CN110812366B

CN110812366B - 一种可用于激素补充的mRNA药物及其制备方法

Info

Publication number: CN110812366B
Application number: CN201911125305.4A
Authority: CN
Inventors: 刘隽; 彭育才; 向晟楠; 苏晓晔; 刘琪; 雷奕欣; 李爽
Original assignee: Zhuhai Lifanda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Lifanda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2023-11-17
Anticipated expiration: 2039-11-18
Also published as: CN110812366A

Abstract

本发明提供了一种可用于激素补充的mRNA药物及其制备方法，涉及药物技术领域。核酸药物包括编码含有至少两个亚基的生殖激素类蛋白质的mRNA。该核酸药物可以延长生殖激素类药物的半衰期，延长药物作用时间。该核酸药物活性好，可明显减少病人给药次数，改善患者用药的依从性，以及具有更好的治疗效果。上述核酸药物的制备方法无需收集天然原材料，操作简单。

Description

一种可用于激素补充的mRNA药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物技术领域，尤其是涉及一种可用于激素补充的mRNA药物及其制备方法。

背景技术

生殖激素是和生殖相关的激素，例如***、孕激素、***、***、泌乳素以及雄性激素等，其中生殖激素中包括多种蛋白质类的激素。传统的生殖激素类蛋白药物的制备方法包括提取和重组蛋白两种工艺：提取工艺为从含有天然生殖激素类蛋白的物质中提取生殖激素类蛋白活性物质以作为药物，主要包括收集原料和纯化的过程。提取法的缺陷主要有：天然材料来源难以取得，成本也逐渐提升，并且工艺复杂，产率较低，不能满足日益增长的市场需求。重组蛋白为通过设计重组DNA或RNA，经表达***体外表达蛋白质，然后经纯化后得到目的蛋白。重组蛋白工艺的缺陷有生产需要采用细胞培养方式，工艺复杂，成本高昂；重组蛋白的修饰比如糖基化等跟天然产品存在差异，重组蛋白和天然蛋白通常具有不同的药物代谢动力学模式。同时蛋白类药物还具有在体内半衰期较短的缺点，需要患者反复注射，用药不方便因此依从性差。

以绒毛膜***蛋白类药物为例，绒毛膜***(hCG)是胎盘合体滋养层细胞所分泌的一种糖蛋白激素，由垂体前叶腺自然分泌。hCG的主要功能有：维持黄体及降低母体淋巴细胞的活动，防止对胎儿的排斥反应。hCG作为药物可用于接受辅助生殖技术如体外受精(IVF)之前进行超***的妇女：在刺激卵泡生长后促发最终的卵泡成熟和黄体化；也可用于无***或少***的妇女：可在刺激卵泡生长后促发无***或少***患者的***及黄体化。

从妊娠期妇女的尿液中提取的hCG已经在不育治疗中使用了很多年。从尿液中提取hCG包括大量尿液的收集和处理、pH值调整以析出杂质、离子交换柱层析进行纯化的过程。重组形式的hCG蛋白(rhCG)，可以采用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行表达，随后使用离子交换层析和反向高效液相色谱等方法进行纯化。尿液为原料进行提纯方式，由于尿液来源有限，工艺复杂，产率较低，因此目前市场上主流的hCG产品均采用重组蛋白技术。然而，重组hCG产品与从人尿中产生的hCG具有不同的药物代谢动力学模式，重组蛋白类hCG产品要在体内发挥作用需要有持续的刺激，通常hCG在单次注射后24小时左右就会被清除，即便加大给药剂量也无法延长蛋白质在体内的作用时间。因此市场上所有重组hCG产品都需要连续反复注射才能发挥效果，患者依从性差。因此，对传统的生殖激素类蛋白药物进行改进是目前市场需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种核酸药物，缓解了现有技术中存在的生殖激素类蛋白药物药效不佳的问题。

本发明的第二目的在于提供上述核酸药物的制备方法。

本发明的第三目的在于提供上述核酸药物、或上述核酸药物的制备方法在制备用于治疗生殖相关疾病的产品中的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种核酸药物，所述核酸药物包括编码含有至少两个亚基的生殖激素类蛋白质的mRNA。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种上述核酸药物的制备方法，包括将编码生殖激素类蛋白质的mRNA和任选的辅料混合，得到所述核酸药物。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述核酸药物或上述制备方法在制备用于治疗生殖相关疾病的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的核酸药物包括编码含有至少两个亚基的生殖激素类蛋白质的mRNA。mRNA所合成出来的目标蛋白经天然半衰期衰减的过程中，mRNA仍可以不断合成新的目标蛋白质进行补充，因此可持续表达蛋白质，从而延长其编码的蛋白质在体内的半衰期，实现延长药效维持时间的效果。本发明的核酸药物在达到同等效果的前提下，可明显减少病人给药次数，改善患者用药的依从性，以及具有更好的治疗效果。mRNA在递送至体内后，可利用人体内的细胞产生内源性的蛋白质，具有更好的活性。本发明提供的核酸药物的制备方法无需收集天然原材料，生产方法简单。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中HEK293细胞上清中hCG蛋白浓度；

图2为本发明实施例3中不同的给药方式下的给药效果；

图3为本发明实施例4中小鼠中hCG血药浓度随时间的变化；

图4为本发明实施例5中小鼠中hCG血药浓度随时间变化曲线；

图5为本发明实施例6中hCG mRNA给药后小鼠子宫增重效果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

mRNA是蛋白质的前体，在导入到人体后mRNA会逐渐表达成目标蛋白质。在mRNA所合成出来的目标蛋质白经天然半衰期衰减的过程中，mRNA仍可以不断合成新的目标蛋白质进行补充。mRNA递送到体内后在一定时间段内可持续表达蛋白质，因此以mRNA作为生殖激素类药物的活性成分可以延长其编码的生殖激素在体内的半衰期，从而实现长时间的药效。因此本发明的核酸药物在达到同等效果的前提下，可明显减少病人给药次数，改善患者用药的依从性，以及更好的治疗效果。以编码生殖激素类蛋白质的mRNA作为药物活性成分，无需收集天然原材料，生产方法简单。mRNA在递送至体内后，可利用人体内的细胞产生内源性的蛋白质，具有更好的活性。

