UA124187C2 - Спосіб отримання гонадотропіну - Google Patents
Спосіб отримання гонадотропіну Download PDFInfo
- Publication number
- UA124187C2 UA124187C2 UAA201711487A UAA201711487A UA124187C2 UA 124187 C2 UA124187 C2 UA 124187C2 UA A201711487 A UAA201711487 A UA A201711487A UA A201711487 A UAA201711487 A UA A201711487A UA 124187 C2 UA124187 C2 UA 124187C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- sequence
- pso
- nucleic acid
- cell
- homology
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 54
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 67
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 244000005894 Albizia lebbeck Species 0.000 claims 1
- 241000566113 Branta sandvicensis Species 0.000 claims 1
- 241001649081 Dina Species 0.000 claims 1
- 241000023813 Isia Species 0.000 claims 1
- 241000609789 Kobus vardonii Species 0.000 claims 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 235000015111 chews Nutrition 0.000 claims 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 claims 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims 1
- 229910052718 tin Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 140
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 39
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 38
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 16
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 8
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 7
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 7
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 7
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 7
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 7
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 7
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 7
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- -1 and the like) Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000664681 Homo sapiens Peroxisomal sarcosine oxidase Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 3
- 102000044800 human PIPOX Human genes 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 2
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710083574 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100031974 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Human genes 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- 241001077660 Molo Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- HORYNJCIACQHGZ-BHVWUGLYSA-N 1-[(3R,4R,5S,6R)-3-amino-2,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-[(2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]ethanone Chemical compound C(C)(=O)C1(O)[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O2)CO)[C@H](O1)CO HORYNJCIACQHGZ-BHVWUGLYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000786798 Atya Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 241000152447 Hades Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102000004451 Pituitary Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010081865 Pituitary Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002513 anti-ovulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000011965 cell line development Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 229940126523 co-drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 210000000720 eyelash Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000008217 follicular development Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000029849 luteinization Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000008063 pharmaceutical solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/99—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
- C12Y204/99004—Beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase (2.4.99.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Винахід стосується клітини-господаря, яка характеризується тим, що вона містить інтегровану в свій геном послідовність, яка є кодуючою для , ланцюга hCG, та застосування клітини-господаря для отримання рекомбінантного hCG.
Description
Представлений винахід стосується гонадотропінів для застосування в лікуванні безпліддя.
Зокрема винахід стосується хронічного гонадотропного гормону людини (ПСО).
Гонадотропіни представляють собою групу гетеродимерних глікопротеїнових гормонів, які регулюють гонадну функцію у чоловіків та жінок. Вони включають фолікулостимулюючий гормон (ЕН), лютеїнізуючий гормон (ІН) та хронічного гонадотропін (Со).
Хронічний гонадотропний гормон людини (ПСО) секретується в основному плацентою людини під час вагітності та забезпечує підтримку жовтого тіла. НС містить 92 амінокислотну альфа субодиницю (с ланцюг), також властивих іншим глікопротеїновим гормонам ІН та Е5Н, та 145 амінокислотну бета субодиницю (В ланцюг) унікальну для по, яка зумовлює специфічність гормону. Кожна субодиниця є пост-трансляційно модифікованою за рахунок додавання складних вуглеводних залишків. Альфа субодиниця містить 2-М-зв'язані сайти глікозилування на амінокислотах 52 та 78, та бета субодиниця містить 2-М-зв'язані сайти глікозилування на амінокислотах 13 та 30, та чотири О-зв'язані сайти глікозилування на амінокислотах 121, 127, 132 та 138. "ба, екстрагований з сечі вагітних жінок |Спогадоп (Реггтіп9)|, використовували протягом багатьох років в лікуванні безпліддя. Отримання по, екстрагованого з сечі, передбачає збирання та обробку великої кількості сечі. Оміїгеїе (бегопо), рекомбінантна версія ПСО, також є доступною для застосування в лікуванні безпліддя. Даний рекомбінантний продукт експресується в клітинах яєчника китайського хом'ячка (СНО), та має інший фармакокінетичний профіль до ПСО, отриманого з сечі людини.
Існує суттєва неоднорідність, пов'язана з препаратами ПСО, яка відноситься до різниці в кількості різних присутніх ізоформ. Індивідуальні ізоформи пСО демонструють ідентичні амінокислотні послідовності, але відрізняються тим наскільки вони є посттрансляційно модифікованими; окремі ізоформи характеризуються гетерогенністю вуглеводних розгалужених структур та різними кількостями включення сіалової кислоти (термінального цукру), обидва з яких, як спостерігається, впливають на специфічну біосактивність ізоформи.
Глікозилування рекомбінантних по ("по") продуктів відображає діапазон глікозилтрансфераз, присутніх в лінії клітин-господарів. Існуючий гпСбО продукт, ОміїгеїІе, отримують зі сконструйованих клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО клітини). Діапазон модифікацій глікану в по, отриманому з СНО, є більш обмеженим, ніж той, який виявлено в натуральних продуктах, отриманих з сечі. Приклади зниженої гетерогенності глікану, виявлені в
Со, отриманому з СНО, включають недостатність розділялючого глюкозаміну та знижений вміст ядерного фукозилювання та подовження ацетиллактозаміну. Крім того, клітини СНО є тільки здатними додавати сіалову кислоту, використовуючи а2,3 зв'язок (Кадауа єї аї, 1988, /ТаКешсні веї а, 1988, 5мепзз5оп вї а!., 1990).
Людський сечовий ПСО (тобто, пСО, екстрагований з сечі вагітних жінок), який використовували до теперішнього часу в лікуванні безпліддя, в дійсності, представляє собою плацентарний ПСО; ПСО, який продукується в (людській) плаценті та потім виділяється з сечею.
Даний СО виділяється з сечі для застосування як фармацевтичний продукт. Воизпейа еї а! (Кем
Епдосг Меїгабр бізога (2011) 12:289-302) стверджує, що "хоча гіпофізарні гонадотропіни мають як а2,3-, так і а2,6- зв'язану сіалову кислоту, плацентарний ПСО та рекомбінантні гонадотропіни, продуковані в клітинах яєчника китайського хом'ячка, мають тільки а2,3- зв'язану сіалову кислоту". Таким чином, людський сечовий ПСО (який виробляється в плаценті) включає тільки а2,3- сіалілування (аналогічно до рекомбінантних продуктів, отриманих в клітинній лінії СНО).
Таким чином, відомі фармацевтичні композиції, які включають ПСО, включають тільки а2,3- зв'язану сіалову кислоту, але не включають а2,6- зв'язану сіалову кислоту.
Було продемонстровано, що рекомбінантний препарат Е5Н (Огдапоп) відрізняється за кількістю ЕН з ізоелектричною точкою (рі) нижче 4 (розглядаються як кислотні ізоформи) у порівнянні з гіпофізарним, сироватковим ЕЗН або ЕЗН в постменопаузній сечі (Шіоа-Адиціте еї а!І., 1995). Кількість кислих ізоформ в препаратах сечі Е5Н була набагато вищою в порівнянні з рекомбінантними продуктами - Сюпаї!-ї (Бегопо) та Ригедоп (Огдапоп) (Апдегзеп еї аї., 2004). Це повинно відображати більш низький молярний вміст сіалової кислоти в гЕ5Н, оскільки вміст негативно зарядженого глікану, модифікованого сульфатом, є низьким в Е5Н. Більш низький вміст сіалової кислоти, в порівнянні з природним Е5Н, є ознакою як комерційно доступних Е5Н продуктів, так і, таким чином, повинно відображатися обмеження у виробничому процесі (Вахзей апа Огіерегдеп, 2005). Період напіввиведення з кровообігу ЕЗН був задокументований для матеріалів з різних джерел Деякі з даних матеріалів були фракціоновані на основі загальної молекулярної заряду, який характеризується їх рі, де більша кількість кислоти прирівнюється до більш високого негативного заряду. Основним сприятливим чинником щодо загального бо молекулярного заряду є загальний сіаловий вміст кожної молекули ЕЗН. Наприклад, тн
(Огдапоп) має вміст сіалової кислоти приблизно 8 моль/моль, тоді як ЕЗН, отриманий з сечі, має більш високий вміст сіалової кислоти (де І еєцму єї а). 1996). Відповідні показники плазматичного кліренсу у щурів дорівнюють становлять 0,34 та 0,14 мл/хв. (Шіоа-Адиїте єї аї. 2003). В іншому прикладі, де зразок рекомбінантного ЕЗН був розподілений на високі та низькі рі фракції, ефективність іп мімо фракції з високим рі (більш низький вміст сіалової кислоти) була зниженою, та вона мала більш короткий період напіввиведення з плазми (С'Апіопіо еї а). 1999). Заявники виявили, що, подібний до ЕН, відомий, рекомбінантний ПСО продукт, отриманий з СНО (наприклад, ОміїгеІе) також має більш низький вміст ПСО з ізоелектричною точкою (рі) нижче 4 (розглядаються як кислотні ізоформи), ніж сечовий ПСО, який також відображає більш низький вміст сіалової кислоти відомого гпСО продукту, в порівнянні з сечовим ПСО.
Заявники розробили людський похідний рекомбінантний ПСО (тобто рекомбінантний ПСО, який продукується або експресується в клітинній лінії людини, наприклад, отриманий шляхом конструювання клітинної лінії людини), який має більш кислотний профіль, ніж гпСОо продукт, отриманий з клітинної лінії СНО, Оміїгеїе, та має більш високий вміст сіалової кислоти. Даний
Со є об'єктом міжнародної патентної заявки Ме РСТ/ЗВ2010/001854, опублікованої як УМО 2011/042688. Рекомбінантний ПСО із сумішшю як аг2,3-, так ії а2,6-зв'язаної сіалової кислоти отримували шляхом конструювання людської клітинної лінії для того, щоб експресувати як
Со, так і а2,3 сіалілтрансферазу. Експресований продукт є високо кислотним, який має вміст сіалової кислоти |виражений у вигляді співвідношення молей сіалової кислоти до молей протеїну) наприклад, 19,1 моль/моль, та містить суміш як а2,3-, так і а2,6-зв'язаних сіалових кислот; останнє забезпечується ендогенною активністю сіалілтрансферази. Дослідження заявників вказують на те, що тип зв'язування сіалової кислоти, а2,3- або а2,6-, може мати суттєвий вплив на біологічний кліренс ПСО. Людські клітинні лінії, на відміну від клітинних ліній
СНО, можуть експресувати рекомбінантний ПСО із сіаловими кислотами, приєднаними за рахунок, як аг2,3, так і а2,6 зв'язків.
Клітинна лінія з М/О 2011/042688 також експресує людського походження рекомбінантний
ПСО. Однак, клітинна лінія також експресує відносно високий рівень вільного ВД ланцюга (вільної бета субодиниці), та потребувала очистки (для того, щоб видалити даний вільний В ланцюг з продукту ПСО).
Зо Заявники на даний момент розробили нову клітинну лінію, яка експресує як ПТС, так і 02,3 сіалілтрансферазу, та яка продукує (пс зі зменшеною кількістю вільного ВД ланцюга, тим самим підвищуючи вихід та зменшуючи рівень необхідної очистки продукту (дивіться фігуру 7).
Відповідно до представленого винаходу передбаченою є клітина (наприклад, господар), яка характеризується тим, що вона містить інтегровану в свій геном послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для са ланцюга ПСО, вибрану з: послідовності, яка відповідає ЗЕО ІЮ
МО: 1; послідовності, яка має щонайменше 96,5 95 гомологічність з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:1 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 96,595 ідентичність послідовності з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:1); послідовності, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з (наприклад, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 гомологічність з) послідовністю 5ЕО ІЮ
МО:1 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 97 95 ідентичність послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 99595 ідентичність послідовності 3) послідовністю ЗЕО ІО МО 1); послідовності, яка відповідає ЗЕО ІЮ МО. 4; послідовності, яка має щонайменше 96,5 95 гомологічність з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 4 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 96,5 905 ідентичність послідовності з послідовністю ЕС І МО:4); та послідовності, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з (наприклад, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 гомологічність з) послідовністю 5ЕО ІЮО МО:4 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 9795 ідентичність послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 9995 ідентичність послідовності 3) послідовністю 5ЕО ІЮО МО:4). Переважно послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для а ланцюга ПСО, не є послідовністю, яка є депонованою як АНО0О7338 (тобто, переважно, послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для са ланцюга ПСО, не є показаною в ЗЕО ІЮ МО:5). Клітина може додатково містити інтегровану в свій геном кДНК, яка кодує альфа-2,3-сіалілтрансферазу, наприклад, послідовність, яка відповідає ЗЕО ІО МО: 3. Клітина може додатково містити інтегровану в свій геном послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для В ланцюг ПСО, наприклад, послідовність, яка відповідає 5ЕО ІЮ МО:2.
Клітина-господар може представляти собою, наприклад, РЕК.СбФ клітину, НТ1080 клітину, аТ-55 клітину, тощо. Переважно клітина представляє собою РЕК.СбФ клітину, таку як РЕН.СбФ клітина депонована в ЕСАСС Мо 96022940.
