CN114514330A - 用于检测甘蓝型油菜中染色体易位的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于检测甘蓝型油菜(Brassicanapus)中染色体易位的组合物和方法。本公开总体上涉及植物分子生物学领域，并且在特定的实施例中，本公开涉及植物内染色体易位检测领域。在某些实施例中，甘蓝型油菜的该染色体易位发生在N7和N16染色体之间。在其他实施例中，该染色体易位是同源染色体相互易位。因此，本公开提供了用于鉴定、检测和利用这种染色体易位的组合物和方法。

Description

用于检测甘蓝型油菜中染色体易位的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年9月26日提交的美国临时专利申请序列号62/906352的权益，将其公开内容通过引用以其整体特此并入。

序列表的引用

该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“Bnapus Chromosomal Translocation 2_ST25”，创建于2020年9月22日，大小为191千字节，并且与本说明书一并提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开总体上涉及植物分子生物学领域，并且在特定的实施例中，本公开涉及植物内染色体易位检测领域。在某些方面，甘蓝型油菜(Brassica napus)的染色体易位发生在N7和N16染色体之间。在其他方面，染色体易位是同源染色体相互易位。因此，本公开提供了用于鉴定、检测和利用这种染色体易位的组合物和方法。

背景技术

甘蓝型油菜(卡诺拉油菜)是世界范围内生长的作为植物油的主要来源的主要经济作物之一。对食用健康油的需求不断增长增加了甘蓝型油菜作为食品的重要性。甘蓝型油菜是成本最低的植物油来源之一。甘蓝型油菜油在全世界消费的食用油中占很大比例。将它用作液体油，用于烘焙、油炸、沙拉酱、人造黄油和多种加工食品。甘蓝型油菜在农艺上很好地适应于世界许多地区，并且产量逐年增加。甘蓝型油菜油的低成本和易得性为将这种商品油升级成为农民增加价值的更高价值的特种油提供了绝佳的机会。对甘蓝型油菜新的改良品系的开发仍然是育种工作者面临的一个持续挑战。

甘蓝型油菜是一种最近形成的异源四倍体物种，包含两种密切相关的同源亚基因组类型，命名为A和C。尽管是四倍体，但由于严格控制减数***染色体配对，防止高度相似的同源染色体之间的重组，卡诺拉油菜在遗传上表现为二倍体。然而，在卡诺拉油菜的‘天然’多倍体中，A和C基因组之间可能以低频率发生“从头”重组(不像重新合成的卡诺拉油菜，这些事件以更高的频率发生)，导致各种大型同源染色体结构重排(HCR)。由于与具有商业重要性的性状连锁，少有的历史HCR被人为选择并且被无意中固定在卡诺拉油菜种质中。一类HCR是相互易位(同源染色体相互易位)，其中同源重组导致A和C染色体的部分相互交换而不损失任何遗传物质。衍生自甘蓝型油菜植物间杂交的后代，因存在或不存在同源染色体互易位而不同，可分为两组。具有‘亲本类型’染色体构成而没有明显遗传物质损失或获得的那些，以及具有导致遗传物质加倍或缺失的‘非亲本重组类型’染色体构成的那些。第二组将导致复杂的非孟德尔分离模式。在甘蓝型油菜的文献中，很少鉴定出和报道‘固定’同源染色体相互易位。

可用于选育甘蓝型油菜新品系的分子育种测定是所希望的。例如，可用于检测和监测甘蓝型油菜内同源染色体相互易位的测定具有特别重要的意义。

因此，本领域迫切需要继续鉴定用于分子育种测定的可以容易地应用于甘蓝型油菜育种的新方法和组合物。

发明内容

本文公开了用于检测卡诺拉油菜(canola)植物、组织或细胞中的N7/N16同源染色体相互易位的序列、构建体和方法。在一些方面，本公开涉及对N7/N16同源染色体相互易位的至少一种PCR扩增子的检测，其中所述一种或多种PCR扩增子位于SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4内。在其他方面，本公开涉及筛选第一卡诺拉油菜植物、组织或细胞的N7/N16同源染色体相互易位。在其他方面，本公开涉及选择第一卡诺拉油菜植物、组织或细胞或选择第一卡诺拉油菜植物、组织或细胞的后代，由此所得植物、组织或细胞展示出N7/N16同源染色体相互易位。在另外的方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在一些方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:372-488或其互补序列中的任一个关联的探针。在其他方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在其他方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:255-371或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在其他方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在一个方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:372-488或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在一些方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:255-371或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在其他方面，本公开涉及量化由扩增反应产生的扩增子。在一些方面，量化扩增反应的结果包括产生特征图谱。因此，特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。此外，特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。同样地，该荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。在又另外的方面，本公开涉及通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在另一方面，本公开涉及通过确定所述核酸的大小来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在一个方面，确定大小包括HPLC或电泳。

本文公开了用于检测卡诺拉油菜植物、组织或细胞中的N7/N16同源染色体相互易位的序列、构建体和方法。在一些方面，本公开涉及对与N7/N16同源染色体相互易位关联的至少一种PCR扩增子的检测，其中该一种或多种PCR扩增子位于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3内。在其他方面，本公开涉及筛选第一卡诺拉油菜植物、组织或细胞的N7/N16同源染色体相互易位。在其他方面，本公开涉及选择第一卡诺拉油菜植物、组织或细胞或选择第一卡诺拉油菜植物、组织或细胞的后代，由此所得植物、组织或细胞展示出N7/N16同源染色体相互易位。在另外的方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ IDNO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQID NO:15或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在一些方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ IDNO:138-254或其互补序列中的任一个关联的探针。在其他方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在其他方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:21-137或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在其他方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在一个方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:138-254或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在一些方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ IDNO:21-137或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在其他方面，本公开涉及量化由扩增反应产生的扩增子。在一些方面，量化扩增反应的结果包括产生特征图谱。因此，特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。此外，特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。同样地，该荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。在又另外的方面，本公开涉及通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在另一方面，本公开涉及通过确定所述核酸的大小来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在一个方面，确定大小包括HPLC或电泳。

在其他方面，本公开涉及使用本主题公开的方法和组合物选择的卡诺拉油菜植物。在一个方面，卡诺拉油菜植物可以是从使用本主题公开的方法和组合物选择的卡诺拉油菜植物获得的后代卡诺拉油菜植物。在另外的方面，卡诺拉油菜植物包含卡诺拉油菜种子。卡诺拉油菜种子的示例性结构包括外壳和胚。在其他方面，卡诺拉油菜植物包含卡诺拉油菜植物部分。示例性卡诺拉油菜植物部分包括植物细胞、植物原生质体、可从中再生植物的植物细胞组织培养物、植物DNA、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物部分(如胚、花粉、胚珠、花、种子、叶、根、根尖、花药等)中完好的植物细胞。在此类实施例中，使用本主题公开的组合物和方法测定卡诺拉油菜植物中N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。

在一个方面，本公开涉及将N7/N16同源染色体相互易位渗入后代卡诺拉油菜植物中。在另外的方面，本公开涉及将亲本卡诺拉油菜植物与另一种亲本卡诺拉油菜植物杂交，其中至少一种亲本卡诺拉油菜植物包含N7/N16同源染色体相互易位。在另一方面，本公开涉及从如前所述的杂交中收获后代种子，其中该后代种子包含N7/N16同源染色体相互易位。在其他方面，本公开涉及种植后代种子。在另外的方面，本公开涉及培育后代种子，其中后代种子产生后代卡诺拉油菜植物，其中后代卡诺拉油菜植物包含N7/N16同源染色体相互易位。

在一些方面，本公开涉及将N7/N16同源染色体相互易位渗入后代卡诺拉油菜植物中，其中渗入发生在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4内。在另外的方面，将N7/N16同源染色体相互易位渗入后代卡诺拉油菜植物中通过产生SEQ ID NO:2的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在一些方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:372-488或其互补序列中的任一个关联的探针。在其他方面，将N7/N16同源染色体相互易位渗入后代卡诺拉油菜植物通过产生SEQ ID NO:4的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在其他方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:255-371或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在其他方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在一个方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:372-488或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在一些方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:255-371或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在其他方面，本公开涉及量化由扩增反应产生的扩增子。在一些方面，量化扩增反应的结果包括产生特征图谱。因此，特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。此外，特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。同样地，该荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy7荧光染料、和ROX荧光染料。在又另外的方面，本公开涉及通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在另一方面，本公开涉及通过确定所述核酸的大小来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在一个方面，确定大小包括HPLC或电泳。

在一些方面，本公开涉及将N7/N16同源染色体相互易位渗入后代卡诺拉油菜植物中，其中渗入发生在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3内。在另外的方面，将N7/N16同源染色体相互易位渗入后代卡诺拉油菜植物中通过产生SEQ ID NO:1的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在一些方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:138-254或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，将N7/N16同源染色体相互易位渗入后代卡诺拉油菜植物中通过产生SEQ ID NO:3的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在其他方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:21-137或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在其他方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在一个方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:138-254或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在一些方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ IDNO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:21-137或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在其他方面，本公开涉及量化由扩增反应产生的扩增子。在一些方面，量化扩增反应的结果包括产生特征图谱。因此，特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。此外，特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。同样地，该荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。在又另外的方面，本公开涉及通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在另一方面，本公开涉及通过确定所述核酸的大小来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在一个方面，确定大小包括HPLC或电泳。

在另一方面，本公开涉及用于确定卡诺拉油菜植物、组织或细胞中N7/N16同源染色体相互易位的合子型的PCR测定方法。在一些方面，本公开涉及使用第一探针、第一正向引物和第一反向引物对来自卡诺拉油菜植物样品的多核苷酸进行第一PCR测定。在其他方面，本公开涉及使用第二探针、第二正向引物和第二反向引物对多核苷酸样品进行第二PCR测定。在另外的方面，本公开涉及量化第一探针和第二探针。在其他方面，本公开涉及比较第一PCR测定和第二PCR测定的量化的第一探针和量化的第二探针以确定合子型，其中N7/N16同源染色体相互易位的合子型选自由以下组成的组：纯合子、杂合子、半合子和无效(nullizygous)。在一个方面，第一和第二PCR测定是多重PCR形式。在另一方面，第一和第二PCR测定在单个PCR测定管或孔中进行。在其他方面，第一和第二PCR测定是实时PCR。在其他方面，通过在扩增期间测量从荧光染料发射的激发/发射光谱来量化第一探针和第二探针。在另外的方面，通过使用ΔΔCt公式比较量化的第一探针和第二探针来确定合子型。

在一些方面，本公开涉及用于确定卡诺拉油菜植物、组织或细胞中N7/N16同源染色体相互易位的合子型的PCR测定方法，其中PCR测定发生在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4内。在另外的方面，确定N7/N16同源染色体相互易位到后代卡诺拉油菜植物中的合子型的PCR测定通过产生SEQ ID NO:2的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在一些方面，SEQID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:372-488或其互补序列中的任一个关联的探针。在其他方面，确定卡诺拉油菜植物中N7/N16同源染色体相互易位的合子型的PCR测定方法通过产生SEQ ID NO:4的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ IDNO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在其他方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:255-371或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在其他方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在一个方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:372-488或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在一些方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ IDNO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:255-371或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在其他方面，本公开涉及量化由扩增反应产生的扩增子。在一些方面，量化扩增反应的结果包括产生特征图谱。因此，特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。此外，特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。同样地，该荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。在又另外的方面，本公开涉及通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在另一方面，本公开涉及通过确定所述核酸的大小来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在一个方面，确定大小包括HPLC或电泳。

在一些方面，本公开涉及用于确定卡诺拉油菜植物、组织或细胞中N7/N16同源染色体相互易位的合子型的PCR测定方法，其中PCR测定发生在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3内。在另外的方面，确定N7/N16同源染色体相互易位到后代卡诺拉油菜植物中的合子型的PCR测定通过产生SEQ ID NO:1的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在一些方面，SEQ IDNO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:138-254或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，确定N7/N16同源染色体相互易位到后代卡诺拉油菜植物中的合子型的PCR测定通过产生SEQ ID NO:3的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQID NO:19或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在其他方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:21-137或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，SEQ IDNO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在其他方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在一个方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQID NO:138-254或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在一些方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:21-137或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在其他方面，本公开涉及量化由扩增反应产生的扩增子。在一些方面，量化扩增反应的结果包括产生特征图谱。因此，特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。此外，特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。同样地，该荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。在又另外的方面，本公开涉及通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在另一方面，本公开涉及通过确定所述核酸的大小来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在一个方面，确定大小包括HPLC或电泳。

在一个方面，本主题公开将N7/N16同源染色体相互易位渗入卡诺拉油菜种质中。在另外的方面，本公开涉及检测第一卡诺拉油菜植物中与N7/N16同源染色体相互易位关联的至少一种PCR扩增子，其中该一种或多种PCR扩增子位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、或SEQ ID NO:4内。在另一方面，本公开涉及将N7/N16同源染色体相互易位渗入卡诺拉油菜种质中。在一个方面，本公开涉及在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的1百万碱基对、950千碱基对、900千碱基对、850千碱基对、800千碱基对、750千碱基对、700千碱基对、650千碱基、600千碱基对、550千碱基对、500千碱基对、450千碱基对、400千碱基对、350千碱基对、300千碱基对、250千碱基对、200千碱基对、150千碱基对、100千碱基对、90千碱基对、80千碱基对、70千碱基对、60千碱基对、50千碱基对、40千碱基对、30千碱基对、20千碱基对、10千碱基对、9千碱基对、8千碱基对、7千碱基对、6千碱基对、5千碱基对、4千碱基对、3千碱基对、2千碱基对、1千碱基对、750个碱基对、或500个碱基对内渗入性状。在另外的方面，本公开涉及在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的1百万碱基对、950千碱基对、900千碱基对、850千碱基对、800千碱基对、750千碱基对、700千碱基对、650千碱基、600千碱基对、550千碱基对、500千碱基对、450千碱基对、400千碱基对、350千碱基对、300千碱基对、250千碱基对、200千碱基对、150千碱基对、100千碱基对、90千碱基对、80千碱基对、70千碱基对、60千碱基对、50千碱基对、40千碱基对、30千碱基对、20千碱基对、10千碱基对、9千碱基对、8千碱基对、7千碱基对、6千碱基对、5千碱基对、4千碱基对、3千碱基对、2千碱基对、1千碱基对、750个碱基对、或500个碱基对内渗入性状。在其他方面，性状选自由以下组成的组：杀昆虫抗性性状、除草剂耐受性性状、氮利用效率性状、水利用效率性状、营养品质性状、DNA结合性状、选择性标记性状、黑胫病抗性性状、枯萎病性状、白锈病耐受性性状、抗倒伏性状、株高性状、早熟性状、油性状、蛋白质性状和硫代葡萄糖苷性状。

在一些方面，本公开涉及用于确定卡诺拉油菜植物、组织或细胞中N7/N16同源染色体相互易位的在1百万碱基对、950千碱基对、900千碱基对、850千碱基对、800千碱基对、750千碱基对、700千碱基对、650千碱基、600千碱基对、550千碱基对、500千碱基对、450千碱基对、400千碱基对、350千碱基对、300千碱基对、250千碱基对、200千碱基对、150千碱基对、100千碱基对、90千碱基对、80千碱基对、70千碱基对、60千碱基对、50千碱基对、40千碱基对、30千碱基对、20千碱基对、10千碱基对、9千碱基对、8千碱基对、7千碱基对、6千碱基对、5千碱基对、4千碱基对、3千碱基对、2千碱基对、1千碱基对、750个碱基对、或500个碱基对内渗入的性状的PCR测定方法，其中PCR测定发生在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4内。在另外的方面，N7/N16同源染色体相互易位到后代卡诺拉油菜植物的PCR测定通过产生SEQ ID NO:2的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQID NO:16或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在一些方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQID NO:372-488或其互补序列中的任一个关联的探针。在其他方面，卡诺拉油菜植物中的N7/N16同源染色体相互易位的PCR测定通过产生SEQ ID NO:4的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ IDNO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在其他方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:255-371或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ IDNO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在其他方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在一个方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:372-488或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在一些方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:255-371或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在其他方面，本公开涉及量化由扩增反应产生的扩增子。在一些方面，量化扩增反应的结果包括产生特征图谱。因此，特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。此外，特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。同样地，该荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。在又另外的方面，本公开涉及通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在另一方面，本公开涉及通过确定所述核酸的大小来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在一个方面，确定大小包括HPLC或电泳。

