UA124182C2 - Спосіб покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду - Google Patents

Abstract

Винахід стосується способу покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду порівняно з фізіологічно активним білком або пептидом, не кон’югованим з Fc-фрагментом імуноглобуліну, де спосіб включає кон’югацію фізіологічно активного білка або пептиду з N-кінцем Fc-фрагмента імуноглобуліну через непептидильний полімер рН від 5,0 до 7,0, де фізіологічно активним білком або пептидом є ексендин-4, глюкагон, глюкагоноподібний пептид-1 (GLP-1), глюкагоноподібний пептид-2 (GLP-2) або оксинтомодулін, і де непептидильний полімер є поліетиленгліколем.

Description

імуноглобуліну, де спосіб включає кон'югацію фізіологічно активного білка або пептиду з М- кінцем Ес-фрагмента імуноглобуліну через непептидильний полімер рН від 5,0 до 7,0, де фізіологічно активним білком або пептидом є ексендин-4, глюкагон, глюкагоноподібний пептид- 1 (СІ Р-1), глюкагоноподібний пептид-2 (СІ Р-2) або оксинтомодулін, і де непептидильний полімер є поліетиленгліколем.

Ве інеулів . паси тривале дії с о. ще

ІЗ і

З Х 8 5 й за 12 їй за реззинмість (МИ, мароснов неуміну)

Фіг

Винахід стосується способу покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду у порівнянні з розчинністю фізіологічно активного білка або пептиду, не кон'югованого з

Ес-фрагментом імуноглобуліну, який полягає у кон'югації фізіологічно активного білка або пептиду з Ес-фрагментом імуноглобуліну. Також винахід стосується композиції, призначеної для покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду, що містить Ес-фрагмент імуноглобуліну та покращує цю розчинність у порівнянні з композицією без Ес-фрагменту імуноглобуліну.

Лікарські засоби виявляють свої фармакологічні дії лише після їх розчинення, отже розчинність лікарських засобів тісно пов'язана з їх ефективністю. Водорозчинні лікарські засоби можна легко отримати у вигляді ін'єкційних композицій та у разі їх вживання у вигляді таблеток розчинюються у шлунково-кишковому тракті. Однак лікарські засоби з поганою водорозчинністю у разі застосування без солюбілізації будуть опинятися у шлунково-кишковому тракті у вигляді агрегатів, як-то грудочок та вони не розчинюються на окремі молекули та погано поглинаються.

Крім того застосування лікарських засобів з поганою водорозчинністю у вигляді ін'єкційних композицій без солюбілізації призводить до закупорювання кровоносних судин, що викликає згортання крові. Отже, лікарські засоби з поганою водорозчинністю не можна застосовувати у вигляді ін'єкційних композицій та розчинність лікарських засобів є головною проблемою при отриманні ліків.

Одним з відомих способів солюбілізації є застосування поверхнево-активного засобу, як солюбілізатора. Поверхнево-активні засоби мають як гідрофобні, так і гідрофільні групи у кожній молекулі. У воді гідрофобні вуглеводневі ланцюги секвеструються всередині та на гідрофільні групи діє вода з утворенням сферичних міцел. Ці лікарські засоби може бути розчинено інкапсулюванням у міцелах, проте якщо в цьому способі застосовано поверхнево-активний засіб з високою концентрацією, то вони можуть бути неприйнятними для внутрішньовенного введення. До того ж розведення мікроемульсій нижче критичної концентрації міцел поверхнево- активних засобів може викликати осаджування лікарського засобу у міцелах (ЧоигпаїЇ ої

Адуапсейд Рпаптасу Едисайоп 8 Резеагсй 2(1)32-67 (2012) ІБ5М 2249-3379). Відповідно існує потреба у способі постійного збільшення розчинності лікарського засобу без залежності від концентрації композиції без застосування поверхнево-активних засобів.

Зо Винахідники здійснили багато зусиль у цій галузі, щоб розробити спосіб, здатний покращити розчинність лікарського засобу, як-то фізіологічно активного білка або пептиду. В результаті було відкрито, що у разі кон'югації Ес-фрагменту імуноглобуліну з фізіологічно активним білком або пептидом розчинність цього фізіологічно активного білка або пептиду ефективно збільшується, що надає можливість легко отримати композицію, яка містить цей фізіологічно активний білок або пептид з фармацевтично ефективною концентрацією, тим самим завершуючи цей винахід.

Метою цього винаходу є отримання способу покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду у порівнянні з розчинністю фізіологічно активного білка або пептиду, який не є кон'юговано з Ес-фрагментом імуноглобуліну, способу, який полягає у кон'югації фізіологічно активного білка або пептиду з Ес-фрагментом імуноглобуліну.

Іншою метою цього винаходу є отримання композиції, призначеної для покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду, що містить Ес-фрагмент імуноглобуліну та яка покращує цю розчинність у порівнянні з композицією без Ес-фрагменту імуноглобуліну.

Якщо фізіологічно активний білок або пептид кон'юговано відповідно за винаходом з Ес- фрагментом імуноглобуліну, то розчинність фізіологічно активного білка або пептиду можна ефективно покращити, що тим самим може бути ефективно застосовано для отримання різних лікарських засобів.

Опис Фігур.

На Фіг. 1 наведено стандартні калібрувальні графіки інсуліну та кон'югату інсуліну тривалої дії.

На Фіг. 2 наведено результат перевірки розчинності інсуліну та кон'югату інсуліну тривалої дії за композицією, наведеною у Таблиці 1, в якому розчинність інсуліну складає 0,628 мг/мл та розчинність кон'югату інсуліну тривалої дії складає 15 мг/мл (на основі інсуліну).

На Фіг. З наведено стандартні калібрувальні графіки похідної оксинтомодуліну з послідовністю ЗЕО ІО Ме: 27 та кон'югату похідної оксинтомодуліну-ПЕГ-Рс-фрагменту імуноглобуліну.

На Фіг. 4 наведено результат перевірки розчинності похідної оксинтомодуліну з послідовністю ЗЕО ІО Ме: 27 та кон'югату похідної оксинтомодуліну-ПЕГ- Ес-фрагменту імуноглобуліну за композицією, наведеною у Таблиці 4, в якому розчинність похідної оксинтомодуліну складає 0,188 мг/мл та розчинність цього кон'югату складає 11 мг/мл (на основі оксинтомодуліну).

Один з аспектів цього винаходу стосується способу покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду у порівнянні з фізіологічно активним білком або пептидом, якій не кон'юговано до Ес-фрагменту імуноглобуліну та цей спосіб полягає у кон'югації фізіологічно активного білка або пептиду з Ес-фрагментом імуноглобуліну.

У особливому втіленні, застосований у способі за винаходом Ес-фрагмент імуноглобуліну є

Ес-фрагментом, отриманим з імуноглобуліну Ідс, ІдА, дО, ЧЕ або ІЗ9М.

У іншому особливому втіленні, застосований у способі за винаходом Ес-фрагмент імуноглобуліну є гібридом з доменів, в якому кожний домен має інше походження та походить від імуноглобуліну, вибраного з групи, яка складається з дос, ІдА, дО, ІДЕ та І9ЗМ.

У іншому особливому втіленні, застосований у способі за винаходом Ес-фрагмент імуноглобуліну є димером або мультимером, який складається з одноланцюгових імуноглобулінів однакового походження.

У іншому особливому втіленні, застосований у способі за винаходом Ес-фрагмент імуноглобуліну є аглікозилованим Ес-фрагментом людського імуноглобуліну Ідс4.

У іншому особливому втіленні, операція отримання кон'югату за винаходом полягає у прикріпленні фізіологічно активного білка або пептиду до Ес-фрагменту імуноглобуліну через непептидильний полімер.

У іншому особливому втіленні, отриманий із застосуванням способу за винаходом кон'югований з Ес-фрагментом імуноглобуліну фізіологічно активний білок або пептид є у вигляді злитого білку.

У іншому особливому втіленні, застосований у способі за винаходом непептидильний полімер є поліетиленгліколем.

У іншому особливому втіленні, застосований у способі за винаходом непептидильний полімер вибрано з групи, яка складається з поліпропіленгліколю, кополімеру етиленгліколю та пропіленгліколю, поліоксиетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілового етеру, біорозкладаного полімеру, як-то полімолочной кислоти (РІА) та

Зо полілактид-ко-гліколіду (РІ СА), ліпідного полімеру, хітину, гіалуронової кислоти та їх комбінації.

У іншому особливому втіленні, спосіб за винаходом полягає у збільшенні розчинності фізіологічно активного білка або пептиду у водному розчині.

У іншому особливому втіленні, застосований у способі за винаходом водний розчин містить лимоннокислий або оцтовокислий буферний розчин, полісорбат, як неіонний поверхнево- активний засіб, маніт, як цукроспирт та хлорид натрію або метіонін, як ізотонічний засіб.

У іншому особливому втіленні застосований у способі за винаходом водний розчин має рн 5,0- 7,0.

У іншому особливому втіленні застосованим у способі за винаходом фізіологічно активним білком або опептидом є ексендин-4, глюкагон, глюкагоноподібний пептид-! (СІ Р-1), глюкагоноподібний пептид-2 (СІ Р-2), паратиреоїдний гормон (РТН), кальцитонін, інсулін або оксинтомодулін.

У іншому особливому втіленні застосований у способі за винаходом водний розчин також містить поверхнево-активний засіб.

У іншому аспекті передбачено композицію для покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду, що містить Ес-фрагмент імуноглобуліну та покращує цю розчинність у порівнянні з композицією без Ес-фрагменту імуноглобуліну.

У особливому втіленні ця композиція містить кон'югат фізіологічно активного білка або пептиду та Ес-фрагмент імуноглобуліну, в якому фізіологічно активний білок або пептид приєднано до Ес-фрагменту імуноглобуліну через пептидильний або непептидильний лінкер, як активний інгредієнт.

Винахід стосується способу покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду у порівнянні з некон'югованим до Ес-фрагменту імуноглобуліну фізіологічно активним білком або пептидом, який полягає у кон'югації цього фізіологічно активного білка або пептиду з

Ес-фрагментом імуноглобуліну. Застосування цього способу за винаходом призводить до появи ефекту покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду навіть без додавання до розчинника поверхнево-активного засобу. У випадку застосування фізіологічно активного білка або пептиду, особливо інсуліну, оксинтомодуліну тощо, який є компонентом відомих білкових лікарських засобів, він має низьку розчинність з рН у діапазоні 5-7, який є основним діапазоном рН для композицій, призначених для введення у організм. Відповідно існують труднощі у отриманні в композиціях фізіологічно активного білка або пептиду в бажаній концентрації. Також існує проблема, обумовлена тим, що ці ін'єкційні композиції у разі введення в організм можуть викликати осаджування, що стає причиною непередбачених побічних дій.

Неочікувано винаходом було підтверджено, що цей білок буде мати збільшену розчинність у разі, коли рН знаходиться у зазначених вище межах та фізіологічно активний білок або пептид кон'юговано з Ес-фрагментом імуноглобуліну. Інакше кажучи, застосування способу за винаходом призводить до покращення розчинності білка або пептиду, як-то інсуліну або оксинтомодуліну, який має низьку розчинність в умовах слабокислого рН 5-7.

Як тут застосовано, термін "розчинність" означає ступінь, до якої фізіологічно активний білок або пептид розчиняється у прийнятному для введення у організм людини розчиннику та більш детально, він стосується ступеня насичення розчиненої речовини у цьому розчиннику при певній температурі. Розчинність може бути виміряно шляхом визначення концентрації розчиненої речовини у точці насичення. Наприклад, цю концентрацію може бути виміряно, але без обмеження, із застосуванням Уф-спектрофотометрії або ВЕРХ-хроматографії після додавання до розчиннику надлишкової кількості речовини для розчинення з наступним перемішуванням та фільтрацією отриманого розчину. Для застосування фізіологічно активного білка або пептиду з лікувальною метою, важливо розчинити його фармацевтично ефективну кількість у розчиннику, який є важливим фактором, який слід враховувати у визначенні концентрації лиофилизированої композиції одразу після його відновлення або концентрації активного інгредієнта рідкої композиції.

Було підтверджено, що у випадку, коли фізіологічно активний білок або пептид кон'юговано з

Ес-фрагментом імуноглобуліну, його розчинність помітно збільшується у порівнянні з розчинністю фізіологічно активного білка або пептиду, до якого не приєднано такого фрагменту.

Отриманий на основі цього факту винахід відрізняється покращенням розчинності фізіологічно активного білка або пептиду у водному розчині.

Згідно за втіленням цього винаходу, спостерігається помітне збільшення розчинності у разі застосування інсуліну або оксинтомодуліну, як типового фізіологічно активного пептиду з кон'югованим з ним Ес-фрагментом імуноглобуліну (Фіг. 2 та 4).

Зо Як тут застосовано, термін "водний розчин" означає розчин, призначений для розчинення фізіологічно активного білка або пептиду. Цей водний розчин є розчином, прийнятним для введення фізіологічно активного білка або пептиду в організм людини. У особливому втіленні винаходу цей водний розчин може мати нейтральний або слабокислий рн, наприклад, рН 5,0 - 7,0. Застосований у способі за винаходом водний розчин не обмежено певним типом, але він може містити лимоннокислий або оцтовокислий буферний розчин, що містить полісорбат, як неіонний поверхнево-активний засіб, маніт, як цукроспирт та хлорид натрію або метіонін, як ізотонічний засіб.

У способу за винаходом Ес-фрагмент імуноглобуліну може бути приєднано до фізіологічно активного білка або пептиду через непептидильний полімер. Точніше кажучи, Ес-фрагмент імуноглобуліну може бути приєднано до непептидильного полімеру, приєднано до фізіологічно активного білка або пептиду або до фізіологічно активного білка або пептиду може бути приєднано Ес-фрагмент імуноглобуліну з непептидильним полімером.

