ES2837111T3 - Procedimiento de producción de gonadotropina - Google Patents
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Abstract
Una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 1; o una secuencia de ácido nucleico con al menos un 97% de identidad de secuencia con el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de producción de gonadotropina
La presente invención se refiere a gonadotropinas para su uso en el tratamiento de la infertilidad. En particular, se refiere a la gonadotropina coriónica humana (hCG).
Las gonadotropinas son un grupo de hormonas glicoproteicas heterodiméricas que regulan la función gonadal en hombres y mujeres. Incluyen la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona luteinizante (LH) y la gonadotropina coriónica (CG).
La gonadotropina coriónica humana (hCG) se secreta principalmente por la placenta humana durante el embarazo y contribuye al mantenimiento del cuerpo lúteo. La hCG comprende una subunidad alfa de 92 aminoácidos (cadena a), también común a las otras hormonas glicoproteicas LH y FSH, y una subunidad beta de 145 aminoácidos (cadena p) exclusiva de la hCG, que dicta la especificidad de la hormona. Cada subunidad se modifica postraduccionalmente mediante la adición de residuos de carbohidratos complejos. La subunidad alfa contiene 2 sitios de glicosilación ligados a N en los aminoácidos 52 y 78 y la subunidad beta contiene 2 sitios de glicosilación ligados a N en los aminoácidos 13 y 30 y cuatro sitios de glicosilación ligados a O en los aminoácidos 121, 127, 132 y 138.
La hCG extraída de la orina de mujeres embarazadas [Choragon (Ferring)] se ha utilizado durante muchos años en el tratamiento de la infertilidad. La producción de hCG extraída de la orina implica la recogida y el procesamiento de grandes cantidades de orina. También está disponible para su uso en el tratamiento de la infertilidad una versión recombinante de hCG, Ovitrelle (Serono). Este producto recombinante se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO) y tiene un perfil farmacocinético diferente al de la hCG producida a partir de orina humana.
Existe una heterogeneidad considerable asociada con las preparaciones de hCG que está relacionada con diferencias en las cantidades de diversas isoformas presentes. Las isoformas de hCG individuales muestran secuencias de aminoácidos idénticas pero difieren en la medida en la que se modifican postraduccionalmente; las isoformas particulares se caracterizan por la heterogeneidad de las estructuras de ramificación de carbohidratos y por diferentes cantidades de incorporación de ácido siálico (un azúcar terminal), pareciendo influir ambas en la bioactividad de la isoforma específica.
La glicosilación de productos de hCG recombinante (''rhCG'') refleja la gama de glicosiltransferasas presentes en la línea de células huésped. El producto de rhCG existente, Ovitrelle, se deriva de células de ovario de hámster chino (células CHO) genomanipuladas. El abanico de modificaciones de glicanos en rhCG derivada de CHO es más limitado que el que se encuentra en los productos naturales, derivados de la orina. Los ejemplos de la heterogeneidad de glicano reducida que se encuentra en la rhCG derivada de CHO incluyen una carencia de glucosamina de bisección y un contenido reducido de fucosilación del núcleo y extensiones de acetil lactosamina. Además, las células CHO solo pueden añadir ácido siálico utilizando el enlace a2,3 (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al., 1990).
La hCG urinaria humana (es decir, la hCG extraída de la orina de mujeres embarazadas) que se ha utilizado hasta la fecha en el tratamiento de la infertilidad es, de hecho, hCG placentaria; hCG producida en la placenta (humana) y posteriormente excretada en la orina. Esta hCG se extrae de la orina para su uso como producto farmacéutico. Bousfield et al. (Rev Endocr Metab Disord (2011) 12: 289-302) afirman que "mientras que las gonadotropinas hipofisaria poseen ácido siálico unido tanto en a2,3 como en a2,6, la hCG placentaria y las gonadotropinas recombinantes producidas en células de ovario de hámster chino poseen sólo ácido siálico unido en a2,3". Por lo tanto, la hCG urinaria humana (que se produce en la placenta) incluye sólo la sialilación en a2,3 (como los productos recombinantes derivados de la línea celular CHO). Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas conocidas que incluyen hCG incluyen sólo ácido siálico unido en a2,3, pero no incluyen ácido siálico unido en a2,6.
Se ha demostrado que una preparación de FSH recombinante (Organon) difiere en las cantidades de FSH con un punto isoeléctrico (pl) inferior a 4 (consideradas las isoformas ácidas) en comparación con la FSH hipofisaria, sérica o de orina posmenopáusica (Ulloa-Aguirre et al. 1995). La cantidad de isoformas ácidas en las preparaciones urinarias de FSH era muy superior en comparación con los productos recombinantes, Gonal-f (Serono) y Puregon (Organon) (Andersen et al. 2004). Esto debe reflejar un contenido molar inferior de ácido siálico en rFSH, dado que el contenido de glicano cargado negativamente modificado con sulfato es bajo en FSH. El contenido inferior de ácido siálico, en comparación con la FSH natural, es una característica de los dos productos de FSH disponibles comercialmente y, por lo tanto, debe reflejar una limitación en el proceso de fabricación (Bassett y Driebergen, 2005). La vida útil en circulación de la FSH se ha documentado para materiales de una diversidad de fuentes. Algunos de estos materiales se han fraccionado basándose en la carga molecular global, caracterizada por su pl, en la que más ácido equivale a una carga negativa superior. El principal contribuyente a la carga molecular general es el contenido siálico total de cada molécula de FSH. Por ejemplo, rFSH (Organon) tiene un contenido de ácido siálico de aproximadamente 8 mol/mol, mientras que la FSH derivada de orina tiene un contenido de ácido siálico superior (de Leeuw et al. 1996). Las tasas de aclaramiento plasmático correspondientes en ratas son de 0,34 y de 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre et al.
2003). En otro ejemplo en el que se dividió una muestra de FSH recombinante en fracciones de pl alto y pI bajo, la
potencia in vivo de la fracción de pl alto (contenido inferior de ácido siálico) se redujo y presentó una semivida en plasma más corta (D'Antonio et al. 1999). Los solicitantes han descubierto que, al igual que la FSH, el producto de hCG recombinante derivado de CHO conocido (por ejemplo, Ovitrelle) también tiene una cantidad más reducida de hCG con un punto isoeléctrico (pl) inferior a 4 (consideradas las isoformas ácidas) que la hCG urinaria, lo que también refleja un contenido de ácido siálico más reducido del producto rhCG conocido en comparación con la hCG urinaria.
Los solicitantes han desarrollado una hCG recombinante derivada de seres humanos (es decir, una hCG recombinante que se produce o se expresa en una línea celular humana, por ejemplo producida mediante genomanipulación de una línea celular humana) que tiene un perfil más ácido que el producto de rhCG derivado de la línea celular CHO, Ovitrelle, y que tiene un contenido superior de ácido siálico. Esta rhCG es el objeto de la solicitud de patente internacional N° PCT/GB2010/001854, publicado como documento WO 2011/042688. Se produjo hCG recombinante con una mezcla de ácido siálico unido tanto en a2,3 como en a2,6 genomanipulando una línea celular humana para que expresara tanto rhCG como a2,3-sialiltransferasa. El producto expresado es muy ácido, tiene un contenido de ácido siálico [expresado en términos de una relación de moles de ácido siálico con respecto a moles de proteína] de, por ejemplo, 19,1 mol/mol, y porta una mezcla de ácidos siálicos unidos tanto en a2,3 como en a2,6; estos últimos vienen proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena. La investigación de los solicitantes indica que el tipo de enlace de ácido siálico, a2,3 o a2,6, puede tener una influencia drástica sobre el aclaramiento biológico de hCG. Las líneas celulares humanas, a diferencia de las líneas celulares CHO, pueden expresar hCG recombinante con ácidos siálicos unidos por enlaces tanto a2,3 como a2,6.
La línea celular del documento WO 2011/042688 expresa hCG recombinante derivada de seres humanos. No obstante, la línea celular también expresa un nivel relativamente alto de la cadena p libre (subunidad beta libre) y se requirió purificación (para eliminar esta cadena p libre del producto de hCG).
