CN110072888B

CN110072888B - 药剂、用途和方法

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Publication number: CN110072888B
Application number: CN201780077932.8A
Authority: CN
Inventors: P·卡尔伦基; K·福; J·B·斯塔文哈根
Original assignee: H Lundbeck AS
Current assignee: H Lundbeck AS
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2037-12-14
Also published as: BR112018016717A2; WO2018109058A1; MA47019A; JP2020504717A; JP7144755B2; EP3555127A1; US11325968B2; WO2018109058A9; CN110072888A; US20200024337A1

Abstract

本发明涉及表示为m2E6的小鼠抗体、嵌合ch2E6、以及3种人源化形式(2E6‑HLD1、2E6‑HLD2和2E6‑HLD3)和HLD1的亲和力成熟形式：7A10、5A1、9D7、9G11、7C4、L3、8D9、9C12或6B6，以产生更高亲和力的抗体。

Description

药剂、用途和方法

本发明涉及新颖种类的、与α-突触核蛋白特异性结合的单克隆抗体，还涉及将这些分子及其α-突触核蛋白结合片段用于治疗和诊断共核蛋白病的方法。

对序列表的引用

本申请包括根据37 C.F.R.1.821等的一个或多个序列表，该序列表以计算机可读介质披露(文件名称：1074-WO-PCT_ST25.txt，创建于2017年12月11日，并且具有43kB的大小)，将该文件通过援引以其全文并入本文。

背景技术

共核蛋白病(synucleinopathy)，也称为路易体疾病(LBD)，其特征在于用显微镜可见为路易体(LB)和/或路易神经突(其中蛋白α-突触核蛋白是主要组分)的细胞内蛋白聚集体的沉积(Jellinger,Mov Disord.[运动障碍]2012年1月；27(1):8-30；McKeith等人,Neurology[神经病学](1996)47:1113-24)。共核蛋白病包括帕金森氏病(包括帕金森氏病的特发性和遗传性形式)和弥漫性路易体(DLB)病(也称为路易体痴呆(DLB)，阿尔茨海默氏病的路易体变体(LBV)，组合型阿尔茨海默氏和帕金森氏病(PD)，纯自主神经衰竭和多***萎缩(MSA；例如橄榄体脑桥小脑萎缩，纹状体黑质变性和希—德二氏综合征))。共核蛋白病经常具有多巴胺能黑质纹状体***的变性，造成帕金森病中的核心运动缺陷(僵硬、运动过慢、静止性震颤)，但是在与非运动功能障碍(例如痴呆和自主神经***缺陷)关联的中枢、外周和自主神经***和脑区以及其他器官中还存在路易体和营养不良路易神经突的广泛出现。在帕金森氏病和其他共核蛋白病中，若干非运动体征和症状被认为先于运动症状。此类早期体征包括例如REM睡眠行为障碍(RBD)和嗅觉的丧失以及便秘(Mahowald等人,Neurology[神经病学](2010)75:488-489)。在老年人群体中,共核蛋白病仍旧是运动障碍和认知恶化的普通原因(Galasko等人,Arch.Neurol.[神经病学档案](1994)51:888-95)。

底丘脑核(STN)中放电增加和放电模式改变被认为是有助于PD的症状，并且帕金森氏病状态下STN放电与皮质振荡活动强烈同步(Shimamoto等人,J Neurosci.[神经科学杂志]2013年4月24日；33(17):7220-33)。在PD患者中，STN神经元在θ(4-8Hz)、α(8-12Hz)和β(12-30Hz)范围内改变了振荡放电模式(Levy等人,Brain.[脑]2002；125:1196–1209)并且扩大了与邻近STN单位以及在β范围内的STN局部场电位(LFP)的同步(Moran等人,Brain.[脑]2008；131:3395–3409)。与人PD相似，在PD的动物模型中，已经在STN中观察到放电模式的显著改变，例如，具有规律放电模式的神经元的百分比减少而具有不规律、混合或爆发模式的神经元的百分比增加(Ryu等人Neurosci Lett.[神经科学快报]2011；11月14日；505(2):113-8)。通过旋转行为测量，用高频率刺激的光遗传学驱动进入STN传入纤维稳健地并可逆地减轻PD症状(Gradinaru等人,Science[科学]2009；4月17日；324(5925):354-9)。类似地，STN的深部脑刺激可以逆转动物模型(Li等人，2012)和人患者(综述于Hickey和StacyFront Neurosci.[神经科学前沿]2016；4月28日；10:173)中的PD症状。

α-突触核蛋白是蛋白家族的成员，包括β-和γ-突触核蛋白和突触素(synoretin)。α-突触核蛋白表达在与突触关联的正常状态下，并且被认为在调节突触泡释放中起作用，并且由此影响神经通信、可塑性、学习和记忆。

若干研究已经暗示，在PD发病机理中，α-突触核蛋白具有中心作用。在病理学条件下，该蛋白可以聚集以形成细胞内不溶性原纤维。例如，突触核蛋白在LB中积累(Spillantini等人,Nature[自然](1997)388:839-40；Takeda等人,J.Pathol.[病理学杂志](1998)152:367-72；Wakabayashi等人,Neurosci.Lett.[神经科学快报](1997)239:45-8)。在α-突触核蛋白基因的突变以及该基因的二倍和三倍重复与帕金森病罕见的家族形式共分离(Kruger等人,Nature Gen.[自然遗传学](1998)18:106-8；Polymeropoulos等人,Science[科学](1997)276:2045-7)。

一个重要的发现一直认为α-突触核蛋白可分泌到细胞外液并且存在于血浆和脑脊液(CSF)中。若干研究，例如Pacheco等人(2015)和其他人的研究(Pacheco等人JNeurochem.[神经化学杂志]2015年3月；132(6):731-4；Conway等人,Proc Natl Acad SciUSA[美国国家科学院院刊](2000)97:571-576；Volles等人,J.Biochem.[生物化学杂志]42:7871-7878，2003)已经表明，细胞外突触核蛋白在脑中起着致病作用。他们已证明细胞外α-突触核蛋白寡聚体拥有对脑神经元质膜的神经毒性。基于突触核蛋白分泌数据的另一个有趣的假设是α-突触核蛋白的朊病毒样传播构成帕金森氏病和其他共核蛋白病进展的基础(Lee等人2014,Nat Rev Neurol.[自然评论神经病学]2014年2月；10(2):92-8；Hansen和Li 2012,Trends Mol Med.[分子医学发展趋势]2012年5月；18(5):248-55)。这些发现产生了可以通过免疫疗法靶向细胞外突触核蛋白的希望(Vekiarellis等人2011,LancetNeurol.[柳叶刀神经学]2011年11月；10(11):1015-25)。

天然存在的α-突触核蛋白自身抗体已经显示存在于PD患者和健康对照中。已经报道了有时这些组之间没有显著差异(Smith等人2012,PLoS One.[公共科学图书馆期刊]2012；7(12):e52285；Maetzler等人2014,PLoS One.[公共科学图书馆期刊]2014年2月21日；9(2):e88604,Papachroni等人2007 J Neurochem.[神经化学杂志]2007年5月；101(3):749-56和Woulfe等人2002,Neurology.[神经病学]2002年5月14日；58(9):1435-6)，相比健康对照有时在PD患者中增加水平的α-突触核蛋白自身抗体(Gruden等人2011,JNeuroimmunol.[神经免疫学杂志]2011年4月；233(1-2):221-7,Gruden等人2012,Neuroimmunomodulation.[神经免疫调节]2012；19(6):334-42和Yanamandra 2011,PLoSOne.[公共科学图书馆期刊]2011年4月25日；6(4):e18513)或在PD患者中降低的α-突触核蛋白自身抗体(Besong-Agbo等人2013,Neurology.[神经病学]2013年1月8日；80(2):169-75)。在发现自身抗体后很早就表明了循环的抗α-突触核蛋白自身抗体可作为关于α-突触核蛋白聚集的保护作用的可能性(Woulfe等人2002,Neurology.[神经病学]2002年5月14日；58(9):1435-6)。

在转基因小鼠中过量表达α-突触核蛋白模拟路易体疾病的一些病理学方面。在过去的数十年已经产生了若干过量表达α-突触核蛋白的不同转基因系的小鼠(描述于综述：Koehler等人2014,PLoS One.[公共科学图书馆期刊]2013年5月31日；8(5):e64649Fleming和Chesselet,2006,Behav Pharmacol.[行为药理学]2006年9月；17(5-6):383-91；Springer和Kahle 2006,Curr Neurol Neurosci Rep.[当前神经病学和神经科学报告]2006年9月；6(5):432-6)。具有Thy-1和PDGFβ启动子的小鼠系发展了运动缺陷和认知缺陷，并已被用于证明在体内针对α-突触核蛋白的抗体的神经保护作用。然而，没有转基因系具有强的多巴胺能神经元变性，并且通常运动表型是由运动神经元内的表达驱动，这些运动神经元在帕金森氏病中通常不会变性。因此，潜在的疾病调节治疗的积极成果是否通过对多巴胺能神经元或其他中枢神经***神经元的作用来介导尚不清楚。

一个在转基因小鼠模型中的强大发现是人α-突触核蛋白的长期超表达损害突触功能。使用体外和体内两个***的研究显示在海马体中野生型(wt)人α-突触核蛋白的超表达损害突触传递(Nemani等人2010,Neuron.[神经元]2010年1月14日；65(1):66-79；Paumier等人2013,PLoS One.[公共科学图书馆期刊]2013年8月1日；8(8):e70274)。这已显示在海马体的CA1区中，在该区中两个研究都发现减少的基础突触传递。这后面的机制假设为α-突触核蛋白细胞内的积累导致功能障碍的突触释放。然而，最近关于α-突触核蛋白分泌到突触中的细胞外间隙和α-突触核蛋白寡聚体对突触功能的毒性作用的发现打开了细胞外α-突触核蛋白在突触功能障碍中发挥作用的可能性，并因此打开了治疗性抗体以援救缺陷的能力。

使用病毒载体来过量表达α-突触核蛋白代表在啮齿动物中模拟PD的一种重要的方式，因为这一方法产生黑质纹状体神经元的相对快速进步的变性，这是在小鼠或大鼠中通过遗传突变没有被重现的特征(Kirik和Bjorklund,2003,Trends Neurosci.[神经科学发展趋势]2003年7月；26(7):386-92)。此外，病毒基因递送揭示了野生型α-突触核蛋白诱导黑质纹状体病理的能力(Kirik等人2002,J Neurosci.[神经科学杂志]2002年4月1日；22(7):2780-91)，这一发现与具有α-突触核蛋白二倍和三倍重复的以家族形式的PD的证据一致(Lee和Trojanowski,2006,Neuron.[神经元]2006年10月5日；52(1):33-8)。在一个研究中已经显示针对α-突触核蛋白N-末端的山羊抗体使帕金森氏病的基于AAV-α-突触核蛋白的大鼠模型免受多巴胺能细胞死亡并减轻行为缺陷(Shahaduzzaman等人2015,PLoS One.[共科学图书馆期刊]2015年2月6日；10(2):e0116841)。

最近已经显示α-突触核蛋白病理的朊病毒样传播发展了α-突触核蛋白病理并且也发展了多巴胺能细胞死亡(Luk等人2012,Science.[科学]2012年11月16日；338(6109):949-53)。这一模型已经被用来显示α-突触核蛋白抗体可以减轻该病理(Tran等人2014,Cell Rep.[细胞报告]2014年6月26日；7(6):2054-65)。在这个模型中，抗体治疗能够减少磷酸化α-突触核蛋白在若干脑区(包括黑质中的多巴胺能神经元)积累并减少运动缺陷的发展。

除了突变，α-突触核蛋白基因的替代性剪接和该蛋白的翻译后修饰，例如磷酸化作用、泛素化、硝化、和截短可以产生α-突触核蛋白的蛋白形式，该蛋白形式具有形成α-突触核蛋白的聚集的和/或有毒的形式的增加的能力(Beyer和Ariza,Mol Neurobiol.[分子神经生物学]2013年4月；47(2):509-24)。然而，α-突触核蛋白的精确的病理学的种类仍然未知。已经将各种从寡聚体至原纤维范围的错误折叠的/聚集的/分泌的种类和不同翻译后修饰与毒性关联，但哪一个最重要还没有达成一致(是否真的甚至只有单一的毒性种类)。最近已经报道了患有PD、DLB和MSA的患者中存在改变的α-syn剪接同种型水平(Cardo等人Neurosci Lett[神经科学快报]2014；562(6):45–49,和Brudek等人J Neurochem[神经化学杂志]2016.1月；136(1):172-85)。112-α-突触核蛋白同种型结合的更高聚集潜力(Manda等人PLoS One[公共科学图书馆期刊]2014年6月3日；9(6))以及水平增加可能在PD或相关病理学(例如MSA)的病理生理学中起作用。

整体上，具有相似的形态学和神经学改变的α-突触核蛋白在人、小鼠、和蝇等不同动物模型中的积累表明这种分子是路易体疾病的发病机制的中心。

已经显示若干不同的α-突触核蛋白抗体在临床前动物模型中具有治疗作用。已经显示靶向涉及α-突触核蛋白残基91-99的表位的抗体和靶向涉及α-突触核蛋白残基118-126的表位的抗体两者都对转基因小鼠的运动和认知缺陷有作用(Games等人2014,JNeurosci.[神经科学杂志]2014年7月9日；34(28):9441-54)。这些抗体中最先进的是基于小鼠单克隆抗体9E4的人源化抗体，该人源化抗体靶向涉及α-突触核蛋白残基118-126的表位并且现在处于I期临床试验。靶向涉及α-突触核蛋白残基120-140的表位的C-末端抗体274(Bae等人2012,J Neurosci.[神经科学杂志]2012年9月26日；32(39):13454-69)也显示在临床前模型中对从细胞至细胞的病理传播有作用。除了这些，靶向构象的种类例如α-突触核蛋白的寡聚体和原纤维的抗体已经显示可以至少减少这些推测有毒的α-突触核蛋白种类的水平(等人2014,Neurobiol Dis.[疾病神经生物学]2014年9月；69:134-43和Spencer等人2014,Mol Ther.[分子治疗]2014,10月；22(10):1753-67)。在体内降低α-突触核蛋白寡聚体水平的这些构象抗体，例如mab47，也显示靶向α-突触核蛋白氨基酸121-125的C-末端表位(US 20120308572)。其他构象的、原纤维和寡聚体特异性抗体也靶向C-末端序列(Vaikath等人Neurobiol Dis.[疾病神经生物学]2015；79:81-99)。

本发明涉及与全长α-突触核蛋白结合的小鼠抗体2E6(和人源化、嵌合和亲和力成熟的版本)。该抗体在50种针对α-突触核蛋白的单克隆抗体中在功能筛选方面是优越的，并且发现在防止α-突触核蛋白原纤维的细胞积累方面出人意料地有效。还发现它与来自人患病脑的病理学α-突触核蛋白的结合出人意料地好，比另一种α-突触核蛋白抗体9E4结合更多的截短的或可替代地剪接的α-突触核蛋白种类(Masliah等人,PLoS One[公共科学图书馆期刊],2011,4月29日；6(4)–序列出版于专利US 8609820)。抗体2E6可以在体外防止α-突触核蛋白聚集，并且它可以溶解预成的α-突触核蛋白聚集体。α-突触核蛋白的聚集形式可以与抗体形成免疫复合物，并且抗体2E6的存在经由Fc介导的吞噬作用增加这些免疫复合物的摄取。抗体2E6结合原纤维并阻断或中和原纤维，防止它们在细胞模型中接种新的α-突触核蛋白聚集体。在体内，在单次外周剂量后，抗体可以逆转转基因α-突触核蛋白小鼠中神经元放电的损害，并且长期给予若干个月，该抗体降低α-突触核蛋白超表达对损害的囊泡释放的作用。这种作用可以转化为用该抗体治疗的人PD患者中突触传递的改善。

最后，我们发现在大鼠α-突触核蛋白帕金森氏病模型中，在长期治疗两个月后，抗体2E6可以逆转STN中神经元的病理学不规律放电。由于STN病理学活动在PD症状中起主要作用，逆转皮质-底丘脑通路中的病理学变化对于减轻运动缺陷是重要的。

已经将亲本小鼠抗体人源化并且亲和力成熟以产生用于治疗α-突触核蛋白病的治疗性抗体。人源化抗体以及亲和力成熟形式保留与亲本抗体相同的结合和基于细胞的功能。

发明内容

本发明涉及表示为m2E6的小鼠抗体、嵌合ch2E6、以及3种人源化形式(2E6-HLD1、2E6-HLD2和2E6-HLD3)和HLD1的亲和力成熟形式：7A10、5A1、9D7、9G11、7C4、L3、8D9、9C12或6B6，以产生更高亲和力的抗体。

本发明还涉及能够与该抗体，并且特别是本文披露的2E6和HLD-1竞争结合α-突触核蛋白上表位的单克隆抗体。

特异性单克隆抗体披露于本文的权利要求1-81中。

附图说明

图1显示筛选级联。用α-突触核蛋白的不同聚集形式对三只小鼠进行免疫。筛选高滴度小鼠并产生单克隆细胞系。使用α-突触核蛋白ELISA从约1000个孔中回收50个阳性克隆。针对防止SK-mel5细胞中原纤化α-突触核蛋白积累的能力来筛选识别α-突触核蛋白的50种单克隆抗体(实例1)。出人意料的是，只有非常少数(50个中的4个)α-突触核蛋白抗体能够抑制原纤化α-突触核蛋白的积累。将m2E6选择作为最有效的抗体，并在PD的细胞和动物模型中进一步分析。此外，将m2E6人源化为2E6-HLD-1、2和3(实例2)，并且将2E6-HLD1进一步亲和力成熟为HLD1-7A10。针对α-突触核蛋白的所有变体的动力学结合数据列于表5、6和7中(实例2)。

图2显示来自抗体m2E6与来自α-突触核蛋白氨基酸序列136-140的肽的表位作图的ELISA数据(未显示其他非结合肽)。上小图显示肽序列YEPEA是抗体m2E6的完全结合所必需的。中小图显示相同的肽，其中酪氨酸残基被硝基酪氨酸替代(序列中显示为数字5)。酪氨酸136的硝化消除了抗体与肽的结合。下小图显示所选择的氨基酸的双丙氨酸筛选诱变。阵列中存在的双丙氨酸替代指出倒数第二个氨基酸P138、E139和A 140的关键作用。(实例3)。