Відповідно до представленого винаходу передбаченою є РЕК.СбФ клітина, така як РЕК.СбФ 60 клітина, депонована в ЕСАСС Мо 96022940, яка характеризується тим, що вона додатково містить інтегровану в свій геном послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для а ланцюга ПСО. Послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для « ланцюга пНСО може бути вибраною з: послідовності, яка відповідає ЗЕБЕО ІЮ МО: 1; послідовності, яка має щонайменше 90 95 гомологічність з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:1 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:1); послідовності, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з (наприклад, щонайменше 98 95 або щонайменше 9995 гомологічність 3) послідовністю ЕС ІЮ МО:1 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 9795 ідентичність послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 ідентичність послідовності 3) послідовністю 5ЕО ІЮ МО:1); послідовності, яка відповідає ЗЕО ІО МО. 4; послідовності, яка має щонайменше 90 95 гомологічність з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 4 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:4); та послідовності, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 9995 гомологічність 3) послідовністю ЗЕО ІЮ МО:4 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 97 95 ідентичність послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 9995 ідентичність послідовності з) послідовністю 5ЕО ІЮ МО:4). Переважно послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для а ланцюга ПСО не представляє собою послідовність, яка є депонованою як
АНОО7338. Клітина може додатково містити інтегровану в свій геном кДНК, яка кодує альфа-2,3- сіалілтрансферазу, наприклад, послідовність, яка відповідає 5ЕБЕО ІЮ МО: 3. Клітина може додатково містити інтегровану в свій геном послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для В ланцюга ПСО, наприклад, послідовність, яка відповідає зЕО ІЮ МО:2.
До уваги буде прийнято те, що термін "послідовність, яка є кодуючою для а ланцюга ПСО" або "послідовність (нуклетнової кислоти), яка є кодуючою для а ланцюга по", який використовується в даному документі, також стосується послідовності, яка є кодуючою для а ланцюга ЕЗН (або послідовності, яка є кодуючою для а ланцюга ІН), оскільки а« ланцюг ПСО є таким самим як той, що для Е5Н (та Г Н).
Термін "послідовність нуклеїнової кислоти" в даному документі стосується будь-якої молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептиди, такі як пептиди, протеїни, тощо. Дані молекули нуклеїнової кислоти можуть бути отримані з ДНК, РНК або їх аналогів. Однак,
Зо переважними є молекули нуклеїнової кислоти, отримані з ДНК.
Кваліфікованому фахівцю ов даній галузі чітко зрозуміло, що модифікація вихідної нуклеотидної послідовності описує спосіб оптимізації стосовно частоти використання кодону.
Внесені зміни можуть бути легко ідентифіковані шляхом порівняння модифікованої послідовності та вихідної послідовності. Крім того, обидві послідовності (тобто, вихідна послідовність та оптимізована послідовність) будуть кодувати для однієї і тієї ж амінокислотної послідовності.
Амінокислотна послідовність с-ланцюга людського пСО є розкритою в УУО2011/042688 (зазначена як 5ЕО ІО1 в тому документі), та є описаною в Рідде5 апа Сооатап 1979. Вона є депонованою як АНОО7388, та є показаною як 5ЕО ІЮ МО. 5 нижче. Амінокислотна послідовність
В-ланцюга людського НС представлена в 5ЕО ІЮО Мо, 2, та є депонованою як МР. 000728. Дані амінокислотні послідовності відповідають немутантного типу амінокислотним послідовностям а- та В-ланцюга людського ПСО. Терміни "немутантного типу послідовність нуклеїнової кислоти" або "вихідна послідовність нуклеїнової кислоти" для цілей представленого винаходу стосуються послідовності нуклеїнової кислоти, яка є призначеною для того, щоб використовуватись для (над)експресії в клітині-господарі, та яка не була адаптованою до частоти використання кодону в клітині-осподарі, але представляє собою фактичну немутантного типу послідовність нуклеїнової кислоти, яка є кодуючою для протеїну. Термін "оптимізована послідовність нуклеїнової кислоти" для цілей представленого винаходу стосується послідовності, яка була модифікованою для експресії в клітині-осподарі за рахунок адаптування послідовності немодифікованої/вихідної послідовності нуклеїнової кислоти. Оптимізована послідовність нуклеїнової кислоти кодує протеїн, який має таку саму амінокислотну послідовність, як і протеїн, кодований немодифікованою послідовністю. Заявники розробили оптимізовані послідовності, які кодують а-ланцюг ПС (дивіться, наприклад, 5ЕО ІЮ Мо. 1 та 4, Фігура 1).
Відповідно до представленого винаходу в наступному аспекті передбаченою є полінуклеотидна послідовність (наприклад, полінуклеотидна послідовність, яка є кодуючою для са ланцюга ПСО), яка містить послідовність, вибрану з послідовності нуклеїнової кислоти, яка відповідає 5ЕО ІЮ МО: 1; послідовності нуклеїнової кислоти, яка відповідає ЗЕ ІЮО МО: 4; послідовності нуклеїнової кислоти 3 щонайменше 9795 гомологічністю з (наприклад, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 гомологічністю з) нуклетїновою кислотою 5ЕО ІЮ МО: 60 1 «наприклад, послідовності нуклеїнової кислоти з щонайменше 9795 ідентичністю послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 99595 ідентичністю послідовності 3) нуклетновою кислотою 5ЕО ІЮ МО: 1); та послідовності нуклеїнової кислоти з щонайменше 97 95 гомологічністю з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 гомологічністю 3) нуклеїновою кислотою 5ЕСО ІЮО МО: 4 (наприклад, послідовності нуклеїнової кислоти з щонайменше 97 95 ідентичністю послідовності з (наприклад, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичністю послідовності 3) нуклеїновою кислотою 5ЕО І МО: 4).
Відповідно до представленого винаходу в наступному аспекті передбаченим є спосіб отримання рекомбінантного ПСО в клітині, який включає культивування клітини в прийнятному середовищі та збір рекомбінантного протеїну (ПСО) із зазначеної клітини та/або зазначеного середовища (наприклад, збір рекомбінантного ПСО з клітинного культурального супернатанта), де клітина (клітина-господар) містить інтегровану в свій геном послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для «с ланцюга ПСО, вибрану з: послідовності, яка відповідає ЗЕО ІЮ
МО: 1; послідовності, яка має щонайменше 90 95 гомологічність з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:1 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 9095 ідентичність послідовності з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:1); послідовності, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з (наприклад, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 гомологічність з) послідовністю 5ЕО ІЮ
МО:1 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 97 95 ідентичність послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 99595 ідентичність послідовності 3) послідовністю 5ЕО ІЮ МО:1); послідовності, яка відповідає 5ЕО ІЮ МО. 4; послідовності, яка має щонайменше 90 95 гомологічність з послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 4 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 9095 ідентичність послідовності з послідовністю ЗЕ І МО:4); та послідовності, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з (наприклад, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 гомологічність з) послідовністю 5ЕО ІЮО МО:4 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 9795 ідентичність послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 ідентичність послідовності 3) послідовністю 5ЕО І МО:4). Переважно, послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для « ланцюга ПСО не є послідовністю, яка є депонованою як АНО0О7338. Клітина може додатково містити інтегровану в свій геном кКДНК, яка кодує альфа-2,3-сіалілтрансферазу, наприклад, послідовність, яка відповідає 5ЕО ІЮ МО: 3.
Клітина може додатково містити інтегровану в свій геном послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для В ланцюга ПСО, наприклад, послідовність, яка відповідає 5ЕО ІЮ МО:2.
Спосіб може включати додаткову стадію або стадії очистки рекомбінантного ПСО, отриманого із зазначеної клітина та/або зазначеного середовища (наприклад, очистка рекомбінантного ПСО з клітинного культурального супернатанта).
Клітина (господар) може представляти собою, наприклад, РЕК.СбФ клітину, НТ1080 клітину, аТ-55 клітину, тощо. Переважно клітина представляє собою РЕК.СбФ клітина, таку як РЕН.СбФ клітина, депонована в ЕСАСС Мо 96022940.
Відповідно до представленого винаходу в наступному аспекті передбаченим є спосіб продукування рекомбінантного ПСО ов клітині який включає культивування клітини в прийнятному середовищі та збір рекомбінантного протеїну (пс) із зазначеної клітини та/або зазначеного середовища (наприклад, збір рекомбінантного ПСО з клітинного культурального супернатанта), де клітина представляє собою РЕК.СбФ клітину (таку як РЕК.СбФ клітина, депонована в ЕСАСС по. 96022940), яка містить інтегровану в свій геном послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для «а ланцюга ПСО. Послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для с ланцюга ПСО, може бути вибраною з: послідовності, яка відповідає ЗЕО
ІО МО: 1; послідовності, яка має щонайменше 90 95 гомологічність з послідовністю ЗЕО ІЮ МО 1 (наприклад, послідовністю, яка має щонайменше 9095 ідентичність послідовності з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:1); послідовності, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з (наприклад, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 гомологічність з) послідовністю 5ЕО ІЮ
МО:1 (наприклад, послідовністю, яка має щонайменше 97 95 ідентичність послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 9995 ідентичність послідовності 3) послідовністю 5ЕО ІЮ МО:1); послідовності, яка відповідає 5ЕО ІЮ МО. 4; послідовності, яка має щонайменше 90 95 гомологічність з послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 4 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 9095 ідентичність послідовності з послідовністю ЗЕ І МО:4); та послідовність, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з (наприклад, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 гомологічність з) послідовністю 5ЕО ІЮ МО:4 (наприклад, послідовністю, яка має щонайменше 9795 ідентичність послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 9995 ідентичність послідовності 3) послідовністю 5ЕО ІЮО МО:4). Переважно послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для « ланцюга ПСО не є послідовністю, яка є депонованою як АНО0О7338. Клітина може додатково містити інтегровану в свій геном кДНК, 60 яка кодує альфа-2,3-сіалілтрансферазу, наприклад, послідовність, яка відповідає 5ЕО ІО МО: 3.
Клітина може додатково містити інтегровану в свій геном послідовність (нуклеїнової кислоти), яка є кодуючою для В ланцюга ПСО, наприклад, послідовність, яка відповідає БЕО ІЮО МО:2.
Спосіб може включати додаткову стадію або стадії очистки рекомбінантного ПСО, отриманого із зазначеної клітини та/або зазначеного середовища (наприклад, очистка рекомбінантного ПСО від клітинного культурального супернатанта).
Термін "клітина-господар" для цілей представленого винаходу стосується будь-якої клітина, яка зазвичай використовується для експресії, тобто транскрипції та трансляції послідовностей нуклеїнової кислоти для одержання, наприклад, поліпептидів. Зокрема, термін "клітина- господар" або "організм" стосується прокаріотів, нижчих еукаріотів, рослин, клітин комах або клітинних культуральних систем ссавців. Переважно, клітина-господар представляє собою клітину ссавця, більш переважно клітина-господар представляє собою людську клітину, ще більш переважно РЕКСбО клітину.
Термін "молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти" в межах значення представленого винаходу є призначеною для того, щоб включати всі види молекул нуклеїнової кислоти, які можуть бути введені в клітину-господар, та, які здійснюють експресію послідовності нуклеїнової кислоти, яка міститься в межах молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти. Термін включає, наприклад, плазмідні вектори та вірусні вектори (наприклад, аденовірусні, лентивірусні та ретровірусні вектори), як є добре відомим в даній галузі з рівня техніки.
Відповідно до представленого винаходу в наступному аспекті передбаченою є молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка містить (першу) послідовність нуклеїнової кислоти, яка є кодуючою для «4 ланцюга ПСО, де (перша) послідовність нуклеїнової кислоти є вибраною з послідовності, яка відповідає 5ЕО ІЮО МО: 1; послідовності, яка має щонайменше 96,5 95 гомологічність з послідовністю 5ЕО ІЮО МО:1 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 96,5 95 ідентичність послідовності з послідовністю ЗЕО ІО МО:1); послідовності, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 гомологічність 3) послідовністю ЗЕО ІЮ МО:1 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 97 965 ідентичність послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 ідентичність послідовності 3) послідовністю 5ЕО ІЮО МО:1); послідовності, яка відповідає ЗЕО ІЮ
МО. 4; послідовності, яка має щонайменше 96,5 95 гомологічність з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 4 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 96,595 ідентичність послідовності з послідовністю ЗЕ ІЮ МО:14; та послідовності, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з (наприклад, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 гомологічність з) послідовністю 5ЕО ІЮ
МО:4 (наприклад, послідовність яка має щонайменше 97 95 ідентичність послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 99595 ідентичність послідовності 3) послідовністю 5ЕО ІЮ МО:4). Переважно, молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за даним аспектом представленого винаходу містить як оптимізовану послідовність нуклеїнової кислоти, яка є кодуючою для а-ланцюга людського ПСО, так і послідовність нуклеїнової кислоти, яка є кодуючою для В-ланцюга ПСО. Переважно, (перша) послідовність нуклеїнової кислоти знаходиться під контролем промотора, який є активним в клітині-господарі. Переважно молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти додатково містить другу послідовність нуклеїнової кислоти, яка є кодуючою для В ланцюга по. Друга послідовність нуклеїнової кислоти, яка є кодуючою для В ланцюга ПСО може представляти собою послідовність, яка відповідає ЗЕО ІЮ Мо. 2.
Друга послідовність нуклеїнової кислоти може бути під контролем окремого промотора, який
Є активним в клітині-господарі. Перша послідовність нуклеїнової кислоти та/або друга послідовність нуклеїнової кислоти може бути під контролем вірусного промотора (наприклад,
СММіе промотора).
