UA120247C2 - Антитіло до ceacam5 і його застосування - Google Patents

Антитіло до ceacam5 і його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA120247C2
UA120247C2 UAA201506107A UAA201506107A UA120247C2 UA 120247 C2 UA120247 C2 UA 120247C2 UA A201506107 A UAA201506107 A UA A201506107A UA A201506107 A UAA201506107 A UA A201506107A UA 120247 C2 UA120247 C2 UA 120247C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
sequence
antibody
zeo
seasam5
human
Prior art date
Application number
UAA201506107A
Other languages
English (en)
Inventor
П'єр-Франсуа Берн
Пьер-Франсуа Бэрн
Франсіс Бланш
Франсис Бланш
Ерве Бушар
Эрве Бушар
Беатріс Камерон
Беатрис Камерон
Тарік Дабдубі
Тарик Дабдуби
Стефані Декарі
Стэфани Дэкари
Поль Феррарі
Поль Феррари
Алєксєй Рак
Алексей Рак
Original Assignee
Санофі
Санофи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Санофі, Санофи filed Critical Санофі
Publication of UA120247C2 publication Critical patent/UA120247C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/537—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57473—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen, i.e. CEA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3

Abstract

Винахід стосується виділеного антитіла або його зв'язувального фрагмента, яке зв'язується з доменом А3-В3 білків СЕАСАМ5 людини і Масаса fascicularis, виділеної нуклеїнової кислоти, вектора, клітини-хазяїна. Винахід також стосується імунокон'югата, що містить дане антитіло, кон'юговане або зв'язане з інгібуючим ріст агентом, фармацевтичної композиції, що містить антитіло або імунокон'югат, застосування даного антитіла для лікування злоякісного новоутворення, а також застосування антитіла для ex vivo детекції експресії СЕАСАМ5 в біологічному зразку.

Description

антитіло або імунокон'югат, застосування даного антитіла для лікування злоякісного новоутворення, а також застосування антитіла для ех мімо детекції експресії СЕАСАМ5 в біологічному зразку.
Даний винахід стосується антитіл, що специфічно зв'язуються з біллами СЕАСАМ5 людини і
Масаса газсісціагі5, а також виділених нуклеїнових кислот, векторів і клітин-хазяїнів, що містять послідовності, кодуючі зазначені антитіла. Винахід також стосується імунокон'югатів, що містять зазначені антитіла, кон'юговані або зв'язані з інгібуючим ріст засобом, і фармацевтичних композицій, що містять антитіла або імунокон'югати за винаходом. Винахід стосується застосування антитіл або імунокон'югатів за винаходом для лікування злоякісних пухлин або у діагностичних цілях.
Раково-ембріональний антиген (РЕА) являє собою глікопротеїн, залучений у клітинну адгезію. Уперше РЕА ідентифікували в 1965 (Соїа апа Ргеедтап, 9. Ехр. Меад., 121, 439, 1965) як білок, у нормі експресований зародковим кишечником протягом перших шести місяців вагітності і виявлений в злоякісних пухлинах підшлункової залози, печінки і кишечнику. Сімейство РЕА належить до імуноглобулінового суперсімейства. Сімейство РЕА складається з 18 генів і підрозділяється на дві підгрупи білків: підгрупу споріднених раково-ембріональному антигену молекул клітинної адгезії (СЕАСАМ) і підгрупу специфічного для вагітності глікопротеїну (Каттетгег 4 2іттептапп, ВМС Віоіоду 2010, 8:12).
У людей підгрупа СЕАСАМ складається з 7 членів: СЕАСАМІ, СЕАСАМЗ, СЕАСАМАЯ,
СЕАСАМ5, СЕАСАМб6, СЕАСАМ7, СЕАСАМВ8. Численні дослідження показали, що СЕАСАМ5, ідентичний початково ідентифікованому РЕА, високо експресований на поверхні клітин колоректальних пухлин, клітин пухлин шлунка, легень, молочних залоз, передміхурової залози, яєчника, шийки матки і сечового міхура і слабко експресований у невеликій кількості в нормальних епітеліальних тканинах, таких як клітини циліндричного епітелію і бокалоподібні клітини в товстій кишці, слизисті клітини шийки в шлунку і клітини плоского епітелію в стравоході і шийці матки (Натітагвігот еї аї. 2002, іп "Титог тагкКег5, Рпузіоіоду, Рашобіоіоду, Тесппоїоду апа Сіїпіса! Арріїсайопе" Еа5. Оіатапаїй5 Е. Р. еї аі., ААСС Ргевз5, УМазпіпдіоп рр. 375). Таким чином, СЕАСАМ5 може являти собою терапевтичну мішень, придатну для підходів пухлиноспецифічної спрямованої доставки, таких як імунокон'югати. Даний винахід стосується моноклональних антитіл до СЕАСАМ5 і демонструє, що їх можна кон'югувати з цитотоксичним засобом для індукції цитотоксичної активності, здатної приводити до знищення пухлинних клітин іп міго, і для індукції регресу пухлини іп мімо.
Позаклітинні домени представників сімейства СЕАСАМ складаються з повторюваних імуноглобуліноподібних (Ід-подібних) доменів, які підрозділяють на З типи, А, В і М, залежно від гомології послідовностей. СЕАСАМЬ5 містить сім таких доменів, а саме М, А1, В1, А2, В2, АЗ і ВЗ.
Домени СЕАСАМ5 АТ, А?2 і АЗ, з одного боку, і домени СЕАСАМ5 ВІ, В2 і ВЗ, з іншого боку, демонструють високу гомологію послідовностей, домени А СЕАСАМ5 людини демонструють від 84 до 87 95 парної подібності послідовностей і домени В - від 69 до 80 95. Крім того, інші представники СЕАСАМ людини, що містять у своїй структурі домени А і/або В, а саме
СЕАСАМІ, СЕАСАМб, СЕАСАМ?7 і СЕАСАМВ8, демонструють гомологію з СЕАСАМ5 людини.
Зокрема, домени А і В білла СЕАСАМб людини демонструють гомологію послідовностей з доменами АЇ і АЗ і з будь-яким з доменів В1-В3 СЕАСАМ5 людини, відповідно, яка навіть вище, ніж гомологія, спостережувана у доменів А і доменів В СЕАСАМ5 людини.
З метою орієнтованої на РЕА діагностики або терапії одержана множина антитіл до РЕА. Як проблему в цій галузі завжди вказували специфічність до споріднених антигенів, наприклад озпагкеу еї аї. (1990, Сапсег Кезеагсп 50, 2823). Унаслідок зазначеної вище гомології деякі з раніше описаних антитіл можуть демонструвати зв'язування з повторюваними епітопами
СЕАСАМ5, присутніми у різних імуноглобулінових доменах, демонструючи перехресну реактивність з іншими представниками СЕАСАМ, такими як СЕАСАМІ, СЕАСАМ6, СЕАСАМ7 або СЕАСАМВ8, з відсутністю специфічності до СЕАСАМ5. Виходячи з орієнтованої на РЕА терапії бажана специфічність антитіл до СЕАСАМ5 так, щоб вони зв'язувалися з експресуючими СЕАСАМ5 людини пухлинними клітинами, але не зв'язувалися з деякими нормальними тканинами, експресуючими інших представників СЕАСАМ. Варто звернути увагу на те, що СЕАСАМІ, СЕАСАМб і СЕАСАМВ8 описані як експресовані нейтрофілами людини і приматів, що не є людиною (Ебгапіттпе)/аєй еї аї., 2000, Ехр. СеїІ Ке5., 260, 365; 2пао еї аї., 2004, 9. Іттипої. Меїйоав», 293, 207; 5ігісКіапа еї аї., 2009, 9. Раїйої., 218, 380), де показано, що вони регулюють гранулоцитопоез і відіграють певну роль в імунній відповіді.
Описаний кон'югат антитіла до СЕАСАМб і лікарського засобу, такий як антитіло до
СЕАСАМ6б з майтанзиноїдом, розроблений Сепепіесп (5ігісКіапа еї аї., 2009, 9. Раїйпої., 218, 380), для якого показано, що він індукує залежну від СЕАСАМ6б гематопоетичну токсичність у приматів, що не є людиною. Автори розглядали цю токсичність, пов'язувану з накопиченням кон'югата антитіла з лікарським засобом у кістковому мозку й елімінацією гранулоцитів і їх 60 клітин-попередників, як основний фактор небезпеки. Таким чином, більш точно, у терапевтичних цілях, перехресна реактивність антитіла до СЕАСАМ5 з СЕАСАМІ, СЕАСАМб,
СЕАСАМ7 або СЕАСАМ8 може знижувати терапевтичний індекс сполуки, збільшуючи токсичність для нормальних тканин. Таким чином, від одержання антитіл, специфічно спрямованих до СЕАСАМ5, що перехресно не реагують з іншими молекулами сімейства
СЕАСАМ, існує велика користь, особливо для застосування як кон'югата антитіла з лікарським засобом (АЮС) або з будь-яким іншим механізмом дії, що приводить до знищення клітини- мішені.
Крім того, оскільки СЕАСАМ5 описаний як експресований, хоча і на низькому рівні, у деяких нормальних клітинних тканинах, необхідно розробити антитіла до СЕАСАМ»5, здатні зв'язуватися з СЕАСАМ5 людини, а також з СЕАСАМ5 яванського макака (Масаса газсісшіагів), оскільки такі антитіла можна легко тестувати у доклінічних токсикологічних дослідженнях у яванських макаків з оцінкою їх показників безпеки. Хоча було показано, що ефективність терапевтичних антитіл може залежати від локалізації епітопа в мішені, як у випадку функціональних антитіл (ЮОоегп еї аІ. 2009, 9. ВіоІЇ. Спет. 284, 10254), так і у випадку, коли залучені ефекторні функції (Веег5 ей а). бетіп. НетаїйоЇ. 47:107-114), потрібно продемонструвати, що реагуюче перехресно антитіло людини/мавпи зв'язує епітопи в тих же повторюваних Ід-подібних гомологічних доменах білків людини і яванського макака.
Комбінація необхідності у видовій перехресній реактивності таких антитіл зі специфічністю відносно СЕАСАМ5О людини і Масаса Тазсісшагіх, наприклад з відсутністю перехресної реактивності з іншими представниками СЕАСАМ Масаса газсісціагі5 і людини, додає додатковий рівень складності, враховуючи загальну гомологію послідовностей білків СЕАСАМ людини і
Масаса газсісціагів.
Фактично, загальне парне вирівнювання послідовності СЕАСАМ5 Масаса Газсісшціагіє з послідовністю СЕАСАМ5 людини (ААДАБ1967.1/С1:180223, 702 амінокислоти) продемонструвало тільки 78,5 95 ідентичність. Гени СЕАСАМІ1, СЕАСАМ5 і СЕАСАМ6б Масаса тазсісціагі5 клоновані і проведене загальне вирівнювання доменів А, В і М людини і Масаса газсісціагі5. За допомогою цього вирівнювання попередньо визначено, що існує дуже мало областей, якщо вони взагалі існують, для локалізації ідеального епітопа, який був би загальним для СЕАСАМ5 людини і макака і не був би загальним з іншим представником сімейства. З цих причин очікувалося, що
Зо розробка антитіл, які перехресно реагують з СЕАСАМ5 людини і Масаса Гавзсісшіагіє без перехресної реактивності з іншими представниками СЕАСАМ людини і Масаса газсісціагі5, буде мати низьку імовірність успіху. Слід зазначити, що раніше описані антитіла до СЕАСАМ5 фактично ніколи не були документально доведені відносно перехресної реактивності у Масаса
Тазсісціагі5, з дуже невеликими виключеннями (МТ111, див. нижче).
У клінічних випробуваннях вже використовувалися антитіла до СЕАСАМ5 людини, такі як лабетузумаб Іттипотеадісв5 (також відомий як ИММ14, ЗпагкКеу еї аї., 1995, Сапсег Кезеагсі, 55, 5935). Показано, що це антитіло не зв'язується зі спорідненими антигенами, але перехресно не реагує з СЕАСАМ5 Масаса газсісціагіх. Слід зазначити, що антитіло МТ111 Місготеї (також відоме як антитіло МЕОБІ-565 МеаІтітипе) являє собою біспецифічне антитіло, що зв'язується з СЕАСАМ5 людини і СОЗ людини (Репд єї аЇ., Ріо5 ОМЕ, 7(5)е3641; МО 2007/071426).
Зазначено, що МТ111 одержане за допомогою злиття одноланцюжкового варіабельного фрагмента (5сЕм) антитіла, що розпізнає СЕАСАМ5О людини і яванського макака, з 5сЕм антитіла, що розпізнає СЮОЗ людини (постер Обегві єї а, ААСА Аппиа! Мееїїіпу Арі 2009,
Репмег, СО). Також опубліковано, що МТ111 не зв'язується з іншими представниками сімейства
СЕАСАМ (Реп еї аї!., Рі о5 ОМЕ, 7(5):е3641). МТ111 зв'язується з конформаційним епітопом у домені А2 СЕАСАМ5 людини. Цей конформаційний епітоп відсутній у варіанті сплайсингу
СЕАСАМ5 людини, який, поряд з повнорозмірним СЕАСАМЬ5, експресований на пухлинах (Репа еї аі,, РГо5 ОМЕ, 7(5):е3641). Крім того, доказів, що МТ111 зв'язується з тим же епітопом у
СЕАСАМ5 Масаса газсісціагі5, немає.
З метою одержання нових антитіл до поверхневого білла СЕАСАМ5 з оптимальними для терапевтичних цілей характеристиками автори винаходу імунізували мишей рекомбінантними білками і пухлинними клітинами. Вони піддали скринінгу сотні гібридом з використанням ЕГІЗА на декілька рекомбінантних білків сімейства СЕАСАМ і проточної цитометрії з відповідними лініями клітин для відбору тільки імуноглобулінів (92) з переважними характеристиками.
Несподівано, вони змогли відібрати гібридомні клони й одержати відповідні зрілі ІД, що мають усі бажані характеристики. Вони з високою афінністю специфічно зв'язуються з доменом АЗ3-ВЗ3
СЕАСАМ5 людини і не розпізнають біли СЕАСАМІ1, СЕАСАМб, СЕАСАМ? і СЕАСАМВ8 людини.
Відносно клітин ці антитіла демонструють високу афінність відносно пухлинних клітин (у наномолярному діапазоні). Крім того, ці антитіла також зв'язуються з білюм СЕАСАМ5 Масаса 60 Тазсісціагі5 з відношенням афінностей у мавпи/людини, що менше або дорівнює 10. Антитіла за винаходом специфічно зв'язуються з доменом АЗ-ВЗ3 СЕАСАМ5 Масаса ГТазсісшагіб5 і не розпізнають інших представників СЕАСАМ Масаса газсісшціагів.
Внаслідок націлювання на домен АЗ-В3 СЕАСАМ5 ці антитіла мають збільшений потенціал до ураження пухлин, оскільки вони мають здатність до зв'язування як з повнорозмірним
СЕАСАМ5 людини, так і з його варіантом сплайсингу, ідентифікованим Реп еї аї. (РІ о5 ОМЕ, 7(5):е3641).
Нарешті, СЕАСАМ5 описаний у літературі як поверхневий білок, що погано інтерналізується (розглянуто у ЗспПтіаї еї аї., 2008, Сапсег Іттипої. Іттипоїйег. 57, 1879), і, таким чином, не може бути придатною мішенню для кон'югатів антитіл з лікарськими засобами. Незважаючи на те, що було опубліковано на відомому рівні техніки, автори винаходу продемонстрували, що антитіла, які вони одержали, здатні приводити до інтерналізації комплексу СЕАСАМ5-антитіло після зв'язування і при комбінації з цитотоксичним засобом індукувати цитотоксичну активність відносно пухлинних клітин іп міго. Ці ж антитіла, комбіновані з цитотоксичним засобом, також здатні до суттєвого інгібування росту пухлини у мишей, що несуть первинні пухлини товстої кишки і шлунка людини.
Визначення
Як використовують у даному описі, "СЕАСАМ5" означає "споріднену раково-ембріональному антигену молекулу клітинної адгезії 5", також відому як "СОббе" (кластер диференціювання 6ббе) або РЕА. СЕАСАМ5 являє собою глікопротеїн, залучений у клітинну адгезію. СЕАСАМ5 високо експресований, зокрема на поверхні клітин колоректальних пухлин, клітин пухлин шлунка, легень і матки.
Еталонна послідовність повнорозмірного СЕАСАМ5 людини, що містить сигнальний пептид (положення 1-34) і пропептид (положення 686-702), доступна в базі даних СепВапкК під номером доступу ААА5БІ1967.1 (5БО ІО МО:52). В європеоїдній популяції ідентифіковано п'ять несинонімічних ЗМР з частотою, більшою 2 95, чотири з них локалізовані в домені М (у положеннях 80, 83, 112, 113) і останній - у домені А2 (у положенні 398) СЕСАМ5 людини (5ЕО
ІО МО:58). сепВапК АДА51967.1 містить основний гаплотип (І8О, У83, 1112, 1113 ії Е398).
Послідовність позаклітинного домену СЕАСАМ5 Масаса гТазсісціагіх, клонована авторами винаходу, описана в ЗЕО ІЮ МО:53.
Зо "Домен" може являти собою будь-яку область білка, як правило, визначувану на основі гомологій послідовностей, і часто належить до конкретної структурної або функціональної структури. Відомо, що представники сімейства СЕАСАМ складаються з Ід-подібних доменів.
Термін домен у даному описі, використовують для позначення окремих Ід-подібних доменів, таких як "домен М", або для груп послідовних доменів, таких як "домен АЗ-В3".
Доменна організація СЕАСАМ5 людини є наступною (на основі послідовності АААБ1967.1
СепВапк; 5ЕО ІО МО:52):
Таким чином, домен АЗ-В3 СЕАСАМ5 людини складається з амінокислот у положеннях 499- 685 5ЕО ІЮ МО:52.
Доменна організація СЕАСАМ5 Масаса Тазсісшагіє є наступною (на основі клонованої послідовності позаклітинного домену; 5ЕО ІЮ МО:53):
Таким чином, домен АЗ-В3 СЕАСАМ5 Масаса Газсісціагіє складається з амінокислот у положеннях 465-654 5ЕО ІЮ МО:53. "Кодуюча послідовність" або послідовність, "кодуюча" продукт експресії, такий як РНК, поліпептид, білок або фермент, являє собою нуклеотидну послідовність, яка при експресії приводить до продукції цих РНК, поліпептиду, білка або ферменту, тобто нуклеотидна послідовність кодує амінокислотну послідовність цього поліпептиду, білка або ферменту.
Кодуюча білок послідовність може містити старт-кодон (як правило, АТС) і стоп-кодон.
Як використовують у даному описі, указання на конкретні білки (наприклад, антитіла) може включати поліпептид з природною амінокислотною послідовністю, а також варіанти і модифіковані форми незалежно від їх походження або способу одержання. Білок з природною амінокислотною послідовністю являє собою білок з такою ж амінокислотною послідовністю, як одержують із природних джерел. Такі білюим з природною послідовністю можна виділяти з природних джерел або можна одержувати стандартними рекомбінантними способами і/або способами синтезу. Білки з природною послідовністю конкретно включають природні укорочені або розчинні форми, варіанти природних форм (наприклад, альтернативно сплайсовані форми), природні алельні варіанти і форми, що включають посттрансляційні модифікації. Білки з природною послідовністю включають білки, що несуть посттрансляційні модифікації, такі як глікозилування або фосфорилування, або інші модифікації визначених амінокислотних залишків.
Термін "ген" означає послідовність ДНК, кодуючу або відповідну конкретній послідовності амінокислот, яка включає весь або частину одного або декількох білків або ферментів, і може включати або не включати регуляторні послідовності ДНК, такі як промоторні послідовності, що визначають, наприклад, умови, у яких відбувається експресія гена. Деякі гени, що не є структурними генами, можуть транскрибуватися з ДНК у РНК, але не транслюватися в амінокислотну послідовність. Інші гени можуть функціонувати як регулятори структурних генів або як регулятори транскрипції ДНК. Зокрема, термін ген може призначатися для геномної послідовності, кодуючої білок, тобто послідовності, що містить послідовності регулятора, промотору, інтронів і екзонів.
Послідовність, "щонайменше на 85 95 ідентична еталонній послідовності", являє собою послідовність, по усій своїй довжині на 85 95 або більше, наприклад 90 95, 91 95, 92 95, 93 Фо, 94
Фо, 95 905, 96 905, 97 95, 98 95 або 99 95, ідентичну зі всією еталонною послідовністю.
Відсоток "ідентичності послідовностей" можна визначати, порівнюючи дві послідовності, оптимально вирівняні у вікні порівняння, де частина полінуклеотидної або поліпептидної послідовності у вікні порівняння для оптимального вирівнювання двох послідовностей може містити додавання або делеції (тобто пропуски) у порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить додавань або делецій). Відсоток розраховують, визначаючи кількість положень, у яких в обох послідовностях знаходиться ідентичний залишок основи нуклеїнової кислоти або амінокислоти, з одержанням кількості співпадаючих положень, ділячи кількість співпадаючих положень на загальну кількість положень у вікні порівняння і множачи результат на 100 з одержанням відсотка ідентичності послідовностей. Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння проводять за допомогою глобального парного вирівнювання, наприклад, з використанням алгоритму Нідлмана і Вунша, 9. Мої. Віої. 48:443 (1970). Відсоток ідентичності послідовностей можна легко визначати, наприклад, з використанням програми МееаІе, з матрицею ВГОБИОМб62, і наступних параметрів штраф за створення пропуску-10, штраф за продовження пропуску-0,5. "Консервативна амінокислотна заміна" являє собою амінокислотну заміну, у якій амінокислотний залишок заміняють іншим амінокислотним залишком з групою К бічного ланцюга з подібними хімічними властивостями (наприклад, зарядом, розміром або гідрофобністю). Як правило, консервативна амінокислотна заміна змінює функціональні властивості білка незначно. Приклади груп амінокислот, що містять бічні ланцюги з подібними хімічними властивостями, включають 1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин; 2) бічні ланцюги з аліфатичною гідроксильною групою: серин і треонін; 3) бічні ланцюги, що містять амід: аспарагін і глутамін; 4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин і триптофан; 5) основні бічні ланцюги: лізин, аргінін і гістидин; б) кислотні бічні ланцюги: аспарагінова кислота і глутамінова кислота; і 7) сірковмісні бічні ланцюги: цистеїн і метіонін.
Групи для консервативних амінокислотних замін також можна визначати на основі розміру амінокислот. "Антитіло" може бути природним або звичайним антитілом, у якому два важкі ланцюги зв'язані один з одним дисульфідними зв'язками і кожен важкий ланцюг зв'язаний дисульфідним зв'язком з легким ланцюгом. Існує два типи легких ланцюгів, лямбда (І) і каппа (К). Існує п'ять основних класів (або ізотипів)у важких ланцюгів, що визначають функціональну активність молекул антитіл: ІМ, дО, Іде, ІдА і ІДЕ. Кожен ланцюг містить визначену послідовність доменів.
Легкий ланцюг містить два домени або області, варіабельний домен (МІ) і константний домен бо (СУ). Важкий ланцюг містить чотири домени, варіабельний домни (МН) і три константних домени
(СНІ, СН? ї СНЗ, у сукупності позначувані як СН). Варіабельні області легких (МІ) і важких (МН) ланцюгів визначають розпізнавання і специфічність антигену при зв'язуванні. Домени константних областей легких (СІ) і важких (СН) ланцюгів забезпечують важливі біологічні властивості, такі як асоціація ланцюгів антитіл, секреція, проходження трансплацентарного бар'єра, зв'язування комплементу і зв'язування з рецепторами Ес (ЕсА). Фрагмент Ем являє собою М-кінцеву частину фрагмента Рар імуноглобуліну і складається з варіабельних частин одного легкого ланцюга й одного важкого ланцюга. Специфічність антитіла полягає в структурній комплементарності ділянки зв'язування антитіла й антигенної детермінанти. Ділянки зв'язування антитіл складені з залишків, що переважно знаходяться в гіперваріабельних областях або областях, що визначають комплементарність (СОК). Іноді на загальну структуру домену і, таким чином, на ділянку зв'язування впливають залишки з негіперваріабельних або каркасних областей (ЕК). Таким чином, області, що визначають комплементарність, або СОК, належать до послідовностей амінокислот, які спільно визначають афінність і специфічність зв'язування природної області Ем природних ділянок зв'язування імуноглобулінів. Кожний з легких і важких ланцюгів імуноглобулінів містить три СОК, що позначаються СОК1-І, СОВ2-Ї,
СОВЗ-Ї ії СОК1-нН, СОН2г-Н, СОВЗ-Н, відповідно. Таким чином, звичайна антигензв'язувальна ділянка антитіла містить шість СОК, що включають набір СОМ з кожної області М важкого і легкого ланцюгів. "Каркасні області" (ЕК) належать до послідовностей амінокислот, що знаходяться між СОК, тобто до тих частин варіабельних областей легких і важких ланцюгів імуноглобулінів, що є відносно консервативними у різних імуноглобулінів одного виду. Кожний з легких і важких ланцюгів імуноглобуліну містить чотири ЕЕ, що позначаються ЕК1-І, ЕВ2-І, ЕВЗ-Ї, ЕВА-Ї. і ЕК1-
Н, ЕВ2-Н, ЕВЗ-Н, ЕНВА-Н, відповідно.
Як використовують у даному описі, "каркасна область людини" являє собою каркасну область, яка по суті ідентична (приблизно на 85 95 або більше, наприклад 90 95, 91 905, 92 95, 93
Фо, 94 905, 95 905, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95) каркасній області природного антитіла людини.
У контексті винаходу визначення СОК/ЕК у легких або важких ланцюгах імуноглобулінів варто проводити на основі визначення ІМС (і еїгапс еї аї. Оем. Соптр. Іттипої., 2003, 27(1):55- 77; мли ітд. огу).
Зо Як використовують у даному описі, термін "антитіло" означає звичайні антитіла і їх фрагменти, а також однодоменні антитіла і їх фрагменти, зокрема варіабельні області важких ланцюгів однодоменних антитіл, і химерні, гуманізовані, біспецифічні або поліспецифічні антитіла.
Як використовують у даному описі, антитіло або імуноглобулін також включає "однодоменні антитіла", які описані зовсім нещодавно і які являють собою антитіла, у яких області, що визначають комплементарність, Є частиною однодоменного поліпептиду. Приклади однодоменних антитіл включають антитіла з важких ланцюгів, антитіла, позбавлені легких ланцюгів від природи, однодоменні антитіла, одержувані зі звичайних чотириланцюжкових антитіл, сконструйовані однодоменні антитіла. Однодоменні антитіла можна одержувати у будь- яких видів, включаючи, але не обмежуючись ними, мишу, людину, верблюда, ламу, козу, кролика, корову. Однодоменні антитіла можуть являти собою природні однодоменні антитіла, відомі як антитіла з важких ланцюгів, позбавлені легких ланцюгів. Зокрема, антитіла з важких ланцюгів, від природи позбавлені легких ланцюгів, продукують види Сатеїїдає, наприклад верблюд, одногорбий верблюд, лама, альпака і гуанако. В антитілах з важких ланцюгів сімейства верблюдячих також відсутній домен СНІ.
Варіабельна область важкого ланцюга цих однодоменних антитіл, позбавлених легких ланцюгів, відома в даній галузі як "УНН" або "нанотіло". Подібно звичайним доменам УН, УНН містить чотири ЕК і три СОК. Нанотіла мають визначені переваги над звичайними антитілами: вони приблизно в десять разів менше, ніж молекули Ідс, і, як наслідок, правильно згорнуті функціональні нанотіла можна одержувати за допомогою експресії іп міго, досягаючи при цьому високого виходу. Крім того, нанотіла є дуже стабільними і стійкими до дії протеаз. Властивості і продукція нанотіл розглянуті в Нагптзеп апа Ое Наага Н.). (Аррі. Місгобіої!. Віотесппої. 2007 Мом; 77(1):13-22).
Як використовують у даному описі, термін "моноклональне антитіло", або "тАБ", стосується молекули антитіла однієї амінокислотної послідовності, що спрямована до конкретного антигену, і його не слід витлумачувати як потребуючий продукції антитіла яким-небудь конкретним способом. Моноклональне антитіло можна одержувати за допомогою одного клону або В-клітини гібридоми, а також воно може бути рекомбінантним, тобто одержаним за допомогою білкової інженерії.
Термін "химерне антитіло" стосується сконструйованого антитіла, яке, у найбільш широкому розумінні, містить одну або декілька областей з одного антитіла й одну або декілька областей з одного або декількох інших антитіл. В одному з варіантів здійснення химерне антитіло містить домен МН і домен МІГ. антитіла, одержаний у тварини, що не є людиною, в асоціації з доменом
СН ї доменом СІ. іншого антитіла, в одному з варіантів здійснення антитіла людини. Як тварину, що не є людиною, можна використовувати будь-яку тварину, таку як миша, щур, хом'як, кролик або т. п. Химерне антитіло також може означати поліспецифічне антитіло зі специфічністю щонайменше відносно двох різних антигенів.
Термін "гуманізоване антитіло" стосується антитіла, яке повністю або частково походить від тварини, що не є людиною, і яке модифіковане з заміною визначених амінокислот, наприклад у каркасних областях доменів УН і Мі, для уникнення або мінімізації імунної відповіді у людей.
Константні домени гуманізованого антитіла здебільшого є доменами СН і СІ. людини. "Фрагменти" (звичайних) антитіл містять частину інтактного антитіла, зокрема антигензв'язувальної області або варіабельної області інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіл включають Ем, Раф, Е(аб)г, Раб, авЕм, (авЕм)», взсЕм, 5е(Ем)», діатіла, біспецифічні і поліспецифічні антитіла, одержані з фрагментів антитіл. Фрагмент звичайного антитіла також може бути однодоменним антитілом, таким як антитіло з важкого ланцюга або
УНН.
Термін "Бар" означає фрагмент антитіла з молекулярною масою приблизно 50000 і антигензв'язувальною активністю, у якому за допомогою дисульфідного зв'язку зв'язана приблизно половина М-кінцевої ділянки важкого ланцюга і весь легкий ланцюг. Як правило, його одержують із фрагментів за допомогою обробки Іде протеазою папаїном.
Термін "Каб" стосується фрагмента антитіла з молекулярною масою приблизно 100000 і антигензв'язувальною активністю, яка трохи вище, ніж у 2 ідентичних фрагментів Раб, зв'язаних дисульфідним зв'язком у шарнірній області. Як правило, його одержують із фрагментів, за допомогою обробки Ідсї протеазою пепсином.
Термін "Бар" стосується фрагмента антитіла з молекулярною масою приблизно 50000 і антигензв'язувальною активністю, який одержують за допомогою руйнування дисульфідного зв'язку ЕК(аб)2 у шарнірній області.
Зо Поліпептид одноланцюжкового Ем ("5СЕм") являє собою ковалентно зв'язаний гетеродимер
МН.МІ, який, як правило, експресований зі злиттям генів, що містять кодуючі МН і МІ. гени, зв'язані кодуючим пептид лінкером. Фрагмент 5сЕм людини за винаходом містить СОК, які утримуються в належній конформації, наприклад, з використанням способів генетичної рекомбінації. Двовалентні і полівалентні фрагменти антитіл, такі як двовалентні 5с(Ем)2, можуть формуватися або спонтанно, за допомогою асоціації одновалентних 5сЕм, або їх можна одержувати, зв'язуючи одновалентні 5сЕм пептидним лінкером. "а5ЕРу" являє собою гетеродимер
МН, стабілізований дисульфідним зв'язком. "(азЕм)2" означає два а5гЕм, зв'язані пептидним лінкером.
Термін "біспецифічне антитіло" або "В5АБ" означає антитіло, у якому в одній молекулі скомбіновані антигензв'язувальні ділянки двох антитіл. Таким чином, В5АБ здатні зв'язувати два різні антигени одночасно. Для конструювання, модифікації і продукції антитіл або похідних антитіл з бажаним набором властивостей зв'язування і ефекторних функцій зі зростаючою частотою використовували генну інженерію, як описано наприклад, у ЕР 2050764 А1.
Термін "поліспецифічне антитіло" означає антитіло, у якому в одній молекулі скомбіновані антигензв'язувальні ділянки двох або більше антитіл.
Термін "діатіла" стосується невеликих фрагментів антитіл 3 двома антигензв'язувальними ділянками, де ці фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (МН), зв'язаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (МІ) в одному поліпептидному ланцюзі (МН-МІ).
Використовуючи лінкер, що є занадто коротким, щоб дозволити спарювання двох доменів одного і того ж ланцюга, домени примушують спарюватися з комплементарними доменами іншого ланцюга й одержують дві антигензв'язувальні ділянки.
Термін "гібридома" означає клітину, яку одержують, піддаючи В-клітину, одержану за допомогою імунізації ссавця, що не є людиною, антигеном, клітинному злиттю з мієломною клітиною, одержаною у миші, або т. п., яка продукує бажане моноклональне антитіло з антигенною специфічністю.
Під "очищеним" і "виділеним" мають на увазі, коли вони стосуються поліпептиду (тобто антитіла за винаходом) або нуклеотидної послідовності, що зазначена молекула присутня по суті за відсутності інших біологічних макромолекул того ж типу. Як використовують у даному описі, термін "очищений" означає, що присутньо щонайменше 75 95, 85 95, 95 95, 96 90, 97 95 або бо 98 95 по масі біологічних макромолекул одного типу. "Виділена" молекула нуклеїнової кислоти,
кодуюча конкретний поліпептид, стосується молекули нуклеїнової кислоти, що по суті не містить інших молекул нуклеїнової кислоти, які не кодують зазначений поліпептид; однак молекула може містити деякі додаткові основи або групи, які не здійснюють несприятливого впливу на основні характеристики композиції.
Як використовують у даному описі, термін "індивідуум" означає ссавця, такого як гризун, кішка, собака і примат. Крім того, індивідуум за винаходом являє собою людину.
Антитіла
Автори винаходу домоглися успіху в одержанні, скринінгу і відборі специфічних відносно
СЕАСАМХ5 антитіл миші, які демонструють високу афінність відносно білу»а СЕАСАМ5 людини і
Масаса Тазсісціагіє і які по суті перехресно не реагують з біллами СЕАСАМІ, СЕАСАМБб,
СЕАСАМ? і СЕАСАМВ8 людини і з біллами СЕАСАМІ, СЕАСАМб і СЕАСАМ8 Масаса газсісшціагів.
Автори винаходу визначили послідовність варіабельних областей важких і легких ланцюгів таких моноклональних антитіл, так званих антитіл МАБ1, МАБ2, МАБЗ, МАБА і МАБ5.
Так називане "антитіло МАБІ" містить: варіабельний домен важкого ланцюга, що складається Кк! послідовності
ЕММІ МЕБОСОЇ МКРОСБІ КІ БСААБОЕТЕ55МАМОУМУВОТРЕКВІ ЕМУМАТІЗБСЗМІУМІ ОБУКОа
ВЕТІЗАОМАКМТІ МІ ОМ55І В5ЕЕОТАМУУСАВРАУУаМРАМОММУ СЯМЮСТОМУТУ5 (5ЕО ІЮ МО:31, де СОК представлені напівжирними символами), у якому ЕК1-Н охоплює положення амінокислот 1-25, СОВ1Т-Н охоплює положення амінокислот 26-33 (5ЕО ІЮ МО:1), ЕВ2-Н охоплює положення амінокислот 34-50, СОВ2-Н охоплює положення амінокислот 51-58 (ЗЕО ІЮ
МО:2), ЕВЗ-Н охоплює положення амінокислот 59-96, СОВЗ-Н охоплює положення амінокислот 97-109 (5ЕО ІЮ МО:3) ії ЕК4-Н охоплює положення амінокислот 110-120, і варіабельний домен легкого ланцюга, що складається Кк! послідовності
РІСМТОБОКЕМЗТ ЗМИВУ СКАБОММаТММАМУООКРООБРКРІ ІУ5АБУВУЗаМРОВЕТОа5а
ЗаТОЕТІ ТІБММОБЕОІ АЕМЕСООСУМОУ РІ МУТРИаСсИТткКіІ ЕК (ЗЕО ІЮО МО:32, де СОР представлені напівжирними символами), у якому ЕК1-і охоплює положення амінокислот 1-26, СОВ1-І охоплює положення амінокислот 27-32 (5ЕО ІЮ МО:4), ЕН2-Ї. охоплює положення амінокислот 33-49, СОН2-Ї охоплює положення амінокислот 50-52, ЕВЗ-Ї охоплює положення амінокислот 53-88, СОНВЗ-І охоплює положення амінокислот 89-98 (5ЕБО І МО:б) і ЕК4-Ї охоплює положення амінокислот 99-108.
Так називане "антитіло МАБ2" містить: варіабельний домен важкого ланцюга, що складається Кк! послідовності
ЕМО ОБЕБОаСМІ МКРОСБІ КІ БСААБОаЄМЕЗ5МОМБУУВОТРЕКВІ ЕМУМАМІБ5С.:И СІ МЕРОТМОС
ВЕТМ5АОМАКМТІ МІ ОММ5І К5ЕОТАІМУСААНУБГИ5ЗаРЕАМУУС,СОСТІ МТУБА (ЗЕО ІО МО:33, де
СОК представлені напівжирними символами), у якому ЕК1-Н охоплює положення амінокислот 1-25, СОВ1-Н охоплює положення амінокислот 26-33 (5ЕО ІЮ0 МО:7), ЕВ2-Н охоплює положення амінокислот 34-50, СОВ2-Н охоплює положення амінокислот 51-58 (5ЕО ІЮО МО:8), ЕВЗ-Н охоплює положення амінокислот 59-96, СОВЗ-Н охоплює положення амінокислот 97-109 (5ЕО
ІО МО:9) і ЕК4-Н охоплює положення амінокислот 110-120, і варіабельний домен легкого ланцюга, що складається Кк! послідовності
ІОМТО5РАБІ БАБМОЕТМТІ СВАБЕМІЕБМІ АМ/МООКОСКОРОГІ МУМТКТАгЕСМРОВЕЗОбО5
СТОЕБ5І КІМБІ ОРЕОРаБУМСОННМСТРЕТРОа5БаткіІ БІК (5ЕО ІЮ МО:34, де СОК представлені напівжирними символами), у якому ЕК1-ї охоплює положення амінокислот 1-26, СОВ1-І охоплює положення амінокислот 27-32 (5ЕО 10 МО:10), ЕН2-Ї. охоплює положення амінокислот 33-49, СОН2-Ї охоплює положення амінокислот 50-52, ЕВЗ-Ї охоплює положення амінокислот 53-88, СОВЗ-Ї охоплює положення амінокислот 89-97 (5ЕБО ІЮО МО:12) і ЕК4-Ї охоплює положення амінокислот 98-107.