图3显示来自路易体痴呆患者(DLB)和年龄匹配的健康对照(CTR)五种脑匀浆之间的α-突触核蛋白和磷酸化(Ser129)α-突触核蛋白的含量的差异。将这些匀浆用于进一步分级以富集α-突触核蛋白的病理学形式，即在Ser129处聚集和磷酸化(实例4)。

图4显示来自可溶性级分(S1)、以及来自DLB患者(用粗体文本表示的泳道)和年龄匹配的健康对照(CTR)(用灰色文本表示的泳道)的富集α-突触核蛋白病理形式(P1和P2)的级分的α-突触核蛋白的免疫沉淀(使用m2E6，和m2E6的人源化版本：2E6-HLD1、2和3抗体)。该图显示m2E6和人源化变体2E6-HLD1-3与对比α-突触核蛋白抗体9E4(小鼠和人源化形式两者)显著不同。m2E6和人源化变体能够免疫沉淀α-突触核蛋白的截短的或可替代地剪接版本，而9E4则不能。此外，m2E6和人源化变体识别P1和P2级分中α-突触核蛋白的病理学聚集形式，而9E4不识别(实例4)。

图5显示通过m2E6对体外α-突触核蛋白聚集的抑制。当单体α-突触核蛋白在37℃振荡孵育若干天时，硫黄素荧光增加，这指示α-突触核蛋白聚集成淀粉样蛋白(对照曲线)。与单体α-突触核蛋白混合的m2E6的增加量显示对硫黄素荧光增加的剂量依赖性抑制(实例5)。

图6显示通过m2E6对α-突触核蛋白原纤维的解离。对预成的α-突触核蛋白原纤维进行超声处理以将它们分解成较小的微纤维。将抗体m2E6以不同的摩尔比率添加到超声处理的原纤维中。不添加抗体(无抗体(No ab))的对照原纤维或与不结合α-突触核蛋白(B12)的同种型对照抗体一起孵育的原纤维显示通过电子显微镜可视化的广泛的原纤维网络。与不同浓度的m2E6一起孵育的原纤维显示在较大原纤维中的剂量依赖性降低。

图7显示m2E6与培养基中的α-突触核蛋白原纤维结合并抑制它们在非吞噬细胞中的积累。A)添加到细胞培养基中的α-突触核蛋白原纤维的免疫沉淀。这显示m2E6能够识别并降低培养基中α-突触核蛋白原纤维，而对照抗体B12(非反应性人IgG)和另一种α-突触核蛋白抗体5G4(来自Roboscreen公司)则不能。

B)SHSY-5Y细胞(用α-突触核蛋白原纤维和抗体处理24小时，然后洗涤并裂解)的蛋白质印迹。这显示2E6-HLD1减少了细胞中积累的原纤维的量，而B12抗体没有。

C)在SKmel5细胞(如所指示的与原纤维、m2E6和α-突触核蛋白肽共孵育24小时)中α-突触核蛋白原纤维积累的自动荧光成像。这显示m2E6减少了细胞中原纤维的积累。该作用是特异性的，因为它可以被覆盖m2E6表位的肽126-140抑制，但不能被表位外的肽(氨基酸113-120)抑制。

D)在SKmel5细胞中(24小时，亲和力成熟的2E6-HLD1抗体2E6_7A10从0.1至10μg/ml的剂量应答)α-突触核蛋白原纤维的积累。因此，2E6_7A10与溶液中的α-突触核蛋白原纤维结合，并以剂量依赖性方式减少它们在细胞中的积累。

星号(***)指示，当与仅原纤维相比，双尾t检验的p值低于0.0001(实例6)。

图8显示m2E6在培养基中结合原纤化的哺乳动物产生的α-突触核蛋白并抑制其在原代皮质神经元中的积累。

A)显示所有2E6变体都降低培养基中α-突触核蛋白寡聚体，包括全长和一些截短版本(较弱的低分子量条带)。对比抗体m9E4也降低全长α-突触核蛋白，然而9E4的人源化版本(美国专利20080175838)在截短版本和14kDa全长版本的α-突触核蛋白两者的免疫沉淀中效率低得多，这指示与培养基中哺乳动物蛋白结合较少。另一种对比抗体(来自百健公司(Biogen)的12F4，US 8,940,276)仅给出与B12对照差别不大的弱条带。

B)显示用m2E6抗体孵育导致原代皮质神经元中胞内α-突触核蛋白聚集体的积累减少。

C)和D)显示(在相同实验的两个读数中)使用非反应性B12或对比9E4抗体共孵育Syn-BAP PFF(预成的原纤维＝PFF–将哺乳动物α-突触核蛋白被制成原纤维，对这些原纤维进行超声处理以产生PFFs–前体或种子至完整的原纤维)不改变细胞中Syn-BAP PFF的积累，而用m2E6或2E6-HLD1处理将积累水平降低至背景水平。仅用Syn-BAP PFF处理的细胞显示每个细胞约4.5个斑点(图8D)；B12或h9E4同样没有显著改变这一点。用m2E6、h2E6-HLD2或h2E6-HLD3的处理显著降低了积累水平(至每个细胞约3个斑点)，并且2E6-HLD1显示出向更低斑点数的趋势(实例6)。

图9显示2E6与条件培养基中的α-突触核蛋白原纤维结合并抑制从细胞至细胞的转移。

A)来自用α-突触核蛋白原纤维处理24小时的SK-mel5细胞的条件培养基的免疫沉淀。收获培养基并用于IP(免疫沉淀)。2E6有效地免疫沉淀α-突触核蛋白。

B)在向培养基中添加α-突触核蛋白原纤维后，在“饲养”板上将积累胞内α-突触核蛋白原纤维的细胞的百分比定量为含有α-突触核蛋白斑点的％细胞，C)将来自饲养细胞的培养基转移到受体板上，并且同样，在“受体”板上对具有胞内α-突触核蛋白原纤维的细胞的百分比进行定量。B)和C)显示m2E6显著减少“饲养”和“受体”板两者中具有α-突触核蛋白聚集体(斑点)的细胞数量。对比抗体1H7(WO 2005047860)对任一板都没有作用。对照抗体(B12)同样没有作用。

(实例6)。

图10显示2E6-HLD1剂量依赖性地抑制内源性α-突触核蛋白的接种。用具有HA标签的α突触核蛋白表达质粒转染HEK293细胞，随后转染α突触核蛋白原纤维并添加各种浓度的2E6-HLD1。48小时后，通过超速离心将细胞裂解物分级成Triton和SDS可溶性级分，并通过免疫印迹分析。具有HA标签的α突触核蛋白高于17KD。将磷酸-突触核蛋白和β-肌动蛋白的比率用于定量不溶性α-突触核蛋白(SDS可溶性部分)。

A.来自HEK293细胞的SDS可溶性级分的蛋白质印迹。顶部图像显示使用抗体4B12(检测人α突触核蛋白)和针对β-肌动蛋白的抗体的免疫印迹。底部图像显示使用抗体Ab51253(检测磷酸-突触核蛋白)的免疫印迹。与对照抗体B12相比，用2E6-HLD1的处理显示α-突触核蛋白聚集和磷酸化的剂量依赖性抑制。

B.来自图10A中磷酸-突触核蛋白的蛋白质印迹的定量。2E6-HLD1以剂量依赖性方式抑制可溶性α-突触核蛋白向不溶性级分的转化(实例6)。

图11显示在F28-snca转基因的和年龄匹配的对照小鼠的海马体内的谢弗侧枝(Schaffer collateral)-CA1突触的基础突触传递和配对脉冲易化的损害。场兴奋性突触后电位(fEPSP)被应用到谢弗侧枝的单一刺激诱发，并且基础突触传递通过测量fEPSP斜率作为刺激强度的函数进行评估(a)。诱导配对脉冲易化通过短期突触可塑性进行评估(b)，其中应用具有变化的刺激间时间间隔的双刺激，并测量第二fEPSP的斜率与第一fEPSP的斜率之间的比率。通过双向方差分析(ANOVA)与重复测量，随后进行邦费罗尼(Bonferroni)t检验(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)来分析所有数据(实例7)。

图12和13显示9E4(15mg/kg，腹膜内)对F28-snca转基因小鼠的海马体内的谢弗侧枝-CA1突触的基础突触传递和配对脉冲易化的损害的急性作用。

在图12中场兴奋性突触后电位(fEPSP)被应用到谢弗侧枝的单一刺激诱发，并且基础突触传递通过测量fEPSP斜率作为刺激强度的函数进行评估。9E4能够部分逆转缺陷

在图13中诱导配对脉冲易化通过短期突触可塑性进行评估，其中应用具有变化的刺激间时间间隔的双刺激，并测量第二fEPSP的斜率与第一fEPSP的斜率之间的比率。9E4不能够逆转缺陷。

通过双向ANOVA与重复测量，随后进行邦费罗尼(Bonferroni)t检验来分析所有数据(实例7)。

图14显示m2E6(15mg/kg，腹膜内)对F28-snca转基因小鼠的海马体内的谢弗侧枝-CA1突触的基础突触传递的损害的急性有益作用。

在图14中场兴奋性突触后电位(fEPSP)被应用到谢弗侧枝的单一刺激诱发，并且基础突触传递通过测量fEPSP斜率作为刺激强度的函数进行评估。m2E6能够完全逆转缺陷。

在图15中诱导配对脉冲易化通过短期突触可塑性进行评估，其中应用具有变化的刺激间时间间隔的双刺激，并测量第二fEPSP的斜率与第一fEPSP的斜率之间的比率。m2E6对F28-snca转基因小鼠中损害的PPF没有急性作用(但观察到长期治疗后的作用)。

图16和17显示m2E6在基础突触传递的逆转损害中的急性剂量依赖性作用。5mg/kg(图16)和2.5mg/kg(图17)(腹膜内)的m2E6对F28-snca转基因小鼠的海马体内谢弗侧枝-CA1突触的基础突触传递损害的作用。数据显示m2E6对逆转缺陷的剂量依赖性作用。

场兴奋性突触后电位(fEPSP)被应用到谢弗侧枝的单一刺激诱发，并且基础突触传递通过测量fEPSP斜率作为刺激强度的函数进行评估。通过双向ANOVA与重复测量，随后进行邦费罗尼(Bonferroni)t检验来分析所有数据(实例7)。

图18显示低剂量的人源化2E6：2E6-HLD1与嵌合ch2E6(m2E6可变结构域)相比，在逆转基础突触传递的损害中增加的功效。

ch2E6和2E6-HLD1(两者均为2.5mg/kg(腹膜内))对F28-snca转基因小鼠的海马体内的谢弗侧枝-CA1突触的基础突触传递和配对脉冲易化的损害的急性作用。场兴奋性突触后电位(fEPSP)被应用到谢弗侧枝的单一刺激诱发，并且基础突触传递通过测量fEPSP斜率作为刺激强度的函数进行评估。ch2E6显示逆转损害的强烈趋势，而相同低剂量的人源化形式2E6-HLD1完全逆转了损害。

在图19中诱导配对脉冲易化通过短期突触可塑性进行评估，其中应用具有变化的刺激间时间间隔的双刺激，并测量第二fEPSP的斜率与第一fEPSP的斜率之间的比率。如用m2E6观察到的，嵌合2E6对F28-snca转基因小鼠中损害的PPF没有任何显著作用

图20和21显示m2E6降低自由活动小鼠中α-突触核蛋白的胞外水平，而9E4则不能。

图20显示全身给予2E6或对照同种型5C9(15mg/kg，腹膜内)对自由活动的F28snca转基因小鼠海马体中人α-突触核蛋白水平的作用。将基础人α-突触核蛋白作为两个连续样品(11.9±2.4ng/ml)中人α-突触核蛋白浓度的平均值，并在同一动物中设定为100％。*p<0.05，***p<0.001；2E6对比对照同种型抗体5C9

图21显示全身给予h9E4或对照同种型抗hel(两者均为15mg/kg，腹膜内)对自由活动的F28snca转基因小鼠海马体中人α-突触核蛋白胞外水平的作用。将基础人α-突触核蛋白作为2-3个连续样品(7.8±1.2ng/ml)中人α-突触核蛋白浓度的平均值，并在同一动物中设定为100％。(实例8)。

图22显示大鼠α-突触核蛋白AAV模型中抗体处理(病毒注射和电生理学测量)的时间轴的示意图(实例9)。

图23和24显示在人α-突触核蛋白超表达的大鼠中，在一个脑区域(底丘脑核)中的神经元活动模式发生了变化。用m2E6的处理使异常神经元放电模式正常化。

在未处理的GFP超表达大鼠或α-突触核蛋白超表达大鼠(在病毒注射后用对照mIgG1或m2E6(15mg/kg，腹膜内，每周两次)处理8-10周)中STN神经元的放电模式。在图23中，通过单向ANOVA、随后进行邦费罗尼(Bonferroni)事后检验来分析峰电位间隔的变异系数(CV)。用m2E6的处理导致其CV ISI降低的非显著趋势。

在图24中，通过卡方检验分析以规律、不规律或爆发放电模式放电的神经元的比例。用m2E6的处理诱导了展现出3种不同放电模式的神经元的比例的显著正常化。

N：动物的数目；n：神经元的数目。**，将PBS处理的α-突触核蛋白大鼠与未处理的GFP大鼠进行比较，**p<0.01。将¤m2E6与α-突触核蛋白超表达大鼠中的mIgG1进行比较，¤p<0.05,¤¤p<0.01(实例9)。

图25显示长期治疗(15mg/kg，腹膜内，16-18周)后，m2E6对F28-snca转基因小鼠的海马体内的谢弗侧枝-CA1突触的配对脉冲易化的有益作用。

用m2E6或对照mIgG1(5C9)的长期治疗对F28-snca转基因的和年龄匹配的对照小鼠的海马体内的谢弗侧枝-CA1突触的配对脉冲易化。场兴奋性突触后电位(fEPSP)被应用到谢弗侧枝的单一刺激诱发，并且基础突触传递通过测量fEPSP斜率作为刺激强度的函数进行评估。诱导配对脉冲易化(PPF)通过短期突触可塑性进行评估，其中应用具有变化的刺激间时间间隔的双刺激，并测量第二fEPSP的斜率与第一fEPSP的斜率之间的比率。通过双向ANOVA与重复测量，随后进行邦费罗尼(Bonferroni)t检验(对于Tg-snca+5C9对比年龄匹配的+5C9，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；对于Tg.snca+m2E6对比Tg-snca+5C9，¤p<0.05,¤¤p<0.01,¤¤¤p<0.001)来分析所有数据。(实例9)。

具体实施方式

定义

如本文所用的，术语“α-突触核蛋白”与α-突触核蛋白蛋白质同义，并且是指任何α-突触核蛋白蛋白质同种型(例如在UniProt中鉴定为P37840，1-3)。关于如下显示的SEQID NO:1，给予α-突触核蛋白的氨基酸编号，其中甲硫氨酸(M)是氨基酸残基1：

SEQ ID NO:1：

本发明涉及抗体和能够与α-突触核蛋白(并且特别是与人α-突触核蛋白)特异性结合的抗体片段。特别地，抗体及其片段展现出与人α-突触核蛋白的126-140(SEQ ID NO:2)表位特异性结合的能力。

本发明上下文中，术语“抗体(Ab)”是指免疫球蛋白分子，或根据本发明的一些实施例可以是有能力与分子(“抗原”)的表位特异性结合的免疫球蛋白分子的片段。天然存在的抗体典型地包括四聚体，它典型地由至少两条重(H)链和至少两条轻(L)链构成。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成，重链恒定区通常由3个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。重链可以具有任何同种型，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(IgA1和IgA2亚型)、IgM以及IgE。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区(CL)构成。轻链包括κ链和λ链。重链和轻链可变区典型地负责抗原识别，而重链和轻链恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫***的各种细胞(例如，效应子细胞)和经典补体***的第一组分(C1q))的结合。VH和VL区可以进一步细分成称作“互补性决定区”的超变区，它们中间穿插着更保守的称为“构架区”(FR)的区。每个VH和VL由三个CDR(互补性决定区)结构域和四个FR结构域组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。特别相关的是已经“被分离”以便存在于与它可以在自然界中存在的不同于物理环境中的或者已经被修饰以便在氨基酸序列上不同于天然存在的抗体的抗体及其抗原结合片段。

如本文所用的，术语“抗体的抗原结合片段”意指能够与表位特异性结合的抗体的片段。抗原结合片段可以含有这种抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR结构域，并且尽管能够与这种表位特异性结合，仍可以展现出对不同于这种抗体的表位的这种表位的特异性、亲和力或选择性。然而，优选地，抗原结合片段含有这种抗体的所有6个CDR结构域。抗体的抗原结合片段可以是单一多肽链(例如scFv)，或者可以包括两个或更多个多肽链，各自具有氨基末端和羧基末端(例如，双抗体、Fab片段、Fab₂片段等)。可以例如通过完整抗体的蛋白酶切割来获得展现出抗原结合能力的抗体片段。更优选地，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，此类基因序列或其编码cDNA可以将这两个结构域使用重组方法通过柔性接头连接，这些柔性接头使得这两个结构域能够成为单条蛋白链，在该单条蛋白链中VL区和VH区缔合以形成单价抗原结合分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可替代地，通过采用太短(例如，小于约9个残基)的柔性接头以使得单条多肽链的VL区和VH区缔合在一起，可以形成双特异性抗体、双抗体或类似分子(其中两条此类多肽链缔合在一起以形成二价抗原结合分子)(关于双抗体的描述，参见例如PNAS USA[美国国家科学院院刊]90(14),6444-8(1993))。本发明所涵盖的抗原结合片段的实例包括(i)Fab'或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或如描述于WO2007059782中的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，包含两个由二硫键在铰链区连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其实质上由VH结构域和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其实质上由VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等人,Nature[自然]341，544-546(1989))，其实质上由VH结构域组成并且被还称为结构域抗体(Holt等人；Trends Biotechnol.[生物技术趋势]2003年11月；2i(ll):484-90)；(vi)骆驼抗体或纳米抗体(Revets等人；Expert OpinBiol Ther.[生物理论专家观点]2005年1月；5_(l):l ll-24)以及(vii)分离的CDR。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分离基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接，该合成接头使得它们能够成为单一蛋白链，在该单一蛋白链中VL区和VH区配对以形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,Science[科学]242,423-426(1988)和Huston等人,PNAS USA[美国国家科学院院刊]85,5879-5883(1988))。本文进一步讨论在本发明的上下文中的这些和其他有用抗体片段。还应理解的是，除非另外指明，否则术语抗体还包括抗体样多肽，例如通过任何已知技术(例如酶促切割、肽合成和重组技术)提供的嵌合抗体和人源化抗体以及保留与抗原特异性结合能力的抗体片段(抗原结合片段)。这样产生的抗体可以具有任何同种型。如本文所用的，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。使用本领域的普通技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段；可以按与完整抗体相同的方式针对实用性容易地对能够与所希望的表位结合的适合片段进行筛选。