在一些方面，本公开涉及用于确定卡诺拉油菜植物、组织或细胞中N7/N16同源染色体相互易位的在1百万碱基对、950千碱基对、900千碱基对、850千碱基对、800千碱基对、750千碱基对、700千碱基对、650千碱基、600千碱基对、550千碱基对、500千碱基对、450千碱基对、400千碱基对、350千碱基对、300千碱基对、250千碱基对、200千碱基对、150千碱基对、100千碱基对、90千碱基对、80千碱基对、70千碱基对、60千碱基对、50千碱基对、40千碱基对、30千碱基对、20千碱基对、10千碱基对、9千碱基对、8千碱基对、7千碱基对、6千碱基对、5千碱基对、4千碱基对、3千碱基对、2千碱基对、1千碱基对、750个碱基对、或500个碱基对内渗入的性状的PCR测定方法，其中PCR测定发生在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3内。在另外的方面，N7/N16同源染色体相互易位到后代卡诺拉油菜植物的PCR测定通过产生SEQ ID NO:1的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在一些方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ IDNO:138-254或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，PCR测定通过产生SEQ IDNO:3的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ IDNO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在其他方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:21-137或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在其他方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在一个方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ IDNO:138-254或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在一些方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ IDNO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:21-137或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在其他方面，本公开涉及量化由扩增反应产生的扩增子。在一些方面，量化扩增反应的结果包括产生特征图谱。因此，特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。此外，特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。同样地，该荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。在又另外的方面，本公开涉及通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在另一方面，本公开涉及通过确定所述核酸的大小来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在一个方面，确定大小包括HPLC或电泳。

在另一方面，本公开涉及选择包含N7/N16同源染色体相互易位的卡诺拉油菜植物。在一个方面，本公开涉及针对N7/N16同源染色体相互易位对至少一种卡诺拉油菜植物进行基因分型，其中该至少一种卡诺拉油菜植物包含SEQ ID NO:255-488或其互补序列。在另外的方面，本公开涉及选择包括与SEQ ID NO:255-488或其互补序列关联的N7/N16同源染色体相互易位的卡诺拉油菜植物。在另外的方面，本公开涉及包含SEQ ID NO:255-488的PCR扩增子。在其他方面，本公开涉及量化由扩增反应产生的扩增子。在一些方面，量化扩增反应的结果包括产生特征图谱。因此，特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。此外，特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。同样地，该荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。在又另外的方面，本公开涉及通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在另一方面，本公开涉及通过确定所述核酸的大小来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在一个方面，确定大小包括HPLC或电泳。

在另一方面，本公开涉及选择包含N7/N16同源染色体相互易位的卡诺拉油菜植物。在一个方面，本公开涉及针对N7/N16同源染色体相互易位对至少一种卡诺拉油菜植物进行基因分型，其中该至少一种卡诺拉油菜植物包含SEQ ID NO:21-254或其互补序列。在另外的方面，本公开涉及选择包括与SEQ ID NO:21-254或其互补序列关联的N7/N16同源染色体相互易位的卡诺拉油菜植物。在另外的方面，本公开涉及包含SEQ ID NO:21-254的PCR扩增子。在其他方面，本公开涉及量化由扩增反应产生的扩增子。在一些方面，量化扩增反应的结果包括产生特征图谱。因此，特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。此外，特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。同样地，该荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。在又另外的方面，本公开涉及通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在另一方面，本公开涉及通过确定所述核酸的大小来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在一个方面，确定大小包括HPLC或电泳。

另一方面，本公开涉及一种用于确定包含N7/N16同源染色体相互易位的卡诺拉油菜植物中的重组基因频率的PCR测定方法。在一些方面，在卡诺拉油菜植物、组织或细胞中确定N7/N16同源染色体相互易位的重组基因频率。在一些方面，本公开涉及使用第一探针、第一正向引物和第一反向引物对来自卡诺拉油菜植物样品的多核苷酸进行第一PCR测定。在其他方面，本公开涉及使用第二探针、第二正向引物和第二反向引物对多核苷酸样品进行第二PCR测定。在另外的方面，本公开涉及量化第一探针和第二探针。在其他方面，本公开涉及比较第一PCR测定和第二PCR测定的量化的第一探针和量化的第二探针以确定重组基因频率，其中N7/N16同源染色体相互易位的重组基因频率选自由以下组成的组：连锁、紧密连锁或极其紧密连锁。在一个方面，第一和第二PCR测定是多重PCR形式。在另一方面，第一和第二PCR测定在单个PCR测定管或孔中进行。在其他方面，第一和第二PCR测定是实时PCR。在其他方面，通过在扩增期间测量从荧光染料发射的激发/发射光谱来量化第一探针和第二探针。在另外的方面，通过使用ΔΔCt公式比较量化的第一探针和第二探针来确定合子型。

在一些方面，本公开涉及用于确定卡诺拉油菜植物、组织或细胞中N7/N16同源染色体相互易位的重组基因频率的PCR测定方法，其中PCR测定发生在SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4内。在另外的方面，N7/N16同源染色体相互易位到后代卡诺拉油菜植物的PCR测定通过产生SEQ ID NO:2的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ IDNO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在一些方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:372-488或其互补序列中的任一个关联的探针。在其他方面，卡诺拉油菜植物中的N7/N16同源染色体相互易位的PCR测定方法通过产生SEQ ID NO:4的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在其他方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQID NO:255-371或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在其他方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在一个方面，SEQ ID NO:2的扩增子包含与SEQ IDNO:372-488或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在一些方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:4的扩增子包含与SEQ ID NO:255-371或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在其他方面，本公开涉及量化由扩增反应产生的扩增子。在一些方面，量化扩增反应的结果包括产生特征图谱。因此，特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。此外，特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。同样地，该荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。在又另外的方面，本公开涉及通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在另一方面，本公开涉及通过确定所述核酸的大小来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在一个方面，确定大小包括HPLC或电泳。

在一些方面，本公开涉及用于确定卡诺拉油菜植物、组织或细胞中N7/N16同源染色体相互易位的重组基因频率的PCR测定方法，其中PCR测定发生在SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3内。在另外的方面，N7/N16同源染色体相互易位到后代卡诺拉油菜植物的PCR测定通过产生SEQ ID NO:1的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在一些方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:138-254或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，N7/N16同源染色体相互易位到后代卡诺拉油菜植物的PCR测定通过产生SEQ ID NO:3的扩增子来检测，其中该扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物。因此，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。同样，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。在其他方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:21-137或其互补序列中的任一个关联的探针。在另外的方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ IDNO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在其他方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在一个方面，SEQ ID NO:1的扩增子包含与SEQ ID NO:138-254或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在一些方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。在另外的方面，SEQ ID NO:3的扩增子包含与SEQ ID NO:21-137或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。在其他方面，本公开涉及量化由扩增反应产生的扩增子。在一些方面，量化扩增反应的结果包括产生特征图谱。因此，特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。此外，特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。同样地，该荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。在又另外的方面，本公开涉及通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在另一方面，本公开涉及通过确定所述核酸的大小来确定N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。在一个方面，确定大小包括HPLC或电泳。

根据权利要求书和具体实施方式中提供的以下实施例，前述和其他特征将变得更加显而易见，其参考附图和序列表进行。

序列表

如37 C.F.R.§1.822中定义，使用核苷酸碱基的标准字母缩写，显示了在所附序列表中列出的核酸序列。仅示出每个核酸序列的一个链，但是通过对展示的链的任何提及，应理解为包括互补链和反向互补链。因为一级核酸序列的互补序列和反向互补序列必然由一级序列公开，所以通过对核酸序列的任何提及，都包括互补序列和反向互补序列，除非另外明确指明(或从其中出现序列的上下文中另外清楚可见)。在所附序列表中：

以SEQ ID NO:1提供来自DH12075 v1.1基因组的染色体7的碱基对17578019至17583020的染色体间隔。

以SEQ ID NO:2提供来自NS1822BC基因组的染色体7的碱基对20106368至20111369的染色体间隔。

以SEQ ID NO:3提供来自DH12075 v1.1基因组的染色体16的碱基对13651438至13656439的染色体间隔。

以SEQ ID NO:4提供来自NS1822BC基因组的染色体16的碱基对8089982至8094983的染色体间隔。

以SEQ ID NO:21-137提供DHN16探针序列。

以SEQ ID NO:138-254提供DHN7探针序列。

以SEQ ID NO:255-371提供NSN16探针序列。

以SEQ ID NO:372-488提供NSN7探针序列。

以SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15提供DHN7引物序列。

以SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:19提供DHN16引物序列。

以SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:16提供NSN7引物序列。

以SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:20提供NSN16引物序列。

具体实施方式

开发可以容易地应用于甘蓝型油菜育种的分子育种测定的新方法和组合物对甘蓝型油菜育种者具有重要意义。具有时间效率并且可以节省成本的商业上可行的测定是特别令人感兴趣的。更重要的是能够以各种不同的规模完成测定。从单个Eppendorf^TM试管到更大的多孔形式，该测定的应用应易于在任何应用形式中使用。本文公开了可检测甘蓝型油菜中N7/N16同源染色体相互易位的分子育种测定的方法和组合物。在本公开中首次提供了断点的详细基因组表征、这种同源染色体相互易位的遗传/物理范围、全球优良种质中的频率和在各种杂种优势池中的分布、以及与具有商业价值的性状的连锁。

本主题公开的用于可检测甘蓝型油菜中N7/N16同源染色体相互易位的分子育种测定的方法和组合物提供了相对于通常可用于寻径育种(routing breeding)的低通量、低分辨率和昂贵的方法(例如，荧光原位杂交(FISH)，和使用低密度分子标记***(如RFLP和SSR)，以及其他已知方法)的显著改进。在育种后代中，存在甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位导致非亲本重组类型，其特征在于同源区域中的区段缺失和加倍。用于可检测甘蓝型油菜中N7/N16同源染色体相互易位的分子育种测定的方法和组合物为克服甘蓝型油菜育种的特定问题提供了许多优势。

甘蓝型油菜育种者面临的一个特定问题是开发一种检测甘蓝型油菜育种程序中的性状渗入的方法。通过N7/N16同源染色体的易位，可以将培育为接近甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位的性状引入到甘蓝型油菜种质的新品系中。天然性状或转基因性状均可培育到N7或N16染色体的染色体区域内的基因座中。依靠甘蓝型油菜特定品系内的易位机制，可以将该性状渗入甘蓝型油菜的新品系中。因此，用于可检测甘蓝型油菜中N7/N16同源染色体相互易位的分子育种测定的方法和组合物为甘蓝型油菜内的渗入性状提供了解决方案。

甘蓝型油菜育种者面临的一个特定问题是开发一种检测甘蓝型油菜育种程序中杂种优势的方法。在已被鉴定为关于甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位分离的育种后代中鉴定“亲本类型”类别的甘蓝型油菜品系具有杂种优势。目前，没有能力检测和富集/丢弃这些变体，从而导致育种成本和时间效率的损失。因此，用于可检测甘蓝型油菜中N7/N16同源染色体相互易位的分子育种测定的方法和组合物为检测甘蓝型油菜内的杂种优势提供了解决方案。

甘蓝型油菜育种者面临的一个特定问题是开发一种用于甘蓝型油菜育种程序的信号检测的测定。典型的商业规模的“信号检测”方法依赖于单一的参考遗传图谱和标记顺序，绕过从头构建群体特异性遗传图谱进行信号检测。如果一个大的同源染色体相互易位(如N7/N16)在杂种优势池中差异分布/固定，并且作图群体正在关于N7/N16同源染色体相互易位分离，那么此类信号检测测定可能导致不准确的分配这些染色体上存在的数量性状基因座和基因，直接影响标记驱动的正交和回交育种选择。因此，用于可检测甘蓝型油菜中N7/N16同源染色体相互易位的分子育种测定的方法和组合物为检测甘蓝型油菜内N7/N16同源染色体相互易位提供了解决方案。

现在已经公开了用于检测甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位的新方法。所公开的方法可以部署为高通量测定，允许快速和有效地鉴定样品子集，然后可以通过传统的植物育种方法进一步处理这些样品。所公开的测定描述了用于鉴定和获得甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位的高质量、高通量过程。

定义

除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。在冲突的情况下，则以包括定义的本申请为准。除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。本文提及的所有出版物、专利和其他参考文献出于所有目的通过引用以其整体并入，就好像每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指示以引用方式并入，除非仅指示专利或专利出版物的特定部分通过引用并入。

为了进一步阐明本公开，提供以下术语、缩写和定义。

如本文所使用的，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“含有(contain)”或“含有(containing)”或其任何其他变型均旨在非排他性或开放性。例如，包含一系列要素的组合物、混合物、工艺、方法、制品、或设备不必仅限于这些要素，而是可以包括其他未明确列出的要素或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的要素。此外，除非有相反的明确说明，否则“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，条件A或者B通过以下中的任一项满足：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，以及A和B都为真(或存在)。

同样，在本公开的实施例的元素或组分前的不定冠词“一个/一种(a/an)”关于例子(即元素或组分的出现)的数量旨在是非限制性的。因此，“一个”或“一种”应理解为包括一个/一种或至少一个/至少一种，并且元素或组分的单数词语形式还包括复数，除非所述数字明显意指单数。

如在本文中使用的，术语“发明”或“本发明”是非限制性的术语，并且并不旨在是指特定发明的任何单一实施例，而是涵盖如公开于本申请中的所有可能的实施例。

“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特殊情况。它与非特异性模板复制(即，依赖于模板但不依赖于特异性模板的复制)形成对比。模板特异性在此区别于复制(即，合适的多核苷酸序列的合成)的保真度和核苷酸(核糖核酸或脱氧核糖核酸)特异性。模板特异性经常根据“靶标”特异性来描述。就靶序列被查找以从其他核酸中分选出来而言，所述靶序列是“靶标”。设计了主要用于这种分选的扩增技术。

如本文所使用的，术语“聚合酶链式反应”和“PCR”通常是指无需克隆或纯化即可增加基因组DNA混合物中靶序列区段浓度的方法(美国专利号4,683,195；4,683,202；和4,965,188；通过引用并入本文)。这种用于扩增靶序列的方法包括：将过量的两个寡核苷酸引物引入到包含了所希望的靶序列的DNA混合物中，随后在DNA聚合酶的存在下进行一种精确顺序的热循环。这两个引物与双链靶序列的其对应链互补。为了实现扩增，使该混合物变性，并且然后使引物退火为靶分子内的其互补序列。退火后，用一种聚合酶使这些引物延伸，以便形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多“循环”)以获得所希望的靶序列的高浓度扩增区段。所希望的靶序列的扩增区段的长度是由引物相对于彼此的相对位置决定的，并且因此，此长度是一个可控制的参数。由于该过程的重复方面，该方法被称为“聚合酶链式反应”(以下称为“PCR”)。因为靶序列的所希望的扩增区段变为混合物中的主要序列(就浓度来说)，所以它们被称为“PCR扩增的”。

术语“扩增子”是指自然或人工扩增事件(例如，聚合酶链式反应)产物形成多核苷酸(例如，DNA)区段。在一些实施例中，扩增子是“长度”扩增子，并且长度为至少5kb，或至少6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb、17kb、18kb、19kb、或20kb。

如本文所使用的，术语“分离的”意指已经从其自然环境中除去，或从首次形成该化合物时存在的其他化合物中除去。术语“分离的”涵盖从自然来源分离的材料以及通过在宿主细胞中重组表达制备后回收的材料(例如，核酸和蛋白质)、或化学合成的化合物，如核酸分子、蛋白质和肽。

如本文所使用的，术语“纯化的”涉及分子或化合物的分离，所述分子或化合物以基本上不含通常与在天然或自然环境中的分子或化合物关联的污染物，或者基本上在相对于化合物初次形成时存在的其他化合物的浓缩中富集的，并且意指由于与原始组合物中的其他组分分离而纯度提高了。如本文所使用的，术语“纯化的核酸”来描述已经与其他生物化合物分离的、分离产生的或纯化的核酸序列，所述其他生物化合物包括但不限于多肽、脂质和碳水化合物，同时影响组分中的化学或功能改变组分(例如，可以通过去除蛋白质污染物并断开将核酸与染色体中其余DNA连接的化学键，从染色体上纯化核酸)。

如本文所使用的，术语“合成的”是指通过化学合成作为体外过程产生的多核苷酸(即，DNA或RNA)分子。例如，可以在Eppendorf^TM管内的反应期间产生合成DNA，使得合成DNA由DNA或RNA的天然链酶促产生。可以利用其他实验室方法来合成多核苷酸序列。寡核苷酸可以在寡核苷酸合成仪上通过使用亚磷酰胺的固相合成化学合成。合成的寡核苷酸可以作为复合物彼此退火，从而产生“合成的”多核苷酸。化学合成多核苷酸的其他方法是本领域已知的，并且可以容易地实现以用于本公开。

如本文所使用的术语“约”意指大于或小于所陈述的值或值的范围的百分之十，但并非旨在仅针对此更宽泛的定义来指定任何值或值的范围。术语“约”之后的每个值或值的范围也旨在涵盖所陈述绝对值或值的范围的实施例。

出于本公开的目的，“基因”包括编码基因产物的DNA区域(参见下文)，以及调节该基因产物的产生的所有DNA区域，无论此类调控序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不限于启动子序列、终止子、翻译调控序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点、内含子和基因座控制区。

如本文所使用的，术语“天然的”或“自然的”定义了天然存在的状况。“天然DNA序列”是自然界中存在的DNA序列，其是通过自然方式或传统育种技术产生的，但不是通过基因工程(例如，使用分子生物学/转化技术)产生的。

