EA034022B1

EA034022B1 - Способ получения гонадотропина

Info

Publication number: EA034022B1
Application number: EA201791724A
Authority: EA
Inventors: Даниель Плаксин; Айелет Гринхют
Original assignee: Ферринг Б.В.
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2019-12-19
Also published as: SI3286209T1; EA201791724A1; IL253694B; PT3286209T; US20180127477A1; RS61163B1; CL2017002661A1; SG11201706832PA; ES2837111T3; MA41949A; HK1246325A1; AU2016251314A1; CA2975449A1; CN107532172A; DK3286209T3; HUE051879T2; CN114107315A; LT3286209T; KR102658666B1; US10464984B2

Abstract

Клетка-хозяин, отличающаяся тем, что она содержит интегрированную в ее геном последовательность, кодирующую α-цепь хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), и применение клетки-хозяина для получения рекомбинантного ХГЧ.

Description

Изобретение относится к гонадотропинам для применения в лечении бесплодия. В частности, оно относится к хорионическому гонадотропину человека (ХГЧ).

Г онадотропины представляют собой группу гетеродимерных гликопротеиновых гормонов, которые регулируют гонадную функцию у мужчин и женщин. Они включают фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ) и хорионический гонадотропин (ХГ).

Хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) выделяется главным образом человеческой плацентой во время беременности и обеспечивает сохранение желтого тела. ХГЧ содержит альфа-субъединицу (α-цепь) из 92 аминокислот, также свойственную другим гликопротеиновым гормонам ЛГ и ФСГ, и бета-субъединицу (β-цепь) из 145 аминокислот, присущую только ХГЧ, которая определяет специфичность гормона. Каждая субъединица подвергается посттрансляционной модификации путем добавления сложных углеводных остатков. Альфа-субъединица содержит сайты 2-Ы-связанного гликозилирования на аминокислотах 52 и 78, и бета-субъединица содержит сайты 2-Ы-связанного гликозилирования на аминокислотах 13 и 30 и четыре сайта O-связанного гликозилирования на аминокислотах 121, 127, 132 и 138.

ХГЧ, экстрагированный из мочи беременных женщин [Choragon (Ferring)], использовали в течение многих лет в лечении бесплодия. Получение ХГЧ, экстрагированного из мочи, включает сбор и переработку больших количеств мочи. Для применения в лечении бесплодия также доступен Ovitrelle (Serono), представляющий собой рекомбинантный вариант ХГЧ. Этот рекомбинантный продукт экспрессируется в клетках яичника китайского хомячка (СНО) и имеет фармакокинетический профиль, отличный от ХГЧ, полученного из мочи человека.

Наблюдается значительная гетерогенность, связанная с препаратами ХГЧ, которая имеет отношение к различиям в количествах различных присутствующих изоформ. Отдельные изоформы ХГЧ демонстрируют идентичные аминокислотные последовательности, но различаются по степени посттрансляционной модификации; конкретные изоформы отличаются гетерогенностью структур углеводных ветвей и включением отличающихся количеств сиаловой кислоты (концевой сахар), то и другое оказывает влияние на удельную биоактивность изоформы.

Гликозилирование препаратов рекомбинантного ХГЧ (рХГЧ) отражает диапазон гликозилтрансфераз, имеющихся в клеточной линии хозяина. Современный препарат рХГЧ, Ovitrelle, продуцируется сконструированными клетками яичника китайского хомячка (клеток СНО). Диапазон модификаций гликана у рХГЧ, полученного из клеток СНО, более ограничен, чем диапазон, обнаруженный в натуральных продуктах, полученных из мочи. Примеры пониженной гетерогенности гликана, обнаруженной у рХГЧ, полученного из СНО, включают недостаток глюкозамина в точках ветвления и пониженное содержание фукозилирования ядра и ацетиллактозаминовых удлинений. Кроме того, клетки СНО способны присоединять сиаловую кислоту, используя только а2,3-сцепление (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al.., 1990).

ХГЧ из мочи человека (т.е. ХГЧ, экстрагированный из мочи беременных женщин), который до сих пор использовался в лечении бесплодия, представляет собой, в действительности, плацентарный ХГЧ; ХГЧ, продуцированный в (человеческой) плаценте и затем выделенный в мочу. Этот ХГЧ экстрагируют из мочи для применения в качестве фармацевтического продукта. Bousfield et al. (Rev. Endocr. Metab. Disord. (2011) 12:289-302) констатируют, что в то время как гипофизарные гонадотропины имеют как α2,3-, так и а2,6-связанную сиаловую кислоту, плацентарный ХГЧ и рекомбинантный гонадотропин, продуцированные в клетках яичника китайского хомячка, имеют только а2,3-связанную сиаловую кислоту. Таким образом, ХГЧ из мочи человека (который продуцируется в плаценте) включает только а2,3-сиалирование (подобно рекомбинантным продуктам, произведенным клеточной линией СНО). Таким образом, известные фармацевтические композиции, которые включают ХГЧ, включают только а2,3-связанную сиаловую кислоты, но не включают а2,6-связанную сиаловую кислоту.

Было продемонстрировано, что препарат рекомбинантного ФСГ (Organon) отличается количествами ФСГ с изоэлектрической точкой (pl) ниже 4 (рассматриваются кислые изоформы) при сравнении с гипофизарным, сывороточным ФСГ или ФСГ из мочи женщины в постменопаузе (Ulloa-Aguirre et al. 1995). Количество кислых изоформ в препаратах ФСГ из мочи было значительно больше по сравнению с рекомбинантными препаратами, Gonal-f (Serono) и Puregon (Organon) (Andersen et al. 2004). Это должно отражать более низкое молярное содержание сиаловой кислоты в rFSH, так как содержание отрицательно заряженного гликана, модифицированного сульфатом, является низким в ФСГ. Более низкое содержание сиаловой кислоты по сравнению с природным ФСГ является особенностью обоих препаратов ФСГ, имеющихся в продаже, и по этой причине должно отражать ограничение в процессе изготовления (Bassett and Driebergen, 2005). Время существования ФСГ в кровеносной системе было подтверждено документально для веществ из различных источников. Некоторые из этих веществ были разделены на фракции на основе суммарного заряда молекулы, который характеризуется ее pl, в котором большая кислотность приравнивается к более высокому отрицательному заряду. Основной вклад в суммарный заряд молекулы вносит общее содержание сиаловых кислот каждой молекулы ФСГ. Например, rFSH (Organon) имеет содержание сиаловой кислоты в размере около 8 моль/моль, тогда как полученный из мочи ФСГ

- 1 034022 имеет более высокое содержание сиаловой кислоты (de Leeuw et al., 1996). Соответствующие скорости выведения из плазмы у крысы равняются 0,34 и 0,14 мл/мин (Ulloa-Aguirre et al., 2003). В другом примере, когда образец рекомбинантного ФСГ разделяли на фракции с высоким и низким pl, in vivo активность фракции с высоким pI (более низкое содержание сиаловой кислоты) снижалась, и она имела более короткий период полувыведения из плазмы (D'Antonioet al., 1999). Авторы изобретения обнаружили, что, как и в случае с ФСГ, известный препарат рекомбинантного ХГЧ, полученный из СНО (например Ovitrelle), также имеет более низкое количество ХГЧ с изоэлектрической точкой (pl) ниже 4 (рассматриваются кислые изоформы), чем ХГЧ, полученный из мочи, что также отражает более низкое содержание сиаловой кислоты известного препарата рХГЧ по сравнению с ХГЧ из мочи.

Авторы изобретения разработали полученный из человеческих клеток рекомбинантный ХГЧ (т.е. рекомбинантный ХГЧ, который продуцируется или экспрессируется в человеческой клеточной линии, например изготовленной путем конструирования человеческий клеточной линии), который имеет более кислый профиль, чем препарат рХГЧ, полученный из клеточной линии СНО, Ovitrelle, и который имеет более высокое содержание сиаловой кислоты. Этот рХГЧ является объектом международной заявки на патент № PCT/GB2010/001854, опубликованной как WO 2011/042688. Рекомбинантный ХГЧ со смесью α2,3 и а2,6-связанной сиаловой кислоты получали путем конструирования человеческой клеточной линии для экспрессии как рХГЧ, так и а2,3-сиалилтрансферазы. Экспрессированный продукт является очень кислым и имеет содержание сиаловой кислоты [выраженное в виде отношения молей сиаловой кислоты к молям белка], например, 19,1 моль/моль и содержит смесь как α2,3-, так и а2,6-связанных сиаловых кислот; причем последняя обеспечивается действием эндогенной сиалилтрансферазы. В исследовании авторов изобретения указано, что тип сцепления сиаловой кислоты, α2,3- или α2,6-, может иметь очень сильное влияние на биологическое выведение ХГЧ. Человеческие клеточные линии, в отличие от клеточных линий СНО, могут экспрессировать рекомбинантный ХГЧ с сиаловыми кислотами, присоединенными посредством как α2,3, так и α2,6 сцеплений.

Клеточная линия согласно WO 2011/042688 хорошо экспрессирует полученный из человеческих клеток рекомбинантный ХГЧ. Однако эта клеточная линия также экспрессирует относительно высокий уровень свободной β-цепи (свободной бета-субъединицы), и требовалась очистка (для удаления этой свободной β-цепи из продукта ХГЧ).