Як тут застосовано, термін "непептидильний полімер" означає біосумісний полімер, який містить одну або більше одиниць, які повторюються, зв'язаних між собою ковалентним зв'язком за виключенням пептидного зв'язку.

Непептидильний полімер, який може бути застосовано у винаході може бути вибрано з групи, яка складається з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етиленгліколю та пропіленгліколю, поліоксиетилованих поліолів, полівінілового спирту, полісахаридів, декстрану, полівінілового етеру, біорозкладаних полімерів, як-то РА (полімолочна кислота) та РІ СА (полілактид-ко-гліколід), ліпідних полімерів, хітинів, гіалуронової кислоти та їх комбінацій та переважно, але без обмеження, він є поліетиленгліколем. Також обсяг винаходу охоплює й добре відомих у цій галузі похідних цих сполук, які фахівці в цій галузі можуть легко отримати.

Будь-який непептидильний полімер може бути застосовано без обмеження, допоки він є полімером, який має стійкість до протеолітичних ферментів іп мімо, отже він не так легко розщеплюється цими протеолітичними ферментами, що дозволяє Ес-фрагменту імуноглобуліну виконувати функцію носія. Непептидильний полімер має молекулярну масу 1-100 кДа та зокрема 1-20 кДа. Крім того, непептидильний полімер винаходу, прикріплений до Ес-фрагмента імуноглобуліну може бути одним полімером або поєднанням інших типів полімерів.

Непептидильний полімер може мати реакційну групу, здатну зв'язуватися з Ес-фрагментом імуноглобуліну та з білоювим або пептидним лікарським засобом, отже має функції лінкера, зв'язуючи Ес-фрагмент імуноглобуліну та цей білок або пептид.

Зв'язування фізіологічно активного білка або пептиду з Ес-фрагментом імуноглобуліну із застосуванням непептидильного полімеру, як лінкера може бути досягнуто шляхом послідовного здійснення (1) реакції непептидильного полімеру з будь-яким фізіологічно активним білком або пептидом та Ес-фрагментом імуноглобуліну; та (2) реакцією продукту реакції, отриманого внаслідок операції (1) з іншим фізіологічно активним білком або пептидом та Ес-фрагментом імуноглобуліну.

Однак, якщо Ес-фрагмент імуноглобуліну у операції (1) приєднано до непептидильного полімеру, який має реакційну групу на обох кінцях, то частина продуктів, отриманих внаслідок операції (1) може мати місток, в якому два М-кінця Ес-фрагменту імуноглобуліну у певних реакційних умовах прикріплено до обох кінців непептидильного полімеру. Отримані у операції (1) ці місткові продукти можуть додатково запобігати виникненню вторинної реакції зв'язування фізіологічно активного білка або пептиду або може значно зменшити кількість такого зв'язування. Отже, у втіленні, для запобігання утворенню містків між Ес-фрагментами імуноглобуліну, спочатку може бути здійснено реакцію між непептидильним полімером та фізіологічно активним білком або пептидом, а потім може бути послідовно здійснено реакцію між непептидильним полімером з приєднаним до нього фізіологічно активним білком або пептидом та Ес-фрагментом імуноглобуліну. Однак не існує потреби до здійснення зазначеного способу покращення розчинності за винаходом саме таким чином.

Зазначену у операції (1) хімічну реакцію зв'язування непептидильного полімеру з фізіологічно активним білююм або пептидом або Ес-фрагментом імуноглобуліну може бути здійснено із застосуванням відомого у цій галузі способу. Наприклад, непептидильний полімер з реакційною групою на обох кінцях може вступати в хімічну реакцію з фізіологічно активним білком або пептидом або Ес-фрагментом імуноглобуліну з температурою 0-25 "С та час такої реакції буде складати 1-16 год. Протягом цієї реакції, фізіологічно активний білок або пептид або Ес-фрагмент імуноглобуліну може бути ковалентно зв'язано з зазначеним непептидильним полімером через реакційну групу.

Зо Реакцію зв'язування фізіологічно активного білка або пептиду з непептидильним полімером у операції (1) може бути здійснено у реакційному розчині, що містить органічний розчинник. У цьому випадку органічний розчинник може бути будь-яким, але без обмеження, органічним розчинником, який звичайно застосовують у цій галузі, особливо первинним, вторинним, третинним спиртом та спиртом, який має 1-10 атомів карбону. Точніше кажучи, цим спиртом може бути ізопропіловий спирт, етанол або метанол. Органічний розчинник може бути легко вибрано з органічних розчинників, прийнятних для застосування з цим типом фізіологічно активного білка або пептиду. Крім того, кількість органічного розчинника, якого може бути застосовано для зв'язування між фізіологічно активним білююм або пептидом та непептидильним полімером головним чином складає, але без обмеження, 10-60 95, більш точніше 30 95 - 55 95 та більш точніше 45 95 - 55 95 відносно загальної кількості реакційного розчину. Показник рН реакційного розчину головним чином може складати, але без обмеження, 4,5-7,0 та більш точніше кажучи 5,0-6,5.

У залежності від типу реакційної групи, яка бере участь у реакції, для здійснення наведених вище операцій до них може бути залучено відновник.

У цьому випадку під відновником за винаходом мається на увазі будь-який відомий у цій галузі відновник, функції якого полягають у відновленні оборотного імінного подвійного зв'язку, який виникає в результаті зв'язування альдегідної групи непептидильного полімеру та аміногрупи поліпептиду (яким є фізіологічно активний білок або пептид або Ес-фрагмент імуноглобуліну) з утворенням ковалентного зв'язку. Для досягнення цілей цього винаходу, відновник може бути включено до складу реакційного розчину з метою дозволити виникнення ковалентного зв'язку між непептидильним полімером та фізіологічно активним білком або пептидом або Ес-фрагментом імуноглобуліну. Відновником за винаходом може бути будь-який відомий у цій галузі відновник, наприклад, але без обмеження, ціаноборогідрід натрію, піридин- борановий комплекс, борогідрид натрію, диметиламін - борановий комплекс, триметиламін - борановий комплекс або триацетоксиборгідрид натрію. Прийнятний відновник може бути вибрано в залежності від характерних ознак фізіологічно активного поліпептиду або сталої ділянки імуноглобуліну та реакційного розчинника.

Також цей відновник може бути додано до кінцевої концентрації 1-20 мМ для реакції зв'язування (реакції операції (1)) між фізіологічно активним білком або пептидом та непептидильним полімером або між Ес-фрагментом імуноглобуліну та непептидильним полімером та до кінцевої концентрації 1-100 мМ для реакції сполучення (реакції операції (2)).

Слід зазначити, що непептидильний полімер може мати реакційну групу на обох кінцях та кожна така група здатна до зв'язування з Ес-фрагментом імуноглобуліну та фізіологічно активним білком або пептидом, точніше кажучи, кожна така реакційна група здатна до зв'язування з М-кінцевою аміногрупою або лізином або з тіоловою групою цистеїну фізіологічно активного білка або пептиду; або Ес-фрагменту імуноглобуліну. Головним чином цю реакційну групу на обох кінцях вибрано з групи, яка складається з реакційної альдегідної групи, пропіональдегідної групи, бутиральдегідної групи, малеїмідної групи та сукцинімідної похідної. У цьому випадку, сукцинімідною похідною може бути, але без обмеження, сукцинімідил- карбоксиметил, сукцинімідил валерат, сукцинімідил-метилбутаноат, сукцинімідил- метилпропіонат, сукцинімідил-бутаноат, сукцинімідил- пропіонат М-гідроксисукцинімід або сукцинімідил-карбонат. Будь-яку реакційну групу може бути застосовано без обмеження, допоки вона зв'язується з аміногрупою або тіоловою групою амінокислотного залишку Ес-фрагменту імуноглобуліну та фізіологічно активного білка або пептиду.

Зокрема, якщо зазначений непептидильний полімер має реакційну альдегідну групу на обох кінцях, то він буде ефективним у зв'язуванні обома кінцями з фізіологічно активним білком або пептидом та імуноглобуліном з мінімальними неспецифічними реакціями. Кінцевий продукт, отриманий в результаті відновного алкілування із застосуванням альдегідного зв'язку є набагато стійкішим, ніж продукт, зв'язаний амідним зв'язком. Альдегідна реакційна група вибірково зв'язується з М-кінцем в умовах низького рН та може зв'язуватися з лізиновим залишком (Гуз) з утворенням ковалентного зв'язку в умовах високого рН, наприклад, рН 9,0.

Реакційні групи на обох кінцях лінкера, як-то непептидильного полімеру можуть бути однаковими або відрізнятися між собою. Наприклад, лінкер може мати малеімідну групу на одному кінці та альдегідну, пропіональдегідну або бутиральдегідну групу на іншому кінці. Коли в якості непептидильного полімеру застосовують полієтиленгліколь з реакційними гідроксильними групами на обох кінцях, то ці гідроксильні групи може бути активовано у різні реакційні групи з допомогою відомих хімічних реакцій або для отримання білкового кон'югату за винаходом тривалої дії може бути застосовано наявний у продажу поліетиленгліколь з модифікованою реакційною групою.

До того ж, реакційні групи непептидильного полімеру можуть зв'язуватися, але без особливого обмеження, з М-кінцевою аміногрупою або аміногрупою бічного ланцюга лізинового залишку фізіологічно активного білка або пептиду та, відповідно, Ес-фрагменту імуноглобуліну.

У цьому разі цей лізиновий залишок фізіологічно активного білка або пептиду та Ес-фрагменту імуноглобуліну не є обмеженим у певному положенні та необмежені приклади такого лізинового залишку містять штучні амінокислоти та похідні лізину, допоки вони будуть мати аміногрупу, здатну до зв'язування з реакційною групою непептидильного полімеру, а також природний лізин.

Слід зазначити, що коли фізіологічно активний білок або пептид спочатку вступає в хімічну реакцію з непептидильним полімером у операції (1), їх молярне відношення у реакції складає 1:1-1:20 та у операції (2) відбувається реакція кон'югату фізіологічно активного білка або пептиду та непептидильного полімеру, який є продуктом операції (1) з Ес-фрагментом імуноглобуліну з молярним відношенням 1:0,5-1:10, але без обмеження.

Додатково спосіб за винаходом може полягати у відокремленні та очищенні кон'югату фізіологічно активного поліпептиду з непептидильним полімером або кон'югату Ес-фрагменту імуноглобуліну з непептидильним полімером, який є продуктом операції (1), отриманим перед початком операції (2). Цей процес може бути здійснено із застосуванням різних відомих у цій галузі способів відокремлення, як-то хроматографії.

У операції (2), якщо кон'югат фізіологічно активного поліпептиду з непептидильним полімером вступає в хімічну реакцію з Ес-фрагментом імуноглобуліну, то показник рН у розчині буде дорівнювати, але без особливого обмеження, 4,0-9,0.

Також слід зазначити, що фізіологічно активний білок або пептид та Ес-фрагмент імуноглобуліну може бути кон'юговано між собою у вигляді злитого (гібридного) білка.

Як тут застосовано, термін "злитий білок" означає білок, отриманий шляхом поєднання двох або більше генів, які у природних умовах кодують різні білки. Такий злитий білок може бути отримано штучним шляхом із застосуванням технологій рекомбінантної ДНК. Також цей злитий білок може існувати у вигляді фізіологічно активного білка або пептиду та Ес-фрагменту імуноглобуліну, зв'язаних між собою пептидильним лінкером або без застосування лінкера. "Пептидильний лінкер" тут означає пептидне зв'язування двох типів білка, які разом складають злитий білок. Цей пептидильний лінкер може бути включено, але без обмеження, з метою незалежного згортання двох білкових складових злитого білка або для збереження кожної функції цих двох білків навіть у вигляді злитого білка.

Як тут застосовано, термін "Рс-фрагмент імуноглобуліну" означає важколанцюгову сталу ділянку 2 (СН2) та важколанцюгову сталу ділянку З (СНЗ) імуноглобуліну, за виключенням змінних важко- та легколанцюгових ділянок, важколанцюгової сталої ділянки 1 (СНІ) та легколанцюгової сталої ділянки 1 (СІ 1) імуноглобуліну, а також він може містити шарнірну ділянку у важколанцюговій сталій ділянці. Також Ес-фрагмент імуноглобуліну за винаходом може бути розширеним Ес-фрагментом імуноглобуліну, який містить частину або всю важколанцюгову сталу ділянку 1 (СНІ) та/або легколанцюгову сталу ділянку 1 (СІ1) за виключенням змінних ділянок важких та легких ланцюгів імуноглобуліну, допоки він буде діяти суттєво так само або краще, ніж Ес-фрагмент імуноглобуліну природного білка. Також він може бути ділянкою, яка має делецію відносно великої частини амінокислотної послідовності СН2 та/або СНЗ. Інакше кажучи, Ес-фрагмент імуноглобуліну за винаходом може містити (1) домен

СНІ, домен СН2, домен СНЗ та домен СНА, (2) домен СНІ та домен СНІ, (3) домен СНІ та домен СНЗ, (4) домен СН2 та домен СНЗ, (5) поєднання одного або більше доменів сталої ділянки та шарнірну ділянку імуноглобуліну (або частину шарнірної ділянки) та (6) димер кожного домену важколанцюгових сталих ділянок та легколанцюгової сталої ділянки.

Стосовно цілей заявленого винаходу, Ес-фрагмент імуноглобуліну означає речовину, яка має ефект підвищення розчинності зв'язаного з ним лікарського засобу, тобто фізіологічно активного білка або пептиду та це також може мати відношення до носія лікарського засобу.