在一些优选的实施方式中，所述核酸药物优选包括***，***(gonadotropin)是一组在男性和女性中调节生殖功能的异二聚体糖蛋白激素。所述***包括但不限于促卵泡激素(FSH)、***(LH)和绒毛膜***(CG)中的一种或多种；在一些可选的实施例中，核酸药物可以只含有编码FSH、LH和CG中一种的mRNA；在一些可选的实施例中，核酸药物还可以同时包含多种编码不同***的mRNA，以同时补充多种***：例如可以为但不限于为：同时包含编码FSH的mRNA和编码LH的mRNA；同时包含编码FSH的mRNA和编码LH的mRNA；同时包含编码LH的mRNA和编码CG的mRNA；或，同时包含编码FSH的mRNA、编码LH的mRNA和CG的mRNA。

本发明不限制生殖激素的物种来源，编码生殖激素类蛋白的mRNA可以为天然mRNA的序列，也可以为经密码子优化的序列；编码的生殖激素类蛋白可以为人的生殖激素类蛋白，也可以为其他物种的生殖激素类蛋白；为了更适用于人补充生殖激素，优选包括人生殖激素类蛋白。

本发明所述的生殖激素类蛋白质为至少含有两个亚基的蛋白质。在一些可选的实施方式中，单一mRNA含有生殖激素类蛋白质的所有亚基的编码区，即核酸药物中的一条mRNA就能够翻译出整个具有多亚基结构的生殖激素类蛋白质；在另一些可选的实施方式中，单一mRNA只含有生殖激素类蛋白质的一个亚基的编码区；即一条mRNA只能够翻译出生殖激素类蛋白质的一个亚基。可以理解的是，核酸药物可以含有编码生殖激素类蛋白质所有亚基的mRNA，以使核酸药物在其作用的对象中翻译出完整的具有多亚基结构的生殖激素蛋白；当生殖激素类蛋白质中一个亚基也具有药物的活性时，核酸药物也可以含有至少一个编码单一亚基的mRNA，以使核酸药物在其作用的对象中翻译出具有药物活性的亚基。

本发明通过hCG的核酸药物的实验发现，将hCG的α亚基的编码区和β亚基的编码区分别设置于不同的mRNA，核酸药物的治疗效果优于将hCG的两个亚基的编码区设置于同一条mRNA，因此在一些优选的实施方式中，优选单一mRNA只含有生殖激素类蛋白质中一个亚基的编码区的方式构建核酸药物。

在一些可选的实施方式中，所述mRNA还包含(a)～(e)中的至少一种：(a)5’-帽结构：5’-帽结构可以增加mRNA的稳定性，避免mRNA被核酸外切酶降解，为核糖体对mRNA的识别提供信号，优选使用m7GpppG。(b)聚腺苷酸序列：聚腺苷酸序列能够避免mRNA被核酸外切酶降解，同时终结转录。所述聚腺苷酸优选含有60-120个腺苷，更优选含有80-100个腺苷。(c)5’UTR：5’非翻译区对mRNA的翻译具有调控作用，5’UTR优选长度为10-200个核苷酸，更优选为15-100个核苷酸；所述5’UTR优选包含DNAH2基因的5’UTR，编码包含DNAH2基因5’UTR的5’UTR的DNA序列优选如SEQ ID NO.5所示；或，5’UTR中含有KOZAK序列，编码KOZAK序列的DNA序列优选如SEQ ID NO.4所示。(d)3’UTR：3’的非翻译区优选包括血红蛋白HBA2的3’UTR序列，编码包含血红蛋白HBA2的3’UTR序列的3’UTR的DNA序列优选如SEQ ID NO.6所示。(e)内部核糖体进入序列(IRES)：IRES可以使蛋白质翻译起始不依赖于5‘帽结构，直接从信使mRNA中间起始翻译。IRES优选包括脊髓灰质炎II型病毒(Poliovirus type 2)的IRES序列，编码脊髓灰质炎II型病毒的序列优选如SEQ ID NO.7所示。

在一些具体的实施例中，可选地，所述mRNA由编码区、5’UTR和3’UTR构成；可选地，所述mRNA由编码区和IRES序列构成；可选地，所述mRNA由编码区、5’-帽结构、IRES序列和聚腺苷酸序列组成。

在一些优选的实施方式中，mRNA含有5’-帽结构、聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR。在一些优选的实施方式中，mRNA含有5’-帽结构、聚腺苷酸序列、5’UTR、3’UTR和内部核糖体进入序列。

在一些可选的实施方式中，所述mRNA含有修饰的核苷酸，所述含有修饰的核苷酸指的是mRNA中的核苷酸经过修饰，例如经2’-O-甲基化修饰核苷酸；或者使用其他种类的核苷酸替换mRNA中常规的核苷酸，例如使用L-nucleoside(L-核苷)和假尿嘧啶(pseudo-UTP)替换mRNA中的常规核苷酸。可选地，mRNA中含有L-核苷和pseudo-UTP；可选地，含有2’-O-甲基化修饰的核苷酸。

在一些优选的实施方式中，所述修饰包括假尿嘧啶化修饰，将mRNA中的UTP替换为pseudo-UTP，假尿嘧啶化修饰能够增强mRNA的稳定性和应急反应应答。

在一些优选的实施方式中，mRNA含有修饰的UTP和/或CTP；可选地，UTP经过修饰；可选地，CTP经过修饰；可选地，UTP和CTP经过修饰。UTP修饰例如包括5端-替换的UTP，例如5-甲氧基尿苷；1端-替换的假尿苷，例如1-甲基-假胞苷；CTP修饰例如包括5’端-替换的CTP，例如5-甲基-胞苷。

