BR122022013574B1 - Método para a introdução de uma mutação mediada por oligonucleobase de reparação de gene em uma sequência de ácido desoxirribonucleico alvo em um genoma de protoplasto vegetal - Google Patents

Abstract

A invenção provê para métodos aperfeiçoados a modificação de genes em células vegetais, e plantas e sementes derivados desta. Mais especificamente, a invenção se refere ao aumento da eficiência da mutação do gene alvo combinando oligonucleotídeos de reparação de gene com abordagens que melhoram a disponibilidade de componentes dos mecanismos de reparação de gene de célula alvo.

Description

[001] O presente pedido reivindica prioridade sobre o Pedido de Patente Provisório U.S. N°. 61/801,320, depositado em 15 de março de 2013, que está incorporado neste documento em sua totalidade à guisa de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] Esta invenção refere-se em linhas gerais a novos métodos para melhorar a eficiência do direcionamento de modificações a localidades específicas em sequência genômicas ou outras sequências de nucleotídeos. Além disso, esta invenção refere-se a DNA alvo que foi modificado, mutado ou marcado pelas abordagens divulgadas neste documento. A invenção refere-se igualmente a células, tecido e organismos que foram modificados pelos métodos da invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Quebra de fita dupla (DSB) de DNA potencializa a recombinação homóloga em células vivas e foi explorada para edição direcionada de genomas por meio de endonucleases manipuladas. O componente chave das nucleases manipuladas é o domínio de reconhecimento de DNA que é capaz de direcionar a nuclease à localidade alvo do genoma para uma quebra de fita dupla do DNA. O reparo da DSB devido à união de extremidades não homólogas (NHEJ) resulta em deleções/inserções mutagênicas de um gene alvo. De maneira alternativa, a DSB pode estimular recombinação homóloga entre o lócus endógeno alvo e um fragmento de DNA homólogo introduzido exogenamente com dados genéticos desejados, um processo denominado direcionamento de genes.

[004] O método mais promissor envolvendo direcionamento de genes ou genomas são as nucleases de dedo de zinco (ZFN) customizadas, um tipo de enzima híbrida que consiste em domínios de ligação de DNA de proteínas dedo de zinco e o domínio de nuclease Fokl (FN). A tecnologia ZFN envolve em primeiro lugar o uso de proteínas híbridas derivadas a partir dos domínios de ligação de DNA das proteínas dedo de zinco (ZF) e o domínio de clivagem não-específico da endonuclease Fokl. Os ZFs podem ser conjuntados como módulos customizados para reconhecer sequências de DNA selecionadas após a ligação na localidade pré-selecionada, produz-se um DSB pela ação do domínio de clivagem de Fokl.

[005] A endonuclease de Fokl foi isolada pela primeira vez a partir da bactéria Flavobacterium okeanokoites. Esta nuclease de tipo IIS consiste em dois domínios separados, o domínio de ligação de DNA com terminal em N e o domínio de clivagem de DNA com terminal em C. As funções do domínio de ligação de DNA para reconhecimento de uma sequência não- palindrômica 5'-GGATG-375'-CATCC-3', enquanto o domínio catalítico cliva DNA de fita dupla não-especificamente a uma distância diz a de 9 a 13 nucleotídeos a jusante da localidade de reconhecimento. O Fokl existe como monômero inativo em solução, tornando-se um dímero ativo após a ligação a seu DNA alvo e na presença de certos metais divalentes. Como um complexo funcional, duas moléculas de Fokl, cada qual ligando-se a uma molécula de DNA de fita dupla, dimerizam-se através do domínio catalítico de DNA para a clivagem eficaz de fitas duplas de DNA.

[006] De maneira similar, nucleases podem ser igualmente produzidas usando-se outras proteínas/domínios caso sejam capazes de reconhecimento de DNA específico. Efetores TAL pertencem a um vasto grupo de proteínas bacterianas que existem em diversas cepas de Xanthomonas e são translocadas até células hospedeiras por um sistema de secreção tipo III, assim chamados efetores tipo III. Uma vez nas células hospedeiras, comprovou-se que alguns efetores TAL ativam transcricionalmente seus genes alvo hospedeiros correspondentes, seja pela virulência da cepa (habilidade de provocar doenças) ou avirulência (capacidade de detonar reações de resistência por parte do hospedeiro) dependendo-se do contexto genético do hospedeiro. Cada efetor contém os motivos de localização nuclear funcionais e um potente domínio de ativação de transcrição que são característicos do ativador de transcrição eucariótico. E cada efetor contém igualmente uma região repetitiva central que consiste em números variados de unidades de repetição de 34 aminoácidos, e a região de repetição como domínio de ligação de DNA determina a especificidade biológica de cada efetor.

[007] Zhang et al., Plant Physiol. 161: 20-27, 2013, o qual se encontra incorporado a este documento à guisa de referência em sua totalidade, divulga o uso de TALENs - nucleases de efetores semelhantes a ativadores transcricionais - que são endonucleases manipuladas com base na combinação de um domínio de ligação de DNA semelhante a um efetor TAl com um domínio catalítico de Fokl. Pela manipulação do domínio de ligação de DNA, estes TALENs podem, alegadamente, podem ser facilmente projetados para reconhecer domínios de ligação de DNA específicos. Por meio do uso de protoplastos de tabaco como sistema modelo, a atividade das TALENs foi avaliada usando-se um repórter polinucleotídico anelante de fita única que compreender uma sequência de codificação de proteína amarelo fluorescente ligada a uma localidade de reconhecimento de TALEN. Este sistema repórter foi administrado a protoplastos, e um evento de clivagem-e-reparo pôde ser medido pela expressão de YFP funcional.

RESUMO DA INVENÇÃO

[008] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a métodos para a introdução de uma mutação mediada por reparo genético de oligonucleobase (GRON) em uma sequência alvo do ácido desoxirribonucleico (DNA) em uma célula vegetal. Os métodos compreendem, inter alias, o cultivo da célula vegetal sob condições que aumentam um ou mais processos de reparo de DNA celular antes de e/ou coincidentes com a administração de uma GRON na célula vegetal.

[009] Em certas modalidades, as condições que aumentam um ou mais processos de reparo de DNA celular compreende um ou mais dentre: introdução de uma ou mais localidades dentro da GRON ou do DNA de célula vegetal que são alvos para reparo de excisão de base, introdução de uma ou mais localidades na GRON ou no DNA de célula vegetal que são alvos para junção de extremidade não-homólogas, introdução de uma ou mais localidades na GRON ou no DNA de célula vegetal que são alvos para junção de extremidades mediada por micro-homologia, introdução de uma ou mais localidades na GRON ou no DNA de célula vegetal que são alvos de recombinação homóloga, e introdução de uma ou mais localidades na GRON ou no DNA da célula vegetal que são alvos para reparo por "pushing".

[0010] Em determinadas modalidades, a sequência alvo de ácido desoxirribonucleico (DNA) encontra-se dentro do genoma da célula vegetal. A célula vegetal pode ser não-transgênica ou transgênica, e a sequência alvo de DNA pode ser um transgene ou um gene endógeno da célula vegetal.

[0011] Em certas modalidades, as condições que aumentam um ou mais processos de reparo de DNA celular, compreendem a introdução de um ou mais compostos que induzem quebras de fita dupla ou fita única de DNA na célula vegetal anteriormente a ou coincidentemente com a administração do GRON na célula vegetal. Compostos exemplares serão descritos a seguir.

[0012] Os métodos e compostos divulgados neste documento são aplicáveis, no geral, a plantas. A título de exemplo, exclusivamente, a espécie vegetal por ser selecionada a partir do grupo que consiste em canola, girassol, milho, tabaco, beterraba sacarina, algodão, milho, trigo, cevada, arroz, alfafa, cevada, sorgo, tomate, manga, pêssego, maçã, pêra, morango, banana, melão, batata, cenoura, alface, cebola, feijão de soja, soja spp, cana, ervilha, grão de bico, ervilha do campo (“field pea”), feijão faba, lentilhas, nabo, rutabaga, couve de Bruxelas, tremoço, couve-flor, kale, faveira, choupo, pinho, eucalipto, uva, citros, triticale, alfafa, centeio, aveia, relva e forrageiras gramíneas, linho, óleo de colza, mostarda, pepino, ipomeia, bálsamo, pimenta, berinjela, calêndula, lótus, repolho, margarida, cravo, tulipa, íris e lírio. Estas podem aplicar-se também, parcial ou totalmente, a todos os outros sistemas biológicos que incluam, mas não se limitem a, bactérias, fungos e células de mamíferos e até mesmo suas organelas (por exemplo, mitocôndrias e cloroplastos).