Також одержаний варіант антитіла МАБ2, за допомогою внесення в СОК2-Ї заміни К5Б2Е.
Цей варіант, що у даному описі позначений "Мабраквгв", має по суті таку ж афінність відносно
СЕАСАМХ5 людини і Масаса газсісціагіх, як і МАБ2.
Так називане "антитіло МАБ3З" містить: варіабельний домен важкого ланцюга, що складається Кк! послідовності
ЕМКІ МЕЗОСИЇ МКРИаСБІ ТІ РСААБОЕЄТЕЗАУАМОЗУУВОТРЕКВІ ЕММАБВІЗЗОС,ОТтУУРОоБУКОВ
ЕТМ5АОМАВМІ Р ОМ55І АБЕОТОМУМСАВУМУМО5БЕЇ ОМ СсОСТТІТУ55 (ЗЕО ІО МО:35, де
СОК представлені напівжирними символами), у якому ЕК1-Н охоплює положення амінокислот 1-25, СОВІ-Н охоплює положення амінокислот 26-33 (5ЕО ІО МО:13), ЕВ2-Н охоплює положення амінокислот 34-50, СОВ2-Н охоплює положення амінокислот 51-57 (5ЕО ІЮ МО:14),
ЕВЗ-Н охоплює положення амінокислот 58-95, СОНЗ-Н охоплює положення амінокислот 96-108 (ЗЕО ІО МО:15) і ЕК4-Н охоплює положення амінокислот 109-119, і варіабельний домен легкого ланцюга, що складається Кк! послідовності
РІММТО5ОВЕМ5Т ЕСОВУЗУТСКАБОММатММАММООКРИООБРКАЇ ІМ5АБУВУБаМРОВЕТОа5а
ЗОаТОЕТІ ТІБММОЗЕОСГ АЕМЕСООСУМММУРІМТРОССОТКІ БІК (ЗБО 10 МОЗ36б, де Сом представлені напівжирними символами), у якому ЕК1-Ї. охоплює положення амінокислот 1-26,
СОВ1-Ї охоплює положення амінокислот 27-32 (ЗЕБО ІЮО МО:16), ЕН2-Ї. охоплює положення амінокислот 33-49, СОВ2-Ї. охоплює положення амінокислот 50-52, ЕНЗ-Ї. охоплює положення амінокислот 53-88, СОВЗ3-Ї охоплює положення амінокислот 89-98 (ЗЕО ІЮ МО:18) і ЕК4-ІЇ охоплює положення амінокислот 99-108.
Так називане "антитіло МАБА4" містить: варіабельний домен важкого ланцюга, що складається Кк! послідовності
ЕМОЇ МЕЗОСОЇ МКРОСБІ КІ БСААБОЄТЕ55УОМУМВОТРЕКАІ ЕМ/УМАРІББУСОЯВТУУАОТУКО
ВЕТІБНОМАКМТІ МІ ОМ55І КОЕОТАМЕМСААНУБат5аРЕАМУУСОСТІ МТУ5А (5ЕО ІЮО МО:37, де
СОК представлені напівжирними символами), у якому ЕК1-Н охоплює положення амінокислот 1-25, СОВІ-Н охоплює положення амінокислот 26-33 (5ЕО І МО:19), ЕВ2-Н охоплює положення амінокислот 34-50, СОВ2-Н охоплює положення амінокислот 51-58 (5ЕО ІО МО:20),
ЕВЗ-Н охоплює положення амінокислот 59-96, СОНЗ-Н охоплює положення амінокислот 97-109 (ЗЕО І МО:21) і ЕК4-Н охоплює положення амінокислот 110-120, і варіабельний домен легкого ланцюга, що складається Кк! послідовності
ІОМТО5РАБІ БАБМСОЕТМТІ СВАЗЕМІМОМЕАММООКОСКОРОЇ І МУМАКІ АЕСМРОНЕЗОБИабБа
ТОЕ5І КІМБІ ОРЕОРаТУМСОННУСІРЕТРОБОТКІ БІК (5БО ІЮ МО:38, де СОК представлені напівжирними символами), у якому ЕК1-ї охоплює положення амінокислот 1-26, СОВ1-І охоплює положення амінокислот 27-32 (5ЕО 10 МО:22), ЕН2-Ї. охоплює положення амінокислот 33-49, СОН2-Ї охоплює положення амінокислот 50-52, ЕВЗ-Ї охоплює положення амінокислот 53-88, СОВЗ-Ї охоплює положення амінокислот 89-97 (5ЕБО ІЮО МО:24) і ЕК4-Ї охоплює положення амінокислот 98-107.
Так називане "антитіло МАБ5" містить: варіабельний домен важкого ланцюга, що складається Кк! послідовності
ЕГО МЕБССМІ МКРОСБІ КІ БСААБИаГАєЗБМОМОУМУВОТРЕКАГ ЕМ УТМІМЗОССТП УУРОТУКОа
ВЕТІБНОМАВМТІ МІ ОМ55І КЗЕОТАІММСТАНМРО5БОРЕАУМСОСТІ МТУ5А (ЗЕО ІЮО МО:39, де
Зо СОК представлені напівжирними символами), у якому ЕК1-Н охоплює положення амінокислот 1-25, СОВІ-Н охоплює положення амінокислот 26-33 (5ЕО І МО:25), ЕНВ2-Н охоплює положення амінокислот 34-50, СОВ2-Н охоплює положення амінокислот 51-58 (5ЕО ІЮ МО:26),
ЕВЗ-Н охоплює положення амінокислот 59-96, СОНЗ-Н охоплює положення амінокислот 97-109 (ЗЕО ІО МО:27) і ЕК4-Н охоплює положення амінокислот 110-120, і варіабельний домен легкого ланцюга, що складається Кк! послідовності
ІОМТО5РАБІ БАБМОЕТМТІ СВАБЕМІМОМІ А МООКОСКОРОГІ МУМАКТІ ТЕСМРОВЕЗО5Иа5
СТОЕБ5І КІМБІ ОРЕОРаБУМСОННМСТРЕТРОа5БаткКіІ БІК (5ЕО ІЮ МО:40, де СОК представлені напівжирними символами), у якому ЕК1-і охоплює положення амінокислот 1-26, СОВ1-І охоплює положення амінокислот 27-32 (5ЕО 10 МО:28), ЕН2-Ї. охоплює положення амінокислот 33-49, СОН2-Ї охоплює положення амінокислот 50-52, ЕВЗ-Ї охоплює положення амінокислот 53-88, СОВЗ-Ї охоплює положення амінокислот 89-97 (5ЕБО ІЮО МО:30) і ЕК4-Ї охоплює положення амінокислот 98-107.
Таким чином, винахід стосується антитіла, яке зв'язується з СЕАСАМ5 людини і Масаса
Тазсісціагів.
В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом зв'язується з доменами АЗ-ВЗ
СЕАСАМ5 людини і Масаса Тавзсісціагіз. Більш конкретно, антитіло може зв'язуватися з доменами АЗ-ВЗ3 людини і Масаса їазсісцшіагіз незалежно від того, чи експресовані вони у виділеній формі або знаходяться в розчинному позаклітинному домені або в заякореному у мембрані повнорозмірному білку СЕАСАМ5.
Специфічність антитіл до домену АЗ-ВЗ3 СЕАСАМ5 людини є вигідною, оскільки в європеоїдній популяції в цьому домені не повідомлялося ні про один 5МР з частотою, більшою 2 до, що мінімізує ризик того, що у частині популяції епітоп(и) антитіла в СЕАСАМЗ5 змінені.
Винахід також стосується антитіла, що конкурує за зв'язування з доменом АЗ-ВЗ білків
СЕАСАМ5 людини і Масаса їазсісціагіє з антитілом, що містить варіабельні області важких і легких ланцюгів антитіла, вибраного з групи, що складається з так званих антитіл МАБІ, МАБ2,
МАБакзогв, МАБЗ, МАБА і МАБ»5, тобто вибраних із групи, що складається з: а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО:31 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО:32; р) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:33 і 60 варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО:34;
с) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності «ЕС ІЮ МО:33 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:34, у якому К у положенні 52 замінений на Е; а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності зХЕО ІЮ МО:З5 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФБЕО ІЮ МО:36; е) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО:37 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО:38; і
І) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:39 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО:40.
Здатність антитіла-кандидата конкурувати за зв'язування з доменом АЗ-ВЗ білків СЕАСАМ5 людини і Масаса Тазсісціагіє з антитілом, що містить варіабельні області важких і легких ланцюгів антитіла, вибраного з групи, що складається з антитіл МАБІ, МАБ2, МАБЗ, МАБА і
МАБ5О (далі позначувані як "еталонне" антитіло), можна легко оцінювати, наприклад, за допомогою конкурентного ЕГІЗА, де антиген (тобто домен АЗ-В3 СЕАСАМ5 людини або Масаса
Тазсісціагі5 або поліпептид, який містить або складається з фрагмента СЕАСАМ5 людини або
Масаса Тазсісцшагі5, що містить домен АЗ-В3, зокрема позаклітинний домен СЕАСАМ5 людини або Масаса їазсісціагіє) зв'язаний з твердою підкладкою, і додають два розчини, що містять антитіло-кандидат і еталонне антитіло, відповідно, і антитілам дають можливість конкурувати за зв'язування з антигеном. Потім можна вимірювати кількість еталонного антитіла, зв'язаного з антигеном, і порівнювати з кількістю еталонного антитіла, зв'язаною з антигеном, коли її вимірюють відносно негативного контролю (наприклад, розчину, що не містить антитіла).
Кількість зв'язаного еталонного антитіла в присутності антитіла-кандидата, зменшена в порівнянні з кількістю зв'язаного еталонного антитіла в присутності негативного контролю, означає, що антитіло-кандидат конкурувало з еталонним антитілом. З метою зручності еталонне антитіло для полегшення детекції зв'язаного еталонного антитіла можна мітити (наприклад, флуоресцентно)о. Можна проводити повторні вимірювання з серійними розведеннями антитіла-кандидата і/або еталонного антитіла.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, таке антитіло і, наприклад, антитіло, що конкурує за зв'язування з доменом АЗ-В3 білків СЕАСАМ5 людини і Масаса гТазсісціагіє з
Зо антитілом, як визначено в Б), с), е) і У вище, зв'язується з двома областями домену АЗ-ВЗ білка
СЕАСАМ5 людини, що складаються з амінокислот у положеннях 109-115 (5ЕО ІЮ МО:76) і амінокислот у положеннях 131-143 (ЗЕО ІЮ МО:77) домену АЗ-В3 білка СЕАСАМ5 людини, відповідно. Фактично, ідентифіковано, що конформаційний епітоп для антитіла МАБ2 лежить в областях 109-115 і 131-143 домену АЗ-В3 білла СЕАСАМ5 людини, і, оскільки МАБ2, МАБА і
МАБ5 є структурно близькоспорідненими, автори винаходу вважають, що зазначені антитіла зв'язуються з одним і тим же епітопом.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, антитіло за винаходом специфічне до поверхневих білків СЕАСАМ5 людини і Масаса Газсісціагіє. В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом не зв'язується або по суті перехресно не реагує з біллами СЕАСАМІ1 людини, СЕАСАМб людини, СЕАСАМ7 людини, СЕАСАМ8 людини, СЕАСАМІ Масаса
Табхсісціагіз, СЕАСАМ6б Масаса їазсісціагі5 і СЕАСАМ8 Масаса Тазсісціагів.
Зокрема, антитіло не зв'язується або по суті перехресно не реагує з позаклітинним доменом зазначених вище білків СЕАСАМ людини і Масаса газсісціагів.
Повнорозмірний біль СЕАСАМІ людини доступний у базі даних СсепВапКк під номером доступу МР 001703.2 (5ЕО ІЮ МО:11). Позаклітинний домен СЕАСАМІ людини складається з амінокислот у положеннях 35-428 5ЕО ІЮ МО:11. Повнорозмірний біллк СЕАСАМб6 людини доступний у базі даних СепВапкК під номером доступу МР 002474.3 (5ЕБО ІЮ МО:71).
Позаклітинний домен СЕАСАМ6 людини складається з амінокислот у положеннях 35-327 5ЕО
ІО МО:71.
Повнорозмірний білок СЕАСАМ7 людини доступний у базі даних сСепВапк під номером доступу МР. 008821.1 (5ЕО І МО:72). Позаклітинний домен СЕАСАМ7 людини складається з амінокислот у положеннях 36-248 5ЕО ІЮ МО:72.
Повнорозмірний біллк СЕАСАМ8 людини доступний у базі даних СепВапК під номером доступу МР 001807.2 (5ЕО І МО:73). Позаклітинний домен СЕАСАМ8 людини складається з амінокислот у положеннях 35-332 5ЕО ІЮ МО:73.
Позаклітинний домен СЕАСАМІ М.азсісціагіз складається з амінокислот у положеннях 35- 428 повнорозмірного білка, тобто амінокислот 1-394 5ЕО ІЮ МО:57.
Позаклітинний домен СЕАСАМ6б М.азсісціагіз складається з амінокислот у положеннях 35- 327 повнорозмірного білка, тобто амінокислот 1-293 5ЕО ІЮ МО:61.
Позаклітинний домен СЕАСАМВ М.азсісціагі5 складається з амінокислот у положеннях 35- 332 повнорозмірного білка, тобто амінокислот 1-298 5ЕО ІЮ МО:63. "Афінність" у теорії визначають рівноважною асоціацією цілого антитіла й антигену. Її можна експериментально оцінити рядом відомих способів, таких як вимірювання швидкостей асоціації і
Б дисоціації з використанням поверхневого плазмонного резонансу або вимірювання ЕСбзхо (або уявної Ко) у імунохімічному аналізі (ЕГІ5БА, БАС5). У цих аналізах ЕС5о являє собою концентрацію антитіла, яка індукує відповідь посередині між вихідним рівнем і максимумом після визначеного часу експозиції при визначеній концентрації антигену при ЕГІ5А (твердофазному імуноферментному аналізі) або клітин, експресуючих антиген, при БАС5 (активоване флуоресценцією сортування клітин).
Моноклональне антитіло, що зв'язується з антигеном 1 (А91), "перехресно реагує" з антигеном 2 (Адг2), коли ЕСзо знаходяться в подібному діапазоні для обох антигенів. У даному описі моноклональне антитіло, що зв'язується з Ад1, перехресно реагує з Ад2, коли відношення афінності відносно Ад2 до афінності відносно Аді дорівнює або менше 10 (наприклад, 5, 2, 1 або 0,5), де афінність відносно обох антитіл вимірюють одним і тим же способом.
Моноклональне антитіло, що зв'язується з Ад1, "не є по суті перехресно реагуючим" з Ад2, коли афінності відносно двох антигенів відрізняються дуже сильно. Якщо зв'язування є занадто низьким, афінність відносно Ад2 може бути невимірною. У даному описі моноклональне антитіло, що зв'язується з АЯ1, не є по суті перехресно реагуючим з Ад2, коли зв'язування моноклонального антитіла з Ад2 складає менше 5 95 від зв'язування того ж моноклонального антитіла з Аді у тих же експериментальних умовах і при тій же концентрації антитіла. На практиці використовувана концентрація антитіла повинна являти собою ЕСзхо або концентрацію, необхідну для досягнення плато насичення, одержуваного при використанні Ад1.
Моноклональне антитіло "специфічно зв'язується з" або "специфічне відносно" Ад1, коли воно по суті перехресно не реагує з Ад2. Таким чином, антитіло за винаходом має відношення афінності відносно СЕАСАМ5 людини до афінності відносно СЕАСАМ5 Масаса Тазсісцшіагі5, що складає «10, наприклад «5, х2, «1 або «0,5. Таким чином, поліпептид за винаходом можна використовувати в токсикологічних дослідженнях, проведених у мавп, оскільки профіль токсичності, спостережуваний у мавп, буде відповідати передбачуваним потенційним
Зо несприятливим впливам у людей.
Варіант здійснення винаходу має афінність відносно СЕАСАМ5 людини або СЕАСАМ5
Масаса їазсісціагіє, або того й іншого, котра складає «10 нМ, наприклад «5 НМ, «3 НМ, «1 нм або «0,1 нМ, наприклад афінність від 0,01 нМ до 5 нМ і/або афінність від 0,1 нМ до 5 нМ або від 01 нМдо 1 нм.
Афінність відносно СЕАСАМ5 людини або відносно СЕАСАМ5 Масаса газсісшіагіх можна визначити як значення ЕСво у ЕГІЗА з використанням як іммобілізованого антигену розчинного рекомбінантного СЕАСАМ5.
Антитіло за винаходом також може мати уявну константу дисоціації (уявну Ко), як можна визначити за допомогою аналізу ЕАС5 на лінії пухлинних клітин МКМ4А5 (05М7, АСС 409) або на ксенотрансплантаті пухлинних клітин, одержаних у пацієнта (СК-І24НА-034Р доступно в
Опсодезідп ВіоїесппоЇІоду, колекція пухлин СКемеЕС), що складає «25 нМ, наприклад «20 нМ, «10 нМ, «5 НМ, «3 НМ або «1 нМ. Уявна Ко може знаходитися в діапазоні 0,01-20 нм або може знаходитися в діапазоні 0,1-20 нМ, 0,1-10 нМ або 0,1-5 НМ.
Крім того, показано, що антитілами за винаходом можна детектувати експресію СЕАСАМ5 за допомогою імуногістохімії в заморожених і фіксованих у формаліні і занурених у парафін (ЕЕРЕ) тканинних зрізах.
На фіг. 7 представлені вирівнювання послідовностей областей МУН і МІ. антитіл МАБІ1, МАБ2,
МАБЗ, МАБА і МАБ5. Порівняння послідовностей СКО-Н і СОК-Ї. свідчить, що структурно МАБ2,
МАБА і МАБ5, з одного боку, і МАБІ і МАБЗ, з іншого боку, є близькоспорідненими, причому зазначені антитіла, імовірно, зв'язуються з одним і тим же епітопом. Порівняння послідовностей
СвАО-Н ї СОБК-Ї додатково установило положення СОК, які у двох групах антитіл є строго консервативними і які, таким чином, вважають важливими для специфічності, тоді як інші положення можна піддавати замінам.
Авторами винаходу додатково ідентифіковано, що залишки в положеннях 101-109 МН МАБ2 (тобто залишки СОКЗ-Н) і залишки в положеннях 47-54 і 88-104 МІ МАБа2 (тобто області, що містять СОК2-Ї ії СОКЗ3-Ї,, відповідно) складають частину або формують паратоп антитіла для домену АЗВЗ3 СЕАСАМ5 людини.
Крім того, за допомогою замін одиничних кислот залишки в положеннях 27, 28, 29, 31, 51, 52, 89, 90, 93, 94, 96 і 97 МІ МАБ2 (тобто в межах СОК1-Ї, СОВ2-Ї і СОКЗ-І) ії залишки в 60 положеннях 26-31, 51-58, 97, 103, 104, 107 і 109 МН МАБ2 (тобто в межах СОК1-Н, усієї СОМК2-Н і в межах СОКЗ-Н) ідентифіковані як нейтральні відносно зв'язування з позаклітинними доменами СЕАСАМ5 людини і яванського макака. Крім того, показано, що залишки в положеннях 30 і 92 МІ МАБІ2 (тобто в межах СОК1-І і СОКЗ-Ї) і залишки в положеннях 98 і 100
МН МАБІ2 (тобто в межах СОКЗ-Н) допускають консервативну заміну. Оскільки МАБ2, МАБА і
МАБ5 несуть один і той же набір 6 СОК або дуже близькоспоріднених СОК, вважають, що варіації в одних і тих же положеннях МАБ4 або МАБ5 у послідовностях УН або Мі, або як УН, так ії СІ також приводять до варіантів антитіл, що зберігають специфічність і/або афінність зв'язування відносно СЕАСАМ5 людини і яванського макака.
Слід зазначити, що, оскільки всі залишки СОК2-Н ідентифіковані як нейтральні відносно зв'язування з позаклітинним доменами СЕАСАМ5 людини і яванського макака, автори винаходу вважають, що СОМК2-Н може не брати участь у взаємодії. Таким чином, в антитілах за винаходом СОК2-Н може мати будь-яку послідовність з 6-10 амінокислот, що є характерною довжиною послідовностей СОК2-Н в антитілах людини.
Таким чином, антитіло за винаходом містить: а) СОВ1-Н, що складається з послідовності ХіХ2ХзХаХ5Хв7О (5ЕО ІЮ МО:83), де кожний з Хі,
Хе, Хз, Ха, Х5 і Хв являє собою будь-яку амінокислоту; і
СОВ2-Н, що складається з послідовності довжиною 6-10 амінокислот, переважно послідовності довжиною 8 амінокислот, у якій у будь-якому положенні може знаходитися будь- яка амінокислота; і
СОВЗ-Н, що складається з послідовності ХіХаНХзБсаХаХоаРХвАХ; (БО ІЮ МО:84), де кожний з Хі, Ха, Х5, Хв, і Х7 являє собою будь-яку амінокислоту, Х2 являє собою А або 5, і Хз являє собою У, Е або МУ; і/або р) СОВІ1-Ї, що складається з послідовності ХіХг2ХзХаХ5У (ЗЕО ІЮО МО:85), де кожний з Хі, Хо,
Хз і Хо являє собою будь-яку амінокислоту, і Х. являє собою У, Е або МУ; і
СОВ2-Ї, що складається з послідовності МХ:Х2, де кожний з Х: і Х» являє собою будь-яку амінокислоту; і
СОВЗ-Ї, що складається з послідовності ХіІХаНХзХаХ5РХеХ? (ЗЕО ІЮ МО:86), де кожний з Хі,
Хе, Ха, Х5, Хв і Х?7 являє собою будь-яку амінокислоту, Хз являє собою У, Е або МУ.
В одному з варіантів здійснення СОК1-Н складається з послідовності ХіХ2ХзХаХ5Хв7О (5ЕО
Ко) ІО МО:83), де Хі являє собою с або Х»2 являє собою ЕК, або Хз являє собою Т, А або У, або Ха. являє собою РЕ, або Хо являє собою 5, або Хв являє собою 5, або будь-яку їх комбінацію.
В одному з варіантів здійснення СОК2-Н складається з послідовності ІХІ5Х2саХзтТ (5ЕО І
МО:79), де Хі являє собою 5 або М (зокрема 5), Хг являє собою У або С (зокрема 0), Хз являє собою К або І. У додатковому варіанті здійснення Хз являє собою |.
В одному з варіантів здійснення СсокЗ3-Н складається Кк! послідовності
ХІХаНХзгахХх:ХоарвРх АХ»? (ЗЕО І МО 84), Хі являє собою А або Т або Х. являє собою Т або 5, або Х5 являє собою 5, або Хв являє собою КЕ, або Х7 являє собою У, або будь-яку їх комбінацію.
В одному з варіантів здійснення СОК1-І| складається з послідовності ХіХгХзХаХ5У (5ЕО 10
МО:85), де Хі являє собою Е або Хг2 являє собою М, або Хз являє собою І, або Х5 являє собою 5, або будь-яку їх комбінацію.
В одному з варіантів здійснення СОК2-ІЇ складається з послідовності МХіХг2, де Хі являє собою А або Т, і Х2 являє собою К або КЕ.
В одному з варіантів здійснення СОКЗ-Ї складається з послідовності ХіІХаНХзХаХ5РХехХ?7 (ЗЕО ІЮО МО:86), де Хі являє собою СО або Хо являє собою Н, або Ха являє собою б, або Х5 являє собою Т, або Хв являє собою РЕ, або Х?7 являє собою Т, або будь-яку їх комбінацію.
Відповідно до одного з варіантів здійснення антитіло за винаходом містить: а) СОВ1-Н, що складається з послідовності ЕХІЕ55УЮ (ЗЕО ІЮО МО:78), де Хі являє собою
Т,Аабом; і
СОВ2-Н, що складається з послідовності ІХ:5Х»саХзтТ (ЗЕО ІЮ МО:79), де Хі: являє собою 5 або М (зокрема 5), Хг2 являє собою У або с (зокрема С), Хз являє собою К або Ї; і
СОВЗ-Н, що складається з послідовності ХІАНУРсаХх»БаРЕАМ (ЗЕО ІЮ МО:80), де Х: являє собою А або Т (зокрема А), і Х2 являє собою Т або 5; і/або р) СОВТ1-Ї, що складається з послідовності ЕМІЄБМ (ЗЕО ІЮ МО:10) або ЕМІУ5ЗМ (ЗЕО ІЮ
МО:22); і
СОВ2-Ї, що складається з послідовності МХ:Х», де Хі являє собою А або Т, і Хо являє собою
К або КЕ, зокрема ЕК; зокрема СОК2-Ї, що складається з МАК, МТК і МТЕ; і
СОВЗ-Ї, що складається з послідовності ОННМОТРЕТ (ЗЕО І МО:12) або ОННУСІРЕТ (ЗЕО ІЮО МО:24).
Відповідно до одного з варіантів здійснення, у СОК2-Н Хі являє собою 5 або М, Хо являє 60 собою 0, і Хз являє собою |.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, СОК2-Н складається з ІББИССИТ (5ЕО І
МО:8), ІЗБМСсИаВТт (ЗЕО ІЮ МО:20) або ІМ5СХССИІТ (5ЕО 1О МО:26).
Відповідно до одного з варіантів здійснення, у СОКЗ-Н Х: являє собою А або Т, і Хо являє собою 5.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, СОКЗ3-Н складається з ААНУГа5БОРЕАХМ (5ЕО
ІО МО:9), ААНУРат5аРЕАМХ (ЗЕО ІО МО:21) або ТАНУРа55ОаРЕАМ (5ЕО ІЮ МО:27).
Будь-яка комбінація цих варіантів здійснення включена у винахід.
Альтернативно, антитіло за винаходом містить: а) СОВ1-Н, що складається з послідовності ОЕТЕ5ХУХ» (5ЕО ІЮ МО:81), де Хі являє собою
В або 5, зокрема 5, і Х» являє собою А або; і
СОВ2-Н, що складається з послідовності ІБ5ССХ:Х2Хз (ЗЕБЕО ІЮ МО:82), де Хі відсутній, являє собою 5 або о (зокрема с), Х2 являє собою 0, У або І, і Хз являє собою Т або |; і
СОВЗ-Н, що складається з послідовності АВРАМУСМРАМОМ (ЗЕБО ІЮ МО:3) або
АВУМУМО55НРЇ ОМ (5ЕО ІЮ МО:15); і/або р) СОВТ1-Ї, що складається з послідовності ОММатМ (5ЕО ІО МО 4); і
СОВ2-Ї, що складається з послідовності ЗА5; і
СОВЗ-Ї, що складається з послідовності ООММОМРІ МТ (5ЕО ІЮО МО:6) або ОСОММММРІ МТ (ЗЕО ІО МО:18).
Відповідно до одного з варіантів здійснення, СОК2-Н складається з послідовності ІБ5БООЗУЇ (ЗЕО ІЮО МО:2) або ІЗ5БОСОТ (ЗЕО ІО МО:14).
Відповідно до одного з варіантів здійснення, СОК2-Н складається з послідовності ІБ5БООЗУЇ (ЗЕО ІО МО:2), і СОКЗ-Н складається з послідовності АКРАУУСМРАМОМУ (5ЕО ІЮО МО:3).
Відповідно до одного з варіантів здійснення, СОК2-Н складається з послідовності ІЗ5БОСОТ (ЗЕО ІЮО МО:14), і СОКЗ-Н складається з послідовності АЕММУМО5ЗЕЇ УМ (ЗЕО ІЮ МО:15).
Відповідно до одного з варіантів здійснення, антитіло за винаходом містить послідовності
СОК важких і/або легких ланцюгів одного з так званих антитіл до СЕАСАМ5 МАБІ, МАбБ2,
МАБакзгв, МАБЗ, МАБА і МАБ5.
Таким чином, винахід стосується антитіла, що містить: а) СОВ1-Н з послідовністю СЕТЕЗЗМА (ЗЕО ІЮО МО: 1) або з послідовністю, що відрізняється
Ко) від 5ЕО ІЮ МО:1 однією заміною амінокислоти; СОК2-Н з послідовністю ІБ (ЗЕО ІЮ
МО:2) або з послідовністю, що відрізняється від 5ЕО ІЮ МО:2 однією або декількома замінами амінокислот; СОВЗ-Н з послідовністю АКРАУУСОМРАМОМ (5ЕО ІЮО МО:3) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮ МО:З однією заміною амінокислоти; СОК1-Ї з послідовністю
ОММСОТМ (5ЕО ІО МО:4) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮ МО:4 однією заміною амінокислоти; СОК2-Ї з послідовністю ЗАЗ або з послідовністю, що відрізняється від ЗА5 однією заміною амінокислоти, і СОКЗ-Ї. з послідовністю ООУМЗУРІ МТ (5ЕБО ІЮ МО:6) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮ МО:6 однією заміною амінокислоти; або
Б) СОВ1-Н з послідовністю СЕМЕЗЗМУО (ЗЕО ІЮ МО:7) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮ МО:7 однією заміною амінокислоти; СОК2-Н з послідовністю ІЗ5ООСОІТ (ЗЕО І
МО:8) або з послідовністю, що відрізняється від 5ЕО ІЮ МО:8 однією або декількома замінами амінокислот; СОКЗ-Н з послідовністю ААНУГО55ОРЕАХМ (5ЕО ІЮ МО:9) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО І МО:9 однією або декількома замінами амінокислот; СОК1-Ї з послідовністю ЕМІЕ5МУ (5ЕО ІЮ МО:10) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮ МО:10 однією заміною амінокислоти; СОМ2-Ї. з послідовністю МТК або МТК або з послідовністю, що відрізняється від МТК або МТК однією заміною амінокислоти, і СОКЗ3-Ї з послідовністю
ОННУСТРЕТ (5ЕО ІЮО МО:12) або з послідовністю, що відрізняється від 5Е0О ІЮ МО:12 однією заміною амінокислоти; або с) СОВІ-Н з послідовністю СЕТЕБКМА (ЗЕБО ІЮ МО:13) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕБЕО ІЮО МО:13 однією заміною амінокислоти; СОК2-Н з послідовністю
БО ІЗБОСОТ (5ЕО ІЮ МО:14) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮ МО:14 однією або декількома замінами амінокислот; СОКЗ-Н з послідовністю АЕУМУМО5ЗЕЇ УМ (ЗЕО ІЮ МО:15) або з послідовністю, що відрізняється від ЖЕО ІЮ МО:15 однією заміною амінокислоти; СОМК1-Ї. з послідовністю ОММОТМ (5ЕО ІЮ МО:16) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮ МО:16 однією заміною амінокислоти; СОМК2-Ї з послідовністю БАЗ або з послідовністю, що відрізняється від БА5 однією заміною амінокислоти, і СОКЗ-Ї. з послідовністю ООММММУРІ МТ (ЗЕБЕО ІЮ МО:18) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮ МО:18 однією заміною амінокислоти; або а) СОВІ-Н з послідовністю СЕТЕЗ5МО (5БО ІО МО:19) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮО МО:19 однією заміною амінокислоти; СОК2-Н з послідовністю 60 ІЗЗУСОКТ (5ЕО ІЮ МО:20) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮ МО:20 однією або декількома замінами амінокислот; СОКЗ-Н з послідовністю ААНУЕОСТ5ОРЕАМ (5ЕО ІЮ МО:21) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮ МО:21 однією або декількома замінами амінокислот; СОМ1-Ї з послідовністю ЕМІМ5М (ЗЕБО ІЮО МО:22) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮО МО:22 однією заміною амінокислоти; СОМ2-Ї з послідовністю МАК або з послідовністю, що відрізняється від МАК однією або декількома замінами амінокислот, і СОМЗ-
І з послідовністю ОННУСІРЕТ (5ЕО ІО МО:24) або з послідовністю, що відрізняється від 5ЕО ІЮ
МО:24 однією заміною амінокислоти; або е) антитіла, що містить СОК1-Н з послідовністю СЕАЕЗБ5УЮО (5БО ІЮО МО:25) або з послідовністю, що відрізняється від 5ЕО ІЮ МО:25 однією заміною амінокислоти; СОК2-Н з послідовністю ІМТ (5ЕО ІЮ МО:26) або з послідовністю, що відрізняється від 5ЕО ІЮ
МО:26 однією або декількома замінами амінокислот; СОВ3-Н з послідовністю ТАНУЕОЗЗОРЕАУ (ЗЕО ІЮ МО:27) або з послідовністю, що відрізняється від 5ЕО ІЮ МО:27 однією або декількома замінами амінокислот; СОК1-І. з послідовністю ЕМІУЗМУ (ЗЕО ІЮ МО:28) або з послідовністю, що відрізняється від ЗЕО ІЮ МО:28 однією заміною амінокислоти; СОМ2-Ї з послідовністю МАК або з послідовністю, що відрізняється від МАК однією або декількома замінами амінокислот, і СОКЗ-
І з послідовністю ОННУСТРЕТ (5ЕО ІО МО:30) або з послідовністю, що відрізняється від 5ЕО
ІО МО:30 однією заміною амінокислоти.
Одну або декілька окремих амінокислот в одній або декількох із зазначених вище послідовностей СОК можна змінювати за допомогою заміни, зокрема за допомогою консервативної заміни. Така зміна може призначатися, наприклад, для видалення ділянки глікозилування або ділянки дезамідування в зв'язку з гуманізацією антитіла.
На основі вирівнювань послідовностей областей УН і МІ. МАБІ, МАБ2, МАБЗ, МАБА і МАБ5 і на основі одиночних замін амінокислот у варіанті антитіла МАБ2, амінокислоту можна заміняти: у СОК1-Н в одному або декількох положеннях 1-6, наприклад у положенні 3 СОК1-Н з послідовністю СЕМЕ5ЗУО (5ЕО ІЮ МО:7), СОЕТЕЗ5МУЮ (5ЕО ІЮО МО:19) або СБАЕ5З5МО (5ЕО ІЮ
МО:25) або в положенні 6 СОК1-Н з послідовністю СЕТЕ55ЗМА (ЗЕО ІЮО МО:1) або СЕТЕЗКУА (ЗЕО ІО МО:13); і/або у СОМК2-Н в одному або декількох будь-яких положеннях або в одному, двох або трьох положеннях 2, 4 і 7 СОР2-Н з послідовністю ІБ (5Б6О ІЮ МО:8), ІЗБУООКТ (5ЕО І
Ко) МО:20) або ІМ5ОСОІТ (ЗЕО ІЮ МО:26), або в одному, двох або трьох положеннях 6, 7 і 8 (де послідовність складається з 8 амінокислот) СОК2-Н з послідовністю ІЗ5ООБЗУІ (ЗЕО ІЮ МО:2) або ІЗ5БОСОТ (5ЕО ІЮО МО:14); і/або див. вище; у СОКЗ-Н в одному або декількох положеннях 1, 7, 8, 11 і 13, наприклад в одному або двох положеннях 1 і 7 СОКЗ-Н з послідовністю ААНУБЕО5БОРЕАХМ (5ЕО ІО МО:9), ААНУЕСТ5ЗОРЕАДУ (ЗЕО ІЮ МО:21) або ТАНУЄО5З5ЗОРЕАХМ (5ЕО ІЮО МО:27), або в положенні 3, 4, 7, 8, 9, 10 або 11 послідовностей АКРАУУСМРАМОМ (5ЕО ІЮ МО:3) або АЕУМУМО55ЗРЕЇ ОМ (5ЕО ІЮ МО: 15); і/або у СОК1-І в одному або декількох положеннях 1-5, зокрема в одному або декількох положеннях 1, 2, З і 5 або в положенні 4 СОК1-І з послідовністю ЕМІЕ5МУ (ЗЕО ІЮО МО:10) або
ЕМІУ5МУ (5ЕО ІЮО МО:28); і/або у СОК2-Ї. у положеннях 2 і/або З послідовності МАК, МТК або МТЕ, зокрема щонайменше в положенні З, якщо є присутнім К. У такому випадку, наприклад, К у положенні З СОК2-Ї можна заміняти на Е; і/або у СОКЗ-Ї в одному або декількох положеннях 1, 2, 5, 6, 8 і 9, наприклад у положенні 6
СОВЗ-Ї з послідовністю ОННУСІРЕТ (5ЕО ІЮ МО:24) або ОННУСТРЕТ (5ЕО ІО МО:30), або в положенні 5 СОКЗ-Ї. з послідовністю ООМУМЗУРІ МТ (5ЕО ІЮ МО:6) або ООУММУРІ МТ (5ЕО І
МО:18).
Відповідно до одного з варіантів здійснення, в антитілах за винаходом: положення 5 СОКЗ-Н з послідовністю ААНУЕО5ЗЗОРЕАМ (ЗЕО ІЮО МО:9), ААНУЕОТ5ОРЕАХУ (ЗЕО ІЮ МО:21) або ТАНУЄО5ЗОРЕАМХ (5ЕО ІЮ МО:27) і/або положення 6 СОК1-І. з послідовністю ЕМІЕ5У (ЗЕО ІЮ МО:10) або ЕМІМЗМ (5ЕО ІЮО МО:28); імабо положення З СОКЗ-Ї. з послідовністю ОННУСІРЕТ (5ЕО ІЮО МО:24) або ОННУСТРЕТ (ЗЕО ІЮ
МО:З30) є немодифікованим(и).