Як тут застосовано, термін "носій" означає речовину, яка зв'язується з лікарським засобом.

Звичайно носій зв'язується з лікарським засобом для збільшення або усунення фізіологічної активності лікарського засобу. Однак, стосовно цілей заявленого винаходу, носій за цим винаходом означає речовину, яка зводить до мінімуму зниження фізіологічної активності лікарського засобу та збільшує його стійкість іп мімо та тривалість ефективної дії, затримуючи

Зо доставляння лікарського засобу у кров з місця введення у разі підшкірного введення та водночас покращує розчинність цього білка або пептиду. Хоча для застосування в якості носіїв було досліджено різні речовини, як-то ліпіди, полімери тощо, однак цей винахід стосується застосування Ес-фрагменту імуноглобуліну, як носія, призначеного для збільшення тривалості дії іп мімо лікарського засобу, до якого прикріплено носій шляхом мінімізації зменшення його активності іп мімо, а також збільшення до максимуму його розчинності. До того ж, цей Ес- фрагмент імуноглобуліну є біорозкладаним поліпептидом, який може бути метаболізовано іп мімо, отже його можна безпечно застосувати, як носій лікарського засобу. Завдяки цим характеристикам може бути розроблено кон'югат, в якому Ес-фрагмент імуноглобуліну буде приєднано до фізіологічно активного білка або пептиду та який буде кон'югатом тривалої дії за винаходом.

Застосований для покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду за винаходом Ес-фрагмент імуноглобуліну також може бути приєднано до фізіологічно активного білка або пептиду або безпосередньо або через лінкер. У цьому разі, ділянку фізіологічно активного білка або пептиду, до якої приєднано Ес-фрагмент імуноглобуліну не є певним часом обмежено та можливо застосування будь-якого місця всередині цього білка або пептиду або можливо приєднання до його М- або С-кінця. Однак, для того, щоб дозволити отриманому із застосуванням способу за винаходом кон'югату фізіологічно активного білка або пептиду з Ес- фрагментом імуноглобуліну виявити фізіологічну активність після введення його в організм людини переважно застосовують вибір ділянки, яка не буде пригнічувати цієї фізіологічної активності відповідно від типу фізіологічно активного білка або пептиду, але не обмежуючись цим.

Крім того, завдяки малій молекулярній масі, застосування Ес-фрагменту імуноглобуліну є більш бажаним з точки зору отримання, очищення та виходу кон'югату, ніж застосування повної молекули імуноглобуліну. Також, оскільки цей фрагмент позбавлено Рар-ділянки, яка має високу гетерогенність через відмінності амінокислотної послідовності різних антитіл, очікується, що його застосування значно покращить гомогенність та зменшить можливість викликання антигенних властивостей клітин крові.

Також Рс-фрагмент імуноглобуліну за винаходом охоплює не тільки амінокислотну послідовність природного походження, але й послідовність її похідних. Під похідною амінокислотної послідовності мається на увазі, що вона має один або більше амінокислотних залишків, які відрізняються від амінокислотної послідовності дикого типу та можуть виникати у природі або їх може бути штучно отримано. Ес-фрагмент імуноглобуліну містить похідні, які є результатом делеції, вставки, консервативного або неконсервативного заміщення або їх поєднання. Вставку звичайно отримують шляхом додавання безперервної амінокислотної послідовності розміром 1-20 амінокислот або її може бути отримано з більш довгої послідовності. Делеція звичайно зачіпає приблизно 1-30 амінокислотних залишків. Способи отримання похідних послідовності Ес-фрагменту імуноглобуліну наведено у Міжнародних патентних публікаціях МоМо УМО 97/34631 та МО 96/32478, включених сюди шляхом посилання.

Також в цій галузі відомі заміни амінокислот у білках та пептидах, які звичайно не змінюють активності молекул (Н. Меншгайй, К.Г. НІЇЇ, Тпе Ргоїеіп5, ("Білки") Асадетіс Ргез5, Мем/ ХогкК, 1979).

Найбільш поширеними амінокислотними замінами є заміни АїЇа/Зег, має, А5р/сІмМ, Тпг/5ег,

АІа/Спу, АІа/ТНтг, бЗег/Авзп, АІа/Маї, Зе/Сіу, Тну/Рпе, АїІа/Рго, І уз/Ага, Азр/Авп, І еш/ЛІє, Геш/маї,

АІа/СіІш та Азр/сС1у, які відбуваються у обох напрямках. Крім того, Ес-фрагмент імуноглобуліну при бажанні може бути модифіковано шляхом фосфорилювання, сульфатування, акрилування, гликозилування, метилування, фарнезилування, ацетилювання, амідування тощо.

Вищезазначена похідна Ес-ділянки імуноглобуліну може бути похідною, яка має біологічну активність, еквівалентну біологічній активності Ес-ділянки імуноглобуліну за винаходом, але має підвищену структурної стійкість цієї ділянки до впливу тепла, рН тощо.

Також Ес-фрагмент імуноглобуліну може бути отримано з матеріалу природного типу, виділеного з організму людини або тварин, як-то корів, кіз, свиней, мишей, кролів, хом'яків, щурів, морських свинок тощо або це можуть бути його рекомбінантні конструкції чи похідні, отримані з трансформованих тваринних клітин або мікроорганізмів. Також їх може бути отримано з природного імуноглобуліну шляхом виділення цілих імуноглобулінів з організму людини або тварини та їх обробкою протеолітичним ферментом. Папаїн розщеплює природний імуноглобулін у Рабр та Ес ділянках та обробка пепсином призводить до отримання фрагментів рес та Е(ар)». Ці фрагменти може бути піддано, наприклад, ексклюзійній хроматографії для

Зо виділення Ес або рЕ'с. Наприклад, Ес-фрагмент імуноглобуліну за винаходом може бути отриманим з мікроорганізму рекомбінантним Рс-фрагментом імуноглобуліну людського походження.

Крім того, Ес - ділянка імуноглобуліну за винаходом може існувати у формі, яка має природні цукрові ланцюги, збільшені або зменшені у порівнянні з природною формою цукрові ланцюги або може існувати у деглікозилованій формі. Збільшеного або зменшеного глікозилування або деглікозилування імуноглобулінового Ес-фрагменту може бути досягнуто із застосуванням стандартних способів, наприклад, хімічного способу, ферментативного способу або генно- інженерного способу із застосуванням мікроорганізмів. Причому, у разі деглікозилування, комплемент (С14), який зв'язується з Ес-фрагментом імуноглобуліну стає значно скороченим зі зменшенням або усуненням залежної від антитіл або залежної від комплементу цитотоксичності, що таким чином не викликає непотрібних імунних реакцій іп мімо. У цьому контексті, деглікозиловані або аглікозиловані Ес-фрагменти імуноглобуліну більш відповідають призначенню носіїв лікарського засобу.

Як тут застосовано, термін "деглікозилування" означає ферментативне усунення цукрових функціональних груп з Ес-фрагменту імуноглобуліну та термін "аглікозилування" означає, що

Ес-фрагмент імуноглобуліну отримано у неглікозилованій формі від прокаріотів, переважніше від Е. соїї.

Слід зазначити, що Ес-фрагмент імуноглобуліну може походити від людини або від інших тварин, включаючи корів, кіз, свиней, мишей, кролів, хом'яків, щурів та морських свинок та переважно він має людське походження. До того ж, Ес-фрагмент імуноглобуліну може бути Ес- фрагментом, який походить від імуноглобулінів типу дос, ІдА, дО, ЧЕ та ДМ або якого може бути отримано із застосуванням їх комбінацій або гібридів. Переважно він походить від імуноглобулінів типу (дО або ІДдМ, які є одними з найбільш поширених білків у крові людини та ще переважніше він походить від імуноглобулінів типу дос, які, як відомо, збільшують час напівжиття ліганд-зв'язуючих білків.

Слід зазначити, що, як тут застосовано, термін "комбінація" означає, що поліпептиди, які кодують одноланцюгові Ес-фрагменти імуноглобуліну однакового походження зв'язано з одноланцюговим поліпептидом іншого походження з утворенням димеру або мультимеру.

Інакше кажучи, димер або мультимер може бути отримано з двох або більш фрагментів, вибраних з групи, яка складається з фрагментів де Ес, ІдА Ес, І9ДМ Ес, дО Ес та ІЧЗЕ Ес.

Термін "гібрид", як тут застосовано, означає, що у одноланцюговому Ес-фрагменті імуноглобуліну присутні послідовності, які кодують два або більше Ес-фрагмента імуноглобуліну різного походження. У цьому винаході можливо застосування різних типів гібридів. Інакше кажучи, доменні гібриди можуть складатися з 1 - 4 доменів, вибраних з групи, яка складається з фрагментів СНІ, СН2, СНЗ та СНА Ес-ділянки імуноглобуліну Ідс, І9М, ІдА, ІДЕ та дО та може містити шарнірну ділянку.

Слід зазначити, що імуноглобуліни ЇД0 можна розділити на підкласи Ідс1, Ідс2, доз та

Ід04 та цей винахід також стосується комбінацій та гібридів цих підкласів. Переважним є застосування підкласів ІдДо2 та Ідс4 та найбільш бажаним є застосування Ес-фрагменту Ідс4ї, який рідко має ефекторні функції, як-то комплемент-залежну цитотоксичність (СОС).

Ес-фрагмент імуноглобуліну за винаходом може також бути у рекомбінантній формі, в якій шарнірну ділянку приєднано до його М-кінця. В цьому випадку, виражені у вигляді агрегатів Ес- фрагменти імуноглобуліну не викликають втрату активності. Також вони є Ес - фрагментами у вигляді активного димеру або мономеру, який не має стартового метіонінового залишку, який кодується ініціюючим кодоном, отже мають переваги з точки зору солюбілізації та рефолдингу.

Відповідний Ес-фрагмент імуноглобуліну за винаходом детально описано у Патентах Кореї

МоМо 755315, 775343 та 824505, включених сюди шляхом посилання.

Отже, найбільш бажаним Ес-фрагментом імуноглобуліну, застосованим, як носій лікарського засобу для злитого білка з інсуліном та оксинтомодуліном за винаходом є неглікозилована Ес- ділянка, яка походить від людського імуноглобуліну Ідс4. Ес-фрагмент людського походження є більш бажаним, ніж Ес-фрагмент іншого походження, який може діяти, як антиген у організмі людини та викликати небажані імунні відповіді, як-то призводити до появи нових антитіл проти цього антигену.

Як тут застосовано, термін "фізіологічно активний білок або пептид" має відношення до білка або пептиду, який регулює генетичну експресію або фізіологічні функції. З точки зору цілей цього винаходу, сюди може бути включено будь-який фізіологічно активний білок або пептид без обмеження, допоки він буде збільшувати розчинність.

Слід зазначити, що зазначені тут амінокислоти скорочено наступним чином відповідно за правилами номенклатури ІОРАС-ІВ:

Аланін: Айа або А; Аргінін: Агод або К;

Аспарагін: Азп або М; Аспарагінова кислота: Ар або 0;

Цистеїн: Су або С; Глютамінова кислота: Сім або Е;

Глютамін: Сіп або СО); Гліцин: СіІу або 0;

Гістидин: Ні або Н; Ізолейцин: Пе або І;

Лейцин: І еи або І; Лізин: І ух або К;

Метіонін: Меї або М; Фенілаланін: Рпє або Е;

Пролін: Рго або Р; Серин: Зег або 5;

Треонін: Тиг або Т; Триптофан: Тгр або МУ;

Тирозин: Туг або У; Валін: Маї або М;

Крім того, в даному описі для амінокислот може бути застосовано одно- та трибуквені коди.

Поняття фізіологічно активного білка або пептиду на додаток до природного фізіологічно активного білка або пептиду також охоплює всі його похідні, фрагменти та варіанти.

Як тут застосовано, термін "похідна" означає пептид, що має хімічне заміщення (наприклад, альфа-метилування, альфа-гідроксилування), делецію (наприклад, дезамінування) або модифікацію (наприклад, М-метилування) певної групи амінокислотних залишків у амінокислотній послідовності природного фізіологічно активного білка або пептиду. До цього терміну також може бути включено пептидоміметик, який зберігає активні властивості природного фізіологічно активного пептиду без гомології з його послідовністю.

Як тут застосовано, термін "пептидоміметик" означає білковоподібний ланцюг, який було розроблено для імітування пептиду. Прикладом такого пептидоміметика, але без обмеження, може бути Ю-пептидоміметик, який містить ЮО-амінокислоту. Цей пептидоміметик може бути легко отримано із застосуванням відомих у цій галузі способів отримання таких сполук.

Як тут застосовано, термін "варіант" означає білок або пептид, який має одну або більше амінокислотних послідовностей, які відрізняються від амінокислотних послідовностей природного білка або пептиду та має відношення до пептиду, який зберігає активність природного білка. Цей варіант може бути отримано з допомогою будь-якої з операцій заміщення, додавання, делеції та модифікації або із застосуванням поєднання цих операцій у частині амінокислотних послідовностей природного білка або пептиду, причому додані амінокислоти можуть мати штучне походження (наприклад, амінокислоти Ю-типу).

Як тут застосовано, термін "фрагмент" означає фрагмент, який має одну або більше делецій амінокислот на М- або С-кінці природного білка або пептиду та переважно, це є фрагмент, який зберігає активність природного білка.

Фізіологічно активний білок або пептид, який може бути отримано з допомогою будь-якого способу може мати природне або рекомбінантне походження та, наприклад, він може бути рекомбінантним білком, отриманим із застосуванням прокаріотичних клітин, як-то, але без обмеження, клітин Е. Соїї, як клітин-хазяїв.