Відповідно до представленого винаходу в наступному аспекті передбаченою є клітина- господар, яка містить або включає молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти в передбаченому вище порядку (наприклад, клітина-господар, яка містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка містить (першу) послідовність нуклеїнової кислоти, яка є кодуючою для «4 ланцюга ПСО, де (перша) послідовність нуклеїнової кислоти є вибраною з послідовності, яка відповідає 5ЕО ІЮО МО: 1; послідовності, яка має щонайменше 96,5 95 гомологічність з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:1 (наприклад, послідовність яка має щонайменше 96,5 95 ідентичність послідовності з послідовністю ЗЕО ІО МО:1); послідовності, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 гомологічність 3) послідовністю ЗЕО ІЮ МО:1 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 97 965 ідентичність послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 ідентичність послідовності 3) послідовністю ЗЕО ІЮ МО':1); послідовності, яка відповідає ЗЕО ІЮ 60 МО. 4; послідовності, яка має щонайменше 96,5 95 гомологічність з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 4
(наприклад, послідовність, яка має щонайменше 96,595 ідентичність послідовності з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:4); та послідовності, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з (наприклад, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 гомологічність з) послідовністю 5ЕО ІЮ
МО:4 (наприклад, послідовність, яка має щонайменше 97 95 ідентичність послідовності з (наприклад, щонайменше 9895 або щонайменше 9995 ідентичність послідовності 3) послідовністю ЗЕО ІЮО МО:4).
Заявники виявили, що клітини (клітини-господарі), клітинні лінії, які мають в своєму складі дані клітини-господарі, молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, полінуклеотиди та способи за винаходом можуть продукувати рекомбінантний ПСО з високим виходом та чистотою (наприклад, з невеликою кількістю вільного бета ланцюга).
Відповідно до представленого винаходу в наступному аспекті передбаченим є рекомбінантним по ("тпСО" або "геспСо"), який включає а2,3- та а2,6-сіалілування, де рекомбінантний пСО продукується в клітині, як описано та заявлено в даному документі.
Рекомбінантний ПСО може мати вміст сіалової кислоти |виражений у вигляді співвідношення молей сіалової кислоти до молей протеїну) від 12 моль/моль до 20 моль/моль, наприклад, від 12 моль/моль до 15,5 моль/моль, наприклад, від 12 моль/моль до 14,9 моль/моль. гпСо (або препарат гпСбо) може мати вміст сіалової кислоти від 12,5 моль/моль до 14,5 моль/моль, наприклад, вміст сіалової кислоти від 12,8 моль/моль до 13,2 моль/моль. гпСо (або препарат
Со) відповідно до винаходу може мати вміст сіалової кислоти 13 моль/моль.
В прикладах за винаходом, гпСбО може бути присутнім у вигляді однієї ізоформа або у вигляді суміші ізоформ. Рекомбінантний ПСО (або препарат го), отриманий з використанням способів та клітин за винаходом, включає а2,3- та а2,6-сіалілування. Під сіалілуванням слід розуміти кількість сіалових залишків, присутніх на вуглеводних структурах ПСО. а2,3-
Сіалілування означає сіалілування в 2,3 положенні (як є добре відомим в даній галузі з рівня техніки); та а2,6 сіалілування означає сіалілування в 2,6 положенні (також є добре відомим в даній галузі з рівня техніки). Таким чином, в даному документі, формулювання "95 від загального сіалілування може представляти собою а 2,3 сіалілування" стосується 95 від загальної кількості залишків сіалової кислоти, присутніх в ПСО, який є сіалілованим в 2,3 положення. Термін "де 95 від загального сіалілування є са2,6-сіалілуванням" стосується 95 від загальної кількості залишків сіалової кислоти, присутніх в ПСО, який є сіалілованим в 2,6 положення. Термін "де 95 від загального сіалілування є а2,8-сіалілуванням" стосується 9о від загальної кількості залишків сіалової кислоти, присутніх в ПСО, який є сіалілованим в 2,8 положення. по (або препарат пс), отриманий з використанням способів та клітин відповідно до винаходу, може мати від 1 95 до 99 95 від загального сіалілування, яке представляє собою аг2,3- сіалілування. гпСбО (або препарат СО), отриманий з використанням способів та клітин відповідно до винаходу, може мати від 195 до 9095 від загального сіалілування, яке представляє собою а2,3-сіалілування. гпСо (або препарат пСс) відповідно до винаходу може мати 10 95 або більш від загального сіалілування, яке представляє собою а2,3-сіалілування, наприклад, від 1095 до 9095 від загального сіалілування може представляти собою аг2,3- сіалілування. Наприклад, 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80 або 90 95 або більше від загального сіалілування може представляти собою аг2,3-сіалілування. Від 4595 до 80 95 від загального сіалілування може представляти собою а2,3-сіалілування, наприклад, від 5095 до 70 95 від загального сіалілування може представляти собою а2,3-сіалілування, наприклад, від 55 до 65 95 від загального сіалілування може представляти собою аг2,3-сіалілування. пп (або препарат
Со) може включати са2,3-сіалілування в кількості, яка становить від 65 до 95 95 від загального сіалілування, наприклад, від 70 до 90 95 від загального сіалілування, наприклад, від 85 до 90 95 від загального сіалілування. по (або препарат го), отриманий з використанням способів та клітин за винаходом, може мати від 1 до 99 95 від загального сіалілування, яке представляє собою са2,6-сіалілування. по (або препарат го) за винаходом може мати від 5 до 50 95 від загального сіалілування, яке представляє собою а2,6-сіалілування. Наприклад, від 5 до 45 95, наприклад, від 6 до 40 95, наприклад, від 7 до 3095, наприклад, від 8 до 2095 від загального сіалілування може представляти собою са2,6- сіалілування. гпСОо (або препарат гпСбО) може включати а2,6- сіалілування в кількості, яка становить 20-75 95 від загального сіалілування, наприклад, 30-60 95 від загального сіалілування, наприклад, 35-45 95 від загального сіалілування. СО (або препарат гпСо) може включати с2,6-сіалілування в кількості, яка становить від 5 до 35 95 від загального сіалілування, наприклад, від 10 до 20 95 від загального сіалілування. Наприклад, 11- 55 95 від загального сіалілування може представляти собою а2,6- сіалілування. пСбО або препарат гпСбб, отриманий з використанням способів та клітин може бо необов'язково додатково включати а2,8 сіалілування. гпСО (або препарат гпСо) за винаходом можу мати 595 або менше від загального сіалілування, яке представляє собою аг2,8- сіалілування, наприклад, від 0 до 4 95, наприклад, 0,1-4 95 від загального сіалілування може представляти собою а2,8- сіалілування. гпСО (або препарат гпиСОо) за винаходом може мати жодного а2,8-сіалілування. ПСО (або препарат гпСс), отриманий з використанням способів та клітин відповідно до винаходу може мати вміст сіалової кислоти (кількість сіалілування на молекулу ПСО) (на основі маси протеїну, а не на основі маси протеїну плюс вуглевод) 6 95 або більше (наприклад, від 6 95 до 15 95, наприклад, від 7 95 до 13 95, наприклад, від 8 95 до 12 95, наприклад, від 11 95 до 15 95, наприклад, між 12 95 до 14 95) за масою. по (або препарат пс) може бути продукований або експресований в людський клітинній лінії, наприклад, РЕК.Сб6Ф клітинній лінії, НТ1080 клітинній лінії, тощо. гпСОс (або препарат
СО) може бути продукований або експресований в людській похідній клітинній лінії або модифікованій людській клітинній лінії наприклад, РЕК.СбФ похідній клітинній лінії або модифікованій РЕК.СбФ клітинній лінії, модифікованій НТ1080 клітинній лінії або НТ1080 похідній клітинній лінії, тощо. В переважному прикладі, гпПСО продукується або експресується в
РЕК.СбФ клітинній лінії, РЕК.СбФ похідній клітинній лінії або модифікованій РЕК.СбФ клітинній лінії. ГПО, який продукується або експресується в людській клітинній лінії (наприклад, РЕК.СбФ клітинній лінії, НТ1080 клітинній лінії, Т-55 клітинній лінії), буде включати деяку кількість а2,6- зв'язаниї сіалових кислот (02,6 сіалілування), що забезпечується ендогенною активністю сіалілтрансферази (клітинної лінії та буде включати деяку кількість а2,3-зв'язаних сіалових кислот (02,3 сіалілування), що забезпечується ендогенною активністю сіалілтрансферази клітинної лінії. Клітинна лінія може бути модифікованою, використовуючи а2,3- сіалілтрансферазу. Альтернативно або додатково, клітинна лінія може бути модифікованою, використовуючи а2,6-сіалілтрансферазу. Це може спростити (та зробити більш ефективним) спосіб отримання, оскільки маніпулювання та контроль, наприклад, за середовищем росту клітин для підтримування сіалілування, може бути менш критичним, ніж при використанні відомих способів. Спосіб також може бути більш ефективним, оскільки отримується невелика кількість основного ПСО в порівнянні з виробництвом відомих продуктів гпПСО; продукується більш кислотний пс, та розділення/видалення основного ПСО є менш проблематичним.
СО може бути отриманий з використанням а2,3- сіалілтрансферази, наприклад, отриманий з використанням людської клітинної лінії, модифікованої з використанням аг2,3- сіалілтрансферази. гпСбО може включати са2,6-зв'язані сіалові кислоти (02,6 сіалілування), що забезпечується ендогенною активністю сіалілтрансферази. гпбО може бути отриманий з використанням а2,3- та/або со2,6-сіалілтрансферази, наприклад, отриманий з використанням людської клітинної лінії, модифікованої з використанням а2,3-сіалілтрансферази та/або аг2,6- сіалілтрансферази.
Відповідно до представленого винаходу в наступному аспекті передбаченим є рекомбінантний ПСО або препарат рекомбінантного ПСО, як описано в даному документі, який продукується або експресується за способами, описаними в даному документі.
Структура птСО містить гліканові фрагменти. Як є добре відомим в даній галузі з рівня техніки може відбуватися розгалуження, в результаті чого глікан може мати 1, 2, 3, 4 або більш термінальних цукрових залишків або "антен". гпСО відповідно до аспектів винаходу відповідно до винаходу може мати глікани з моно-антенними, та/або ді-антенними, та/або три-антенними, та/або тетра-антенними глікановими структурами. гпСО може включати моно-антенні, та/або бі- антенні, та/або три-антенні, та/або тетра-антенні гліканові структури, наприклад, з наступними відносними кількостями: від 0,1 до З 95 моно-антенних; від 65 95 до 85 95 бі-антенних; від 15 до 25 95 три-антенних та від 0,5 до 1,5 95 тетра-антенних (наприклад, як показано МАХ аналізом заряджених гліканів).
Відповідно до представленого винаходу в наступному аспекті передбаченою є фармацевтична композиція, яка містить рекомбінантний ПСО (СС), який має а2,3-сіалілування та а2,6-сіалілування, де рекомбінантний пСО продукується з використанням способів та/або клітин, розкритих в даному документі. ГпПСО може мати вміст сіалової кислоти |виражений у вигляді співвідношення молей сіалової кислоти до молей протеїну) від 12 моль/моль до 15,5 моль/моль, наприклад, від 12 моль/моль до 14,9 моль/моль (наприклад, в передбаченому вище порядку). гпСбО може мати вміст сіалової кислоти від 12,5 моль/моль до 14,5 моль/моль, наприклад, вміст сіалової кислоти від 12,8 моль/моль до 13,2 моль/моль. Переважно псСо відповідно до винаходу має вміст сіалової кислоти 13 моль/моль.
Фармацевтична композиція може додатково містити ЕН та/або І Н.
Е5Н може бути отриманий за будь-яким способом, відомим в даній галузі. ЕН, як використовується в даному документі, включає людського походження та рекомбінантний ЕЗН. 60 Людського походження БЕ5Н може бути виділений з будь-якого відповідного джерела
(наприклад, сечі) за будь-яким способом, відомим в даній галузі. Е2Н може представляти собою рекомбінантний ЕЗН - наприклад, який експресується в людській клітинній лінії. Способи експресування та очистки рекомбінантного Е5Н є добре відомими в даній галузі з рівня техніки.
ЇН може бути отриманий за будь-яким способом, відомим в даній галузі. ІН, як використовується в даному документі, , включає людського походження та рекомбінантний І Н.
Людського походження І Н може бути виділений з будь-якого відповідного джерела (наприклад, сечі) за будь-яким способом, відомим в даній галузі Способи експресування та очистки рекомбінантного І Н є відомим в даній галузі з рівня техніки.
Фармацевтична композиція може бути призначена для, або для застосування в, лікуванні безпліддя, наприклад, для застосування в, наприклад, допоміжних репродуктивних технологіях (АКТ), індукції овуляції або внутрішньоматковій інсемінації (ШІ). Фармацевтична композиція може бути призначена для, або для застосування в, індукуванні кінцевого дозрівання / овуляції та лютеїнізації, стимуляцію фолікулярного розвитку у жінок з серйозним дефіцитом ІН та ЕН, та/або в подтриманні функції жовтого тіла (гпСО/ІН). Фармацевтична композиція може бути призначена для, або для застосування в, індукуванні монофолікулярного розвитку в ановуляторних жінок М/НО типу ІІ (наприклад, пс з гі Н), для посилення мультифолікулярної відповіді з ІН праймуванням у пацієнтів, які піддаються СОН (наприклад, по з гі НН), та для доповнення до СОН для того, щоб покращити рівні імплантації/вагітності (наприклад, гпСо з
Г/Н), та/або збільшення рівнів вагітності в допоміжних репродуктивних технологіях.