所述修饰的位置包括但不限于蛋白质或蛋白质亚基的编码区、5’-UTR区、3’-UTR区和帽子区中的一种或多种，实例包括但不限于：修饰mRNA的编码区；修饰mRNA的编码区和5’-UTR区和3’-UTR区；修饰mRNA的帽子区。

在一些可选的实施方式中，所述核酸药物还包括用于递送mRNA的递送制剂，以使编码生殖激素类蛋白质的mRNA更好的递送至体内，递送制剂包括但不限于阳离子脂质体、阳离子蛋白、阳离子多肽或阳离子聚合物。

在一些优选实施方式中，核酸药物包括由编码生殖激素类蛋白质的mRNA和脂质成分组成的脂质纳米颗粒，其中脂质成分和mRNA的质量比优选为(10-30):1，例如可以但不限于10:1、15:1、20:1、25:1或30:1，优选20:1，更优选20:1。

在一些优选的实施方式中，脂质成分包括可质子化阳离子脂质、胆固醇、辅助脂质和表面活性剂。可质子化阳离子脂质优选包括但不限于DODMA、Dlin-MC3-DMA、Dlin-KC2-DMA或DlinDMA，优选包括Dlin-MC3-DMA。优选地，可质子化阳离子脂质占脂质成分摩尔含量的20-50％，例如可以但不限于20％、30％、40％或50％。优选地，胆固醇或胆固醇的衍生物占脂质成分摩尔含量的20-50％，例如可以但不限于20％、30％、40％或50％。辅助脂质包括但不限于DSPC、DOPE、DOPC或DOPS，优选包括DSPC。优选地，辅助脂质占脂质成分摩尔含量的5-20％，例如可以但不限于5％、10％、15％或20％。优选地，表面活性剂包括但不限于PEG修饰的脂质和/或水溶性表面活性剂，表面活性剂可以单独使用PEG修饰的脂质或单独使用水溶性表面活性剂，也可以同时使用PEG修饰的脂质和水溶性表面活性剂。其中PEG修饰的脂质包括但不限于PEG-DMG或PEG-DSPE，更优选包括PEG-DMG。优选地，PEG修饰的脂质占脂质成分摩尔含量的1-5％，例如可以但不限于1％、2％、3％、4％或5％，更优选3％。水溶性表面活性剂包括但不限于Tween 20、Tween 80、P188或PVA。优选地，水溶性表面活性剂和脂质成分的重量体积比为0.2-2％，例如可以但不限于0.2％、0.5％、1％、1.5％或2％，更优选1％。

在一些优选的实施方式中，核酸药物包括人绒毛膜***(hCG)mRNA药物。hCG的主要功能有：维持黄体及降低母体淋巴细胞的活动，防止对胎儿的排斥反应，用于接受辅助生殖技术，以及用于无***或少***的妇女。优选地，编码hCG的mRNA编码人的hCG，更适合在哺乳动物，特别是人体内表达，且编码hCG的mRNA优选经过密码子优化。

hCG蛋白结构中包括α和β两个亚基。α亚基与LH、FSH、TSH近似，尤其是与LH有较大的免疫交叉反应，含有92个氨基酸。β亚基为hCG独有的，含有145个氨基酸。通过mRNA技术合成具有hCG蛋白质表达功能的mRNA产品，在小鼠实验中发现hCG核酸药物可以显著延长hCG在体内的作用时间，并提高药物递送到体内后的蛋白表达效果，单次注射mRNA产品即可超过市场上相应蛋白类药物多次注射才能达到的效果；hCG核酸药物在小鼠体内能够产生人绒毛膜***，并在小鼠中有子宫增重效果。

在一些可选的实施方式中，所述核酸药物包括hCG mRNA，所述hCG mRNA包括hCG的α亚基的编码区和hCG的β亚基的编码区，能够同时编码α亚基和β亚基。hCG mRNA优选含有hCG的α亚基的编码区、hCG的β亚基的编码区、5’-帽结构、聚腺苷酸序列、5’UTR、3’UTR和内部核糖体进入序列，hCG mRNA优选含有如SEQ ID NO.1所示序列。

在一些优选的实施方式中，所述核酸药物包括hCGαmRNA和hCGβmRNA，hCGαmRNA包含hCG的α亚基的编码区，hCGβmRNA包含hCG的β亚基的编码区。

在一些优选的实施方式中，hCGαmRNA含有α亚基的编码区、5’-帽结构、聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR，hCGαmRNA优选含有如SEQ ID NO.2所示序列。

在一些优选的实施方式中，hCGβmRNA含有β亚基的编码区、5’-帽结构、聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR，hCGβmRNA优选含有如SEQ ID NO.3所示序列。

在一些优选的实施方式中，核酸药物中hCGαmRNA和hCGβmRNA的摩尔比为(1～2)：(1～2)；优选为(1～1.5)：(1～1.5)；更优选为1:1。

在一些优选的实施方式中，通过实验发现，hCG的核酸药物中优选使用Dlin-MC3-DMA作为递送制剂。且优选采用静脉给药和皮下给药的方式给药，给药后在小鼠中给药3个小时后就可以在血液中检测到hCG蛋白，并能持续表达48小时以上，其中静脉给药的方式效果更佳。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了上述核酸药物的制备方法，所述制备方法包括将mRNA和任选的辅料混合，得到所述核酸药物。“任选的辅料”指的是可选择添加，或不添加的，本领域可接受的辅料。