Los solicitantes han desarrollado ahora una nueva línea celular que expresa tanto rhCG como a2,3-sialiltransferasa, y que produce rhCG con una cantidad reducida de cadena p libre, mejorando así el rendimiento y reduciendo el nivel de purificación del producto requerida (véase la figura 7).
Según la presente invención, se proporciona una célula (por ejemplo, una célula huésped) caracterizada porque comprende integrada en su genoma una secuencia (de ácido nucleico) que codifica la cadena a de hCG seleccionada de entre: una secuencia según la SEQ ID NO: 1; una secuencia que tiene al menos el 96,5% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 96,5% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 1); una secuencia que tiene al menos el 97% de homología con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de homología con) la secuencia de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 97% de identidad de secuencia con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con) la secuencia de SEQ ID NO: 1); una secuencia según la SEQ ID NO. 4; una secuencia que tiene al menos el 96,5% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 96,5% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 4); y una secuencia que tiene al menos el 97% de homología con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de homología con) la secuencia de la SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 97% de identidad de secuencia con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con) la secuencia de la SEQ ID NO: 4). Preferentemente, la secuencia (de ácido nucleico) que codifica la cadena a de hCG no es la secuencia que está registrada en el banco como AH007338 (es decir, preferentemente, la secuencia (de ácido nucleico) que codifica la cadena a de hCG no es la que se muestra en la SEQ ID NO: 5). La célula puede comprender además integrado en su genoma un ADNc que codifica una alfa-2,3-sialiltransferasa, por ejemplo, una secuencia según la SEQ ID NO: 3. La célula puede comprender además integrada en su genoma una secuencia (de ácido nucleico) que codifica la cadena p de hCG, por ejemplo la secuencia según la SEQ ID NO: 2.
La célula huésped puede ser, por ejemplo, una célula PER.C6®, una célula HT1080, una célula GT-5s, etc. Preferentemente, la célula es una célula PER.C6®.
Se apreciará que las expresiones "una secuencia que codifica la cadena a de hCG" o "una secuencia (de ácido nucleico) que codifica la cadena a de hCG" utilizadas en el presente documento también se refieren a una secuencia que codifica la cadena a de FSH (o una secuencia que codifica la cadena a de LH), porque la cadena a de hCG es la misma que la de FSH (y LH).
El término "secuencia de ácido nucleico" en el presente documento se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que codifica polipéptidos tales como péptidos, proteínas, etc. Estas moléculas de ácido nucleico pueden consistir en ADN, ARN o análogos de los mismos. Sin embargo, se prefieren las moléculas de ácido nucleico que consisten en ADN.
El experto en la técnica es claramente consciente de que la modificación de una secuencia de nucleótidos de partida describe el proceso de optimización con respecto al uso de codones. Los cambios introducidos se pueden identificar fácilmente comparando la secuencia modificada y la secuencia inicial. Además, ambas secuencias (es decir, la secuencia inicial y la secuencia optimizada) codificarán la misma secuencia de aminoácidos.
La secuencia de aminoácidos de la cadena a de hCG humana se divulga en el documento WO2011/042688 (denominada SEQ ID 1 en dicho documento), y es la descrita por Fiddes y Goodman, 1979. Está registrada en el banco como AH007388, y se muestra como SEQ ID NO: 5 a continuación. La secuencia de aminoácidos de la cadena p de hCG humana se representa en la SEQ ID NO: 2 y está registrada en el banco como NP_000728. Estas secuencias de aminoácidos corresponden a las secuencias de aminoácidos de tipo silvestre de las cadenas a y p de hCG humana. Los términos "secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre" o "secuencia de ácido nucleico inicial", para los fines de la presente invención, se refieren a una secuencia de ácido nucleico que está destinada a utilizarse para (sobre)expresión en una célula huésped y que no se ha adaptado al uso de codón en la célula huésped, pero que es la secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre real que codifica la proteína. El término "secuencia de ácido nucleico optimizada", para los fines de la presente invención, se refiere a una secuencia que se ha modificado para expresión en una célula huésped adaptando la secuencia de la secuencia de ácido nucleico no modificada/inicial. Una secuencia de ácido nucleico optimizada codifica una proteína que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la proteína codificada por la secuencia no modificada. Los solicitantes han desarrollado secuencias optimizadas que codifican la cadena a de hCG (véase, por ejemplo, las SEQ ID NO: 1 y 4, figura 1).
Según la presente invención, en un aspecto adicional, se proporciona una secuencia de polinucleótidos (por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena a de hCG) que comprende una secuencia seleccionada de una secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 1; una secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 4; una secuencia de ácido nucleico con al menos el 97% de identidad de secuencia con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con) el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1; y una secuencia de ácido nucleico con al menos el 97% de identidad de secuencia con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con) el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4.
Según la presente invención, en un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para producir hCG recombinante en una célula, que comprende cultivar la célula en un medio adecuado y recolectar la proteína recombinante (hCG) de dicha célula y/o de dicho medio (por ejemplo, recolectar el hCG recombinante del sobrenadante del cultivo celular), en el que la célula (célula huésped) comprende integrada en su genoma una secuencia (de ácido nucleico) que codifica la cadena a de hCG seleccionada de entre: una secuencia según la SEQ ID NO: 1; una secuencia que tiene al menos el 96,5% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 [por ejemplo una secuencia que tiene al menos el 97% de homología con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de homología con) la secuencia de la SEQ ID NO: 1]; una secuencia según la SEQ ID NO. 4; una secuencia que tiene al menos el 96,5% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 97% de homología con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de homología con) la secuencia de la SEQ ID NO: 4; y una secuencia que tiene al menos el 97% de identidad de secuencia con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con) la secuencia de la SEQ ID NO: 4. Preferentemente, la secuencia (de ácido nucleico) que codifica la cadena a de hCG no es la secuencia que está registrada en el banco como AH007338. La célula puede comprender además integrado en su genoma un ADNc que codifica una alfa-2,3-sialiltransferasa, por ejemplo una secuencia según la SEQ ID NO: 3. La célula puede comprenden además integrada en su genoma una secuencia (de ácido nucleico) que codifica la cadena p de hCG, por ejemplo la secuencia según la SEQ ID NO: 2. El procedimiento puede incluir una etapa o etapas adicionales de purificación de la hCG recombinante obtenida de dicha célula y/o dicho medio (por ejemplo, purificación de la hCG recombinante a partir del sobrenadante del cultivo celular).
La célula (huésped) puede ser, por ejemplo, una célula PER.C6®, una célula HT1080, una célula GT-5s, etc. Preferentemente, la célula es una célula PER.C6®.
La secuencia (de ácido nucleico) que codifica la cadena a de hCG puede seleccionarse de entre: una secuencia que tiene al menos el 97% de homologva con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de homologva con) la secuencia de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 97% de identidad de secuencia con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con) la secuencia de la SEQ ID NO: 1); una secuencia seg'i'n la SEQ ID NO. 4; una secuencia que tiene al menos el 90% de homologva con la secuencia de la SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 4); y una secuencia que tiene al menos el 97% de homologva con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de homologva con) la secuencia de SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 97% de identidad de secuencia con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con) la secuencia de la SEQ ID NO: 4). Preferentemente, la secuencia (de ácido nucleico) que codifica la cadena a de hCG no es la secuencia que está registrada en el banco como AH007338. La célula puede comprender además integrado en su genoma un ADNc que codifica una alfa-2,3-sialiltransferasa, por ejemplo una secuencia según la SEQ ID NO: 3. La célula puede comprender además integrada en su genoma una secuencia (de ácido nucleico) que codifica la cadena p de hCG, por ejemplo la secuencia según la SEQ ID NO: 2. El procedimiento puede incluir una etapa o etapas adicionales de purificación de la hCG recombinante obtenida de dicha célula y/o de dicho medio (por ejemplo, purificación de la hCG recombinante a partir del sobrenadante del cultivo celular).