Фармацевтична композиція може бути призначена для, або для застосування в, попереджені самовільних абортів, та/л"або попереджені недоношенності. Фармацевтична композиція може бути призначена для, або для застосування в, лікуванні ендометріозу.
Фармацевтична композиція може використовуватися, наприклад, при медичних показаннях, при яких використовуються відомі препарати ПСО. Представлений винахід також передбачає застосування СО та/або препарата гпСбО, описаного в даному документі (відповідно до аспектів за винаходом) для, або у виробництві лікарського засобу для, лікуванні безпліддя.
Фармацевтична композиції за представленим винаходом може бути сформульованою в добре відомі композиції для будь-якого способу введення лікарського засобу, наприклад, перорального, ректального, парентерального, трансдермального (наприклад, пластирні
Зо технології), внутрішньовенного, внутрішньом'язового, внутрішньочеревного, підшкірного, інтрацистернального, внутрішньовагінального, внутрішньочеревного, місцевого (порошки, мазі або краплі), або у формі буккального або назального спрею. Типова композиція включає фармацевтично прийнятний носій, такий як водний розчин, нетоксичні наповнювачі, включаючи солі та консерванти, буфери та подібні до них, як це описано в Кептіпдіоп'є Рпаптасеціїсаї! зсієпсе5 п'ятнадцяте видання (Май Рибіїзпіпд Сотрапу, 1975), на сторінках з 1405 по 1412 та 1461 - 87, та національному формулярі ХІМ чотирнадцяте видання (Атегісап Рпагтасеціїсаї!
Аз5осіайоп, 1975), серед інших. Приклади прийнятних водних та неводних фармацевтичних носіїв, розріджувачів, розчинників або наповнювачів включають воду, етанол, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь, та подібні), карбоксиметилцелюлозу та їх прийнятні суміші, рослинні олії (такі як оливкова олія), та ін'єкційні органічні складні ефіри, такі як етилолеат. Композиції за представленим винаходом також можуть містити добавки, такі як, але не обмежуючись ними, консерванти, зволожуючі речовини, емульгуючи агенти, та диспергуючі агенти. Антибактеріальні та протигрибкові можуть бути включеними для запобігання росту мікробів та включають, наприклад, м-крезол, бензиловий спирт, парабен, хлорбутанол, фенол, сорбінову кислоту та подібні. Крім того, бажаним може бути включити ізотонічні агенти, такі як цукри, хлорид натрію, тощо.
В деяких випадках для того, щоб забезпечити довготривалу дію бажаним є уповільнити абсорбцію СО (та інших активних інгредієнтів, якщо вони присутні) з підшкірної або внутрішньом'язової ін'єкції. Це може бути досягнуте за рахунок використання рідкої суспензії кристалічного або аморфного матеріалу з низькою розчинністю на воді. Швидкість абсорбції
ПСО потім залежить від його швидкості розчинення, яка, в свою чергу, може залежати від розміру кристала та кристалічної форми. Альтернативно, відстрочена абсорбція парентерально введеної комбінованої форми пСОС виконується шляхом розчинення або суспендування комбінації ПСО в олійному наповнювачі. Форми депо для ін'єкцій можуть бути зроблені шляхом утворення мікрокапсулярних матриць СС (та інших агентів, якщо вони присутні) у біологічно розщеплюваних полімерах, таких як полілактид-полігліколід. В залежності від співвідношення
ПСО до полімеру та природа використовуваного конкретного полімеру, може контролюватися швидкість вивільнення ПСО. Приклади інших біологічно розщеплюваних полімерів включають полівінілпіролідон, полі(орто-складні ефіри), полі(ангідриди) та інші. Депо ін'єкційні препарати бо також отримують за рахунок оточення ПСО ліпосомами або мікроемульсіями, які є сумісними з тканинами тіла. Ін'єкційні композиції можуть бути стерилізованими, наприклад, шляхом фільтрування через бактеріє-утримуючий фільтр або шляхом включення в свій склад стерилізуючих агентів у вигляді стерильних твердих композицій, які можуть бути розчинені або дисперговані в стерильній воді або іншому стерильному ін'єкційному середовищі безпосередньо перед застосуванням. Ін'єкційні композиції можуть бути поставлені в будь-якому відповідному контейнері, наприклад, флаконі, попередньо заповненому шприці, картриджів для ін'єкцій, тощо.
Препарати (наприклад, ін'єкційний препарат) може поставлятися у вигляді продукту, який містить фармацевтичні композиції, яка містить ПСО (необов'язково з Е5Н, ІН, тощо) Якщо існує більше ніж один активний інгредієнт (тобто ПСО та, наприклад, Е5Н або ІН), вони можуть бути прийнятними для введення по-окремості або разом. Якщо вводяться по-окремості, введення може бути послідовним. Продукт може поставлятися в будь-якому відповідному пакуванні.
Наприклад, продукт може містити декілька попередньо наповнених шприців або флаконів, які містять або ПСО, ЕЗН, або комбінацію як ЕЗН, так і ПСО. Шприці або флакони можуть бути упаковані в блистерну упаковку або іншим способом для підтримки стерильності. Продукт може необов'язково містити інструкції щодо використання препаратів ПСО та ЕН. рН та точна концентрація різних компонентів фармацевтичної композиції відповідно до звичайної практики в даній галузі. Дивіться ЗОООМАМ апа сії МАМ'є ТНЕ РНАВМАСОЇ ОСІСАЇГ
ВАБІЗЄ РОН ТНЕВАРЕШТІСЄ, 7" ей. В переважному варіанті здійснення, композиції за винаходом поставляються як композиції для парентерального введення. Загальні способи отримання парентеральних препаратів є відомими в даній галузі та є описаними в КЕМІМСТОМ;
ТНЕ 5СІЕМСЕ апа РКАСТІСЕ ОЕЄ РНАКМАСУ, зирга, на сторінках 780-820. Парентеральні композиції можуть поставлятися у вигляді рідких препаратів або у вигляді твердих препаратів, які будуть змішуватися зі стерильним ін'єкційним середовищем безпосередньо перед введенням. В одному варіанті здійснення, парентеральні композиції поставляються у вигляді дозованої одиничної форми для простоти введення та однорідності дозування.
Детальний опис винаходу
Представлений винахід зараз буде описаним більш детально з посиланням на наступні приклади та креслення, які додаються, в яких:
Фігура 1 показує нуклеїнову кислоту та похідні амінокислотної послідовності оптимізованої
ПСО альфа послідовності;
Фігура 2 показує нуклеїнову кислоту та похідні амінокислотної послідовності ПСО бета послідовності;
Фігура З показує нуклеїнову кислоту та похідні амінокислотної послідовності 5ТЗОАЇ 4
Фігура 4 показує плазмідну карту вектора експресії рпСо альфа/бета;
Фігура 5 показує вектор експресії а2,3-сіалілтрансферази (5ТЗСАЇ 4);
Фігура 6 показує детектування ізоформ гпСбО з використанням ІЕЕ, забарвленого кумасі блакитного в композиціях відповідно до винаходу (смуги 4, 5, 6 та 7, 15 мкг на смугу); композиція похідної СНО з попереднього рівня техніки, ОміїгеПе (смуга 2, 15 мкг); та людський сечовий продукт, отриманий у вагітних жінок Момагеї (смуга 3, 15 мкг); та
Фігура 7 порівнює концентрацію ПСО ("альфа-бета ПСО") та вільного бета ланцюга ("бета
ПСО"), отриманого з використанням клітин за винаходом, включаючи "оптимізовану" нуклеїнову послідовність альфа субодиниці, у порівнянні з концентрацією по ("альфа-бета ПСО") та вільного бета ланцюга ("бета ПСО"), отриманого в порівняльному прикладі клітини, включаючи
МУЛ (немутантного типу) альфа субодиницю;
Приклади 1-7
Огляд процесу розробки клітинної лінії
Одна плазміда, яка несе ПСО альфа та бета ланцюги, кожен з яких походить з окремого
СММіе промотора, був трансфікованим в РЕК.СбФ клітини шляхом електропорації.
Дана плазміда переносила касету з геномією резистентності до неоміцину (Фіг. 4), що дозволяє виділяти трансфектанти з використанням (35418 (Сепеїісіп). Пули трансфектантів розмножували та потім піддавали клонуванню за способом серійних розбавлень в 96-лункових планшетах з відбором 5418. Клональні лінії розмножували та високо експресовані колонії були ідентифіковані, грунтуючись на титрі ПСО в клітинному культуральному супернатанті.
Вибраними були п'ять отриманих клонів, вибір яких грунтується на високій продуктивності, кожен з них був потім трансфікованим з другою плазмідою гена 5Т20БАЇ1 4, експресуючого а2,3- сіалітрансферазу разом з маркером відбору гігроміцину (Фіг. 5). Кожен з п'яти пулів трансфекції був розмножений, та клітинні культуральні супернатанти оцінювали щодо концентрації ПСО та фармакокінетики (РК) іп мімо.
Потенційно перспективні пули потім піддавали іншому раунду клонування за способом бо серійних розбавлень. Отримані в результаті клони розмножували, та клітинні культуральні супернатанти оцінювали щодо концентрації пСО, та піддавали обробці галактозою на СС протеїні (з використанням лектинового ЕГІЗА). Ті, які мали низький рівень поверхневої галактози були піддані подальшим аналізам, які включають іп мімо РК. Клони, , які продукували
ПСО 3 оптимальними профілями РК, мали низьку поверхневу галактозу та експресували протеїн на високих рівнях, оцінювали та відбирали для характеристики продуктивності та росту.
Приклад 1: Вибір послідовності та плазмідні вектори
Кодуюча ділянка гена для ПСО альфа поліпептида є показаною на Фіг. 1. Кодуюча ділянка гена для послідовності ПСО альфа поліпептида називається в даному документі зЕО ІЮ МО: 1.
Кодуюча ділянка гена для ПСО бета поліпептида використовувалась відповідно до Фіддеса та Гудмена (1980). Послідовність є депонованою як МР. 000728 та є узгодженою з протеїновими послідовностями СОСбетаЗз, СОСбета5 та СОбета7. Послідовність називається в даному документі як БЕО ІЮО МО: 2.
Кодуюча ділянка гена для бета-галактозиду альфа-2,3-сіалілтрансферази 4 (а2,3- сіалілтрансферази, ЗТЗОАЇ 4) використовувалась відповідно до Кітагава та Паулсона (1994).
Послідовність є депонованою як І 23767 та називається в даному документі як ЗЕО ІЮО МО: 3.
Використовувалась дві плазміди: перша, рис, спів-експресує альфа та бета ланцюги ПСО; та друга, експресує сіалілтрансферазний ген ЗТЗОАЇ 4.
Приклад 2а: Конструювання вектора експресії ПСО риСо представляє собою синтетичний альфа ланцюг ПСО, оптимізовані щодо використання кодону в клітинах ссавців, включаючи нативний альфа сигнальний пептид ПСО. Він може бути сконструйованим за способами, добре відомими в даній галузі.
Кодуюча послідовність альфа поліпептида ПСО (5ЕО ІЮ МО: 1) та бета поліпептида ПСО (МР 000728, 5ЕО ІО МО: 2) була ампліфікована з використанням ПЛР, застосовуючи способи, добре відомі в даній галузі (дивіться, наприклад, Міжнародну патентну заявку, опубліковану як
УМО2011/042688). рпиСбоО альфа ДНК розщеплювався Ватні та Мпе! та вставлявся в сайти
Ватні та Мпе! на СМУ, керований вектором експресії ссавця (Стгисеї! вектор рсОМАЗО02Мео).
Це розташувало ген у правильній орієнтації для експресії, керованої промотором СММіеє з сигналом полі-А ВОН по ходу транскрипції. Нативний ПСО бета ген, який включає нативний сигнальний пептид, розщеплювали ферментами рестрикції Авзсі та Нраї та вставляли в сайти
Зо А5сі та Нраї, таким чином, що експресія повинна була керуватись другим промотором СММіе з додатковим сигналом полі-А ВОН по ходу транскрипції. Скелет вектора також включав неоміциновий маркер резистентності, а також елементи, необхідні для відбору та реплікації в прокаріотичних клітинах. Вектор був ампліфікованим та секвенованим з використанням загальних способів, які є відомими в даній галузі з рівня техніки. Послідовності оптимізованих альфа та нативного (немутантного типу) бета ланцюгів ПСО є представленими на фігурах 1 та 2, відповідно.
Всі колонії, відібрані для секвенування, містили правильні послідовності, які відповідають
ЗЕО ІЮ МО: 1 та ЗЕО ІЮ МО: 2. Плазміда риСо АВ була вибрана для трансфекції (Фігура 4).
Приклад 260: Конструювання вектора експресії 53
Ген ЗТЗОАЇ 4 експресується в реТ3. Кодуюча послідовність бета-галактозидної альфа-2,3- сіалілтрансферази 4 (513, 123767, 5ЕО ІЮ МО: 3, фіг. 3) була ампліфікована з використанням
ПЛР, застосовуючи комбінацію праймерів 2,357 М та 2,35ТТгем. 2,351 5-ССАасаАтоСасСсСАССАТа Та тОоСсТасАав,Са7астацАдас-3 2,351тем У-П "ТТ ТТТСТТААатСАпААа,ааАСа,атадаатстта-3
Отриману в результаті ампліфікована 5Т3 ДНК розщеплювали за допомогою ферментів рестрикції Ватні та АЙ та вставляли в Ватні та АЙ сайти на СМУ, керованому вектором експресії ссавця, який несе гігроміциновий маркер резистентності (вектор, рсрМАЗО02Мео), таким чином, що він розташовується по ходу транскрипції СММіе промотора та проти ходу транскрипції полі-А послідовності ВОН. Скелет вектора також включав гігроміциновий маркер резистентності, а також елементи, необхідні для відбору та реплікація в прокаріотичних клітинах. Вектор був ампліфікованим, як раніше описано, та секвенованим. Клон ретзЯ (Фігура 5) містив правильну послідовність, яка відповідає ЗЕО ІЮ МО: З та був вибраний для трансфекції.
