UA121099C2 - Спосіб підвищення ефективності спрямованої модифікації генів із застосуванням опосередкованої олігонуклеотидами репарації генів - Google Patents

Abstract

Винахід стосується застосування однієї або декількох сайтспецифічних ендонуклеаз, які вводять однониткові розриви, для поліпшення мутаційного перетворення олігонуклеоосновами для репарації генів (GRON) як донорами.

Description

Винахід стосується застосування однієї або декількох сайтспецифічних ендонуклеаз, які вводять однониткові розриви, для поліпшення мутаційного перетворення олігонуклеоосновами для репарації генів (ЗКОМ) як донорами.

001) Дана заявка претендує на пріоритет на підставі попередньої заявки на патент США Мо 61/801320, поданої 15 березня 2013 р., зміст якої даним включено в дану заявку за допомогою посилання.

ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ

І002| Даний винахід у цілому відноситься до нових способів підвищення ефективності спрямованої модифікації певних положень у геномних або інших послідовностях нуклеотидів.

Крім того, даний винахід відноситься до цільового ДНК, яку модифікували, мутували або позначили за допомогою підходів, описаних у даній заявці. Даний винахід також відноситься до клітин, тканини й організмів, які були модифіковані за допомогою способів згідно з даним винаходом.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

003) Двониткові розриви ДНК (ДНР) підвищують рівень гомологічної рекомбінації в живих клітинах, і їх застосовують для спрямованого редагування генома за допомогою застосування сконструйованих ендонуклеаз. Ключовим компонентом сконструйованих нуклеаз є домен впізнавання ДНК, що здатний направляти нуклеазу на цільовий сайт генома для одержання двониткового розриву геномної ДНК. Клітинна репарація ДНР завдяки негомологічному з'єднанню кінців (НГЗК) призводить до мутагенних делецій/вставок у цільовому гені. З іншого боку, ДНР може стимулювати гомологічну рекомбінацію між ендогенним цільовим локусом і введеним екзогенно фрагментом гомологічної ДНК із бажаною генетичною інформацією, такий процес називається спрямованим впливом на гени.

І004)| У найбільш перспективному способі, що передбачає редагування гена або генома, застосовують спеціально сконструйовані нуклеази з цинковими пальцями (2ЕМ), тип гібридного ферменту, що складається з ДНК-сполучних доменів білків із цинковими пальцями та домена нуклеази ЕБоКкІ (ЕМ). Методика 2ЕМ, насамперед, включає застосування гібридних білків, отриманих із ДНК-сполучних доменів білків із цинковими пальцями (2Е) і неспецифічно розщеплює домен ендонуклеази ЕоКІ. 2Е можуть бути зібрані з модулів, які спеціально сконструйовані таким чином, щоб вони дізнавалися про вибрані послідовності ДНК після зв'язування із заздалегідь вибраним сайтом, і ДНР одержують під дією розщеплюючого домена

ЕоКІ.

Зо 005) Ендонуклеаза ЕокКІ спочатку була виділена з бактерії Ріамобасієегішт оКеапоКоїйез. Дана нуклеаза типу ІІ5 складається з двох окремих доменів: М-кінцевого ДНК-сполучного домена та

С-кінцевого домена, розщеплюючого ДНК. Функція ДНК-сполучного домена складається у впізнаванні непаліндромної послідовності 5'-ЯСАТИа-375-САТОСС-3", тоді як каталітичний домен неспецифічно розщеплює двониткову ДНК на певній відстані в 9 і 13 нуклеотидів по ходу транскрипції від сайту впізнавання. У розчині РОКІ присутній у вигляді неактивного мономеру та стає активним димером після зв'язування з цільовою ДНК й у присутності деяких двовалентних металів. У вигляді функціонального комплексу кожна з двох молекул ЕоК!І зв'язується з двонитковою молекулою ДНК і димеризується за допомогою ДНК-каталітичного домена для ефективного розщеплення подвійних ниток ДНК.

І006| Аналогічно, нуклеази також можна одержати, застосовуючи інші білки/домени, якщо вони здатні специфічно впізнавати ДНК. Ефектори ТАЇ належать до великої групи бактеріальних білків, які перебувають у різних штамах Хапіпотопазх і переміщаються в клітини- хазяїни за допомогою системи секреції ІІ типу, і називаються ефекторами ПІ типу. Виявили, що як тільки вони виявляються в клітинах-хазяїнах, деякі ефектори ТАГ. транскрипційно активують відповідні цільові гени хазяїна, або для вірулентності штаму (здатності викликати захворювання), або для авірулентності штаму (здатності запускати реакції стійкості в хазяїна), залежно від генетичного контексту хазяїна. Кожен ефектор містить функціональні мотиви ядерної локалізації й ефективний домен активації транскрипції, властиві еукаріотичному активатору транскрипції. | кожен ефектор також містить центральну ділянку з повторами, що складається із змінних кількостей повторюваних одиниць з 34 амінокислот, і зазначена ділянка з повторами як ДНК-сполучний домен визначає біологічну специфічність кожного ефектора.

І007| В 2Ппапо та ін., Ріапі Рпузіо!ї. 161: 20-27, 2013, яка даним повністю включена в дану заявку за допомогою посилання, описане застосування нуклеаз ТАГЕМ (Тгапзсгіріоп Асіїмайог-

Їіке Епесіог Мисієазе5, ефекторні нуклеази, подібні до активаторів транскрипції), які являють собою сконструйовані ендонуклеази на основі комбінації подібного ефектору ТА ДНК- сполучного домена з каталітичним доменом ЕокКіІ. За наявними даними, шляхом конструювання

ДНК-сполучного домена такі ТАГЕМ можна легко розробити таким чином, щоб вони впізнавали певні ДНК-сполучні домени. Застосовуючи протопласти тютюну в якості модельної системи, активність ТАГЕМ оцінювали із застосуванням полінуклеотидного репортера однониткового бо відпалу, що містить послідовність кодуючу жовтий флуоресцентний білок, з'єднану з сайтом впізнавання ТАГЕМ. Таку репортерну систему доставляли у протопласти, і подію розщеплення та репарації можна було виміряти за експресією функціонального УЕР.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

008) У першому аспекті даний винахід відноситься до способів введення опосередкованої

СКОМ (олігонуклеооснова для репарації генів) мутації в цільову послідовність дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) у клітині рослини. Зазначені способи включають, серед іншого, культивування клітини рослини при умовах, які підсилюють один або більше процесів репарації клітинної ДНК, перед й/або одночасно з доставкою СКОМ у клітину рослини.

ІЇО09| У деяких варіантах реалізації умови, які підсилюють один або більше процесів репарації клітинної ДНК, включають одну або більше з наступних умов: введення в СКОМ або в

ДНК клітини рослини одного або більше сайтів, які є мішенями для ексцизійної репарації основ, введення в СКОМ або в ДНК клітини рослини одного або більше сайтів, які Є мішенями для негомологічного з'єднання кінців, введення в ОКОМ або в ДНК клітини рослини одного або більше сайтів, які є мішенями для опосередкованого мікрогомологією з'єднання кінців, введення в ОКОМ або в ДНК клітини рослини одного або більше сайтів, які Є мішенями для гомологічної рекомбінації, і введення в ОКОМ або в ДНК клітини рослини одного або більше сайтів, які є мішенями для репарації виштовхування. 0010) У деяких варіантах реалізації цільова послідовність дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) перебуває всередині генома клітини рослини. Клітина рослини може бути нетрансгенною або трансгенною, і цільова послідовність ДНК може являти собою трансген або ендогенний ген зазначеної клітини рослини.

ІЇО011| У деяких варіантах реалізації умови, які підсилюють один або більше процесів репарації клітинної ДНК, включають введення однієї або більше сполук, які викликають одно- або двониткові розриви ДНК, у клітину рослини перед або одночасно з доставкою СОКОМ у клітину рослини. Приклади сполук описані далі в даній заявці.

ЇО0О12| Способи та композиції, описані в даній заявці, застосовні для рослин у цілому.

Винятково як приклад, вид рослини може бути вибраний з групи, що складається з наступних видів: канола, соняшник, кукурудза, тютюн, цукровий буряк, бавовник, маїс, пшениця, ячмінь, рис, люцерна, ячмінь, сорго, томат, манго, персик, яблуко, груша, полуниця, банан, диня,

Зо картопля, морква, латук, цибуля, соя культурна, види сої, цукрова тростина, горох, нут, горох польовий, кінський біб, сочевиця, ріпа, бруква, брюссельська капуста, люпін, кольорова капуста, капуста кормова, кормові боби, тополя, сосна, евкаліпт, виноград, цитрусова рослина, тритікале, люцерна, жито, овес, дерен і кормові трави, льон, олійний рапс, гірчиця, огірок, в'юнок, бальзамін, перець, баклажан, чорнобривець, лотос, кочанна капуста, ромен, гвоздика, тюльпан, ірис і лілія. Це також може відноситись в цілому або частково до всіх інших біологічних систем, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: клітини бактерій, грибів і ссавців і навіть їх органели (наприклад, мітохондрії та хлоропласти). 0013) У деяких варіантах реалізації зазначені способи додатково включають відтворення рослини, що містить мутацію, введену за допомогою СОКОМ, із клітини рослини, і можуть включати збір насіння від рослини. 0014) У відповідних аспектах даний винахід відноситься до клітин рослини, що містить геномну модифікацію, введену за допомогою ОКОМ відповідно до способів, описаних у даній заявці, до рослини, що містить геномну модифікацію, введену за допомогою ОКОМ відповідно до способів, описаних у даній заявці, або до насіння, що містить геномну модифікацію, введену за допомогою СКОМ відповідно до способів, описаних у даній заявці. 0015) Інші варіанти реалізації даного винаходу повинні стати очевидні після ознайомлення з наступним докладним описом, типовими варіантами реалізації та формулою винаходу.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

(0016) Визначення

І0017| Даний винахід варто розуміти у відповідності з наступними визначеннями.

І0018| Олігонуклеооснова являє собою полімер нуклеооснов, що може гібридизуватись шляхом спарювання основ за Уотсон-Кріком із ДНК, що має комплементарну послідовність.