El término "célula huésped", para los fines de la presente invención, se refiere a cualquier célula que se utiliza comúnmente para la expresión, es decir, la transcripción y la traducción de secuencias de ácido nucleico para la producción de, por ejemplo, polipéptidos. En particular, el término "célula huésped" u "organismo" se refiere a
procariotas, eucariotas inferiores, plantas, células de insectos o sistemas de cultivo de células de mamíferos. Preferentemente, la célula huésped es una célula de mamífero, de forma más preferida la célula huésped es una célula humana, de forma incluso más preferida una célula PERC6®.
Se pretende que el término "molécula de ácido nucleico recombinante", en el sentido de la presente invención, comprenda todo tipo de moléculas de ácido nucleico que sean capaces de introducirse en una célula huésped y efectuar la expresión de una secuencia de ácido nucleico que está contenida en la molécula de ácido nucleico recombinante El término incluye, por ejemplo, vectores plasmídicos y vectores víricos (por ejemplo, vectores adenovíricos, lentivíricos y retrovíricos), como son bien conocidos en la técnica.
Se proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una (primera) secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena a de hCG, (primera) secuencia de ácido nucleico que se selecciona a partir de una secuencia según la SEQ ID NO: 1; una secuencia que tiene al menos el 96,5% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 96,5% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 1); una secuencia que tiene al menos el 97% de homología con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de homología con) la secuencia de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 97% de identidad de secuencia con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con) la secuencia de la SEQ ID NO: 1); una secuencia según la SEQ ID NO. 4; una secuencia que tiene al menos el 96,5% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 96,5% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 14; y una secuencia que tiene al menos el 97% de homología con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de homología con) la secuencia de la SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 97% de identidad de secuencia con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con) la secuencia de la SEQ ID NO: 4). La molécula de ácido nucleico recombinante comprende tanto una secuencia de ácido nucleico optimizada que codifica la cadena a de hCG humana como una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena p de hCG. Preferentemente, la (primera) secuencia de ácido nucleico se encuentra bajo el control de un promotor que es activo en una célula huésped. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende además una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena p de hCG. La segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena p de hCG puede ser la secuencia según la SEQ ID NO: 2.
La segunda secuencia de ácido nucleico puede encontrarse bajo el control de un promotor aparte que está activo en una célula huésped. La primera secuencia de ácido nucleico y/o la segunda secuencia de ácido nucleico pueden encontrarse bajo el control de un promotor vírico (por ejemplo, un promotor CMVie).
Se proporciona una célula huésped que comprende o incluye una molécula de ácido nucleico recombinante tal como se ha establecido anteriormente (por ejemplo, una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una (primera) secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena a de hCG, seleccionándose la (primera) secuencia de ácido nucleico a partir de una secuencia según la SEQ ID NO: 1; una secuencia que tiene al menos el 96,5% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 96,5% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 1); una secuencia que tiene al menos el 97% de homología con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de homología con) la secuencia de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 97% de identidad de secuencia con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con) la secuencia de la SEQ ID NO: 1); una secuencia según la SEQ ID NO.4; una secuencia que tiene al menos el 96,5% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 96,5% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 4); y una secuencia que tiene al menos el 97% de homología con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de homología con) la secuencia de SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, una secuencia que tiene al menos el 97% de identidad de secuencia con (por ejemplo, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con) la secuencia de la SEQ ID NO: 4).
Los solicitantes han descubierto que las células (células huésped), líneas celulares que incorporan estas células huésped, moléculas de ácido nucleico recombinantes, polinucleótidos y procedimientos de la invención pueden producir hCG recombinante con alto rendimiento y pureza (por ejemplo, con poca cadena beta libre).
La hCG recombinante (''rhCG'' o "rechCG") incluye sialilación en a2,3 y a2,6, y la hCG recombinante se produce en una célula tal como se describe y se reivindica en el presente documento. La hCG recombinante puede tener un contenido de ácido siálico [expresado en términos de una relación de moles de ácido siálico con respecto a moles de proteína] de 12 mol/mol a 20 mol/mol, por ejemplo, de 12 mol/mol a 15,5 mol/mol, por ejemplo, de 12 mol/mol a 14,9 mol/mol. La rhCG (o preparación de rhCG) puede tener un contenido de ácido siálico de 12,5 mol/mol a 14,5 mol/mol, por ejemplo, un contenido de ácido siálico de 12,8 mol/mol a 13,2 mol/mol. La rhCG (o preparación de rhCG) puede tener un contenido de ácido siálico de 13 mol/mol.
La rhCG puede estar presente como una única isoforma o como una mezcla de isoformas.
La hCG (o preparación de rhCG) recombinante producida por los procedimientos y las células de la invención incluye sialilación en a2,3 y a2,6. Por sialilación se entiende la cantidad de residuos siálicos presentes en las estructuras de
carbohidratos de hCG. Sialilación en a2,3 significa sialilación en la posición 2,3 (como se sabe bien en la técnica); y sialilación en a2,6 significa sialilación en la posición 2,6 (como también se sabe bien en la técnica). Por lo tanto, en el presente documento, la expresión "% de la sialilación total puede ser sialilación en a2,3" se refiere al % del número total de residuos de ácido siálico presentes en la hCG que están sialilados en la posición 2,3. La expresión "% de la sialilación total que es sialilación en a2,6" se refiere al % del número total de residuos de ácido siálico presentes en la hCG que están sialilados en la posición 2,6. La expresión "% de la sialilación total que es sialilación en a2,8" se refiere al % del número total de residuos de ácido siálico presentes en la hCG que están sialilados en la posición 2,8.
La rhCG (o preparación de rhCG) producida por medio de los procedimientos y las células según la invención puede tener del 1% al 99% de la sialilación total que es sialilación en a2,3. La rhCG (o preparación de rhCG) producida por medio de los procedimientos y las células según la invención puede tener del 1% al 90% de la sialilación total que es sialilación en a2,3. La rhCG (o preparación de rhCG) según la invención puede tener el 10% o más de la sialilación total que es sialilación en a2,3, por ejemplo, entre el 10% y el 90% de la sialilación total puede ser sialilación en a2,3. Por ejemplo, el 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80 o 90% o más de la sialilación total puede ser sialilación en a2,3. Del 45% al 80% de la sialilación total puede ser sialilación en a2,3, por ejemplo, del 50% al 70% de la sialilación total puede ser sialilación en a2,3, por ejemplo del 55 al 65% de la sialilación total puede ser sialilación en a2,3. La rhCG (o preparación de rhCG) puede incluir sialilación en a2,3 en una cantidad que es del 65 al 95% de la sialilación total, por ejemplo, del 70 al 90% de la sialilación total, por ejemplo del 85 al 90% de la sialilación total.
La rhCG (o preparación de rhCG) producida por los procedimientos y células de la invención puede tener del 1 al 99% de la sialilación total que es sialilación en a2,6. La rhCG (o preparación de rhCG) de la invención puede tener del 5 al 50% de la sialilación total que es sialilación en a2,6. Por ejemplo del 5 al 45%, por ejemplo del 6 al 40%, por ejemplo del 7 al 30%, por ejemplo del 8 al 20% de la sialilación total puede ser sialilación en a2,6. La rhCG (o preparación de rhCG) puede incluir sialilación en a2,6 en una cantidad que es el 20-75% de la sialilación total, por ejemplo, el 30-60% de la sialilación total, por ejemplo el 35-45% de la sialilación total. La rhCG (o preparación de rhCG) puede incluir sialilación en a2,6 en una cantidad que es del 5 al 35% de la sialilación total, por ejemplo, del 10 al 20% de la sialilación total. Por ejemplo, el 11 -55% de la sialilación total puede ser sialilación en a2,6.