如本文所使用的，“转基因”被定义为编码基因产物的核酸序列，所述基因产物包括例如但不限于mRNA。在一个实施例中，所述转基因/异源编码序列是外源核酸，其中通过基因工程将转基因/异源编码序列引入宿主细胞(或其后代)，其中通常找不到转基因/异源编码序列。在一个实例中，转基因/异源编码序列编码工业上或药学上有用的化合物，或编码希望的农艺性状的基因(例如，除草剂抗性基因)。在又另一个实例中，转基因/异源编码序列是反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。在一个实施例中，所述转基因/异源编码序列是内源核酸，其中希望的是内源核酸的另外的基因组拷贝，或相对于宿主生物体中靶核酸的序列处于反义方向的核酸。

如本文所定义的“基因产物”是由基因产生的任何产物。例如，基因产物可以是基因(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、干扰RNA、核糖酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质的直接转录产物。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑等方法修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻化和糖基化修饰的蛋白质。基因表达会受到外部信号的影响，例如，细胞、组织或生物体暴露于增加或减少基因表达的药剂。基因的表达也可以在从DNA到RNA到蛋白质的途径中的任何地方受到调控。调控基因表达的方式是，例如，通过控制转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子(如mRNA)的降解或特定蛋白质分子在制备后的激活、失活、区室化或降解，或其组合。可以通过本领域已知的任何方法(包括但不限于Northern印迹、RT-PCR、Western印迹或一种或多种体外、原位或体内蛋白活性测定)在RNA水平或蛋白质水平上测量基因表达。

如本文所使用的，术语“基因表达”涉及这样的过程，通过该过程，核酸转录单位(包括例如基因组DNA)的编码信息通常被转化为细胞的可操作的、不可操作的、或结构的部分，经常包括蛋白质的合成。基因表达会受到外部信号的影响；例如，细胞、组织或生物体暴露于增加或减少基因表达的药剂。基因的表达也可以在从DNA到RNA到蛋白质的途径中的任何地方受到调控。调控基因表达的方式是，例如，通过控制转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子(如mRNA)的降解或特定蛋白质分子在制备后的激活、失活、区室化或降解，或其组合。可以通过本领域已知的任何方法(包括但不限于Northern印迹、RT-PCR、Western印迹或一种或多种体外、原位或体内蛋白活性测定)在RNA水平或蛋白质水平上测量基因表达。

如本文所使用的，术语“核酸分子”(或“核酸”或“多核苷酸”)可以指核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA以及上述的合成形式和混合聚合物的有义链和反义链二者。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任何一种核苷酸的修饰形式。如本文所使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。除非另有说明，否则核酸分子的长度通常至少为10个碱基。所述术语可以指长度不确定的RNA或DNA分子。所述术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括通过自然存在的和/或非自然存在的核苷酸键连接在一起的自然存在的核苷酸和修饰的核苷酸之一或二者。

如本领域技术人员将容易理解的，核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或可以含有非自然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个自然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，不带电荷的键：例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、氨基甲酸酯等；带电荷的键：例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等；下垂部分：例如，肽；嵌入剂：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷基化剂；和修饰的键：例如，α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体、三链体、发夹、环状和挂锁构型。

转录沿着DNA链以5’到3’的方式进行。这意味着RNA是通过在生长链的3’末端顺序添加核糖核苷酸5’-三磷酸(必需消除焦磷酸盐)而制备的。在线性或环状核酸分子中，如果离散元件(例如特定的核苷酸序列)在另一元件的5’方向上结合同一核酸或将结合同一核酸，则这些离散元件可以称为位于相对于那个元件的“上游”或“5’”端。类似地，如果离散元件是或将要从另一个元件在3’方向上与相同的核酸结合，则离散元件相对于那个元件可以是“下游”或“3’”。

如本文所使用的，碱基“位置”是指给定碱基或核苷酸残基在指定核酸内的位置。可以通过与参考核酸比对(参见下文)来定义指定的核酸。

杂交涉及通过氢键结合两个多核苷酸链。寡核苷酸及其类似物通过互补碱基之间的氢键合杂交，包括沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦(reversed Hoogsteen)氢键合。通常，核酸分子由含氮碱基组成，所述含氮碱基是嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合称为“碱基配对”。更具体地说，A将氢键合至T或U，而G将键合至C。“互补的”是指发生在两个不同的核酸序列或同一核酸序列的两个不同的区域之间的碱基配对。

“特异性可杂交”和“特异性互补”是表示足够程度的互补性的术语，使得在寡核苷酸与DNA或RNA靶标之间发生稳定且特异性的结合。寡核苷酸不必与其靶序列100％互补即可特异性杂交。当寡核苷酸与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能时，寡核苷酸可特异性杂交，并且具有足够程度的互补性以避免寡核苷酸与非靶序列在希望特异性结合的条件下(例如在体内测定或***的情况中在生理条件下)的非特异性结合。这种结合称为特异性杂交。

导致特定严格性程度的杂交条件将根据所选择的杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg2+浓度)将有助于杂交的严格性，尽管洗涤时间也会影响严格性。Sambrook等人(编)Molecular Cloning：A LaboratoryManual[分子克隆：实验室手册]第二版第1-3卷,冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港,1989年,chs.9和11中讨论了有关获得特定严格性程度所需的杂交条件的计算。

如本文所使用的，“严格条件”涵盖仅在杂交分子与DNA靶之间的错配小于50％时才发生杂交的条件。“严格条件”包括另外的特定严格性水平。因此，如本文所使用的，“中严格性”条件是指在所述条件下序列错配率超过50％的分子不会杂交；“高严格性”条件是指在所述条件下错配率超过20％的序列不会杂交；以及“非常高严格性”条件是指在所述条件下错配率超过10％的序列不会杂交。

在特定的实施例中，严格条件可以包括在65℃下杂交，然后在65℃下用0.1x SSC/0.1％SDS洗涤40分钟。

以下是代表性的非限制性的杂交条件：非常高严格性：在65℃下，在5x SSC缓冲液中杂交16小时；在室温下在2x SSC缓冲液中洗涤两次，每次持续15分钟；并且在65℃下在0.5x SSC缓冲液中洗涤两次，每次持续20分钟。高严格性：在65℃-70℃下，在5x-6x SSC缓冲液中杂交16-20小时；在室温下，在2x SSC缓冲液中洗涤两次，每次5-20分钟；并且在55℃-70℃下在1x SSC缓冲液中洗涤两次，每次持续30分钟。中严格性：在室温至55℃下在6xSSC缓冲液中杂交16-20小时；在室温至55℃下在2x-3x SSC缓冲液中洗涤至少两次，每次持续20-30分钟。

在特定的实施例中，特异性杂交的核酸分子可以在非常高严格性杂交条件下保持结合。在这些和另外的实施例中，特异性杂交的核酸分子可以在高严格性杂交条件下保持结合。在这些和另外的实施例中，特异性杂交的核酸分子可以在中严格性杂交条件下保持结合。

如本文所使用的，术语“寡核苷酸”是指短核酸聚合物。寡核苷酸可以通过切割更长的核酸区段或通过聚合单个核苷酸前体来形成。自动化合成仪允许合成长度长达数百个碱基对的寡核苷酸。因为寡核苷酸可以结合互补的核苷酸序列，所以它们可以用作检测DNA或RNA的探针。由DNA组成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可以用于PCR(扩增小DNA序列的技术)。在PCR中，寡核苷酸典型地称为“引物”，它允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。

术语“百分比序列同一性”或“百分比同一性”或“同一性”可互换使用，是指基于在两个或更多个氨基酸或核苷酸序列之间进行比较的序列中相应同一位置之间的同一匹配的序列比较。百分比同一性是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分例如核苷酸或氨基酸的比对窗口中不变的程度。本领域已知的杂交实验和数学算法可以用于确定百分比同一性。存在许多数学算法作为本领域已知的计算序列百分比同一性的序列比对计算机程序。这些程序可以分为全局序列比对程序或局部序列比对程序。

全局序列比对程序通过端对端比较比对以找到精确匹配，将精确匹配的数目除以较短序列的长度，然后乘以100，计算出两个序列的百分比同一性。基本上，当两个序列最佳比对(具有适当的核苷酸***、缺失或缺口)时，参考(“查询”)多核苷酸分子的线性多核苷酸序列与测试(“受试者”)多核苷酸分子相比，同一的核苷酸的百分比。

本地序列比对程序在计算上相似，但是仅比较序列的比对片段，而不是利用端到端分析。诸如BLAST的局部序列比对程序可用于比较两个序列的特定区域。两个序列的BLAST比较会产生E值或期望值，该值表示具有得分等于或优于原始比对得分(S)的不同比对的数量，预期偶然在数据库搜索中发生。E值越低，匹配越显著。因为数据库大小是E值计算中的一个元素，所以对于任何给定的查询/条目匹配，通过BLASTing针对公共数据库(如GENBANK)获得的E值通常随着时间的推移而增加。在设定多肽功能预测的置信度标准时，“高”BLAST匹配在本文中被认为具有对于最高BLAST命中而言的E值小于1E-30；中等的BLASTX E值为1E-30至1E-8；并且低的BLASTX E值大于1E-8。使用E值、百分比同一性、查询覆盖率和命中覆盖率的组合来确定本公开中的蛋白质功能分配。查询覆盖率是指查询序列以BLAST比对表示的百分比。命中覆盖率是指以BLAST比对方式表示的数据库条目的百分比。在本公开的一个实施例中，从保守蛋白序列的功能推断查询多肽的功能，其中(1)hit[命中]_p<1e-30或％identity[同一性]>35％且query[查询]_coverage[覆盖率]>50％且hit[命中]_coverage[覆盖率]>50％，或(2)hit[命中]_p<1e-8且query[查询]_coverage[覆盖率]>70％且hit[命中]_coverage[覆盖率]>70％。

用于比较的序列的比对方法是本领域熟知的。描述了多种程序和比对算法。在一个实施例中，本主题公开涉及使用VectorNTI套件的AlignX比对程序(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性。AlignX比对程序是针对多核苷酸或蛋白质的全局序列比对程序。在一个实施例中，本主题公开涉及使用LASERGENE生物信息学计算套件的MegAlign程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(MegAlign^TM

DNASTAR.麦迪逊,威斯康星州)。MegAlign程序是针对多核苷酸或蛋白质的全局序列比对程序。在一个实施例中，本主题公开涉及使用比对程序的Clustal套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比，该套件包括但不限于ClustalW和ClustalV(Higgins和Sharp(1988)Gene[基因].12月15日；73(1):237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS[计算机应用生物科学]5:151-3；Higgins等人(1992)Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学]8:189-91)。在一个实施例中，本主题公开涉及使用比对程序(包括但不限于BLASTP、BLASTN、BLASTX等)的BLAST套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)。此类BLAST比对程序的另外的实例包括Gapped-BLAST或PSI-BLAST(Altschul等人,1997)。在一个实施例中，本主题公开涉及使用比对程序的EMBOSS套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比，该套件包括但不限于：Matcher、Needle、Streter、Water、Wordmatch等(Rice,P.,Longden,I.&Bleasby,A.EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件].Trends in Genetics[遗传学趋势]16(6)276-77(2000))。在一个实施例中，本主题公开涉及使用Needleman和Wunsch的Gap比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Needleman和Wunsch,JournalofMolecularBiology[分子生物学杂志]48:443-453,1970)。在一个实施例中，本主题公开涉及使用Smith和Waterman的BestFit比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics,[应用数学进展]2:482-489,1981,Smith等人,Nucleic Acids Research[核酸研究]11:2205-2220,1983)。这些程序产生发散序列的生物学上有意义的多重序列比对。将针对所选序列计算的最佳匹配比对排列起来，以便可以看到同一性、相似性和差异。

术语“相似性”是指氨基酸序列之间的比较，并且不仅考虑对应位置的同一的氨基酸，而且考虑对应位置的功能上相似的氨基酸。因此，除了序列相似性之外，多肽序列之间的相似性还指示功能相似性。

术语“同源性”有时用于指两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的相似性水平，以位置同一性(即序列相似性或同一性)的百分比表示。同源性也指进化相关性的概念，通常通过共享相似序列的不同核酸或蛋白质之间的相似功能特性来证明。

如本文所使用的，术语“变体”是指基本相似的序列。就核苷酸序列来说，可使用本领域熟知的分子生物学技术来鉴定自然存在的变体，诸如像用本文概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术来鉴定。

对于核苷酸序列，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所使用的，“天然”核苷酸序列包括自然存在的核苷酸序列。就核苷酸序列来说，可使用本领域熟知的分子生物学技术来鉴定自然存在的变体，例如，用以下概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术来鉴定。核苷酸序列变体还包括人工合成的核苷酸序列，比如那些采用定点诱变技术产生的核苷酸序列。通常，如通过本文别处所描述的序列比对程序和参数确定的，本公开的特定的核苷酸序列的变体将与该特定的核苷酸具有至少约40％、45％、50％>、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％o、99％或更高的序列同一性。本公开的核苷酸序列的生物活性变体可能与该序列相差只有1至15个核酸残基，只有1至10个，如6至10个，只有5个，只有4、3、2个，或甚至只有1个核酸残基。

如本文所使用的，术语“可操作地连接”涉及当第一核酸序列与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，当启动子影响编码序列的转录或表达时，该启动子可操作地连接到编码序列。当重组产生时，可操作地连接的核酸序列通常是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们在同一阅读框中。但是，元件不必连续地可操作地连接。

如本文所使用的，术语“再生”意指从植物细胞(例如，植物原生质体或外植体)生长植物的过程。

如本文所使用的，术语“培养”是指细胞或生物体在各种培养基上或各种培养基中体外繁殖，使得在一组物理条件下，控制液体培养基内的细胞的维持或生长。应当理解，在培养中生长的细胞的后代可能与亲本细胞不完全同一(即，在形态、基因、或表型上)。

如本文所使用的，术语“共表达”是指在同一宿主生物体内，同时产生两种或更多种基因产物。

如本文所使用的，术语“简并的”是指其中某些位置并不由单个特定核苷酸定义的引物或探针核酸。因此，在这样一个简并位置，引物或探针序列可以是至少两种不同核苷酸中的任一个。此类位置通常表示靶核酸的基因型方面的差异。出于本公开的目的，简并序列还可以表示为在至少两个位置处不同的多个非简并单个序列的混合物。

如本文所使用的，术语“表达”是指细胞内过程，包括编码DNA分子(例如用来产生多肽的结构基因)所经历的转录和翻译。

如本文所使用的，术语“转基因细胞”意指源自或再生自经转化的细胞或源自转基因细胞的任何细胞。示例性转基因细胞包括源自经转化的植物细胞和特定细胞的植物愈伤组织，例如叶、根、茎，例如体细胞，或获得自转基因植物的繁殖(生殖)细胞。

如本文所使用的，术语“转基因植物”意指源自经转化的植物细胞或原生质体的植物或其后代，其中植物DNA含有在同一株系的天然非转基因植物中最初并不存在的引入的外源DNA分子。在本领域，有时术语“转基因植物”和“经转化的植物”作为同义术语使用，用于定义其DNA含有外源DNA分子的植物。然而，科学上认为更正确的是，它是指获得自经转化的植物细胞或原生质体的再生植物(就是转基因植物)，并且本文将遵循这样使用。

如本文所使用的，术语“引物”是指当条件适合于引物延伸产物的合成时能够充当沿着互补链的合成起始点的寡核苷酸。合成条件包括存在四种不同的脱氧核糖核苷酸三磷酸和至少一种聚合诱导剂，如逆转录酶或DNA聚合酶。这些存在于合适的缓冲液中，其可以包括作为辅因子的成分或在各种合适的温度下影响诸如pH等条件的成分。引物典型地是单链序列，使得扩增效率得到优化，但是可以利用双链序列。

如本文所使用的，术语“探针”是指与靶序列杂交的寡核苷酸。在

或

样式的测定程序中，探针与位于两个引物的退火位点之间的靶标的一部分杂交。探针包括约八个核苷酸、约十个核苷酸、约十五个核苷酸、约二十个核苷酸、约三十个核苷酸、约四十个核苷酸或约五十个核苷酸。在一些实施例中，探针包括约八个核苷酸至约十五个核苷酸。探针还可以包括可检测标记，例如荧光团(

异硫氰酸荧光素等)。可检测标记可以直接共价附接于探针寡核苷酸，例如位于探针的5’末端或探针的3’末端。包括荧光团的探针还可以进一步包括淬灭剂，例如Black Hole Quencher^TM、Iowa Black^TM等。

如本文所使用的，术语“限制性内切核酸酶”和“限制酶”是指细菌酶，每种这样的酶在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA。2型限制酶在同一位点识别并切割DNA，包括但不限于XbaI、BamHI、HindIII、EcoRI、XhoI、SalI、KpnI、AvaI、PstI和SmaI。

如本文所使用的，术语“载体”与术语“构建体”、“克隆载体”和“表达载体”可互换使用，并且意指可将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞，以转化宿主并促进所引入的序列的表达(例如转录和翻译)的载体。“非病毒载体”旨在意指不包含病毒或逆转录病毒的任何载体。在一些实施例中，“载体”是包含至少一个DNA复制起点和至少一个选择性标记基因的DNA序列。实例包括但不限于将外源DNA带入细胞的质粒、粘粒、噬菌体、细菌人工染色体(BAC)或病毒。载体还可以包括一个或多个基因、反义分子和/或选择性标记基因以及本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达由载体编码的核酸分子和/或蛋白质。

