлене на епітоп, що включає залишки 91-99 альфа-синуклеїну, так і антитіла, націлені на епітоп, що включає залишки 118-126 альфа-синуклеїну, впливають на рухові і когнітивні порушення у трансгенних мишей (Сатеб еї аЇ. 2014, 9 Мешговсі. 2014 ди! 9;34(28):9441-54). Найбільш досконалим з цих антитіл є гуманізоване антитіло на основі моноклонального антитіла 9Е4 миші, яке націлене на епітоп, який включає залишки 118-126 альфа-синуклеїну, і яке зараз знаходиться на фазі І клінічних випробувань. Також було показано, що С-кінцеве антитіло 274, яке націлене на епітоп, який включає залишки 120- 140 альфа-синуклеїну (Ває еї аїЇ. 2012, У Мешгозсі. 2012 Бер 26;32(39):13454-69), виявляє в доклінічній моделі свій вплив на розповсюдження патології серед клітин. Окрім цього, було показано, що антитіла, націлені на конформаційні різновиди альфа- синуклеїну, такі як олігомери і фібрили, здатні щонайменше знижувати рівні цих імовірно токсичних різновидів альфа-синуклеїну (Гіпавзігот еї аїЇ. 2014, Мешгобіо! Обі5. 2014 Зер;69:134-43 і 5Брепсег еї аї. 2014,
Мої Тнег. 2014 Осг22(10):1753-67). Також було показано, що ці конформаційні антитіла, які знижують рівні олігомерів альфа- синуклеїну іп мімо, такі як табвб47, націлені на епітопи на С-кінці альфа-синуклеїну, що охоплюють амінокислоти 121-125 (0520120308572). Інші конформаційні, специфічні до фібрил і олігомерів, антитіла також націлені на С-кінцеві послідовності (Маїкаїй еї а!. Мешигобіо! бів. 2015;79:81-99).
Оскільки токсична форма альфа-синуклеїну є невідомою, терапевтичне антитіло в ідеалі має бути здатне зв'язуватися з більшістю різновидів альфа-синуклеїну, які утворюються в результаті альтернативного сплайсингу або посттрансляційних модифікацій, таких як усікання, а також з олігомерними і фібрилярними формами. Одна проблема з існуючими антитілами, які
Зо були випробувані як терапевтичні засоби в доклінічних моделях, як розглянуто вище, полягає в тому, що багато з них націлені на С-кінцеві епітопи, які не зустрічаються в деяких основних усічених формах альфа- синуклеїну. Наприклад, амінокислотами, які важливі для зв'язування 9Е4, є аспарагін 122 і тирозин 125 (за результатами аланінового сканування, представленими в патенті О520140127131), і це означає, що це антитіло не може зв'язувати різновиди альфа- синуклеїну, які усічені по амінокислотах 119 ії 122 і є одними з основних усічених різновидів в тканині головного мозку, ураженою хворобою Паркінсона (КейПе еї аЇ. сі Кер. 2014:4:5797).
Аналогічна ситуація існує і з антитілом 274 і антитілом тар47 (58632776). Також, амінокінцеві антитіла можуть не бути здатні зв'язуватися з деякими з основних усічених різновидів альфа- синуклеїну, у яких відсутні перші амінокислоти, такими як альфа-синуклеїн, усічений до амінокислот 5-140. У разі антитіла 9Е4, одним із запропонованих механізмів дії є запобігання усіканню по амінокислотах 119-122 в позаклітинному просторі, оскільки антитіло зв'язуватиметься з тією ж ділянкою, що і протеаза, яка розщеплюватиме альфа-синуклеїн (Сатев єї аІ.2014, 2 Мешговсі. 2014 ди! 9;34(28):9441-54). Схожий механізм дії можна також виявити у разі антитіл в безпосередній близькості від цього сайту, і тому можна очікувати, що навколо цієї ділянки таку активність матимуть багато антитіл.
Існують деякі отримані на тваринних моделях підтвердження про токсичну роль усічених різновидів альфа-синуклеїну. Було показано, що експресія усіченого альфа- синуклеїну під управлінням тирозин-гідроксилазного промотору приводить до розвитку нігростріарної патології, яка зазвичай не спостерігається в моделях з трансгенним альфа-синуклеїном (Тоїагі5 еї аї. 2006, У Мешйговсі. 2006 Арг 12:26(15):3942-50; МаКкатаївзи еї аІ. 2006, Мешйгобіо! Адіпа. 2008
Арг29(4):574-85). Наприклад, експресія амінокислот 1-130 білка альфа-синуклеїну людини, що має мутацію А5ЗЗТ, викликала ембріональну втрату дофамінергічних нейронів в компактному шарі чорної субстанції, тоді як експресія повнорозмірного білка її не викликала (Ууакатаїйви еї аї. 2006, Меигобріо! Адіпд. 2008 Арг29(4):574-85). Експресія молекули альфа-синуклеїну розміром в 120 амінокислот під управлінням промотору кальцій/кальмодулін-залежної протеїнкінази ІЇ альфа (СаткКіІ-альфа) була асоційована з агрегацією альфа-синуклеїну і прогресуючим порушенням в тестах пам'яті кортикально-гіпокампальних ділянок, включаючи лабіринт Барнеса і розпізнавання нових об'єктів (Наї! еї а. 2015, Ехр Мешгої. 2015 Реб;264:8-13). Також в щурячій
ААМ-моделі сумісна експресія усіченого на С- кінці альфа-синуклеїну збільшувала індуковану бо повнорозмірним альфа-синуклеїном патологію (Шизоу еї ай. 2010, Еиг у Мешгозсі. 2010
Аца;32(3):409-22).
У цьому винаході були створені антитіла (такі як "ЗМ37" і "ЗМ285", описані в прикладах), які можуть зв'язуватися з токсичним фрагментом альфа-синуклеїну 1-119/122 і нейтралізувати цю усічену форму альфа-синуклеїну. Антитіла цього винаходу, такі як ЗМ37 і ЗМ285, здатні зв'язуватися з іншими олігомерними формами альфа- синуклеїну і змінювати їх поглинання іншими резидентними клітинами ЦНС так, щоб в результаті зменшувалося розповсюдження захворювання. Крім того, несподівано було виявлено, що антитіла цього винаходу, такі як ЗМ37 і 285, перевершують антитіла, відомі з рівня техніки, такі як 9Е4, в зв'язуванні з різними різновидами альфа- синуклеїну в головному мозку людини і надають несподівано чудовий вплив на усунення позаклітинного альфа-синуклеїну і нормалізацію порушеної синаптичної передачі, що індукується присутністю аномального альфа-синуклеїну іп мімо. Як додаткову ілюстрацію їх терапевтичних можливостей можна привести, що антитіла цього винаходу, такі як
ОМ37 і 285, здатні запобігати появі пов'язаного із захворюванням рухового фенотипу у щурячій моделі хвороби Паркінсона. Нарешті, антитіла (СМ37 і СМ285 здатні пригнічувати затравлювальну дію у відношенні агрегації і фосфорилування ендогенного альфа-синуклеїну, індуковану позаклітинними затравлювальними частинками рекомбінантного патологічного альфа-синуклеїну, в первинних нейронах мишей. Антитіла, такі як З3М37 і 285, також можуть пригнічувати затравлювальну дію у відношенні розвитку альфа-синуклеїнової патології в дофамінергічних нейронах іп мімо у мишачій моделі хвороби Паркінсона, що ще більше підтверджує терапевтичну здатність цих антитіл запобігати розповсюдженню патології від клітини до клітини. Разом узяті ці дані переконливо підтверджують можливість застосування цих нових антитіл (ЗМ37 і (ЗМ285 як нових терапевтичних засобів, здатних модифікувати захворювання шляхом пригнічення механізму розповсюдження патологічних змін, пов'язаних із захворюванням, серед нейронів у пацієнтів з хворобою Паркінсона.
Згідно з додатковим аспектом цього винаходу передбачені З амінокислотні варіанти антитіла ЗМ37. Всі варіанти мають схожі функціональні показники з початковим антитілом
СМ37, але з поліпшеними властивостями щодо можливості виробництва. Ці варіанти зменшують ризик посттрансляційної модифікації, що відбувається в зв'язувальному домені антитіла ЗМ37, і забезпечують деяке полегшення отримання антитіла. Це є переважним, оскільки великомасштабне клінічне або комерційне виготовлення антитіл є складним і дорогим, а забезпечення однорідним продуктом у фармацевтичних лікарських препаратах має вирішальне значення, зокрема, у разі імуноглобулінів і білків.
Суть винаходу
Цей винахід відноситься до нових моноклональних антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів, які здатні специфічно зв'язуватися з епітопом в межах амінокислот 112-117 в альфа-синуклеїні (ЗЕО 10 МО:9 (ПШЕОМР)) Епітоп, що зв'язується антитілами або антигензв'язувальними фрагментами цього винаходу, такими як ілюстративне антитіло "ЗМ37" або "5М285", в даному описі називається "епітопом 112-117". Антитіла цього винаходу специфічно зв'язуються з певним епітопом в межах епітопу 112-117 і можуть, відповідно до одного варіанту здійснення, конкурувати з антитілом 5М37 або СМ285 за зв'язування з певним епітопом в межах амінокислот 112-117. Наприклад, антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти цього винаходу можуть конкурувати за зв'язування з епітопом в межах амінокислот 112-117 альфа-синуклеїну людини, при цьому важкий ланцюг складається з варіабельного домену за 5ЕО ІЮ МО:7, а легкий ланцюг складається з варіабельного домену за ЗЕО ІЮО МО:8.
Таке конкурентне інгібування зв'язування можна визначити за допомогою аналізів і способів, добре відомих з рівня техніки, наприклад, за допомогою аналізу неміченого зв'язування, такого як поверхневий плазмонний резонанс (ЗРК). Наприклад, іммобілізацією альфа- синуклеїну людини на поверхні і інкубуванням з еталонним антитілом "ЗМ37" або без нього перед інкубуванням з антитілом або зв'язувальним фрагментом, що підлягає тестуванню. Як альтернативу, можна застосовувати підхід попарного картування, при якому еталонне антитіло "ЗМ37" іммобілізують на поверхні, антиген альфа-синуклеїну людини зв'язують з іммобілізованим антитілом, а потім тестують друге антитіло стосовно здатності одночасно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини (див. "ВіІіАсогефФ Аззау Напароок", СЕ Неайсаге Пе осієпсе5, 29-0194-00 АА 05/2012, розкриття якого включено в даний опис шляхом посилання).
Конкретніше, антитіло ЗМ285 зв'язує епітоп в межах залишків 112-117 альфа- синуклеїну, що містить залишки 112-115 альфа-синуклеїну (І ЕО; 5ЕО ІЮО МО:19).
Згідно з одним варіантом здійснення цей винахід відноситься до моноклонального антитіла
СМ37, його варіантів (наприклад, варіанту 1 5М37, варіанту 2 ЗМ37 і варіанту 3 ОМ37) або сма285. 60 Зокрема, цим винаходом передбачається моноклональне антитіло ЗМ37, його варіанти
(наприклад, варіант 1 ОМ37, варіант 2 М37 і варіант 3 СМ37) або СМ285, і винахід охоплює такі антитіла, а також їх похідні, які мають достатню кількість (наприклад, 1, 2 або 3) СО легкого ланцюга і достатню кількість (наприклад, 1, 2 або 3) СОК важкого ланцюга для утворення сайту зв'язування, здатного специфічно зв'язуватися з синуклеїном людини.
Переважно такі антитіла матимуть три СОК легкого ланцюга і три СОК важкого ланцюга, як визначено нижче. Нумерація амінокислотних залишків в цій ділянці відповідає ІМСТФ), міжнародній інформаційній системі ІтМипоСепетіс5Ф або Кабаї, Е. А., УмМи, Т. Т., Реггу, Н. М.,
СонНезтанпп, К. 5. « ЕовіІег, б. (1991). Зедиєпсев ої Ргоїєїпв ої Іттипоіодіса! Іпіегезі, 5-е видання, О.5. ЮОерагітепі ої
Неанй апа Нитап зЗегмісе5, публікація МІН Мо 91-3242; Споїпіа, С. 8, І езК, А. М. (1987). Сапопісаї зігисіигез Гог Пе Нурегуатіаріе дотаїп5 ОЇ Іттиподіобиїїп5. У. Мої. Вісі. 196, 901-917.
Згідно з одним варіантом здійснення моноклональне антитіло або його антигензв'язувальні фрагменти мають зв'язучий синуклеїновий антиген фрагмент, що містить або складається з (а) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:1; і/або (Б) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:2; і/або (с) СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО:3; і/або (4) СОК!І легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО 4; і/або (є) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:5; і/або () СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО:6; який здатний специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини.
Згідно з іншим варіантом здійснення моноклональне антитіло або його антигензв'язувальні фрагменти мають зв'язучий синуклеїновий антиген фрагмент, що містить або складається з (а) СОК!І1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:1; (Б) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО:33, 34 або 35; (с) СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МОЗ; (4) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО 4; (є) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:5; і (5 СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:6; який здатний специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини.
Згідно з ще одним варіантом здійснення моноклональне антитіло або його антигензв'язувальні фрагменти мають зв'язучий синуклеїновий антиген фрагмент, що містить або складається з (а) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:20; і/або (Б) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:21; і/або (с) СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ
МО:22; і/або (4) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО:23; і/або і/або (є) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО:24; () СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО:25; який здатний специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини.
Згідно з одним варіантом здійснення моноклональне антитіло або його антигензв'язувальні фрагменти мають зв'язучий синуклеїновий антиген фрагмент, що містить амінокислотну послідовність (у його СОК, його варіабельних доменах, його каркасних залишках або в його константних доменах), яка відрізняється від послідовності антитіл до альфа-синуклеїну, що зустрічаються в природі, і яка характеризується (щодо таких антитіл до альфа-синуклеїну, що зустрічаються в природі) (Ї) різницею щодо афінності зв'язування (КО) до альфа-синуклеїну; (ії) різницею щодо здатності пригнічувати усікання протеазами фібрил альфа- синуклеїну; (ії) різницею щодо здатності обертати порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей Е28-5пса; (м) різницею щодо здатності знижувати рівні альфа-синуклеїну в гіпокампі миші, за результатами вимірювання за допомогою мікродіалізу іп мімо; і/або (м) різницею щодо здатності, при тривалому введенні, відновлювати рухову функцію у щурячій моделі хвороби Паркінсона; (м) різницею щодо здатності запобігати затравлювальній дії альфа-синуклеїну (такої як накопичення нерозчинного фосфорилованого альфа-синуклеїну іп міго і/або у мишачій моделі хвороби Паркінсона) і/або (мі) різницею щодо здатності зв'язувати усічений альфа-синуклеїн в головному мозку
Гс10) людини.
Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти цього винаходу можна використовувати в способі лікування, діагностики або візуалізації синуклеопатій, таких як хвороба Паркінсона (РО), включаючи ідіопатичну і спадкову форми хвороби Паркінсона), хвороба дифузних тілець
Леві (0 ВО), варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ВМ), хвороба Гоше (СО), комбінована хвороба Альцгеймера і Паркінсона (САРО), дійсна вегетативна недостатність і множинна системна атрофія.
Стислий опис ілюстративних матеріалів
На фіг. 1 показані протоколи імунізації для отримання гібридом. У таблиці вказані відмінності імуногенів і ліній мишей, які були використані для виявлення ЗМ37 і зМ285. Різних мишей
НСо17-ВаїЇБ/с ії НСо12/ВаІр/с імунізували незалежно (опис цих мишей наведений нижче).
Гібридома, що експресує СОМ37, була виявлена у мишей, імунізованих фібрилами повнорозмірного альфа-синуклеїну, що містить амінокислоти 1-140, і стимульованих усіченими фрагментами альфа-синуклеїну 1-60 їі 1-119 від повнорозмірного (ЕР) альфа-синуклеїну (ЗЕО 10
МО 10). Гібридома, що експресує антитіло ОМ285, отримана згідно з протоколом імунізації, в якому мишей НСо12-ВаїІр/с імунізували повнорозмірним мономерним альфа-синуклеїном, з амінокислотами 1-140, з подальшим стимулюванням повнорозмірним фібрилярним альфа- синуклеїном (приклад 1).
На фіг. 2 (секції А-С) показані результати скринінгу ЗМ37 стосовно зв'язування з альфа- синуклеїном, гомологами і ортологами альфа-синуклеїну.
А) Зв'язування антитіла ОМ37 з альфа-синуклеїном за результатами Еї ІЗА без промивального розчину (ЕМАТ).
В) За результатами 5РЕК (Рогпіебріо) зв'язування антитіла 5М37 є специфічним до альфа- синуклеїну (секція "альфа"), і воно не зв'язує інші споріднені білки сімейства синуклеїнів, бета- синуклеїн (секція "бета") і гамма-синуклеїн (секція "гамма"). Вимірювання проводили за допомогою 5РЕК (Ропебріо Осієїгей). ЗМ37 демонструє схоже зв'язування з альфа-синуклеїном від яванського макака (секція Супо) і миші (секція "миша"). (Приклад 1).
С) За результатами 5РК (Еопебіо Осіеїгейа) зв'язування антитіла ЗМ285 є специфічним до альфа-синуклеїну, і воно не зв'язує інші споріднені білки сімейства синуклеїнів, бета-синуклеїн і гамма-синуклеїн. Вимірювання проводили за допомогою ЗРК (Рогпебріо Осіеїгей), яке
Зо продемонструвало схоже зв'язування 5М285 з альфа- синуклеїном від яванського макака (Супо) і миші ("миша") (приклад 1).
На фіг. З (секції А-С) показана афінність зв'язування СМ37 в режимі реального часу.
А) Зв'язування антитіла 5М37 з альфа-синуклеїном, виміряне в КИ (відносних одиницях) (вісь "у"), за часом (вісь "Х") було визначене за допомогою 5РЕ (ВіАсогеФф 3000).
Ід кози до антитіл людини був іммобілізований на чипі СМ5. 5М37 захоплювали на чип з іммобілізованими Ідс кози до антитіл людини і тестували серію концентрацій альфа-синуклеїну людини (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 нМ) стосовно зв'язування з поверхнею. У кожному проміжку між циклами відновлювали поверхню сенсора.
В) Сигнал від зв'язування при різних концентраціях, перетворений в криву зв'язування.
С) Розраховані константи зв'язування антитіла 5М37 (позначеного підс1-6004-037-С1065) (приклад 2).
На фіг. 4 (секції А-С) показана афінність зв'язування ЗМ285 в режимі реального часу.
А) Зв'язування антитіла ЗМ285 з альфа-синуклеїном, виміряне в КИ (вісь "у"), за часом (вісь
Х) було визначене за допомогою 5РЕК (ВІАсогеФ 3000). дС кози до антитіл людини був іммобілізований на чипі СМ5. ЗМ285 захоплювали на чип з іммобілізованими дос кози до антитіл людини і тестували серію концентрацій альфа- синуклеїну людини (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 нМ) стосовно зв'язування з поверхнею. У кожному проміжку між циклами відновлювали поверхню сенсора.
В) Сигнал від зв'язування при різних концентраціях, перетворений в криву зв'язування.
С) Розраховані константи зв'язування антитіла ОМ285 (позначеного ПпіІдс1-6004-285) (приклад 2).
На фіг. 5 (секції А-С) показано зв'язування антитіла порівняння 9Е4 в режимі реального часу.
А) Показано зв'язування 9Е4 з альфа-синуклеїном, виміряне в КО (вісь "у"), за часом (вісь "Х"), визначене за допомогою ЗРЕ (ВІіАсогеФ 3000). дб кози до антитіл людини був іммобілізований на чипі СМ5. 9Е4 захоплювали на чип шляхом його зв'язування з до кози до антитіл людини, що був іммобілізований на чипі. Тестували серію концентрацій альфа- синуклеїну людини (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 нМ) стосовно зв'язування з поверхнею. У кожному проміжку між циклами відновлювали поверхню сенсора. бо В) Сигнал від зв'язування при різних концентраціях, перетворений в криву зв'язування.
С) Розраховані константи зв'язування для антитіла 9Е4. (Приклад 2).
На фіг. 6 показана амінокислотна послідовність альфа-синуклеїну. Основні сайти усікання (позначені стрілками) в тканині головного мозку людини були ідентифіковані за допомогою мас- спектрометрії (КеїПе ЧЕ, Нідо5 КЕ, Кудег УМУ, Мадог А, Вєасі Та, Адієг СН, МегсНапі К, Кпіептап
МО. Оцапійайме теазитетепі ої іпіасі аїрпа-зуписієїп ргоївоїоптв їот розі-топет сопігої апа
Раїкіпвоп'є аізеазе бБгаіїп їїзвиє Бу тавз5 5ресіготеййу. осі Вер. 2014 Одц! 23:А4:5797. аої: 10.1038/5терОо5797).
На фіг. 7 (секції А-В) показані результати епітопного картування стосовно антитіл ЗМ37 і
ОМ285. Дані ЕГІЗБА, що демонструють відносні рівні зв'язування антитіл з послідовними пептидами (з 20 мономерів), отриманими з амінокислотної послідовності 95-132 альфа- синуклеїну (інші пептиди, що не зв'язуються, не показані).
А) Епітопу для ЗМ37 для повного зв'язування необхідна послідовність І ЕОМР (ЗЕО ІЮ
МО:9).
В) ОМ285 для повного зв'язування необхідний пептид І'ЕО (ЗЕО ІЮ МО:19). (Приклад 3).
На фіг. 8 (секції А-В) показано схематичне представлення усічених форм альфа- синуклеїну.
А) Епітопи зв'язування для 5М37/285 (ГЕОМР; 5ЕО ІО МО:9) і 9Е4 (МЕАМУЕ; 5ЕО ІЮ МО:36) показані жирним на амінокислотній послідовності альфа-синуклеїну (5ХЕО ІЮ МО:10). Стрілки указують С-кінцеві сайти усікання, показані на фіг. 6.
В) Основні усічені форми альфа-синуклеїну, які були ідентифіковані з матеріалу головного мозку людини. Розмір, виходячи з кількості амінокислот, вказаний справа. Повнорозмірний синуклеїн складається зі 140 амінокислот. Як можна вирахувати з епітопів, зЗМ37, його варіанти 1-3 ії М285 повинні зв'язувати повнорозмірну молекулу і фрагменти 1-119/122, 1-135. Антитіло 9Е4 зв'язуватиметься тільки з повнорозмірною молекулою і фрагментом 1-135. Специфічність менших С-кінцевих фрагментів, що залишилися після усікань, не показана.
На фіг. 9 показано, що антитіла ОМ37 і (М285 утворюють імунопреципітат з повнорозмірним альфа-синуклеїном, а також з усіченим альфа-синуклеїном з головного мозку людини. Неочищені гомогенати головного мозку людини з І В інкубували з випробовуваними антитілами (гранули (без АБ), з контрольним антитілом Ї901 людини В12, яке не зв'язується з альфа-синуклеїном, ЗМ-37, варіантом 2 ЗМ37, ЗМ-285 і (т)9Е4 мишії) і на ХЗО5-РАСЕ розділяли
Зо імуновиснажений супернатант і імунопреципітований матеріал. На вестерн-блоті видно смуги, що є повнорозмірною формою і різними усіченими формами альфа-синуклеїну, що виводяться з супернатанту і створюють імунопреципітат з антитілами (ІР). Як можна бачити, антитіла СМ37,
ОМ37м2 і ОМ285 виводили основні різновиди альфа-синуклеїну з супернатанту, а ІР демонструє ці різновиди: усічені різновиди 1-135, 1-119/122 і повнорозмірний альфа- синуклеїн. 9Е4 не діє на різновиди 1-119/122, а лише створює імунопреципітат з повнорозмірним і з 1-135 (приклад 4).
На фіг. 10 показано схематичне зображення протеолізу фібрил альфа-синуклеїну, що розщеплюються кальпаїном по амінокислоті 119/122. Фібрили альфа-синуклеїну (РЕЕ) додають до культури з випробовуваним антитілом (РЕЕ-) або без нього (РЕБК).
Присутність 2М-37/285 пригнічує утворення усіченого альфа-синуклеїну в клітинах і його секрецію в клітинне середовище.
На фіг. 11А показано, що 5М37 пригнічує утворення смуги усіченої форми (12 кДа) як в середовищах, так і в клітинних лізатах первинних культур клітин кори мишей, оброблених за допомогою РЕР. Білки розділяли за допомогою 505-РАСЕ і піддавали вестерн-блотингу для виявлення різних різновидів альфа-синуклеїну. У клітинах, оброблених тільки РЕ або контрольним антитілом (В12), виявляються дві смуги мономерного альфа-синуклеїну на рівні 12 і 14 кДа, що репрезентують усічений і повнорозмірний альфа-синуклеїн, відповідно. У присутності зМ-37 має місце тільки слабка смуга на рівні 12 кДа, що указує на те, що більша частина продукту розщеплювання заблокована. Цей ефект також відбивається в середовищах клітин.
Відносні рівні накопичення також можуть бути інгібовані присутністю (зЗМ-37, що відбивається в зменшенні відносної інтенсивності смуги у 14 кДа. Як альтернатива може зменшуватися кількість смуги 14 кДа, доступна для поглинання клітинами. (Приклад 5).
На фіг. 118 показане дозозалежне пригнічення протеолізу фібрил альфа- синуклеїну антитілами СМ37, варіантом 2 М37 і ОМ285. У клітинних лізатах з первинних культур клітин кори миші з низькою концентрацією антитіл (0,1 мкг/мл) присутня як смуга, що репрезентує повнорозмірний (РІ) альфа-синуклеїн, так і смуга, що репрезентує усічений на С-кінці (СТ) альфа-синуклеїн (показано стрілками).
Збільшення концентрації антитіл до 1, 5 і 10 мкг/мл призводить до зниження протеолізу бо фібрил альфа-синуклеїну в клітинах. Це спостерігається як з антитілом 5М37, так і з ЗМ37м2 і з антитілом СМ285. Контрольні зразки обробляють антитілом ЇдДс1 людини В12, яке не розпізнає альфа-синуклеїн. Також присутній контроль без додавання антитіл (без АБ), а також клітини, що не містять фібрили альфа-синуклеїну (без Азуп). Загальна кількість альфа-синуклеїну також знижується в зразках, оброблених 37, 37м2 і 285, в порівнянні з контролем В12 або "без антитіла", що вказує на те, що всі три антитіла зменшують накопичення альфа-синуклеїну в клітинах залежним від концентрації чином. Смуга актину у верхній частині гелю демонструє рівне завантаження зразків (приклад 5).
На фіг. 12 показаний вплив 5М37 і ЗМ285 на затравлювальну дію стосовно агрегації альфа- синуклеїну і фосфорилування альфа-синуклеїну в первинних кортикальних нейронах миші. 12А) Приклад зображень первинних нейронів, забарвлених стосовно фосфорилованого альфа-синуклеїну, який виявляється у вигляді плям або цяточного забарвлювання в клітинах, при затравлювальній дії на клітини або 1 нг чистих затравлювальних молекул, або неочищених затравлювальних частинок альфа- синуклеїну. 128) Вестерн-блот білків з первинних кортикальних нейронів, розділених на розчинну і нерозчинну фракції. Блоти забарвлювали специфічним до альфа-синуклеїну людини антитілом (4812/Н а-зуп), специфічним до фосфо-5ег-129-альфа-синуклеїну антитілом (ар51253/рз-а-5уп) і специфічним до альфа-синуклеїну миші антитілом (037А2/М а-5уп), і було видно, що додавання неочищених затравлювальних частинок в первинних нейронах приводить до накопичення ендогенного альфа-синуклеїну миші і фосфорилованого альфа-синуклеїну і до високомолекулярних мультимерів альфа- синуклеїну в нерозчинній фракції. 120) ОМ37, варіант 2 ОМ37 і ОМ285 пригнічують появу фосфорилованого альфа- синуклеїну, що за допомогою автоматизованого мікроскопа АККАХМ5САМ"М від СеПотіс5 кількісно визначається як кількість позитивних плям альфа-синуклеїнового фосфосерину 129 в клітинах. ОЗМ37, ОМ37м2 і 5М285 зменшують кількість плям фосфорилованого альфа- синуклеїну в клітинах дозозалежним чином. 120)) З вестерн-блота гомогенатів первинних кортикальних нейронів, оброблених найбільш високою дозою антитіла (133 нМ) і забарвлених стосовно актину, альфа- синуклеїну людини, фосфорилованого альфа-синуклеїну і альфа-синуклеїну миші, видно, що антитіла 37, 37м2 і 285 пригнічують усікання неочищених затравлювальних частинок альфа-синуклеїну, що
Зо поглинаються клітинами, в нерозчинній фракції. Всі антитіла також пригнічують накопичення фосфорилованих ендогенних мишачих і високомолекулярних мультимерів фосфорилованого альфа-синуклеїну миші в нерозчинній фракції. Смуга актину на верхній частині гелю демонструє рівне завантаження зразків (приклад 6).
На фіг. 13 показана базальна синаптична передача в синапсі САТ колатералі Шеффера в гіпокампі трансгенних Е28-5пса і контрольних мишей відповідного віку. Польові збуджуючі постсинаптичні потенціали (ТЕРБР) викликали одним стимулом, що прикладається до колатералей Шеффера, а базальну синаптичну передачу оцінювали шляхом вимірювання градієнта польового збуджуючого постсинаптичного потенціалу (ТЕРБЗР) залежно від інтенсивності стимуляції. Короткострокову синаптичну пластичність оцінювали за допомогою стимуляції індукції подвійних імпульсів. Різні значення інтенсивності стимуляції складали 0, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 ї 500 мкА, і їх послідовно прикладали в порядку зростання з 2-3 повторами для кожної інтенсивності. Було виявлено, що базальна синаптична передача значно погіршується у трансгенних мишей Е28-5пса, які надмірно експресують альфа-синуклеїн дикого типу, в порівнянні з контрольними мишами відповідного віку (приклад 7).
На фіг 14 показаний вплив системного введення одноразової дози 9Е4 людини (15 мг/кг, і.р.) на порушення базальної синаптичної передачі в синапсі САТ колатералі Шеффера в гіпокампі трансгенних мишей Е28-5пса. Польові збуджуючі постсинаптичні потенціали (ТЕР5Р) викликали одним стимулом, що прикладається до колатералей Шеффера, а базальну синаптичну передачу оцінювали шляхом вимірювання градієнта ТЕРОР залежно від інтенсивності стимуляції. Короткочасна обробка за допомогою П9Е4 індукувала значне обертання порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей Е28-5пса (Тд-5псанпо9ЕаЯ в порівнянні з Тд- 5зпса-РВ5, р-0,002). Проте, обертання при обробці П9Е4 було лише частковим, про що свідчила значуще нижча базальна синаптична передача в порівнянні з тваринами того ж приплоду, яких обробляли за допомогою РВ5 (р-0,007) (приклад 7).
На фіг 15 показаний вплив системного введення одноразової дози ЗМ37 людини (15 мг/кг, і.р.) або ізотипічного контрольного антитіла (В12) на порушення базальної синаптичної передачі в синапсі САТ колатералі Шеффера в гіпокампі трансгенних мишей Е28-5пса. Польові збуджуючі постсинаптичні потенціали (ТЕРОР) викликали одним стимулом, що прикладається до бо колатералей Шеффера, а базальну синаптичну передачу оцінювали шляхом вимірювання градієнта ТЕРЗР залежно від інтенсивності стимуляції. Короткочасна обробка за допомогою
СМ37 індукувала повне обертання порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей Е28-5пса (Тд-зпсаноМ37 в порівнянні з Тд-з:псанВ12, р-0,004) (приклад 7).
На фіг 16 показаний вплив системного введення одноразової дози ЗМ285 людини (15 мг/кг, ір.) на порушення базальної синаптичної передачі в синапсі САТ колатералі Шеффера в гіпокампі трансгенних мишей Е28-5пса. Польові збуджуючі постсинаптичні потенціали (ТЕРБ5Р) викликали одним стимулом, що прикладається до колатералей Шеффера, а базальну синаптичну передачу оцінювали шляхом вимірювання градієнта ТЕРОР залежно від інтенсивності стимуляції. Короткочасна обробка за допомогою СМ285 індукувала повне обертання порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей Е28-5пса (Т9- 5псаноМма285 в порівнянні з Тд-зпса-РВ5, р-0,001) (приклад 7).
На фіг. 17 (секції А-В) показаний вплив системного введення (15 мг/кг, і.р.) 9ЗЕ4 людини,
СМ37 або ізотипічного контрольного антитіла (антитіла до НЕЇ) на рівні альфа-синуклеїну людини в інтерстиціальній рідині (і5ї) в гіпокампі трансгенних мишей Е28-5пса, що вільно рухаються. Середнє значення двох-трьох початкових значеньи(4 год. - б год.) до обробки антитілом брали як початковий рівень і приймали за 100 95 для кожної тварини. Відмінності аналізували за допомогою двофакторного дисперсійного аналізу (АМОМА) з повторними вимірюваннями. Початкові рівні альфа- синуклеїну людини в гіпокампі складали 8,1541,1 нг/мл (середнє х ЗЕМ, п-25, не скоректовані стосовно відновлення діалізного зонда іп міго). Введення
ОМ37 індукувало більше зменшення альфа-синуклету людини в гіпокампі мишей Е28 в порівнянні як з антитілом порівняння, 9Е4 людини, так і з контрольним ізотипічним антитілом до
НЕГ. Моменти часу, в які спостерігали значущі відмінності в рівнях альфа-синуклеїну серед тварин, оброблених ЗМ37 або контрольним антитілом, позначені зірочкою. (Приклад 8).
На фіг. 18 показано схематичне представлення часового графіка обробки антитілами (стрілки вниз), вірусних ін'єкцій і поведінкових оцінок в щурячій ААМ- моделі з альфа- синуклеїном людини, показаних на фіг. 19 (приклад 9).
На фіг. 19 показано, що антитілл ЗМ37 може у щурячій ААМ-моделі зменшувати паркінсонічні рухові порушення після тривалої обробки. Вплив тривалої обробки за допомогою
СМ37 або РВ5 у ААМ-щурів з альфа-синуклеїном людини на рухову асиметрію оцінюють в
Зо тестуванні передніх кінцівок на асиметричність. Кожного щура тестували відносно використання передніх лап шляхом спостереження протягом 5 хвилин. Відсоток використання правої передньої лапи (іпсилатеральної по відношенню до ін'єкції) і використання лівих (передніх лап, контралатеральних до правих) розраховували для кожної тварини (показано на осі у) "7, хх р-е0,05 і 0,01 в порівнянні з щурами яким вводили РВ5 та зелений флуоресцентний білок (СЕР).
Щури, оброблені РВ5, як і раніше, мають значну асиметрію у використанні лап, тоді як тварини, які обробляються антитілом ЗМ37, вже не мають значного порушення. (Приклад 9).
На фіг. 20А-20С показано, що тривала обробка антитілом 5М37 може зменшити патологічне фосфорилування альфа-синуклеїну, що індукується введенням фібрилярних затравлювальних частинок патологічного альфа-синуклеїну в смугасте тіло мишей. На фіг. 20А наведено схематичне представлення, що показує відносний час обробки щодо введення затравлювальних частинок і підрахунку клітин. Антитіло ЗМ37 вводили за один день до введення фібрилярних затравлювальних частинок рекомбінантного альфа- синуклеїну в задню частину смугастого тіла мишей, а потім щотижнево протягом шести тижнів. Режим дозування був або 15 мг/кг і.м., або 30 мг/кг і.р. На фіг. 208 показаний рівень концентрації (М37 в плазмі крові з урахуванням місця введення і дози.
Щотижня брали зразки перед введенням нової дози антитіла. На фіг. 20С показаний рівень концентрації ЗМ37 в спинномозковій рідині (с5ї) з урахуванням дози і місця введення в кінці дослідження. На фіг. 200 наведено порівняння кількості клітин з позитивними стосовно фосфорилованого альфа-синуклеїну включеннями, підрахованими з кожного шостого зрізу в чорній субстанції, після обробки СМ37 або РВ5-контролем. Миші, оброблені ЗМ37 як 15 мг/кг ім., так і З0 мг/кг ір., мали значуще зменшення кількості клітин з включеннями фосфорилованого альфа-синуклеїну в порівнянні з мишами, обробленими РВ5 (приклад 10).
На фіг. 21 показані результати вирівнювання білків а- (ЗЕО ІЮ МО:10), В- (ЗЕО ІЮО МО:37) і у- (ЗЕО ІЮ МО:38) синуклеїну людини. Виділені амінокислотні залишки, що відрізняються від а- синуклеїну. Гепи вказані крапкою. Номери за 5м/із5Ргої наведені в дужках.
На фіг. 22 показані результати вирівнювання ортологів альфа-синуклеїну (яванського макака, БЕО ІЮ МО:39; щура, 5ЕО ІЮ МО:40; миші, 5ЕО ІЮ МО:41). Виділені амінокислотні залишки, що відрізняються від альфа-синуклеїну людини (5ЕО ІЮ МО:10). Номери за Зугіз5Ргої показані в дужках. бо На фіг. 23 показана тимчасова експресія ЗМ37 (під назвою ОМ37 дикого типу (м) ії З варіантів ЗМ37 під назвою маг 1, 2 і 3 М37. Зірочка вказує, що дані визначені після очищення білком А і нейтралізації. Т указує, що дані розраховані з виходу, отриманого після білка А їі нейтралізації, по відношенню до об'єму експресуючої культури (0,4 л).
На фіг. 24 показаний конкурентний ЕГІ5А, що вимірює зв'язування чотирьох антитіл 5М37
У, маг 1 ОМ37, маг 2 ЗМ37 і маг 3 ЗМ37 з альфа-синуклеїном людини. Планшети, покриті альфа-синуклеїном, застосовують для виявлення кількості антитіла, що залишилася після попередньої інкубації в розчині кожного антитіла (0,3 мкг/мл), із збільшенням концентрації альфа-синуклеїну (0-1000 нМ). Всі чотири антитіла демонструють схоже зв'язування з альфа- синуклеїном.
На фіг. 25 показана таблиця, в якій наведено порівняння кінетичних параметрів швидкості зв'язування ОМ37Ул і варіантів 1-3 з іммобілізованим рекомбінантним альфа- синуклеїном людини. Зв'язування вимірювали за допомогою 5РК, а швидкості визначали з використанням алгоритму зв'язування 11 (ВіАсогефФ 1200).
На фіг. 26 наведено порівняння впливу антитіл до альфа-синуклеїну на рівні фосфорилованого альфа-синуклеїну в первинних нейронах мишей, оброблених фібрилярними затравлювальними частинками патологічного альфа-синуклеїну.
Первинні нейрони обробляли затравлювальними частинками (10 нг) в присутності або у відсутності чотирьох антитіл: (3М37, маг 1 ЗМ37, маг 2 ЗМ37 і маг З ОМ37 (2 мкг).
Нейрони фіксували і забарвлювали після З тижнів і аналізували за допомогою
АККАУЗСАМ М від СеПотісз5 відносно плям, позитивних стосовно фосфорилованого на серині 129 альфа-синуклеїну. Клітини, оброблені або тільки затравлювальними частинками, або затравлювальними частинками плюс ізотипічне контрольне антитіло (В12), демонструють значущо підвищені рівні фосфорилування. Клітини, оброблені антитілом ЗМ37м і З варіантами, можуть пригнічувати фосфорилування альфа- синуклеїну, всі вони демонструють той же рівень фосфорилування, що і клітини, які не отримували затравлювальних частинок. Дані показані як середнє 50, як визначено з семи зображень на лунку для п'яти лунок. М-2.