La preparación de rhCG o rhCG producida por los procedimientos y las células puede incluir opcionalmente además sialilación en a2,8. La rhCG (o preparación de rhCG) de la invención puede tener el 5% o menos de la sialilación total que es sialilación en a2,8, por ejemplo, del 0 al 4%, por ejemplo el 0,1-4% de la sialilación total puede ser sialilación en a2,8. La rhCG (o preparación de rhCG) de la invención puede no tener sialilación en a2,8.
La rhCG (o preparación de rhCG) producida por medio de los procedimientos y las células según la invención puede tener un contenido de ácido siálico (cantidad de sialilación por molécula de hCG) de (con respecto a la masa de proteína, en lugar de la masa de proteína más carbohidrato) del 6% o superior (por ejemplo entre el 6% y el 15%, por ejemplo entre el 7% y el 13%, por ejemplo entre el 8% y el 12%, por ejemplo entre el 11% y el 15%, por ejemplo entre el 12% y el 14%) en masa.
La rhCG (o preparación de rhCG) puede producirse o expresarse en una línea celular humana, por ejemplo, una línea celular PER.C6®, una línea celular HT1080, etc. La rhCG (o preparación de rhCG) puede producirse o expresarse en un línea celular derivada de seres humanos o una línea celular humana modificada, por ejemplo, una línea celular derivada de PER.C6® o una línea celular PER.C6® modificada, una línea celular HT1080 modificada o una línea celular derivada de HT1080, etc. En un ejemplo preferido, la rhCG se produce o se expresa en una línea celular PER.C6®, una línea celular derivada de PER.C6® o una línea celular PER.C6® modificada. La rhCG que se produce o se expresa en una línea celular humana (por ejemplo, una línea celular PER.C6®, una línea celular HT1080, una línea celular GT-5s) incluirá algunos ácidos siálicos unidos en a2,6 (sialilación en a2,6) proporcionados por actividad de sialiltransferasa endógena [de la línea celular] e incluirá algunos ácidos siálicos unidos en a2,3 (sialilación en a2,3) proporcionados por actividad de sialiltransferasa endógena [de la línea celular]. La línea celular se puede modificar utilizando a2,3-sialiltransferasa. Como alternativa o adicionalmente, la línea celular puede modificarse utilizando a2,6-sialiltransferasa. Esto puede simplificar (y hacer más eficaz) el procedimiento de producción porque la manipulación y el control de, por ejemplo, el medio de crecimiento celular para retener la sialilación puede ser menos crítico que con los procesos conocidos. El procedimiento también puede ser más eficaz porque se produce poca rhCG básica en comparación con la producción de productos de rhCG conocidos; se produce más rhCG ácida y la separación/eliminación de hCG básica es menos problemática.
La rhCG puede producirse utilizando una a2,3-sialiltransferasa, por ejemplo, puede producirse utilizando una línea celular humana modificada usando una a2,3-sialiltransferasa. La rhCG puede incluir ácidos siálicos unidos en a2,6 (sialilación a2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena. La rhCG puede producirse utilizando una a2,3- y/o una a2,6-sialiltransferasa, por ejemplo, puede producirse utilizando una línea celular humana modificada usando una a2,3-sialiltransferasa y/o una a2,6-sialiltransferasa.
La estructura de rhCG contiene restos de glicano. Puede producirse ramificación, con el resultado de que el glicano puede tener 1, 2, 3, 4 o más residuos terminales de azúcar o "antenas", tal como se sabe bien en la técnica. La rhCG según aspectos de la invención puede tener glicanos con estructuras de glicano mono-antenarias y/o di-antenarias y/o tri-antenarias y/o tetra-antenarias. La rhCG puede incluir estructuras de glicano mono-antenarias y/o bi-antenarias
y/o tri-antenarias y/o tetra-antenarias, por ejemplo, con las cantidades relativas siguientes: del 0,1 al 3% monoantenarias; del 65% al 85% bi-antenarias; del 15 al 25% tri-antenarias y del 0,5 al 1,5% tetra-antenarias (por ejemplo, tal como se muestra en el análisis WAX de glicanos cargados).
Se proporciona una composición farmacéutica que comprende una hCG recombinante (rhCG) que tiene sialilación en a2,3 y sialilación en a2,6, produciéndose la hCG recombinante mediante los procedimientos y/o las células que se divulgan en el presente documento. La rhCG puede tener un contenido de ácido siálico [expresado en términos de una relación de moles de ácido siálico con respecto a moles de proteína] de 12 mol/mol a 15,5 mol/mol, por ejemplo, de 12 mol/mol a 14,9 mol/mol (por ejemplo, tal como se ha establecido anteriormente). La rhCG puede tener un contenido de ácido siálico de 12,5 mol/mol a 14,5 mol/mol, por ejemplo, un contenido de ácido siálico de 12,8 mol/mol a 13,2 mol/mol. Preferentemente, la rhCG tiene un contenido de ácido siálico de 13 mol/mol.
La composición farmacéutica puede comprender además FSH y/o LH.
La FSH puede obtenerse por cualquier medio conocido en la técnica. La FSH, tal como se utiliza en el presente documento, incluye FSH derivada de seres humanos y recombinante. La FSH derivada de seres humanos se puede purificar a partir de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, orina) mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. La FSH puede ser FSH recombinante, por ejemplo, expresada en una línea celular humana. Los procedimientos de expresión y purificación de FSH recombinante son bien conocidos en la técnica.
La LH puede obtenerse por cualquier medio conocido en la técnica. La LH, tal como se utiliza en el presente documento, incluye LH derivada de seres humanos y recombinante. La LH derivada de seres humanos se puede purificar a partir de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, orina) mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los procedimientos de expresión y purificación de LH recombinante son conocidos en la técnica.
La composición farmacéutica puede ser para, o para su uso en, el tratamiento de la infertilidad, por ejemplo para su uso en, por ejemplo, tecnologías de reproducción asistida (ART), inducción de la ovulación o inseminación intrauterina (IIU). La composición farmacéutica puede utilizarse para desencadenar la maduración final/ovulación y luteinización, la estimulación del desarrollo folicular en mujeres con deficiencia grave de LH y FSH y/o en soporte lúteo (rhCG/rLH). La composición farmacéutica puede ser para, o para su uso en, la inducción de desarrollo monofolicular en mujeres anovulatorias de tipo II según la OMS (por ejemplo, rhCG con rLH), para mejorar la respuesta multifolicular con cebado de LH en pacientes sometidas a COH (por ejemplo, rhCG con rLH) y para complementar la COH para mejorar las tasas de implantación/embarazo (por ejemplo, rhCG con rLH) y/o aumentar las tasas de embarazo en tecnologías de reproducción asistida. La composición farmacéutica puede ser para, o para su uso en, la prevención de abortos espontáneos y/o la prevención de la prematuridad. La composición farmacéutica puede ser para, o para su uso en, el tratamiento de la endometriosis.
La composición farmacéutica puede utilizarse, por ejemplo, en indicaciones médicas en las que se utilizan preparaciones de hCG conocidas.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en composiciones bien conocidas para cualquier vía de administración de fármacos, por ejemplo, oral, rectal, parenteral, transdérmica (por ejemplo, tecnología de parches), intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, local (polvos, ungüentos o gotas) o como pulverización bucal o nasal. Una composición típica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una solución acuosa, excipientes no tóxicos, que incluyen sales y conservantes, tampones y similares, tal como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoquinta edición (Matt Publishing Company, 1975), páginas 1405 a 1412 y 1461-87, y el formulario nacional XIV, decimocuarta edición (American Pharmaceutical Association, 1975), entre otros. Los ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos farmacéuticos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como el aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Las composiciones también pueden contener aditivos tales como, pero sin limitación, conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. Se pueden incluir agentes antibacterianos y antifúngicos para prevenir el crecimiento de microbios e incluyen, por ejemplo, m-cresol, alcohol bencílico, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. Además, puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares.