Приклад З - Трансфекція плазміди
Плазміда рис (Фіг. 4), яка має єдиний сайт Руці, розташований в гені прокаріотичної бета- лактамази, була лінеаризованною з Рмц! (Мем/ Епдіапа Віоїар5 Саї. Мо. КО150). Лінеаризована плазміда ДНК була трансфектованою в РЕК.СбФ клітинах наступним чином.
Клітинні культури підтримували в повному РЕКМАВ середовищі (СО4РЕКМАВ (Нусіопе Саї.
Мо. 5НЗ0871.01), доповненому І -глутаміном до З мМ кінцевої концентрації (Іпмігодеп Саї. Мо. бо 25030-123) та плюронилом Еб8 в кінцевій концентрації 1,0 г/л (Іпийгодеп Саї. Мо. 24040-032) в
250 мл конічних колбах Ерлонмейера. Клітини підтримували в інкубаторі зі струшуванням (Киппег Сіїто-зНнаКег ІЗЕ1-Х), який встановлювали на 100 об./хв., 5 95 СбО»г та 37 "С, протягом щонайменше 14 днів до трансфекції. За 48 годин до трансфекції, клітини переносили у свіже середовище зі щільністю 0,5 х 105 клітин/мл.
В день трансфекції клітини були перераховані в лічильнику ВесКтап Сошег мМіСеїІ ХЕ для того, щоб визначити щільність клітин та забезпечити життєздатність, яка становить » 90 95.
Клітини збирали шляхом центрифугування та повторно суспендували в свіжому середовищі
РЕКМАВ перед тим, як змішували з лінеаризованною риСо ДНК. Суміш клітина/дДНК піддавали дії електрошоку в камері електропоратора, встановленого на 250 В протягом 5 мс, перед тим як швидко переносити в 10 мл попередньо нагрітого середовища РЕКМАВ. Даний процес повторювали всього 6 разів, та всі б трансфекцій об'єднувались в одну колбу для тканинної культури Т-175 см". Колбу розташовували в статичний інкубатор, встановлений при 37 "С, 5 95
СО». Через 48 годин, клітини повторно суспендували у відповідному об'ємі селективного
РЕКМАВ (повне середовище РЕКМАВс418 (125 мкг/мл)) для того, щоб отримати щільність життєздатних клітин 0,5 х 105/мл.
Культуру пулу пасажували двічі на тиждень, підтримуючи клітини при щільності 0,3 х 105 клітин/мл у селективному середовищі до тих пір доки життєздатність клітин не підвищувалась на » 5095. В даній точці клітини переносили на струшування культури у 250 мл колбах
Ерленмейера. Через декілька тижнів в умовах струшування культури з супернатанту пула відбирали зразок та аналізували щодо концентрацію ПСО. Як тільки було встановлено, що пул був позитивним для експресії пйСО, клітини готували для клонування за способом серійних розбавлень.
Клітинну суспензію в концентрації 0,3 життєздатних клітин/"мл отримували в середовищі
РЕЕМАВ, доповненому С-418 в концентрації 125 мкг/мл. Клітинну суспензію розподіляли в 96- лункові планшети з плоским дном для тканинних культур в концентрації 200 мкл/лунку та інкубували у зволоженій атмосфері при 37 "С, 595 СО» (Віпдег СВ150). Планшети регулярно сканувалися з використанням пристрою для візуалізації зображення Сепеїїх Сіопе Зеїесі Ітадег для відстеження росту клітин у кожній лунці.
Через два тижні 535 лунок були ідентифікованими як такі, що містять активно ростучих
Зо колоній клітин. Із супернатантів з даних лунок відбирали зразки та аналізували щодо ПСО, використовуючи комерційний набір (ОКО діагностика НСС ЕГІЗА Саї. Мо ЕІА1469). На підставі результатів даних аналізів, 162 колонії були перенесені в 24-лункові планшети, які містять 0,5 мл/лунку селективного середовища РЕКМАВ. Коли клітини в лунках утворювали майже суцільний шар клітин, з супернатанту з кожної зі 162 лунок відбирали зразки та аналізували щодо рівнів ПСО. На підставі даних результатів, 91 найкращих експресуючих клітинних ліній відбирали для розмноження в колби Т-25. Дані клітинні лінії знову вирощували до утворення майже суцільного шару, після чого з супернатантів відбирали зразки та аналізували для ПСО, як зазначено вище. На підставі даних результатів, 58 найкращих експресуючих клітинних ліній розмножували в Т-75 колбах. Специфічний аналіз рівня продуктивності (ЗРК) проводився на кожній з даних 58 клітинних ліній за способами, відомими в даній галузі з рівня техніки, та питому продуктивність виражали в пг/клітина/день.
Таким чином, в даному прикладі плазміда, яка має в своєму складі альфа та бета ланцюги
ПСО, була трансфектованою в РЕК.СбФ клітини, та трансфектанти відокремлювали з використанням середовища, яке містить (3418. Зростаючі колонії клітин піддавали скринінгу щодо концентрації ПСО в супернатанті, та ті, які експресують найвищий рівень, розмножували додатково. Після подальших циклів розмноження та скринінгу, 20 клонів, які експресують ПСО, були відібрані для дослідження росту та продуктивності. На підставі результатів даних досліджень, 5 клонів були відібрані для трансфекції з другою плазмі дою, яка має в своєму складі ген 5ТЗОАЇ 4.
Приклад 4 - Трансфекція з ретТЗ3 плазмідою 5ТЗОАЇ 4
Стабільні клони генерували як описано раніше в прикладі 3.
П'ять найкращих клонів, отриманих з використанням способу, як описано в прикладі 3, були відібрані для трансфекції з рОТ3 плазмідою ЗТЗСА14 (дивіться приклад 2, фігуру З та 5).
Трансфекцію здійснювали шляхом електропорації з використанням того самого способу, який є описаним в прикладі 3, за винятком того, що трансформанти вибирали в повному середовищі
РЕКМАВ, доповненому гігроміцином в концентрації 0,5 мкг/мл замість (3418. З використанням даного способа було отримано п'ять пулів, які експресують ПСО.
Зразки супернатантів з пулів трансфекції оцінювали в фармакокінетичній моделі з щурами та, на підставі цих даних разом із даними з аналізу зв'язування з КСА-лектином (вимірювання бо поверхневої галактози на ланцюгах ПСО), один пул був відібраний для подальшого клонування за способом серійних розбавлень, з використанням способів, відомих в даній галузі з рівня техніки.
Дане клонування з розбавленням давало »б0О0 клонів, кожен з яких також був скринінгований щодо експресії пСО, та ступінь поверхневої галактози вимірювали шляхом зв'язування КСА-лектину. Ті клони, які мали найнижчі рівні поверхневої галактози, додатково розмножували, та зразки піддавали РК іп мімо, що підтверджує дані про зв'язування лектину
П'ять клонів, отриманих з одного пулу додатково оцінювали щодо характеристик росту та продуктивності.
Кожен з даних клонів розмножували та отримували банк клітин посівного матеріалу після стандартних процедур кріоконсервування. Штами з банку клітин посівного матеріалу були розморожені та визнані життєздатними.
Приклад 5 - Аналіз з використанням ізоелектричного фокусування.
Електрофорез визначається як перенесення заряджених молекул через розчинник електричним полем. Рухливість біологічної молекули через електричне поле буде залежати від сили поля, чистого заряду на молекулі, розміру та форми молекули, іонної сили та властивостей середовища, через яке молекули мігрують.
Ізоелектричне фокусування (ІЕЕ) представляє собою електрофоретичну методику для розділення протеїнів на основі їхнього рі. рі представляє собою рнН, при якому протеїн не має ніякого чистого заряду та не буде мігрувати в електричному полі. Вміст сіалової кислоти в ізоформах ПСО в незначній мірі змінює точку рі для кожної ізоформи, яку можуть використовувати при застосуванні даної техніки, щоб візуалізувати ізоформи Рег.Сб ПСО з кожного клону.
Ізоелектричні точки Рег.Сб, отриманих ізоформ ПСО, аналізували з використанням ізоелектричного фокусування. Рег.Сб пСО отримували як описано в прикладі 6. Зразки ПСО
Рег.Сб були розділені на гелях МомехФф ІЕРЕ, які містять 5 95 поліакриламіду в нативних умовах при градієнті рН 3,0 - 7,0 в розчині амфоліту з рН 3,0 - 7,0. Протеїни були візуалізовані з використанням забарвлення кумасі блакитного, з використанням способів, добре відомих в даній галузі з рівня техніки.
Фігура 6 показує детектування ізоформ гпСбО з використанням ІЕЕ, забарвленого кумасі блакитним в композиції, отриманій відповідно до винаходу, отриманій з клонованих клітинних ліній, створених за способом, представленим в прикладі 6 (смуги 4, 5, 6 та 7, 15 мкг на смугу); композиція похідної СНО з попереднього рівня техніки, ОміїгеПе (Смуга 2, 15 мкг); та людський сечовий продукт, отриманий від вагітних жінок Момагеї! (Смуга 3, 15 мкг). Смуги представляють ізоформи ПСО, які містять різні кількості молекул сіалової кислоти. Фігура 6 показує, що рекомбінантний по, продукований людською клітинною лінією, сконструйований з аг2,3- сіалілтрансферазою (композиції відповідно до винаходу), є більш кислотними, ніж ОмігейПе та
СО з сечі від вагітних жінок.
Фігура 7 порівнює концентрацію ПСО ("альфа-бета ПСО") та вільний бета ланцюг ("бета по"), отриманий з використанням клітин за винаходом (тобто, з використанням клітинних ліній, здійснених за способом, представленим в прикладах 1-4), які включають "оптимізовану" альфа субодиницю, у порівнянні з концентрацією ПСО ("альфа-бета ПСО"), та вільний бета ланцюг ("бета ПСО"), отриманий в клітинах з порівняльного прикладу, які включають УТ (немутантного типу) альфа субодиницю. Фігура 7 показує, що клітини за винаходом експресують великі кількості ПСО та низький рівень надлишку вільної бета субодиниці. Іншими словами, вихід та чистота рекомбінантного ПСО, отриманого з використанням клітин та способів за винаходом, є помітно покращеними. Таблиця А показує відсоток вільних Б6-пСОо субодиниць у напівочищених зразках різних партій пйСО, отриманих з використанням клітин за винаходом (тобто, з використанням клітинних ліній, отриманих за способом, представленим в прикладах 1-4), які включають "оптимізовану" альфа субодиницю ("опт. альфа ПСО"), в порівнянні з відсотком вільних 6-пСО субодиниць у напів-очищених зразках ПСО, отриманих в клітинах порівняльного прикладу, які включають М/Т (немутантного типу) альфа субодиницю (УМ альфа ПСО"), як визначено з використанням гідрофобний феніл-5РУМ ВЕРХ хроматографії.
Таблиця А показує, що клітини за винаходом експресують високі кількості ПСО та досить низький надлишок вільної бета субодиниці (5,7 - 10,6 95) в порівнянні з клітинами, які включають
УМ альфа субодиницю (64 - 66 95). Іншими словами, вихід та чистота рекомбінантного ПСО, отриманого з використанням клітин та способів за винаходом є помітно покращеними.
Таблиця А
М/пальфапсо(102) | 660 г -:ЖБ
Опт.альфбайсс(29) | 66 у(
Приклад 6 - Огляд продукування та очистки
Розробленою була процедура отримання рекомбінантного ПСО в клітинах РЕК.Сб, які були культивовані в суспензії в середовищі, яке не містить сироватку. Процедура описана нижче та застосовувалась до декількох клітинних ліній РЕК.С6, які продукують ПСО.
Рекомбінантний пСО з а2,3-сіалілтрансфераза-трансфектованого клону отримували з використанням способів з прикладів 1 - 4, описаних вище.
Клітини вирощували в шейкер-колбах в середовищі 6ОКО (ЗАЕС) до досягнення щільності клітин від 1 х 106 до З х 105 клітини/мл. клітини переносили в 5 л біореактор з скляною перемішуваною ємністю зі щільністю приблизно 1 х 105 клітини/мл. Біореактор працював в перфузійному режимі Біореактор працював в перфузійному режимі з використанням середовищ
Ргорен (І опга).
Після цього очищення продукту г пСО здійснювалось з використанням різних ультрафільтраційних стадій, аніоно- та катіонообмінної імобілізованої хроматографії, гідрофобної хроматографії та псевдоафінної хроматографії, за способами, добре відомим в даній галузі з рівня техніки.
Під час усіх хроматографічних процедур наявність імунореактивного рекомбінантного ПСО підтверджували за допомогою ЕГІЗА (ОКО ЕїА 1469) та ІЕЕ (Приклад 5).