[0013] Em determinadas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a regeneração de uma planta que contém uma mutação introduzida pela GRON a partir da célula vegetal, e pode compreender a coleta de sementes da planta.

[0014] Em aspectos relacionados, a presente invenção refere-se a células vegetais que compreendem uma modificação genômica introduzida por uma GRON de acordo com os métodos descritos neste documento, uma planta que compreende uma modificação genômica introduzida por uma GRON de acordo com os métodos descritos neste documento, ou uma semente que compreende uma modificação genética introduzida por uma GRON de acordo com os métodos descritos neste documento.

[0015] Outras modalidades da invenção se tornarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, das modalidades exemplares e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0016] A Fig. 1 representa o efeito da concentração de TALEN no direcionamento de GRON de uma mutação GFP para BFP em um modelo de protoplasto de Arabidopsis.

[0017] A Fig. 2 representa o projeto de um TALEN para uso no direcionamento de uma mutação BFP para GFP, conforme descrito nos Exemplos.

[0018] A Fig. 3 representa a introdução de quebras de fita dupla em uma sequência alvo mediada pelo plasmídeo TALEN pCLS14165 conforme medido por citometria de fluxo em um ensaio de hibridização de fita simples.

[0019] A Fig. 4 representa a porcentagem de conversão de GFP em BFP mediada por nickase TALEN (plasmídeo pCLS15771) sozinho, codificando e não codificando GRON, e uma combinação de GRON mais TALEN.

[0020] A Fig. 5 representa a porcentagem de conversão de GFP em BFP mediada por nickase TALEN (plasmídeo pCLS15771) sozinho, codificando e não codificando GRON, e uma combinação de GRON mais TALEN.

[0021] A Fig. 6 representa a porcentagem de conversão de GFP em BFP mediada por nickase TALEN (plasmídeo pCLS15771) sozinho, codificando e não codificando GRON, e uma combinação de GRON mais TALEN.

[0022] A Fig. 7 representa a porcentagem de conversão de GFP em BFP mediada por nickase TALEN (plasmídeo pCLS15769) sozinho, codificando e não codificando GRON, e uma combinação de GRON mais TALEN.

[0023] A Fig. 8 representa a porcentagem de conversão de GFP em BFP mediada por nickase TALEN (plasmídeo pCLS15769) sozinho, codificando e não codificando GRON, e uma combinação de GRON mais TALEN.

[0024] A Fig. 9 representa a porcentagem de conversão de GFP em BFP mediada por nickase TALEN (plasmídeo pCLS15769) sozinho, codificando e não codificando GRON, e uma combinação de GRON mais TALEN.

[0025] A Fig. 10 representa a porcentagem de conversão de GFP em BFP mediada por um quebrador de fita dupla TALEN (plasmídeo pCLS14165) sozinho, codificando e não codificando GRON, e uma combinação de GRON mais TALEN.

[0026] A Fig. 11 representa a porcentagem de conversão de GFP para BFP mediada por TALEN sozinho, GRON codificante e não codificante, e uma combinação de GRON mais TALEN.

[0027] A Fig. 12 representa a porcentagem de conversão de GFP em BFP mediada por nickase TALEN (plasmídeo pCLS15769) sozinho, codificando e não codificando GRON, e uma combinação de GRON mais TALEN.

[0028] A Fig. 13 representa a porcentagem de conversão de GFP em BFP mediada por nickase TALEN (plasmídeo pCLS15769) sozinho, codificando e não codificando GRON, e uma combinação de GRON mais TALEN.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0029] Definições

[0030] A invenção deve ser compreendida em conformidade com as seguintes definições.

[0031] Uma oligonucleobase é um polímero de nucleobases, cujo polímero pode hibridizar-se por paridade de base Watson-Crick a um DNA que contenha a sequência complementar.

[0032] Nucleobases compreendem uma base, a qual é uma purina, piridina ou um derivado ou análogo da mesma. Nucleobases incluem nucleobases de peptídeos, as subunidades de ácidos nucleicos de peptídeos e nucleoses de morfolina, bem como nucleosídeos e nucleotídeos. Nucleosídeos são nucleobases que contém uma unidade de pentossefuranosil, por exemplo, uma ribosida opcionalmente substituída ou 2'-desoxirribosida. Nucleosídeos podem ser ligados por uma ou várias unidades de ligação, que podem ou não conter um fósforo. Nucleosídeos que são ligados por ligações de fosfodiéster não substituídas são denominados nucleotídeos.

[0033] Uma cadeia de oligonucleobases tem um único terminal 5' e 3', que são as últimas nucleobases do polímero. Uma cadeia de oligonucleobases específica pode conter nucleobases de todos os tipos. Um composto de oligonucleobase é um composto que compreende uma ou mais cadeias de oligonucleobases que são complementares e hibridizadas por paridade de base Watson-Crick. Nucleobases são ou de tipo desoxirribo ou de tipo ribo. Nucleobases do tipo ribo são nucleobases que contêm pentosefuranosil em que 2' carbono é um metileno substituído com um hidroxil, alquiloxi ou halogêneo. Nucleobases do tipo desoxirribo são nucleobases outras que não nucleobases do tipo ribo, e incluem todas as nucleuobases que não contêm uma unidade de pentossefuranosil.

[0034] Uma cepa de oligonucleobases genericamente inclui tanto cadeias de oligonucleobase quanto segmentos ou regiões de cadeias de oligonucleobase. Uma cepa de oligonucleobase tem uma extremidade 3' e uma extremidade 5'. Quando uma cepa de oligonucleobase é coextensiva com uma cadeia, as extremidades 3' e 5' da cepa são também terminais 3' e 5' da cadeia.

[0035] De com a presente invenção, órgãos vegetais incluem, mas não se limitam a, folhas, caules, raízes, brotos vegetativos, botões florais, meristemas, embriões, cotilédones, endosperma, sépalas, pétalas, pistilos, carpelos, estames, anteras, micrósporos, pólen, tubos de pólen, óvulos, ovários e frutos ou seções, fatias ou discos tirados dos mesmos. Tecidos vegetais incluem, mas não se limitam a, tecidos calosos, tecidos de solo, tecidos vasculares, tecidos de armazenamento, tecidos meristemáticos, tecidos da folha, tecidos de broto, tecidos de raiz, tecidos vesicular, tecidos de tumor de vegetais e tecidos reprodutivos. Células vegetais incluem, mas não se limitam, células isoladas com paredes celulares, agregados das mesmas de variadas dimensões, e protoplastos.

[0036] Duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos são idênticas se a sequência de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos, respectivamente, nas duas sequências for a mesma quando alinhadas para a máxima correspondência conforme descrito abaixo. Os termos "idêntica"ou percentual de "identidade," no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subseqüências que são iguais ou têm um determinado percentual de resíduos de aminoácidos ou de nucleotídeos que seja igual, quando comparadas e alinhadas para máxima correspondência em uma janela de comparação, conforme medido usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Para polipeptídeos em que as sequências diferem em substituições conservativas, o percentual de identidade de sequência pode ser ajustado de forma ascendente para corrigir a natureza conservativa da substituição. Meios para realizar este ajuste são bem conhecidos a indivíduos versados na técnica. Normalmente, isso envolve a pontuação de uma substituição conservativa como uma incompatibilidade parcial ao invés de total, assim aumentando o percentual de identidade de sequência. Assim, por exemplo, onde a um aminoácido idêntico é atribuída uma pontuação de 1 e a uma substituição não-conservativa, uma pontuação de zero, atribui-se a uma substituição conservativa uma pontuação entre zero e 1. A pontuação de substituições conservativas é calculada de acordo com, por exemplo, o algoritmo de Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11-17 (1988), por exemplo, conforme implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif., EUA).