На фіг. 27 наведено порівняння залежної від температури агрегації ул. ЗМ37, ма/1, маг2 і маг3. Зразок кожного з антитіл піддавали постійному підвищенню температури протягом часу і одночасно вимірювали рівень агрегації за багатокутовим розсіянням світла (Рготеїйеив5 МТ.48,
Зо МапоТетрег Тесппоїодієз). Температура початку агрегації є схожою для СМ37 і варіантів 5М37, проте найнижчий рівень агрегації спостерігали для М37-Магг.
Докладний опис винаходу
Використовуваний в даному описі винаходу термін "альфа-синуклеїн" є синонімом "білка альфа-синуклеїну" і відноситься до будь-якої з ізоформ білка альфа- синуклеїну (що ідентифікуються, наприклад, в ОпіРгої під номерами РЗ37840, 1-3).
Нумерація амінокислот альфа-синуклеїну наведена відносно ЗЕО ІЮ МО:10, показаною нижче, причому метіонін (М) є амінокислотним залишком 1:
ЗЕО ІЮО МО:10:
МОМЕМКОЇ ЗК АКЕСМУМАААЕ КТКОСМАЕАА СКТКЕСМІ УМ 5КТКЕСУМН СМАТУМАЕКТК
ЕОМТМУСОСАМ МТаМУТАМАОК ТУЕСАСВІАА АТОЕУККРОЇ СКМЕЕСАРОЄЕ СІПГЕОМРМУОР
ОМЕАМЕМРБЗЕ ЕЯМОЮМЕРЕА
Цей винахід відноситься до антитіл і до фрагментів антитіл, які здатні специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном і, зокрема, з альфа-синуклеїном людини. Зокрема, антитіла і їх фрагменти характеризуються здатністю специфічно зв'язуватися з епітопом в межах 112-117 альфа-синуклеїну людини.
Термін "антитіло" (АБ) в контексті цього винаходу відноситься до молекули імуноглобуліну або, відповідно до деяких варіантів здійснення цього винаходу, фрагменту молекули імуноглобуліну, які мають здатність специфічно зв'язуватися з епітопом молекули ("антигену").
Антитіла, що зустрічаються в природі, зазвичай являють собою тетрамер, який зазвичай складається щонайменше з двох важких (Н) ланцюгів і щонайменше з двох легких (І) ланцюгів.
Кожен важкий ланцюг складається з варіабельного домену важкого ланцюга (скорочено позначеного в даному описі винаходу як МН) і константного домену важкого ланцюга, що зазвичай складається з трьох доменів (СНІ, СН2 і СНЗ). Важкі ланцюги можуть відноситися до будь-якого ізотипу, зокрема
Іо (підтипи ІДО1, Ід2, ІдОЗ і 1дс4), ІДА (підтипи ІДА1 і ІдА2), ДМ і ЧЕ. Кожен легкий ланцюг складається з варіабельного домену легкого ланцюга (скорочено позначеного в даному описі винаходу як МІ) і константного домену легкого ланцюга (СІ). Легкі ланцюги включають каппа- ланцюги і лямбда-ланцюги.
Варіабельний домен важкого і легкого ланцюгів зазвичай відповідає за розпізнавання 60 антигену, тоді як константний домен важкого і легкого ланцюгів може опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, зокрема з різними клітинами імунної системи (наприклад, ефекторними клітинами) і першим компонентом (С14) класичної системи комплементу. МН- і Мі-ділянки можна додатково підрозділити на ділянки гіперваріабельності, що називаються "ділянками, що визначають комплементарність (гіперваріабельні ділянки)", які чергуються з ділянками з консервативною послідовністю, що називаються "каркасними ділянками " (ЕК). Кожен МН і МІ. складається з трьох СОК-доменів і чотирьох ЕК-доменів, розташованих від аміно-кінця до карбокси-кінця в наступному порядку:
ЕВ1-СОВ1-ЕН2-СОВ2-ЕА3-СО83-ЕК4. Варіабельні домени важкого і легкого ланцюгів містять зв'язувальний домен, який взаємодіє з антигеном. На особливу увагу заслуговують антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, які були "виділені" так, щоб вони існували у фізичному середовищі, відмінному від середовища, в якому вони можуть зустрічатися в природі, або які були модифіковані так, щоб вони відрізнялися за амінокислотною послідовністю від антитіла, що зустрічається в природі.
Термін "епітоп" означає антигенну детермінанту, здатну специфічно зв'язуватися з антитілом. Епітопи зазвичай складаються з поверхневих груп молекул, таких як амінокислоти або цукрові бічні ланцюги, і зазвичай мають специфічні характеристики тривимірних структур, а також специфічні характеристики заряду. Конформаційні і лінійні епітопи відрізняються тим, що зв'язування з першим, але не з останнім, завжди втрачається у присутності денатуруючих розчинників. Епітоп може містити амінокислотні залишки, що безпосередньо беруть участь в зв'язуванні, і інші амінокислотні залишки, які не приймають безпосередньої участі в зв'язуванні, наприклад амінокислотні залишки, які ефективно блокуються пептидом, що специфічно зв'язується з антигеном (іншими словами, амінокислотний залишок знаходиться в межах зони розпізнавання пептиду, що специфічно зв'язується з антигеном). Термін "епітоп 112-117" відноситься до ділянки альфа-синуклеїу людини, яка містить щонайменше 4 з 6 амінокислотних залишків 112-117 альфа-синуклеїну людини, причому епітоп не включає жодного залишку з 1-111 (зокрема будь-який залишок з 106-111) альфа-синуклеїну людини або жодного залишку з 118-140 (зокрема залишок 118-120) альфа- синуклеїну людини. У контексті даного опису вважають, що антитіло здатне специфічно зв'язуватися з епітопом в межах епітопу 112-117, якщо воно здатне специфічно зв'язуватися з
Зо альфа-синуклеїном людини шляхом зв'язування щонайменше з 4 з 6 амінокислотних залишків епітопу 112-117.
Вживаний в даному описі винаходу термін "антигензв'язувальний фрагмент антитіла" означає фрагмент, частину, ділянку або домен антитіла (незалежно від того, як він отриманий (наприклад, за допомогою розщеплювання, рекомбінантно, синтетично і т. д.)), який може специфічно зв'язуватися з епітопом, і, таким чином, термін "антигензв'язувальний" означає те ж саме, що і "епітопзв'язувальний", так що, наприклад, термін "антигензв'язувальний фрагмент антитіла" призначений позначати те ж, що і "епітопзв'язувальний фрагмент антитіла".
Антигензв'язувальний фрагмент може містити 1, 2, 3, 4, 5 або усі 6 СОБК-доменів такого антитіла, і, не дивлячись на те, що він здатний специфічно зв'язуватися з таким епітопом, він може проявляти специфічність, афінність або селективність відносно такого епітопу, який відрізняється від епітопу такого антитіла. Переважно, проте, щоб антигензв'язувальний фрагмент містив усі 6 СОК-доменів такого антитіла. Антигензв'язувальний фрагмент антитіла може бути частиною одного поліпептидного ланцюга (наприклад, 5сЕм), або містити його, або може представляти собою частину двох або більше поліпептидних ланцюгів, або містити їх, причому кожний з них має амінокінець і карбоксильний кінець (наприклад, діатіло, Еаб- фрагмент, Рабро-фрагмент і т. д.). Фрагменти антитіл, які проявляють антигензв'язувальну здатність, можна отримати, наприклад, в результаті протеазного розщеплювання інтактних антитіл. Не дивлячись на те, що два домени Ем-фрагмента, МІ ії МН, в природних умовах кодуються окремими генами або полінуклеотидами, які кодують такі послідовності генів (наприклад, їх кодуючою кДНК), переважніше, щоб їх можна було з'єднати за допомогою рекомбінантних способів гнучким лінкером, який забезпечує можливість їх отримання у вигляді одного білкового ланцюга, в якому Мі- і МН-ділянки асоціюються з утворенням одновалентних антигензв'язувальних молекул (відомих як одноланцюгові Ем (5сЕм), див., наприклад, Віга еї аї., (1988) бЗсієпсе 242:423-426; і Ниєюп еї аї. (1988) Ргос. Маї!. Асад. Зсі. (0.5.А.) 85:5879-5883). Як альтернатива, при використанні гнучкого лінкера, який є дуже коротким (наприклад, менш ніж приблизно 9 залишків), для того, щоб забезпечити можливість асоціації МІ - і МН- ділянок одного поліпептидного ланцюга разом, можна отримати біспецифічне антитіло, діатіло або подібну молекулу (у якій два такі поліпептидні ланцюги асоціюються разом з утворенням двовалентної антигензв'язувальної молекули) (для опису діатіл див., бо наприклад, РМАБ БА 90(14), 6444-8 (1993)). Приклади антигензв'язувальних фрагментів, що охоплюються цим винаходом, включають (ї) Габ'- або Гар-фрагмент - одновалентний фрагмент, що складається з МІ-, МН-, СіІ- і СНІ-доменів, або одновалентне антитіло, описане у
МО2007059782; (ії) Е(ав)2-фрагменти - двовалентні фрагменти, що містять два ГЕар-фрагменти, сполучені дисульфідним містком на шарнірному домені; (ії) Ба-фрагмент, що по суті складається з МУН- і СНІ1-доменів; (їм) Ем-фрагмент, що по суті складається з Мі - і МН-доменів, (м) аАр-фрагмент (мага еї аї., Маїиге 341, 544-546 (1989)), який по суті складається з МН-домену і також називається доменними антитілами (НОої; еї аї; Тгепав Віотесппої. 2003 Мом;2 (І): 4684-90); (м) антитіла верблюжих або нанотіла (Кемеїз еї аї; Ехрегі Оріп Віо! Тег. 2005 дап;5 (І): 11-24) і (мії) виділену гіперваріабельну ділянку (СОМ). Крім того, не дивлячись на те, що два домени Ем- фрагмента, МІ ї МН, кодуються окремими генами, вони можуть бути сполучені за допомогою рекомбінантних способів синтетичним лінкером, який забезпечує можливість їх отримання у вигляді одного білкового ланцюга, в якому Мі- і МН- ділянки знаходяться в парі з утворенням одновалентних молекул (відомих як одноланцюгові антитіла або одноланцюгові Ем (5СЕм), див., наприклад, Віга еї аї., 5сіепсе 242, 423-426 (1988) і Нивіоп еї аІ., РМАБ ЗА 85, 5879-5883 (1988)). Ці ї інші фрагменти антитіл, застосовні в контексті цього винаходу, додатково обговорюються в даному описі винаходу. Також слід розуміти, що термін "антитіло", якщо не вказане інше, також включає антитілоподібні поліпептиди, такі як химерні антитіла і гуманізовані антитіла, і фрагменти антитіл, що зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (антигензв'язувальні фрагменти), отримувані за допомогою будь-якої відомої методики, такої як ферментативне розщеплювання, синтез пептидів і рекомбінантні методики. Отримане антитіло може мати будь-який ізотип. Використовуваний в даному описі винаходу термін "ізотип" означає клас імуноглобуліну (наприклад, /дсСс1і, Ідс2, ІдсЗ або 1Ідс4), який кодується генами константного домену важкого ланцюга. Такі фрагменти антитіл отримують за допомогою традиційних методик, відомих фахівцям в даній галузі техніки; відповідні фрагменти, здатні зв'язуватися з бажаним епітопом, можна без зусиль піддати скринінгу відносно корисності таким же чином, як і інтактне антитіло.
Термін "біспецифічноє антитіло" означає антитіло, що містить два незалежні антигензв'язувальні фрагменти, кожен з яких націлений на незалежні мішені. Ці мішені можуть бути епітопами, присутніми в різних білках, або різними епітопами, присутніми в одній і тій же
Зо мішені. Молекули біспецифічних антитіл можна отримати за допомогою компенсаторних амінокислотних змін в константних доменах НС початкових молекул моноспецифічних двовалентних антитіл. Отримане в результаті гетеродимерне антитіло містить один Раб, внесок в утворення якого вносять два різні початкові моноспецифічні антитіла. Амінокислотні зміни в
Ес-домені приводять до підвищеної стабільності гетеродимерного антитіла з біспецифічністю, яка стабільна за часом. (Кіадулау еї аї., Ргоївіп Епдіпеегіпд 9, 617-621 (1996), СипазекКагап ес! аї., вс 285, 19637-1(2010), Моогевї аІ., МАБре 3:6 546-557 (2011), Бігор еї аї., МВ 420, 204-219 (2012), Меї? єї аї., Ргоївїп Епдіпеегіпд 25:10 571-580 (2012), І абгі)п єї аі., РМАБ 110:113, 5145- 5150 (2013), бргеїег Моп Кгецйдепвівєїп єї аіІ., МАБ5 5:5 646-654 (2013)). Біспецифічні антитіла також можуть включати молекули, які отримані за допомогою злиття СЕМ. Потім два моноспецифічні 5сїм незалежно з'єднують з Ес-доменами, які можуть утворювати стабільні гетеродимери, з отриманням однієї біспецифічної молекули (Мабгу еї аіІ., РЕО5 23:3 115-127 (2010). Біспецифічні молекули мають здатність до подвійного зв'язування.
Наприклад, націлювання, як на терапевтичну мішень, так і на трансцитозний поверхневий рецептор з метою доставки терапевтичного антитіла через гематоенцефалічний бар'єр для лікування захворювання ЦНС.
Терміни ЗМ37, ЗМ-37, ЗМ37 дикого типу (м), тар37 і 6004-37 використовують в даному описі взаємозамінним чином, і всі вони відносяться до одного і того ж антитіла.
Під терміном антитіло ЗМ37 мають на увазі антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить важкий ланцюг, який наведений в СОК1-3 за 5ЕО ІЮ МО:1-3, і СОК1-3
БО легкого ланцюга, які наведені в ЗЕО ІЮ МО:4-6, або що складається з них. Згідно 3 одним варіантом здійснення антитіло ОМ37 або його антигензв'язувальний фрагмент може містити варіабельний домен важкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО:7 і/або варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІО МО:8 або складатися з них. Наприклад, антитіло ЗМ37 може бути антитілом
ІС, що містить важкий ланцюг, що складається з варіабельного домену за 5ЕО ІЮ МО:7 і константного домену за ЗЕО ІЮ МО:18, разом з легким ланцюгом, що складається з варіабельного домену за ЗЕО ІЮ МО:8 і константного каппа-домену за ЗЕО ІЮ МО:17.
Дезамінування білків, і в цих випадках антитіл, може відбуватися спонтанно в ході виготовлення і зберігання, але також і іп мімо, і воно утруднює контроль якості кінцевого фармацевтичного лікарського препарату. Дезамінування також в деяких випадках може бо впливати на активність молекули. Дезамінування відбувається на аспарагінових залишках, але локалізацію відповідного аспарагіну може бути важко спрогнозувати з упевненістю, але в деяких випадках на неї може впливати аспарагін- гліциновий мотив. У антитілі ЗМ37 виявлено декілька можливих мотивів дезамінування, проте, було виявлено, що один вірогідний сайт дезамінування знаходиться на залишку 54 важкого ланцюга. Подальша заміна аспарагіну іншою амінокислотою не є безпосереднім наслідком, але було виявлено, що З варіанти 2М37 (варіант (маг) 1, 2 і 3 СМ37) зберігають активність початкового ЗМ37 (ЗМ37 дикого типу (УМ)).
Термін "варіанти 5М37" означає дезаміновані варіанти 1, 2 або 3, де варіант 1 містить заміну М545, варіант 2 містить заміну М540), а варіант З містить М54Н в порівнянні з антитілом
ОМ37, описаним в даному описі винаходу вище.
Таким чином, мається на увазі, що варіант (маг) 1, 2 і З антитіла СОМ37 включає антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить важкий ланцюг, який наведений в СОК'І і З за
ЗЕОІЮ МОЇ З із СМ 37 і СОК1-3 легкого ланцюга з СМ37, які наведені в 5ЕО ІЮ МО:4-6, або що складається з них, але який відрізняється за їх СОК2 важкого ланцюга, так що варіант 1 має
СО 2 за 5ЕО ІЮ МО:33, варіант 2 має СОК 2 за 5ЕО ІО МО:34, а варіант З має СОК 2 за 5БЕО
ІО МО:З5.
Згідно з одним варіантом здійснення варіанти антитіла 5М37 або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть містити варіабельний домен важкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО:30, 31 ї 32 відповідно для варіанту 1, 2 і З і варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО:8 або складатися з них. Антитіло (3М37 може бути антитілом Дб, що містить важкий ланцюг, що складається з варіабельного домену за ЗЕО ІЮ МО:30, 31 або 32 і константного домену за ЗЕО
ІО МО:18, разом з легким ланцюгом, що складається з варіабельного домену за ЗЕО ІЮ МО:8 і константного каппа-домену за 5ЕО ІЮ МО:17.
Терміни 5М285, ЗМ-285, тар285 і 6004-285 використовують в даному описі винаходу взаємозамінним чином, і всі вони відносяться до одного і того ж антитіла.
Під терміном "антитіло (М285" мають на увазі антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить важкий ланцюг, який наведений в СОК1-3 за БЕО ІЮ МО:20-22, і СОК1-3 легкого ланцюга, які наведені в 5Е0О ІЮ МО:23-25, або що складається з них. Згідно з одним варіантом здійснення антитіло СМ37 або його антигензв'язувальний фрагмент може містити
Зо варіабельний домен важкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО:26 і/або варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО:27 або складатися з них. Наприклад, антитіло 5М37 може бути антитілом ідо, що містить важкий ланцюг, що складається з варіабельного домену за ЗЕО ІЮ
МО:26 ії константного домену за 5ЕО ІЮ МО:28, разом з легким ланцюгом, що складається з варіабельного домену за ЗЕО ІЮ МО:27 і константного каппа-домену за 5ЕО ІЮО МО:29.
Антитіло 5М285 специфічно зв'язує епітоп в послідовності 112-115 (ЩЕ, 5ЕО ІЮ МО 19) альфа-синуклеїну людини (ЗЕО ІЮ МО:10).
Якщо в даному описі винаходу не вказане інше, то нумерація амінокислотних залишків в цій ділянці відповідає ІМСТФ, міжнародній інформаційній системі ІтМипосСепетіс5Ф), або Кабаї, Е.
А. Ми, Т. Т., Рету, Н. М., боНезтапп, К. 5. 5 ЕоеїПег, б. (1991). бедиєпсев ої Ргоївїнв5 ої
Ітітипоїодіса! Іпіегеві, Бій ейй., МІН Рибіїсайоп по. 91-3242 Ш.5. ЮОерайтепі ої Неайй апа
Нитапзегуісев. Споїйніа, С. 8 І е5К, А. М. (1987). Сапопісаї! вігисіигезв Тог Ше Ппурегуагіаріє дотаїпв5 ої іттиподіобиїїпв5. У. Мої. Віо!. 196, 901-917).
Вираз "антитіло до альфа-синуклеїну" або "антитіло проти альфа-синуклеїну" (використовуване в даному описі винаходу взаємозамінним чином залежно від контексту, в якому воно написане) означає антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які специфічно зв'язуються з альфа-синуклеїном або фрагментом альфа- синуклеїну, як визначено в даному описі винаходу вище, зокрема, з послідовністю альфа-синуклеїну, що відповідає ЗЕО
ІО МО: 9 і/або 19.
Використовуваний в даному описі винаходу термін "антитіло людини" (який може бути скорочений до "питАбБ" або "НиМабр") призначений включати антитіла, що мають варіабельні і константні домени, отримані з послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Антитіла людини цього винаходу можуть включати амінокислотні залишки, що не кодуються послідовностями імуноглобуліну зародкової лінії людини (наприклад, мутації, введені за допомогою випадкового або сайт-специфічного мутагенезу іп міго або під час перебудови гена або за допомогою соматичної мутації іп мімо).
Використовувані в даному описі винаходу терміни "моноклональне антитіло" або "композиція на основі моноклональних антитіл" відносяться до препарату з молекул антитіл єдиного молекулярного складу. Традиційна композиція на основі моноклональних антитіл характеризується єдиною специфічністю зв'язування і афінністю до конкретного епітопу. Згідно 60 з певними варіантами здійснення моноклональне антитіло може складатися із більш ніж одного
Еаб-домену, за рахунок чого підвищується специфічність більш ніж до однієї мішені. Терміни "моноклональне антитіло" або "композиція на основі моноклональних антитіл" не призначені для обмеження будь-яким конкретним способом отримання (наприклад, рекомбінантним, трансгенним, гібридомним і т. д.).
Термін "гуманізований" відноситься до молекули, що зазвичай отримується з використанням рекомбінантних методик, яка має антигензв'язувальний сайт, отриманий з імуноглобуліну від виду, відмінного від людини, і решту структури імуноглобуліну, в основі якої лежить структура іабо послідовності імуноглобуліну людини. Антигензв'язувальний сайт може містити або повні варіабельні домени антитіла, відмінного від людського, злиті з константними доменами людини, або тільки гіперваріабельні ділянки (СОК) таких варіабельних доменів, прищеплені до відповідних людських каркасних ділянок варіабельних доменів людини. Залишки каркасних ділянок таких гуманізованих молекул можуть бути дикого типу (наприклад, повністю людськими), або вони можуть бути модифіковані так, щоб мати одне або декілька амінокислотних заміщень, які не зустрічаються в антитілі людини, послідовність якого послужила основою для гуманізації. Гуманізація зменшує або усуває вірогідність того, що константний домен молекули виступатиме в ролі імуногена у людей, але зберігається можливість імунної відповіді на чужорідний варіабельний домен (ГоВидій, А.Р. еї аї. (1989) "Моизе/Нитап Спітетгіс Мопосіопа! Апіїроду Іп Мап: Кіпеїїс5 Апа Іттипе Незропзе", Ргос. Маї).
Асай. 5сі. (0.5.А.) 86:4220-4224). Інший підхід фокусується не тільки на отриманні константних доменів людського походження, але також і на модифікації варіабельних доменів, з тим щоб реконструювати їх якомога ближче до людської форми. Відомо, що варіабельні домени як важкого, так і легкого ланцюгів містять по три гіперваріабельні ділянки (СОК), які розрізняються за відповіддю на дані антигени і визначають здатність до зв'язування, фланковані чотирма каркасними ділянками (ЕК), які є відносно консервативними у даного виду і які імовірно виконують роль остову для СОК. Якщо відмінні від людських антитіла отримують до певного антигену, варіабельні домени можна "реконструювати" або "гуманізувати" шляхом щеплення
СОК, отриманих з антитіла, відмінного від людського, до ЕК, які присутні в антитілі людини, що підлягає модифікації. Про застосування такого підходу до різних антитіл повідомлялося в зай,
К. єї аї. (1993) Сапсег Рез 53:851-856. Вівсптапи, І. єї а). (1988) "Везпаріпд Нитап Апііродієв тої ТПегару", Маїште 332:323-327; Метоеуєп, М. еї аї. (1988) "Незпаріпа Нитап Апііродієвв:
Стайіпуд Ап Апійузогуте Асіїмйу", Зсіепсе 239:1534-1536; Кешерогоцди, С. А. еї аї. (1991) "Нитапігайоп ОЇ А Моизе Мопосіопа! Апіїбоду Ву СОВ-Стайіпд: Те Ітропапсе ОЇ ЕРгатемогк
Везідиез Оп Гоор Сопіоптаїййоп", Ргоїєїп Епаіпеєегіпуд 4:773-3783; Маеєда, Н. єї аї. (1991) "Сопвігисіоп ОЇ Везпарей Нитап Апіїбодіез МПА НІМ-Мешігаїїгіпд Асіїмну", Нитап Апііїбодієв
Нубгідота 2:1124-134; Соптап, 5. 0. еї аї. (1991) "Везпаріпд А Тнегарешіс СО04 Апііроаду", Ргос.
Маї. Асай. 5сі. (0.5.А.) 88:4181-4185; Тетрезві, Р.В. єї аї. (1991) "Везпаріпд А Нитап Мопосіопаї
Апіїроду То Іппірїї Нитап Везрігаюгу 5упсуйа! Мігив5 Іптесіоп іп мімо", Віо/Тесппоіоду 9:266-271;
Со, М. 5. еї аї. (1991) "Нитапігейд Апііродієвз Рог Апіїміга! Тнегару", Ргос. Маї)!. Асад. сі. (0О.5.А.) 88:2869-2873; Сапег, Р. єї аї. (1992) "Нитапігайоп ОЇ Ап Апіі-рів5пег2 Апіїбоду Рог Нитап
Сапсег ТНегару", Ргос. Маї). Асад. 5сі. (0О.5.А.) 89:4285-4289; і Со, М.5. еї а. (1992) "Спітегіс Апа
Нитапігейд Апііїродієз МН Зресіїйсну Бог Тне СОЗЗ Апіїдеп", У. Іттипої. 148:1149-1154. Згідно з деякими варіантами здійснення гуманізовані антитіла зберігають всі послідовності СО (наприклад, гуманізоване антитіло миші, яке містить усі шість СОК антитіл миші). Згідно з іншими варіантами здійснення гуманізовані антитіла містять одну або декілька СОК (одну, дві, три, чотири, п'ять, шість), які змінені відносно початкового антитіла і які також називаються однією або декількома СОЕ, "отриманими з" одного або декількох СОК початкового антитіла.
Можливість гуманізації антигену добре відома (див., наприклад, патенти США МоМо 5225539, 5530101, 5585089, 5859205, 6407213, 6881557).
У контексті даного опису вважають, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент "специфічно" зв'язуються з ділянкою іншої молекули (тобто епітопом), якщо вони вступають в реакцію або асоціюються з цим епітопом частіше, швидше, з більшою тривалістю і/або з більшою афінністю або авідністю в порівнянні з альтернативними епітопами. Згідно з одним варіантом здійснення антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент цього винаходу зв'язуються щонайменше в 10 разів сильніше зі своєю мішенню (альфа-синуклеїном людини), ніж з іншою молекулою; переважно щонайменше в 50 разів сильніше і переважніше щонайменше в 100 разів сильніше.
Переважно, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язуються у фізіологічних умовах, наприклад, іп мімо. Таким чином, антитіло, яке здатне "специфічно зв'язуватися" з епітопом в межах залишків 112-117 (ПС ЕОМР (5ЕБО ІЮ МО:9)) альфа-синуклеїну людини, бо охоплює антитіло або його антигензв'язувальні фрагменти, які здатні зв'язуватися з епітопом в межах залишків 112-117 альфа- синуклеїну людини з такою специфічністю і/або в таких умовах.
Способи, відповідні для визначення такого зв'язування, будуть відомі фахівцям в даній галузі техніки, а ілюстративні способи описані в супроводжуючих прикладах. Використовуваний в даному описі винаходу термін "зв'язування" в контексті зв'язування антитіла із заздалегідь визначеним антигеном зазвичай означає зв'язування з афінністю, що відповідає КО, що становить приблизно 107 М або менше, як наприклад, приблизно 108 М або менше, як наприклад, приблизно 107 М або менше при визначенні, наприклад, за допомогою технології поверхневого плазмонного резонансу (5РЕ) на ВІіАсогефФ 3000 або на приладі Т200іпвігитепі із застосуванням антигену як ліганду і антитіла як аналізованої речовини, яке зв'язується із заздалегідь визначеним антигеном з афінністю, що відповідає КО, яка щонайменше вдесятеро нижче, як наприклад, щонайменше в 100 разів нижче, наприклад щонайменше в 1000 разів нижче, як наприклад, щонайменше в 10000 разів нижче, наприклад, щонайменше в 100000 разів нижче, ніж його афінність при зв'язуванні з неспецифічним антигеном (наприклад, В5А, казеїном), відмінним від заздалегідь визначеного антигену або близькоспорідненого антигену.
Ступінь, на яку афінність є більш низькою, залежить від КО антитіла, так що якщо КО антитіла є дуже низькою (тобто антитіло є високоспецифічним), то ступінь, на яку афінність до антигену є більш низькою, ніж афінність до неспецифічного антигену, може бути щонайменше 10000- кратною.
Використовуваний в даному описі винаходу термін "ка" (с -1 або 1/с) відноситься до константи швидкості дисоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену.
Вказане значення також називають значенням Коїї.
Використовуваний в даному описі винаходу термін "Ка" (М-1 х с-1 або 1/М:-с) відноситься до константи швидкості асоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену.
Використовуваний в даному описі винаходу термін "КО" (М) відноситься до рівноважної константи дисоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену, і її отримують шляхом ділення Ка на Ка.
Використовуваний в даному описі винаходу термін "КА" (М-1 або 1/М) відноситься до рівноважної константи асоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену, і її отримують шляхом ділення Ка на Ка.
Згідно з одним варіантом здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувальних фрагментів, які характеризуються однією або декількома з наступних властивостей: і. афінністю зв'язування (КО) до альфа-синуклеїну в діапазоні 0,5-10 нМ, наприклад 1-5 нм або 1-2 НМ; і. здатністю пригнічувати усікання протеазами фібрил альфа-синуклеїну; ії. здатністю обертати порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей Е28- впса; ім. здатністю знижувати рівні альфа-синуклеїну в гіпокампі миші, за результатами вимірювання за допомогою мікродіалізу іп мімо; м. здатністю, при тривалому введенні, відновлювати рухову функцію у щурячій моделі хвороби Паркінсона; мі. здатністю запобігати затравлювальній дії альфа-синуклеїну (такій як накопичення нерозчинного фосфорилованого альфа-синуклеїну іп мійго і/або у мишачій моделі хвороби
Паркінсона) і/або міі. здатністю зв'язувати усічений альфа-синуклеїн в головному мозку людини.
Афінність зв'язування (КО) до альфа-синуклеїну можна визначити за допомогою способів, добре відомих з рівня техніки, наприклад, описаних в прикладі 2.
Термін "здатність пригнічувати усікання протеазами фібрил альфа-синуклеїну" включає здатність пригнічувати індуковане кальпаїном-ї утворення фрагмента 1-119-122 альфа- синуклеїну людини в первинних кортикальних нейронах (див. приклад 5).
Термін "здатність обертати порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей
Е28-5пса" включає здатність обертати порушення синаптичної передачі і пластичності в ділянці
СА1 гіпокампу у трансгенних мишей Е28-5пса, наприклад, як показано за допомогою градієнта
ТЕРБ5Р, виміряного електрофізіологічними способами (див. приклад 6).
Термін "здатність знижувати рівні альфа-синуклеїну в гіпокампі миші, за результатами вимірювання за допомогою мікродіалізу іп мімо", включає здатність знижувати рівні альфа- синуклеїну людини в гіпокампі безсонних трансгенних мишей Е28-5пса, що вільно рухаються, за результатами вимірювання з використанням мікродіалізу іп мімо (див. приклад 7).
Термін "здатність, при тривалому введенні, відновлювати рухову функцію у щурячій моделі бо хвороби Паркінсона" включає здатність зменшувати або усувати рухову асиметрію у щурячій моделі хвороби Паркінсона з використанням вектора на основі рекомбінантного аденоасоційованого вірусного вектора (гААМ) (див. приклад 8).
У деяких антитілах для збереження зв'язування в гуманізованому антитілі необхідна лише частина СОК, а саме підмножина залишків СОК, необхідних для зв'язування, що називаються
ЗОК. Залишки СОК, що не контактують з відповідним епітопом і не містяться в 5ОК, можна ідентифікувати на підставі попередніх досліджень (наприклад, залишки НбО-Нб5 в Н2 СОК часто не є необхідними) з ділянок СОК за Кабаї, розташованих зовні гіперваріабельних петель за СПпоїпіа (див., Караї еї а. (1992) БЕООЕМСЕВ ОБ РКОТЕІЇМ5 ОО ІММИОМОГОБІСАЇ.
ІМТЕВЕЗТ, Маїйопаї Іпзійшез ої Неайй Рибіїсайоп Мо. 91-3242; Споїпіа, С. єї а. (1987) "Сапопіса!
Зігисішгез Рог Пе Нурегуапаріє дотаїпв ОГ Іттиподіобиїййв", У. Мої. ВіоІ. 196:901-917), за допомогою молекулярного моделювання, і/або емпіричним шляхом, або як описано в сСоплаїев,
М.В. єї аї. (2004) "БОВ Стапйіпа ОГ А Мигіпе Апіїрбоду Овіпд Мийіріе Нитап Сегптіїпе Тетріаїез То
Міпітіге П5 Іттиподепісйу", Мої. Іттипої. 41:863-872. У таких гуманізованих антитіл в положеннях, в яких відсутні один або декілька залишків донорної СОК або в яких відсутня вся донорна СОК, амінокислота, що займає таке положення, може бути амінокислотою, що займає відповідне положення (згідно з нумерацією за Кара) в акцепторній послідовності антитіла.
Кількість таких замін акцепторних амінокислот на донорні в СОК, які потрібно включити, відображає баланс альтернативних думок. Такі заміни потенційно є переважними для зниження кількості амінокислот миші в гуманізованому антитілі і, отже, для зниження потенційної імуногенності. Проте, заміни також можуть викликати зміну афінності, а переважним є уникати значних зменшень афінності Положення для заміни в межах СОК і амінокислоти, що підлягають заміні, також можна вибрати емпіричним шляхом.
Той факт, що зміна однієї амінокислоти в залишку СОК може привести до втрати функціонального зв'язування (Киаікой, 5. еїс. (1982) "Біпдіе Атіпо Асій ЗиБрзійшіоп АКегіпод
Апіідеп-Віпаіпу Зресіїісйу", Ргос. Маї). Асад. сі. (О5А) 79(6):1979-1983), забезпечує можливість систематичної ідентифікації альтернативних функціональних послідовностей СОК. У одному переважному способі отримання таких варіантів СОМ полінуклеотид, що кодує СОК, піддають мутації (наприклад, шляхом випадкового мутагенезу або за допомогою сайт-спрямованого способу (наприклад, з ампліфікацією, опосередкованою полімеразною ланцюговою реакцією, з
Зо праймерами, які кодують мутантний локус)) з отриманням СОЖК, що має замінений амінокислотний залишок.
Шляхом порівняння ідентичності початкової (функціональної) послідовності СОК за відповідним залишком з ідентичністю варіанта послідовності СОК із заміною (нефункціональної) для цієї заміни можна визначити вагу заміни згідно з ВІОБИМБ2.і). У системі ВГОБОМ представлена матриця амінокислотних замін, що створюється шляхом аналізу бази даних послідовностей відносно достовірних вирівнювань (Едау, 5.Е. (2004) "МУНеге ріа Тне ВГ ОБОМб2
АІйдптепі б5соге Маїгіх Соте Егот?", Майшге Віоївсн. 22(8):1035-1036; Непікої, 9У.с. (1992) "Атіпо асіа вирвійшіоп таїйгісе5 їот ргоїєїп ріоск5", Ргос. Маї). Асад. сі. (ОА) 89:10915-10919; Кап, 5. єї а). (1990) "Меїйноад5 Рог Авзезвіпд ТНе 5іаїївіїса! бБідпітісапсе ОЇ МоіІєсшаг Зедиепсе Ееаштев
Ву віпд Сепега! 5согіпд Зспетев", Ргос. Май). Асад. сі. (О5А) 87:2264-2268; Айвениї, 5.Е. (1991) "Атіпо Асій Зирвійшіоп Маїйгісе5 Егот Ап Іптоптайоп ТНеогеїїс Реггресіїме", У. Мої. Віо!. 219, 555-565. В даний час найбільш досконалою базою даних ВГОБИМ є база даних В О50М62 (ВГОЗИМб2.іїЇ)). У таблиці 1 представлені значення ваги замін згідно з ВГОБОМБб2. її (чим більше вага, тим консервативнішою є заміна і, таким чином, тим ймовірніше, що заміна не впливатиме на функцію). Якщо, наприклад, антигензв'язувальний фрагмент, що містить отриманий в результаті СОЖК, не може зв'язуватися з альфа-синуклеїном, то вагу заміни згідно з
В'ОоБИМб2.Її| вважають недостатньо консервативною і вибирають і проводять нову кандидатну заміну, що має більшу вагу заміни. Так, наприклад, якщо початковим залишком був глутамат (Е), а нефункціональним замінюючим залишком був гістидин (Н), то вага заміни згідно з в'ОоБИМба2.ї| дорівнюватиме 0, а консервативніші зміни (наприклад, аспартат, аспарагін, глутамін або лізин) є переважними.
Таблиця 1 ГА|ВнІмМіо|СсС Іо ЕєЇ сіні! 1 | су км РІЗ ТММ
Ал 2|2г|о|л ло 12е|л|л лічі 2 лі|н|о зе о віллі о|2|зі|Іні ої 20312 32|л|3 2||11 312 мі2|0|-6Їїн|з|о0 001 ні 0 2|3 2і|ні|о| 412 0о/-2|2|-|6| 30 -е|-1-71| 3141733 110-114 13 з со0|з3/|-31|-3159|-34|31| 3113112 3|1|1 1 212 7
Оо|лініо|о0|з3|55 | 21032 ніо|з3 л1|0|71 217 2
ЕЇлЛ|0/|0|ч2|4|2 51210 3| 3 ні 23 101312 2 саіо|21|01-1|3|-2 261 2| 4|4 1 2| | 21|0|21 213 ні гіої|ніл|з3|1о0 1012158! 3|-3 7 2|7 1 2||21 212 1171-31-31 -31/-11|-3 31-41 3|-4|:2 Зно 3|2|-11 3 1 3 71 2|-31|4|-1|-213|-4|3|2|44 23210 3 2|7 121 кІлізо|л| зн гла 5|| 3101312 2 міліл 23110 2|3| 2 ні лі а|л|іл іл лін
ЕЕ! 2|31|-3|31|2|-3 з3| 31710101 31016 4|-2| 2 м 1-3 7
РІЛЛІ 22171321 21|3|31 71 2| 4 -7| | 4 13 2 5Інілініо|л|1о0 0017 2| 210112 1|4|к| 312 тІо|л|о|л|л|л ее ля || ее о МГо|з31|31|31|ч1|212|з3|з|з| ніг ні еа| 210 | з | 71 | 4
Таким чином, цей винахід передбачає застосування випадкового мутагенезу для ідентифікації поліпшених СОМ. У контексті цього винаходу консервативні заміни можуть бути визначені як заміни в межах класів амінокислот, відображених в одній або декількох з наступних трьох таблиць.
Класи амінокислотних залишків для консервативних замін
Таблиця 2
Азр (0) і Сім (Е)
Гуз (К), Аго (Б) і Ні (Н)
Зег (5), Тпг (Т), Авп (М) і Сіп (0)
Су (С), Ага (А), Ма! (М), Г.еи (і Пе ()
Суз (С), Ме! (М) і Рго (Р)
Рпе (Р), Туг (СЮ і Тгр (ММ)
Альтернативні класи амінокислотних залишків для консервативних замін
Таблиця З пн І В: о У ПО ши и и т ПО с ПОД ПО 1 4в' кі вм ни п и З п о ПО ГТ
Альтернативні фізичні і функціональні класифікації амінокислотних залишків
Таблиця 4
Групи консервативніших замін включають валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін- тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін і аспарагін-глутамін.