Відповідно до одного з варіантів здійснення, у СОК1-Н з послідовністю СЕМЕЗ5МУО (5ЕО ІЮ
МО:7), СЕТЕЗЗМО (5ЕБО ІО МО:19) або СБАЕ55МО (5БО ІЮ МО:25) амінокислота, на яку заміняють амінокислоту в положенні З СОК1-Н, вибрана з групи, що складається з Т, А або УМ.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, у СОК1-Н з послідовністю ЗЕТЕЗЗМУА (5ЕО ІЮ
МО:1) або СОЕТЕЗЕХУА (ЗЕО ІО МО:13) амінокислота, на яку заміняють амінокислоту в положенні 60 6 СОВ1-Н, являє собою ЕК або 5.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, у СОКЗ-Н з послідовністю ААНУБО5ЗОРЕАУ (ЗЕО ІО МО:9), ААНУЄОТЗОРЕАМ (5ЕО І МО:21) або ТАНУРО55ОРЕАМ (5ЕО ІЮ МО:27) амінокислота, на яку заміняють амінокислоту в положенні 1 СОКЗ-Н, являє собою А або Т, і/або амінокислота, на яку заміняють амінокислоту в положенні 7 СОКЗ-Н, являє собою Т або 5.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, у СОКЗ-Н з послідовністю АКРАУУОМРАМОУ (ЗЕО ІЮ МО:3) або АКУММУМОЗБРІ ОМ (ЗЕБЕО ІЮ МО:15) амінокислота, на яку заміняють амінокислоту в положенні З СОКЗ-Н, являє собою МУ або Р, у положенні 4 являє собою А або М, у положенні 7 являє собою О або с, у положенні 8 являє собою 5 або М, у положенні 9 являє собою 5 або Р, у положенні 10 являє собою Е або А або в положенні 11 являє собою У або У.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, амінокислота, на яку заміняють амінокислоту в положенні 4 СОК1-І.,, являє собою У або КЕ.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, у СОК2-Ї з послідовністю МАК, МТК або МТК амінокислота, на яку заміняють амінокислоту в положенні 2 СОК2-Ї, являє собою А або Т.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, у СОКЗ-Ї. з послідовністю ООУМЗУРІ МТ (ЗЕО
ІО МО:6) або ООФУММУРІ МТ (5ЕО ІЮ МО:18) амінокислота, на яку заміняють амінокислоту в положенні 5 СОКЗ-Ї.,, являє собою М або 5.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, у СОКЗ-Ї. з послідовністю ОННУСІРЕТ (5ЕО ІЮ
МО:24) або ОННУОТРЕТ (ЗЕО ІО МО:30) амінокислота, на яку заміняють амінокислоту в положенні 6 СОКЗ-Ї.,, являє собою І або Т.
Будь-яка комбінація зазначених вище варіантів здійснення включена у винахід.
В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом являє собою звичайне антитіло, таке як звичайне моноклональне антитіло або фрагмент антитіла, біспецифічне або поліспецифічне антитіло.
В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом містить або складається з да або його фрагмента.
Винахід також стосується антитіл, як визначено вище, що додатково містить щонайменше варіабельний домен важкого ланцюга і/або варіабельний домен легкого ланцюга одного з п'яти так званих антитілдо СЕАСАМ5 МАБбБІ, МАБ2, МАБЗ, МАБА і МАБ5.
Таким чином, один з варіантів здійснення винаходу стосується антитіла, що містить:
Ко) а) варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:31 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, і/або варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю
ЗЕО ІЮ МО:32 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй; або р) варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:33 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, і/або варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю
ЗЕО ІЮ МО:34 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй; або с) варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:35 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, і/або варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю
ЗЕО ІЮ МО:36 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй; або а) варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:37 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, і/або варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю
ЗЕО ІЮ МО:38 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй; або е) варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:39 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, і/або варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю
ЗЕО ІЮ МО:40 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй.
Наприклад, послідовність варіабельного домену важкого або легкого ланцюга при необхідності може відрізнятися від еталонної послідовність зХЕО ІЮО МО:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 або 40 однією або декількома замінами амінокислот, зокрема однією або декількома консервативними замінами амінокислот і/або замінами на канонічні залишки. В одному з варіантів здійснення послідовність варіабельного домену важкого або легкого ланцюга може
БО відрізнятися від еталонної послідовності зЗЕО ІЮ МО:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 або 40 тільки консервативними замінами амінокислот.
По суті, в одній або декількох з каркасних областей ЕК1-Ї, ЕР2-Ї, ЕВЗ-Ї, ЕВ4-Ї. і/або ЕК1-Н,
ЕВ2-Н, ЕВЗ-Н, ЕВ4-Н у порівнянні з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 або 40 присутні зміни послідовності.
Однак також можливі заміни амінокислот в одній або декількох СОК. В одному з варіантів здійснення послідовність варіабельного домену легкого ланцюга може відрізнятися від послідовності БЕО ІЮ МО:34 щонайменше заміною К на К у положенні 52 5ЕО ІЮ МО:34 (у
СОогрг-Ї).
Антитіло за винаходом і його фрагмент можуть відповідно являти собою антитіло миші і бо фрагмент антитіла миші.
Антитіло також може являти собою химерне антитіло і в одному з варіантів здійснення антитіло миші/людини, наприклад антитіло, що містить варіабельні домени важких і легких ланцюгів миші і домен СН і домен Сі антитіла людини. Поліпептид може являти собою фрагмент такого антитіла.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, антитіло за винаходом являє собою: а) химерне антитіло, що містить або складається з важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ
МО:41 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, або легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮО МО:42 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй (тобто важкого і/або легкого ланцюга СПМАБІ, як описано в прикладі 5); або з важкого ланцюга і легкого ланцюга, або р) химерне антитіло, що містить або складається з важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ
МО:43 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, або легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО':44 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй (тобто важкого і/або легкого ланцюга СПИМАБ2, як описано в прикладі 5); або з важкого ланцюга і легкого ланцюга, або с) химерне антитіло, що містить або складається з важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ
МО:45 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, або легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:46 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй (тобто важкого і/або легкого ланцюга СИМАБЗ, як описано в прикладі 5); або з важкого ланцюга і легкого ланцюга, або а) химерне антитіло, що містить або складається з важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ
МО:47 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, або легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:48 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй (тобто важкого і/або легкого ланцюга СПИМАБ4, як описано в прикладі 5); або з важкого ланцюга і легкого ланцюга, або е) химерне антитіло, що містить або складається з важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ
МО:49 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, або легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:50 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй (тобто важкого і/або легкого ланцюга СПИМАБ5, як описано в прикладі 5); або з важкого ланцюга і
Ко) легкого ланцюга, або
У) фрагмент химерного антитіла, визначеного в а), б), с), 4) або є).
Антитіло також може являти собою гуманізоване антитіло або фрагмент гуманізованого антитіла. В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом може являти собою результат гуманізації будь-якого з химерних антитіл, визначених вище в а), Б), с), а), е) або б).
У даній галузі відома множина способів гуманізації послідовності антитіла; див. наприклад, огляд АЇтадго 5 Егап5зоп (2008), Егопі Віозсі. 13:1619-1633. Одним із широко використовуваних способів є щеплення СОК або реконструкція антитіл, що включає щеплення послідовностей
СОК донорного антитіла, як правило антитіла миші, у каркас антитіла людини з різною специфічністю. Оскільки щеплення СОК може знижувати специфічність і афінність зв'язування і, таким чином, біологічну активність антитіла, що не належить людині, з щепленою СОК, в вибраних положеннях антитіла з щепленою СОК можна вносити зворотні мутації для збереження специфічності й афінності зв'язування вихідного антитіла. Ідентифікацію положення для можливих зворотних мутацій можна проводити з використанням інформації, доступної в літературі й у базах даних антитіл. Амінокислотні залишки, що є кандидатами для зворотних мутацій, як правило, є залишками, що розташовані на поверхні молекул антитіл, тоді як залишки, які знаходяться усередині або які мають низьку міру поверхневої експозиції, звичайно не заміняють. Альтернативним щепленню СОК і зворотним мутаціям способом гуманізації є зміна поверхні, при якому не розташовані на поверхні залишки, які походять з антитіла, що не належить людині, зберігають, тоді як поверхневі залишки змінюють на залишки, що належать антитілу людини. Інший альтернативний спосіб відомий як "спрямовуваний відбір" (Чезрегз еї а). (1994), ВіоїесппоЇІоду, 12, 899) ї його можна використовувати для одержання з антитіла миші антитіла, яке повністю належить людині, що зберігає епітоп і характеристики зв'язування вихідного антитіла.
У химерних антитіл гуманізація, як правило, включає модифікацію каркасних областей послідовностей варіабельних областей.
Амінокислотні залишки, що є частиною СОЖК, як правило, у зв'язку з гуманізацією не змінюють, хоча у визначених випадках змінювати окремі амінокислотні залишки СОК може бути бажаним, наприклад, для видалення ділянки глікозилування, ділянки дезамідування або небажаного залишку цистеїну. М-зв'язане глікозилування відбувається за допомогою бо приєднання олігосахаридного ланцюга до залишку аспарагіну в трипептидній послідовності Авп-
Х-Зег або Авбп-Х-Тйг, де Х може являти собою будь-яку амінокислоту за винятком Рго.
Видалення М-зв'язаної ділянки глікозилування можна досягати за допомогою мутування залишків А5п або бег/Тпг в інші залишки, наприклад, за допомогою консервативної заміни.
Дезамідування залишків аспарагіну і глутаміну може відбуватися залежно від таких факторів, як рН і поверхнева експозиція. Особливо чутливі до дезамідування залишки аспарагіну, переважно, коли вони знаходяться в послідовності Абп-СІу і меншою мірою в інших дипептидних послідовностях, таких як Азп-АЇа. Таким чином, коли в послідовності СОК присутня така ділянка дезамідування, наприклад Абп-СІу, може бути бажано видалити цю ділянку, як правило, за допомогою консервативної заміни з видаленням одного з залишків-учасників.
Заміна в послідовності СОК з видаленням одного з залишків-учасників також призначена для включення в даний винахід.
Беручи як приклад так називане "антитіло МАБ2", гуманізоване антитіло або його фрагмент у варіабельній області важкого ланцюга може містити наступні мутації: Р замість С у положенні 9 і/або С замість М у положенні 10; і/або 5 замість К у положенні 19; і/або К замість К у положенні 43; і/або с замість К у положенні 44; і/або А замість Е у положенні 60; і/або 5 замість р у положенні 62; і/або К замість О у положенні 65; і/або Т замість К у положенні 87; і/або М замість І у положенні 89; і/або 5 замість А у положенні 113; де положення наведені відповідно до БЕО ІЮ МО:33.
Також розглядаючи так називане "антитіло МАБ2" як приклад, гуманізоване антитіло або його фрагмент у варіабельній області легкого ланцюга може містити наступні мутації: О замість
Е у положенні 17 і/або К замість Т у положенні 18; і/або Р замість О у положенні 40; і/або К замість О у положенні 45; і/або ЕК замість К у положенні 52; і/або О замість О у положенні 70; і/або Т замість К у положенні 74; і/або 5 замість М у положенні 76; і/або А замість С у положенні 84; і/або Т замість 5 у положенні 85; де положення наведені відповідно до ЗЕО ІЮ МО:34.
В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом являє собою гуманізоване антитіло, яке містить або складається з важкого ланцюга, що містить зазначені нижче мутації, де положення наведені відповідно до ЗЕО ІЮО МО:33: а) Р замість о у положенні 9 і с замість М у положенні 10; і 5 замість К у положенні 19; і К замість К у положенні 43; і 5 замість О у положенні 62; і К замість О у положенні 65; і Т замість К
Ко) у положенні 87; або
БЮ) Р замість Со у положенні 9 і С замість М у положенні 10; і 5 замість К у положенні 19; і К замість К у положенні 43; і б замість К у положенні 44; і А замість Е у положенні 60; і 5 замість
О у положенні 62; і К замість О у положенні 65; і Т замість К у положенні 87; і М замість І у положенні 859; і 5 замість А у положенні 113; і/або гуманізоване антитіло, яке містить легкий ланцюг, що містить зазначені нижче мутації, де положення наведені відповідно до ЗЕО ІЮО МО:34: с) О замість Е у положенні 17 і Р замість О у положенні 40; і К замість О у положенні 45; і Т замість К у положенні 74; і 5 замість М у положенні 76; або а) О замість Е у положенні 17 і К замість Т у положенні 18; і Р замість 0 у положенні 40; і К замість О у положенні 45; і О замість О у положенні 70; і Т замість К у положенні 74; і 5 замість
М у положенні 76; і А замість с у положенні 84; і Т замість 5 у положенні 85; або е) О замість Е у положенні 17 і К замість Т у положенні 18; і Р замість О у положенні 40; і К замість О у положенні 45; і К замість К у положенні 52; і О замість О у положенні 70; і Т замість
К у положенні 74; і 5 замість М у положенні 76; і А замість С у положенні 84; і Т замість 5 у положенні 85.
В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом являє собою гуманізоване антитіло, одержане за допомогою щеплення СОК антитіла за винаходом в каркасні області альтернативного антитіла, більш конкретно в каркасні області, що належать людині. Узяття як прикладу МАБ2, 6 щеплених СОК МАбБагкоги у каркас, який належить людині, що складається з генів ІЗНМ3-23 і І5КМ10-39, і проведення трьох зворотних мутацій, що відповідають положенням 34 і 53 у МІ (ЗЕО ІЮО МО:34) і положенню 50 у МН (ЗЕО ІЮ МО:33), привело до одержання антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ
МО:74 і варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:75.
В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом являє собою гуманізоване антитіло, що містить або складається з важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:51, 5ЕО ІЮ МО:5 або
ЗЕО ІО МО:74 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй; і/або легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:17, 5ЕО ІЮ МО:23, 5ЕО ІЮ МО:29, 5ЕО ІЮО МО:55 або 5ЕО ІО МО:75 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй (гуманізовані варіабельні домени важких і легких ланцюгів МАБ2).
В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом являє собою гуманізоване антитіло, яке містить важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮО МО:51 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, і легсий ланцюг з послідовністю 5ЕО І МО:17 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, або важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО І МО:5 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ
МО:23 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, або важкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІЮО МО:5 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, і легкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:29 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, або важкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:51 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:55 або з послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, або важкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:74 або послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй, і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:75 або послідовністю, щонайменше на 85 95 ідентичною їй.
У зазначеному гуманізованому антитілі або його фрагменті варіабельні домени важких і легких ланцюгів можуть містити акцепторні каркасні області, що належать людині. Гуманізоване антитіло додатково містить константні домени важких і легких ланцюгів людини, коли вони присутні.
В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом являє собою антитіло ПИМАб2-3 або його варіант, тобто виділене антитіло, яке зв'язується з доменом АЗ-В3 білків СЕАСАМ5 людини і Масаса їазсісціагів і яке містить: а) важкий ланцюг, що складається з послідовності ЗЕО ІЮ МО:87 або з послідовності, щонайменше на 85 95 ідентичної їй; або
Б) легкий ланцюг, що складається з послідовності ЗЕО ІЮ МО:88 або з послідовності, щонайменше на 85 95 ідентичної їй, або важкий ланцюг і легкий ланцюг.
В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом являє собою антитіло пиМАБ2-4 (МАр2 Ма мн1-іда1) або його варіант, тобто виділене антитіло, яке зв'язується з доменом
АЗ-ВЗ білків СЕАСАМ5 людини і Масаса газсісціагів і яке містить: с) важкий ланцюг, що складається з послідовності 560 ІЮ МО:89 або з послідовності, щонайменше на 85 95 ідентичної їй; і/або
Ко) Я) легкий ланцюг, що складається з послідовності 5ЕО ІЮ МО:90 або з послідовності, щонайменше на 85 95 ідентичної їй.
Антитіло за винаходом також може являти собою однодоменне антитіло або його фрагмент.
В одному з варіантів здійснення винаходу фрагмент однодоменного антитіла може складатися з варіабельної області важкого ланцюга (МНН), що містить СОК1-Н, СОВ2-Н і СОКЗ-Н антитіл, як описано вище. Антитіло також може являти собою антитіло з важкого ланцюга, тобто антитіло, позбавлене легкого ланцюга, що може містити або не містити домен СНІ.
Однодоменне або антитіло його фрагмент також може містити каркасні області однодоменного антитіла верблюдячих і необов'язково константний домен однодоменного антитіла верблюдячих.
Антитіло за винаходом також може являти собою фрагмент антитіла, наприклад фрагмент гуманізованого антитіла, вибраний із групи, що складається з Ем, Раб, К(аб)», Бар", азЕм, (д5Ем)», 5СЕМ, 5С(Ем)» і діатіла.
Антитіло також може являти собою біспецифічне або поліспецифічне антитіло, одержане з фрагментів антитіл, де щонайменше один фрагмент антитіла являє собою фрагмент антитіла за винаходом. Поліспецифічні антитіла являють собою полівалентні білкові комплекси, як описано, наприклад, у ЕР 2050764 АТ або 05 2005/0003403 А1.
Біспецифічні або поліспецифічні антитіла за винаходом можуть мати специфічність (а) відносно епітопа АЗ-В3 на СЕАСАМ5 людини/Масаса Тазсісціагіх, що є мішенню одного з так званих антитіл МАБ1І, МАБ2, МАБрБЗ, МАБА ії МАБ»5, ї (Б) щонайменше відносно одного іншого антигену. Відповідно до одного з варіантів здійснення, щонайменше один інший антиген не є представником сімейства СЕАСАМ людини або Масаса газсісціагіх, і в одному з варіантів здійснення щонайменше жодним або не всіма з СЕАСАМІ людини і Масаса ГТазсісціагів,
СЕАСАМб людини і Масаса Газсісціагіх, СЕАСАМ7 людини і Масаса Тазсісціагіє і СЕАСАМ8 людини і Масаса їазсісціагіз. Відповідно до іншого варіанта здійснення, щонайменше один інший антиген може являти собою епітоп на СЕАСАМ5 людини і Масаса газсісціагі5, відмінний від зазначеного епітопа АЗ-В3, що є мішенню одного з так званих антитіл МАБІ, МАБ2, МАБЗ,
МАБА і МАБ5.
Зазначені антитіла можна одержувати будь-яким способом, добре відомим у даній галузі. В одному з варіантів здійснення зазначені антитіла одержують способами, описаними нижче в 60 даному документі.
Антитіла і їх фрагменти за винаходом можна використовувати у виділеній (наприклад, очищеній) формі, або вони можуть знаходитися у векторі, такому як мембранний або ліпідний носій (наприклад, ліпосома).
Нуклеїнові кислоти, вектори і рекомбінантні клітини-хазяїни
Додатковим об'єктом винаходу є послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить або складається з послідовності, кодуючої антитіло за винаходом, як визначено вище.
Як правило, зазначена нуклеїнова кислота являє собою молекулу ДНК або РНК, яку можна ввести в будь-який придатний вектор, такий як плазміда, косміда, епісома, штучна хромосома, фаговий або вірусний вектор.
Терміни "вектор", "клонуючий вектор" і "експресуючий вектор" означають носій, за допомогою якого послідовність ДНК або РНК (наприклад, чужорідний ген) можна вводити в клітину-хазяїна, щоб трансформувати хазяїна і стимулювати експресію (наприклад, транскрипцію і трансляцію) введеної послідовності.
Таким чином, додатковим об'єктом винаходу є вектор, який містить нуклеїнову кислоту за винаходом.
Такі вектори можуть містити регуляторні елементи, такі як промотор, енхансер, термінатор і т. п., що викликають або контролюють експресію зазначеного поліпептиду після введення індивідууму. Приклади промоторів і енхансерів, використовуваних у експресуючому векторі для тваринної клітини, включають ранній промотор і енхансер 5М40 (Міликаті Т. еї аї. 1987), промотор і енхансер ГТК вірусу лейкозу Молоні мишей (Киулапа У еї аї. 1987), промотор (Мазоп
У.О. еї аї. 1985) і енхансер (Сійев 5.0. єї аіІ. 1983) Н-ланцюга імуноглобуліну і т. п.
Можна використовувати будь-який експресуючий вектор для клітин тварин, за умови, що можна вбудувати і експресувати ген, кодуючий С-область антитіла людини. Приклади придатних векторів включають рАсСЕ107 (Міуа)і Н. еї а). 1990), рАСЕ103 (Мі2гиКаті Т. еї а. 1987), рназог74 (Вгаду 0. еї аї. 1984), рКСЕ (ОС Наге К. еї аї. 1981), рес1 бета 42-4- (Міуаїї Н. еї аї. 1990) і т. п.
Інші приклади плазмід включають плазміди, що реплікуються, які містять ділянку початку реплікації, або плазміди, що інтегруються, наприклад, такі як РОС, рсОМА, рВЕ і т. п.
Інші приклади вірусних векторів включають аденовірусні, ретровірусні вектори, вектори на
Зо основі вірусу герпесу і ААМ. Такі рекомбінантні віруси можна одержувати способами, відомими в даній галузі, такими як трансфекція упаковуючих клітин або транзиторна трансфекція плазмідами- або вірусами-помічниками. Типові приклади упаковуючих віруси клітин включають клітини РАЗІ17, клітини РоісСкІР, клітини сОРепмж, клітини 293 і т. д. Докладні протоколи одержання таких дефектних по реплікації рекомбінантних вірусів можна знайти, наприклад, у
МО 95/14785, МО 96/22378, 005 5882877, 005 6013516, 05 4861719, 005 5278056 і УМО 94/19478.
Додатковим об'єктом даного винаходу є клітина, трансфікована, інфікована або трансформована нуклеїновою кислотою і/або вектором за винаходом.
Термін "трансформація" означає введення "чужорідного" (тобто невласного) гена, послідовності ДНК або РНК у клітину-хазяїна так, що клітина-хазяїн починає експресувати введений ген або послідовність з одержанням бажаної речовини, як правило білка або ферменту, кодованої геном або послідовністю, що вводяться. Клітина-хазяїн, яка одержала і експресує ДНК або РНК, що вводиться, є "трансформованою".
Нуклеїнові кислоти за винаходом можна використовувати для одержання рекомбінантного антитіла за винаходом в придатній експресуючій системі. Термін "експресуюча система" означає клітину-хазяїна і сумісний вектор в умовах, придатних, наприклад, для експресії білка, кодованого чужорідною ДНК, що переноситься вектором і введена в клітину-хазяїна.
Типові експресуючі системи включають клітини-хазяїни Е. соїї і плазмідні вектори, клітини- хазяїни комах і бакуловірусні вектори і клітини-хазяїни ссавців і вектори. Інші приклади клітин- хазяїнів включають, але не обмежуючись ними, прокаріотичні клітини (такі як бактерії) і еукаріотичні клітини (такі як дріжджові клітини, клітини ссавців, клітини комах, клітини рослин і т. д.). Конкретні приклади включають Е. соїї, дріжджі Кісумеготусе5 або Засспаготусев, лінії клітин ссавців (наприклад, клітини Мего, клітини СНО, клітини ЗТ3, клітини СОЗ і т. д.), а також первинні або стабілізовані культури клітин ссавців (наприклад, одержувані з лімфобластів, фібробластів, ембріональних клітин, епітеліальних клітин, нервових клітин, адипоцитів і т. д.).
Приклади також включають клітини 5Р2/0-АЯа14 миші (АТСС СКІ 1581), клітини РЗУХб6З-Аа8.653 миші (АТОС СК 1580), клітини СНО з дефектним геном дигідрофолатредуктази (далі в даному описі позначуваним як "ген ОНЕК") (Огпіаць б. еї аї. 1980), клітини УВ2/ЗНІ.Р2.С11.16Аа9.20 щура (АТСС СНІ 1662, далі в даному описі позначувані як "клітини УВ2/0") і т. п. В одному з варіантів здійснення використовують клітини УВ2/0, через посилення активності АОСС химерних або бо гуманізованих антитіл при експресії в цих клітинах.
Для експресії гуманізованого антитіла експресуючий вектор може бути вектором такого типу, де ген, кодуючий важкий ланцюг антитіла, і ген, кодуючий легкий ланцюг антитіла, знаходяться на окремих векторах, або типу, де обидва гени знаходяться на одному і тому ж векторі (тандемного типу). Відносно простоти конструювання експресуючого гуманізовані антитіла вектора, простоти введення в клітини тварин і балансу між рівнем експресії ланцюгів Н ії антитіл у клітинах тварин, експресуючий гуманізоване антитіло вектор являє собою вектор тандемного типу (Зпйага К. еї а. У. Іттипої. Меїпоаз. 1994 ап. 3; 167(1-2):271-8). Приклади експресуючого гуманізоване антитіло вектора тандемного типу включають РКАМТЕХ9З (МО 97/10354), рЕЕ 18 і т. п.
Даний винахід також стосується способу одержання рекомбінантної клітини-хазяїна, експресуючої антитіло за винаходом, де зазначений спосіб включає стадії: () введення рекомбінантної нуклеїнової кислоти або вектора, як описано вище, у компетентні клітини- хазяїни іп міго або ех мімо, (ії) культивування одержаних рекомбінантних клітин-хазяїнів іп міго або ех мімо, і (ії) необов'язкового відбору клітин, експресуючих і/або секретуючих зазначене антитіло.
Такі рекомбінантні клітини-хазяїни можна використовувати для одержання антитіл за винаходом.
Способи одержання антитіл за винаходом
Антитіла за винаходом можна одержувати будь-яким способом, відомим у даній галузі, але без обмежень, таким як будь-який хімічний, біологічний, генетичний або ферментативний спосіб, окремо або в комбінації.
Знаючи амінокислотну послідовність бажаної послідовності, фахівець у даній галузі може легко одержувати зазначені антитіла або ланцюги імуноглобулінів стандартними способами одержання поліпептидів. Наприклад, їх можна синтезувати добре відомим способом твердофазного синтезу з використанням комерційно доступного пристрою для пептидного синтезу (такого, як виробляє Арріїєдй Віозувіет»5, Бовіег Сйу, Саїйогпіа) і інструкцій виробника.
Альтернативно, антитіла і ланцюги імуноглобулінів за винаходом можна синтезувати за допомогою технологій рекомбінантних ДНК, як добре відомо в даній галузі. Наприклад, ці фрагменти можна одержувати як продукти експресії ДНК після введення послідовностей ДНК,
Зо кодуючих бажаний (полі)упептид у експресуючі вектори і введення таких векторів придатним еукаріотичним або прокаріотичним хазяїнам, які експресують бажаний поліпептид, з яких їх пізніше можна виділяти добре відомими способами.
Крім того винахід стосується способу одержання антитіла за винаходом, де спосіб включає стадії (і) культивування трансформованих клітин-хазяїнів за винаходом; (ії) експресії зазначеного антитіла або поліпептиду, і (ії) відновлення зазначеного антитіла або поліпептиду.
Антитіла за винаходом придатним способом виділяють із середовища для культивування загальноприйнятими способами очищення імуноглобулінів, такими як, наприклад, білок А- сефароза, хроматографія на гідроксіапатиті, електрофорез у гелі, діаліз або афінна хроматографія.
В одному з варіантів здійснення гуманізоване химерне антитіло за даним винаходом можна продукувати одержанням послідовності нуклеїнових кислот, кодуючих гуманізовані домени МІ і
МН, як описано вище, конструюючи експресуючий химерне антитіло людини вектор, вставляючи їх у експресуючий вектор для клітин тварин, що несе гени, кодуючі СН антитіла людини і Сі. антитіла людини, і експресуючи кодуючу послідовність, вводячи експресуючий вектор у клітину тварини.
Відносно домену СН химерного антитіла людини, він може являти собою будь-яку область, що належить важким ланцюгам імуноглобулінів людини, але придатними є області класу да, а також можна використовувати будь-який з підкласів, що належать класу ІдС, таких як ІДС,
Іс, ІдОЗ і Ід4. Також відносно СІ химерного антитіла людини, він може являти собою будь- яку область, що належить легким ланцюгам імуноглобулінів людини, і можна використовувати області класу каппа або класу лямбда.
Способи одержання гуманізованих або химерних антитіл включають загальноприйняті способи рекомбінантних ДНК і трансфекції генів, що добре відомі в даній галузі (див. Моггіхоп 5.І.. еї а. (1984) і патентні документи 05 5202238 і 5 5204244).
Способи одержання гуманізованих антитіл на основі загальноприйнятих способів рекомбінантних ДНК і трансфекції генів добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Кіесптапп
М. еї аї. 1988; Меибегдег М.5. еї а. 1985). Антитіла можна гуманізувати рядом способів, відомих у даній галузі, включаючи, наприклад, спосіб, описаний у заявці МО 2009/032661, щеплення
СО (ЕР 239400; публікація РСТ М/О91/09967; патенти США МоМо 5225539; 5530101 і 5585089), бо вінірування або зміну поверхні (ЕР 592106; ЕР 519596; Радіап Е.А. (1991); 5щшапісКа О.М. еї аї.
(1994); ВодизКа М.А. еї аї. (1994)) і перестановку ланцюгів (патент США Мо 5565332). Загальна технологія рекомбінантних ДНК для одержання таких антитіл також відома (див. Європейську патентну заявку ЕР 125023 і міжнародну патентну заявку МО 96/02576).
Еаь за даним винаходом можна одержувати, обробляючи антитіло, що специфічно реагує з
СЕАСАМ5, протеазою, такою як папаїн. Також Бар можна одержувати, вставляючи послідовності ДНК, кодуючі ланцюги антитіла Рар, у вектор для експресії у прокаріот або для експресії у еукаріот і вводячи вектор у прокаріотичні або еукаріотичні клітини (за необхідності) з експресією Раб.
Каб)2 за даним винаходом можна одержувати, обробляючи антитіло, що специфічно реагує з СЕАСАМ5, протеазою пепсином. Також Е(аб')»2 можна одержувати, зв'язуючи Рар', описані нижче, за допомогою тіоефірного зв'язку або дисульфідного зв'язку.
Еаб' за даним винаходом можна одержувати, обробляючи Е(аб)2, що специфічно реагує з
СЕАСАМ5, відновником, таким як дитіотреїтол. Також Бар можна одержувати, вставляючи послідовності ДНК, кодуючі ланцюги антитіла Бар, у вектор для експресії у прокаріот або у вектор для експресії у еукаріот і вводячи вектор у прокаріотичні або еукаріотичні клітини (за необхідності) з проведенням його експресії. 5сЕм за даним винаходом можна одержувати, беручи послідовності СОК або доменів МН і
МІ, як описано вище, конструюючи ДНК, кодуючу фрагмент 5сЕм, вставляючи ДНК у прокаріотичний або еукаріотичний експресуючий вектор і потім вводячи експресуючий вектор у прокаріотичні або еукаріотичні клітини (за необхідності) з експресією 5сЕм. Для одержання гуманізованого фрагмента 5сЕм, можна використовувати добре відому технологію, називану щеплення СОЖК, що включає вибір областей, що визначають комплементарність (СОК), за винаходом і щеплення їх на каркас фрагмента 5сЕм людини відомої тривимірної структури (див., наприклад, УМО 98/45322; УМО 87/02671; 05 5859205; 05 5585089; 5 4816567; ЕР 0173494).
Модифікація антитіл за винаходом
Передбачена модифікація(ї) послідовності амінокислот антитіл, описаних у даному документі. Наприклад, може бути бажаним поліпшити афінність зв'язування і/або інші біологічні властивості антитіл. Відомо, що, коли гуманізоване антитіло одержують тільки простим щепленням СОК з МН і Мі. антитіла, одержаного у тварини, що не є людиною, у ЕК МН і МІ антитіла людини, можна відновлювати антигензв'язувальну активність порівняно з активністю вихідного антитіла, одержаного у тварини, що не є людиною. Вважають, що з антигензв'язувальною активністю прямо або опосередковано може бути асоційовано декілька амінокислотних залишків МН і МІ. антитіла, що не належить людині, не тільки в СОК, але також і в ЕК. Таким чином, заміна цих амінокислотних залишків іншими амінокислотними залишками, що походять з ЕК МН і Мі антитіла людини, буде знижувати активність зв'язування. Для вирішення цієї проблеми в антитілах людини з щепленими СОК, що не належать людині, варто починати спроби ідентифікувати в амінокислотних послідовностях ЕК МН і Мі. антитіл людини амінокислотний залишок, який безпосередньо асоційований зі зв'язуванням антитіла або який взаємодіє з амінокислотним залишком СОК, або який підтримує тривимірну структуру антитіла і який безпосередньо асоційований зі зв'язуванням з антигеном. Знижену антигензв'язувальну активність можна підвищувати, заміняючи ідентифіковані амінокислоти амінокислотними залишками вихідного антитіла, одержаного у тварини, що не є людиною.
В одному з варіантів здійснення даного винаходу шість СОК антитіла миші за винаходом і три амінокислоти з його каркаса прищеплювали на каркас, що належить людині, що приводило до одержання гуманізованого антитіла (МАБ2 МІ д5МНОг) з важким ланцюгом з послідовністю
ЗЕО ІЮ МО:74 і легким ланцюгом з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:75, яке зберігало характеристики зв'язування з СЕАСАМ5 людини і яванського макака.
У структурах антитіл за даним винаходом й в кодуючих їх послідовностях ДНК можна проводити модифікації і зміни і, проте, одержувати функціональне антитіло або поліпептид з бажаними характеристиками.
При внесенні змін в амінокислотні послідовності поліпептиду, варто враховувати індекс гідрофобності амінокислот. У даній галузі в основному зрозуміла важливість індексу гідрофобності амінокислот у забезпеченні функції біологічної взаємодії білка. Загальновідомо, що відносно гідрофобний характер амінокислоти додає внесок у вторинну структуру одержуваного білка, що у свою чергу визначає взаємодію білка з іншими молекулами, наприклад ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антитілами, антигенами і т.п. У кожної амінокислоти визначений індекс гідрофобності на основі її гідрофобності і характеристик заряду, вони являють собою: ізолейцин (4,5); валін (14,2); лейцин (43,8); фенілаланін (2,8); цистеїн/цистин (2,5); метіонін (ї1,9); аланін (41,8); гліцин (-0,4); треонін (-0,7); серин (-0,8);
триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролін (-1,6); гістидин (-3,2); глутамінат (-3,5); глутамін (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагін (-3,5); лізин (-3,9) і аргінін (-4,5).
Додатковим об'єктом за даним винаходом є варіанти поліпептидів за даним винаходом зі збереженням функції.
Наприклад, визначені амінокислоти в структурі білка можна заміняти іншими амінокислотами без суттєвої втрати активності. Оскільки здатність до взаємодії і характер білка визначають його біологічну функціональну активність, можна проводити визначені заміни амінокислот у послідовності білка і, звичайно, в кодуючій його послідовності ДНК, однак при цьому одержуючи білок з подібними властивостями. Таким чином, передбачено, що в послідовностях антитіл за винаходом або у відповідних послідовностях ДНК, кодуючих зазначені поліпептиди, можна проводити різні зміни без суттєвої втрати їх біологічної активності.
У даній галузі відомо, що визначені амінокислоти можна заміняти іншими амінокислотами з подібним індексом або показником гідрофобності і, проте, одержувати білок з подібною біологічною активністю, тобто як і раніше одержувати біологічно функціонально еквівалентний білок. Для ідентифікації в антитілі або поліпептиді за винаходом всіх амінокислот, які можна заміняти без значної втрати зв'язування з антигеном, також можна використовувати добре відомі способи, такі як спосіб зі скануванням аланіном. Такі залишки можна кваліфікувати як нейтральні, оскільки вони не залучені в зв'язування антигену або в підтримання структури антитіла. Одне або декілька цих нейтральних положень можна заміщати аланіном або іншою амінокислотою без змін основних характеристик антитіла або поліпептиду за винаходом.
Це проілюстровано в даному винаході за допомогою способу зі скануванням аланіном, проведеного на СОК МАбБа2когя, який продемонстрував, що декілька положень цих СОК, очевидно, є нейтральними, оскільки аланін фактично можна заміняти без достовірного впливу на зв'язування з СЕАСАМ5 людини і яванського макака. Таким чином, очікують, що варіанти антитіл, одержані після таких нейтральних замін, залишаться функціонально ідентичними вихідному антитілу. У прикладі 6.4, що наводиться, проводили заміни в гуманізованому варіанті
МАБ2, але передбачувано, що подібні варіації також будуть зберігати біологічну функцію при введенні в будь-який варіант МАБ2, Мабв4і або МарБб», оскільки всі ці споріднені антитіла несуть
Зо один і той же набір з 6 СОК або дуже близькоспоріднених СОК. Нейтральні положення можна визначити як залишки 27, 28, 29, 31, 51, 52, 89, 90, 93, 94, 96, 97 у послідовностях МІ. цього сімейства антитіл (ЗЕО ІЮ МО:34 або 5ЕО ІЮ МО:38, або 5ЕО ІЮ МО:40, або 5ЕО ІО МО:17, або
ЗЕО ІО МО:23, або 5ЕО ІЮО МО:29, або ЗЕО ІЮ МО:55, або ЗЕО ІО МО:75) і залишки 26-31, 51-58, 97, 103, 104, 107, 109 у послідовностях УН цього сімейства антитіл (ЗЕО ІЮ МО:33 або 5ЕО ІЮ
МО:37, або ЗЕО ІЮ МО:39, або ЗЕО ІЮ МО:5, або ЗЕО ІО МО:51, або ЗЕО ІЮ МО:74).
Нейтральні положення можна представити як положення, де в СОК Мабр2, Марі або Мар5 можна проводити будь-яку заміну амінокислоти. Фактично, у принципі сканування аланіном аланін вибраний, оскільки цей залишок не несе особливих структурних або хімічних властивостей. Загальновизнано, що, якщо аланіном можна заміняти конкретну амінокислоту без зміни властивостей білка, багато інших замін, якщо не всі заміни, амінокислот, з великою імовірністю, також будуть нейтральними. У іншому випадку, коли аланін є амінокислотою дикого типу, якщо показано, що конкретна заміна є нейтральною, з великою імовірністю інші заміни також будуть нейтральними.