Слід зазначити, що таким фізіологічно активним білком або пептидом може бути, але без обмеження, оксинтомодулін, ексендин-4, глюкагоноподібний пептид -1 (СІ Р-1), а Р-2, інсулінотропні пептиди, як-то глюкозозалежний інсулінотропний пептид (СР), інсулін, глюкагон, паратиреоїдний гормон (РТН) або кальцитонін. Як описано вище, фізіологічно активний білок або пептид являє собою поняття, яке окрім природного фізіологічно активного білка або пептиду також охоплює всі його похідні, варіанти та фрагменти.

Як тут застосовано, термін "Інсулін" означає пептид, який виділяє підшлункова залоза у відповідь на підвищені рівні глюкози у крові для захоплення глюкози у печінці, м'язах або жировій тканині та перетворення її на глікоген з припиненням застосування жирів, як джерела енергії, що таким чином регулює рівень глюкози в крові. Цей пептид включає нативний інсулін, базальний інсулін та агоністи, попередники та похідні інсуліну, а також їх фрагменти та варіанти.

Як тут застосовано, термін "природний інсулін" має відношення до гормону, який виділяється підшлунковою залозою для сприяння засвоєнню глюкози та пригнічення розпаду жирів, отже він контролює рівень глюкози у крові. Інсулін утворюється шляхом обробки з попередника, який має назву проінсуліну та не має функції регулювання рівня глюкози у крові.

Амінокислотні послідовності інсуліну є наступними:

Ланцюг А:

Спу-Пе-МаІ-Спіи-СтТп-Сув-Сув- Гиг-5ег-Пе-Сув-5ег-І еи- Гут-С1п-Ї ей-С1ПІи-Авп- Туг-Субз-Азп (ЗЕО І

Коо) Мо 1)

Ланцюг В:

Ріпе-МаІ-Азп-С1п-Нів-Ї еи-Сувз-Спу-5ег-Нів-І еи-МаІ-Спи-Аїа-Ї еи- Тук- еи-МаІ-Сув-Спту-сп1и-Ага- сСіу-Рпе-РНе-Туг- Тиг-Рго-Гувз-ТАг (ЗЕО ІО Ме 2)

Як тут застосовано, термін "базальний інсулін" має відношення до пептиду, який регулює нормальний щоденний рівень глюкози у крові, як-то, наприклад, препарати левемір, лантус, деглюд тощо.

Як тут застосовано, термін "агоніст інсуліну" має відношення до сполуки, яка зв'язує інсуліновий рецептор та виявляє таку ж біологічну активність, як інсулін, але яка не має відношення до структури інсуліну.

Термін "варіант інсуліну" має відношення до пептиду, який має одну або більше амінокислотних послідовностей, які відрізняються від амінокислотних послідовностей природного інсуліну та зберігає функцію контролювання рівня глюкози у крові в організмі.

Термін "похідна інсуліну" має відношення до пептиду, який має гомологію амінокислотної послідовності до природного інсуліну, яка складає щонайменше 80 95 та який може мати певні хімічно заміщені, усунені або змінені групи амінокислотних залишків та зберігає функцію контролювання рівня глюкози у крові в організмі.

Термін "фрагмент інсуліну" означає фрагмент, який має делецію однієї або більше амінокислот на М- або С-кінці інсуліну та зберігає функцію контролювання рівня глюкози у крові в організмі.

Кожен зі способів отримання агоністів, похідних, ферментів та варіантів інсуліну може бути застосовано окремо або у комбінації. Наприклад, винахід стосується пептиду, який має одну або більше амінокислот, які відрізняються від амінокислот у складі природного пептиду та дезамінування М-кінцевого амінокислотного залишку та зберігає функцію контролювання рівня глюкози у крові в організмі. Застосований у винаході інсулін може бути отримано з допомогою рекомбінантної технології а також може бути синтезовано із застосуванням способу твердофазного синтезу.

Застосований у винаході інсулін також може бути зв'язано з непептидильним полімером, який у цьому винаході може бути застосовано, як лінкер. Цей непептидильний полімер застосовують, як лінкер для зв'язування Ес-фрагменту імуноглобуліну, тим самим зберігаючи активність інсуліну з покращенням розчинності, а також покращенням стійкості. Також можливо застосування пептидного лінкера з допомогою технології генетичної рекомбінації.

Винахід також стосується фізіологічно активного білка або пептиду, якого кон'юговано з Ес- фрагментом імуноглобуліну для покращення розчинності цього білка або пептиду. Хоча не існує окремого обмеження у виборі місця зв'язування, однак модифікація А-ланцюга інсуліну може зменшити активність та стійкість, отже, Ес-фрагмент імуноглобуліну може бути приєднано до В- ланцюга через лінкер або без застосування лінкера. Зокрема, Ес-фрагмент імуноглобуліну може бути приєднано, але без обмеження, до М-кінця В-ланцюга інсуліну через непептидильний лінкер або без застосування непептидильного лінкера.

Як тут застосовано, термін "оксинтомодулін" означає пептид, який походить від попередника глюкагону, що має назву преглюкагону та охоплює природний оксинтомодулін та його попередники, похідні, фрагменти та варіанти.

Оксинтомодулін має наступну амінокислотну послідовність:

НЗОСТЕТОУЗКМ ОБАКАОВЕМОУМ ММ ТКАМАММІА (ЗЕО ІЮ Мо 3).

Похідна оксинтомодуліну включає пептиди, пептидні похідні або пептидоміметики, яких було отримано шляхом додавання, делеції або заміщення частини амінокислот послідовності оксинтомодуліну з активуванням рецептора СІ Р-1 та глюкагонового рецептора з більш високим рівнем активності у порівнянні з природним оксинтомодуліном. Похідна оксинтомодуліну за винаходом може мати будь-яку амінокислотну послідовність з послідовностей 5ЕО ІЮ Мо 4-36.

Також цей фрагмент оксинтомодуліну зберігає функцію контролювання рівня глюкози у крові в організмі.

Також варіантом оксинтомодуліну є пептид, який має один або більше амінокислотних залишків, які відрізняються від подібних залишків у складі амінокислотної послідовності природного оксинтомодуліну та має функцію активування рецептора СІ Р-1 та глюкагонового рецептора. Способи отримання зазначеного варіанту, похідної та фрагменту оксинтомодуліну може бути застосовано окремо або у поєднанні. Наприклад, винахід стосується пептиду, який має одну або більше амінокислот, які відрізняються від амінокислот природного пептиду, має дезамінування М-кінцевих амінокислотних залишків та має функцію активування рецептора

Зо СІ Р-1 та глюкагонового рецептора.

Похідна оксинтомодуліну за винаходом охоплює будь-який пептид, який отримано шляхом заміщення, додавання, делеції або шляхом пост-трансляційних модифікацій (наприклад, метилування, ацилювання, убиквитинування, застосування внутрішньомолекулярного ковалентного зв'язування) у амінокислотній послідовності «ЕО ІЮО Мо З з метою одночасного активування рецептора СІ Р-1 та глюкагонового рецептора. У заміщенні або додаванні амінокислот може буде застосовано будь-яку з 20 амінокислот, які звичайно зустрічаються в білках людини, а також може бути застосовано атипові або штучні амінокислоти. Атипові амінокислоти можна придбати з торгівельних джерел, як-то від компаній бідта-Аагісн,

СпетрРер Іпс. та Сеплуте РПагтасеціїсаІі5. Пептиди, які містять ці амінокислотні та атипові пептидні послідовності може бути синтезовано та придбано у приватних постачальників, як-то компанії Атегісап Реріїде Сотрапу (США), Васпет (США) або Апудеп (Корея).

У особливому втіленні, похідна оксинтомодуліну за винаходом є новим пептидом, який містить амінокислотну послідовність за наступною Формулою 1:

В1-хХ1-хХ2-АТЕТ50-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20- хХ21-Х22-Х23-Х24-К2 (Формула 1)

В якій складова К1 є гістидином, дезаміно-гістидилом, диметил-гістидилом (М-диметил- гістидилом), бета-гідроксиімідазопропіонілом, 4-імідазоацетилом, бета-карбоксиімідазо- пропіонілом або тирозином;

Х1 є АІВ (аміноізомасляною кислотою), ЮО-аланіном, гліцином, Заг (М- метилгліцин), серин

БО або Ю-серином;

Х2 є глютаміновою кислотою або глютаміном;

ХЗ є лейцином або тирозином;

ХА є серином або аланіном;

Х5 є лізином або аргініном;

Хб є глютамін або тирозином;

Х7 є лейцин або метіонін;

ХВ є аспарагіновою кислотою або глютаміновою кислотою;

ХУ є глютаміновою кислотою, серином, альфа-метил-глютаміновою кислотою або її видалено;

Х10 є глютаміном, глютаміновою кислотою, лізином, аргініном, серином або її видалено;

Х11 є аланіном, аргініном, валіном або її видалено;

Х12 є аланіном, аргініном, серином, валіном або її видалено;

Х13 є лізином, глютаміном, аргініном, альфа-метил-глютаміновою кислотою або її видалено;

Х14 є аспарагіновою кислотою, глютаміновою кислотою, лейцином або її видалено;

Х15 є фенілаланіном або її видалено;

Х16 є ізолейцином, валіном або її видалено;

Х17 є аланіном, цистеїном, глютаміновою кислотою, лізином, глютаміном, альфа-метил- глютаміновою кислотою або її видалено;

Х18 є триптофаном або її видалено;

Х19 є аланіном, ізолейцином, лейцином, серином, валіном або її видалено;

Х20 є аланіном, лізином, метіоніном, глютаміном, аргініном або її видалено;

Х21 є аспарагіном або її видалено;

Х22 є апланіном, гліцином, треоніном або її видалено;

Х23 є цистеїном, лізином або її видалено;

Х24 є пептидом, що містить 2-10 амінокислот та складається з комбінацій аланіну, гліцину та серину або її видалено; та

К2 є послідовністю КРЕМАКММІА (ЗЕБО ІО Мо 37) СРББ5БОАРРРБЗ (5БО ІЮО Мо 38),

СРБ5БЗСОСАРРРБК (ЗЕО ІЮО Мо 39), НБОСТЕТЗОУЗКМІ О (ЗЕО ІЮО Мо 40), НБОСТЕТЗОМ БМ ОК (ЗЕО ІЮ Ме 41), НСЕСТЕТ50І ЗБКОМЕЕЕАМК (5ЕО ІО Мо 42) або її видалено (за виключенням випадків, коли амінокислотна послідовність за Формулою 1 є ідентичною амінкислотній послідовності 5ЕО ІЮ Мо 3).

З метою посилення активності оксинтомодуліну дикого типу до рецептора СІ Р-1 та глюкагонового рецептора, похідну оксинтомодуліну за винаходом може бути заміщено 4- імідазоацетилом, в якому видалено альфа-карбон гістидину у положенні 1 амінокислотної послідовності, позначеної як БЗЕО ІЮ Мо 3; дезаміно-гістидилом, в якому видалено М-кінцеву аміногрупу; диметил-гістидилом (М-диметил-гістидилом), в якому М-кінцеву аміногрупу

Зо перетворено на дві метильні групи; бета-гідроксиїімідазопропіонілом, в якому М-кінцеву аміногрупу заміщено гідроксильною групою або бета-карбоксиімідазопропіонілом, в якому М- кінцеву аміногрупу заміщено карбоксильною групою. Крім того, ділянку, яка зв'язує рецептор

СІ Р-1 може бути заміщено амінокислотами, що посилюють гідрофобні та іонні зв'язки або їх комбінаціями. Також для посилення активності рецептора С Р-1 частину послідовності оксинтомодуліну може бути заміщено амінокислотною послідовністю сі Р-1 або ексендину-4.

Крім того, частину послідовності оксинтомодуліну може бути заміщено послідовністю, яка стабілізує альфа - спіраль. Наприклад, амінокислоти у положеннях 10, 14, 16, 20, 24 та 28 амінокислотної послідовності за Формулою 1 може бути заміщено амінокислотами, які складаються з Туг(4-Ме), Рпе, Рпе(4-Ме), Рпе(4-СІ), Рпе(4-СМ), Рпе(4-МО»), Рпе(4-МН»ег), Ра,

Раї, Маї, Аіа(2-тієнілу) та АіІа(бензотієнілу), які, як відомо, надають стійкості альфа-спіралі, або з їх амінокислотних похідних.

Група Туг(4-Ме) у цій заявці є похідною тирозину, в якій гідроген гідроксильної групи тирозину заміщено метильною групою; РПе(4-Ме) є похідною фенілаланіну, в якій пара- положення фенілаланіну заміщено метильною групою; Рпе(4-СІ) є похідною фенілаланіну, в якій пара-положення фенільної групи заміщено хлоридом; Рпе(4-СМ) є похідною фенілаланіну, в якій пара-положення фенільної групи заміщено ціанідною групою; Рпе(4-МОг2) є похідною фенілаланіну, в якій пара-положення фенільної групи заміщено нітрогрупою; та Рпе(4-МНг) є похідною фенілаланіну, в якій пара-положення фенільної групи заміщено аміногрупою.

На додачу до цього, фенілгліцерин позначено, як Рід; Раї є похідною аланіну, в якій бета- метильну групу аланіну заміщено піридильною групою; Ма! є похідною аланіну, в якій бета- метильну групу аланіну заміщено нафтильною групою; АїПа(2-тієніл) є похідною аланіну, в якій бета-метильну групу аланіну заміщено 2-тієніловою групою; та АїПІа(бензотієніл) є похідною аланіну, в якій бета-метильну групу аланіну заміщено бензо-тієніловою групою.