[0037] Os termos "substancialmente idênticos"e "identidade percentual" no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos, referem- se a sequências ou subseqüências que têm pelo menos 50 %, vantajosamente 60 %, preferivelmente 70 %, mais preferivelmente 80 % e, o mais preferível de todos, 90-95 %, de identidade residual com nucleotídeo ou aminoácido quando alinhadas para máxima correspondência ao longo de um janela de comparação tal como medida usando-se um dos seguintes algoritmos e comparação ou por alinhamento manual e inspeção visual. Esta definição refere-se igualmente ao complemento de uma sequência teste, que tem complementaridade substancial de sequência ou subseqüência quando a sequência teste tem identidade substancial à sequência de referência.

[0038] Um indivíduo versado na técnica reconhecerá que dois polipeptídeos podem também ser "igualmente idênticos"se os dois polipeptídeos forem imunologicamente similares. Deste modo, a estrutura proteica geral pode ser similar enquanto a estrutura primária dos dois polipeptídeos apresenta variação significativa. Portanto, um método para medir se dois polipeptídeos são substancialmente idênticos envolve a medição a ligação de anticorpos monoclonais e policlonais a cada polipeptídeo. Dois polipeptídeos são substancialmente idênticos se os anticorpos específicos para uma primeira ligação de polipeptídeo a um segundo polipeptídeo com uma afinidade de pelo menos um terço da afinidade pelo primeiro polipeptídeo. Para comparação seqüencial, normalmente uma sequência atua como uma sequência de referência, à qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, sequências de teste e referência são alimentadas a um computador, coordenadas de subseqüência são projetadas, caso necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de sequência são projetados. O algoritmo de comparação de seqüência então calcula o percentual de identidade de seqüência para a(s) sequência(s) teste em relação à seqüência de referência, com base nos parâmetros do programa designados.

[0039] O alinhamento ideal de sequências para a comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, 0.4dv. Appl. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de busca por similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'I. Acad. Sci. USA 5 85:2444 (1988), pela implementação computadorizada destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), por softwares para alinhamento tais como VECTOR NTI Version #6 por InforMax, Inc. MD, USA, pelos procedimentos descritos em in ClustalW, Thompson, J. D., Higgins, D. G. e Gibson, T. J. (1994) CLUSTALW: aumentando a sensibilidade de alinhamento de sequências múltiplas progressivas através da pesagem de sequência, penalidades de posição-brechas específicas e escolha de matriz de peso. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680 ou por inspeção visual (ver geralmente, Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, uma parceria entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)).

[0040] Exemplos de algoritmos que são adequados para a determinação do percentual de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos de BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 33 89-3402, respectivamente). O software para realização de análises BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information (no endereço da web www.ncbi.nlm.nih.gov). Este algoritmo envolve primeiramente a identificação de pares de sequência de alta pontuação (HSPs) identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação de limite com valor positivo T quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é referido como o limite de pontuação de palavra próximo (Altschul et al, supra). Estes acertos de palavras próximos iniciais atuam como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longos que contêm os mesmos. Os acertos de palavra são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência na medida em que a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos de correspondência; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos de desalinhamento; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos hits de palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de pontuação negativa; ou o fim de qualquer sequência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo de BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa de BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cepas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação de BLOSUM62 (vide Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)). Além de calcular o percentual de identidade de sequência, o algoritmo BLAST também executa uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (vide, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos poderia ocorrer por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucleico teste ao ácido nucleico de referência for inferior a cerca de 0,1, mais preferencialmente inferior a cerca de 0.01, e mais preferencialmente ainda inferior a cerca de 0,001.

[0041] Quebra de Fita

[0042] A inclusão de compostos que induzem quebras de fita dupla ou fita única, seja no oligonucleotídeo ou conjuntamente com o oligonucleotídeo, gera uma lesão que é reparada por junção de extremidades não homólogas (NHEJ), junção de extremidades mediada por micro-homologia (MMEJ) e recombinação homóloga. A título de exemplo, a família de bleomicina de antibióticos, nucleases de dedo de zinco, Fokl (ou qualquer classe tipo IIS de enzima de restrição) e outras nucleases podem ser covalentemente acoplados à extremidade 3' ou 5' dos oligonucleotídeos de reparo, de modo a introduzir quebras de fita dupla na vizinhança do local alvejado para conversão pelo oligonucleotídeo de reparo. A família de bleomicina de antibióticos são glicopeptídeos de clivagem de DNA incluem bleomicina, zeocina, fleomicina, talisomicina, pepleomicina e outros.

[0043] Os métodos de invenção não são limitados à natureza ou tipo do reagente modificador de DNA. Por exemplo, tais reagentes modificadores de DNA liberam radicais que resultam em quebra de fita de DNA. De maneira alternativa, os reagentes alcalinizam o DNA para formar aductos que bloqueariam a replicação e a transcrição. Em outra alternativa, os reagentes geram reticulados ou moléculas que inibem enzimas celulares conducentes a quebras de fita. Exemplos de reagentes modificadores de DNA que foram ligados a oligonucleotídeos para formar TFOs incluem, mas não se limitam a, indolocarbazolas, diimida de naftaleno (NDI), transplatina, bleomicina, análogos de ciclopropapirroloindol, e fenantodihidrodiozinas. Especificamente, indolocarbazolas são inibidores da topoisomerase I. A inibição destas enzimas resulta em quebras de fita e formação de aductos proteicos de DNA [Arimondo et al., Bioorganic and Medicinal Chem. 8, 777, 2000]. NDI é um fotooxidante que pode oxidar guaninas que poderiam causar mutações em localidades de resíduos de guaninas [Nunez, et al., Biochemistry, 39, 6190, 2000]. Transplatina, segundo já se demonstrou, reage com DNA em um alvo triplex quando o TFO é ligado ao reagente. Esta reação causa a formação de aductos de DNA que seriam mutagênicos [Columbier, et al., Nucleic Acids Research, 24: 4519, 1996]. A bleomicina é um interruptor de DNA, amplamente utilizado como uma radiação mimética. Tem sido ligada oligonucleotideos e já de demonstrou que é ativa como interruptor neste formato [Sergeyev, Nucleic Acids Research 23, 4400, 1995; Kane, et al., Biochemistry, 34, 16715, 1995]. Análogos de ciclopropapirroloindol tem sido ligados a TFOs e, segundo se demonstrou, alcalinizam DNA em uma sequência triplex alvo. O DNA alquilado conteria então aductos que seriam mutagénicos [Lukhtanov, et al., Nucleic Acids Research, 25, 5077, 1997]. Fenantodiidrodioxinas são quinonas mascaradas que liberam espécies radicais em caso de fotoativação. Têm sido associadas a TFOs e já se demonstrou que introduzem quebras em DNA duplex em caso de fotoativação [Bendinskaset al., Bioconjugate Chem. 9, 555, 1998].

[0044] Uma estratégia para a produção de disrupção de gene alvo é através da geração de quebras de DNA de fita dupla ou fita única causada por endonucleases específicas a determinado local. As endonucleases são usadas mais frequentemente para disrupção de gene alvo em organismos que foram tradicionalmente refratários a métodos mais convencionais de direcionamento de genes, tais como algas, plantas e grandes modelos animais, incluindo humanos. Por exemplo, existem atualmente em andamento experimentos clínicos humanos que envolvem nucleases de dedo de zinco para o tratamento e prevenção da infecção por HIV. Além disso, a manipulação de endonucleases está sendo, no momento, usada em tentativas para interromper genes que produzem fenótipos indesejáveis em colheitas.

[0045] As endonucleases de endereçamento, também conhecidas como meganucleases, são endonucleases específicas a sequências que geram quebras de fita dupla em DNA genômica com um alto grau de especificidade devido a suas amplas (por exemplo, >14 bp) localidades de clivagem. Enquanto a especificidade das endonucleases de endereçamento para suas localidades alvo permite direcionamento preciso das quebras induzidas de DNA, as localidades de sítio de endunucleases de endereçamento são raras e a probabilidade de encontrar uma localidade de clivagem de ocorrência natural em um gene alvo é baixa.

[0046] Endonucleases de endereçamento manipulado são geradas mediante a modificação da especificidade de endonucleases de endereçamento já existentes. Em uma abordagem, são introduzidas variações na sequência de aminoácido de endonucleases de endereçamento de ocorrência natural e, em seguida, as endonucleases de endereçamento resultantes sofrem uma varredura para a seleção de proteína funcionais que clivam uma localidade de ligação alvo. Em outra abordagem, endonucleases de endereçamento quiméricas são manipuladas mediante a combinação das localidades de reconhecimento de duas diferentes endonucleases de endereçamento de modo a criar-se uma nova localidade de reconhecimento comporta de uma meia-localidade de cada endonuclease de endereçamento.