Приклад 7 - Вміст сіалової кислоти
Сіалову кислоту представляє собою протеїн-зв'язаний вуглевод, який, як вважається, є моносахаридом та зустрічається в комбінації з іншими моносахаридами, такими як галактоза, маноза, глюкозамін, галактозамін та фукоза. Загальну сіалову кислоту на очищеному пСОо відповідно до винаходу вимірювали з використанням способу на основі способу Запіоп еї. аї. (9. Віоспет. Віорпу5. Меїпоав5. 30 (1995), 37 - 48).
Вимірювали загальний вміст сіалової кислоти у зразках Рег.Сб рекомбінантного ПСО, модифікованого а2,3- сіалілтрансферазою (отриманого з використанням способів з прикладу 4 та 6), та результати представлені в таблиці 1 нижче Івиражені у вигляді співвідношення молей сіалової кислоти до молей протеїну).
Приклад 8 - Біоаналіз ПСО відповідно до ОР
Біоаналіз ПСО проводили для того, щоб визначити специфічну активність ПСО для кожного із зразків, наведених в таблиці 1 нижче. Активність вимірювали відповідно до ОР (О5Р
Моподгарнв: Спопопіс Сюопадоїгоріп, ОБРО Опісіа! 8/1/09-11/30/09), з використанням ОміїгеПе як стандарта. ОмійїгеПе має біологічну активність 26 000 МоО/мг (Сцт Мей Ке5 Оріп. 2005 Оес; 21(12): 1969 - 76). Допустима межа становила » 21 000 МО пСос/мг. Біологічна активність для зразків рекомбінантних ПСО, продукованих людською клітинною лінією ПСО, сконструйованих з а2,3- сіалілтрансферазою показані в таблиці 1.
Таблиця 1 11111111 Зразок | 1 1 2 | 3 | 4 | 5 | 6
Вміст сіалової кислоти (5А) до Ефективності
Зразок///////7777777777111717171177 11180119 | 70 | "п
Вміст сіалової кислоти (5А) самольслнюльоо 119 з з
Таблиця 1 (продовження) 11111111 Зразок | 1 112 | 3 | 4 | 5 | 6
Ефективність МО/мг 0 27227 | 26142 | 26539 | 26181 | 24230 до Ефективності батвіеоворюмом) 0017 | 006 | а | вва
Як видно вище, ефективність є подібною, та може бути більшою, ніж ОміїгейПе (дивіться, наприклад, зразок 7).
Використовувана література:
Апаетзеп СУ, М/езієгоаага І С, апа мап У/еІу М. (2004). ЕЗН ізоїопт сотрозйоп ої соттегсіаї допадоїгорніп ргерагаїййопе: а педієсієд азресі? Вергод Віотеєа Опіїпе. 9(2), 231-236.
Ваззей ВМ, апа Огіерегдеп В. (2005). Сопіїпиєйд ітргометепів іп їйе диаїйу апа сопвівієпсу ої тоППгоріп ага, гесотбріпапі питап ЕН. Нергоа Віотеа Опіїпе. 10(2), 169-177. р'Аптогпіо М., Во!теїїї Е., Оайіа А., Виссі В., Мазсіа М., РоІПена Р., Різсіїеїїї О., апа Рароїап В. (1999) Віоіодіса! спагасієгігайноп ої гесотбріпапі питап оїїсіе війтиацпд погтопе ізоїопт5. Нитап
Вергодисійп 14, 1160-1167.
Надев, 9. б. апа Сосадтап, Н. М. (1979) Івоїайіоп, сіопіпа апа зедиепсе апаїувзів ої Ше сОМА
Тог пе аірпа-зирипії ої пПитап спогіопіс допадоїгоріп. Маїшиге, 281, 351-356.
Ніадев, У. б. апа Соодтап, Н. М. (1980) Тне сОМА ог Ше реїа-зибипії ої питап спогіопіс допадоїгоріп зиддевів емоїшіоп ої а депе Бу геадіпгочой іпіо (Ше 3'-ипігапвіаїей гедіоп. Маїшге, 286, 684-387.
Кадамжа У, ТаКазакі 5, Шівиті У, Нової К, 5Ппітіг2и Н, Коспіре М, апа Кобраїа А. (1988).
Сотрагаїйме 5ішау ої Те азрагадіпе-ІїпйКей зидаг спаінв ої пашта! Нитап іпіепегоп-реїа 1 апа гесотбріпапі питап іпіепегоп-бейа 1 роодисед Бу ійгее аійегепі таттаїйап сеїІв. ) Віо!ї Снет. 263(33), 17508-17515.
Гомту ОН, Возебгоцдпи МУ, Раїт АГ, Вапааї! Ну. (1951) Ргоївїп теазигтетепі м/йй Ше РЕоїїйп рпепої геадепі. У Віої Спет. 193(1), 265-75. ому, РУ, Мсі вап, С, допе5 ВІ апа Заїдипазіпдат М. (1976) Рипісайоп ої апієтіог рішнагу апа пуроїнаіатіс поптопез Сіїп Раїної Зиррі (Ав5ос Сіїп Раїпої). 7, 16-21.
Воуїе І, Вадсійе СМ, ЮОжек ВА апа Нида РМ (2006) Меїподв іп МоїІесшаг Віоіоду, ей
ВгосКпайзеп-5Зеспиї2басі (Нитапа Ргезвз), 347: СПІусобіоіоаду ргоїосоїв, 125-144.
Зіеєїтап 51, апа Ропієу ЕМ. (1953) Авзау ої Ше поїЇїсіє війтшайпуд погптопе Бразей оп Ше апдтепіайоп мїй питап спогіопіс допадоїоріп. Епдостіпоіоду. 53(6), 604-616.
Зуеп55оп ЕС, бБогеднап В, апа Рацівоп 90. (1990) Огдапігайноп ої Те реїа-даїасіозіде аірна 2,6-5іаізунгапвтегазе депе. Емідепсе ог Ше апзсгірійопа! гедшайноп ої їегтіпа! діусозуїайоп. У Віої
Спет. 265(34):20863-20868.
ТаКеиспі М, ТаКазакі 5, Міуагакі Н, Ка Т, Новпі 5, Коспіре М, апіа Кораїа А (1988).
Сотрагаїме зішау ої Те азрагадіпе-ІпКей зидаг спаінв ої питап егуїпгороїівїйп5 ригіівй їот игіпе апа Ше сийиге теаїшт ої гесотбріпапі Спіпезе Натвзівг омагу сеїІв. У Віої Спет. 263(8), 3657-3663.
ШПоа-Адціте А, Міддієу АВ г, Вейіп5 ІЛ, апа Радтапарнап М. (1995). РоПсіІе-5ітиіайтпта івопогтопев: сПпагасівгігайоп апа рпузіоіодіса! геіємапсе. Епдостг Нем.16(6), 765-787.
ШПоа-Адиіте А, Тітовві С, Вагтіоз-де-Тотаві /), Маідопадо А, апа Мауцаи Р. (2003). Ітрасі ої сатбопуагаїе Пеїегодепейу іп їшпсйоп ої тоїЇІсІє-вітшиіайпд погтопе: зіцаїе5 дегімей їот іп міто апа іп мімо тодвеї!5. Віо! Нергоад. 69(2), 379-389.
МЕВЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«ВМ» о ватггіпйу БАаговкентісві А/5 «АЙ» ЕКЗ ОТРИМАННЯ ГОНАДОТРОПІНУ «АЗОВ ж ха» 35154955, 4 «Ї5їх 8щі5-0а-24 «Ох 15 «1705 Раб тІїв» Уго 5.5 «Ох ії «гїїх 349 «вії» ДНК й «213» нове взрівпе «НН» 1 - зтоистесї ассозавутв сессЗссвіє сс ссстоювиех ЗссКас що зе тесаса еасскстоа смоасаЯзає гакссссяЗаю Зсассстоса заввасске їв кит своасс аасстоюсає ссстаєстя саатосакує зстасеекх се іо такссссаскос ссстосозво свзадавазсс атостузкУє заааанасої оБссовосово ав ацсасскаст ссутпоссва заостзсаве сф вассю завіс стінок З ззвокассяєв ссзсктоссВ стос Сустаскасть аква 34 «АВМ» 2 «вії» 98 «афев ДНК «13» Мою зарієнх «НН З Й відзнаку є фосавуочех каста ття стЯастстов зсатозасЗа засаходяса 5 хсгавоЗадс ссстсвкне асозоссве скжатсватє совок пет Ка засзастасс ссезвтесає свссотсявс ассассвВіст зоссоВОств сг 180 зцвнссЗсо хастасаово пост якос заз сазсомеє 240 дасутасоєх ссозакссак «соЗстскї спустЗсссЯє зсовсякуав секс щмюЮ зсствсассо тозрстстсвВо сів тсватЯї дсассстуєє десвосал састаВекУЄ зво ши ссса зодвссвссс скттаєстат Захуассссє Зсктссаува стестсттес 420 їсаазвосскс сессссссвао ссжКтссВМух кевжеесвВає ісссооачке сеєВеВсе Зо ксчвжсетсс сасзатва В «ах «ках а «гії» ДК «Х13» неще зарієп5 «МН Щ акотятссто сзуастЧаза ясксстоакс сао стс соска стса ток 5 тастаттсєв ссткссодаЗ мнвевозувсе ассовасЕх СЕКС ск ситсссВа Кі: стврінка З азаавосазс сетекстсса ЗозЕодоарса озоазосавов сссстааваст стоазкаде ї50 їз сюе зісвосссаЕ стсстаса стран ат екс нКИ саваасвссв 258 тстастЕасЗ вествссста щннвисаваа зЗоааЗсваз) атсуекссі ссоцоекосВ. 30 есавісясся остсстссВ сессаааває ікла сво ссо сова ка зо
ЧссосЗаоЗа зспрвсассв зстасооаве совет заоятоссві свасавотає 425 знацямсз ав кеаза сватексссз Фкзоастоост зковосутаЗ «птЗЧостеє «ко замассвесвз ткож Кк стассктоавЗ ес есаст сов сссаз адсвазаає Бе заксссвоуйсвз сзветскжсяк сетодтааск стсааоЗсва фоЗзвектссВ стозаїтово ОО нседауксстоаз чзаїниюва зсодакосов ззазакгес: поввасвясс тЕссеКеВе ЩО тато сса зісствався ззжЕсУЗатЕ стсааскеек косттсаїоаа зт тт
Засззвастяє товзасстаєс азтосизеяв ссвоозаса ксвзасвах всскассвсо ТВО есккстсоав ссвісакась засескссас сескетоаст соскоасВвоаЕ соску Б зЗоастасксво асусстзсав сазоавосяв ассаттсасї всівтавоаса затсасцскс 00 задтссвіса соч сезча ссзсавтекс ссссазовов ссстзассах тазасяата зо стоадвава давоствесаз зазсстсвсв сКстстоа З «2305 4 хаїіїн У «Ф231й» ДНК й «ії» Нощо 5арівепЕ «ню» 4 щесЕстТозса меодсто ссссовосЯє ассстосачо аааасссоте сттсдосеа БО «ЕтЗасвккК ствісскеасв зесаек тест ксв ас ев соска 125 «ЗносазЗєв візаавесах естостосяо аававсоков ссзосаВАв сан коЄ ї1х0 псдоссзаоа естасазссо соптзассоко зіоОсЧсЗасх їсзаоазснев завсовоевся 243 цсстоассвакї возоасвссто ствствессас зво 277 «се 5 каіїх «35» ДЯК й «ії» моло зарівпх кн 5 заст астї асвзазантв вуса аск Ктсстосз сао ак стоса 5 зкхстссакї ссостсесква сукосвооаЕ тосссзаяве ссасоскасв «фам есв 133 тхесжЕстссс ажсоЗкис сссавтівсте сзетясато3 стос сіктаВаОсВ 15а каїсоссстк светазочіє сзазазоайк асан ес азс света я хскасіасЕ Ффівтаастза ассжатавс зуоаісасв засо гіксазаоа ю спзодассаса сесакоаска сстесзотаєкЕ тоЕївстаїс всаавксківа й ЗМ «30» б «21іїхм 316 сторінка є
«ал» ВВ й «13 Ной зарієнх «Нюх 5
Мет Ажро тує Туг АгЯ Куй тТуг АТя АТ тів КВе рем ма! ТАР рем Заг ї х 10 15
Уві вів іже ні Уаї вфецз ніх 5еє Аа ре» Ахроуа! бів Ар осСуз Рга 20 73 30 сЗіц Суб тнгоїан бій 515 АВ РРО РВе РМе пег піп Рко сіу АТ ко 35 40 45 її ем бій Сув має бі Суб Суз ЕНж ек Ага Аїд Туг Ве ТВкОРгО 5а 55 БО іван Ага его Був Му ТВг Мет ей ха) Бій вух Ап УЖЕ Те Заб 1
В "З хо вав отвке осСує Сря ма) Аїд фу Вер Тук Ап Аг Ууді їй уві век фіу 85 0 З5
ФІу бе дух Уді сіб Аза НІВ ТВКОАїа Суз нів Суб Бег ТвгоСу5 Туг іо 105 У
Ту? Ні5 дух кг «ай «21їз 1855 «іду ВАТ «3» нот зарівна «Оз мет біб Меж Ре сів сбіу їв їеч цем огец івн ве оїємн 5вг ом бу 3 5 13 15
Оу ТВ ТР АЇїа бегобух бій во рвц Ага го Агу Су Ага вга їі хо 25 30 даподія тТВгогев Аа Уві 616 вуз бів 0іу Суб Рко Уа! Суб їі ТВ ке я 45 маї дей ТвВе о тве жів сСуз ліз біу Туг Суб вго ТВгоМмет ТР Ага ма! за 55 БО ем Фів біу уві се Бго Аїд ва бго Вів Узі Узі Суз Ах Тук ага 5 та 75 ва