En algunos casos, para lograr una acción prolongada, es deseable ralentizar la absorción de hCG (y otros ingredientes activos, si están presentes) a partir de una inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. La tasa de absorción de hCG depende entonces de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retardada de una forma de combinación de hCG administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo la combinación de hCG en un vehículo oleoso. Pueden producirse formas de depósito inyectables formando matrices microencapsuladas de hCG (y otros agentes, si están presentes) en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación de hCG con respecto al polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación de hCG. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen polivinilpirrolidona, poli(ortoésteres), poli(anhídridos), etc. Las
formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando la hCG en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales. Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o mediante incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes de su uso. Las formulaciones inyectables se pueden suministrar en cualquier recipiente adecuado, por ejemplo, un vial, una jeringa precargada, cartuchos de inyección y similares.
Las formulaciones (por ejemplo, la formulación inyectable) se pueden suministrar como un producto que tiene composiciones farmacéuticas que contienen hCG (opcionalmente con FSH, LH, etc.) Si hay más de un ingrediente activo (es decir, hCG y, por ejemplo, FSH o LH), estas pueden ser adecuadas para la administración por separado o conjuntamente. Si se administran por separado, la administración puede ser secuencial. El producto puede suministrarse en cualquier envase apropiado. Por ejemplo, un producto puede contener varias jeringas precargadas o viales que contienen hCG, FSH o una combinación de FSH y hCG. Las jeringas o viales pueden envasarse en un envase de tipo blíster u otros medios para mantener la esterilidad. Un producto puede contener opcionalmente instrucciones para el uso de las formulaciones de hCG y FSH.
El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan según la práctica rutinaria en este campo. Véase GOODMAN y GILMAN, Th e PHARMACOLOGICa L BASIS FOR THERAPEUTICS, 7a ed. En una forma de realización preferida, las composiciones de la invención se suministran como composiciones para administración parenteral. Los procedimientos generales para la preparación de las formulaciones de uso parenteral se conocen en la técnica y se describen en REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, citado anteriormente, en las páginas 780-820. Las composiciones de uso parenteral pueden suministrarse en una formulación líquida o como un sólido que se mezclará con un medio inyectable estéril justo antes de su administración. En una forma de realización, las composiciones de uso parenteral se suministran en forma de dosificación unitaria para proporcionar facilidad la administración y uniformidad de la dosificación.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los ejemplos siguientes y a los dibujos adjuntos en los que:
La figura 1 muestra secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos derivadas de la secuencia alfa de hCG optimizada;
La figura 2 muestra secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos derivadas de la secuencia beta 
de hCG;
La figura 3 muestra secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos derivadas de ST3GAL4;
La figura 4 muestra un mapa plasmídico del vector de expresión de phCGalfa/beta;
La figura 5 muestra el vector de expresión de a2,3-sialiltransferasa (ST3GAL4);
La figura 6 muestra la detección de isoformas de rhCG mediante tinción de IEF con azul de Coomassie en composiciones según la invención (carriles 4, 5, 6 y 7, 15 pg por carril); la composición derivada de CHO de la técnica anterior, Ovitrelle (carril 2, 15 pg); y un producto urinario humano obtenido de mujeres embarazadas Novarel (carril 3, 15 pg); y
La figura 7 compara la concentración de hCG ("alfa-beta CG") y la cadena beta libre ("beta CG") producidas utilizando las células de la invención que incluyen la secuencia nucleica "optimizada" de la subunidad alfa, en comparación con la concentración de hCG ("alfa-beta CG") y cadena beta libre ("beta hCG") producidas en células de ejemplo comparativas que incluyen la subunidad alfa WT (tipo silvestre);
Ejemplos 1 a 7
Descripción general del proceso de desarrollo de una línea celular
Un único plásmido que porta cadenas alfa y beta de hCG, cada una controlada por un promotor CMVie separado, se transfectó en células PER.C6® mediante electroporación.
Este plásmido portaba un casete de genes de resistencia a neomicina (figura 4) que permitía la selección de transfectantes utilizando G418 (geneticina). Se expandieron mezclas de transfectantes y después se sometieron a clonación por dilución limitante en placas de 96 pocillos bajo selección por G418. Las líneas clonales se expandieron y las colonias de alta expresión se identificaron basándose en el título de hCG en el sobrenadante del cultivo celular.
Se seleccionaron cinco clones candidatos, basándose en su alta productividad, y cada uno se transfectó después con un segundo plásmido que expresaba el gen de la a2,3-sialiltransferasa ST3GAL4 junto con el marcador de selección
de higromicina (figura 5). Cada una de las cinco mezclas de transfección se expandió y los sobrenadantes de cultivo celular se evaluaron para determinar la concentración de hCG y la farmacocinética (PK) in vivo.
A continuación, las mezclas prometedoras se sometieron a otra ronda de clonación por dilución limitada. Los clones resultantes se expandieron y los sobrenadantes del cultivo celular se evaluaron para determinar la concentración de hCG y la galactosa expuesta en la proteína hCG (mediante ELISA de lectina). Aquellos con un nivel bajo de galactosa expuesta se sometieron a ensayos adicionales que incluyen PK in vivo. Se evaluaron y se seleccionaron los clones que produjeron hCG con perfiles de PK óptimos, que tenían un nivel reducido de galactosa expuesta y que expresaban la proteína en niveles altos, y se seleccionaron por sus características de productividad y crecimiento.
Ejemplo 1: Selección de secuencia y vectores plasmídicos
La región codificante del gen para el polipéptido alfa de hCG se muestra en la figura 1. La región codificante del gen para la secuencia del polipéptido alfa de hCG se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 1.
La región codificante del gen para el polipéptido beta de hCG se utilizó según Fiddes y Goodman (1980). La secuencia está registrada en el banco como NP_000728 y es acorde con las secuencias de proteínas de CGbeta3, CGbeta5 y CGbeta7. La secuencia se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 2
La región codificante del gen de la beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (a2,3-sialiltransferasa, ST3GAL4) se utilizó según Kitagawa y Paulson (1994). La secuencia está registrada en el banco como L23767 y se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 3.
Se utilizaron dos plásmidos: el primero, phCG, coexpresa las cadenas alfa y beta de hCG; y el segundo expresa el gen de la sialiltransferasa ST3GAL4.
Ejemplo 2a: Construcción del vector de expresión de hCG
El phCG es una cadena alfa de hCG sintética, optimizada para el uso de codones en células de mamíferos que incluyen el péptido señal alfa de hCG nativo. Puede diseñarse mediante ingeniería genética utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica.
La secuencia codificante del polipéptido alfa de hCG (SEQ ID NO: 1) y el polipéptido beta de hCG (NP_000728, SEQ ID NO: 2) se amplificaron mediante PCR utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional publicada como WO2011/042688). El ADN de alfa de phCG se digirió con BamHI y NheI y se insertó en los sitios BamHI y NheI en un vector de expresión de mamífero dirigido por CMV (vector de Crucell pcDNA3002Neo). Este dispuso el gen en la orientación correcta para la expresión dirigida por un promotor CMVie con una señal poliA de BGH cadena abajo. El gen beta de hCG nativo, que incluye el péptido señal nativo, se digirió con las enzimas de restricción AscI y HpaI y se insertó en los sitios AscI y HpaI de modo que la expresión fuera dirigida por un segundo promotor CMVie con una señal poli A de BGH cadena abajo adicional. El esqueleto del vector también incluía un marcador de resistencia a neomicina, así como elementos necesarios para la selección y la replicación en células procariotas. El vector se amplificó y se secuenció utilizando procedimientos generales conocidos en la técnica. Las secuencias de las cadenas alfa de hCG optimizada y beta nativa (tipo silvestre) se proporcionan en las figuras 1 y 2, respectivamente.
Todas las colonias seleccionadas para la secuenciación contenían las secuencias correctas según la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. Se seleccionó el plásmido phCG A B para la transfección (figura 4).
Ejemplo 2b: Construcción del vector de expresión de ST3
El gen ST3GAL4 se expresa en pST3. La secuencia codificante de beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3, figura 3) se amplificó mediante PCR utilizando la combinación de cebadores 2,3STfw y 2,3STrev.