Додаткові групи амінокислот також можуть бути складені за допомогою принципів, описаних, наприклад, в Стеідпіоп (1984) Ргоїеіп5: Зігисіиге апа Моїесшціаг Ргорегііїеєз (24 Еа. 1993), МУ. Н.
Егеетап апа Сотрапу.
Як альтернативу можна застосовувати технологію фагового дисплея для підвищення (або зниження) афінності СОК. Ця технологія, яка називається дозріванням афінності, передбачає використання мутагенезу або "прогулянки по СОМ", а повторний відбір передбачає застосування цільового антигену або фрагмента антигену, з яким відбувається зв'язування, для виявлення антитіл, що мають СОК, які зв'язуються з антигеном з вищою (або нижчою) афінністю в порівнянні з первинним або початковим антитілом (див., наприклад, Сіазег еї аїІ. (1992) У. Іттипоїоду 149:3903). Мутагенез цілих кодонів, а не окремих нуклеотидів, приводить до отримання напіввипадкового набору амінокислотних мутацій. Можна сконструювати бібліотеки, що складаються з пулу варіантів клонів, кожен з яких відрізняється однією зміною амінокислоти в одній СОК і який містить варіанти, що представляють кожну можливу амінокислотну заміну для кожного залишку СОК. Мутанти з підвищеною (або зниженою) афінністю зв'язування з антигеном можна піддати скринінгу шляхом приведення в контакт іммобілізованих мутантів з міченим антигеном. Для ідентифікації антитіл-мутантів з підвищеною або зниженою афінністю до антигену можна застосовувати будь- який відомий з рівня техніки спосіб скринінгу (наприклад, ЕГІЗА) (див. Ми єї аї. 1998, Ргос. Маї)!.
Асай. сі. (0О.5.А.) 95:6037; Уекоп еї аї., 1995, 9. Іттипоіоду 155:1994). Можливе застосування методики "прогулянки по СОК", за допомогою якої рандомізують легкий ланцюг (див. Зспіег еї а!., 1996, У. Мої. Віо. 263:551).
Способи здійснення такого дозрівання афінності описані, наприклад, в Кгаизе, .).С. еї аї. (2011) "Ап Іпзепйіоп Миїайоп ТНаї Оівютів Апіїбоду Віпаїпд 5йе Агспійесіиге Еппапсев5 Рипсійоп ОЇ
А Нитап Апііроду", МВіо. 2(1) рії: е00345-10. дої: 10.1128/тВіо.00345-10; Киап, С.Т. еї аї. (2010) "Аніпнку-Маїйигейд Апіі-Сіусоргоївїіп ММВ РесотрБбіпапі Іттипоїохіп5 Тагдеїйпу Маїїдпапі Спіотав
Ап Меїапотав", Іпі. У. Сапсег 10.1002/|с.25645; НаскКеї, В.). еї ах. (2010) "Ззарійу Апа СОВ
Сотровійоп Віазев Епгісп Віпдег Рипсііопаїйу І апазсарев", у. Мо). Віої. 401(1):84-96; Мопідотегу,
О.К. еї аї. (2009) "Аніппу Маїигайоп Апа Спагасієгігайоп ОЇ А Нитап Мопосіопа! Апіїбоду Адаїпві
НІМ-1 др41", МАБб5 1(5):462-474; Саяивісніпа, Е. єї аі. (2009) "АНіпйу Майшгайоп Ву Таговївй
Оімегвіїїсайоп ОЇ Те СОВ-НЕ2 Іоор ОЇ А Мопосіопа! Раб Оеєгімед Рот А Зупіпеїїс Маїме Нитап
Апіїрбоду І Інгагу Апа бігесієйд Адаїп5і Тпеє Іпіегпаї! Тгітегіс Соїйед-Сої! ОЇ Сір41 Мівідв А 5еї ОЇ Рарз
ММ Ітргомей НІМ-1 Мешгаїїгайоп Роїепсу Апа Вгєайін", Мігоіїоду 393(1):112-119; Ріпіау, МУ... еї а. (2009) "АНіпйу Маїйгайоп ОЇ А Нитапігей АНаї Апіроду Бог АМТІ-ВАСЕ Тнегару:
СотргеНепвзіме Миїадепевзіз Немеаї5 А Нідп І еме! ОЇ Миїайопаї! Ріавіїсйу Воїй Іпвіде Апа Оцівіде
Тне Сотріетепіату-Оеєїеттіпіпу Недіопв", ). Мої. Віої. 388(3):541-558; Вовігот, «у. еї аї. (2009) "Ітпргоміпуд Апіїбоду Віпаіїпд Айіпйу Апа Зресіїїсйу Рог Тнегарецшіїс ОемеІортепі", Меїйосдв5 Мо).
Віо!. 525:353-376; еїеїаї, 5. еї аї. (2008) "п Міго Айіпйу Майшгайоп ОЇ Нитап СМ-С5Е Апіїродієв
Ву Тагдеїва СОВ-Оіметгвітісайоп", Мої. Іттипої. 46(1):135-144; і Вагаегав, Е. еї аї. (2008) "Айіпйу
Маїигаїйоп ОЇ Апііродієв Азвівієй Ву Іп 5іЇїсо Модеїїпд", Ргос. Маї!. Асад. сі. (ОБА) 105(26):9029-9034.
Таким чином, послідовність варіантів СОМ охоплюваних антитіл або їх антигензв'язувальних фрагментів може відрізнятися від послідовності СОК початкового антитіла ЗМ37, ЗМ37 маг 1-3 або 285 за замінами; наприклад, за заміненими 4 амінокислотними залишками, 3 амінокислотними залишками, 2 амінокислотними залишками або 1 з амінокислотних залишків.
Згідно з варіантом здійснення цього винаходу додатково передбачається, що амінокислоти в
СОВ-ділянках можна замінювати за допомогою консервативних замін, визначених в трьох таблицях вище.
Використовуваний в даному описі винаходу термін "лікування" або "здійснення лікування" означає полегшення, уповільнення, ослаблення або обернення розвитку або тяжкості захворювання або порушення або полегшення, уповільнення, ослаблення або усунення одного або декількох симптомів або побічних ефектів такого захворювання або порушення. Для цілей цього винаходу термін "лікування" або "здійснення лікування" додатково означає підхід для отримання сприятливих або бажаних клінічних результатів, де термін "сприятливі або бажані клінічні результати" включає без обмеження полегшення симптому, зниження ступеня порушення або захворювання, стабілізований (тобто такий, що не погіршується) стан захворювання або порушення, затримку або уповільнення прогресу стану захворювання або порушення, полегшення або пом'якшення стану захворювання або порушення і ремісію захворювання або порушення, або частково, або повністю, що піддається виявленню або не піддається виявленню.
Термін "ефективна кількість", вживаний відносно антитіла або його антигензв'язувальних фрагментів цього винаходу, відноситься до кількості, яка при введенні в необхідних дозах і протягом необхідних періодів часу є достатньою для досягнення наміченого біологічного ефекту або бажаного терапевтичного результату, включаючи, без обмеження, досягнення клінічних результатів. Фраза "терапевтично ефективна кількість", що застосовується у відношенні антитіла або його антигензв'язувальних фрагментів цього винаходу, призначена позначати таку кількість антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, яка є достатньою для полегшення, пом'якшення, стабілізації, обернення, уповільнення, ослаблення або затримки прогресу порушення або хворобливого стану або симптому порушення або захворювання.
Згідно з одним варіантом здійснення спосіб цього винаходу передбачає введення антитіла або його антигензв'язувального фрагмента в комбінаціях з іншими сполуками. У такому разі "ефективною кількістю" є кількість комбінації, достатня для того, щоб викликати намічений
Зо біологічний ефект.
Терапевтично ефективна кількість антитіла до альфа-синуклеїну або його антигензв'язувального фрагмента цього винаходу може варіюватися залежно від таких чинників, як стан хвороби, вік, стать і вага індивідуума, а також здатність антитіла до альфа- синуклеїну викликати бажану відповідь у індивідуума. Терапевтично ефективна кількість також є кількістю, при якій будь-які токсичні або пагубні ефекти антитіла або частини антитіла переважуються терапевтично сприятливими ефектами.
Як вказано вище, цей винахід, зокрема, відноситься до моноклонального антитіла, здатного специфічно зв'язуватися з епітопом в межах амінокислот 112-117 альфа- синуклеїну людини (ЗЕБЕО 10 МО:9 (ІСЕОМР)). Згідно з одним варіантом здійснення антитіло може конкурувати з антитілом ОМ37 за зв'язування з епітопом в межах амінокислот 112-117 альфа-синуклеїну.
Антитіла цього винаходу, проілюстровані за допомогою ЗМ37, його варіантів маг 1-3 ЗМ37 і
ОСМ285, і їх фрагменти, що зв'язують альфа-синуклеїн, здатні зв'язувати фрагмент токсичного альфа-синуклеїну, що складається із залишків 1-119/122 альфа- синуклеїну, і нейтралізувати його токсичність (наприклад, шляхом позаклітинного зв'язування з фрагментом альфа- синуклеїну і запобігання за рахунок цього його поглинанню клітинами). На диво, антитіла цього винаходу, які здатні зв'язуватися з епітопом в межах амінокислот 112-117 альфа-синуклеїну, мають кращі властивості в порівнянні з антитілами з попереднього рівня техніки, такими як антитіло 9Е4, стосовно зв'язування з токсичними різновидами альфа-синуклеїну в головному мозку людини і мають кращий вплив на усунення позаклітинного альфа-синуклеїну і нормалізацію порушеної синаптичної передачі, що індукується альфа-синуклеїном іп мімо.
Антитіла цього винаходу здатні полегшувати прояв відповідного рухового фенотипу у щурячій моделі хвороби Паркінсона.
Антитіла цього винаходу переважно є людськими або гуманізованими антитілами. Цей винахід також передбачає спосіб зменшення утворення агрегатів альфа- синуклеїну у пацієнта, який передбачає введення пацієнтові, що потребує такого лікування, терапевтично ефективної кількості антитіла цього винаходу.
Крім того, антитіла можуть бути представлені в композиції разом з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем і/або стабілізатором. Антитіла цього винаходу можна застосовувати в терапії. Зокрема, антитіла цього винаходу можна застосовувати при лікуванні бо синуклеопатій, таких як хвороба Паркінсона (включаючи ідіопатичні спадкові форми хвороби
Паркінсона), хвороба Гоше, хвороба дифузних тілець Леві (СВО), варіант хвороби
Альцгеймера з тільцями Леві (ВМ), комбінована хвороба Альцгеймера і Паркінсона, дійсна вегетативна недостатність і множинна системна атрофія.
Лікування, що передбачається цим винаходом, може бути тривалим, і пацієнт може отримувати лікування щонайменше протягом 2 тижнів, наприклад, щонайменше протягом 1 місяця, 6 місяців, 1 року або довше.
Антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти цього винаходу можна отримати за допомогою різних клітинних ліній, таких як клітинна лінія людини, клітинна лінія ссавця, відмінного від людини, і клітинна лінія комахи, наприклад клітинна лінія СНО, клітинна лінія
НЕК, клітинна лінія ВНК-21, клітинна лінія миші (така як клітинна лінія мієломи), клітинна лінія фібросаркоми, клітинна лінія РЕК.Сб, клітинна лінія НКВ-11, клітинна лінія САР і клітинна лінія
Нин-7 людини (Юитогпі еї аї, 2015, Стії Вем ВіоїесНнпої. бер 18:1-13., зміст якої включено в даний опис шляхом посилання).
Антитіла цього винаходу являють собою, наприклад, моноклональні антитіла, що отримуються за допомогою гібридомного способу, вперше описаного в КопПіег еї а!., Маїиге 256, 495 (1975), або можуть бути отримані за способами із застосуванням рекомбінантної ДНК.
Моноклональні антитіла також можна виділити з фагових бібліотек антитіл за допомогою методик, описаних, наприклад, в Сіаскзхоп еї аї!., Маїиге 352, 624-628 (1991) і Магкз єї аї., У. МОЇ.
Вісі. 222, 581-597 (1991). Моноклональні антитіла можна отримати з будь-якого відповідного джерела. Так, наприклад, моноклональні антитіла можна отримати з гібридом, отриманих з В- лімфоцитів селезінки миші, отриманих від мишей, імунізованих антигеном, що представляє інтерес, наприклад, у вигляді клітин, експресуючих антиген на поверхні, або нуклеїнової кислоти, що кодує антиген, що представляє інтерес. Моноклональні антитіла також можуть бути отримані з гібридом, що походять з експресуючих антитіла клітин від імунізованих людей або відмінних від людини ссавців, таких як щури, кролі, собаки, вівці, кози, примати і т. д.
Згідно з одним варіантом здійснення антитіло цього винаходу є антитілом людини.
Моноклональні антитіла людини, направлені проти альфа-синуклеїну, можна отримувати із застосуванням трансгенних або трансхромосомних мишей, що несуть частини імунної системи людини замість системи миші. Такі трансгенні і трансхромосомні миші включають мишей, що називаються в даному описі винаходу мишами НимМАБ і мишами КМ, відповідно.
Миша НиМАБ містить мінілокус гена імуноглобуліну людини, який кодує нереаранжировані послідовності варіабельних і константних доменів важких ланцюгів (н їі у) і варіабельних і константних доменів легких (к) ланцюгів імуноглобуліну людини разом з цільовими мутаціями, які інактивують ендогенні локуси |ц- і к-ланцюга (Гопрегу, М. еї аїЇ., Маїште 368, 856-859 (1994)). Відповідно, ці миші характеризуються пониженою експресією ДМ або ІдК миші, і у відповідь на імунізацію введені трансгени людського важкого і легкого ланцюга піддаються перемиканню класу і соматичній мутації, щоб утворювати високоафінні моноклональні антитіла дес людини к-ізотипу (І опрего, М. еї а. (1994), див. вище; огляд яких наведений в І опрего, М., Напароок ої Ехрегітепіа! Рпаптасоїіоду 113, 49- 101 (1994), І опрего, М. апа Низлаг, 0., Іпет. Нем.
Ітітипої. Мої. 13 65-93 (1995) і Нагаїіпо, Р. апа Гопрегод, М., Апп. М. У. Асай. Зсі 764 536-546 (1995)). Отримання мишей НиМАБ детально описано в Тауїог, Г. еї аї., Мисівїс Асіа5 Незеагсп 20, 6287-6295 (1992), Спеп, 9. еї аї., Іпіегпайопаї! Іттипоіоду 5, 647-656 (1993), Тиайоп еї аї., у.
Іттипої. 152, 2912-2920 (1994), Тауюг, І. еї аї., Іптегтайопа! Іттипоіоду б, 579-591 (1994),
ЕівпУліа, 0. еї а!., Маїшге Віоїтесппоіоду 14, 845-851 (1996).
Див. також 05 5545806, 05 5569825, 05 5625126, 05 5633425, 5 5789650, 005 5877397,
ОБ 5661016, 05 5814318, 005 5874299, 05 5770429, 05 5545807, МО 98/24884, МО 94/25585, МО 93/1227, МО 92/22645, УМО 92/03918 ії УМО 01/09187.
Миші НСо7, НСо12, НСо17 і НСо20 мають порушення УКО в своїх ендогенних генах легкого ланцюга (каппа) (як описано в Спеп еї аї., ЕМВО .). 12, 811-820 (1993)), порушення СМО в своїх ендогенних генах важкого ланцюга (як описано в прикладі 1 публікації МО 01/14424) і трансген
КСо5 людського легкого каппа-ланцюга (як описано в Різпу/лій еї аї., Маїшге ВіоїесппоЇоду 14, 845-851 (1996)). Крім того, миші НСо7 мають трансген НСо7 людського важкого ланцюга (як описано в 5 5770429), миші НСо12 мають трансген НСо12 людського важкого ланцюга (як описано в прикладі 2 публікації УМО 01/14424), миші НСо17 мають трансген НСо17 людського важкого ланцюга (як описано в прикладі 2 публікації М/УО 01/09187), а миші НСо20 мають трансген НСо20 людського важкого ланцюга. Отримані в результаті миші експресують трансгени важкого і легкого каппа-ланцюга імуноглобуліну людини в генетичному оточенні, гомозиготному у відношенні порушення ендогенних локусів мишачого важкого і легкого каппа- (516) ланцюга.
У мишей лінії КМ ендогенний ген мишачого легкого каппа-ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню, як описано в Спеп еї аЇ., ЕМВО 4. 12, 811-820 (1993), а ендогенний ген мишачого важкого ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню, як описано в прикладі 1 публікації М/О 01/09187. Ця лінія мишей несе трансген КСоб5 людського легкого каппа- ланцюга, як описано в Різпм/йа еї аї., Маїшге ВіоїесппоЇоду 14, 845-851 (1996). Ця лінія мишей також несе трансхромосому людського важкого ланцюга, що складається з фрагмента пСЕ (5020) хромосоми 14, як описано в УМО 02/43478. Мишей НСо12-ВаїБ/с, НСо17-ВаїБ/с і НСо20-
ВаІр/с можна отримати шляхом схрещування НСо12, НСо17 і НСо20 з КСо5м//кКІу(Ва!шр), як описано в публікації ЛО 09/097006.
У мишей лінії КМ ендогенний ген мишачого легкого каппа-ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню, як описано в Спеп еї аіІ., ЕМВО 4. 12, 811-820 (1993), а ендогенний ген важкого ланцюга миші був підданий гомозиготному руйнуванню, як описано в прикладі 1 публікації УМО 01/09187. Ця лінія мишей несе трансген КСо5 людського легкого каппа-ланцюга, як описано в Рі5пм/йа еї аї., Маїиге ВіоїесппоЇоду 14, 845-851 (1996). Ця лінія мишей також несе трансхромосому людського важкого ланцюга, що складається з антигензв'язувального фрагмента ПСЕ (5020) хромосоми 14, як описано в УМО 02/43478.
Спленоцити від цих трансгенних мишей можна застосовувати для отримання гібридом, які секретують моноклональні антитіла людини, відповідно до добре відомих методик.
Моноклональні або поліклональні антитіла людини цього винаходу або антитіла цього винаходу, що походять від інших видів, також можна отримати трансгенним шляхом за допомогою отримання іншого ссавця, відмінного від людини, або рослини, що є трансгенною стосовно послідовностей важких і легких ланцюгів імуноглобуліну, що представляють інтерес, і отримання з нього антитіла у добувній формі. Що стосується отримання антитіл у ссавців трансгенним шляхом, то антитіла можуть бути отримані в молоці кіз, корів або інших ссавців і добуті з нього. Див., наприклад, О5 5827690, 5 5756687, 05 5750172 і 05 5741957.
Антитіло цього винаходу може відноситися до будь-якого ізотипу. Вибір ізотипу зазвичай визначатиметься бажаними ефекторними функціями, такими як індукція АОСС. Ілюстративними ізотипами є ІДС1, Ідс2, ІдоЗ і Іде4. Можна використовувати константні домени будь-якого з людських легких ланцюгів каппа- або лямбда-типу. За необхідності, клас антитіла до альфа-
Зо синуклеїну цього винаходу можна перемкнути за допомогою відомих способів. Наприклад, антитіло цього винаходу, яке спочатку було ІДМ, можна піддати перемиканню класу на антитіло
Ід цього винаходу. Додатково, методики перемикання класу можна застосовувати для перетворення одного підкласу до на інший, наприклад з досі на Ідс2. Таким чином, ефекторна функція антитіл цього винаходу може бути змінена шляхом перемикання ізотипу, наприклад, на антитіло дС1, Ідс2, ДОЗ або Ід04 для різних терапевтичних застосувань. Згідно з одним варіантом здійснення антитіло цього винаходу є антитілом Іде1, наприклад ІДС, к.
Вважають, що антитіло відноситься до конкретного ізотипу, якщо його амінокислотна послідовність найбільш гомологічна такому ізотипу в порівнянні з іншими ізотипами. Згідно з одним варіантом здійснення антитіло цього винаходу є повнорозмірним антитілом, переважно антитілом Ідс, зокрема, антитілом Ідс1, к. Згідно з іншим варіантом здійснення антитіло цього винаходу є фрагментом антитіла або одноланцюговим антитілом.
Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти можуть бути отримані, наприклад, шляхом фрагментації на антигензв'язувальні фрагменти із застосуванням традиційних методик, а антигензв'язувальні фрагменти можна піддати скринінгу відносно корисності таким же чином, як описано в даному описі винаходу для повних антитіл. Наприклад, антигензв'язувальні Е(аб)2- фрагменти можуть бути отримані шляхом обробки антитіла пепсином. Отриманий в результаті антигензв'язувальний Е(аб)2-фрагмент можна обробити для відновлення дисульфідних містків з отриманням антигензв'язувальних фрагментів Рар'. Антигензв'язувальні ЕРар-фрагменти можна отримати шляхом обробки антитіла дО папаїном; антигензв'язувальні Рар'-фрагменти можна отримати за допомогою розщеплювання пепсином антитіла до. Антигензв'язувальний
Каб)- фрагмент також може бути отриманий шляхом зв'язування описаного нижче Рар' за допомогою тіоетерного зв'язку або дисульфідного зв'язку. Антигензв'язувальний Бар'- фрагмент являє собою антигензв'язувальний фрагмент антитіла, отриманий шляхом розрізання дисульфідного зв'язку в шарнірному домені Е(ар)2. Антигензв'язувальний Бар'-ррагмент може бути отриманий шляхом обробки антигензв'язувального Е(аб)2- фрагмента відновником, таким як дитіотреітол. Антигензв'язувальний фрагмент антитіла також може бути отриманий шляхом експресії нуклеїнових кислот, що кодують такі антигензв'язувальні фрагменти, в рекомбінантних клітинах (див., наприклад, Емап5 еї аї., ). Іттипої. Меїй. 184, 123-388 (1995)). Наприклад, химерний ген, що кодує частину антигензв'язувального Е(абБ)2-фрагмента, може включати 60 послідовності ДНК, що кодують ділянку СНІ і шарнірний домен ланцюга Н, за якими розташований стоп-кодон для зупинки трансляції з отриманням такої усіченої молекули антигензв'язувального фрагмента антитіла.
Згідно з одним варіантом здійснення антитіло до альфа-синуклеїну являє собою одновалентне антитіло, переважно одновалентне антитіло, описане у УМО2007059782 (яка включена в даний опис шляхом посилання у її повному обсязі), що має делецію в шарнірному домені. Відповідно, згідно з одним варіантом здійснення антитіло являє собою одновалентне антитіло, де вказане антитіло до альфа-синуклеїну сконструйоване за допомогою способу, що передбачає і) забезпечення конструктом нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг вказаного одновалентного антитіла, при цьому вказаний конструкт містить нуклеотидну послідовність, що кодує Мі -ділянку вибраного антигенспецифічного антитіла до альфа- синуклеїну, і нуклеотидну послідовність, що кодує константну Сі -ділянку Ід, де вказана нуклеотидна послідовність, що кодує МІ -ділянку вибраного антигенспецифічного антитіла, і вказана нуклеотидна послідовність, що кодує Сі -ділянку Ід, функціонально зв'язані разом і де у разі підтипу ЇДО1 нуклеотидна послідовність, що кодує Сі -ділянку, була модифікована так, щоб Сі -ділянка не містила будь- яких амінокислот, здатних утворювати дисульфідні зв'язки або ковалентні зв'язки з іншими пептидами, що містять ідентичну амінокислотну послідовність Сі -ділянки, у присутності поліклонального дос людини або при введенні тварині або людині; ії) забезпечення конструктом нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг вказаного одновалентного антитіла, причому вказаний конструкт містить нуклеотидну послідовність, що кодує МН-ділянку вибраного антигенспецифічного антитіла, і нуклеотидну послідовність, що кодує константну СН- ділянку Ід людини, де нуклеотидна послідовність, що кодує СН-ділянку, була модифікована так, щоб ділянка, що відповідає шарнірному домену, і, як того вимагає підтип Ід, інші ділянки СН-ділянки, такі як СНЗ-ділянка, не містили будь-яких амінокислотних залишків, які беруть участь в утворенні дисульфідних зв'язків або ковалентних зв'язків або стабільних нековалентних зв'язків між важким ланцюгом і іншими пептидами, що містять ідентичну амінокислотну послідовність
СН-ділянки Ід людини, у присутності поліклонального ЇДО людини або при введенні тварині людині, де вказана нуклеотидна послідовність, що кодує МН-ділянку вибраного антигенспецифічного антитіла, і вказана нуклеотидна послідовність, що кодує СН- ділянку
Зо вказаного Ід, функціонально зв'язані разом; ії) забезпечення клітинною системою експресії для отримання вказаного одновалентного антитіла; ім) отримання вказаного одновалентного антитіла шляхом сумісної експресії конструктів нуклеїнових кислот за (і) і (ії) в клітинах клітинної системи експресії за (її).
Аналогічно, згідно з одним варіантом здійснення антитіло до альфа-синуклеїну являє собою одновалентне антитіло, яке містить () варіабельний домен антитіла цього винаходу, описаний в даному описі, або антигензв'язувальну частину вказаної ділянки, і (ї) СНнН-домен імуноглобуліну або його домен, що містить домени СН2 і СНЗ, де СН-домен або його домен був модифікований так, що домен, відповідний шарнірному домену, і, якщо імуноглобулін не відноситься до підтипу Ідс4, інші домени СН-домену, такі як домен СНЗ, не містять будь-які амінокислотні залишки, які здатні утворювати дисульфідні зв'язки з ідентичним доменом СН або інші ковалентні або стабільні нековалентні зв'язки між важким ланцюгом і ідентичним СН-доменом у присутності поліклонального ЇдД людини.
Згідно з додатковим варіантом здійснення важкий ланцюг одновалентного антитіла до альфа-синуклеїну був модифікований таким чином, що весь шарнірний домен був підданий делеції.
Згідно 3 ще одним додатковим варіантом здійснення послідовність вказаного одновалентного антитіла була модифікована таким чином, що вона не містить будь-які акцепторні сайти М-зв'язаного глікозилування.
Цей винахід також включає "біспецифічні антитіла" де ділянка зв'язування з альфа- синуклеїном (наприклад, ділянка зв'язування з альфа-синуклеїном моноклонального антитіла до альфа-синуклеїну) є частиною двовалентного або полівалентного біспецифічного остову, який націлюється на більш ніж один епітоп (наприклад, другий епітоп може передбачати епітоп рецептора, що бере участь в активному транспорті, так щоб біспецифічне антитіло могло проявляти поліпшений трансцитоз через біологічний бар'єр, такий як гематоенцефалічний бар'єр). Таким чином, згідно ще одним додатковим варіантом здійснення одновалентний Бар антитіла до синуклеїну може бути сполучений з додатковим Раб або 5сім, які націлюються на інший білок, з отриманням біспецифічного антитіла. Біспецифічне антитіло може мати подвійну функцію, наприклад терапевтичну функцію, що надається доменом, що зв'язується з бо синуклеїном, і транспортну функцію, яка може забезпечувати зв'язування з молекулою рецептора для поліпшення перенесення через біологічний бар'єр, такий як гематоенцефалічний бар'єр.
Антитіла до альфа-синуклеїну і їх антигензв'язувальні фрагменти цього винаходу також включають одноланцюгові антитіла. Одноланцюгові антитіла являють собою пептиди, в яких сполучені Ем-ділянки важкого і легкого ланцюга. Згідно з одним варіантом здійснення цей винахід передбачає одноланцюговий Ем (5сЕУ), де важкі і легкі ланцюги в Ем антитіла до альфа- синуклеїну цього винаходу сполучені за допомогою гнучкого пептидного лінкера (зазвичай з приблизно 10, 12, 15 або більше амінокислотних залишків) в один пептидний ланцюг. Способи отримання таких антитіл описані, наприклад, в 05 4946778, РійсКІпип іп Те РІагтасоїоду ої
Мопосіопаї! Апіїбодієв, мо!. 113, Возепригу апа Моотге єдвз. Зргіпдег-Мепад, Мем МоїКк, рр. 269-315 (1994), Віга еї а!., 5сіепсе 242, 423-426 (1988), Низюп єї аІ., РМА5 ОА 85, 5879-5883 (1988) і МсСайегпу еї аї., Маїшге 348, 552-554 (1990). Одноланцюгове антитіло може бути одновалентним, якщо використовуються тільки один МН і Мі, двовалентним, якщо використовуються два МН і МІ, або полівалентним, якщо використовується більше двох МН і МІ...
Описувані в даному описі винаходу антитіла до альфа-синуклеїну і їх антигензв'язувальні фрагменти можуть бути модифікованими шляхом включення будь- якої відповідної кількості модифікованих амінокислот і/або асоціацій з такими кон'югованими замісниками. Придатність в цьому контексті зазвичай визначається здатністю щонайменше в значній мірі зберігати селективність стосовно альфа- синуклеїну і/або специфічність стосовно альфа-синуклеїну, що асоціюється з недериватизованим початковим антитілом до альфа- синуклеїну. Включення однієї або декількох модифікованих амінокислот може бути переважним, наприклад, для збільшення періоду напівжиття поліпептиду в сироватці, зменшення антигенності поліпептиду або підвищення стабільності поліпептиду при зберіганні.
Амінокислота(и) піддається(ються) модифікації, наприклад, котрансляційно або посттрансляційно в ході отримання рекомбінантним шляхом (наприклад, М-зв'язане глікозилування в мотивах М-Х-5/Ї в ході експресії в клітинах ссавців) або піддається(ються) модифікації синтетичними засобами. Необмежувальні приклади модифікованої амінокислоти включають глікозиловану амінокислоту, сульфатовану амінокислоту, преніловану (наприклад, фарнезиловану, геранілгераніловану) амінокислоту, ацетиловану амінокислоту, ациловану
Зо амінокислоту, ПЕГіловану амінокислоту, біотиніловану амінокислоту, карбоксиловану амінокислоту, фосфориловану амінокислоту і т. д. У літературі представлено безліч джерел, які можуть бути керівництвом для фахівця з модифікації амінокислот. Приклади протоколів знаходяться в УмаїЇКег (1998) Ргоївіп Ргоїосоїє Оп СО-Нот, Нитапа Ргевзв5, Тома, Му.
Модифіковану амінокислоту можна вибрати, наприклад, з глікозилованої амінокислоти,
ПЕГілованої амінокислоти, фарнезилованої амінокислоти, ацетилованої амінокислоти, біотинілованої амінокислоти, амінокислоти, кон'югованої з ліпідним фрагментом, або амінокислоти, кон'югованої з органічним дериватизуючим засобом.
Антитіла до альфа-синуклеїну також можна модифікувати хімічним шляхом за допомогою ковалентного кон'югування з полімером, наприклад, для збільшення періоду напівжиття в кровотоку. Ілюстративні полімери і способи приєднання їх до пептидів наведені, наприклад, в
ОБ 4766106, 05 4179337, 05 4495285 і 05 4609546. Додаткові ілюстративні полімери включають поліоксіегиловані поліоли і поліеєтиленглікюль (РЕС) (наприклад, РЕС з молекулярною масою від приблизно 1000 до приблизно 40000, наприклад, від приблизно 2000 до приблизно 20000, наприклад, приблизно 3000-12000 г/моль).
Антитіла цього винаходу можна додатково застосовувати в способі діагностики або як діагностичний візуалізуючий ліганд.
Згідно з одним варіантом здійснення передбачаються антитіла до альфа- синуклеїну, що містять одну або декілька мічених радіоактивним ізотопом амінокислот.
Мічене радіоактивним ізотопом антитіло до альфа-синуклеїну можна застосовувати як в діагностичних, так і в терапевтичних цілях (ще однією можливою ознакою є кон'югування з міченими радіоактивним ізотопом молекулами). Необмежувальні приклади таких міток включають без обмеження вісмут (2ЗВі), вуглець (С, 790, 102), хром (Сг), кобальт (?"Со, 90Со), мідь (Си), диспрозій (55ру), ербій (99Ег), фтор СР), гадоліній (159(34, 159(54), галій (8(за, б/Са), германій (88се), золото (178Ди), гольмій (95Но), водень (ЗН), індій (п, 72Іп, 79|п, 115Іп), йод (71, 123), 125), 131), іридій (92Іу, залізо (Бе), криптон (8'"Ктг), лантан (9 а), лютецій (7 и), марганець (Мп), молібден (9Мо), азот (ЗМ, 7»М), кисень (20), паладій (99Ра), фосфор (З2Р), калій (К), празеодим ("2Рг), прометій (9Ріт), реній (86ВЩе, 88Ке), родій (99КИ), рубідій (9'ВЬ, 82), рутеній (32Ви, 97Ви), самарій (535т), скандій (775с), селен ("»5е), натрій (Ма), стронцій (855, 8951, 925г), сірку (355), 60 технецій (Тс), талій (2ТІ), олово (35п, 71751), ксенон (93Хе), ітербій (99Ур, 175Мр, 177), ітрій
(0) ії цинк (652п). Способи отримання амінокислот, мічених радіоактивними ізотопами, і відповідних похідних пептидів відомі з рівня техніки (див., наприклад, Уипопапз еї аї., у Сапсег
Спетоїпегару апа Віоїпегару 655-686 (2-е видання, під редакцією СВагтпег і І опдо, І ірріпсой
Камеп (1996)) ії 05 4681581; 05 4735210; 05 5101827; 005 5102990 (05 КЕЗ35500), 05 5648471 і 55697902. Наприклад, радіоактивний ізотоп можна кон'югувати за допомогою способу із застосуванням хлораміну
Т (Мпаедгеп, 5. еї аї. (1998) "Спіогатіпе-Т Іп Нідн-5ресіїіс-Асіїмну Вадіоіодіпайоп ОЇ Апііродіе5
Овіпд М-Зиссіпітіау!-3-(Тітеїну!єтаппуї) Вепгоаїе Аз Ап Іпіептеаіаїе", Мисі. Мед. Віої. 25(7):659- 665; Кипи, М. еї а). (1993) "Зйе-5ресіїїс Сопідайоп Ої А Вадіоіодіпаїєд Рпепеїйпуіатіпе Оегімайме
То А Мопосіопа! Апіїбоду ВНезиїйв Іп Іпстєазей Вадіоасіїмігу І осаїїгайоп Іп Титог", У. Мед. Спет. 36(9):1255-1261; Веа, О.МУ. єї аІ. (1990) "Зйе-5ресіїісаПу гадіоіодіпаїєд апіїбоду ог іагаєїіпа
Тїмтогв", Сапсег Ве5. 50(3 Зиррі):8575-8615).
Цей винахід також передбачає антитіла до альфа-синуклеїну і їх антигензв'язувальні фрагменти, мічені за допомогою детектовної флуоресцентної мітки (такої як хелат рідкоземельного елементу (наприклад, хелат європію)), мітки флуоресцеїнового типу (наприклад, флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, 5- карбоксифлуоресцеїн, 6- карбоксифлуоресцеїн, дихлортриазиніламінфлуоресцеїн), мітки родамінового типу (наприклад,
АГЇЕХА РІООМКФ 568 (Іпийгодеп), ТАМЕКАФ або данзилхлорид), МІМОТАС 680 ХІІ
РЕ ООКОСНКОМЕ"М (Регкіп ЕІтег), фікоеритрину; умбеліферону, лісаміну; ціаніну; фікоеритрину, техаського червоного, ВОБІРМ РІ -5ЕФ (Іпмігодеп) або його аналога, всі з яких підходять для оптичного виявлення. Можна використовувати хемілюмінесцентні мітки (наприклад, люмінол, люциферазу, люциферин і екворин). Таку діагностику і виявлення також можна здійснити шляхом зв'язування діагностичної молекули цього винаходу з придатними до виявлення речовинами, включаючи, без обмеження, різні ферменти, при цьому ферменти включають, без обмеження, пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу або ацетилхолінестеразу, або з комплексами з простетичними групами, такими як, без обмеження, стрептавідин/біотин і авідин/біотин.
Можна використовувати хемілюмінесцентні мітки (наприклад, люмінол, люциферазу, люциферин і екворин). Таку діагностику і виявлення також можна здійснити шляхом зв'язування діагностичної молекули цього винаходу з придатними до виявлення речовинами, включаючи, без обмеження, різні ферменти, при цьому ферменти включають, без обмеження, пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, бета- галактозидазу або ацетилхолінестеразу, або з комплексами з простетичними групами, такими як, без обмеження, стрептавідин/біотин і авідин/біотин. Також можна використовувати парамагнітні мітки, і їх переважно виявляють за допомогою позитронно- емісійної томографії (РЕТ) або однофотонної емісійної комп'ютерної томографії (ЗРЕСТ). Такі парамагнітні мітки включають, без обмеження, сполуки, що містять парамагнітні іони алюмінію (АЇ), барію (Ва), кальцію (Са), церію (Се), диспрозію (Су), ербію (Ег), європію (Би), гадолінію (са), гольмію (Но), іридію (Іг), літію (Гі), магнію (Мо), марганцю (Мп), молібдену (М), неодиму (Ма), осмію (05), кисню (0), паладію (Ра), платини (РО), родію (КП), рутенію (Ки), самарію (Зт), натрію (Ма), стронцію (Зг), тербію (ТБ), тулію (Тт), олова (Зп), титану (Ті), вольфраму (У) і цирконію (7), і, зокрема, Со, СА, Сі, би, Ееє, Рез, (баз, Мп, Мі, Ті, Ме її М, позитронно-активні метали з використанням різних видів позитронно-емісійної томографії і нерадіоактивних парамагнітних іонів металів.
Таким чином, згідно з одним варіантом здійснення антитіло до альфа-синуклеїну цього винаходу може бути помічене флуоресцентною міткою, хемілюмінесцентною міткою, парамагнітною міткою, радіоїзотопною міткою або ферментною міткою.
Мічене антитіло можна застосовувати для виявлення наявності або вимірювання кількості вказаного альфа-синуклеїну в головному мозку суб'єкта. Цей спосіб може передбачати виявлення або вимірювання кількості антитіла до альфа-синуклеїну, зв'язаного з вказаним альфа-синуклеїном, за допомогою візуалізації іп мімо і може передбачати візуалізацію ех мімо вказаного антитіла до альфа-синуклеїну, зв'язаного з вказаним альфа-синуклеїном.
Згідно з додатковим аспектом цей винахід відноситься до вектора експресії, що кодує один або декілька поліпептидних ланцюгів антитіла цього винаходу або його антигензв'язувального фрагмента. Такі вектори експресії можна застосовувати для отримання антитіл і антигензв'язувальних фрагментів цього винаходу рекомбінантним шляхом.
Вектор експресії в контексті цього винаходу може являти собою будь-який відповідний ДНК- або РНК-вектор, включаючи хромосомні, нехромосомні і синтетичні вектори на основі нуклеїнових кислот (послідовність нуклеїнової кислоти, що містить відповідний набір елементів контролю експресії). Приклади таких векторів включають похідні 5М40, бактеріальні плазміди, бо фагову ДНК, бакуловірус, дріжджові плазміди, вектори, отримані в результаті об'єднання плазмід і фагової ДНК, і вектори на основі вірусної нуклеїнової кислоти (РНК або ДНК). Згідно з одним варіантом здійснення нуклеїнова кислота, що кодує антитіло до альфа-синуклеїну, міститься у векторі на основі "голої" ДНК або РНК, що включає, наприклад, лінійний елемент експресії (описаний, наприклад, в ЗуКе5 апа допп5іюоп, Маї Віоїтесі 12, 355-59 (1997)), векторі на основі щільно укладеної нуклеїнової кислоти (як описано, наприклад, в 5 6077835 і/або УМО 00/70087), плазмідному векторі, такому як рВК322, рОС 19/18 або рис 118/119, векторі мінімального розміру "тідде" на основі нуклеїнової кислоти (як описано, наприклад, в зЗспакомв»кі єї а)Ї., МОЇ Тнег 3, 793-800 (2001)) або представлена у вигляді векторного конструкта нуклеїнової кислоти, що осаджується, такого як конструкт, що осаджується СаРох (як описано, наприклад, в УМО 00/46147, Вепмепізіу апа Кезпеї, РМАБ ОА 83, 9551-55 (1986), М/ідіег єї аї.,
СеїІ 14, 725 (1978), і Согаго апа Реагзоп, Зотаїййс Сеї!Ї Сепеїїіс5 2, 603 (1981)). Такі вектори на основі нуклеїнової кислоти і їх застосування добре відомі з рівня техніки (див., наприклад, О5 5589466 і 05 5973972).