Ав Уві Ага РБеа біз Бег Ті Агеовац го б5іу Суз вто Ага Біу уд а 35 ав РКО Уві хар Заг ту лій Уді із це фак оСу5 БІВ Суб Аа ву сторіниз З
155 ще» ла
СУБ АгО Аго аб ТВгОТвгоаАхр о Сух Ру біу Рго Буй двронів Рга їв 120 125
ТвгоСух АБ АБроРгО АгО Ре сій АБО беє хек баг бег цух Аа Рго їх 15 140
Бго РгОо Же ве го Хек обго хаб Ага це) обго сіу вро баг о АЗр ОТАК 145 ї30 155 150
Рго їі бео его Бій 165 «М» їх «гії» 332 хафк» ВК й «233 моло врутень еНюЮ»
Мет сСух Бго ліз біу ТРробуз ес гео Аїд Мет фен Мід ів зі ви ї 5 18 Іще
Уві Уаї Меї Уа! Тор о тТуг бег Хі бег де бій ачр Аг тує Кі Ти «0 25 ІН
Мви Рве тут вне РгОо жіє рРго бій бух ух біб рго Сух Ме біп О1у 15 40 45 бів Аа Бі аг Су АТа баг озух грец Ре сі деп тТуг бог Аг АЗО м 55 що піп Бго ї1і8 РБРве ів аго іез бів в5р тує Бе тт оуді вух ТВг орг 7а 75 8
Заг аіз туг бів ви о Вгео тут Біу тТвгору5 бБіу Мак щі ЕВ Бец оре 85 з ях їец ака жа! мем Аїа хів тб оЗеб Зак Зак же Бго бу ява Ї16 Ф1п 300 105 о аг сем аг сСух Аг Ага сСуз Уві уві уві біу аАва Біу Ні Аг ве 15 150 їх
АгО Ашп Зегкояак оре Фіу аз Аз їіе дай оїуз тує АорохВі зві її о 135 130 де іч Аа АБа Аїа рго уаф АЇЗ сбіу туго бів Ф1у дярома! Ту ет 155 150 155 150
Зїуз ТВК о ТвРОМеЖ Ага сви рве тує вге бін бек дів ніж вне Ахр ого 365 170 175 сторінка З
Муз уві біз Ай А5лоРго Авр о тТВго во цев о уві ве) Узі Аїа РВе губ 150 ї55 19)
Аїд меж дер вва ніх тер оїіє бін тТВгожіє ем обеє АБр вух фу гу 3155 200 205
УЗі Ага був О1У Ре ТРВ Буб ШІ го Рго ве ІТ ТїбБроаАхо УДі д5п 23 із зо
Вгао був іп Тіз дга Зі Бей Ап вго вве бе о мег біц Ї1а АХ АЇА и 230 235 40
АжВ ух іо бен бек ін Рго Меї сів бів Рго Ага уз Хв вух бій 245 250 5
Муз Рго ТВе ТВгодіу ев гео АТ ТТ ТВгобеео АЇВ бе нів мех суз о ж ат варів уУдІ Ні їі АВ БІ БИБ 5іу тТуг КРО АЯВ АЇВ Туг АФА вКуУФ 275 250 285 зуб сів твВе жів нів туго туго ої бів їі ТВР обер уз баг мех а18 290 295 зо діу бег йіу міх Ай ма) 5Зег бій бїн дід вен аїа Ї1е вуз аг МЕ 3За5 з 315 ЗО ів бів Меє Біу діа 116 Бу5 АВ би ТМг Бак вне 325 330 «Шо «ії» 9 «231йх РЕТ х»ії» нещео зарієпь «00 З ід вко Ар охаї бій ав сухо вк біз бух ТВГоівц біб біб ава его 3 5 13 15
Ріе РМе его сій рРго бі АЇВ рРго їі рен бій Суз Меж біу Сух Сух 20 25 а ве Звг Ага Аїа тує вк тТВговгРО без Аго Зек губ їу5 Тр омМеї зен 35 40 їх зві вія Ку Аза УВІ ТБгоБеє бін Бек ТВк оСув Куз Уві АЇВ фу бер а тут Ап Аг УДі ТАгомаі? Меї біу біу ве бух ма) сім Аеп мі ТВг 55 7о 75 во
АВ Су5 ні Суз Заг ТВг су» Тук Тугк НІВ Муз бБег сторінка 5
85 ЗО «ЕМ 10 «іх 16 «Вії» вЕТ хи33» можОо Зздвіввх «НО» 38 мит АВ о Туг тТуг Аг фу Туг а13 Аа їфе Бе ве Уа! ТВ рен бе ї З 10 У
УВІ вве бец нія уді зе Ні бек АЇа Рго АБО УЗ Бі АВ Су РТО га 25 за сів Суб Тк оєви бів біс а5п бго Бе вне 5еб Бій вго Фіу Аїа вго 35 40 45 їі ев бів Сує меж сїу Суз Сух РіБ бек Ага ів тТук рко твкорго 0 55 БО
ШЕИ Аго бег бух ух ТВг о Ме це) Уді Зів уз ахп УВІ ТВгоБек бід 55 7 75 ха «Б о ЇВг Су бух ді А1ї8 їу5 зве Тук два ака ха о тве ов) меї Ту 85 ЗО 955
Фіу Бе ух уді Ф3іц Аа ні тТвг оАіа Су Нія Сух 5ег ТНК сСузх Тут 100 135 мо тує мі5 рух баг «а» ІЗ «МІХ 37 «12» ДНК й «8313» Мох чарієпь «Нюх 1 ссвопвтссо севссвкака сстакасає созавоє 37 «ВМ» 15 «їх 5 «аЗЕ» ДНК й «13» мой чарієпе «МН» 15
ЖЕСТ звоїсзаовзо ЗасесоазиаЕ СК 15 сторінка 5
Claims (8)
1. Полінуклеотидна послідовність, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка відповідає ЗБО ІЮ МО: 1, або яка містить послідовність нуклеїнової кислоти з щонайменше 97 905 ідентичністю послідовності з нуклеїновою кислотою з 5ЕО ІЮ МО: 1.
2. Полінуклеотидна послідовність, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка відповідає ЗБЕО ІЮ МО: 4, або яка містить послідовність нуклеїнової кислоти з щонайменше 97 905 ідентичністю послідовності з нуклеїновою кислотою з 5ЕО ІО МО: 4.
3. Клітина, яка характеризується тим, що вона містить інтегровану в свій геном послідовність, яка є кодуючою для «а ланцюга ПСО, вибрану з: послідовності, яка відповідає 5ЕО ІЮО МО: 1; послідовності, яка має щонайменше 96,5 95 гомологічність з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 1; послідовності, яка має щонайменше 97 95 гомологічність з послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 1; послідовності, яка відповідає ЗЕО ІО МО: 4; послідовності, яка має щонайменше 96,5 95 гомологічність з послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 4; та послідовності, яка має щонайменше 97 90 гомологічність з послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 4.
4. Клітина за п. 3, яка являє собою клітину РЕК.СбФ).
5. Клітина за будь-яким одним з пп. З або 4, яка характеризується тим, що вона додатково містить інтегровану в свій геном кКДНК, яка кодує альфа-2,3-сіалілтрансферазу.
6. Клітина за будь-яким одним з пп. 3-5, яка характеризується тим, що вона додатково містить інтегровану в свій геном послідовність нуклеїнової кислоти, яка є кодуючою для ВД ланцюга ПСО.
7. Спосіб отримання рекомбінантного протеїну в клітині, який включає культивування клітини за будь-яким одним з пп. 3-6 в прийнятному середовищі та збір рекомбінантного протеїну із зазначеної клітини та/або зазначеного середовища.
8. Спосіб за п. 7, в якому рекомбінантний протеїн являє собою рекомбінантний ПСО.
Фу. Спугимізований альфа ВО: ТНПУ АСТАСО ВАТА ОО МАТИ КК ПК ОКИС ха лАВаКИ і М А я ; Ж ЗВКЦЯ ЯВндід птмтнтттмотттнответотне ки В Я и ВИК о ВЕ ЗИ ЕН МДЕ З А МАО ЗИ МИСЯМИ СК СБ ЗВО ОЙ ЗИ М ВИ МИ СМ ЕЛ З А ЗМК НИ КОВИХ МЕ е Яще Я М а ШЕ З В ВЕ се ОЕМ М В З м а ЗИ М и з З КУ МЕ ОД В НЕ: УХИКЕУ СМ В Ж ОКА а КИ ВЕ КИ ТК В Валова Са КОТУ ТОопапилаВаЦа ВИХ ох ДС М З ЗИ ИН В А А СОВИ Во В ЗВ ВЛ ВИ ВИ ЗИОНИ ЗН ОИН ОИСПНОННИ А СМ ВИ М НО НИ р м з о в р і м м и п и п п п пк р я і п і о п п и кя Ос кое іо ка Во оф В З ка кову о вів сф м ОВ фо и в онов в ув ее пеки фе есюи й те юю и ет екв рт кеатьнь жених ік кни ф ник екю тиви е феєю ееютеькоюе спін ооо ото КУТ; УЖ КУМХУКУ пелетні тінц тт няння птн ттінтінтіікнти їй чо Ди: ще МИС ДИ М що МЕ о лк ЗД МД В ЗО В НИ У т В І ЗК З З УА ПИ В а М З УА ЗІ пом о с А а п В ВО НИ АВ сао во: вва о ЗО ВВ ОС а зв вав осв а ооо и пи пово Сх ЗБЕ МЕ ЗІ Е М У КВ ЗЕ З С ВЕ З: В В В о ик З: ЗВО ВЕ З о М: ЗЕ Но ВО ЗК ЗЕ ДН В ЗО А ВХ МУ
Фіг. 2: Немутантного типа бета ланцює «ува оккпсао пуску сепсису сля аскк це всска дива рад сскопти вип жк в ви я В вжи ль ВІВ МК во Кл Поети З й новій я какая ок ас ак ісія зе в нсвя Ма живсь квК й ОК СНИ ЗД ве ЗМИВ ЯН С В С Я З ВА З НН НИ НА НЕ ЗИ САНИ же ше з З с ЗИ З З ЗВ З ВК З Я - З КЗ я ЗШ СОМ З ЗМ З В З З З М СВ З ЗХ З ЗВ СП В ЗІ а МК З МКК Я ща пи ко ек цх. духами сухе уєсюкиу Мчіцкжексвикуромихжеесмихо еВ: косою асй дечсессвсек мода зечсікурхаоу веуеефант фан нн ек фах фак жанру вужа фе кафе а анн у фек фен уанівиее еи ення. ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕН А ЕЕ А ЕЕ А КЕ КЕ ЕЕ А А ЕЕ А ву ф р з зе п он ЗА ЗНО ВИ ІН ВИК НИ МА В Я ВИНЕН А В ВК В ОДЕ ЕСВ Е Я т ї ї с т У З 7 З х Е ї х У т із т тя З 5 Зх Є КО З» ЯЗ Я: дя 43х За «5 85 3 Ж ЕВ 54 бот 5 ле З Б ХУ ОЗ БО Ж я В о 5 ччпскузсотцюхаросисозч ач созскасисавичсчсавусопаЗессайсоева сист ссичсоопискпавахо мус нн а а В о м и п а хх 3 8 Ах її Кк в хм с хх В У Кк ЕЕ Б Хі У п а З НН; ВА ЗНА Я САНЯ о пом пав анн дині ин зом мон пах пово звшо в томи мк лай Хо пай в в Чиста хи види: ав» св ик лиш ну па жов домо п, зав МОЖ НО ж Хю б 75 75 79 5 7 ОО ЗК 5 85 що 35 З З? 85 а ЗІ ЗХ 85 жо 85 53 8 55 88 ща кспхвсчссиодсисезадсспісавсцпі вивих пусадев чевспшеасі ноут снадикаститсскіу ником. пов рено веж фор ж еф м мк кт рр чт фа ДЕК т т тв кот в фс фур фо т В Ку фе дюн кн ур укиюх нн о и ото
В х. ЗК І МЕ ж Дн Ай В в МН НИ НИ НО ЬЯ х со мВ. мно пн зни зн жит пн: зн зано зи и нн з ЗК Зно ин вин зи зими: зни ин зи зим о Умов Филй : зн: занно н зни нн зинн зн І Заї с3 що МЕ За; МА ще аа ЗР ЗХ зЗ15 344 315 ЗК ІХ 38 З1Б ІЩ5 Ж ЗХА ха За зяб З ЗХ; Ж ЗАВ ЗВО дл БЖ ЗА чЧабесказужсяпивискесосакациорссксосайлвосии ока косе засвсосцацатеписоуфапа сина ес асо ее ц висежкннекинивовникииайикюсвакююважинавжк вий нови нютииювєькики вики ав ниви нене юєтожикея Тов р іх ово ЗІ З З ДИНА ЗИ ЯН з АН К СЗДВНЕ ЗНИЗИВСЯ вами мама иа зм мимо ом злимов вм: го Мам: за змиє зе За: Золе момох Хи ЗВЕ З У т |З т т і ї Н у с і т т Ж Ж В їх) їЗА ЗХ с) АЖ 12 ЗЯ5 134 Б 2155 ХРО За та 301 ХО ЗВ Ж 8 8 БІ Б ОСУВ ЗВ ЗИ ЗВ 33 ке ЗБК ах