І0019| Нуклеооснови включають основу, що являє собою пурин, піримідин або їхні похідні або аналоги. Нуклеооснови включають пептидні нуклеооснови, субодиниці пептидних нуклеїнових кислот і морфолінові нуклеооснови, а також нуклеозиди та нуклеотиди. Нуклеозиди являють собою нуклеооснови, які містять пентозафуранозильну групу, наприклад, можливо містять замісники рибозид або 2'-дезоксирибозид. Нуклеозиди можуть бути з'єднані однією з декількох сполучних молекул, які можуть містити або можуть не містити фосфор. Нуклеозиди, які з'єднані фосфодіефірними зв'язками, що не містять замісників, називають нуклеотидами. бо І00209| Ланцюг олігонуклеооснов містить один 5'- і один 3'-кінець, які являють собою крайні нуклеооснови полімеру. Конкретний ланцюг олігонуклеооснов може містити нуклеооснови всіх типів. Олігонуклеооснова являє собою сполуку, що містить один або більше ланцюгів олігонуклеооснов, які комплементарні та гібридизовані шляхом спарювання основ за Уотсон-

Кріком. Нуклеооснови належать або до дезоксирибо-типу, або до рибо-типу. Нуклеооснови рибо-типу являють собою нуклеооснови, що містять пентозафуранозил, де 2'-атом вуглецю являє собою метилен, що містить як замісник гідроксил, алкілокси або галоген. Нуклеооснови дезоксирибо-типу являють собою нуклеооснови, відмінні від нуклеооснов рибо-типу, і включають всі нуклеооснови, які не містять пентозафуранозильну групу. 0021) Нитка олігонуклеооснов у загальному випадку включає як ланцюг олігонуклеооснов, так і фрагменти або ділянки ланцюгів олігонуклеооснов. У нитки олігонуклеооснов є 3'-кінець та 5'-кінець. Якщо нитка олігонуклеооснов має однакову довжину з ланцюгом, то 3'- і 5'-кінці нитки також являють собою 3'- і 5'- кінці ланцюга.

І0022| Згідно з даним винаходом органи рослини включають, але не обмежені перерахованими: листя, стебла, коріння, вегетативні бруньки, квіткові бруньки, меристеми, ембріони, сім'ядолі, ендосперм, чашолистки, пелюстки, маточки, плодолистики, тичинки, пильовики, мікроспори, пилок, пилкові трубки, сім'ябруньки, зав'язі та фрукти, або зрізи, скибочки або пластинки, взяті з них. Тканини рослини включають, але не обмежені перерахованими: калусні тканини, покривні тканини, провідні тканини, запасаючі тканини, меристематичні тканини, тканини листа, тканини пагона, тканини кореня, тканини гала, тканини пухлини рослини та репродуктивних тканин. Клітини рослини включають, але не обмежені перерахованими: ізольовані клітини з клітинними стінками, їхні агрегати різного розміру та протопласти. 0023) Два полінуклеотиди або поліпептиди ідентичні, якщо послідовність нуклеотидів або амінокислотних залишків, відповідно, у двох зазначених послідовностях однакова при вирівнюванні до максимальної відповідності, як описано нижче. Терміни "ідентичний" або "відсоток ідентичності" у контексті двох або більше нуклеїнових кислот або поліпептидних послідовностей відносяться до двох або більше послідовностей або підпослідовностей, які однакові або містять певний відсоток однакових амінокислотних залишків або нуклеотидів при порівнянні та вирівнюванні до максимальної відповідності у вікні порівняння, що вимірюють,

Зо застосовуючи один із наступних алгоритмів порівняння послідовностей або шляхом вирівнювання вручну та шляхом візуальної оцінки. Для поліпептидів, послідовності яких відрізняються на консервативні заміни, відсоток ідентичності послідовностей можна збільшити, щоб ввести виправлення на консервативну природу таких замін. Засоби для введення таких виправлень добре відомі фахівцям у даній області. Зазвичай вони включають оцінку консервативної заміни як часткової, а не повної розбіжності, що збільшує відсоток ідентичності послідовностей. Таким чином, наприклад, коли ідентичній амінокислоті привласнюють 1 бал і не консервативній заміні привласнюють нуль балів, то консервативній заміні привласнюють бал між нулем та 1. Бали для консервативних замін розраховують згідно, наприклад, алгоритму

Меуегз і МіПег, Сотршиїег Арріїс. Віої. зсі. 4: 11-17 (1988), наприклад, що здійснюється у програмі

РС/СЕМЕ (ІпіеПдепеїіс5, Маунтін-Вью, Каліфорнія, США).

І0024| Формулювання "по суті ідентичний" та "відсоток ідентичності" у контексті двох нуклеїнових кислот або поліпептидів відносяться до послідовностей або підпослідовностей, ідентичність нуклеотидів або амінокислотних залишків яких становить щонайменше 50 95, переважно 60 95, переважно 70 95, більш переважно 80 95 і найбільше переважно 90-95 95 при вирівнюванні до максимальної відповідності у вікні порівняння, що вимірюють, застосовуючи один із наступних алгоритмів порівняння послідовностей або шляхом вирівнювання вручну та візуальної оцінки. Дане визначення також відноситься до послідовності, комплементарної досліджуваній послідовності, послідовності або підпослідовності яких у значній мірі комплементарні, коли досліджувана послідовність у значній мірі ідентична еталонній послідовності. 00251 Для фахівця в даній області техніки буде очевидно, що два поліпептиди також можуть бути "по суті ідентичними", якщо два зазначених поліпептиди імунологічно подібні. Таким чином, загальна білкова структура може бути подібною, тоді як для первинної структури двох зазначених поліпептидів демонструють істотні відмінності. Отже, спосіб вимірювання того, чи є два поліпептиди по суті ідентичними, включає вимірювання зв'язування моноклональних або поліклональних антитіл з кожним поліпептидом. Два поліпептиди по суті ідентичні, якщо антитіла, специфічні до першого поліпептиду, зв'язуються з другим поліпептидом з афінністю, рівною щонайменше одній третині від афінності до першого поліпептиду. Для порівняння послідовностей зазвичай одна послідовність виступає в ролі еталонної послідовності, 3 якою бо порівнюють досліджувані послідовності. При застосуванні алгоритму порівняння послідовностей досліджувану й еталонну послідовності вводять у комп'ютер, встановлюють координати підпослідовностей, при необхідності, і встановлюють параметри програми алгоритму порівняння послідовностей. Алгоритм порівняння послідовностей потім розраховує відсоток ідентичності послідовностей для досліджуваної послідовності(ей) у порівнянні з еталонною послідовністю на підставі встановлених параметрів програми.

І0026| Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути здійснено, наприклад, за допомогою алгоритму локальної гомології Сміта-Ватермана, 0.4дм. Аррі. май. 2:482 (І 98 І), за допомогою алгоритму гомологічного вирівнювання Нідлмана-Вунша, 9). Мої. Віої. 48:443 (1970), за допомогою способу пошуку подібності Пірсона та Ліпмана, Ргос. Маг. Асай. 5бі.

БА 5 85:2444 (1988), за допомогою комп'ютеризованих реалізацій даних алгоритмів (САР,

ВЕЗТРЇІТ, РА5ТА й ТЕА5ТА у пакеті програмного забезпечення УмМізсопзіп Сепеїїс5, Сепеїіс5

Сотршег Сгошр, 575 Зсіепсе Ог., Медісон, Вісконсін), за допомогою програмного забезпечення для вирівнювання, такого як МЕСТОК МТІ, версія 6, від ІптогМах, Іпс., Меріленд, США, за допомогою процедур, описаних в СіивіаЇї, Тпотрзоп, у. 0., Ніддіп5, Ю. б. ії сірзоп, Т. 9. (1994) СГО5ТтАЇ МУ: ітргоміпу Ше зепзйймйу ої ргодгезвіме тийіріє зедоепсе аїїдптепі годи зедиоепсе меїднііпу, розпйоп-5ресіїїс дар репашез апа меїдні тайіх споїісе. Мисієїс Асід5 Незеагси, 22:4673- 4680 або шляхом візуальної оцінки (див., в загальних рисах, Ргоїосої!5 іп МоїІесціаг Віоіоду, РЕ. М.

А!йзибеї! та ін., ред., Сигтепі Ргоїосоїі5, спільне підприємство Сгеепе Рибії5піпуд Ав5зосіагезв, Іпс., і

Уопп УМіеу 5 5Ооп5, Іпс. (1995, Додаток) (А!зибе!ї)).

І0027| Приклади алгоритмів, які підходять для визначення відсотка ідентичності послідовностей і подоби послідовностей, являють собою алгоритми ВІ А5Т і ВІ А5Т 2.0, які описані в АїЇї5сапиЇ та ін. (1990) 9. Мої. Віої. 215: 403-410 й Анб5спиі та ін. (1977) Мисівїс Асід5 Кев. 25:33 89-3402, відповідно. Програмне забезпечення для проведення розрахунків ВІАЗТ доступне для загального використання на сайті Майопа! Сепіег ог ВіоїесппоЇоду Іптоптаїйоп (пер:/Лумлми.побі.піт.пій.дом/). У даному алгоритмі спочатку проводять ідентифікацію пар послідовності з високими балами (НОР) шляхом ідентифікації коротких "слів" довжини У у запитуваній послідовності, які або збігаються, або задовольняють деякій позитивній граничній вазі (балу) Т при вирівнюванні з словом такої самої довжини у послідовності з бази даних. Т називають граничним балом сусідніх слів (Ай5сапиі! та ін., вище). Такі первісні збіги сусідніх слів

Зо використовують як запал для ініціації пошуку з метою виявлення утримуючих їх більш довгих

Н5Р. Потім співпадання слів подовжують в обох напрямках уздовж кожної послідовності доти, доки може збільшуватись кумулятивна вага вирівнювання. Кумулятивні ваги для послідовностей нуклеотидів обчислюють з використанням параметрів М (призовий бал за пару співпадаючих залишків; завжди 20) і М (штрафний бал за незбіжні залишки; завжди «0). Для послідовностей амінокислот для обчислення кумулятивної ваги використовують матрицю ваг. Подовження збігів слів у кожному напрямку припиняється в тому випадку, коли: кумулятивна вага вирівнювання різко знижується на величину Х від свого максимального досягнутого значення; кумулятивна вага знижується до нуля або нижче внаслідок накопичення одного або більше вирівняних залишків із негативними балами; або якщо досягається кінець кожної з послідовностей.

Параметри алгоритму ВГА5Т МУ, Т ї Х визначають чутливість та швидкість вирівнювання. У програмі ВГА5БТМ (для послідовностей нуклеотидів) у якості параметрів, що задають за замовченням, використовують довжину слова (М), рівну 11, очікування (Е), рівне 10, М-5, М--4, і порівняння обох ниток. Для амінокислотних послідовностей у програмі ВІ А5ТР використають в якості параметрів, що задають за замовченням, довжину слова (М/), рівну 3, очікування (Е), рівне 10, і матрицю ваг ВГОБИМб2 (див. Непікоїї і Непікоїї, Ргос. Маї). Асай. зсі. ОБА 89: 10915 (1989)). Крім обчислення відсотка ідентичності послідовностей алгоритм ВІ А5Т також здійснює статистичний аналіз подібності двох послідовностей (див., наприклад, Кагіїй й Айб5сПиї, Ргос.