Згідно з одним варіантом здійснення вектор підходить для експресії антитіл до альфа- синуклеїну або їх антигензв'язувальних фрагментів в бактеріальній клітині.
Приклади таких векторів включають вектори експресії, такі як Віпезосгірі (5ігагадепе), вектори ріМ (мап НееКе 5 Зспизвіег, У ВіоЇ Спет 264, 5503-5509 (1989), вектори рЕТ (Момадеп,
Мадісон, Вісконсін) тощо).
Вектор експресії може також, або альтернативно, бути вектором, відповідним для експресії в дріжджовій системі. Можна використовувати будь-який вектор, відповідний для експресії в дріжджовій системі. Відповідні вектори включають, наприклад, вектори, що містять конститутивні або індуковані промотори, такі як промотор гена фактора альфа, алкогольоксидази і РОН (огляд яких наведений в ЕЕ. А!йзибеї еї аї., ей. Сшитепі Ргоїосої5 іп
Моїесшіаг Віоіоду, Стеепе Рибіїзпіпу апа Ум/іеу Іпіегосієпсе Мем Могк (1987),
Стапі єї аї., Меїподз іп Епгутої 153, 516-544 (1987), Манапомісн, 0. єї ані. Меїподз Мої. Віо|. 824, 329-358 (2012), СеїїК, Е. єї аї. Віоїеснпої. Адм. 30(5), 1108-1118 (2012), Ії, Р. єї аї. Аррі.
Віоспет. ВіотесНпої. 142(2), 105-124 (2007), Воеєг, Е. єї аї. Аррі. Місгобіо!.
Віоїтеснпої. 77(3), 513-523 (2007), мап дег Маай, У.М. Меїйод: Мо!. Віої. 178, 359-366 (2002), і НоїПдег, Р. Меїтоаз Мої. Віої. 178, 349-357 (2002)).
Зо У векторі експресії цього винаходу нуклеїнові кислоти, що кодують антитіло до альфа- синуклеїну, можуть містити будь-який відповідний промотор, енхансер і інші елементи, сприяючі експресії, або бути пов'язаними з ними. Приклади таких елементів включають сильні промотори експресії (наприклад, ІЕ промотор/(енхансер СММ людини, а також ГТК промотори КМ, 5М40,
ЗІ 3-3, ММТУ ії НІМ), ефективні полі-(А)- послідовності термінації, точку початку реплікації для продукту плазміди в Е. сої, ген стійкості до антибіотиків як селективний маркер і/або відповідний сайт клонування (наприклад, полілінкер). Нуклеїнові кислоти також можуть містити індукований промотор, а не конститутивний промотор, такий як ІЕ СММ (фахівець в даній галузі техніки зрозуміє, що такі терміни фактично описують ступінь експресії гена в певних умовах).
Антитіла антигензв'язувального фрагмента цього винаходу можна отримати в різних клітинних лініях, таких як клітинна лінія людини, клітинна лінія ссавця, відмінного від людини, і клітинна лінія комахи, наприклад клітинна лінія СНО, клітинна лінія НЕК, клітинна лінія ВНК-21, клітинна лінія миші (така як клітинна лінія мієломи), клітинна лінія фібросаркоми, клітинна лінія
РЕК.Сб, клітинна лінія НКВ-11, клітинна лінія САР і клітинна лінія НинН-7 людини (ЮШитогпі еї аї, 2015, Стії Вем ВіоїеєсНнпої. ер 18:1-13., зміст, який включено в даний опис шляхом посилання).
Згідно ще одним додатковим аспектом цей винахід відноситься до рекомбінантної еукаріотичної або прокаріотичної клітини-хазяїна, такої як трансфектома, яка продукує антитіло або його антигензв'язувальний домен цього винаходу, визначені в даному описі винаходу, або біспецифічну молекулу цього винаходу, визначену в даному описі винаходу. Приклади клітин- хазяїнів включають клітини дріжджів, бактерій і ссавців, такі як клітини СНО або НЕК.
Наприклад, згідно з одним варіантом здійснення цей винахід передбачає клітину, що містить нуклеїнову кислоту, стабільно інтегровану в клітинний геном, яка містить послідовність, що кодує продукт експресії у вигляді антитіла до альфа-синуклеїну цього винаходу або його антигензв'язувального фрагмента. Згідно з іншим варіантом здійснення цей винахід передбачає клітину, що містить неінтегровану нуклеїнову кислоту, таку як плазміда, косміда, фагміда або лінійний елемент експресії, яка містить послідовність, що кодує продукт експресії у вигляді антитіла до альфа-синуклеїну цього винаходу.
Згідно з додатковим аспектом цей винахід відноситься до способу отримання антитіла до альфа-синуклеїну цього винаходу, причому вказаний спосіб передбачає стадії а) культивування гібридоми або клітини-хазяїна цього винаходу, як описано в даному описі винаходу вище, і Б) 60 очищення антитіла цього винаходу від культурального середовища.
Згідно з одним варіантом здійснення цей винахід відноситься до препарату, який, в тому сенсі, в якому даний термін використовують в даному описі винаходу, містить антитіло до альфа-синуклеїну, визначене в даному описі винаходу, і який практично не містить антитіл, що утворюються в природних умовах, які або не здатні зв'язуватися з альфа-синуклеїном або які істотним чином не змінюють функціональні характеристики препарату, спрямовані проти альфа- синуклеїну. Таким чином, такий препарат не охоплює сироватку крові, що утворюється в природних умовах, або очищене похідне такої сироватки крові, що містить суміш антитіла до альфа-синуклеїну і іншого антитіла, яке не змінює функціональні характеристики антитіла до альфа-синуклеїну в препараті; де такі функціональні характеристики вибрані з групи, що складається з (ї) афінності зв'язування (КО) антитіла до альфа-синуклеїну стосовно альфа- синуклеїну; (і) здатності антитіла до альфа-синуклеїну пригнічувати усікання протеазами фібрил альфа- синуклеїну; (ії) здатності антитіла до альфа-синуклеїну обертати порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей Е28-5пса; (м) здатності антитіла до альфа-синуклеїну знижувати рівні альфа-синуклеїну в гіпокампі миші, за результатами вимірювання за допомогою мікродіалізу іп мімо; і (м) здатності антитіла до альфа-синуклеїну при тривалому введенні відновлювати рухову функцію у щурячій моделі хвороби Паркінсона; (м) здатності запобігати затравлювальній дії альфа-синуклеїну (такій як накопичення нерозчинного фосфорилованого альфа-синуклеїну іп мійго і/або у мишачій моделі хвороби
Паркінсона) і/або (мії) здатності зв'язувати усічений альфа-синуклеїн в головному мозку людини. Цей винахід, зокрема, відноситься до препаратів такого антитіла до альфа- синуклеїну, що має структурну зміну в своїй амінокислотній послідовності (у будь-яких своїх
СОК, варіабельних доменах, залишках каркасної ділянки і/або константних доменах) в порівнянні із структурою антитіла до альфа-синуклеїну, яке зустрічається в природі, де вказана структурна зміна обумовлює значну зміну функціональних характеристик, що проявляються моноклональним антитілом до альфа-синуклеїну, (тобто відмінність більш ніж на 20 95, відмінність більш ніж на 40 95, відмінність більш ніж на 60 95, відмінність більш ніж на 80 95, відмінність більш ніж на 100 95, відмінність більш ніж на 150 95, відмінність більш ніж в 2 рази, відмінність більш ніж в 4 рази, відмінність більш ніж в 5 разів або відмінність більш ніж в 10 разів у функціональних характеристиках) в порівнянні з функціональними характеристиками, що проявляються вказаним антитілом до альфа- синуклеїну, яке зустрічається в природі; де такі функціональні характеристики являють собою: () афінність зв'язування (КО) моноклонального антитіла до альфа-синуклеїну стосовно альфа-синуклеїну; (її здатність моноклонального антитіла до альфа-синуклеїну пригнічувати усікання протеазами фібрил альфа-синуклеїну; (її) здатність моноклонального антитіла до альфа-синуклеїну обертати порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей Е28-5пса; (м) здатність моноклонального антитіла до альфа-синуклеїну знижувати рівні альфа- синуклеїну в гіпокампі миші, за результатами вимірювання за допомогою мікродіалізу іп мімо; імабо (м) здатність моноклонального антитіла до альфа-синуклеїну при тривалому введенні відновлювати рухову функцію у щурячій моделі хвороби Паркінсона; (м) здатність запобігати затравлювальній дії альфа-синуклеїну (такій як накопичення нерозчинного фосфорилованого альфа-синуклеїну іп мійго і/або у мишачій моделі хвороби
Паркінсона) і/або (мії) здатність зв'язувати усічений альфа-синуклеїн в головному мозку людини; особливо в тих випадках, де такі змінені функціональні характеристики є результатом структурної зміни і, отже, невіддільні від неї.
Термін "що практично не містить" антитіл, що утворюються в природних умовах, відноситься до повної відсутності таких антитіл, що утворюються в природних умовах, в таких препаратах або до включення таких антитіл, що утворюються в природних умовах, в такі препарати в концентрації, в якій вони істотним чином не впливають на властивості зв'язування з альфа- синуклеїном даних препаратів. Говорять, що антитіло є "виділеним", якщо воно не має еквівалента, що утворюється в природних умовах, або було відокремлене або очищене від компонентів, які в природних умовах супроводжують його. бо Термін "антитіла, що утворюються в природних умовах", використовуваний у відношенні таких препаратів, відноситься до антитіл (включаючи аутоантитіла, що утворюються в природних умовах), утворення яких викликається в організмі живих людей або інших тварин як природний наслідок функціонування їх імунних систем.
Таким чином, препарати цього винаходу не виключають, а насправді явним чином охоплюють препарати, які містять антитіло до альфа-синуклеїну і спеціально додане додаткове антитіло, яке здатне зв'язуватися з епітопом, який відсутній у альфа- синуклеїну. Такі препарати, зокрема, включають варіанти їх здійснення, де даний препарат характеризується підвищеною ефективністю при лікуванні синуклеопатій, таких як хвороба Паркінсона (зокрема ідіопатична і спадкова форма хвороби Паркінсона), хвороба Гоше, хвороба дифузних тілець
Леві (01 ВО), варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ВМ), комбінована хвороба
Альцгеймера і Паркінсона, дійсна вегетативна недостатність і множинна системна атрофія.
У ще одному додатковому аспекті цей винахід відноситься до фармацевтичної композиції, яка містить () антитіло до альфа-синуклеїну або його антигензв'язувальний фрагмент, обидва з яких визначені в даному описі винаходу, або препарат, в тому сенсі, в якому цей термін визначений в даному описі винаходу, який містить таке антитіло до альфа- синуклеїну або його антигензв'язувальний фрагмент, і (ї) фармацевтично прийнятний носій.
Фармацевтичні композиції можна складати з фармацевтично прийнятними носіями або розріджувачами, а також з будь-якими іншими відомими допоміжними засобами і наповнювачами згідно з загальноприйнятими методиками, такими як, наприклад, методики, розкриті в Кетіпдїоп: Те Зсіепсе апа Ргасіїсе ої Рпаптасу, 22па Едайоп, Сеппаго, Ед., Маск
Рибріївпіпу Со., Еазюп, РА, 2013.
Фармацевтично прийнятні носії або розріджувачі, а також будь-які інші відомі допоміжні засоби і наповнювачі мають бути придатними для вибраної сполуки цього винаходу і вибраного способу введення. Придатність носіїв і інших компонентів фармацевтичних композицій визначають на підставі відсутності значного негативного впливу на бажані біологічні властивості вибраної сполуки або фармацевтичної композиції цього винаходу (наприклад, на підставі меншого, ніж істотний вплив (на підставі 10 95 або меншого відносного інгібування, 5 95 або
Зо меншого відносного інгібування і т. д.) стосовно зв'язування з епітопом.
Фармацевтична композиція цього винаходу також може містити розріджувачі, наповнювачі, солі, буфери, детергенти (наприклад, неіонний детергент, такий як Тмееп-20 або Тмееп-80), стабілізатори (наприклад, цукри або вільні протеїногенні амінокислоти), консерванти, фіксатори тканин, солюбілізатори і/або інші матеріали, відповідні для включення у фармацевтичну композицію. Розріджувач вибирають так, щоб він не впливав на біологічну активність комбінації. Прикладами таких розріджувачів є дистильована вода, фізіологічний фосфатно-сольовий буферний розчин, розчини Рінгера, розчин декстрози і розчин Хенка. Крім того, фармацевтична композиція або склад також можуть містити інші носії або нетоксичні нетерапевтичні неімуногенні стабілізатори і т. п. Композиції також можуть містити великі макромолекули, що поволі метаболізуються, такі як білки, полісахариди, такі як хітозан, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти і сополімери (наприклад, функціоналізована латексом сефароза, агароза, целюлоза і т. п.), полімери амінокислот, сополімери амінокислот і ліпідні агрегати (наприклад, масляні краплі або ліпосоми).
Фактичні рівні доз активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях цього винаходу можна змінювати для того, щоб отримати таку кількість активного інгредієнта, яка є ефективною для досягнення бажаної терапевтичної відповіді для конкретного пацієнта, композиції і способу введення. Вибраний рівень дози залежатиме від ряду фармакокінетичних чинників, зокрема активності конкретних використовуваних композицій цього винаходу або їх аміду, шляху введення, часу введення, швидкості виведення конкретної використовуваної сполуки, тривалості лікування, інших лікарських засобів, сполук і/або матеріалів, вживаних в комбінації з конкретними використовуваними композиціями, віку, статі, ваги, стану, загального стану здоров'я і анамнезу пацієнта, що піддається лікуванню, а також аналогічних чинників, добре відомих в галузі медицини.
Фармацевтичну композицію можна вводити будь-яким відповідним шляхом і способом, зокрема парентеральним, місцевим, пероральним або інтраназальним способом, для профілактичного і/або терапевтичного лікування. Згідно з одним варіантом здійснення фармацевтичну композицію цього винаходу вводять парентерально. Використовувані в даному описі винаходу фрази "парентеральне введення" і "що вводиться парентерально", означають способи введення, відмінні від ентерального і місцевого введення, зазвичай шляхом ін'єкції, і бо включають епідермальну, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну,
інтратекальну, внутрішньокапсулярну, внутрішньоочноямкову, внутрішньосерцеву, внутрішньошкірну, внутрішньочеревну, внутрішньосухожильну, транстрахеальну, підшкірну, субкутикулярну, внутрішньосуставну, підкапсулярну, субарахноїдальну, інтраспінальну, внутрічерепну, інтраторакальну, епідуральну і внутрішньогрудинну ін'єкцію ї інфузію. Додаткові відповідні шляхи введення сполуки цього винаходу іп мімо і іп міго добре відомі з рівня техніки і можуть бути вибрані звичайними фахівцями в даній галузі техніки. Згідно з одним варіантом здійснення цю фармацевтичну композицію вводять за допомогою внутрішньовенної або підшкірної ін'єкції або інфузії.
Фармацевтично прийнятні носії включають всі без виключення відповідні розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби, засоби, що надають ізотонічність, антиоксиданти і засоби, що уповільнюють абсорбцію, і т. п., які є фізіологічно сумісними із сполуками цього винаходу.
Приклади відповідних водних і неводних носіїв, які можна використовувати у фармацевтичних композиціях цього винаходу, включають воду, сольовий розчин, фосфатно- сольовий буферний розчин, етанол, декстрозу, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т. п.), а також їх придатні суміші, рослинні олії, такі як оливкова олія, кукурудзяна олія, арахісова олія, бавовняна олія і кунжутна олія, колоїдні розчини карбоксиметилцелюлози, трагакантову камедь і придатні для ін'єкцій органічні естери, такі як етилолеат, і/або різні буфери. В галузі фармацевтики добре відомі інші носії.
Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для індивідуального отримання стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій.
Застосування таких середовищ і засобів для фармацевтично активних речовин відоме з рівня техніки. За винятком випадків, коли будь-яке традиційне середовище або засіб є несумісними з активною сполукою, передбачається їх застосування у фармацевтичних композиціях цього винаходу.
Належну плинність можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування матеріалів для покриття, таких як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у разі дисперсій і шляхом застосування поверхнево-активних речовин.
Фармацевтичні композиції цього винаходу також можуть містити фармацевтично прийнятні антиоксиданти, наприклад, (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, гідрохлорид цистеїну, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію і т. п.; (2) жиророзчинні антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутилований гідроксіанізол (ВНА), бутилований гідрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол і т. п.; і (3) металохелатори, такі як лимонна кислота, етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕОТА), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота і т. п.
Фармацевтичні композиції цього винаходу також можуть містити засоби, що забезпечують ізотонічність, такі як цукри, багатоатомні спирти, такі як маніт, сорбіт, гліцерин, або хлорид натрію, в композиціях.
Фармацевтичні композиції цього винаходу також можуть містити одну або декілька допоміжних речовин, відповідних для вибраного шляху введення, такі як консерванти, зволожувальні речовини, емульгатори, диспергуючі речовини, консерванти або буфери, які можуть збільшити термін зберігання або ефективність фармацевтичної композиції.
Сполуки цього винаходу можна отримувати з носіями, які захищатимуть сполуки від швидкого вивільнення, наприклад, у вигляді складу з контрольованим вивільненням, в тому числі у вигляді імплантатів, трансдермальних пластирів і мікроінкапсульованих систем доставки. Такі носії можуть включати желатин, гліцерилмоностеарат, гліцерилдистеарат, полімери, які руйнуються біологічно, біосумісні полімери, такі як сополімер етилену і вінілацетату, поліангідриди, полігліколеву кислоту, колаген, поліортоестери і полімолочну кислоту, окремо або разом з воском, або інші матеріали, добре відомі з рівня техніки. Способи отримання таких складів в цілому відомі фахівцям в даній галузі техніки. Див., наприклад, Зивіаіїпей апа
Сопітоїїєй ВеІєазе Ога Овєїїмегу Зувієтв, .). В. Вобіпзоп, єд., Магсеї! Реккег, Іпс., Мем МогКк, 1978.
Згідно з одним варіантом здійснення сполуки цього винаходу можна складати для забезпечення належного розподілу іп мімо. Фармацевтично прийнятні носії для парентерального введення включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для індивідуального приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій. Застосування таких середовищ і засобів для фармацевтично активних речовин відоме з рівня техніки. За винятком випадків, коли які-небудь традиційне середовище або засіб є несумісними з активною сполукою, передбачається їх застосування у фармацевтичних композиціях цього винаходу. У композиції також можуть бути включені додаткові активні сполуки. бо Фармацевтичні композиції для ін'єкцій як правило мають бути стерильними і стабільними в умовах виготовлення і зберігання. Композиція може бути складена у вигляді розчину, мікроемульсії, ліпосоми або іншої впорядкованої структури, відповідної для високої концентрації лікарського засобу. Носій може бути водним або неводним розчинником або дисперсійним середовищем, що містить, наприклад, воду, етанол, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т. п.) і відповідні їх суміші, рослинні олії, такі як оливкова олія, і придатні для ін'єкцій органічні естери, такі як етилолеат. Належну плинність можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування покриття, такого як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у разі дисперсії і шляхом застосування поверхнево-активних речовин. В багатьох випадках буде переважним включення засобів, що забезпечують ізотонічність, наприклад цукрів, багатоатомних спиртів, таких як гліцерин, маніт, сорбіт, або хлориду натрію в композицію. Тривалого всмоктування ін'єкційних композицій можна досягти шляхом включення в композицію засобу, що уповільнює всмоктування антитіла, наприклад моностеаратних солей і желатину. Стерильні ін'єкційні розчини можна отримати шляхом поміщення активної сполуки в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним інгредієнтом або комбінацією інгредієнтів, наприклад, перелічених вище, при необхідності з подальшою стерилізуючою мікрофільтрацією. Зазвичай дисперсії отримують шляхом поміщення активної сполуки в стерильний наповнювач, який містить основне дисперсійне середовище і інші необхідні інгредієнти, наприклад, з перелічених вище. У разі стерильних порошків для приготування стерильних ін'єкційних розчинів прикладами способів отримання порошків є вакуумна сушка і сублімаційна сушка (ліофілізація), в результаті якої отримують порошкоподібний активний інгредієнт плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з їх розчину, заздалегідь підданого стерилізуючій фільтрації.
Стерильні ін'єкційні розчини можна отримати шляхом поміщення активної сполуки в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним інгредієнтом або комбінацією інгредієнтів, перелічених вище, при необхідності з подальшою стерилізуючою мікрофільтрацією. Зазвичай дисперсії отримують шляхом поміщення активної сполуки в стерильний наповнювач, який містить основне дисперсійне середовище і інші необхідні інгредієнти з перелічених вище. У разі стерильних порошків для отримання стерильних ін'єкційних розчинів прикладами способів приготування є вакуумна сушка і сублімаційна сушка (ліофілізація), в результаті якої отримують порошкоподібний активний інгредієнт плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з їх розчину, заздалегідь підданого стерилізуючій фільтрації.
Схеми прийому у вищезгаданих способах лікування і шляхах застосування, описаних в даному описі винаходу, коректують для отримання оптимальної бажаної відповіді (наприклад, терапевтичної відповіді). Наприклад, можна вводити одноразову болюсну дозу, можна вводити декілька розділених доз протягом деякого часу, або дозу можна пропорційно зменшувати або збільшувати, як визначається потребами терапевтичної ситуації. Композиції для парентерального введення можна складати у вигляді одиничної лікарської форми для простоти введення і рівномірності дозування. Одинична лікарська форма, використовувана в даному описі винаходу, відноситься до фізично дискретних одиниць, зручних як одиничні дози для суб'єктів, що підлягають лікуванню; при цьому кожна одиниця містить попередньо визначену кількість активної сполуки, розраховану для отримання бажаного терапевтичного ефекту, спільно з необхідним фармацевтичним носієм. Технічні вимоги до одиничних лікарських форм цього винаходу продиктовані (а) унікальними характеристиками активної сполуки і конкретним терапевтичним ефектом, якого необхідно досягти, і (Б) обмеженнями, притаманними галузі складання такої активної сполуки для лікування чутливості у індивідуумів, і безпосередньо залежать від них.
Ефективні дози і схеми прийому для антитіл до альфа-синуклеїну залежать від захворювання або стану, що підлягають лікуванню, і можуть бути визначені фахівцями в даній галузі техніки. У будь-який заданий день, коли дають дозу, доза може знаходитися в діапазоні
БО від приблизно 0,0001 до приблизно 100 мг/кг і частіше від приблизно 0,01 до приблизно 5 мг/кг ваги тіла реципієнта. Наприклад, дози можуть складати 1 мг/кг ваги тіла або 10 мг/кг ваги тіла або знаходитися в діапазоні 1-10 мг/кг ваги тіла. Таким чином, ілюстративні дози включають від приблизно 0,1 до приблизно 10 мг/кг/ваги тіла, від приблизно 0,1 до приблизно 5 мг/кг/ваги тіла, від приблизно 0,1 до приблизно 2 мг/кг/ваги тіла, від приблизно 0,1 до приблизно 1 мг/кг/ваги тіла, наприклад, приблизно 0,15 мг/кг/ваги тіла, приблизно 0,2 мг/кг/ваги тіла, приблизно 0,5 мг/кг/ваги тіла, приблизно 1 мг/кг/ваги тіла, приблизно 1,5 мг/кг/ваги тіла, приблизно 2 мг/кг/ваги тіла, приблизно 5 мг/кг/ваги тіла або приблизно 10 мг/кг/ваги тіла.
Лікар із стандартною кваліфікацією в даній галузі легсо може визначити і призначити ефективну кількість необхідної фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар може почати з доз бо антитіла до альфа-синуклеїну, використовуваного у фармацевтичній композиції, нижчих рівнів,
ніж потрібно для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступово підвищувати дозу до досягнення бажаного ефекту. В цілому, відповідною добовою дозою композиції цього винаходу буде така кількість сполуки, яка є найнижчою дозою, ефективною для отримання терапевтичного ефекту. Така ефективна доза зазвичай залежатиме від описаних вище чинників. Введення може бути, наприклад, внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, внутрішньочеревним або підшкірним. За бажанням, ефективну добову дозу фармацевтичної композиції можна вводити у вигляді двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести або більше частин дози, що вводяться окремо з відповідними інтервалами протягом доби, необов'язково у вигляді одиничних лікарських форм. Хоча сполуки цього винаходу можна вводити окремо, переважно вводити сполуки у вигляді фармацевтичної композиції, описаної вище.
Мічені антитіла цього винаходу можна застосовувати в діагностичних цілях для виявлення, діагностики або моніторингу захворювань або порушень. Цей винахід передбачає виявлення або діагностику нейродегенеративного або когнітивного захворювання або порушення, зокрема, без обмеження, хвороби Паркінсона, ідіопатичної хвороби Паркінсона, хвороби Паркінсона сімейного походження, хвороби дифузних тілець Леві (080), варіанту хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ІВМ), комбінованої хвороби Альцгеймера і Паркінсона, дійсної вегетативної недостатності або множинної системної атрофії, які передбачають (а) проведення аналізу наявності різновидів альфа-синуклеїну і його фрагментів в клітинах або зразках тканини суб'єкта із застосуванням одного або декількох антитіл, які специфічно зв'язуються з альфа- синуклеїном; і (б) проведення порівняння рівня антигену з контрольним рівнем, наприклад, рівнями в зразках нормальної тканини, при цьому підвищення аналізованого рівня антигену в порівнянні з контрольним рівнем антигену свідчить про захворювання або порушення або свідчить про тяжкість захворювання або порушення.
Антитіла цього винаходу можна застосовувати для аналізу альфа-синуклеїнового мономера, олігомерів, фібрилярних форм або фрагментів альфа-синуклеїну в біологічному зразку за допомогою імуногістохімічних способів, добре відомих з рівня техніки. Інші способи з використанням антитіл, застосовні для виявлення білка, включають імунологічні аналізи, такі як твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІ5ЗА), радіоімунологічний аналіз (КІА) і аналізи з
Зо використанням платформи Мезо 5саІе Оізсомегу (М5О). У таких наборах і способах можна застосовувати відповідні мітки для антитіл, і мітки, відомі з рівня техніки, включають ферментні мітки, такі як лужна фосфатаза і глюкозооксидаза; радіоізотопні мітки, такі як йод (7251, 791), вуглець (17С), сірка (355), тритій (ЗН), індій (п) і технецій (9п"ТГс); а також люмінесцентні мітки, такі як люмінол і люцифераза; і флуоресцентні мітки, такі як флуоресцеїн і родамін.
Наявність мічених антитіл до альфа-синуклеїну або їх фрагментів, що зв'язуються з альфа- синуклеїном, можна виявляти іп мімо в діагностичних цілях. Згідно з одним варіантом здійснення діагностика передбачає а) введення суб'єктові ефективної кількості такої міченої молекули; Б) очікування протягом деякого проміжку часу після введення для забезпечення концентрації міченої молекули в місцях відкладення Ар (за наявності таких) і для забезпечення очищення від незв'язаної міченої молекули до фонового рівня; с) визначення фонового рівня і а) виявлення міченої молекули у суб'єкта, при цьому виявлення міченої молекули на рівні, що перевищує фоновий, свідчить про те, що суб'єкт має захворювання або порушення, або свідчить про тяжкість захворювання або порушення. Відповідно до такого варіанту здійснення молекулу мітять візуалізуючим фрагментом, відповідним для виявлення за допомогою конкретної системи візуалізації, відомої фахівцям в даній галузі техніки. Фонові рівні можна визначити за допомогою різних способів, відомих з рівня техніки, зокрема шляхом порівняння кількості виявленого міченого антитіла із стандартним значенням, заздалегідь визначеним для конкретної системи візуалізації. Способи і системи, які можна застосовувати в діагностичних способах цього винаходу, включають, без обмеження, комп'ютерну томографію (СТ), сканування всього тіла, таке як позитронно- емісійна томографія (РЕТ), магнітно-резонансна візуалізація (МК) і ультразвукове дослідження.
Згідно 3 додатковим аспектом цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувальних фрагментів цього винаходу для застосування в медицині.
Згідно 3 додатковим аспектом цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувальних фрагментів цього винаходу для застосування при лікуванні, діагностиці або візуалізації синуклеопатії.
Згідно з одним варіантом здійснення моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент призначені для застосування при лікуванні хвороби Паркінсона, ідіопатичної хвороби Паркінсона, сімейних форм хвороби Паркінсона, хвороби дифузних тілець 60 Леві (0 ВО), варіанту хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ВМ), комбінованої хвороби
Зо
Альцгеймера і Паркінсона, дійсної вегетативної недостатності або множинної системної атрофії.
Згідно з додатковим аспектом цей винахід відноситься до застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента цього винаходу при виготовленні лікарського препарату для лікування, діагностики або візуалізації синуклеопатії.
Згідно з додатковим аспектом цей винахід відноситься до лікування, діагностики або візуалізації хвороби Паркінсона або інших синуклеопатій, що передбачає введення ефективної дози антитіла цього винаходу або його антигензв'язувального фрагмента.
Переважно, в шляхах застосування і способах щодо даних аспектів цього винаходу лікування є тривалим і переважно здійснюється щонайменше протягом 2 тижнів, наприклад, щонайменше протягом 1 місяця, 6 місяців, 1 року або довше.
Згідно з додатковим аспектом цей винахід передбачає набір, що містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент цього винаходу.
ВАРІАНТИ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ
Як буде очевидно з тексту і прикладів, цей винахід додатково відноситься до наведених нижче варіантів здійснення. 1. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які здатні специфічно зв'язуватися з епітопом в межах амінокислот 112-117 в альфа-синуклеїні (ЗЕО ІЮ МО:9 (ПЕОМР)). 2. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1, які конкурують з антитілом ЗМ37 за зв'язування з вказаним епітопом.
З. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1, які являють собою ЗМ37, варіант 1 ЗМ37, варіант 2 М37 або варіант З ОМ37. 4. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які здатні специфічно зв'язуватися з епітопом в межах амінокислот 112-115 в альфа-синуклеїні (ЗЕО ІЮ МО:19 (І ЕБ)). 5. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 1 або 4, які являють собою 5М285. 6. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно попередніми варіантами здійснення, де антитіло містить інтактне антитіло або складається з нього. 7. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь- яким з попередніх варіантів здійснення, які містять антигензв'язувальний фрагмент, вибраний з групи, яка складається з Ем-фрагментів (наприклад, одноланцюгового Ем і зв'язаного дисульфідним зв'язком Ем), Раб-подібних фрагментів (наприклад, Бар- фрагментів, Рар'-фрагментів і Е(абр)2- фрагментів) і доменних антитіл (наприклад, окремих варіабельних МН-доменів або варіабельних Мі -доменів), або які складаються з нього. 8. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь- яким з попередніх варіантів здійснення, де моноклональне антитіло вибране з групи, що складається з антитіл підтипу ЇДС1, Іде2, дО і ІдО4. 9. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь- яким з попередніх варіантів здійснення, де антитіло або антигензв'язувальний фрагмент характеризується однією або декількома з наступних властивостей: (ї) афінністю зв'язування (КО) до альфа-синуклеїну в діапазоні 0,5-10 нМ, наприклад 1-5 нм або 1-2 НМ;
Зо (і) здатністю пригнічувати усікання протеазами фібрил альфа-синуклеїну; (ії) здатністю обертати порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей
Е28-5пса; (м) здатністю знижувати рівні альфа-синуклеїну в гіпокампі миші, за результатами вимірювання за допомогою мікродіалізу іп мімо; (м) здатністю, при тривалому введенні, відновлювати рухову функцію у щурячій моделі хвороби Паркінсона; (м) здатністю запобігати затравлювальній дії альфа-синуклеїну (такій як накопичення нерозчинного фосфорилованого альфа-синуклеїну іп мійго і/або у мишачій моделі хвороби
Паркінсона) і/або (мії) здатністю зв'язувати усічений альфа-синуклеїн в головному мозку людини. 10. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з попередніх варіантів здійснення, які є людськими або гуманізованими. 11. Моноклональне антитіло, або моноклональне антитіло згідно з варіантами здійснення 1-
З і 6-10, або їх антигензв'язувальний фрагмент, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, що містить наступні СОК: а) СЕТЕЗЗМАМТ (ЗЕО ІЮ МО 1) або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей за амінокислотами, або не більше 3 відмінностей за амінокислотами, або не більше 2 відмінностей за амінокислотами, або не більше 1 відмінності за амінокислотами;
Б) АІКБ(М/5/0О/Н) СОКТО МАОБМКО (5БО ІО МО:2, 33, 34, 35) або амінокислотну
БО послідовність, що має не більше 4 відмінностей за амінокислотами, або не більше 3 відмінностей за амінокислотами, або не більше 2 відмінностей за амінокислотами, або не більше 1 відмінності за амінокислотами; або с) АКМУМАРЕРОЗ (ЗЕО ІО МО:3) або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей за амінокислотами, або не більше 3 відмінностей за амінокислотами, або не більше 2 відмінностей за амінокислотами, або не більше 1 відмінності за амінокислотами. 12. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 11, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, що містить СОК за ЗЕО ІЮ
МОТІіз і СОМ за 5ЕО ІЮО МО:2 і 33, 34 або 35.
13. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 11, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, або що складаються з нього, вибраний з групи, що складається з а) ЕМО ЕЗаСЯ ІУОТОО05ІВІ ЗСААБОЕТЕ5 З5УМАМІМУУМВОА РОКИ ЕМУ5БА
ІВ5МарАТОМ АОБУКаВЕТтІ 5АОМБОМТІМ ГОММ5ІААєО ТАМУУСАКММУ АРЕРОБМУСОСТ
Ї МТУ55 (ЗЕО ІЮ МО7),
Б) ЕМО ЕЗаСТЯ ІУМОТОС05ІВІ ЗСААБОЕТЕ5 З5УМАМІМУУМВОА РОКИ ЕМУ5БА
ІН55ОаОВТОМ АОБУКОаВЕТІ 5АОМ5ОМТІМ ГОММ5ІВАєО ТАМУУСАКММУ АРЕОБУСОСТ
ЇМТУ55 (ЗЕО ІЮ МО:30), с) ЕМО ЕЗаССО! ІМОТОО05ІВІ 5СААБОЕТЕ5 З5МАМІММАОА РОКИ ЕММА
ІА5ОСОвАТОМ АОБУКОВАЕТІ 5ВОМБОМТІМ ГОММ5ІВНАЕО ТАУММСАКММ АРЕОБУСОСТ
ЇМТМ55 (ЗЕО ІЮ МО:31) або а) ЕМО ЕЗаСО 1МОТО025І1В8І З5СААБОБЕТЕ5 З5МАМІМУВОА Рака ЕММА
ІВ5НОарАТОМ АОБУКаВЕТтІ 5АОМБОМТІМ ГОММ5ІААєО ТАМУУСАКММУ АРЕРОБМУСОСТ
ЇМТУ55 (ЗЕО ІЮ МО:32). 14. Моноклональне антитіло, або моноклональне антитіло згідно з варіантами здійснення 1-
З ії 6-13, або їх антигензв'язувальний фрагмент, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить наступні СОЕ: а) АБОБЗУ5ЗЗМІ А (ЗЕО ІЮ МО:4) або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей за амінокислотами, або не більше З відмінностей за амінокислотами, або не більше 2 відмінностей за амінокислотами, або не більше 1 відмінності за амінокислотами;
Б) САБЗБОБКАТ (5БО ІЮО МО:5) або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей за амінокислотами, або не більше 3 відмінностей за амінокислотами, або не більше 2 відмінностей за амінокислотами, або не більше 1 відмінності за амінокислотами; або с) ООУО5ЗРУМТ (ЗЕО ІЮ МО:6) або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей за амінокислотами, або не більше 3 відмінностей за амінокислотами, або не більше 2 відмінностей за амінокислотами, або не більше 1 відмінності за амінокислотами. 15. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 14, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить СОК за 5ЕО ІЮ МО:
Зо 4,516. 16. Антитіло або його антигензв'язувальний Фрагмент згідно з варіантом здійснення 14, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЕІМІТО5РОТ І5І5РОЕВАТ І5СВАБОБМО 55441 АММООК РООАРАЦІМ САБОААТаЇР оОвВЕБЗавбБавБат ОТ ТІЗАГЕ РЕОЕАМУМСО ОМОаББРМУТЕО
ОСТКМЕЇК (ЗЕО ІО МО:8) або що складається з неї. 17. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 14, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність
ЕІМІТО5РОТ І5ІЗ5РОЕНВАТ І5СВАБОБМО 55441 АММООК РООАРАЦІМ САБО5ВАТИаЇР оОвВЕБЗавбБавБат ОТ ТІЗАГЕ РЕОЕАМУМСО ОМОаББРМУТЕО
ОСТКМЕЇК (ЗЕО ІО МО:8) або що складається з неї. 18. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантами здійснення 1-3 і 6-17, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:8 або що складаються з неї, і варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислоти, приведені в будь-якій з з«ЕО ІЮ МО:7, 33, 34 або 35, або що складається з них. 19. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантами здійснення 1-3 і 6-18, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність за 5ХЕО
ІЮ МО:8 або що складається з неї, і варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислоти, приведені в 5ЕО ІЮ МО:34, або що складається з них, що мають підвищену термостабільність, таку як підвищена стабільність, що запобігає агрегації і розгортанню, як показано на фіг. 27, що є на 2 55-10 95 стабільнішими при значеннях температури вище 65 "С в порівнянні з ЗМ37 УМ, на 2 95- 8 95 стабільнішими при значеннях температури вище 65 С в порівнянні з ЗМ37 мі або на 2 95-5 95 стабільнішими при значеннях температури вище 65 С в порівнянні з З3М37 Ул. 20. Моноклональне антитіло, або моноклональне антитіло згідно з варіантами здійснення 1- 10, або їх антигензв'язувальний фрагмент, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, що містить наступні СОК: а) ААБСЕТЕЗКЕТМТ (5ЕО ІО МО:20) або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей за амінокислотами, або не більше 3 відмінностей за амінокислотами, або не 60 більше 2 відмінностей за амінокислотами, або не більше 1 відмінності за амінокислотами;
р) АІЗавБООоОстТ5 МАОЗМУКО (5ЕО ІЮ МО:21) або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей за амінокислотами, або не більше З відмінностей за амінокислотами, або не більше 2 відмінностей за амінокислотами, або не більше 1 відмінності за амінокислотами; або с) АКМУМАРЕЮОМ (5ЕО ІЮО МО:22) або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей за амінокислотами, або не більше 3 відмінностей за амінокислотами, або не більше 2 відмінностей за амінокислотами, або не більше 1 відмінності за амінокислотами. 21. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 20, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, що містить СОЕК за ЗЕО ІЮ МО: 20,21122. 22. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 20, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЕМО ГЕБОСИО І МОРОСБІ ВІ 5СААБаЕТЕ5 ВЕТМТМУУВОА РОКОаЇ ЕМ/У5А ІЗаБОСИТОУ доБУКОаВІ ТМ 5АОМ5КМТІ М ГОММ5І ВАЕО ТАМУМСАКММУУ
АРЕВУМСОСТ І МТУ55 (ЗЕО І МО 26) або що складається з неї. 23. Моноклональне антитіло, або моноклональне антитіло за будь-яким з варіантів здійснення 1-10 і 20-22, або їх антигензв'язувальний фрагмент, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить наступні СОК: а) ВАБОЗМУ5БАЗУІ А (ЗЕО ІЮ МО:23) або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей за амінокислотами, або не більше 3 відмінностей за амінокислотами, або не більше 2 відмінностей за амінокислотами, або не більше 1 відмінності за амінокислотами; е) САЗБКАТ (5БО ІЮ МО:24) або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей за амінокислотами, або не більше З відмінностей за амінокислотами, або не більше 2 відмінностей за амінокислотами, або не більше 1 відмінності за амінокислотами; або
У ФОМО5БРУМТ (ЗЕО ІЮ МО:25) або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей за амінокислотами, або не більше 3 відмінностей за амінокислотами, або не більше 2 відмінностей за амінокислотами, або не більше 1 відмінності за амінокислотами.