[0047] Uma classe de endonucleases artificiais são as endonucleases de dedo de zinco. As endonucleases de dedo de zinco combinam um domínio de clivagem não-específico, tipicamente o da endonuclease Fokl, com domínios proteicos de dedo de zinco que são manipulados para ligar sequências específicas de DNA. A estrutura modular das endonucleases de dedo de zinco as torna plataformas versáteis para a administração ao genoma de quebras de fita dupla de localidade específica. Uma limitação das endonucleases de dedo de zinco é que a baixa especificidade para uma localidade alvo ou a presença de múltiplas localidades alvo em um genoma pode resultar em eventos de clivagem fora do alvo. Como a endonuclease de Fokl cliva como um dímero, uma estratégia para prevenir eventos de clivagem fora de alvo tem sido projetar domínios de dedos de zinco que se liguem em 9 localidades adjacentes de pares base.

[0048] TALENs são nucleases direcionáveis que são usadas para induzir quebras de fita dupla e fita única em localidades específicas de DNA, que são, em seguida, reparadas por mecanismos que podem ser explorados de modo a formar alterações de sequência no sítio de clivagem.

[0049] O bloco de construção fundamental que é usado para manipular a região de ligação de DNA de TALENs é um domínio de repetição altamente conservado derivado de TALEs de ocorrência natural codificados pela proteobactéria Xanthomonas spp. A ligação de DNA por um TALEN é mediada por arranjos de repetições de aminoácidos 33-35 altamente conservados que são flanqueados por domínios derivados de TALE adicionais nas extremidades amino-terminais e carboxi-terminais das repetições.

[0050] Tais repetições de TALE ligam-se especificamente a uma base única de DNA, cuja identidade é determinada por dois resíduos hipervariáveis tipicamente encontrados nas posições 12 e 13 da repetição, sendo o número de repetições em um arranjo correspondido ao cumprimento do ácido nucleico alvo desejado, e a identidade da repetição selecionada para corresponder à sequência de ácido nucleico alvo. O ácido nucleico alvo tem, de preferência, entre 15 e 20 pares base, de modo a maximizar a seletividade da localidade alvo. A clivagem do ácido nucleico alvo ocorre, tipicamente, a 50 pares base da ligação TALEN. Programas de computador para projeção de localidade de reconhecimento TALEN já foram descritos no âmbito da técnica. Vide, por exemplo, Cermak et al., Nucleic Acids Res. 2011 July; 39(12): e82.

[0051] Uma vez projetados para corresponder à sequência alvo desejada, TALENS podem ser expressos de maneira recombinante e introduzidos nos protoplastos como proteínas exógenas, ou expressos a partir de um plasmídeo no interior do protoplasto.

[0052] Estrutura GRON e Introdução em Células Vegetais

[0053] A oligonucleobase recombinagênica pode ser introduzida em uma célula vegetal usando-se qualquer método comumente usado no âmbito da técnica, incluindo, mas não limitando-se a, microcarregadores (administração biolística), microfibras (cerdas), eletroporação, captação direta de DNA e microinjeção. Exemplos ilustrativos de uma oligonucleobase recombinagênica são descritos abaixo.

[0054] A invenção pode ser praticada com oligonucleobases recombinagênicas tendo as conformações e químicas descritas nas patentes Kmiec e Kmiec II que são incorporadas a este documento à guisa de referência. Kmiec I ensina um método para a introdução de alterações genéticas específicas em um gene alvo. As oligonucleobases recombinagênicas em Kmiec I e/ou Kmiec II contêm duas fitas complementares, uma das quais contém pelo menos um segmento de nucleotídeos do tipo RNA (um "segmento RNA") que são pareadas por base a nucleótidos do tipo DNA da outra fita.

[0055] Kmiec II divulga que não-nucleotídeos de purina e pirimida que contenham base podem ser substituídos por nucleotídeos. U.S. Pat. Nos. 5,756,325; 5,871,984; 5,760,012; 5,888,983; 5,795,972; 5,780,296; 5,945,339; 6,004,804; and 6,010,907 e na Patente Internacional N° PCT/US00/23457; e nas Publicações de Patente Internacionais N°s WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; WO 99/40789; US 6,870,075; e no Pedido de Patente Publicada US 20030084473, as quais encontram-se incorporadas a este documento em sua totalidade, divulgam moléculas recombinagênicas adicionais que podem sem utilizadas na presente invenção. O termo "oligonucleobase recombinagênica" é utilizado neste documento para denotar moléculas que podem ser usadas nos métodos da presente invenção e incluem oligonucleotídeos em duplex misturados, não-nucleotídeos que contenham moléculas ensinadas em Kmiec II, oligodesoxinucleotideos de fita única e demais moléculas recombinagênicas ensinadas nas patentes e publicações de patentes supramencionadas.

[0056] Em uma modalidade, a oligonucleobase recombinagênica é um oligonucleotídeo em duplex misturado em que os nucleotídeos de tipo RNA do oligonucleotídeo em duplex misturado são tornados resistentes a RNase substituindo-se o 2'-hidroxil com uma funcionalidade fluoro, cloro ou bromo ou colocando-se um substituinte em 2'-O. Substituintes adequados incluem os substituintes ensinados pelo Kmiec II. Substituintes alternativos incluem os substituintes ensinados na Patente US No. 5,334,711 (Sproat) e os substituintes ensinados pelas Publicações de Patente EP 629 387 e EP 679 657 (coletivamente referidas como Pedidos Martin), as quais encontram-se incorporadas a este documento à guisa de referência. Tal como utilizado neste documento, um 2'-fluoro, cloro ou bromo derivado de um ribonucleotídeo ou um ribonucleotídeo que tenha um 2'-OH substituído com um substituinte descrito nos Pedidos Martin ou Sproat é denominado um "Ribonucleotídeo 2'-Substituído". Tal como utilizado neste documento, o termo "nucleotídeo tipo RNA" significa um nucleotídeo 2'-hidroxil ou Nucleotídeo 2'-Substituído que seja ligado a outros nucleotídeos de um oligonucleotídeo em duplex misturado por uma ligação de fosfodiéster não- substituída ou quaisquer outras ligações não-naturais ensinadas em Kmiec I ou Kmiec II. Tal como utilizado neste documento, o termo "nucleotídeos tipo desoxirribo" significa um nucleotídeo com um 2'-H, que pode ser ligado a outros nucleotídeos de um MDON por uma ligação de fosfodiéster não- substituído ou quaisquer outras ligações não-naturais ensinadas por Kmiec I ou Kmiec II.

[0057] Em uma modalidade da presente invenção, a oligonucleobase recombinagênica é um oligonucleotídeos em duplex misturados que é ligada unicamente por ligações de fosfodiéster não-substituído. Em modalidades alternativas, a ligação é por fosfodiésteres substituídos, derivados de fosfodiésteres e ligações não à base de fósforo, tal como ensinado por Kmiec II. Em outra modalidade, cada nucleotídeo de tipo RNA no oligonucleotídeo em duplex misturado é um Nucleotídeo 2'-Substituído. Modalidades especificamente preferenciais de Ribonucleotídeos 2'- Substituídos são os ribonucleotídeos substituídos 2'-fluoro, 2'-metoxi, 2'- propiloxi, 2'-aliloxi,2'-hidroxiletiloxi, 2'-metoxietiloxi, 2'-fluoropropiloxi e 2'- trifluoropropiloxi. Modalidades mais preferenciais de ribonucleotídeos 2'- substituídos são nucleotídeos substituídos 2'-fluoro, 2'-metoxi, 2'- metoxietiloxi e 2'-aliloxi. Em outra modalidade, o oligonucleotídeo em duplex misturado é ligado por ligações de fosfodiéster não-substituído.