Маг. Асад. бсі. ОБА 90: 5873-5787 (1993)). Одним із критеріїв ступеня подібності, що дозволяє одержати алгоритм ВІГА5БТ, є найменша сумарна ймовірність (Р(М), що дає показник імовірності, з якої співпадіння між двома послідовностями нуклеотидів або амінокислот може відбутися випадковим чином. Наприклад, нуклеїнову кислоту вважають подібною з еталонною послідовністю, якщо найменша сумарна ймовірність при порівнянні досліджуваної нуклеотидної послідовності з еталонною нуклеотидною послідовністю менше, ніж приблизно 0,1, більш переважно менше, ніж приблизно 0,01, і найбільше переважно менше, ніж приблизно 0,001. (0028) Розрив ниток

І0029| Включення сполук, які викликають одно- або двониткові розриви, або всередину олігонуклеотиду, або разом із олігонуклеотидом, викликає ушкодження, що репарується за допомогою негомологічного з'єднання кінців (НГЗК), опосередкованого мікрогомологією з'єднання кінців (ОМЗК) і гомологічної рекомбінації. Як приклад, антибіотики з сімейства бо блеоміцину, нуклеази із цинковими пальцями, РОКІ (або будь-який клас ферментів рестрикції типу ІІ5) і інші нуклеази можна ковалентно з'єднати з 3'- або 5-кінцями олігонуклеотидів для репарації, щоб ввести двониткові розриви поблизу сайту, на зміну якого спрямований олігонуклеотид для репарації. Антибіотики з сімейства блеоміцину являють собою розщеплюючі

ДНК глікопептиди та включають блеоміцин, зеоцин, флеоміцин, талісоміцин, пеплеоміцин та інші антибіотики. 00301 Способи згідно з даним винаходом не обмежені природою або типом застосовуваного

ДНК-модифікуючого реагенту. Наприклад, такі ДНК-модифікуючі реагенти вивільняють радикали, які призводять до розриву нитки ДНК. Як альтернатива, зазначені реагенти алкілують

ДНК із утворенням аддуктів, які будуть блокувати реплікацію та транскрипцію. В альтернативному варіанті зазначені реагенти утворюють поперечні зшивки або молекули, які інгібують клітинні ферменти, призводячи до розривів ниток. Приклади ДНК-модифікуючих реагентів, які приєднують до олігонуклеотидів для одержання утворюючих триплекс олігонуклеотидів (ТЕО), включають, але не обмежені перерахованими: індолокарбазоли, нафталіндімід (МОЇ), трансплатин, блеоміцин, аналоги циклопропапіролоїндолу та фенантродигідродіоксини. Зокрема, індолокарбазоли являють собою інгібітори топоізомерази І.

Інгібування даних ферментів призводить до розривів ниток й утворення аддуктів із ДНК і білками (Агітопдо та ін., Віоогдапіс апі Медісіпаї Спет. 8, 777, 2000). МОЇ являє собою фотоокислювач, який може окисляти гуаніни, що може викликати мутації в сайтах із залишками гуаніну (Мипе? та ін., Віоспетізігу, 39, 6190, 2000). Було показано, що трансплатин реагує із ДНК у триплексній мішені, коли ТРО пов'язаний із зазначеним реагентом. Дана реакція викликає утворення аддуктів ДНК, які будуть мутагенними (СоЇІштрбіег та ін., Мисіеїс Асід5 Кезеагсі, 24: 4519, 1996). Блеоміцин являє собою реагент, що вносить розриви в ДНК, широко застосовуваний як аналог радіації. Його з'єднували з олігонуклеотидами та показали, що він активний як реагент, що вносить розриви в ДНК, у такому форматі (Зегдеуем, Мисієїс Асіав5

Кезеагп 23, 4400, 1995; Капе, та ін., Віоспетівігу, 34, 16715, 1995). Аналоги циклопропапіролоіїндолу з'єднували з ТЕО і показали, що вони алкілують ДНК у послідовності триплексної мішені. Після цього алкілована ДНК буде містити хімічні аддукти, які будуть мутагенними (Сиктпапом, та (|н., Мисієїс Асій5 Кезеагс!, 25, 5077, 1997).

Фенантродигідродіоксини являють собою замасковані хінони, які вивільняють радикали при

Зо фотоактивації. Їх з'єднували з ТЕО і показали, що вони вводять розриви в дуплекс ДНК при фотоактивації (Вепаїп5Кав та ін., Віосопідасєе Спет. 9, 555, 1998).

І0ОО31| Одна стратегія для спрямованого порушення гена полягає в утворенні розривів однониткової або двониткової ДНК, викликаних сайтспецифічними ендонуклеазами.

Ендонуклеази найбільше часто застосовують для спрямованого порушення генів в організмах, які зазвичай стійкі до більш традиційних способів спрямованого впливу на гени, таких як моделі водоростей, рослин і великих тварин, включаючи людей. Наприклад, у цей час здійснюють клінічні випробування в людини, що передбачають застосування нуклеаз із цинковими пальцями для лікування та запобігання ВІЛ-інфекції. Крім того, конструювання ендонуклеаз на сьогоднішній день застосовують при спробах порушити гени, які призводять до утворення небажаних фенотипів у зернових культурах. 00321) Хомінг-ендонуклеази, також відомі як мегануклеази, являють собою сайт-специфічні ендонуклеази, які утворюють двониткові розриви в геномній ДНК із високим ступенем специфічності завдяки більшим (наприклад, » 14 п.о.) сайтам розщеплення. Незважаючи на те, що специфічність хомінггеендонуклеаз до цільових сайтів дозволяє точне позиціювання індукованих розривів ДНК, сайти розщеплення хомінг-ендонуклеазами зустрічаються рідко й імовірність виявлення розщеплення, що зустрічається у природі сайту, у цільовому гені низька. 0033) Сконструйовані хомінг-ендонуклеази одержують шляхом модифікації специфічності існуючих хомінг-ендонуклеаз. В одному підході у послідовність амінокислот хомінг-ендонуклеаз, які зустрічаються у природі вводять варіації, а потім отримані сконструйовані хомінг- ендонуклеази піддають скринінгу, щоб вибрати функціональні білки, які розщеплюють цільовий сайт зв'язування. В іншому підході химерні хомінг-ендонуклеази конструюють шляхом комбінування сайтів впізнавання двох різних хомінг-ендонуклеаз, щоб одержати новий сайт впізнавання, що складається з половин сайтів кожної хомінг-ендонуклеази.

І0034| Один клас сконструйованих ендонуклеаз являє собою клас ендонуклеаз із цинковими пальцями. В ендонуклеазах із цинковими пальцями сполучають домен неспецифічного розщеплення, зазвичай з ендонуклеази РОКІ, з доменами білків із цинковими пальцями, які сконструйовані таким чином, щоб вони зв'язувалися з певними послідовностями ДНК. Модульна структура ендонуклеаз із цинковими пальцями робить їх універсальною платформою для створення сайт-специфічних двониткових розривів у геномі. Одне обмеження ендонуклеаз із бо цинковими пальцями полягає в тому, що низька специфічність до цільового сайту або присутність декількох цільових сайтів у геномі може призвести до випадків розщеплення поза цільовим сайтом. Тому що ендонуклеаза РОКІ розщеплює у вигляді димеру, одна стратегія для запобігання випадків розщеплення поза цільовим сайтом складається в розробці доменів із цинковими пальцями, які зв'язуються з суміжними сайтами з 9 пар основ.

Ї0035| ТАГЕМ являють собою направлені на мішень нуклеази, які викликають одно- і двониткові розриви у певних сайтах ДНК, які потім репаруються за допомогою механізмів, які можна застосовувати, щоб внести зміни у послідовність в сайті розщеплення. 0036) Основний структурний елемент, що застосовують для конструювання ДНК-сполучної ділянки ТА ЕМ, являє собою домен з високо консервативним повтором, отриманий з ТАЇ Е, які зустрічаються у природі, кодованих протеобактеріями виду Хапіпотопав. ТАЇ ЕМ зв'язує ДНК за допомогою групи високо консервативних повторів з 33 - 35 амінокислот, які фланковані додатковими отриманими з ТАЇЕ доменами на аміно-кінцях і карбокси-кінцях зазначених повторів.

ІЇ0037| Такі повтори ТАЇЕ специфічно зв'язуються з одиночною основою ДНК, що ідентифікують два гіперваріабельних залишки, зазвичай виявлених у положеннях 12 і 13 повтору, при цьому кількість повторів у групі відповідає довжині бажаної цільової нуклеїнової кислоти, конкретний повтор вибирають, щоб він підходив до цільової послідовності нуклеїнової кислоти. Розмір цільової нуклеїнової кислоти переважно становить від 15 до 20 пар основ, щоб максимізувати селективність до цільового сайту. Розщеплення цільової нуклеїнової кислоти зазвичай відбувається в межах 50 пар основ від сайту зв'язування ТАГЕМ. Комп'ютерні програми для розробки сайту впізнавання ТАГЕМ були описані в даній області техніки. Див., наприклад, Септак та ін., Мисієїс Асіа5 Ке5. 2011., липень; 39(12): е82.

І0038| Після розробки ТА ЕМ таким чином, щоб вони підходили до бажаної цільової послідовності, їх можна рекомбінантно експресувати і вводити у протопласти як екзогенні білки, або експресувати з плазміди всередині протопласту.

І0039| Структура СОКОМ і його впровадження в клітини рослини.