术语“双特异性抗体”是指含有两个独立结合结构域的抗体，每个结合结构域靶向独立的靶标。这些靶标可以是在相同靶标上的不同蛋白或不同表位。可以使用亲本单特异性二价抗体分子的HC的恒定区中的补偿氨基酸变化来制备双特异性抗体分子。所得异源二聚体抗体含有一个由两个不同亲本单特异性抗体贡献的Fab。Fc结构域中的氨基酸变化导致具有随时间稳定的双特异性的异源二聚体抗体的稳定性增加(Ridgway等人,ProteinEngineering[蛋白质工程]9,617-621(1996)，Gunasekaran等人,JBC[生物化学杂志]285,19637-19641(2010)，Moore等人,MAbs 3:6 546-557(2011)，Strop等人,JMB[微生物学与生物技术杂志]420,204-219(2012)，Metz等人,Protein Engineering[蛋白质工程]25:10571-580(2012)，Labrijn等人,PNAS[美国国家科学院院刊]110:113,5145-5150(2013),Spreter Von Kreudenstein等人,MAbs 5:5 646-654(2013))。双特异性抗体还可以包括使用ScFv融合体产生的分子。然后将两个单特异性scfv独立地连接至能够形成稳定异源二聚体的Fc结构域，以产生单个双特异性分子(Mabry等人,PEDS[蛋白质工程、设计和选择]23:3115-127(2010))。双特异性分子具有双重结合能力。例如，出于输送治疗性抗体穿过血脑屏障以治疗CNS疾病的目的，同时定位治疗靶标和转胞表面受体。

如本文所用的，术语“人源化抗体”旨在是指非人(例如鼠)抗体的形式，这些抗体是特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合子序列)，这些片段含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体CDR的残基被来自非人物种(供体抗体)(例如具有所希望的特异性、亲和力和能力的小鼠、兔、或大鼠)的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体将包含既不在受体中也不在输入的CDR或框架序列中发现的残基，而是包括进一步改进和优化抗体性能的残基。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个并且典型地是两个可变结构域，其中基本上所有的FR区是人共有序列的那些。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。抗体可以具有本领域技术人员已知的修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，它们相对于原始抗体是改变的，它们还被称为一个或多个“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR的CDR。

如本文所用的，术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点特异性诱变或在基因重排期间或在体内通过体细胞突变引入的突变)。

如本文所用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂。常规的单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。在某些实施例中，单克隆抗体可以由多于一种Fab结构域构成，由此增加对多于一种靶标的特异性。

抗体“小鼠2E6”或“m2E6”旨在意指由轻链SEQ ID NO 19和重链SEQ ID NO 20组成的抗体。

抗体“嵌合2E6”或“ch2E6”旨在意指由轻链SEQ ID NO 21和重链SEQ ID NO 22组成的抗体。

抗体“2E6-HLD-1”或“h2E6-HLD-1”或“H2E6-HLD-1”或“2E6-HLD1”旨在意指由轻链SEQ ID NO 23和重链SEQ ID NO 24组成的抗体。

抗体“2E6-HLD-2”或“h2E6-HLD-2”或“H2E6-HLD-2”或“2E6-HLD2”旨在意指由轻链SEQ ID NO 25和重链SEQ ID NO 26组成的抗体。

抗体“2E6-HLD-3”或“h2E6-HLD-3”或“H2E6-HLD-3”或“2E6-HLD3”旨在意指由轻链SEQ ID NO 27和重链SEQ ID NO 28组成的抗体。

抗体“6B6”旨在意指由轻链SEQ ID NO 45和重链SEQ ID NO 46组成的抗体。

抗体“5A1”旨在意指由轻链SEQ ID NO 29和重链SEQ ID NO 30组成的抗体。

抗体“9D7”旨在意指由轻链SEQ ID NO 31和重链SEQ ID NO 32组成的抗体。

抗体“9G11”旨在意指由轻链SEQ ID NO 33和重链SEQ ID NO 34组成的抗体。

抗体“L3”或“L3-11”(本文中可互换使用)旨在意指由轻链SEQ ID NO 37和重链SEQ ID NO 38组成的抗体。

抗体“7A10”旨在意指由轻链SEQ ID NO 39和重链SEQ ID NO 40组成的抗体。

抗体“8D9”旨在意指由轻链SEQ ID NO 41和重链SEQ ID NO 42组成的抗体。

抗体“9C12”旨在意指由轻链SEQ ID NO 43和重链SEQ ID NO 44组成的抗体。

抗体“7C4”旨在意指由轻链SEQ ID NO 35和重链SEQ ID NO 36组成的抗体。

除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号是根据EU编号***(也称为EU索引)，如描述于Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[免疫学目的蛋白质序列]，第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health[公共卫生服务，美国国立卫生研究院]，贝塞斯达，马里兰州，1991中。

如本文所用的，抗体或其抗原结合片段被说成“特异性”结合另一分子的区(即，表位)，如果它相对于替代性表位与该表位更加频繁地、更加快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力或亲合力反应或缔合的话。在一个实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段比另一个分子至少10倍更强烈地与其靶标(人α突触核蛋白)结合；优选地强至少50倍并且更优选地强至少100倍。优选地，抗体或其抗原结合片段在生理条件下(例如，在体内)结合。因此，通过与人α-突触核蛋白的氨基酸126-140([SEQ ID NO 2])“特异性结合”，我们包括该抗体或其抗原结合片段以这种特异性和/或在此类条件下与氨基酸126-140结合的能力。适合于确定这种结合的方法是本领域的普通技术人员已知的，并且示例性方法描述在所附实例中。如本文所用的，在抗体与预定抗原结合的上下文中，术语“结合”典型地是指当通过例如表面等离子体共振(SPR)技术在BIAcore 3000或T200仪器中使用抗原作为配体并且使用抗体作为分析物来确定时，以相应于约10^-7M或更小(例如约10^-8M或更小，例如约10^-9M或更小)的KD的亲和力的结合，并且相比于与不是预定抗原或密切相关抗原的非特异性抗原(例如BSA，酪蛋白)结合的亲和力，以相应于低至少十倍例如低至少100倍、例如低至少1,000倍、例如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍的KD的亲和力与该预定抗原结合。使亲和力更低的量依赖于抗体的KD，从而当抗体的KD非常低时(即抗体是高度特异性的)，则使针对抗原的亲和力低于针对非特异性抗原的亲和力的量可以是至少10,000倍。

如本文所用的，术语“kd”(sec-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值又称为koff值。

如本文所用的，术语“ka”(M-1x sec-1或1/Msec)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。

如本文所用的，术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数并且通过kd除以ka获得。

如本文所用的，术语“KA”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数并且通过ka除以kd获得。

CDR残基的单一氨基酸改变可以导致功能性结合的损失的事实(Rudikoff,S.等(1982)“Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity[改变抗原结合特异性的单一氨基酸取代]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]79(6):1979-1983)提供了用于***地鉴定替代性功能CDR序列的手段。在用于获得此类变体CDR的一个优选方法中，诱变编码CDR的多核苷酸(例如经由随机诱变或通过定点方法(例如聚合酶链介导的采用编码突变座位的引物进行的扩增))以产生具有经取代的氨基酸残基的CDR。通过比较原始(功能性)CDR序列中的相关残基的身份与取代的(非功能性)变体CDR序列的身份，可以鉴定出该取代的BLOSUM62.iij取代得分。BLOSUM***提供了通过分析受信任的比对的序列的数据库而创建的氨基酸取代的矩阵(Eddy,S.R.(2004)“Where DidThe BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From？[BLOSUM62比对得分矩阵来自哪里？]”，Nature Biotech.[自然生物技术]22(8):1035-1036；Henikoff,J.G.(1992)“Aminoacid substitution matrices from protein blocks[来自蛋白质块的氨基酸取代矩阵]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]89:10915-10919；Karlin,S.等人(1990)“Methods For Assessing The Statistical Significance Of MolecularSequence Features By Using General Scoring Schemes[用于通过使用一般评分方案评估分子序列特征的统计学显著性的方法]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]87:2264-2268；Altschul,S.F.(1991)“Amino Acid Substitution Matrices FromAn Information Theoretic Perspective[从信息理论角度的氨基酸取代矩阵]”，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]219,555-565)。目前，最先进的BLOSUM数据库是BLOSUM62数据库(BLOSUM62.iij)。表1呈现了BLOSUM62.iij取代得分(得分越高取代越保守，并且因此更加可能地，该取代将不会影响功能)。如果包含所得CDR的抗原结合片段不能与例如α-突触核蛋白结合，则BLOSUM62.iij取代得分被认为是不充分保守的，并且选择且产生新的具有更高取代得分的候选取代。因此，例如，如果原始残基是谷氨酸(E)并且非功能性取代残基是组氨酸(H)，则BLOSUM62.iij取代得分将为0，并且更保守的变化(例如到天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或赖氨酸)是优选的。

本发明因此考虑了随机诱变用于鉴定改善的CDR的用途。在本发明的上下文中，保守取代可以由反映在以下三个表中的一个或多个中的氨基酸类别内的取代定义：

保守取代的氨基酸残基类别：

替代性保守氨基酸残基取代类别：

/>

氨基酸残基的替代性物理和功能分类：

更保守的取代分组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。

另外组的氨基酸还可以使用描述于例如Creighton(1984)Proteins:Structureand Molecular Properties[蛋白质：结构和分子特性](第2版1993)，W.H.Freeman andCompany[W.H.弗里曼公司]中的原则来配制。

噬菌体展示技术可以可替代地用于增加(或降低)CDR亲和力。被称为亲和力成熟的这种技术采用诱变或“CDR步移”并且重选择使用靶标抗原或其抗原性抗原结合片段来鉴定具有如下CDR的抗体，这些CDR当与初始抗体或亲本抗体相比时以更高(或更低)亲和力与抗原结合(参见例如，Glaser等人(1992)J.Immunology[免疫学杂志]149:3903)。诱变整个密码子而不是单个核苷酸产生氨基酸突变的半随机谱。可构建由一组变体克隆所组成的库，每一克隆都在单个CDR中相差单个氨基酸改变，并且这些克隆包含代表了每个CDR残基的每个可能氨基酸取代的变体。可通过使固定化突变体与经标记的抗原相接触来筛选对抗原的结合亲和力增加(或减少)的突变体。本领域中已知的任何筛选方法(例如ELISA)可以用于鉴定对抗原具有增加或降低的亲和力的突变体抗体(参见Wu等人1998,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]95:6037；Yelton等人,1995,J.Immunology[免疫学杂志]155:1994)。可以可能地使用使轻链随机化的CDR步移(参见例如Schier等人,1996,J.Mol.Bio.[分子生物学杂志]263:551)。

用于完成此类亲和力成熟的方法描述于例如：Krause,J.C.等人(2011)“AnInsertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture EnhancesFunction Of A Human Antibody[扭曲抗体结合位点构造的***突变增强了人抗体的功能]”，MBio.2(1)pii:e00345-10.doi:10.1128/mBio.00345-10；Kuan,C.T.等人(2010)“Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins TargetingMalignant Gliomas And Melanomas[靶向恶性胶质瘤和黑色素瘤的亲和力成熟的抗糖蛋白NMB重组免疫毒素]”，Int.J.Cancer[国际癌症杂志]10.1002/ijc.25645；Hackel,B.J.等人(2010)“Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder FunctionalityLandscapes[稳定性和CDR组成偏移丰富了结合物功能景观]”，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]401(1):84-96；Montgomery,D.L.等人(2009)“Affinity Maturation AndCharacterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41[针对HIV-1gp41的人单克隆抗体的亲和力成熟和表征]”，MAbs 1(5):462-474；Gustchina,E.等人(2009)“Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop OfA Monoclonal Fab Derived From A SyntheticHuman Antibody Library AndDirected Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set OfFabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth[通过衍生自合成原初人抗体文库并且针对Gp41的内部三聚卷曲螺旋的单克隆Fab的CDR-H2环的靶向多样化的亲和力成熟产生了一组具有改善的HIV-1中和效力和幅度的Fab]”，Virology[病毒学]393(1):112-119；Finlay,W.J.等人(2009)“Affinity Maturation Of A Humanized RatAntibody For Anti-RAGE Therapy:Comprehensive Mutagenesis Reveals A High LevelOf Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions[用于抗RAGE疗法的人源化大鼠抗体的亲和力成熟：全面诱变揭示在互补决定区内外同时存在的高水平的突变可塑性]”，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]388(3):541-558；Bostrom,J.等人(2009)“Improving Antibody Binding Affinity AndSpecificity For Therapeutic Development[改善抗体结合亲和力和特异性用于治疗开发]”，Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]，525:353-376；Steidl,S.等人(2008)“InVitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification[通过靶向的CDR多样化的人GM-CSF抗体的体外亲和力成熟]”，Mol.Immunol.[分子免疫学]46(1):135-144；和Barderas,R.等人(2008)“AffinityMaturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling[通过计算机建模辅助的抗体的亲和力成熟]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]105(26):9029-9034。

术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的抗原决定簇。表位通常由例如氨基酸或糖侧链分子的表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于与前者而非后者的结合在变性溶剂的存在下缺失。表位可以包含直接牵涉在结合中的氨基酸残基以及其他没有直接牵涉在结合中的氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换言之，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的作用范围之内)。

如本文所用的，术语“治疗(treatment或treating)”意指减轻、减慢或逆转疾病或障碍的进展或严重性、或者减轻、减慢或逆转这种疾病或障碍的一种或多种症状或副作用。出于本发明的目的，“治疗(treatment或treating)”另外意指用于获得有益的或所希望的临床结果的方法，其中“有益的或所希望的临床结果”包括但不限于症状的缓解、障碍或疾病程度的减小、稳定化的(即没有恶化的)疾病或障碍状态、疾病或障碍状态进展的延缓或减慢、疾病或障碍状态的减轻或缓和以及疾病或障碍的减退，不论是部分地或全部地、可检测出的或不可检测出的。

当应用于本发明的抗体时，“有效量”是指在所需剂量和持续时期下足以实现预期生物作用或所希望的治疗结果(包括而不限于临床结果)的量。当应用于本发明的抗体时，短语“治疗有效量”旨在表示抗体足以减轻、缓和、稳定、逆转、减慢或延缓障碍或疾病状态的进展、或者该障碍或疾病的症状的进展的量。在实施例中，本发明的方法提供用于与其他化合物相组合来给予该抗体。在此类情况下，“有效量”是足以引起预期的生物作用的该组合的量。

抗α-突触核蛋白抗体的治疗有效量可以根据以下因素而变化，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗α-突触核蛋白抗体在个体中引起所希望的应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有利作用大于抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。

本发明提供了单克隆抗体，其与本文中表示为2E6的抗体竞争结合α-突触核蛋白上的表位。特别地，抗体与氨基酸126-140(SEQ ID No 2)内的表位特异性结合。在具体的实施例中，抗体可以与包含P138、E139和A140或由其组成的表位结合。

抗体优选地是人源化抗体。

因此，本发明涉及单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

SEQ ID NO:3或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

SEQ ID NO:5或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

单克隆抗体或其抗原结合片段可包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

SEQ ID NO:6或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

SEQ ID NO:7或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

SEQ ID NO:8或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

根据实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链可变区。

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区。

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区。

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列和SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链可变区。

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链可变区。

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区。

在另一个实施例中，本发明涉及单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

SEQ ID NO:9或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

单克隆抗体或抗原结合片段可包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

SEQ ID NO:12或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链可变区。

在另一个实施例中，本发明涉及单克隆抗体或抗原结合片段，该单克隆抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

SEQ ID NO:10或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

SEQ ID NO:18或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列或由其组成。

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区。

在本发明的另一个实施例中，本发明涉及单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

SEQ ID NO:11或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链可变区。

根据本发明的另一个实施例，本发明涉及单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

SEQ ID NO:13或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

SEQ ID NO:16或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含氨基酸序列的轻链可变区。根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变区。

SEQ ID NO:14或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链可变区。

根据本发明的实施例，本发明涉及单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

SEQ ID NO:15或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或由其组成重链可变区。

根据本发明的另一个实施例，本发明涉及单克隆抗体或抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

SEQ ID NO:17或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

根据另一个实施例，单克隆抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或由其组成的重链可变区。

根据一个实施例，抗体可以不能经由已知的免疫球蛋白受体引发免疫应答。可以改变抗体以限制或降低其与已知免疫球蛋白受体相互作用的能力。例如，抗体可以是去糖基化的、含有重链恒定区中的氨基酸变化、或两者。

本发明还提供了在患者中减少α-突触核蛋白聚集体的形成的方法，该方法包括向需要此类治疗的患者给予治疗有效量的本发明的抗体。

此外，抗体可以与药学上可接受的载体、稀释剂和/或稳定剂一起处于组合物中。本发明的抗体可以在疗法中使用。特别地，本发明的抗体可以被用于治疗共核蛋白病，例如帕金森氏病(包括帕金森氏病的特发性和遗传性形式)、戈谢病、弥漫性路易体病(DLBD)、阿尔茨海默氏病的路易体变体(LBV)、组合型阿尔茨海默氏和帕金森氏病、纯自主神经衰竭和多***萎缩。本发明的抗体还能够基于处于发展PD风险的人的基因档案治疗这些人和/或治疗处于发展非PD核心症状风险的人，这些非PD核心症状将来可能使这些人发展PD。

治疗可以是长期的并且患者可以接受至少2周(例如至少持续1个月、6个月、1年或更久)治疗。

本发明的抗体可以例如是通过杂交瘤方法产生的单克隆抗体，该方法首次由Kohler等人,Nature[自然]256,495(1975)进行描述，或者可以是通过重组DNA方法产生的单克隆抗体。还可以使用在例如Clackson等人,Nature[自然]352,624-628(1991)和Marks等人,J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]222,581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。单克隆抗体可以从任何适合的来源获得。因此，例如，单克隆抗体可以从制备自鼠类脾脏B淋巴细胞的杂交瘤获得，这些淋巴细胞获得自用目的抗原或编码目的抗原的核酸免疫的小鼠，例如，这些淋巴细胞处于在表面表达该抗原的细胞的形式。单克隆抗体还可以衍生自免疫的人的或非人哺乳动物(例如大鼠、兔、狗、绵羊、山羊、灵长类动物等)的表达抗体的细胞的杂交瘤获得。