2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3'
2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3'
El ADN de ST3 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción BamHI y AflII y se insertó en los sitios BamHI y AflII en el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina (vector pcDNA3002Neo) de forma que se localizara cadena abajo del promotor de CMVie y cadena arriba de la secuencia poliA de BGH. El esqueleto del vector también incluía un marcador de resistencia a higromicina, así como elementos necesarios para la selección y la replicación en células procariotas. El vector se amplificó tal como se ha descrito anteriormente y se secuenció. El clon pST3 # 1 (figura 5) contenía la secuencia correcta según la SEQ ID NO: 3 y se seleccionó para transfección.
Ejemplo 3: Transfección de plásmidos
El plásmido phCG (figura 4), que tiene un único sitio Pvul ubicado en el gen de la beta-lactamasa procariota, se linealizó con Pvul (New England Biolabs N° de cat. R0150). El ADN plasmídico linealizado se transfectó en células PER.C6® de la forma siguiente.
Se mantuvieron cultivos celulares en medio PERMAB completo (CD4PERMAB (Hyclone N° de cat. SH30871.01) suplementado con L-glutamina a una concentración final 3 mM (Invitrogen N° de cat. 25030-123) y Pluronic F68 a una concentración final de 1,0 g/l (Invitrogen N° de cat. 24040-032) en matraces Erlenmeyer de 250 ml. Las células se mantuvieron en una incubadora con agitación (Kuhner Climo-shaker ISF1-X) a 100 rpm, 5% de CO2 y 37 °C, durante al menos 14 días antes de la transfección. Las células se transfirieron a medio nuevo a una densidad de 0,5 x 106 células/ml 48 horas antes de la transfección.
El día de la transfección, las células se contaron en un Beckman Coulter ViCell XR para determinar la densidad celular y asegurar que la viabilidad fuera > 90%. Las células se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en medio PERMAB nuevo antes de mezclarlas con ADN de phCG linealizado. La mezcla de células/ADN se sometió a electrochoque en la cámara de un electroporador ajustada a 250 V durante 5 ms, antes de transferirla rápidamente a 10 ml de medio PERMAB precalentado. Este proceso se repitió un total de 6 veces y las 6 transfecciones se mezclaron en un único matraz de cultivo de tejidos T-175 cm2. El matraz se dispuso en una incubadora estática ajustada a 37 °C, 5% de CO2. Después de 48 horas, las células se resuspendieron en el volumen apropiado de PERMAB selectivo (medio PERMAB completo G418 (125 pg/ml)) para proporcionar una densidad celular viable de 0,5 x 106/ml.
Se realizó un pasaje del cultivo de la mezcla dos veces por semana, manteniendo las células a una densidad de 0,3 x 106 células/ml en medio selectivo hasta que la viabilidad celular aumentó a > 50%. En este punto, las células se transfirieron a cultivos en agitación en matraces Erlenmeyer de 250 ml. Después de varias semanas en cultivo con agitación, se tomaron muestras del sobrenadante de la mezcla y se evaluó la concentración de hCG. Una vez que se estableció que la mezcla era positiva para la expresión de hCG, las células se prepararon para la clonación por dilución limitada.
Se preparó una suspensión celular a 0,3 células viables/ml en medio PERMAB suplementado con G-418 a 125 pg/ml. La suspensión celular se dispensó en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos a 200 pl/pocillo y se incubó en una atmósfera humidificada a 37 °C, 5% de CO2 (aglutinante CB150). Las placas se escanearon con regularidad utilizando el generador de imágenes Genetix Clone Select para rastrear el crecimiento de las células en cada pocillo.
Después de dos semanas, se identificaron 535 pocillos que contenían colonias de células en crecimiento activo. Se tomaron muestras de los sobrenadantes de estos pocillos y se analizaron para determinar la hCG utilizando un kit comercial (DRG diagnostics HCG ELISA N° de cat. EIA1469). Basándose en los resultados de estos ensayos, se transfirió un total de 162 de las colonias a placas de 24 pocillos que contenían 0,5 ml/pocillo de medio PERMAB selectivo. Cuando las células de los pocillos estaban cerca de la confluencia, se tomaron muestras del sobrenadante de cada uno de los 162 pocillos y se evaluaron los niveles de hCG. Basándose en estos resultados, se seleccionaron 91 de las líneas celulares de mejor expresión para expandirlas en matraces T-25. Estas líneas celulares se cultivaron de nuevo hasta cerca de la confluencia, momento en el que se tomaron muestras de los sobrenadantes y se analizaron para determinar la hCG como anteriormente. Basándose en estos resultados, las 58 líneas celulares de mejor expresión se expandieron en matraces T-75. El análisis de la tasa de producción específica (SPR) se realizó en cada una de estas 58 líneas celulares mediante procedimientos conocidos en la técnica y la productividad específica se expresó en pg/célula/día.
Por lo tanto, en este ejemplo se transfectó un plásmido que incorporaba cadenas alfa y beta de hCG en células PER.C6® y se seleccionaron los transfectantes utilizando medio que contenía G418. Las colonias de células en crecimiento se cribaron para determinar la concentración de hCG en el sobrenadante y las que expresaban el nivel más alto se expandieron adicionalmente. Después de rondas subsiguientes de expansión y cribado, se seleccionaron 20 clones que expresaban hCG para estudios de crecimiento y productividad. Basándose en los resultados de estos estudios, se seleccionaron 5 clones para la transfección con un segundo plásmido que incorpora el gen ST3GAL4.
Ejemplo 4: Transfección con el plásmido pST3 de ST3GAL4
Se generaron clones estables tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 3.
Los cinco mejores clones producidos mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 3 se seleccionaron para transfección con el plásmido pST3 de ST3GAL4 (véase el ejemplo 2, figuras 3 y 5). La transfección se realizó mediante electroporación utilizando el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 3, excepto que los transformantes se seleccionaron en medio PERMAB completo suplementado con higromicina a 0,5 pg/ml en lugar de G418. Utilizando este procedimiento, se obtuvieron cinco mezclas que expresaban hCG.
Se analizaron muestras de sobrenadantes de las mezclas de transfección en un modelo farmacocinético de rata y, basándose en estos datos, junto con los datos del ensayo de unión de RCA-lectina (midiendo la galactosa expuesta en las cadenas de hCG), se seleccionó una única mezcla para clonación por dilución limitada adicional, mediante procedimientos conocidos en la técnica.
Esta clonación por dilución produjo > 600 clones, cada uno de los cuales también se cribó para determinar la expresión de hCG y el grado de galactosa expuesta medido por unión de RCA-lectina. Los clones con los niveles más bajos de galactosa expuesta se expandieron adicionalmente y las muestras se sometieron a PK in vivo y datos de corroboración de unión a lecitina. Se evaluaron además cinco clones derivados de la única mezcla para determinar las características de crecimiento y productividad.
Cada uno de estos clones se expandió y se produjo un banco celular de reservas para siembra siguiendo procedimientos estándar de crioconservación. Las reservas del banco celular de reservas para siembra se descongelaron y se comprobó que eran viables.
Ejemplo 5: Análisis por enfoque isoeléctrico
La electroforesis se define como el transporte de moléculas cargadas a través de un disolvente mediante un campo eléctrico. La movilidad de una molécula biológica a través de un campo eléctrico dependerá de la intensidad del campo, la carga neta de la molécula, el tamaño y la forma de la molécula, la fuerza iónica y las propiedades del medio a través del que migran las moléculas.
El enfoque isoeléctrico (IEF) es una técnica electroforética para la separación de proteínas en función de su pl. El pl es el pH al que una proteína no tiene carga neta y no migrará en un campo eléctrico. El contenido de ácido siálico de las isoformas de hCG altera sutilmente el punto pl para cada isoforma, que se puede explotar utilizando esta técnica para visualizar las isoformas de hCG de Per.C6 de cada clon.
Los puntos isoeléctricos de las isoformas de hCG producidas por Per.C6 se analizaron utilizando enfoque isoeléctrico. La hCG de Per.C6 se produjo tal como se describe en el ejemplo 6.