І0040| Рекомбінагенну олігонуклеооснову можна ввести в клітину рослини, застосовуючи будь-який спосіб, широко використовуваний у даній області, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: мікроносії (біолістичну доставку), мікроволокна (нитковидні кристали),

Зо електропорацію, безпосереднє поглинання ДНК і мікроін'єкцію. Наочні приклади рекомбінагенної олігонуклеооснови описані нижче. 0041) Даний винахід можна здійснити із застосуванням рекомбінагенних олігонуклеооснов, що мають конформації та хімічні склади, описані у патентах Ктіеєс І та Ктіеєс ЇЇ, які включені в дану заявку за допомогою посилання. В Кітіес І описаний спосіб внесення певних генетичних змін у цільовий ген. Рекомбінагенні олігонуклеооснови в Ктіес | та/або Ктіес ІІ містять дві комплементарні нитки, одна з яких містить щонайменше один фрагмент із нуклеотидів РНК-типу

СРНК-фрагмент"), які спарені з нуклеотидами ДНК-типу іншої нитки. (0042) В Ктієс ІІ описано, що не стосовні до нуклеотидів молекули, які містять пуринові та піримідинові основи, можна використовувати замість нуклеотидів. У патентах США під номерами 5756325; 5871984; 5760012; 5888983; 5795972; 5780296; 5945339; 6004804 і 6010907; і у міжнародному патенті номер РСТ/О500/23457; і у публікаціях міжнародних патентів під номерами УМО 98/49350; УМО 99/07865; УМО 99/58723; УМО 99/58702; УМО 99/40789; 05 6870075; і в опублікованій заявці на патент США 20030084473, зміст кожної з яких даним повністю включено в дану заявку, описані додаткові рекомбінагенні молекули, які можна застосовувати для даного винаходу. Термін "рекомбінагенна олігонуклеооснова" використовують у даному тексті для позначення молекул, які можна застосовувати в способах згідно з даним винаходом, і рекомбінагенна олігонуклеооснова включає змішані дуплексні олігонуклеотиди, молекули, що містять не стосовні до нуклеотидів молекули, описані в Ктіес ЇЇ однониткові олігодезоксинуклеотиди й інші рекомбінагенні молекули, описані у перерахованих вище патентах і публікаціях патентів.

ІЇ0043| В одному варіанті реалізації рекомбінагенна олігонуклеооснова являє собою змішаний дуплексний олігонуклеотид, у якому нуклеотиди РНК-типу змішаного дуплексного олігонуклеотиду роблять стійкими до РНКази шляхом заміни 2'"-гідроксилу на функціональну групу фтору, хлору або брому або шляхом додавання замісника для 2'-О. Підходящі замісники включають замісники, описані в Ктіес Ії. Альтернативні замісники включають замісники, описані у патенті США номер 5334711 (5ргоаї), і замісники, описані у публікаціях патентів ЕР 629 387 й

ЕР 679 657 (у сукупності, Мапіп Арріїсайоп5), які включені в дану заявку за допомогою посилання. У даному тексті похідна рибонуклеотиду з 2'-фтором, хлором або бромом або рибонуклеотид, у якому 2'-ОН заміщена на замісник, описаний в Магіп Арріїсайоп5 або Зргоаї, бо називають "2'і-заміщеним рибонуклеотидом". У даній заявці термін "нуклеотид РНК-типу"

означає 2'-гідроксил або 2'-заміщений нуклеотид, що з'єднаний з іншими нуклеотидами змішаного дуплексного олігонуклеотиду за допомогою фосфодіефірного зв'язку, що не містить замісники, або будь-яких із штучних засобів з'єднання, описаних в Ктіеєс І або Ктіеєс ІІ. У даній заявці термін "нуклеотид дезоксирибо-типу" означає нуклеотид, що містить 2'-Н, що може бути з'єднаний з іншими нуклеотидами МООМ за допомогою фосфодіефірного зв'язку, що не містить замісники, або будь-якого із штучних засобів з'єднання, описаних в Ктіеєс І або Ктієс ІІ.

І0044| В одному варіанті реалізації даного винаходу рекомбінагенна олігонуклеооснова являє собою змішаний дуплексний олігонуклеотид, що з'єднаний винятково фосфодіефірними зв'язками, що не містять замісників. В альтернативних варіантах реалізації з'єднання здійснюється за допомогою фосфодіефірів, що містять замісники, фосфодіефірних похідних і містків, не основаних на фосфорі, описаних в Ктіес ІІ. У ще одному варіанті реалізації кожний нуклеотид РНК-типу в змішаному дуплексному олігонуклеотиді являє собою 2'-заміщений нуклеотид. Особливо переважні варіанти реалізації 2'-заміщених рибонуклеотидів являють собою рибонуклеотиди, що містять як замісники 2"-фтор, 2'-метокси, 2'"--пропілокси, 2'-алілокси, г'-гідроксіетилокси, 2'-метоксіетилокси, 2'-фторпропілокси та 2'-трифторпропілокси. Більш переважні варіанти реалізації 2'-заміщених рибонуклеотидів являють собою рибонуклеотиди, що містять як замісники 2"-фтор, 2'-метокси, 2'--метоксіетилокси й 2'"-алілокси. В іншому варіанті реалізації змішаний дуплексний олігонуклеотид з'єднаний з фосфодіефірними зв'язками, що не містять замісників. (0045) Хоча змішаний дуплексний олігонуклеотид, що містить лише один тип 2"-заміщеного нуклеотиду РНК-типу, більш зручно синтезувати, способи згідно з даним винаходом можна здійснити зі змішаними дуплексними олігонуклеотидами, що містять два або більше типів нуклеотидів РНК-типу. Функція фрагмента РНК може залишитися не порушеною після переривання, викликаного впровадженням дезоксинуклеотиду між двома тринуклеотидами

РНК-типу, відповідно, в обсяг терміна фрагмент РНК входить такий "перерваний фрагмент

РНК". Не перерваний фрагмент РНК називають безперервним фрагментом РНК. В альтернативному варіанті реалізації фрагмент РНК може містити чередуючі стійкі до РНКзи та 2-ОН нуклеотиди, що не містять замісники. Змішані дуплексні олігонуклеотиди переважно складаються з менше ніж 100 нуклеотидів і більш переважно з менше ніж 85 нуклеотидів, але

Зо більше ніж 50 нуклеотидів. Перша та друга нитки спарені за Уотсон-Кріком. В одному варіанті реалізації нитки змішаного дуплексного олігонуклеотиду ковалентно зв'язані за допомогою лінкера, такого як однонитковий гекса, пента або тетрануклеотид, таким чином, що перша та друга нитки є фрагментами одного олігонуклеотидного ланцюга, що містить один 3'- і один 5'- кінець. 3'- і 5'-кінці можуть бути захищені шляхом додавання "шпилькового кепа", за допомогою чого 3'- і 5'-кінцеві нуклеотиди спарені за Уотсон-Кріком із сусідніми нуклеотидами. Крім того, можна помістити другий шпильковий кеп у місце з'єднання між першою та другою нитками на відстані від 3'- і 5'-кінців, щоб стабілізувати спарювання за Уотсон-Кріком між першою та другою нитками. (0046) Перша та друга нитки містять дві ділянки, які гомологічні двом фрагментам цільового гена ацетил-КоА карбоксилази (АККази), тобто, мають однакові послідовності з цільовим геном.

Гомологічна ділянка містить нуклеотиди фрагмента РНК і може містити один або більше нуклеотидів ДНК-типу з сполучного фрагмента ДНК, а також може містити нуклеотиди ДНК-типу, які не перебувають всередині впровадженого фрагмента ДНК. Дві області гомології розділені, і кожна розташована поруч із областю, послідовність якої відрізняється від послідовності цільового гена, названої "гетерологічною ділянкою". Гетерологічна ділянка може містити один, два або три незбіжних нуклеотиди. Незбіжні нуклеотиди можуть бути безперервними або, як альтернатива можуть бути розділені одним або двома нуклеотидами, які гомологічні цільовому гену. Як альтернатива гетерологічна ділянка також може містити вставку одного, двох, трьох або п'яти або меншої кількості нуклеотидів. Як альтернатива послідовність змішаного дуплексного олігонуклеотиду може відрізнятися від послідовності цільового гена лише делецією одного, двох, трьох або п'яти або меншої кількості нуклеотидів із змішаного дуплексного олігонуклеотиду. У цьому випадку вважають, що довжина та положення гетерологічної ділянки являє собою довжину делеції, навіть якщо жодного нуклеотиду змішаного дуплексного олігонуклеотиду не перебуває всередині гетерологічної ділянки. Відстань між фрагментами цільового гена, які комплементарні двом гомологічним ділянкам, також являє собою довжину гетерологічногі ділянки, коли передбачається заміна або заміни. Якщо гетерологічна ділянка містить вставку, то вона розділяє гомологічні ділянки в змішаному дуплексному олігонуклеотиді на більшу відстань, ніж їх комплементарні гомологічні фрагменти перебувають у гені, і зворотне справедливо, коли гетерологічна ділянка кодує делецію. бо ІЇ0047| Кожний з фрагментів РНК змішаних дуплексних олігонуклеотидів є частиною гомологічної ділянки, тобто, ділянки послідовності, що ідентична фрагменту цільового гена, і дані фрагменти РНК спільно переважно містять щонайменше 13 нуклеотидів РНК-типу, і переважно від 16 до 25 нуклеотидів РНК-типу, або ще більш переважно 18-22 нуклеотиди РНК- типу, або найбільше переважно 20 нуклеотидів. В одному варіанті реалізації фрагменти РНК гомологічних ділянок розділені та розташовані поруч, тобто, "з'єднані" впровадженим фрагментом ДНК. В одному варіанті реалізації кожний нуклеотид гетерологічної ділянки являє собою нуклеотид впровадженого фрагмента ДНК. Впроваджений фрагмент ДНК, що містить гетерологічну ділянку змішаного дуплексного олігонуклеотиду, називають "мутаторним фрагментом"

І0048| Заміна, яку потрібно ввести в цільовий ген, кодується гетерологічною ділянкою.

Заміна, яку потрібно ввести в ген, може являти собою заміну однієї або більше основ послідовності гена, що заміняє нативну амінокислоту в даному положенні на бажану амінокислоту. 0049) В іншому варіанті реалізації даного винаходу рекомбінагенні олігонуклеооснова являє собою однонитковий олігодезоксинуклеотидний мутаційний вектор, або З5ОМУ, що описаний у міжнародній заявці на патент РСТ/О500/23457, що повністю включена в дану заявку за допомогою посилання. Послідовність 550ММ заснована на тих самих принципах, що й мутаційні вектори, описані у патентах США під номерами 5756325; 5871984; 5760012; 5888983; 5795972; 5780296; 5945339; 6004804 і 6010907 й у міжнародних публікаціях під номерами М/О 98/49350; УМО 99/07865; УМО 99/58723; УМО 99/58702; УМО 99/40789; в 5 6870075 і в опублікованій заявці на патент США 20030084473. Послідовність Х5ОММУ містить дві ділянки, які гомологічні цільовій послідовності, розділені ділянкою, що містить бажані генетичні зміни, названою мутаторною ділянкою. Послідовність мутаторної ділянки може мати ту саму довжину, що й послідовність, яка розділяє гомологічні ділянки в цільовій послідовності, але має іншу послідовність. Така мутаторна ділянка буде викликати заміну.