在一个实施例中，本发明的抗体是人抗体。可以使用携带部分人免疫***和部分灭活的小鼠抗体库的转基因或转染色体小鼠产生针对α-突触核蛋白的人单克隆抗体。这种转基因和转染色体小鼠包括本文分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠。

HuMAb小鼠含有人免疫球蛋白基因微基因座连同靶向突变，该微基因座编码非重排人重链可变和恒定(μ和Y)以及轻链可变和恒定(κ)链免疫球蛋白序列，该靶向突变使内源性μ和κ链基因座失活(Lonberg,N.等人,Nature[自然]368,856-859(1994))。因此，这种小鼠展示出小鼠IgM或IgK的表达减少，并且应答于免疫，所引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgG、κ单克隆抗体(Lonberg,N.等人(1994)，同上；综述于Lonberg,N.,Handbook of Experimental Pharmacology[实验药物学手册]113,49-101(1994)，Lonberg,N.和Huszar,D.,Intern.Rev.Immunol.[国际免疫学评论]第13卷65-93(1995)，以及Harding,F.和Lonberg,N.,Ann.N.Y.Acad.Sci[纽约科学院年刊]764536-546(1995))。HuMAb小鼠的制备详细描述于Taylor,L.等人,Nucleic Acids Research[核酸研究]20,6287-6295(1992)，Chen,J.等人,International Immunology[国际免疫学]5,647-656(1993)，Tuaillon等人,J.Immunol.[免疫学杂志]152,2912-2920(1994)，Taylor,L.等人,International Immunology[国际免疫学]6,579-591(1994)，Fishwild,D.等人,Nature Biotechnology[自然生物技术]14,845-851(1996)。还参见US 5,545,806、US5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,789,650、US 5,877,397、US 5,661,016、US5,814,318、US 5,874,299、US 5,770,429、US 5,545,807、WO 98/24884、WO 94/25585、WO93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918以及WO 01/09187。

HCo7、HCo12、HCo17和HCo20小鼠在其内源性轻链(κ)基因中具有JKD破坏(如描述于Chen等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12,(1993))，在其内源性重链基因中具有种CMD破坏(如描述于WO 01/14424的实例1)以及KCo5人κ轻链转基因(如描述于Fishwild等人,Nature Biotechnology[自然生物技术]14,845-851(1996))。此外，HCo7小鼠具有HCo7人重链转基因(如描述于US 5,770,429)，HCo12小鼠具有HCo12人重链转基因(如描述于WO01/14424的实例2)，HCo17小鼠具有HCo17人重链转基因(如描述于WO 01/09187的实例2)并且HCo20小鼠具有HCo20人重链转基因。所得小鼠在对内源性小鼠重链和κ轻链座位破坏纯合的背景下表达人免疫球蛋白重链和κ轻链转基因。

在KM小鼠品系中，内源性小鼠κ轻链基因已经被同型结合地破坏，如描述于Chen等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12,811-820(1993)，并且内源性小鼠重链基因已经被同型结合地破坏，如描述于WO 01/09187的实例1。这个小鼠品系携带人κ轻链转基因KCo5，如描述于Fishwild等人,Nature Biotechnology[自然生物技术]14,845-851(1996)中。这个小鼠品系还携带由染色体14片段hCF(SC20)构成的人重链转染色体，如描述于WO02/43478中。HCo12-Balb/c、HCo17-Balb/c和HCo20-Balb/c小鼠可以通过将HCo12、HCo17和HCo20与KCo5[J/K](Balb)杂交来产生，如描述于WO 09/097006中。

来自这些转基因小鼠的脾细胞可以用于根据熟知的技术产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤。本发明的人单克隆抗体或多克隆抗体或者源于其他物种的本发明的抗体还可以通过产生对于目的免疫球蛋白重链和轻链序列而言转基因的另一非人哺乳动物或植物并且从其中产生可回收形式的抗体而转基因地产生。与哺乳动物中的转基因生产相结合，抗体可以从山羊、奶牛或其他哺乳动物的乳中产生和回收。参见例如US 5,827,690、US 5,756,687、US 5,750,172和US 5,741,957。

本发明的抗体可以具有任何同种型。同种型的选择典型地将由所希望的效应子功能(例如ADCC诱导)来指导。示例性同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用人轻链恒定区κ或λ中任一者。如果希望的话，可以通过已知方法转换本发明的抗α-突触核蛋白抗体的类别。例如，最初是IgM的本发明抗体可以类别转换为本发明的IgG抗体。此外，类别转换技术可以用来将一个IgG亚类转化成另一亚类，例如从IgGl到IgG2。因此，本发明的抗体的效应子功能可以通过同种型切换变为例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体，用于各种治疗用途。在一个实施例中，本发明的抗体是IgG1抗体，例如IgG1，

在一个实施例中，本发明的抗体是全长抗体，优选IgG抗体，特别是IgG1，抗体。在另一个实施例中，本发明的抗体是抗体片段或单链抗体。

在某些实施例中，嵌合抗体经工程化以成为人源化抗体。典型地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)衍生自非人抗体，并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选地还包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法综述于例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.[生物科学前沿杂志]13:1619-1633(2008)，并进一步描述于例如，Riechmann等人,Nature[自然]332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat'lUSA[美国国家科学院学报]86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321、和7,087,409；Kashmiri等人,Methods[方法]36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.[分子]抗体片段可以是例如通过使用常规技术的片段化获得，并且按与如本文针对完整抗体描述的相同方式针对实用性对片段进行筛选。例如，F(ab')2片段可以通过用胃蛋白酶处理抗体而产生。可以处理所得F(ab')2片段以减少二硫桥，以产生Fab'片段。Fab片段可以通过用木瓜蛋白酶处理IgG抗体而获得；Fab'片段可以用胃蛋白酶消化IgG抗体而获得。F(ab')2片段还可以通过经由硫醚键或二硫键结合以下描述的Fab'来产生。Fab'片段是通过切割F(ab')2的铰链区的二硫键获得的抗体片段。Fab'片段可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理F(ab')2片段获得。抗体片段还可以通过在重组细胞中表达编码此类片段的核酸产生(参见例如Evans等人,J.Immunol.Meth.[免疫学方法杂志]184,123-38(1995))。例如，编码F(ab')2片段一部分的嵌合基因可以包括编码CH1结构域和H链的铰链区的DNA序列，随后为翻译终止密码子，以产生这样一种截短的抗体片段分子。

在一个实施例中，抗α-突触核蛋白抗体是单价抗体，优选地是具有铰链区缺失的单价抗体，如描述于WO 2007059782(将其通过援引以其全文并入本文)中。因此，在一个实施例中，抗体是单价抗体，其中所述抗α-突触核蛋白抗体通过以下方法构建，该方法包括：i)提供编码所述单价抗体的轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码所选抗原特异性抗α-突触核蛋白抗体的VL区的核苷酸序列和编码Ig的恒定CL区的核苷酸序列，其中编码所选抗原特异性抗体的VL区的所述核苷酸序列和编码Ig的CL区的所述核苷酸序列被可操作地连接在一起，并且其中，在IgG1亚型的情况下，编码CL区的核苷酸序列已经被修饰，这样使得在多克隆人IgG的存在下或当给予给动物或人时，该CL区不含有能够与包含该CL区的一致氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价键的任何氨基酸；ii)提供编码所述单价抗体的重链的核酸构建体，所述构建体包含编码所选抗原特异性抗体的VH区的核苷酸序列和编码人Ig的恒定CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的核苷酸序列已经被修饰，这样使得在多克隆人IgG的存在下或当给予给动物、人时，对应于铰链区和(如由Ig亚型所要求的)CH区的其他区(例如CH3区)的区不包含参与和包含人Ig的CH区的一致氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价或稳定的非共价重链间键的任何氨基酸残基，其中编码所选抗原特异性抗体的VH区的所述核苷酸序列和编码所述Ig的CH区的所述核苷酸序列被可操作地连接在一起；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达***；iv)通过在(iii)的细胞表达***的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体来产生所述单价抗体。

类似地，在一个实施例中，抗α-突触核蛋白抗体是单价抗体，该单价抗体包含：

(i)如本文描述的本发明的抗体的可变区或所述区的抗原结合部分，以及

(ii)免疫球蛋白的CH区或其包含CH2和CH3区的抗原结合片段，其中该CH区或其抗原结合片段已经被修饰，这样使得对应于铰链区和(如果该免疫球蛋白不是IgG4亚型的话)CH区的其他区(例如CH3区)不包含任何氨基酸残基，这些任何氨基酸残基能够与一致的CH区形成二硫键或在多克隆人IgG的存在下与一致的CH区形成其他共价或稳定的非共价重链间键。

在另外的实施例中，单价α-突触核蛋白抗体的重链已经被修饰，这样使得已经缺失整个铰链。

在另一个另外的实施例中，所述单价抗体的序列已经被修饰，这样使得它不包含用于N-连接的糖基化的任何受***点。

在另一个另外的实施例中，突触核蛋白抗体的单价Fab连接到另外的靶向不同蛋白的Fab或scfv，以产生双特异性抗体。双特异性抗体可以具有双重功能，例如由抗突触核蛋白结合结构域赋予的治疗功能和可以与受体分子结合以增强跨生物屏障(例如血脑屏障)转移的转运功能。

本发明的抗α-突触核蛋白抗体还包括单链抗体。单链抗体是其中重链和轻链Fv区相连的肽。在一个实施例中，本发明提供了单链Fv(scFv)，其中本发明的抗α-突触核蛋白抗体的Fv中的重链和轻链由柔性肽接头(典型地为约10、12、15或更多个氨基酸残基)连接成单条肽链。产生此类抗体的方法描述于例如US 4,946,778；Pluckthun，在ThePharmacology of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体药理学],第113卷,Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag[施普林格出版公司],纽约，第269-315页(1994)；Bird等人,Science[科学]242,423-426(1988)；Huston等人,PNAS USA[美国国家科学院院刊]85,5879-5883(1988)和McCafferty等人,Nature[自然]348,552-554(1990)。单链抗体可以是单价的，如果仅使用单个VH和VL的话；可以是二价的，如果使用两个VH和VL的话；或可以是多价的，如果使用两个以上VH和VL的话。

通常，可以通过包含任何适合数目的修饰的氨基酸和/或与此类缀合取代基缔合来修饰本文描述的抗α-突触核蛋白抗体。在此上下文中适合性通常由至少基本上保留与非衍生化亲本抗α-突触核蛋白抗体相关的α-突触核蛋白选择性和/或α-突触核蛋白特异性的能力决定。该一个或多个修饰氨基酸的包含在以下方面可以是有利的，例如，增加多肽血清半衰期，降低多肽抗原性，或增加多肽储存稳定性。对一种或多种氨基酸进行修饰，例如，在重组产生的过程中与翻译同时进行或在翻译之后进行(例如，在哺乳动物细胞中表达过程中在N-X-S/T基序上的N-连接的糖基化作用)，或通过合成手段进行修饰。修饰的氨基酸的非限制性实例包括糖基化的氨基酸、硫酸化的氨基酸、异戊二烯化(例如，法尼基化、香叶基-香叶基化(geranylgeranylated))的氨基酸、乙酰化的氨基酸、酰化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、羧基化的氨基酸、磷酸化的氨基酸等。足够指导本领域中的普通技术人员进行氨基酸修饰的参考文献在文献中相当充分。示例性方案见于Walker(1998)Protein Protocols On CD-Rom[只读型光盘蛋白质指南]，Humana Press[胡马纳出版社]，Totowa[托托瓦]，新泽西州。修饰的氨基酸可以例如选自糖基化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、缀合到脂质部分的氨基酸或缀合到有机衍化剂的氨基酸。

抗α-突触核蛋白抗体还可以通过共价缀合到聚合物而化学地修饰，以例如增加其循环半衰期。示例性聚合物以及将它们附接到肽的方法说明于例如US 4,766,106；US 4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546中。另外的说明性聚合物包括聚氧乙基化的多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，分子量在约1,000与约40,000之间，例如在约2,000与约20,000之间，例如约3,000-12,000g/mol的PEG)。

抗体可以进一步用在诊断方法中或用作诊断成像配体。

在一个实施例中，提供了包含一个或多个放射性标记的氨基酸的抗α-突触核蛋白抗体。放射性标记的抗α-突触核蛋白抗体可以用于诊断和治疗两种目的(缀合到放射性标记的分子是另一可能特征)。此类标记的非限制性实例包括但不限于铋(²¹³Bi)、碳(¹¹C、¹³C、¹⁴C)、铬(⁵¹Cr)、钴(⁵⁷Co、⁶⁰Co)、铜(⁶⁴Cu)、镝(¹⁶⁵Dy)、铒(¹⁶⁹Er)、氟(¹⁸F)、钆(¹⁵³Gd、¹⁵⁹Gd)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、锗(⁶⁸Ge)、金(¹⁹⁸Au)、钬(¹⁶⁶Ho)、氢(³H)、铟(¹¹¹In、¹¹²In、¹¹³In、¹¹⁵In)、碘(¹²¹I、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I)、铱(¹⁹²Ir)、铁(⁵⁹Fe)、氪(^81mKr)、镧(¹⁴⁰La)、镥(¹⁷⁷Lu)、锰(⁵⁴Mn)、钼(⁹⁹Mo)、氮(¹³N、¹⁵N)、氧(¹⁵O)、钯(¹⁰³Pd)、磷(³²P)、钾(⁴²K)、镨(¹⁴²Pr)、钷(¹⁴⁹Pm)、铼(¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re)、铑(¹⁰⁵Rh)、铷(⁸¹Rb、⁸²Rb)、钌(⁸²Ru、⁹⁷Ru)、钐(¹⁵³Sm)、钪(⁴⁷Sc)、硒(⁷⁵Se)、钠(²⁴Na)、锶(⁸⁵Sr、⁸⁹Sr、⁹²Sr)、硫(³⁵S)、锝(⁹⁹Tc)、铊(²⁰¹Tl)、锡(¹¹³Sn、¹¹⁷Sn)、氙(¹³³Xe)、镱(¹⁶⁹Yb、¹⁷⁵Yb、¹⁷⁷Yb)、钇(⁹⁰Y)以及锌(⁶⁵Zn)。用于制备放射性标记的氨基酸和相关肽衍生物的方法在本领域是已知的(参见例如，Junghans等人,在Cancer Chemotherapy and Biotherapy[癌症化疗和生物疗法]655-686(第2版，Chafner和Longo编辑，Lippincott Raven[利平科特瑞文公司](1996))以及US 4,681,581、US 4,735,210、US 5,101,827、US 5,102,990(US RE35,500)、US 5,648,471和US 5,697,902)。例如，放射性同位素可以氯胺T方法进行缀合(Lindegren,S.等人(1998)“Chloramine-T In High-Specific-Activity Radioiodination OfAntibodies Using N-Succinimidyl-3-(Trimethylstannyl)Benzoate As AnIntermediate[使用N-琥珀酰亚胺基-3-(三甲基锡烷基)苯甲酸酯作为中间体的抗体的高比活放射性碘化中的氯胺-T]”，Nucl.Med.Biol.[核医学与生物学]25(7):659-665；Kurth,M.等人(1993)“Site-Specific Conjugation Of A Radioiodinated PhenethylamineDerivative To A Monoclonal Antibody Results In Increased RadioactivityLocalization In Tumor[放射性碘化的苯乙胺衍生物至单克隆抗体的位点特异性缀合在肿瘤中产生增加的放射性]”，J.Med.Chem.[药物化学杂志]36(9):1255-1261；Rea,D.W.等人(1990)“Site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors[用于靶向肿瘤的位点特异性放射性碘化的抗体]”，Cancer Res.[癌症研究]50(3增刊):857s-861s)。

本发明还提供了使用以下可检测地标记的抗α-突触核蛋白抗体：荧光标记(例如稀土螯合物(例如，铕螯合物))、荧光素型标记(例如，荧光素、荧光素异硫氰酸酯、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、二氯三嗪基胺荧光素)、罗丹明型标记(例如，ALEXA568(英杰公司(Invitrogen))、/>或丹磺酰氯)、VIVOTAG 680 XL FLUOROCHROME^TM(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))、藻红蛋白；伞形酮、丽丝胺；花菁；藻红蛋白、德克萨斯红、BODIPY/>(英杰公司)或其类似物，所有这些都适用于光学检测。可以采用化学发光标记(例如，鲁米诺、荧光素酶、荧光素和水母蛋白)。这种诊断和检测还可以通过将本发明的诊断分子偶合至可检测物质(包括但不限于各种酶，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶)或者偶合至辅基复合体(例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素)来完成。

可以采用化学发光标记(例如，鲁米诺、荧光素酶、荧光素和水母蛋白)。这种诊断和检测还可以通过将本发明的诊断分子偶合至可检测物质(包括但不限于各种酶，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶)或者偶合至辅基复合体(例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素)来完成。还可以采用顺磁性标记，并且优选地使用正电子发射断层术(PET)或单光子发射计算机断层术(SPECT)进行检测。此类顺磁性标记包括但不限于含有铝(Al)、钡(Ba)、钙(Ca)、铈(Ce)、镝(Dy)、铒(Er)、铕(Eu)、钆(Gd)、钬(Ho)、铱(Ir)、锂(Li)、镁(Mg)、锰(Mn)、钼(M)、钕(Nd)、锇(Os)、氧(O)、钯(Pd)、铂(Pt)、铑(Rh)、钌(Ru)、钐(Sm)、钠(Na)、锶(Sr)、铽(Tb)、铥(Tm)、锡(Sn)、钛(Ti)、钨(W)和锆(Zi)并且特别是Co⁺²、CR⁺²、Cr⁺³、Cu⁺²、Fe⁺²、Fe⁺³、Ga⁺³、Mn⁺³、Ni⁺²、Ti⁺³、V⁺³和V⁺⁴的顺磁离子的化合物，使用各种正电子发射断层术的正电子发射金属以及非放射性顺磁金属离子。

因此，在一个实施例中，可以用荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记来标记本发明的抗α-突触核蛋白抗体。可以使用经标记的抗体检测或测量所述α-突触核蛋白在受试者的脑中的存在或量。此方法可以包括检测或测量与所述α-突触核蛋白结合的抗α-突触核蛋白抗体的体内成像，并且可以包括与所述抗α-突触核蛋白结合的所述抗α-突触核蛋白抗体的离体成像。

在另外的方面，本发明涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的一条或多条多肽链的表达载体。此类表达载体可以用于重组产生本发明的抗体。