У наведеному прикладі 6.4 у СОК Мар2, Маб4 або МаБр5 також ідентифіковані чотири положення, для яких виявлено, що вони не є нейтральними відносно сканування аланіном, але де заміни амінокислот консервативного типу мають нейтральну дію (залишки 30 ї 92 у послідовностях У. і залишки 98 і 100 у послідовностях МН цього сімейства антитіл).
Також очікують, що дві або більше нейтральних мутацій в різних положеннях у будь-якій або в обох послідовностях антитіла при комбінації, як правило, приведуть до антитіла, яке значною мірою зберігає функціональну активність вихідного антитіла. Це проілюстровано, наприклад, на комбінованих замінах ІС Т51А і 1С Т94А, МІ 5З1А і МН О54М або МІ Т53І ї МН 553А в
МАБ2 МІ д5УНаг.
Як викладено вище, заміни амінокислот, таким чином, як правило, основані на відносній подібності замісників бічних ланцюгів амінокислот, наприклад на їх гідрофобності, гідрофільності, заряді, розмірі і т. п. Ілюстративні заміни, що враховують будь-яку з зазначених вище характеристик, добре відомі фахівцям у даній галузі і включають: аргінін і лізин; глутамінат і аспартат; серин і треонін; глутамін і аспарагін і валін, лейцин і ізолейцин.
Також може бути бажано модифікувати антитіло за винаходом відносно ефекторної функції, наприклад, щоб підсилити обумовлену антигеном опосередковану клітинами цитотоксичність бо (АОСС) і/або обумовлену комплементом цитотоксичність (СОС) антитіла. Цього можна досягти за допомогою проведення однієї або декількох замін амінокислот у Ес-області антитіла.
Альтернативно або додатково, у Ес-область можна вводити залишок(ки) цистеїну, таким чином, забезпечуючи формування в цій області дисульфідного зв'язку між ланцюгами. Одержане, таким чином, гомодимерне антитіло може мати поліпшену здатність до інтерналізації і/або посилене, обумовлене комплементом, знищення клітин і/або антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС) (Сагоп Р.С. еї аї. 1992; і зпорез В. 1992).
Інший тип модифікації амінокислот антитіла за винаходом може бути придатний для зміни вихідного профілю глікозилування антитіла, тобто за допомогою видалення однієї або декількох вуглеводних груп, що знаходяться в антитілі, і/або додавання однієї або декількох ділянок глікозилування, що не представлені в антитілі Присутність будь-якої з трипептидних послідовностей аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, де ХХ являє собою будь-яку амінокислоту за винятком проліну, створює потенційну ділянку глікозилування. Додавання або видалення ділянки глікозилування в антитілі придатним чином проводять, змінюючи послідовність амінокислот так, щоб вона містила одну або декілька описаних вище трипептидних послідовностей (для М-зв'язаних ділянок глікозилування).
Інший тип модифікації включає видалення послідовностей, іп 5іїсо або експериментально визначених, як такі, що потенційно приводять до продуктів руйнування або гетерогенності препаратів антитіл. Як приклади, залежно від таких факторів, як рН і поверхнева експозиція, може відбуватися дезамідування залишків аспарагіну і глутаміну. Особливо чутливі до дезамідування залишки аспарагіну, переважно, коли вони знаходяться в послідовності А5п-О1У, і в меншій мірі в інших дипептидних послідовностях, таких як А5п-Аіїа. Таким чином, коли в антитілі або поліпептиді за винаходом присутня така ділянка дезамідування, зокрема Авп-Сту, може бути бажано видалити цю ділянку, як правило, за допомогою консервативної заміни з видаленням одного з залишків-учасників. Такі заміни в послідовності з видаленням одного з залишків-учасників також призначені для включення в даний винахід.
Інший тип ковалентної модифікації включає хімічне або ферментативне зв'язування з антитілом глікозидів. Ці способи переважні тим, що вони не вимагають одержання антитіла в клітині-хазяїні, що має здатність до глікозилування, для М- або О-зв'язаного глікозилування.
Залежно від використовуваного способу зв'язування, цукор(іри) можна приєднувати до (а)
Зо аргініну і гістидину, (Б) вільних карбоксильних груп, (с) вільних сульфгідрильних груп, таких як групи цистеїну, (4) вільних гідроксильних груп, таких як групи серину, треоніну або гідроксипроліну, (е)д ароматичних залишків, таких як залишки фенілаланіну, тирозину або триптофану, або (ї) амідної групи глутаміну. Наприклад, такі способи описані в УМО 87/05330.
Видалення будь-якої вуглеводної групи, що знаходиться на антитілі, можна проводити хімічно або ферментативно. Хімічне деглікозилування вимагає впливу на антитіло сполуки трифторметансульфонової кислоти або еквівалентної сполуки. Ця обробка приводить до відщіплення більшості або всіх цукрів за винятком зв'язувального цукру (М-ацетилглюкозамін або М-ацетилгалактозамін), залишаючи антитіло інтактним. Хімічне деглікозилування описане в зо|апг Н. еї аї. (1987) і в Едде А.5. єї аї. (1981). Ферментативне відщіплення вуглеводних груп від антитіла можна проводити з використанням ряду ендо- і екзоглікозидаз, як описано в
ТпоїтаКита М.А. еї а. (1987).
Інший тип ковалентної модифікації антитіла включає зв'язування антитіла з одним з ряду небілкових полімерів, наприклад з поліетиленгліколем, поліпропіленгліколем або поліоксіалкіленами, способом, зазначеним у патентах США МоМо 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 або 4179337.
Імунокон'югати
Даний винахід також стосується цитотоксичних кон'югатів або імунокон'югатів, або кон'югатів антитіло-лікарський засіб, або кон'югатів. Як використовують у даному описі, усі ці терміни мають одне і те ж значення і є взаємозамінними.
Антитіла миші, МАБІ, МАБ2, МАБЗ, МАБА і МАБ5, кон'югували з майтанзиноїдом (ОМ4) за допомогою лінкера 5РОВ (М-сукцинімідилпіридилдитіобутират). Виявлено, що одержані кон'югати антитіло-лікарський засіб (АС) мають цитотоксичну активність на клітини раку шлунка МКМ45 людини зі значеннями ІСвос1 нМ.
Подібним чином одержували кон'югати антитіло-«ЗОРОВ-ОМ4 на основі химерної форми кожного з МАБІ, МАБр2, МАБ4 і МАБ5. Одержані спИмМАБ1-5РОВ-ОМ4, спмМАБ2-5РОВ-ОМА,
СсПМАВБЗ-5РОВ-ОМА ії сИМАбБ4-5Р08-ОМА. оцінювали в двох дозах відносно первинних пухлин товстого кишечнику СК-І2Н-034Р, що піддаються вимірюванню, п/ш імплантованих самкам мишей 5СІЮ. Аналіз зміни об'єму пухлини для кожної обробленої і контрольної тварини і 95 регресу пухлини продемонстрували, що спИмМАБ2-5РОВ-ОМ4, спИмМАБбБА-5РОВ-ОМА4 ії спмМАБ5Б- 60 ЗРОВ-ОМА були високоактивними, щонайменше при найбільшій оцінюваній дозі, і що сСИМАбБ2-
ЗРОВ-ЮОМ4 був активний в обох оцінюваних дозах. Зокрема, одержували до 82 95 регресу пухлини.
Кон'югати антитіло-ВРОВ-ОМА також одержували з використанням гуманізованих варіантів
МАБ2 (пимМАБ2-1-5208-0М4, пимМАБр2-2-5РОВ-ОМА4 ї пиМАБ2-3-5РОВ-ОМ4). АОС, що містять химерні (СПМАБ2-5РОВ-ОМ4) або гуманізовані варіанти МАБ2, порівнювали з кон'югатом неспоріднене антитіло-БРОВ-ЮОМ4 відносно цитотоксичної активності для клітин МКМ45. Усі
АБС з химерними і гуманізованими варіантами МАБ2 демонстрували значення ІСвос1 НМ, тобто значення ІСво у 53-35 разів менше, ніж виміряна цитотоксична активність кон'юЮгата ОМА з неспорідненим антитілом, що, таким чином, свідчить про опосередковану СЕАСАМ5 цитотоксичну активність кон'югатів з антитілами до СЕАСАМ5.
Оцінювали протипухлинну активність пимМАБ2-3-5РОВ-ОМ4 їі пПимМАБ2-4-5Р08-ОМА4 і порівнювали з СПМАВБ2-5РОВ-ЮОМА відносно вимірних первинних пухлин товстого кишечнику СЕ-
ІШВ-034Р, п/ш імплантованих самкам голих мишей СО-1. Усі кон'югати були високоактивними при найбільшій оцінюваній дозі (10 мг/кг).
Додатково оцінювали протипухлинну активність пПиИМАБ2-3-5РОВ-ОМА ії пиМАБ2-3-сульфо-
ЗРОВ-ОМ4 відносно вимірних первинних пухлин товстого кишечнику СЕ-І2В-034Р, п/ш імплантованих самкам мишей 5СІЮ. пиМАр2-3-5РОВ-0ОМ4 був активний при 5 і 2,5 мг/кг,
ПиМАБ2-3-сульфо-5РОВ-ЮМА був високоактивний при 5 мг/кг і активний при 2,5 мг/кг.
Додатково оцінювали протипухлинну активність пиМАБб2-3-5РОВ-ОМА4 відносно вимірних первинних пухлин легень ГШМ-МІС-0014, п/ш імплантованих самкам мишей 5СІЮ, і виявлено, що вони були високоактивними при 10 і 5 мг/кг.
Кожен кон'югат з ОМА містив середню кількість молекул ОМА (або "відношення лікарський засіб-до-антитіла" або "АК" знаходилося) у діапазоні від 2 до 5.
Таким чином, винахід стосується "їімунокон'югатів", що містять антитіло за винаходом, зв'язане або кон'юговане щонайменше з одним інгібуючим ріст засобом, таким як цитотоксичний засіб або радіоактивний ізотоп. "Інгібуючий ріст засіб" або "антипроліферативний засіб", який можна використовувати незалежно, належить до сполуки або композиції, яка інгібує ріст клітин, особливо пухлинних клітин, іп міго або іп мімо.
Зо Як використовують у даному описі, термін "цитотоксичний засіб" стосується речовини, що інгібує або попереджує функціонування клітин і/або викликає руйнування клітин. Термін "цитотоксичний засіб" призначений для включення хіміотерапевтичних засобів, ферментів, антибіотиків і токсинів, таких як низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи їх фрагменти і або варіанти, і різних протипухлинних засобів або засобів проти злоякісних пухлин, описаних нижче. У деяких варіантах здійснення цитотоксичний засіб являє собою таксоїд, алкалоїд барвінку, майтанзиноїд або аналог майтанзиноїду, такий як ОМ1 або ОМА, низькомолекулярний лікарський засіб, томаміцин або похідне піролобензодіазепіну, похідне криптофіцину, похідне лептопіцину, ауристатин або аналог доластатину, пролікарський засіб, інгібітори топоізомерази
ІЇ, алкілуючий ДНК засіб, антитубуліновий засіб, СС-1065 або аналог СС-1065.
Як використовують у даному описі, "майтанзиноїди" означають майтанзиноїди й аналоги майтанзиноїдів. Майтанзиноїди являють собою лікарські засоби, які інгібують формування мікротрубочок і які є високотоксичними для клітин ссавців.
Приклади придатних майтанзиноїдів включають майтанзинол і аналоги майтанзинолу.
Приклади придатних аналогів майтанзинолу включають аналоги майтанзинолу з модифікованим ароматичним кільцем і аналоги майтанзинолу з модифікаціями в інших положеннях. Такі придатні майтанзиноїди описані в патентах США МоМо 4424219; 4256746; 4294757; 4307016; 4313946; 4315929; 4331598; 4361650; 4362663; 4364866; 4450254; 4322348; 4371533; 6333410; 5475092; 5585499 і 5846545.
Конкретні приклади придатних аналогів майтанзинолу з модифікованим ароматичним кільцем включають: (1) С-19-дехлор (патент США Мо 4256746) (одержаний за допомогою відновлення ГАН ансамітоцину Р); (2) С-20-гідрокси-(або С-20-деметил)/-С-19-дехлор (патенти США МоМо 4361650 і 4307016) (одержаний за допомогою деметилування з використанням Зігеріотусе5 або Асііпотусе5 або дехлорування з використанням Г АН); і (3) б-20-деметокси, С-20-ацилокси (-ОСОНВ), -/-дехлор (патент США Мо 4294757) (одержаний за допомогою ацилювання з використанням ацилхлоридів).
Конкретні приклади придатних аналогів майтанзинолу з модифікаціями в інших положеннях (516) включають:
(1) С-9-5Н (патент США Мо 4424219) (одержаний за допомогою реакції майтанзинолу з Нео або Реоббв); (2) С-14-алкоксиметил (деметокси/СНгОК) (патент США Мо 4331598); (3) С-14-гідроксиметил або ацилоксиметил (СН2ОН або СНгОАс) (патент США Мо 4450254) (одержаний у Мосагаіа); (4) С-15-гідроксилацилокси (патент США Мо 4364866) (одержаний за допомогою перетворення майтанзинолу 5ігеріотусев); (5) С-15-метокси (патенти США МоМо 4313946 і 4315929) (виділений з Тгем/а пиаійога); (6) С-18-н-деметил (патенти США МоМо 4362663 і 4322348) (одержаний за допомогою деметилування майтанзинолу 5ігеріотусеФв); і (7) 4,5-дезокси (патент США Мо 4371533) (одержаний за допомогою відновлення майтанзинолу трихлоридом титану/! АН).
В одному з варіантів здійснення винаходу в цитотоксичних кон'югатах за даним винаходом як цитотоксичний засіб використовують тіолвмісний майтанзиноїд (ОМ1), формально називаний
Ме-деацетил-М2-(З-меркапто-1-оксопропіл)майтанзин. рм1 представлений наступною структурною формулою (1): (в) я ах ?о меО М о) (І). й что он
Мео
В іншому варіанті здійснення в цитотоксичних кон'югатах за даним винаходом як цитотоксичний засіб використовують тіолвмісний майтанзиноїд ОМА, формально називаний Ме- деацетил-М2-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентилумайтанзин. ОМА представлений наступною структурною формулою (І): 6)
М 5Н іх
МеО М 25
Х й а м" со (он!
Мео
У додаткових варіантах здійснення винаходу можна використовувати інші майтанзини, включаючи тіол- і дисульфідвмісні майтанзиноїди, що містять моно- або діалкільну заміну на атомі вуглецю, що несе атом сірки. Вони включають майтанзиноїд, що містить у С-3, 0-14- гідроксиметил, С-15-гідрокси або С-20-дезметил, бічний ланцюг ацилованої амінокислоти з ацильною групою, що несе просторово утруднену сульфгідрильну групу, де атом вуглецю ацильної групи, що несе тіольну функціональну групу, містить один або два замісники, де зазначені замісники являють собою СНз, Се2Н5, лінійний або розгалужений алкіл або алкеніл, що
Зо містить від 1 до 10 реагентів, і в розчині може бути присутнім будь-який агрегат.
Приклади цих цитотоксичних засобів і способів кон'югації додатково наведені в заявці УМО 2008/010101, що включена за допомогою посилання.
Термін "радіоактивний ізотоп" призначений для включення радіоактивних ізотопів, придатних для лікування злоякісних пухлин, таких як А", Ві2!2, Епб9, (81, (125, ув0, |дт, рзг,
Ве"86, Ве88, т!»з, 589 і радіоактивні ізотопи и. Як правило, такі радіоактивні ізотопи в основному випромінюють бета-випромінювання. В одному з варіантів здійснення радіоактивний ізотоп являє собою ізотоп, що випромінює альфа-випромінювання, більш конкретно торій-227, який випромінює альфа-випромінювання. Імунокон'югати за даним винаходом можна одержувати, як описано в заявці УМО 2004/091668.
У деяких варіантах здійснення антитіла за даним винаходом ковалентно, напряму або за допомогою розщеплюваного або нерозщеплюваного лінкера, зв'язані щонайменше з одним інгібуючим ріст засобом.
Як використовують у даному описі, "лінкері- означає хімічну молекулу, яка містить ковалентний зв'язок або ланцюг атомів, що ковалентно зв'язують поліпептид з молекулою лікарського засобу.
Кон'югати можна одержувати способами іп міго. Для зв'язування лікарського засобу або пролікарського засобу з антитілом використовують лінкерну групу. Придатні лінкерні групи добре відомі в даній галузі і включають дисульфідні групи, тіоефірні групи, кислотолабільні групи, фотолабільні групи, пептидазолабільні групи і естеразолабільні групи. Кон'югацію антитіл за винаходом з цитотоксичними засобами або інгібуючими ріст засобами можна проводити з використанням ряду біфункціональних засобів, що зв'язують білки, включаючи, але не обмежуючись ними, М-сукцинімідилпіридилдитіобутират (ЗРОВ), 4-К5-нітро-2-піридиніл)дитіо |- 2,5-діоксо-1-піролідиніловий ефір бутанової кислоти (нітро-5РОВ), 4-(піридин-2-ілдисульфаніл)- 2-сульфомасляну кислоту (сульфо-5РОВ), М-сукцинімідил(2-піридилдитіо)пропіонат (ЗРОР), сукцинімідил(іМ-малеіїмідометил)циклогексан-1-карбоксилат (МСС), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні складних імідоефірів (такі як диметиладипімідат НС), активні складні ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі як глутаровий альдегід), бісазидосполуки (такі як о біс-(п-азидобензоїл)гександіамін), похідні бісдіазонію (такі яко біс-(п- діазонійбензоїл)етилендіамін), діїзоціанати (такі як толуол-2,6-діїзоціанат) і сполуки бісактивного фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Наприклад, можна одержувати рициновий імунотоксин, як описано в Мітена еї аї. (1987). Ілюстративним хелатуючим засобом для кон'югації радіонуклеотиду З антитілом Є мічена по вуглецю 1- ізотіоціанатобензилметилдіетилентриамінпентаоцтова кислота (МХ-ОТРА) (УМО 94/11026).
Зо Лінкер може являти собою "розщеплюваний лінкер- що полегшує вивільнення цитотоксичного засобу або інгібуючого ріст засобу в клітині. Наприклад, можна використовувати кислотолабільний лінкер, чутливий до пептидаз лінкер, естеразолабільний лінкер, фотолабільний лінкер або дисульфідвмісний лінкер (наприклад, див. патент США Мо 5208020).
Також лінкер може бути "нерозщеплюваним лінкером" (наприклад, лінкер 5МСС), що в деяких випадках може приводити до кращої переносимості.
Альтернативно, за допомогою рекомбінантних способів або пептидного синтезу можна одержувати злитий білок, що містить антитіло за винаходом і цитотоксичний або інгібуючий ріст поліпептид. Послідовність ДНК може містити відповідні області, кодуючі дві частини кон'югата, або одну поруч з іншою, або розділені областю, кодуючою лінкерний пептид, що не порушує бажані властивості кон'югата.
Антитіла за даним винаходом також можна використовувати в залежній опосередкованій ферментами терапії пролікарськими засобами за допомогою кон'югації поліпептиду з активуючим пролікарський засіб ферментом, що перетворює пролікарський засіб (наприклад, пептидильний хіміотерапевтичний засіб, див. М/О 81/01145) в активний протираковий лікарський засіб (див., наприклад, УМО 88/07378 і патент США Мо 4975278). Ферментативний компонент імунокон'югата, придатний для АЮЕРТ, включає будь-який фермент, здатний діяти на пролікарський засіб таким чином, щоб перетворювати його в більш активну, цитотоксичну форму. Ферменти, що придатні в способі за даним винаходом, включають, але не обмежуючись ними, лужну фосфатазу, придатну для перетворення у вільні лікарські засоби фосфатвмісних пролікарських засобів; арилсульфатазу, придатну для перетворення у вільні лікарські засоби сульфатвмісних пролікарських засобів; цитозиндезаміназу, придатну для перетворення в протираковий лікарський засіб 5-фторурацил, нетоксичний фторцитозин; протеази, такі як протеаза Зеїтайа, термолізин, субтилізин, карбоксипептидази і катепсини (такі як катепсини В і
У, які придатні для перетворення у вільні лікарські засоби пептидвмісних пролікарських засобів;
Р-аланілкарбоксипептидази, придатні для перетворення пролікарських засобів, що містять замісники ЮО-амінокислот; розщеплюючі вуглеводи ферменти, такі як О-галактозидаза і нейрамінідаза, придатні для перетворення у вільні лікарські засоби глікозилованих пролікарських засобів; Р-лактамазу, придатну для перетворення у вільні лікарські засоби лікарських засобів, дериватизованих Р-лактамами; і пеніцилінамідази, такі як пеніцилін М бо амідаза або пеніцилін С амідаза, придатні для перетворення у вільні лікарські засоби лікарських засобів, дериватизованих по їх атомах азоту амінів феноксіацетильними або фенілацетильними групами, відповідно. Ферменти можна ковалентно зв'язувати з поліпептгидами за винаходом способами, добре відомими в даній галузі, такими як використання гетеробіфункціональних зшивальних реагентів, описаних вище.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, інгібуючий ріст засіб у кон'югаті за винаходом являє собою майтанзиноїд, в одному з варіантів здійснення ОМІ1 або ОМА.
У зазначеному кон'югаті антитіло кон'юговане з зазначеним щонайменше одним інгібуючим ріст засобом за допомогою лінкерної групи. В одному з варіантів здійснення зазначена лінкерна група являє собою розщеплюваний або нерозщеплюваний лінкер, такий як ЗРОВ, сульфо-5РОВ або 5МСОС.
Кон'югат можна вибирати з групи, що складається з: ї) кон'югата антитіло-ФОРОВ-ЮОМА4 формули (ПП): нк н
АС вв ча тий -рм о о стр у о
СЕ | о он Антитіло
ЩО й М с ї ах он я А ай те :
ІН (ну
М он п
АЬБРОВ-ОМА її) кон'югата антитіло-сульфо-5РОВ-ОМА формули (ІМ): осбко
Н х 5, М. За ото Ту
Ух о я зо о що Антитіло кі М- ше ен о
Я тТцто | (хх о г ж он й
Ав-ЗаоЗРОВ-ОМА і ії) кон'югата антитіло-БМОС-ОМ1 формули (М):
о х 4 Ба; о й о о о М ; ще ! 7 | о
Ще те Антитию аа ї : н бе; -9 он (Ух п
АЬ-ЗМССОМИ
У зазначеному варіанті здійснення антитіло, яке включається в кон'югат, вибране з групи, що складається 3: ї) гуманізованого антитіла, що містить важкий ланцюг з послідовністю БЕО ІЮ МО:51 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:17, і) гуманізованого антитіла, що містить важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:5 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:23, ії) гуманізованого антитіла, що містить важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮО МО:5 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:29, і ім) гуманізованого антитіла, що містить важкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:51 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:55.
В одному з варіантів здійснення кон'югат являє собою кон'югат формули (ПП), (ІМ) або (М), як визначено вище, у якому антитіло являє собою гуманізоване антитіло, що містить важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:5 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:29.
Як правило, кон'югат можна одержувати способом, який включає стадії: () приведення необов'язково забуференого водного розчину зв'язуючого клітини засобу (наприклад, антитіла за винаходом) у контакт із розчинами лінкера і цитотоксичної сполуки; (і) наступного необов'язкового відділення кон'югата, що утворюється в (ї), від зв'язуючого клітини засобу, що не прореагував.
Водний розчин зв'язуючого клітини засобу можна буферувати такими буферами, як, наприклад, фосфат, ацетат, цитрат калію або М-2-гідроксіетилпіперазин-М'-2-етансульфонова кислота (буфер Нере5). Буфер залежить від характеру зв'язуючого клітини засобу.
Цитотоксична сполука знаходиться в розчині в органічному полярному розчиннику, наприклад у диметилсульфоксиді (ДМСО) або диметилацетаміді (ОМА).
Температура реакції, як правило, складає від 20 до 40 "С. Час реакції може варіювати від 1 до 24 годин. Реакцію між зв'язуючим клітини засобом і цитотоксичним засобом можна контролювати за допомогою ексклюзійної хроматографії (5ЕС) з використанням рефрактометричного і/або УФ-детектора. Якщо вихід кон'югата є занадто низьким, можна
Зо збільшити час реакції.
Для проведення розділення на стадії (ії) фахівець у даній галузі може використовувати ряд різних методів хроматографії: наприклад, кон'югат можна очищати за допомогою 5ЕС, адсорбційної хроматографії (такої як іонообмінна хроматографія, ІЕС), гідрофобної хроматографії (НІС), афінної хроматографії, хроматографії зі змішаною підкладкою, такої як хроматографія на гідроксіапатиті, або високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Також можна використовувати очищення за допомогою діалізу або діафільтрації.
Як використовують у даному описі, термін "агрегати" означає асоціати, що можуть формуватися між двома або більше зв'язуючими клітини засобами, де зазначені засоби є модифікованими, або не за допомогою кон'югації. Агрегати можуть утворюватися під впливом великої кількості параметрів, таких як висока концентрація зв'язуючого клітини засобу в розчині, рН розчину, високе напруження зсуву, кількість зв'язаних димерів і їх характер гідрофобності, температура (див. Уумапд 5 Сбо5п, 2008, 9У. Метрбгапе озсі., 318: 311-316, і цитовані там посилання); слід зазначити, що відносний вплив деяких 3з цих параметрів точно не встановлений. У випадку білків і антитіл, фахівець у даній галузі може звернутися до СтотуеїЇ еї аі. (2006, ААРБ Цошпа!, 8(3):Е572-Е579). Вміст агрегатів можна визначати добре відомим фахівцям способом, таким як ЗЕС (див. Умакег еї а!., 1993, Апаї. Віоспет., 212(2):469-480).
Після стадії (і) або (ії), розчин, що містить кон'югат, може бути підданий додатковій стадії (ії) хроматографії, ультрафільтрації і/або діафільтрації.
Після проведення цих стадій кон'югат відновлюють у водному розчині.
Відповідно до одного з варіантів здійснення, кон'югат за винаходом характеризується "відношенням лікарського засобу до антитіла" (або "САК") у діапазоні від 1 до 10, наприклад від 2 до 5, зокрема від З до 4. Як правило, це являє собою випадок кон'югатів, що містять молекули майтанзиноїдів.
Ця величина ОАК може варіювати залежно від характеру використовуваного антитіла і лікарського засобу (тобто інгібуючого ріст засобу) поряд з експериментальними умовами, використовуваними для кон'югації (подібних до відношення інгібуючого ріст засобу/антитіла, часу реакції, характеру розчинника і співрозчинника, якщо він присутній). Таким чином, контакт антитіла і інгібуючого ріст засобу приводить до одержання суміші, яка містить декілька кон'югатів, що відрізняються один від одного різними відношеннями лікарського засобу до антитіла; необов'язково чистого антитіла; необов'язково агрегатів. Таким чином, визначуване
БАК є середнім значенням.
Спосіб, який можна використовувати для визначення БАК, полягає в спектрофотометричному вимірюванні відношення оптичної густини розчину значною мірою очищеного кон'югата при Ло і 280 нм. 280 нм являє собою довжину хвилі, як правило, використовувану для вимірювання концентрації білка, такої як концентрація антитіла. Довжина хвилі Ло вибрана так, щоб забезпечити відмінність лікарського засобу від антитіла, тобто, як абсолютно зрозуміло фахівцю, Ло являє собою довжину хвилі, при якій лікарський засіб має високу оптичну густину, і Ло досить далека від 280 нм для уникнення суттєвого перекривання піків оптичної густини лікарського засобу й антитіла. У випадку молекул майтанзиноїдів, Ло можна вибирати величиною 252 нм. Спосіб розрахунку ПАК можна знайти в Апіопу 5. Юітйгом (єд), 1 С, 2009, Тнегарешііс Апіїродієз апа Ргоюсо!5, мої. 525, 445, Зргіпдег Зсієпсе:
Зо Оптичні густини кон'югата при Хо (Аж) і при 280 нм (Агво) вимірюють в аналізі мономерних піків при ексклюзійній хроматографії (ЕС) (що дозволяє розрахувати параметр "ППАК(ЗЕС)") або з використанням класичного спектрофотометричного пристрою (що дозволяє розрахувати параметр "АК(ШМ)"). Оптичні густини можна виразити наступним чином:
Ахор--(СохЄрло)-Н(САХЄАМЮ),
Агво-(Сох Єргво)-Н(САХ ЄАгВО), де: со і сл відповідно являють собою концентрації лікарського засобу й антитіла в розчині,
Єрю і Єргво відповідно являють собою молярні коефіцієнти екстинкції лікарського засобу при
Хо і 280 нм,
Єдхо І Єдгво ВІДПОВІДНО ЯВЛЯЮТЬь Собою молярні коефіцієнти екстинкції антитіла при Хо і 280 нм.
Розв'язання цих двох рівнянь із двома невідомими приводить до наступних рівнянь: сот (Єдгвох Ало)-(Єдлох Агво) Й (Єолох Єдгво) -(Єдлох Єоргво) |,
СА-|Агво-(сох Єргво) |/Єдгво.
Потім на основі відношення концентрації лікарського засобу до концентрації антитіла розраховують середнє ОАВ: ОАВ-со/са.
Фармацевтичні композиції
Антитіла або імунокон'югати за винаходом для одержання терапевтичних композицій можна комбінувати з фармацевтично прийнятними ексципієнтами і необов'язково матриксами з тривалим вивільненням, такими як біорозкладані полімери.
Таким чином, інший об'єкт винаходу являє собою фармацевтичну композицію, яка містить антитіло або імунокон'югат за винаходом і фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт.
Винахід також стосується поліпептиду або імунокон'югата за винаходом для застосування як лікарського засобу. "Фармацевтично" або "фармацевтично прийнятний" стосується молекулярних структур і композицій, які не приводять до шкідливих, алергічних або інших несприятливих реакцій, коли їх, за необхідності, вводять ссавцю, особливо людині. Фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт стосується нетоксичного твердого, напівтвердого або рідкого наповнювача, розріджувача, інкапсулюючої речовині або складу допоміжного засобу будь-якого типу.
Як використовують у даному описі, "фармацевтично прийнятні носії" включає будь-який і всі бо розчинники, диспергуючі середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби і т. п.,
які є фізіологічно сумісними. Приклади придатних носіїв, розріджувачів і/або ексципієнтів включають одне або декілька з води, амінокислот, фізіологічного розчину, забуференого фосфатом сольового буфера, фосфатного, ацетатного, цитратного, сукцинатного буферів; амінокислот і їх похідних, таких як гістидин, аргінін, гліцин, пролін, гліцилгліцин; неорганічних солей Масі, хлориду кальцію; цукрів або поліспиртів, таких як декстроза, гліцерин, етанол, сахароза, трегалоза, маніт; поверхнево-активних речовин, таких як полісорбат 80, полісорбат 20, полоксамер 188 і т. п., а також їх комбінації. У багатьох випадках, у композицію переважно включати засоби надання ізотонічності, такі як цукри, поліспирти або хлорид натрію, а також склад може містити антиоксидант, такий як триптамін, і стабілізатор, такий як Туееп-20.
Зрозуміло, що форма фармацевтичних композицій, шлях введення, дозування і схема лікування залежать від стану, що підлягає лікуванню, тяжкості захворювання, віку, маси і статі пацієнта і т. д.
Фармацевтичні композиції за винаходом можна формулювати для топічного, перорального, парентерального, інтраназального, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного або внутрішньоочного введення |і т. п.
В одному з варіантів здійснення фармацевтичні композиції містять носії, які є фармацевтично прийнятними для ін'єктованого складу. Вони можуть являти собою ізотонічні, стерильні, сольові розчини (моно- або дифосфат натрію, хлорид натрію, калію, кальцію або магнію і т. п. або суміші таких солей солі) або сухі, особливо ліофілізовані композиції, що при додаванні, залежно від випадку, стерилізованої води або фізіологічного розчину забезпечують склад ін'єктованих розчинів.
Фармацевтичну композицію можна вводити за допомогою пристроїв для комбінування лікарських засобів.
Дози, використовувані для введення, можна встановлювати як функцію різних параметрів, наприклад як функцію застосовуваного способу введення, відповідної патології або, альтернативно, бажаної тривалості лікування.
Для одержання фармацевтичних композицій ефективну кількість антитіла або імунокон'югата за винаходом можна розчиняти або диспергувати у фармацевтично прийнятному носії або водному середовицщі.
Зо Фармацевтичні форми, придатні для застосування як ін'єкцій, включають стерильні водні розчини або дисперсії; склади, що містять кунжутну олію, арахісову олію або водний пропіленгліколь; і стерильні порошки для негайного приготування стерильних ін'єктованих розчинів або дисперсій. В усіх випадках, форма повинна бути стерильною і ін'єктованою за допомогою придатного пристрою або системи для доставки без руйнування. Вона повинна бути стабільна в умовах одержання і зберігання, і її необхідно захищати від забруднюючої дії мікроорганізмів, таких як бактерії і гриби.
Розчини активних сполук можна одержувати у вигляді вільних основ або фармакологічно прийнятних солей у воді, придатним чином змішуючи з поверхнево-активною речовиною. Також можна одержувати дисперсії в гліцерині, рідких поліетиленгліколях і їх сумішах і в оліях. У звичайних умовах зберігання і застосування ці препарати містять консервант для запобігання росту мікроорганізмів.
Поліпептид, антитіло або імунокон'югат за винаходом можна формулювати в композицію в нейтральній формі або у формі солі. Фармацевтично прийнятні солі включають кислотно- адитивні солі (формовані з вільними аміногрупами білка), що сформовані з неорганічними кислотами, такими як, наприклад, хлористоводнева або фосфорна кислота, або такими органічними кислотами як оцтова, щавлева, винна, мигдальна і т. п. Також можна одержувати солі, формовані вільними карбоксильними групами з неорганічними основами, наприклад, такими як гідроксиди натрію, калію, амонію, кальцію або заліза, і з такими органічними основами як ізопропіламін, триметиламін, гліцин, гістидин, прокаїн і т. п.
Носій також може являти собою розчинник або диспергуюче середовище, що містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь, і т. п.), їх придатні суміші і рослинні олії. Придатну плинність можна підтримувати, наприклад, використовуючи такі покриття, як лецитин, підтримуючи необхідний розмір частинок, у випадку дисперсії і використовуючи поверхнево-активні речовини.
Запобігання дії мікроорганізмів можна здійснювати різними антибактеріальними (|і протигрибковими засобами, наприклад парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбіновою кислотою, тимеросалом і т. п. У багатьох випадках переважно включати засоби надання ізотонічності, наприклад цукри або хлорид натрію. Пролонгування всмоктування ін'єктованих композицій можна здійснювати, використовуючи в композиціях засоби, що затримують бо всмоктування, наприклад моностеарат алюмінію і желатин.
Стерильні ін'єктовані розчини одержують за допомогою додавання необхідної кількості активної сполуки в придатний розчинник, за необхідності, з будь-яким з інших інгредієнтів, перерахованих вище, з наступною стерилізацією фільтруванням. Як правило, дисперсії одержують, додаючи різні стерилізовані активні інгредієнти в стерильний носій, що містить основне диспергуюче середовище й інші необхідні інгредієнти з перерахованих вище. У випадку стерильних порошків, для одержання стерильних ін'єксгованих розчинів переважні способи одержання являють собою методи вакуумного сушіння і ліофілізації, якими одержують порошок активного інгредієнта і будь-якого бажаного додаткового інгредієнта з їх попередньо простерилізованого фільтруванням розчину.
Також передбачене одержання більш концентрованих або висококонцентрованих розчинів для прямої ін'єкції де передбачене використання як розчинника ДМСО для забезпечення екстремально швидкого проникнення, доставки високих концентрацій активних засобів у малу область пухлини.
Після складання розчини вводять способом, що відповідає дозованому складу й у такій кількості, що є терапевтично ефективною. Склади легко водити в ряді лікарських форм, таких як тип ін'єктованих розчинів, описаний вище, а також можна використовувати вивільняючі лікарський засіб капсули і т. п.
Наприклад, для парентерального введення у водному розчині розчин, якщо необхідно, потрібно відповідним чином буферизувати і спочатку зробити рідкий розріджувач ізотонічним достатньою кількістю сольового розчину або глюкози. Ці водні розчини особливо придатні для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного і інтраперитонеального введення. У зв'язку з цим, з урахуванням даного опису, стерильні водні середовища, які можна використовувати, відомі фахівцям у даній галузі. Наприклад, одне дозування можна розводити в 1 мл ізотонічного розчину Масі і доводити до 1000 мл рідиною для підшкірного введення або ін'єктгувати у ділянку, призначену для інфузії (див. наприклад, "Нетіпдіоп'є РПаптасешйісаї!
Зсіепсе5" 151 Еаййоп, рр. 1035-1038 апа 1570-1580). Залежно від стану індивідуума, що піддається лікуванню, обов'язково проводять визначені зміни дозування. У будь-якому випадку, відповідну дозу для індивідуума визначає фахівець, відповідальний за введення.
Антитіло або імунокон'югат за винаходом можна формулювати в терапевтичній суміші так,
Зо щоб вона містила приблизно від 0,01 до 100 міліграмів на дозу або приблизно стільки.
На додаток до антитіла або імунокон'югата, формульованого для парентерального введення, такого як внутрішньовенна або внутрішньом'язова ін'єкція, інші фармацевтично прийнятні форми включають, наприклад, таблетки або інші тверді форми для перорального введення; капсули з уповільненим вивільненням і будь-яку іншу форму, використовувану на даний час.
У визначених варіантах здійснення для введення поліпептидів у клітини-хазяїни передбачене використання ліпосом і/або наночастинок. Одержання і використання ліпосом і/або наночастинок відоме фахівцям у даній галузі.
Як правило, нанокапсули можуть утримувати сполуки стабільним і відтворюваним способом.