В настоящее время авторы изобретения разработали новую клеточную линию, которая экспрессирует рХГЧ и а2,3-сиалилтрансферазу и продуцирует рХГЧ с пониженным количеством свободной β-цепи, тем самым улучшая выход и снижая уровень требуемой очистки продукта (см. фиг. 7).

Согласно настоящему изобретению предложена клетка (например клетка-хозяин), отличающаяся тем, что она содержит интегрированную в ее геном последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующую α-цепь ХГЧ, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 1; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 96,5% с последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 96,5% идентичность последовательности SEQ ID NO: 1); последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% (например, гомологию по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности (например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) SEQ ID NO: 1); последовательности SEQ ID NO: 4; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 96,5% с последовательностью SEQ ID NO: 4 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 96,5% идентичность последовательности SEQ ID NO: 4); и последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% (например, гомологию по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с последовательностью SEQ ID NO: 4 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности (например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) SEQ ID NO: 4). Предпочтительно последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующая α-цепь ХГЧ, не является последовательностью, которая внесена в банк данных в виде АН007338 (т.е. предпочтительно последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующая α-цепь ХГЧ, не является последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 5). Клетка может дополнительно содержать интегрированную в ее геном кДНК, кодирующую а-2,3-сиалилтрансферазу, например последовательность SEQ ID NO: 3. Клетка может дополнительно содержать интегрированную в ее геном последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующую β-цепь ХГЧ, например последовательность SEQ ID NO: 2.

Клетка-хозяин может представлять собой, например, клетку PER.C6®, клетку НТ1080, клетку GT-5s и так далее. Предпочтительно клетка представляет собой клетку PER.C6®, такую как клетка PER.C6®, депонированная под № 96022940 в ЕСАСС (Европейской коллекции клеточных культур животных).

Согласно настоящему изобретению предложена клетка PER.C6®, такая как клетка PER.C6®, депонированная под № 96022940 в ЕСАСС, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит интегрированную в ее геном последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующую α-цепь ХГЧ. Последова

- 2 034022 тельность (нуклеиновой кислоты), кодирующая α-цепь ХГЧ, может быть выбрана из последовательности согласно SEQ ID NO: 1; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 90% с последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID NO: 1); последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% (например, гомологию по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности (например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) SEQ ID NO: 1); последовательности SEQ ID NO: 4; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 90% с последовательностью SEQ ID NO: 4 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID NO: 4); и последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% (например, гомологию по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с последовательностью SEQ ID NO: 4 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности (например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) SEQ ID NO: 4). Предпочтительно последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующая α-цепь ХГЧ, не является последовательностью, которая внесена в банк данных виде АН007338. Клетка может дополнительно содержать интегрированную в ее геном кДНК, кодирующую а-2,3-сиалилтрансферазу, например последовательность согласно SEQ ID NO: 3. Клетка может дополнительно содержать интегрированную в ее геном последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующую β-цепь ХГЧ, например последовательность согласно SEQ ID NO: 2.

Следует понимать, что термин последовательность, кодирующая α-цепь ХГЧ или последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующая α-цепь ХГЧ, используемый в этом документе, также относится к последовательности, кодирующей α-цепь ФСГ (или к последовательности, кодирующей α-цепь ЛГ), так как α-цепь ХГЧ является точно такой же, как и α-цепь для ФСГ (и ЛГ).

Термин последовательность нуклеиновой кислоты в этом документе относится к любой молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептиды, такие как пептиды, белки и так далее. Эти молекулы нуклеиновых кислот могут быть образованы ДНК, РНК или их аналогами. Однако молекулы нуклеиновой кислоты, которые образованы ДНК, являются предпочтительными.

Специалист в данной области техники понимает, что модификация исходной нуклеотидной последовательности описывает процесс оптимизации в отношении частоты использования кодона. Включенные замены можно легко идентифицировать путем сравнения модифицированной последовательности и исходной последовательности. Кроме того, обе последовательности (т.е. исходная последовательность и оптимизированная последовательность) будут кодировать одну и ту же аминокислотную последовательность.

Аминокислотная последовательность α-цепи человеческого ХГЧ раскрыта в WO 2011/042688 (в этом документе называется SEQ ID NO: 1) и описана у Fiddes and Goodman 1979. Она внесена в банк данных под № АН007388 и показана в виде SEQ ID NO: 5 ниже. Аминокислотная последовательность β-цепи человеческого ХГЧ отображена в SEQ ID NO: 2 и внесена в банк данных в виде NP_000728. Эти аминокислотные последовательности соответствуют аминокислотным последовательностям дикого типа α- и β-цепи человеческого ХГЧ. Термины последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа или исходная последовательность нуклеиновой кислоты для целей настоящего изобретения относятся к последовательности нуклеиновой кислоты, которая предназначена для использования для (сверх)экспрессии в клетке-хозяине и которая не была адаптирована к частоте использования кодона в клетке-хозяине, но представляет собой действительную последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа, кодирующую белок. Термин оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты для целей настоящего изобретения относится к последовательности, которая была модифицирована для экспрессии в клетке-хозяине путем адаптации последовательности к немодифицированной/исходной последовательности нуклеиновой кислоты. Оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок, имеющий такую же аминокислотную последовательность как белок, кодированный немодифицированной последовательностью. Заявители разработали оптимизированную последовательность, которая кодирует α-цепь ХГЧ (см., например, SEQ ID NO: 1 и 4, фиг. 1).

Согласно настоящему изобретению в еще одном аспекте предложена полинуклеотидная последовательность (например, полинуклеотидная последовательность, кодирующая α-цепь ХГЧ), содержащая последовательность, выбранную из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1; последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4; последовательности нуклеиновой кислоты с гомологией по меньшей мере 97% (например, с гомологией по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с нуклеиновой кислотой SEQ ID NO: 1 (например, последовательности нуклеиновой кислоты с по меньшей мере 97% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности) нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1); и последовательности нуклеиновой кислоты с гомологией по меньшей мере 97% (например, с гомологией по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с нуклеиновой кислотой SEQ ID NO: 4 (например, последовательности

- 3 034022 нуклеиновой кислоты с по меньшей мере 97% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности) нуклеиновой кислоты

SEQ ID NO: 4).

Согласно настоящему изобретению в еще одном аспекте предложен способ получения рекомбинантного ХГЧ в клетке, включающий культивирование клетки в подходящей среде и выделение рекомбинантного белка (ХГЧ) из указанной клетки и/или указанной среды (например, выделение рекомбинантного ХГЧ из супернатанта клеточной культуры), где клетка (клетка-хозяин) содержит интегрированную в ее геном последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующую α-цепь ХГЧ, выбранную из: последовательности SEQ ID NO: 1; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 90% с последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID NO: 1); последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) SEQ ID NO: 1); последовательности SEQ ID NO: 4; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 90% с последовательностью SEQ ID NO: 4 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID NO: 4); и последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с последовательностью SEQ ID NO: 4 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) SEQ ID NO: 4). Предпочтительно последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующая α-цепь ХГЧ, не представляет собой последовательность, которая внесена в банк данных в виде АН007338. Клетка может дополнительно содержать интегрированную в ее геном кДНК, кодирующую альфа-2,3-сиалилтрансферазу, например последовательность согласно SEQ ID NO: 3. Клетка может дополнительно содержать интегрированную в ее геном последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующую β-цепь ХГЧ, например последовательность согласно SEQ ID NO: 2. Способ может включать дополнительную стадию или стадии очистки рекомбинантного ХГЧ, полученного из указанной клетки и/или указанной среды (например, очистку рекомбинантного ХГЧ от супернатанта клеточной культуры).

Клетка (хозяин) может представлять собой, например, клетку PER.C6®, клетку НТ1080, клетку GT-5s и т.д. Предпочтительно клетка представляет собой клетку PER.C6®, такую как клетка PER.C6®, депонированная под № 96022940 в ЕСАСС.

Согласно настоящему изобретению в еще одном аспекте предложен способ получения рекомбинантного ХГЧ в клетке, включающий культивирование клетки в подходящей среде и выделение рекомбинантного белка (ХГЧ) из указанной клетки и/или указанной среды (включает получение рекомбинантного ХГЧ из супернатанта клеточной культуры), где клетка представляет собой клетку PER.C6® (такую как клетка PER.C6®, депонированная под № 96022940 в ЕСАСС), содержащую интегрированную в ее геном последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующую α-цепь ХГЧ. Последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующая α-цепь ХГЧ, может быть выбрана из: последовательности SEQ ID NO: 1; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 90% с последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID NO: 1); последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) SEQ ID NO: 1); последовательности SEQ ID NO: 4; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 90% с последовательностью SEQ ID NO: 4 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID NO: 4); и последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с последовательностью SEQ ID NO: 4 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) SEQ ID NO: 4). Предпочтительно последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующая α-цепь ХГЧ, не представляет собой последовательность, которая внесена в банк данных как АН007338. Клетка может дополнительно содержать интегрированную в ее геном кДНК, кодирующую α-2,3-сиалилтрансферазу, например последовательность согласно SEQ ID NO: 3. Клетка может дополнительно содержать интегрированную в ее геном последовательность (нуклеиновой кислоты), кодирующую β-цепь ХГЧ, например последовательность согласно SEQ ID NO: 2. Способ может включать дополнительную стадию или стадии очистки рекомбинантного ХГЧ, полученного из указанной клетки и/или указанной среды (например, очистку рекомбинантного ХГЧ от супернатанта клеточной культуры).