术语“质粒”定义了能够在原核或真核宿主细胞中常染色体复制的核酸的环状链。所述术语包括可以是DNA或RNA并且可以是单链或双链的核酸。所述定义的质粒还可以包括对应于细菌复制起点的序列。

如本文所使用的，术语“选择性标记基因”定义了编码蛋白质的基因或其他表达盒，该蛋白质有助于鉴定***了选择性标记基因的细胞。例如，“选择性标记基因”涵盖报告基因以及用于植物转化以例如保护植物细胞免于选择剂或对选择剂提供抗性/耐受性的基因。在一个实施例中，仅那些接受功能选择性标记的细胞或植物能够在具有选择剂的条件下***或生长。短语“标记阳性”是指已经被转化为包括选择性标记基因的植物。

如本文所使用的，术语“可检测标记”是指能够检测的标记，诸如像放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。可检测标记的实例包括但不限于以下：荧光标记(例如，FITC、若丹明、镧系元素荧光粉)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基、由二级报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一个实施例中，可检测标记可以通过多种长度的间隔臂附接以减少潜在的空间位阻。

如本文所使用的，术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”是指可在特定限制位点处或通过同源重组***核酸或多核苷酸中的DNA区段。如本文所使用的，DNA的区段包含编码目的多肽的多核苷酸，并且盒和限制位点被设计为确保将盒***适当的阅读框中以进行转录和翻译。在一个实施例中，表达盒可以包括编码目的多肽的多核苷酸，并且除了促进特定宿主细胞转化的多核苷酸外还具有元件。在一个实施例中，基因表达盒还可以包括允许在宿主细胞中增强表达编码目的多肽的多核苷酸的元件。这些元件可以包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、响应元件、终止子序列、聚腺苷酸化序列等。

如本文所使用的，“接头”或“间隔子”是将两个分开的实体彼此结合的键、分子或分子的组。接头和间隔子可以提供两个实体的最佳间隔，或者可以进一步提供允许两个实体彼此分离的不稳定的连接。不稳定键包括光可裂解基团、酸不稳定部分、碱基不稳定部分和酶可裂解基团。如本文所使用的术语“多接头”或“多克隆位点”定义了位于核酸序列上彼此10个核苷酸内的三个或更多个2型限制酶位点的簇。在其他情况下，如本文所使用的“多接头”是指通过任何已知的无缝克隆方法(即Gibson

NEBuilder HiFiDNA

Golden Gate Assembly、

Assembly等)靶向连接两个序列的一段核苷酸。包含多接头的构建体用于核酸序列如基因的编码区的***和/或切除。

如本文所使用的，术语“对照”是指在分析程序中用于比较目的的样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。例如，在分析程序的目的是检测细胞或组织中差异表达的转录物或多肽的情况下，通常优选包括阳性对照(如来自已知植物的表现出所希望的表达的样品)和阴性对照(如来自已知植物的缺少所希望的表达的样品)。

如本文所使用的，术语“植物”包括整株植物以及任何后代，细胞、组织或植物的一部分。可以在本公开中使用的植物类别通常与易于诱变的高等和低等植物类别一样广泛，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。因此，“植物”包括双子叶植物和单子叶植物。术语“植物部位”包括植物的任何部位，包括例如且不限于：种子(包括成熟种子和未成熟种子)；植物切段；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如花粉、胚、花朵、果实、枝、叶、根、茎和外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织或组织成结构或功能单元的任何其他组的植物细胞。植物细胞或组织培养物可能能够再生具有从其获得细胞或组织的植物的生理和形态特征的植物，并且能够再生具有与所述植物基本相同的基因型的植物。相比之下，一些植物细胞不能再生以产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚芽、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花丝、花、籽粒、穗、穗轴、苞叶或茎秆。

植物部分包括可收获部分和可用于后代植物繁殖的部分。可用于繁殖的植物部分包括例如但不限于：种子；果实；插条；幼苗；块茎；和根茎。植物的可收获部分可以是植物的任何有用的部分，包括例如但不限于：花；花粉；幼苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。

植物细胞是植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单个细胞或细胞聚集物(例如，易碎的愈伤组织和培养的细胞)的形式，并且可以是更高组织的单元(例如，植物组织、植物器官和植物)的部分。因此，植物细胞可以是原生质体、产生配子的细胞或可以再生为整株植物的细胞或细胞集合。这样，包含多个植物细胞并且能够再生为完整植物的种子在本文的实施例中被认为是“植物细胞”。

如本文所使用的，术语“连锁不平衡”是指两个基因座之间或性状与标记之间的统计关联。

如本文所使用的，基因或标记之间的连锁是指染色体上的基因或标记显示出可测量的概率一起传递给下一代个体的现象。两个基因或标记彼此越接近，这个概率就越接近(1)。因此，术语“连锁”可以指一个或多个基因或标记与基因一起以大于0.5的概率传递(这是从标记/基因位于不同染色体上的独立分类中预期的)。因为染色体上两个基因或标记的接近程度与基因或标记将一起传递给下一代个体的概率直接相关，所以术语“连锁”在本文中也可以指位于同一芸苔属(Brassica)物种染色体上彼此约2.0Mb内的一个或多个基因或标记。因此，两个“连锁”基因或标记可能相隔约2.1Mb；2.00Mb；约1.95Mb；约1.90Mb；约1.85Mb；约1.80Mb；约1.75Mb；约1.70Mb；约1.65Mb；约1.60Mb；约1.55Mb；约1.50Mb；约1.45Mb；约1.40Mb；约1.35Mb；约1.30Mb；约1.25Mb；约1.20Mb；约1.15Mb；约1.10Mb；约1.05Mb；约1.00Mb；约0.95Mb；约0.90Mb；约0.85Mb；约0.80Mb；约0.75Mb；约0.70Mb；约0.65Mb；约0.60Mb；约0.55Mb；约0.50Mb；约0.45Mb；约0.40Mb；约0.35Mb；约0.30Mb；约0.25Mb；约0.20Mb；约0.15Mb；约0.10Mb；约0.05Mb；约0.025Mb；约0.012Mb；以及约0.01Mb。基因可以与位于基因外显子或内含子内的标记“连锁”。在这种情况下，连锁的基因和标记之间的间隔为0.00Mb。

标记和/或基因也可以与表型“连锁”，例如，其中涉及连锁基因或与连锁标记连锁的基因的表型。如本领域技术人员将理解的，如果从位于退火时使用的特定引物的远端之间的基因组DNA的跨度中添加或减去核苷酸，该标记的长度将发生变化。

如本文所使用的，术语“紧密连锁”可指位于同一染色体上彼此约0.5Mb内的一个或多个基因或标记。因此，两个“紧密连锁”基因或标记可能相隔约0.6Mb；约0.55Mb；0.5Mb；约0.45Mb；约0.4Mb；约0.35Mb；约0.3Mb；约0.25Mb；约0.2Mb；约0.15Mb；约0.12Mb；约0.1Mb；约0.05Mb；以及约0.00Mb。

如本文所使用的，术语“极其紧密连锁”可指位于同一染色体上彼此约100kb内的一个或多个基因或标记。因此，两个“极其紧密连锁”基因或标记可能相隔约125kb；约120kb；约115kb；约110kb；约105kb；100kb；约95kb；约90kb；约85kb；约80kb；约75kb；约70kb；约65kb；约60kb；约55kb；约50kb；约45kb；约40kb；约35kb；约30kb；约25kb；约20kb；约15kb；约12kb；约10kb；约5kb；约1kb；以及约0kb。

连锁、紧密连锁和极其紧密连锁的遗传标记可用于标记辅助育种程序，以鉴定包含连锁的表型和/或基因类型的个体，并将这些性状和/或基因培育成芸苔属品种。

例如，通过确定其他标记和示例性SSR标记之间的重组频率，可以将其他标记鉴定为等同于该示例性标记。这样的确定可以利用基于Mather(1931),The MeasurementofLinkage in Heredity[遗传连锁的测定],梅休因公司(Methuen&Co.),伦敦的方法的正交对比的改进方法，然后进行最大似然测试以确定重组频率。Allard(1956)Hilgardia24:235-78。如果在任何栽培品种中重组频率的值小于或等于0.10(即10％)，则出于在当前公开的方法中使用的目的，其他标记被认为等同于特定参考标记。

如本文所使用的，在此使用的术语“杂交”是指雌性植物(或配子)被雄性植物(或配子)受精。术语“配子”是指在植物中通过有丝***由配子体产生并参与有性生殖的单倍体生殖细胞(卵子或***)，在此期间，两个异性配子融合形成二倍体合子。该术语通常包括提及花粉(包括***细胞)和胚珠(包括卵子)。因此，“杂交”通常是指一个个体的胚珠与另一个个体的花粉受精，而“自交”是指一个个体的胚珠与来自同一个体的花粉受精。当在实现基因组区域或区段渗入的上下文中提及杂交时，本领域技术人员将理解，为了实现一株植物的染色体的仅一部分渗入到另一株植物的染色体中，由于在亲本品系配子的产生过程中发生了交叉事件，因此要求在杂交过程中重组两个亲本品系的基因组随机部分。因此，双亲的基因组必须通过杂交组合在单个细胞中，在从所述细胞产生配子并在受精过程中融合后，将导致渗入事件。

术语“合子型”意指确定核酸的来源是杂合子、纯合子还是半合子。

如本文所使用的，术语“杂合”意指当不同等位基因位于同源染色体上的相应基因座时存在的遗传情况。

如本文所使用的，术语“纯合子”意指当同一等位基因位于同源染色体上的相应基因座时存在的遗传情况。

如本文所使用的，术语“半合子”是指在二倍体状态下一条染色体上的给定基因座处具有基因的等位基因，而该对染色体的另一条染色体上没有相应的基因座。

如本文所使用的，术语“渗入”是指通过杂交那些个体、物种、品种或栽培品种而从一个个体、物种、品种或栽培品种转移到另一个体、物种、品种或栽培品种的基因组中的基因组区段。

如本文所使用的，术语“渗入(introgressing、introgress和introgressed)”是指自然和人工过程，由此通过杂交那些物种、品种或栽培品种，将单个基因或整个性状从一个个体、物种、品种或栽培品种转移到另一个物种、品种或栽培品种的基因组中。在植物育种中，该过程通常包括与轮回亲本自交或回交，以提供除了渗入基因或性状之外基本上具有轮回亲本特征的越来越纯合的植物。

术语“回交”是指其中由两个亲本品系之间的杂交得到的植物与其亲本品系之一杂交的过程，其中回交中使用的亲本品系被称为轮回亲本。重复回交导致基因组变得越来越纯合或变为近交。

术语“自交”是指自体受精的过程，其中个体用自己的花粉授粉或受精。

除非另外具体解释，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。分子生物学中常用术语的定义可以在例如：Lewin,Genes V[基因V],Oxford University Press[牛津大学出版社],1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia ofMolecular Biology[分子生物学百科全书],Blackwell Science Ltd.[布莱克威尔科学有限公司],1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology：AComprehensiveDeskReference,[分子生物学和生物技术：综合办公桌参考]VCHPublishers,Inc.,[VCH出版公司]1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。

实施例

可以通过选择或筛选甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位的植物材料来鉴定和分离植物细胞、愈伤组织、组织或植物。可以使用各种测定来检测包含甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位的多核苷酸。以下技术可用于多种情况，并且在一个实施例中，可用于检测甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。例如，分子的存在可以多种方式确定，包括在扩增反应中使用序列的引物或探针。在一个实施例中，本公开涉及通过产生扩增产物或扩增子的扩增反应来检测包含甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位的植物的方法。对扩增子的检测指示该植物是否含有甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位。

可以通过任何合适的方法进行核酸序列的扩增。一般参见，Kwoh等人,Am.Biotechnol.Lab.[美国生物技术实验室]8,14-25(1990)。合适的扩增技术的实例包括但不限于聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链置换扩增(一般参见G.Walker等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89,392-396(1992)；G.Walker等人,NucleicAcids Res.[核酸研究]20,1691-1696(1992))、基于转录的扩增(参见D.Kwoh等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA[美国科学院院报]86,1173-1177(1989))、自我持续序列复制(或“35R”)(参见J.Guatelli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]87,1874-1878(1990))、Qβ复制酶***(参见P.Lizardi等人,BioTechnology[生物技术]6,1197-1202(1988))、基于核酸序列的扩增(或“NASBA”)(参见R.Lewis,Genetic Engineering News[基因工程新闻]12(9),1(1992))、修复链式反应(或“RCR”)(参见R.Lewis，同上)和自返式DNA扩增(boomerang DNA amplification)(或“BDA”)(参见R.Lewis，同上)。通常优选聚合酶链式反应。

包含甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位的多核苷酸或其区段可用作PCR扩增的引物和/或探针。在进行PCR扩增时，可以容忍引物和模板之间存在一定程度的错配。因此，示例性引物的突变、缺失和***(尤其是在5’端添加核苷酸)落入本主题公开的范围内。可以通过本领域普通技术人员已知的方法在给定的引物中产生突变、***和缺失。

因此，以SEQ ID NO:1提供来自DH12075 v1.1基因组的染色体7的碱基对17578019至17583020的染色体间隔；以SEQ ID NO:2提供来自NS1822BC基因组的染色体7的碱基对20106368至20111369的染色体间隔；以SEQ ID NO:3提供来自DH12075 v1.1基因组的染色体16的碱基对13651438至13656439的染色体间隔；并且以SEQ ID NO:4提供来自NS1822BC基因组的染色体16的碱基对8089982至8094983的染色体间隔。此外，本文提供了探针序列：以SEQ ID NO:21-137提供DHN16探针序列；以SEQ ID NO:138-254提供DHN7探针序列；以SEQID NO:255-371提供NSN16探针序列；以SEQ ID NO:372-488提供NSN7探针序列。此外，本文提供了引物序列：以SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13和SEQID NO:15提供DHN7引物序列；以SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:19提供DHN16引物序列；以SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16提供NSN7引物序列；并且以SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20提供NSN16引物序列。这些序列提供了可用于扩增反应的示例性组合物。本领域技术人员可以利用所公开的引物和探针序列来扩增基因组序列的片段并且检测所得扩增子。

在一些实施例中，可以检测扩增子。在该实施例的一个方面，通过电泳在琼脂糖凝胶上检测扩增子。本领域技术人员了解可以使用的各种类型的琼脂糖凝胶电泳试剂和技术。例如脉冲场凝胶电泳、脉冲正交凝胶电泳、琼脂糖多凝胶电泳和传统的琼脂糖凝胶电泳可以与本主题公开一起使用。在另外的实施例中，可以检测扩增子的大小，以确定是否对甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位进行测定。在一个方面，扩增子的大小可以是约50个碱基对、100个碱基对、150个碱基对、200个碱基对、250个碱基对、300个碱基对、350个碱基对、400个碱基对、450个碱基对、500个碱基对、550个碱基对、600个碱基对、650个碱基对、700个碱基对、750个碱基对、800个碱基对、850个碱基对、900个碱基对、950个碱基对、1千碱基对、2千碱基对、3千碱基对、4千碱基对、5千碱基对、6千碱基对、7千碱基对、8千碱基对、9千碱基对、10千碱基对、11千碱基对、12千碱基对、13千碱基对、14千碱基对、15千碱基对、16千碱基对、17千碱基对、18千碱基对、19千碱基对、或20千碱基对。

在完成PCR反应和探针检测之后，可以使用例如任何合适的计算机图形软件来生成表格和分布图。用具有相似和/或已知基因型背景的野生型、半合子和纯合子DNA获得的结果可作为阳性或阴性对照。在分离的群体中，可以获得三个数据点集群，从而可以直观地确定样品结果可能属于分离的集群之一。可替代地，可以使用数据分析计算机软件来计算样品结果属于每个分离的集群的概率，其中最可能的集群作为样品名称。当进行视觉确定时，每个集群的边界可以是任意的，例如，当三个数据点集群清晰可见时。

原始荧光强度数据也可以使用合适的分析软件包(如KLIMS(KBioscience实验室信息管理***))直接从读板器进行测定。可以生成一个图，具有在一个轴上绘制的突变型等位基因的特定探针产生的荧光信号的相对荧光单位(RFU)，以及在另一个轴上绘制的野生型等位基因的特定探针产生的荧光信号的RFU。然后可以基于数据的图形展示中的集群分离来进行合子型确定。

不包含甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位的样品可能只会导致野生型PCR产物的荧光读数。含有半合子或纯合子突变型基因组DNA的样品可能导致突变型特异性探针的RFU读数高于阴性背景对照的读数。如果样品没有产生足够的结果，则样品中的基因组DNA可能质量和/或数量不足，应进行新的DNA制备和/或新的PCR反应。优选地，不含DNA样品的阴性对照样品显示出非常低的一种或多种基因特异性探针检测。还优选已知纯合子对照仅显示对照中突变型或野生型DNA的高检测，并且已知半合子对照显示突变型和野生型DNA的高检测。