Щоб уникнути побічних ефектів унаслідок надлишку внутрішньоклітинних полімерів, такі ультрадисперсні частинки (з розміром приблизно 0,1 мкм), як правило, розробляють з використанням полімерів, здатних до руйнування іп мімо. Для застосування за даним винаходом передбачені біорозкладані поліалкілціаноакрилатні наночастинки або біорозкладані наночастинки з полілактиду або зі співполімеру полілактиду і гліколіду, що задовольняють ці вимоги, і такі частинки можуть бути легко одержані.
Ліпосоми одержують з фосфоліпідів, що дисперговані у водному середовищі і спонтанно формують багатошарові концентричні двошарові везикули (також називані багатошаровими везикулами (МІ М)). Як правило, діаметр МІМ складає від 25 нм до 4 мкм. Обробка МІ М ультразвуком приводить до формування малих одношарових везикул (ЗОМ) з діаметром у діапазоні від 200 до 500 А, що містять у серцевині водний розчин. Фізичні характеристики ліпосом залежать від рн, іонної сили і присутності двовалентних катіонів.
Терапевтичні способи і застосування
Автори винаходу продемонстрували, що п'ять антитіл, які вони одержали, здатні забезпечувати інтерналізацію комплексу СЕАСАМ5-антитіло після зв'язування. Крім того, вони продемонстрували, що ці антитіла, комбіновані з цитотоксичним майтанзиноїдом (ОМУ), індукують цитотоксичну активність відносно пухлинних клітин МКМ45 людини іп міго. Також вони продемонстрували, що ці імунокон'юЮгати на мишачій моделі одержаних у пацієнтів ксенотрансплантатів первинної пухлини товстого кишечнику людини індукують суттєву протипухлинну активність іп мімо при використанні в дозі 5 мг/кг і 2,5 мг/кг з однією ін'єкцією на бо добу 14 після імплантації пухлини.
Зо
Таким чином, поліпептиди, антитіла, імунокон'югати або фармацевтичні композиції за винаходом можуть бути корисні для лікування злоякісних пухлин.
Злоякісна пухлина для лікування антитілами, імунокон'юЮлгтатами або фармацевтичними композиціями за винаходом являє собою злоякісну пухлину, експресуючу СЕАСАМЬ5, зокрема надекспресуючу СЕАСАМХ5 у порівнянні з нормальними (тобто непухлинними) клітинами того ж тканинного походження. Експресію СЕАСАМ5 злоякісними клітинами можна легко оцінити, наприклад, з використанням антитіла за винаходом, як описано в наведеному нижче розділі "Діагностичні застосування", і, зокрема, імуногістохімічним способом, наприклад, як описано в прикладі 8.
В одному з варіантів здійснення злоякісна пухлина може являти собою колоректальний рак, рак шлунка, легень, шийки матки, підшлункової залози, стравоходу, яєчника, щитовидної залози, сечового міхура, ендометрія, молочної залози, печінки (наприклад, холангіокарциному), передміхурової залози або шкіри. Скринінг панелі пухлин людини за допомогою імуногістохімії з використанням антитіла миші до СЕАСАМ5 людини за винаходом фактично продемонстрував забарвлення антитілами в цих типах злоякісних пухлин, як більш докладно описано прикладі 8.
Антитіла або імунокон'югати за винаходом можна використовувати окремо або в комбінації з будь-яким придатним інгібуючим ріст засобом.
Антитіла за винаходом можна кон'югувати або зв'язувати з інгібуючим ріст засобом, цитотоксичним засобом або з активуючим пролікарський засіб ферментом, як описано вище.
Фактично, антитіла за винаходом можуть бути придатні для спрямування зазначених інгібуючого ріст засобу, цитотоксичного засобу або пролікарського засобу в злоякісні клітини, експресуючі або надекспресуючі на своїх поверхнях СЕАСАМ5.
Також добре відомо, що терапевтичні моноклональні антитіла можуть приводити до виснаження клітин, що несуть антиген, специфічно розпізнаваний антитілом. Це виснаження можуть опосередковувати щонайменше три механізми: опосередковувана антитілами клітинна цитотоксичність (АЮОСС), залежний від комплементу лізис і пряме протипухлинне інгібування росту пухлини внаслідок сигналів, що подаються антигеном, до якого спрямоване антитіло. "Обумовлена комплементом цитотоксичність", або "СОС", стосується лізису клітини-мішені в присутності комплементу. При зв'язуванні першого компонента системи комплементу з
Зо антитілами, що зв'язані з упізнаваним ними антигеном, відбувається ініціація активації класичного шляху комплементу. Для оцінки активації комплементу можна проводити аналіз
СОС, наприклад, як описано в Салапо-Запіого вії аї. (1997). "Антитілозалежна клітинна цитотоксичність7, або "АЮСС", стосується форми цитотоксичності, при якій секретовані антитіла зв'язуються з рецепторами Ес (Ес), представленими на визначених цитотоксичних клітинах (наприклад, на клітинах природних кілерів (МК), нейтрофілах і макрофагах), забезпечуючи специфічне зв'язування цих цитотоксичних ефекторних клітин з клітинами-мішенями, що несуть антиген, і потім знищення клітин-мішеней. Для оцінки активності АЮСС молекули, що представляє інтерес, можна проводити аналіз АОСС іп міїго, такий як аналіз, описаний у патентах США МоМо 5821337 або 5821337.
Таким чином, об'єктом винаходу є спосіб лікування злоякісної пухлини, який включає введення потребуючому цього індивідууму терапевтично ефективної кількості поліпептиду, антитіла, імунокон'югата або фармацевтичної композиції за винаходом.
У контексті винаходу, як використовують у даному описі, термін "лікування" означає обернення, зменшення, інгібування прогресування або запобігання порушенню або патологічному стану, відносно якого застосовують такий термін, або одному або декільком симптомам такого порушення або стану. Як використовують у даному описі, під терміном "лікування злоякісної пухлини" мають на увазі інгібування росту злоякісних клітин пухлини і/або прогресування метастазів зазначеної пухлини. Також таке лікування може приводити до обернення росту пухлини, тобто зменшення розміру вимірюваної пухлини. Зокрема, таке лікування приводить до повного регресу пухлини або метастазів.
У контексті винаходу термін "пацієнт" або "потребуючий цього пацієнт" призначений для позначення людини або ссавця, що не є людиною, ураженого або ймовірно ураженого злоякісною пухлиною. Зокрема, зазначений пацієнт може являти собою пацієнта, якого визначили як сприйнятливого до терапевтичного засобу, націленого на СЕАСАМ5, зокрема до антитіла або імунокон'югата за винаходом, наприклад, способом, як описано нижче в даному документі.
Під "терапевтично ефективною кількістю" поліпептиду за винаходом мають на увазі достатню кількість поліпептиду для лікування зазначеного злоякісного захворювання, з 60 прийнятним співвідношенням користь/ризик, придатним для будь-якого медичного лікування.
Однак варто розуміти, що загальне добове використання поліпептидів і композицій за даним винаходом знаходиться на розсуді лікуючого лікаря в обсязі озвученого лікарського рішення.
Конкретний рівень терапевтично ефективної дози для будь-якого конкретного пацієнта залежить від ряду факторів, включаючи порушення, що підлягає лікуванню, і тяжкість цього порушення; активність конкретного застосовуваного поліпептиду; конкретну застосовувану композицію, вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать і дієту пацієнта; час введення, шлях введення і швидкість виведення конкретного застосовуваного поліпептиду; тривалість лікування; використовувані в комбінації або одночасно з конкретним застосовуваним поліпептидом лікарські засоби і подібні фактори, добре відомі в галузі медицини. Наприклад, фахівцям у даній галузі добре відомо про початок дозування сполук на рівнях, менших ніж рівні, необхідні для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступового збільшення дози до досягнення бажаного ефекту.
Іншим об'єктом винаходу є поліпептид, антитіло, імунокон'югат або фармацевтична композиція за винаходом для застосування при лікуванні злоякісної пухлини.
Поліпептид, антитіло, імунокон'югат або фармацевтичну композицію можна використовувати для інгібування прогресування метастазів злоякісної пухлини.
Поліпептиди за винаходом можна використовувати в комбінації з будь-якою іншою терапевтичною стратегією для лікування злоякісних пухлин (наприклад, допоміжна терапія) і/або для уповільнення росту метастатичної пухлини.
Ефективність лікування антитілом або імунокон'югатом за винаходом можна легко оцінювати іп мімо, наприклад, на мишачій моделі злоякісної пухлини, і вимірюючи, наприклад, зміни об'ємів пухлин у груп, що піддаються обробці, і контрольних груп, 95 регресу пухлини, частковий регрес і/або повний регрес, як визначено в прикладі 5.3.
Діагностичні застосування
Опубліковано, що СЕАСАМ5 високо експресований на поверхні клітин колоректальних пухлин, клітин пухлин шлунка, легень, матки і слабко експресований у невеликій кількості нормальних епітеліальних клітин, таких як епітеліальні клітини товстого кишечнику і стравоходу.
Крім того, скринінг панелі пухлин людини за допомогою імуногістохімії з використанням антитіла миші до СЕАСАМ5 людини за винаходом продемонстрував забарвлення антитілами
Зо колоректального раку, раку шлунка, легень, шийки матки, підшлункової залози, стравоходу, яєчника, щитовидної залози, сечового міхура, ендометрія, молочної залози, печінки (зокрема холангіокарцинома), передміхурової залози і шкіри.
Таким чином, СЕАСАМ5 являє собою маркер злоякісних пухлин і, таким чином, має потенціал до використання для указання ефективності протиракової терапії або детекції рецидиву захворювання.
В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом використовують як компонент аналізу в рамках терапії, спрямованої на експресуючі СЕАСАМ5 пухлини, для визначення сприйнятливості пацієнта до терапевтичного засобу, контролю ефективності протиракової терапії або детекції рецидиву захворювання після лікування. Зокрема, одне і те ж антитіло за винаходом використовують як у вигляді компонента терапевтичного засобу, так і у вигляді компонента діагностичного аналізу.
Таким чином, додатковим об'єктом винаходу є антитіло за винаходом для застосування при детекції експресії СЕАСАМ5 у індивідуума або для застосування при детекції експресії
СЕАСАМ5 ех мімо у біологічному зразку, одержаному у індивідуума. Зокрема, зазначена детекція може бути призначена для а) діагностики наявності у індивідуума злоякісної пухлини, або р) визначення сприйнятливості пацієнта зі злоякісною пухлиною до терапевтичного засобу, націленого на СЕАСАМУ5, зокрема імунокон'югата за винаходом, або с) контролю ефективності терапії злоякісної пухлини, що несе СЕАСАМ»5, або детекції рецидиву злоякісної пухлини після терапії злоякісної пухлини, що несе СЕАСАМ5, зокрема для терапії імунокон'югатом за винаходом; за допомогою детекції експресії поверхневого білка СЕАСАМ5 на пухлинних клітинах.
В одному з варіантів здійснення антитіло призначене для застосування іп міго або ех мімо.
Наприклад, СЕАСАМ5 можна детектувати з використанням антитіла за винаходом іп міго або ех мімо у біологічному зразку, одержаному у індивідуума. Застосування за винаходом також може являти собою застосування іп мімо. Наприклад, антитіло за винаходом вводять індивідууму і детектують і/або кількісно визначають комплекси антитіло-клітини, при цьому детекція зазначених комплексів є показником злоякісної пухлини.
Крім того винахід стосується способу детекції присутності злоякісної пухлини у індивідуума 60 іп міго або ех мімо, який включає стадії:
(а) приведення біологічного зразка, одержаного у індивідуума, у контакт з антитілом за винаходом, зокрема в умовах, придатних для формування комплексів антитіла з зазначеним біологічним зразком; (Б) вимірювання рівня антитіл, зв'язаних із зазначеним біологічним зразком; (с) детекції присутності злоякісної пухлини за допомогою порівняння виміряного рівня зв'язаного антитіла з контролем, де підвищений рівень зв'язаного антитіла в порівнянні з контролем свідчить про злоякісну пухлину.
Винахід також стосується способу визначення сприйнятливості пацієнта зі злоякісною пухлиною до терапевтичного засобу, націленого на СЕАСАМ»5, зокрема до імунокон'югата за винаходом, іп міїго або ех мімо, де спосіб включає стадії: (а) приведення біологічного зразка, одержаного у пацієнта зі злоякісною пухлиною, у контакт з антитілом за винаходом, зокрема в умовах, придатних для формування комплексів антитіла з зазначеним біологічним зразком; (Б) вимірювання рівня антитіла, зв'язаного з зазначеним біологічним зразком; (с) порівняння виміряного рівня антитіла, зв'язаного з зазначеним біологічним зразком, з рівнем антитіла, зв'язаним з контролем; де підвищений рівень антитіла, зв'язаного з зазначеним біологічним зразком, у порівнянні з контролем є показником сприйнятливості пацієнта до терапевтичного засобу, націленого на
СЕАСАМ5.
У зазначених вище способах зазначений контроль може являти собою нормальний, незлоякісний біологічний зразок того ж типу або контрольне значення визначають як характерний рівень зв'язаного антитіла в нормальному біологічному зразку того ж типу.
В одному з варіантів здійснення антитіла за винаходом придатні для діагностики злоякісної пухлини, експресуючої СЕАСАМ»5, такої як колоректальний рак, рак шлунка, легень, шийки матки, підшлункової залози, стравоходу, яєчника, щитовидної залози, сечового міхура, ендометрія, молочної залози, печінки (зокрема, холангіокарцинома), передміхурової залози або шкіри.
Крім того винахід стосується способу контролю ефективності терапії злоякісної пухлини, що несе СЕАСАМУЬ, іп міїго або ех мімо, який включає стадії:
Зо (а) приведення біологічного зразка індивідуума, який проходить терапію злоякісної пухлини, що несе СЕАСАМ»5, у контакт з антитілом за винаходом, зокрема, в умовах, придатних для формування комплексів антитіла з зазначеним біологічним зразком; (Б) вимірювання рівня антитіла, зв'язаного з зазначеним біологічним зразком; (с) порівняння виміряного рівня зв'язаного антитіла з рівнем антитіла, зв'язаного з контролем; де знижений рівень антитіла, зв'язаного з зазначеним біологічним зразком, у порівнянні з контролем є показником ефективності зазначеної терапії злоякісної пухлини, що несе
СЕАСАМ5.
У зазначеному способі підвищений рівень антитіла, зв'язаного з зазначеним біологічним зразком, у порівнянні з контролем є показником неефективності зазначеної терапії злоякісної пухлини, що несе СЕАСАМ5.
В одному з варіантів здійснення зазначений контроль являє собою біологічний зразок того ж типу, що і біологічний зразок, який піддається аналізу, але який одержували у індивідуума раніше, у ході терапії злоякісної пухлини, що несе СЕАСАМ5.
Крім того винахід стосується способу детекції рецидиву злоякісної пухлини після терапії злоякісної пухлини, що несе СЕАСАМУЬ, іп міїго або ех мімо, який включає стадії: (а) приведення біологічного зразка, одержаного у індивідуума, який пройшов терапію злоякісної пухлини, що несе СЕАСАМУЬ, у контакт з антитілом за винаходом, зокрема, в умовах, придатних для формування комплексів антитіла з зазначеним біологічним зразком; (5) вимірювання рівня антитіла, зв'язаного з зазначеним біологічним зразком; (с) порівняння виміряного рівня зв'язаного антитіла з рівнем антитіла, зв'язаного з контролем; де підвищений рівень антитіла, зв'язаного з зазначеним біологічним зразком, у порівнянні з контролем є показником рецидиву злоякісної пухлини після терапії злоякісної пухлини, що несе
СЕАСАМ5.
Зокрема, зазначений контроль являє собою біологічний зразок того ж типу, що і біологічний зразок, який піддається аналізу, але який одержували у індивідуума раніше, при проходженні або після завершення терапії злоякісної пухлини, що несе СЕАСАМ5.
Зокрема, зазначена терапія злоякісної пухлини, що несе СЕАСАМУ»5, являє собою терапію з бо використанням антитіла або імунокон'югата за винаходом. Зазначена терапія злоякісної пухлини, що несе СЕАСАМ5, спрямована на злоякісну пухлину, експресуючу СЕАСАМФ5, зокрема колоректальний рак, рак шлунка, легень, шийки матки, підшлункової залози, стравоходу, яєчника, щитовидної залози, сечового міхура, ендометрія, молочної залози, печінки (зокрема, холангіокарциному), передміхурової залози або шкіри.
В одному з варіантів здійснення антитіла за винаходом можна мітити детектованою молекулою або речовиною, такою як флуоресцентна молекула, радіоактивна молекула або будь-яка інша з міток, відомих тим, що вони забезпечують (безпосередньо або опосередковано) сигнал.
Як використовують у даному описі, термін "мічений", відносно антитіла за винаходом, призначений для включення антитіл, мічених безпосередньо за допомогою зв'язування (тобто фізичного зв'язування) детектованої речовини, такої як радіоактивний засіб або флуорофор (наприклад, флуоресцеїнізотіоціанат (БІТС) або фікоеритрин (РЕ), або індоціанін (Суб5)) з поліпептидом, а також опосередкованого мічення поліпептиду шляхом взаємодії з детектованою речовиною.
Антитіло за винаходом можна мітити радіоактивною молекулою будь-яким відомим в даній галузі способом. Наприклад, радіоактивні молекули містять, але не обмежуючись ними, радіоактивні атоми для сцинтиграфічних досліджень, такі як 1729, 1124, |п!", Ве"86, Ве"88. Теб9,
Також поліпептиди за винаходом можна мітити спіновою міткою для томографії за допомогою ядерного магнітного резонансу (ЯМР) (також відомої як магнітно-резонансна томографія, МРТ), такою як йод-123, індій-111, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, марганець або залізо. "Біологічний зразок" включає ряд видів зразків, одержаних у індивідуума, і їх можна використовувати в діагностичному або контролюючому аналізах. Біологічні зразки включають, але не обмежуючись ними, кров і інші рідкі зразки біологічного походження, тверді зразки тканин, такі як зразок біопсії або тканинні культури, або клітини, одержувані з нього і їх потомства. Таким чином, біологічні зразки включають клінічні зразки, клітини в культурі, супернатанти клітин, лізати клітин, сироватку, плазму, біологічну рідину і зразки тканин, зокрема зразки пухлин.
В одному з варіантів здійснення біологічний зразок може являти собою зразок тканини,
Зо фіксований у формаліні і занурений у парафін (БЕРЕ). Фактично, антитіла за винаходом переважно можна використовувати для ЕЕРЕ-тканин, що є форматом, використовуваним у більшості лікарень для збирання й архівування зразків тканин.
Винахід також стосується способу детекції присутності злоякісної пухлини у індивідуума іп мімо, який включає стадії: а) введення пацієнту антитіла за винаходом, міченого детектованою міткою;
Б) детекції локалізації зазначеного міченого детектованою міткою антитіла у пацієнта за допомогою томографії.
Антитіла за винаходом можуть бути придатні для визначення стадії злоякісної пухлини (наприклад, радіотомографії). їх можна використовувати окремо або в комбінації з іншими маркерами злоякісних пухлин.
Як використовують у даному описі, терміни "детекція" або "детектований" включають якісну і/або кількісну детекцію (вимірювання рівнів) з порівнянням або без порівняння з контролем.
У контексті винаходу, як використовують у даному описі, термін "діагностика" означає визначення характеру медичного стану, спрямоване на ідентифікацію патології, що уражує індивідуума, на основі обсягу зібраних даних.
У зазначеному способі злоякісна пухлина являє собою злоякісну пухлину, експресуючу
СЕАСАМУ»5, зокрема колоректальний рак, рак шлунка, легень, шийки матки, підшлункової залози, стравоходу, яєчника, щитовидної залози, сечового міхура, ендометрія, молочної залози, печінки (зокрема, холангіокарциному), передміхурової залози або шкіри.
Набори
Нарешті, винахід також стосується наборів, що містять щонайменше одне антитіло або один імунокон'югат за винаходом. Набори, що містять антитіла за винаходом, знаходять застосування в детекції поверхневого білюа СЕАСАМ5 або в терапевтичних або діагностичних аналізах. Набори за винаходом можуть містити поліпептид або антитіло, зв'язані з твердою підкладкою, наприклад планшетом для культивування тканин або гранулами (наприклад, сефарозними гранулами). Можна надавати набори, що містять антитіла для детекції і кількісного визначення поверхневого білка СЕАСАМ5 іп міїго, наприклад, у ЕГІЗА або вестерн- блотингу. Таке антитіло, придатне для детекції можна надавати з міткою, такою як флуоресцентна або радіоактивна мітка. 60 Короткий опис послідовностей
ЗЕО ІЮ МО:1-4 і б демонструють послідовності СОК1-Н, СОН2-Н, СОВЗ-Н, СОВІ1-І ії СОКЗ-І. з так називаного антитіла "МАБ1".
ЗЕО ІЮО МО:5 демонструє варіант послідовності МН, УНтТа, гуманізованого антитіла МАбБ2.
ЗЕО ІЮО МО:7-10 ї 12 демонструють послідовності СОМК1-Н, СОНВ2-Н, СОВЗ-Н, СОНВІ1-Ї і
СОНВЗ-Ї з так називаного антитіла "МАБ2".
ЗБЕО ІЮ МО:11 демонструє послідовність СЕАСАМІ людини, як доступно в СепВапк
МР 001703.2.
ЗЕО ІЮ МО:13-16 і 18 демонструють послідовності СОК1-Н, СОВ2-Н, СОВЗ-Н, СОНІ1-Ї і
СОНВЗ-Ї з так називаного антитіла "МАБЗ".
ЗЕО ІОЮО МО:17 демонструє варіант послідовності МІ, МІ1, гуманізованого антитіла МАбБ2.
ЗЕО ІЮ МО:19-22 і 24 демонструють послідовності СОК1-Н, СОВ2-Н, СОВЗ-Н, СОНІ1-Ї і
СОНВЗ-Ї з так називаного антитіла "МАБА".
ЗЕО ІЮ МО:23 демонструє варіант послідовності МІ, МІ Та, гуманізованого антитіла МАБ2.
ЗЕО І МО:25-28 і 30 демонструють послідовності СОК1-Н, СОВ2-Н, СОВЗ-Н, СОНІ1-Ї. і
СОНВЗ-Ї з так називаного антитіла "МАБ5Б".
ЗЕО ІО МО:29 демонструє варіант послідовності МІ, МІ 1с, гуманізованого антитіла МАбБ2.
ЗЕО ІЮО МО:31 демонструє послідовність МН антитіла "МАБ1".
ЗЕО ІОЮО МО:32 демонструє послідовність МІ. антитіла "МАБ1".
ЗЕО ІЮ МО:33 демонструє послідовність МН антитіла "МАбБ2".
ЗЕО ІЮ МО:34 демонструє послідовність МІ. антитіла "МАБ2".
ЗЕО ІЮ МО:35 демонструє послідовність МН антитіла "МАБЗ".
ЗЕО ІЮ МО:36 демонструє послідовність МІ. антитіла "МАБЗ".
ЗЕО ІЮ МО:37 демонструє послідовність МН антитіла "МАбБА".
ЗЕО ІЮ МО:38 демонструє послідовність МІ. антитіла "МАбБА".
ЗЕО ІЮ МО:39 демонструє послідовність МН антитіла "МАБ5".
ЗЕО ІЮ МО:40 демонструє послідовність МІ. антитіла "МАБ5".
ЗЕО ІЮО МО:41 демонструє послідовність важкого ланцюга антитіла СПМАБІ.
ЗЕО ІЮ МО:42 демонструє послідовність легкого ланцюга антитіла СПМАБІ1.
ЗЕО ІЮ МО:43 демонструє послідовність важкого ланцюга антитіла СПМАбБ2.
Зо ЗЕО ІЮ МО:44 демонструє послідовність легкого ланцюга антитіла СИМАбБ2.
ЗЕО ІЮ МО:45 демонструє послідовність важкого ланцюга антитіла СПМАбБЗ.
ЗЕО ІЮ МО:46 демонструє послідовність легкого ланцюга антитіла СПМАбБЗ.
ЗЕО ІЮ МО:47 демонструє послідовність важкого ланцюга антитіла СПМАБаА.
ЗЕО ІЮ МО:48 демонструє послідовність легкого ланцюга антитіла СИМАбБаА.
ЗЕО ІЮ МО:49 демонструє послідовність важкого ланцюга антитіла СПМАбБ»5.
ЗЕО ІЮ МО:50 демонструє послідовність легкого ланцюга антитіла СИМАбБ5.
ЗЕО ІЮО МО:51 демонструє варіант послідовності УН, УНІ, гуманізованого антитіла МАбБ2.
ЗЕО ІЮ МО:52 демонструє послідовність повнорозмірного СЕАСАМ5 людини, як доступно в базі даних СепВапкК під номером доступу ААА51967.1.
ЗБО ІЮ МО:53 демонструє послідовність позаклітинного домену СЕАСАМ5 Масаса
Тазсісціагів.
ЗЕО ІЮ МО:54 демонструє послідовність легкого ланцюга химерного антитіла (одержаного з антитіла "МАБ2"), що містить мутацію з К52 у К52.
ЗЕО ІЮ МО:55 демонструє варіант послідовності МІ, МІ 1йа, гуманізованого антитіла МАБ2.
ЗЕО ІЮ МО:56 демонструє послідовність позаклітинного домену ПСЕАСАМІ (положення 35- 428 повнорозмірного ПСЕАСАМІ (МР 001703.2) з наступною додатковою ділянкою з 24 амінокислот, що містить Нів-мітку).
ЗБЕО ІЮО МО:57 демонструє послідовність позаклітинного домену ССЕАСАМІ з наступною додатковою ділянкою з 24 амінокислот, що містить Нівб-мітку.
ЗЕО ІЮ МО:58 демонструє послідовність позаклітинного домену ПСЕАСАМ5 (положення 35- 685 повнорозмірного ПСЕАСАМ5 (ААА5бІ1967.1) з наступною додатковою ділянкою з 24 амінокислот, що містить Нів-мітку).
ЗБЕО І МО:59 демонструє послідовність позаклітинного домену ССЕАСАМ5 з наступною додатковою ділянкою з 24 амінокислот, що містить Нів-мітку.
ЗЕО ІЮ МО:60 демонструє послідовність позаклітинного домену ПСЕАСАМ6б (положення 35- 327 повнорозмірного ПСЕАСАМб (МР 002474.3) з наступною додатковою ділянкою з 24 амінокислот, що містить Нів-мітку).
ЗБЕО ІЮО МО:61 демонструє послідовність позаклітинного домену ССЕАСАМб з наступною додатковою ділянкою з 24 амінокислот, що містить Нівб-мітку.
ЗЕО ІЮ МО:62 демонструє послідовність позаклітинного домену ПСЕАСАМВ8 (положення 35- 332 повнорозмірного ПСЕАСАМ8 (МР 001807.2) з наступною додатковою ділянкою з 24 амінокислот, що містить Нів-мітку).
ЗБЕО І МО:63 демонструє послідовність позаклітинного домену ССЕАСАМВ8 з наступною додатковою ділянкою з 24 амінокислот, що містить Нівб-мітку.
ЗЕО ІЮ МО:64 демонструє послідовність позаклітинного домену ПСЕАСАМ?7 (положення 36- 248 повнорозмірного ПСЕАСАМ7 (МР 008821.1) з наступною додатковою ділянкою з 24 амінокислот, що містить Нів-мітку).
ЗБЕО ІО МО65 демонструє послідовність М-А1І-В81 ПСЕАСАМ5 (положення 35-320 повнорозмірного ПСЕАСАМ5 (ААА5Б1967.1.)) з наступною Нів-міткою з 6 амінокислот.
ЗБО 10 МО:6б демонструє послідовність А2-82 РПСЕАСАМ5 (положення 321-498 повнорозмірного ПСЕАСАМ5 (ААА51967.1.)) з наступною Нів-міткою з 6 амінокислот.
ЗБО 10 МО:67 демонструє послідовність АЗ-В3 РПСЕАСАМ5 (положення 499-685 повнорозмірного ПСЕАСАМ5 (ААА51967.1.)) з наступною Нів-міткою з 6 амінокислот.
ЗБЕО ІЮ МО:68 демонструє послідовність М-А1-В1 сСЕАСАМ5 з наступною додатковою ділянкою з 24 амінокислот, що містить Нів-мітку.
ЗБЕО І МО:69 демонструє послідовність А2-В2 сСЕАСАМ5О з наступною додатковою ділянкою з 24 амінокислот, що містить Нів-мітку.
ЗБЕО ІЮ МО:70 демонструє послідовність АЗ-ВЗ3 сССЕАСАМ5 з наступною додатковою ділянкою з 24 амінокислот, що містить Нів-мітку.
ЗБЕО І МО:71 демонструє послідовність повнорозмірного білла СЕАСАМб людини, як доступно в зепВапк МР 002474.3.
ЗБЕО І МО:72 демонструє послідовність повнорозмірного білла СЕАСАМ7 людини, як доступно в зепВапк МР 008821.1.
ЗЕБЕО ІЮ МО:73 демонструє послідовність повнорозмірного білю«а СЕАСАМ8 людини як доступно в зЗепВапк МР 001807.2.
ЗЕО ІЮ МО:74 демонструє послідовність УН варіанта гуманізованого МАВ2 МІ д5МНаог.
ЗЕО ІЮ МО:75 демонструє послідовність МІ. варіанта гуманізованого МАБ2 МІ д5МНаг.
ЗБЕО І МО:76 демонструє послідовність амінокислот у положеннях 109-115 АЗ-ВЗ3
Ко) СЕАСАМ5 людини.
ЗБЕО ІЮ МО:77 демонструє послідовність амінокислот у положеннях 131-143 АЗ-ВЗ3
СЕАСАМ5 людини.
ЗБО 10 МО:78 демонструє консенсусну послідовність СОК1-Н сімейства антитіл
МАБ2/МАБА/МАБ5 на основі порівнянь послідовностей.
ЗБО ОО МО:79 демонструє консенсусну послідовність СОК2-Н сімейства антитіл
МАБ2/МАБА/МАБ5 на основі порівнянь послідовностей.
ЗБО 10 МО:80 демонструє консенсусну послідовність СОКЗ-Н сімейства антитіл
МАБ2/МАБА/МАБ5 на основі порівнянь послідовностей.
ЗБО ОО МО:81 демонструє консенсусну послідовність СОК1-Н сімейства антитіл
МАБІ/МАБВЗ.
ЗБО 10 МО:82 демонструє консенсусну послідовність СОК2-Н сімейства антитіл
МАБІ/МАБВЗ.
ЗБО ОО МО:х83 демонструє консенсусну послідовність СОК1-Н сімейства антитіл
МАБ2/МАБ4/МАВр5О она основі залишків, ідентифікованих як нейтральні при зв'язуванні позаклітинних доменів СЕАСАМ5 людини і Масаса Тазсісціагів.
ЗБО 10 МО:84 демонструє консенсусну послідовність СОКЗ-Н сімейства антитіл
МАБ2/МАБ4/МАБ5О она основі залишків, ідентифікованих як нейтральні при зв'язуванні позаклітинних доменів СЕАСАМ5 людини і Масаса Тазтсісціагів.
ЗБО 10 МО:85 демонструє консенсусну послідовність СОМК1-| сімейства антитіл
МАБр2/МАр4/МАрО она основі залишків, ідентифікованих як нейтральні при зв'язуванні позаклітинних доменів СЕАСАМ5 людини і Масаса їазсісціагів.
ЗБО 10 МО:86 демонструє консенсусну послідовність СОМКЗ-ІЇ сімейства антитіл
МАБ2/МАБ4/МАБ5О она основі залишків, ідентифікованих як нейтральні при зв'язуванні позаклітинних доменів СЕАСАМ5 людини і Масаса Тазтсісціагів.
ЗБО ІЮ МО:87 демонструє послідовність важкого ланцюга пимМАБб2-3 (МАБ2 МіІлсУНта-
ІЯС1).
ЗЕО ІО МО:88 демонструє послідовність легкого ланцюга ПИМАБ2г-3 (МАВ2 МІ леМУНта-Ідат).
ЗЕО ІО МО:89 демонструє послідовність важкого ланцюга пПиМАБ2-4 (МАБ2 МІта мн1-1ідат1).
ЗЕО ІО МО:90 демонструє послідовність легкого ланцюга пиМАБ2-4 (МАВ2 МІ ламн1-їідат1). бо Опис креслень
Фіг. 1. Оцінка селективності антитіл до СЕАСАМ5.
Фіг. 2. Картування доменів антитілдо СЕАСАМ5 на СЕАСАМ5 людини.
Фіг. 3. Картування доменів антитілдо СЕАСАМ5 на СЕАСАМ5 яванського макака.
Фіг. 4. Оцінка протипухлинної активності кон'югатів СИМАБ4А-5РОВ-ОМА4, сиМАБІ-5РОВ-ОМА,
СИМАБ5-5РОВ-ОМ4 ії спмМАБбБ2-5РОВ-ОМА4 проти первинної аденокарциноми товстої кишки людини СВ-ІСН-0З4Р у самок мишей 5СІЮ.
Фіг. 5. Оцінка протипухлинної активності кон'югатів ПиИМАБр2-3-5РОВ-ОМ4, пиМАр2-4-5РОЮВ- рма4 і спимМАбБ2-5РОВ-ОМА проти первинної аденокарциноми товстої кишки людини СВ-ІСВ-034Р у самок мишей 5СІЮ.
Фіг. 6. Оцінка протипухлинної активності кон'югата пиИМАр2г-3-5РОВ-ОМА проти первинної аденокарциноми шлунка людини ЗТО-ІМО-006 у самок мишей СІЮ.
Фіг. 7. Вирівнювання послідовностей областей МН і Мі антитіл МАБ1, МАБ2, МАБЗ, МАБА і
МАБ5.
Фіг. 8. Аналіз НЕМ5 кон'югата СИМАБІ1-5РОВ-ОМА.
Фіг. 9. Аналіз НЕМ5 кон'югата СИМАБ2-5РОВ-ОМА.
Фіг. 10. Аналіз НКМ5 кон'югата СИМАБ4-5РОВ-ОМА.
Фіг. 11. Аналіз НКМ5 кон'югата СИМАВБ5-5РОВ-ОМА.
Фіг. 12. Аналіз НКМ5 кон'югата пПиМмМАр2-2-5РОВ-ОМА.
Фіг. 13. Аналіз НКМ5 кон'югата пимМАБ2-1-5208-ОМА.
Фіг. 14. Аналіз НКМ5 кон'югата пПиМмМАр2-3-5РОВ-ОМА.
Фіг. 15. Аналіз НКМ5 кон'югата пПИимМАБб2г-4-5РОВ-ОМА.
Фіг. 16. Активність зв'язування гуманізованих варіантів МАБ2 з позаклітинним доменом
СЕАСАМ?5 людини і мавпи.
Фіг. 17. Стабільність зв'язування гуманізованих варіантів МАБ2 з позаклітинним доменом
СЕАСАМХ5 людини і мавпи.
Фіг. 18. Оцінка протипухлинної активності кон'югата пПиМАБ2-3-5РОВ-ОМА проти первинної аденокарциноми легень людини ГШМ-МІС-0014 у самок мишей СІЮ.
Фіг. 19. Оцінка протипухлинної активності кон'югатів пиМАБ2-3-5РОВ-ОМА4 і пиМАБ2-3- сульфо-5РОВ-ЮОМ4 проти первинної аденокарциноми товстої кишки людини СЕК-І2НА-034Р. у
Зо самок голих мишей СО1.
Фіг. 20. Аналіз НКМ5 пПимМАБ2-3-сульфо-5РОВ-ЮОМА.
Фіг. 21. Аналіз НКЕМ5 пимМмАБ2-3-5МОС-ОМІ1.
Фіг. 22. Вирівнювання варіабельних доменів важкого ланцюга МАБ2, МАБбБ4, МАБ5, гуманізованого УНтТа, гуманізованого УНІ і гуманізованого МНаг.
Фіг. 23. Вирівнювання варіабельних доменів легкого ланцюга МАБ2, МАБ4, МАБ5, гуманізованого МІ 1, гуманізованого Міла, гуманізованого Міс, гуманізованого Ма і гуманізованого МІ д5.
ПРИКЛАДИ
Даний винахід далі проілюстрований прикладами, що наводяться нижче, які не слід витлумачувати як додаткове обмеження.
Зміст списку послідовностей, фігур і всіх посилань, патентів і опублікованих патентних заявок, цитованих на всьому протязі даного опису, у явній формі повністю включений в даний опис за допомогою посилання.
Приклад 1. Одержання рекомбінантних позаклітинних доменів білків СЕАСАМ
У цьому прикладі за допомогою транзиторної експресії в клітинах ембріональної нирки людини НЕК293 з використанням плазмід, що забезпечують експресію відповідних кКДНК, як наведено в таблиці 1, одержували позаклітинні домени білка (ЕСО), одержані з СЕАСАМ людини (й) або яванського макака (с).
Кожну експресуючу плазміду поміщали в комплекс з 293Гесіп'"Мм (ІШе Тесппоїодіє5) і додавали в культивовані в суспензії клітини 293-Е (одержані з клітин НЕК293). Через вісім діб після трансфекції супернатанти культур збирали, і відповідний розчинний білок очищали за допомогою ІМАС (СЕ Неайвсаге) з одержанням партії білка (див. таблицю 1).