Las muestras de hCG de Per.C6 se separaron en geles Novex® IEF que contenían poliacrilamida al 5% en condiciones nativas en un gradiente de pH 3,0 - 7,0 en una solución anfolítica a pH 3,0 - 7,0. Las proteínas se visualizaron usando tinción con azul de Coomassie, utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica.
La figura 6 muestra la detección de isoformas de rhCG mediante tinción de IEF con azul de Coomassie en composiciones producidas según la invención producidas a partir de las líneas celulares clonadas preparadas mediante el procedimiento establecido en los ejemplos 6 (carriles 4, 5, 6 y 7, 15 pg por carril); la composición derivada de CHO de la técnica anterior, Ovitrelle (carril 2, 15 pg); y un producto urinario humano obtenido de mujeres embarazadas Novarel (carril 3, 15 pg). Las bandas representan isoformas de hCG que contienen diferentes cantidades de moléculas de ácido siálico. La figura 6 indica que la hCG recombinante derivada de la línea celular humana genomanipulada con a2,3-sialiltransferasa (composiciones según la invención) es más ácida que Ovitrelle y la hCG urinaria de mujeres embarazadas.
La figura 7 compara la concentración de hCG ("alfa-beta hCG") y la cadena beta libre ("beta hCG") producidas utilizando las células de la invención (es decir, utilizando líneas celulares producidas mediante el procedimiento establecido en los ejemplos 1 a 4) que incluyen la subunidad alfa "optimizada", en comparación con la concentración de hCG ("alfa-beta hCG") y la cadena beta libre ("beta hCG") producidas en células de ejemplo comparativas, incluida la subunidad alfa WT (de tipo silvestre). La figura 7 muestra que las células de la invención expresan altas cantidades de hCG y un bajo exceso de la subunidad beta libre. En otras palabras, se mejora significativamente el rendimiento y la pureza de la hCG recombinante producida por las células y los procedimientos de la invención.
La tabla A indica el porcentaje de subunidades de p-hCG libres en muestras semipurificadas de varios lotes de hCG producidos utilizando las células de la invención (es decir, utilizando líneas celulares preparadas mediante el procedimiento establecido en los ejemplos 1 a 4) que incluyen la subunidad alfa "optimizada" ("alfa hCG opt."), en comparación con el porcentaje de subunidades de p-hCG libres en muestras semipurificadas de hCG producidas en células de ejemplo comparativas, incluida la subunidad alfa WT (de tipo silvestre) ("alfa hCG WT"), según se determina mediante cromatografía HPLC con fenil-5PW hidrófobo.
La tabla A muestra que las células de la invención expresan altas cantidades de hCG y un exceso bastante menor de la subunidad beta libre (5,7 - 10,6%) en comparación con las células que incluyen la subunidad alfa WT (64 - 66%). En otras palabras, se mejora significativamente el rendimiento y la pureza de la hCG recombinante producida por las células y los procedimientos de la invención.
Tabla A
Ejemplo 6: Descripción general de la producción y la purificación
Se desarrolló un procedimiento para producir hCG recombinante en células PER.C6 que se cultivaron en suspensión en medio carente de suero. El procedimiento se describe a continuación y se aplicó a varias líneas celulares PER.C6 productoras de hCG.
Se preparó hCG recombinante de un clon transfectado con a2,3-sialiltransferasa utilizando los procedimientos de los ejemplos 1 a 4 descritos anteriormente.
Las células se cultivaron en matraces con agitación en medio 6GRO (SAFC) hasta que se logró una densidad celular de 1 x 106 a 3 x 106 células/ml. Las células se transfirieron a un biorreactor de tanque con agitación de vidrio de 5 l con una densidad de aproximadamente 1 x 106 células/ml. El biorreactor operó en modo de perfusión utilizando un medio Proper1 (Lonza).
Posteriormente, se llevó a cabo la purificación del producto rhCG utilizando varias etapas de ultrafiltración, cromatografía de captura de intercambio aniónico y catiónico, cromatografía hidrófoba y cromatografía de pseudoafinidad, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.
Durante todos los procedimientos cromatográficos, la presencia de hCG recombinante inmunorreactiva se confirmó mediante ELISA (DRG EIA 1469) e IEF (ejemplo 5).
Ejemplo 7: Contenido de ácido siálico
El ácido siálico es un carbohidrato unido a proteína que se considera un monosacárido y se presenta en combinación con otros monosacáridos tales como galactosa, manosa, glucosamina, galactosamina y fucosa. El ácido siálico total en rhCG purificada según la invención se midió utilizando un procedimiento basado en el procedimiento de Stanton et al. (J. Biochem. Biophys. Methods. 30 (1995), 37 - 48).
Se midió el contenido total de ácido siálico de las muestras de hCG recombinante de Per.C6 modificada con a2,3-sialiltransferasa (producida mediante los procedimientos de los ejemplos 4 y 6) y los resultados se proporcionan en la tabla 1 siguiente [expresados en términos de una relación de moles de ácido siálico con respecto a moles de proteína].
Ejemplo 8: Bioensayo de hCG según la USP
Se llevó a cabo un bioensayo de hCG, con el fin de determinar la actividad específica de hCG, para cada una de las muestras de la tabla 1 siguiente. La actividad se midió según la USP (USP Monographs: Chorionic Gonadotropin, USPC Official 8/1/09-11/30/09), utilizando Ovitrelle como patrón. El Ovitrelle tiene una actividad biológica de 26.000 UI/mg (Curr Med Res Opin. 2005 de diciembre; 21 (12): 1969 - 76). El límite de aceptación fue > 21.000 UI de hCG/mg. La actividad biológica para muestras de hCG recombinantes de hCG derivadas de líneas celulares humanas genomanipuladas con a2,3-sialiltransferasa se muestra en la tabla 1.
Tabla 1
Tal como se observó anteriormente, la potencia es similar y puede ser superior a la de Ovitrelle (véase, por ejemplo, la muestra 7).
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69(2), 379-389.