在一些优选的实施方式中，所述mRNA由DNA模板转录得到。可选地，所述DNA模板含有生殖激素类蛋白质的所有亚基的编码区；可选地，所述DNA模板只含有生殖激素类蛋白质中一个亚基的编码区。将线性化的DNA模板转录得到mRNA，优选采用体外转录获取mRNA，体外转录mRNA采用体外无细胞生产，不涉及活细胞的培养及复杂的分离工程，生产条件便于控制。优选在RNA聚合酶的催化下，采用体外转录获取mRNA，转录mRNA的原料包括ATP、CTP、pseudo-UTP、GTP和ARCA帽子。然后将体外转录的产物浓缩后得到核酸药物中编码生殖激素类蛋白质的mRNA。

在一些优选的实施方式中，将mRNA溶解于水相得到含有mRNA的溶液，得到第一混合物，再将第一混合物与递送制剂混合均匀，得到所述核酸药物；其中水相优选包括缓冲液，缓冲液包括但不限于柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液；优选使用柠檬酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液的pH优选为3.5～4.5。第一混合物中，mRNA的浓度优选为0.05～0.15mg/mL，例如可以但不限于0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.12mg/mL或0.15mg/mL，优选为0.1mg/mL。

在一些优选的实施方式中，所述核酸药物包括脂质纳米颗粒：所述脂质纳米颗粒的制备方法还包括如下步骤：将所述脂质成分溶解于有机相，得到第二混合物，然后将所述第一混合物和所述第二混合物混合，得到第三混合物。在一些可选的实施方式中，先稀释所述第三混合物，然后浓缩，得到所述核酸药物，优选是稀释50～100倍，例如可以但不限于为50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍；在另一些可选的实施方式中，去除所述第三混合物中的有机相后，得到所述核酸药物。采用先稀释后浓缩第三混合物，或采用去除第三混合物中的有机相的方法，均分别独立的优选使核酸药物中的脂质纳米颗粒的浓度至50-200μg/ml，例如可以为但不限于为50μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、150μg/ml或200μg/ml。

有机相优选使用无水C1～C4低碳醇，更优选使用无水乙醇。第二混合物中脂质的浓度为4～8mg/mL，例如可以但不限于为4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL或8mg/mL，优选为6mg/mL。第一混合物和第二混合物优选按照体积比为1：(2～4)混合，更优选按照1:3混合。在混合第一混合物和第二混合物时，可以手工混合，或者采用微流控设备混合，为了使混合的操作更加的精确，优选使用微流控设备进行混合。用微流控设备混合时，流速控制优选为3mL/min-24mL/min，例如可以为但不限于为3mL/min、5mL/min、10mL/min、12mL/min、15mL/min、20mL/min或24mL/min，优选为12mL/min。

在一些优选的实施方式中，所述核酸药物中编码的蛋白质包括hCG，所述核酸药物含有hCGαmRNA和hCGβmRNA；并且hCGαmRNA和hCGβmRNA以摩尔比为(1～2)：(1～2)混合；优选以摩尔比(1～1.5)：(1～1.5)混合；更优选以摩尔比1:1混合。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述核酸药物、或上述核酸药物的制备方法在制备用于治疗生殖相关疾病的产品中的应用。上述核酸药物可以延长激素类药物的半衰期，延长药物作用时间，药物活性好，可明显减少病人给药次数，改善患者用药的依从性，以及更好的治疗效果。将上述核酸药物制备用于治疗生殖相关疾病的产品，例如和其他药物联合用药，或和其他治疗设备成套使用，产品的治疗效果更佳。

实施例1

验证两种不同mRNA设计思路对hCG蛋白表达量的影响：在HEK293细胞上利用商业化试剂lipofectamine2000转染两种不同的mRNA(hCG mRNA：为单链mRNA，两个亚基设计在同一个链上，具有如SEQ ID NO.1所示序列，hCGαmRNA和hCGβ mRNA，hCGαmRNA编码hCG的α亚基，具有如SEQ ID NO.2所示序列，hCGβmRNA编码hCG的β亚基，具有如SEQ ID NO.3所示序列，转染时hCGαmRNA和hCGβmRNA的摩尔比1:1混合)，将mRNA进行细胞转染。

将从液氮中复苏的HEK293细胞培养一代后备用。实验前24小时将HEK293细胞种入6孔板中，细胞密度为400000-500000个每孔。37℃培养箱培养24h候观察细胞状态，当细胞汇合度到达约80-90％后即可开始实验。按照产品说明中提供方法制备lipofectamine2000与编码HCG基因的mRNA的纳米复合物，将等量的裸HCG的mRNA作为阴性对照组，lipofectamine2000与编码HCG基因的mRNA体积质量比为2:1，二者混合后室温静置15分钟，直接加入6孔板细胞培养液中，保证每孔加入1μg的mRNA。随后将细胞于37度培养箱孵育24小时后收集细胞培养上清液，并利用ELISA法检测HCG蛋白表达量。实验结果显示mRNA分别编码hCG时，hCG蛋白表达更高。结果如图1所示。

实施例2

对各类递送制剂以及不同给药对编码hCG的mRNA的体内外递送效率进行了评估。本实施例采用hCGαmRNA(如SEQ ID NO.2所示序列)和hCGβmRNA(如SEQ ID NO.3所示序列)作为编码hCG的mRNA。实验结果显示多种递送制剂能够在体外细胞上高效转染hCG的mRNA并表达hCG蛋白，其中商业化试剂lipofectamine2000具有最高的转染效率。然而在体内动物实验中仅使用Dlin-MC3-DMA制备的脂质纳米颗粒制剂LNP(MC3)可以通过静脉或皮下给药的方式成功递送hCG的mRNA。实验结果显示体外细胞转染结果与体内动物实验结果不存在对应性，hCG的mRNA在体内的递送过程远远比体外细胞转染复杂。实验结果如表1所示。