Також не існує обмежень по типу та кількості призначених для вставки амінокислот, які стабілізують альфа - спіраль або їх похідних. У особливому втіленні між амінокислотними залишками може бути утворено внутрішньомолекулярні кільця, наприклад, такі кільця може бути отримано у положеннях 10 та 14, 12 та 16, 16 та 20, 20 та 24 та 24 та 28 та в цьому випадку, відповідні положення може бути заміщено парою, яка складається з глютамінової кислоти та лізину. Також не існує певного обмеження у кількості цих внутрішньомолекулярних кілець, утворених в цій похідній оксинтомодуліну, розчинність якої може бути покращено з допомогою способу за винаходом.

У втіленні, оксинтомодулін, розчинність якого покращено із застосуванням способу за винаходом або його похідні може бути похідною оксинтомодуліну, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з послідовностей за наступними Формулами 2-6. У особливому втіленні ця похідна оксинтомодуліну за винаходом є пептидом, який має амінокислотну послідовність за наступною Формулою 2, в якій амінокислотну послідовність оксинтомодуліну заміщено на послідовність ексендину або СІ Р-1:

В1-А-КЗ (Формула 2)

У іншому особливому втіленні похідна оксинтомодуліну за винаходом є пептидом, який має амінокислотну послідовність за наступною Формулою 3, в якій частину амінокислотної послідовності оксинтомодуліну приєднано до послідовності ексендину або сІР-1 із застосуванням відповідного амінокислотного лінкеру:

В1-8-С-КА4 (Формула 3)

У іншому особливому втіленні ця похідна оксинтомодуліну за винаходом є пептидом, в якому частину амінокислотної послідовності оксинтомодуліну заміщено амінокислотами, здатними посилювати афінність зв'язування до рецептора сі Р-1. Наприклад, Геи у положенні 26, який зв'язується з рецептором с Р-1 шляхом гідрофобної взаємодії заміщено гідрофобним залишком, Пе або МаІ, що тим самим підсилює афінність зв'язування до рецептора СІ Р-1.

Точніше кажучи, сполука за наступною Формулою 4 є пептидом, включаючи оксинтомодулінові пептиди, який має покращену афінність зв'язування до рецептора (заміщення у положенні Об): ві-50аТЕТ5ОУБКМІ 0-01-02-03-04-05- ЕМОМ/-06-07-М-О08-К3 (Формула 4)

У іншому особливому втіленні, ця похідна оксинтомодуліну за винаходом є пептидом, включаючи сполуку за наступною Формулою 5, в якому частину амінокислотної послідовності видалено, додано або заміщено іншою амінокислотою з метою посилення активних властивостей природного оксинтомодуліну, спрямованих до рецептора СІ Р-1 та глюкагонового рецептора:

В1-Е1-ОСТЕТ5ОМ5КМІ 0-Е2-ЕЗ-ВА-Е4-Е5-Ехм-Е6-ЖМІ ММТ-Е7-К5 (Формула 5)

Зо Наведена у Формулах 2-5 складова КІ є такою ж саме, як і у описі до Формули 1;

А" вибрано з групи, яка складається з послідовностей 5ОСТЕТ5ОУЗКМІОБАКА

ООРМОУМ-ММТ (5БО ІО Ме 43), 5БОСТЕТ5ОМБКМІ ОБЕЕАМКІРІЄЕУММ ММ (БО 10 Мо 44),

ЗОСТЕТЗОУЗКУІ ОЕККАООРМАУМ КМТ (5БО ІО Ме 45) СБОСТЕТ5ОУЗКМІ ЕЕЕАМКІ БЕ

ІЕУМГКМО (БО ІО Ме 46) СОСТЕТ5ОУЗКОМЕБЕБАМКІРІЕУМ КМО (БО ОО Ме 47),

СЕСТЕТ5ЗОІЇ ЗВОМЕЕЕАМВІ РІЕММАА (5ЕБО 10 Ме 48) та 5ОСТЕТ5ОУЗКОМЕЕЕАМНКІ РІ

ЕМ/-ММО (5ЕО ІО Мо 49);

В" вибрано з огрупи, яка складається з послідовностей 5ОСТЕТ5ОМ5КМУІО5ККА

ООРМОУМ-ММТ (5БО ІО Ме 43), 5БОСТЕТ5ОМБКМІ ОБЕЕАМКІРІЄЕУММ ММ (БО 10 Мо 44), 5ОСТЕТЗрУЗКМІОЕККАООЕМАУМ КМТ (5БО ОО Ме 45) БОСТЕТЗОМУЗАМІ ЕЕЕАМВІ Е

ІЕУМГКМО (БО ІО Ме 46) СОСТЕТ5ОУЗКОМЕБЕБАМКІРІЕУМ КМО (БО ОО Ме 47),

СЕСТЕТ5ЗОЇ БКОМЕЕЕАМКІ РІЕУМАА (5ЕО ІЮО Мо 48), БОСТЕТ5ОУЗКОМЕЕЕАМКІ ГРІЄ І ММО (ЗЕО ІЮ Мо 49), ЗЕСТЕТ50ОЇ ЗКОМЕЕЕАМКІ РІЕММ (ЗЕО ІЮО Мо 50) та БОСТЕТ5ОМ ЗМІ 0 (5ЕО

ІО Мо 51);

С" є пептидом, який має 2-10 амінокислот та складається з комбінацій аланіну, гліцину та серину; р1 є серином, глютаміновою кислотою або аргініном; ра є аргініном, глютаміновою кислотою або серином; р3З є аргініном, аланіном або валіном; раА є аргініном, валіном або серином; р5 є глютаміном, аргініном або лізином; рб є ізолейцином, валіном або серином; р7 є метіоніном, аргініном або глютаміном; ра є треоніном, гліцином або аланіном;

Е1 є серином, АЇ!В, Заг, О-аланіном або О-серином;

Е2 є серином або глютаміновою кислотою;

ЕЗ є аргініном або лізином;

Е4 є глютаміном або лізином;

Е5 є аспарагіновою кислотою або глютаміновою кислотою;

ЕЄ є глютаміном, цистеїном або лізином;

Е7 є цистеїном, лізином або цю складову видалено;

КЗ є послідовністю КАЕМЕММІА (ЗЕБО ІЮ Мо 37), СРЗ5БСОАРРРЗ (ЗБО ІЮО Мо 38) або

СРБЗБОАРРРБК (5ЕО ІЮ Мо 39);

КА є послідовністю НБОСТЕТОУБЗКМІ О (5ЕО ІЮО Мо 40), НБОСТЕТЗОУЗАМІ ОК (5ЕО ІЮО Мо 41) або НСЕСТЕТ5ОЇ ЗКОМЕЕЕАМК (5ЕО ІО Мо 42); та

КБ є послідовністю КРЕМАКММІА (ЗЕБО ІО Мо 37) СРББ5БОАРРРБЗ (5БО ІЮО Мо 38),

СРББОАРРРБУК (5ЕО ІО Мо 39) або її видалено (за виключенням випадків, коли амінокислотні послідовності за Формулами 2-5 є ідентичними послідовності ЗЕО ІЮО Мо 3).

Точніше кажучи, ця похідна оксинтомодуліну за винаходом може бути пептидом за наступною Формулою 6:

В1-Х1-Х2-А4ТЕТ50-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20-

Х21-Х22-Х23-Х24-НК2 (Формула 6). в якій К1 є гістидином, дезаміно-гістидилом, 4-імідазоацетилом або тирозином;

Х1 є АІВ (атіпоіїзомасляною кислотою), гліцином, серином або Ю-серином;

Х2 є глютаміновою кислотою або глютаміном;

ХЗ є лейцином або тирозином;

ХА є серин або аланіном;

Х5 є лізином або аргініном;

Хб є глютаміном або тирозином;

Х7 є лейцин або метіонін;

ХВ є аспарагіновою кислотою або глютаміновою кислотою;

ХУ є глютаміновою кислотою, альфа-метил-глютаміновою кислотою або її видалено;

Х10 є глютаміном, глютаміновою кислотою, лізином, аргініном або її видалено;

Х11 є аланіном, аргініном або її видалено;

Х12 є аланіном, валіном або її видалено;

Х13 є лізином, глютаміном, аргініном, альфа-метил-глютаміновою кислотою або її видалено;

Х14 є аспарагіновою кислотою, глютаміновою кислотою, лейцином або її видалено;

Х15 є фенілаланіном або її видалено;

Х16 є ізолейцином, валіном або її видалено;

Х17 Є аланіном, цистеїном, глютаміновою кислотою, глютаміном, альфа-метил- глютаміновою кислотою або її видалено;

Х18 є триптофаном або її видалено;

Х19 є аланіном, ізолейцином, лейцином, валіном або її видалено;

Х20 є аланіном, лізином, метіоніном, аргініном або її видалено;

Х21 є аспарагіном або її видалено;

Х22 є треоніном або її видалено;

Х23 є цистеїном, лізином або її видалено;

Х24 є пептидом, який має 2-10 амінокислот, які складаються з гліцину або її видалено; та К2 є послідовністю КЕМАММІА (5ЕО ІЮО Мо 37), ОРБЗБОАРРРБ (5ЕБЕО ІЮО Мо 38), ОРЗБОАРРРЗК (ЗЕО ІЮ Мо 39), НБОСТЕТЗОМ5КМІ О (ЗЕО ІЮО Мо 40), НБОСТЕТ5О УЗЕМІ ОК (ЗЕО ІЮО Мо 41),

НОЕСТЕТ5ОЇ БКОМЕЕЕАМК (5ЕО ІЮО Мо 42) або її видалено (за виключенням випадків, коли амінокислотна послідовність за Формулою 6 є ідентичною амінокислотній послідовності БЕО ІЮ

Мо 3).

Точніше кажучи, цю похідну оксинтомодуліну за винаходом може бути вибрано з групи, яка складається з пептидів зЗЕО ІЮ МоМо 4-36.

Оксинтомодулін має активні властивості двох пептидів, І Р-1 та глюкагону. СІ Р-1 знижує рівень глюкози в крові, зменшує споживання їжі та пригнічує спорожнення шлунка, тоді як глюкагон збільшує рівень глюкози в крові, сприяє розщепленню жирів та зменшує масу тіла за рахунок покращення енергетичного метаболізму. Якщо у складі одного пептиду існує два пептиди з різною біологічною дією та один з цих пептидів виявляє більш домінантну дію, ніж інший, то можуть виникнути небажані ефекти. Якщо глюкагон виявляє більш домінантну дію, ніж

СІ Р-1, то рівень глюкози в крові може бути збільшено. Якщо СІ Р-1 виявляє більш домінантну дію, ніж глюкагон, то це може стати причиною появи таких побічних ефектів, як нудота та блювота. Загальна ефективність може відрізнятися в залежності від співвідношень активності цих двох пептидів.

Як тут застосовано, термін "інсулінотропний пептид" означає пептид, який має інсулінотропну функцію та цей пептид сприяє синтезу та експресії інсуліну у бета-клітинах підшлункової залози. Прикладами такого інсулінотропного пептиду можуть бути, але без обмеження, такі сполуки, як глюкагоноподібний пептид-ї1 (СІ Р-1), глюкагоноподібний пептид-2 (СІ Р-2), ексендин-3, ексендин-4, імідазоацетил (СА) ексендин-4 або глюкозозалежний інсулінотропний пептид (СІР), допоки вони будуть зберігати свою інсулінотропну функцію.

Застосований у винаході інсулінотропний пептид на додачу до природного інсулінотропного пептиду також охоплює всі його похідні, варіанти та фрагменти та їх загальні описи є такими ж, як описано вище.

Описи СІ Р-1, ексендину-3 або ексендину-4 та їх похідних наведено у Патентній публікації

Кореї Мо 10-2012-0137271 (або М/02012-169798) стосовно цієї похідної оксинтомодуліну та у

Патентній публікації Кореї Мо 10-2009-0008151 (або УУО2009-011544) стосовно похідних інсулінотропного пептиду та їх включено сюди шляхом посилання, але без обмеження.

Як тут застосовано, термін "глюкагон" означає пептидний гормон, який збільшує рівень глюкози у крові. Функціями глюкагону є перетворення глікогену на глюкозу у печінці для збільшення рівнів глюкози у крові.

Слід зазначити, що природний глюкагон може мати наступну послідовність.

Нібз-Зег-С1п-Сту- Гпи-Рпе-Тиг-5ег-Авр-Туг-5еи-І уб-Туі-І еи-Авр-5ег-Агу-Ага-АІа-СИп-Авр-РНе-

Ма!І-сіп-Ттр-І еи-Меї-Авп-ТАг (ЗЕО ІЮО Мо 52)

Застосований у винаході глюкагон охоплює, на додачу до природного глюкагону, також всі його похідні, варіанти та фрагменти, загальні описи яких є такими ж, як описано вище.

Як тут застосовано, термін "паратиреоїдний гормон (паратгормон, (ПтГ))" означає гормон, який вивільняється з паращитоподібних залоз та дія якого призводить до збільшення концентрації кальцію в крові. Інформацію стосовно амінокислотної послідовності паратиреоїдного гормону можна отримати з відомих баз даних, як--о база даних сСепВапк

Національного інституту охорони здоров'я США. Термін "паратиреоїдний гормон" також охоплює, на додачу до природного паратиреоїдного гормону, всі його похідні, варіанти та фрагменти.

Як тут застосовано, термін "кальцитонін" є тироїдним гормоном, який регулює концентрацію кальцію в крові та дія якого полягає у зменшенні цієї концентрації в крові. Інформацію стосовно амінокислотної послідовності кальцитоніну можна отримати з відомих баз даних, як-то бази

Зо даних СепВапк Національного інституту охорони здоров'я США. Цей термін, на додачу до природної форми кальцитоніну, також охоплює всі його похідні, варіанти та фрагменти.