Термин клетка-хозяин для целей настоящего изобретения относится к любой клетке, которую обычно используют для экспрессии, т.е. транскрипции и трансляции последовательностей нуклеиновой кислоты, для продуцирования, например, полипептидов. В частности, термин клетка-хозяин или орга- 4 034022 низм относится к клеткам прокариот, низших эукариот, растений, насекомых или к системам культивирования клеток млекопитающих. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, более предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку человека, еще более предпочтительно клетку PERC6®.

Предполагается, что термин рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты в понимании настоящего изобретения содержит все виды молекул нуклеиновых кислот, которые могут быть введены в клетку-хозяина и могут осуществлять экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты. Термин включает, например, плазмидные векторы и вирусные векторы (например, аденовирусные, лентивирусные и ретровирусные векторы), которые хорошо известны в данной области техники.

Согласно настоящему изобретению в еще одном аспекте предложена рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая (первую) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь ХГЧ, которая (первая) последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из последовательности SEQ ID NO: 1; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 96,5% с последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 96,5% идентичность последовательности SEQ ID NO: 1); последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) SEQ ID NO: 1); последовательности SEQ ID NO: 4; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 96,5% с последовательностью SEQ ID NO: 4 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 96,5% идентичность последовательности SEQ ID NO: 14; и последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с последовательностью SEQ ID NO: 4 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) SEQ ID NO: 4). Предпочтительно рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты этого аспекта настоящего изобретения содержит как оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь человеческого ХГЧ, так и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь ХГЧ. Предпочтительно (первая) последовательность нуклеиновой кислоты находится под контролем промотора, который действует в клетке-хозяине. Предпочтительно рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь ХГЧ. Вторая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь ХГЧ, может представлять собой последовательность согласно SEQ ID No. 2.

Вторая последовательность нуклеиновой кислоты может находиться под контролем отдельного промотора, который действует в клетке-хозяине. Первая последовательность нуклеиновой кислоты и/или вторая последовательность нуклеиновой кислоты могут находиться под контролем вирусного промотора (т.е. например CMV (цитомегаловирусного) промотора).

Согласно настоящему изобретению в еще одном аспекте предложена клетка-хозяин, содержащая или включающая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, как изложено выше (содержит клетку-хозяина, содержащую рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую (первую) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь ХГЧ, которая (первая) последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из последовательности SEQ ID NO: 1; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 96,5% с последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 96,5% идентичность последовательности SEQ ID NO: 1); последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) SEQ ID NO: 1); последовательности SEQ ID NO: 4; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 96,5% с последовательностью SEQ ID NO: 4 (например, последовательности, которая имеет по меньшей мере 96,5% идентичность последовательности SEQ ID NO: 4); и последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) с последовательностью SEQ ID NO: 4 (например, последовательность, которая имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности (по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) SEQ ID NO: 4).

Авторы изобретения обнаружили, что клетки (клетки-хозяева), клеточные линии, включающие эти клетки-хозяева, рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, полинуклеотиды и способы по изобретению могут продуцировать рекомбинантный ХГЧ с высоким выходом и чистотой (например, с небольшим количеством свободной β-цепи).

Согласно настоящему изобретению в еще одном аспекте предложен рекомбинантный ХГЧ (рХГЧ или рекХГЧ), который включает α2,3- и а2,6-сиалирование, где рекомбинантный ХГЧ получен в клетке, как описано и заявлено в настоящем изобретении. Рекомбинантный ХГЧ может иметь содержание

- 5 034022 сиаловой кислоты [выраженное в виде отношения молей сиаловой кислоты к молям белка] от 12 до моль/моль, например от 12 до 15,5 моль/моль, например от 12 до 14,9 моль/моль. рХГЧ (или препарат рХГЧ) может иметь содержание сиаловой кислоты от 12,5 до 14,5 моль/моль, например содержание сиаловой кислоты от 12,8 до 13,2 моль/моль. рХГЧ (или препарат рХГЧ) согласно изобретению может иметь содержание сиаловой кислоты 13 моль/моль.

В примерах изобретения рХГЧ может содержаться в виде одной изоформы или в виде смеси изоформ.

Рекомбинантный ХГЧ (или препарат рХГЧ), полученный посредством способов и клеток по изобретению, включает α2,3- и а2,6-сиалирование. Под сиалированием подразумевается количество остатков сиаловой кислоты, имеющихся в углеводных структурах ХГЧ. а2,3-сиалирование означает сиалирование в 2,3-положении (которое хорошо известно в данной области техники); и а2,6-сиалирование означает сиалирование в 2,6-положении (также хорошо известное в данной области техники). Таким образом, в этом документе формулировка % общего сиалирования может представлять собой а2,3-сиалирование относится к % общего количества остатков сиаловой кислоты, имеющихся в ХГЧ, которые сиалированы в 2,3-положении. Термин % общего сиалирования, представляющего собой а2,6-сиалирование относится к % общего количества остатков сиаловой кислоты, имеющихся в ХГЧ, которые сиалированы в 2,6-положении. Термин % общего сиалирования, представляющего собой а2,8-сиалирование относится к % общего количества остатков сиаловой кислоты, имеющихся в ХГЧ, которые сиалированы в 2,8-положении.

рХГЧ (или препарат рХГЧ), полученный посредством способов и клеток согласно изобретению, может иметь от 1 до 99% общего сиалирования, представляющего собой а2,3-сиалирование. рХГЧ (или препарат рХГЧ), полученный посредством способов и клеток согласно изобретению, может иметь от 1% до 90% общего сиалирования, представляющего собой а2,3-сиалирование. рХГЧ (или препарат рХГЧ) согласно изобретению может иметь 10% или более общего сиалирования, представляющего собой а2,3-сиалирование, например от 10 до 90% общего сиалирования может представлять собой а2,3-сиалирование. Например, 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80 или 90% или более общего сиалирования может представлять собой а2,3-сиалирование. От 45 до 80% общего сиалирования может представлять собой а2,3-сиалирование, например от 50 до 70% общего сиалирования может представлять собой а2,3-сиалирование, например от 55 до 65% общего сиалирования может представлять собой а2,3-сиалирование. рХГЧ (или препарат рХГЧ) может включать а2,3-сиалирование в количестве, которое составляет от 65 до 95% общего сиалирования, например от 70 до 90% общего сиалирования, например от 85 до 90% общего сиалирования.

рХГЧ (или препарат рХГЧ), полученный посредством способов и клеток по изобретению, может иметь 1-99% общего сиалирования, представляющего собой а2,6-сиалирование. рХГЧ (или препарат рХГЧ) по изобретению может иметь от 5 до 50% общего сиалирования, представляющего собой а2,6-сиалирование. Например, от 5 до 45%, например, от 6 до 40%, например, от 7 до 30%, например, от 8 до 20% общего сиалирования может представлять собой а2,6-сиалирование. рХГЧ (или препарат рХГЧ) может включать а2,6-сиалирование в количестве, которое составляет от 20 до 75% общего сиалирования, например 30-60% общего сиалирования, например 35-45% общего сиалирования. рХГЧ (или препарат рХГЧ) может включать а2,6-сиалирование в количестве, которое составляет от 5 до 35% общего сиалирования, например от 10 до 20% общего сиалирования. Например, 11-55% общего сиалирования может представлять собой а2,6-сиалирование.

рХГЧ или препарат рХГЧ, полученный посредством способов и клеток по изобретению, может возможно дополнительно включать а2,8-сиалирование. рХГЧ (или препарат рХГЧ) по изобретению может иметь 5% или менее общего сиалирования, представляющего собой а2,8-сиалирование, например от 0 до 4%, например 0,1-4% общего сиалирования может представлять собой а2,8-сиалирование. рХГЧ (или препарат рХГЧ) по изобретению может не иметь а2,8-сиалирование.

рХГЧ (или препарат рХГЧ), полученный посредством способов и клеток согласно изобретению, может иметь содержание сиаловой кислоты (количество сиалирования на молекулу ХГЧ) (на основе массы белка, а не масс белка плюс углеводов) 6% или более (например, от 6 до 15%, например от 7 до 13%, например от 8 до 12%, например от 11 до 15%, например от 12 до 14%) по массе.