表1编码hCG的mRNA与各类递送制剂在HEK293细胞上转染效率及通过各种给药途径在小鼠体内递送效果

	细胞转染	静脉注射	肌肉注射	皮下注射
					lipofectamine2000	++++	-	-	-
DOTAP/DOPE	++	-	-	N/A
					jetPEI	++	-	-	N/A
PEI 25kDa	++	-	-	N/A
					LNP(DOTAP)	-	N/A	-	N/A
protamine	-	N/A	-	N/A
					liposome	-	N/A	-	N/A
LNP(MC3)	+	+++	-	+

+：细胞上清检出hCG表达或小鼠给药后3h-48h血清检出hCG，+++：强阳性，-：细胞上清未检出hCG表达或小鼠给药后3h-48h血清未检出hCG，LNP(MC3)：以Dlin-MC3-DMA为核心脂质的脂质纳米颗粒。LNP(DOTAP)：以DOTAP为核心脂质的脂质纳米颗粒。

其中，各递送制剂递送mRNA的制备方法如下：

鱼精蛋白(protamine)纳米颗粒的制备：

a.将mRNA溶解于超纯水中，调节浓度为0.5mg/ml。

b.将protamine(鱼精蛋白)溶解于另一管超纯水中，调节浓度为0.5mg/ml。

c.将鱼精蛋白与mRNA溶液按照1:2的体积比混合。

d.利用涡旋震荡器混合30秒，并室温静置15分钟即可。

聚乙烯亚胺(PEI)纳米颗粒的制备：

a.将mRNA溶解于超纯水中，调节浓度为0.5mg/ml。

b.将PEI溶解于另一管超纯水中，调节浓度使得PEI上氨基与核酸磷酸根的数量比在2:1到20:1之间。

c.将PEI及mRNA溶液等体积混合。

d.利用涡旋震荡器混合30秒，并室温静置15分钟即可。

阳离子脂质体及阳离子脂质纳米颗粒的制备：

阳离子脂质体的制备方法：

a.按照以下配方制备脂质氯仿溶液：阳离子脂质选自DOTAP，中性辅助脂质选自DOPE。二者摩尔比为20:9。

b.取适量氯仿溶液于圆底烧瓶中，并利用旋转蒸发法去除有机溶剂，并制得干燥的脂质膜；

c.利用真空干燥设备干燥圆底烧瓶中的脂质膜2小时。

d.取无RNA酶超纯水加入圆底烧瓶中水化脂质膜，并于37度水浴中震荡水化10分钟，保证水化后脂质体浓度为3mg/ml。

e.将水化好的脂质体置于水浴超声仪于40度超声40分钟，既得阳离子脂质体的水悬液产品以下命名为Tf4。

阳离子脂质体与mRNA的纳米复合物的制备方法：

a.取适量mRNA溶液稀释于PBS溶液中，浓度为0.1mg/ml。

b.取脂质体悬液适量稀释于PBS溶液中，控制与mRNA质量比为1.5:1至4:1。

c.利用移液枪将二者混合，轻轻吹打5次，静置15分钟，既得阳离子复合物。

d.粒度分析分析产品质量，复合物大小约为180-200nm。

Lipofectamine2000阳离子复合物制备方法：

a.将mRNA溶解于OptiMEM(Thermo)中，调节浓度为0.1mg/ml。

b.将lipofectamine2000溶解于OptiMEM(Thermo)中，所用体积与所用核酸质量的比值(v/w)为1:1到2:1之间，此处优选2:1。

c.静置15分钟即可。

脂质纳米颗粒的制备方法如下：

1.将hCGαmRNA和hCGβmRNA以摩尔比1:1混合溶解于PH＝4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml。

2.将递送制剂成分分别溶解于无水乙醇，并将总脂质浓度调整至6mg/ml。各脂质成分摩尔比例为：50％Dlin-MC3-DMA/DOTAP，38.5％cholesterol，10％DSPC，1.5％PEG-DMG或50％Dlin-MC3-DMA/DOTAP，40％cholesterol，7％DSPC，3％PEG-DMG或40％Dlin-MC3-DMA/DOTAP，50％cholesterol，10％DSPC，1.5％PEG-DMG。

3.微流控设备混合的方式将有机相与水相以1:3的体积比混合，利用微流控设备混合时流速控制为12ml/min。

4.所得混合液立刻用PH＝7.4的PBS溶液稀释100倍，使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分并浓缩至100μg/ml，所得即为包裹hCG的mRNA的脂质纳米颗粒。

实施例3

编码荧光素酶的mRNA为单链mRNA长度约为2000nt，其所表达荧光素酶可以在催化相应底物时发出荧光信号，因此可以用作报告基因研究制剂及给药方式对mRNA体内递送效率，分布，及表达的影响。此前研究发现通过皮下及静脉注射的方式可以在小鼠体内递送HCG的mRNA并能在小鼠血清中产生HCG蛋白。因此我们将皮下及静脉注射作为备选给药方式，在20μg的HCG(α，β链分开)mRNA中掺入5μg的荧光素酶mRNA，并参照实施例2中工艺制备LNP制剂(MC3)，通过不同给药方式对小鼠注射LNP制剂，利用小动物活体荧光成像***检测到的荧光素酶表达量即可以间接反映HCG的mRNA在体内的递送及表达情况。

使用尾静脉给药及皮下注射的方式导入包含5μg荧光素酶mRNA及20μg HCG mRNA的LNP制剂(MC3)。2小时后对给药小鼠注射荧光素酶底物，待10分钟后麻醉小鼠并通过荧光活体成像***观察荧光素酶在小鼠体内的表达情况(图2)。发现无论是利用静脉注射或是皮下注射的方式，在2小时后均可检测到荧光素酶mRNA的表达，皮下注射的小鼠荧光素酶仅在注射部位表达，静脉给药的小鼠荧光素酶表达在肝脏部位，静脉注射给药小鼠荧光素酶信号强度及范围大于皮下给药小鼠。然而在给药后24小时静脉给药小鼠肝脏已检测不到荧光信号，表明肝脏mRNA表达时间较短。皮下给药小鼠在24小时后仍有较高荧光信号，且信号可持续到给药后48小时以上。分析通过静脉给药mRNA表达较快但持续时间短但所表达分泌型蛋白可以直接通过肝脏进入外周循环，因此可以推测静脉注射可以较快表达HCG蛋白并较快产生药效。经皮下给药的mRNA表达较为持久，然而分泌型蛋白需要经过局部组织吸收才能进入血液循环，起效可能较慢。