Таблиця 1
Опис рекомбінантних позаклітинних доменів білків СЕАСАМ послідовності
ПСЕАСАМІ |ЕСО СЕАСАМІ людини (35-428 МР 001703.2 ЗЕО ІЮ МО:56 оСЕАСАМ!. |ЕСО СЕАСАМІ Мавсісціатів (35-428) кгонований Для Внутрішніх! ЗО О МО 57
ПСЕАСАМ5 |ЕСО СЕАСАМ5 людини (35-685 АААБ51967.1 ЗЕО ІЮ МО:58
СсСЕАСАМ5 |ЕСО СЕАСАМ5 М азсісціагів (85-ввв) клонований для внутрішніх. ЗЕО І МО:59
НСЕАСАМб |ЕСО СЕАСАМ6б людини (35-327 МР 0024743 ЗЕО ІЮ МО:60
ССЕАСАМб |ЕСО СЕАСАМБб М азсісиціагів (85-з2т) м іонований для внутрішніх. ЗЕО ІЮ МО:61
ПСЕАСАМВ8 |ЕСО СЕАСАМВ8 людини (35-332 МР 0018072 ЗЕО І МО:62
СсСЕАСАМВ8 |ЕСО СЕАСАМВ М авзсісшагів (85-382) понований для внутрішніх. ЗЕО І МО:63
ПСЕАСАМ7 |ЕСО СЕАСАМ?7 людини (36-248 МР 008821.1 ЗЕО ІЮ МО:64 нию"нШнцнТНИІНнИнниннннн шин
НСЕАСАМ5 | Домен М-А1-В81 СЕАСАМ5 людини ,
МАВ 35-320 ААдА51967.1 ЗЕО І МО:65
ПСЕАСАМ5 |Домен А2-82 СЕАСАМ5 людини о дов? 324-498 ААдА51967.1 ЗЕО І МО:66
ПСЕАСАМ5 |Домен АЗ-ВЗ3 СЕАСАМ5 людини о
АЗВЗ 499-685 ААдА51967.1 ЗЕО ІЮ МО:67
СсСЕАСАМ5 | Домен М-А1-В1 СЕАСАМ5 клонований для внутрішніх ,
МАТВІ М.газсісціагів (35-320 цілей ЗО о МО 68 ниююши?)и дини
СсСЕАСАМ5 |Домен А2-В82 СЕАСАМЬ5 М. азсісціагів | клонований для внутрішніх о дово 321-498 цілей ЗО р МО 69
СсСЕАСАМ5 |Домен АЗ-ВЗ3 СЕАСАМЬ5 М азсісціагі5| клонований для внутрішніх о
АЗВЗ 499-688 цілей ЗБО о МО:7о
Приклад 2. Одержання моноклональних антитіл миші до СЕАСАМ5
У цьому прикладі одержували моноклональні антитіла після імунізації мишей по протоколу, що приводить до одержання тАб до СЕАСАМ5.
Приклад 2.1. Імунізація й одержання гібридом
Імунізацію, злиття і скринінг проводили з використанням мієломних клітин РЗХ6З3-А98.653 з позаклітинним доменом СЕАСАМ5 людини, позаклітинним доменом СЕАСАМ5 яванського макака або з пухлинними клітинами ШМС11 людини, як описано в М/еппегрегу А.Е. еї аї. 1993.
Ат. У). Раїної., 143(4), 1050-1054; і КіраїнісК еї а. 1997. Нургідота 16:381389.
З використанням способу КІММ5, як описано в КіїраїгіскК еї аї. (1997, Нубгідота, 16:381389), у кожної самки мишей ВА! В/с у віці 6-8 тижнів (5082342; Спапе5. Кімег. Гарз., Ваг Нагрог, МЕ) проводили чотири цикли імунізації протягом 14 діб з інтервалами 3-4 доби. Антигени, емульговані в ад'юванті Тіептах (ТіегМах сої Адіимапі; Зідта 22684), підшкірно вводили в шість ділянок, проксимально дренуючих лімфовузлів, вздовж спини миші й у шість розташованих поруч ділянок вздовж черевця. Через чотири доби після останньої ін'єкції мишей умертвляли. Асептично виділяли двосторонні підколінні, поверхневі пахові, пахвові і бронхіальні лімфовузли і промивали свіжим середовищем КРМІ.
З використанням класичного способу, як описано в М/еппегрегу А.Е. еї аї. (1993, Ат. 5.
Раїпої., 143(4), 1050-1054), кожній самці мишей ВАГ В/с у віці 6-8 тижнів (5082342; Спагіє5. Кімег.
Іарв., Ваг Наїбог, МЕ) проводили три цикли імунізації протягом 41 доби. Антигени вводили інтраперитонеально в черевну ділянку миші. Через три доби після останньої ін'єкції мишей умертвляли й асептично виділяли селезінку і промивали свіжим середовищем КРМІ.
З лімфовузлів або із селезінки виділяли лімфоцити і суспензію одиночних клітин двічі відмивали середовищем КРМІ з наступним злиттям з мієломними клітинами РЗХб63-АС8.653 з використанням поліетиленгліколю. Після злиття, суміш клітин інкубували в інкубаторі при 37 "С протягом 16-24 годин. Одержаний препарат клітин переносили в селективне напівтверде середовище й асептично вносили в 100-мм чашки Петрі і інкубували при 37 "С. Через десять діб після початку відбору, чашки перевіряли на ріст гібридом і видимі колонії наколювали і поміщали в 96-ямкові планшети, що містять по 200 мкл середовища для вирощування. 96- ямкові планшети витримували в інкубаторі при 37 "С протягом 2-4 діб.
Приклад 2.2. Скринінг і характеристика іп міго антитіл мишей до СЕАСАМ5
Первинний скринінг на продукцію Їдсї до СЕАСАМ5 проводили за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА) з використанням як захоплюючого антигену білла СЕАСАМ5 людини (одержаного, як описано в прикладі 1) і за допомогою ЕАС5 з використанням декількох ліній пухлинних клітин людини (Н4б6О, МКМ4А5, 51463, 5КМЕЇ 28 ії ОМС111). Для аналізу ЕГІЗА планшети покривали білом СЕАСАМ5 людини при 0,25 мкг/ямку в РВЗ і в планшет додавали 100 мкл антитіл до СЕАСАМ5/ямку. Планшет інкубували при 37 "С протягом 1 години і п'ять разів промивали РВ5, що містить 0,05 95 Туееп-20 (РВ5-Т). Потім у кожну ямку додавали 100 мкл антитіл кролика до Ід: миші, кон'югованих з пероксидазою хрону (бЗідта; ЖА9О44) у розведенні 1:50000. Після інкубації при 37 "С протягом 1 години в темряві, планшети п'ять разів відмивали РВ5-Т. Зв'язування антитіл візуалізували, додаючи буфер ТМВ-НегО:» і зчитуючи при довжині хвилі 450 нм. Для аналізу ЕАС5 пухлинні клітини людини при 40000 клітин/ямку вносили в 96-ямковий планшет Нідп Віпа (М5О І 15Х8-3) і протягом 45 хв. при 4 "С додавали 100 мкл/ямку антитіл до СЕАСАМ5 і три рази промивали РВЗ з 1 95 ВБ5А. Протягом 45 хв. при 4 "С додавали 100 мкл/ямку антитіл кози до ЇдДСї миші, кон'югованих з АіІехаб47 (Іпийгодеп; ж
А2135) і три рази промивали РВ5 з 1 95 ВБА. Зв'язування антитіл оцінювали після центрифугування і ресуспендування клітин, додаючи 200 мкл/ямку РВЗ з 1 95 В5А і зчитуючи з використання системи проточної цитометрії сцуамафт еазуСуїе м 8НТ.
Для оцінки специфічності до СЕАСАМ5 антитіл до СЕАСАМ5 96-ямкові планшети покривали рекомбінантними біллами СЕАСАМІ, СЕАСАМб, СЕАСАМ?7 і СЕАСАМВ8 людини (одержаними, як описано в прикладі 1) з використанням тих же умов покриття, як описано вище. У планшети додавали антитіла до СЕАСАМ5 і детектували з використанням антитіл кролика до Їдсї миші, кон'югованих з пероксидазою хрону (Зідта; ЖА9УО44). Зв'язування антитіл візуалізували, додаючи буфер ТМВ-НгО:» і зчитуючи при довжині хвилі 450 нм. Результати, представлені на фіг. 1, демонструють, що антитіла до СЕАСАМ5 селективні для СЕАСАМ5 людини відносно
Зо СЕАСАМІ, СЕАСАМб, СЕАСАМ?7 і СЕАСАМВ8 людини.
Приклад 2.3. Характеристика зв'язування тАБ
Уявну афінність антитіл до СЕАСАМ5 відносно НСЕАСАМ5, експресованого на поверхні пухлинних клітин МКМ45 людини (05М2, АСС 409), визначали за допомогою системи проточної цитометрії зцамат еазуСуе "м 8НТ. Пухлинні клітини МКМ45 при 40000 клітини/ямку вносили в 9б-ямковий планшет Нідп Віпа (М5О І 15Х8-3), і протягом 45 хв. при 4 "С додавали 100 мкл антитіл до СЕАСАМ5/ямку в 2-кратних серійних розведеннях, починаючи з 20 мкг/мл до 12 розведень у розріджувачі для аналізу і три рази промивали РВЗ5 з 1 95 ВЗА. Протягом 45 хв. при 4 "С додавали 100 мкл/ямку антитіл кози до ЇдСї миші, кон'югованих з АіІехаб47 (Іпийгодеп; ж
А2135), і три рази промивали РВ5 з 1 95 ВБА. Зв'язування антитіл оцінювали після центрифугування і ресуспендування клітин, додаючи 200 мкл/ямку РВЗ з 1 9о ВБА і зчитуючи з використанням системи проточної цитометрії (зцама?Ф еазуСуїе"м 8НТ. Значення уявної Ко і
ЕСво визначали з використанням програмного забезпечення. ВІОБТОФТ-ВІМОЇ!МОа і ВІОЗТОТ-
ЗРЕБЕб, відповідно.
Таблиця 2
Значення ЕСво, одержані для клітин МКМ4А5
Картування доменів антитіл до СЕАСАМ5 відносно білків СЕАСАМ5 людини і СЕАСАМ5 яванського макака визначали за допомогою ЕГІБА. 96б-ямкові планшети покривали рекомбінантними доменами АТ (143-237), А1-В1 (143-320), А2-82 (321-498) і АЗ-ВЗ (499-685) білка СЕАСАМ5 людини (одержаними, як описано в прикладі 1) і рекомбінантними доменами М-
А1-8В1 (1-320), А1-В1 (143-320), А2-В2 (321-498) і АЗ-ВЗ (499-688) білла СЕАСАМ5 яванського макака (одержаними, як описано в прикладі 1) з використанням тих же умов покриття, як описано вище. У планшети додавали очищені антитіла і детектували з використанням антитіл кролика до да миші, кон'югованих з пероксидазою хрону (Зідта; ЖА9044). Зв'язування антитіл візуалізували, додаючи буфер ТМВ-НгОг» і зчитуючи при довжині хвилі 450 нм. Результати представлені на фіг. 2 і З і демонструють, що антитіла до СЕАСАМ5 зв'язуються з доменом АЗ-
ВЗ білків СЕАСАМ5 людини і яванського макака.
Ізотипи окремих тАБб визначали з використанням набору ізотипування ІДС миші відповідно до інструкцій виробника (ЗЕКОТЕС посилання ММТ1). П'ять специфічних до СЕАСАМ5 тА являли собою да, ізотипу К.
Приклад 3. Характеристика антитіл мишей до СЕАСАМ5
Приклад 3.1. Характеристика антитіл мишей до СЕАСАМ5 іп міїго
Гібридому миші, експресуючу специфічні до СЕАСАМ5 АБ, одержували в колбі Т500, і кондиціоновані середовища збирали через 7 діб росту. Специфічні до СЕАСАМ5 АБ очищали, пропускаючи кондиціоновані середовища через колонку з білком б, промивали і елюювали 100
ММ буфером гліцин/НСІ з рН-2,7 буфер. Елюат піддавали діалізу проти РВ5 з наступною стерилізацією фільтруванням і зберігали при 4 "С.
Усі специфічні до СЕАСАМ5 тАБр за допомогою ЕЇІ5А оцінювали на їх здатність зв'язуватися з біллами СЕАСАМ5 людини і приматів. Планшети покривали білами СЕАСАМ5 людини або приматів, у планшет додавали тАб до НСЕАСАМ5 і детектували з використанням антитіл кролика до ІдСї миші, кон'югованих з пероксидазою хрону (Зідта; ЖА9044). Зв'язування антитіл візуалізували, додаючи буфер ТМВ-НеО» і зчитуючи при довжині хвилі 450 нм.
Таблиця З
Значення ЕсСбво, що відповідають зв'язувальній здатності специфічних до СЕАСАМ5 тАб відносно білка СЕАСАМ5 приматів (Відношення приматлюдинаї | 22 | 05 | 10 | 06 | 1
Приклад 3.2. Уявна афінність і зв'язувальна здатність антитіл до СЕАСАМ5 відносно клітин первинної пухлини товстої кишки людини на пізніх стадіях СК-І2НА-034Р при проточній цитометрії
Первинну пухлину товстої кишки людини на пізніх стадіях СЕ-ІСВ-0ОЗ4АР (диїїеп еї аї., Сіїй.
Сапсег. Вевз. Осіорег 1, 2012, 18(19):5314-5328) одержували з одержаного у пацієнта ксенотрансплантата у мишей. Пухлину СЕ-І2Н-034Р ферментативно дисоціювали з використанням колагенази типу ІМ (Іпмігодеп; Ж17104-019) і дезоксирибонуклеази І (Іпмігодеп; я18047-019) протягом 1 години при 4 "С. Життєздатність клітин визначали за допомогою застосування Міасошпі з використанням системи проточної цитометрії бцамаф еазуСуге м 8НТ.
Для розрахунку уявної афінності пухлинні клітини СЕ-І2А-034Р при 40000 клітин/'ямку наносили на 96-ямковий планшет Нідп Віпа (М50 І 15Х8-3) і додавали 100 мкл антитіл до СЕАСАМ5/ямку в 2-кратних серійних розведеннях, починаючи з 20 мкг/мл до 12 розведень у розріджувачі для аналізу протягом 45 хв. при 4 "С і три рази промивали РВЗ з 1 95 ВБА. Протягом 45 хв. при 47С додавали 100 мкл/ямку антитіл кози до Ідсї миші, кон'югованих з Аіехаб47 (Іпмігодеп; Ж А2135), або антитіл кози до (ДС людини, кон'югованих з АІеха488 (Іпийгодеп; Ж А11013), ії три рази промивали РВ5 з 1 95 В5БА. Зв'язування антитіл оцінювали після центрифугування і ресуспендування клітин, додаючи 200 мкл/ямку РВ5 з 1 95 В5А і зчитуючи з використанням системи проточної цитометрії Сцамат еазуСуге"м 8НТ. Значення уявної Ко і ЕСз5о визначали з використанням програмного забезпечення ВІОЗТ(ФТ-ВІМОЇМО і ВІО5ТФТ-5РЕЕбБ, відповідно.
Зв'язувальну здатність антитіл до СЕАСАМ5 визначали з використанням набору калібрувального стандарту для ІдСь миші (Віосуїех Ж7208) або набору калібрувального стандарту для ІДС людини (Віосуїех ЯСРО10) по інструкціях виробника.
Таблиця 4
Значення Кб і ЕСво, одержані на клітинах первинної пухлини товстої кишки людини на пізніх стадіях СЕ-ІСВ-034Р
Приклад 3.3. Активність інтерналізації специфічних до СЕАСАМ5 антитіл миші
Для оцінки інтерналізації антитіл до СЕАСАМ5 МАБІ, МАБ2, МАБЗ, МАБ4 і МАБ5,
Б життєздатні клітини МКМ45 інкубували протягом 24 годин при 37 "С/5 95 СО» (або 4 "С на льоду для негативного контролю) з 10 мкг/мл попередньо мічених АІехагРіцог488 антитіл до СЕАСАМ5.
Потім одну частину ямок промивали середовищем для культивування і позаклітинні мічені АЕ антитіла, зв'язані з клітинами, гасили за допомогою інкубації клітин з антитілом до АіІехаБійог488 (50 мкг/мл) на льоду протягом 30 хв. (рівень внутрішньоклітинної флуоресценції). Іншу частину ямок інкубували тільки з середовищем для культивування в тих же умовах (загальний рівень флуоресценції).
Потім клітини відділялли і промивали, і збирали в середовище для культивування з наступним аналізом проточної цитометрії з використанням аналізатора МАСЗОШАМТ Ммуб.
Вимірювали асоційовану з клітинами флуоресценцію 1х107 клітин, і потім кількісно визначали середню інтенсивність флуоресценції відібраних життєздатні клітини. Коефіцієнт інтерналізації ( до) визначали діленням асоційованої з гашеними клітинами флуоресценції на загальну асоційовану з клітинами флуоресценцію, множачи на 100. Дані виражають у вигляді середнього--стандартне відхилення (510).
Таблиця 5
Інтерналізація антитіл до СЕАСАМХ5 мишії в лінії клітин МКМ45 через 24 години
П'ять специфічних до СЕАСАМ5 антитіл після зв'язування з СЕАСАМ5, експресованим на клітинній поверхневій мембрані, піддавалися інтерналізації, підтримуючи їх використання в області імунокон'югатів антитіл для специфічного спрямування цитотоксичних засобів у злоякісні клітини. Антитіла до СЕАСАМ5 МАБІ, МАБ2, МАБЗ, МАБА і МАБ5 через 24 години інкубації продемонстрували інтерналізацію в лінію злоякісних клітин МКМ45 людини на рівні 49,9 95, 45 95, 51,1 95, 42,5 95, 51,7 95, відповідно.
Приклад 3.4. Цитотоксична активність відповідних АОС миші відносно лінії клітин МКМ4А5
Антитіла миші кон'югували для визначення їх цитотоксичної активності іп міго. У пробірку об'ємом 15 мл при кімнатній температурі (23 "С) послідовно додавали тАб, буфер А/НЕРЕЗ (4
Зо о), ОМА (диметилацетамід, 20 95 об./об.), потім 6 еквівалентів лінксера 5РОВ при перемішуванні на магнітній мішалці. Після ночі при кімнатній температурі додавали розчин ОМА (майтанзиноїд, 9,6 еквівалента) у 15 мМ ОМА і 5 годин проводили реакцію. Неочищену суміш кон'югата очищали на колонках Бирегдех 200руд 16/60 або с2гб5 26/10 (РВ5-Ма ріН7,4/5 95 ММР), концентрували на Атісоп 15 (Ф 50009 і фільтрували на МіШех 0,22 мкм.
Потім тестували дію кон'югатів антитіл до СЕАСАМ5 з майтанзиноїдом на життєздатність пухлинних клітин з використанням набору Сеї! Тіег-Сіо (Рготеда). Для проведення цього тесту, клітини раку шлунка людини МКМ45 висівали в 96б-ямкові планшети і давали можливість прикріплюватися протягом 4 годин у 37 "С/атмосфері 5 96 СО». До висіяних клітин додавали різні концентрації кон'югатів антитіл до СЕАСАМХУ. Потім клітини інкубували протягом 96 годин у тій же атмосфері. Потім у ямки додавали реагент Сеї! Тпег-сСіо протягом 10 хв. при кімнатній температурі і вимірювали люмінесцентний сигнал з використанням планшетного лічильника
Епмівіоп (Регкіп-ЕІтег).
Таблиця 6
Цитотоксична активність специфічних до
СЕАСАМ5 АОС миші відносно СЕАСАМ5 з лінії клітин МКМ4А5 ; . . Цитотоксична активність во (НМ)
Антитіла до СЕАСАМУЬ, кон'юговані з майтанзиноїдом (0ОМ4), МАБ1-5Р608-0М4, МАБ2-5РОВ-
ОМА, МАБ3-5РОВ-ОМ4, МАБ4-5РОВ-ОМА4 ії МАБ5-5РОВ-ОМА4, продемонстрували цитотоксичну активність іп міїго з ІСзо 0,89, 0,14, 0,53, 0,96 і 0,24 нМ, відповідно.
Приклад 4. Визначення послідовностей важких і легких ланцюгів тАб до СЕАСАМ5
Послідовності варіабельних доменів тАбБ одержували з гібридоми і клонували в експресуючий вектор для гарантії того, що клоновані тАр мають ті ж характеристики, що і вихідні тАб миші.
Одержані амінокислотні послідовності дозволяли одержувати інформацію, що відповідає даним, одержаним на очищених тАбБ, одержаних з гібридоми, за допомогою М-кінцевого секвенування і мас-спектрометрії (РХ/МС) важких і легких ланцюгів (І С, НС) (див. таблицю 7).
Таблиця 7
Мас-спектрометричний аналіз тАб до СЕАСАМ5 з гібридоми 11111111 Ммасаддау7///7/7/7/7/7/7/////77777С послідовності 7 дне(воє) | 77777503208.77777777/|7717171717171717171717111150390...7./:К(«Х СУ 7 дне(воє) | 7777750288.77777777717 71717171 50286...7С/С 11 дне(воє) | 77777150372.77 | ...777717171717101050373.../::: ГУ: 1 дне(воє) | 777771503707777777ЙЮЮ.|...7717070050370....7/:/:КЮК:И/ Г/|:И 111 не(воє) | 7777750о32977777 | 77771717171717171717171711503980...7/:К(«.::С("еС "МАр2і являє собою антитіло, одержане за допомогою однієї з клонованих гібридом і з якого одержували так називане "МАБ2" за допомогою внесення канонічних залишків у каркасні області МІ. і МН, як описано в прикладі 5.
Приклад 5. Кон'югат антитіла з лікарським засобом (АБС) (химерний)
Приклад 5.1. Недериватизоване химерне тАр
Послідовності нуклеїнової кислоти варіабельних доменів МН, МІ клонували в експресуючі вектори в злитті з кодуючими послідовностями ЇД21 людини або константного домену Скаппа людини, відповідно, з одержанням потім партії химерних тАб за допомогою транзиторної експресії в НЕК293, як описано в прикладі 1. Афінності відносно СЕАСАМ5 людини і яванського макака в тАбБ миші і химерних тАБр залишалися подібними. У таблиці 8 афінності проілюстровані ЕСво, одержаними за допомогою ЕГІЗА з СЕАСАМ5 людини або яванського макака.
Таблиця 8
ЕСовхо, одержані з СЕАСАМ5 для тАБ з гібридоми миші і відповідних химерних таб 11111111 |спмАв2(партяг) | 014 | 07 щ 10111111 |спмМаракоя//// 177701 | 05
Послідовності областей СОК виводили на основі послідовності білка з використанням номенклатури ІМОТ. Вони відповідають ЗЕ ІО МО:1-4, 6, 7-10, 12, 13-16, 18, 19-22, 24, 25-28,
ЗО.
Слід зазначити, що в порівнянні з антитілом, одержаним за допомогою клонованої гібридоми (МАБ2і), у клон МАБ2 у положеннях 410, 42К їі 450) у МІ і в положеннях 50) і 75 у МН внесені канонічні залишки.
Крім того, у СОК2 клону МАБ2 СЕА-4 розташований лізин у положенні 52 у МІ, який у клоні
Мабрагкогв заміщений аргініном. Одержували партію в тих же умовах, як партію, що відповідає клону МАБ2, і вона приводила до подібної афінності відносно позаклітинного домену СЕАСАМ5 людини і яванського макака, як представлено в таблиці 7. Варто підкреслити, що цю точкову мутацію в СОК можна проводити без якого-небудь впливу на зв'язування.
Послідовності І С і НС химерного тАБ для клону МАбБ2 і клону Мабра2когин відповідають ЗЕО ІЮ
МО:43, 44, 54.
Конструювали СспПМАбБаІ, як описано в прикладі 4. Воно являє собою химерне тАб, одержане з клону МАБ2 з ді людини, ізотипу Ск. Послідовності відповідають 5ЕО ІЮ МО:43 і 44. За допомогою транзиторної експресії в НЕК293 одержували партію в масштабі 300 мг з наступним очищенням білка за допомогою афінної хроматографії, для даних про зв'язування див. таблицю 7. Воно являє собою недериватизоване тАб, використовуване для одержання АОС.
Приклад 5.2. Одержання і характеристика АОС
У цьому прикладі з недериватизованих химерних тАб одержували імунокон'югати. Потім оцінювали ефективність іп мімо.
Розрахунок ОАК
Кон'югат, як правило, містить від 1 до 10 молекул майтанзиноїду, ковалентно зв'язаного з антитілом (так називане "відношення лікарського засобу до антитіла" або "САК"). Ця кількість може варіювати залежно від характеру антитіла і використовуваного майтанзиноїду поряд з експериментальними умовами, використовуваними для кон'югації (такими як відношення майтанзиноїд/антитіло, час реакції, характер розчинника і співрозчинника, якщо він присутній).
Таким чином, контакт між антитілом і майтанзиноїдом приводить до суміші, яка містить декілька кон'югатів, що відрізняються один від іншого різними відношеннями лікарського засобу до антитіла; необов'язково недериватизоване антитіло; необов'язково агрегати. Таким чином, визначуване БАК є середнім значенням.
Спосіб, використовуваний у даному описі, для визначення ОАК, складається зі спектрофотометричного вимірювання відношення оптичної густини розчину значною мірою очищеного кон'югата при 252 і 280 нм. Зокрема, зазначене ОАК можна спектрофотометрично визначити з використанням виміряних коефіцієнтів екстинкції, відповідно при 280 нм їі 252 нм для антитіла і для майтанзиноїду (єргво-5,180 М" см" і Єргвг-26,159 М" см"). Спосіб розрахунку запозичений у Апіопу 5. Оітйгом (ей), Г.С, 2009, Тпегарешіс Апіїродієз5 апа Ргоїосої5, мої. 525, 445, Зргіпдег 5сіепсе і більш докладно описаний нижче.
Оптичні густини кон'югата при 252 нм (А252) і при 280 нм (А280) вимірюють в аналізі мономерних піків при ексклюзійній хроматографії (ЕС) (дозволяючи розрахувати параметр "ПАК(ЗЕС)") або з використанням класичного спектрофотометричного пристрою (що дозволяє розрахувати параметр "АК(ШМ)"). Оптичні густини можна виражати наступним чином:
Агв2-(СохЄргв52) Н(САХ Агов),
Агво-(Сох Єргво)-Н(САХ ЄАгВО), де:
со і сл відповідно являють собою концентрації майтанзиноїду й антитіла в розчині,
Єргвг і Єргво відповідно являють собою молярні коефіцієнти екстинкції майтанзиноїду при 252 і 280 нм,
Єргвг і Єдгоо відповідно являють собою молярні коефіцієнти екстинкції антитіла при 252 і 280 нм.
Розв'язання цих двох рівнянь з двома невідомими приводить до наступних рівнянь: со-|(Єдгвох А252)-(Єдовах Агво ДИ (Єргвах Єдгво) -(Єдовах Єргво) |,
СА-(Агво-(Сох Єргво) |/Єдгво.
Потім на основі відношення концентрації лікарського засобу до концентрації антитіла розраховують середнє САК: ОАВ-со/са.
Деглікозилування і високорозрізнювальна мас-спектрометрія кон'югатів (НКМ5)
Деглікозилування являє собою спосіб ферментативного розщеплення за допомогою глікозидази. Деглікозилування проводять у 500 мкл кон'югованогої-100 мкл 50 мМ буфера Ттгі5
НСІ-10 мкл ферменту гліканази-Е (100 одиниць ліофілізованого ферменту/100 мкл води).
Середовище перемішують на центрифузі "вортекс" і підтримують ніч при 37 "С. Потім деглікозилований зразок готовий до аналізу в НКМ5. Мас-спектри одержували в системі Умагеге
О-Тої-2 у позитивному режимі електророзпилення (Еб). Умови хроматографії є наступними: колонка - 4 мкм Віобийе 250 ОВН 5ЕС 4,6х300 мм (Маїег5); розчинники: А - амонію форміат 25 мІМя1 95 мурашина кислота; В - СНзСМ; температура колонки: 30 "С; швидкість потоку 0,4 мл/хв.; ізократична елюція 70 95 А30 90 В (15 хв.).
Аналітична ексклюзійна хроматографія (ЗЕС)
Колонка: колонка ТоКає!ї 13000 5МУХІ. 5 мкм, 7,8 ммх30 см, ТОБОН ВІОЗСІЕМСЕ, 1 І С Рап й 08541 захисна колонка Т5К-СЯБЇ 5МУХІ 7 мкМ, 40хб мм, ТОБОН ВІО5СІЕМСЕ, 11 С Рай я 08543.
Рухома фаза: КСІ (0,2М), КНгРОх (0,052М), КНгРОх (0,107М), ІРОН (20 95 в об'ємі).
Умови аналізу: ізократична елюція при 0,5 мл/хв. протягом 30 хв.
Аналіз проводять у системі ВЕРХ Гаспгот Бїше (МегсК) з використанням спектрофотометричного детектора САО І 2455.
Склад буферів
Зо Буфер А (рн-б6,5): Масі (50 мМ), фосфатно-калієвий буфер (50 мМ), ЕОТА (2 мМ).
Буфер Но (рН.5,5): гістидин (10 мМ), гліцин (130 мМ), сахароза 5 95 (мас./об.), НСІ (8 мМ).
Використовувані скорочення
СУ: об'єм колонки; ВАК: відношення лікарського засобу й антитіла; ОМА: диметилацетамід;
НЕРЕБ5: 4-(2-гідроксіетил)-1-піперазинетансульфонова кислота; НЕМ5: мас-спектроскопія високого розрізнення; МН: М-гідроксисукцинімід; нітро-5РОВ: бутанова кислота, складний 4-|(5- нітро-2-піридиніл)дитіо|-2,5-діоксо-1-піролідиніловий ефір (можна одержувати, як описано в патенті М/О 2004016801); ММР: М-метилпіролідинон; КТ: кімнатна температура; ЕС: ексклюзійна хроматографія.
АОС (химерне):
СИМАБІ-5РОВ-ЮОМА
Аналітичні дані:
Му(АБ)-148438 г/моль; МИ(ОМа4)-780,38 г/моль,
Єгво нм(Аб)-213320; є252 нм(АБ)-73473,
Єгво нм ОМ4)-:5180 і є252 нм ЮОМ4)-26159.
При перемішуванні, при КТ у посудину додавали 3,59 мл СсСпИМАБІ1 (С-5,72 мг/мл у буфері
РВ5 з рН-7,4) з наступним додаванням 0,312 мл ОМА і 0,046 мл розчину лінкера нітро-5РОВ (5,0 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Розчин перемішували на центрифузі "вортекс" протягом 30 сек і потім повільно перемішували при КТ протягом З годин. При перемішуванні на магнітній мішалці послідовно додавали 3,8 мл буфера РВЗ з рнН-7,5, 0,389 мл ОМА і 0,074 мл розчину ОМА (15
ММ розчин у ОМА). Через 2,5 години при КТ неочищену реакційну суміш очищали на знесолюючій колонці Ні оаа 26/60 (З,ирегаех 200 пг; СЕ Неайсаге), попередньо витримували з 1 СМ 1М Маон, 2 СМ води і 2 СМ буфера РВ5 з рН-7,4, що містить в об'ємі 5 956 ММР. Кон'югат елюювали буфером РВ5 з рН-7,4, що містить 5 95 ММР, ї фракції мономерних кон'югатів об'єднували, концентрували в Атісоп ОКга-15 (нгасеї! 10 Кк, Мійіроге) і фільтрували на 0,22 мкм фільтрі.
Таким чином, одержували 7,6 мл кон'югата СПМАБбБ1-5РОВ-ОМА4 (с-2,19 мг/мл) у вигляді безбарвного прозорого розчину. Потім кон'югат аналізували на кінцеве навантаження лікарського засобу і чистоту мономерів: ОАК (ШМ)-3,38; АК (5ЕС)-3,34; КТ-17,54 хв.; чистота мономерів-99,8 90. бо Результат аналізу НКМ5 представлений на фіг. 8.
СсПМАБВБ2-5РОВ-ЮОМА
Аналітичні дані:
Му(АБ)-147900 г/моль; МИ(ОМа4)-780,38 г/моль,
Єгво нм(Аб)-201400; є252 нм(АБ)- 70889,
Єгво нм ОМ4)-:5180 і є252 нм ЮОМ4)-26159.
При перемішуванні, при КТ у посудину додавали 3,8 мл СИМАБІ2 (С-5,08 мг/мл у буфері РВ5 з рН-7,4) з наступним додаванням 0,337 мл ОМА і 0,0433 мл розчину лінкера нітро-РОВ (5,0 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Розчин перемішували на центрифузі "вортекс" протягом 30 сек. і потім повільно перемішували при КТ протягом З годин. При перемішуванні на магнітній мішалці послідовно додавали 3,12 мл буфера РВЗ з рнН-7,5, 0,319 мл ОМА і 0,069 мл розчину ОМА (15
ММ розчин у ОМА). Через 2 години при КТ неочищену реакційну суміш фільтрували на 0,45 мкм фільтрі й очищали на знесолюючій колонці Ні оай 26/60 (Зирегдех 200 пг; СЕ Неайсагеє), попередньо витримували з 1 СМ 1М Маон, 2 СМ води і 2 СМ буфера РВ5 з рН-7,4, що містить в об'ємі 5 95 ММР. Кон'югат елюювали буфером РВЗ з рН-7,4, що містить 5 95 ММР, їі фракції мономерних кон'югатів об'єднували, концентрували на Атісоп ОКга-15 (Опгасеї! 10 К, МіПіроге) і фільтрували на 0,22 мкм фільтрі.
Таким чином, одержували 7,5 мл кон'югата СПМАбБ2-5РОВ-ОМА4 (с-1,8 мг/мл) у вигляді безбарвного прозорого розчину. Потім кон'югат аналізували на кінцеве навантаження лікарського засобу і чистоту мономерів: ОАК (0М)-4,10; АК (5ЕС)-4,05; КТ-17,52 хв.; чистота мономерів-99,9 95.
Результат аналізу НКМ5 представлений на фіг. 9.
СсПМАБА-5РОВ-ЮОМА
Аналітичні дані:
Му(АБ)-148124 г/моль; МИ(ОМа4)-780,38 г/моль,
Єгво нм(АБ)-204380; Єгво нм АБ)- 73142,
Єгво нм ОМ4)-:5180 і Єгво нм ОМ4)-26159.
При перемішуванні, при КТ, у посудину додавали 3,63 мл сСпПМАБбБа (С-5,69 мг/мл у буфері
РВ5 з рнН-7,4) з наступним додаванням 0,316 мл ОМА і 0,0465 мл розчину лінкера нітро-5РОВ (5,0 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Розчин перемішували на центрифузі "вортекс" протягом 30 сек.
Зо і потім повільно перемішували при КТ протягом З годин. При перемішуванні на магнітній мішалці послідовно додавали 3,8 мл буфера РВЗ з рнН-7,5, 0,389 мл ОМА і 0,074 мл розчину ОМА (15
ММ розчин у ОМА). Через 2 години при КТ неочищену реакційну суміш очищали на знесолюючій колонці НіГоай 26/60 (Зирегдех 200 пг; СЕ Неайвсаге), попередньо витримували з 1 СМ 1М
Маон, 2 СМ води і 2 СМ буфера РВ5 з рН-7,4, що містить в об'ємі 5 95 ММР. Кон'югат елюювали буфером РВ5 з рН-7,4, що містить 5 95 ММР, ї фракції мономерних кон'югатів об'єднували, концентрували на Атісоп Ойга-15 (Окгасеї! 10 Кк, Мійіроге) і фільтрували на 0,22 мкм фільтрі.
Таким чином, одержували 6,5 мл кон'юЮгата СИМАБ4-5РОВ-ОМА4 (с-2,20 мг/мл) у вигляді безбарвного прозорого розчину. Потім кон'югат аналізували на кінцеве навантаження лікарського засобу і чистоту мономерів: ОАК (0М)-3,87; АК (5ЕС)-3,85; КТ-17,52 хв.; чистота мономерів-99,8 90.
Результат аналізу НКМ5 представлений на фіг. 10.
СПМАБ5-5РОВ-ЮОМА
Аналітичні дані:
Му(АБ)-148040 г/моль; МИ(ОМА)-780,38 г/моль,
Єгво нм(АБ)-207360; Єгво нм АБ)- 72288,
Єгво нм ОМ4)-:5180 і Єгво нм ОМ4)-26159.
При перемішуванні, при КТ у посудину додавали 3,15 мл СПИМАБ5 (С-6,38 мг/мл у буфері
РВ5 з рнН-7,4) з наступним додаванням 0,269 мл ОМА і 0,0453 мл розчину лінкера нітро-СРОВ (5,0 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Розчин перемішували на центрифузі "вортекс" протягом 30 сек і потім повільно перемішували при КТ протягом З годин. При перемішуванні на магнітній мішалці послідовно додавали 4,1 мл буфера РВЗ з рН-7,5, 0,317 мл ОМА і 0,072 мл розчину ОМА (15
ММ розчин у ОМА). Через 2 години при КТ неочищену реакційну суміш фільтрували на 0,45 мкм фільтрі й очищали на знесолюючій колонці Ні оай 26/60 (Зирегдех 200 пг; СЕ Неайсагеє), попередньо витримували з 1 СМ 1М Маон, 2 СМ води і 2 СМ буфера РВ5 з рН-7,4, що містить в об'ємі 5 95 ММР. Кон'югат елюювали буфером РВ5 з рН-7,4, що містить 5 95 ММР, ї фракції мономерних кон'югатів об'єднували, концентрували на Атісоп ОКга-15 (кгасеї! 10 Кк, Мійіроге) і фільтрували на 0,22 мкм фільтрі.
Таким чином, одержували 7,5 мл кон'югата
АпіСЕАСАМ5 пуб 1917СЕАЯ4 УН5БОЇ5 МІ 412442К450 Іда1-5РОВ-ОМА (с-3,4 мг/мл) у вигляді бо безбарвного прозорого розчину. Потім кон'югат аналізували на кінцеве навантаження лікарського засобу і чистоту мономерів: ОАК (ОМ)-3,4; АК (5ЕС)-3,4; КТ-17,49 хв.; чистота мономерів-99,8 90.
Результат аналізу НКМ5 представлений на фіг. 11.
Приклад 5.3. Ефективність іп мімо
Чотири химерних кон'югати (СПМАБбБ4-5РОВ-ОМА, сиИмМАБбІ-5РОВ-ОМА4, спМмМАБ5-5РОВ-ОМА і
СсПМАБ2-5РОВ-ОМ4) оцінювали при 2 дозах відносно вимірних первинних пухлин товстого кишечнику СК-І2В-034Р, п/ш імплантованих самкам мишей ЗСІЮ. Контрольні групи залишали без обробки. Дози кон'югатів наведені в мг/кг. Їх вводили в дозах 5 і 2,5 мг/кг за допомогою внутрішньовенної (в/в) болюсної ін'єкції на добу 14 після імплантації пухлини.