рХГЧ (или препарат рХГЧ) может продуцироваться или экспрессироваться в клеточной линии человека, например клеточной линии PER.C6®, клеточной линии НТ1080 и так далее. рХГЧ (или препарат рХГЧ) может продуцироваться или экспрессироваться в полученной из человеческих клеток клеточной линии или в модифицированной клеточной линии человека, например, полученной из клеточной линии PER.C6®, или модифицированной клеточной линии PER.C6®, модифицированной клеточной линии НТ1080 или из клеточной линии, полученной из НТ1080, и так далее. В предпочтительном примере рХГЧ продуцируется или экспрессируется в клеточной линии PER.C6®, полученной из PER.C6® клеточной линии или модифицированной клеточной линии PER.C6®. рХГЧ, который продуцируется или экспрессируется в клеточной линии человека (например, клеточной линии PER.C6®, клеточной линии

- 6 034022

НТ1080, клеточной линии GT-5s), будет включать некоторые а2,6-связанные сиаловые кислоты (а2,6-сиалирование), обеспечиваемые действием эндогенной сиалилтрансферазы [клеточной линии], и будет включать некоторые а2,3-связанные сиаловые кислоты (а2,3-сиалирование), обеспечиваемые действием эндогенной сиалилтрансферазы [клеточной линии]. Клеточная линия может быть модифицирована с использованием а2,3-сиалилтрансферазы. Альтернативно или дополнительно, клеточная линия может быть модифицирована с использованием а2,6-сиалилтрансферазы. Это делает более простым (и более эффективным) способ производства, так как манипуляция и контроль, например, среды для выращивания клеток для сохранения сиалирования, могут быть менее критическими, чем у известных процессов. Способ также может быть более эффективным, так как продуцируется небольшое количество основного рХГЧ по сравнению с продуцированием известных продуктов рХГЧ; продуцируется более кислый рХГЧ, и отделение/удаление основного ХГЧ является менее проблематичным.

рХГЧ может быть получен с использованием а2,3-сиалилтрансферазы, например продуцирован с использованием человеческой клеточной линии, модифицированной с использованием а2,3-сиалилтрансферазы. рХГЧ может включать а2,6-связанные сиаловые кислоты (а2,6-сиалирование), обеспечиваемые действием эндогенной сиалилтрансферазы. рХГЧ может быть получен с использованием α2,3- и/или а2,6-сиалилтрансферазы, например получен с использованием человеческой клеточной линии, модифицированной с использованием а2,3-сиалилтрансферазы и/или а2,6-сиалилтрансферазы.

Согласно настоящему изобретению в еще одном аспекте предложен рекомбинантный ХГЧ или препарат рекомбинантного ХГЧ, как описано в этом документе, который продуцируется или экспрессируется посредством способов, описанных в этом документе.

Структура рХГЧ содержит гликановые группировки. Разветвление может происходить таким образом, что гликан может иметь 1, 2, 3, 4 или более концевых остатков сахаров или антенн, что хорошо известно в данной области техники. рХГЧ согласно аспектам изобретения может иметь гликаны с моноантенными, и/или диантенными, и/или триантенными, и/или тетраантенными гликановыми структурами. рХГЧ может включать моноантенные, и/или биантенные, и/или триантенные, и/или тетраантенные гликановые структуры, например, в относительных количествах, как изложено ниже: от 0,1 до 3% моноантенных; от 65 до 85% биантенных; от 15 до 25% триантенных и от 0,5 до 1,5% тетраантенных (например, как показано путем WAX-анализа заряженных гликанов).

Согласно настоящему изобретению в еще одном аспекте предложена фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный ХГЧ (рХГЧ), имеющий а2,3-сиалирование и а2,6-сиалирование, где рекомбинантный ХГЧ получен посредством способов и/или клеток, раскрытых в этом документе. рХГЧ может иметь содержание сиаловой кислоты [выраженное в виде отношения молей сиаловой кислоты к молям белка] от 12 до 15,5 моль/моль, например от 12 до 14,9 моль/моль (например, как изложено выше). рХГЧ может иметь содержание сиаловой кислоты от 12,5 до 14,5 моль/моль, например содержание сиаловой кислоты от 12,8 до 13,2 моль/моль. Предпочтительно рХГЧ согласно изобретению имеет содержание сиаловой кислоты 13 моль/моль.

Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать ФСГ и/или ЛГ.

ФСГ может быть получен посредством любого способа, известного в данной области техники. ФСГ при использовании в этом документе включает полученный из человеческих клеток и рекомбинантный ФСГ. Полученный из человеческих клеток ФСГ может быть очищен от любого соответствующего источника (например, мочи) посредством любого способа известного в данной области техники. ФСГ может представлять собой рекомбинантный ФСГ, например экспрессированный в человеческой клеточной линии. Способы экспрессии и очистки рекомбинантного ФСГ хорошо известны в данной области техники.

ЛГ может быть получен посредством любого способа, известного в данной области техники. ЛГ, при использовании в этом документе, включает полученный из человеческих клеток и рекомбинантный ЛГ. Полученный из человеческих клеток ЛГ может быть очищен от любого соответствующего источника (например, мочи) посредством любого способа, известного в данной области техники. Способы экспрессии и очистки рекомбинантного ЛГ известны в данной области техники.

Фармацевтическая композиция может быть предназначена для лечения или для применения в лечении, бесплодия, например для применения, например, во вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ), стимуляции овуляции или внутриматочной инсеминации (ВМИ). Фармацевтическая композиция может быть предназначена для инициирования, или для применения в инициировании окончательного созревания/овуляции и лютеинизации, стимулировании развития фолликулов у женщин с серьезным дефицитом ЛГ и ФСГ, и/или в поддержании функции желтого тела (рХГЧ/рЛГ). Фармацевтическая композиция быть предназначена для индуцирования, или для применения в индуцировании, монофолликулярного роста у женщин с ановуляцией II типа по классификации ВОЗ (например, рХГЧ с рЛГ), для усиления мультифолликулярного ответа с помощью ЛГ-прайминга у пациенток, проходящих СГЯ (контролируемую гиперстимуляцию яичников) (например, рХГЧ с рЛГ), и для дополнения к СГЯ для улучшения коэффициентов имплантации/беременности (например, рХГЧ с рЛГ) и/или повышения коэффициентов беременности во вспомогательных репродуктивных технологиях. Фармацевтическая композиция быть

- 7 034022 предназначена для предупреждения, или для применения в предупреждении выкидышей, и/или предупреждении преждевременных родов. Фармацевтическая композиция быть предназначена для лечения, или для применения в лечении, эндометриоза.

Фармацевтическую композицию можно использовать, например, при медицинских показаниях, когда используют известные препараты ХГЧ. В настоящем изобретении также предложено применение рХГЧ и/или препарата рХГЧ, описанного здесь (согласно аспектам изобретения), для изготовления, или в изготовлении, лекарственного средства для лечения бесплодия.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены в виде хорошо известных композиций для любого пути введения лекарственного средства, например перорального, ректального, парентерального, трансдермального (например, методика с пластырями), внутривенного, внутримышечного, подкожного, интрацистернального, интравагинального, внутрибрюшинного, местного (порошки, мази или капли) или в виде буккального или назального спрея. Обычная композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, такой как водный раствор, нетоксичные эксципиенты, включая соли и консерванты, буферы и тому подобные, как описано в пятнадцатом издании Remington's Pharmaceutical Sciences (Matt Publishing Company, 1975), на стр. 1405-1412 и 1461-87 и в 14-м издании Национального формуляра XIV (American Pharmaceutical Association, 1975), среди прочего. Примеры подходящих водных и неводных фармацевтических носителей, разбавителей, растворителей или средств доставки включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и подобные), карбоксиметилцеллюлозу и их подходящие смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Композиции по настоящему изобретению также могут содержать добавки, такие как, без ограничения, консерванты, увлажняющие средства, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Антибактериальные и противогрибковые агенты могут быть включены для предупреждения роста микробов и включают, например, м-крезол, бензиловый спирт, парабен, хлорбутанол, фенол, сорбиновую кислоту и тому подобные. Кроме того, может быть желательно включать изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и тому подобные.

В некоторых случаях для осуществления пролонгированного действия желательно замедлять поглощение ХГЧ (и других активных ингредиентов, если имеются) после подкожной или внутримышечной инъекции. Это можно осуществить путем использования жидкой суспензии кристаллического или аморфного вещества с плохой растворимостью в воде. Скорость поглощения ХГЧ тогда зависит от его скорости растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристалла и кристаллической формы. Альтернативно, отсроченное поглощение парентерально введенной комбинированной формы ХГЧ достигается путем растворения или суспендирования комбинации ХГЧ в средстве доставки в виде масла. Инъецируемые формы депо могут быть изготовлены путем образования матриц микроинкапсулирования ХГЧ (и других агентов, если имеются) в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактидполигликолид. В зависимости от отношения ХГЧ к полимеру и от природы конкретного используемого полимера скорость высвобождения ХГЧ можно регулировать. Примеры других биоразлагаемых полимеров включают поливинилпирролидон, поли(ортоэфиры), поли(ангидриды) и так далее. Инъецируемые депо-композиции также готовят путем включения ХГЧ в липосомы или микроэмульсии, которые являются совместимыми с тканями организма. Инъецируемые композиции можно стерилизовать, например, посредством фильтрации через задерживающий бактерии фильтр или путем включения стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые могут быть растворены или диспергированы в стерильной воде или другой стерильной инъецируемой среде непосредственно перед применением. Инъецируемые композиции могут поставляться в любом подходящем контейнере, например флаконе, предварительно заполненном шприце, картриджах для инъекций и т.п.