Зо 24. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 23, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить СОЕК за 5ЕО ІЮ МО: 23,24 125. 25. Антитіло або його антигензв'язувальний Фрагмент згідно з варіантом здійснення 24, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЕІМІТО5РОТ І5І5РОЕНВАТ І5СВАБОБУ5 АБЗМІАММООК РООАРВІИ ІМ сСАБОААТИаЇР овВЕЗавбзават ОТ ТУ5ВІЕ РЕОБЕАУМУСО ОМИа5ОРМТЕС
ОСТКМЕЇК (ЗЕО ІО МО:27) або що складається з неї. 26. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з попередніх варіантів здійснення, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:27 або що складається з неї, і варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислоти, приведені в будь-якій з ЗЕО ІЮ
МО:26, або що складається з них. 27. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з попередніх варіантів здійснення, що містять Ес-ділянку. 28. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з попередніх варіантів здійснення, що додатково містять складову для збільшення періоду напівжиття іп мімо даного засобу. 29. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 28, де складова для збільшення періоду напівжиття іп мімо вибрана з групи, що складається з поліетиленгліколю (РЕС), сироваткового альбуміну людини, глікозилованих груп, жирних кислот і декстрану. 30. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з попередніх варіантів здійснення, де поліпептид антитіла додатково містить детектовну складову. 31. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 30, де детектовна складова є флуоресцентною міткою, хемілюмінесцентною міткою, парамагнітною міткою, радіоїзотопною міткою або ферментною міткою. 32. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 30 або 31, де детектовна складова містить радіоактивний ізотоп або складається з 60 нього.
33. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 32, де радіоактивний ізотоп вибраний з групи, що складається з веттс, 111|п, 67(За, 88(За, 72Ав, 897, 123) і 201Т|, 34. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 30, де детектовна складова містить парамагнітний ізотоп або складається з нього. 35. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 34, де парамагнітний ізотоп вибраний з групи, що складається з 157630, 55Мп, 1вгпду, 52 і 56Ев. 36. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 30-35, де детектовна складова виявляється за допомогою методики візуалізації, такої як ЗРЕСТ, РЕТ, МКІ, оптична або ультразвукова візуалізація. 37. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 30-36, де детектовна складова опосередковано з'єднана з антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом за допомогою з'єднувальної складової. 38. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 37, де з'єднувальна складова вибрана з групи, що складається з похідних 1,4,7,10- тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетраоцтової кислоти (ОТА), дефероксаміну (ОБО), похідних діетилентриамінпентаоцтового авіду (ОТРА), оппохідних 5-2-(4-ізотіоціанатобензил)-1,4,7- триазациклононан-1,4,7-ацетилацетооцтової кислоти (МОТА) і похідних 1,4,8,11- тетраазациклодоседан-1,4,8,11-тетраоцтової кислоти (ТЕТА). 39. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з попередніх варіантів здійснення або поліпептидний ланцюг, що входить до їх складу. 40. Молекула нуклеїнової кислоти згідно з варіантом здійснення 39, де молекула є молекулою кДНК. 41. Молекула нуклеїнової кислоти згідно з варіантом здійснення 30 або 31, що кодує важкий ланцюг антитіла або його варіабельний домен. 42. Молекула нуклеїнової кислоти згідно з будь-яким з варіантів здійснення 39-41, що кодує
Зо легкий ланцюг антитіла або його варіабельний домен. 43. Вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти згідно з будь-яким з варіантів здійснення 39-42. 44. Рекомбінантна клітина-хазяїн, що містить молекулу нуклеїнової кислоти згідно з будь- яким з варіантів здійснення 39-42 або вектор згідно з варіантом здійснення 43. 45. Спосіб отримання антитіла або антигензв'язувального фрагмента згідно з будь- яким з варіантів здійснення 1-27, при цьому спосіб передбачає культивування клітини- хазяїна згідно з варіантом здійснення 44 в умовах, що забезпечують можливість експресії кодованого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента. 46. Фармацевтична композиція, яка містить моноклональне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-35 і фармацевтично прийнятний носій. 47. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантами здійснення 1-35 для застосування в медицині. 48. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантами здійснення 1-35 для застосування при лікуванні, діагностиці або візуалізації синуклеопатії. 49. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 48 для застосування при лікуванні хвороби Паркінсона (включаючи ідіопатичну і спадкову форми хвороби Паркінсона), хвороби Гоше, хвороби дифузних тілець Леві (СІ ВО), варіанту хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (І ВМ), комбінованої хвороби Альцгеймера і
Паркінсона, дійсної вегетативної недостатності і множинної системної атрофії. 50. Застосування моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента згідно з варіантами здійснення 1-35 при виготовленні лікарського препарату для лікування, діагностики або візуалізації синуклеопатії. 51. Застосування моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента згідно з варіантом здійснення 50 при виготовленні лікарського препарату для лікування хвороби
Паркінсона (включаючи ідіопатичну і спадкову форми хвороби Паркінсона), хвороби Гоше, хвороби дифузних тілець Леві (БІ ВО), варіанту хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ВМ), комбінованої хвороби Альцгеймера і Паркінсона, дійсної вегетативної недостатності і множинної бо системної атрофії.
52. Спосіб лікування, діагностики або візуалізації синуклеопатії у суб'єкта, при цьому вказаний спосіб передбачає введення фармацевтичної композиції згідно з варіантом здійснення 46 вказаному суб'єктові в ефективній кількості. 53. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування згідно з варіантом здійснення 48, або застосування згідно з варіантом здійснення 50, або спосіб згідно з варіантом здійснення 52 для лікування хвороби Паркінсона (включаючи ідіопатичну і спадкову форми хвороби Паркінсона), хвороби Гоше, хвороби дифузних тілець Леві (0 ВО), варіанту хвороби
Альцгеймера з тільцями Леві (ВМ), комбінованої хвороби Альцгеймера і Паркінсона, дійсної вегетативної недостатності і множинної системної атрофії. 54. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування; або застосування; або спосіб згідно з варіантом здійснення 52 або 53, де лікування є тривалим. 55. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування; або застосування; або спосіб згідно з варіантом здійснення 52, де тривале лікування здійснюють протягом щонайменше 2 тижнів, наприклад, протягом щонайменше 1 місяця, 6 місяців, 1 року або довше. 56. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування; або застосування; або спосіб згідно з будь-яким з варіантів здійснення 47-55, де суб'єктом є людина. 57. Набір, що містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантами здійснення 1-35. 58. Набір згідно з варіантом здійснення 57 для застосування в медицині. 59. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантами здійснення 30-35 для застосування при виявленні наявності або вимірюванні кількості вказаного альфа-синуклеїну в головному мозку або рідині організму суб'єкта. 60. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантом здійснення 59, де вказане виявлення або вимірювання передбачає візуалізацію іп мімо вказаного антитіла до синуклеїну, зв'язаного з вказаним альфа- синуклеїном. 61. Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з варіантами здійснення 30-35, де вказане виявлення або вимірювання передбачає візуалізацію ех мімо вказаного антитіла до синуклеїну, зв'язаного з вказаним альфа- синуклеїном.
Коо) ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Скринінг антитіл 1. Отримання імуногена і ліганду
Для застосування як імуногенів отримували і продукували наступні білки, показані на фіг. 1.
Мишей імунізували трьома імуногенами: фібрилами повнорозмірного рекомбінантного альфа- синуклеїну людини; рекомбінантним білком альфа-синуклеїну людини, що містить амінокислоти 1-60 (Ерерііїде, Богарт, Джорджія), і рекомбінантним білююм альфа-синуклеїну людини, що містить амінокислоти 1-119. Для отримання фібрил з повнорозмірного альфа-синуклеїну застосовували ліофілізований продукт від Крерііде, Богарт, Джорджія (номер за каталогом 5- 1001-2). Його розчиняли в буфері на основі 20 мМ Ттгіз і 300 мМ Масі до концентрації білка 1 мг/мл. Для отримання фібрил розчин білка інкубували у вигляді 170 мкл аліквот в 96-лунковому планшеті з керамічною гранулою діаметром 70 мкм в кожній лунці при 200 об./хв. у інкубаторі з шейкером Мопетр 56 (І абпеї Іпіегпайопаї, Едісон, Нью-Джерсі, США) при 37 "С протягом 7 днів, а після утворення фібрил додавали тіофлавін Т і вимірювали флуоресценцію в одній з лунок.
Рекомбінантний альфа-синуклеїн, що містить амінокислоти 1-60, розчиняли у воді з отриманням концентрації 1 мг/мл.
Рекомбінантний альфа-синуклеїн, що містить амінокислоти 1-119, отримували з використанням наступного конструкту. Синтетичний ген, що кодує гістидинову мітку з 6 амінокислот, за якою слідував сайт розщеплювання фактором Ха і послідовність, що кодує амінокислоти 1-119 альфа-синуклеїну людини:
МАННННННІЕ САЕМОМЕМКаЇ ЗКАКЕСУММАА АЕКТКОСМАЕ АДОКТКЕСМІ УуУазкткЕам
МНамМАТМАЕК ТКЕОУТМУсСОе АМУТОаМТАМА ОКТУЕСАСБ5І АААТОЕУМККО ОЇ СКМЕЕСАР
ОБСІГЕОМРМ 0 (ЗЕО ІО МО:16), був синтезований за допомогою Сепвогірі і клонований в сайт Мае1І-Хпої у векторі експресії рЕТ24а(-) (Момадеп).
Вектор експресії вводили за допомогою трансформації в Е. соїї штаму ВІ 21 і протягом ночі окрему колонію забирали для експресії за допомогою системи аутоіндукції експресії від компанії
Момадеп (призначений для користувача протокол ТВ383, рев. НІ1005). Кінцевий об'єм культури складав 500 мл. Клітини збирали шляхом центрифугування протягом 10 хвилин при 6000 9, а потім лізували за допомогою реагенту для екстракції білка ВидВивіег (призначений для бо користувача протокол 18245, рев. 0304). Після лізису зразок освітлювали шляхом центрифугування, а супернатант використовували для подальшого очищення.
Білок з Ніз-міткою очищали на 5 мл колонці НіхТгар (СЕ ПпПеасаге), урівноваженій в 20 мМ фосфаті натрію, рН 7,5, 1 М Масі (А-буфер). Після внесення зразка і промивання за допомогою
А-буфера білок елюювали в градієнті до 0,25 М імідазолу в А-буфері впродовж 20 об'ємів колонки. Фракції по 5 мл збирали і аналізували за допомогою 5О5-РАСЕ. Фракції з білком, що представляє інтерес, об'єднували, концентрували і вносили до колонки для ексклюзивної хроматографії 5200 (26/60) (СЕ пеаййсаге) в 10 мМ Ттгі5, рН 7,4, 300 мМ Масі. Фракції ще раз об'єднували згідно з наявністю в ЗХО5-РАСЕ смуги з очікуваним розміром.
Для видалення М-кінцевої мітки очищений альфа-синуклеїн 1-119 з Ніб-міткою інкубували з фактором Ха в співвідношенні 1:50 з використанням набору від Момадеп (69037-ЗЕЕХ). Після інкубації протягом ночі фактор Ха видаляли порціями за допомогою агарози Хаїтевбі.
Розщеплений альфа-синуклеїн 1-119 остаточно очищали за допомогою пермісивної хроматографії НіхТгар, як описано вище. З елюату отримували очищений альфа-синуклеїн 1- 119 і концентрували його до «400 мкг/мл за допомогою концентруючих пристроїв Сепігісоп.
Альфа-синуклеїн (Крерійає) регідратували в РВ5 при 2 мг/мл і при перемішуванні по краплях додавали пероксинітрит (100 мкл/мг білка). Потім нітрозилований альфа- синуклеїн піддавали діалізу в 5 л РВ5 і зберігали при -20 "С.
Для окиснення альфа-синуклеїну використовували дофамін. Об'єднували рівні об'єми 200 мкМ розчину дофаміну-НСЇІ. (Зідта Р5244), приготованого в 10 мМ РВ2, рн 7,4, і 28 МКМ розчину альфа-синуклеїну (Крерііде) в 10 мМ РВ5, рН 7,4. Отриманий в результаті 14
МКМ альфа-синуклеїн/100 мкМ дофаміну інкубували при 37 "С О/М (протягом ночі). Потім окиснений альфа-синуклеїн піддавали діалізу в РВЗ і зберігали при -20 "С.
Для здійснення скринінгу різноманітної бібліотеки антитіл до альфа-синуклеїну отримували різні нативні і химерні версії білків синуклеїну. Конструкти для скринінгу включали наступне: альфа-синуклеїн людини, миші, щура і яванського макака, бета- синуклеїн людини, гамма- синуклеїн людини (фіг. 21 і 22) і, нарешті, похідне альфа- синуклеїну, у якого були відсутні залишки 120-140 альфа-синуклеїну. Крім того, отримували серію з 4 конструктів, отриманих перетасовуванням: А-5уп-ААКК-ВАР, А-5уп-ВААК-ВАР, А-5уп-ВВАА-ВАР, А-5уп-ВВКК-ВАР (ЗЕО ІЮ МО:11-14). Ці
Зо конструкти містили лінійні відрізки альфа-синуклеїну людини (А), бета-синуклеїну людини (В) і альфа-синуклеїну курки («К). Клонували гени, що містять мітку у вигляді біотин-акцепторного пептиду (ВАР), злиту з С-кінцем лігандів для полегшення сайт- специфічного біотинілування кожного з лігандів. Біотинілування забезпечувало приєднання лігандів до гранул, використовуваних у форматі ЕГІЗА в розчині.
Конструювали вектори експресії ссавців, що несуть різні злиті конструкти альфа- синуклеїну з ВАР-міткою (АзЗупВАР). Ліганди експресували в клітинах НЕК 293 за допомогою тимчасової трансфекції (зептаб А/5). 2. Імунізація
Антитіла НиМабр-5уписівїп отримували в результаті імунізацій мишачої лінії НИМАБ НСо17-
ВАГ В/с ї НСо12-ВАЇ В/с, мишей з подвійним нокаутом щодо легкого каппа-ланцюга і важкого ланцюга імуноглобуліну (14) миші, що запобігає експресії антитіл, які є повністю мишачими (моноклональне антитіло людини, Медагех Іпс., Сан- Хосе, Каліфорнія, США). Різні мишачі лінії були зроблені трансгеенними шляхом вставки локусів важкого ланцюга Ід людини і локусів легкого каппа-ланцюга Ід людини, і вони відрізнялися за кількістю генів МН (варіабельного домену важкого ланцюга) і МІ. (варіабельного домену легкого ланцюга) людини. 48 мишей поперемінно імунізували інтраперитонеально (ІР) за допомогою 20 мкг антигенів і підшкірно (5С, в основу хвоста) тим же імуногеном з інтервалом 14 днів.
Здійснювали максимум вісім імунізацій: 4 ІР і 4 560.
Першу імунізацію проводили альфа-синуклетновими імуногенами в повному ад'юванті
Фрейнда (СЕА, Оіїсо І арогафогіе5, Детройт, Мічиган, США), наступні імунізації - в неповному ад'юванті Фрейнда (ІБА). Після виявлення, що сироваткові титри є достатніми (розведення сироватки 1/50 або нижче було виявлено позитивним в аналізі антиген-специфічного скринінгу, описаного вище, щонайменше в двох послідовних подіях скринінгу, що проводяться двічі на тиждень), мишей додатково двічі стимулювали внутрівенно (ІМ) за допомогою 10 мкг імуногенного білка альфа- синуклеїну в 100 мкл РВЗ за чотири і три дні до злиття.
Протоколи імунізації показані на фіг 1.
Антитіло 37 було отримано за протоколом імунізації, згідно з яким використовували фібрили повнорозмірного а-синуклеїну людини, що чергуються з усіченими на С-кінці формами альфа- бо синуклеїну з амінокислотами 1-60 і 1-119.
Антитіло 285 було отримано за протоколом імунізації, згідно з яким а- синуклеїновий мономер 1-140 людини використовували для перших 4 імунізацій. Якщо титр був відсутній, імунізацію продовжували фібрилами (ір/5с), інакше її продовжували мономером. 3. Створення НиМабр-гібридоми
НимМАр-мишей з вироблянням достатнього антигенспецифічного титру, як визначено вище, убивали і брали селезінку і лімфатичні вузли, прилеглі до черевної аорти і порожнистої вени.
Злиття спленоцитів і клітин лімфатичних вузлів з лінією мишачих клітин мієломи проводили шляхом електрозлиття з використанням системи для електрозлиття СЕЕЕ 50 (Су Риїзе
Зсієеєпсе5, Глен Берні, Меріленд, США), по суті, відповідно до інструкцій виробника. Злиті клітини висівали в середовище для культивування злитих клітин, що містить 10 95 бичачої сироватки
ЕейаІСіІопе І (Регбіо) 1 мМ пірувату натрію (Сатрбгех), 0,5 од./мл пеніциліну, 0,5 од./мл стрептоміцину (Сатргех), 50 мкМ 2-меркаптоетанолу (Іпмігодеп), 600 нг/мл інтерлейкіну 6 (1-6) (Зігашттапп), 1 х НАТ (5ідта) і 0,5 мг/мл канаміцину (Іпмігодеп) в НУО тАОСсСЕ-Маб (Регбіо).
Через десять днів збирали супернатант і клітини оновлювали середовищем для збору, що містить 10 95 бичачої сироватки РеїаїІСіопе І, 0,5 од./мл пеніциліну, 0,5 од./мл стрептоміцину, 600 нг/мл 1-6 і 1 х реонтТ (Сатьгех) в НУО тАрсСЕ-Маб. Супернатанти культур гібридоми піддавали скринінгу за допомогою первинних скринінгових досліджень. Супернатанти охарактеризували стосовно зв'язування з вісьма різними лігандами. До їх числа входили 4 ортологи: людини, миші, щура і яванського макака, альфа-синуклеїн людини, бета-синуклеїн і гамма-синуклеїн людини (ЗЕО ІО МО: 37-41), і, нарешті, їх тестували відносно їх здатності зв'язуватися з похідним альфа- синуклеїну людини, у якого були відсутні залишки 120-140 альфа-синуклеїну.
Скринінг антитіл до альфа-синуклеїну проводили з використанням формату високоефективної ЕГІЗА в суспензії за допомогою автоматизованих систем обробки рідини (Сепітар А/5). Зчитування планшетів виконували за допомогою двох систем: ЕМАТ 8200 від Арріїєй Віозузієт5 використовували для зчитування 384-лункових планшетів, а цитометр ІтадеХрге55 Меїо5 Сутегїег від МоїІесшаг Оемісе5 використовували для зчитування 1536-лункових планшетів.
В ході первинного скринінгу клони охарактеризували за їх здатністю зв'язуватися з 8 різними лігандами. До їх числа входила серія з 4 конструктів, отриманих перетасовуванням: А-5уп-
Зо ААКК-ВАР, А-5уп-ВААК-ВАР, А-5уп-ВВАА-ВАР, А-5уп-ВВКК-ВАР (ЗЕО 10 МО:11-14), альфа- синуклеїн-ВАР з делецією по 120-140, нітрований альфа-синуклеїн-ВАР людини і окиснений альфа-синуклеїн-ВАР людини.
Стисло, сироватки або супернатант, що містять потенційно специфічні відносно альфа- синуклеїну антитіла, додавали до гранул для забезпечення зв'язування з альфа- синуклеїном або конструктами, отриманими на основі альфа-синуклеїну. Зв'язування антитіл до альфа- синуклеїну виявляли за допомогою флуоресцентного кон'югату, Бу! ідпібв49, кон'югованого з дО кози проти антитіл людини, Ес-специфічного. У скринінгові дослідження як позитивні контролі було включено два відомі антитіла миші до альфа-синуклеїну, 8509 і бБуп211. Для забезпечення специфічного виявлення антитіл до альфа-синуклеїну при скринінгу титру в 384- лунковому форматі як негативний контроль використовували сироватковий пул антитіл до альфа-синуклеїну, тоді як в аналізі на основі 8 гранул в 1536б-лунковому форматі використовували ДО людини СпготРиге (торговельне найменування).
Гібридомні клітини з визначених в ході первинного скринінгу лунок з найкращим результатом висівали в напівтверде середовище, виготовлене з 40 95 СіІопеМеадіа (Сепеїїх, Гемпшир,
Великобританія) і 60 95 повного середовища НМСО 2х (Нусіопе, Волтем, США). У разі кожної лунки з первинного скринінгу її вміст висівали в лунку 6- лункового чорного планшета Сепеїїх. З кожної лунки забирали 25 субклонів за допомогою системи СіопеРіх (Сепеїїх). Субклони забирали в середовище для збору.
Через сім днів супернатанти субклонів знову піддавали скринінгу відносно специфічного до синуклеїну зв'язування ДО людини і вимірювали концентрацію ДС людини за допомогою платформи Осієї (Гоперіо, Менло-Парк, США). З кожної лунки первинного скринінгу вибирали найкращий субклон і розмножували його в середовищі для розмноження, що містить тільки 600 нг/мл 1-6, 0,5 од./мл пеніциліну, 0,5 од./мл стрептоміцину і 1 х ргонТ. Субклони розмножували в наступному порядку: одна лунка 96-лункового планшета - одна лунка 24-лункового планшета - чотири лунки 24- лункового планшета - шість лунок б-лункового планшета. Клони, отримані в результаті цього процесу, були позначені як первинні клони (РОС).
Додаткові дослідження стосовно зв'язування антитіла проводили з використанням Осівї
З8АКЕО (Ропіеріо, Менло-Парк, США). Розчини антитіл НиМар з концентрацією 2 мкг/мл отримували шляхом розведення в розчиннику зразків (РогіеВіо, арт. Мо 18-5028). Чутливі до бо аміногруп сенсори (ЕопевВіо, арт. Мо 18-0008) використовували для іммобілізації НиМабр. Перед зв'язуванням з чутливими до аміногруп сенсорами антитіла НиМабр розводили в буфері МЕ5, рн 6,0 (18-5027). Зв'язування здійснювали при 30 С і 1000 об./хв. таким чином. Чутливі до аміногруп сенсори попередньо змочували в РВЗ і потім активували за допомогою розчину для активації ЕОС/ЯМНОЗ (РопеВіо. арт. Мо 18-1033/18-1034) (відповідно до інструкції виробника) протягом 300 секунд. На активовані сенсори іммобілізували антитіла НиМар протягом 600 секунд.
Зв'язування 37 і 285 в платформі Осіеї з рекомбінантним альфа-синуклеїном людини, яванського макака і миші і відсутність зв'язування з бета- або гамма- синуклеїном людини показано на фігурі 2. 4. Аналіз послідовностей специфічних щодо синуклеїну варіабельних доменів НиМаБб і клонування у вектори експресії 3 0,2-5 х 106 гібридомних клітин отримували загальну РНК і з 100 нг загальної РНК отримували 5-ВАСЕ-комплементарну ДНК (кКДНК) за допомогою набору для ампліфікації КДНК
ЗМАКТ КАСЕ (Сіопіесі) відповідно до інструкцій виробника.
Ділянки, що кодують МН і МІ, ампліфікували за допомогою ПЛР і безпосередньо клонували в рамці зчитування у вектори експресії рЗЗо1ї ії раЗКарра (що містять послідовності, що кодують константні домени ЇдД01 людини/каппа) шляхом незалежного від лігування клонування (Азіапіаі5, б. апа РУ де допд, Мисієїс Асіаз Нез 1990; 18 (20): 6069-74). Для кожного антитіла секвенували 16 клонів МІ. і 16 клонів УН. Для додаткового вивчення і експресії відбирали клони з коректною відкритою рамкою зчитування (ОКР). Здійснювали тимчасову експресію векторів всіх комбінацій важких ланцюгів і легких ланцюгів в клітинах Егеезі(уїетТМ 293-Е з використанням 293тТесііп.
У разі секвенування СМ37 в МН-ділянці був виявлений додатковий цистеїн в домені СОКЗ в положенні 106. Для унеможливлення неправильного згортання і потенційної втрати активності антитіл із-за утворення дисульфідного зв'язку в положенні 106 здійснювали мутацію цистеїну на серин.
Антитіло порівняння 9Е4 створювали на основі послідовності МН і Мі, отриманої від гібридоми РТА-8221 (патентна публікація США 20080175838) (5ЕО ІЮ МО 42 і 43) 5. Експресія/очищення антитіл
Антитіла отримували в клітинах НЕК293 бЕ за допомогою трансфекції з використанням
Зо векторів рТТ5 і РЕЇІрго як засобу для тимчасової трансфекції (Канадська національна рада з наукових досліджень). Стисло, важкі і легкі ланцюги трансфектували в клітини НЕК29З3 з використанням РЕЇрго (ММУК) і через 24 години після трансфекції клітини доповнювали ТМ1 (Зідта). Клітини вирощували до тих пір, поки життєздатність не досягала 5095, і вихід антитіл вимірювали за допомогою еазу дб їШге (Тегто). Культуральний супернатант фільтрували через 0,2 мкм тупикові фільтри, завантажували в 5 мл колонки з білком А (гтРгоїеіпй А ЕЕ, Атегепат Віозсіепсе) і елюювали за допомогою 0,1 М лимонної кислоти-МаоН, рн 3. Елюат негайно нейтралізували за допомогою 2 М Тгтгі5-НСІ, рН 9, Її діалізували до 12,6 мМ МанНегРО», 140 мм масі, рН 7,4 (В.Вгашйп), О/М (протягом ночі). Після діалізу зразки піддавали стерилізуючій фільтрації через 0,2 мкм тупикові фільтри. Чистоту визначали за допомогою 505-РАСЕ, а концентрацію вимірювали за допомогою нефелометрії і поглинання при 280 нм. Очищені антитіла розділяли на аліквоти і зберігали при -80 "С.
Приклад 2. Характеристика антитіл за допомогою поверхневого плазмонного резонансу
Зв'язування антитіл з альфа-синуклевном в режимі реального часу вимірювали за допомогою ВіАсоге?ф 3000. Поверхню для захоплення отримували шляхом амінного зв'язування поліклонального антитіла кроля до антитіл миші (частина набору для захоплення антитіл миші,
СЕ Неайсаге Мо за кат. ВК-1008-38) в першій проточній комірці (Ес) і другій проточній комірці (Ес2) чипа СМ5 (ВІАсогеФ)). Антитіло миші захоплювали в Ес2 при концентрації, необхідній для досягнення рівня ліганду біля 500КИ. Забезпечували стабілізацію початкового рівня протягом 10 хвилин перед введенням аналіту (АЗупВАР) в Ес1-2 при 30 мкл/хв. АБУпВАР проганяли при 100-3200 нм ї 25-3200КО, відповідно. Найвищу концентрацію в кожній серії титрування проганяли двічі. Поверхню відновлювали за допомогою 10 мМ гліцин-НСЇІ, рН 1,7 (30 с ін'єкція) для видалення захопленого антитіла миші і аналіту в кінці кожного циклу.
НВ5О-ЕР (СЕ Неайсаге Мо за кат. ВК-1001-88) використовували як рухомий буфер і розріджувач зразка у всіх експериментах, а аналіз проводили при 25 "С. Всі зразки до отримання зберігали при 4 "С.
Відповідь, зареєстровану в Ес, де було іммобілізовано іммобілізоване антитіло, але було відсутнє іммобілізоване антитіло до альфа-синуклеїну, віднімали від відповіді в Ес2. Алгоритм зв'язування 1:11 або 2:11 використовували для наближення до набору даних за допомогою програмного забезпечення ВіАемаїчайоп версії 4.1.1. Результати можна бачити на фіг. 3, 4 ї 5, бо на яких показано зв'язування антитіла 37, 285 і 9Е4 з альфа-синуклеїном людини.
Приклад 3. Епітопне картування
Епітопне картування антитіл до альфа-синуклеїну проводили в Рерзсап (Рерзсап 7 цідегвіцізмед 2 8243 ВС, Лелістад, Нідерланди) за допомогою матриць лінійних пептидів, що перекриваються. Зв'язування антитіла з кожним з синтезованих 20-мірних пептидів тестували за допомогою ЕГ І5А на основі Рерзсап. Матрицю з лінійними пептидами, що охоплює всю кодуючу послідовність альфа-синуклеїну, а також всі пептиди з окисненими метіонінами або нітрозилованими тирозинами, інкубували з розчином первинного антитіла (протягом ночі при 47). Після промивання матриці з пептидами інкубували з 1/1000 розведенням кон'югату пероксидази і антитіла (ЗВА Мо за кат. 2010-05) протягом однієї години при 25 "С. Після промивання додавали субстрат для пероксидази 2,2'-азиноди-3-етилбензтіазолінсульфонат (АВТ) і 2 мкл/мл 3- відсоткового НгОг. Через одну годину вимірювали прояв кольору. Прояв кольору оцінювали кількісно за допомогою камери з напівпровідниковою світлочутливою матрицею (ССО) і системи обробки зображень. Для обробки даних значення отримували з ССО- камери в діапазоні від 0 до 3000 тА (міліодиниць оптичної щільності) аналогічно із стандартним ЕГІЗА-зчитувачем для 96-лункових планшетів.
Результати кількісно оцінювали і зберігали в базі даних Реріар. Зрідка лунка містила повітряну бульбашку, що приводило до псевдопозитивного значення, тоді знімки перевіряли вручну, а будь-які значення, викликані повітряною бульбашкою, оцінювали як 0. Дані зв'язування для антитіла 37 і 285 з пептидами, що містять послідовність ІГЕЮОМР або ГЕО, відповідно, можна побачити на фігурі 7.
Приклад 4. Імунопреципітація альфа-синуклеїну з гомогенатів передньої поясної кори головного мозку людини від пацієнтів з деменцією з тільцями Леві
Здатність антитіл зв'язуватися і осаджувати альфа-синуклеїн з неочищених гомогенатів поясної кори від людини з ОІВ або здорового контролю (відміченого ") аналізували за допомогою імунопреципітації. Заморожений зразок з поясної кори людини (отриманий за допомогою Тіззце ЗоЇшіоп5 4, Шотландія) розтинали на частини в кріостаті і 100 мг зразка додавали до 1600 мкл реагенту для лізису клітин сеїЇЇУйс М (Зідта С2978), що містить інгібітори протеаз і інгібітори фосфатаз (Коспе). Тканину головного мозку гомогенізували до повного розчинення зразка за допомогою бісерного гомогенізатора РгесеїПу5 (Вегіп есппоїодіев,
Зо Франція) 4 х 30 с при 5000 об./хв. Розчин центрифугували при 3000 х д і супернатанти використовували як неочищений гомогенат для імунопреципітації.
Для імунопреципітації 10 мкг антитіла змішували з магнітними гранулами Рупабеад» ргоїеїп б з використанням інструкцій виробника (Ійе ТесппоЇодіе5, Пейслі, Великобританія).
Неочищений гомогенат головного мозку розводили в 30 разів в буфері для лізису (Зідта). Зв'язані з антитілами гранули ЮОупабреай5 змішували з 500 мкл розведеного гомогенату і інкубували протягом 90 хвилин при кімнатній температурі при безперервному перемішуванні в струшувачі. Після інкубації гранули промивали в промивальному буфері і зв'язані антигени елюювали з використанням неденатуруючого буфера для елюювання відповідно до інструкцій виробника (протокол Юупабеай с, І їе Тесппоїодіев,
Пейслі, Великобританія). Результат імунопреципітації візуалізували за допомогою вестерн- блотинга з виявленням моноклонального антитіла миші до альфа- синуклеїну людини (4812,
Тпепто Зсіепійіс). Патерни смуг, що репрезентують різні за молекулярною масою форми альфа-синуклеїну, що осаджуються, розрізнялися у антитіл 37, варіанту 2 37 і 285 і антитіла порівняння 9ЕА4 в тому, що антитіло 37, 37м2 і 285 можуть імунопреципітувати основні різновиди альфа-синуклеїну, повнорозмірний альфа-синуклеїн (Б. азуп 1-140) і усічені на С-кінцевому кінці різновидності (1-135 і 1-119/122), тоді як антитіло 9Е4 не могло імунопреципітувати усічені різновиди 1-119/122. Фігура 9.
Приклад 5. Пригнічення усікання протеазами фібрил альфа-синуклеїну антитілами в клітинній культурі
Мономери і фібрили рекомбінантного альфа-синуклеїну можуть поглинатися первинними нейронами в культурі. Як показано схематично на фігурі 10, після поглинання альфа-синуклеїну нейронами він може бути оброблений внутріклітинними протеазами, такими як кальпаїн І, при цьому основний сайт чутливості до протеази знаходиться на амінокислоті 119/122. Для вивчення усікання альфа-синуклеїну протеазами отримували первинні кортикальні нейрони мишей, як описано в ЕЇмапд еї аі. 2009 (ЕМмапуд еї аІ. 9У Меигоспет. 2009;110(5):1377-87), і обробляли цитарабіном на БІМЗ (3-й день іп міго) для пригнічення зростання астроцитів. На рІМА (4-й день іп міго) нейрони обробляли за допомогою оброблених ультразвуком (5 хв. при 5095 потужності в пристрої для обробки ультразвуком з чашоподібним диспергатором) заздалегідь сформованих фібрил альфа-синуклеїну (РЕЕ) з кінцевою концентрацією 0,7 мкм бо окремо або разом з антитілами при вказаних концентраціях. Після 24 годин інкубації збирали середовище і лізували клітини. Вестерн-блотинг проводили як на середовищах, так і на клітинному лізаті з використанням антитіла 4812 (фіг. 11А) (Ріегсе МА1-90346) і вторинного антитіла до антитіл миші. Після зондування за допомогою 4В12 « антитіл до антитіл миші блоти очищали і повторно зондували за допомогою антитіла до ЇдС людини. На блоті з 4812 можна бачити, що в середовищах від клітин, оброблених тільки РЕБЕ, були інтенсивні смуги на рівні 14 і 12 кДа, де 14 кДа репрезентує повнорозмірний альфа-синуклеїн (РІ -азуп), а 12 кДа репрезентує усічений на С-кінці фрагмент 1-119/122 (СТ-азуп). На додаток до цього були присутні смуги з вищою молекулярною масою, які, швидше за все, представляли собою стійкі до 505 олігомерні різновиди. Сумісна обробка ізотипічним контрольним антитілом В12 не змінювала даний патерн протеолізу або поглинання.
У середовищах від клітин, оброблених фібрилами разом з 37, в основному був присутній повнорозмірний альфа-синуклеїн (14 кДа) і лише невеликі кількості смуги усіченого на кінці різновиду (12 кДа). У клітинних лізатах від клітин, оброблених фібрилами разом з 37, присутній тільки повнорозмірний альфа-синуклеїн, що свідчило про те, що 37 запобігає розщеплюванню
РІ -альфа-синуклеїну. Більш того, загальна кількість РІ -альфа-синуклеїну була пониженою в порівнянні з клітинами, обробленими тільки РЕЕ або контрольним антитілом В12. Декількома групами (Сатез еї аї, Ат У ої РаїШшої, Мої. 182, Мо. 3, Магсй, 2013; Кіїспіє еї аї, Неанй, Мої. 4, зЗресіа! Івиє, 1167-1177, 2012; Мізпігеп-Ебрег2, Віоспетівігу, 2005, 44, 7818-7829; Оипу вї а), Ат
У ої Раїйої, МоЇ. 170, Мо. 5, Мау 2007) було показано, що альфа-синуклеїн може розщеплюватися кальпаїном-ї1. Було виявлено, що сайт розщеплювання кальпаїном-1! у фібрилованого альфа-синуклеїну знаходиться в ділянці 114-122 (Мівпігеп-Ебеїт7, ої
Мешйгоспет, 86, 836-847, 2003). Іп мімо у трансгенних тварин і в головному мозку людини 1- 119/122, мабуть, є основним продуктом розщеплювання, в альфа-синуклеїні розщеплювання, судячи з усього, має місце після аспартату 119 або аспарагіну 122, який дезамідований до аспартату і розщеплюється кальпаїном або іншою протеазою з аналогічною специфічністю розщеплювання. Ці результати свідчать, що антитіло 37 здатне пригнічувати С-кінцеві усікання альфа-синуклеїну. Епітоп антитіла 37 перекривається з сайтом зв'язування ферменту кальпаїн- 1, тому зв'язування 37 з альфа-синуклеїном здатне безпосередньо пригнічувати зв'язування і
Зо розщеплювання, опосередковане кальпаїном-1 (фіг. 10 ї 11).
Епітоп 285 перекривається з епітопом 37, і очікується, що він пригнічуватиме розщеплювання протеазами. Амінокислотна послідовність 37м2 відрізняється від 37 тільки однією амінокислотою в СОК і має схоже з 37 зв'язування, тому також очікується, що воно, аналогічно 37, пригнічуватиме розщеплювання протеазами. Для вивчення того, чи є цей ефект антитіл дозозалежним, був поставлений 24-годинний експеримент з сумісним додаванням РЕБЕ і антитіл до первинних кіркових нейронів. Концентрація РЕЕ була стабільною (10 мкг/мл), тоді як концентрації контрольного антитіла В12 і антитіл 37, 37м2 і 285, які були протестовані, складали 10, 5, 1 ї 0,1 мкг/мл. Виявлення альфа-синуклеїну на вестерн-блотах проводили за допомогою антитіла 1904/4812 (Арсат), яке має епітоп в ділянці 103-108 і, отже, зв'язується як з
Н., так і з усіченим на С-кінці альфа-синуклеїном (фіг. 118). Як можна бачити з фігури 118, як СМ37, так і 37м2 та ОМ285 здійснюють дозозалежне пригнічення розщеплювання протеазами з майже повним пригніченням розщеплювання при високій концентрації антитіла.