Спосіб за винаходом застосовують для ефективного збільшення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду без застосування поверхнево-активного засобу. Однак поверхнево- активний засіб також може бути застосовано з метою додаткового збільшення розчинності.

Інакше кажучи, поверхнево-активний засіб додають до водного розчину та кон'югати тривалої дії фізіологічно активного білка або пептиду та Ес-фрагменту імуноглобуліну інкапсулюються у міцелах, тим самим додатково збільшуючи розчинність кон'югату.

Інший аспект винаходу також стосується композиції для покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду, яка містить Ес-фрагмент імуноглобуліну та таким чином виявляє покращену розчинність у порівнянні з композицією без Ес-фрагменту імуноглобуліну.

Зазначена тут композиція містить кон'югат фізіологічно активного білка або пептиду та Ес- фрагмент імуноглобуліну, причому цей фізіологічно активний білок або пептид, як активний інгредієнт приєднано до Ес-фрагмента імуноглобуліну через пептидний або непептидильний лінкер.

У втіленні винаходу було перевірено, чи буде збільшуватися розчинність інсуліну або оксинтомодуліну в умовах слабокислого рН за рахунок кон'югації типового фізіологічно активного пептиду, інсуліну або оксинтомодуліну з Ес-фрагментом імуноглобуліну. В результаті було виявлено, що отримана кон'югована форма Ес-фрагмента імуноглобуліну значно збільшує розчинність інсуліну або оксинтомодуліну у порівнянні з некон'югованою формою (Таблиці 2 та

З, Фіг. 2; та Таблиці 5 та 6; Фіг. 4). Цей результат свідчить про те, що цей спосіб за винаходом може бути застосовано для покращення розчинності пептиду або білка та зокрема для значного покращення розчинності пептиду або білка, який має дуже низьку розчинність у нейтральних або слабокислих умовах, отже композиція, яка містить його фармацевтично ефективну концентрацію є важкою???

Далі цей винахід буде більш детально описано з посиланням на наступні приклади. Однак слід зазначити, що ці приклади наведено виключно з ілюстративною метою та цей винахід не має бути ними обмежено.

Приклад 1: Оцінка розчинності інсуліну та кон'югату інсуліну тривалої дії. (1) Отримання кон'югату інсуліну тривалої дії.

Порошок інсуліну розчинили у 10 мМ НСЇ та потім для ПЕГілування М-кінця В - ланцюга інсуліну було здійснено хімічну реакцію цього розчину з 3,4 К пропіон-АЇ О2 ПЕГ (сполука ПЕГ з двома пропіональдегідними групами (МОБ, дЧарап)) з температурою 4"С, молярним відношенням інсуліну до ПЕГ, яке складало 1:2 та концентрацією інсуліну у 5 мг/мл. Цю реакцію було здійснено у суміші 50 мМ цитрату натрію (рН 5,0) та 45 95 ізопропанолу та до реакційної суміші також було додано відновник (2-20 мМ ціаноборогідриду натрію). Потім реакційний розчин було очищено на колонці 5Р. НР (СЕ НеайпНсаге) із застосуванням буферу, який містив цитрат натрію (рН 3,0) з градієнтом концентрації КСІ. Для отримання кон'югату інсуліну-ПЕГ-Ес- фрагменту імуноглобуліну було здійснено хімічну реакцію моно-ПЕГілованого інсуліну з Ес- фрагментом імуноглобуліну з молярним відношенням приблизно 1:1,2 та загальною концентрацією білка у 20 мг/мл, яка тривала приблизно 13 годин з кімнатною температурою. У цьому випадку було застосовано реакційний розчин, який містив 100 мМ НЕРЕ5З та 22 ММ фосфат калію з рН 8,2 із додаванням відновника (20 мМ ціаноборогідрид натрію).

Після закінчення цієї реакції отриманий реакційний розчин пропустили крізь колонку з С- сефарозою НР (СЕ Неайсаге) із застосуванням буферу Ттіз-НСІ (рН 7,5) та градієнту концентрації Масі та для кінцевої очистки кон'югату інсуліну-«ПЕГ-Ес-фрагменту імуноглобуліну отриманий розчин потім пропустили через колонку бБоцсе 15 ІБО (СПЕ Неайнсаге) із застосуванням буферу Ттібз-НСЇІ (рН 7,5) та градієнту концентрації сульфату амонію. (2) Перевірка розчинності інсуліну та кон'югату інсуліну тривалої дії.

Для перевірки розчинності інсуліну та кон'югату інсуліну тривалої дії було отримано стандартний та досліджуваний матеріал інсуліну та кон'югату інсуліну тривалої дії відповідно до композиції, як наведено у наступній Таблиці 1.

Досліджувані матеріали інсуліну та кон'югату інсуліну тривалої дії мстили композицію оцтовокислого буферного розчину з рН 6.0, неіїонного поверхнево-активного засобу (полісорбат), цукроспирту (маніт) та ізотонічного засобу (хлорид натрію). Відповідно із застосуванням наведених у Таблицях 2 та З кількісних значень, досліджувані матеріали було розчинено з кімнатною температурою, неповністю розчинений досліджуваний матеріал інсуліну

Зо піддали центрифугуванню та для перевірки розчинності було застосовано лише відібраний супернатант.

Для цієї перевірки серед теоретичних кількісних значень досліджуваного інсулінового матеріалу було визначено максимальне кількісне значення, яке дорівнювало приблизно 10 мг/мл та являло собою кількісне значення, отримане шляхом перетворення 100 мг/мл кон'югату інсуліну тривалої дії на інсулін. Цей досліджуваний матеріал інсуліну, розчинений з максимальним кількісним значенням було піддано серійному розведенню та було визначено мінімальне кількісне значення, тобто точку (0,008 мг/мл) повного розчинення інсуліну без домішок або грудочок.

Відповідний стандартний калібрувальний графік для інсуліну та кон'югату інсуліну тривалої дії спочатку було підтверджено із застосуванням ВЕРХ-хроматографії з оберненою фазою (Р-

НРІ С), як наведено у Фіг. 1. Обчислення кількісних значень інсуліну та кон'югату інсуліну тривалої дії було здійснено шляхом накладання площин піків дослджуваних матеріалів інсуліну та кон'югату інсуліну тривалої дії, які було підтверджено із застосуванням ВЕРХ-хроматографії з оберненою фазою відповідно на стандартний калібрувальний графік. Результати наведено у

Таблицях 2 та З та на Фіг. 2.

Таблиця 1 кон'югату інсуліну тривалої дії "

Таблиця 2

Інсулін (мг/мл) застосуванням стандартного калібрувального графіка)

11111111 мом)

Таблиця З

Кон'югат інсуліну тривалої дії (на основі інсуліну)

Теоретичне кількісне значення . . застосуванням стандартного калібрувального графіка) (мг/мл) (мг/мл)

ОО вя111Г18ви1

Як видно з Таблиць 2 та 3, кількісне значення досліджуваного матеріалу кон'югату інсуліну тривалої дії, розчиненого у буфері композиції кон'югату інсуліну тривалої дії свідчить про наявність невеликої різниці між теоретичним та виміряним значеннями, тоді як кількісне значення досліджуваного матеріалу інсуліну, розчиненого у буфері композиції кон'югату інсуліну тривалої дії свідчить про наявність великої різниці (аж до різниці приблизно у 16 разів) між теоретичним та виміряним значеннями. Крім того, після розчинення досліджуваного матеріалу інсуліну у буфері композиції кон'югату інсуліну тривалої дії, у всіх випадках, за виключенням застосування концентрації у 0,008 мг/мл, після центрифугування було спостережено наявність грудочок матеріалу. Як видно з цього результату, розчинність було покращено з допомогою Ес- фрагменту імуноглобуліну, застосованого, як носія кон'югату інсуліну тривалої дії.

Приклад 2: Оцінка розчинності оксинтомодуліну та кон'югату оксинтомодуліну тривалої дії. (1) Отримання похідної кон'югату оксинтомодуліну тривалої дії.

Було здійснено хімічну реакцію похідної оксинтомодуліну з реактивом МА -10 К-АГО ПЕГ (МОРЕ, дарап) (температура 4 "С, час реакції - приблизно 1 год.; молярне відношення реагентів - 171, концентрація похідної оксинтомодуліну - З мг/мл) з метою ПЕГілування МАЇ-1ОК-АГО ПЕГ у цистеїновому залишку, який знаходився у 30 положенні послідовності ЗЕО ІЮ Мо 27, яка є амінокислотною послідовністю цієї похідної оксинтомодуліну. Цю реакцію було здійснено у 50

ММ Ттгіз (рН 7.5) та 60 Фо ізопропанолі. Для очищення цієї моно-ПЕГілованої по цистеїну похідної оксинтомодуліну отриманий реакційний розчин після закінчення реакції спочатку пропустили крізь колонку 5Р. НР (СЕ Неайнсаге, Змедеп) із застосуванням буферу цитрату натрію (рН 3,0) буфер та градієнту концентрації КСІ. Потім було здійснено хімічну реакцію очищеної таким чином моно-ПЕГілованої похідної оксинтомодуліну та Ес-фрагменту імуноглобуліну (молярне відношення 1:4, загальна концентрація білка - 20 мг/мл, температура 4 "С, час здійснення реакції - приблизно 16 год.) У цьому випадку, реакційним розчином був 100 мМ фосфат калію з рН 6,0 та до нього було додано відновник (20 мМ ціаноборогідрид натрію). Після закінчення реакції реакційний розчин спочатку пропустили крізь колонку з бутил-сефарозою (Вшуї зЗерпагозе ЕЕ від СЕ Неаййсаге, Зугедеп) із застосуванням буферу Вів-Тгіз буфер та градієнта

Зо концентрації масі, а потім пропустили крізь колонку Зошгсе ІЗО (СЕ Неайсаге, Змуедеп) із застосуванням буферу цитрату натрію та градієнту концентрації сульфату амонію, тим самим здійснивши кінцеве очищення цього кон'югату похідної оксинтомодуліну - ПЕГ- Ес - фрагменту імуноглобуліну. (2) Перевірка розчинності оксинтомодуліну та кон'югату оксинтомодуліну тривалої дії.

Для перевірки розчинності похідної оксинтомодуліну з послідовністю ЗЕО ІО Мо: 27 та кон'югату похідної оксинтомодуліну тривалої дії відповідно до наведеного у наступній Таблиці 4 складу було отримано стандартний та досліджуваний матеріал похідної оксинтомодуліну та кон'югату похідної оксинтомодуліну тривалої дії.

У складі досліджуваних матеріалів похідної оксинтомодуліну та кон'югату похідної оксинтомодуліну тривалої дії було застосовано композицію лимоннокислого буферного розчину з рН 5,6; неіонного поверхнево-активного засобу (полісорбат); цукроспирту (маніт) та метіонін.

Відповідно до наведених у Таблицях 5 та 6 кількісних значень, досліджувані матеріали було розчинено з кімнатною температурою, неповністю розчинений досліджуваний матеріал похідної оксинтомодуліну було центрифуговано та для перевірки розчинності було застосовано лише відібраний супернатант.

У цьому разі з теоретичних кількісних значень цього досліджуваного матеріалу похідної оксинтомодуліну було визначено максимальне кількісне значення, яке складало приблизно 5 мг/мл та яке було кількісним значенням, отриманим шляхом переворення 80 мг/мл кон'югату похідної оксинтомодуліну тривалої дії на похідну оксинтомодуліну.

Цей досліджуваний матеріал похідної оксинтомодуліну, розчинений з максимальним кількісним значенням було піддано серійному розведенню та було визначено мінімальне кількісне значення, тобто точку (0,008 мг/мл) повного розчинення інсуліну без домішок або грудочок.

Відповідний стандартний калібрувальний графік для похідної оксинтомодуліну та кон'югату похідної оксинтомодуліну тривалої дії спочатку було підтверджено із застосуванням ВЕРХ- хроматографії з оберненою фазою (ЕР-НРІ С), як наведено у фіг. 3. Обчислення кількісних значень цієї похідної оксинтомодуліну та кон'югату похідної оксинтомодуліну тривалої дії було здійснено шляхом накладання площин піків дослджуваних матеріалів цієї похідної оксинтомодуліну та кон'югату похідної оксинтомодуліну, які було підтверджено із застосуванням

ВЕРХ-хроматографії з оберненою фазою відповідно на стандартний калібрувальний графік.

Таблиця 4 оксинтомодуліну тривалої дії "

Таблиця 5

Похідна оксинтомодуліну (мг/мл) застосуванням стандартного калібрувального графіка) (мг/мл)

Таблиця 6

Кон'югат похідної оксинтомодуліну тривалої дії (мг/мл) застосуванням стандартного калібрувального графіка) (мг/мл) о 1Г11196111 вв

Як видно з Таблиць 5 та 6 та Фіг. 4, кількісне значення досліджуваного матеріалу кон'югату похідної оксинтомодуліну тривалої дії, розчиненого у буфері композиції кон'югату оксинтомодуліну тривалої дії свідчить про наявність невеликої різниці між теоретичним та виміряним значеннями, тоді як кількісне значення досліджуваного матеріалу похідної оксинтомодуліну, розчиненого у буфері композиції кон'югату оксинтомодуліну тривалої дії свідчить про наявність великої різниці (аж до різниці приблизно у 27 разів) між теоретичним та

Зо виміряним значеннями. Крім того, після розчинення досліджуваного матеріалу похідної оксинтомодуліну у буфері композиції кон'югату оксинтомодуліну тривалої дії, у всіх випадках, за виключенням застосування концентрації у 0,008 мг/мл після центрифугування було спостережено наявність грудочок матеріалу. Як видно з цього результату, розчинність похідної оксинтомодуліну було покращено з допомогою Ес-фрагменту імуноглобуліну, застосованого, як носія кон'югату похідної оксинтомодуліну тривалої дії.