ЇОО50| Нуклеотиди 5БЗОММ являють собою дезоксирибонуклеотиди, які з'єднані немодифікованими фосфодіефірними зв'язками за винятком того, що 3'-кінцевий та/або 5'- кінцевий міжнуклеотидні зв'язки або, як альтернатива дві 3'-кінцеві та/або 5'-кінцеві міжнуклеотидні зв'язки можуть являти собою фосфоротіоат або фосфороамідат. У даній заявці міжнуклеотидний зв'язок являє собою зв'язок між нуклеотидами 55О0ММ і не включає зв'язок між

З3З'-кінцем нуклеотиду або 5'-кінцем нуклеотиду та блокуючим замісником, дивись вище. У конкретному варіанті реалізації довжина З5ОММ становить 21 - 55 дезоксинуклеотидів, і загальна довжина ділянок гомології, відповідно, становить щонайменше 20 дезоксинуклеотидів, і довжина кожної з щонайменше двох ділянок гомології повинна становити щонайменше 8 дезоксинуклеотидів.

Ї0051| ББОММ може бути сконструйований таким чином, щоб він був комплементарним або кодуючій нитці або не кодуючій нитці, цільового гена. Якщо бажана мутація являє собою заміну однієї основи, переважно, щоб обидва мутаторних нуклеотиди, являли собою піримідин. У тих випадках, коли це відповідає досягненню необхідного функціонального результату, переважно, щоб як мутаторний нуклеотид, так і націлениий нуклеотид у комплементарній нитці являли собою піримідини. Особливо переважними є З5ОМУ, які кодують трансверсійні мутації, тобто мутаторний нуклеотид С або Т не сполучений, відповідно, з нуклеотидом С або Т у комплементарній нитці. 0052) На додаток до олігодезоксинуклеотиду 55ОММ може містити 5'- замісник, блокуючий замісник, що приєднаний до 5'-кінцевих атомів вуглецю за допомогою лінкеру. Хімічна природа лінкеру не є критичною, на відміну від його довжини, що переважно повинна становити щонайменше 6 атомів, і сам лінкер повинен бути гнучким. Можна застосовувати різні нетоксичні замісники, такі як біотин, холестерин або інші стероїди або неінтеркалюючий катіонний флуоресцентний барвник. Особливо переважними як реагенти для одержання 55ОММ є реагенти під торговельними найменуваннями СуУЗТМ та Су5ТМ в СіІеп Кезеагсп (тепер СЕ

Неансаге), Стерлінг, Віргінія, які являють собою блоковані фосфорамідити, які при включенні в олігонуклеотид дозволяють одержати 3,3,33'-тетраметил-М, М'-ізопропіл, що містить як замісники індомонокарбоціаніновий та індодикарбоціаніновий барвники, відповідно. СуЗ є найбільш переважним. Якщо індокарбоціанін містить як замісник М-оксіалкіл, його можна зручно з'єднати з 5-кінцем олігодезоксинуклеотиду за допомогою фосфодіефіру з 5'-кінцевим фосфатом. Хімічний склад лінкеру між барвником та олігодезоксинуклеотидом не є критичним, і його вибирають для зручності синтезу. Якщо використовують доступний для придбання фосфорамідит СуЗ, як зазначено, то отримана 5'-модифікація складається з блокуючого замісника, і лінкера разом, які являють собою М-гідроксипропіл, М'-фосфатидилпропіл, 3,3,3',3- бо тетраметил- індомонокарбоціанін.

0053) У переважному варіанті реалізації індокарбоціаніновий барвник є тетра-заміщеним у 3- ії 3- положеннях індольних кілець. Без обмеження теорією такі замісники не дозволяють барвнику бути інтеркалюючим барвником. Вид замісників у даних положеннях не є критичним.

З5ОММ може додатково містити 3"- блокуючий замісник. Крім того, хімічний склад 3'- блокуючі замісники, не є критичним.

І0054| В іншому переважному варіанті реалізації рекомбінагенний олігонуклеотид являє собою одноланцюговий олігодезоксинуклеотид, що містить 3'-кінцевий нуклеотид, 5'-кінцевий нуклеотид, довжина якого становить щонайменше 25 дезоксинуклеотидів і не більше ніж 65 дезоксинуклеотидів, і має послідовність, що містить щонайменше дві ділянки, кожна з яких складається з щонайменше 8 дезоксинуклеотидів, відповідно, ідентичних щонайменше двом ділянкам цільового хромосомного гена, при цьому сукупна довжина даних ділянок становить щонайменше 24 нуклеотиди, і дані ділянки розділені щонайменше одним нуклеотидом у послідовності цільового хромосомного гена, або у послідовності олігодезоксинуклеотиду, або обох, таким чином, що послідовність олігодезоксинуклеотиду не ідентична послідовності цільового хромосомного гена. Див. патент США 6271360, який включений у дану заявку за допомогою посилання. 0055) Мікроносії та мікроволокна.

Ї0056| Застосування металевих мікроносіїв (мікросфер) для впровадження більших фрагментів ДНК у клітини рослини, що мають целюлозні клітинні стінки, шляхом метального проникнення (далі називаного біолістичною доставкою) добре відомі фахівцям у відповідній області. У патентах США під номерами 4945050; 5100792 і 5204253 описані основні методики вибору мікроносіїв і пристроїв для їхнього проектування. У патентах США під номерами 5484956 і 5489520 описане одержання родючої трансгенної кукурудзи із застосуванням бомбардування мікрочастинками калусної тканини кукурудзи. Біолістичні методики також застосовують для трансформації незрілих ембріонів кукурудзи.

ІЇ0057| Конкретні умови застосування мікроносіїв у способах згідно з даним винаходом розкриті у міжнародній публікації УМО 99/07865. У типовій методиці крижані мікроносії (60 мг/мл), змішаний дуплексний олігонуклеотид (60 мг/мл), 2,5 М СасСі?2 й 0,1 М спермідин додають у зазначеному порядку; суміш обережно перемішують, наприклад за допомогою струшування,

Зо протягом 10 хвилин і залишають при кімнатній температурі на 10 хвилин, після чого мікроносії розбавляють 5 об'ємами етанолу, центрифугують та перерозчиняють в 100 95 етанолі. Гарні результати можна одержати для концентрації в адгезивному розчині 8-10 мкг/мкл мікроносіїв, 14-17 мкг/мкл змішаного дуплексного олігонуклеотиду, 1,1-1,4 М Сасі?2 ї 18-22 мМ спермідину.

Оптимальні результати спостерігали при умовах, що включають 8 мкг/мкл мікроносіїв, 16,5 мкг/мкл змішаного дуплексного олігонуклеотиду, 1,3 М Сасіг2 і 21 мМ спермідину. 0058) Рекомбінагенні олігонуклеооснови також можна впровадити в клітини рослини для здійснення даного винаходу, застосовуючи мікроволокна для проникнення через клітинну стінку та клітинну мембрану. У патенті США номер 5302523, СоПее та ін., описане застосування волокон карбіду кремнію 30 х 0,5 мкм і 10 х 0,3 мкм для полегшення трансформації суспензійних культур кукурудзи Віаск Мехісап Змееї. Будь-який механічний спосіб, який можна застосовувати для введення ДНК із метою трансформації клітини рослини із застосуванням мікроволокон, можна використовувати для доставки рекомбінагенних олігонуклеооснов, щоб застосовувати їх для одержання розглянутих мутантів Аккази. Наочний спосіб мікроволоконної доставки рекомбінагенної олігонуклеооснови описаний далі. Стерильні мікроволокна (2 мкг) суспендують в 150 мкл рослинного культурального середовища, що містить приблизно 10 мкг змішаного дуплексного олігонуклеотиду. Суспензійній культурі дають можливість відстоятись, і рівні об'єми ущільнених клітин і стерильної суспензії волокно/нуклеотид струшують на вортексі протягом 10 хвилин і висівають. Селективні середовища вносять відразу ж або із затримкою аж до приблизно 120 годин, у міру доцільності для конкретної властивості.

І0059| Електропорація.

І0060| В альтернативному варіанті реалізації рекомбінагенні олігонуклеооснови можна доставляти в клітину рослини шляхом електропорації протопласту, отриманого з частини рослини відповідно до методик, які добре відомі середньому фахівцю в даній області. Див., наприклад, саїоі5 та ін., 1996, в Меїпоа5 іп МоїІесшіаг Віоіоду 55:89-107, Нитапа Ргев5, Тотова,

Нью-Джерсі; Кірр та ін., 1999, в Меїйпод5 іп МоїІесціаг Віоіоду 133:213-221, Нитапа Ргез5, Тотова,

Нью-Джерсі.

ІЇ0О61| Рекомбінагенні олігонуклебоснови також можна ввести в мікроспори шляхом електропорації. Після вивільнення тетради мікроспора стає одноядерною й тонкостінною. Вона починає збільшуватися та розвиває зародкову пору перед утворенням екзини. Мікроспора на бо даній стадії потенційно більш сприйнятлива до трансформації екзогенної ДНК, ніж інші клітини рослини. Крім того, розвиток мікроспори можна змінювати іп міго, щоб одержати або гаплоїдні ембріони, або ембріогенний калус, з якого можна відтворити рослини (Сопцтапз5 та ін., Ріапі СеїЇ

Вер. 7:618-621, 1989; баца та ін., Ріапі Зсі. 67:83-88, 1990; Мапезпхмагі та ін., Ат. У Вої. 69:865- 879, 1982; 5спаєїег, Аду. Іп Сеії Сийиге 7:161-182, 1989; Змапзоп та ін., Ріапі Сеї! Кер. 6:94-97, 1987). Таким чином, із трансформованих мікроспор можна відтворити безпосередньо гаплоїдні рослини або дигаплоїдні родючі рослини після подвоєння хромосоми за допомогою стандартних способів. Див. також заявку США, що перебуває на одночасному розгляді, серійний номер 09/680858, названу Сотрозйоп5 апа Меїпоаз їТог Ріапі Сепеїіс Моайїісайоп, зміст якої включено в дану заявку за допомогою посилання.

І0062| Способи електропорації мікроспор описані в Удагаїпаца та ін., Ріапі Зсі. 93:177-184, 1993, і РеппеїЇ ї Наирітап, Ріапі СеїЇ Керогі5 11:567-570, 1992. Способи електропорації протопластів рослини МООМ також можна пристосувати для застосування для електропорації мікроспор. 0063) Нитковидні кристали та мікроін'єкція.