Приклад 6. Опосередковане антитілом пригнічення затравлювальної дії щодо агрегації альфа-синуклеїну в клітинній культурі
У декількох дослідженнях було показано, що екзогенне додавання фібрилярних агрегатів рекомбінантного альфа-синуклеїну може привести до їх проникнення в клітини, і мобілізації ендогенного альфа-синуклеїну, і індукції агрегації і фосфорилування альфа-синуклеїну іп міїго і іп мімо в агрегати, які мають схожість з І В (МоіІрісеїПП-Оаїєу єї аІ. 2011, ик єї аІ. 2012а, ГиК еї аї. 2012р, Кесазеп5 еї аЇ. 2013, Рееїаегі5 еї аі. 2015). Для дослідження затравлювальної дії відносно ендогенного альфа- синуклеїну миші з використанням затравлювальних частинок рекомбінантного альфа- синуклеїну первинні кіркові нейрони миші, отримані як вказано вище, висівали в 96- лункові планшети (15000 клітин на лунку). На 5-й день культивування іп міїго (ОМ) 50 95 середовища замінювали і доповнювали арабінозидом цитозину (кінцева конц. 1 мкМ). На 6-й день (СІМ 6) половину середовища замінювали на кондиційоване глією середовище разом з фібрилярним матеріалом альфа-синуклегїну - неочищеними затравлювальними частинками фібрил або чистими затравлювальними частинками.
Неочищені затравлювальні частинки фібрил отримували з рекомбінантного мономерного альфа-синуклетну людини, який був виділений з бактерій, а мономери фільтрували через відсікаючий фільтр Атісоп ОКга 100000 (Міпроге Мо за кат. бо ОРС510096) і доводили до концентрації 1 мг/мл в РВ5, рН 7,4. Для отримання неочищених затравлювальних частинок фібрил розчин мономера інкубували в термоміксері при 37С з безперервним перемішуванням (800 об./хв.) до досягнення плато (оцінювали шляхом щоденних вимірювань з тіофлавіном 5). Для мінімізації випаровування додавали краплю мінеральної оливи для покриття розчину. Загальний час інкубації складав 5-7 днів. Чисті затравлювальні
Б частинки отримували з неочищених фібрилярних затравлювальних частинок, які центрифугували для їх очищення, а утворений осад ресуспендували в свіжому РВЗ і обробляли ультразвуком. Антитіла додавали один раз на ІМ 6 разом з неочищеними затравлювальними частинками альфа-синуклеїну. Половину середовища первинних нейронів кожного тижня замінювали кондиційованим глією середовищем, підтримуючи їх до БІМ21.
Нейрони фіксували і забарвлювали по фосфо-синуклеїну за допомогою антитіла кроля, специфічного щодо фосфорилування альфа-синуклеїну по амінокислоті 5129 (арсат 51253), з подальшим додаванням флуоресцентно міченого антитіла до антитіла кроля, флуоресценцію кількісно оцінювали за допомогою автоматизованої флуоресцентної мікроскопії на СеїПотіс5 Аггаузсап. Ядра були виявлені в одному каналі, і за ними визначали кількість придатних клітин. Плями фосфорилованого альфа-синуклеїну були виявлені в іншому каналі в попередньо визначеній кільцеподібній зоні, що оточує ядра, таким чином репрезентуючи цитоплазму клітин. Розраховували середню кількість плям на клітину. Приклад забарвлювання клітин показаний на фіг. 12А. Плями фосфорилованого альфа-синуклеїну не спостерігали для необроблених нейронів.
Нейрони, що інкубувалися з неочищеними або чистими затравлювальними частинками (1-10 нг на лунку), індукували фосфорилування альфа-синуклеїну (фіг. 12А). В нейритах фосфорилований синуклеїн мав вид плям або цяток, а деяка частина фосфо- синуклеїну в нейритах виглядала подовженою.
Для досліджень розділення на фракції клітини збирали у фосфатно-сольовий буферний розчин (РВЗ) і центрифугували. Осад ресуспендували в буфері з 1 95 Тритону з інгібіторами протеаз. Зразки витримували на льоду протягом 15 хвилин з подальшою обробкою ультразвуком. Зразки центрифугували при 100000 х д протягом 30 хвилин при 47с.
Супернатант збирали і позначали як розчинну фракцію. Осад промивали один раз в буфері з
Тритоном і ресуспендували в 195 505-буфері з подальшою обробкою ультразвуком. Зразки
Зо знову центрифугували при 100000 х д протягом 30 хвилин.
Супернатант збирали у вигляді нерозчинної фракції. Вимірювали концентрації білка і зразки проганяли на 4-12 95 гелі ЗОЗ РАСЕ, промакували на мембрани і здійснювали виявлення альфа-синуклеїну і фосфорилованого альфа-синуклеїну (5129Р) за допомогою, відповідно, антитіла 4812/1904 (Трпептпо зсіепійс: МА1-90346-синуклеїн людини), антитіла 5129Р-азуп (абсат 51253) і антитіла до синуклеїну миші (передача сигналів в клітині- О37Аб).
На фіг. 128 показані результати вестерн-блотинга розчинної і нерозчинної фракції з первинних нейронів з неочищеними затравлювальними частинками і без них. Як можна бачити з фігури 128, додавання затравлювальних частинок приводило до накопичення ендогенного альфа-синуклеїну миші і р-5129-альфа-синуклеїну, а також мультимерів фосфорилованого альфа-синуклеїну миші в нерозчинній Фракції клітин.
Для перевірки, чи можуть антитіла пригнічувати затравлювальну дію, використовували затравлювальні частинки альфа-синуклеїну в конц. 6,6 нМ (10 нг/лунку). Для отримання дозозалежного ефекту на ОМ 6 разом додавали антитіла і затравлювальні частинки альфа- синуклеїну в різних концентраціях (починаючи з найбільш високої конц. антитіла на рівні 133 нм і понижуючи до 133 пМ). Нейрони знову фіксували і забарвлювали по фосфо-синуклеїну (абсат 51253) і флуоресценцію від клітин кількісно оцінювали за допомогою автоматизованої флуоресцентної мікроскопії на
СеПотіс5 агаузсап. На Сеїотіс5 агтаузсап підраховували плями/цятки на клітину. Як можна бачити з фігури 12С, як антитіло 37, так і антитіла 37м2 та 285 зменшували фосфорилування альфа-синуклеїну в нейронах дозозалежним чином зі схожим максимальним інгібуванням для 37, 37м2 і 285 (близько 70-75 95) і ЕС5О близько 5 нМ. Фракціонування клітинних білків на розчинну і нерозчинну фракцію після обробки антитілом в найвищій концентрації (133 нМ) демонструвало, що всі антитіла 37, 37м2 і 285 пригнічували усікання рекомбінантних неочищених затравлювальних частинок і накопичення усіченого на С-кінці фрагмента (СТ а-5уп) і зменшували накопичення фосфорилованого ендогенного альфа-синуклеїну миші і агрегованих форм альфа-синуклеїну миші в нерозчинній фракції, що видно на фігурі 120.
Приклад 7. Сильні електрофізіологічні ефекти антитіл до альфа-синуклеїну іп мімо
Високі рівні експресії альфа-синуклеїну людини присутні в гіпокампі трансгенних 60 мишей Е28-5пса, моделі, у якій надекспресується альфа-синуклеїн дикого типу під контролем промотору альфа-синуклеїну миші (У/ехїепипа М, еї а. Мої СеїЇ Мешйгозсі. 2008 Оес; 39 (4):586-91). Оцінку синаптичної передачі і пластичності в СА1-зоні гіпокампу у 4-6-місячних самців трансгенних мишей Е28-5пса і контрольних мишей відповідного віку проводили за допомогою електрофізіологічних методів іп мімо. З даних видно, що базальна синаптична передача значно погіршувалася у трансгенних мишей Е28-5пса в порівнянні з контрольними мишами відповідного віку (фіг. 13).
Самців трансгенних мишей Е28-5пса і контрольних мишей відповідного віку (СКО Бгееадаіпод,
Тасопіс Еигоре А/5) у віці від 4 до 6 місяців розміщували поодинці в умовах з регульованою температурою (22:1,5 "С) і вологістю (55-65 Фо) і тримали при циклі чергування світла і темряви 12:12 год. (світло включали о 06:00 год.). Їжа і вода були доступні без обмежень.
Тварин анестезували шляхом інтраперитонеальної (і.р.) ін'єкції уретану (1,2 г/кг). Потім мишей розміщували в стереотаксичній рамці, їх температуру доводили до 37,5 "С за допомогою електричної грілки, і оголяли череп. На лобову кістку поміщали платиновий дріт, який виступав як контроль, і просвердлювали додатковий отвір для введення реєструючих і стимулюючих електродів в гіпокамп за наступними координатами відповідно до атласу Рахіпов5 і ЕгапкКіїп (Рахіпоз апа ЕРгапкКіїп'є їе Моизе Вгаїп іп 5іегеоїахіс Соогаїпаїевз, 4(п Еайіоп, 2001): реєструючий - на 1,5-1,7 мм назад від брегми, на 1,0-1,2 мм латерально від серединної лінії, на 1,4-1,7 мм нижче за поверхню головного мозку; стимулюючий - на 1,8-2,0 мм назад від брегми, на 1,5-1,7 мм латерально від серединної лінії, на 1,5-1,7 мм нижче за поверхню головного мозку. Тварин залишали в стереотаксичній рамці протягом всього періоду реєстрації даних і регулярно перевіряли рівень їх анестезії.
Потенціали поля (ТЕРОР) викликали в САї7 шляхом електричної стимуляції колатералі
Шеффера кожні 30 с, а глибину розташування реєструючого електроду регулювали до тих пір, поки у відповідь на монополярний прямокутний імпульс не був зареєстрований негативний
ТЕРБР. Градієнт викликаного ТЕРБ5Р вимірювали в діапазоні 30-70 95 від максимальної амплітуди
ТЕРБ5Р.
Після індукції оптимального ТЕРЗР базальну синаптичну передачу оцінювали за залежністю між інтенсивністю стимуляції і градієнтом викликаного ТЕР5Р (залежності "вхід-вихід"). Різні інтенсивності стимуляції складали 0, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 ї 500 мкА, і їх послідовно прикладали в порядку зростання з 2-3 повторами для кожної інтенсивності. Було виявлено, що базальна синаптична передача значно погіршувалася у трансгенних мишей Б28-5пса в порівнянні з контрольними мишами відповідного віку.
Встановлені порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей Е28-5пса використовували для тестування ЗМ37, ЗМа285 і антитіла порівняння ПО9ЕА відносно їх здатності блокувати опосередкований альфа-синуклеїном ефект.
Реєстрації даних проводили в усіх експериментах через 3-6 годин після введення одноразової дози антитіла дозою 15 мг/кг (І.р.). Базальну синаптичну передачу реєстрували у кожної тварини в гіпокампі за наявності можливості і реєстрували їх як окремі експерименти.
Короткочасна обробка за допомогою пП9Е4 індукувала значне обертання порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей Е28-5пса (Тд-5псанпо9ЕаЯ в порівнянні з Тд- зпса-РВ5, р-0,002, фіг. 14). Проте, обертання при обробці пП9Е4 було лише частковим, про що свідчила значна відмінність від базальної синаптичної передачі у тварин одного приплоду, оброблених РВЗ (р-0,007).
Короткочасна обробка за допомогою СЗМ37 індукувала значне обертання порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей Е28-5пса (Та-з:псаноМ37 в порівнянні з
Та-зпса-РВ5, р-0,004, фіг. 15). Базальна синаптична передача у оброблених за допомогою
СМ37 трансгенних мишей значно не відрізнялася від базальної синаптичної передачі у оброблених за допомогою РВ5 тварин одного приплоду, що свідчило про повне обертання порушення (фіг. 15).
ОМ285 також індукувало значне обертання порушення базальної синаптичної передачі у трансгенних мишей БЕ28-5пса (фіг. 16). Базальна синаптична передача у оброблених за допомогою ЗМ285 трансгенних мишей значно не відрізнялася від базальної синаптичної передачі у оброблених за допомогою РВ5 тварин одного приплоду, що свідчило про повне обертання порушення.
Приклад 8. Мікродіаліз для оцінки альфа-синуклеїну людини в головному мозку безсонних тварин, що рухаються вільно
Для оцінки рівнів альфа-синуклеїну людини в інтерстиціальній рідині головного мозку (ІЗЕ) використовували двотактний спосіб мікродіалізу. Мишей поодинці розміщували в умовах з бо регульованою температурою (22:1,5 "С) і вологістю (55-65 Фо) і тримали при циклі чергування світла і темряви 12:12 год. (світло включали о 06:00 год.). Їжа і вода були доступні без обмежень. Це дослідження проводили на гіпокампі трансгенних мишей Е28-5пса (віком 50-54 тижні). Для здійснення мікродіалізу в гіпокампі мишей анестезували ізофлураном і в головний мозок стереотаксично імплантували внутрішньоцеребральну направляючу канюлю (СМА), розташовуючи мікродіалізний зонд в гіпокампі (координати наконечника зонда: на 3,1 мм назад і на 2,8 мм латерально від брегми і на 1,3 мм відносно твердої мозкової оболонки) відповідно до атласу Рахіпоз і ЕгапкКіїп 2001. Для фіксації направляючих канюль застосовували анкерні гвинти і акриловий цемент. Після імплантації канюлі забезпечували відновлення мишей після операції протягом 2-3 днів перед діалізом.
В день експерименту через направляючу канюлю вводили 2-міліметровий СМА- зонд з межею виявлення 1000 кДа. Зонд з'єднували з перистальтичним насосом для мікродіалізу з двома каналами (МАВ20, Місгобіоїесп) і запускали в двотактному режимі. Впускну трубку мікродіалізного зонда сполучали з перистальтичним насосом, який здійснює перфузію штучної спинномозкової рідини (ас5б, в мМ: 147 Масі, 2,7 КСІ, 1,2 Сасі», 0,85 МасСі») за допомогою зонда. Перистальтичний насос також з'єднували з випускною трубкою для запобігання втраті перфузійної рідини із зонда при виштовхуванні рідини через трубку. Як перфузійний буфер 25 95 фракцію бичачого альбуміну М (Зідта) розводили до 0,2 95 штучною С5Е в день застосування і фільтрували через 0,1-мкм мембрану. Фактичну витрату потоку насоса визначали без приєднаного зонда. Пробірки для зразків зважували до і після забору зразків протягом заданого періоду часу і розраховували витрату потоку. Потім насос встановлювали на постійний потік у 1 мкл/хв. Впродовж всього періоду експерименту використовували 120-хвилинний режим забору зразків. Щоб уникнути перешкоди у вигляді пошкодження тканини, проміжок до проведення експерименту встановлювали на 14-48 годин після імплантації зонда. Через 14-16 годин після початку експериментів 5М37, 9Е4 людини або ізотипічний контроль (антитіло до НЕЇ) вводили і.р. при 15 мг/кг і збирали додаткові б зразків (12 год. збору). Діалізати зберігали при -80 "С. Концентрацію альфа- синуклеїну людини визначали за допомогою ЕГІЗА (набору для ЕГІ5А Сомапсе).
Середнє значення двох-трьох початкових значень (4 год. - б год.) до обробки антитілом приймали як початковий рівень і приймали за 100 95 для кожної тварини. Дані оцінювали за
Зо допомогою двохфакторного дисперсійного аналізу (АМОМА) з повторними вимірюваннями для оцінки статистичної значущості. Початкові рівні альфа-синуклеїну людини в гіпокампі складали 8,1-41,1 нг/мл (середнє хх ЗЕМ, п-25, не скоректовані щодо відновлення діалізного зонда іп міго). Введення 2М37 індукувало більше зменшення рівня альфа-синуклеїну людини в гіпокампі мишей Е28 в порівнянні як з антитілом порівняння, 9Е4 людини, так і з ізотипічним контролем (антитілом до НЕ). (Фіг. 17).
Приклад 9. Тривалі ефекти антитіл до альфа-синуклеїну іп мімо. Антитіло (ЗМ37 покращує руховий фенотип у щурячій моделі хвороби Паркінсона.
Цілеспрямованої надекспресії альфа-синуклеїну людини в дофамінергічних нейронах в середньому мозку щура можна досягти за допомогою вектора на основі рекомбінантного аденоасоційованого вірусу (ГААМ), і вона асоційована з прогресуючою втратою дофамінергічних клітин в чорній субстанції, а також з руховими порушеннями.
Дорослих самок щурів лінії 5ргадое-Саміеу (225-250 г) використовували для експресії альфа-синуклеїну людини в чорній субстанції (ЗМ) шляхом введення їм аденоасоційованого вірусу серотипу ААМ2/5, що містить промотор бета-актину курки з енхансерними елементами з промотору цитомегаловірусу, після якого слідує КДНК альфа-синуклеїну людини і УУРКЕ- елемент, як описано раніше (Хи ГІ, Оаїу Т, Сао С, РІоце ТЕ, 5о0по 5, Вугпе ВУ, Запаз М5, Ропаег
КР (2001). У цій моделі було показано, що експресія альфа-синуклеїну людини приводить до нейродегенерації дофамінергічних нейронів. Маіїпдау М, еї аІ. СМ5 5ресіг. 2005 Маг;10(3):235- 44). Для перевірки впливу терапевтичного антитіла до альфа-синуклеїну в цій моделі обробку антитілом починали за 2-4 дні до введень вірусу і продовжували до кінця дослідження (фіг. 18).
Введення РВЗ5 в тому ж об'ємі (5 мл/кг: ІР) використовували як контроль. ЗМ37 вводили двічі на тиждень дозою 15 мг/кг (ІР). Вірусні частинки (ГААМ2/5), що містять ген альфа- синуклеїну м/ людини або зелений флуоресцентний білок (СЕР), вводили односторонньою ін'єкцією в ЗМ.
Тварин анестезували комбінацією НурпогтФб і боптпіситФ в кількості 2,0 мл/кг 5.с. і поміщали в стереотаксичну рамку. Їх температуру доводили до 37,5 "С за допомогою нагрівальної подушки і оголяли череп.
Просвердлювали отвір над правою 5М за наступними координатами, відповідно до атласу
Рахіпоб5 і УМаївоп (Рахіпо5 4 УМаїбоп, 1998): 5,5 мм назад і 2,0 мм латерально від брегми.
Одноразову ін'єкцію З мкл ГгГААМ2/5-аІрна-зуп або гААМ2/5-СЕР проводили на глибині 7,2 мм бо нижче за тверду мозкову оболонку і при витраті потоку 0,2 мкл/хв. за допомогою шприца
Гамільтона, сполученого із стереотаксичним інжектором. Голка залишалася на місці на додаткові 5 хвилин для забезпечення дифундування вектора в 5М. Після операції тварин повертали в їх власну клітку і поміщали в нагріте середовище, де забезпечували їх відновлення після анестезії. Оцінку рухової асиметрії в тесті передніх кінцівок на асиметричність проводили до ін'єкцій ААМ, а також через 3, 7 і 10 тижнів після ін'єкцій ААМ. Представлені дані відповідали співвідношенню між користуванням правою передньою лапою в порівнянні із загальним користуванням лівою і правою передніми лапами. Поведінку кожної тварини в тесті передніх кінцівок на асиметричність реєстрували на камеру протягом всього 5 хвилин, і була проведена ручна оцінка кількості торкань з використанням лівої і правої передніх лап протягом 5 хвилин в останній день тестування через 10 тижнів після введення вірусу. На 10-му тижні значне порушення було присутнє у ААМ-5уп в порівнянні з щурами, яким вводили ААМ-СЕР (р-0,012).
Показана тенденція до обертання порушення у тварин, оброблюваних ЗМ37, в міру того, як їх поведінка відрізнялася від СЕР-щурів (відповідно, р-0,163 і р-0,407 для дт37). Ці результати свідчили, що антитіло ЗМ37 здатне покращувати паркінсонічний руховий фенотип в цій щурячій моделі (фіг. 18 і 19).
Приклад 10. Тривалі ефекти антитіл до альфа-синуклеїну іп мімо. Антитіло ЄМ37 пригнічує затравлювальну дію відносно агрегації і фосфорилування ендогенного альфа-синуклеїну миші
Введення заздалегідь утворених фібрил альфа-синуклеїну, отриманих з рекомбінантного білка, в задню частину смугастого тіла мишей дикого типу мобілізувало ендогенний альфа- синуклеїн миші і індукувало утворення фосфорилованих агрегатів 5ег-129 усередині нейронів в корі, мигдалині і чорній субстанції (ІК еї аї. 2012, бсіепсе. 2012 Мом 16;338(6109):949-53). Для перевірки того, що специфічне щодо альфа-синуклеїну моноклональне антитілло ОМ37 може зменшувати появу утворення індукованих фібрилами альфа-синуклеїну включень фосфорилованого альфа-синуклеїну іп мімо, було використано в цілому 45 мишей.
Мишам вводили СМ 37 при 30 мг/кг і.р, ЗМ 37 при 15 мг/кг і.м. або носій ір (РВ5). Через один день мишей анестезували і стереотаксичним методом вводили в одну півкулю 2 мкл неочищених затравлювальних частинок рекомбінантного альфа- синуклеїну людини, отриманих як описано раніше (приклад 6) (загалом 2 мкг неочищених затравлювальних частинок на тварину). Для введення неочищених затравлювальних частинок
Зо розкривали череп, просвердлюючи отвір, і вставляли одну скляну піпетку (координати: 0,5 мм наперед від брегми 42,0 мм латерально від серединної лінії) в правий передній мозок для цілеспрямованого введення інокулята в задню частину смугастого тіла (42,6 мм під твердою мозковою оболонкою). Після відновлення миші отримували щотижневі і.р. або і.м. ін'єкції антитіл до убивання через 45 днів. Групам з 15 мишей/групу раз на тиждень вводили або ім 5М37 15 мг/кг, або ір 5М37 30 мг/кг, або РВЗ (10 мл/кг) ір.
Для вимірювання концентрації антитіл в плазмі крові один раз на тиждень брали кров з щік безпосередньо перед наступною ін'єкцією, тобто через 7 днів після останньої ін'єкції. Плазму крові отримували шляхом центрифугування при 2000 д, інкубації протягом 15 хвилин при кімнатній температурі (КТ), після цього супернатант заморожували при -20"0. В кінці дослідження брали зразок спинномозкової рідини (С5Е) і заморожували його при -20 "С. Зразки плазми крові і С5Е аналізували для визначення концентрації (9 людини за допомогою М50О.
Стисло, антитіло миші до Ї9 людини (клон МНІ16-1 (М1268) використовували для захоплення, плазму крові або СЗЕ інкубували в лунці з подальшим додаванням антитіла кози з сульфо- міткою до антитіл людини як антитіло для виявлення (М5О Мо за кат. К32АШ-1). Планшети аналізували відносно електрохемілюмінесценції за допомогою М5О.
Рівні антитіл в плазмі крові показані на фігурі 208, і з них видно дозозалежне збільшення концентрації антитіл в плазмі крові і накопичення антитіл в плазмі протягом шести тижнів. Рівні антитіл в с5ї показані на фігурі 20С, і з них видно, що близько 0,1 95 рівня антитіл в плазмі крові можна виміряти в с5і.
На 45-й день з моменту ін'єкції затравлювальних частинок у вигляді фібрил альфа- синуклеїну мишей анестезували, транскардіально перфузували фосфатно-сольовим буфером (РВ5) з подальшою перфузією забуференим до нейтрального параформальдегідом (4 95).
Видаляли головний мозок і інкубували його протягом ночі для подальшої фіксації в забуференому до нейтрального параформальдегіді.
Імуногістохімію проводили на послідовних зрізах товщиною 45 мкм в Меигозсіепсе аззосіаїез. Стисло, за допомогою технології МийкіВгайп? до 25 штук головного мозку мишей спільно заливали в один блок, всього З блоки, заморожували, і робили зрізи товщиною 45 мкм у фронтальній площині, і збирали в чашки, що містять антиген- консервувальний розчин. Кожен шостий зріз забарвлювали антитілом до альфа- синуклеїну з фосфорилованим 5ег-129 бо (антитілом до альфа-синуклеїну (фосфо-5129)
ІРзуп/«81А|Ї ар184674) для виявлення реакційних структур альфа-синуклеїну з фосфорилованим 5ег-129.
Кількісне визначення патології рбуп здійснювали шляхом ручного підрахунку позитивних щодо імунореактивності клітин на зображеннях з 10-кратним збільшенням 5-7 зрізів, що охоплюють всю чорну субстанцію від кожного шостого зрізу. Підрахунок здійснювали сліпим методом. Кількість клітин в мигдалині і чорній субстанції аналізували за допомогою однофакторного АМОМА з подальшим аналізом за допомогою І-критерію Бонферроні, де ефект антитіла ЗМ37 порівнювали з обробкою РВ5.
Як можна бачити з фіг. 20С, обробка антитілом 5М37 значущо зменшувала кількість внутріклітинних включень в чорній субстанції в порівнянні з контролем РВЗ при ір або ім обробці. З даних видно, що антитілло ЗМ37 спроможне надавати терапевтичний ефект при РО шляхом блокування проникнення позаклітинного патологічного альфа-синуклеїну в нейрони, блокування його розповсюдження між нейронами і/або полегшення його усунення з ІЗЕ в результаті поглинання в мікроглію. Оскільки така поява включень була пов'язана з втратою дофамінергічних нейронів і розвитком паркінсонічних рухових порушень в тваринних моделях, обробка антитілом ЗМ37 спроможна надати терапевтичний вплив на втрату дофамінергічних клітин і розвиток рухових порушень при РО.
Приклад 11. Можливість виготовлення ЗМ37 і варіантів ЗМ37
Антитіла до альфа-синуклеїну отримували в культурі клітин ссавців в умовах, які імітують умови отримання, які будуть використані для отримання клінічного матеріалу для застосування на пацієнтах. Добре відомо, що білки, отримані таким чином, піддаються посттрансляційним модифікаціям, які можуть впливати як на терапевтичну ефективність антитіла, так ії на біофізичні характеристики, які впливають на стабільність антитіла з часом. Емпіричні знання, отримані протягом десятиріч досліджень, дозволили виявити набір посттрансляційних модифікацій, які відомі як такі що надають ризик щодо можливості розробки конкретної молекули. Було показано, що ці посттрансляційні модифікації корелюють з амінокислотними ланцюгами, присутніми в первинній послідовності білків важких і легких ланцюгів.
Були створені алгоритми, які можуть виявити ці послідовності і визначити потенційний ризик, який вони надаватимуть на можливість виготовлення і можливість розробки терапевтичного
Зо антитіла.
Аналіз первинної послідовності антитіла іп 5йїсо можна застосовувати для зниження ризику для молекули відносно можливості її розробки як терапевтичного засобу. Зокрема, докладний аналіз УН- і Мі -ділянок може виявити унікальні амінокислоти, які вважаються за важливі для активності молекул, але також можуть нести потенційний ризик для їх стабільності з часом. Специфічне дезамідування послідовностей було ідентифіковане як потенційний ризик для білкових структур. Дезамідування білків може відбуватися на амідних бічних ланцюгах глутамінів або аспарагінових залишків і перетворювати їх на карбоксилатну групу (Гогеп2о еї аї.
РІГ ОБопе, 0О1:10.1371, Оес. (2015)). Неферментативне дезамідування при нейтральному рн відбувається швидше для аспарагіну, і тому вважають, що для нього ризик вищий, ніж для глутаміну. На активність додатково впливає подальша амінокислота в послідовності, і така зміна активності може відбуватися зі швидкістю, яка обчислюється днями або роками. Фактичну долю білка, який піддається дезамідуванню, необхідно оцінювати експериментально для визначення впливу такої зміни як на його стабільність, так і на його активність.
Авторами цього винаходу був ідентифікований сайт для дезамідування в МН- домені М37.
Амінокислотним залишком 54 є аспарагін (М), після якого слідує гліцин (б) в положенні 55. М54 схильний до високого ризику спонтанного дезамідування. Для зниження такого ризику авторами цього винаходу був створений набір з З варіантів, в яких аспарагін (М) замінений серином (5), глутаміном (С) або гістидином (Н). Усі З варіанти були отримані в культурі клітин ссавців за допомогою способів тимчасової трансфекції (приклад 1.5).
Всі З варіанти демонстрували схожі властивості експресії і очищення, як і ЗМЗ37Уи. (Фіг. 23).
Для кожного з восьми продуктів об'ємом 400 мл здійснювали тимчасові трансфекції із застосуванням клітин СНОК1Т5М О5-КО, які до цього знаходилися в культурі протягом мінімум 2 тижнів. Клітини пересівали за 24 години до трансфекції. Всі трансфекції проводили шляхом електропорації за допомогою Сепе Риїзе ХСеї! (Віо-Каа). Для кожної трансфекції життєздатні клітини ресуспендували в попередньо нагрітому середовищі СО-СНО, доповненому 6 мМ І1- глутаміну, до 2,86 х 107 клітин/мл. 40 мкг кожної встановленої ЗОМ-ДНК, що містить відповідні важкі і легкі ланцюги, вносили аліквотою в кожну кювету (кювета Віо-Кай, СепеРиїзег, зазор 0,4 см, 165-2088) і додавали 700 мкл клітинної суспензії. Клітини піддавали електропорації з бо напругою 300 В, 900 мкф. Піддані трансфекції клітини переносили в повторно нагріте в колбі
Ерленмейєра середовище і до колби також переносили вміст кювет, двічі промитих заздалегідь нагрітим середовищем. Культури трансфектантів інкубували в струшуючому термостаті при 36,5 С, 5 95 СО», 85 95 вологості, 140 об./хв. протягом 6 днів. Життєздатність клітин вимірювали під час збору за допомогою автоматизованого пристрою для підрахунку клітин Седех НіКез (Козспе).
Для оцінки важливості залишку 54 в зв'язуванні з альфа-синуклеїном людини авторами цього винаходу в двох різних експериментах була проаналізована здатність варіантів зв'язуватися. За допомогою конкурентного формату ЕГІЗА авторами цього винаходу було оцінено, чи робитиме вплив зміна залишку 54 на здатність ЗМ37 зв'язувати альфа-синуклеїн в розчині. Шляхом оцінки концентрації синуклеїну, яка може пригнічувати зв'язування антитіла з синуклеїном, нанесеним на планшети для ЕГІ5А, авторами цього винаходу було показано, що всі три варіанти зберігали таке ж зв'язування, що і ЗМ37м/і, і вони зв'язувалися з альфа- синуклеїном з високою афінністю, що в результаті давало ІС5О 1-2 НМ (фіг. 24). Конкурентний аналіз проводили за допомогою попередньої інкубації при фіксованій концентрації (0,3 мкг/мл) кожного з наступних антитіл: ЗМ37 (званого ОМ З37м/), варіанту 1 ОМ37, варіанту 2 ОМ37 і варіанту 3 ЗМ37 з діапазоном 0-1000 нМ альфа-синуклеїну людини протягом 60 хвилин при кімнатній температурі. Незв'язане антитіло, що залишилося, захоплювали і вимірювали на планшетах для ЕЇГІБА, покритих 100 нг/мл рекомбінантного альфа-синуклеїну людини, із застосуванням антитіла для виявлення антитіл людини шляхом електрохемілюмінесценції (М50, Гейтерсберг, Меріленд).
Значення ІС50 взаємодії дорівнювали 1,9 нМ, 1,6 нМ, 2,1 нМ і 1,4 нМ для, відповідно, ЗМ37
У, варіанту 1 ЗМ37, варіанту 2 ОМ37 і варіанту 3 ЗМ37 (за результатами визначення за допомогою Ргізт сгарпрадф)).
За допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ЗРЕ) авторами цього винаходу була оцінена кінетика зв'язування в режимі реального часу ОМ37 мл (2 партії) і трьох варіантів (приклад 2). Альфа-синуклеїн людини захоплювали на мікроскопічний препарат (ліганд) і кожне з антитіл тестували в декількох концентраціях як аналіти. Аналіз кривих зв'язування у присутності антитіла при численних концентраціях показав, що швидкості асоціації були однаковими для всіх чотирьох антитіл, аналогічно, при видаленні антитіла з буфера, зміряні
Зо швидкості дисоціації не демонстрували статистичної різниці між антитілами. При використанні алгоритму зв'язування 11 усі 4 антитіла мали майже ідентичні константи зв'язування (фіг. 25).
Для оцінки впливу зміни М54 на функціональну активність 5М37 авторами цього винаходу була проаналізована здатність антитіл блокувати затравлювальну активність синуклеїну в культурі первинних нейронів (приклад 6). Рівень затравлювальної дії вимірювали за допомогою антитіла, специфічного до фосфо-синуклеїну. За результатами вимірювання за допомогою сигналу від фосфо-синуклеїну всі З антитіла були здатні блокувати затравлювальну дію (фіг. 26). Більш того, рівень пригнічення був 87 РСТ/ЕР2016/066476 однаковим для всіх 4 антитіл. Дані на основі такого сигналу додатково підтверджують дані стосовно зв'язування, що амінокислота 54 в МН-домені нееє необхідною для афінності зв'язування з альфа-синукле"їном людини або для інгібування затравлювально'ї дії в аналізі на первинних клітинах. Більш того, авторами цього винаходу було виявлено, що усі три ці антитіла можна було отримати за допомогою стандартних способів експресії і очищения. Що цікав 0, для одного з варіантів М54С) спостерігали збільшення виходу при отриманні в порівнянні з іншими варіантами, що має велике значения, коли антитіло необхідно буде отримувати у великих промислових масштабах. Ці дані підтверджують можливість зниження потенційного ризику дезамідування шляхом заміни аспарагіну (М) на іншу амінокислоту без проблеми втрати активності.
Зразки кожного з антитіл у ОМ37, маг, маг2 і маг3 піддавали постійному підвищенню температуря протягом часу і одночасно вимірювали рівень агрегації" за багатокутовим розсіянням світла (РготеїШеи5з МТ.48, МапоТетрег Тесппоодіе5). Було виявлено, що температура початку агрегації була схожою для ЗМ37 і варіантів СМ37, проте найнижчий рівень агрегації спостерігали для З5М37-Мага2 (фіг. 27).