在一个实施例中，扩增反应被量化。在其他实施例中，使用特征图谱对扩增反应进行量化，其中该特征图谱选自由以下组成的组：解链温度或荧光特征图谱。在一些实施例中，通过ΔΔct方法量化扩增反应。在其他实施例中，通过比较循环阈值方法量化扩增反应。在另外的实施例中，通过标准曲线法量化扩增反应。

标准曲线。可使用核酸建立标准曲线。这些方法是众所周知的并且包括内部对照、双链DNA、表达靶基因的cDNA或体外产生的单链DNA。方法可以根据选择用作标准的核酸来建立标准曲线。

比较循环阈值。比较循环阈值(Ct)方法，也称为2^-ΔΔCt法，也用于量化DNA水平。Ct方法将测试反应与对照或校准样品进行比较。将对照/校准样品和测试样品的Ct值归一化。在本发明的一个实施例中，将Ct值归一化到任意截止值，20-22。在另一个实施例中，将Ct值归一化到阴性对照(没有抑制的样品)的1个Ct值以内。这允许测定的灵敏度和适当的动态范围。

Ct方法。也可以用ΔΔCt公式来描述Ct方法；ΔΔCt＝ΔCt_测试样品-ΔCt_参考样品。测试样品和参考样品的扩增效率必须大约相同，才能使公式有效。可以通过将样品与模板稀释度进行比较确定扩增效率。当cDNA稀释度与ΔCt的曲线接近于零时，扩增效率大约相同。

可以通过本领域技术人员已知的方法从植物组织中分离(例如，提取和纯化)DNA。例如，可从凯杰公司(Qiagen,Inc)获得用于DNA分离的商业试剂盒。在一些实施例中，来自特定植物的叶圆片被打孔并转移到收集管中。每次取样后，可以用70％的酒精清洁打孔机，用水冲洗并干燥。可根据制造商的建议制备DNA提取缓冲液。然后可以根据制造商的说明使用试剂盒分离DNA。最后，可以使用例如Quant-iT^TM

量化试剂盒(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)和分光光度计或通过任何其他合适的技术来确定分离的DNA的浓度。

在另外的实施例中，本主题公开的组合物和方法可用于设计针对以SEQ ID NO:1提供的来自DH12075 v1.1基因组的染色体7的碱基对17578019至17583020的染色体间隔的新引物和探针序列。本领域技术人员可以利用本公开设计可以结合该多核苷酸序列(例如SEQ ID NO:1)的约12个碱基对、13个碱基对、14个碱基对、15个碱基对、16个碱基对、17个碱基对、18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对的引物、21个碱基对、22个碱基对、23个碱基对、24个碱基对、25个碱基对、26个碱基对、27个碱基对、28个碱基对、29个碱基对、30个碱基对或更多碱基对。可被设计为结合该序列的引物可以与该序列或与该序列的反向互补序列直接互补。同样地，本领域技术人员可以利用本公开设计可以结合该多核苷酸序列(例如SEQID NO:1)的约12个碱基对、13个碱基对、14个碱基对、15个碱基对、16个碱基对、17个碱基对、18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对或更多碱基对。可被设计为结合该序列的探针可以与该序列或与该序列的反向互补序列直接互补。以SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15提供示例性DHN7引物序列。以SEQ ID NO:138-254提供示例性DHN7探针序列。鉴于来自DH12075 v1.1基因组的染色体7的碱基对17578019至17583020的染色体间隔以本文公开的SEQ ID NO:1提供，本领域技术人员将能够设计和生产此类组合物。

在实施例中，本主题公开的组合物和方法可用于设计针对以另外的SEQ ID NO:2提供的来自NS1822BC基因组的染色体7的碱基对20106368至20111369的染色体间隔的新引物和探针序列。本领域技术人员可以利用本公开设计约12个碱基对、13个碱基对、14个碱基对、15个碱基对、16个碱基对、17个碱基对、18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对的引物、21个碱基对、22个碱基对、23个碱基对、24个碱基对、25个碱基对、26个碱基对、27个碱基对、28个碱基对、29个碱基对、30个碱基对或可以结合该多核苷酸序列(例如SEQ ID NO:2)的更多碱基对。可被设计为结合该序列的引物可以与该序列或与该序列的反向互补序列直接互补。同样地，本领域技术人员可以利用本公开设计约12个碱基对、13个碱基对、14个碱基对、15个碱基对、16个碱基对、17个碱基对、18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对或可以结合该多核苷酸序列(例如SEQ ID NO:2)的更多碱基对。可被设计为结合该序列的探针可以与该序列或与该序列的反向互补序列直接互补。以SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16提供示例性NSN7引物序列。以SEQ ID NO:372-488提供示例性NSN7探针序列。鉴于来自NS1822BC基因组的染色体7的碱基对20106368至20111369的染色体间隔以本文公开的SEQ ID NO:2提供，本领域技术人员将能够设计和生产该组合物。

在另外的实施例中，本主题公开的组合物和方法可用于设计针对以SEQ ID NO:3提供的来自DH12075 v1.1基因组的染色体16的碱基对13651438至13656439的染色体间隔的新引物和探针序列。本领域技术人员可以利用本公开设计约12个碱基对、13个碱基对、14个碱基对、15个碱基对、16个碱基对、17个碱基对、18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对的引物、21个碱基对、22个碱基对、23个碱基对、24个碱基对、25个碱基对、26个碱基对、27个碱基对、28个碱基对、29个碱基对、30个碱基对或可以结合该多核苷酸序列(例如SEQ ID NO:3)的更多碱基对。可被设计为结合该序列的引物可以与该序列或与该序列的反向互补序列直接互补。同样地，本领域技术人员可以利用本公开设计约12个碱基对、13个碱基对、14个碱基对、15个碱基对、16个碱基对、17个碱基对、18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对或可以结合该多核苷酸序列(例如SEQ ID NO:3)的更多碱基对。可被设计为结合该序列的探针可以与该序列或与该序列的反向互补序列直接互补。以SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19提供示例性DHN16引物序列。以SEQ ID NO:21-137提供示例性DHN16探针序列。鉴于来自DH12075 v1.1基因组的染色体16的碱基对13651438至13656439的染色体间隔以本文公开的SEQ ID NO:3提供，本领域技术人员将能够设计和生产此类组合物。

在另外的实施例中，本主题公开的组合物和方法可用于设计针对以SEQ ID NO:4提供的来自NS1822BC基因组的染色体16的碱基对8089982至8094983的染色体间隔的新引物和探针序列。本领域技术人员可以利用本公开设计约12个碱基对、13个碱基对、14个碱基对、15个碱基对、16个碱基对、17个碱基对、18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对的引物、21个碱基对、22个碱基对、23个碱基对、24个碱基对、25个碱基对、26个碱基对、27个碱基对、28个碱基对、29个碱基对、30个碱基对或可以结合该多核苷酸序列(例如SEQ ID NO:4)的更多碱基对。可被设计为结合该序列的引物可以与该序列或与该序列的反向互补序列直接互补。同样地，本领域技术人员可以利用本公开设计约12个碱基对、13个碱基对、14个碱基对、15个碱基对、16个碱基对、17个碱基对、18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对或可以结合该多核苷酸序列(例如SEQ ID NO:4)的更多碱基对。可被设计为结合该序列的探针可以与该序列或与该序列的反向互补序列直接互补。以SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20提供示例性NSN16引物序列。以SEQ ID NO:255-371提供示例性NSN16探针序列。鉴于来自NS1822BC基因组的染色体16的碱基对8089982至8094983的染色体间隔以本文公开的SEQ ID NO:4提供，本领域技术人员将能够设计和生产该组合物。

在其他实施例中，本主题公开的组合物和方法可用于特定扩增测定，如针对N7/N16同源染色体相互易位的终点扩增测定。例如，已经开发了一种终点PCR测定，用于测试含有N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜的合子型。在一个实施例中，用于确定甘蓝型油菜植物中N7/N16同源染色体相互易位基因的合子型的方法包括扩增测定。这种扩增或PCR测定可以是定量的和/或实时的和/或多重形式的。在一个实施例中，方法采用

型探针(双标记探针，在5’→3’核酸外切酶活性时发出荧光)。在一个实施例中，方法采用

型探针和与N7/N16同源染色体相互易位选择性杂交的寡核苷酸。在一个实施例中，N7/N16同源染色体相互易位探针可以与该寡核苷酸的5’端的可检测标记偶联。在一个实施例中，该寡核苷酸还可以与3’端的淬灭剂部分偶联。N7/N16同源染色体相互易位的淬灭剂部分的一个实例是Black Hole Quencher^TM(生物搜索技术公司(BiosearchTechnologies)，诺瓦托市，加利福尼亚州)。从而，合适的仪器将检测复制期间通过DNA聚合酶的核酸酶活性切割寡核苷酸探针所产生的荧光。然后分析软件根据荧光数据确定扩增产物的量。

在一个实施例中，用于甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位的终点方法包括：a)使用第一探针、第一正向引物和第一反向引物对来自甘蓝型油菜的多核苷酸样品进行第一PCR测定；b)量化第一探针；以及c)确认发生在甘蓝型油菜基因组内的N7/N16同源染色体相互易位。在一个实施例中，探针被可检测地标记。在一个实施例中，引物和探针对甘蓝型油菜中的N7/N16同源染色体相互易位具有特异性。在一个实施例中，本文提供了探针序列：以SEQ ID NO:21-137提供DHN16探针序列；以SEQ ID NO:138-254提供DHN7探针序列；以SEQID NO:255-371提供NSN16探针序列；以SEQ ID NO:372-488提供NSN7探针序列。在一个实施例中，本文提供了引物序列：以SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:15提供DHN7引物序列；以SEQ ID NO:2991-5492、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19提供DHN16引物序列；以SEQ ID NO:5493-8026、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16提供NSN7引物序列；并且以SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20提供NSN16引物序列。在其他实施例中，N7/N16同源染色体相互易位与关联性状(天然或转基因)以约1百万碱基对、950千碱基对、900千碱基对、850千碱基对、800千碱基对、750千碱基对、700千碱基对、650千碱基、600千碱基对、550千碱基对、500千碱基对、450千碱基对、400千碱基对、350千碱基对、300千碱基对、250千碱基对、200千碱基对、150千碱基对、100千碱基对、90千碱基对、80千碱基对、70千碱基对、60千碱基对、50千碱基对、40千碱基对、30千碱基对、20千碱基对、10千碱基对、9千碱基对、8千碱基对、7千碱基对、6千碱基对、5千碱基对、4千碱基对、3千碱基对、2千碱基对、1千碱基对、750个碱基对、或500个碱基对的距离连锁。

在一些实施例中，荧光信号或荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。这些荧光信号或荧光染料提供了可用于扩增反应的示例性组合物。

在其他实施例中，淬灭剂选自由以下组成的组：Dabcyl淬灭剂、Tamra淬灭剂、Qxl淬灭剂、Iowa BlackFQ淬灭剂、Iowa Black RQ淬灭剂、IR Dye QC-1淬灭剂、小沟结合淬灭剂、或Blackhole淬灭剂。这些淬灭剂提供了可用于扩增反应的示例性组合物。

在其他实施例中，使用合适的第二荧光DNA染料进行扩增反应，所述第二荧光DNA染料能够以流式细胞术可检测的浓度范围染色细胞DNA，并且具有可被实时热循环仪检测的荧光发射光谱。本领域普通技术人员应该理解，其他核酸染料是已知的并且正在不断被鉴定。可以使用具有合适激发和发射光谱的任何合适的核酸染料，如

SYTOX

SYBR Green

和

在一个实施例中，第二荧光DNA染料是

以小于10μM、小于4μM或小于2.7μM使用。这些染料提供了可用于扩增反应的示例性组合物。

例如，可以用荧光染料(例如，FAM、VIC和MGBNFQ)标记靶标特异性引物和探针，这可以快速量化靶标特异性荧光信号。可以在预定数量的循环后测量PCR产物，例如，当反应处于早期指数阶段时。

在一些实施例中，标记包括荧光染料(例如，罗丹明染料(例如，R6G、R110、TAMRA、ROX等)、荧光素染料(例如，JOE、VIC、TET、HEX、FAM等)、卤代荧光素染料、花菁染料(例如，CY3、CY3.5、CY5、CY5.5等)、

染料(例如，FL、530/550、TR、TMR等)、Alexa

染料(例如，488、532、546、568、594、555、653、647、660、680等)、二氯罗丹明染料、能量转移染料(例如，

v 1染料、

v 2染料、

v 3染料等)、Lucifer染料(例如，Lucifer黄等)、Cascade

Oregon

等。荧光染料可以在扩增过程中通过它们发射的激发和/或发射光谱来区分和测量。

在一个实施例中，PCR测定方法可以包括将PCR反应混合物加载到PCR测定管中，其中该PCR反应混合物包含具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶、脱氧核苷酸、缓冲液、第一和第二正向引物、第一和第二反向引物、第一和第二探针、以及多核苷酸样品，并且其中第一探针和第二探针包含具有可区分激发/发射光谱的荧光染料；以及在扩增条件下进行一个或多个扩增步骤，使得聚合酶的5’至3’核酸酶活性切割第一和第二探针，从而释放包含可区分激发/发射光谱的荧光染料。

本主题公开的组合物和方法可用于特定扩增测定，如合子型测定。例如，已经开发了一种终点PCR测定，用于测试含有N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜的合子型。该测定能够对具有N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜种质进行大规模和高通量筛选。该测定还将增加使用N7/N16同源染色体相互易位***开发甘蓝型油菜品系的规模。

在一个实施例中，用于确定甘蓝型油菜中N7/N16同源染色体相互易位的合子型的方法包括：a)使用第一探针、第一正向引物和第一反向引物对来自甘蓝型油菜的多核苷酸样品进行第一PCR测定；b)使用第二探针、第二正向引物和第二反向引物对来自甘蓝型油菜的多核苷酸样品进行第二PCR测定；c)量化第一和第二探针；以及d)比较量化的第一和第二探针以确定合子型。在一个实施例中，探针被可检测地标记。在一个实施例中，引物和探针对甘蓝型油菜中的N7/N16同源染色体相互易位具有特异性。在一个实施例中，本文提供了探针序列：以SEQ ID NO:21-137提供DHN16探针序列；以SEQ ID NO:138-254提供DHN7探针序列；以SEQ ID NO:255-371提供NSN16探针序列；以SEQ ID NO:372-488提供NSN7探针序列。在一个实施例中，本文提供了引物序列：以SEQ ID NO:489-2990、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15提供DHN7引物序列；以SEQ ID NO:2991-5492、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19提供DHN16引物序列；以SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16提供NSN7引物序列；并且以SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:20提供NSN16引物序列。

本主题公开的组合物和方法可用于特定扩增测定，如检测由N7/N16同源染色体相互易位导致的性状渗入的测定。例如，已经开发了一种终点PCR测定，用于测试含有N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜的合子型。该测定能够对具有N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜种质进行大规模和高通量筛选。该测定还将增加使用N7/N16同源染色体相互易位***开发甘蓝型油菜品系的规模。通过检测N7/N16同源染色体相互易位，可以通过该测定来检测在约1百万碱基对、950千碱基对、900千碱基对、850千碱基对、800千碱基对、750千碱基对、700千碱基对、650千碱基、600千碱基对、550千碱基对、500千碱基对、450千碱基对、400千碱基对、350千碱基对、300千碱基对、250千碱基对、200千碱基对、150千碱基对、100千碱基对、90千碱基对、80千碱基对、70千碱基对、60千碱基对、50千碱基对、40千碱基对、30千碱基对、20千碱基对、10千碱基对、9千碱基对、8千碱基对、7千碱基对、6千碱基对、5千碱基对、4千碱基对、3千碱基对、2千碱基对、1千碱基对、750个碱基对、或500个碱基对内的任何关联性状(天然或转基因)。本领域技术人员将理解，在得到易位后，连锁性状将保持与N7/N16染色体区域连锁，并且当N7/N16染色体区域在甘蓝型油菜基因组内易位时用以检测它的测定将指示存在任何连锁性状。特别地，其中如本公开中提供的，鉴定N7/N16染色体易位的断点。

用于渗入的性状

在一些实施例中，检测甘蓝型油菜中N7/N16同源染色体相互易位的测定可用于通过甘蓝型油菜育种程序检测性状(天然和转基因)的渗入。

可以用本主题公开的甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位测定来检测目的天然性状。适用于本公开的构建体的目的示例性天然性状包括但不限于赋予如下的编码序列：(1)有害生物抗性或疾病抗性、(2)对除草剂的耐受性、(3)添加农学性状的价值，诸如；产量提高、氮利用效率、水利用效率和营养品质，(4)蛋白质以位点特异性方式与DNA结合，(5)表达小RNA；以及(6)选择性标记。根据一个实施例，甘蓝型油菜N7/N16同源染色体基因座进一步与编码赋予杀昆虫抗性、除草剂耐受性、小RNA表达、氮利用效率、水利用效率、或营养品质的基因产物的至少一个其他天然性状编码序列堆叠。