І0064| У ще одному альтернативному варіанті реалізації рекомбінагенну олігонуклеооснову можна доставити в клітину рослини за допомогою нитковидних кристалів або шляхом мікроін'єкції в зазначену клітину рослини. Так названу методику нитковидних кристалів здійснюють по суті як описано у Егате та ін., 1994, Ріапі 9. 6:941-948. Рекомбінагенну олігонуклеооснову додають до нитковидних кристалів і використовують для трансформації клітин рослини. Рекомбінагенну олігонуклеооснову можна інкубувати разом із плазмідами, що містять послідовності, кодуючі білки, здатні утворювати комплекси з рекомбіназою у клітинах рослини, таким чином, що каталізується рекомбінація між зазначеним олігонуклеотидом і цільовою послідовністю.

І0065)| Селекція рослин 0066) У різних варіантах реалізації рослини, описані в даній заявці, можуть бути будь-якого виду з двочасткових, однодольних або голонасінних рослин, включаючи будь-які види деревних рослин, які ростуть як дерево або чагарник, будь-які трав'яні види або будь-які види, які дають їстівні фрукти, насіння або овочі, або будь-які види, які дають яскраві або ароматні квіти.

Наприклад, рослину можна вибрати з групи, що складається з наступних видів рослин: канола,

Зо соняшник, кукурудза, тютюн, цукровий буряк, бавовник, маїс, пшениця, ячмінь, рис, люцерна, ячмінь, сорго, томат, манго, персик, яблуко, груша, полуниця, банан, диня, картопля, морква, латук, цибуля, соя культурна, види сої, цукрова тростина, горох, нут, горох польовий, кінський біб, сочевиця, ріпа, бруква, брюссельська капуста, люпін, кольорова капуста, капуста кормова, кормові боби, тополя, сосна, евкаліпт, виноград, цитрусова рослина, тритікале, люцерна, жито, овес, дерен і кормові трави, льон, олійний рапс, гірчиця, огірок, в'юнок, бальзамін, перець, баклажан, чорнобривець, лотос, кочанна капуста, ромен, гвоздика, тюльпан, ірис, лілія, і рослини, що дають горіхи, якщо вони ще конкретно не згадані.

І0067| Можна досліджувати стійкість або толерантність до гербіциду рослин і клітин рослин, застосовуючи широко відомі в даній області техніки способи, наприклад, шляхом вирощування рослини або клітини рослини у присутності гербіциду та вимірюванні швидкості росту в порівнянні з швидкістю росту під час відсутності гербіциду. 0068) У даному тексті по суті нормальний ріст рослини, органу рослини, тканини рослини або клітини рослини визначають як швидкість росту або швидкість розподілу клітин рослини, органу рослини, тканини рослини або клітини рослини, що становить щонайменше 35 95, щонайменше 5095, щонайменше 6095 або щонайменше 7595 від швидкості росту або швидкості розподілу клітини відповідної рослини, органу рослини, тканини рослини або клітини рослини, експресуючої білок АНАЗ дикого типу.

ІЇ0069| У даній заявці по суті нормальний розвиток рослини, органу рослини, тканини рослини або клітини рослини визначають як походження одного або більше подій розвитку в рослині, органі рослини, тканині рослини або клітині рослини, що по суті однаково з таким, що відбувається у відповідній рослині, органі рослини, тканини рослини або клітині рослини, експресуючій зазначений білок дикого типу.

І0070| У деяких варіантах реалізації органи рослини, представлені в даній заявці, включають, але не обмежені перерахованими: листя, стебла, коріння, вегетативні бруньки, квіткові бруньки, меристеми, ембріони, сім'ядолі, ендосперм, чашолистки, пелюстки, маточки, плодолистки, тичинки, пильовики, мікроспори, пилок, пилкові трубки, сім'ябруньки, зав'язі та фрукти, або зрізи, скибочки або пластинки, взяті з них. Тканини рослини включають, але не обмежені перерахованими: калусні тканини, покривні тканини, провідні тканини, запасаючі тканини, меристематичні тканини, тканини листа, тканини пагона, тканини кореня, тканини гала, 60 тканини пухлини рослини та репродуктивних тканин. Клітини рослини включають, але не обмежені перерахованими: ізольовані клітини з клітинними стінками, їхні агрегати різного розміру та протопласти. 00711) Рослини є по суті "толерантними" до відповідного гербіциду, коли їх піддають його впливу й одержують криву дозової залежності, що зрушена вправо у порівнянні з такою, отриманою для аналогічним чином підданого впливу даного гербіциду нетолерантної подібної рослини. Для таких кривих дозової залежності "доза" нанесена на графік на вісь х та "відсоток убитих", "гербіцидна дія" і так далі, нанесено на графік на вісь у. Для толерантних рослин буде потрібно більше гербіциду, ніж для нетолерантних подібних рослин, щоб одержати дану гербіцидну дію. Рослини, які по суті "стійкі" до гербіциду, проявляють трохи, якщо взагалі проявляють, некротичних, літичних, хлоротичних або інших ушкоджень, коли їх піддають впливу гербіциду при концентраціях й інтенсивності, які зазвичай використовують в агрохімічному співтоваристві, щоб убити бур'яни у полі. Рослини, які стійкі до гербіциду, також толерантні до гербіциду.

І0072| Одержання рослин.

І0073| Відомі способи культивування різних тканин різних видів рослини та регенерації рослин із них. Наприклад, нарощування культурного сорту каноли в культурі тканини описане у будь-якому з наступних джерел, але не обмежене будь-якими з перерахованих далі джерел:

Спиопоа та ін., "А 5ітріе СийКиге Меїпоа ог Вгаззіса пуросоїуї5 Ргогоріавзів", Ріапі Сеїї Керогів 4:4- б, 1985; Вагеру, Т. Г., та ін., "А Каріа апа ЕпПесіїме АкКегпаїйме Ргоседиге їог їШТе Недепегаїйоп ої

Ріапів от Нуросощмі Ргоїоріавзів ої Вгазвзіса париз", Ріапі Сеї! Верогіз (бргіпод, 1996); Капна, К., та ін., "п міго Ріапі Богтайоп їот (ет Ехріапі5 ої Каре", РПузіої. Ріапі, 31:217-220, 1974;

Магазітймшім, 5., та ін., "Зресієз 5ресіїйс Зпосої ВНедепегайоп Везропзе ої Сомуіедопагу Ехріапів ої

Вгазвісав", РіІапі Сеї! Нерогіз (Зргіпуд 1988); Зулапзоп, Е., "Містозроге Сипиге іп Вгаззіса", Меїподз іп МоїІесціаг Віоіоду, том 6, розділ 17, стор. 159, 1990.

І0074| Подальше розмноження сорту може відбуватися в культурі тканини та шляхом регенерації. Культивування різних тканин сої та регенерація рослин з них добре відомі й опубліковані у багатьох джерелах. Наприклад, можна послатися на наступні джерела:

Котаївиаа, Т. та ін., "ЗСепоїуре Х Бистозе Іпіегасіюп5 ог Ботаїйс Етбгуодепевів іп бБоуреапв",

Стор сі. 31:333-337, 1991; ерпепв, Р. А., та ін., "Адгопотіс ЕмаЇчайоп ої Тізвце-Сийиге-ЮОеєгімейд

Зо Зоубрєеап Ріапів", Тпеог. Аррі. Сепеї. 82:633-635, 1991; Коптаївзида, Т. та ін., "Майшгайоп апа

Септіпайоп ої бБотаїйс Етргуов аз Аїесієй ру бистозе апа Ріапі Стоп Веашіацогз5 іп 5оуреапз

Сіусіпе дгасіїв ЗКмогі2 апа Сіусіпе тах (І..) Меїт.", Ріапі Сеїї, Тізвие апа Огдап Сипиге, 28:103- 113, 1992; Опіїг, 5. та ін., "Кедепегайоп ої Бегйе Ріапіб5 їот Ргоїоріавзів ої Зоуреап (Сіусіпе тах

І. Меїт.); Сепоїуріс Сіїегепсев іп Сийите Незропзе", Ріапі Сеї! Веропів 11:285-289, 1992; Рапавєу,

Р. та ін., "Ріапі Кедепегайоп їот Геаї апа Нуросоїу! Ехріапіб5 ої СіІусіпе м/ідній (МУ. апа А.)

МЕВОС. маг. Іопаісацда", дарап 9. Вгеєд. 42:1-5, 1992; і ЗПпецу, К., та ін., "Зітшацйоп ої п Мйго зЗпоої Огдаподепезвів іп Сіусіпе тах (Ме!тії.) Бу АйїПапіоїп апа Атідев", Ріапі сівепсе 81:245-251, 1992. Описи патенту США номер 5024944, виданого 18 червня 1991 р., автори Соїп5 та ін.,|і патенту США номер 5008200, виданого 16 квітня 1991 р., автори Капсі та ін., даним повністю включені в дану заявку за допомогою посилання. 0075) У наступних прикладах проілюстроване здійснення даного винаходу, але вони не повинні тлумачитись як обмежуючий об'єм даного винаходу.

І0076| Приклад 1. Істотно поліпшене перетворення гена синього флуоресцентного білка (ВЕР) у трансгенних клітинах Агабідорзі5 (Шайапа у зелений флуоресцентний білок (СЕР) шляхом введення спрямованої однонуклеотидної мутації за допомогою олігонуклеотидів для репарації генів (ЗКОМ) у комбінації з парою ефекторних нуклеаз, подібних до активаторів транскрипції (ТАГЕМ), які водять розрив поруч із сайтом заміни цільової основи.

І0077| Одержували лінію Агарідорзі5 з декількома копіями гена синього флуоресцентного білка за допомогою способів, відомих фахівцям у даній області (див., наприклад, Сіоцдй і Вгепі, 1998). З кореня даної лінії одержували меристематичні культури тканини, які застосовували для виділення та культивування протопластів (див., наприклад, Маїйиг та ін., 1995). Доставки СОКОМ у протопласти домагалися шляхом опосередкованого поліетиленгліколем (ПЕГ) поглинання

СКОМ протопластами. Застосовували спосіб з використанням 96б-ямкового формату, аналогічний такому, описаному в Ешціуага та Каїо (2007). Протокол коротенько описаний далі.

Наведені об'єми відповідають об'ємам, що додають в окремі ямки 96-ямкового планшета. 1. Змішували 6,25 мкл суміші ОЗКОМ/ТАГЕМ (80 мкМ ВЕР4 Содіпд/41 мер СОКОМ) з 25 мкл протопластів, отриманих із меристематичної тканини трансгенного за ВЕР кореня Агабрідорбів, при концентрації 5 х 106 клітин/мл у кожній ямці 96-ямкового планшета. 2. Додавали 31,25 мкл 40 95 розчину ПЕГ і перемішували протопласти. 60 3. Оброблені клітини інкубували на льоді протягом 30 хв.