Фу. 3: Нуклеїнова кислота та похідні амінокислотні послідовності ЗІЗОАІ Я. зпсодсусчкхуюхотокукоккихо оскар сток соми сокностуи сс уд воувск увести сао зикаєких ЩЕ сх МОМ М М М М М М М М М ЗЕНИК УНН АН ЗИа ЕоВВ й КЕ К ІВ ОВ АН ЗНИК ЗОООЕ ВЕ ЗВ, З ЗМ ЕЗЇ ми и І и з п З З а и ЕХ ЯМ З с М З С М СВК с хе сиссстудетувокудек ие аситеккумКиктсопасисте ваша е юку псмоюкавкихдоуускодкуоакавуниоскощкихогккодкхосхионхуя З ваз не І ЗИ Вик З о ЗМ З ЗІ С с У В З ЗЕ С МЕ С ча М КМ М З ІК СХ З В В ЗВ З З М М С З ВЕ с ХА ВЕ ЗМ КК зиххоупаовкискнновнодох кома уосихвсх ув аи кох у окис ен и Доу вецжаклсвекиоючнк ие пийссссссоокхоокноссвкоивох ЗБЕ А и пляж дянкй СУДЕН ЗИ НЕ ЖИ ЗА Не я ЗАМКУ СНИК ЗМ ЯНИЗ ЗІЄ Е ПИВЕВ ЗЕЕВВ ЗИ ЗАМ ЧА ЗО ІК ВЕ ЗВО ЗВО Ан с лини нон м зн Пн но М нн он нн ки ни ню ни оно и нн нн ми нон і и но зе М М М М С М М З СТ В В М В: М З З ВЕ ХЕ М З З В М МО М В В В А М М М С В А ОКУ Зрнрвсюиссекссксеоикоюексскувпссезяоаапошепоксихусадисди свв апцоокипеорстдкуокхооиков довела ссотккоокхатихужевкадем ЗА ВЕ ОМ ММ М а ЗИМИ ЛИ ЗМ У он СЗВНОС ЗВО З: З ЗВ З З М ЗД ЗД ВД ВК ЗЕ ЗВ НИ ЗНЗ КА НКУ МВ а хз» В Ве о В З ВЕ В МО М І Ма В М В ОМ о В ЕК В С В В В В С во ВО В СВ В М ВВ В С З МОВ чкисеваттедаектнатупнокиМосхховхоохкхоаВикаиксгоцосикоухсокиКо самих ли трсспааі сиди АК пдосллсскдспувскасквссск их ВО ОКО охо, ТЕЖ оо пп По хо Ж мому мух ох МО УМО хх МОМ ЩІ (МОХ ХО МИ Мф осв хо хо 5 хе Мох їм смс ж 0 У хо їх Ма хо оки МІ М хиФбскпстелусипіфававс:кутсввдсвек Вонг ииив им удав мг Мхую цими. и я хх хх ксеюкиаи беликіхквети жує же. ши во І М В а В НО Ва В ВЕ В С В В В В п ВЕ с В М С о а В Мо КЕ В КО Мо ЕС ВВ о о Ов М ВО хасспузнасхжчассподкикоксавикоохкскихойкооккуси цу икІднихохксопсадп пасток хоокуКОВХХд ств виході вВи ЩЕ СУД В ЗД ІК А ДО НЕ ЗВ ЗИ Не З А ЗМО ВЕ ЗИ А ЗЕ ЗИ ЗОВ ВВ ВАВ А ЗЕ А ОВО ВОЯ дотик нн ан заново ж УВА НА Са До З КИНАСК р оно з Ка прасок ЕК Хв пра пн зв вв а о кв оо вв ло мн морси Мого дЖж ди ох охо Моск ок о дм ме дк МО шк ХО СМ В ОХе їх М) ХО ж МЕ МХ де хо МО 03 до М) схо сх де їх хх 5 3 (ФО 5х Хі Фдесмеккщеудтасествюсисенуо клон сисних ушок носно са хо повихави аск их спек висьв их сих «укрскпасммиоеажикоки КУ ООН ЗК ОО Ко о КК АК Ко КК Ко о КОКО НН ОК В ІД В КЕ ЗД КО З І ПО ЗК ІА А ПО НКУ В ОКО В В В ШЕ паро зи и м м В и и и и ВК о М и А ВИ В А и оптукаемядсетквомуємхсснво хе тсд риси дицаокхосих ак ккасхвсскхнокуволимсвлдісокІ ск секмопкуожкакспсьикитя висо до ЕЕ п и вок В В в в п В ПТС щ-щ-- шо БМ ом ха ха хо хм ЗМО МУ хо пом Ух І ЗМ Ме ЖМ ОМ МУ хх сх жк У 2 М до мому Ж Й
Фігура 4. Вектор експресії рис пса сви М й ді й й БЕ вів су й З ше ВЕ ши с Зрртзмю зі рисбаю Ів Ктв їі Ко і; бояр) зиму ї х. в с я са сну Ге Н х ВСН рід х псов Фігура 5. Вектор експрасії ває, З-сівлійтознеферази (ЗТЗАЯ) У ШИ нн Й ка чь. "а "о зву І рез й ЧР абнва є ялввв й що
"З. ча зві вно в М й й ни у.
Фіг. 5 Ії с . ойбевно / | сетвівованнй сла Й в й Що
Фіг. У
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15164965 | 2015-04-24 | ||
| PCT/EP2016/059006 WO2016170113A1 (en) | 2015-04-24 | 2016-04-22 | Method of production of gonadotrophin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA124187C2 true UA124187C2 (uk) | 2021-08-04 |
Family
ID=53002568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201711487A UA124187C2 (uk) | 2015-04-24 | 2016-04-22 | Спосіб отримання гонадотропіну |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10464984B2 (uk) |
| EP (1) | EP3286209B1 (uk) |
| JP (1) | JP6964519B2 (uk) |
| KR (1) | KR102658666B1 (uk) |
| CN (2) | CN114107315A (uk) |
| AU (1) | AU2016251314B2 (uk) |
| BR (1) | BR112017016895A2 (uk) |
| CA (1) | CA2975449A1 (uk) |
| CL (1) | CL2017002661A1 (uk) |
| CO (1) | CO2017011964A2 (uk) |
| DK (1) | DK3286209T3 (uk) |
| EA (1) | EA034022B1 (uk) |
| ES (1) | ES2837111T3 (uk) |
| HK (1) | HK1246325A1 (uk) |
| HR (1) | HRP20201945T1 (uk) |
| HU (1) | HUE051879T2 (uk) |
| IL (1) | IL253694B (uk) |
| LT (1) | LT3286209T (uk) |
| MA (1) | MA41949B1 (uk) |
| MD (1) | MD3286209T2 (uk) |
| MX (1) | MX2017010884A (uk) |
| MY (1) | MY185823A (uk) |
| PH (1) | PH12017501585A1 (uk) |
| PT (1) | PT3286209T (uk) |
| RS (1) | RS61163B1 (uk) |
| SA (1) | SA517390029B1 (uk) |
| SG (1) | SG11201706832PA (uk) |
| SI (1) | SI3286209T1 (uk) |
| TN (1) | TN2017000328A1 (uk) |
| UA (1) | UA124187C2 (uk) |
| WO (1) | WO2016170113A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201707136B (uk) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112020003379A2 (pt) | 2017-09-01 | 2020-08-25 | Ferring B.V. | usos de hormônio folículo-estimulante recombinante (fsh) para estimulação ovariana controlada |
| CN108264549A (zh) * | 2018-03-29 | 2018-07-10 | 北京伟杰信生物科技有限公司 | 重组绒促性素rhCG的制备方法及应用 |
| TW201945024A (zh) | 2018-04-30 | 2019-12-01 | 荷蘭商菲林公司 | 用於經控制之卵巢刺激的組成物 |
| CN110812366B (zh) * | 2019-11-18 | 2023-11-17 | 珠海丽凡达生物技术有限公司 | 一种可用于激素补充的mRNA药物及其制备方法 |
| CN113337562B (zh) * | 2021-05-24 | 2022-06-03 | 宁波人健药业集团股份有限公司 | 使用CHO细胞高效发酵生产rhCG的方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6855544B1 (en) | 1999-04-15 | 2005-02-15 | Crucell Holland B.V. | Recombinant protein production in a human cell |
| WO2001058493A1 (en) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Maxygen Aps | Conjugates of follicle stimulating hormones |
| US20030036181A1 (en) | 2000-06-30 | 2003-02-20 | Okkels Jens Sigurd | Peptide extended glycosylated polypeptides |
| CN1194016C (zh) * | 2000-12-29 | 2005-03-23 | 申庆祥 | 新的人绒毛膜***－促黄体素融合蛋白及其制法和用途 |
| CN101250531B (zh) * | 2006-11-27 | 2013-04-24 | 株式会社Lg生命科学 | 一核苷酸序列、包含该序列的表达载体、该载体转化的动物细胞及利用该细胞生产人fsh的方法 |
| TWI604850B (zh) | 2009-10-05 | 2017-11-11 | 菲瑞茵國際中心股份有限公司 | 藥學製劑 |
| US8326547B2 (en) * | 2009-10-07 | 2012-12-04 | Nanjingjinsirui Science & Technology Biology Corp. | Method of sequence optimization for improved recombinant protein expression using a particle swarm optimization algorithm |
| CA2784861A1 (en) * | 2009-12-21 | 2011-07-14 | Pharmathene, Inc. | Recombinant butyrylcholinesterases and truncates thereof |
| JP2015518705A (ja) * | 2012-04-02 | 2015-07-06 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． | ヒト疾患に関連する生物製剤およびタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド |
| DE18200782T1 (de) | 2012-04-02 | 2021-10-21 | Modernatx, Inc. | Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen |
| CN103539862B (zh) * | 2013-11-01 | 2015-04-01 | 广州联康生物科技有限公司 | 一种长效重组促卵泡激素及其应用 |
-
2016
- 2016-04-22 WO PCT/EP2016/059006 patent/WO2016170113A1/en active Application Filing
- 2016-04-22 KR KR1020177022423A patent/KR102658666B1/ko active IP Right Grant
- 2016-04-22 MX MX2017010884A patent/MX2017010884A/es unknown
- 2016-04-22 ES ES16721722T patent/ES2837111T3/es active Active
- 2016-04-22 MD MDE20180206T patent/MD3286209T2/ro unknown
- 2016-04-22 MY MYPI2017703981A patent/MY185823A/en unknown
- 2016-04-22 EA EA201791724A patent/EA034022B1/ru unknown
- 2016-04-22 PT PT167217223T patent/PT3286209T/pt unknown
- 2016-04-22 MA MA41949A patent/MA41949B1/fr unknown
- 2016-04-22 DK DK16721722.3T patent/DK3286209T3/da active
- 2016-04-22 BR BR112017016895A patent/BR112017016895A2/pt active Search and Examination
- 2016-04-22 UA UAA201711487A patent/UA124187C2/uk unknown
- 2016-04-22 US US15/566,961 patent/US10464984B2/en active Active
- 2016-04-22 JP JP2017555503A patent/JP6964519B2/ja active Active
- 2016-04-22 RS RS20201492A patent/RS61163B1/sr unknown
- 2016-04-22 AU AU2016251314A patent/AU2016251314B2/en active Active
- 2016-04-22 TN TNP/2017/000328A patent/TN2017000328A1/en unknown
- 2016-04-22 LT LTEP16721722.3T patent/LT3286209T/lt unknown
- 2016-04-22 CN CN202111399800.1A patent/CN114107315A/zh active Pending
- 2016-04-22 HU HUE16721722A patent/HUE051879T2/hu unknown
- 2016-04-22 EP EP16721722.3A patent/EP3286209B1/en active Active
- 2016-04-22 CA CA2975449A patent/CA2975449A1/en active Pending
- 2016-04-22 SI SI201631009T patent/SI3286209T1/sl unknown
- 2016-04-22 CN CN201680022637.8A patent/CN107532172A/zh active Pending
- 2016-04-22 SG SG11201706832PA patent/SG11201706832PA/en unknown
-
2017
- 2017-07-27 IL IL253694A patent/IL253694B/en unknown
- 2017-09-04 PH PH12017501585A patent/PH12017501585A1/en unknown
- 2017-09-26 SA SA517390029A patent/SA517390029B1/ar unknown
- 2017-10-19 CL CL2017002661A patent/CL2017002661A1/es unknown
- 2017-10-20 ZA ZA2017/07136A patent/ZA201707136B/en unknown
- 2017-11-24 CO CONC2017/0011964A patent/CO2017011964A2/es unknown
-
2018
- 2018-05-08 HK HK18105909.9A patent/HK1246325A1/zh unknown
-
2020
- 2020-12-04 HR HRP20201945TT patent/HRP20201945T1/hr unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2745557C1 (ru) | Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), включающий альфа-2,3- и альфа-2,6-сиалирование | |
| JP6718951B2 (ja) | 調節卵巣刺激のための組成物 | |
| UA124187C2 (uk) | Спосіб отримання гонадотропіну | |
| RU2588650C2 (ru) | Фармацевтический препарат, содержащий рекомбинантный хорионический гонадотропный гормон человека | |
| US11439686B2 (en) | Recombinant FSH composition for treatment of infertility | |
| WO2012168680A1 (en) | Pharmaceutical preparation comprising recombinant fsh | |
| TW201302783A (zh) | 藥學製備物 |