Alfa de hCG optimizada
Secuencia de nucleótidos de alfa de hCG optimizada (SEQ ID NO: 1)
1 ATGGACTACT ACCGGAAGTA CGCCGCCATC TTCCTGGTGA CCCTGAGCGT
GTTCCTGCAC
61 GTGCTGCACA GCGCCCCTGA CGTGCAGGAC TGCCCCGAGT GCACCCTGCA
GGAAAACCCC
121 TTCTTCAGCC AGCCTGGCGC CCCTATCCTG CAGTGCATGG GCTGCTGCTT
CAGCAGAGCC
181 TACCCCACCC CCCTGCGGAG CAAGAAAACC ATGCTGGTGC AGAAAAACGT
GACCAGCGAG
241 AGCACCTGCT GCGTGGCCAA GAGCTACAAC CGGGTGACCG TGATGGGCGG
CTTCAAGGTG
301 GAGAACCACA CCGCCTGCCA CTGCAGCACC TGCTACTACC ACAAGTCCT
Secuencia de proteínas de alfa de hCG optimizada
1 MDYYRKYAAI FLVTLSVFLH VLHSAPDVQD CPECTLQENP FFSQPGAPIL
QCMGCCFSRA
61 YPTPLRSKKT MLVQKNVTSE STCCVAKSYN RVTVMGGFKV ENHTACHCST CYYHKS
Polipéptido beta de gonadotropina coriónica humana
Número de acceso NP 000728
Secuencia de nucleótidos de beta de hCG (SEQ ID NO: 2)
Secuencia de nucleótidos
1 ATGGAGATGT TCCAGGGGCT GCTGCTGTTG CTGCTGCTGA GCATGGGCGG
GACATGGGCA
61 TCCAAGGAGC CGCTTCGGCC ACGGTGCCGC CCCATCAATG CCACCCTGGC
TGTGGAGAAG
121 GAGGGCTGCC CCGTGTGCAT CACCGTCAAC ACCACCATCT GTGCCGGCTA
CTGCCCCACC
181 ATGACCCGCG TGCTGCAGGG GGTCCTGCCG GCCCTGCCTC AGGTGGTGTG
CAACTACCGC
241 GATGTGCGCT TCGAGTCCAT CCGGCTCCCT GGCTGCCCGC GCGGCGTGAA
CCCCGTGGTC
301 TCCTACGCCG TGGCTCTCAG CTGTCAATGT GCACTCTGCC GCCGCAGCAC
CACTGACTGC
361 GGGGGTCCCA AGGACCACCC CTTGACCTGT GATGACCCCC GCTTCCAGGA
CTCCTCTTCC
421 TCAAAGGCCC CTCCCCCCAG CCTTCCAAGT CCATCCCGAC TCCCGGGGCC
CTCGGACACC
481 CCGATCCTCC CACAATAA
Secuencia de proteínas de beta de hCG
1 MEMFQGLLLL LLLSMGGTWA SKEPLRPRCR PINATLAVEK EGCPVCITVN TTICAGYCPT
61 MTRVLQGVLP ALPQWCNYR DVRFESIRLP GCPRGVNPW SYAVALSCQC ALCRRSTTDC
121 GGPKDHPLTC DDPRFQDSSS SKAPPPSLPS PSRLPGPSDT PILPQ
Beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4
Número de acceso L23767
Secuencia de nucleótidos de ST3GAL4 (SEQ ID NO: 3)
1 ATGTGTCCTG CAGGCTGGAA GCTCCTGGCC ATGTTGGCTC TGGTCCTGGT CGTCATGGTG
61 TGGTATTCCA TCTCCCGGGA AGACAGGTAC ATCGAGCTTT TTTATTTTCC CATCCCAGAG
121 AAGAAGGAGC CGTGCCTCCA GGGTGAGGCA GAGAGCAAGG CCTCTAAGCT CTTTGGCAAC
181 TACTCCCGGG ATCAGCCCAT CTTCCTGCGG CTTGAGGATT ATTTCTGGGT CAAGACGCCA
241 TCTGCTTACG AGCTGCCCTA TGGGACCAAG GGGAGTGAGG ATCTGCTCCT CCGGGTGCTA
301 GCCATCACCA GCTCCTCCAT CCCCAAGAAC ATCCAGAGCC TCAGGTGCCG CCGCTGTGTG
361 GTCGTGGGGA ACGGGCACCG GCTGCGGAAC AGCTCACTGG GAGATGCCAT CAACAAGTAC
421 GATGTGGTCA TCAGATTGAA CAATGCCCCA GTGGCTGGCT ATGAGGGTGA CGTGGGCTCC
481 AAGACCACCA TGCGTCTCTT CTACCCTGAA TCTGCCCACT TCGACCCCAA AGTAGAAAAC
541 AACCCAGACA CACTCCTCGT CCTGGTAGCT TTCAAGGCAA TGGACTTCCA CTGGATTGAG
601 ACCATCCTGA GTGATAAGAA GCGGGTGCGA AAGGGTTTCT GGAAACAGCC TCCCCTCATC
661 TGGGATGTCA ATCCTAAACA GATTCGGATT CTCAACCCCT TCTTCATGGA GATTGCAGCT
721 GACAAACTGC TGAGCCTGCC AATGCAACAG CCACGGAAGA TTAAGCAGAA GCCCACCACG
781 GGCCTGTTGG CCATCACGCT GGCCCTCCAC CTCTGTGACT TGGTGCACAT TGCCGGCTTT
841 GGCTACCCAG ACGCCTACAA CAAGAAGCAG ACCATTCACT ACTATGAGCA GATCACGCTC
901 AAGTCCATGG CGGGGTCAGG CCATAATGTC TCCCAAGAGG CCCTGGCCAT TAAGCGGATG
961 CTGGAGATGG GAGCTATCAA GAACCTCACG TCCTTCTGA
Secuencia de proteínas de ST3GAL4
1 MCPAGWKLLA MLALVLWMV WYSISREDRY IELFYFPIPE KKEPCLQGEA ESKASKLFGN
61 YSRDQPIFLR LEDYFWVKTP SAYELPYGTK GSEDLLLRVL AITSSSIPKN IQSLRCRRCV
121 WGNGHRLRN SSLGDAINKY DWIRLNNAP VAGYEGDVGS KTTMRLFYPE SAHFDPKVEN
181 NPDTLLVLVA FKAMDFHWIE TILSDKKRVR KGFWKQPPLI WDVNPKQIRI LNPFFMEIAA
241 DKLLSLPMQQ PRKIKQKPTT GLLAITLALH LCDLVHIAGF GYPDAYNKKQ TIHYYEQITL
301 KSMAGSGHNV SQEALAIKRM LEMGAIKNLT SF
Cadena alfa de hCG optimizada
Secuencia de nucleótidos de la cadena alfa de hCG optimizada (SEQ ID NO: 4)
1 GCCCCTGACG TGCAGGACTG CCCCGAGTGC ACCCTGCAGG AAAACCCCTT CTTCAGCCAG
61 CCTGGCGCCC CTATCCTGCA GTGCATGGGC TGCTGCTTCA GCAGAGCCTA CCCCACCCCC
121 CTGCGGAGCA AGAAAACCAT GCTGGTGCAG AAAAACGTGA CCAGCGAGAG CACCTGCTGC
181 GTGGCCAAGA GCTACAACCG GGTGACCGTG ATGGGCGGCT TCAAGGTGGA GAACCACACC
241 GCCTGCCACT GCAGCACCTG CTACTACCAC AAGTCCT
Secuencia de proteínas de la cadena alfa de hCG optimizada
1 APDVQDCPEC TLQENPFFSQ PGAPILQCMG CCFSRAYPTP LRSKKTMLVQ KNVTSESTCC
61 VAKSYNRVTV MGGFKVENHT ACHCSTCYYH KS
Polipéptido alfa de hCG
Número de acceso AH007338
Secuencia de nucleótidos de alfa de hCG (SEQ ID NO: 5)
1 ATGGATTACT ACAGAAAATA TGCAGCTATC TTTCTGGTCA CATTGTCGGT GTTTCTGCAT
61 GTTCTCCATT CCGCTCCTGA TGTGCAGGAT TGCCCAGAAT GCACGCTACA GGAAAACCCA
121 TTCTTCTCCC AGCCGGGTGC CCCAATACTT CAGTGCATGG GCTGCTGCTT CTCTAGAGCA
181 TATCCCACTC CACTAAGGTC CAAGAAGACG ATGTTGGTCC AAAAGAACGT CACCTCAGAG
241 TCCACTTGCT GTGTAGCTAA ATCATATAAC AGGGTCACAG TAATGGGGGG TTTCAAAGTG
301 GAGAACCACA CGGCGTGCCA CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCTTA A Secuencia de proteínas de alfa de hCG
Claims (8)
1. Una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 1; o una secuencia de ácido nucleico con al menos un 97% de identidad de secuencia con el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1.
2. Una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 4; o una secuencia de ácido nucleico con al menos un 97% de identidad de secuencia con el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4.
3. Una célula caracterizada por que comprende integrada en su genoma una secuencia que codifica la cadena a de hCG seleccionada de entre: una secuencia según la SEQ ID NO: 1; una secuencia que tiene al menos un 96,5% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 1; una secuencia que tiene al menos un 97% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 1; una secuencia según la SEQ ID NO: 4; una secuencia que tiene al menos un 96,5% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 4; y una secuencia que tiene al menos un 97% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 4.
4. Una célula según la reivindicación 3, que es una célula PER.C6®.
5. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, caracterizada por que además comprende integrado en su genoma un ADNc que codifica alfa-2,3-sialiltransferasa.
6. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizada por que además comprende integrada en su genoma una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena p de hCG.
7. Un procedimiento para producir proteína recombinante en una célula que comprende cultivar una célula según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 en un medio adecuado y recolectar la proteína recombinante de dicha célula y/o dicho medio.
8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que la proteína recombinante es hCG.
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