4. У кожну ямку додавали 200 мкл розчину УУ5 і перемішували клітини. 5. Планшети залишали для інкубації на льоді протягом 30 хв, дозволяючи протопластам осісти на дно кожної ямки. 6. Видаляли 200 мкл середовища над осілими протопластами. 1. Додавали 85 мкл культурального середовища (М5АР, див. Маївпиг та ін., 1995). 8. Планшети інкубували при кімнатній температурі в темряві протягом 48 годин. Кінцева концентрація ОКОМ після додавання культурального середовища становила 8 мкм. до протопластів із зеленою флуоресценцією

І0078| Застосовуючи даний протокол вводили плазміди ТАГЕМ при різних концентраціях разом із ОКОМ. Через сорок вісім годин після доставки ОКОМ зразки аналізували за допомогою проточної цитометрії для того, щоб виявити протопласти, зелена та жовта флуоресценція яких відрізняється від такої в контрольних протопластів. Зелена флуоресценція викликалася введенням спрямованої мутації в ген ВЕР, що призводило до синтезу СЕР. Результати показані на фігурі 1.

Концентрація плазміди ТАГ ЕМ (мкМ)

І0079| Фігура 1. Протопласти, отримані з меристематичної тканини кореня, обробляли плазмідами ТАГЕМ при різних концентраціях разом із СОКОМ, що викликає спрямовану мутацію в гені ВЕР, що призводить до його перетворення в ген СЕР. Експресію СЕР вимірювали за допомогою проточної цитометрії через 48 год. після доставки ЗКОМ/ТАГ ЕМ. (0080) Для всіх наведених нижче прикладів 2-11 справедливий наступний опис: (оо81) авоОмМ (00821) Розробка направленого перетворення ВЕР--СЕР.

ВЕР-СЕР НббУ САС-»ТАС.

ВЕРА/С/41/5-Суз/3'-ійС

УСбостоатаАССАССТТСАССТАСОСсССОСТасАаатасттодасн

ВЕРА/МС/41/5-Суз/3'-ійС умасСстаАдасАСсТасасасСсатАсатадлдсатаатсАаСадаван 0083) Розробка не направленого на ВЕР контролю.

ВЕР Нбб-САС

Коо) ВЕРО/С/41/5'-3ЗРБ/3'-3Р5

УСосТосатаАССАССТТСАСССАСОЬСЯтаслатасттсдасн

ВЕРО/МС/41/5-3РБ/3'-ЗРБ уасСстаАлдасАСсТасасассатасатАдАасатаатсАСсАвасчн

ДНК- сполучний домен ефектору ТАЇ. 00841 ТАГ ЕМ:

ДНК- сполучний домен ефектору ТАЇ.

ТАТЕМ:

ДНК- сполучний домен сх---ЕфекторУ ТА

СЯ, ВЕрЯ/НС ВОМ

СЕТ АТИТОТК ТКУ Р КК ВО ВКА СВО ЕТ ПОВІКУ ВОК ОВО ВО СО ЧУВ ОСА СВОЯ

ОААСТАСАССВЕНОСОСТРСООСОВСТ У КОВО АК ОС АСВ ТО КОВО СОВОК ОВО м и п з п и з их з и С З З З а, М и з и, и за п ЗІ З З,

ДНК- сполучний домен ефектору ТА. (0085) рсСІ 514165 містить обидва плеча ТАЇ на одній плазміді (розробленої відповідно до 4папуд та ін., 2013), при цьому кожне плече зв'язується з підкресленою послідовністю та з'єднано з мономером ЕоКіІ. Така комбінація призводить до утворення двониткового розриву (ДНР), як показано нижче в аналізі однониткового відпалу (З55А), здійсненому таким самим способом, що описаний в 2Ппапо та ін. (2013).

ях 4 ів: | пе: Ж

ККА-ВЕР З БКАЛВЕР ОСТ 65 її їв ід : 16 Е ще А я Ку З. З : че ч 1 ДИН пе Я Км : яд ЕЕ. ть : жа ш З ЗЕЖН : за я 4 : ї

Е їх Я їх и и ни в В ни нн в п Ма

Ван ше (0086) рсСІ 515771 являє собою ніказу з мутацією (0450А) в домені РОКІ для лівого плеча.

Праве плече в даній конструкції відповідає такому в рСІ 514165. (0087) рСІ 515769 являє собою ніказу з мутацією (0450А) в домені РОКІ для правого плеча. 5 Ліве плече в даній конструкції відповідає такому в рСІ 514165. (0088) СОКОМ і ТАГЕМ тестували, як показано нижче. Контрольні обробки, що складаються з ненаправлених СОКОМ (ВЕРО/С або ВЕРО/МС) і ТАГЕМ окремо, а також помилкових обробок 4095 розчином ПЕГ, у якому немає СКОМ або плазміди ТАГЕМ, не проявляли істотної трасформуючої активності. 0089) У даній системі конструкція ВЕР4/МС ОКОМ окремо виявилася краще, ніж конструкція

ВЕР4А/С СКОМ окремо. Комбінування даних конструкцій з ДНР ТАГЕМ (рсіІ 514165) поліпшувало обидві, при цьому найбільшу активність та кратність поліпшення (у багатьох випадках » 2 порядків величини) спостерігали для ВЕР4/С СОКОМ. Значне поліпшення також спостерігали при комбінуванні СОКОМ з парами ніказ ТАГЕМ, і очікували, що воно найбільш корисно завдяки мінімізації побічного ефекту, коли мутації направлені на декілька генів/ локусів/ алелей одночасно.

І0090)| Приклад 2: СОКОМ плюс ніказа ТАГЕМ. пу ми пр а ар о 0.5 . в.

Ш.

Го.

Г-: ШЕ ше ка ниви в шт в. ш с є 03 ст питання тпатнннкя пн пою їх г 5

Е 0.2 нн в нн мн пи ная тн

КІ ес о С ж ШЩ я жо - М п

Хибна ВЕРІ-/Є ВЕРО/МС ВЕРІ1-/» ВЕРА/С ВЕРІ-/н ВЕРАЛЧС ВЕРІ1-/к (рРа515771) (ра5і5771) (рСі515771) (рСі515771)

ТЦ ТАЕМ я ТАМ ТАЇЕМ к

ВЕРО/ЧС ВЕРАІС ВЕРА/НС

(00911 Приклад 3: СОКОМ плюс ніказа ТАГЕМ. ' 925 ф-іііпишшшши поки 2е (5 02 : В

В.

Б

« 015 ше с що їх т а 9 в понти . . ше - то ни р Щи а. р - й Й | ї и ши

Хибна ВЕРІ/. ВЕРОЛЮС /ВЕРІ-/к ВЕРА/С ВЕРІ-/. 0 ОВЕРФИЖС 0 ВЕРІ-/к (рсі515771) (рі515771) (рСі515771) (рСі 515771)

ТАМ ТАБЕМ я ТАЕМ я ТАМ я

ВЕРО/МС ВЕРА/С ВЕРА/НС (0092| Приклад4: СКОМ плюс ніказа ТАГЕМ. 0.45 Ян нетто С ОТ Я ТЕ т тн па й

ПЕ: Як нн пп нн повин '

В- оз- о

Ф : 20254 що і

Ш 02

Ж.

Ф :

Ооо045 нин 7 в / г | В 3,8 рази тя 01 : шк е В 19,5 рази

Ж оо : ! ! як в. Щщ

Хибна вВЕРІ/ю ВЕРО/МС ВЕРІ/Єє ВЕРАИС ВЕРІ-/. ВЕРАИМС /ВЕРІ-/Є (рсі515771) (рсі515771) (вс1515771) (ра515771)

ТАМ ТАЕМ Ж ТАЦЕМ ТАМ

ВЕРО/ЧС ВЕРФ/С ВЕРЯ/МС

ІЇ0093| Приклад5: ОКОМ плюс ніказа ТАГЕМ.

ОА оп пн пн нн нн пі пн пп пн 035 екю ктнтеттнтнентннтненткннненткнннентннннененннтн г і 03 сежтестжтни ж ТТ ЛТЕТЕ ЖЖ торт тут тт т осілі тт умілі ііт іже вл я. тил нині нати -- Я А (Я ю ; : - т пн юю я пп з оп зшонльш "І п

БОС 025. з менонтнонтнтттчттттуттетн птн ватчеттттн тю суне тесту з плення етснссю сення шк й

ЕЗ

Фо оз рентних пиття

В в. 0.15 5 пивний є і тт ш а !

Хибна ВЕРІЯ/- ВЕРО/ЮС ВРРІя/- 00ОВЕРАИС ВБЕРіз/» ВЕРЕС ВЕРІ-/. (рс1515769) (рсі515769) (рсг515769) (рс1515759)

ТАМ ТАЦЕМ» ТАБЕКМ ж ТАЦЕК я

ВЕРО/ЧС ВЕРА/С ВЕРА/ЧС (О094| Прикладе: ОКОМ плюс ніказа ТАГЕМ. 0.07 ел нн В В В 005 В1.16рази... ад -- (0 . а . 6. 004 : ! т» МДБ..6..6.ФдД(Д(ФДФДШЩ

І. Е

Ж 003 4

У і ше 8 в Гол в У й НН кни птн а ш 001 пекнт тет п он пплідитвексчай шен 00

Хибна

Моск ВЕВ1/- ВЕРО/МС ОО ВЕРІ к/- ВЕР4ИС ВЕРія/- ВЕРА/МС 0 ВЕР1з/- (рСі 515769) (рСі515769) (рсьбі5769) (рсі515759)

ТАЕМ ТАЕМ ж ТАМ я ТАЕМ »

ВЕРО/МС ВЕРІ/С ВЕРА/МС

ЇО095| Приклад7: СсКОМ плюс ніказа ТАТ ЕМ. ов пня 07 а. 24 а. : й |. а тя о 05 ше ч«ининтнш ї . фол ж ве а ша

Од фнннттттнннтттннтеннксте пкт тенет тент - а т - . зе 02 нина аа а аа потен таксон пн ше ши и щ о ж.

Хибна ВРРія/- ВЕРО/МС ВЕРі-я/- 0 ОВЕРАИС ВЕРІЯя/- ВЕРАИМС ВЕР /- (рРСі515769) (рСі 515769) (рсіє15769) (рсі515769) тАЕМ ТАБЕМ є ТАЦЕМ я ТАЕК

ВЕРО/ЧС ВЕРАЙС ВЕРІ/МС

О096| Приклад8: сКОМ плюс ДНР ТАТЕМ.