Препараты (например, инъецируемый препарат) могут поставляться в виде продукта, имеющего фармацевтические композиции, содержащие ХГЧ (возможно с ФСГ, ЛГ и т.д.). Если имеет место более чем один активный ингредиент (т.е. ХГЧ и, например, ФСГ или ЛГ), они могут быть подходящими для введения раздельно или вместе. При введении раздельно введение может быть последовательным. Продукт может поставляться в любой подходящей упаковке. Например, продукт может содержать ряд предварительно заполненных шприцев или флаконов, содержащих либо ХГЧ, ФСГ, либо комбинацию и ФСГ и ХГЧ. Шприцы или флаконы могут быть упакованы в блистерную упаковку или другие средства для сохранения стерильности. Продукт может возможно содержать инструкции для применения композиций ХГЧ и ФСГ.

pH и точную концентрацию различных компонентов фармацевтической композиции регулируют в соответствии с обычной практикой в этой области. См. GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS, 7^th ed. В предпочтительном воплощении композиции по изобретению поставляются в виде композиций для парентерального введения. Обычные способы получения парентеральных композиций являются известными в данной области техники и описаны в REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, at pages 780-820. Парентеральные композиции могут поставляться в жидком препарате или в виде твердого вещества, которое будут смешивать со стерильной инъецируемой средой непосредственно перед введением. В одном воплощении парентеральные композиции поставляются в форме единицы дозирования для облегчения введения и

- 8 034022 однородности единиц дозирования.

Подробное описание изобретения

Ниже следует более подробное описание изобретения со ссылкой на следующие примеры и на прилагаемые графические материалы, в которых на фиг. 1 показаны последовательность нуклеиновой кислоты и последовательность с дериватизированными аминокислотами оптимизированной «.-последовательности ХГЧ;

на фиг. 2 - последовательность нуклеиновой кислоты и последовательность с дериватизированными аминокислотами β-последовательности ХГЧ;

на фиг. 3 - последовательность нуклеиновой кислоты и последовательность с дериватизированными аминокислотами ST3GAL4;

на фиг. 4 - плазмидная карта для вектора экспрессии α/β пХГЧ (phCG);

на фиг. 5 - вектор экспрессии «2,3-сиалилтрансферазы (ST3GAL4);

на фиг. 6 - детекция изоформ рХГЧ, окрашенных Кумасси синим, посредством IEF (изоэлектрического фокусирования) в композициях по изобретению (дорожки 4, 5, 6 и 7, 15 мкг на дорожку); в произведенной в СНО композиции известного уровня техники, Ovitrelle (дорожка 2, 15 мкг); и в человеческом продукте, полученном из мочи беременных женщин Novarel (дорожка 3, 15 мкг); маркер ИЭФ (дорожка 1 (pl сверху: 7,0, 6,8, 6,5, 6,0, 5,1 и 4,75 соответственно); и на фиг. 7 сопоставляется концентрация ХГЧ (альфа-β ХГЧ) и свободной β-цепи (бета ХГЧ), продуцированной с применением клеток по изобретению, включая оптимизированную нуклеиновую последовательность альфа-субъединицы, в сравнении с концентрацией ХГЧ (альфа-бета ХГЧ) и свободной β-цепи (бета ХГЧ), продуцированной в клетках сравнительного примера, включая альфасубъединицу ДТ (дикого типа).

Примеры 1-7.

Обзор процесса создания клеточной линии.

Отдельную плазмиду, несущую α- и β-цепи ХГЧ, где каждая управляется отдельным промотором CMVie, трансфицировали в клетки PER.C6® путем электропорации.

Эта плазмида несла устойчивую к неомицину генную кассету (фиг. 4), позволяющую осуществлять селекцию трансфектантов, используя G418 (Geneticin). Пулы трансфектантов выращивали и затем подвергали клонированию методом серийных разведений в 96-луночных планшетах при селекции с G418. Клональные линии выращивали и колонии с высокой экспрессией идентифицировали на основе титра ХГЧ в супернатанте клеточной культуры.

Выбирали пять основных клонов, основываясь на высокой продуктивности, и затем каждый трансфицировали второй плазмидой, экспрессирующей ген «2,3-сиалилтрансферазы ST3GAL4, а также с селективным маркером гигромицина (фиг. 5). Каждый из пяти трансфекционных пулов выращивали и супернатанты клеточных культур оценивали на концентрацию ХГЧ и in vivo фармакокинетику (ФК).

Перспективные пулы затем подвергали новому циклу клонирования методом серийных разведений. Полученные клоны выращивали и супернатанты клеточных культур оценивали на концентрацию ХГЧ и экспонированную галактозу на белке ХГЧ (путем ИФА с использованием лектина). Клоны с низким уровнем экспонированной галактозы подвергали дополнительным анализам, включая in vivo ФК. Клоны, которые продуцировали ХГЧ с оптимальными фармакокинетическими (ФК) профилями, имеющие низкий уровень экспонированной галактозы и экспрессирующие белок с высокими уровнями, оценивали и выбирали по продуктивности и характеристикам роста.

Пример 1. Селекция последовательностей и плазмидные векторы.

Кодирующая область гена альфа-полипептида ХГЧ показана на фиг. 1. Кодирующая область гена альфа-полипептидной последовательности ХГЧ называется в этом документе SEQ ID NO: 1.

Кодирующую область гена бета-полипептида ХГЧ использовали согласно Fiddes and Goodman (1980). Последовательность внесена в банк данных как NP_000728 и согласуется с белковыми последовательностями CGbeta3, CGbeta5 и CGbeta7. Последовательность называется в этом документе SEQ ID NO: 2.

Кодирующую область гена бета-галактозид-альфа-2,3-сиалилтрансферазы 4 («2,3-сиалилтрансфераза, ST3GAL4) использовали согласно Kitagawa and Paulson (1994). Последовательность внесена в банк данных как L23767 и называется в этом документе SEQ ID NO: 3.

Использовали две плазмиды: первая, phCG, соэкспрессирует α- и β-цепи ХГЧ; и вторая экспрессирует ген сиалилтрансферазы ST3GAL4.

Пример 2а. Конструирование вектора экспрессии ХГЧ.

рХГЧ представляет собой синтетическую α-цепь ХГЧ, оптимизированную для частоты использования кодона в клетках млекопитающих, включающую нативный сигнальный пептид альфа ХГЧ. Она может быть сконструирована посредством способов, хорошо известных в данной области техники.

Кодирующую последовательность альфа-полипептида ХГЧ (SEQ ID NO: 1) и бета-полипептид ХГЧ (NP_000728, SEQ ID NO: 2) амплифицировали путем ПЦР, используя способы, хорошо известные в данной области техники (см., например, международную заявку на патент, опубликованную как

- 9 034022

WO 2011/042688). ДНК альфа рХГЧ расщепляли с помощью BamHI и NheI и вставляли в сайты BamHI и NheI на управляемом CMV векторе экспрессии млекопитающих (вектор pcDNA3002Neo, Crucell). Это располагает ген в правильной ориентации для экспрессии, управляемой промотором CMVie с сигналом полиА (полиаденилирования) гормона роста крупного рогатого скота (BGH) в прямом направлении. Нативный ген бета ХГЧ, включающий нативный сигнальный пептид, расщепляли с помощью рестриктаз AscI и HpaI и вставляли в сайты AscI и HpaI так, чтобы экспрессия могла управляться вторым промотором CMVie с дополнительным сигналом полиА BGH в прямом направлении. Каркас вектора также включал маркер устойчивости к неомицину, а также элементы, требующиеся для селекции и репликации в прокариотических клетках. Вектор амплифицировали и секвенировали, используя общепринятые способы, известные в данной области техники. Последовательности оптимизированной α-цепи ХГЧ и нативной (дикого типа) β-цепи изображены на фиг. 1 и 2 соответственно.

Все колонии, выбранные для секвенирования, содержали правильные последовательности согласно SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Плазмидные A+B рХГЧ селектировали для трансфекции (фиг. 4).

Пример 2б. Конструирование вектора экспрессии ST3.

Ген ST3GAL4 экспрессируется в pST3. Кодирующую последовательность бета-галактозид-альфа2,3-сиалилтрансферазы 4 (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3, фиг. 3) амплифицировали путем ПЦР, используя комбинацию праймеров 2,3STfw и 2,3STrev.

2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3' 2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3'

Полученную амплифицированную ДНК ST3 расщепляли с помощью рестриктаз BamHI и AflII и вставляли в сайты BamHI и AflII на управляемом CMV векторе экспрессии млекопитающих, несущем маркер устойчивости к гигромицину (вектор pcDNA3002Neo), так, чтобы она располагалась в прямом направлении немедленно-раннего промотора CMV и в обратном направлении последовательности поли-А BGH. Каркас вектора также включал маркер устойчивости к гигромицину, а также элементы, требующиеся для селекции и репликации в прокариотических клетках. Вектор амплифицировали, как описано ранее, и секвенировали. Клон pST3#1 (фиг. 5) содержал правильную последовательность согласно SEQ ID NO: 3 и был селектирован для трансфекции.