实施例4

mRNA药物在小鼠体内可表达人绒毛膜***：包裹两种序列mRNA的LNP制剂(MC3)通过静脉或皮下注射方式递送到小鼠体内(每只注射包含20μg的mRNA)，给药后3和48小时检测小鼠血清中hCG蛋白含量。血样中的hCG蛋白经由hCG单链mRNA或hCGαmRNA和hCGβmRNA***给药后，通过小鼠自体细胞表达并释放入血。血液中的hCG蛋白含量通过蛋白ELISA法定量。实验结果如图3所示：比较了不同序列设计以及不同给药途径在给药后3小时及48小时，血清hCG的浓度。静脉给药后3小时hCGαmRNA和hCGβmRNA血清hCG浓度远高于hCG单链mRNA，且其表达量可维持至48小时。hCGαmRNA和hCGβmRNA皮下给药后3小时未检出血清hCG，但在48小时后检测出血清hCG。说明不同给药方式hCG表达后入血快慢及效率有显著差异。因此hCG的mRNA药物优选静脉注射。

实施例5

比较hCG mRNA和重组蛋白静脉给药后24小时内，血清hCG的浓度变化趋势。以静脉给药后2小时的值为标准线，给药6小时后hCG mRNA给药组呈上升趋势，至12小时才回落低于标准线。而重组蛋白给药组一直呈现下降趋势，而且下降速度高于mRNA给药组。说明重组蛋白入血后浓度一直在下降，而mRNA入血后还在持续表达蛋白，半衰期更长，由此可见采用mRNA药物的形式，在人或动物体内能达到更持久的表达效果，相比蛋白类药物具有优越性。实验结果如图4所示。

实施例6

hCG导致的小鼠子宫重量增加是评价hCG治疗效果的唯一指标，采用实施例2中制备得到的LNP(MC3)包裹hCGαmRNA和hCGβmRNA的脂质纳米颗粒作为核酸药物，对小鼠静脉和皮下给药(1μg/只)后3天称量小鼠子宫重量并与对照组小鼠子宫重量比较。实验结果如图5所示。给药后3天如小鼠子宫重量相比对照组有所增加则说明hCG已发挥药效。本实验参照中国药典2010版推荐的绒促性素生物测定方法，取3周龄雌性小鼠，采用静脉或者皮下的方式分别进行1次给药，72小时后测量小鼠子宫重量，观察药效。本实验发现一次给药后第三天实验组小鼠子宫相比对照组有明显增加。且静脉及皮下给药均能达到效果。前期多次实验已确定利用中检院提供重组hCG蛋白质制剂3天连续三次高剂量给药后子宫重量约为30-60mg，因此说明mRNA药物一次给药即可相当于蛋白药物三次大剂量给药的效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海丽凡达生物技术有限公司

<120> 一种可用于激素补充的mRNA药物及其制备方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1798

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggagaccca agcuggcuag cgggagaaag cuuaccaugg agauguucca ggggcugcug 60

cuguugcugc ugcugagcau gggcgggaca ugggcaucca aggagccgcu ucggccacgg 120

ugccgcccca ucaaugccac ccuggcugug gagaaggagg gcugccccgu gugcaucacc 180

gucaacacca ccaucugugc cggcuacugc cccaccauga cccgcgugcu gcaggggguc 240

cugccggccc ugccucaggu ggugugcaac uaccgcgaug ugcgcuucga guccauccgg 300

cucccuggcu gcccgcgcgg cgugaacccc guggucuccu acgccguggc ucucagcugu 360

caaugugcac ucugccgccg cagcaccacu gacugcgggg gucccaagga ccaccccuug 420

accugugaug acccccgcuu ccaggacucc ucuuccucaa aggccccucc ccccagccuu 480

ccaaguccau cccgacuccc ggggcccucg gacaccccga uccucccaca augauuaaaa 540

cagcucuggg guuguuccca ccccagaggc ccacguggcg gccaguacac ugguauugcg 600

guaccuuugu acgccuguuu uauacucccu ucccccguaa cuuagaagca caauguccaa 660

guucaauagg aggggguaca aaccaguacc accacgaaca agcacuucug uucccccggu 720

gaggcuguau aggcuguuuc cacggcuaaa agcggcugau ccguuauccg cucauguacu 780

ucgagaagcc uaguaucacc uuggaaucuu cgaugcguug cgcucaacac ucaaccccag 840

aguguagcuu aggucgauga gucuggacgu uccucaccgg cgacgguggu ccaggcugcg 900

uuggcggccu accuguggcc caaagccaca ggacgcuagu ugugaacaag gugugaagag 960

ccuauugagc uaccugagag uccuccggcc ccugaaugcg gcuaauccua accacggagc 1020

aggcaguggc aauccagcga ccagccuguc guaacgcgca aguucguggc ggaaccgacu 1080

acuuugggug uccguguuuc cuuuuauuuu uacaauggcu gcuuauggug acaaucauug 1140

auuguuauca uaaagcaaau uggauuggcc auccggugag aauuugauua uuaaauuacu 1200

cucuuguugg gauugcuccu uugaaaucuu gugcacucac accuauugga auuaccucau 1260

uguuaagaua ucauggauua cuacagaaaa uaugcagcua ucuuucuggu cacauugucg 1320

guguuucugc auguucucca uuccgcuccu gaugugcagg auugcccaga augcacgcua 1380

caggaaaacc cauucuucuc ccagccgggu gccccaauac uucagugcau gggcugcugc 1440

uucucuagag cauaucccac uccacuaagg uccaagaaga cgauguuggu ccaaaagaac 1500

gucaccucag aguccacuug cuguguagcu aaaucauaua acagggucac aguaaugggg 1560

gguuucaaag uggagaacca cacggcgugc cacugcagua cuuguuauua ucacaaaucu 1620

ugaggacuag uuauaagacu gacuagcccg augggccucc caacgggccc uccuccccuc 1680

cuugcaccga gauuaauaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaag 1798

<210> 2

<211> 532

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggggcuagcg ccgccaccau ggacuacuac cgcaaauacg cagcuaucuu ucucgucacu 60