Зв оурттттттттннтя з

Б

(ОД фени тт котика конт нет тт яння оеджет о ут ння тт

Г- ш. 5 ш 2 ї- й. піл ли ження, плити пн нн ттин пря нення вит

І х ш - 19 «фен помп нев ттр тет стнн тт т т жооаІчоско каааа а каааье аа тала ач ст ана ет тет ттттннтт зя еваничеееежтянтяя г

Фі пиття

Е

Ж

05 ' В 174,7 рази В 8,4 рази пиши шк ши шк

Хибна ВЕРІз/ю ВЕРОЛЮС ВЕРАЙС ВЕРІЛ/є ВЕРАЙМС ОО ВЕР1з/ (рСі514165) (ра1514165) (рСІ 514165)

ТАЕМ ТАБЕМ 5 ТАЕМ я

ВЕР/С ВЕРА/НС

(О097| Приклад9: ОКОМ плюс ТАГЕМ. 35 нини 3 в и и и м нин ни и ш. о а 25 шин и нин тами тент нт яті вт поло тропів сь оложетя т в ж я 2 В- септика чи

І

9 Без ТАТЕМ о М ЗЕРІНІ-

І. Що іти ж т вен т пат я птах т тео ектетья потен т пк Вот онежннння пенні. Я ВЕРІ-Йе 9 | В ВЕРІ іх кі рф нин пінні тат 05 птн прп піонититннн пішли

ВЕРА/С ВЕРА/МС (0095| Приклад 10: ОКОМ плюс ніказа ТАГЕМ.

По нн вно в п п поп опо по пппнннння г. 01 | спи нпки тя ри ни а МБ аа, НИДННВ и п а пи а щ

Б о в. 208 що ся с в « т !

Ж 06. пн р і в | В 4,7 рази

ГТ псннняяяютт тет тт тенет спать шШ о і й в рі 102 г п ин І шт ппнннннннних о щ

Хибна ВЕРІжйА ВЕРОЛУС ОВЕРІЯ/- 0 ВЕРАЙО ВЕРІЯ/- ВЕРАЙС ОО ВЕР1ч/- (рсІ515769) ірсі515759) (рії515769) (рб1515769)

ТЕМ ТАЦЕН я ТАЦЕМ ж ТАЕМ ж

ВЕРО/НС ВЕРАа/С ВЕРА/МС

(0099) Прикладії: ОКОМ плюс ДНР ТАТЕМ. 14 ГО яд 12 і шо. (ФО 14. нн я Р «Р « ,« Я Я Я не тн ння а

Г- шо га ов к є а; М - - що о в а 4 т

Е

Ж 02 4- в54Орази 0 рана а а ж а а І наз ВИНИ

Хибна ВЕРІ1 з/в ВЕР1 З. ВЕРО/ЧС ВЕРАД; ВЕР1Я/н (рСІ514165) (рС1514165) (рСІ514165)

ТАТЕМ ТАТЕМ (набР н ТАШЦЕМ « ВЕРА/С

РК) 00100) Посилання

І00101| Сіоцди, 5.9., ї Вепі, А.Р. (1998). Ріога! аїр: А зітрійей тетоа ог Адгобасіейт- теаіагеай ігапотогтаїйоп ої Агарідорвзів ІНаїйіапа. Ріапі 9. 16, 735-743. 5 (00102) Маїйиг, 9., 52аБрадов, І, і Копс7, С. (1995) А 5ітріе тейїтоа Гог ізоїайоп, Іїдиїйі сикКиге, тмапвіоптаїцоп апа гедепегаїййоп ої Агарідорвів ІНаїїапа ргоїоріавів. Ріапі Сеї! Вер. 14, 221-226 001031 РціКауа У, Каїо М (2007) 5рій Інсітетазе сотрієтепіайоп аззау о зщшау ргоївїп-ргоївїп іпіегасіюпз іп Агабідорвів ргогоріавів. Ріапі У 52: 185-195 001041 2Напо У, 2Напо ЕК, Гї Х, ВаїЇег ОА, Ої М, акег Са, Водаапоме АУ, Моуїаз ОН. (2013)

Ткапзвсріюп асіїмайог-їКе ейПесіог писієазе5 епаріє ейісієпі ріапії депоте епдіпеегіпд. Ріапі

РНузіої!. 161(1):20-7.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 сІВО5 5 ІС

СІВО5 ЕОКОРЕ В.М. «120» СПОСОБИ ТА КОМПОЗИЦІЇ ДЛЯ ПІДВИЩЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ СПРЯМОВАНОЇ

МОДИФІКАЦІЇ ГЕНІВ ІЗ ЗАСТОСУВАННЯМ ОПОСЕРЕДКОВАНОЇ ОЛІГОНУКЛЕОТИДАМИ

РЕПАРАЦІЇ ГЕНІВ

«1305 сСІВи5-026-РСТ «140» РСтТ/и52014/029621 «1415» 2014-03-14 «150» 61/801,320 «151» 2013-03-15 «160» 6 «1705 Расепжети версія 3.5 «2105 1 «211» 43 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид -4005 1 мсссісодстда ссасстєсас стасддсдєд садтдсскса сі 43 «210» 2 «211» 43 «212» ДНК «213» штучна послідовність «2202 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 2 миассдааоса ссосасдссо садасдааод содаєсасодга доб 43 «210» 3 «211» 43 «2122 ДНК «213» штучна послідовність «220» , «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» З

Ууссстісуєда ссассттсас ссасудасдата садсастсса пс 43 «2105» 4 211» 43 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» о , . , «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «А00» 4 мастдаадса ссдсасоссо садасдаадо сдоєсасдад одн 43 «2105» 5 «211» 78

«212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» о о й , «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «221» СО «222» (13..(78) «400» 5 сес 919 сесс тод сесс асс сс 99 асс асс їх асс сас З9с 979 «аа 48

Рго маї Рго тер Рго тТйг о ге ма! тТВг оте РКБе тиг Ні сіу Маї с1п 1 5 10 15 тас тс адс сс жас ссс дас сас ата ага 78

Суб Ре б5ег Аг Туг Рго Ар Ні Меб Гуз «210» 6 «211» 26 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» , , . «223» бпис штучної послідовності: Синтетичний лептид «00» 6 .

Рго ма! Рго Тер Рго Тийг оСец ма! ТБг отВе РБе те нів с1у ма! сп 1 5 10 15

Суб Ре 5ег о АгО Туг РГО А5р нНіз Мет Гуз

Claims (1)

1. 20 25 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

   1. Спосіб введення мутації, опосередкованої олігонуклеоосновою для репарації генів (ВОМ), У цільову послідовність дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) у клітині, який відрізняється тим, що включає культивування клітини при умовах, які підсилюють один або більше процесів репарації клітинної ДНК, перед й/або одночасно з доставкою СОМ у клітину рослини, так що умови, які підсилюють один або більше процесів репарації клітинної ДНК, включають введення однієї або більше сайтспецифічних ендонуклеаз, які індукують однониткові розриви, в клітину рослини.

   2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що одну або більше сайтспецифічних ендонуклеаз, які індукують однониткові розриви, вибирають з ТАГЕМ, ендонуклеаз із цинковими пальцями і мегануклеаз.

   З. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що одна або більше сайтспецифічних ендонуклеаз, які індукують однониткові розриви, ковалентно зв'язані з ОКОМ.

   4. Спосіб за одним із пп. 1-3, який відрізняється тим, що клітина являє собою клітину рослини, що належить до виду, вибраного з групи, що складається з наступних видів: канола, соняшник, кукурудза, тютюн, цукровий буряк, бавовник, пшениця, ячмінь, рис, люцерна, сорго, томат, манго, персик, яблуко, груша, полуниця, банан, диня, картопля, морква, латук, цибуля, види сої, включаючи сою культурну, цукрова тростина, горох, нут, горох польовий, кінський біб, сочевиця, ріпа, бруква, брюссельська капуста, люпин, цвітна капуста, капуста кормова, кормові боби, тополя, сосна, евкаліпт, виноград, цитрусова рослина, тритикале, люцерна, жито, овес, дерен і кормові трави, льон, олійний рапс, гірчиця, огірок, в'юнок, бальзамін, перець, баклажан, чорнобривці, лотос, капуста білоголова, ромен, гвоздика, тюльпан, ірис і лілія.

   5. Спосіб за одним із пп. 1-4, який відрізняється тим, що зазначена клітина є трансгенною.

   б. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що цільова послідовність ДНК являє собою ендогенний ген зазначеної клітини.

   7. Спосіб за одним із пп. 1-6, який відрізняється тим, що зазначений спосіб додатково включає Зо відтворення рослини, що містить мутацію, введену за допомогою ОКОМ, із клітини рослини.

   8. Застосування однієї або більше сайтспецифічних ендонуклеаз, які вводять однониткові розриви, для поліпшення мутаційного перетворення олігонуклеоосновами для репарації генів

   (КОМ) як донорами, що включають введення однієї або більше сайтспецифічних ендонуклеаз

   9. Застосування за п. 8, яке відрізняється тим, що одну або більше сайтспецифічних ендонуклеаз, які індукують однониткові розриви, вибирають з ТАГЕМ, ендонуклеаз із цинковими і о. спосіб мегануклева. п додатково включає оцінку ефективності перетворення СВОМ, причому спосіб включає: синій флуоресцентний білок, при цьому СНОМ сконфігурований таким чином, щоб він вводив мутацію у заздалегідь визначеному сайті цільової послідовності ДНК, щоб викликати перетворення синього флуоресцентного білка, у результаті якого синій флуоресцентний білок буде випускати флуоресценцію на відмінній довжині хвилі, при цьому перед або одночасно з введенням СНОМ, ДНК всередині протопласта приводять у контакт із однією або більше ендонуклеаз, які вводять однониткові розриви в цільову послідовність ДНК всередині сайту, на який націлений СРОМ,; і визначення ефективності перетворення. | Й

   11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що одну або більше сайтспецифічних ендонуклеаз, які вводять однониткові розриви, вибирають з ТАГЕМ, ендонуклеаз із цинковими пальцями і

   12. Спосіб за п. 10 або 11, який відрізняється тим, що цільова послідовність ДНК є присутньою ТЗ, Спосіб зап. або 11 який відрізняється тим, що цільова послідовність ДНК є присутньою У плазмід за одним із пп. 10-13, який відрізняється тим, що одна або більше сайтспецифічних ендонуклеаз, які вводять однониткові розриви забезпечують підвищену ефективність перетворення у порівнянні з ефективністю, визначеною для СОКОМ під час відсутності зазначеної однієї або декількох сполук, які вводять однониткові розриви.

   б. рен нення о " «ЕН яв

   В.0005 00010 0.001959 0.003538 0.007977 00153 0.053507 6.061353 ТАТЕМ ріазтй сопсепітаєоп (МІ

   Фіг. 1