Пример 3. Трансфекция плазмиды.

Плазмидный пХГЧ (фиг. 4), который имеет один сайт PvuI, расположенный в прокариотическом гене бета-лактамазы, линеаризовали с PvuI (New England Biolabs, номер по каталогу R0150). Линеаризованную плазмидную ДНК трансфицировали в клетки PER.C6® следующим образом.

Клеточные культуры поддерживали в полной среде PERMAB (CD4PERMAB (Hyclone, номер по каталогу SH30871.01), дополненной L-глутамином до конечной концентрации 3 мМ (Invitrogen, номер в каталоге 25030-123) и Pluronic F68 в конечной концентрации 1,0 г/л (Invitrogen, номер по каталогу 24040032), в 250 мл колбах Эрленмейера. Клетки поддерживали во встряхивателе-инкубаторе (KuhnerClimo-shaker ISF1-X), установленном на 100 об/мин, 5% CO₂ и 37°C, в течение по меньшей мере 14 суток до трансфекции. 3a 48 ч до трансфекции клетки переносили в свежую среду с плотностью 0,5х 10⁶ клеток/мл.

В сутки трансфекции клетки подсчитывали в Beckman Coulter ViCell XR, чтобы определить плотность клеток и убедиться, что жизнеспособность составляла не ниже 90%. Клетки собирали путем центрифугирования и ресуспендировали в свежей среде PERMAB перед смешиванием с линеаризованной ДНК рХГЧ. Смесь клетки/ДНК подвергали воздействию электрошока в камере электропоратора, установленном на 250 В, в течение 5 мс перед быстрым переносом в 10 мл предварительно нагретой среды PERMAB. Этот процесс повторяли всего 6 раз, и все 6 трансфекции объединяли в одной Т-175 см² колбу с тканевой культурой. Колбу помещали в статичный инкубатор, установленный на 37°C, 5% CO₂. Через 48 ч клетки ресуспендировали в подходящем объеме селективной PERMAB (полная среда PERMAB + G418 (125 мкг/мл)) до получения плотности жизнеспособных клеток 0,5х 10⁶/мл.

Культуру пула пассировали два раза в неделю, поддерживая клетки при плотности 0,3х10⁶ клетка/мл в селективной среде до повышения жизнеспособности клеток до выше 50%. В этот момент клетки переводили в культивирование на качалке в 250 мл колбах Эрленмейера. После нескольких недель в культивировании на качалке отбирали образцы супернатанта пула и анализировали на концентрацию ХГЧ. После того как устанавливали, что пул являлся положительным в отношении экспрессии ХГЧ, клетки готовили для клонирования методом серийных разведений.

Суспензию клеток с 0,3 жизнеспособными клетками/мл готовили в среде PERMAB, дополненной G-418 в концентрации 125 мкг/мл. Суспензию клеток дозировали/распределяли в 96-луночные планшеты для тканевой культуры с плоским дном в концентрации 200 мл/лунка и инкубировали в увлажненной атмосфере при 37°C, 5% CO₂ (Binder CB150). Планшеты регулярно сканировали, используя Genetix Clone Select Imager, для отслеживания роста клеток в каждой лунке.

Через две недели идентифицировали 535 лунок, которые содержали активно растущие колонии клеток. Отбирали образцы супернатанта из этих лунок и анализировали на ХГЧ, используя имеющийся в продаже набор (DRG diagnostics HCG ELISA, номер по каталогу EIA1469). На основе результатов этих

- 10 034022 анализов всего 162 колонии переносили в 24-луночные планшеты, содержащие 0,5 мл/лунка селективной среды PERMAB. Когда клетки в лунках стали близки к конфлюентности, отбирали образцы супернатанта из каждой из 162 лунок и анализировали на уровни ХГЧ. На основе этих результатов 91 лучше всех экспрессирующую клеточную линию выбирали для размножения в колбах Т-25. Эти клеточные линии снова выращивали до приближения к конфлюентности, момента, в который отбирали образцы супернатанта и анализировали на ХГЧ, как сказано выше. На основе этих результатов 58 лучших экспрессирующих клеточных линий выращивали в колбах Т-75. Анализ удельной скорости продуцирования (SPR) выполняли на каждой из этих 58 клеточных линиях посредством способов, известных в данной области техники, и удельную продуктивность выражали в пг/клетка/сутки.

Таким образом, в этом примере плазмиду, включающую α- и β-цепи ХГЧ, трансфицировали в клетки PER.C6®, и трансфектанты селектировали, используя среду, содержащую G418. Растущие колонии клеток проверяли на концентрацию ХГЧ в супернатанте, и колонии, экспрессирующие самый высокий уровень, выращивали дальше. После дальнейших циклов размножения и проверки отбирали для исследований роста и продуктивности 20 клонов, которые экспрессировали ХГЧ. На основе результатов этих исследований 5 клонов отбирали для трансфекции со второй плазмидой, включающей ген ST3GAL4.

Пример 4. Трансфекция с ST3GAL4 плазмидой pST3.

Стабильные клоны генерировали, как описано ранее в примере 3.

Пять лучших клонов, полученных посредством способа, который описан в примере 3, отбирали для трансфекции с ST3GAL4 плазмидой pST3 (см. пример 2, фиг. 3 и 5). Трансфекцию выполняли электропорацией, используя способ, такой же, как описанный в примере 3, за исключением того, что трансформанты селектировали в полной среде PERMAB, дополненной гигромицином в концентрации 0,5 мкг/мл вместо G418. Используя этот способ, получали пять пулов, которые экспрессировали ХГЧ.

Образцы супернатантов из трансфекционных пулов анализировали на фармакокинетической модели крыс, и на основе этих данных, наряду с данными анализа связывания лектина рецепторами RCA (измерение экспонированной галактозы на цепях ХГЧ), посредством способов, известных в данной области техники, выбирали один пул для дальнейшего клонирования методом серийных разведений.

Это клонирование методом серийных разведений позволило получить более 600 клонов, каждый из которых также проверяли на экспрессию ХГЧ и уровень экспонированной галактозы, как измерено посредством связывания лектина рецепторами RCA. Клоны с самыми низкими уровнями экспонированной галактозы выращивали в дальнейшем, и образцы подвергали in vivo ФК и подтверждали данные о связывании лектина. Пять клонов, полученных из одного пула, дополнительно оценивали касательно характеристик роста и продуктивности.

Выращивали каждый из этих клонов и создавали клеточный банк посевного материала, следуя стандартным процедурам криоконсервирования. Запасы клеток из клеточного банка посевного материала размораживали и обнаруживали их жизнеспособными.

Пример 5. Анализ посредством изоэлектрического фокусирования.

Электрофорез определяют как перемещение заряженных молекул в растворителе под действием электрического поля. Подвижность биологической молекулы в электрическом поле будет зависеть от напряженности электрического поля, суммарного заряда молекулы, размера и формы молекулы, ионной силы и свойств среды, через которую молекулы мигрируют.

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) представляет собой способ электрофореза для разделения белков на основе их pI. pI представляет собой pH, при котором белок не имеет суммарного заряда и не будет мигрировать в электрическом поле. Содержание сиаловой кислоты в изоформах ХГЧ незначительно изменяет точку pI для каждой изоформы, что может быть использовано при применении этого способа для визуализации изоформ ХГЧ Per.C6 из каждого клона.

Изоэлектрические точки изоформ ХГЧ, продуцированного Per.C6, анализировали, применяя изоэлектрическое фокусирование. ХГЧ Per.C6 продуцировали, как описано в примере 6.

Образцы ХГЧ Per.C6 разделяли в гелях для ИЭФ Novex®, содержащих 5% полиакриламида, в естественных условиях в градиенте pH 3,0-7,0 в растворе амфолита с pH 3,0-7,0. Белки визуализировали, применяя окрашивание Кумасси синим, используя способы, хорошо известные в данной области техники.

На фиг. 6 показана детекция посредством ИЭФ изоформ рХГЧ, окрашенных Кумасси синим, в композициях, полученных согласно изобретению, продуцированных клонированными клеточными линиями, полученными способом, изложенным в примере 6 (дорожки 4, 5, 6 и 7, 15 мкг на дорожку); в произведенной с помощью СНО композиции известного уровня техники, Ovitrelle (дорожка 2, 15 мкг); и в человеческом продукте, полученном из мочи беременных женщин Novarel (дорожка 3, 15 мкг). Полоски представляют собой изоформы ХГЧ, содержащие различные количества молекул сиаловой кислоты. На фиг. 6 показано, что полученный из человеческой клеточной линии рекомбинантный ХГЧ, сконструированный с а2,3-сиалилтрансферазой (композиции по изобретению), является более кислым, чем Ovitrelle и ХГЧ из мочи беременных женщин.