[0058] Embora oligonucleotídeos em duplex misturados com um tipo apenas de nucleotídeo tipo RNA 2'-substituído sejam sintetizados de maneira mais conveniente, os métodos da invenção podem ser praticados com oligonucleotídeos em duplex misturados com dois ou mais tipos de nucleotídeos de tipo RNA. A função de um segmento de RNA pode não ser afetada por uma interrupção causada pela introdução de um desoxinucleotídeo entre dois trinucleotídeos de tipo RNA; em conformidade, o termo segmento de RNA abarca tal "segmento de RNA interrompido". Um segmento de RNA não-interrompido é denominado segmento de RNA contíguo. Em uma modalidade alternativa, um segmento de RNA pode conter nucleotídeos não-substituídos 2'- OH e resistentes a RNase alternante. Os oligonucleotídeos em duplex misturados têm, preferivelmente, menos de 100 nucleotídeos e, mais preferivelmente ainda, menos de 85 nucleotídeos, mas mais de 50 nucleotídeos. A primeira e a segunda fita têm paridade de bases Watson-Crick. Em uma modalidade, as fitas do oligonucleotídeo em duplex misturado são ligadas covalentemente por um ligante, como um hexa, penta ou tetranucleotídeo de fita única, de modo que a primeira e segunda fita são segmentos de uma única cadeia de oligonucleotídeo com uma única extremidade 3' e uma única extremidade 5'. As extremidades 3' e 5' podem ser protegidas pela adição de uma "terminação de tipo 'hairpin'", segundo a qual os nucleotídeos de terminação 3' e 5'são pareados, por paridade Watson-Crick, a nucleotídeos adjacentes. Uma segunda terminação do tipo hairpin pode, adicionalmente, ser posicionada na junção entre a primeira e a segunda fita distante das extremidades 3' e 5', de modo que a paridade Watson-Crick entre a primeira e a segunda fita é estabilizada.

[0059] A primeira e segunda fita contêm regiões que são homólogas a dois fragmentos do gene ACCase alvo, isto é, têm a mesma sequência do gene alvo. Uma região homóloga contém os nucleotídeos de um segmento de RNA e pode conter um ou mais nucleotídeos de tipo DNA do segmento conectivo de DNA e pode conter igualmente nucleotídeos de tipo DNA que não se encontram no segmento de DNA interferente. As duas regiões de homologia são separadas por, e são, cada qual, adjacentes a, uma região com sequência que difere da sequência do gene alvo, denominada "região heteróloga". A região heteróloga pode conter um, dois ou três nucleotídeos incompatíveis. Os nucleotídeos incompatíveis podem ser contíguos ou, como alternativa, podem ser separados por um ou dois nucleotídeos que são homólogos ao gene alvo. Como alternativa, a região heteróloga pode igualmente conter uma inserção ou um, dois, três, cinco ou menos nucleotídeos. Como alternativa, a sequência do oligonucleotídeo em duplex misturado pode diferir da sequência do gene alvo apenas pela deleção de um, dois, três, ou cinco ou menos nucleotídeos do oligonucleotídeo em duplex misturado. O comprimento e a posição da região heteróloga é, neste caso, considerada como tendo o comprimento da deleção, muito embora nenhum nucleotídeo do oligonucleotídeo em duplex misturado se encontre na região heteróloga. A distância entre os fragmentos do gene alvo que são complementares às duas regiões homólogas tem, identicamente, o comprimento da região heteróloga quando uma substituição ou substituições são pretendidas. Quando a região heteróloga contém uma inserção, as regiões homólogas são, portanto, separadas no oligonucleotídeo em duplex misturado mais longe no gene do que seus fragmentos complementares homólogos, e a recíproca se aplica quando a região heteróloga codifica uma deleção.

[0060] Os segmentos de RNA dos oligonucleotídeos em duplex misturados são, cada qual, parte de uma região homóloga, isto é, uma região que é sequencialmente idêntica ao fragmento do gene alvo, cujos segmentos contêm, conjuntamente, de preferência pelo menos 13 nucleotídeos do tipo RNA e preferivelmente de 16 a 25 nucleotídeos de tipo RNA ou ainda mais preferivelmente 18-22 nucleotídeos de tipo RNA ou, mais preferivelmente, 20 nucleotídeos. Em uma modalidade, segmentos de RNA das regiões de homologia são separados por e adjacentes a, isto é, "conectado por" um segmento de DNA interferente. Em uma modalidade, cada nucleotídeos da região homóloga é um nucleotídeo de um segmento de DNA interferente. Um segmento de DNA interferente que contém a região heteróloga de um oligonucleotídeo em duplex misturado é denominado "segmento mutador".

[0061] A mudança a ser introduzida no gene alvo é codificada pela região heteróloga. A mudança a ser introduzida no Gene A pode ser uma mudança em uma ou mais bases da sequência de genes que altera o aminoácido nativo na posição do aminoácido desejado.

[0062] Em outra modalidade da presente invenção, a oligonucleobase recombinagênica é um vetor mutacional de fita única de oligodesoxinucleotídeo ou SSOMV, que é divulgado no Pedido de Patente Internacional PCT/US00/23457, o qual se encontra incorporado a este documento em sua totalidade à guisa de referência. A sequência do SSOMV tem base nos mesmos princípios dos vetores mutacionais descritos nas Patentes US N°s. 5,756,325; 5,871,984; 5,760,012; 5,888,983; 5,795,972; 5,780,296; 5,945,339; 6,004,804; e 6,010,907 e nas Publicações Internacionais N°s WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; WO 99/40789; US 6,870,075; e no Pedido de Patente Publicado US 20030084473. A seqüência do SSOMV contém duas regiões que são homólogas com a sequência alvo separada por uma região que contém a alteração genética desejada denominada região mutadora. A região mutadora pode ter uma sequência com o mesmo comprimento da sequência que separa as regiões homólogas na sequência alvo, porém, tendo uma sequência diferente. Uma tal região mutadora causará uma substituição.

[0063] Os nucleotídeos do SSOMV são desoxirribonucleotídeos que são ligados por ligações de fosfodiéster não-modificadas, salvo o fato de que a ligação internucleotídica no terminal 3' e/ou '5 ou, alternativamente, as duas ligações internucleotídicas no terminal '3 e no terminal '5, podem ser fosforotioato ou fosfoamidato. Tal como utilizado neste documento, uma ligação internucleotídica é a ligação entre nucleotídeos do SSMOV e não inclui a ligação entre o nucleotídeo de extremidade 3' ou nucleotídeo de extremidade '5 e um substituinte bloqueador, vide supra. Em uma modalidade específica, o comprimento do SSOMV está entre 21 e 55 desoxinucleotídeos e os comprimentos das regiões de homologia têm, de maneira adequada, comprimento total de pelo menos 20 desoxinucleotídeos e pelo menos duas regiões de homologia devem ter, cada qual, comprimentos de pelo menos 8 desoxinucleotídeos.

[0064] O SSOMV pode ser projetado para ser complementar tanto à fita codificante quanto à não-codificante do gene alvo. Quando a mutação desejada é uma substituição de uma base única, é preferível que ambos os nucleotídeos mutadores sejam uma pirimidina. Na medida em que isto seja consistente com a obtenção do resultado funcional desejado, é preferível que tanto o nucleotídeo mutador quanto o nucleotídeo alvo na fita complementar sejam pirimidinas. São particularmente preferenciais os SSOMVs que codificam mutações de transversão, isto é, um nucleotídeo mutador C ou T é incompatibilizado, respectivamente, com um nucleotídeo C ou T na fita complementar.

[0065] Além do oligodesoxinucleotídeo, o SSOMV pode conter um substituinte de bloqueio 5' que seja anexado aos carbonos de terminação 5'através de um ligante. A química do ligante não é crítica, afora seu comprimento, que deve ser preferencialmente de pelo menos 6 átomos, e o fato de ser flexível. Uma variedade de substituintes não-tóxicos tais como biotina, colesterol ou outros esteróides ou uma tinta fluorescente catiônica não-intercalante pode ser usada. Particularmente preferenciais como reagentes para produzir SSMOV são reagentes vendidos como Cy3TM and Cy5TM pela Glen Research, Sterling VA (presentemente GE Healthcare), que são fosforoamiditas bloqueadas que, quando incorporadas a um oligonucleotídeo, rendem indomonocarbocianina substituída com 3,3,3',3'- tetrametil N,N'-isopropil e tintas de indodicarbocianina, respectivamente. Cy3 é a mais preferencial. Quando a indocarbocianiana é substituída com N-oxialquil, ela pode ser convenientemente ligada à terminação 5' do oligodesoxinucleotídeo através de um fosfodiéster com fosfato de terminação 5'. A química da tinta ligante entre a tinta e o oligodesoxinucleotídeo não é crítica e é selecionada segundo um critério de conveniência sintética. Quando a fosforamidita Cy3 comercialmente disponível é usada como direcionada, a modificação '5 resultando consiste em um substituinte de bloqueio e ligante conjuntos que são um N- hidroxipropil, N'-fosfatidilpropil 3,3,3',3'-tetrametil indomonocarbocianina.