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110х ХХ. Лукибек А/С (НН. Тпбіресю А/В) «1802 Нові мовоклональні антитіла до альфа-синуклейну «їзах 0982 «ківо» 43 «170» басецзеоой тежвісюв 3.5 «І» ії «її» 10 «аїй2 ВНЕ «238» Штучна «220» Що «893» СБВ і зажкого лавцдюкюка ОМ «00» 1 біу ре ТВж Ре Як бек Тук Аїа Меї ТЕ 1 5 10 «Віз 5 «81ї» 17 «2і8» РВЕ. . «2182 Штучна «а» «223У СОД2 важкого лавцюва МУ «400» 2 їз Їїе Аку Бех Аби 01у Авр Яка Твх йвр Тут Від Авр Вех Уві Цув ії Б 10 15 «у «2ї0» З «вії» 8 «212» РЕЖ «із» Штучна «ках «?33» СОКЗ важкого яавцюгта СМ «оп» З аАзїа Був Дво Тер Аза реко Ре Авр Вех І 1 в «іо» й «вії» 1 «8122 РЕ «813» Штучна «вадх ее» СА зекчесро давню с
МН й й
Вів йек Щі Бех Мві Бек ек бах Ту їм дія к 5 іа «Ек В «ІВ т «Мій» ВЕЖ «ВЕ Ше чаняк «ака Ма Я песжює пеню еще 5 сів дів Бех дек Аку Аіїз БЕ 3 5 «оз є І сі» а «ід ВЕЖ «кій Жтучиа «Ех «ЕЖЗ» СКОБ З лезо ванщеи ОМА? «ам Є із єїн Жук Бі Беж бек БЖже Тер ТвЕ ії в ж Я «вії 116 «віх ВЕЖ «ех ножні «Ей Х «ше СІВ. важно мелках СТ «аа У іа Уаї3 ів бе їжи» Біб Бе Бі Біт з3у беи Май їі ТвВж сьє жу ї В Хо ї5
Зая Кен: да Ша ЖЖ Су Зів вза Беж ЗУ Кі Жос Же ех Мек Теж в я КІ дів мМеб ївБк кр Уві Вже Шап діа Бо БіЖ Кф СІЖ бені ах Жеро ва 41 5
Яоє Віа Їїв Ажц Бах лав БЕУуУ ер бу Мк ар Тк Аів Авю бет ТаХ о 55 Во їхав піж вату Ріж Твж їЇзе бек дко Аяю Аво беж 15 дам Твж Без беж в "па тя ва без бін Веб бай Яшж Їи Ба вів піз йо Тйжх Віз Уві Туж Туж Сбуя що 5
Дів бе беж Жжо Аа ко бе Дер Яех Жжхр Бі бів БА БЖ бо вх
ОО ОО Й ща
Твк щі бек ВЕЖ
Яких: «Зійх й «іх 08 «із ВИЖ «33» Веучна «вве «тй3» йевкий ланцюєю М ОЗ . «ва» я ів ті з5і То ЧОаж БЕЗ Ше» до Біо тає без Бек б: Зак Бкш Ку ря 5 10 В віз вагу Аїв Те ієві Беж Суя зба біз йет сів Ше Уві бек йек бак
Ж Ку за
Жук іа віз їжр тує бів бів ув БЖ 01 бів Аз Бтго йже Бех Шви
За «о 45 тів тую БУ діа бек бек аг Азїв» Тк бі ї3ів Бко вар Аша Ем: Важ
Ба З ва бі Ба Сі Бак Бі Же Ав бУна ЖБК Жямх ЖЖ їз Бек Аж зей Ома 5 та ТЕ йо
БЕЗ Бій Заю Ре із Уві Тує бук Сузв шфй бій Ффек БІ бах ек же 8 5 о
Жхв тье Бе Біу пів Сі Твж Яма Уві і ів Був їщо 145 «Іі З «і» й «ід» ра «ній шручна «Шев «ЩІ3У Жпітов 138-5УТ «ах 9 їв Бе сію Авзр Меб Вже і а
«Ме Іо сеиіївуУ 0 сеї БЕЖ «213» йеучна в жрся «ІЗ» борьфа-сзевуюиайя «аж й
Мах йшр Уві Кре мМеб дув 55 бе бек Буз аїя Пув бію Бі ві У із йів Ай фія муж ЖЕ Суб бів біу Уві йів бій Аївя Вів сізк Тара ав 25 за
Жиж Шев Бі Сіу Уві їже Тук Чаї ж Бех Шув Таж фа іх бі вх ті нів Шіж чеі дів ТВи Уві хів Сів був ЗвВЕ уз Біб іп Узі ТБЕ
Боб В 5 вва ві піт Бі дів Мві Уві Жнх бху Уві їВк Віз Уай Аве Слів Кав ва "то ТЕ що
Ти чаї іа Зі Аза біУу бек бів Аіз Аів бів Тнх (У Ва Уві їжа я з5 туз вер бін інв БУ їде Ана бій йуз бі дія ко ів бів бі Жів
Ж) 355 310 їм біс дже» Ме Жго Маі йдем о Бжо вро Ав Біх Аїзв фуж ша БЕ Жка 115 2 і85
Важ іє біз БіУу Тк бів Авробує біз Бка Бій ДІВ їй їж ща «дій 41 «жвьж щи жкаїш» ВЕЖ «813» бвучна
ВУЗУ ки «ФІ» А-Був-ВАКИ-НАВ «ай
Ме дар уві фін Меї їж 1 Без бет Був Бів Бу Сіль іт Уві чек 1 5 18 3 іа вла дів біс цує ТВж їжа бій бі а3 вія біз Аїв ла січ Був й «8 ЗВ
Те Бу біз Су Уві бе Тук уві і Яех їуе Тк їз бів бі» уві
ЗБ за 38 чві Віз ші ві Яля Жни Ті діа Зі: Був Тнх Був Бім бій в Ж ва Б ко азв чаї Біу Шку із ві чі Трж Зі Уві Жнх вів Уві Аза бів Був 55 7а ще во
Жнива піз біу ів З3іУ Бай хів вів Аіз аа ТНЕ Щі зи ай їв 85 ВХ з5 їз Ар ів їм Аза їше біб Ази Бі Сб Бі Біне беб Зб 3 Бі 308 ак 150 мас узі вза Аа УВЕ Авр Хі Бгто Уві ме Вт із баецв М: Вів ЖчУж
ЗІ їх 125 бі Веб Рко фо біб Сі біб Фук сів зв Зуж Бі йжо Біб Азв Біж 35 555 во йех Аза Бі Бі Бак пі СУ Бех йвоа Кер їі Ме Сб Аа зп Мув 45. 150 155 їй їїв сів Жке Ніз а 155 «ви» 15 «1їз 155 -«війв ВЕЖ ехіЗ» БШтучих «ЖИ «3» А-ВувхВААКеВАВ «авах 32
Має ази Св: ре Ме ув ФіШЖ Бей бек Ме: ів Був Сі БЖ ві твї і 5 КЕ ї5
Аїв вія Мія іш бше ЖВжЖ Шу зв Бе Уві ЖївЕ Біб АЇв Акяа сля йди
КЗ 25 З
Жвж їв Пів біу Жеі Жюва Тух бві б1у беж фе ЖЕ їз біз Біу Же 35 за 45 чві Нів біу уві дія Твж Уа) Зів біз Був ЖВх Туя бів біл в Же
Ко
Ава зі СЬЖ 1у Аза чаї Уві ТвЕ бу Уві Твж ліз Уві Ака Бію Цуй 65 "7 ЧЕ Ей
Знак чаї Пів Бі із б3У Вет Хі А1з вів діз ТВж бі ре чай ци 85 5 з5
ЦЗ Вир бів без Ада Му» ів Аза бів із Сеу Бе беж бів бе Се
ЗНА їо5 34
Мей уві деп й Яке йнр Хі жо Уві дав рЕО шій дев бів Аба Вуж їії5 120 155
Са Меб вже Бхо Зів Шію бів туК біб Аве Як слав Без з бів У ча 35 140
Заг діа пішж біу баг 3 Сіу без Аяп дюв їз Ре біз Віж бій був 45 що 55 ів
Хїж Ши; ТЕр Ні ЇВ 165 «20 їЗ «тії» їБЕ «гі» РЕ овій» феучна «Кей «303» д-буп-ВВАА-НАВ «вне їз
Мах дев ча Бі Мей їйше Зіж бен Лех Меб дів Жлуж іх сф ві Зв 1 5 о ї5
Вів дів Вів БК Бу ТНК пу ія зіу Уві ТНю біж Аля аз бю Зв 20 25 За
ТВк їде Шкс Сіт УВА ба Тут ві 03У Бек уз Жнге дже біз Біу чи з5 чо «5 кі біп ді аії вів Бех ві із Бі ув їж Був Біо Шів вів беж «в Б КО
Він тні Бу ім айв зві ві Знж СКЖ Уві Жнк Аме чаї АВ ів Зв
КІ 75 та
Тнх уві бій бух вла біу бек їїв Аз Аіа Аза ХВх біу Бе Уві Ще 85 За ок
Щув дав сів бе: СІК Ця йля Сів біз біу Аза Бо Біп іш Ту Пе 100 05 38 їец пів йне Маб Бра Чі Авв о їхо дар бен бів дів Тух бій Ме бе 115 їй 125
Зах пін піз піу ух ців айв бук біз Бко сії діа бію Беж да Фу ї30 їз 140 сіж ек ФІЖ Ж тла: дев вер їів Бва біз дів ій Шує тією біо ТЕрВ
ЖЕ За З БО
Бів віх «віх їй «їх з65 «ЖИЖУ Верна ее» ! кО23» А вуй-НЕКЕОВАВ «кава»
Ма дер укі Вів Має їв слу їм Бек Має дів Хде із Сту ні Чаї й В 10 я кіз авта із Бій цуя Тв руж бів Бін Уві ТЕ Сів Азв ів Біб був 20 25 | а
Же бує біз біу Уві Ми Ту Уві бір ех Шу ЇБг Ве іє біу Уві з ай 45
Уаї бів бі» чаії вів беж Уві йів бій ца Же Був бій бій Аїв бек ях 5 кс є
Ніз їн Сі Ст» Кіз Уві чаї яйе Ку уві Тк ййа аі вів ія Був
КІ 5 во
Жак Чаї ко Шім Аля біт Аз їіє Азв Ат Аіз ЖвВе сту їйз Маї Був 85 зо 5 їує дир Фо їні хів бус йів йай із ств біу Жбе рез шій ціа біде
КИ еся Ж
Має уаї Абп айва Твс Авр отія Бто Зеі Дюв ко біб дав бій Аза Тух її їж 125 бій мМаб бхо Бее бів біз бій тмЕ ста дер тую сло ко бе Аз бі ї36 135 зо '
Веж Віз біж ау беж Су Бу без Аям Вже їі Біе піч вія СЕ їде їа5 Ії1Б0 55 160 їі сій Тср Нія біз
ЗБЕ. «ші» 15 «гії» її «тів» ВЕЖ иа» ВУ чия. «иО «2Е3» А-Вун-З020-140 реї-нАВ «або» 5 ек варю УВі Бе Ме цу СУ без Беж Був Кі буз ів Бку ува ча і 5 30 ї5 ів лів Аза бі Буз Жах бує ія СТУ Чаї вів а Аїа Віз АУ Бує хо Кк за
Та був са бій а Без Ту? Чаї БУ Вех Шу ТВЖ Тв сів у У за «й 45 ті Ні БІУ Чиї Аза Бк чі Азїа ОО бує Твк був ЗМ: бак Уві ТЕ
ІТ в о
Ана Же) Бі Фіу Атїв ві Уві ТвЕ 35 Уві Звк Кіа Ущі Ала бів Ду в КО т як
Че таз ців Біу Аля бі Бех же Дія айіїв АтТа Твж Біу Ба Чак їдра 5. Ж З був йяр біп ес СУ цу дям піз біс щію Аїя хо бів Бім іу їв
ЖІН 105 310 іс: ім Бар не Бже Мі Азор Зі» Беж Ай ШіУ БІУ Беж СУж ЗУ ей 3115 ве 325 два Авю хів Бе бів дів Бів бує Хів біз Фер наш шій ай ї55 їжо кеїо» ЯК каз 53 «Тіз» ВА «жі» шШаеучна «пах І «823» бмінокиослети 1-38 алефасннукляйїну «оп їв мак йіш Нів Нів Нав Біш Ні Кіз ів біз СУ все Ме дар чаї Жве ї к ї6б їв ев пує піу Бе Зак бує Вів пт бі Сбру Уві 35 вів йба вів СМ й я о їв ЖвжЕ Му а сау Уві Аа и дів Аїв Сіу Бе Те ілле Сів бу
КЗ 40 ак
ЧаАБ їн Туж Уві іт Бак уз ТЕ бу ПИ СА МВА УА Нів Зі чаї ще Б ща ків Че ме ля ах ба веж Злую кі біз узі Таж Ав Ма Ж іх то же во зів уві Уві їВе піу УБі ТвЕ Аза Уа Аа бів уз Жвк тві би ЩіЖ не ЗАВ 95
Аі« йіУу Бес їі6 Аів із вів ЖБК ЄВУ Фіва Уві Був фа яр Ба їжи 159. ї105 138. с1іу ту дай ів Фе 0іу Аїа ее бів бі Фу Х38 їає 835 Вар Вб і45 а їа5
Вко чві АВ
Іза «вій» 17 «Вії» МНЕ «вій БАТ «і3У жеумня «лаб» І «ВаЗо» мавп іксаюзтанена ділянеа ТС «аба» ї тн Укі іш вів ке Бек Уві Біне КБ б ес же беж Лоякх Є Ох ї 5 315 15 їєнх ше бек бу Тк вів Беж Уві бі Сує Ки їні Бий Ва фе Тук и Ж а
Вхе Акч бів йів їже Ма) бій їжхроБуз Уві Мвройає дія їжа Сіл бек
За. Кв 45 іу вва За Бів бі беж УВК Твк Біб в бер На їуз вар пек ЖЕ й ще ви
Ту Бас їні Бек Ясх Тк Меч ТВ їв Яеж був Лія Вар жук щі Був 85 чо Я во
Нів ін ві Тїжк вій був сїз Мазі Жих НХе бів бі їм бах беж Бке о 5 таї Твк Гу Вас Ре дев Акч б1у БМх був за 105 «аз ї8 киїїз ЗВ жаїаз РЕЖ «ійж Швучна «ай» лабі іненстненвна діляжия НС) сайвоМ ля він бек Те же Біж жа ет Ті Бе Бке Бей Дай Во йвк бак Був бек Тв: Бек Зіж Шіу Тк Аза Вів Іжех БЕ Сув їн За) Му Вер шеж то 75 за їбе ркз біз Бо ла) ТвВх Уві Бех Ткр Ази бек ПіУ Віз тей Жвх бек кі 4й 45
Сіу чаї Ще Тк Бе бко Аа Уві Шес бів Бек Щек ку Шевх Беж Чек
Бо а Ва їе Жех Бех ау уві ту Уві рес баж беж Шеж їжи Сім Те ів ТЕ й 70 тк во
Жуж їів Ста Ба Уві дае Мов Муз реє Жеж йзв їх був Уеь бар Буж ве Зо в і
Ві тав бів жо був Вех Сує Авр обу тн ніз вк Ста Бхо вже був ав їв їй
Бе вів Бе і ів би Сі бі Бе беж МВА Рюж їде фе Бе же жк ї55 ї55 тв рхо Буй АврожнЕ їні Меї Хі бек вт Тато рко бів чі ТвЕ Оув їз 335 348 чиї вії Уві йям Уві ет нів сщфз дяр Бк бів ві Був Бе вт ТЕр 145 кя 155 Кк тек Уві дер піт Уві біз УВі Нів Аяе Ай Був Тк був бхе Ажд г
Її зав ее їч5 ів біл бак бе Беж ТВх Тух Дку Маії Ме) Бес Уві Шев ТвЕ Ма їні 89 і85 453
Вів СБ йвю Тжр Їєвх Ав Зіу бує біз Тк ую Сюшие Му УЗА ее Дав 195 255 ва їше АЬа баи Бо Вів Ше жів бій цує ТБ Ве бас уз Бі Гуя ау 216 рес ав бін Бже Якщо сіц ВЕ Бій чЗві Тує Же їні ШЖкс же беж оз іх ла
Ка а | 3 ай
Має Тж Муб Аве» сів Уві беж поз ТвЕ Свв їмкі чаі ув шіУ Не ТУуж ах кет Кер фхо Яек яр їле Аква Чаї па ТЕр Біб бек дез ніж бів Веб Біл» Авя
БВ хе жа вп Тук Був Твж Жак Рко рка Чаї Без Ар обЗеє ав о Сіх Беж Бр. ЕВ
КЕ ви вх ївє» Жук Бет БШуж Тлна Жах Уві взр їв Бек жу ЖкрвоОМ ів ММ Яанх
Я ша зай
Меві Шбєе йес Суєю Зак Мві Мек Ні біз Аїа Хек: Мія Аа Нів Жуж ЖЕ
Зав З зї5 зо ій Бу бБегє Зеяїі Жак Хе беж Реа КУ еяій» ї8 «ії» й «іа» РЕ «13» Яеучна весревся «Моя» Впітом 1312-3185 МН «ай» ії5
Кіа Бев Ба Авр ї «шій» хо «кі» 3 «вій» БЕТ «і ВКУЧЕВИЕВ «І ух «ВО» СОКі ввженстч: панцюта СМОВУ «оо» 25
«ій с «кій 8 «ар ВЕК «їз Веучев «оду «Вик СИБЯ ежчоснчх лаву МНЕ с«аойж 5 ів бій Тж 93У бак Важ рез Тв ТЕ
Во 5 «Вій ве «віх 316 чаї ВЕЖ «В153 Штучна «ОІВ жкаеї» УНН БМаАВЕ «аа» ЗЕ іш У бів ес йшн Стій беж Сі Бім схе феї Уві бів Бо бі 1 ї З їв їв бах їяч йку Би: беж Сев Ала Ав ех Сі бе УвВх Бе бек Асу Ве 20 55 зо
Твх Ма Те Тер о Уужі йку бій дів ко О3Уу їли ЗЖу іа Сім Шк УнА ав «й.
Жак вів її ве БїУ Ват зе сі; біж ЗЕ ек Гук Аїв о бвро лає УЖЕ ва ЕЕ а їде СІ йху їжлх Бе ві бе вжо вер Ап бас бує Ази ТВх меш тУж
З ТЕ гу тн біл Маб йзо бек їн Ах Аза піз Ажр ТвБж йха ув» Тук Туж сув 85 зе З
Кін їде Яни Тїкр о Аїя вхо Рвє Дер Тут йкук Зі Ав у Чж яз Ме 158 в її
Жвж ЧА бак Бак
МЕ: «ій» 27 «г» ї08 «ВІШх ВВЖ. «ШЕ» Штучна «вто «ща» У СМОВ5 дів вій бек бі» Ре УВЕж Рі бек Асш Ра ТвБк Меб Те і 5 18. «шій» і «ії» ей Важ «піЗ» Шеучна «ВУ «23» СЕУ зажисез нанцюта ОМИНЗ «Ніну 1 віз їіз Зах сіу Бвзж Бім БШіу ШіУ Те Мат бут Аза Вер беж Уві Мув ї Ж її 5
У
«ох 28 «ії» 9 «ії» ЩЕ «213» Шеечна «ВУ» «3» ОВО Зажкора лани ЦВВ «а 22 дів пу вне Тже» Аза Брко бе Авр бук і 5 «кій» 23 «пі» 13 «еій ВАХ «Я» Шеучна. вч я «йИ3З» СОВі нескоге панич Ма «опо» 23 йжц Вів бек 016 беж УВі Бех Ак Як Тук беж ТВ 3 5 їй еіш» ша «вії т «ші» вит «ії» Жеучни «ох «3» ВЕО периюотс панцюта Мана «а да піу дія Вєек беж даху Аїз їВж ї 5
«ца хх іх Ії ев) Хна ЯМж бів бек Бк За ТВжЖ лах беж ат. беж Ше Ж ї Б 10 15 щіз вжи бів ЖЖ їм Бек Сув Ак бів Вик бів Бек Уві Явзх Вк ВЕЖ жи «5 за
Фуж йеп вів Укр Ту в ів Був Ккб ЗіУ Сів 518 го йже їжи Те
З г 45 її Тужк Шіу В» бес дес Ак ма ЇВ Бі їіж Бк» вяр ха КВ ВЕ як їй Ко сії ех сіу бек БУ Те Аво бе Твжх без Тк Уяії бек Ак й б я 7 тв ко фо Ім Авв Бе Аля Чех тує Туж уз бів пів Тук біу Бек Беж бже 8 о ЗЕ
Ткв їх Бе БІУ ів біз Таж їдев Уві їм Те Яви щмю Б «від» жи «ів» 3-9 «іш» БЕЖ «ВІЗ» щеучня «нейУх Що «ЯЗ» Комсванена діялжняа їщсЬ СМ чаро» ЗВ дів бак Хв Пує бі фжо бак їжі Ббе РЕо їні але РЕ Беж Бек бує ї г о 15
Як ЖТвт Бек ШЕУ Шіу Тк Ажфа Аз ів Фі сСую іїша Уві Пузє Авр тує й о. й5 З.
Бе Вкє шлю Бус зі Три ві Зак Тжв дя Бек ЗКУ Вів їж ТвВж Зак
За за «8 іх Уаі1 нів Знж Бве Рко дів таі їн: бів Яек бек Ук їжак Жук Мак о 5 о
Тимка бек йож узі ві вк Маї Беб Яще Шеж бак їні ШУ Таж бію ТЕ "че ТВ що
Жук Хі бує лез уні дян Нів Буре бко Як ев Тік Куж Жаї дар Хує
Й як 22 55
Вт мМаї Щіз Вухо Був бек Сух зр тив Ту Пів Те Суз реко Без су
Зо їа5 110
Бке Аїв бе Зіш Бех ої) СЬЖ БУ Ве Яєес бе бе ем ве вк Бре
ІВ їі їх був вко ув Ар Тато Без Меб Ге бек йо Те Бк зів ва ТЕЖ см 130 3 148:
Уві чі Уві йарм Уві бек Мів Ух бяр Юа Зю ві Ха Ж: бмет УКЕ 145 56 155 Ів тТук Чаї Ашор біу Уві біз вії іє деп дія бує Жве їв Рто Бга ІВ
Зо ї78 ї78 іо бів Тух дай Вес Жвх Тух Ах Уві щі Ват ві їни Тк Увх їж зно ї885. 438
Нів бій Аяр Ткр ен дав Бі Був Бій Жук Мув Схшя БУМ Чаї Бе Аа 195 за а дув він їв Бо АВв Бже їЗе Ше Шев ТвЕ Хе ех Му іа ше У іп реє дея біз ко бів За Жук ТЕ їй Вее Бке бат аку Бів а жаВ. ОО жа5 З
Ме Твк їж дао ів Маі беж зе ЗБЕ був їз бі Був ШУ ББе Теж 2435 289 зв тРЕЄ ек лжр Хі Азїв Уві Фіє ЕВ Фі бек Вей ПКУ бів бжо СЛю Ав
ТЕЗ ЗЕ кто дви Тук уз ТВ Зак вто вро Уві їі вер бек Авр Зі век Ре рве
Же зо тя
Жу Тут Яве пив ви ТВ Уві Аве Му Шес Ак тТжр ка баю б Ве и5а | 295 Зо
Фаї Біне бек Сех Бек уві меж Ні бів Але Тв На Ав. Жів Тує Тв
За з Зі5 а дів іде цех йо бек цей йек ко ЗУ «ів0ж 85 «ії» б «ія ЕК «жаж Щеучня в2
«ЗИ3У Кацвесланевю СОН «ОО» 29
ТНК Увь Ада віз рЕо бек увЬ Бе Хі Бе бго Ехо Веб бар бів бів і В їй і15
Бач їв ах БіУ ТВ ліва бек Уа ві Сув Кайх їм Дает ля Же бук 28 25 за
Бхе Ач біз Але бух Уві біз хр іши Уві дав яв віз їй бів ет 35 40 4йї січ я ес Са Сім бек ні ТВж біз сів Бер бах бе дев бах ТВх
ВО ве БО тус Важ бле Бех беж ТЇНЕ Тяжка ТВЖ Кеш Беж ую іа Ар Жук щі Хляв
БЕ та КЕ во
Нія бує Уві Жук Аїв ув (3 Май Те Не біп Шу їм: беж йеє Бра 86 Зо че чаї ТВж Цев бат рве вай аж Зі бі Сеє о 105 ейій» ЗЕ «вії Б «ії» ви: «йіаж шемчна «ай «йеЗ» Бажекий лданцює варіння 1 СЕ «ов Зо щка ві біл і їнюа зЗіз Бек бі Бі Б1У Бе Мал бів Тнж беж БУ
Бак реч вка Без Бек Сув Азія АБа Беж Бі ре ТвЕ Бе Бас беж ЖИЕ
За із мех тв» їжа тві й палю вів ро СЕУ Бу Сію Ханв біз Тир нх 10 48
Жек Аїа їіз Акц Вех бак ПіЖ дер Ася Тих Авр о Тук Аіж Ашр бек Уві о 5 в їше Біу Ага Бе Те Іза бах Аху вже два Вас бій Аве жве Хара Тужх в то тв во ва бів Ма Авв Бек ев Лич Аів Са Авр Твж Аз УВі Тук Тк Сук в Зо вв аж їде вав ТЕ дів Бхо Ре Мар нах Тхрв Бі Заз БУ Же Бе Уві 120 198 кв
Яр Мі беж БЕ 135 жеї0» Зі «вії» 315 «12 вт «ії Штучна. ве аткя «а» ВажемА пами варізняв й МТ «ню Зі
Січ ві іє їж бах 035 бок бу Зіу біж бас Уеї бів ївк біж іх ї В 10 18 йажх Бляиз Вк беєе Зак сте Аз АхХа беж Біу Рію Тк Ве бек беж Тух 2 25 за віз Ме ТВК Жтр Чаї жу шів Аха хе Бі їшя су Беі під Тер Уві
ЗБ за 45
Жек Аів Кіз Ахе Зак Пі: Бі йар Ас Тит Ар Тук ів Бер Зак чаї що В о ще Зі Вид бе ТНЕж їі Беж дека Кер Ап беж бів йев ТВЕ ба Тух «в та тя но їшх ів Меб дя; Зах їжа ВК Аїа Бі Ар о їнНж дів ві бю їує Сун вк а зе дів їуа дев Тер іа жо Яйе Ажр беж Те О1у бів ЗВіЖ Жвк йеа Уві 06 198 її
Тих Чаї бек вк
Ме «тії» З «1» 36 «Фе» НЕ «Вид : «ТЗ» Шажемй пжеуют арія З ОМ? «ай» ЗУ тів чні бів Тен: Їмн; бій» бек С3ж З3іу Шіж їжі Уві біж Явж Бу Бу ї 5 кто 35 бек баз айс би баг Сую Аа Аїа бек Фіч Віа Тк Біб Бех Жах Тух 29 хе За дів Мей ТБж Ткр Уаі йга бів вів Бе Зі Буж БЕЖ Тех Б Тер'ящі
ЩО 45 дек вів Її йо Взк Ні 0ХУ ев о Ака ТвВе бар Тук Аз Аяр Бех Уві о 55 що та біт йжа ЯбБе Ти 315 бек виш вар вп Чек «ФМ Аза Те о Тямх Ту 5 7а ль во їво бів Меб Дей бак їае Ар Аїв Бі: Авр Тк Аза Чаї Ттрж Те Сев 85 що 55 дів їдкя дав Тсв лів со бе вар бах Тжрв о Сіу Сі МУ ЧВЖ їжео УВА
З 105 310 тн Жеї бек Бак ії5 «жВОх 33 «щії» її «ЕВ РЕЖ «жі» Шетечна ватажки «833» СИ й важкоу шани ввріжкеє 1 М «НК 3 дів їі да Яекх Вер ШіУ Аяр Ак ТВЖ Авр Туж Аів Авр бах Чиї їдне ї 5 10 15 ет «же 34 «вії Ж «білу ВЕЖ «213» Штучна «ах Щ «223» ЄВ 0 важкого Явнцюєа вжраанев ж СМ? «400» 34 діз їїз вто ех бів бу Аяр джу ЖНж ЛароТух Аза вАшр ах т ех ії В 10 ї5 у «ФВ ЗБ «ії 17 «иа» ВВЕ «ії» Беучив «Й «ЖЕ3» ОСОБ а важкотга явнцюже варіант З ШУ а За ів Кі Ак Беж Ків у Авр Ах. Тои Анр отут Аїа йер бах Майї Шув і 5 їй т еку «-т1йз» ЗЕ «ії» 5 «ій» ЕЕ «аб «виї» шпітой Зв'явзувании Зий «оп» ЗЕ дна бів Ала Ффук БІ. 1 в «вій» ЗУ «її» аа «кій РЕ «жі» Веучна. «ай «225» Бета-смиуклейи дюдиние «ай» 37
Меб Авр уві Ере Ме кв 3 лим: Бек ВН Аа бує Фі бі Май Чаї і в 19 їв
Аїа йтя вів (із бує Тпж їлув хол Бі жі їж Бі Вів йіж 135 їж го 25 зо
Тк був бів бут Уві Ппей Тужх Уві бі» бек ув Тих Бкш бів біт чаї 4б й чаї бів СЕУ Маї Аза Яви ві Аїж Сб їде ТВЕ Ште Фіз бі Аїв Вев
БЕ З що нів їяєс пі біж діж Уві Віа бак біу Аїа біЖ вяй ї1е Аіз аза Аів а 7 7 ва
НЕ СБ Хо Мі. ож йже а бала Бе Бк Зо Ав бані Хлкв фею» С 85 віз ща біз Мак іш аж сін Азфа Аа Сім бів же їн їі Ба Бк іа бе 1050 зо 3118 бін орто сля сті бій Беж Тук бів йвв БЕ РЕ бів Ст ОД уж бів 125 120 125 бій Тук шій хо бти Дій їз «каїкж З «ній» 57 «шій» БВЖ «вії» шлеуєчна че «й» Ганюасомнукнляейи люди асо За
Маж дер Уві Ба бара Шев Су Бе Беж їз йка їде бів сію ах вах 1 В за 18
ЯМУ АЗа ші Щі Жее фе жара Се М чі Фев іш Аа Аза б Пув хо КЕ ха
ЯвЕ Їде Щаез Му Уві веж ТУ ві біж віз їлюав ТВХ уз Зі Ав Ух зв 45 45 теві дів Яес Уві Тну Яех Уві Аз піз їшв Тх дув бів бій діва дев
СВІ ОКЯ во із чаї бек біз дів Уві Уві Як беж ві дав ТїБки Маї діа ТНж Ши
КЕ У во
Жве уві за біб Аівз біш дев їїФ Алв Уві ТЕ Ваг Бу ві Уві Бе ва ва ще
Ба бів дер ха Аку Бте бек Аза Бхо біз бів бій бе би Але вк
Мк вв їх
Хе бід фу біж біз Уві ія бій бів Афа бів бек Біу Бі вар мо ї2о їж «діб» 35 «тії» 345 «ій» ВЕТ «КА О НІКИ
«о «й23У Оброблок вльфа-синуклеїну дня званлького макаюв «00» З
Бе йвр о яі Бе Ба бу ау Кана Яег Гуз йіж Сує біл діу жі м ї в. їй 15 ізн Аза Віз із Муз ТвЕ бе Фів біу Уві. Аів сла Вів Аїв ЄВУ ув
КУ В жа тТНЕ щу ШУів су ЗА їжвмо ТК Че бі бек їхав ТВБх ЗХув біз і чаї аа 45
Чаї ів БЕ Уші Вів Те Чі із біб уз ТвЕк Був Сі ББи ві Же
БО 55 що
Аза чаї сі Бі віз ві УБі ТВ БІК УВА ТвЕ АВ зі Аза бів Бе ве 7 7 вх:
Звг ві ше Бі Аіїв СК; Ве їїє Аів Зі вів ТЕБЕ шБи Біне Хе їлюВ
Ех що За
БКуа дер шевя З Сі Шу Ве бів Ба у Аха Бо бю» Ма Фу ЇЗе 180 ї05 138 ії) Сів вен Мак рез Уві дар бже Аве аа щі ів ЗУук із Ма жо 335 155 їй йог Зіч оз сіб ТУ сій Лев тує ів Бже бів Ба 155 ї35 140 «ії» 140 «ей КЕ «ій» Шеучна се «аа» Среоної люка нну для їка «аа» чо
Ме вар ві ре Мас бив СК їх беж дув Ака Га бі беж Уа мі 1 В ї6 15 дів він діє йтя фуз ТВвх Був Піп ші Мві Аза біз йів Аля сіж Був 5 зв трж Хе діє біж бай йеб Тух ві біу беж йух ЖК їж МЕ жу в
З ай ч5 і ів Плу чі ТвВж Тек Уві Азіз Чі: бує їж Був Ма С3я ві Твж 0 Ба «а дав Чаї су біжЖ вів Уві Уві Тв бів бві твт Аїа ув) Аа Ка цу що та З5 во
Зве Уві Б5із Біж дів сіу Аза хів дів йів дів Жах Біж іє ві їду ве зо щх
ТУ йяв біл Мей біу ше Бі ББо бів Біу Тек ре бів біль Ж хі їси зах їх їз біз дев Ме Ро Ма) дер рко беж Зек тм Аіз тую із Меб Бее 115 190 885
Ясе ББа ів БА Жек Фів яю Туж бла ко Січ Аїв 3 із35 їй «наш 4 «її» 40 «йійх ВЕЖ - «їй» Щеична «ве «Ійаз бртолог адьйа-сннуклаїну для мищі «в» ЗЕ
Меї йяв уві Ре Має був Шіу їз Яву Муз діа їже біз біх уві Уві
Ж ж 18 15 йіа діа Аїа біз зу Хвк був бів Сту Уві Вів бів бів йіа Сіу бує 8 25 зо
Жвт їз бів біу Уві во Тук Уві б3іу Ве їж Твж Був біз бі зі
Зк ча КІ чаї Нів діє Уві тн ївж Уві Аїш бів був Тк був ОМ бів ві Те ве я г
Де: ві бі Шіу діа узі Уві тве пі Уві фа Аза баї ів бїпо Був я та 78 во
ТвЕ Уві біз БіУ Ай щіуУ дак їіз Ді йів Аза Жвж Сіу ЕБе чЧві Був в Я 5
Бут див» бій МНеб бі Був бі бів бін Б1у Тук жо бів сів Біж Зіїв 150 105 115 їве Із вро Ме Бе уві Авр Вто Зіу бек Сію йів Туж бів Меж Бе ї1ї5 ї28 ів
Бек Ди бів У Ту БІЙ без ТК бін Вже Бе вів
ЗО Я 140 іх 45 «иіж чав чиїй ЕТ «йБ» шеучна, се «вах ще 94 «ЩО» ай бі. Мві бе Хе бві сіл бек бі щі» біу аа ві бів Без бі Бі ї Е 18 45 ее їн Аве ії Вак сув лів Аїш Нет ЗІ; ва ЖЕ Ве Вес йев» ЖЕ о ЗЕ Зо біЖ Має Вех Ткр Уві Ага Сів Аза реко БЦ був Бі Фев бін Ткр Зла
Зо Кун. її вів ше їі ек век Сі ОКУ У бек ТЕ Ту Жук Вжо Вер бив Ух
Б ях ко їтув ЗІ йже Бе Як їі бек о й барв ба Аів був бяв беж жнюз Як ще І ККУ 5 й їх піп меж Ази бек їн дку вів Біо вер Твк Аза Уві Тух Ху був
ВЕ та За дія вго Біф сіу ів Фіу ї3іє Вер тує ТюЕр біжу бів біт Те тя У81 о 105 їко їве УВА Мох шк Аза Ве Же Бу ЗКУ Бже ех МЕ Рре БЕб їні вка 115 120 3-5 реа бек веж був Зак Тс Бех Ст Му ЖЖ й Аза Хе СІ бує фа 130 ЩЕ ї40 чаї їжше вав Тук Вб» фже при ко Май Те ча йех ЖЄкр дае бек Фу 85 їБо ке їва віз йіяа їбБе Вес бі Уві Нів ЖВх Бра Бе Аза Уві тяжі Бів бек беж і85 АТО їтя
Піу Без Ук беб Інв Ва Ват Уві уві їж тазі Ехо бе бек Бек Беа ї86 зва о біт вне біе» Так отбух Її без Аяп ові два Міз їв бБже Бее Ав їВЕ
Ой | «5
Ще ті дар Був Ве ах СМ Вже Твув Беж св Лв; Зара ЖМи Між ва а хі5 хи О бе рес рже Суз ЕКО йіж рима ОХ Зв їже Зі ОХу Бке бек чех фр ей що 235 жо
Шез ває Бус Бр цуя КБжо був Ар УвЕ Ву Меб її Бек Вгу ТНЕ Вко з ТЕ аа па чаї Тк су ех ві ві ар жа ек Мів із бер Бко їз Ма
БО 265 жо їтув Юне Аа тТев Ту Мі йерофіт бай Фа УБі Нав бат ів їде ТЕ жів зва 285
Буа фко вюе цію сій ій Тк вве ЯЗво їх Тук и дку Уві Мяї вак чі
КІ ще З їжа Тв УВА ЗИ нія Зі Кер їкр ес аж Біт Бує За Фут беж сев
З5 Зо ЗІБ | а
Ж Чаї Беж йдем Ди й Кк Шюо Ві йко її 019 їде Тве тів беж зи З ЗБ
Буг вів Буя БІ сій рого йсу із Буо біз Укі Жук Так їм ко ка зай ЕВ. За
Яех вхо віз бів ве Твж Буз Авп Кз Фі Зак без їх бра Бан зві
ЗВ 6 ЗБЕ їша ЩіУ Ве Тух Еко Зак Ар Кі Ака Мел бі Тер см ее Аах
КУ З ЗНО біз Вт біз яв Ази Туж Буя Тк Твк о Бржо Рез У) Без Ар» бек вер зве 31) з955 Ж іт беж Бе рРіш бе; ТУЖ беж фу без ТЕ Уві АЖр вує бек БЕ тер 445 «3 415 ів дія ЯіУу дае Уві Ввє беж Суб бек чаї Ме Бі Фів Ай Янахм Вів: ай 25 438 аяв Ній Тук тн Сів був бак йеа Бех інт; ет Рко біж Му «38. й їх
«15» 43 «її що «ваш ВЕЖ -аї8» юку «га «айае с ва «во» ЯЗ
Кер їїе Скай Меж Тв» бів бак Рко бег бат ів йех Аїз Ве Уві у ї 5 щи я дер Ки: Чаї ЖнЕ її Вк Су дев Бек її бів ТАЖ без їн Жук бак за 25 зо
Вех вт бів із дев Зужк їв Вів Тир Бра бів бі» буз рез біу Був за ча 8
Вів вКо був те ле Іво Тук Тїхв дів бак Хі АК Був Бак бі Ух
Я 53 рко Бак дха Ве Бес СКУ Ос ім бак ЗіУу Тж Аяр о Біна Жах Гама Ту: як ча ТУ 5 їзв Бак бар їв іа РЕ біз дер рез Ав ТВЕ Жук теє Сув Бій хе г ва а
Туг Туж Бетг тую Юре єв їв ЮВа іч Біт біт Жах Був Пе Фіз Хіж 185 05 115 щУв для тТнНе чаї вів ів ко бак ві Же їїі6 Ба Вже Его бек кв ії15 Уа З біл пів ізо вує бек Піу ТВ йів Бек узі Жаї бує ме рем два дея вс аа ї40
Рів Вуж Ро дже БМ: ака Беж Ма бів ев Сеє Чаї Ажр бра йія Та 145 50 їч5 Зо біт Вех Біу Аа Бек Бій Ба бе Узі тат бів сів ве Беж був Ашр 185 зо їв
Би ТВж Тут бБегт їж Бек Жех Тв те ТБ ви бек о жую віз даю Туг таз і88 іо бів Був Нів їж Уві Тут Мія був пію Уві Твж Нів бій БУ Бей Зах
КЗ га иа бак рто Уаф ТВ Мув бе Ре Ав Аа жі біз Сук 218 715 У

Claims (46)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, де вказане антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, специфічно зв'язує щонайменше 4 амінокислоти із 112-117 (5ЕО ІЮ МО:9 (ПГЕОМР)) альфа-синуклеїну людини (5ЕО ІЮ МО':10), яке містить:
(а) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:1; (Б) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:2 або 5ЕО ІО МО:33, або 5ЕО 10 МО:34, або 5ЕО ІО МО:35; (с) СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:3З; (4) СОК!І легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ХЕО 10 МО 4; (є) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО 10 МО:5; та (у СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО 10 МО:6.
2. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 1, де (в) СОК2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:2.
3. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 1, де (5) СОК2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО:33.
4. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 1, де (в) СОК2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО:З4.
5. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 1, де (5) СОК2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО:З5.
6. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, де вказане антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент специфічно зв'язує щонайменше 4 амінокислоти із 112-117 (5ЕО І МО:9 (ПГЕОМР)) альфа-синуклеїну людини (5ЕО ІЮ МО':10), яке містить: (а) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:20; (Б) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:21; (с) СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО 1О МО:22; (4) СОК!І легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ФЕО ІО МО:23; (є) легкий ланцюг СОК2, що має амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО 24; та () СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:25.
7. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 6, де щонайменше 4 амінокислоти із 112-117 епітопа являють собою амінокислоти 112-115 (5ЕО ІЮО МО:19 (ПІ 'ЕВ)) альфа-синуклеїну людини (5ЕО ІЮ МО:10).
8. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким з попередніх пунктів, що містить інтактне антитіло або складається з нього.
9. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким з попередніх пунктів, де моноклональне антитіло вибране з групи, що складається з антитіл підтипу ЇДдДС1, Ідс2, ІдоЗ або Ідссаі.
10. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким з попередніх пунктів, що містить антигензв'язувальний фрагмент, вибраний з групи, що складається з Ем-фрагментів (наприклад, одноланцюгового Ем і зв'язаного дисульфідним зв'язком Ем), Габ-подібних фрагментів (наприклад, Раб-фрагментів, Рар'-фрагментів і Е(аб)»г- фрагментів) і доменних антитіл (наприклад, окремих варіабельних доменів МН або варіабельних доменів МІ), або складається з нього.
11. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким з попередніх пунктів, яке являє собою людське, гуманізоване, рекомбінантне або химерне антитіло.
12. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 2, що містить важкий ланцюг, що складається з варіабельного домену за 5ЕО І МО:7, і легкий ланцюг, що складається з варіабельного домену за 5ЕО ІЮ МО:8.
13. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 3, що містить важкий ланцюг, що складається з варіабельного домену за 5ЕО 10 МО:З0, і легкий ланцюг, що складається з варіабельного домену за 5ЕО ІЮ МО:8.
14. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 4, що містить важкий ланцюг, що складається з варіабельного домену за 5ЕО ІЮ МО:31 їі варіабельного домену за 5ЕО ІЮ МО:8.
15. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 5, що містить важкий ланцюг, що складається з варіабельного домену за 5ЕО ІЮ МО:32 і варіабельного домену за 5ЕО ІЮ МО:8.
16. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 6, що містить важкий ланцюг, що складається з варіабельного домену за 5ЕО ІЮ МО:26 і варіабельного домену за 5ЕО ІЮ МО:27.
17. Фармацевтична композиція, яка містить моноклональне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів і фармацевтично прийнятний носій.
18. Нуклеїнова кислота, що кодує антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь- яким з пп. 1-16.
19. Застосування моноклонального антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за будь-яким з пп. 1-16 в терапії захворювання, опосередкованого альфа-синуклеїном.
20. Застосування моноклонального антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за будь-яким з пп. 1-16 при лікуванні синуклеопатії.
21. Застосування моноклонального антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за п. 20 при лікуванні хвороби Паркінсона, ідіопатичної і спадкової форм хвороби Паркінсона, хвороби Гоше (50), хвороби дифузних тілець Леві (0 ВО), варіанта хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (І ВМ), комбінованої хвороби Альцгеймера і Паркінсона, дійсної вегетативної недостатності або множинної системної атрофії.
22. Застосування моноклонального антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за будь-яким з пп. 1-16 при виготовленні лікарського препарату для лікування захворювання, опосередкованого альфа-синуклеїном.