На фиг. 7 сравнивают концентрацию ХГЧ (альфа-бета ХГЧ) и свободной β-цепи (бета ХГЧ),

- 11 034022 полученных с применением клеток по изобретению (т.е. используя клеточные линии, полученные способом, изложенным в примерах 1-4), которые включают оптимизированную альфа-субъединицу, по сравнению с концентрацией ХГЧ (альфа-бета ХГЧ) и свободной β-цепи (бета ХГЧ), продуцированных в клетках сравнительного примера, включающих альфа-субъединицу ДТ (дикого типа). На фиг. 7 показано, что клетки по изобретению экспрессируют высокие количества ХГЧ и небольшой избыток свободной бета-субъединицы. Другими словами, выход и чистота рекомбинантного ХГЧ, продуцированного посредством клеток и способов по изобретению, заметно улучшены.

В табл. А показано процентное содержание свободных субъединиц β-ХГЧ в полуочищенных образцах разных партий ХГЧ, продуцированного с использованием клеток по изобретению (т.е. используя клеточные линии, полученные способом, изложенным в примерах 1-4), которые включают оптимизированную альфа-субъединицу (опт. альфа ХГЧ), по сравнению с процентным содержанием свободных субъединиц β-ХГЧ в полуочищенных образцах ХГЧ, продуцированного в клетках сравнительного примера, включающих альфа-субъединицу ДТ (дикого типа) (альфа ХГЧ ДТ), как определено посредством гидрофобной хроматографии на Phenyl-5PW (ВЭЖХ).

В табл. 1 показано, что клетки по изобретению экспрессируют высокие количества ХГЧ и более низкий избыток свободной бета-субъединицы (5,7-10,6%) по сравнению с клетками, включающими альфа-субъединицу ДТ (64-66%). Другими словами, выход и чистота рекомбинантного ХГЧ, продуцированного посредством клеток и способов по изобретению, заметно улучшены.

Таблица 1

Клон	% свободной β-ХГЧ (РНЕ - 5PW)
Альфа ХГЧ (1G2) ДТ	64,1
Альфа ХГЧ (1G2) ДТ	66,0
Опт. альфа ХГЧ (13,8)	5,7
Опт. альфа ХГЧ (29)	7,5
Опт. альфа ХГЧ (29)	6,6
Опт. альфа ХГЧ (29)	10,6

Пример 6. Обзор продуцирования и очистки.

Методику разрабатывали для получения рекомбинантного ХГЧ в клетках PER.C6, которые культивировали в суспензии в среде, не содержащей сыворотку. Методика описана ниже, и ее использовали для нескольких продуцирующих ХГЧ клеточных линий PER.C6.

Рекомбинантный ХГЧ из трансфицированного а2,3-сиалилтрансферазой клона получали, используя способы примеров 1-4, описанные выше.

Клетки выращивали в колбах на качалке в среде 6GRO (SAFC) до достижения плотности клеток от 1х10⁶ до 3х10⁶ клеток/мл. Клетки переносили в 5 л стеклянный биореактор с механическим перемешиванием с плотностью около 1х10⁶ клеток/мл. Биореактор работал в режиме перфузии, используя среду Proper1 (Lonza).

После этого выполняли очистку продукта рХГЧ, используя разные стадии ультрафильтрации, анионо- и катионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию и псевдоаффинную хроматографию, посредством способов, хорошо известных в данной области техники.

В продолжение всех хроматографических способов присутствие иммунореактивного рекомбинантного ХГЧ подтверждали посредством ИФА (DRG EIA 1469) и ИЭФ (пример 5).

Пример 7. Содержание сиаловой кислоты.

Сиаловая кислота представляет собой углевод, связывающий белок, который считается моносахаридом и встречается в комбинации с другими моносахаридами, подобными галактозе, маннозе, глюкозамину, галактозамину и фукозе. Общую сиаловую кислоту на очищенном рХГЧ по изобретению измеряли, используя способ, основанный на способе Stanton et. al. (J. Biochem. Biophys. Methods. 30 (1995), 37-48).

Измеряли общее содержание сиаловой кислоты в образцах рекомбинантного ХГЧ Per.C6, модифицированного а2,3-сиалилтрансферазой (полученного посредством способов примера 4 и 6), и результаты представлены в табл. 1 ниже [выраженные в виде отношения молей сиаловой кислоты к молям белка].

Пример. 8. Биоанализ ХГЧ в соответствии с USP (Фармакопеи США).

Биоанализ ХГЧ выполняли с целью определения удельной активности ХГЧ для каждого из образцов табл. 1 ниже. Активность измеряли в соответствии с USP (USP Monographs: Chorionic Gonadotropin, USPC Official 8/1/09-11/30/09), используя в качестве стандарта Ovitrelle. Ovitrelle имеет биологическую активность 26000 МЕ/мг (Curr. Med. Res. Opin. 2005 Dec; 21(12):1969-76). Допустимый предел составлял более 21000 ME ХГЧ/мг. Биологическая активность для образцов рекомбинантных ХГЧ, сконструированных с а2,3-сиалилтрансферазой из ХГЧ, полученного из человеческой клеточной линии, показана в табл. 2.

- 12 034022

Таблица 2

Образец

сиаловом сиаловом

26142

100,5

Содержание кислоты (СК) (мкмоль СК/ мкмоль ХГЧ)

Активность МЕ/мг % Активности

Ovitrelle 26000 МЕ/мг

Образец

Активность МЕ/мг % Активности

Ovitrelle 26000 МЕ/мг

Как видно из указанного выше, активность близка к активности Ovitrelle и может быть больше нее (см., например, образец 7).

Ссылки

Andersen CY, Westergaard LG, and van Wely M. (2004). FSH isoform composition of commercial gonadotrophin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online. 9(2), 231-236.

Bassett RM, and Dhebergen R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online. 10(2), 169-177.

D’Antonio M., Borrelli F., Datola A., Bucci R. , Mascia M. , Polletta P., Piscitelli D., and Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, 1160-1167.

Fiddes, J. C. and Goodman, Η. M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis of the cDNA for the alfa-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281, 351-356.

Fiddes, J. C. and Goodman, Η. M. (1980) The cDNA for the beta-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough into the З’-untranslated region. Nature, 286, 684-387.

Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, and Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem. 263(33), 17508-17515.

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1), 265-75.

- 13 034022

Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL and Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior anterior pituitary and hypothalamic hormones Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol). 7, 16-21.

Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA and Rudd PM (2006) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (human Press), 347: Glycobiology protocols, 125-144.

Steelman SL, and Pohley FM. (1953) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 53(6), 604-616.

Svensson EC, Soreghan B, and Paulson JC. (1990) Organization of the betagalactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem. 265(34):20863-20868.

Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, and Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 263(8), 3657-3663.

Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, and Padmanabhan V. (1995). Follicle-stimulating isohormones: characterization and physiological relevance. Endocr Rev. 16(6), 765-787.

Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Bamos-de-Tomasi J, Maldonado A, and Nayudu P. (2003). Impact of carbohydrate heterogenety in function of follicle stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod. 69(2), 379389.

Оптимизированная α ХГЧ.

Нуклеотидная последовательность оптимизированной α ХГЧ (SEQ ID NO: 1):

1	ATGGACTACT	ACCGGAAGTA	CGCCGCCATC	TTCCTGGTGA	CCCTGAGCGT	GTTCCTGCAC
61	GTGCTGCACA	GCGCCCCTGA	CGTGCAGGAC	TGCCCCGAGT	GCACCCTGCA	GGAAAACCCC
121	TTCTTCAGCC	AGCCTGGCGC	CCCTATCCTG	CAGTGCATGG	GCTGCTGCTT	CAGCAGAGCC
181	ТАССССАССС	CCCTGCGGAG	CAAGAAAACC	ATGCTGGTGC	AGAAAAACGT	GACCAGCGAG
241	AGCACCTGCT	GCGTGGCCAA	GAGCTACAAC	CGGGTGACCG	TGATGGGCGG	CTTCAAGGTG
301	GAGAACCACA	CCGCCTGCCA	CTGCAGCACC	TGCTACTACC	ACAAGTCCT

Последовательность белка оптимизированной альфа ХГЧ:

MDYYRKYAAI FLVTLSVFLH VLHSAPDVQD CPECTLQENP FFSQPGAPIL QCMGCCFSRA

YPTPLRSKKT MLVQKNVTSE STCCVAKSYN RVTVMGGFKV ENHTACHCST CYYHKS

Бета-полипептид человеческого хорионического гонадотропина.

Номер доступа NP_000728.

Нуклеотидная последовательность β ХГЧ (SEQ ID NO: 2).