[0066] Em uma modalidade preferencial, a tinta de indocarbocianina é tetra substituída nas posições 3 e 3' dos anéis de indola. Sem limitação quanto à teoria, essas substituições impedem que a tinta seja uma tinta intercalante. A identidade dos substituintes nestas posições não é crítica. O SSOMV pode, além disso, ter um substituinte bloqueante '3. Novamente, a química do substituinte bloqueante 3'não é critica.

[0067] Em outra modalidade preferencial, o oligonucleotídeo recombinagênico é um oligodesoxinucleotídeo de fita única com um nucleotídeo de extremidade 3', um nucleotídeo de extremidade 5', com pelo menos 25 desoxinucleotídeos e não mais que 65 desoxinucleotídeos, e com uma sequência que compreende pelo menos duas regiões, cada qual de pelo menos 8 desoxinucleotídeos que são, cada qual, respectivamente, idênticas a pelo menos duas regiões do gene cromossomial alvo, cujas regiões, em conjunto, tem pelo menos 24 nucleotídeos de comprimento, e cujas regiões são separadas por pelo menos um nucleotídeo na sequência do gene cromossomial alvo ou na sequência do oligodesoxinucleotídeo ou ambos de modo que a sequência oligodesoxinucleotídica não é idêntica à sequência do gene cromossomial alvo. Vide Patente US 6.271.360, que se encontra incorporada a este documento à guisa de referência.

[0068] Microcarregadores e Microfibras

[0069] O uso de microcarregadores metálicos (microesferas) para a introdução de grandes fragmentos de DNA em células vegetais com paredes celulares de celulose por meio de penetração projétil é conhecido a indivíduos versados na técnica relevante (doravante administração biolística). As Patentes US N °s 4,945,050; 5,100,792 e 5,204,253 descrevem técnicas gerais para seleção de microcarregadores e dispositivos para projetá-los. N°s 5.484.956 e 5.489.520 descrevem a preparação de milho transgênico fértil usando bombardeio microprojétil de tecido caloso de milho. As técnicas de biolística são também usadas na transformação de embriões imaturos de milho.

[0070] Condições específicas para o uso de microcarregadores nos métodos da presente invenção são descritos na Publicação Internacional WO 99/07865. Em uma técnica ilustrativa, microcarregadores gélidos (60 mg/ml), oligonucleotídeos em duplex misturados (60 mg/ml) 2,5 M CaCl2 e 0,1 M de espermidina são adicionados nesta ordem; a mistura é gentilmente agitada, por exemplo, por meio de um vórtice, por 10 minutos, e permite-se que assente em temperatura ambiente por 10 minutos, quando os microcarregadores são diluídos em 5 volumes de etanol, centrifugados e ressuspendidos em etanol 100%. Bons resultados podem ser obtidos com uma concentração na solução de aderência de microcarregadores de 8-10 µg/µl, 14-17 µg/ml de oligonucleotídeos em duplex misturados, 1,1-1,4 M de CaC2 e 18-22 mMespermidina. Resultados ideais foram observados em condições de 8 µg/µ de microcarregadores, 16,5 µg/ml de oligonucleotídeo em duplex misturado, 1,3 M de CaCl e 21mm de espermidina.

[0071] Oligonucleobases recombinagênicas podem ser igualmente introduzidas em células vegetais para a prática da presente invenção usando microfibras para penetrar a parede celular e membrana celular. As Patentes US N ° 5.302.523 para Coffee et al. descrevem o uso de 30 vezes 0,5 µm e 10 vezes 0,3 m de fibras de carbida de silício para facilitar a transformação das culturas de milho em suspensão de Black Mexican Sweet. Qualquer técnica mecânica que pode ser usada para introduzir DNA na transformação de um célula vegetal usando-se microfibras de que podem ser utilizados na administração de oligonucleobases recombinogênicas para uso em presentificar os mutantes de ACCase, Uma técnica ilustrativa para a administração de microfibra de uma oligonucleobase recombinagênica dá-se da seguinte maneira: Microfibras estéreis (2 µg) são suspensas em 150 µl de meio para cultura vegetal contendo cerca de 10 µg de um oligonucleotídeo em duplex misturado. Permite-se que uma cultura de suspensão assente e volumes iguais de células agrupadas e a fibra estéril/suspensão de nucleotídeo são agitadas em vórtice por 10 minutos e chapeadas. Meios seletivos são aplicados imediatamente ou com atraso de até cerca de 120 horas, tal como é apropriado para o traço específico.

[0072] Eletroporação

[0073] Em uma modalidade alternativa, as oligonucleobases recombinagênicas podem ser administradas à célula vegetal por meio de eletroporação de um protoplasto derivado de uma parte vegetal de acordo com técnicas que são bastante conhecidas a um indivíduo moderadamente versado na técnica. Vide, por exemplo, Gallois et al., 1996, in Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, N.J.; Kipp et al., 1999, in Methods inMolecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, N.J.

[0074] Oligonucleobases recombinagênicas podem ser igualmente introduzidas em micrósporos por meio de eletroporação. Após liberação da tétrade, o micrósporo é uninuclear e tem paredes finas. Ele começa a ampliar-se e desenvolve um poro germinativo antes das formas exinas. Um micrósporo nesta fase é potencialmente mais suscetível à transformação com DNA exógeno que outras células vegetais. Além disso, o desenvolvimento de micrósporo pode ser alterado in vitro de modo a produzir outros embriões haplóides ou calos embriogênicos que podem ser regenerados em plantas (Coumans et al., Plant Cell Rep. 7:618-621, 1989; Datta et al., Plant Sci. 67:83-88, 1990; Maheshwari et al., Am. J Bot. 69:865-879, 1982; Schaeffer, Adv. In Cell Culture 7:161-182, 1989; Swanson et al., Plant Cell Rep. 6:94-97, 1987). Assim, micrósporos transformados podem ser regenerados diretamente em plantas haplóides ou plantas diplóides férteis quando da duplicação de cromossomos por meio de métodos tradicionais. Ver também pedido co-pendente US Número de série 09/680,858 intitulado Compositions and Methods for Plant Genetic Modification, o qual se encontra incorporado a este documento à guisa de referência.

[0075] Métodos de eletroporação de micrósporos são descritos em Jardinaud et al., Plant Sci. 93:177-184, 1993, e Fennell and Hauptman, Plant Cell Reports 11:567-570, 1992. Métodos para eletroporação de MDON em protoplastos vegetais podem ser igualmente adaptados para uso em eletroporação de micrósporo.

[0076] Cerdas e Microinjenção

[0077] Em mais uma modalidade alternativa, a oligonucleobase recombinagênica pode ser igualmente administrada à célula vegetal por cerdas ou microinjeção da célula vegetal. A assim chamada técnica das cerdas é desempenhada essencialmente tal como descrito em Frame et al., 1994, Plant J. 6:941-948. A oligonucleobase recombinagênica é acrescentada às cerdas e usada para transformar as células vegetais. A oligonucleobase recombinagênica pode ser co-incubada com plasmídeos que compreendem sequências que codificam proteínas capazes de formar complexos de recombinase em células vegetais de modo que a recombinação é catalisada entre o oligonucleotídeo e a sequência alvo.

[0078] Seleção de Plantas

[0079] Em várias modalidades, plantas tais como as divulgadas neste documento podem ser de qualquer espécie de planta dicotiledônea, monocotiledônea ou gimnospérmica, incluindo qualquer planta amadeirada que cresça como árvore ou arbusto, qualquer espécie herbácea, ou qualquer espécie de produza frutos comestíveis, sementes ou vegetais, ou qualquer espécie que produz flores coloridas ou aromáticas. A título de exemplo, a planta pode ser selecionada, talvez, a partir de um espécie vegetal do grupo que consiste em canola, girassol, milho, tabaco, beterraba sacarina, algodão, milho, trigo, cevada, arroz, alfafa, cevada, sorgo, tomate, manga, pêssego, maçã, pêra, morango, banana, melão, batata, cenoura, alface, cebola, feijão de soja, soja spp, cana, ervilha, grão de bico, ervilha do campo, feijão faba, lentilhas, nabo, rutabaga, couve de Bruxelas, tremoço, couve-flor, kale, faveira, choupo, pinho, eucalipto, uva, citros, triticale, alfafa, centeio, aveia, relva e forrageiras gramíneas, linho, óleo de colza, mostarda, pepino, ipomeia, bálsamo, pimenta, berinjela, calêndula, lótus, repolho, margarida, cravo, tulipa, íris e lírio, e nozes que produzem plantas na medida em que não tenham sido especificamente mencionadas até o presente momento.