在本发明的上下文中，表达载体可以是任何适合的DNA或RNA载体，包括染色体载体、非染色体载体和合成核酸载体(包含一组适合的表达控制元件的核酸序列)。此类载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒与噬菌体DNA的组合的载体以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施例中，编码抗α-突触核蛋白抗体的核酸被包含在裸DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件(如描述于例如Sykes和Johnston,Nat Biotech[自然生物技术]12,355-59(1997))、紧凑型核酸载体(如描述于例如US 6,077,835和/或WO 00/70087)、质粒载体(例如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119)、“侏儒(midge)”最小尺寸的核酸载体(如描述于例如Schakowski等人,MoI Ther[分子治疗学]3,793-800(2001))，或作为沉淀型核酸载体构建体，例如CaPO₄沉淀型构建体(如描述于例如WO 00/46147；Benvenisty和Reshef,PNAS USA[美国国家科学院院刊]83,9551-55(1986)；Wigler等人,Cell[细胞]14,725(1978)以及Coraro和Pearson,Somatic CellGenetics[体细胞遗传学]2,603(1981))。此类核酸载体及其使用在本领域是熟知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。

在一个实施例中，载体适用于在细菌细胞中表达抗α-突触核蛋白抗体或其抗α-突触核蛋白结合抗原结合片段。此类载体的实例包括以下表达载体，例如BlueScript(Stratagene公司)、pIN载体(Van Heeke和Schuster,J Biol Chem[生物化学杂志]264,5503-5509(1989))、pET载体(Novagen公司，麦迪逊，威斯康星州)等。

表达载体还可以是或可替代地是适用于在酵母***中进行表达的载体。可以采用任何适用于在酵母***中进行表达的载体。适合的载体包括例如包含组成型或诱导型启动子(例如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体(综述于：F.Ausubel等人编辑Current Protocolsin Molecular Biology[分子生物学实验指南],Greene Publishing and WileyInterScience[格林出版和威利国际科学]纽约(1987)，和Grant等人,Methods in Enzymol[酶学方法]153,516-544(1987))。

在本发明的表达载体中，编码抗α-突触核蛋白抗体的核酸可以包含任何适合的启动子、增强子和其他有助于表达的元件或者与其缔合。此类元件的实例包括强表达型启动子(例如，人CMV IE启动子/增强子连同RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR启动子)、有效的聚(A)终止序列、用于在大肠杆菌中产生质粒的复制起点、作为选择性标志的抗生素抗性基因和/或便利的克隆位点(例如，多聚接头)。核酸还可以包含与组成型启动子(如CMV IE)相对的诱导型启动子(本领域的技术人员应认识到此类术语实际上是在某些条件下的基因表达程度的描述语)。

在甚至另外的方面，本发明涉及重组真核或原核宿主细胞，例如转染瘤，其产生如本文定义的本发明的抗体或者如本文定义的本发明的双特异性分子。宿主细胞的实例包括酵母、细菌、和哺乳动物细胞，例如CHO或HEK细胞。例如，在一个实施例中，本发明提供了包含稳定地整合进细胞基因组中的核酸的细胞，该基因组包含编码本发明的抗α-突触核蛋白抗体或其α-突触核蛋白结合抗原结合片段的表达的序列。在另一个实施例中，本发明提供了包含非整合型核酸(例如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件)的细胞，该核酸包含编码本发明的抗α-突触核蛋白抗体的表达的序列。

在另外的方面，本发明涉及用于产生本发明的抗α-突触核蛋白抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)培养如在上文描述的本发明的杂交瘤或宿主细胞，并且b)从培养基中纯化本发明的抗体。

在甚至另外的方面，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含：

-如本文定义的抗α-突触核蛋白抗体，和

-药学上可接受的载体。

这些药物组合物可以用药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂根据常规技术配制，这些常规技术是例如在以下中披露的技术：Remington:TheScience and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，第22版，Gennaro编辑，马克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿，宾夕法尼亚，2013。

药学上可接受的载体或稀释剂连同任何其他已知的佐剂和赋形剂应该适合于本发明的所选化合物和所选给予方式。基于就抗原结合而言对本发明的所选化合物或药物组合物的所希望的生物特性的显著不利影响的缺少(例如，小于实质性影响(10％或更少相对抑制、5％或更少相对抑制等))来确定药物组合物的载体和其他组分的适合性。

本发明的药物组合物还可以包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如，非离子型洗涤剂(如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如，无糖或无蛋白氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂、和/或其他适用于包含于药物组合物中的材料。以不影响组合物的生物活性为目的来选择稀释剂。此类稀释剂的实例为蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液。此外，药物组合物或配制品还可以包含其他载体，或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。组合物还可以包含大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖(像壳聚糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如，乳胶功能化的交联琼脂糖、琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物以及脂质聚集体(例如，油滴或脂质体)。

本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得对于特定患者、组合物和给予方式而言有效实现所希望的治疗应答的活性成分量。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明的具体组合物或其酰胺的活性，给予途径，给予时间，所采用的具体化合物的***速率，治疗持续时间，与所采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和既往病史以及医学领域熟知的类似因素。

药物组合物可以通过任何适合的途径和方式给予，包括：用于预防性和/或治疗性治疗的胃肠外、局部、口服或鼻内手段。在一个实施例中，胃肠外地给予本发明的药物组合物。如本文所用的，短语“胃肠外给予(parenteral administration)”和“胃肠外地给予(administered parenterally)”意指除肠内和局部给予之外的给予方式，通常是通过注射，并且特别是包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、皮内、腹膜内、皮下、表皮下、关节内、蛛网膜下、脊柱内注射和输注。

在体内和体外给予本发明的化合物的另外的适合途径是本领域中熟知的，并且可以由本领域普通技术人员选择。

在一个实施例中，该药物组合物是通过静脉内或皮下注射或输注来给予。

药学上可接受的载体包括任何和所有适合的溶剂、分散培养基、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂以及可与本发明的化合物生理上兼容的类似物。

可以用于本发明的药物组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及其适合的混合物、植物油(例如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油、以及芝麻油)、羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)和/或各种缓冲剂。在药物领域中其他载体是熟知的。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。使用此类培养基和药剂用于药物活性物质在本领域是已知的。除了在任何常规培养基或药剂与活性化合物不兼容的情况下，考虑了其在本发明的药物组合物中的使用。

本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

本发明的药物组合物还可以在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇、甘油)或氯化钠。

本发明的药物组合物还可以含有一种或多种适用于所选给予途径的佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，这些佐剂可以增强药物组合物的保质期或有效性。本发明的化合物可以与载体一起制备，这些载体可以保护化合物免于被快速释放，如控释配制品，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送***。此类载体可以包括明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、可生物降解的生物兼容聚合物(例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸)(单独的或与蜡一起)或本领域熟知的其他材料。用于制备此类配制品的方法通常是本领域普通技术人员已知的。参见例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems[缓释和控释递药***],J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker,Inc.[马歇尔德克公司]，纽约，1978。

在一个实施例中，可以将本发明的化合物配制成确保在体内恰当分布。用于胃肠外给予的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。使用此类培养基和药剂用于药物活性物质在本领域是已知的。除了在任何常规培养基或药剂与活性化合物不兼容的情况下，考虑了其在本发明的药物组合物中的使用。还可以将补充活性化合物掺入组合物中。

注射用药物组合物在制造和储存条件下典型地必须是无菌且稳定的。可以将组合物配制为溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)的水性或非水性溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)，通过维持所需的粒度(在分散体的情况下)和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘油、甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟抗体吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现。无菌可注射溶液可以通过按需要将所需量的活性化合物与一种例如像上文列举的成分或成分的组合掺在适当溶剂中，随后灭菌微孔过滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，该无菌载体含有基础分散介质和例如来自上文列举的那些的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这从其之前的无菌过滤溶液得到活性成分和任何另外的所希望成分的粉剂。

无菌可注射溶液可以通过按需要将所需量的活性化合物与一种上文列举的成分或成分的组合掺在适当溶剂中，随后灭菌微孔过滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，该无菌载体含有基础分散介质和来自上文列举的那些的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这从其之前的无菌过滤溶液得到活性成分和任何另外的所希望成分的粉剂。

调整在以上治疗方法和本文描述的使用中的剂量方案，以提供最佳希望的应答(例如，治疗应答)。例如，可以给予单次推注，可以随时间给予若干分次剂量或者可以由治疗情况的紧迫性所指示的按比例减少或增加剂量。为了便于给予和剂量统一，胃肠外组合物可以被配制为剂量单位形式。如本文所用的，剂量单位形式是指作为针对待治疗受试者的单一剂量适合的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生与所需药物载体相关的所希望的治疗作用的活性化合物的预定量。针对本发明的剂量单位形式的描述受指示于并且直接取决于(a)活性化合物的独特特征和待达到的具体治疗作用，以及(b)在复合这种活性化合物以在个体中获得灵敏治疗的领域中固有的限制。

抗α-突触核蛋白抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症并且可以由本领域的普通技术人员确定。在剂量给予的任何一天，剂量的范围可以从约0.01至约10mg/kg宿主体重，并且更通常是从约0.01至约5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg体重的范围内。因此示例性剂量包括：从约0.1至约10mg/kg/体重、从约0.1至约5mg/kg/体重、从约0.1至约2mg/kg/体重、从约0.1至约1mg/kg/体重，例如约0.15mg/kg/体重、约0.2mg/kg/体重、约0.5mg/kg/体重、约1mg/kg/体重、约1.5mg/kg/体重、约2mg/kg/体重、约5mg/kg/体重、或约10mg/kg/体重。

具有本领域普通技术的医师可以容易地确定并且开出所需药物组合物的有效量。例如，医师可以按低于为了达到所希望的治疗作用所需的水平开始给予药物组合物中采用的抗α-突触核蛋白抗体，并且逐步增加剂量直至达到所希望的作用。通常，本发明的组合物的适合日剂量将是有效产生治疗作用的最低剂量的化合物量。这样一个有效剂量通常将取决于上述因素。给予可以例如是静脉内的、肌内的、腹膜内的或皮下的。如果希望的话，药物组合物的有效日剂量可以在一整天以适当的时间间隔分开为两个、三个、四个、五个、六个或更多个子剂量来给予，任选地以单位剂型给予。虽然本发明的化合物可以单独给予，但是优选的是作为如上描述的药物组合物给予该化合物。本发明的标记抗体可以用于诊断目的，以检测、诊断或监测疾病或障碍。本发明提供了用于对神经退行性或认知疾病或障碍(包括但不限于阿尔茨海默氏病)的检测或诊断，包括：(a)使用与α-突触核蛋白特异性结合的一种或多种抗体，测定焦谷氨酸化的Aβ片段在受试者细胞或组织样品中的存在；和(b)将该抗原的水平与对照水平(例如，在正常组织样品中的水平)进行比较，借此相比于该抗原的对照水平而言该抗原的测定水平的增加指示该疾病或失调，或指示该疾病或失调的严重性。

使用本领域熟知的免疫组织化学方法，本发明的抗体可以用于测定生物样品中的α-突触核蛋白单体，α-突触核蛋白的寡聚体、原纤维形式或片段。有用于检测蛋白质的其他基于抗体的方法包括免疫测定(例如酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA))以及基于中型发现平台(mesoscale discovery platform)的测定(MSD)。适合的抗体标记可以用在此类试剂盒和方法中，并且本领域已知的标记包括酶标记，例如碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶；放射性同位素标记，例如碘(¹²⁵I、¹³¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹²¹In)和锝(^99mTc)；和发光标记，例如鲁米诺和荧光素酶；以及荧光标记，例如荧光素和罗丹明。

可以在体内检测经标记的抗α-突触核蛋白抗体或其α-突触核蛋白结合片段的存在，用于诊断目的。在一个实施例中，诊断包括：a)向受试者给予有效量的这种经标记分子；b)在给予之后等待一个时间间隔，以允许经标记的分子在Aβ沉积位点(如果有的话)浓缩，并且以允许未结合的经标记的分子被清除至背景水平；c)确定背景水平；并且d)检测受试者中经标记的分子，使得对超过背景水平的经标记的分子的检测指示受试者患有该疾病或障碍，或者指示该疾病或障碍的严重性。根据这种实施例，将该分子用成像部分标记，以用于使用本领域的普通技术人员已知的具体成像***检测。背景水平可以通过本领域中已知的不同方法来确定，包括将检测到的经标记的抗体的量与之前确定的针对具体成像***的标准值进行比较。可用于本发明的诊断方法中的方法以及***包括但不限于计算机断层摄影(CT)、全身扫描例如正电子发射体层摄影(PET)、磁共振成像(MRI)、以及超声检查。

在另外的方面，本发明涉及用于在医学中使用的本发明的抗体或其抗原结合片段。

在另外的方面，本发明涉及用于在共核蛋白病的治疗、诊断或成像中使用的本发明的抗体或其抗原结合片段。

在一个实施例中，单克隆抗体或其抗原结合片段用于在帕金森氏病、特发性帕金森氏病、弥漫性路易体病(DLBD)、阿尔茨海默氏病的路易体变体(LBV)、组合型阿尔茨海默氏和帕金森氏病、纯自主神经衰竭或多***萎缩的治疗中使用。

在另外的方面，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段在制造药物中的用途，该药物用于对共核蛋白病进行治疗、诊断或成像。

在另外的方面，本发明涉及对帕金森氏病或其他共核蛋白病进行治疗、诊断或成像，包括给予有效剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段。

优选地，在本发明的那些方面的用途和方法中，治疗是长期的，并且优选地持续至少2周，例如至少持续1个月、6个月、1年或更久。

在另外的方面，本发明提供了包含本发明的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。

序列

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本发明的实施例

如应从文本和实例显而易见的，本发明进一步涉及以下实施例：

实施例

1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段能够与α-突触核蛋白的氨基酸126-140(SEQ ID NO.2)内的表位特异性结合。

2.根据实施例1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段与抗体m2E6、ch2E6、2E6-HLD1、2E6-HLD2或2E6-HLD3、7A10、5A1、9D7、9G11、7C4、L3、8D9、9C12或6B6中任一个竞争结合所述表位。

3.根据实施例1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含完整抗体或由其组成。

4.根据实施例1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含选自下组的抗原结合片段或由其组成，该组由以下组成：Fv片段(例如单链Fv和二硫化物键合的Fv)，Fab样片段(例如Fab片段，Fab'片段和F(ab)₂片段)，和结构域抗体(例如单V_H可变结构域或V_L可变结构域)。

5.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体选自下组，该组由以下组成：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型的抗体。

6.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段展现出以下特性中的一种或多种：

·对于α-突触核蛋白的结合亲和力(KD)，该结合亲和力在0.5-10nM之间，例如在1-5nM之间或在1-2nM之间；

·抑制神经元细胞中α-突触核蛋白原纤维的积累的能力；

·抑制α-突触核蛋白原纤维从细胞转移到细胞的能力；

·抑制α-突触核蛋白胞内接种的能力；

·在F28-snca转基因小鼠中逆转基础突触传递的损害的能力；

·如通过体内微透析测量的，降低小鼠海马体内α-突触核蛋白的水平的能力；

·当长期给予时，使帕金森氏病大鼠模型中底丘脑核(STN)中的病理学不规律和爆发的放电模式正常化的能力；和/或

·当长期给药时，逆转转基因α-突触核蛋白小鼠海马体内PPF的损害的能力。

7.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段是人的或人源化的。

8.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:3或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:4或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:5或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

9.根据实施例8所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 3、4和5的CDR。

10.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:6或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:7或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:8或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

11.根据实施例10所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 6、7和8的CDR。

12.根据实施例8或9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或由其组成。

13.根据实施例10或11所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或由其组成。

14.根据实施例12和13所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或由其组成。

15.根据实施例8或9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由其组成。

16.根据实施例10或11所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或由其组成。

17.根据实施例15和16所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或由其组成。

18.根据实施例8或9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或由其组成。

19.根据实施例10或11所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成。

20.根据实施例18和19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成。

21.根据实施例8或9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由其组成。

22.根据实施例10或11所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由其组成。

23.根据实施例21和22所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由其组成。

24.根据实施例8或9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由其组成。

25.根据实施例10或11所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由其组成。

26.根据实施例24和25所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由其组成。

27.根据实施例8或9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由其组成。

28.根据实施例10或11所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列或由其组成。

29.根据实施例27和28所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列或由其组成。

30.根据实施例1-7中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:9或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

31.根据实施例30所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 9、4和5的CDR。

32.根据前述实施例30和31中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:12或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

33.根据实施例32所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 12、7和8的CDR。

34.根据实施例30或31所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或由其组成。

35.根据实施例32或33所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或由其组成。

36.根据实施例34和35所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或由其组成。

37.根据实施例1-7中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:10或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

38.根据实施例37所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 10、4和5的CDR。

39.根据前述实施例37或38所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:18或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

40.根据实施例39所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 6、7和18的CDR。

41.根据实施例37或38所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由其组成。

42.根据实施例39或40所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列或由其组成。

43.根据实施例41和42所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列或由其组成。

44.根据实施例37或38所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或由其组成。

45.根据实施例39和40所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或由其组成。

46.根据实施例44和45所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或由其组成。

47.根据实施例1-7中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:11或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

48.根据实施例47所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 3、4和11的CDR。

49.根据前述实施例47或49所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

50.根据实施例49所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 6、7和8的CDR。

51.根据实施例47或48所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由其组成。

52.根据实施例49或50所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由其组成。

53.根据实施例51和52所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由其组成。

54.根据实施例1-7中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

55.根据实施例54所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 3、4和5的CDR。

56.根据前述实施例54或55所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:13或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:16或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

57.根据实施例56所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 6、13和16的CDR。

58.根据实施例54或55所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或由其组成。

59.根据实施例56或57所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由其组成。

60.根据实施例58和59所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由其组成。

61.根据实施例1-7中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

62.根据实施例61所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 3、4和5的CDR。

63.根据前述实施例61或62所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:14或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

64.根据实施例63所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 6、14和8的CDR。

65.根据实施例61或62所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由其组成。

66.根据实施例63或64所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或由其组成。

67.根据实施例65和66所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或由其组成。

68.根据实施例1-7中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

69.根据实施例68所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 3、4和5的CDR。

70.根据前述实施例68或69所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:15或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

71.根据实施例70所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 6、15和8的CDR。

72.根据实施例68或69所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或由其组成。

73.根据实施例70或71所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或由其组成。

74.根据前述实施例72和73中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或由其组成。

75.根据实施例1-7中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下CDR：

76.根据实施例75所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 3、4和5的CDR。

77.根据前述实施例75或76所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:17或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

78.根据实施例77所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 6、7和17的CDR。

79.根据实施例75或76所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或由其组成。

80.根据实施例77或78所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或由其组成。

81.根据实施例79或80所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或由其组成。

82.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含Fc区。

83.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段进一步包含用于增加药剂的体内半衰期的部分。

84.根据实施例83所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该用于增加体内半衰期的部分选自下组，该组由以下组成：聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和葡聚糖。