23. Застосування лікарського препарату за п. 22 при лікуванні хвороби Паркінсона (включаючи ідіопатичну і спадкову форми хвороби Паркінсона), хвороби Гоше (50), хвороби дифузних тілець Леві (0 ВО), варіанта хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (І ВМ), комбінованої хвороби Альцгеймера і Паркінсона, дійсної вегетативної недостатності або множинної системної атрофії.
24. Спосіб лікування хвороби Паркінсона або іншої синуклеопатії у суб'єкта, при цьому вказаний спосіб передбачає введення моноклонального антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за будь-яким з пп. 1-16 або фармацевтичної композиції за п. 17 вказаному суб'єктові в ефективній кількості.
25. Спосіб за п. 24, де лікування є тривалим.
26. Спосіб за п. 25, де тривале лікування триває щонайменше 2 тижні.
27. Спосіб за п. 24, де суб'єктом є людина.
28. Застосування набору, що містить антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким з пп. 1-16 або фармацевтичну композицію за п. 17 в терапії захворювання, опосередкованого альфа-синуклеїном.
29. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким з пп. 1-16, яке помічене за допомогою детектовної мітки.
30. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 29, де вказана детектовна мітка являє собою флуоресцентну мітку, хемілюмінесцентну мітку, парамагнітну мітку, радіоізотопну мітку або ферментну мітку.
31. Застосування моноклонального антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за будь-яким з пп. 29-30 або фармацевтичної композиції за п. 17 при виявленні наявності або вимірюванні кількості вказаного альфа-синуклеїну в головному мозку суб'єкта.
32. Застосування за п. 31, де вказане виявлення або вимірювання передбачає візуалізацію /п уїуо вказаного антитіла до синуклеїну, зв'язаного з вказаним альфа-синуклеїном.
33. Застосування за п. 31, де вказане виявлення або вимірювання передбачає візуалізацію ех умо вказаного антитіла до синуклеїну, або вказаного його антигензв'язувального фрагмента, зв'язаного з вказаним альфа-синуклеїном.
34. Застосування моноклонального антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за будь-яким з пп. 1-16 або 29-30 або фармацевтичної композиції за п. 17 при виготовленні лікарського препарату для лікування, діагностики або візуалізації синуклеопатії.
35. Застосування моноклонального антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, або препарату, або фармацевтичної композиції за п. 34, де лікарський препарат призначений для застосування при лікуванні хвороби Паркінсона (включаючи ідіопатичну і спадкову форми хвороби Паркінсона), хвороби Гоше (50), хвороби дифузних тілець Леві (БІ ВО), варіанта хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ВМ), комбінованої хвороби Альцгеймера і Паркінсона, дійсної вегетативної недостатності і множинної системної атрофії.
36. Спосіб лікування, діагностики або візуалізації хвороби Паркінсона або інших форм синуклеопатії у суб'єкта, при цьому вказаний спосіб передбачає введення моноклонального антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за будь-яким з пп. 1-16 або 29-30 або фармацевтичної композиції за п. 17 вказаному суб'єктові в ефективній кількості.
37. Спосіб за п. 36, де лікування є тривалим.
38. Спосіб за п. 37, де тривале лікування здійснюють щонайменше 2 тижні.
39. Спосіб за п. 38, де суб'єктом є людина.
40. Застосування моноклонального антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за будь-яким з пп. 29-30 або фармацевтичної композиції за п. 17 при виявленні наявності або вимірюванні кількості вказаного альфа-синуклеїну в головному мозку або рідині організму суб'єкта.
41. Застосування за п. 40, де вказане виявлення або вимірювання передбачає візуалізацію /п уїуо вказаного антитіла до синуклеїну, зв'язаного з вказаним альфа-синуклеїном.
42. Застосування за п. 41, де вказане виявлення або вимірювання передбачає візуалізацію ех умо вказаного антитіла до синуклеїну або вказаного його антигензв'язувального фрагмента, зв'язаного з вказаним альфа-синуклеїном.
43. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким з пп. 1-16, яке було отримане або вироблене в клітинній лінії, такій як клітинна лінія людини, клітинна лінія ссавця, відмінного від людини, клітинна лінія комахи, дріжджів або бактерії.
44. Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 43, отримане в клітинній лінії СНО, клітинній лінії НЕК, клітинній лінії ВНК-21, клітинній лінії миші (такій як клітинна лінія мієломи), клітинній лінії фібросаркоми, клітинній лінії РЕН.Сб, клітинній лінії НКВ- 11, клітинній лінії САР і клітинній лінії НинН-7 людини.
45. Моноклональне антитіло за будь-яким з пп. 1-14, що містить константний домен, визначений в 5ЕО ІО МО:18, і константний каппа-домен, визначений в 5ЕО ІЮ МО:17.
46. Моноклональне антитіло за будь-яким з пп. 15-16, що містить константний домен, визначений в 5ЕО ІЮ МО:28, константний каппа-домен, визначений в 5ЕО 10 МО:29. Ямалегня С Претожеж 0 Ліні мя | ш гами фібрнль пожнороюмійн | Повний ОНСог Вам ! : і ного альфа снвжкневих Ва'ювнану І ' Хорні, Фрейнна і . і неповний : ' | які чергуються З адчюванх ! Фрейда. ! ! у яльіресвнуклетноне 1-60 ; знефачннукасіном 14115 | ! і ї Я Н ТЕМІ Повнорозмірний меної 0 Повшжй Нева ! мер пиьфа-сниуклсїну пдонжнх ! ОДИН, зв яЖН Фрейда І стідеють фібри або неповний І ' мономер адювант !
Фіг. 1
В у охлоу Графік клітинної лінії " Б СВВБО04-А-ЗУМВАР 7-4 "Ж му Дн аск дя хх Св: З 2 ; Я Щи мм ЕЕ ет / жом ЕЙ й ве зо / в ЩЕ: й й -5 3 - Конц.
Фіг. 2А а-Синуклеїн людини 28 р | пев скла Р ц / Ж 18 / Е аю / и й щш о що ж Час їз В-Синуклеїн людини «х ! с в юю щ ж ю
Фіг. 28 а-Синуклеїн макака зо я ромен я х и : й ше ше ше шк З у-Синуклеїн людини Ще ! Ме ! х 0 й 3 жен вени і и що ! ЗЕ і й ше ше ше Час Кг
Фіг. 28 (продовження)
о-Синуклеїн миші ши нн ви ше / / а б що ще БО Мас (сі
Фіг. 28 (продовження) а-Синуклеїн людини ААУ: вОо-ВОВа- 206 що Ко х пи х ЩО ще пн зе і за Ї же зе | . Ем їе ве Е ою ще Час (с)
Фіг. 20
В-Синуклеїн людини В-ЗЖМ: е-8004-285 аю ! «ло зе - 2 ж ща : зво і чоо !
а. ї метр панно Ї дня нн діння Я ! 8 ще ах ва -а чес зхе Ки чав че за Чво (6
Фіг. 23 (продовження)
а-Синуклеїн макака А-ВУМ-МЕ: Ізб-5004-285 вв : ав І аа зе щ вве й | ення ннніннтннсьнст хХ зе й чай ; ; ще ою / зе , а ! Час іс
Фіг. 2С (продовження)
у-Синуклеїн людини с-5УМ: юдОс-О0є-ов85 в: хо Ка зи є та ж зла а 1 о ФК пеногенсненноеккклкюннняя котне и КА А В в Я -а - ще щ-ее о чо ще ще Час
Фіг. 2С (продовження)
а-Синуклеїн миші ААБ'МАММ: 9-8004-385 вдо ! 4 зд зю ШИ зло / Я зе / ! че і; ме / ! в вдо я ! до !
Час.
Фіг. 20 (продовження) А ко | 00 ям 07 мас г
Фіг. З
І од Б ту оо ее зей ех Вей її еЇ КОоНИ. р ни шві С СС ЕЕ СЕ НН ії Віибі-яО04-037 | ї : ев о 00осееюгео00овмо важ А й С г є ц з
Фіг. З (продовження) я ЗК " ! Еш Мен чені В ї У покослсоевйн Є ої Бж п що о М ки оС вв й У В й У з з з щ СУ зи Зк ІЗ зе зе Чаш Щи
Фіг. 4
В В р: Шен з сакняння в жк В ж, в а ве дей ва і їль Конц. Назва 000 КАО/МІСО Жов зл ВИК НИ АННИ ЛИН ААН
Фіг. 4 (продовження) во Ей - 1 нм ! и - і Й нена ставте з й , , шк і м й- І т х г ТЕ 3425 "М о Мас а Фіг, 5 вою Б) В а й т-ва ва і ет пи ооо нини по и о іі ооо ой ше киш пи а: емо: | лав ЗВ 0 я92 051
Фіг. 5 (продовження) носи ПиХВКЕУ УВК МОУ УМА КИ, МОУ гЕсТН Ася ТОУХДУВОКІОМО ІАЕ У АКОШІКНЕВОД ОКО виш о ши ї БЖ БЕ
Фіг. 6
А ж ІННИ НННИНИНВИ щі ШИНИ. ж ВІННІ ; ок аа ин Б НН боковій вав ПИВІ Іл Ин ни МИ лання В ши нлннлнлншнлнНншнлчнжнчнжлчжяшячяНляжяшяшнНляНННН : ЗЕНІ пон ве як як - Ще : ! с Як і ж Ву ! . т Я Її и Б я ей я Ко ' ' зада: -- й "В Е і с шк ї я еЕ . -- В За з | се - ! - || я | Е -к : -к ! ! як М і ЕЕ ш щи шими ж я пр аа ча оч че ча че чи Шик й ем ем й ей и ! ! ке, ; ж М ка а є ШК ДИ тки ка киш и А
Фіг. 7
МИХ ЕККВЦОКАККО С УАНАВКТ ВОСЕНИ КО УАЕК ТВО ВНУ и ї не Б мо во м Б Б І зо м о НТ ве зва
Фіг. 8 У зятя ія Супернатант 8 з а - Бек дк Мо жк ши ши ше ше шк и Ше ДС «а шиши : я «тв з ек те є п с
ЕХ. хх що "БО ПИШНА КО НВ ща с «щоб й З З шо Ф До Б В азув ів ЛАМИ НН ПН З Знй КЕ Ат о В пе СН я ще ; 7 Б 0 ННІ
Фіг. 9 пе
«ши. ! ве нннтнни ВАРЕНЕ (ля ЗІ М сс ЛОВ Є о-у
Фіг. 10 А Кондиційєснане середовище Клітинний лізе : х с г. зд ІНН Я о ве ФІГ ТА
37. В аа 0005 ' ше ше й Нв ве як важно М з 000 вВюЮ о зма 00485 - нен нт Ввуав Бехавхи М
Фіг. 118
Фіг. 12А
Розчинна МВ: Н а-зуп ре-а-зуп М а-вуп : с ! . о ши. оц
І . і оо .-я ДА а. «к є а ух пишні шин ши ох З Шо БЕ 855 5 в о «5 ХЕ КУ В з БЕ, ах 55 нн Е ок НЕ: 55 п шк в
Фіг. 128
Мереозчинна Навувп вальауй М а-зув 0 й, 0СЖЦС(С (С її ! сояаувп воФ В хх В з Ку й Ж Є й - е Кк: Зк З Б 5 88 а 5 2 т ж: ї З г Б я 95 х 55
ЩЕ. що «о Ме Фо ж 7 ВЕ її
Фіг. 128 (продовження)
знокнне вит нин, Кеди ЯК я т . КЕ ач і ГУ а т їх : вк й з ві с В ЗЕ 4 Ї нт Й ооннниннпнютпнанноттооаннаннссс нини нн, і ж не й с: . Е З ї ТЕ че ІЗ ее х : Х: х в ве Е У : х х ; Як ; ж. : ин ки ши п В В СОС і щі Я їй ча г - ром
Фіг. 1260 тт : За З че ! : шко аг КУ ! КЕ: х ЖЕК х і Її : ах КЗ З З ш зов І ї й З : чн и НЯ ї рев І КА В ; Е ши ШИ. Те ККССС КОСООКОСТІ КК пат ЖК КК КК КАК КК АЖ
Фіг. 12С (продовження)
Мвув -4В12 г х НН ставув веідовув - абО1553 ОО ПО А с 00000000 Мувтимеря с Р вбльвув нн ВО КН ЕЙ А ох НН г М. рвчьнув Е ок 5 в'я 5 в Бо | і ж Ж | і і н ш ши: ї- ві В. виш шишешишишинени і у Ї Н І і їз Бех Н Н ши жи ше щи ши ше шви шишки ваш Розчинна МНерезчинна 7 Нейрони к очищені. ще Сон ВВ равтювальні Частинки сс
Фіг. 120
МНеупо ія ОО ОО ОО 53 ВУХ Е КК ХХ ХК ОХ ОК КЕ ЗК КОМ МОМ Я с Б ; о. екемн КЕ ВІ с о г сут ПО о. ХК фснннннннкню: Ме ВВ нан я СЗТ АЄ 11111113 бльтимерв 0 ВИНОЮ Б: ЗНМ НИ НН ЗНАК; т Ж От ЕЕ ши ши ши ж з ше ЕЕ: ВЕ ПЕН МН Ж: НИ ; : 1 ! ке ож : Не ІЗ їх їО Н Н 1 же Ж : Н їж Ії Ж ї Н і ЕОР: і шк Б. : ! ше шен Е ТЕафЕрення е вича яннї Ї
Фіг. СО продовження!
хіх Кахнтлереинин віданні еве ку пед т ши їн Її Же ке й Й КЕ и Е я
В. ва Ка
Е г. р «дяк. ї Я - яв і ва ви ний Как да і и й НУ раки і КІ у «В засне ще що 1 5 8 5 Б в Б що В Звгпчевнв внністя» ства СР
Фіг. 13 св ес сяк ЩО сервлтадени; ! - 4 о сера : ї й ї : | ії нев ни д щ ї в преннод, У і. у не и і я. я г і і . ой во а г Вт налу ятнй г. Ж щ Б б що з б 8 зе у вунауляцй иа
Фіг. 14
ЗОЗ Ру ВоІНЯтонтьнк ВфУЛИНВІДОКО ЗКУ - ВИДККОЮВЕННеКі ОО Тех ЗІ Я чо і КВ Зв Я СН Бош Що ох . х З ПИ есе ре ЗМ Н В В о " й в а ШЕ : | ра я БО р З ше ши і и . во дн о ШИ ! й Ме й і Сай : ЖЕ Х . а и й в нн жк зх хе ще з Кнрекнк в ет ковані Тен
Фіг. 15 «він Пероняоія зсррте як прута я Р кВ: жа що ково ев ж РКО ВК ей ФВІКУО уж. ВАННЯ Тека Ж рН ВЕ. х ТК манеж нИВЕ ОМ веду ж дкоценН тт а о і ев й й ; ее Ко і ва З » ; - З й й 7 з й оті і ф КІ ща 5 з ЕК че За ЗК Ба ев вкучнязнії (кн р
Фіг. 16 міжкродіапів з ї У жа їв ше нн І У спщои Я є -- я сяк Вінтєніну Де НЕ те ї5 8 ЖК о Ше тек пана Й па КЗ Е | вв. ін'єкцій М, А. щи ре р, її рт х Ех 1 х Я КІ Ж Кк 5 ж як у ТЯ " хе г ЯК ен п о пою пом новово пелн змив ово поча почає почат топ йтод бо Вод ТК тод ковий ховви кажнй Час (одини) Мікводіавів ян У ох Її її з пи чо т дв-Актянв до НЕК. ТК ? ; раль ; Ах Анти ДО МЕД. Я КЗ і ; діт Ез й ? ца М р сор сяк ВКА тей х і. й ія ї ; хо Ір ін'єкції ХЕ в ЕЕ є УЖ дю «Ж з НН ння пф поча почаї: чочаї: бод год бо тод год хоВни КОВИЙ БОВНМ ре полин)
Фіг. 17 Введення анунзійа. 15 му/вг а. денчі на тиждень ддностовоння Твст на асиметричність ін'єкція ААУ передніх кінцівок з Е . о р ЕВ і Бех 50 : вин нн нан Ех І ії вах о щи
Я. ДО 110 рення нини ж Шо с сонні внне Еш шини ше 51 о ЕВ ШЕ З о наше шини ши ши ві і ОВ, ВО Я зак і СО Х ЕЕ ОО жав | ВЯ ВО ОО ш й їй й пфркннокх ОХ ан нон нн нн нн ення ни г щи і СЕР РО а-куп РА -мМ37
Фіг. 19 Введення антизіва, 15 нік іа. або ЗО микт Бр. один ва на тиждень Її ших: ШИ са, Гістопогія і'єкція дибрии й неннуктнну Підраковування
ЕК м т- НО а о г зав й ШИ ва : шо 7Ю- шу З во 17 : гад Ж щ- йо ! сх ко ! ж З Ж ж щоя 5 Ї кг Б « Я зе ет я з і х КІ ва дичини ен уроннорннренну» де т м" е ще ще т. а - ей ж КК о Ко як ак п К й СМ 37 р СМ 37 м ЗО мг/кг 15 мг/кг
Фіг. 208
4.0 її
Е 3.5 ! - Зо я 54 25 к г 2.0- ш ' н в є 4.6. ГЕ ш і-й 10 05- МУ р ВВ В м роюли Ни-озб1-037 Нінюб1-037
І.В. І. У. (30 мг/кг) (15 мг/кг)
Фіг. 200 є ЩЕ ї Е ХХХ КК в за бо о «8 м. ою ях - ЕВ КЕ ї нн Зеник З Ж. ї3 ж ше денаненннннн НН а 41 о «ВЕ ЕН Е «и ЕН ННІ Зро 0 РВЕ 37
Фіг. 200 ж че а « ж о ве в 8 ШЕ З т я фоОожоОох о о в в З г: ж 8 є киш а Б а м м м ої КЕ її вв в в в з ж ожо зв ж ж ше " м м ай , Е що Е й до о 4 Шк 5 ШИ: о КЕ ЕЕ є Кк жк ж в в в 6 7 тот т в шої» ков дк ШЕ, ка ши НН: м ПУ я є А Аа й ши ши с КЕ Ж жк В У У м є Е Б ЕЖЕ В | мо щі в 6 в км в в ч ше ше ше ож м "У" ми У ж й жк В ЩА її о: тв а А й ІВ МО момов ВШ їз ше ше Е Ж ж ЕЕ Кк Кк КЕ і Я К Кк за т ж її В : ще НИ Я Кк ж Кк В КЕ Кк кю а аа їв Е ЕЕ ЖЕ «є в б б В в а о ч м жк зе А А я ге ої ЕЕ: чо 5 ЕЕ ЕК з я М 5 А А А В У ВХ бе а «к а З НЕ 4 ву ШИ є о « "ний Я "і т т т в м ж м м Кк шк м У ШУ Е Е Е 35 5 5 т Ку б б В : СИ: м ож м юш з я
Фіг. 21 жо ов «ек в ве ще ще 5 є ВЗ с ТЕ ШЕУ ЩЕ ж ШЕ; НЕ Ше Б 5 5 ШЕ 8: У з ЕЙ а ід з ів - т в 5 Ех 1 г: в т ї М ца и ше: : Ще па я . ак Ж х я І ме Ша з В сша ни Є це Кк х К В ї В Я ЗМ їз о ти з в ще мож щ 5 ж НЕ и ни б ВИШ їж
ШІ. 5 в : КИ: щі й й а 5 в ЩЕ 133 ці в а в з «В за Б В ох - ще їм ОК яв 5 її. КВ ЕЕ й й во Я з БИ. їж в а в в Ще ї В й чі й 2: 00 13 ши: ни ши в дв в Д КЕ: ца 5 1 МЕН нин я: м Я їв . ЕЕ 135 с: 0 и й ї- 133 к Шк оо» ни НЕ: за 500 Б ; х з 5 х кеш - Ж Е 136 0 ке . ЖЕ є 12 хе ПШШНН й в зи оз ШЕБе г г: за іх 5 о кох М п в ки 0 ШИ . Кк: за г х х хв х У У за же - й її . Е Е За3 пе В їв? - вв з 5 в не Я ЕЕ Кеу ке я , ще г а г ма Е Що Кі х 116
Фіє. 21 (продовження)
КОНКУ ЗКУ п І. За ще МОВ СК в ЕЕ БИ щі ж ж В ЕКЗ ЕН ож ож В х век В «Ж ОХ Еш Ж КО зр ож я деофеойк яко ЗВ Зкоже кОЗКОВ я Б ват кож ож ож ЕЕ щеоук те ж В щр ве ОС жов ж Зо я 0 зе ож ЖЖ Медик З од жо ЯЗ св В НЕ У зо жо жо їЕ як ков ко ОКВ що вк ов ож ЯЕ авшаж шок вовк ВЕ Зое ОВК ях як оон Якою хе ЖК ОВК жо ж ВЕ сек: ех хе 88 ее ох в вве В Зк о дк Вжжжмк В дже хо ж ЩО вк ж вро ко корону ОВ екон вва Ж за В в ж хвоя сю як шк з ВЕ ок Б ЩЕ Р В НЕ У зо во ВК дковк жк ОВ жов Ж шва В зе ою ВЕ с ще вояк ше срк 0 В Жов оО В шко що ож й дк Зк ЗК ОК кош вок Х Ще жо кові В ко щк ем З ше З СЕУ жо Ба де од ожкоує ЗВ шві ЗВ кож вок ок чх я оон шк в ООО в я божеояюоскх СК зо шк же со Ж шок В мож жо В зк ие Ж с Ше ее МАУ зе ЕЕ що Зк ово ВУ ши ко й в ЗВ зок З ж ков ЗУ Свв в ЗКУ о С Як ЛЯ жк В БО Бо ее В Да ОО ве тк Зх Кк ОБ ве» Я ож же в Во зок о во ов Ж ж вк жо як У зо ок З яке о ВЕ ково ОЗ ск КОСУ совок же ОЕ вес кош Б зе в вк в ЖК ткож жк БО еко 1 з ежжк В за соя КВ шоу ож СК ж хо око вок о Я ВВ. тк жокж МЕ я в засос ОО В КК ОК теж хе 0 Зоо ОО ЖЕ Зкофк од ООН жо ж М
Фіг. 22
Пон вовк нки ее поломки нн куникнннких и пн за ІЗ Е Хв ВИ че: хо НН о Ск, БУ Мролуют о Немео лей КЖонценчннве Сен без Те ЗЕ ЧИЕ Я Е ЗД 4 ї з шкк Ж ий КО КЕ Я ш ши ше ше Ди еще ни ИН ВВ ВИ ши ке СУУУХУ ММ й ї ках З уж кжу див ще Е х жк КК х вк жи ж МТ ей ВМ 0000 | ши ше ще Коаеннеееененнннннсх Денне УК УКУХ щи рою вело кжк Совенк: їх У "ікклккллкккКК» гЯ З керрєвх в о КМ КК їх ЗЕ хх х За ще ха ат жі Ї ЕМ и ши пн ши ше ее ГУ Кене нн пн НО В ССС Ж дп І ко аку хх 3 зх Я З ща я ЕЯ ЕЕ ШЕ шШшШЕ с: ше ши ше ки ШО і в ВИ нн весна Я
Фіг. 23 ТЯ у жн М ще не йде : Збще "Ж ш і ож БО | . Мк? їх І Є ще БО, е й і. в ще 5 Сама ме с ! хх Ж х; Я -Я : К Чи ши ше ше ше. УМ апльфа-синуклану
Фіг. 24 і Е я: г Є
" банк 00000 вай жан аЕ о бик о СВК ШК вн» ря ОБАШЕ АР зання У ФИМР ва партія ВВЕ ве. ж ї5 ялияе З МУК варіанті БАН пт. ж 18 люта 2 ШМУХ шарйантйх ЯН вав. За ід й ФМ; жарівнта БУМ ОаБЕ. Я 15 п: ЩЕ: де Внипазічнний
Фіг. 25 ЖЖ веаріАеУ ех » Зоряне зевБрерччи » З Ні х
В. | сек вх : ї А що | : в | і жін вина ШЕ з ше ш й: й й. те я ж й є їй З б, а С Кй а щі БК ай жкооаж и М а КЕ Кк ще ж А си ше ни ну Ух М: ШИ М; і п л те К й Ки ше Ши ШЕ: к - а й і ой ШЕ М
«ФГ. еВ возєїанання стю сходи завіз деткі чне В ееуоувня ВеХКОДьНЯ врльнос У Ко Є Ко Ка Б В я Б
Я. «ресор ого ов нин ! і : ! й :
4. . : с І (З Е ж ; СЯ : 5 р х Ж ; с ху З : у ТЦ вет Е шк ШИ ШЕ 5 й 5 і як КІ у. ї и п А ї Но ШСИ зн в Б Шк й ц й ць г В й Ех г ! й щи я ї | у З ЩЕ 1 В виш Її Я 1 х ' - У ЖЕ: КОВШ У Ж РОех ще щ Її пе МЕ КН
Фіг. 27
UAA201800664A 2015-07-13 2016-07-12 Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії UA125501C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1512203.9A GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-07-13 Agents,uses and methods
PCT/EP2016/066476 WO2017009312A1 (en) 2015-07-13 2016-07-12 Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125501C2 true UA125501C2 (uk) 2022-04-13

Family

ID=54013851

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201800664A UA125501C2 (uk) 2015-07-13 2016-07-12 Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії

Country Status (33)

Country Link
US (12) US10800836B2 (uk)
EP (1) EP3322722A1 (uk)
JP (3) JP7012004B2 (uk)
KR (1) KR20180029205A (uk)
CN (2) CN107709361A (uk)
AR (1) AR105336A1 (uk)
AU (1) AU2016292896B2 (uk)
BR (1) BR112017027506A2 (uk)
CA (1) CA2989735A1 (uk)
CL (1) CL2018000075A1 (uk)
CO (1) CO2017012941A2 (uk)
CR (2) CR20230300A (uk)
DO (1) DOP2018000013A (uk)
EA (1) EA036499B1 (uk)
EC (1) ECSP18002645A (uk)
GB (1) GB201512203D0 (uk)
GE (1) GEP20207151B (uk)
HK (1) HK1254358A1 (uk)
IL (1) IL256501B (uk)
JO (1) JO3692B1 (uk)
MA (1) MA42439A (uk)
MX (2) MX2018000504A (uk)
MY (1) MY194944A (uk)
NI (1) NI201800006A (uk)
PE (1) PE20181049A1 (uk)
PH (1) PH12018500016A1 (uk)
RU (1) RU2765303C2 (uk)
SV (1) SV2018005612A (uk)
TN (1) TN2018000005A1 (uk)
TW (1) TWI729992B (uk)
UA (1) UA125501C2 (uk)
WO (1) WO2017009312A1 (uk)
ZA (1) ZA201708607B (uk)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201512203D0 (en) * 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
US11542332B2 (en) 2016-03-26 2023-01-03 Bioatla, Inc. Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
WO2018091444A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy
US11325968B2 (en) 2016-12-16 2022-05-10 H. Lundbeck A/S Alpha-synuclein antibodies
US10364286B2 (en) * 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
WO2018151821A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
JP2020512390A (ja) 2017-03-27 2020-04-23 チェイス セラピューティクス コーポレイション シヌクレイノパチーを処置するための組成物および方法
EP3618870A4 (en) * 2017-05-01 2021-04-21 The Trustees of The University of Pennsylvania MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ALPHA-SYNUCLEIN FIBRILLES
US11155608B2 (en) 2017-08-23 2021-10-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibodies against pathological alpha-synuclein, and methods using same
AU2018370279B2 (en) * 2017-11-17 2022-11-03 Abl Bio Inc. Antibodies to a-synuclein and uses thereof
GB201720970D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201720975D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies
WO2019147904A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Quantum-Si Incorporated Machine learning enabled pulse and base calling for sequencing devices
US20210032369A1 (en) * 2018-02-12 2021-02-04 The Scripps Research Institute Methods related to parkinson?s disease and synucleinopathies
US20220018851A1 (en) * 2018-08-09 2022-01-20 Hoffmann-La Roche Inc. Determination of parkinson's disease
TWI734279B (zh) * 2018-12-14 2021-07-21 美商美國禮來大藥廠 抗α-突觸核蛋白抗體及其用途
EP3956027A1 (en) * 2019-04-18 2022-02-23 AC Immune SA Novel molecules for therapy and diagnosis
KR102466943B1 (ko) * 2020-04-02 2022-11-14 한국과학기술연구원 갭을 갖는 바이오 센서를 이용한 파킨슨병 모니터링 방법 및 시스템
CN111537738A (zh) * 2020-05-18 2020-08-14 南通大学附属医院 用于超早期帕金森病检测的试剂盒
TW202323275A (zh) * 2021-09-01 2023-06-16 美商瓦辛尼帝股份有限公司 預防及治療突觸核蛋白病的方法
CN117915952A (zh) 2021-09-16 2024-04-19 H.隆德贝克有限公司 用于治疗突触核蛋白病的组合物和方法

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
GB1512203A (en) 1974-05-08 1978-05-24 Aspin F Rolls for use in profiling film
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3788356T2 (de) 1986-12-15 1994-06-23 British Tech Group Usa Monomere phthalocyanin-reagenzien.
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
CA2113113A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 Simon W. Kantor Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
ATE193301T1 (de) 1993-03-09 2000-06-15 Genzyme Corp Verfahren zur isolierung von proteinen aus milch
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
CA2380813A1 (en) 1999-07-29 2001-02-08 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
ES2282133T3 (es) 1999-08-24 2007-10-16 Medarex, Inc. Anticuerpos frente a la ctla-4 humano y sus usos.
AU7186501A (en) 2000-07-07 2002-01-21 Panacea Pharmaceuticals Inc Methods for preventing neural tissue damage and for the treatment of alpha-synuclein diseases
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
WO2003000714A2 (en) 2001-06-22 2003-01-03 Panacea Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing protein aggregation in neurodegenerative diseases
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US8829198B2 (en) 2007-10-31 2014-09-09 Proteotech Inc Compounds, compositions and methods for the treatment of beta-amyloid diseases and synucleinopathies
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
TW200509968A (en) 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US7358331B2 (en) * 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
HUE034320T2 (en) 2003-05-19 2018-02-28 Prothena Biosciences Ltd Truncated fragments of alpha-synuclein in lewy-body disease
US7674599B2 (en) 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
JP2006031250A (ja) 2004-07-14 2006-02-02 Fuji Xerox Co Ltd 通信装置およびその制御方法
EA013752B1 (ru) * 2004-08-09 2010-06-30 Элан Фармасьютикалз, Инк. Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний
US20060205024A1 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Sun Health Research Institute Method to diagnose and evaluate progression of Alzheimer's disease
CA2657953A1 (en) 2005-07-19 2007-01-25 University Of Rochester Alpha-synuclein antibodies and methods related thereto
EP1973576B1 (en) 2005-11-28 2019-05-15 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
PL3067066T3 (pl) 2007-02-23 2019-09-30 Prothena Biosciences Limited Zapobieganie i leczenie choroby synukleinopatycznej i amyloidogennej
PL2118300T3 (pl) 2007-02-23 2015-11-30 Prothena Biosciences Ltd Zapobieganie i leczenie synukleinopatii i amyloidozy
SI2154969T1 (sl) * 2007-05-16 2016-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Zdravljenje sinukleinopatij
JP5588866B2 (ja) 2007-08-10 2014-09-10 メダレックス エル．エル．シー． Ｈｃｏ３２およびｈｃｏ２７、ならびに関連実施例
WO2009133521A2 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Bioartic Neuroscience Ab Antibodies and vaccines for use in therapeutic and diagnostic methods for alpha-synuclein-related disorders
EP2949666B1 (en) * 2008-12-19 2018-12-19 Biogen International Neuroscience GmbH Human anti-alpha-synuclein antibodies
NZ595630A (en) 2009-04-09 2013-04-26 Amicus Therapeutics Inc Methods for preventing and/or treating degenerative disorders of the central nervous system
JP5894939B2 (ja) 2010-02-26 2016-03-30 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー プロトフィブリル結合抗体ならびにパーキンソン病、レビー小体型認知症および他のα−シヌクレイノパチーの治療および診断方法におけるこれらの使用
EP2366714A1 (en) 2010-03-03 2011-09-21 Dr. Rentschler Holding GmbH & Co. KG Naturally occuring autoantibodies against alpha-synuclein that inhibit the aggregation and cytotoxicity of alpha-synuclein
GB201008682D0 (en) 2010-05-25 2010-07-07 Vib Vzw Epitope tag for affinity based applications
ES2686550T3 (es) 2010-10-11 2018-10-18 Biogen International Neuroscience Gmbh Anticuerpos anti-tau humanos
AU2012272790B2 (en) 2011-06-23 2016-10-06 Biogen International Neuroscience Gmbh Anti-alpha synuclein binding molecules
JP2013059866A (ja) 2011-09-12 2013-04-04 Seiko Epson Corp 液体噴射装置、液体噴射装置の制御方法および液体噴射装置の制御プログラム
EP3378535B1 (en) * 2011-10-28 2023-01-04 Prothena Biosciences Limited Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
JP6345655B2 (ja) 2012-07-03 2018-06-20 ワシントン・ユニバーシティＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ タウに対する抗体
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
CN104869993B (zh) 2012-10-25 2019-01-15 通用医疗公司 治疗阿尔茨海默病及相关疾病的组合疗法
US9534044B2 (en) 2013-02-28 2017-01-03 United Arab Emirates University Alpha-synuclein antibodies and uses thereof
US10513555B2 (en) 2013-07-04 2019-12-24 Prothena Biosciences Limited Antibody formulations and methods
KR102358311B1 (ko) * 2013-11-21 2022-02-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-알파-시누클레인 항체 및 사용 방법
CN107074938A (zh) 2014-10-16 2017-08-18 豪夫迈·罗氏有限公司 抗‑α‑突触核蛋白抗体和使用方法
WO2016179569A1 (en) 2015-05-07 2016-11-10 Axovant Sciences Ltd. Compositions and methods of treating a neurodegenerative disease
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
AU2017272804B2 (en) 2016-06-02 2023-11-23 Medimmune Limited Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
WO2018091444A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation

Also Published As

Publication number Publication date
BR112017027506A2 (pt) 2018-09-11
US20210054057A1 (en) 2021-02-25
ECSP18002645A (es) 2018-03-31
US10800836B2 (en) 2020-10-13
AR105336A1 (es) 2017-09-27
JP7012004B2 (ja) 2022-02-10
ZA201708607B (en) 2019-05-29
WO2017009312A1 (en) 2017-01-19
GB201512203D0 (en) 2015-08-19
RU2017145653A (ru) 2019-08-13
CA2989735A1 (en) 2017-01-19
HK1254358A1 (zh) 2019-07-19
US20190367594A1 (en) 2019-12-05
MY194944A (en) 2022-12-27
US20210061892A1 (en) 2021-03-04
US20170015739A1 (en) 2017-01-19
US11524995B2 (en) 2022-12-13
IL256501B (en) 2021-10-31
US10358482B2 (en) 2019-07-23
US20180179271A1 (en) 2018-06-28
JP2021191763A (ja) 2021-12-16
MX2023009483A (es) 2023-08-22
US20190367595A1 (en) 2019-12-05
US20180179270A1 (en) 2018-06-28
PH12018500016A1 (en) 2018-07-09
JP7138322B2 (ja) 2022-09-16
US10364285B2 (en) 2019-07-30
AU2016292896B2 (en) 2022-02-24
TWI729992B (zh) 2021-06-11
EA201792616A1 (ru) 2018-06-29
SV2018005612A (es) 2018-07-20
RU2017145653A3 (uk) 2019-11-21
US10358483B2 (en) 2019-07-23
US10647764B2 (en) 2020-05-12
CN115925921A (zh) 2023-04-07
US10647763B2 (en) 2020-05-12
JP2022174131A (ja) 2022-11-22
MX2018000504A (es) 2018-04-30
NI201800006A (es) 2018-10-18
RU2765303C2 (ru) 2022-01-28
CR20230300A (es) 2023-08-25
GEP20207151B (en) 2020-09-25
MA42439A (fr) 2018-05-23
JO3692B1 (ar) 2020-08-27
KR20180029205A (ko) 2018-03-20
US20190382473A1 (en) 2019-12-19
CL2018000075A1 (es) 2018-05-11
US20230312693A1 (en) 2023-10-05
US20180127492A1 (en) 2018-05-10
PE20181049A1 (es) 2018-07-03
US10640554B2 (en) 2020-05-05
US20210147522A1 (en) 2021-05-20
US11421024B2 (en) 2022-08-23
EP3322722A1 (en) 2018-05-23
US10358484B2 (en) 2019-07-23
JP2018529634A (ja) 2018-10-11
AU2016292896A1 (en) 2018-01-18
CR20180021A (es) 2018-03-13
CN107709361A (zh) 2018-02-16
CO2017012941A2 (es) 2018-03-09
US20180127491A1 (en) 2018-05-10
US11542323B2 (en) 2023-01-03
TN2018000005A1 (en) 2019-07-08
DOP2018000013A (es) 2018-04-15
IL256501A (en) 2018-02-28
EA036499B1 (ru) 2020-11-17
TW201716440A (zh) 2017-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA125501C2 (uk) Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії
CN109937210B (zh) 用于治疗共核蛋白病的药剂、用途和方法
UA124104C2 (uk) Антитіла, специфічні до гіперфосфорилованого тау-білка, і способи їх застосування
UA123862C2 (uk) Моноклональне антитіло, специфічне до гіперфосфорилованого тау-білка, і спосіб його застосування
CN105339002B (zh) 治疗tau病变的方法
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
UA123390C2 (uk) Терапія і діагностика на основі білків тау-опосередковуваної патології при хворобі альцгеймера
ES2363765T3 (es) Agonistas de fgfr.
UA114883C2 (uk) Антитіло до рецептора епідермального фактора росту-3 (her3)
JP6818268B2 (ja) 抗トランスサイレチンヒト化抗体
UA123695C2 (uk) Епітоп склеростину, антитіло, яке зв'язує склеростин, та застосування такого антитіла для лікування захворювання, опосередкованого склеростином
UA125577C2 (uk) Антигензв'язуюча молекула, які містить тримерний ліганд сімейства tnf
UA118950C2 (uk) Поліпептид, який зв'язує специфічний мембранний антиген простати та комплекс т-клітинного рецептора
EA025245B1 (ru) Антитела против cd100 и способы их применения
EA013677B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение
UA127308C2 (uk) Активована протеазою біспецифічна молекула, яка зв'язує т-клітини
EA022913B1 (ru) Антигенсвязывающие белки
CN107207591A (zh) 血脑屏障受体抗体及使用方法
CN110072888B (zh) 药剂、用途和方法
UA125136C2 (uk) Антитіла, які зв'язуються з сортиліном і пригнічують зв'язування програнуліну
EA024655B1 (ru) ЛИГАНД, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С MSRV-ENV (ВАРИАНТЫ), ScFV И Fab ФРАГМЕНТЫ, АНТИТЕЛО, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОР, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ, АНТИЛИГАНД И СПОСОБ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ, НАБОР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
CN104725507A (zh) 用于治疗神经疾病的人抗体及其诊断和治疗用途
CN108137679A (zh) 对Tau的{p}Ser404表位有选择性的基于抗体的分子和它们在诊断和治疗Tau疾病中的用途
JP2021535078A (ja) 骨の疾患の治療に用いるためのトランスフェリン受容体２のアンタゴニスト及びアゴニスト
WO2019118906A2 (en) Monoclonal antibodies targeting phf1 and at8 epitopes of human tau protein