cucagugugu uccugcaugu gcugcacagu gcaccagacg uucaagacug cccugaaugc 120

acccuccaag agaacccauu cuucagucag ccuggcgcac ccauacucca gugcauggga 180

uguugcuucu caagggccua cccuacucca cugcggucaa agaagaccau gcuggugcag 240

aagaauguua caagugaauc cacaugcugc guugccaaau ccuauaaccg ggugacugug 300

augggugggu ucaaaguuga gaaucacacu gcaugucacu guucuacuug uuacuaucau 360

aagagcuagu gagcuggagc cucgguagcc guuccuccug cccgcugggc cucccaacgg 420

gcccuccucc ccuccuugca ccggcccuuc cuggucuuug aauaaagucu gagugggcag 480

caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ag 532

<210> 3

<211> 679

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggcuagcg ccgccaccau ggaaauguuu caaggccucc ugcuccugcu ccugcucuca 60

augggaggaa cuugggcuuc uaaggagcca cucagaccaa gguguaggcc uaucaacgca 120

acucucgcug uggagaaaga gggcugcccu gucuguauua cugucaacac aaccaucugu 180

gcagguuauu gcccaaccau gaccagggug cuccagggcg ugcugccagc acugccacag 240

guggugugua acuaccggga ugugcgguuc gaaagcauua gacucccagg gugucccaga 300

ggcgugaacc cagugguuuc auacgcagug gcccugucuu gccagugugc ucugugccgg 360

aggaguacaa ccgauugugg aggcccuaag gaccauccuc ugacuuguga ugauccacgc 420

uuucaagaua gcucuagcuc caaggcuccu ccuccauccc ucccuagucc cagcagacug 480

ccagggccua gugacacucc aauucugcca caguagugag cuggagccuc gguagccguu 540

ccuccugccc gcugggccuc ccaacgggcc cuccuccccu ccuugcaccg gcccuuccug 600

gucuuugaau aaagucugag ugggcagcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660

aaaaaaaaaa aaaaaaaag 679

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggctagcgcc gccacc 16

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagacccaag ctggctagcg ggagaaagct tacc 34

<210> 6

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctggagcct cggtagccgt tcctcctgcc cgctgggcct cccaacgggc cctcctcccc 60

tccttgcacc ggcccttcct ggtctttgaa taaagtctga gtgggcagc 109

<210> 7

<211> 738

<212> DNA

<213> 脊髓灰质炎II型病毒（Poliovirus type 2 IRES）

<400> 7

ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcca gtacactggt 60

attgcggtac ctttgtacgc ctgttttata ctcccttccc ccgtaactta gaagcacaat 120

gtccaagttc aataggaggg ggtacaaacc agtaccacca cgaacaagca cttctgttcc 180

cccggtgagg ctgtataggc tgtttccacg gctaaaagcg gctgatccgt tatccgctca 240

tgtacttcga gaagcctagt atcaccttgg aatcttcgat gcgttgcgct caacactcaa 300

ccccagagtg tagcttaggt cgatgagtct ggacgttcct caccggcgac ggtggtccag 360

gctgcgttgg cggcctacct gtggcccaaa gccacaggac gctagttgtg aacaaggtgt 420

gaagagccta ttgagctacc tgagagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcctaacca 480

cggagcaggc agtggcaatc cagcgaccag cctgtcgtaa cgcgcaagtt cgtggcggaa 540

ccgactactt tgggtgtccg tgtttccttt tatttttaca atggctgctt atggtgacaa 600

tcattgattg ttatcataaa gcaaattgga ttggccatcc ggtgagaatt tgattattaa 660

attactctct tgttgggatt gctcctttga aatcttgtgc actcacacct attggaatta 720

cctcattgtt aagatatc 738

Claims

1.一种核酸药物，其特征在于，所述核酸药物包括编码绒毛膜***的mRNA；将绒毛膜***α亚基的编码区和绒毛膜***β亚基的编码区分别设置于不同的mRNA；

所述核酸药物包括hCGαmRNA和hCGβmRNA；

所述hCGαmRNA含有绒毛膜***α亚基的编码区、5’-帽结构、聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述hCGβmRNA含有绒毛膜***β亚基的编码区、5’-帽结构、聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述核酸药物包括由编码绒毛膜***的mRNA和脂质成分组成的脂质纳米颗粒；所述hCGα mRNA和所述hCGβmRNA的摩尔比为（1~2）：（1~2）。

2.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征在于，所述5’-帽结构为m7GpppG。

3.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征在于，所述聚腺苷酸含有60-120个腺苷。

4.根据权利要求3所述的核酸药物，其特征在于，所述聚腺苷酸含有80-100个腺苷。

5.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征在于，还含有内部核糖体进入序列。

6.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征在于，所述mRNA含有修饰的核苷酸。

7.根据权利要求6所述的核酸药物，其特征在于，所述修饰包括L-核苷修饰和/或2’-O-甲基化修饰。

8.根据权利要求6所述的核酸药物，其特征在于，mRNA含有修饰的UTP和/或CTP。

9.根据权利要求6所述的核酸药物，其特征在于，修饰的核苷酸包括UTP替换为pseudo-UTP。

10.根据权利要求6所述的核酸药物，其特征在于，修饰的核苷酸位于编码区、5’-UTR区、3’-UTR区和帽子区中至少一种。

11.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征在于，脂质成分和mRNA的质量比为（10-30）:1。