85.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体多肽进一步包含可检测部分。

86.根据实施例85所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该可检测部分是荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记。

87.根据实施例85或86所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该可检测部分包含放射性同位素或由其组成。

88.根据实施例87所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该放射性同位素选自下组，该组由以下组成：^99mTc、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁸⁹Zr、¹²³I和²⁰¹Tl。

89.根据实施例87所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该可检测部分包含顺磁性同位素或由其组成。

90.根据实施例89所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该顺磁性同位素选自下组，该组由以下组成：¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Cr和⁵⁶Fe。

91.根据实施例85至90中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该可检测部分可通过成像技术例如SPECT、PET、MRI、光学或超声成像检测到。

92.根据实施例85至91中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该可检测部分经由连接部分间接地连接到该抗体或其抗原结合片段。

93.根据实施例92所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该连接部分选自下组，该组由以下组成：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10,四乙酸(DOTA)的衍生物、去铁胺(DFO)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物、以及1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物。

94.一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码根据前述实施例中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或其组分多肽链。

95.根据实施例94所述的核酸分子，其中该分子是cDNA分子。

96.根据实施例94或95所述的核酸分子，该核酸分子编码抗体重链或其可变区。

97.根据实施例94至96中任一项所述的核酸分子，该核酸分子编码抗体轻链或其可变区。

98.一种载体，该载体包含根据实施例94至97中任一项所述的核酸分子。

99.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含根据实施例94至97中任一项所述的核酸分子或根据实施例98所述的载体。

100.一种用于产生根据实施例1至63中任一项中所述的抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括在允许表达所编码的抗体或其抗原结合片段的条件下培养如在实施例81中定义的宿主细胞。

101.一种药物组合物，该药物组合物包含根据实施例1至81中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，以及药学可接受的载体。

102.根据实施例1-81所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，用于在医学中使用。

103.根据实施例1-81所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，用于在共核蛋白病的治疗、诊断或成像中使用。

104.根据实施例103所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，用于在帕金森氏病(包括特发性帕金森氏病)、弥漫性路易体病(DLBD)、阿尔茨海默氏病的路易体变体(LBV)、组合型阿尔茨海默氏和帕金森氏病、纯自主神经衰竭和多***萎缩的治疗中使用。

105.根据实施例1-81所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制造药物中的用途，该药物用于对共核蛋白病进行治疗、诊断或成像。

106.根据实施例105所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制造药物中的用途，该药物用于治疗帕金森氏病(包括特发性帕金森氏病)、弥漫性路易体病(DLBD)、阿尔茨海默氏病的路易体变体(LBV)、组合型阿尔茨海默氏和帕金森氏病、纯自主神经衰竭、多***萎缩、以及基于其基因图谱和/或使其未来可能发展PD的非PD核心症状而处于发展PD的风险的人。

107.一种对受试者中的共核蛋白病进行治疗、诊断或成像的方法，所述方法包括以有效量向所述受试者给予根据实施例101所述的药物组合物。

108.根据实施例103所述使用的抗体或其抗原结合片段，或根据实施例105所述的用途，或根据实施例107所述的方法，用于治疗帕金森氏病(包括特发性帕金森氏病)、弥漫性路易体病(DLBD)、阿尔茨海默氏病的路易体变体(LBV)、组合型阿尔茨海默氏和帕金森氏病、纯自主神经衰竭和多***萎缩，以及基于其基因图谱和/或使其未来可能发展PD的非PD核心症状而处于发展PD的风险的人。

109.根据实施例103、105或107所述的使用的抗体或其抗原结合片段；或用途；或方法，其中该治疗是长期的。

110.根据实施例109所述的使用的抗体或其抗原结合片段；或用途；或方法，其中该长期治疗持续至少2周，例如至少持续1个月、6个月、1年或更久。

111.根据实施例102至110中任一项所述的使用的抗体或其抗原结合片段；或用途；或方法，其中该受试者是人。

112.一种试剂盒，该试剂盒包含根据实施例1-81所述的抗体或其抗原结合片段，用于在医学中使用。

113.根据实施例85-93所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，用于在检测或测量所述α-突触核蛋白在受试者的脑或任何其他器官或体液中的存在或量中使用。

114.根据实施例113所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述检测或测量包括对与所述α-突触核蛋白结合的所述抗突触核蛋白抗体进行体内成像。

115.根据实施例85-93所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述检测或测量包括对与所述α-突触核蛋白结合的所述抗突触核蛋白抗体进行离体(ex vivo)成像。

实例

实例1：抗体发现

A.免疫/杂交瘤筛选

通过用与例如反应性醛交联的不同突触核蛋白聚集体对小鼠进行免疫来产生针对α-突触核蛋白的单克隆抗体。第一抗原由来自Rpeptide公司(4241火星山路(Mars HillRoad)，博加特(Bogart)，GA 30622，美国)的重组冻干α-突触核蛋白制成。其通过将蛋白质溶解在PBS中以产生70uMα-突触核蛋白(1mg/ml)的溶液来制备。将该溶液在37℃孵育18小时并以100ul等分试样冷冻。通过将重组α-突触核蛋白(Rpeptide公司)以70微摩尔溶解在20mM Tris(pH＝7.4)，0.15M NaCl中，从其类似地制备第二抗原。以20:1的摩尔比率将反应性醛ONE(4-氧代-2-壬烯醛，目录号10185，来自开曼化学品(Cayman Chemicals)，安阿伯市，密歇根州)加入到α-突触核蛋白的共价交联寡聚体。将溶液在37℃孵育18小时(不伴随振荡)。通过Vivaspin500旋转柱(10kDa MWCO)除去未反应的ONE，并将样品针对20mM Tris、pH 7.4、0.15M NaCl进行透析，并以等分试样冷冻。第三抗原是重组α-突触核蛋白片段氨基酸1-60(Rpeptide公司)，其作为冻干粉剂(来自Rpeptide公司的原始材料)发送。简言之，对三只雌性小鼠(4-7周龄)进行免疫并加强多至三次。取尾部血并通过针对抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)针对抗突触核蛋白抗体进行筛选。通过血清稀释度定义滴度，以在ELISA中获得基线的3倍的OD读数。选择滴度显示比对照高大于1:50,000的小鼠用于融合。将收获的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合、稀释并从单细胞融合体中铺板。在融合后14天收获上清液并针对抗体产生进行筛选。使用突触核蛋白ELISA从约1000个孔中回收50个阳性克隆。将Clonotyping***/AP试剂盒用于免疫球蛋白分型(南方生物技术公司(SouthernBiotechnology)，伯明翰，阿拉巴马州)。如实例6(图7C)中所述，在SKMEL5细胞测定中针对atto标记的α-突触核蛋白聚集体的积累的减少来筛选50个抗α-突触核蛋白上清液。包括商业抗体LB509作为阳性对照。发现在50种抗血清中，只有4种抗血清减少了α-突触核蛋白的胞内积累，并且这些抗体被用于克隆。然后在测定中测试这四种抗体的剂量应答。选择具有最大作用的抗体2E6用于PD相关模型中的进一步表征。

B.突触核蛋白ELISA

使用抗原特异性ELISA测定来分析抗体阳性融合体的结合。用100ng聚集的突触核蛋白包被康宁公司(Corning)96孔高结合板。在室温(RT)下使用PBS中的5％牛奶封闭孔1小时(hr)。使用PBS+1％Tween 20将板洗涤3次。向每个孔中添加100微升杂交瘤上清液，并将板在室温孵育。随后，将HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(H链和L链特异性或γ链特异性)二抗添加至每个孔中以检测结合的抗突触核蛋白抗体的存在。对于定量底物，添加一个组分TMB，并在OD620处测量板。

C.确定抗体HC和LC可变结构域的DNA序列

选择四种抗α突触核蛋白阳性杂交瘤并从细胞沉淀中提取mRNA。使用oligo(dT)引物通过逆转录酶产生来自每种mRNA制备物的cDNA。随后，使用可变结构域引物进行PCR反应以扩增HC和LC基因的VH和VL区两者。在琼脂糖凝胶上分离扩增的DNA，并且将VH和VL产物两者分离、从凝胶中纯化、克隆到pCR2.1(英杰公司(Invitrogen))中并转化到TOP10细胞中。选择最少6个阳性菌落并通过DNA测序分析以确定VH和VL区的序列。

实例2：抗体工程

单克隆抗体的表达

扩增杂交瘤克隆的培养物，并使用蛋白G色谱法从培养的上清液中纯化小鼠单克隆抗体。使用重链和轻链基因瞬时共转染到HEK293细胞、扩增培养物、收获上清液以及通过蛋白质色谱法纯化来产生重组的小鼠、人和嵌合抗体。在CHO细胞中产生其中重复需要克量的抗体稳定细胞系的情况。可根据需要扩增这些稳定的细胞系，并如前所述进行抗体纯化。

重组抗体的克隆

通过重链和轻链基因的基因合成产生重组单克隆抗体(Geneart公司(Geneart A/G))。随后将合成的基因克隆到标准表达载体(例如pcDNA3.1)中以在哺乳动物细胞培养物中表达。

人源化

通过基于结构的CDR移植进行m2E6的人源化。针对与PDB和IMGT数据库中发现的所有人抗体VL和VH框架氨基酸序列的同源性来筛选2E6 VL和VH结构域的氨基酸序列。使用来自PDB数据库的20SL抗体在m2E6 Fv区上进行结构建模。20SL氨基酸序列分别与2E6 VH和VL结构域具有82.7％和83.2％的同源性。重要的是，20SL的结构以的分辨率确定。2E6人源化框架与20SL的结构比对使得能够确定框架区中的重要残基，这些残基可能经由空间位阻或空间力潜在地影响折叠或局部结构。采用人源化抗体的理论抗体结构建模来指导在人源化版本的2E6中维持特定残基作为原始小鼠氨基酸以维持结合特异性和亲和力的潜在重要性。采用结构建模以优化人源化2E6的活性。

通过将VH CDR移植到人种系基因IGHV1-46*01(69％同源性)框架上进行2E6 VH区的人源化。小鼠2E6与所选择的人框架区之间存在23个氨基酸差异。结构建模鉴定了7个氨基酸位置，其中人残基的变化潜在的对2E6的活性产生负面影响。将这些残基回复突变为原始小鼠氨基酸。产生了三种不同版本的人源化重链。人源化HLD-1含有全部7个回复突变：M37V、I48M、A68V、L70M、V72R、K74T、A79V，HLD-2含有I48M、A68V、L70M、V72R、K74T、A79V，并且HLD-3含有M37V、I48M、L70M、V72R、K74T、A79V。

通过将VL CDR移植到人种系基因IGKV3-11*01(64％同源性)框架上进行2E6 VL区的人源化。小鼠2E6与所选择的人框架区之间存在26个氨基酸差异。结构建模鉴定了4个氨基酸位置(R45L、W46L、V57I、Y70F)，其中人残基的变化潜在的对2E6的活性产生负面影响。对于HLD-1、HLD-2和HLD-3，所有4个残基都回复突变为原始小鼠氨基酸。

HLD-1、HLD-2和HLD-3在HEK 293细胞中瞬时表达。将抗体从培养的上清液中纯化，并且随后使用突触核蛋白配体形式通过SPR(Biacore 3000)分析与突触核蛋白的结合(表5)。

表5：不同人源化2E6克隆和嵌合2E6的动力学结合分析

通过以下来完成HLD1的亲和力成熟：通过基于密码子简并的PCR引物在轻链CDR3中的随机突变，以及通过基于密码子简并的PCR引物在重链CDR3中类似地随机突变和使用易出错的PCR的体外进化。将抗体从培养的上清液中纯化，并且随后通过SPR(Biacore3000)(使用固定在CM5芯片上的抗人IgG Ab捕获的IgG)分析与突触核蛋白的结合(表6)。

表6：在第一轮亲和力成熟后，人源化2E6克隆HLD1的不同亲和力成熟版本的动力学结合分析

ka(1/Ms)

kd(1/s)

KA(1/M)

KD(M)

Chi2

KD改善

Ch2E6

2.45E+04

1.39E-03

1.76E+07

5.67E-08

0.22

1

HLD1

4.16E+04

9.44E-04

4.40E+07

2.27E-08

0.164

2.5

L3-11

1.45E+05

3.16E-04

4.60E+08

2.18E-09

0.285

26

7A10

5.17E+04

2.85E-04

1.81E+08

5.52E-09

0.297

10.3

9C12

4.95E+04

2.78E-04

1.78E+08

5.62E-09

0.631

10

8D9

7.41E+04

4.83E-04

1.53E+08

6.52E-09

0.301

8.7

7C4

1.23E+05

9.97E-04

1.23E+08

8.12E-09

1.04

7

在第一轮亲和力成熟后，我们构建了4个突变(A、B、C、D)：A)将重链CDR2(突变KYNVNFKT至KYNVNIKT)和重链CDR3(突变LGHYGNLYAMDY至LGHYGNLYAKDY)中的两个突变组合；B)将轻链CDR1突变(突变SASSSVSYMH至SASSSVSYIH)掺入到L3-11轻链中；C)将轻链框架突变(突变PRRWIY至PRRLIY，紧邻上游CDR2)掺入到L3-11轻链中；和D)将轻链CDR1突变(突变SASSSVSYMH至SASSSVSYIH)和轻链框架突变(突变PRRWIY至PRRLIY)掺入到L3-11轻链中。基于Biacore数据和抗体序列，我们测试了具有各种组合的轻链和重链的共表达：

1.L3-11轻链+9C12重链

2.L3-11轻链+8D9重链

3.7A10轻链+9C12重链

4.L3-11轻链+A

5.7A10轻链+A

9.B+9C12重链

10.C+9C12重链

11.D+9C12重链

12.B+8D9重链

13.C+8D9重链

14.D+8D9重链

15.B+重链

16.C+重链

17.D+重链

将抗体从培养的上清液中纯化，并且随后通过SPR(Biacore 3000)(使用固定在CM5芯片上的抗人IgG Ab捕获的IgG)分析与突触核蛋白的结合(表7)。

表7：在突变组合后，人源化2E6克隆HLD1的不同亲和力成熟版本的动力学结合分析

ka(1/Ms)

kd(1/s)

KA(1/M)

KD(M)

Chi2

KD改善

Ch2E6

2.45E+04

1.39E-03

1.76E+07

5.67E-08

0.22

1

HLD1

4.16E+04

9.44E-04

4.40E+07

2.27E-08

0.164

2.5

HLD1-14

1.35E+05

5.60E-05

2.42E+09

4.14E-10

0.03

137.0

HLD1-12

2.47E+05

1.12E-04

2.21E+09

4.51E-10

0.12

125.7

HLD1-13

1.46E+05

7.07E-05

2.07E+09

4.83E-10

0.11

117.4

HLD1-15

2.58E+05

1.25E-04

2.06E+09

4.85E-10

0.09

116.9

HLD1-9

2.60E+05

1.33E-04

1.94E+09

5.14E-10

0.06

110.3

HLD1-16

1.53E+05

8.97E-05

1.71E+09

5.85E-10

0.14

96.9

HLD1-2

2.38E+05

1.52E-04

1.57E+09

6.36E-10

0.06

89.2

HLD1-3

9.99E+04

1.26E-04

7.94E+08

1.26E-09

0.06

45.0

HLD1-5

9.29E+04

1.28E-04

7.27E+08

1.38E-09

0.03

41.1

实例3：表位作图

使用在Pepscan(Pepscan Zuidersluisweg 2 8243 RC，荷兰莱利斯塔德(Lelystad,The Netherlands))上的重叠线性肽的阵列完成抗体与α-突触核蛋白的表位作图。抗体对每个合成的20聚体肽的结合在基于Pepscan的ELISA中进行检测。覆盖α-突触核蛋白的整个编码序列的线性肽阵列，以及具有氧化的蛋氨酸或亚硝基酪氨酸的所有肽，用初级抗体溶液(在4℃过夜)孵育。洗涤后，在25℃用1/1000稀释度的抗体过氧化物酶缀合物(SBA,cat.nr.2010-05)将肽阵列孵育1小时。洗涤后，添加过氧化物酶底物2,2'-连氮基-二-3-乙基苯噻唑啉磺酸盐(ABTS)和2μl/ml的3％H₂O₂。1小时后，测定显色。用电荷耦合装置(CCD)-摄像机和图像处理***定量显色。对于数据处理，从CCD摄象机获得范围从0到3000mAU的值，类似于标准的96孔板ELISA阅读器。将结果进行量化，并存储到Peplab数据库。偶尔一个孔包含导致假阳性值的气泡，这些卡被手动检查并且气泡造成的任何值都记分为0。

针对m2E6结果可以见于图2。

实例4：来自路易体痴呆患者和健康对照扣带皮质的人脑匀浆的α-突触核蛋白的免疫沉淀反应

来自路易体痴呆患者(DLB)和年龄匹配的健康对照(CTR)的脑匀浆中α-突触核蛋白和磷酸化(Ser129)α-突触核蛋白的水平。

使用来自路易体痴呆患者(DLB)的五个脑样品和来自年龄匹配的健康对照(CTR)的五个脑样品的扣带皮质样品。将大约50-100mg的组织块在CelLytic^TMM细胞裂解缓冲液(西格玛公司(Sigma))中用Precellys CK-14组织匀浆器匀浆化，随后3000g旋转30min，得到S1和P1级分。上清液(S1)级分含有总的洗涤剂可溶性α-突触核蛋白，沉淀(P1)级分含有洗涤剂不溶性α-突触核蛋白(路易体)。S1级分20.000g、30min(P2)的另外离心含有洗涤剂可溶性聚集形式的α-突触核蛋白，并且186.000g旋转(P3)含有洗涤剂可溶性较小聚集形式的α-突触核蛋白，并且剩余的上清液(S2)含有单体α-突触核蛋白。

图3显示来自路易体痴呆患者(DLB)和五个年龄匹配的健康对照(CTR)的五种脑匀浆中α-突触核蛋白含量的差异。“α-syn”和“磷酸化-α-syn(S129)”框中的五个泳道代表五个不同患者和五个对照的S1、P1、P2、P3和S2级分。可溶性α-突触核蛋白的水平在DLB和CTR中相似(图3，左小图，S1和S2中的“α-syn”)，而用小鼠单克隆抗人α-突触核蛋白(4B12，赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))检测到的DLB(P1级分)中不溶性α-突触核蛋白的量增加。丝氨酸129上磷酸化的不溶性α-突触核蛋白水平(图3，右小图“磷酸化-α-syn(S129)”在用抗Ser-129磷酸化的单克隆抗体(ab51253，艾博抗公司(abcam))检测的DLB(P1、P2和P3级分)中增加。