Нуклеотидная последовательность:

1	ATGGAGATGT	TCCAGGGGCT	GCTGCTGTTG	CTGCTGCTGA	GCATGGGCGG	GACATGGGCA
61	TCCAAGGAGC	CGCTTCGGCC	ACGGTGCCGC	CCCATCAATG	CCACCCTGGC	TGTGGAGAAG
121	GAGGGCTGCC	CCGTGTGCAT	CACCGTCAAC	АССАССАТСТ	GTGCCGGCTA	CTGCCCCACC
181	ATGACCCGCG	TGCTGCAGGG	GGTCCTGCCG	GCCCTGCCTC	AGGTGGTGTG	CAACTACCGC
241	GATGTGCGCT	TCGAGTCCAT	CCGGCTCCCT	GGCTGCCCGC	GCGGCGTGAA	CCCCGTGGTC
301	TCCTACGCCG	TGGCTCTCAG	CTGTCAATGT	GCACTCTGCC	GCCGCAGCAC	CACTGACTGC
361	GGGGGTCCCA	AGGACCACCC	CTTGACCTGT	GATGACCCCC	GCTTCCAGGA	СТССТСТТСС
421	TCAAAGGCCC	CTCCCCCCAG	CCTTCCAAGT	CCATCCCGAC	TCCCGGGGCC	CTCGGACACC
481	CCGATCCTCC	САСААТАА

Последовательность белка β ХГЧ:

MEMFQGLLLL LLLSMGGTWA SKEPLRPRCR PINATLAVEK EGCPVCITVN TTICAGYCPT

MTRVLQGVLP ALPQWCNYR DVRFESIRLP GCPRGVNPW SYAVALSCQC ALCRRSTTDC

121 GGPKDHPLTC DDPRFQDSSS SKAPPPSLPS PSRLPGPSDT PILPQ в-галактозид-а-2,3-сиалилтрансфераза 4.

- 14 034022

Номер доступа L23767.

Нуклеотидная последовательность ST3GAL4 (SEQ ID NO: 3):

ATGTGTCCTG CAGGCTGGAA GCTCCTGGCC ATGTTGGCTC TGGTCCTGGT CGTCATGGTG

TGGTATTCCA TCTCCCGGGA AGACAGGTAC ATCGAGCTTT TTTATTTTCC CATCCCAGAG

121 AAGAAGGAGC CGTGCCTCCA GGGTGAGGCA GAGAGCAAGG CCTCTAAGCT CTTTGGCAAC

181 TACTCCCGGG ATCAGCCCAT CTTCCTGCGG CTTGAGGATT ATTTCTGGGT CAAGACGCCA

241 TCTGCTTACG AGCTGCCCTA TGGGACCAAG GGGAGTGAGG ATCTGCTCCT CCGGGTGCTA

301 GCCATCACCA GCTCCTCCAT CCCCAAGAAC ATCCAGAGCC TCAGGTGCCG CCGCTGTGTG

361 GTCGTGGGGA ACGGGCACCG GCTGCGGAAC AGCTCACTGG GAGATGCCAT CAACAAGTAC

421 GATGTGGTCA TCAGATTGAA CAATGCCCCA GTGGCTGGCT ATGAGGGTGA CGTGGGCTCC

481 AAGACCACCA TGCGTCTCTT CTACCCTGAA TCTGCCCACT TCGACCCCAA AGTAGAAAAC

541 AACCCAGACA CACTCCTCGT CCTGGTAGCT TTCAAGGCAA TGGACTTCCA CTGGATTGAG

601 ACCATCCTGA GTGATAAGAA GCGGGTGCGA AAGGGTTTCT GGAAACAGCC TCCCCTCATC

661 TGGGATGTCA ATCCTAAACA GATTCGGATT CTCAACCCCT TCTTCATGGA GATTGCAGCT

721 GACAAACTGC TGAGCCTGCC AATGCAACAG CCACGGAAGA TTAAGCAGAA GCCCACCACG

781 GGCCTGTTGG CCATCACGCT GGCCCTCCAC CTCTGTGACT TGGTGCACAT TGCCGGCTTT

841 GGCTACCCAG ACGCCTACAA CAAGAAGCAG ACCATTCACT ACTATGAGCA GATCACGCTC

901 AAGTCCATGG CGGGGTCAGG CCATAATGTC TCCCAAGAGG CCCTGGCCAT TAAGCGGATG

961 CTGGAGATGG GAGCTATCAA GAACCTCACG TCCTTCTGA

Последовательность белка ST3GAL4:

1	MCPAGWKLLA	MLALVLWMV	WYSISREDRY	IELFYFPIPE	KKEPCLQGEA	ESKASKLFGN
61	YSRDQPIFLR	LEDYFWVKTP	SAYELPYGTK	GSEDLLLRVL	AITSSSIPKN	IQSLRCRRCV
121	WGNGHRLRN	SSLGDAINKY	DWIRLNNAP	VAGYEGDVGS	KTTMRLFYPE	SAHFDPKVEN
181	NPDTLLVLVA	FKAMDFHWIE	TILSDKKRVR	KGFWKQPPLI	WDVNPKQIRI	LNPFFMEIAA
241	DKLLSLPMQQ	PRKIKQKPTT	GLLAITLALH	LCDLVHIAGF	GYPDAYNKKQ	TIHYYEQITL
301	KSMAGSGHNV	SQEALAIKRM	LEMGAIKNLT	SF

Оптимизированная α-цепь ХГЧ.

Нуклеотидная последовательность оптимизированной α-цепи ХГЧ (SEQ ID NO: 4):

GCCCCTGACG TGCAGGACTG CCCCGAGTGC ACCCTGCAGG AAAACCCCTT CTTCAGCCAG

CCTGGCGCCC CTATCCTGCA GTGCATGGGC TGCTGCTTCA GCAGAGCCTA CCCCACCCCC

121	CTGCGGAGCA	AGAAAACCAT	GCTGGTGCAG	AAAAACGTGA	CCAGCGAGAG	CACCTGCTGC
181	GTGGCCAAGA	GCTACAACCG	GGTGACCGTG	ATGGGCGGCT	TCAAGGTGGA	GAACCACACC
241	GCCTGCCACT	GCAGCACCTG	CTACTACCAC	AAGTCCT

Последовательность белка оптимизированной α-цепи ХГЧ:

APDVQDCPEC TLQENPFFSQ PGAPILQCMG CCFSRAYPTP LRSKKTMLVQ KNVTSESTCC

VAKSYNRVTV MGGFKVENHT ACHCSTCYYH KS α-полипептид ХГЧ.

Номер доступа AH007338.

Нуклеотидная последовательность α ХГЧ (SEQ ID NO: 5):

ATGGATTACT ACAGAAAATA TGCAGCTATC TTTCTGGTCA CATTGTCGGT GTTTCTGCAT

GTTCTCCATT CCGCTCCTGA TGTGCAGGAT TGCCCAGAAT GCACGCTACA GGAAAACCCA

121 TTCTTCTCCC AGCCGGGTGC CCCAATACTT CAGTGCATGG GCTGCTGCTT CTCTAGAGCA

181 TATCCCACTC CACTAAGGTC CAAGAAGACG ATGTTGGTCC AAAAGAACGT CACCTCAGAG

241 TCCACTTGCT GTGTAGCTAA ATCATATAAC AGGGTCACAG TAATGGGGGG TTTCAAAGTG

301 GAGAACCACA CGGCGTGCCA CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCTTA A

Последовательность белка α ХГЧ

MDYYRKYAAI FLVTLSVFLH VLHSAPDVQD CPECTLQENP FFSQPGAPIL QCMGCCFSRA

YPTPLRSKKT MLVQKNVTSE STCCVAKSYN RVTVMGGFKV ENHTACHCST CYYHKS

Claims

1. Нуклеиновая кислота, кодирующая α-цепь ХГЧ (хорионический гонадотропин человека), включающая последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1.

2. Нуклеиновая кислота, кодирующая α-цепь ХГЧ (хорионический гонадотропин человека), включающая последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 4.

3. Нуклеиновая кислота, кодирующая α-цепь ХГЧ (хорионический гонадотропин человека), включающая последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере с 97% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1.

4. Нуклеиновая кислота, кодирующая α-цепь ХГЧ (хорионический гонадотропин человека), включающая последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере с 97% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4.

5. Клетка, отличающаяся тем, что она содержит интегрированную в ее геном последовательность, кодирующую α-цепь ХГЧ (хорионический гонадотропин человека), выбранную из последовательности согласно SEQ ID NO: 1; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 96,5% с последовательностью SEQ ID NO: 1; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% с последовательностью SEQ ID NO: 1; последовательности SEQ ID NO: 4; последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 96,5% с последовательностью SEQ ID NO: 4; и последовательности, которая имеет гомологию по меньшей мере 97% с последовательностью SEQ ID NO: 4.

6. Клетка по п.5, представляющая собой клетку PER.C6®, такую как клетка PER.C6®, депонированная под № 96022940 в ЕСАСС (Европейской коллекции клеточных культур животных).

7. Клетка APER.C6®, такая как клетка PER.C6®, депонированная под № 96022940 в ЕСАСС, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит интегрированную в ее геном последовательность, кодирующую α-цепь ХГЧ.

8. Клетка по любому из пп.5-7, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит интегрированную в ее геном кДНК, кодирующую α-2,3-сиалилтрансферазу.

9. Клетка по любому из пп.5-8, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит интегрированную в ее геном последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь ХГЧ.

10. Способ получения рекомбинантного белка в клетке, включающий культивирование клетки по любому из пп.5-9 в подходящей среде и выделение рекомбинантного белка из указанной клетки и/или указанной среды.

11. Способ получения рекомбинантного ХГЧ в клетке, включающий культивирование клетки в подходящей среде и выделение рекомбинантного белка (ХГЧ) из указанной клетки и/или указанной среды, где клетка представляет собой клетку PER.C6®, содержащую интегрированную в ее геном последовательность, кодирующую α-цепь ХГЧ.