目的天然性状可以包括基因和性状，可以使用近红外反射光谱等技术对种子进行评估。

可以用本主题公开的甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位测定来检测目的转基因。适用于本公开的构建体的目的示例性转基因包括但不限于赋予如下的编码序列：(1)有害生物抗性或疾病抗性、(2)对除草剂的耐受性、(3)添加农学性状的价值，诸如；产量提高、氮利用效率、水利用效率和营养品质，(4)蛋白质以位点特异性方式与DNA结合，(5)表达小RNA；以及(6)选择性标记。根据一个实施例，甘蓝型油菜N7/N16同源染色体基因座进一步与编码选择性标记或赋予杀昆虫抗性、除草剂耐受性、小RNA表达、氮利用效率、水利用效率、或营养品质的基因产物的至少一个其他转基因/异源编码序列堆叠。

1.抗昆虫性

各种抗昆虫性基因可以进一步与甘蓝型油菜N7/N16同源染色体基因座堆叠。甘蓝型油菜的N7/N16同源染色体基因座可以与至少一个含有抗昆虫性基因的其他基因表达盒可操作地连接。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性抗昆虫性编码序列是本领域已知的。作为可与本主题公开的调控元件可操作地连接的抗昆虫性编码序列的实施例，提供以下性状。提供示例性鳞翅目抗昆虫性的编码序列包括：cry1A；cry1A.105；cry1Ab；cry1Ab(截短的)；cry1Ab-Ac(融合蛋白)；cry1Ac(作为

销售)；cry1C；cry1F(作为

销售)；cry1Fa2；cry2Ab2；cry2Ae；cry9C；mocry1F；pinII(蛋白酶抑制剂蛋白)；vip3A(a)；和vip3Aa20。提供示例性鞘翅目抗昆虫性的编码序列包括：cry34Ab1(作为

销售)；cry35Ab1(作为

销售)；cry3A；cry3Bb1；dvsnf7；和mcry3A。提供示例性多重抗昆虫性的编码序列包括ecry31.Ab。以上抗昆虫性基因的列表并不意味着具有限制性。本公开涵盖任何抗昆虫性基因。

2.除草剂耐受性

各种除草剂耐受基因可以进一步与甘蓝型油菜N7/N16同源染色体基因座堆叠。甘蓝型油菜的N7/N16同源染色体基因座可以与至少一个含有除草剂耐受基因的其他基因表达盒可操作地连接。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性除草剂耐受性编码序列是本领域已知的。作为可与本主题公开的调控元件可操作地连接的除草剂耐受性编码序列的实施例，提供以下性状。草甘膦除草剂通过抑制EPSPS酶(5-烯醇式丙酮酸莽草酸酯-3-磷酸合酶)的作用模式。该酶参与植物的生长和发育必不可少的芳香氨基酸的生物合成。本领域已知的多种酶促机制可用于抑制该酶。可以将编码此类酶的基因可操作地连接到本主题公开的基因调控元件。在一个实施例中，选择性标记基因包括但不限于编码草甘膦抗性基因的基因，包括：突变型EPSPS基因，如2mEPSPS基因、cp4 EPSPS基因、mEPSPS基因、dgt-28基因；aroA基因；和草甘膦降解基因，如草甘膦乙酰基转移酶基因(gat)和草甘膦氧化酶基因(gox)。这些性状目前作为Gly-Tol^TM、

GT和Roundup

销售。草铵膦和/或双丙氨磷化合物的抗性基因包括dsm-2、bar和pat基因。bar和pat性状目前作为

销售。还包括提供对2,4-D的抗性的耐受性基因，如aad-1基因(应注意，aad-1基因对芳氧基苯氧基丙酸酯除草剂具有进一步的活性)和aad-12基因(应注意aad-12基因对乙酰氧基乙酸酯合成植物生长素具有进一步的活性)。这些性状作为

作物保护技术销售。ALS抑制剂(磺酰脲类、咪唑啉酮类、***并嘧啶类、嘧啶基硫代苯甲酸酯类、和磺酰基氨基-羰基-***啉酮类)的抗性基因是本领域已知的。这些抗性基因最通常是由点突变为ALS编码基因序列引起的。其他的ALS抑制剂抗性基因包括hra基因、csr1-2基因、Sr-HrA基因和surB基因。一些性状以商品名

销售。抑制HPPD的除草剂包括吡唑啉酮，如苄草唑、吡草酮和苯吡唑草酮；三酮，如硝磺草酮、磺草酮、环磺酮、苯并双环酮；和二酮腈，如异噁唑草酮。已知性状可以耐受这些示例性HPPD除草剂可。HPPD抑制剂的实例包括hppdPF_W336基因(用于抗异噁唑草酮)和avhppd-03基因(用于抗甲基磺草酮)。奥昔尼除草剂耐受性状的实例包括bxn基因，该基因已被证明对除草剂/抗生素溴苯腈具有抗性。麦草畏的抗性基因包括麦草畏单加氧酶基因(dmo)，如国际PCT公开号WO 2008/105890中所公开的。PPO或PROTOX抑制剂型除草剂的抗性基因(例如氟锁草醚、氟丙嘧草酯、氟丙草酯、戊基噁唑酮、唑草酮、异丙吡草酯、吡草醚、苯草醚、唑啶草酮、丙炔氟草胺、氟烯草酸、治草醚、乙氧氟草醚、乳氟禾草灵、氟磺胺草醚、乙羧氟草醚、和甲磺草胺)是本领域已知的。赋予对PPO的抗性的示例性基因包括过表达野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)PPO酶(Lermontova I和GrimmB,(2000)Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX oxidase leads toresistance to the diphenyl-ether herbicide acifluorfen[质体原卟啉原IX氧化酶的过表达导致了对二苯基醚除草剂酸氟芬的抗性].Plant Physiol[植物生理学]122:75-83.)、枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)PPO基因(Li,X.和Nicholl D.2005.Development ofPPOinhibitor-resistant cultures and crops[PPO抑制剂抗性培养物和作物的开发].PestManag.Sci.[有害生物管理科学]61:277-285以及Choi KW,Han O,Lee HJ,Yun YC,MoonYH,Kim MK,Kuk YI,Han SU和Guh JO,(1998)Generation ofresistance to the diphenylether herbicide,oxyfluorfen,via expression of the Bacillus subtilisprotoporphyrinogen oxidase gene in transgenic tobacco plants[通过在转基因烟草植物中表达枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶基因来产生对二苯基醚除草剂氧氟芬的抗性].Biosci BiotechnolBiochem[生物科学、生物技术和生物化学]62:558-560)。吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮的抗性基因包括编码ACCase抑制剂的基因(例如Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3)。赋予对环己二酮和/或芳氧基苯氧基丙酸的抗性的示例性基因包括吡氟氯禾灵、禾草灵、精噁唑禾草灵酸、吡氟禾草灵和喹禾灵。最后，除草剂可以抑制光合作用，包括三嗪或苄腈，通过psbA基因(对三嗪的耐受性)、1s+基因(对三嗪的耐受性)和腈水解酶基因(对苯甲腈的耐受性)提供了耐受性。以上除草剂耐受性基因的列表并不意味着具有限制性。本公开涵盖任何除草剂耐受性基因。

3.农学性状

各种农学性状基因可以进一步与甘蓝型油菜N7/N16同源染色体基因座堆叠。甘蓝型油菜的N7/N16同源染色体基因座可以与至少一个含有农学性状基因的其他基因表达盒可操作地连接。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性农学性状编码序列是本领域已知的。作为可与本主题公开的调控元件可操作地连接的农学性状编码序列的实施例，提供以下性状。pg基因提供的延迟的果实软化抑制了导致细胞壁中果胶分子分解的聚半乳糖醛酸酶的产生，从而导致了果实的延迟软化。此外，延迟的acc基因果实成熟/衰老抑制了天然acc合酶基因的正常表达，导致乙烯产量减少和果实成熟延迟。而accd基因代谢果实成熟激素乙烯的前体，导致果实成熟延迟。可替代地，sam-k基因通过减少S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(乙烯生产的底物)而导致延迟成熟。cspB基因提供的干旱胁迫耐受表型通过保持RNA稳定性和翻译来维持水分胁迫条件下的正常细胞功能。另一个实例包括EcBetA基因，其催化渗透保护剂化合物甘氨酸甜菜碱的产生，赋予了对水分胁迫的耐受性。另外，RmBetA基因催化渗透保护剂化合物甘氨酸甜菜碱的产生，赋予了对水分胁迫的耐受性。bbx32基因提供光合作用和增产，该基因表达一种蛋白质，该蛋白质与一种或多种内源性转录因子相互作用以调节植物的昼/夜生理过程。可以通过表达编码热稳定的α-淀粉酶的amy797E基因来增加乙醇产量，该酶可以通过增加用于降解淀粉的淀粉酶的热稳定性来增强生物乙醇的产量。最后，修饰的氨基酸组合物可以通过编码二氢二吡啶甲酸合酶的cordapA基因的表达而产生，该酶增加了氨基酸赖氨酸的产生。农学性状编码序列的列表并不意指是限制性的。本公开涵盖任何农学性状编码序列。

4.DNA结合蛋白

各种DNA结合转基因/异源编码序列基因/异源编码序列可以进一步与甘蓝型油菜N7/N16同源染色体基因座堆叠。甘蓝型油菜的N7/N16同源染色体基因座可以与至少一个含有DNA结合基因的其他基因表达盒可操作地连接。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性DNA结合蛋白编码序列是本领域已知的。作为可与本主题公开的调控元件可操作地连接的DNA结合蛋白编码序列的实施例，以下类型的DNA结合蛋白可包括：锌指、TALEN、CRISPR和大范围核酸酶。DNA结合蛋白编码序列的列表并不意指是限制性的。本公开涵盖任何DNA结合蛋白编码序列。

5.小RNA

各种小RNA序列可以进一步与甘蓝型油菜N7/N16同源染色体基因座堆叠。甘蓝型油菜的N7/N16同源染色体基因座可以与至少一个含有小RNA序列的其他基因表达盒可操作地连接。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性小RNA性状是本领域已知的。作为可与本主题公开的调控元件可操作地连接的小RNA编码序列的实施例，提供以下性状。例如，通过使编码乙烯形成酶的ACO基因沉默而抑制乙烯的产生，抗efe小RNA的延迟果实成熟/衰老延迟了成熟。通过抑制内源性S-腺苷-L-蛋氨酸，改变了ccomt小RNA的木质素产生，从而降低了胍基(G)木质素的含量：反式咖啡酰氧基CoA 3-O-甲基转移酶(CCOMT基因)。此外，可通过Ppo5小RNA降低疣状茄(Solanumverrucosum)中的黑斑瘀伤耐受性，所述Ppo5小RNA触发Ppo5转录物的降解，从而阻止黑斑瘀伤的发展。还包括dvsnf7小RNA，其dsRNA包含西方玉米根虫Snf7基因的240bp片段，可抑制西方玉米根虫。修饰的淀粉/碳水化合物可以由小RNA产生，如pPhL小RNA(降解PhL转录物以限制通过淀粉降解形成还原糖)和pR1小RNA(降解R1转录物以限制通过淀粉降解形成还原糖)。另外，益处还包括asn1小RNA引起的丙烯酰胺含量降低，所述asn1小RNA触发Asn1降解从而损害天冬酰胺的形成并降低了聚丙烯酰胺含量。最后，pgas ppo抑制小RNA的非褐色表型导致抑制PPO以产生具有非褐色表型的苹果。以上小RNA的列表并不意指是限制性的。本公开涵盖任何小RNA编码序列。

6.选择性标记

也被描述为报告基因的各种选择性标记可以进一步与甘蓝型油菜N7/N16同源染色体基因座堆叠。甘蓝型油菜的N7/N16同源染色体基因座可以与至少一个含有报告基因的其他基因表达盒可操作地连接。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。有许多方法可用于确认选择性标记在转化植物中的表达，包括例如DNA测序和PCR(聚合酶链式反应)、DNA印迹、RNA印迹、用于检测从载体表达的蛋白质的免疫学方法。但是，通常通过目测观察蛋白质来观察报告基因，这些蛋白质在表达时会产生有色产物。示例性的报告基因是本领域已知的，并编码β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP、Phi-YFP)、红色荧光蛋白(DsRFP、RFP等)、β-半乳糖苷酶等(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第三版,冷泉港出版社,纽约,2001，其内容通过引以其整体并入本文)。

利用选择性标记基因来选择经转化的细胞或组织。选择性标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)、壮观霉素/链霉素抗性(AAD)和潮霉素磷酸转移酶(HPT或HGR)的基因，以及赋予对除草化合物抗性的基因。除草剂抗性基因通常编码对除草剂不敏感的修饰靶标蛋白，或编码在其起作用之前能降解植物中的除草剂或使其解毒的酶。例如，已经通过使用编码突变型目标酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸酯-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因获得了对草甘膦的抗性。EPSPS的基因和突变型是熟知的，并且在下面进一步描述。通过使用编码PAT或DSM-2、腈水解酶、AAD-1或AAD-12(这些都是使其对应的除草剂去毒的蛋白质的实例)的细菌基因分别获得了对草铵膦、溴苯腈和2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性。

在一个实施例中，除草剂可抑制生长点或分生组织，包括咪唑啉酮或磺酰脲，并且对这些除草剂具有乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的抗性/耐受性的基因是众所周知的。草甘膦抗性基因包括突变型5-烯醇式丙酮酸莽草酸酯-3-磷酸合酶(EPSP)和dgt-28基因(通过引入重组核酸和/或对天然EPSP基因进行多种体内诱变)、aroA基因和草甘膦乙酰基转移酶(GAT)基因。其他膦酰基化合物的抗性基因包括来自链霉菌物种的bar和pat基因，包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和产绿色链霉菌(Streptomycesviridichromogenes)，以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(编码ACCase抑制剂的基因)。赋予对环己二酮和/或芳氧基苯氧基丙酸的抗性的示例性基因(包括吡氟氯禾灵、禾草灵、精恶唑禾草灵酸、吡氟禾草灵和喹禾灵)包括乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的基因；Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3。在一个实施例中，除草剂可以抑制光合作用，包括三嗪(psbA和1s+基因)或苄腈(硝化酶基因)。此外，此类选择性标记可以包括阳性选择标记，如磷酸甘露糖异构酶(PMI)酶。

在一个实施例中，选择性标记基因包括但不限于编码如下的基因：2,4-D；新霉素磷酸转移酶II；氰酰胺水合酶；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶；色氨酸脱羧酶；二氢吡啶二羧酸合酶和脱敏天冬氨酸激酶；bar基因；色氨酸脱羧酶；新霉素磷酸转移酶(NEO)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)；二氢叶酸还原酶(DHFR)；草丁膦乙酰转移酶；2,2-二氯丙酸脱卤素酶；乙酰羟酸合成酶；5-烯醇式丙酮酸-莽草酸酯-磷酸合酶(aroA)；卤代芳基腈水解酶；乙酰辅酶A羧化酶；二氢蝶呤合酶(sul I)；和32kD光***II多肽(psbA)。一个实施例还包括选择性标记基因，其编码对以下的抗性：氯霉素；甲氨蝶呤；潮霉素；壮观霉素；溴草腈；草甘膦；和草丁膦。以上选择性标记基因的列表并不意在是限制性的。本公开涵盖任何报告基因或选择性标记基因。

在一些实施例中，合成编码序列以在植物中最佳表达。例如，在一个实施例中，已经通过密码子优化修饰了基因的编码序列以增强在植物中的表达。可以优化杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、或选择性标记转基因/异源编码序列，以在特定植物物种中表达，或可替代地可以修饰上述转基因/异源编码序列以在双子叶或单子叶植物中最佳表达。植物偏好性密码子可以从特定目的植物物种中以最大量表达的蛋白质中频率最高的密码子确定。在一个实施例中，编码序列、基因、异源编码序列或转基因/异源编码序列被设计成在植物中以更高的水平表达，从而导致更高的转化效率。植物基因优化的方法是众所周知的。关于合成DNA序列的优化和产生的指导可以在例如WO 2013016546、WO 2011146524、WO 1997013402、美国专利号6166302和美国专利号5380831(通过引用并入本文)中找到。

分子确认

确认甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位的方法是本领域已知的。例如，可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)实现对甘蓝型油菜中N7/N16同源染色体相互易位的检测。通过使用多态性的多态区段侧翼的两个寡核苷酸引物进行PCR检测，然后进行DNA扩增。该步骤包括DNA热变性，然后在低温下将引物退火至它们的互补序列，并用DNA聚合酶延伸退火的引物的重复循环。扩增后在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上对DNA片段进行大小分离是该方法的主要部分。此类选择和筛选方法是本领域技术人员熟知的。可用于鉴定转基因植物的分子确认方法是本领域技术人员已知的。下面进一步描述几种示例性方法。