Для оцінки протипухлинної активності кон'югатів, тварин щодня зважували, і пухлини 2 рази на тиждень вимірювали циркулем. Дозу, що приводить до 20 956 втрати маси в нижчій точці (середнє по групі) або до 10 95 або більше викликаних лікарським засобом випадків загибелі, вважали надмірно токсичною дозою. Маси тіла тварин включали маси пухлин. Об'єм пухлини розраховували з використанням формули маси (мм3)-|довжина (мм)хширина (мм)2/2.
Первинними очікуваними ознаками ефективності є АДТ/ДС, відсоток середнього регресу, частковий і повний регрес (РК і СК).
Зміна об'єму пухлини для кожної обробленої (Т) і контрольної (С) тварини розраховують для кожної пухлини, віднімаючи об'єм пухлини на добу першої обробки (доба визначення стадії) з об'єму пухлини на конкретну добу спостереження. Для обробленої групи розраховують середнє
АТ, і для контрольної групи розраховують середнє АС. Потім розраховують відношення АТ/АС і виражають у вигляді відсотків: АТ/АС-(дельта Т/дельта С)х100.
Дозу вважають терапевтично активною, коли ДТ/АС є меншим, ніж 40 95, і дуже активною, коли АТ/АС є меншим, ніж 10 95. Якщо ДТ/ДС менше 0, дозу вважають високоактивною, і обчислюють відсоток регресу (Ріоултпап .-)., буКе5 0.9., НоїПпд5зпеай М., Зітрзоп-Не!теп І. апа
АПеу М.С. Нитап Шштог хеподгай тоде!5 іп МСІ агид демеІортенпі. Іп: Рєїрід НН ВА, еайог. Вазе!:
Кагадег.; 1999, р. 101-125):
Фо регресу пухлини визначають як 95 зниження об'єму пухлини в обробленій групі на конкретну добу спостереження в порівнянні з її об'ємом на першу добу першої обробки.
У конкретний момент часу і для кожної тварини розраховують 905 регресу. Потім розраховують середній вмуегребуєдня, дер: об'ємо
Частковий регрес (РК): регрес визначений як частковий, якщо об'єм пухлини знижується до 50 95 від об'єму пухлини на початку обробки.
Повний регрес (СК): повний регрес досягається, коли об'єм пухлини-:О мм3 (СЕ. рахують, коли не можна зареєструвати об'єм пухлини).
Результати
Результати представлені на фіг. 4 і в таблиці 9 (нижче). При використанні схеми з одним введенням у дозах 2,5 і 5 мг/кг усі кон'югати, тестовані в цьому дослідженні, не викликають токсичності.
СИМАБІ-5РОВ-ОМА був дуже активний при 5 і 2,5 мг/кг з АТ/АС 0 ії 7 95 (р«0,0001 і р-0,0170 відносно контролю), відповідно. СПМАБ4-5РОВ-ОМА ії сСпПМАВБ5-5РОВ-ОМА були високоактивними при 5 мг/кг з ДТ/ДС -5 і -7 906 (р«0,0001 при порівнянні з контролем), відповідно, і регресом пухлини 25 і 65 95, відповідно. Вони були дуже активними при 2,5 мг/кг з ДТ/ДС 7 і 2 95 (р-0,0152 і р-0,0020 при порівнянні з контролем), відповідно. СПМАВБ2-5РОВ-ЮМА був високоактивним при 5 І 2,5 мг/кг з АТ/АС -10 ї -8 95 (р«0,0001 при порівнянні з контролем), відповідно, регресом пухлини 82 і 39 95, відповідно, і З і 1 СЕ/6, відповідно.
На основі цих результатів усі химерні кон'югати СИМАвБ4-5РОВ-ЮОМ4, спмМАБІ-5РОВ-ОМА,
СПМАБ5-5РОВ-ОМА і СпПМАВБ2-5РОВ-ОМА придатні для розробки терапевтичних АОС.
Таблиця 9
Оцінка протипухлинної активності кон'югатів СИМАБ1-5РОВ-ОМА4, симМАр2-5РОВ-ОМА, сиМАБА-
ЗРОВ-ОМА і сСпПмМАбБ5-5РОВ-ОМА проти первинної аденокарциноми товстої кишки людини СЕ-
ІА-034Р у самок мишей ЗСІЮ
Ви- | Серед- кли- |ня зміна кана | маси
Доза в Схе- | лікар- |тіла в 95 Серед- Серед- Біоста-
Шлях/ | мг/кг ма в | ським |У миші в не ній зе Част- тичне | Комен-
Засіб' | Дозав!| на У -- ІАТ/АС ві. рег- Пов- . , до- | засо- | нижній Кко- - зна- тарі мл/кг | ін'єк- Я Зо ресу - | НИЙ ю бах | бом | точці (доба) | (доба) вий чення ре ц заги- | (доба д д бель | нижньої (доба)| точки) 3 Дуже
САМА - 5 14 0/6 (023) о (033) 2/6 | 0/6 | «0,0001 актив- в/в (10 ний
ЗРОВ- рма мл/кг) 49 Дуже 2,5 14 0/6 й 7 (021) 0/6 | 0/6 | -0,0170 | актив- (рег) ! ний
Висо- -1 -10 82
СИМАБО- 5 14 0/6 (029) | (033) | (033) 6/6 | 3/6 | «0,0001 | коак- Й в/в (10 тивний
ЗРОВ- рма мл/кг) 418 39 Висо- 2,5 14 0/6 (057) -8 (028) (028) 2/6 | 1/6 | «0,0001 | коак- Й тивний -9 25 Висо-
САМАВА- 5 14 0/6 (022) -5 (028) (028) 2/6 | 0/6 | «0,0001 | коак- Й в/в (10 тивний
ЗРОВ- рма мл/кг) 48 Дуже 2,5 14 0/6 й 7 (025) 0/6 | 0/6 | -0,0152 | актив- (021) В ний 48 65 Висо-
СИМАББ- 5 14 0/6 (029) -7 (033) (033) 4/6 | 0/6 | «0,0001 | коак- Й в/в (10 тивний
ЗРОВ- рма мл/кг) -08 Дуже 2,5 14 0/6 й 2 (021) 0/6 | 0/6 | -0,0020 | актив- (023) й ний
Конт- -3,6 в 17 | 719) (ою) с 1 1111 1ї"Склад лікарського засобу: НОБ (10 мМ гістидин, 130 мМ гліцин, 5 95 об./об. сахароза, 0,01 905
Тмееп-80), рн-7 4. 2гЗначення р: тест Даннета в порівнянні з контролем після 2-стороннього дисперсійного аналізу з повторними вимірюваннями перетворених в ранги змін об'єму пухлин від вихідного рівня.
Приклад 6. Гуманізація тАр МАБ2 до СЕАСАМ5
У цьому прикладі іп 5йїсо конструювали гуманізовані варіанти вихідного МАБ2 ІдСї миші.
Одержані тАбБ одержували і визначали подібні характеристики, як для химерного ДС сп-МАбБа2.
Приклад 6.1. Протокол гуманізації 40 а) Гуманізація на основі траєкторій молекулярної динаміки
Послідовності МІ. ї МН клону МАБ2 миші порівнювали з базою даних білків (РОВ) (Вегтап єї аІ,, Мисівіс Асід5 Везеєагси, 2000, 28:235-242). Використовували наступні шаблони: каркас легкого і важкого ланцюгів - ЗЕНВ (90,9 905 ідентичності каркаса легкого ланцюга і 90,8 90 ідентичності каркаса важкого ланцюга), І 1-1І8М, 12-16, Г3-1Р7К, НІ-2ОНА, Н2-ТІСТ ії НЗ-
1РАВ з побудовою моделі гомології ЇС і НС до СЕАСАМ5 з використанням молекулярного операційного середовища (МОЕ) (м. 2011,10 - Снетіса! Сотриййпуд Стор, Оцебес, Сапада).
Потім у моделі гомології мінімізували енергію з використанням стандартних способів, реалізованих у МОЕ.
Потім проводили симуляцію молекулярної динаміки (МО) мінімізованої ЗО-моделі гомології
МАбБІ2 миші, з обмеженнями на білковий каркас при температурі 500 К на 1,1 наносекунду (нс) у генералізованому уявному розчиннику Борна. У цьому першому проході МО кожні 100 пікосекунд (пс) протягом останньої 1 нс витягали 10 різних конформацій. Потім кожну з цих різних конформацій піддавали симуляції МО без обмежень на каркас білка і при температурі 300 К протягом 2,3 нс. Потім для кожного з 10 проходів МО, останні 2000 знімків, один кожну пс, із траєкторії МО використовували для розрахунку, для кожної амінокислоти МАБ2 миші, її середньоквадратичні відхилення (с.к.в.-) порівнювали з еталонним положенням медоїда.
Порівнюючи середнє с.к.в. для 10 окремих проходів МО для даної амінокислоти з загальним середнім с.к.в. всіх амінокислот МАБ2 миші, приймали рішення, чи є амінокислота досить рухомою, як спостерігають при МО, щоб розглядати її як ймовірно взаємодіючу з Т-клітинними рецепторами і відповідальну за активацію імунної відповіді. В антитілі МАБ2 миші як рухомі ідентифіковані 32 амінокислоти, крім СОВ і її безпосереднього оточення в межах 5 А.
Потім рухомість 60 найбільш рухомих амінокислот МАБ2 миші протягом 20 нс (10х2 нс) при симуляції молекулярної динаміки порівнювали з рухомістю відповідних рухомих амінокислот 49 моделей ЗЮО-гомології у людини, для кожної з яких проводили таку ж симуляцію МО. Ці 49 моделей зародкової лінії людини побудовані за допомогою систематичного комбінування репрезентативної панелі 7 легких ланцюгів людини (а саме мК!, мк2, мк3, мк4, матбаа!, матбрааг, матрааз) з репрезентативною панеллю 7 важких ланцюгів людини (а саме мп1а,
Мб, мг, мАЗ, па, мп5, мб) (Мисієїс Асіа Незеєагсі, 2005, Мої. 33, Оаїарахзе ізвиє 0593-0597).
Комбінація уУк1-/йб продемонструвала найбільшу (72,6 95) подібність 40 своїх рухомих амінокислот у порівнянні з рухомими амінокислотами антитіла МАБ2 миші; таким чином, цю модель використовували для гуманізації антитіла МАБ2 з фокусуванням на рухомих амінокислотах. Для парної асоціації амінокислот у МАБ2 миші й амінокислотах мк1-мнб 2 послідовності вирівнювали на основі оптимального ЗО-накладення альфа-атомів вуглецю в 2 відповідних гомологічних моделях. р) Стабілізуючі мутації
Для поліпшення стабільності областей МІ. і МН антитіла до СЕАСАМ»Ь, амінокислоти легких і важких ланцюгів з низькою частотою зустрічальності в порівнянні з їх відповідними канонічними послідовностями, крім СОЕК, початково планували піддати мутації в найбільш часто виявлювані амінокислоти (ДДОЇй»О0,5 ккал/моль (Мопзепйег еї аї. у. Мої. Віої. 2006, 362,580-593)). Перший список консенсусних мутацій для ІС і для НС обмежений амінокислотами, що виявляються в найближчій моделі для людини (тобто мк1-мпб). Жодна з цих мутацій не розташована в зоні "Метіег!" (Боогїе еї аї., у). Мої. ВіоІ. 1992, 224, 487-499). Враховували інші критерії для розгляду цих консенсусних мутацій для потенційної стабілізації антитіла МАБ2 до СЕСАМХ5. Ці критерії являють собою сприятливу зміну гідрофобності на поверхні або молекулярної механіки на основі теоретично розрахованої стабілізації мутанта. Розглядали стабілізуючі мутації, що у літературі опубліковані як ефективні (Ведоцеїе Н.). Мої. Віо!Ї. 2006, 362,580-593; 5івїре В.). Мої.
Віо!. 1994, 240, 188-192). с) Видалення небажаних мотивів послідовностей
Розглядали наступні мотиви послідовностей: Ав5р-Рго (кислотолабільний зв'язок), Абп-Х- зег/Тпг (глікозилування, Х-будь-яка амінокислота крім Рго), А5р-СіІу/Зег/Тпг (формування сукцинімід/30о-А5р у рухомих областях), Авп-С1у/Ніз/Зег/АІа/Сух (експоновані ділянки дезамідування), Меї (окислювання в експонованій області). Одержані гуманізовані послідовності за допомогою ВІ А5Т перевіряли на подібність послідовностей з базою даних імунних епітопів (ІЕОВ) (РГоз Віої! (2005) 3(3)е91). пер:/Лумлиіттипееріоре.ого) для гарантії того, що жодна з послідовностей не містить жодного відомого В- або Т-клітинного епітопа з перерахованих у ній. а) Гуманізовані області МН і МІ.
Запропоновано три версії для легкого ланцюга (МІ1, МІ Та і МІ 1с) і три версії для важкого ланцюга (МНІ, МНіа і МНІБ). У таблиці 10 і таблиці 11 наведена конкретна комбінація амінокислотних залишків, змінених у кожному гуманізованому варіанті МІ. ї МН МАБа2, відповідно.
У таблиці 12 наведені повні амінокислотні послідовності гуманізованих доменів МН і МІ.
Варіант МТ демонструє 5 мутацій, що одержані на основі прямого порівняння найбільш рухомих амінокислот, що не входять у СОК, легкого ланцюга МАБ2 до СЕАСАМ5 і послідовності легкого ланцюга мк1 людини.
Варіант МІ та одержаний з МІ 1 і включає 4 нових мутації, що є консенсусними (послідовність
МК) і потенційно стабілізуючими. Крім того, 1 з цих мутацій зачіпає потенційно проблематичну ділянку дезамідування (0171 ів).
Варіант МІ 1с одержаний з МІ 1а за допомогою внесення 1 мутації К замість К у положенні 52. Фактично, цей К52 розташований у СОК 12 і може являти собою "мішень" для процесу кон'югації.
Варіант МНІ демонструє 7 мутації, що одержані на основі прямого порівняння найбільш рухомих амінокислот, що не входять у СОК, важкого ланцюга МАБбБ2 до СЕАСАМ5 і послідовності важкого ланцюга мб людини.
Варіант МНта одержаний з УНІ і містить 4 нові мутації, що є консенсусними (послідовність мб) і потенційно стабілізуючими.
Гуманізовані домени МІ. ії МН антитіла до СЕАСАМ5 МАБІ2 комбінували наступним чином:
МІ1 ї МНІ; МІ Та і УНІа; Мі 1с ї МНІа; МІ Та і МНІЬ.
Таблиця 10
Мутації варіантів МІ. антитіла до СЕАСАМ5 МАБ2 7 1111111111Др10611111111111р1ррИЙ 8 11111в11 в о 11111111 |1Р Р Р С |Р
КБ 11111111 в
Кеті пе ПОН ПОН с ОН Ж ЗО 84111111 А1111111111С ТА
ПЕВ ПОН КОН хо Но ко
Таблиця 11
Мутації варіантів МН антитіла до СЕАСАМ5 МАБ2 65777711 ДР С ФР 1
Мет ПО Ж ПОН сх НО
ПН: КЕН КОН Є НО бо 11111111 ЩА м.
ПЕТ ПОН КОН БО
АТЗ 11611111
Таблиця 12
Амінокислотні послідовності МН і МІ. ілюстративних гуманізованих антитіл до СЕАСАМ5
Варіант УН або МІ. 5ЗЕО Ір МО:
ЕМОГ ОЕБОаРИОЇ МКРОСБІ 5І 5СААБОБЕМЕ5
ЗУОМ5МУВОТРЕНВІ ЕММАМІЗБОССТТ МЕ о
УНІ клону МАБ2 РОТУКОВЕТУЗВОМАКМТІ МІ ОММ8І ТЕО ЗО Ор МО ві
ТАІМУСААНУга5ЗаРЕАМУСОСТІ МТА
ЕМОГ ОЕБОаРИОЇ МКРОСБІ 5І 5СААБОБЕМЕ5
ЗУОМ5МУВОТРЕНИОЇ ЕМ/МАМІЗЗОССІТ МА о
Унта клону МАБ2 РОТУКОВЕТУЗВОМАКМТІ МІ ОММ8І ТЕО ЗО Ор мо:5
ТАУМУМСААНУРИа5ЗЗОРЕАМУСОСТІ МТУ
РІОМТО5РАБІ БАБМООТМ ІТ СОВАБЕМІЕ
ЗМУ АМУООКРОКОРКІ І МУМТКТІ АгСаМРБ о
МЛ клону МАБ2 ВЕЗО5О5СТОЕВІ ТІЗ5І ОРЕОРО5УУСОН ЕС р Мол7
НУСаТРЕТЕРОа5ИткКіІ БІК
РІОМТО5РАБІ БАБМООВМТІТСВАБЕМІЕ
ЗМУ АМУООКРОКОРКІ І МУМТКТІ АгСаМРБ о
Міла клону МАБ2 ВЕЗО5О5СТОЕВІ ТЗІ ОРЕОРАТУУСОН ЕС Ю МОЗ
НУСаТРЕТЕРОа5ИткКіІ БІК
РІОМТО5РАБІ БАБМООВМТІТСВАБЕМІЕ
ЗМУ АМУООКРОКОРКІ ЇЇ МУМТ АТ АгСМРБ о
МіЛе клону МАБ2 ВЕЗО5О5СТОЕВІ ТЗІ ОРЕОРАТУУСОН ЗО о МО29
НУСаТРЕТЕРОа5ИткКіІ БІК
РІОМТО5РАБІ БАБМООТМ ІТ СОВАБЕМІЕ
ЗМУ АМУООКРОКОРКІ ЇЇ МУМТ АТ АгСМРБ о
Міла клону МАБ2 ВЕЗО5О5СТОЕВІ ТІЗ5І ОРЕОРО5УУСОН ЗБОЮ МО 55
НУСаТРЕТЕРОа5ИткКіІ БІК
Приклад 6.2. Послідовність гуманізованого тАб до СЕАСАМ5
На основі амінокислотних послідовностей варіантів Мі їі МН іп 5йїйсо одержували послідовності нуклеїнових кислот і синтезували за допомогою Сепеагї. Послідовності клонували в експресуючі вектори в злитті з кодуючими послідовностями константних доменів ЇдС1 людини або Скаппа людини, відповідно.
Приклад 6.3. Одержання і характеристика іп міго
Одержували партії гуманізованих тАБ за допомогою транзиторної експресії в НЕК293 і очищали за допомогою афінної хроматографії з білком А. Структуру й ідентичність підтверджували за допомогою аналізів на основі хХО5-РАСЕ, ексклюзійної хроматографії і мас- спектрометрії.
Афінність відносно СЕАСАМ5 людини і яванського макака підтверджували за допомогою
ЕПЗА, ЕСзо надані в таблиці 13.
Таблиця 13
Афінність гуманізованого тАр до СЕАСАМ5 людини і до СЕАСАМ5 яванського макака нин СЕАСАМ5 людини СЕАСАМ?5 яванського макака
ЕСтво (НМ) ЕСво (НМ) пиМАБ2-1 | МАБ2гМІТУНІ-ІдО пимАБ2-3 | МАБ2. МтеУНта-дев пимАбБ2-4 | МАБ2. Міламні-деї спмАр2 |МАБ2-ІдС1
Специфічність до СЕАСАМО людини у порівнянні з СЕАСАМІ, СЕАСАМб, СЕАСАМУ і
СЕАСАМВ8 людини підтверджували за допомогою ЕГІЗА. Її реєстрували як відсоток зв'язування в порівнянні з повним зв'язуванням з СЕАСАМ5 людини, див. таблицю 14.
Таблиця 14
Відсоток зв'язування гуманізованого тАб до СЕАСАМ5 з СЕАСАМ людини пннпІ"к?шжкцєєшюнншшші "СЕА
САМ5 | САМІ | САМб6 | САМ7 / САМВ пиИМАБ2- 1 МАБ2 МІ ТУНІ-Іда 100 95 пиМАБ2-2 МАБ2 МІ тамнНта-дс 100 95 пиИМАБ2-3 МАБ2. МІ ТсУНта-Іда1 100 95 пиИМАБ2-4 МАБ2 МІламні-їіда1 100 95 спМАра МАБ2-ІдДС1 100 Фе
Епітопзв'язувальний домен підтверджували за допомогою ЕГІЗА і продемонстрували, що гуманізовані варіанти специфічно розпізнавали домен АЗ-В3. Його реєстрували як відсоток зв'язування в порівнянні з повним зв'язуванням з СЕАСАМ5 людини у таблиці 15.
Таблиця 15
Відсоток зв'язування гуманізованого тАб до СЕАСАМ5 з доменами СЕАСАМ5 людини пнншНЕШЕНИНВОВВВВННИ ПСЕАСАМ5
М-ег-АТ-ВІ до-В2 АЗ-ВЗ пиИМАБ2- 1 МАБ2 МІ ТУНІ-Іда 100 95 пиМАБ2-2 МАБ2 МІ тамнНта-дс 100 95 пиИМАБ2-3 МАБ2 МІ ТсУНта-Іда1 100 95 пиИМАБ2-4 МАБ2 МІламні-їіда1 100 95 спМАра МАБ2-ІдДС1 100 9
Кінетику зв'язування гуманізованих варіантів МАБ2 до СЕАСАМ5 у порівнянні з химерним
МАБ2, рекомбінантним СЕАСАМ5 людини (ПСЕАСАМ5) і СЕАСАМ5 яванського макака (ССЕАСАМ5) визначали за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу з використанням ВіАсоге 2000 (ВіІАсоге Іпс., Оррзаїа, МУ).
Коротко, біосенсорний чип СМ5 ВіАсоге закріплювали в пристрої й активували 70 мкл
МНБЗ/ЕЮОС 1:11 при кімнатній температурі. Для всіх потоків клітин на активованих чипах іммобілізували ДС миші до Ес людини (ВіАсоге ЖВЕ-1008-39) (50 мкг/мл у 1М ацетатному буфері, рН-5). Іммобілізацію проводили при швидкості потоку 10 мкл/хв. до насичення. Потім чип блокували за допомогою ін'єкції 70 мкл етаноламіну-НСІ, рН-8,5, з наступним одним відмиванням ЗМ МосСі». Для вимірювання зв'язування тАб до СЕАСАМ5 з білюм СЕАСАМ5 людини або білоюм СЕАСАМ5 яванського макака антитіла використовували при 1-5 мкг/мл у рухомому буфері ВіІАсоге (НВ5-ЕР). Антигени (СЕАСАМ5О людини або СЕАСАМ5 яванського макака) ін'єккгували в концентрації від 1 до 500 нМ. Після завершення фази ін'єкції контролювали дисоціацію в рухомому буфері ВіАсоге при тій же швидкості потоку протягом 600 сек. Між ін'єкціями поверхню регенерували з використанням 2х5 мкл МоСі» ЗМ (2х30 сею.
Окремі сенсограми аналізували з використанням програмного забезпечення ВіАемаїчаїоп.
Таблиця 16
Зв'язування гуманізованого тАб до СЕАСАМ5 з СЕАСАМ5 людини і мавпи в СЕАСАМ5 людини СЕАСАМ?5 яванського макака
Ко (НМ) Ко (нм) пиМАра-1 19811111 пиМАра-2 11112451 Ї71117171717171711119601 пиМАбБа-З пиМАБ2-4 771111171698 1... 386 щЩщ спМАра нини хни
Специфічність гуманізованих варіантів МАБ2 до СЕАСАМ5 у порівнянні з химерним МАБ2 до
СЕАСАМ5 яванського макака в порівнянні з СЕАСАМІ, СЕАСАМб і СЕАСАМ8 яванського макака підтверджували за допомогою ЕГ І5А. Її реєстрували як відсоток зв'язування в порівнянні з повним зв'язуванням з СЕАСАМ5 або зв'язуванням при ЕСозо, див. таблицю 17 нижче.
Таблиця 17
Відсоток зв'язування гуманізованого тАб до СЕАСАМ5 з СЕАСАМ яванського макака 11111111 СЕ,» яванськогомакака.їд///УЗО
Приклад 6.4. Характеристика гуманізованих варіантів Мар2, одержуваних за допомогою щеплення на каркаси зародкової лінії людини
У цьому прикладі одержували гуманізовані варіанти Мар2 за допомогою щеплення СКО.
Крім того СОЕК гуманізованого антитіла використовували в способі зі скануванням аланіном для демонстрації того, що деякі положення можна заміняти без впливу на зв'язування з СЕАСАМ5 людини і Масаса їазсісціагів.
Спочатку одержували послідовність гуманізованої версії Маб2 іп 5іїсо за допомогою відбору каркасів зародкової лінії людини на основі структурної гомології з антитілом МАБ2 миші. Для легкого ланцюга відібрані каркаси, що належать людині, визначають гени І2КМ10-39701 і
І2КОг"02, і для важкого ланцюга - гени І2НМУЗ3-23704 і ІЖНОУ4"О1. У ці каркаси, що належать людині, прищеплювали шість СОК Мабакогв. Вносили три зворотних мутації, що відповідають положенням 34 і 53 у МІ (ЗЕО ІО МО:34) (області ЕК2-Ї і ЕКЗ-Ї,, відповідно) і положенню 50 у
МН (ЗЕО ІО МО:33) (область ЕК2-Н), з одержанням наведеної нижче послідовності, визначеної як МАБ2 МІ д5УНаог.
Таблиця 18
Послідовності МН і МІ МАБ2 Мі д5МНаг
ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААБИЕМЕЗЗУЮОМЗУМВОА
МАБ2 УНаг РаКагЕМУЗМ5ЗИСИаТ УМА УКаВЕТІЗВОМЗКМТІ МІ. ЗЕО ІЮ МО:74
ОММ5ЗІ ВАЕОТАУУУСААНУгРаЗЗаРЕАУМ СсОСТІ МТУ
РІОМТО5РБОБІ БАБМАО ВМТ СВАЗЕМІЕЗМІ АММООКРОКА
МАБ2 МІ 95 РКИММТ ВТ О5аМРЗАЕЗ аЗаБатОвТІ ТЗІ ОРЕОЕБАТУМ | БЕО ІЮ МО:75
СОонННУаХтТРЕТЕРСОСТКІ ЕК
Одержували декілька варіантів МАБ2 М д5МНЯД2 за допомогою одиничної заміни кожної амінокислоти шести СОК, переважно аланіном. Коли аланін вже знаходився в СОК
МАБ2 МІ д5УНОг, що має місце в Н-СОКЗ, заміняли іншу амінокислоту (Ма! у залишку 97, Агд у залишку 98 і Азр у залишку 108 5ЕО ІЮО МО:74).
На основі амінокислотних послідовностей варіантів МІ. ї МН іп 5іїсо виводили послідовності нуклеїнової кислоти й одержували за допомогою генного синтезу. Послідовності клонували в експресуючий вектор ссавців у злитті з кодуючими послідовностями константних доменів даси людини або Скаппа людини, відповідно. Гуманізоване МАБ2 МІ д5УНаОг, окремі варіанти, що відрізняються від нього одним положенням, і обмежену кількість комбінаційних мутантів одержували за допомогою транзиторної експресії в клітинах НЕК293. Супернатанти клітин, що містять секретовані Ідсї (20-70 мкг/мл), розбавляли до 1 мкг/мл для використання в аналізах зв'язування з ЕСО СЕАСАМ5 людини, ЕСО Масаса Тавсісшагіє і доменом АЗ-В3 СЕАСАМ5 людини.
Для оцінки впливу цих модифікацій визначали зв'язування Ідс, вимірюючи сигнали РЕ. з використанням пристрою Віасоге Т200 (СЕ Неакййсаге). Антитіла до Ес людини зв'язували з чипом бегіе5 5 СМ5 за допомогою набору для зв'язування амінів з досягненням рівня 10000 одиниць відповіді (РЕ). Захоплювали приблизно від 300 до 600 РЕ кожного варіанта за допомогою ін'єкції супернатантів при 1 мкг/мл з часом контакту 60 секунд і швидкістю потоку 10 мкл/хв. Всі експерименти проводили при 25 "С з НВ5-ЕР-- (10 мМ Нерез, 150 мМ Масі, З мм
ЕОТА, 0,05 95 поверхнево-активна речовина Р20) як рухомим буфером. У режимі скринінгу,
СЕАСАМ5 людини/СЕАСАМ5 яванського макака/уддомен АЗ-ВЗ3 людини ін'єктували при 50 нм над захопленими варіантами Ід: при швидкості потоку 30 мкл/хв. протягом 1 хвилини.
Підтримували фазу дисоціації протягом 60 секунд з наступною регенерацією поверхні 1 імпульсною ін'єкцією ЗМ МоСі2 при швидкості потоку 10 мкл/хв. і часом контакту 30 секунд.
Для кожного експерименту дані відповіді обробляли з використанням контрольної поверхні, таким чином, забезпечуючи корекцію на зміни об'ємного коефіцієнта заломлення і будь-яке неспецифічне зв'язування. Дані другий раз співвідносили з використанням відповіді порожніх ін'єкцій. Згідно зі способом скринінгу, описаним у примітці до заявки СЕ Неаййсаге (Арріїсайоп поїе 28-9777-72 АА), розглядали два параметри для ранжирування варіантів відносно характеристик зв'язування. Першою розраховували активність зв'язування за допомогою розрахунку частки від теоретичного максимального вимірюваного сигналу (відсоток від Куакс, див. фіг. 16). Другим розраховували відсоток залишкового сигналу з використанням контрольних точок дисоціації (перша через 10 секунд після закінчення ін'єкції і друга через 50 секунд після закінчення ін'єкції), і він відображує стабільність зв'язування (див. фіг. 17).
Еквівалентні параметри зв'язування в порівнянні з вихідним антитілом продемонстрували варіанти з одиночною заміною на аланін у зазначених нижче положеннях, що вказує на те, що амінокислоти СОК у цих положеннях нейтральні для зв'язування: залишки І С 27, 28, 29, 31, 51, 52, 89, 90, 93, 94, 96, 97 і залишки НС 26-31, 51-58, 97, 103, 104, 107, 109. Поведінка цих варіантів відносно СЕАСАМ5 людини і мавпи є подібною, зберігаючи, таким чином, їх перехресну реактивність. Виявлено, що зв'язування з доменом АЗ-В3 СЕАСАМ5 також не було зачеплене. Також одержані визначені комбінації двох нейтральних замін і виявлено, що вони приводять до незмінних параметрів зв'язування, як проілюстровано асоціацією С ТАТА з
ЇС Т94А, ІС 5ЗІАзНС о54Мабо1сС Т53Із НС 553А.
Ї навпаки, виявлено, що у всіх інших положеннях СОК, заміна аланіном вихідної амінокислоти індукувала повну втрату зв'язування або суттєво змінювала параметри
Зо зв'язування. Прикладами є положення 101 важкого ланцюга або положення 32 і 91 легкого ланцюга (представлені на фіг. 16 і 17). Другий набір варіантів полягав у тестуванні більш консервативних мутацій у деяких таких положеннях. Зробивши це, автори знайшли, що нейтральними для зв'язування антитіла є наступні консервативні заміни: Туг для Рпе у залишку
МАБ2 Мі 15, Ріє для Туг у залишку 92 МАБ2 МІ95, Зег для Аа у залишку 98 МАБ2 МНО?г і
Рпє для Туг у залишку 100 МАБ2 УНО2 (представлені на фігурах).
Приклад 7. Кон'югати гуманізованих варіантів МАБ2 з лікарськими засобами
Приклад 7.1. Одержання і характеристика
ПиМАБ2-2-5208-ОМ4
Аналітичні дані:
Му(АБ)-147360 г/моль; МИ(ОМа4)-780,38 г/моль,
Єгво нм(Аб)-201400; єЄгво нм(Аб)- 71693,
Єгво ни(ОМ4)-5180; Єгво н(ОМ4)-26159.
При перемішуванні, при КТ у посудину додавали 19,4 мг пимМАбБ2-2 (С-5,1 мг/мл у буфері
РВ5 з рнН-7,4) з наступним додаванням 0,375 мл ОМА і 0,0439 мл розчину лінкера нітро-5РОВ (5,0 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Розчин перемішували на центрифузі "вортекс" протягом 30 сек і потім повільно перемішували при КТ протягом 2 годин. Додавали додатковий об'єм 0,0044 мл розчину лінкера нітро-ЗЗРОВ (5,0 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Через 2 години при КТ при перемішуванні на магнітній мішалці послідовно додавали 2 мл буфера РВЗ з рН-7,510,0702 мл розчину ЮМ4 (15 мМ розчин у ОМА). Через 2 години при КТ неочищену реакційну суміш фільтрували на 0,45 мкм фільтрі й очищали на знесолюючій колонці НіРгер 26/10 (Зерпадех 625, СЕ Неайсаге), попередньо витримували з 1 СМ 1М Маон, 2 СМ води і 2 СМ буфера з гістидину (10 мМ), гліцину (130 мМ), сахарози (5 95), рН-5,5. Кон'югат елюювали буфером з гістидином (10 мМ), гліцином (130 мМ), сахарозою (5 95), рН-5,5, і фракції мономерних кон'югатів об'єднували і фільтрували на 0,22 мкм фільтрі.
Таким чином, одержували 10,3 мл кон'югата пПимМАбр2-2-5РОШЮВ-ОМА (с-1,35 мг/мл) у вигляді безбарвного прозорого розчину. Потім кон'югат аналізували на кінцеве навантаження лікарського засобу і чистоту мономерів: ОАК (0ОМ)-3,7; АК (ЗЕС)-3,6; КТ-17,29 хв.; чистота мономерів-97,9 90.
Результат аналізу НКМ5 представлений на фіг. 12. (510) ПиМАБВБ2-1-56208-ОМА
Аналітичні дані:
Му(АБ)-147563 г/моль; МИ(ОМа4)-780,38 г/моль,
Єгво нм(Аб)-201400; є252 нм(Ар)-69669,
Єгво ни(ОМ4)-5180; є252 нм(ЮОМ4)-26159.
При перемішуванні, при КТ у посудину додавали 3,8 мл розчину ПИМАбБ2-1 (С-5,08 мг/мл у буфері РВ5 з рН-7,4) з наступним додаванням 0,341 мл ОМА і 0,0392 мл розчину лінкера нітро-
ЗРОВ (4,5 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Розчин перемішували на центрифузі "вортекс" протягом 30 сек і потім повільно перемішували при КТ протягом З годин. Додавали додатковий об'єм 0,0087 мл розчину лінкера нітро-5РОВ (1,0 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Через 2 години при КТ при перемішуванні на магнітній мішалці послідовно додавали 2,62 мл буфера РВ5 з рн-7,5, 0,254 мл ОМА і 0,076 мл розчину ОМА (15 мм розчин у ОМА). Через 1 годину при КТ неочищену реакційну суміш фільтрували на 0,45 мкм фільтрі й очищали на знесолюючій колонці НіРгер 26/10 (Берпадех 525, СЕ Неайсаге), попередньо витримували з 1 СМ 1М Маон, 2 СМ води і 2
СМ буфера з гістидину (10 мМ), гліцину (130 мМ), сахарози (5 95), рН-5,5. Кон'югат елюювали буфером з гістидину (10 мМ), гліцину (130 мМ), сахарози (5 95), рН-5,5, і фракції мономерних кон'югатів об'єднували і фільтрували на 0,22 мкм фільтрі.
Таким чином, одержували 9,5 мл кон'югата пиИмМАБб2-1-5Р08-0М4 (с-1,35 мг/мл) у вигляді безбарвного прозорого розчину. Потім кон'югат аналізували на кінцеве навантаження лікарського засобу і чистоту мономерів: ОАК (0ОМ)-4,1; АК (ЗЕС)-4,0; КТ-17,39 хв.; чистота мономерів-96, 7 90.
Результат аналізу НКМ5 представлений на фіг. 13.
ПиМАБ2-3-5РОВ-ОМА.
Аналітичні дані:
Му(АБ)-147417 г/моль; МИ(ОМа4)-780,38 г/моль,
Єгво нм(Аб)-201400; є252 нм(АБ)- 71451,
Єгво ни(ОМ4)-5180; є252 нм(ЮОМ4)-26159.
При перемішуванні, при КТ у посудину додавали 3,8 мл розчину ПИМАБ2-3 (С-5,09 мг/мл у буфері РВ5 з рН-7,4) з наступним додаванням 0,336 мл ОМА і 0,0437 мл розчину лінкера нітро-
ЗРОВ (5 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Розчин перемішували на центрифузі "вортекс" протягом 30 сек і потім повільно перемішували при КТ протягом З годин. Додавали додатковий об'єм 0,0035 мл розчину лінкера нітро-5РОВ (0,4 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Через 1 годину при КТ при перемішуванні на магнітній мішалці послідовно додавали 2,60 мл буфера РВЗ з рН-7,5, 0,248 мл ОМА ії 0,074 мл розчину ОМА (15 мМ розчин у ОМА). Через 1 годину при КТ неочищену реакційну суміш фільтрували на 0,45 мкм фільтрі й очищали на знесолюючій колонці НіРгер 26/10 (Берпадех 025, СЕ Неаїсаге), попередньо витримували з 1 СМ 1М Маон, 2 СМ води і 2
СМ буфера з гістидину (10 мМ), гліцину (130 мМ), сахарози (5 95), рН-5,5. Кон'югат елюювали буфером з гістидину (10 мМ), гліцину (130 мМ), сахарози (5 95), рН-5,5, і фракції мономерних кон'югатів об'єднували і фільтрували на 0,22 мкм фільтрі.
Таким чином, одержували 11 мл кон'югата пимМАБ2-3-5РОВ-ЮОМА (с-1,08 мг/мл) у вигляді безбарвного прозорого розчину. Потім кон'югат аналізували на кінцеве навантаження лікарського засобу і чистоту мономерів: ОАК (0ОМ)-3,9; АК (ЗЕС)-3,8; КТ-17,44 хв.; чистота мономерів-98,4 90.
Результат аналізу НКМ5 представлений на фіг. 14.