[0080] Plantas e células vegetais podem ser testadas para que seja possível verificar sua resistência e tolerância ao herbicida usando métodos conhecidos no âmbito da técnica, por exemplo cultivando a planta ou célula vegetal na presença de um herbicida e medindo a taxa de velocidade do crescimento em comparação à taxa de crescimento na ausência do herbicida.

[0081] Tal como utilizado aqui, o crescimento substancialmente normal de uma planta, órgão vegetal, tecido vegetal ou célula vegetal é definido como uma taxa de crescimento ou taxa de divisão celular da planta, órgão vegetal, tecido vegetal ou célula vegetal que é pelo menos 35%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, ou pelo menos 75% da taxa de crescimento ou taxa de divisão celular em uma planta, órgão vegetal, tecido vegetal ou célula vegetal correspondente que expresse a proteína AHAS de tipo selvagem.

[0082] Tal como utilizado aqui, o desenvolvimento substancialmente normal de uma planta, órgão vegetal, tecido vegetal ou célula vegetal é definido como a ocorrência de um ou mais eventos de desenvolvimento na planta, órgão vegetal, tecido vegetal ou célula vegetal que são substancialmente idênticos àqueles que ocorrem em uma planta, órgão vegetal, tecido vegetal ou célula vegetal correspondente expressando uma proteína do tipo selvagem.

[0083] Em certas modalidades, órgãos vegetais providos neste documento incluem, mas não se limitam a, folhas, caules, raízes, brotos vegetativos, botões florais, meristemas, embriões, cotilédones, endosperma, sépalas, pétalas, pistilos, carpelos, estames, anteras, micrósporos, pólen, tubos de pólen, óvulos, ovários e frutos ou seções, fatias ou discos tirados dos mesmos. Tecidos vegetais incluem, mas não se limitam a, tecidos calosos, tecidos de solo, tecidos vasculares, tecidos de armazenamento, tecidos meristemáticos, tecidos da folha, tecidos de broto, tecidos de raiz, tecidos vesicular, tecidos de tumor de vegetais e tecidos reprodutivos. Células vegetais incluem, mas não se limitam a, células isoladas com paredes celulares, agregados das mesmas de variadas dimensões, e protoplastos.

[0084] Plantas são substancialmente "tolerantes" a um herbicida relevante quando são a ele submetidas e fornecem uma dose/curva de reação que é deslocada à direita em comparação àquela que é provida por uma planta não-tolerante semelhante e similarmente submetida. Tais doses/curvas de reação têm dose representada no eixo X e "morte percentual", "efeito herbicida", etc., representada no eixo Y. Plantas tolerantes demandarão mais herbicida que plantas semelhantes não- herbicidas para produzir um dado efeito herbicida. Plantas que são substancialmente resistentes ao herbicida exibem poucas ou nenhuma lesão necrótica, lítica, clorótica ou de qualquer outro tipo, quando submetidas a herbicida em concentrações e taxas que são tipicamente empregadas pela comunidade agroquímica para matar plantas indesejáveis no campo. Plantas que são resistentes a um herbicida também são tolerantes ao herbicida.

[0085] Geração de Plantas

[0086] Conhece-se a cultura de tecido de diversos tecidos de espécies vegetais e regeneração de plantas da mesma. Por exemplo, a propagação de uma cultivar de canola por cultura de tecido é descrita em qualquer uma das seguintes, sem se limitar a nenhuma delas: Chuong et al., "A Simple Culture Method for Brassica hypocotyls Protoplasts," Plant Cell Reports 4:4-6, 1985; Barsby, T. L., et al., "A Rapid and Efficient Alternative Procedure for the Regeneration of Plants from Hypocotyl Protoplasts of Brassica napus," Plant Cell Reports (Spring, 1996); Kartha, K., et al., "In vitro Plant Formation from Stem Explants of Rape," Physiol. Plant, 31:217-220, 1974; Narasimhulu, S., et al., "Species Specific Shoot Regeneration Response of Cotyledonary Explants of Brassicas," Plant Cell Reports (Spring 1988); Swanson, E., "Microspore Culture in Brassica," Methods in Molecular Biology, Vol. 6, Chapter 17, p. 159, 1990.

[0087] Reprodução adicional da variedade pode ocorrer por meio de cultura de tecido e regeneração. A cultura de tecidos de diversos tecidos de sojas e regeneração de plantas da mesma é bem conhecida no âmbito da técnica e amplamente publicada. Por exemplo, pode-se fazer referência a Komatsuda, T. et al,"Genotype X Sucrose Interactions for Somatic Embryogenesis in Soybeans," Crop Sci. 31:333-337, 1991; Stephens, P. A., et al., "Agronomic Evaluation of Tissue-Culture-Derived Soybean Plants," Theor. Appl. Genet. 82:633-635, 1991; Komatsuda, T. et al., "Maturation and Germination of Somatic Embryos as Affected by Sucrose and Plant Growth Regulators in Soybeans Glycine gracilis Skvortz and Glycine max (L.) Merr." Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 28:103-113, 1992; Dhir, S. et al., "Regeneration of Fertile Plants from Protoplasts of Soybean (Glycine max L. Merr.); Genotypic Differences in Culture Response," Plant Cell Reports 11:285-289, 1992; Pandey, P. et al., "Plant Regeneration from Leaf and Hypocotyl Explants of Glycine wightii (W. and A.) VERDC. var. longicauda," Japan J. Breed. 42:1-5, 1992; and Shetty, K., et al., "Stimulation of In Vitro Shoot Organogenesis in Glycine max (Merrill.) by Allantoin and Amides," Plant Science 81:245-251, 1992. As divulgações da Patente US N. ° 5.024.944, expedida a 18 de junho de 1991 a Collins et al., e a Patente US N. ° 5.008.200, expedida a 16 de abril de 1991 para Ranch, et al, são incorporadas a este documento sem sua totalidade à guisa de referência.

[0088] Os exemplos a seguir ilustram ainda a prática da presente invenção, mas não devem ser interpretados como limitantes de seu escopo.

[0089] Exemplo 1: Conversão dramaticamente melhorada de um gene de proteína fluorescente azul (BFP) em células Arabidopsis thaliana transgênicas a uma proteína fluorescente verde (GFP) por meio da introdução de uma mutação de nucleotídeo alvejada através dos através de Oligonucleotídeos de Reparo de Gene (GROs), em combinação com um par de efetores pseudo-ativadores de transcrição (TALEN) que cliva proximamente à mudança de base alvejada.

[0090] Uma linha de Arabidopsis com múltiplas cópias de um gene de proteína fluorescente azul foi criada por métodos conhecidos a indivíduos versados na técnica (ver, por exemplo, Clough and Brent, 1998). Culturas de tecido meristemático derivadas de raiz foram estabelecidas com esta linha, que foi usado para isolamento de protoplasto e cultura (vide, por exemplo, Mathur et al., 1995). A administração de GRON em protoplastos foi alcançada através de captação de GRON mediada por polietilenoglicol (PEG) em protoplastos. Foi utilizado um método usando um formato de 96 poços, similar àquele descrito por Fujiwara e Kato (2007). A seguir, o protocolo é descrito brevemente. Os volumes dados são aqueles aplicados a poços individuais de um prato de 96 poços. 1. Misturar 6,25 µl de mistura GRON/TALEN (80 µM BFP4 Codificação/41mer GRON) com 25 µl de protoplastos derivados de tecido meristemático de raiz transgênica Arabidopsis BFP a 5x106 células/ml em cada poço de um prato de 96 poços. 2. 31,25 µl de uma solução com 40% de PEG foram acrescentadas e os protoplastos foram misturados. 3. Células tratadas foram incubadas em gelo por 30 minutos. 4. Para cada poço, 200 µl de solução W5 foram acrescentadas e as células, misturadas. 5. Permitiu-se que os pratos incubassem no gelo por 30 min, permitindo assim que os protoplastos assentassem ao fundo de cada poço. 6. 200 µl do meio acima dos protoplastos assentados foram removidos. 7. 85 µl de meio de cultura (MSAP, vide Mathur et al., 1995) foram adicionados. 8. As placas foram incubadas em temperatura ambiente, no escuro, por 48 horas. A concentração final de GRON após a adição de meio de cultura é de 8 µM.