Ці результати вказують на те, що Ес-фрагмент імуноглобуліну застосований, як носій фізіологічно активного білка та пептиду за винаходом є здатним ефективно збільшувати розчинність цього білка та пептиду.

На основі наведеного вище опису, фахівцям у цій галузі слід розуміти, що цей винахід також може бути втілено у іншій особливій формі без змінення його технічного духу або суттєвих характеристик. Отже, слід розуміти, що наведені вище втілення не мають обмежувального характеру, але у всіх аспектах є ілюстративними. Оскільки обсяг цього винаходу визначено доданою Формулою Винаходу, а не наведеним перед нею описом, то всі змінення та модифікації, які потрапляють в її межі або еквіваленти цих меж призначені бути охопленими цією Формулою. «1 ХАНМ ФАРМ; КС ПД, «120» бпоМОо пора ивинЯя розчинності бійка За щВенптидУ їз Зветосуванням зв'язування з РечвВратментом імуноглобуліну «130» ОРАЛЕОБА «тЩО» КА 102014-0038035 «щі» Ф2г014-О5Б 3 «РО» Жора 2 «ех «ШТ» Я «міш» бок ей итучна послідовність «рейх «риЗ» альфделанцює вноулну «ах «МУ Не ма) См са бук ує ТВ бе Не був Беківо тує і и і: З 10 15

Ов Авп туг був Ави то «ій» «й» ЗО ей ГЯлОК «135 штучна послідовність

«аю «ВІ» бета-панцює інсуліну «Де х

Мне уві Аяп о На бе) бук Спу Бег Ні бец ма он Ага ви Тут 1 В ее 15

Гец ма! Су СЛУ СН Ат СНУ Ре ба Туг Те то ув ТА зо 25 о «0 З . «і» ЗУ «125 бок «вій» окбинтоамодул

НК З

Ні Бек Вій Су Те Ре Те Бе Аво ТугЗегіу Туг ів АЗо Заг

З 5 о 15

Ага Аг Ав ів Аве КНе Уві Сп тр кед Ме Аа тп Гуз Ага Ав

Ата Авт Ап Пе Аа «з а «і» 5 «1 Щілок «Р» лЛОоХхІдДнНЕ охоМитТомОодуну ее» «ім варіамт ке

«баЗ» Хав є 4-імідвунщетип. «а да

Хаз бегОіпй Сі» ТВгбве Тр Зєг Ар Тує мі бух Туг уео Авросни ї В та їі5 сін Ав У Ат ес не Не СЯ По бец Ме Ап Тк ув Ага Ави

Б ЗО

А АБТАВІ Не Аа «НН» 5 «ів 3 «12» пов «13» похідна скосинтомодупічу «Км «оаїх варівнт «вах КВ «тех жав є 4 1МмідаЗЦцети см. «Мк» 5

Хаз 'жессп оу ПТ пе Твг егАер ТукБегімє Туга Ар СИ і 5 то 15

Ага Аг Ав іп Аво Бе Уві Аа ПрівціуювАВи ТВ Ох Ето Бег 28 Ко за

Зегізі Аа го Рг го маг

«В» В «831» за «йі12» білок «213 похідна окоекнтомодуліну дод» «пі» варіант «од «й» жав є З імідазовцетипом. «В

Жаа сну С СУ ТЬе РНе Те бБег Авор Тук БегАт Тугіви СТИ СИ

З 5 то 15

Оз Аа Уа Аче ев пе Не Сби Тр ви ув Авп СНУ Сну Бу бет о кое ЗО

Бегоіу Аа Ето Рі) то Бе «дв 7 «р1їх 38 «й1й Щілок «йі1йе похідна скомнтомодутну «рих «ої» варіант тиша С «ва» Хазв є імідазвацетипом. «НИ У

Хав'му сни СУ ТВЕ РНе ТЕГ Зег Ар Тут зегАго си Ме ін С

З 5 Не 15

СЕ Ай Маг Аг ев бНе Не и Ттріеніув Ав пу Му то Бог 2-5 Зо

Заг Су Аа Рго Рго Ето бег кеійх 8 «В» 42 «ий» бІЛОох «кій» похідна окосинтомодуліну «ва «вті» варіннт миша (ЇЇ) «ке» Ава є імідааовцетилом. «щЮе В8

Хва іх Со Оу Ті Ре Пг Заг Ар еи Бе Ат С Меси С

З Не Не 15

Сі Ав Уа Аг беу бе бе су То А Ага нія его СНУ Тег я 25 30

Ра пе ЗагАво пи оБессув тугі пер ща 40 «0 а «тії» 30 «1» ЗЙЛОК «13» похідна дксимтомодуліну «их

«ші» варіант «киря ( «ги» Хад є 4-мідазовцетипом. «00» б

Хаа Заг о су ТТ бНе Те бе Аво Ту бе Ат Тугієп Ар ОО 1 5 10 15

Сни Аа ВЕ Ага беи Рае Пе Си ТПріви Мер Ав Ті ув «10» 10 ! «иїі» «ВІ» білок «й» похідна оксинтомодуліну «оте «Т2ї1» варіант «де «пай» Хаа ема ацетипом. «Не о

Хаз бег й У Тг Ре Тег Зег Авзвіви бегаАго іп і ем Си Січ

З 5 то 15

Ав Уа Аг бе бе бе СМ То беу Мег Ав ув 5-0 25 «й і де ї 1 «ВР» у «ія» білок «ій» похідна сконнтомодуліну кад» «ві» варіант «а «ай» Жвахвмдазовдетилм. кІдох кибі» варіант «ей» 80 ко» Хває альфа метиттлютамновою кислотою «в

Ха у Си Су ТІч Ре ТНгБег Авр Туг За Аг Пи еи Ав ЗІ

З 5 то 15 си Ав Уа Хазіец Ре пе спи трів МебАва Тік Ї ув Аго ви 70 25 Зо

Ага Авп Авп Не Аа «ие 18 «ші» 9) «Війз Щщлок «рі13»е похідна сксичнтомадупіну каео» «вії» варіант «о куща» Хває 4-мидазовцетилом. «а 15

Хай Зег іп Су Тр рве ТЕ Заг Ав Туг бБег Ат со Ме й 4 5 то 15 б Ав у Ага ер Кре Пе са Ттріви ме дви Чу СУ то Бег ща ЗО

Веб А раз Рез бо ет і ув

Зо 43 «й 15 «й1і» 9 «ой» білок «щіа» тюхідна оксинтомодутну «ВИ» «щі» варійну «ок «ВИЗ» Хада з 4 Імідазодцетилам. «За» 15

Хазв Су Си СЯуУ Те еНе ТРК г Ав бен дня Аео СЯ Ме ОВ КО

І 5 то че

СЯ Аа ма Аг без бле Не 3 То Апа АБа МВ чек МВ СНУ ТВг 20 28 за ие в оєгАво тя ЗВ АТ ук сен АвВо Гув

З 40 «мох 4 «ші» З «ій» білок сій 0 похідна соми темОолуліну ке» кайї» варізнт «вик (ЇЇ «и» Хавй є 4-мідазовцетилом, «НК 14

Хва заг Оз ЗУ ТБгбНе ТАг оЗег Аве ук Заг Ат Ту Бе Авр Ну ; 5 10 15

СПУ Зі мів Сі СНО СПУ Тег Ре Тк ЗегАвріви бегіув т Меї іш нь Со Ада Уві Куз «жі» 15 «Ті ЗО ! «ий ОК «13» похідна охсинтомодуліну «Дах «йе12 варіант «ШЕ «ей» Хаз є імідазозуєтилом. «ва» «йеі» варіант «вив» «3» Хазе апюьфаметил тлютаминовою кислотою «ЙО»

«ваї» варіант «аа 0 «ВО» Хаває алюфаметуть т лпютамкинно кислотою «а 15

Хав загс су Тег БВе Тв БегАво ТУ бе АК Тугі ви Аво Хад і 5 то ї6 сни Ав Уді Хав ей Ре Бе СНО Тер ве МеєАЛавй Ту ув 28 ке ЗО ка «Вій» Щлок «ві» похідна сксинтомодхліну «Во» «ві» варіант «иа . «ай» Хаа є д-імідазовцетилпоня. ка» «21 варіант «Ва» (80 «та» Жаве алнба-метитьглютаміновою кислота «ее «ві» варант «ай» 24) «дей» Жавеє апьфа-метил-гтютаміновою кутю

«ще 18

Хва у п Су Те Ре тв Бе Аве Тут Мет Ага тує Бе Ав 'ЄНу 1 5 та 15

Си Ав М Хва сец Ре Пе Хав Тр іви МерАва Ті ув Аг Аве 2 25 З та Ав АВи Пе Аа

Мих «а 17 ев З «ай» СщлЛОоК «ій» похідна оксинтомодуміну «Ох хйдї» варіант сажа» і) каайх Хав: Міда ленм. «ши «жів варіант «вий» А «З» Жаває азпьфа-метипнтлютаміновою кислотою «вом 1

Хаа Су МА Ну Тр че Те Бетг Авро Туг г АТО Туг во бер ЗШ 1 В 10 15

ОВ Ада уд Ат ец Рв Не хав то і ес Меса ТР і ов Аго Ав 28 т5 ЗО

Ага аБА Авп Це Ада

«від» 18 «китів ЗА «ія пок «13» похідна океинтомодульу «вид» «Вії» варівнт «Во «иа Хва вч мідаоацетилОюм. «НМ й

ЖХаа его Оу ТБЕ РБе ТНЕ щег Аве без ет Ав С во (3 Су і 5 то 15 свя Нв Зегб Сяу ТЕ еАе Ті Заг Акрьез Бе Ага Сів во

ЗО

Со уз «Ей» 35 «Фі» 7 «ВІЙ пок «213» похідна оксинтомодуліну «а «кім варіант каві «да» Хай є ЗмМідвабацетилом.

«ОО» а

Хава бек (й СМу Тк РнНа ТЕ ВегАво Тут Бе Аго Туг і ви Або СИ

З 5 10 тв си Аа ча Ага ву Ра Не СНО Тр Не Ате Ада ТВі уч Агу Ап

За

АТЗ лап Аа Не Аа 35 «ех хо «1 ОО «й» ВІЛЕК «ій» похідна оксинтомодуліну «ее» варіант «ви (С «иа» Жва ел мідазозцетилом. «Ю З0

Хазв ше ій Су ПУ Ра Тв БегАво Гиг бег Ага Туга АОС

З ї та 15 св АЧа ма! Аг ев Не Не 316 то Це Ага деп сів Се Бгто Баг я ве зо ве ОВ Ав Рто Бгто че бог ув

За о «В У «ої» Му «1» білок

«ДІ15» похідна оксинтомодуінНу каф» «Ві» варізнт хай «ай» Хва є б імідазовцетилом. се 2

Хвабеготпт ою ТВгеНе Ті БегАво Ту БегАго Туга Аво Спи

З В 10 15

СИ Ав Уві ув во Рне Пе СНО Тто Не Ат Або Тег | ув Агу дви

ЗО

Ага Ав Ав Не Дід «ех 2 «і» 40 «12 білок «Кі» похідна охсинтомодулну «ий» «ді» варіант «ий С «йеЗ» Ха в'я імідазоВцетилом. «ЮК» 22

Хва бегбіп СЛУ Те аа Тебе Аяр Ту ЗегАго Тег во Аво СИ

З 5 10 15

СА Ма! ув сво Рне Це бін тр Пе Аг деп Су МУ Ро Баг йо Ко ЗО

ВегОУ Ав Р Рго Ро бе ув «від» а . «із 37 «ав білок «й» похідна оксинтамодуліну «ва кнаї» варішнт «рем «тей» Має мі азаВио. «щюзх ха

Хаа Зегоів ЗУ ТВ Бр Тк Бег Або Туг Бег Ага со бец СОЮ

З 5 то 15 ж

Сидів Уа Ат ее вве Не СЮ Ттрв УЗ Аг АБО ТНК ув Аг Яви

Ата яв Авп Пе Аа ко» Я «і» За «ій» Вілок «13» похідна оксинтомодупіну «ОМ хів вавдійнт «ви С «Теа» ЖХазб дезаміне-потидинене,

сн» Я хаз дес оій см Пе Рве Те Зег Ар Туг Бегі ув Тур Гвио Аво З

З В 10 15 ів йо Аа уз Зі Ре мі Са Террі ев Ме АБО ТИ ув га 25 за кхе10з 55 «11» о «ий» бійок «Ті» похідна ококнтмодуліну «ей» «ве15 важант «ве (8 «ей» Хай аминсшомастяною кислотаю «ен 05

Ні Хав іп СПу Те Бе Тне Зег Ар Туг ес був Туг ес Аво ЄМО 1 В за. 15 іч ехо Аа ув СР ле Уа Су Тр це Ме Аа ТО 2 2-5 «ТР» 50 «іш бю кеій»м похідна сксинтомодулну «ех «Жиї» варізнт

«кий І5 «ие» Хай ЗМІнНОоїщвеМастянОокЕкиспотОою «ВО яв

Не Хав Сма СУ Те ре ТНК бе Авро Бут Зегі ув Би ес Авр со і 5 та 15 іє Ага Аа ув ВА не У Сп То Сец МебАва Те був що Ко За «м 7 «каіїї» Зі «ай БІЛОК «Іа похідна оксинтомодупіну ке» «а» варіант «вай «ей» ЖХває амінсоізомаспяною кислотою «Ще У

Ні Хва Спо ЗУ Те рве Тег Баг Ав Тусбегіув бра ви Ав СП

З 5 10 15

Гуз Ага Ав був Зо Ве ув сло Тео Ме Ап ТВг Сув -О -5 ЗО «вх еВ «ії» 80 «бій білок «ій» похідна оксинтомодуліну