已经描述了用于序列检测中的分子信标。简而言之，设计了一种FRET寡核苷酸探针，该探针与侧翼基因组和***DNA连接重叠。FRET探针的独特结构导致它含有一个二级结构，该二级结构使荧光和淬灭部分保持紧密相邻。FRET探针和PCR引物(***DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定的聚合酶和dNTP存在下循环。成功进行PCR扩增后，一种或多种FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构的去除以及荧光和淬灭部分的空间分离。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交，存在侧翼基因组/转基因***序列。用于检测扩增反应的这种分子信标测定是本主题公开的一个实施例。

水解探针测定，或者称为

(生命技术公司(Life Technologies)，福斯特城，加利福尼亚州)，是检测和定量DNA序列的存在的方法。简而言之，设计了一种FRET寡核苷酸探针，在转基因中有一个寡核苷酸，在侧翼基因组序列中有一个寡核苷酸，用于事件特异性检测。FRET探针和PCR引物(***DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定的聚合酶和dNTP存在下循环。FRET探针的杂交导致荧光部分的裂解和释放，使其远离FRET探针上的淬灭部分。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交，侧翼/转基因***序列的存在。用于检测扩增反应的这种水解探针测定是本主题公开的实施例。

测定是一种检测和定量DNA序列存在的方法。简单地说，包含集成的基因表达盒的多核苷酸的基因组DNA样品，使用聚合酶链式反应(PCR)为基础的测定(被称为

测定***)筛选。在本主题公开的实践中使用的

测定可以利用其中包含多个引物的

PCR测定混合物。PCR测定混合物中使用的引物可包含至少一种正向引物和至少一种反向引物。正向引物含有对应于DNA多核苷酸的特定区域的序列，而反向引物含有对应于基因组序列的特定区域的序列。另外，在PCR测定混合物中使用的引物可以包含至少一种正向引物和至少一种反向引物。例如，

PCR测定混合物可使用对应于两个不同的等位基因和一个反向引物的两种正向引物。正向引物之一含有对应于内源基因组序列的特定区域的序列。第二正向引物含有对应于DNA多核苷酸的特定区域的序列。反向引物含有对应于基因组序列的特定区域的序列。用于检测扩增反应的这种

测定是本主题公开的一个实施例。

在一些实施例中，荧光信号或荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。

在其他实施例中，使用合适的第二荧光DNA染料进行扩增反应，所述第二荧光DNA染料能够以流式细胞术可检测的浓度范围染色细胞DNA，并且具有可被实时热循环仪检测的荧光发射光谱。本领域普通技术人员应该理解，其他核酸染料是已知的并且正在不断被鉴定。可以使用具有适当的激发和发射光谱的任何合适的核酸染料，如

SYTOX

SYBR Green

和

在另外的实施例中，下一代测序(NGS)可以用于检测。如Brautigma等人,2010所述，DNA序列分析可用于确定分离和扩增片段的核苷酸序列。可将扩增的片段分离并亚克隆到载体中，并使用链终止子方法(也称为Sanger测序)或染料终止子测序进行测序。另外，扩增子可以用下一代测序进行测序。NGS技术不需要亚克隆步骤，并且可以在单个反应中完成多个测序读取。可商购获得三个NGS平台，来自454生命科学公司(Life Sciences)/罗氏公司(Roche)的基因组测序仪FLX^TM，来自Solexa的Illumina Genome Analyser^TM和应用生物***公司(AppliedBiosystems)的SOLiD^TM(‘通过寡核苷酸连接和检测进行测序’的首字母缩略词)。另外，目前正在开发两种单分子测序方法。这些包括来自Helicos Bioscience^TM的真正的单分子测序(tSMS)和来自太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)的SingleMolecule Real Time^TM测序(SMRT)。

由454生命科学公司(Life Sciences)/罗氏公司(Roche)销售的基因组测序仪FLX^TM是长读NGS，它使用乳液PCR和焦磷酸测序来生成测序读段。可以使用300-800bp的DNA片段或含有3-20kb的文库。该反应每次运行可产生超过一百万个约250至400个碱基的读段，总产量为250至400兆碱基。与其他NGS技术相比，该技术可产生最长的读段，但每次运行的总序列输出较低。

Solexa^TM销售的Illumina Genome Analyser^TM是短读NGS，其使用荧光染料标记的可逆终止子核苷酸通过合成方法并基于固相桥式PCR测序。可以使用含有最多10kb DNA片段的配对末端测序文库的构建。反应产生超过1亿个短读段，长度为35-76个碱基。每次运行可产生30-60亿碱基的数据。

Applied Biosystems^TM销售的寡核苷酸连接和检测测序(SOLiD)***是一种短读段技术。这种NGS技术使用的片段双链DNA最长10kb。该***通过连接染料标记的寡核苷酸引物和乳液PCR进行测序，以产生10亿个短读段，每次运行的总序列输出高达300亿碱基。

Helicos Bioscience^TM的tSMS和Pacific Biosciences^TM的SMRT采用了不同的方法，其使用单个DNA分子进行序列反应。tSMS Helicos^TM***可产生多达8亿个短读段，每次运行可产生210亿碱基。这些反应使用荧光染料标记的虚拟终止子核苷酸完成，所述核苷酸被称为’合成测序’方法。

Pacific Biosciences^TM销售的SMRT下一代测序***使用合成实时测序。由于不受可逆终止子的限制，该技术可以产生高达1,000bp的读段长度。每天使用该技术可以产生相当于二倍体人类基因组覆盖率一倍的原始读段吞吐量。

植物组合物和育种

在其他实施例中，本主题公开提供了包含甘蓝型油菜N7/N16同源染色体相互易位的细胞、组织或植物。在一些实施例中，根据公开的甘蓝型油菜的细胞、组织或植物包括但不限于甘蓝型油菜的任何品种或品系。因此，根据所提供的主题公开选择甘蓝型油菜的任何品种或品系。在实施例中，甘蓝型油菜是指油菜籽(rapeseed)、油籽油菜(oilseedrape)、油菜(rape)或卡诺拉油菜(canola)的通用名称。在一些实施例中，甘蓝型油菜品种或品系的遗传背景可能不同。

在另外的实施例中，本主题公开提供了包含N7/N16同源染色体相互易位的种子。在随后的实施例中，提供了来自甘蓝型油菜的种子。甘蓝型油菜种子可以由三个结构部分组成：(1)外壳，即保护性外覆盖物；以及(2)胚芽(也包括子叶)。

本主题公开还涉及一个或多个甘蓝型油菜植物部分。甘蓝型油菜植物部分包括植物细胞、植物原生质体、可从中再生植物的植物细胞组织培养物、植物DNA、植物愈伤组织、植物丛生物和植物中的完整植物细胞或植物部分，如胚、花粉、胚珠、花、种子、叶、根、根尖、花药等。

在随后的实施例中，本主题公开涉及包含N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜细胞。在其他实施例中，本主题公开涉及包含N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜植物部分。在另外的实施例中，本主题公开涉及包含N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜植物组织。在其他实施例中，本主题公开涉及包含N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜植物。在一些实施例中，本主题公开涉及包含N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜种子。

本主题公开的一个实施例提供了一种生产包含N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜的方法，该方法包括以下步骤：a)将母本植物与父本植物杂交；b)从(a)的杂交中收获后代种子；c)种植后代种子；以及，d)培养后代种子，其中后代种子包含N7/N16同源染色体相互易位。

在其他实施例中，本主题公开涉及作为甘蓝型油菜植物的雌性和雄性亲本植物。在另外的实施例中，父本植物与母本植物同基因。在实施例的一个方面，父本植物对于N7/N16同源染色体相互易位是纯合的或杂合的。在实施例的另一方面，母本植物对于N7/N16同源染色体相互易位是纯合的或杂合的。

在本主题公开的又另一个方面，提供了产生后代植物的过程，该过程通常包括将第一亲本植物与第二亲本植物杂交，其中第一亲本植物或第二亲本植物中的至少一者包含N7/N16同源染色体相互易位。这些过程可以进一步举例说明为产生后代种子或植物的过程，其中第一植物与第二植物杂交。

每当雄性植物与另一种不同的近交植物杂交时，就会产生后代或第一代(F₁)杂交植物。因此，可以通过将第一植物与任何第二近交植物杂交来产生后代或F₁杂交植物。因此，包含以第一亲本植物作为亲本产生的N7/N16同源染色体相互易位的任何后代或F₁杂交植物或种子是本主题公开的实施例。

在本公开的实施例中，“杂交”甘蓝型油菜植物的步骤包括种植第一近交甘蓝型油菜植物和不同的第二近交甘蓝型油菜植物的种子(优选地可邻近传粉)。在其他实施例中，“杂交”甘蓝型油菜植物的步骤包括种植、将第一近交甘蓝型油菜植物的花粉人工授粉到不同的第二近交甘蓝型油菜植物。

在一个实施例中，将包含N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜植物用种植者认为合适的一种或多种农用化学品处理。

进一步的步骤包括从接受花粉的植物中收获接近成熟或成熟的种子。在一个特定的实施例中，从母本植物收获种子，并且当需要时，可以使收获的种子生长以产生后代或第一代(F₁)杂交植物。

又另一个步骤包括干燥和调理种子，包括种子处理、分选(分级)以及包装出售给种植者以生产油和谷物。与近交种子一样，可能希望用组合物处理杂交种子，使种子和由其生长的幼苗在暴露于不利条件时更加耐寒。应该提到的是，所得的后代或杂交种子可以出售给种植者用于生产油和谷物，而不是用于育种或种子生产。

更进一步，本主题公开提供了一种通过使所收获的在包含N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜植物上产生的种子生长而产生的后代植物，以及后代植物产生的谷物。

在其他实施例中，本主题公开涉及一种产生后代植物的方法，该方法进一步包括以下步骤：e)将后代植物与包含所需性状的另一植物杂交以产生F1后代植物；f)选择具有所需性状的F1后代植物以产生选择的F1后代植物；g)将选择的F1后代植物与包含N7/N16同源染色体相互易位植物的后代甘蓝型油菜植物杂交以产生回交后代植物；h)选择具有所需性状的回交后代植物；并且，i)连续重复步骤(g)和(h)三次或更多次以产生包含所需性状的选择的第四或更高代回交后代植物。

可以使用各种育种方案来产生后代植物。在一种通常称为系谱法的方法中，亲本可以与另一种不同的植物杂交，该不同的植物诸如第二近交亲本植物，其本身表现出选择的一种或多种所需特征或将选择的一种或多种所需特征赋予杂交组合。如果两个原始亲本植物不提供所有希望的特征，则其他来源可以包括在育种群体中。纯种育种、纯合子近交品系的后代植物也可以用作育种的起始材料或从中开发后代植物的源群体。

此后，收获所得的种子，并在随后的世代(如约五代到约七代或更多代)中选择所得的优良后代植物并进行自交或同胞交配，直到产生如下的一代，该代不再因自交亲本不同的基本所有因素而分离，从而提供了大量独特的纯育种自交系。

在用于产生后代植物的另一个实施例中，通常称为回交，一个或多个期望性状可通过将亲本植物与另一植物(称为供体或非轮回亲本)杂交而引入亲本，该另一植物携带编码一种或多种特定性状的一种或多种基因以产生F₁后代植物。显性和隐性等位基因都可以通过回交进行转移。供体植物也可以是近交系，但在最广义上可以是与轮回亲本杂交可育的任何植物品种或群体的成员。接下来，选择具有所需性状的F₁后代植物。然后，选择的后代植物与亲本或恢复可育亲本杂交以产生回交后代植物。此后，选择包含所需性状以及亲本的生理和形态特征的回交后代植物。该循环重复约一至约八个循环，优选连续约三次或更多次，以产生选择的更高代回交后代植物，当在相同环境中生长时，这些回交后代植物包含亲本的所需性状和所有生理和形态特征。一个或多个示例性所需性状包括抗昆虫性、增强的营养品质、抗除草剂性、产量稳定性、产量增加和对细菌、真菌和病毒疾病的抗性。植物育种领域的普通技术人员将理解育种者使用各种方法来帮助确定应该从分离群体中选择哪些植物以及最终将使用哪些自交系来开发用于商业化的杂种。除了种质知识和育种者使用的其他技能外，选择过程的一部分取决于实验设计以及统计分析的使用。使用实验设计和统计分析来帮助确定哪些植物、哪个植物家族以及最终哪些自交系和杂交组合对于一种或多种目的性状显著更好或有差异。使用实验设计方法来评估误差，以便更准确地确定两个自交系或两个杂交系之间的差异。统计分析包括计算平均值、确定变异源的统计显著性以及计算适当的方差分量。通常使用百分之五或百分之一的显著性水平来确定给定性状所发生的差异是真实的还是由于环境或实验误差造成的。植物育种领域的普通技术人员将知道如何评估两种植物品种的性状以确定这些品种所表达的两种性状之间是否没有显著差异。例如，参见Fehr,Walt,Principles ofCultivar Development[栽培品种开发原则],第261-286页(1987)，将其通过引用并入本文。可使用平均性状值来确定性状差异是否显著，并且优选地在相同环境条件下生长的植物上测量性状。

该方法导致产生具有轮回亲本的基本上所有期望的形态学和生理学特征以及一种或多种特定目的转移性状的后代近交植物。因为这样的后代近交植物对于控制该一种或多种目的转移性状的基因座是杂合的，最后回交代随后将自交以提供一种或多种转移性状的纯育种后代。

在用于产生后代植物的其他实施例中，本主题公开涉及产生从甘蓝型油菜花粉粒产生的双单倍体植物，其中双单倍体植物包含N7/N16同源染色体相互易位。本领域技术人员将理解，花粉粒衍生胚可以由从甘蓝型油菜的花药获得的花粉粒产生。由经历减数***的花粉母细胞形成的这些花粉粒产生胚芽并在之后形成成熟植物(通过在适当的培养基上维持，然后转移到土壤中)。花粉粒是单倍体细胞。本领域技术人员将理解，在一些情况下，单倍体细胞可在有丝***后自发产生一个或多个二倍体细胞。同样，本领域技术人员将理解，可以应用染色体加倍剂来增加单倍体细胞的倍性。在这样的实施例的方面，单倍体细胞变成二倍体细胞。这种二倍体细胞可以产生包含N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜植物。本公开的方法不依赖于染色体加倍的特定遗传机制。通常，本发明的诱导染色体加倍包括将有效量的染色体加倍剂施用于细胞，优选单倍体细胞。任何已知增加细胞倍性的剂都可以用于本主题公开的方法中。示例性且非限制性的染色体加倍剂包括但不限于氟乐灵、秋水仙碱、安磺灵、甲基胺草磷和拿草特。根据所需的结果，可以将染色体加倍剂施用于组织或其细胞，而通常是通过将加倍剂添加到培养基中直接施用于花粉粒。在该实施例的某些方面，在获得单倍体胚芽后施用有效量的染色体加倍剂。在该实施例的其他方面，在甘蓝型油菜发育的花粉粒阶段施用有效量的染色体加倍剂。因此，本主题公开提供了用于开发来自甘蓝型油菜花粉粒的包含N7/N16同源染色体相互易位的后代植物的方法和组合物。

在另外的实施例中，本主题公开涉及确定包含N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜植物中的重组遗传频率。在某些方面，使用由花粉粒产生的包含N7/N16同源染色体相互易位的双单倍体甘蓝型油菜植物来确定重组遗传频率。在其他方面，使用包含N7/N16同源染色体相互易位的子代甘蓝型油菜植物来确定重组遗传频率。在该实施例的一个方面，可以进行针对N7/N16同源染色体相互易位公开的测定以鉴定所公开的基因组序列内的连锁不平衡；例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4。来自这些基因组序列(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4)的多核苷酸的连锁可以使用本公开提供的方法和组合物进行测定，以确定与N7/N16同源染色体相互易位的相对遗传距离。在该实施例的一个方面，可以进行针对N7/N16同源染色体相互易位公开的测定以鉴定染色体7或染色体16上的任何甘蓝型油菜基因组序列内的连锁不平衡。可以使用本公开中提供的方法和组合物测定来自任何甘蓝型油菜基因组序列的多核苷酸在染色体7或染色体16上的连锁以确定与N7/N16同源染色体相互易位的相对遗传距离。在一些方面，由基因组序列测定的多核苷酸之间的连锁可以为与N7/N16同源染色体相互易位连锁、紧密连锁或极其紧密连锁。本领域技术人员将理解，来自本文所公开的基因组序列(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4)的任何多核苷酸序列与N7/N16同源染色体相互易位的断点的连锁可指多核苷酸显示出可测量的概率与N7/N16同源染色体一起在下一代中传递的现象。同样，本领域技术人员将理解，来自任何甘蓝型油菜基因组序列内的在染色体7或染色体16上的任何多核苷酸序列与N7/N16同源染色体相互易位的断点的连锁可指多核苷酸显示出可测量的概率与N7/N16同源染色体一起在下一代中传递的现象。因此，本领域技术人员将理解，一个多核苷酸序列与另一个多核苷酸序列的连锁可以被测量和/或表达为重组频率。当基因的存在对个体的表型有贡献时，与该基因相关的任何多核苷酸序列可以说与该表型连锁。因此，在本公开的一些方面，当N7/N16同源染色体相互易位的存在有助于个体中的表型时，本主题公开中提供的与该基因连锁的N7/N16同源染色体相互易位的多核苷酸序列可以说与该表型连锁。