[0091] Usando este protocolo, plasmídeos de TALEN em diferentes concentrações foram introduzidos conjuntamente com GRON. Protoplastos de raiz derivados de tecido meristemático foram tratados com plasmídeos TALEN em diversas concentrações, juntamente com o direcionamento GRON de uma mutação no gene BFP, causando uma conversão para o gene GFP. A expressão de GFP foi medida por citometria de fluxo 48 horas após administração do GRON/TALEN, de modo a detectar protoplastos cujos fluorescências verdes e amarelas são diferentes das dos protoplastos de controle. A fluorescência verde é causada pela introdução de uma mutação direcionada no gene BFP, o que resulta na síntese de GFP. Os resultados são mostrados na Figura 1.

[0092] Figura 1.

[0093] Para todas as Figuras 4-13, aplica-se a seguinte Legenda:

[0094] GRONs

[0095] BFP->GFP projetos de direcionamento. BFP->GFP H66Y CAC->TAC. BFP4/C/41/5’Cy3/3’idC VCCCTCGTGACCACCTTCACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCH BFP4/NC/41/5’Cy3/3’idC VGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTGAAGGTGGTCACGAGGGH

[0096] Projetos de controle de não-direcionamento BFP. BFP H66 - CAC BFP0/C/41/5’3PS/3'3PS VCCCTCGTGACCACCTTCACCCACGGCGTGCAGTGCTTCAGCH BFP0/NC/41/5’3PS/3'3PS VGCTGAAGCACTGCACGCCGTGGGTGAAGGTGGTCACGAGGGH

[0097] TALENs:

[0098] pCLS14165 tem ambos os braços TAL (projetados conforme Zhang et al., 2013) em um único plasmídeo, com cada braço ligando-se à sequência sublinhada e ligada a um monômero Fokl. Esta combinação produz uma quebra de fita dupla (DSB), tal como representado na Fig. 3, no ensaio de anelamento de fita única (SSA) executado no mesmo foi conforme aqueles presentes em Zhang et al. (2013).

[0099] pCLS15771 é uma nickase com uma mutação (D450A) no domínio Fokl para o braço esquerdo. O braço direito neste construto é conforme pCLS14165.

[00100] pCLS15769 é uma nickase com uma mutação (D450A) no domínio Fokl para o braço direito. O braço esquerdo neste construto é conforme pCLS14165.

[00101] Os GRONs e TALENs foram testados conforme representado nas Figuras 4-13. Os tratamentos de controle que consistiram em GRONs de não-direcionamento (BFP0/C ou BFP0/NC) e TALENs exclusivamente, bem como tratamentos simulados com a solução com 40% de PEG sem GRONs ou plasmídeo de TALEN não apresentaram nenhuma atividade de conversão significativa.

[00102] Neste sistema, o projeto BFP4/NC GRON é melhor que o projeto BFP4/C. Combinando estes com o TALEN DSB (pCLS14165) melhora a ambos com melhor atividade e melhoria de dobras (em muitos casos >2 ordens de magnitude) com o GRON BFP4/C. São igualmente observadas melhorias significativas combinando-se GRONs com pares de TALEN de nickase, e espera-se que sejam ainda mais benéficos ao minimizar-se o dano colateral quando as mutações são direcionadas em diversos genes/localizações/alelos simultaneamente.

[00103] Referências

[00104] Clough, S.J., and Bent, A.F. (1998). Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, 735-743.

[00105] Mathur, J., Szabados, L, and Koncz, C. (1995) A simple method for isolation, liquid culture, transformation and regeneration of Arabidopsis thaliana protoplasts. Plant Cell Rep. 14, 221-226.

[00106] Fujikawa Y, Kato N (2007) Split luciferase complementation assay to study protein-protein interactions in Arabidopsis protoplasts. Plant J 52: 185-195.

[00107] Zhang Y, Zhang F, Li X, Baller JA, Qi Y, Starker CG, Bogdanove AJ, Voytas DF. (2013) Transcription activator-like effector nucleases enable efficient plant genome engineering. Plant Physiol. 161(1):20-7.

Claims (9)

1. Método para a introdução de uma mutação mediada por oligonucleobase de reparação de gene (GRON) em uma sequência de ácido desoxirribonucleico (DNA) alvo em um genoma de protoplasto vegetal, caracterizado por compreender: gerar o protoplasto vegetal a partir de uma célula vegetal compreendendo uma parede celular; e cultivar o protoplasto vegetal sob condições que aumentam um ou mais processos de reparação de DNA celular antes da, e/ou coincidentes com, a entrega de um GRON no protoplasto vegetal, em que as condições que aumentam um ou mais processos de reparação de DNA celular compreendem a introdução de uma ou mais endonucleases sítio-específicas que induzem cortes de fita única no protoplasto vegetal, em que o GRON compreende uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em de um a três nucleotídeos ligados a internucleotídeos 3' fosforotioato ou fosfoamidato, de um a três nucleotídeos ligados a internucleotídeos 5’ fosforotioato ou fosfoamidato, um corante fluorescente 5' Cy3 ou Cy5, um nucleotídeo 3' de ligação reversa dideoxi citidina (idC) invertido, e um ou mais ribonucleotídeos 2'-substituídos, e em que o GRON hibridiza na sequência de DNA alvo para criar par(es) de bases incompatível(eis) que atua(m) como um sinal para atrair o sistema de reparo de genes da célula para o sítio onde o(s) par(es) de bases incompatível(eis) é(são) criado(s), e o GRON é degradado após o(s) nucleotídeo(s) incompatível(eis) dentro da sequência de DNA alvo ser modificado pelo sistema de reparo de genes da célula para introduzir a mutação de modo que nenhum ácido nucleico estranho seja introduzido no genoma do protoplasto vegetal, de modo que o protoplasto vegetal seja não transgênico em relação à mutação, e em que o protoplasto vegetal é gerado a partir de uma célula vegetal de uma espécie selecionada a partir do grupo consistindo em canola, girassol, milho, tabaco, beterraba, algodão, milho, trigo, cevada, arroz, alfafa, cevada, sorgo, tomate, manga, pêssego, maçã, pêra, morango, banana, melão, batata, cenoura, alface, cebola, feijão de soja, soja spp, cana, ervilha, grão de bico, ervilha do campo, feijão faba, lentilhas, nabo, rutabaga, couve de Bruxelas, tremoço, couve-flor, kale, faveira, populus, pinho, eucalipto, uva, citros, triticale, alfafa, centeio, aveia, relva e forrageiras gramíneas, colza, mostarda, pepino, ipoméia, bálsamo, pimenta, berinjela, calêndula, lótus, repolho, margarida, cravo, tulipa, íris e lírio.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais endonucleases sítio-específicas que induzem cortes de fita única são selecionadas a partir de TALENs, endonucleases de dedo de zinco e meganucleases.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais endonucleases sítio-específicas que induzem cortes de fita única são acopladas covalentemente ao GRON.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a regeneração de uma planta com uma mutação introduzida pelo GRON a partir do protoplasto vegetal.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a avaliação de eficiência de conversão de um GRON, em que a sequência de DNA alvo codifica proteína fluorescente azul, em que o GRON é configurado para mutar a sequência de DNA alvo em um sítio predeterminado para causar uma conversão da proteína fluorescente azul no qual a proteína fluorescente azul emite fluorescência em um comprimento de onda diferente, e determinação da eficiência da conversão pela medição da emissão de fluorescência no comprimento de onda diferente.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais endonucleases sítio-específicas que introduzem cortes de fita única são selecionadas a partir de TALENs, endonucleases de dedo de zinco e meganucleases.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA alvo está presente no DNA cromossômico do protoplasto vegetal.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA alvo está presente em um protoplasto vegetal como um plasmídeo.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais endonucleases sítio- específicas que introduzem cortes de cadeia única proveem uma maior eficiência de conversão em relação a uma eficiência determinada para o GRON na ausência dos um ou mais compostos que introduzem cortes de cadeia única.