«иа: хеяїв варіан «иа (2 «Вей? Жває аміновомасляною киспотою «Юм ЗВ

Нік Хва СО У Те Рве Тнг БегАво Ту бе уз Тугі ви Авр оС 1 5 о 15

Був Ага Аа ув СТО Єна УВІ НО То ен МесАже ТЕ був

Ка; «В ЗО «10 25 «Й» З «ОТ» білок «Вій» щштучня послідовніте «ах «ке» похідна охсинтамодулну си: «жі» варіану «йди (8) «вай Хаає звмінзізовасляною кислотою «хх 29

Нів Ха С СУ ТК Не ТЕ Заг Або Туг бБегіує Ту ви Азр ЗИ 7 5 1 15 спа АВ АТ Бує Со не Пе Сув Тер во Меє Ав Тег

У Е ве

«й» ЗО «кі» 88 «гій білок «13» похідна оксимтомоецуліму нови «ТО» варіант «вам (й «йИУ» Хайє аміноїзамасляною кислотою «Кк ЗО

Ні Хав Сі слу Таж на тб Сет Аво Тут Зеєв ув Тугі ви Ар Со з ув Ага дів ув Со не Уві Сі Ттруец Мей Аво ТВ га «ях 8 «те» Іо «ій» похідна зкхинусмодувну «мих «геї» варівнт «ака й) «23» Хаває Я«ерином, «а» З

НІВ Хва лу Тег Ре Тег зе Ар тує бегі о тугі во Аво Заг ї 5 зо 15

Ат Аг Аа іп Ар Ре Уа ОН ТПруво МегАва ТВгіувАт АВп

Зб й 25 ЗО

Аг Авп Аа Не Ав «Вій» З «жі» 37 «ей» пак «Ві1йх похідна вкеммтомодулну

Б

«ії варіант «айв «ВО» Ха Є З-мідаЗоВуатилом. «щюЮ» З2

Жрда Бег От СУ Мт Рене Тв БегАво Тут зе іуз тугі во Ахо Бог

З З 19 15

А АВАВ ОСТ Ар Не ма с То ви МегАвоа Паб ув Аг Ав

За

Ата Авп Ав Не дід

ЗВ

«а 35 «ТМ 37 «ай» Блок кій» похідна зксинтомодуліну «Ше хі» варіант «дей

«ше ЖХває нвадпазодуети пом. «УР «ші» варіант «Ве (й «дей» ЖХваає «Ф-серином. «Оз 33

Хва хаз Сип оуУ ТЯ Не Те Зе Аве Туг бегіуз Тут енер Зо

Я 5 10 15

Аг Ану АВ Си яр Рене уві Ми їтрієюз Ме Аво Тегі Ат Ав

За

Ага ап Ав Це дів «ім За «їз З «ій» (ФфлоеК «Я» штучна послідовність «ве» «вий» похідна зксинтомодУуЛІНУ «ках ке» варізнт «аа» «бе» Хаз є 3-імідвзовцетилом: «ие

«ййїх вапрант «вим (8 «Шеа» кває аміновоМмасляною кислотою «400» 34

Хаа Кава СЛУ Пи бе ТЕЖ жегАворо Тугйеті ув Ту Ка Авр СО 1 5 1й 15

МузвАг Ав ув З Рна у СВ трі во МегАян ТИР СуВ 2о 25 30 «НО» ЗВ «Кі» 30 «ія Зцаок «їй» штучна послідовність «ОО» «ее» похідна схсинтомодуліну «вах вії» варіант сшкеит «й» Ждає шміневомайлянею кислотою «НО» За

Нів Хав (іп Су Твг ее Ти бегАви Ти Аа Гуя Туг ГецАво Сц

З З то 15 іув Ап АВ ув Ми Ре уві ів тріо МегАви ТЕ сСуз о 25 ЗО

«ем З «Ох білок «кіЗ- штучна послідавність «вад»

Тай» похідна схсинтомодуліну ве «ваїк варідмт «дит (і «ший» Хавш аміношомасланою кислотаю «Ов 35

ТубХав бів СУ Тв Ре тег бегАвр Тур ще у Тут еп АБО МИ 1 5 15 15 іуз А Авідв сш ие МВ СМ Прі еи Ме Аа пн Су

Зо «Оз 37 каії» 8 «ій» білок «10» шітучна ПОСТДОВНІСТЬ «ад «иа» група КУ «Юм 37

Гув Аго Авп Апе Ав Ав Не Айва

«10» З кеїії 0 «шій» Білок «1» штучна поспідосвність «а «шшаЗ» група КУ «ще ЗВ слу го сег баг СБ АВ Ето Ето Бгто Ког

З 5 зо «Вій» З «ах «ез лок «ві» штучна послідовнють «вед «ва» група й «Не ЗО

Оу то Заг бек сму ів Ето Ро Рто бег Гук «й» «11» 15 «вій лок «д13» витучна поспідавніст» «ех «везе група Ко м

«а Ю

Нів Бек Оп Су Ті не Тиг БегАяо Тугбегіув Тугай Авр

З 5 1 15 «Ок Я «і В «ей» Щілок «туту, К ; схріик зу «13» 0 штучна поналдовнєть «Ух «фе3» група МУ сек» а

Нів Яевг оп іу Ве ене Тег бегАво Туг БегАго Туг г аи Ар ух ' 5 В 15 «рій» 45 ка» жо «ва» (лок «102 лучна послдовнють «0 «ей» трупа ку «ех 42

Ва у и Су Тег Не ТВг ет Авр ви бегі ув СО Ме сп о

З 5 ІВ 15

СА УВС ув рев. «вій а клі» 9 «ий» бок иа» штучна послідеанноть «ой «иа» трупа й або В «цнз 43

Басов Оу ПЕ РИє Тебе Аз туг бегі уз Тугієс Авор БегАт і 5 15 18

Аа Ав іп Азо Рйе ма ів Тріо Ме Аза ТЕ 29 25 км «112» 88 «15 щілюх «15» утучна послідснність сок» група А збо В «ще а

Бег би СУ Тк ре ТНт Зет Аню Тук Зег ув Тут Ге Ав ЯН 1 5 І-Я 15

Ав'єв Ат во Ра Пен Тур бе Ме Ави Те

Кз

«0» а «ії» 28 «шим лок «ій» штучна послідовність «Ох кре» група А Вік В а» 95

Зегіз Сіу Твг Ве Тег ет Авр Туг бБег ув Тур ев Ар ОА і 5 то 15

Ага Аз Сів Аво КНе Уві Аа тр бе ув Ав Ту «10» 45 «81» бою ке штучна послІдОВите «Ох «йУ» група А або В «М» 46 сік сів Су Ті РНЄ Тв БегАвр ТуббегАлі Туг ем си ОЗ сни

Аа мага ес Рне Це Со тез Кен ув Або у

«М» 47 «Зі» яв «Ва» лок «2135 штучна люспідовність «Ве «ка» трупай або В ха» 47

Фу сів у Твг Аве Тнг ет Авю Тут Зак Ат ів Ме спи и і 5 за 15

Аа маг Ага зи Єна НЕСЛИ Тв ес ув Ада Су «ТО» ав «ох 98 «ія» білок «Ей» штучна поспідовніють «ев» «ей труУМА збо В «ЩО» 48

Су Спи ЧУ ТЕ бе Тебе Ав ви Зег Али са Ме Спо ми ОВ 1 5 То 15

Дів Маг Ага бец Рпе Пе Си То АБ АВ яО 25 «1» аа «вії» я

«шій» лок «1» штучна послідовність «пе» «ваз» група А айе В «ах его о Тв ро Твен Азр ТугБег Ат сів Мегсно бно Є і й Но 15

Ав ча Ага ву РБе не си трів Ме Аа Су 2 8 «Лі» 2 «Я» біпок «13» зитучна поспідсовніть «ей» група 5 «щюЮе ВО су а СНУ тає бле тв щен бер Цво вет Ага п Мей Св Сів си ї 5 1 15

Аів Уа Ага без не бе СНИ Тто

КУ

«10 5 «ії» Ла «ій» ЯЛОК «кій» цтучна поставить

«ШеЗ» трупа В «ЩЮх О5і

Баг СУ Ту Бе Тег ет Аво ТугегАто ТУ еп Ар

Е Бо то «ве Б «Вів У «вій лок «ій» штучна послідовністю «их «ей» глюкагон «ВО Во

Нв бег уУ Тева ТнгбегАво Тур бегі ув Тугі ви Ар Заг

З З НЕО. 15 лмамавмацюлаірене ув ою Пріец Ме АТ

Claims (12)

2-0 -5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду порівняно з фізіологічно активним білком або пептидом, не кон'югованим з Ес-фрагментом імуноглобуліну, в якому спосіб призначений для покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду у водному розчині, що має рнН від 5,0 до 7,0, де спосіб включає кон'югацію фізіологічно активного білка або пептиду з М-кінцем Ес-фрагмента імуноглобуліну через непептидильний полімер, де фізіологічно активним о білюм або пептидом є ексендин-4, глюкагон, глюкагоноподібний пептид-ї (СІ Р-1), глюкагоноподібний пептид-2 (СІ Р-2) або оксинтомодулін, і де непептидильний полімер є поліетиленгліколем.

2. Спосіб за п. 1, в якому Ес-фрагмент імуноглобуліну є Ес-фрагментом, що походить від до, ІЧА, Ід, ІЧЗЕ або Ідм.

3. Спосіб за п. 2, в якому Ес-фрагмент імуноглобуліну є гібридом доменів, в якому кожний домен має інше походження та походить від імуноглобуліну, вибраного з групи, що складається з Ідс, ІЧА, ДО, ІЗЕ та І9М.

4. Спосіб за п. 2, в якому Ес-фрагмент імуноглобуліну є димером або мультимером, що складається з одноланцюгових імуноглобулінів однакового походження.

5. Спосіб за п. 4, в якому Ес-фрагмент імуноглобуліну є аглікозилованим Ес-фрагментом людського імуноглобуліну Ід.

6. Спосіб за п. 1, в якому фізіологічно активний білок або пептид кон'юговано з Ес-фрагментом імуноглобуліну у вигляді злитого білка.

7. Спосіб за п. 1, де ексендин-4 є СА-ексендином-4 (імідазоацетилексендином-4).

8. Спосіб за п. 1, де оксинтомодулін містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26, 27 або

28.

9. Спосіб за п. 1, в якому водний розчин містить лимоннокислий або оцтовокислий буферний розчин, полісорбат як неїонний поверхнево-активний засіб, маніт як цукроспирт та хлорид натрію або метіонін як ізотонічний засіб.

10. Застосування кон'югата, в якому фізіологічно активний білок або пептид зв'язаний з М-кінцем Ес-фрагмента імуноглобуліну через непептидильний полімер для покращення розчинності фізіологічно активного білка або пептиду у водному розчині, що має рН від 5,0 до 7,0, порівняно з фізіологічно активним білком або пептидом, що не є кон'югованим з Ес-фрагментом імуноглобуліну, де фізіологічно активним білком або пептидом є ексендин-4, глюкагон, глюкагоноподібний пептид-ї (СІ Р-1), глюкагоноподібний пептид-2 (СІ Р-2) або оксинтомодулін, і де непептидильний полімер є поліетиленгліколем.

11. Застосування за п. 10, де ексендин-4 є СА-ексендином-4 (імідазоацетилексендином-4).

12. Застосування за п. 10, де оксинтомодулін містить амінокислотну послідовність зБЕО ІЮ МО: 26, 27 або 28. сзаздартнвя калінуюватьни в грації прунну ! що. Е

: . і ух івлитк кі н5 со яаювою. ут і Я «тва ей Ж авбою шо Е ! шин : с зювоН од і ! й 30 8 0030 158 500 во ба канценуваці пеонну ери І І Кузня оютеніи вав рувальени грн вом'оєату НоУиНу жваве ї ван. Е і ух ДБАЗХ з 505 ї : І : Й - і ро вюзою ще же вВОНІ ше БУ ж : пек ї ї я ї Де Е Б МНюООю : ше ! ши ши ши же ни МИ Концентрація ком кматуінсупіну тривало дій аква: ФІ

Ї Ї : УК інсулня . пох 3 пи га ї і Е Н ФВ'ЮЖВТ еко пк кокон х п МЕМ : 5 тривале дії с і Ї Н ї У дапкмнкканкякоранкккя й ; : , ; Еш 2 я р Б ча 5 4 36 розчзунніст: меле на основ веуіну ге бтузнахрункх хавкузувалекни гран яоахідном оковатодиміх

МН. те ватяк ЗА ЛОВ ч Її : Я «това в р : ї Ей ї МЕНЕ: ше ро : ож і: ш : ши Н Ї : в БО бе Бе особ бе 306 350 : Концентрація подано окаенитомодуну ПУКСМИ! і на о а нн о и и М о СІНО ННИ КАН ВУваленни поаднк кеВ Кн яту охо окенитомовяуліну тренианох ДИ нн нн нн и, ни и НО ОКО : - Кей ї БО АСССНИИ -й ї Х УМАНІ ї и ї Е -е Бо і ! й 5 за Я58 5035 ляо ма а камери КОМУ ПЕД окон уму рони вн ім, й : й З ік а похідна с. оконнтомодувіну ПВА же МИТ МБОЖіДнОВ кОхМКе ех з СКК рокіаміні Вінні | с о. с осв шо ОВ . х . ХХ З СО ЕВ 4 тривалої дії . . о. ! ; і го; й й в З 30 15 зачин» цегли.

Ма ОсмОоВі окевНнтовадУвВіНу ФІ 4