在随后的实施例中，本公开涉及将所需性状引入甘蓝型油菜植物中，包括N7/N16同源染色体相互易位植物。在实施例的一个方面，所需性状选自由以下组成的组：天然性状或转基因性状，包括杀昆虫抗性性状、除草剂耐受性状、抗病性性状、产量增加性状、营养品质性状、农学增加性状以及它们的组合。

通过重复回交可以促进植物中所需性状的渗入。本文描述了通过涉及有性繁殖的常规植物育种生产具有N7/N16同源染色体相互易位的甘蓝型油菜植物的方法。方法可以包括将在基因组中包含性状的至少一个拷贝的第一亲本植物与第二亲本植物杂交，以产生F₁后代。第一植物可以是甘蓝型油菜的任何植物或品种。第二亲本植物可以是当与第一植物杂交时能够产生可存活后代植物(即种子)的任何植物。第一和第二亲本植物可以是相同的甘蓝型油菜品系或品种。该方法可以进一步包括自交F₁后代以产生F₂后代。方法可进一步涉及将F₁或F₂后代植物与和第一或第二亲本植物具有相同品系或基因型的植物回交的一代或多代。可替代地，第一次杂交或任何后续杂交的F₁后代可以与和第一或第二植物具有不同品系或基因型的第三植物杂交。

在一些实施例中，如本公开中所述，对后代植物进行基因型和/或合子型测定。一旦对后代植物进行了基因分型和/或确定了它们的合子型，本领域技术人员可以选择具有所需遗传组成的那些后代植物。此类选择的后代植物可用于进一步的杂交、自交或栽培。根据本公开的方法涉及的性状渗入方法减少或消除了不具有所需遗传组成的植物的栽培和/或繁殖，从而提供所需的可靠性和可预测性(通过预期的孟德尔遗传模式)。

可以通过使用未决申请的N7/N16同源染色体相互易位测定来加速回交，以鉴定具有来自轮回亲本的最大遗传互补序列的植物。

直接选择可以应用于单个基因座作为显性性状的情况，如除草剂抗性性状。对于这个选择过程，将初始杂交的后代在回交之前用除草剂喷洒。喷洒消除了任何不具有所需除草剂抗性特征的植物，并且只将那些具有除草剂抗性基因的植物用于随后的回交。在被转移的特征是隐性等位基因的情况下，可能需要对后代进行测试以确定所需的特征是否已成功转移。然后对所有其他回交代重复选择过程(无论是直接的还是间接的)。

本领域普通技术人员应当理解，可以将回交与系谱育种组合，其中亲本与另一株植物杂交，所得后代与亲本或恢复可育亲本回交，之后对该单一回交的所得后代进行后续自交，以发展新的自交系。当需要恢复的亲本特征少于通过常规回交获得的所有亲本特征时，回交和系谱育种的这种组合是有用的。

本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利和专利申请)均以与本公开的明确细节不矛盾的程度通过引用特此并入，并且并入程度如同每个参考文献是单独并且具体地指示通过引用并入并且在本文以其整体阐述一般。本文讨论的参考文献只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容不应解释为承认诸位发明人无权因在先发明而享有早于此类公开内容的权利。

在以下实例中进一步例示本主题公开的实施例。应当理解的是，这些实例仅是通过说明的方式给出的。从上述实施例和以下实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的本质特性，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可进行本公开的实施例的各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，从上述说明书来看，除了本文所示出和描述的那些之外，本公开的实施例的各种修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。以下内容以说明的方式提供，并不旨在限制本发明的范围。

实例

实例1：在甘蓝型油菜中发现和验证染色体N7/N16相互易位断点。

为了发现甘蓝型油菜中N7/N16染色体断点的位置，开发了用于甘蓝型油菜品系NS1822BC的一种基于单分子长读测序的端到端染色体组装。所得的品系NS1822BC参考遗传图谱揭示了N7/N16同源染色体相互易位的存在。使用NS1822BC基因组与公开可用的甘蓝型油菜品系DH12075基因组(不包含N7/N6同源染色体相互易位)的全局比对，首次鉴定了N7和N16染色体上两个断点的位置和序列。如本文所提供的，SEQ ID NO:4提供了与SEQ ID NO:3的染色体16的野生型序列相比，染色体16的N7/N16同源染色体相互易位的序列。如本文所提供的，SEQ ID NO:2提供了与SEQ ID NO:1的染色体7的野生型序列相比，染色体7的N7/N16同源染色体相互易位的序列。该分析得到了对N7/N16同源染色体相互易位的遗传和物理长度的精确估计(表1)。此外，发现近三分之一的N7染色体底端(在遗传空间中从65.8cM到染色体末端102.8cM的37cM区段和在DH12075基因组上从17580520bp到25458507bp的约7.8Mb物理区段)参与了N16染色体同源异形交换。类似地，N16染色体顶部的约9.8cM遗传区段(0-9.8cM)(在DH12075基因组上0-13653938bp的约8.1Mb物理区段)参与了N7染色体同源异形交换。这些交换的区段在含有N7/N16 HRT的个体中以倒置的方向定位。

接下来，在来自北美(NA)、澳大利亚(AU)和欧洲(EU)的优良种质系中评估和表征N7/N16同源染色体相互易位。根据该分析，确定N7/N16同源染色体相互易位在NA种质系中是固定的，在EU种质系中几乎不存在，并且在AU种质系中分离(表2)。

表1.N7/N16同源染色体相互易位断点的物理坐标

表2.种质鉴定

育种地理学	总品系	有易位的品系	无易位的品系
				澳大利亚春季型	145	47	98
欧洲冬季型	255	4	251
				北美春季型	434	400	34
总计	834	451	383

实例2：使用基于琼脂糖的PCR测定检测N7/N16同源染色体相互易位。

不包含N7/N16易位的公共DH12075品系的基因组序列被用于开发两种“野生型PCR测定”，以分别检测N7和N16染色***点处相互染色体交换的不存在。使用位于断点序列位点侧翼的引物(Primer3软件：可在互联网bioprod.phibred.com/primer3/cgi-bin/primer3_www.cgi上获得)设计这些测定(表3和表4)。当在(1％)琼脂糖凝胶上运行时，来自这些测定的PCR扩增产物产生了2,366bp的N7条带和1,963bp的N16条带，诊断为野生型构型或不存在N7/N16易位。

将包含N7/N16易位的专有NS1822BC品系的基因组序列用于开发分别在N7和N16上检测相互易位的两种PCR测定。这些测定是使用位于N7和N16染色体序列上的染色体交换点侧翼的引物开发的(表3和表4)。当在琼脂糖凝胶上运行时，这些测定产生的N7产物为1,828bp，N16产物为1,893bp，其将检测N7和N16相互重组的存在。

表3.使用基于琼脂糖的PCR测定检测N7/N16同源染色体相互易位中使用的序列ID和物理位置

表4.使用基于琼脂糖的PCR测定检测N7/N16同源染色体相互易位中使用的引物ID、物理位置和序列

在测试该PCR测定对于检测易位的存在或不存在的有效性时，使用NS1882BC(确认有易位)和DH12075(确认不包含易位)品系作为阳性和阴性对照。以20ul体积设置PCR反应，其中包含2ul DNA(约8ng)、4ul 100mM引物(2ul正向引物，2ul反向引物)、10ul Phusion GCMaster Mix^TM(飞世尔科技公司(Fisher Scientific))和4ul水。PCR条件如下：98℃30秒，然后是98℃10秒、61℃30秒和72℃120秒的35个循环，最后延伸72℃7分钟，最终无限保持在4℃。将PCR产物在1X TAE缓冲液(Omnipur TAE缓冲液，赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))中在含有Sybr Safe(Sybr Safe DNA凝胶染色^TM，优美缔公司(Unity))的1％琼脂糖凝胶(SeaKem GTG agarose^TM，龙沙公司(Lonza))上分离1h，并使用Alpha Imager利用底部照明板设置发射约530nm的光进行可视化和拍照。对凝胶图像进行评分，一(1)分表示存在相互易位，而零(0)分表示不存在相互易位。

实例3：使用高通量竞争性等位基因特异性PCR基因分型(KASPR^TM)测定检测N7/N16同源染色体相互易位

高通量标记极大地方便了大规模种质筛选和育种。使用N7和N16序列的断点位点设计了允许针对N7/N16同源染色体相互易位，将易位品系从非易位品系中检测出来的共显性测定。KASPAR^TM基因分型***由两部分组成：(1)SNP特异性检测(三种未标记引物的组合)，以及(2)通用反应混合物，其中包含所有其他必需的组分，包括通用荧光报告***和专门开发的Taq聚合酶。四种引物，等位基因特异性引物1(A1)、等位基因特异性引物2(A2)和两种通用引物(C1和C2)或反向引物(表5)，是使用工作流程管理器Kraken^TM(LGCGenomics，英国赫特福德郡霍德斯顿)的测定设计算法设计的。

表5.用于使用KASP^TM测定检测N7/N16同源染色体相互易位中的引物鉴定和物理位置：

使用LGC Genomics测定设计软件设计引物。因此，在测定混合物(约6ng)中使用1.5ul的约4ng/ul DNA，将12ul的100mM每种正向引物和30ul的100mM每种通用反向引物和16ul水混合，以制备每次测定。接下来，将13.6ul的测定与1000ul的KASP Master Mix^TM(LGCGenomics，英国赫特福德郡霍德斯顿)混合。Meridian^TM(LGC Genomics，英国赫特福德郡霍德斯顿)液体处理器将1.3ul混合物分配到含有约6ng无水DNA的1536板上。用Phusion^TM激光密封器(LGC Genomics，英国赫特福德郡霍德斯顿)密封板，并使用英国赫特福德郡霍德斯顿LGC Genomics^TM水循环仪在以下条件下进行热循环：95℃15分钟，95℃20秒、61℃逐步降至55℃1分钟的10个循环，95℃20秒和55℃1分钟的29个循环。使用Pherastar^TM读板器(BMG实验技术公司(BMG Labtech)，德国缅因州法兰克福)测量波长485(FAM)和520(VIC)处的激发。将这些值相对于ROX归一化，并使用KRAKEN软件(LGC Genomics，英国赫特福德郡霍德斯顿)绘制在散点图上并评分。

实例4：使用终点测定开发来检测N7/N16同源染色体相互易位

通常，终点基因分型***由正向和反向引物以及两个荧光标记的探针组成。寡核苷酸引物扩增野生型N7或N16染色体的特定区域，以及易位的N7或N16染色体。寡核苷酸探针与两个引物之间的扩增子结合，并在5’端用VIC或FAM荧光报告染料标记，在3’端用MGBNFQ(小沟结合非荧光淬灭剂)作为淬灭剂。

设计了依赖于可扩增引物(SEQ ID NO:489-10560)和探针(SEQ ID NO:21-488)的跨越N7/N16易位断点位点的终点基因分型***(例如，TAQMAN^TM、KASPAR^TM或其他已知测定)的详尽列表。如本文所提供的，可以用SEQ ID NO:489-2990测定野生型染色体7并用SEQ IDNO:138-254探测。野生型染色体7的测定使用SEQ ID NO:489-1739中任一个作为正向或5’引物，组合地使用SEQ ID NO:1740-2990中任一个作为反向或3’引物，并组合地使用SEQ IDNO:138-254中任一个作为探针。如本文所提供的，可以用SEQ ID NO:2991-5492测定野生型染色体16并用SEQ ID NO:21-137探测。野生型染色体16的测定使用SEQ ID NO:2991-4241中任一个作为正向或5’引物，组合地使用SEQ ID NO:4242-5492中任一个作为反向或3’引物，并组合地使用SEQ ID NO:21-137中任一个作为探针。如本文所提供的，可以用SEQ IDNO:5493-8026测定染色体7的同源染色体相互易位并用SEQ ID NO:372-488探测。用于染色体7的同源染色体相互易位的测定使用SEQ ID NO:5493-6759中任一个作为正向或5’引物，组合地使用SEQ ID NO:6760-8026中任一个作为反向或3’引物，并组合地使用SEQ ID NO:372-488中任一个作为探针。如本文所提供的，可以用SEQ ID NO:8027-10560测定染色体16的同源染色体相互易位并且用SEQ ID NO:255-371探测。用于染色体16的同源染色体相互易位的测定使用SEQ ID NO:8027-9294中任一个作为正向或5’引物，组合地使用SEQ IDNO:9295-10560中任一个作为反向或3’引物，并组合地使用SEQ ID NO:255-371中任一个作为探针。本领域技术人员可以利用此类组合物设计用于检测甘蓝型油菜中N7/N16同源染色体相互易位的测定。

本文公开的这些引物和探针序列可用作检测N7/N16同源染色体相互易位的诊断测定。因此，将1.5ul的约6ng/ul DNA用于测定混合物，将18uM的每种探针和4uM的每种引物组合来进行每次测定。接下来，将13.6ul测定与1000ul ToughMix PCRMasterMix^TM(QuantaBeverly，美国马萨诸塞州)混合。Meridian(LGC Genomics，英国赫特福德郡霍德斯顿)液体处理器将1.3ul混合物分配到含有约6ng无水DNA的1536板上。用Phusion^TM激光密封器(LGCGenomics，英国赫特福德郡霍德斯顿)密封板，并使用英国赫特福德郡霍德斯顿LGCGenomics^TM水循环仪在以下条件下进行热循环：94℃15分钟，94℃30秒、60℃1分钟的40个循环。通过Pherastar读板器(BMG实验技术公司，德国缅因州法兰克福)，使用波长485(FAM)和520(VIC)测量PCR产物。将这些值相对于ROX归一化，并使用KRAKEN软件(LGC Genomics，英国赫特福德郡霍德斯顿)绘制在散点图上并评分。基因型由易位特异性荧光的存在或不存在决定。

虽然本公开可能易于进行各种修改和替代形式，但是本文已经通过例示的方式详细描述了特定实施例。然而，应当理解，本公开并不旨在限于所公开的特定形式。而是，本公开将覆盖落入如由以下所附权利要求及其合法等同物所定义的本公开的范围内的所有修改、等同物和替代物。

Claims (22)

1.一种鉴定卡诺拉油菜植物、组织或细胞中N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在的方法，所述方法包括：

(a)检测所述卡诺拉油菜植物、组织或细胞中与所述N7/N16同源染色体相互易位关联的至少一种PCR扩增子，其中所述一种或多种PCR扩增子位于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4内；

(b)筛选第一卡诺拉油菜植物、组织或细胞的所述N7/N16同源染色体相互易位；以及

(c)选择所述第一卡诺拉油菜植物、组织或细胞或选择所述第一卡诺拉油菜植物、组织或细胞的后代，由此所得植物、组织或细胞展示出所述N7/N16同源染色体相互易位。

2.如权利要求1所述的方法，其中SEQ ID NO:2的所述扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物。

3.如权利要求2所述的方法，其中SEQ ID NO:2的所述扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。

4.如权利要求2所述的方法，其中SEQ ID NO:2的所述扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。

5.如权利要求1所述的方法，其中SEQ ID NO:2的所述扩增子包含与SEQ ID NO:372-488或其互补序列中的任一个关联的探针。

6.如权利要求1所述的方法，其中SEQ ID NO:4的所述扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物。

7.如权利要求6所述的方法，其中SEQ ID NO:4的所述扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的正向或5’引物。

8.如权利要求6所述的方法，其中SEQ ID NO:4的所述扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的反向或3’引物。

9.如权利要求1所述的方法，其中SEQ ID NO:4的所述扩增子包含与SEQ ID NO:255-371或其互补序列中的任一个关联的探针。

10.如权利要求1所述的方法，其中SEQ ID NO:2的所述扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少98％序列同一性的多核苷酸。

11.如权利要求1所述的方法，其中SEQ ID NO:2的所述扩增子包含与SEQ ID NO:5493-8026、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。

12.如权利要求1所述的方法，其中SEQ ID NO:2的所述扩增子包含与SEQ ID NO:372-488或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。

13.如权利要求1所述的方法，其中SEQ ID NO:4的所述扩增子包含与SEQ ID NO:8027-10560、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或其互补序列中的任一个关联的引物共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸。

14.如权利要求1所述的方法，其中SEQ ID NO:4的所述扩增子包含与SEQ ID NO:255-371或其互补序列中的任一个关联的探针共享至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的探针。

15.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：

(a)量化由扩增反应产生的所述扩增子。

16.如权利要求15所述的方法，其中量化所述扩增反应的结果包括产生特征图谱。

17.如权利要求16所述的特征图谱，其中所述特征图谱选自由以下组成的组：解链温度曲线特征图谱和荧光特征图谱。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述特征图谱由嵌入DNA染料、花菁染料或荧光染料产生。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述荧光染料选自由以下组成的组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。

20.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：通过确定所述核酸的核苷酸序列来确定所述N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。

21.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：通过确定所述核酸的大小来确定所述N7/N16同源染色体相互易位的存在或不存在。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述确定大小包括HPLC或电泳。