12.根据权利要求11所述的核酸药物，其特征在于，脂质成分和mRNA的质量比为20:1。

13.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征在于，所述脂质成分包括可质子化阳离子脂质、胆固醇、辅助脂质和表面活性剂；

所述可质子化阳离子脂质选自DODMA、Dlin-MC3-DMA、Dlin-KC2-DMA或DlinDMA；

所述辅助脂质选自DSPC、DOPE、DOPC或DOPS。

14.根据权利要求13所述的核酸药物，其特征在于，所述可质子化阳离子脂质选自Dlin-MC3-DMA。

15.根据权利要求13所述的核酸药物，其特征在于，所述可质子化阳离子脂质占所述脂质成分摩尔含量的20-50%。

16.根据权利要求13所述的核酸药物，其特征在于，所述胆固醇占所述脂质成分摩尔含量的20-50%。

17.根据权利要求13所述的核酸药物，其特征在于，所述辅助脂质选自DSPC。

18.根据权利要求13所述的核酸药物，其特征在于，所述辅助脂质占所述脂质成分摩尔含量的5-20%。

19.根据权利要求13所述的核酸药物，其特征在于，所述表面活性剂包括PEG修饰的脂质和/或水溶性表面活性剂。

20.根据权利要求19所述的核酸药物，其特征在于，所述PEG修饰的脂质包括PEG-DMG或PEG-DSPE。

21.根据权利要求20所述的核酸药物，其特征在于，所述PEG修饰的脂质包括PEG-DMG。

22.根据权利要求19所述的核酸药物，其特征在于，所述PEG修饰的脂质占所述脂质成分摩尔含量的1-5%。

23.根据权利要求22所述的核酸药物，其特征在于，所述PEG修饰的脂质占所述脂质成分摩尔含量的3%。

24.根据权利要求19述的核酸药物，其特征在于，所述水溶性表面活性剂包括Tween20、Tween 80、P188或PVA。

25.根据权利要求19所述的核酸药物，其特征在于，所述水溶性表面活性剂和所述脂质成分的重量体积比为0.2-2%。

26.根据权利要求25所述的核酸药物，其特征在于，所述水溶性表面活性剂和所述脂质成分的重量体积比为1%。

27.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征在于，所述hCGα mRNA和所述hCGβmRNA的摩尔比为（1~1.5）：（1~1.5）。

28.根据权利要求27所述的核酸药物，其特征在于，所述hCGα mRNA和所述hCGβmRNA的摩尔比为1:1。

29.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征在于，所述核酸药物包括所述hCGα mRNA和所述hCGβmRNA，用于递送所述hCGα mRNA和所述hCGβmRNA的递送制剂包括Dlin-MC3-DMA。

30.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征在于，所述核酸药物的给药方式包括静脉给药和皮下给药。

31.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征在于，所述核酸药物的给药方式为静脉给药。

32.权利要求1-31任一项所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，包括：将mRNA溶解于水相得到含有mRNA的溶液，得到第一混合物；将所述脂质成分溶解于有机相，得到第二混合物；将所述第一混合物和所述第二混合物混合，得到第三混合物；然后执行（a）或（b）：

（a）先稀释所述第三混合物，然后浓缩，得到所述核酸药物；

（b）去除所述第三混合物中的有机相后，得到所述核酸药物。

33.根据权利要求32所述的制备方法，其特征在于，所述mRNA由DNA模板转录得到。

34.根据权利要求33所述的制备方法，其特征在于，采用体外转录获取mRNA。

35.根据权利要求34所述的制备方法，其特征在于，将线性化的DNA模板，在RNA聚合酶的催化下，采用体外转录获取mRNA。

36.根据权利要求34所述的制备方法，其特征在于，体外转录mRNA的原料包括ATP、CTP、pseudo-UTP、GTP和ARCA帽子。

37.根据权利要求32所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述水相包括缓冲液。

38.根据权利要求37所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。

39.根据权利要求38所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为柠檬酸盐缓冲液。

40.根据权利要求39所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸盐缓冲液的pH为3.5~4.5。

41.根据权利要求32所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述第一混合物中，mRNA的浓度为0.05~0.15mg/mL。

42.根据权利要求41所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述第一混合物中，mRNA的浓度为0.1 mg/mL。

43.根据权利要求32所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述核酸药物中脂质纳米颗粒的浓度为50-200μg/ml。

44.根据权利要求32所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述稀释所述第三混合物包括将所述第三混合物稀释50-100倍。

45.根据权利要求32所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述去除所述第三混合物中的有机相包括使用切向流过滤去除所述第三混合物中的有机相。

46.根据权利要求32所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述有机相包括无水C1~C4低碳醇。

47.根据权利要求46所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述无水C1~C4低碳醇为无水乙醇。

48.根据权利要求32所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述第二混合物中，所述脂质成分的浓度为4~8 mg/mL。

49.根据权利要求48所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述第二混合物中，所述脂质成分的浓度为6 mg/mL。

50.根据权利要求32所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述第一混合物和所述第二混合物按照体积比为1：（2~4）混合。

51.根据权利要求50所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述第一混合物和所述第二混合物按照体积比为1:3混合。

52.根据权利要求32所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，所述第一混合物和所述第二混合物是使用微流控设备混合的。

53.根据权利要求52所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，利用微流控设备混合时流速控制为3mL/min-24mL/min。

54.根据权利要求53所述的核酸药物的制备方法，其特征在于，利用微流控设备混合时流速控制为12 mL/min。