来自富集α-突触核蛋白病理学形式的级分的α-突触核蛋白的免疫沉淀

通过免疫沉淀分析抗体与来自所有五名DLB患者的人脑扣带皮质的组合级分中级分S1、P1和P2的α-突触核蛋白结合的能力以及下拉该α-突触核蛋白的能力。对于免疫沉淀，将2μg抗体固定在磁性Dynabeads蛋白G上，随后在室温进行90min免疫沉淀。通过用检测抗体(小鼠单克隆抗人α-突触核蛋白(4B12，赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)))的蛋白质印迹对免疫沉淀的产率进行可视化。下拉的α-突触核蛋白的量在小鼠m2E6、人源化2E6-HLD-1和9E4抗体(SEQ ID NO 47和48)之间不同。此外，表示不同分子量形式的α-突触核蛋白被下拉的条带图案在2E6抗体和对比抗体9E4之间不同(图4)。

来自人脑的α-突触核蛋白的免疫沉淀证明m2E6和人源化变体2E6-HLD1-3与9E4显著不同。2E6和人源化变体能够免疫沉淀较低分子量的、可替代地剪接或截短版本的α-syn，而9E4则不能。此外，2E6和人源化变体识别P1和P2级分中α-突触核蛋白的病理学聚集形式，而9E4不识别(图4)。

实例5：α-突触核蛋白聚集的体外抑制和预成的α-突触核蛋白原纤维的解离

α-突触核蛋白聚集的体外抑制

α-突触核蛋白聚集成原纤维组件、路易体和路易神经突(LN)是帕金森氏病的主要标志。原纤维形成是一种复杂的聚合过程，其特征在于S形生长曲线。硫磺素T(ThT)方法用于体外检测α-突触核蛋白的聚集(Giehm和Otzen,2010,Anal Biochem.[分析生物化学]15；400(2):270-81；Giehm等人2011,Methods[方法]；53(3):295-305)。在该测定中，我们测试了m2E6在与α-突触核蛋白单体以不同比率共孵育时减少α-突触核蛋白聚集的作用。简言之，将96孔板加载α-突触核蛋白、ThT和抗体的混合物，用Crystal Clear密封带(汉普顿研究(Hampton Research)，亚里索维耶荷(Aliso Viejo)，加利福尼亚州，美国)密封以避免蒸发。将板加载到Infinite 200荧光板读数器(帝肯(Tecan)，门内多夫瑞士)或Genios Pro(帝肯(Tecan))中并在37℃孵育。振荡搅拌的样品(用轨道或线性搅拌(300rpm))大约50min/h的一段时间。用在450nm处激发和在485nm处发射来测量ThT荧光。对于搅拌的样品，在96孔板中以10min的间隔测量ThT发射。从所有数据中减去缓冲信号。结果表明m2E6在较高摩尔比率(抗体:α-突触核蛋白)下几乎完全抑制α-突触核蛋白的原纤维化(图5)。

α-突触核蛋白原纤维的解离

使用Virginia Lee/Kelvin Luk方案(Luk等人,Science[科学],2012,16；338(6109):949-53)从单体小鼠α-突触核蛋白产生小鼠-α-突触核蛋白预成的原纤维(Mo-PFF)。已经表征了这些Mo-PFF的物理化学特性(通过蛋白质印迹和电子显微镜)和生物学特性(通过细胞中的摄取和毒性)。制备预成的原纤维(PFF)的一个重要步骤是在注射进或用于例如细胞前不久进行超声处理，以解离不能被细胞吸收的较大的PFF聚集体。为了决定最佳超声处理方案(密度/强度和时间)，测试了不同的超声处理范例。将经超声处理的预成的原纤维与抗体(ab)室温下以不同摩尔比率一起孵育24小时。在通过负染色和透射电子显微镜分析之前，将所有样品储存在干冰上。通过将α-突触核蛋白PFF与增加浓度的m2E6以1:100、1:20和1:10的ab:突触核蛋白的摩尔比率孵育，剩余的微纤维是小的，线性的和单个的。所测试的ab的所有浓度都能够使微纤维不再重新缔合成大的原纤维网络，并且甚至可能使它们进一步解离。结果表明增加m2E6的浓度显示将原纤维保持为微纤维中的作用增加(图6)

实例6：细胞模型数据

2E6结合培养基中的α-突触核蛋白原纤维并抑制其在人、神经母细胞瘤和黑色素瘤细胞系中的积累

原纤维制备的说明

重组α-突触核蛋白订购自rPeptide公司(目录号S-1001-2)，并根据制造商的推荐在重蒸馏水中溶解，得到在20mM Tris-HCL/100mM NaCl，pH＝7.4中的1mg/ml溶液。通过使用来自西格玛公司(Sigma)的Atto488蛋白标记试剂盒(#38371)，用Atto488荧光标记α-突触核蛋白。制备30％Atto488标记的α-突触核蛋白和70％未标记的α-突触核蛋白的混合物，并且然后将该混合物在37℃进行孵育，伴随搅拌(300rpm)2天、然后暂停3天、然后搅拌1天、然后暂停1天、然后搅拌4天。之后，收集原纤维并保持在-20℃直至使用。当原纤维用于细胞测定时，总是在添加之前立即将这些原纤维在5min进行超声处理(用喇叭探头超声波仪(horn probe sonicator)设置5.50％循环)。

培养基中α-突触核蛋白原纤维的免疫沉淀

通过免疫沉淀分析抗体结合并下拉溶解在DMEM培养基(如在细胞测定中使用的)中的α-突触核蛋白原纤维的能力。将2μg抗体固定在磁性Dynabeads蛋白G上，随后在室温进行90min免疫沉淀。通过用检测抗体(抗人α-突触核蛋白Ab1904)的蛋白质印迹对免疫沉淀的产率进行可视化。这显示m2E6能够下拉培养基中α-突触核蛋白原纤维，而B12(非反应性人IgG)和5G4(来自Roboscreen公司的抗α-突触核蛋白)不能(图7A)。

在SHSY-5Y细胞中抗体介导的积累抑制

SH-SY5Y(CRL-2266^TM)订购自ATCC并根据ATCC指南进行培养。将细胞以40.000个细胞/孔的密度铺板在涂覆胶原蛋白的板上。附接一天后，用α-突触核蛋白原纤维处理细胞，并将抗体(两者均为10μg/ml)直接添加至培养基中。然后将细胞孵育24小时，之后将其洗涤并裂解。使用来自艾博抗公司(Abcam)的抗体1904在细胞质级分上运行蛋白质印迹。这显示2E6-HLD1减少了细胞中积累的原纤维的量，而对α-突触核蛋白B12没有亲和力的抗体没有减少细胞中积累的原纤维的量(图7B)。

在SK-mel5细胞中抗体介导的积累抑制

根据ATCC指南生长人黑色素瘤细胞系SK-mel5(ATCC，HTB-70)。将细胞以每孔3000个细胞的密度铺板在Falcon BD 96孔板中并使其粘附过夜。将Atto488标记的α-突触核蛋白原纤维与m2E6抗体(0.01mg/ml)和α-突触核蛋白肽113-125或126-140(0.01mg/ml)一起添加至细胞(0.01mg/ml)。孵育24小时后，将细胞在PBS中洗涤两次并用4％多聚甲醛固定。然后将细胞用Hoechst染色并在Cellomics ArrayScan中读数。细胞核在一个信道进行检测，并定义有效目标的数量。在围绕核的预先定义的环形成区域中(从而代表细胞的细胞质)在另一信道中检测Atto488标记的原纤维。对含有α-突触核蛋白斑点的细胞百分比进行定量。结果显示，在未给予原纤维的细胞中，仅有非常低的含有斑点的细胞背景(背景可能是由于自发荧光)(图7C)。在仅给予原纤维的细胞中，75％的细胞已积累胞内斑点。在与原纤维和m2E6抗体共孵育的细胞中，仅有约30％的斑点阳性细胞。当细胞与原纤维、m2E6和126-140肽共孵育时，存在约60％的阳性细胞，因此肽显著抑制m2E6的作用。113-120肽与原纤维和2E6的共孵育不改变m2E6的作用。将原纤维与肽113-120或126-140一起孵育对细胞中原纤维的积累没有作用。因此，m2E6与溶液中的α-突触核蛋白原纤维结合，并抑制它们在细胞中的积累。该作用是特异性的，因为它可以被肽126-140抑制，但不能被113-120抑制(图7C)。

用增加剂量的2E6-HLD1-7A10的处理显示具有斑点的细胞百分比的剂量依赖性降低。用无关的对照抗体(B12)处理的细胞显示无作用(图7D)。

m2E6在培养基中结合哺乳动物产生的寡聚化的α-突触核蛋白并抑制其在原代皮质神经元中的积累

通过免疫沉淀分析抗体结合并下拉溶解在DMEM培养基中的α-突触核蛋白寡聚体的能力。将2μg抗体固定在磁性Dynabeads蛋白G上，随后在室温进行90min免疫沉淀。通过用检测抗体(抗人α-突触核蛋白抗体单克隆(4B12)(MA1-90346，Pierce公司))的蛋白质印迹对免疫沉淀的产率进行可视化。这显示所有2E6变体都下拉培养基中α-突触核蛋白寡聚体(图8A)。对比m9E4和h9E4也确实下拉了寡聚体，但h9E4似乎效率较低(14kDa处的条带非常弱)。另一种对比α-突触核蛋白抗体(来自百健公司(Biogen)的12F4)仅给出与对照抗体B12没有太大差异的弱条带(图8A)。

通过解剖皮质区并在胰蛋白酶溶液中将其均质化，从E14胚胎制备小鼠原代皮质神经元。然后将细胞洗涤并重悬浮于DMEM培养基中，计数并以每孔60000个细胞铺板在预先包被有聚赖氨酸的96孔板中。4小时后，将培养基更换为含有B27补充的神经基础培养基(Neurobasal)。培养2天后，添加阿糖胞苷(Cytoarabinoside)以抑制星形胶质细胞的生长。在DIV7，用10μg/ml Syn-BAP PFF(DIV＝体外培养天数-asyn-BAP PFF＝α-突触核蛋白生物素受体肽标签预成的原纤维)和25μg/ml的抗体一起处理细胞，并且进行24小时孵育。之后，洗涤细胞并通过将100μl 8％多聚甲醛直接添加至孔中的100μl培养基中来固定。通过用15G7-抗体(Enzo公司)和FITC标记的抗大鼠二抗在透化后在细胞上进行免疫细胞化学并用BSA(1％)封闭来完成胞内Syn-BAP PFF聚集体的检测，或用添加至透化的细胞中的链霉亲和素-Atto488(西格玛公司(Sigma))进行(Syn-BAP具有生物素标签并因此能够通过链霉亲和素检测)。通过Hoechst染色检测细胞核。通过Cellomics ArrayScan完成染色的定量。细胞核在一个信道进行检测，并定义有效目标的数量。在围绕核的预先定义的环形成区域中(从而代表细胞的细胞质)在另一信道中检测绿色斑点。计算每个细胞的斑点的平均数量。细胞的一个实例显示于图8B中。基于链霉亲和素-Atto488的Syn-BAP PFF聚集体的检测有一些背景染色(未处理的细胞显示平均每个细胞有一个斑点)，但与仅用Syn-BAP PFF处理的细胞仍有显著差异(每个细胞约有1.8个斑点)(图8C)。Syn-BAP PFF与非反应性B12或9E4抗体的共孵育不会改变细胞中Syn-BAP PFF的积累，而用m2E6或2E6-HLD1的处理可将积累水平降低至背景水平(图8C)。在其他的实验中，仅用Syn-BAP PFF处理的细胞显示每个细胞约4.5个斑点；B12或9E4同样没有显著改变这一点。用m2E6、2E6-HLD2或2E6-HLD3处理显著降低了积累水平(每个细胞至约3个斑点)(图8D)。

人黑色素瘤细胞系中抗体介导的α-突触核蛋白原纤维从细胞转移到细胞的抑制

为了研究我们的抗体是否也对α-突触核蛋白原纤维从细胞到细胞的转移有作用，我们开发了如下测定：根据ATCC指南生长人黑色素瘤细胞系SK-mel5(ATCC，HTB-70)。将细胞以每孔3000个细胞的密度铺板在Falcon BD 96孔板中并使其粘附过夜。在一个板(称为“饲养板”)上，将细胞用超声处理的Atto488标记的α-突触核蛋白原纤维以0.01mg/ml的终浓度培养24小时。然后用新鲜培养基洗涤细胞两次，并且然后将抗体添加至培养基中的细胞中。孵育24小时后，然后将来自单独孔的培养基直接转移到SK-mel5细胞的新板上(“受体板”)。然后通过添加4％多聚甲醛立即固定“饲养板”，而“受体板”在固定(通过将8％多聚甲醛直接添加至培养基中)前放置另外24小时。将两个板保持在黑暗中并用Hoechst染色，并且然后在Cellomics ArrayScan中读数。细胞核在一个信道进行检测，并定义有效目标的数量。在围绕核的预先定义的环形成区域中(从而代表细胞的细胞质)在另一信道中检测Atto488标记的原纤维。对定义细胞的环区中含有α-突触核蛋白聚集体(斑点)的细胞百分比进行定量。

这个想法是将在一定程度上被“饲养”板上的细胞内化的α-突触核蛋白原纤维再次省略，并因此经由条件培养基转移到“受体”板上的细胞中。因此，我们可以测量抗体对“饲养”细胞中清除过程的作用(胞内作用)和细胞转移到“受体”板上的抑制。我们可以表明，大量的α-突触核蛋白原纤维实际上是将“饲养”板上的细胞转移到“受体”板上的细胞(“饲养”上60％细胞阳性-“受体”上37％细胞阳性)。

结果显示m2E6-与原纤维相比-显著降低了“饲养”板和“受体”板两者中具有α-突触核蛋白斑点的细胞的数量(图9)。对比抗体1H7(WO 2007021255)对任一板都没有作用。对照抗体(B12)同样没有作用。商业抗体LB509(艾博抗公司(Abcam))能够降低“饲养”板上α-突触核蛋白的胞内水平，但不会显著降低转移的α-突触核蛋白的量。图9.

抗体介导的α-突触核蛋白的接种抑制

为了显示抗体介导的胞内α突触核蛋白接种抑制的作用，设置了基于HEK293细胞的接种测定。在该测定中，在第1天，用对照(pcDNA)或α-突触核蛋白(WT，具有HA标签)的cDNA表达质粒转染HEK293细胞，并铺板在6孔板中。在第2天，将α-突触核蛋白原纤维(种子)与不同浓度的抗体混合，并使用脂质体转染来转染到细胞中。在第3天，将细胞胰蛋白酶化、分散并重新铺板在6个孔中。在第4天，收获细胞并在Triton缓冲液中裂解。将细胞裂解物超速离心，并将上清液保存为Triton或可溶性级分。将沉淀重悬于SDS缓冲液中并超速离心，并且将上清液标记为SDS可溶性或不溶性级分。将可溶性或不溶性级分两者在SDS凝胶上跑电泳，并且分别通过4B12/1904抗体(总人突触核蛋白)和S129P-asyn抗体(艾博抗公司(Abcam)51253)检测总α-突触核蛋白和磷酸化的α突触核蛋白(S129P)。将SDS可溶性级分中磷酸化的α突触核蛋白/β肌动蛋白的比率用于计算应答于添加种子加减2E6-HLD1而形成的不溶性的聚集α-突触核蛋白的水平。

用α-突触核蛋白质粒进行转染随后转染α-突触核蛋白原纤维促进了α突触核蛋白的聚集和磷酸化，这通过蛋白质印迹上不溶性级分中较高分子量的α突触核蛋白聚集体的存在来指示。由于HA标签的存在，转染的α突触核蛋白跑得更高并且与内源性α突触核蛋白或跑在约17kD的转染的原纤维有区别。

与同种型对照抗体B12相比，将人源化版本的m2E6(2E6-HLD1)与α突触核蛋白原纤维混合减少了α突触核蛋白聚集和磷酸化。(图10A)。α突触核蛋白磷酸化存在利用HLD1的剂量依赖性抑制(图10B)。

实例7：F28-snca转基因小鼠中的急性体内数据

α-突触核蛋白抗体在体内的急性电生理学作用

人α-突触核蛋白的高表达水平存在于F28-snca转基因小鼠的海马体中。4至6个月龄的雄性F28snca转基因小鼠和年龄匹配对照小鼠海马体CA1区域中突触传递和可塑性的体内电生理学评估显示i)与年龄匹配的对照小鼠相比，基础突触传递在F28 snca转基因小鼠中显著损害，并且ii)与年龄匹配的对照小鼠相比，在F28 snca转基因小鼠中配对脉冲易化显著增强(图11)。

根据关于照料和使用实验室动物的欧共体委员会指令(European CommunitiesCouncil Directive)(86/609/EEC)以及管理动物实验的丹麦立法进行所有实验。

在本研究中使用4至6个月龄的F28-snca转基因小鼠和年龄匹配的对照雄性小鼠(塔康欧洲公司(Taconic Europe A/S))。将小鼠在受控的温度(22℃±1.5℃)和湿度条件(55％-65％)下单独饲养并保持12:12小时光/暗循环(在06:00h时开灯)。食物和水可随意获得。

将动物用尿烷(1.2g/kg)用腹膜内(i.p.)注射麻醉。然后，将小鼠固定在立体定位框架，其温度经由加热垫调节至37.5℃，并且颅骨被暴露。将铂丝放置于额骨中以充当参考，并且打额外的孔以用于按照根据帕西尼奥斯和富兰克林图集(atlas of Paxinos andFranklin)(Paxinos和Franklin，2001)的以下坐标将记录和刺激电极***海马体中：记录，前囱后部1.5-1.7mm，中线侧部1.0-1.2mm，在脑表面下方1.4-1.7mm；刺激，前囱后部1.8-2.0mm，中线侧部1.5-1.7mm，在脑表面下方1.5-1.7mm。在整个记录持续时间动物留在立体定位架内，并定期检查其麻醉水平。

每30秒(s)通过谢弗侧枝的电刺激在CA1区诱发场电位(fEPSP)，并且调节记录电极的深度直到应答单极矩形脉冲记录下负fEPSP。诱发的fEPSP斜率被测定为fEPSP的最大幅值的30％和70％之间。

一旦最佳fEPSP被诱导，基础突触传递通过刺激强度和诱发的fEPSP(输入输出关系)的斜率之间的关系进行评估。不同刺激强度为0、25、50、75、100、150、200、300、400和500μA，并且以增加的顺序依次施加，每个强度重复2至3次。相比年龄匹配的对照小鼠，基础突触传递在F28 snca转基因小鼠中发现被显著损害(参见图11a)。

在F28snca转基因小鼠和年龄匹配的对照小鼠中进一步测量配对脉冲易化，这是一种被认为依赖于突触前机制的短期突触可塑性。简言之，将具有从25到1000ms变化的刺激间时间间隔(ISI)的一对刺激施加至谢弗侧枝，并且将第二fEPSP的斜率与第一fEPSP的斜率进行比较。在所有ISI处观察到易化，其最大易化在50和75ms的ISI处。有趣的是，当与年龄匹配的对照小鼠相比，在F28 snca转基因小鼠中在25、50和75ms的ISI观察到显著更强的PPF(图11b)。由于谢弗侧枝特征性地显示由于末端中残余的Ca²⁺导致的易化，因此已经表明抑制谷氨酸释放的操作可能导致PPF增加。因此，我们在F28转基因小鼠中的发现表明损害的基础突触传递可能是由于α-突触核蛋白超表达导致的囊泡释放损害。

将在F28 snca转基因小鼠中鉴定的基础突触传递以及配对脉冲易化的损害进一步用作用以测试α-突触核蛋白抗体功效的读数。给予单剂量抗体(腹膜内)3至6小时后在所有实验中进行记录。当可能时，将在每个动物的两个海马体中的基础突触传递和配对脉冲易化进行记录，并且进一步用作单独的实验。

用h9E4(15mg/kg，腹膜内)的急性处理诱导了F28-snca转基因小鼠中基础突触传递损害的显著逆转(Tg-snca+h9E4对比Tg-snca+PBS，p＝0.002，图12)。然而，通过h9E4的逆转只是局部的，如相比使用PBS处理的同窝仔畜显著降低的基础突触传递所指示的(p＝0.007)。

与用PBS处理的同窝仔畜相比，用PBS处理的Tg-snca证实了PPF的显著增加(p＝0.044，图13)。与PBS处理的转基因小鼠相比，用h9E4处理对PPF没有任何显著作用(图13)。

用对照小鼠IgG(5C9)处理的F28-snca转基因小鼠中基础突触传递显著低于用对照小鼠IgG(5C9)处理的年龄匹配小鼠(p<0.001，图10)。用剂量为15mg/kg的m2E6的急性处理诱导了F28-snca转基因小鼠中基础突触传递损害的显著逆转(Tg-snca+m2E6对比Tg-snca+对照IgG，p＝0.004，图14)。用m2E6处理的转基因小鼠的基础突触传递与用对照mIgG处理的年龄匹配的小鼠基础突触传递没有显著不同，这表明损害的完全逆转。用m2E6的处理对非转基因年龄匹配的小鼠的基础突触传递没有作用。

与对照小鼠IgG处理的年龄匹配的小鼠相比，在对照小鼠IgG处理的F28-snca转基因小鼠中证实了PPF的显著损害(p＝0.023)。当与对照小鼠IgG处理的转基因小鼠相比，用m2E6的处理对F28-snca转基因小鼠中PPF损害没有任何显著作用(图15)。

由于15mg/kg m2E6诱导F28-snca转基因小鼠中基础突触传递损害的完全逆转，因此测试较低剂量以建立剂量-应答关系。5mg/kg(腹膜内)剂量的m2E6显著逆转F28-snca转基因小鼠中基础突触传递损害至与年龄匹配的对照小鼠没有显著差异的水平(图16)。相比之下，虽然在高刺激强度下观察到强烈趋势(在300、400和500μA分别地为p＝0.066、0.010和0.050)，但2.5mg/kg(腹膜内)剂量的m2E6没有显著逆转基底突触传递的损害(图17)。

当与PBS处理相比，以2.5mg/kg(腹膜内)的剂量测试了嵌合2E6(ch2E6)抗体，其部分地逆转F28-snca转基因小鼠中基础突触传递的损害(p＝0.042，图18)。该作用与在本系列实验中用2.5mg/kg剂量的m2E6获得的逆转没有显著差异(未显示)。如用m2E6观察到的，嵌合2E6对F28-snca转基因小鼠中损害的PPF没有任何显著作用(图19)。

亲和力成熟的人源化版本2E6(抗体2E6-HDL1)比嵌合2E6更显著有效地逆转F28-snca转基因小鼠中基础突触传递的损害，并且诱导完全逆转至与PBS处理的同窝仔畜无显著差异的水平(图18)。用2E6-HLD1未观察到F28-snca转基因小鼠中损害的PPF的显著逆转(图19)。

实例8：用于评估在清醒的自由活动动物的脑中人α-突触核蛋白的微透析

推拉式微透析用于评估来自清醒和自由移动的F28snca转基因小鼠的脑间质液(ISF)人α-突触核蛋白。将小鼠在受控的温度(22℃±1.5℃)和湿度条件(55％-65％)下单独饲养并保持12:12小时光/暗循环(在06:00h时开灯)。食物和水可随意获得。为了使得能够在海马体中进行微透析，将小鼠用异氟烷麻醉并且将脑内引导套管立体定向地植入脑中，从而根据帕西尼奥斯和富兰克林图集(atlas of Paxinos and Franklin 2001)将微透析探针定位在海马体中(探针尖的坐标：前囟后面3.1mm并且前囟侧面2.8mm，并且相对于硬脑膜1.3mm)。固定螺栓和丙烯酸接合剂被用于固定导向套管。套管植入后，允许小鼠在透析前从手术恢复2-3天。将探针连接到具有两个信道(MAB20；Microbiotech公司)的微透析蠕动泵以推拉模式运行。微透析探针的入口管连接到蠕动泵，以将人工CSF灌注到探针。蠕动泵也被连接到出口管以防止通过拉动流体穿过管时灌注液从探针中丢失。在不连接探针的情况下确定泵的实际流速。在取样前后对样品管进行称重持续给定时间段并且计算流速。将略微不同的方法用于研究小鼠2E6和人9E4对胞外人α-突触核蛋白水平的作用。

a.小鼠2E6：在F28snca转基因小鼠(大约30周龄)的海马体中进行。在实验的当天，将2-mm的3000kDa截断brainlink探针通过引导套管***。作为灌注缓冲液，在使用当天将25％牛血清白蛋白(西格玛公司(Sigma))用人工CSF(aCSF；以mM计：147NaCl、2.7KCl、1.2CaCl₂、0.85MgCl₂)稀释至2％并且通过0.1-μm膜过滤。泵为具有0.5μL/min的恒流。在整个实验期间使用60-min的采样方案。为了避免组织损伤，探针植入后实验窗口设置为从14至48h。在实验开始后14-16h，收集2个基线样品，并且然后以15mg/kg腹膜内注射小鼠2E6或对照同种型5C9，并且收集另外6个样品(收集6h)。将透析液储存在-80℃直至通过ELISA(科文斯公司(Covance)ELISA试剂盒)确定人α-突触核蛋白。将每一个动物抗体处理之前2个基础值(2h)的平均值当作基线并设置为100％。使用双向方差分析(ANOVA)与重复测量来分析差异。在海马体中人α-突触核蛋白的基础水平为11.9±2.4ng/ml(平均值±SEM，n＝11，未对体外透析探针恢复进行修正)。在对照-5C9-抗体处理的动物中，海马体中人α-突触核蛋白的水平不随时间显著变化(图20)。m2E6(15mg/kg，腹膜内)的给予引起海马体中人α-突触核蛋白的显著减少(图20)。

b.人9E4：在F28snca转基因小鼠(大约50周龄)的海马体中进行。在实验的当天，2-mm的1000kDa截断CMA探针通过引导套管***。作为灌注缓冲液，在使用当天将25％牛白蛋白级分V(西格玛公司(Sigma))用人工CSF(aCSF；以mM计：147NaCl、2.7KCl、1.2CaCl2、0.85MgCl2)稀释至0.2％并且通过0.1-μm膜过滤。将泵设置为具有1μL/min的恒流。在整个实验期间使用120-min的采样方案。为了避免组织损伤，探针植入后实验窗口设置为从14至48h。实验开始后14-16h，收集2-3个基线样品，并且然后以15mg/kg腹膜内注射人9E4或对照同种型抗hel，并且收集另外的6个样品(收集12h)。将透析液储存在-80℃直至通过ELISA(科文斯公司(Covance)ELISA试剂盒)确定人α-突触核蛋白。将每一个动物抗体处理之前2-3个基础值(4h-6h)的平均值当作基线并设为100％。在人9E4或对照同种型抗-hel对胞外人α-突触核蛋白水平的作用之间没有观察到差异(图21)。使用双向方差分析(ANOVA)与重复测量来分析差异。在海马体中人α-突触核蛋白的基础水平为7.8±1.2ng/ml(平均值±SEM，n＝16，未对体外透析探针恢复进行修正)。

实例9

体内α-突触核蛋白抗体的长期作用

m2E6在靶向多巴胺能神经元的人α-突触核蛋白超表达的大鼠模型中以及在人α-突触核蛋白超表达的转基因小鼠模型中起作用。

人α-突触核蛋白在大鼠中脑的多巴胺能神经元中的靶向超表达可以使用重组腺相关病毒载体(rAAV)来实现，并与在黑质中的多巴胺能细胞的渐进损失和运动损害有关。在这种基于大鼠AAV的α-突触核蛋白超表达的模型中，基础神经节神经元放电活动显示以与帕金森氏病患者中描述的类似方式改变，即底丘脑核和黑质网状带中的放电不规律性增加。

使用成年雌性斯普拉-道来(Sprague-Dawley)大鼠(225-250g)。在病毒注射前2至4天开始抗体处理，并持续至研究结束。以相同体积(5ml/kg)给予PBS用作对照。以15mg/kg的剂量每周两次腹膜内给药抗体(图22)。将含有人wtα-syn或GFP的病毒(rAAV2/5)单侧注射到黑质(SN)中。将动物用和/>的组合以2.0ml/kg(皮下)麻醉并放置在立体定位架。它们的温度是经由加热垫调节至37.5℃，并且暴露其头骨。根据帕西尼奥斯和沃森图集(atlas of Paxinos and Watson)(Paxinos和Watson，1998)，以下列坐标在右SN上面钻孔：前囟后部5.5mm和前囟侧面2.0mm。在低于硬脑膜物质7.2mm深度进行3μL的rAAV2/5-α-syn或rAAV2/5-GFP的单次注射，并且使用Hamilton注射器以0.2μL/min的流速连接到立体注射器。针留在原地另外5min以允许在SN中载体扩散。手术后，将动物返回到它们的饲养笼，并放置在加热的环境中允许它们从麻醉中恢复。

AAV注射后8至10周，在尿烷麻醉下在底丘脑核(STN)中进行胞外单个单位记录。所有记录在最后一次抗体注射后2至4天完成。使用电动显微操纵器将玻璃电极降低到STN(前囟后部3.8±0.2mm，和前囟侧部+2.4±0.2mm)。在示波器和***上放大、区分和监测胞外动作电位。使用Spike 2软件记录和分析神经元。在STN中，发现假定的谷氨酸能神经元位于皮质表面下方7.0-7.6mm之间。它们典型地展现出0.5和40尖峰/秒之间的放电速率，以及狭窄的动作电位。将至少200个连续尖峰用于分析。计算每个神经元的平均放电速率和峰电位间隔的变异系数(CV ISI)(定义为ISI的标准偏差与平均ISI x 100之间的比率。如之前所述(Kaneoke和Vitek，1996；Tepper等人，1995)，为每个神经元构建尖峰密度直方图和自相关图并用于定性地将放电模式分类为规律的、不规律的或爆发的。

与AAV-GFP大鼠相比，AAV-α-突触核蛋白大鼠展现出STN神经元改变的放电模式，如峰电位间隔(CV ISI)的变异系数显著增加(图23)和以规律的、不规律的或爆发的模式放电的细胞的比例显著变化(图24)所指示的。有趣的是，用m2E6的处理诱导了展现出3种不同放电模式的神经元比例的显著正常化(图24)，以及它们的CV ISI的非显著降低趋势(图23)。

在人α-突触核蛋白超表达的转基因小鼠模型中m2E6长期治疗后的作用。

将F28 snca转基因小鼠中鉴定的配对脉冲易化损害进一步用作用以测试长期治疗后的抗体功效的读数。

以15mg/kg腹膜内的剂量每周两次向动物给药m2E6或对照mIgG1，持续16-18周。与之前实例7中类似地进行所有记录，但现在在给予最后一次剂量抗体后2至4天而不是3-6小时进行记录，如急性实验所做的那样。当可能时，将在每个动物的两个海马体中的配对脉冲易化进行记录，并且进一步用作单独的实验。

与5C9处理的小鼠相比，在2E6处理的年龄匹配的对照小鼠中配对脉冲易化没有显著差异。如之前所报道，与用5C9处理的年龄匹配的对照小鼠相比，在用5C9处理的F28 sncaTg小鼠中观察到PPF的增强。有趣的是，在F28 snca Tg小鼠中用15mg/kg腹膜内的剂量的2E6的处理正常化了PPF(图25)。

配对脉冲易化(PPF)是一种据信依赖于突触前机制的短期突触可塑性。由于谢弗侧枝特征性地显示由于末端中残余的Ca²⁺导致的易化，因此已经表明抑制谷氨酸释放的操作可能导致PPF增加。因此，我们在F28转基因小鼠中的发现表明损害的基础突触传递可能是由于α-突触核蛋白超表达导致的囊泡释放损害。由于仅用抗体2E6的长期治疗能够逆转PPF的缺陷，表明长期抗体治疗可以降低α-突触核蛋白超表达对囊泡释放损害的作用。这种作用可以转化为用抗体疗法治疗的人PD患者中突触传递的改善。

序列表

<110> H.隆德贝克有限公司（Lundbeck A/S）

<120> 药剂、用途和方法

<130> 1074-WO-PCT

<160> 48

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 140

<212> PRT

<213> 人α-突触核蛋白

<400> 1

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 表位126-140

<400> 2

Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

1 5 10 15

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> CDR1 VL

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Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> CDR2 VL

<400> 4

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> CDR3 VL

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> CDR2 VH

<400> 7

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1 5 10 15

Thr

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> CDR3 VH

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

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1 5 10

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

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<400> 10

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1 5 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> CDR1 VH 7C4

<400> 12

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

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1 5 10 15

Thr

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

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1 5 10 15

Thr

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

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1 5 10 15

Thr

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> CDR3 VH 5A1

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> CDR3 VH 7A10/8D9

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1 5 10

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> m2E6 VL

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> m2E6 VH

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1 5 10 15

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20 25 30

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<213> 人工的

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> ch2E6 VH

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 2E6-HLD1 VH

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 2E6-HLD2 VH

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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<213> 人工的

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 2E6-HLD 3 VH

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 5A1 VH

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Gln Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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<213> 人工的

<220>

<223> 9D7 VH

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<213> 人工的

<220>

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<212> PRT

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<220>

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<213> 人工的

<220>

<223> 7C4 VH

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> L3 VL

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20 25 30

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<220>

<223> L3 VH

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<220>

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<220>

<223> 7A10 VH

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<210> 41

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

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<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 8D9 VH

<400> 42

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 43

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 9C12 VL

<400> 43

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 44

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 9C12 VH

<400> 44

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Ile

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 45

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 6B6 VL

<400> 45

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 46

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 6B6 VH

<400> 46

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 47

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 9E4 LC

<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 48

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 9E4 HC

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

Claims

1.α-突触核蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:3所示的CDR1、SEQ ID NO:4所示的CDR2和SEQ ID NO:5所示的CDR3，和

重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:6所示的CDR1、SEQ ID NO:7所示的CDR2和SEQ ID NO:8所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

a)轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；或者，

b)轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；或者，

c)轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列ID NO:23所示，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者，

d)轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；或者，

e)轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示；或者，

f)轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示。

3.α-突触核蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:9所示的CDR1、SEQ ID NO:4所示的CDR2和SEQ ID NO:5所示的CDR3，和

重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:12所示的CDR1、SEQ ID NO:7所示的CDR2和SEQ ID NO:8所示的CDR3。

4.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。

5.α-突触核蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:4所示的CDR2和SEQ ID NO:5所示的CDR3，和

重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:6所示的CDR1、SEQ ID NO:7所示的CDR2和SEQ ID NO:18所示的CDR3。

6.根据权利要求5所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

a)轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示；或者，

b)轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。

7.α-突触核蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:3所示的CDR1、SEQ ID NO:4所示的CDR2和SEQ ID NO:11所示的CDR3，和

8.根据权利要求7所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。

9.α-突触核蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:6所示的CDR1、SEQ ID NO:15所示的CDR2和SEQ ID NO:8所示的CDR3。

10.根据权利要求9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示。

11.根据前述权利要求1-10任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体或其抗原结合片段能够与α-突触核蛋白的氨基酸126-140(SEQ ID NO.2)内的表位特异性结合。

12.根据前述权利要求1-10任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其为Fv片段或Fab样片段。

13.根据权利要求12所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述Fv片段为单链Fv或二硫化物键合的Fv，所述Fab样片段为Fab片段、Fab'片段或F(ab)₂片段。

14.根据前述权利要求1-10中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体选自：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型的抗体。

15.根据前述权利要求1-10中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段展现出以下特性中的一种或多种：

·对于α-突触核蛋白的结合亲和力(KD)，该结合亲和力在0.5-10nM之间；

·抑制神经元细胞中α-突触核蛋白原纤维的积累的能力；

·抑制α-突触核蛋白原纤维从细胞转移到细胞的能力；

·抑制α-突触核蛋白胞内接种的能力；

·在F28-snca转基因小鼠中逆转基础突触传递的损害的能力；

·通过体内微透析测量的，降低小鼠海马体内α-突触核蛋白的水平的能力；

16.根据前述权利要求1-10中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其是人的。

17.根据前述权利要求1-10中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其是人源化的。

18.根据权利要求1-17任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制造药物中的用途，该药物用于对共核蛋白病进行治疗、诊断或成像。

19.根据权利要求1-17任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制造药物中的用途，该药物用于治疗帕金森氏病、弥漫性路易体病(DLBD)、阿尔茨海默氏病的路易体变体(LBV)、组合型阿尔茨海默氏和帕金森氏病、纯自主神经衰竭、多***萎缩，以及基于其基因图谱和/或使其未来可能发展PD的非PD核心症状而处于发展PD的风险的人。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述帕金森氏病是特发性帕金森氏病。