ПиМАБ2-4-5РОВ-ОМА
Аналітичні дані:
Му(АБ)-147628 г/моль; МИ(ОМа4)-780,38 г/моль,
Єгво нм(АБ)-201400; є252 нм (АБ)- 70628,
Єгво ни(ОМ4)-5180; є252 нм(ЮОМ4)-26159.
При перемішуванні, при КТ у посудину додавали 3,8 мл розчину ПИМАбБ2-4 (С-5,09 мг/мл у буфері РВЗ з рН-7,4) з наступним додаванням 0,345 мл ОМА і 0,0448 мл розчину лінкера нітро-
ЗРОВ (5 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Розчин перемішували на центрифузі "вортекс" протягом 30 сек і потім повільно перемішували при КТ протягом З годин. Додавали додатковий об'єм 0,0027 мл розчину лінкера нітро-5РОВ (0,3 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Через 1 годину при КТ при перемішуванні на магнітній мішалці послідовно додавали 2,70 мл буфера РВЗ з рН-7,5, 0,263 мл ОМА ї 0,075 мл розчину ОМА (15 мМ розчин у ОМА). Через 1 годину при КТ неочищену реакційну суміш фільтрували на 0,45 мкм фільтрі й очищали на знесолюючій колонці НіРгер 26/10 (Берпадех 525, СЕ Неайсаге), попередньо витримували з 1 СМ 1М Маон, 2 СМ води і 2
СМ буфера з гістидину (10 мМ), гліцину (130 мМ), сахарози (5 95), рН-5,5. Кон'югат елюювали буфером з гістидину (10 мМ), гліцину (130 мМ), сахарози (5 95), рН-5,5, і фракції мономерних бо кон'югатів об'єднували і фільтрували на 0,22 мкм фільтрі.
Таким чином, одержували 11 мл кон'югата пПимМАБбБ2-4-5РОВ-ОМА (с-1,23 мг/мл) у вигляді безбарвного прозорого розчину. Потім кон'югат аналізували на кінцеве навантаження лікарського засобу і чистоту мономерів: ОАК (ОМ)-3,8; АК (ЗЕС)-3,8; КТ-17,53 хв.; чистота мономерів-99,3 90.
Результат аналізу НКМ5 представлений на фіг. 15.
Приклад 7.2. Цитотоксичність іп міго
Матеріали і методи
Оцінювали дію кон'югатів антитіл до СЕАСАМ5О з майтанзиноїдами на життєздатність пухлинних клітин, як описано в прикладі 3.4.
Результати
Таблиця 19
Цитотоксична активність специфічних до
СЕАСАМ5 гуманізованих АОС відносно СЕАСАМС5 -- лінії клітин МКМА5
Ці кон'югати спПмМАбБ2г-5РОВ-ОМА4, пиМАБ2-1-5208-0М4,. пиМАБр2-2-5РОВ-ОМА ї пиМАБ2-3-
ЗРОВ-ОМА і неспоріднений кон'югат з ОМА продемонстрували цитотоксичну активність відносно клітин МКМ45 у культурі іп міго з ІСво 0,24, 0,18, 0,23, 0,16 і 8,52 нМ, відповідно. Цитотоксична активність кон'югатів з антитілами до СЕАСАМ5 була в 53-35 разів нижче, ніж вимірювана активність неспорідненого кон'югата з ОМ4, що вказує на опосередковувану СЕАСАМ5 цитотоксичну активність кон'югатів з антитілами до СЕАСАМ5.
Приклад 7.3. Ефективність іп мімо проти первинних пухлин товстого кишечнику СК-ІСА-ОЗАР, п/ш імплантованих самкам голих мишей СО-1
Матеріали і методи
Дві гуманізовані послідовності у вигляді кон'югатів ПИМАб2-3-5Р08-ОМА4 ї пПиМАБ2-4-5Р08-
ОМА оцінювали на 4 рівнях дозування в порівнянні з СИМАБ2-5РОВ-ЮОМА відносно вимірних первинних пухлин товстого кишечнику СВ-ІС2В8-034Р, п/ш імплантованих самкам голих мишей
СО-1. Контрольні групи залишали без обробки. Дози кон'югатів наведені в мг/кг. Їх вводили в дозах 10, 5, 2,5 і 1,25 мг/кг за допомогою внутрішньовенної (в/в) болюсної ін'єкції на добу 19 після імплантації пухлини.
Оцінку токсичності й ефективності проводили, як описано в прикладі 5.
Результати
Зо Результати представлені на фіг. 5 і в таблиці 20 (нижче).
При використанні схеми з одним введенням у дозах 1,25, 2,5, 5 і 10 мг/кг усі кон'югати, тестовані в цьому дослідженні, не викликають токсичності.
ПиМАБ2-4-5РОВ-ОМА ї СПМАВБ2-5РОВ-ОМА були високоактивними при 10 мг/кг з АТ/АС -4 95 (р-«0,0001 у порівнянні з контролем) і регресом пухлини 21 і 19 95, відповідно, активними при 5 мг/кг з АТ/АС 12 (р-0,0105 у порівнянні з контролем) і 17 Фо (р-0,0417 у порівнянні з контролем), відповідно, і мінімально активними при 2,5 мг/кг з ДТ/ДС 36 і 37 95 (несуттєві в порівнянні з контролем), відповідно, і неактивними при 1,25 мг/кг. пиИМАБрБ2-3-5РОВ-ОМА був високоактивним при 10 мг/кг з ДТ/АС - 6 95 (р«е0,0001 у порівнянні з контролем) і регресом пухлини 31 95, дуже активним при 5 мг/кг з АТ/АС 4 905 (р«0,0001 у порівнянні з контролем), активним при 2,5 мг/кг з
АТ/ДАС 12 (р-0,0322 у порівнянні з контролем) і мінімально активним при 1,25 мг/кг, АТ/ДАС 34 9о (не значимо в порівнянні з контролем).
На основі цих результатів гуманізовані послідовності пПИМАБбБ2-3-5РОВ-ОМА4 і пимМАБ2-4-
ЗРОВ-ОМА4 придатні для розробки терапевтичних АОС. З двох послідовностей кращою була
ПиМАБ2-3-5РОВ-ОМА.
Таблиця 20
Оцінка протипухлинної активності кон'югатів пПиИМАрБ2-3-5Р0В-ОМА,
ПиМАВр2-4-5РОВ-ОМА ї спМАБбБ2-5РОВ-ОМА проти первинної аденокарциноми товстої кишки людини СК-ІСН-034Р у самок мишей СО-1
Викли- Середня кана зміна
Доза лікар- маси
Шплях/ в Схе- | ським тіла в 95 ІСереднє Серед- Біоста- . мг/кг на мишу|АтТ/АСві ній 90 тичне .
Засіб' |Доза в ма в | засо- нм о Част- |Пов- Коментарі мл/кг, Я |добах| бом | НИЖНІЙ ж регресу) вий ний| За: ін'єк- заги- | ТОЧЦІ (доба) | (доба) чення р- цію бель (доба . (доба) нижньої точки) -7,3 Високо- 4092) 19 (ов) т00от адивний -4,5 й .
ЗРОВ- (10 до Мінімаль- рма4 мл/кг)| 2,5 | 19 0/6 (020) 36 (032) 0/6 | 0/6 | н.з. но актив- ний 125 19 | 0/6 | до (032) 0/6 |0/6 /н.. | Неактив- ' рго й ний -4,3 Високо- (095) 31 (ов) т00от адивний -3,3 Дуже 3-5РОВ- | (10 -5,4 й . 30 Мінімаль- 1251 19 0/6 й 34 (038) 0/6 | 0/6 )| н.з. но актив- (027) й ний 10 | 19 0/6 3, -4 (032)|21(032)| 2/6 | 0/6 | «0,0001 Дуже ргг " активний -3,2 Ш Дуже 4-5РОВ- | (10 ЗА Мінімаль- рма4 мл/кг)| 2,5 | 19 0/6 (020) 37 (032) 0/6 | 0/6 | н.з. но актив- ний -2,8 Неактив- таволе | о роду воював обняв
Конт- 19 - 3,9 роль рга 1ї"Склад лікарського засобу: НОБЗ (10 мМ гістидин, 130 мМ гліцин, 5 95 об./об. сахароза, 0,01 95
Тмееп-80) рН 7,4. гЗначення р: критерій Даннета в порівнянні з контролем після 2-стороннього дисперсійного аналізу з повторними вимірюваннями перетворених в ранги змін об'єму пухлин від вихідного рівня. н.3.: не значимо.
Приклад 7.4. Ефективність іп мімо проти первинних пухлин шлунка 5ТО-ІМО-006, п/ш імплантованих самкам мишей 5СІЮ
Матеріали і методи
Гуманізований кон'югат пиМАБ2-3-5РОВ-ОМ4 оцінювали на З рівнях дозування проти вимірних первинних пухлин шлунка 5ТО-ІМО-006, п/ш імплантованих самкам мишей СІЮ.
Контрольні групи залишали без обробки. Дози кон'югатів наведені в мг/кг. Їх вводили в дозах 10, і 2,5 мг/кг за допомогою внутрішньовенної (в/в) болюсної ін'єкції на добу 27 після імплантації пухлини.
Оцінку токсичності й ефективності проводили, як описано в прикладі 5. 5 Результати
При використанні схеми з одним введенням у дозах 2,5, 5 і 10 мг/кг, пимМАб2-3-5РОВ-ОМА не індукує токсичності.
Як представлено на фіг. 6 і в таблиці 21, пиИмМАБ2-3-5РОВ-ОМА був дуже активним при 10 мг/кг з ДТ/АС 7 9о (р«е0,0001 у порівнянні з контролем), активним при 5 мг/кг з АТ/ДС 36 95 (р-0,0281 у порівнянні з контролем) і неактивним при 2,5 мг/кг.
Таблиця 21
Оцінка протипухлинної активності кон'югатів пПиИМАрБ2-3-5РОВ-ОМА проти первинної аденокарциноми шлунка людини 5ТО-ІМО-006 у самок мишей ЗСІЮ
Викли- Середня кана зміна
Доза лікар- маси тіла Серед-
Ш в |Схе- вона ІСереднє!| 5 Біоста- . лях мг/кгІма в СРКИМ | Мущув Т/с ві| Й й тичне | Комен-
Засіб! Доза в засо- У о ре- |Част-|Пов- : мл/кг |. а |до | бом ) НИЖНІЙ й гресу ковий! ний |СМ9- тарі ін'єк- | бах точці (доба) чення р- . заги- (доба) цію бель (доба . (доба) нижньої точки) серирее рев тю ов ово 101271 0/6 й 7 (034) 0/6 | 0/6 | «0,0001 | актив- (045) й
ПиМАБ2-3- ний
ЗРОВ- в/в (10 Актив- 255 ов вет З |о6ро6 ее -2,5 ото || в с | 111 "Склад лікарського засобу: НОБ (10 мМ гістидин, 130 мМ гліцин, 5 95 об./об. сахароза, 0,01 95
Тмееп-80) рН 7,4. гЗначення р: критерій Даннета в порівнянні з контролем після 2-стороннього дисперсійного аналізу з повторними вимірюваннями перетворених в ранги змін об'єму пухлин від вихідного рівня. н.3.: не значимо.
Приклад 7.5. Ефективність іп мімо проти первинних пухлин легень ГШМ-МІС-0014, п/ш імплантованих самкам мишей 5СІЮ
Матеріали і методи
Гуманізований кон'югат пимМАБбБ2-3-5РОВ-ОМ4 оцінювали на З рівнях дозування відносно вимірних первинних пухлин легень ГШМ-МІС-0014, п/ш імплантованих самкам мишей 5СІЮ.
Контрольні групи залишали без обробки. Дози кон'югата наведені в мг/кг. Його вводили в дозах 10, 5 ї 2,5 мг/кг за допомогою внутрішньовенної (в/в) болюсної ін'єкції на добу 29 після імплантації пухлини.
Оцінку токсичності й ефективності проводили, як описано в прикладі 5.
Результати
При використанні схеми з одним введенням у дозах 2,5, 5 і 10 мг/кг, пимМАб2-3-5РОВ-ОМА не індукував токсичності.
Як представлено на фіг. 18 і в таблиці 22, пиМАБ2-3-5РОВ-ЮОМА був високоактивним при 10 і 5 мг/кг з ДТ/АС менше 0 9о (р«0,0001 у порівнянні з контролем) і регресом пухлини 67 і 57 90 відповідно, і активним при 2,5 мг/кг з ДТ/ДС 12 95 (р-0,0363 у порівнянні з контролем).
Таблиця 22
Оцінка протипухлинної активності кон'югата пиМАБ2-3-5РОВ-ОМА проти первинної аденокарциноми легень людини І ОМ-МІС-0014 у самок мишей 5СІЮ викли-| Середня зміна
Доза кана |Уаси тіла Серед-|Серед- лікар- о й .
Шпях/! 8 Схе- ським З ую на нє ній 90 Біоста-
Засіб! Доза в мг/кг | ма в засо- | мишу в АТ/ДС | рег- Част- Пов- тичне Комен- о мл/кг |на | до-| бом | нижній | в | ресуУ овуй|ний ЗНА: тарі ін'єк- | бах точці (доба | (доба чення р- цію запи | (доба 42) | 42) бель . (доба) нижньої точки) активний
ПиИМАБ2-3- | в/в (10 Високо- -0,5 12 0,0363 . 229) ов б ові с | ов) (Одоу Ативний -01 кто | || 1 ва 11111 "Склад лікарського засобу: НОБ (10 мМ гістидин, 130 мМ гліцин, 5 95 об./об. сахароза, 0,01 95
Тмееп-80) рН 7,4. гЗначення р: критерій Даннета в порівнянні з контролем після 2-стороннього дисперсійного аналізу з повторними вимірюваннями перетворених в ранги змін об'єму пухлин від вихідного рівня.
Приклад 7.6. Ефективність іп мімо проти первинних пухлин товстого кишечнику СЕ-ІСВ-ОЗАР, п/ш імплантованих самкам мишей 5СІЮ
Матеріали і методи
Оцінювали три кон'югати, що складаються з гуманізованого ПИМАБ2-3, кон'югованого з ОМА за допомогою двох різних лінкерів (ЗРОВ і сульфо-5РОВ), на 2 рівнях дозування відносно вимірних первинних пухлин товстого кишечнику СЕК-І24НА-034Р, п/ш імплантованих самкам мишей 5СІЮ. Контрольні групи залишали без обробки. Дози кон'югатів наведені в мг/кг. Їх вводили в дозах 5 і 2,5 мг/кг за допомогою внутрішньовенної (в/в) болюсної ін'єкції на добу 19 після імплантації пухлини.
Оцінку токсичності й ефективності проводили, як описано в прикладі 5.
Результати
При використанні схеми з одним введенням у дозах 2,5 і 5 мг/кг, ПИМАБ2-3-5Р08-ОМА і
ПиМАБ2-3-сульфо-5РОВ-ОМА не індукували токсичності.
Як представлено на фіг. 19 і в таблиці 23, пиМАБ2-3-5РОВ-ОМА був активним при 5 і 2,5 мг/кг з АТ/ДС 12 ї 40 905, відповідно (р«0,0001 у порівнянні з контролем), пиМАбБ2-3-сульфо-
ЗРОВ-ЮОМ4 був високоактивним при 5 мг/кг з АТ/АС менше 0 95 (р«е0,0001 у порівнянні з контролем) і регресом пухлини 12 95 і активним при 2,5 мг/кг з ДТ/АС 1 95 (р«0,0001 у порівнянні з контролем).
Таблиця 23
Оцінка протипухлинної активності кон'югатів пПиИМАрБ2-3-5Р08-ОМА і
ПиМАБД2-3-сульфо-5РОВ-ОМА проти первинної аденокарциноми товстої кишки людини
Св-І2В-034Р у самок мишей 5СІЮ викли-| Середня кана зміна с с
Доза в ліка- маси тілауоеред- еред- .
Схе- в У на нє ній 9о Біоста-
Шлях/| мг/кг рським . ма в мишу в |АТ/АС | рег- тичне | Комен-
Засіб' Дозаві| на засо- Не о Част- |Пов- . г. до- нижній в о ресу й -| зна- тарі мл/кг | ін'єк- бом . ковий ний ю бах заги- точці | (доба | (доба чення р-
В бель доба | 34) | 34) (доба) нижньої д точки) 5021 ев ровраюя
ПИМАБ2-3- | в/в (10 Міні-
ЗРОВ'ОМЯ млкд | 25 |ч9| ов |л5(038)|. 40 0/6. | 0/6 | «0,0001 | мально актив- ний
Б 19) 06 | ЮИ.| -0 | 42 | 0/6 | о/в |«0,0001 | Високо:
ПИМАБО-3- рго активний 5РОВ-ОМА | МЛ/КО 5 т 25 |19| ов | 2 0/6 | 0/6 | 0,0306 | "актив" рго ний -0,5 кто | | 1 | 1 ва | 1111 1ї"Склад лікарського засобу: НОЗ (10 мМ гістидин, 130 мМ гліцин, 5 95 об./0б6. сахароза, 0,01 95
Тмееп-80) рН 7,4. г2Значення р: критерій Даннета в порівнянні з контролем після 2-стороннього дисперсійного аналізу з повторними вимірюваннями перетворених в ранги змін об'єму пухлин від вихідного рівня.
Приклад 8. Розробка імуногістохімічного (ІНС) протоколу, призначеного для детекції білка
СЕАСАМ5 людини і мавпи у фіксованих у формаліні і занурених у парафін (ЕЕРЕ) тканинах
Матеріали і методи
Тканини
Як джерело тканин людини (пухлинних і непухлинних), а також яванського макака (нормальних) використовували мікропанелі тканин РЕЕРЕ (ТМА, таблиця 24).
Таблиця 24
Мікропанелі фіксованих у формаліні і занурених у парафін тканин, використовувані як джерело тканин ! Мікропанель нормальних тканин мавпи Супо, 33 органи, узяті у
Панель тканин раку товстого кишечнику, 150 зразків
СОсС1501 Рапіотісв нормальних/доброякісних (5 зразків) і злоякісних (70 зразків) тканин
Панель тканин раку товстого кишечнику, 150 зразків
СОосС1502 Рапіотісв нормальних/доброякісних (5 зразків) і злоякісних (70 зразків) тканин
Панель тканин раку товстого кишечнику, 150 зразків
СОосС1503 Рапіотісв нормальних/доброякісних (5 зразків) і злоякісних (70 зразків) тканин . 40 типів пухлин, що містять доброякісні, злоякісні і метастатичні
Панель тканин раку легень, 150 зразків
ГОС1501 Рапютісв нормальних/доброякісних (5 зразків) і злоякісних (70 зразків) тканин
Панель тканин раку легень, 150 зразків
ГОС1502 Рапютісв нормальних/доброякісних (5 зразків) і злоякісних (70 зразків) тканин
Панель тканин раку легень, 150 зразків
ГОС1503 Рапютісв нормальних/доброякісних (5 зразків) і злоякісних (70 зразків) тканин тестування перехресної реактивності антитіл тестування перехресної реактивності антитіл тестування перехресної реактивності антитіл
Панель тканин раку підшлункової залози містить 20 зразків
РАСА81 Рапютісв злоякісних пухлин і 4 зразки нормальних і незлоякісних тканин підшлункової залози зразків, що не є неоплазією пухлин і 8 зразків, що не є неоплазією пухлин і 8 зразків, що не є неоплазією
Панель тканин різних злоякісних пухлин з відповідними
АЗОТ(ІМ) Асситах нормальними тканинами (30 зразків злоякісних пухлин, 30 зразків, що не є неоплазією зразків)
Панель з 59 зразків, що містить 9 або 10 нормальних зразків
МАМ2 зЗиретіоспірб шлунка, стравоходу, легень, колоректальних тканин, щитовидної залози і нирок
Панель з 59 зразків, що містить 9 або 10 зразків раку шлунка,
МАг зЗиретіоспірб стравоходу, легень, колоректального раку, раку щитовидної залози і нирок бо
Продовження Таблиці 24
Панель з 59 зразків, що містить 9 або 10 нормальних зразків
ММА зЗиретіоспірб молочної залози, печінки, сечового міхура, яєчника, підшлункової залози, передміхурової залози
Панель з 59 зразків, що містить 9 або 10 зразків молочної
Ма зЗиретіоспірб залози, печінки, сечового міхура, яєчника, підшлункової залози, раку передміхурової залози 1. Панель з 59 зразків, що містить 9 або 10 нормальних зразків
Панель з 59 зразків, що містить 9 або 10 зразків раку
Мо4 зЗиретіоспірб ендометрія, жовчного міхура, гортані, шийки матки, лімфоми, меланоми кишки і прямої кишки 1. Панель з 59 зразків, що містить 59 зразків нормальної легені нормальних, реактивних і злоякісних тканин шлунка нормальних, реактивних і злоякісних тканин шлунка нормальних, реактивних і злоякісних тканин шлунка
Панель тканин раку шлунка, 16 зразків, 48 зразків, один
ЗТС481 Рапютісв нормальний парний із двома зразками пухлинної тканини від кожного пацієнта
Антитіла
Як первинне моноклональне антитіло миші до СЕАСАМ5 людини використовували МАбБ2. Як вторинне антитіло використовували кон'юговані з біотином антитіла кози до ІдС1 миші (специфічні до ланцюга ут) (посилання 1070-08, партія І 4309-Х761, 5ошпНет Віоїєсн, ОА).
Імунозабарвлення
Застосовували спосіб демаскування антигену з використанням буфера СеїЇ Сопайіопіпо 1 (СС1) при 95 "С протягом 8 хв., і потім при 100 "С протягом 28 хв. Після стадії блокування ендогенного біотину, стекла інкубували з первинним антитілом до антитіла, розведеним у забуференому фосфатом сольовому розчині (РВ5) при 5 мкг/мл протягом 2 годин при 24 с.
Вторинне антитіло кози до антитіл миші, кон'юговане з біотином, інкубували при 24 "С протягом 32 хвилин при 0,5 мкг/мл. Імунозабарвлення проводили з використанням тетрагідрохлориду 3,3- діамінобензидину (АВ) з набору хромогенної детекції ПОАВвВМар"м (760-124, Мепіапа Медісаї!
Зузіетв, Іпс, ОЗА) по рекомендаціях виробника. Стадію контрастного забарвлення проводили з використанням гематоксиліну (760-2037, Мепіапа Меадіса! 5уз(етв, Іпс, ОА) і використовували реагент, що надає синє забарвлення (7600-2037, Мепіапа Медіса! Зузіетв, Іпс, ОБА). Забарвлені стекла піддавали дегідратації і покривали цитосилом ХУ. (8312-4, Віснага-АПап 5сієпійіс, ОА).
ІНС-класифікація
Імунозабарвлені стекла сканували з використанням системи Зсап5соре ХТ (Арегіо
Тесппоіодіех, Міста, СА). З використанням програмного забезпечення Ітадезсоре (версія 10.2.2.2319, Арегіо ТесппоЇодіеєх) одержували оцифровані зображення при збільшенні х20.
Оцінка забарвлення включала гістологічну реакційноздатну ділянку, основний тип реакційноздатних клітин, інтенсивність забарвлення і частоту забарвлення клітин. Негативні зразки класифікували як 0. Позитивні зразки класифікували по шкалі інтенсивності від 1 до 4. Діапазони інтенсивностей описували як слабка (0; 2-4), помірна (2; Зі ії сильна |З; 4).
Частота забарвлення клітин являла собою відсоток імунозабарвлених клітин, і її визначав гістолог, спостерігаючи середнє для зразка. Частоту забарвлення клітин класифікували по 5 категоріях пропорційної шкали: 1 (0-5 Ов), 2 (6-25 У), З (26-50 Фо), 4 (51-75 9о) і 5 (76-100 Об).
Шкалу загальної експресії для пухлин адаптували зі шкали Оллреда (АБ) (Моп5іп 5., М/еі55
Н., Наміднитві Т., Сіаж (.М., Вегагдо М., Ноапи 1.0. єї аї. Ргодевієгопе гесеріог ру іттипопівіоспетівгу апа сіїпіса! ошісоте іп Бгєаві сапсег: а маїїдайноп зішау. Мой. Раїної. 2004; 17:11545-1554). Цю А5 одержували, додаючи інтенсивність і пропорційні шкали з одержанням загальної шкали в діапазоні 0-9. А5 виражали у вигляді відсотка від максимуму на загальній шкалі і класифікували на 5 категорій: дуже низьке (0-25 95), слабке (26-50 95), помірне (51-75 905) і високе (76-100 95). Ступінь ураження визначали як відсоток від позитивних випадків для показання.
Описовий статистичний аналіз
Описову статистику розраховували з використанням програмного забезпечення Місго5ой
Ехсе! 2003. Для кожного показання визначали кількість випадків, кількість позитивних випадків, ступінь ураження, середній показник інтенсивності, середню частоту, середній показник
Оллреда, діапазон інтенсивності, діапазон частоти і діапазон показника Оллреда.
Приклад 8.1. Використання моноклонального антитіла до СЕАСАМ5 для оцінки білка
СЕАСАМ5 у ЕЕРЕ-пухлинах людини за допомогою імуногістохімії (ІНС)
Досліджували велику панель пухлин людини з використанням комерційних стекол з панелями тканин (формат БЕРЕ). Експресію білка СЕАСАМ5 спостерігали в мембрані-цитоплазмі пухлинних клітин (фіг. 1С, 0). У більш диференційованих пухлинах визначена частка забарвлення мембран поляризувалася на апікальному полюсі клітин.
Виявлено, що білок СЕАСАМ5 експресований у: 89 95 випадків аденокарциноми товстого кишечнику (194/219, інтенсивність 2-2,5.5, частота 53-59 95, А5 60-66 95), 49 95 випадків аденокарциноми шлунка (95/195, інтенсивність 2,545, частота 53 905, АБЗ 62 9б), 41 95 випадків аденокарциноми легень (24/58, інтенсивність 1,8-2ж, частота 50-53 95, А5 54- 58 об), 79 95 випадків плоскоклітинної карциноми шийки матки (11/14, інтенсивність 2, частота 22 до, АБ 46 Об), 53 956 випадків аденокарциноми підшлункової залози (18/34, інтенсивність 2, частота 23 95,
А5 42 95), 37 95 випадків плоскоклітинної карциноми стравоходу (23/62, інтенсивність 2-5, частота 16 95,
А5 38 95), 4 95 випадків карциноми яєчника (33/77, інтенсивність 2, частота 43 95, АБЗ 54 905), 11 95 випадків карциноми щитовидної залози (2/18, інтенсивність 1,55, частота 63 95, А5 56
Зо), 25 95 випадків карциноми сечового міхура (5/20, інтенсивність 1,5.5, частота 61 95, А5 56 95), 7 96 випадків аденокарциноми ендометрія (1/14, інтенсивність 2, частота 50 95, А5 56 905), 11 95 випадків карциноми проток молочної залози (2/18, інтенсивність 1,55, частота 53 95, А5 50 об), 53 95 випадків холангіокарциноми (2/6, інтенсивність 1,55, частота 75 95, А5 50 905), 53 956 випадків плоскоклітинної карциноми легень (31/148, інтенсивність 1,5.--, частота 22 905,
А5 39 95), 8 956 випадків аденокарциноми передміхурової залози (1/13, інтенсивність 2, частота 50 9б,
А5 44 95), 25 95 випадків плоскоклітинної карциноми шкіри (2/8, інтенсивність 1,55, частота 23 95, АЗ 39 о).
Приклад 8.2. Тканинна перехресна реактивність моноклонального антитіла до СЕАСАМ5 у яванського макака (Масаса газсісціагі5) і порівняння з профілем експресії у людини
Позаклітинний домен, що походить з білю»а СЕАСАМ5 людини (Ї) або яванського макака (с), одержували за допомогою транзиторної експресії в клітинах ембріональної нирки людини
НЕК293 з використанням плазміди з КДНК СЕАСАМ5 (приклад 1, таблиця 1). Клітинні осади фіксували в 10 95 формаліні (Зідта Аїагісп, ОА) протягом 16 годин і занурювали в парафін у вигляді фрагмента тканини згідно зі стандартною гістологічною процедурою.
Як джерело нормальних тканин людини і мавпи використовували комерційну ТМА (таблиця 21).
Перехресну реактивність Маб2 демонстрували за допомогою імунозабарвлення трансфікованих СЕАСАМ5 людини і мавпи клітин (з локалізацією в мембрані й у цитоплазмі).
У нормальних тканинах яванського макака експресія білла СЕАСАМ5 виявлена в клітинах усмоктувального циліндричного епітелію (2/3 позитивних випадків, з середньою інтенсивністю 1,55, з середньою частотою 55 905).
У непухлинних тканинах людини експресію СЕАСАМ5 також спостерігали в клітинах усмоктувального циліндричного епітелію (62/64 позитивних випадків, середня інтенсивність 2, середня частота 90 95). У тканинах людини експресію СЕАСАМ5 меншою мірою спостерігали в епітеліальних клітинах стравоходу, епітеліальних клітинах голови і шиї, епітеліальних клітинах шлункової ямки й епітеліальних клітин шийки матки.
Приклад 9. Кон'югат антитіла з лікарським засобом (варіант)
ПиМАБВБ2-3 до СЕАСАМ5-сульфо-5РОВ-ЮОМА
Аналітичні дані:
Му(АБ)-147417 г/моль; МИ(ОМа4)-780,38 г/моль,
Єгво нм(АбБ)-201400; є252 нм(АБ)- 71451,
Єгво ни(ОМ4)-5180; є252 нм(ЮОМ4)-26159.
При перемішуванні, при КТ у посудину додавали 7,0 мл розчину ПИМАВБ2-3 до СЕАСАМ5 (С-5,32 мг/мл у буфері РВЗ з рнН-7,4) з наступним додаванням 1,6 мл ОМА і 168,4 мкл розчину лінкера нітро-сульфо-5РОВ (описаного в МО 2009134977) (10 екв. - 15 мМ розчин у ОМА).
Розчин повільно перемішували при КТ протягом З годин. Додавали додатковий об'єм 3,4 мкл розчину лінкера нітро-сульфо-5РОВ (2,0 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Через 2 години при КТ при перемішуванні на магнітній мішалці послідовно додавали 2,90 мл буфера РВЗ з рН-7,4, 0,407 мл ОМА і 0,322 мл розчину ОМА (15 мМ розчин у ОМА). Через 1 годину при КТ і 16 годин при 5 "С неочищену реакційну суміш очищали на знесолюючій колонці НіРгер 26/10 (Зерпадех Сс25,
СЕ Неаййсаге), попередньо витримували з 1 СМ 1М Маон, 2 СУ води і 2 СМ буфера з гістидину (10 мМ), гліцину (130 мМ), сахарози (5 95), рН-5,5. Кон'югат елюювали буфером з гістидину (10
ММ), гліцину (130 мМ), сахарози (5 95), рН-5,5, і фракції мономерних кон'югатів об'єднували і фільтрували на 0,22 мкм фільтрі.
Таким чином, одержували 19 мл кон'югата пиИМАБб2-3 до СЕАСАМ5-сульфо-5РОВ-ОМА (с-1,51 мг/мл) у вигляді безбарвного прозорого розчину. Потім кон'югат аналізували на кінцеве навантаження лікарського засобу і чистоту мономерів: ОАК (ШМ)-3,4; АК (5ЕС)-3,3; чистота мономерів-99,8 95; дані НКМ5: див. фіг. 20.
ПиМАБВБ2-3 до СЕАСАМ5-5МОС-ОМ1
Аналітичні дані:
Ко) Му(АБ)-147417 г/моль; МИ(ОМ'1)-738 г/моль,
Єгво нм(Аб)-201400; є252 нм(АБ)- 71451,
Єгво нм ОМ1)-5180; є252 нм(ЮОМ1)-26159.
При перемішуванні, при КТ у посудину додавали 11,3 мл розчину ПиИМАбБ2-3 до СЕАСАМ5 (С-3,47 мг/мл у буфері А з рН-б6,5) з наступним додаванням 0,387 мл ОМА ії 178 мкл розчину лінкера 5МСОС (10 екв. - 15 мМ розчин у ОМА). Розчин повільно перемішували при КТ протягом 2 годин. У неочищеній реакційній суміші заміняли буфер на знесолюючу колонку НіРгер 26/10 (Зерпадех 25, СЕ Неайвсаге), попередньо витримували з 2 СМ 0,2М Маон, 5 см води і 5 СМ цитратного буфера (рН-5,5). Кон'югат елюювали цитратним буфером (рН-5,5) і фракції мономерних кон'югатів об'єднували і фільтрували на 0,22 мкм фільтрі. До одержаного розчину, при перемішуванні, при КТ послідовно додавали 0,476 мл ОМА і 0,124 мл розчину ОМІ1 (15 мМ розчин у ЮМА). Через 2 години при КТ неочищену реакційну суміш двічі очищали на знесолюючій колонці НіРгер 26/10 (Зерпадех 525, СЕ Неапйсаге), попередньо витримували з 2СМ Маон 0 2М, 5 СМ води і 5 СМ буфера з гістидину (10 мМ), гліцину (130 мМ), сахарози (5 95), рнН.5,5. Кон'югат елюювали буфером з гістидину (10 мМ), гліцину (130 мМ), сахарози (5 9б5), рн-»,5, ії фракції мономерних кон'югатів об'єднували, фільтрували на 0,22 мкм фільтрі.
Таким чином, одержували 9,5 мл кон'югата пиИМАбБ2-3 до СЕАСАМ5-5МСОС-ОМІ (с-1,73 мг/мл) у вигляді безбарвного прозорого розчину. Потім кон'югат аналізували на кінцеве навантаження лікарського засобу і чистоту мономерів: ОАК (0М)-2,7; ВАК (ЗЕС)-2,9; чистота мономерів-99,6 95; дані НКМ5: див. фіг. 21.
Приклад 10. Характеристика епітопа і паратопа СЕАСАМ5-АЗВЗ у комплексі з ар МНтТамі тс
МАБІ2 з використанням заміни водень-дейтерій в асоціації з мас-спектрометрією (НОХ М5)
Приклад 10.1. Принцип НОХ М5
Заміна водень-дейтерій в амідах (НОХ) в асоціації з мас-спектрометрією (М5) забезпечує ідентифікацію областей білків, які вважають такими, що беруть участь у конформаційних змінах або взаємодіях. Більш конкретно, цей спосіб забезпечує ідентифікацію областей антигену, що демонструють, після інкубації в дейтерованому буфері і протеолізу, зниження включення дейтерію в його формі, зв'язаній з антитілом, у порівнянні з його вільною формою.
Епітоп належить до тих областей, заміна в яких уповільнюється зв'язуванням з антитілом. У статті, що нещодавно вийшла, докладно описані різні стадії з характеристикою епітопів з використанням цього підходу (папа с)., ММІйбоп І. М., Тгірайі Р., заїйе 5.К., Коих К.Н., Еттей
М.В., ВіаКпеу С.Т., 2напд Н.М. «5 Магзпаї! А.С. (2011). Апаїпуїїса! Спетівігу, 83, 7129-7136.).
Приклад 10.2. Матеріали
Кодуючі варіабельні домени послідовності МАБ2 МНТаміс (ЗЕО ІЮ МО:5 і 5ЕО ІЮ МО:29) клонували в експресуючий вектор ссавців у злитті з коюодуючими послідовностями домену СНІ людини (як виявлено в одержаних з розщепленого папаїном ідст аб) з наступною гексагістидиновою міткою або з константним доменом Скаппа людини, відповідно. Одержували партію бар МАр2 МУНТамі 1с у культивованих у суспензії клітинах НЕК293-Е5'М за допомогою транзиторної трансфекції двома експресуючими плазмідами, кодуючими два ланцюги, у комплексі з 293тесіїп"М (Іпмйгодеп). Через сім діб після трансфекції збирали супернатант культури, що містить секретований білок, центрифугували і фільтрували на 0,22 мкм мембрані.
Бар очищали за допомогою афінної хроматографії на ІМАС (НізТгар, ЗЕ Неайсаге) з використанням градієнта імідазолу в РВ5. Потім об'єднані фракції, що містять баб, очищали ексклюзійною хроматографією (Зирегаех 200, СЕ Неайсаге), зрівноваженою РВ5.
Одержували мічений Ніх домен АЗ-В3 ПСЕАСАМ5 (ЗЕБО ІЮ МО:67) з використанням культивованих у колбі клітин НЕК293-Е57М за допомогою транзиторної трансфекції експресуючої плазміди. Кожну добу додавали кіфунензин (інгібітор процесу, обумовленого розщепленням глікозилування). Супернатант культури, що містить секретований білок, збирали через сім діб після трансфекції, центрифугували і фільтрували на 0,22 мкм мембрані. У супернатант додавали ЕпаоН до 625 мк/мл, потім З години інкубували при 37 "с.
Деглікозилований НСЕАСАМ5-АЗВЗ очищали афінною хроматографією на ІМАС (НіхТгар, СЕ
Неапйсаге) з використанням градієнта імідазолу в РВ5. Потім об'єднані фракції, що містять деглікозилований ПСЕАСАМ5-АЗВЗ, очищали ексклюзійною хроматографією (Зирегаех 200, СЕ
Неайвсаге), зрівноваженою РВ5. Мас-спектрометричний аналіз деглікозилованого ПСЕАСАМ5-
АЗВЗ продемонстрував дві молекули (22485 і 22278 Да), що вказує на те, що білок несе 7 або 8 залишків М-ацетилглюкозаміну (СІСМАСс).
Для одержання комплексу, обидва білки об'єднували з надлишком у 1,5 моль деглікозилованого ПСЕАСАМ5-АЗВЗ на один моль Раб. Цей надлишок видаляли ексклюзійною хроматографією на Зирегадех 200, зрівноваженою забуференим фосфатом сольовим розчином.
Фракції, відповідні Гар з антигеном, використовували для дослідження обміну дейтерію.
Приклад 10.3. Методи
Експерименти обміну водню/дейтерію (НОХ) були повністю автоматизовані з використанням автодозатора РАЇ (СТО Апаїуїіс5). Він забезпечував старт і гасіння обміну, контроль температури протеолізу (4 "С), ін'єкцію дейтерованих пептидів, керування клапанами для ін'єкції і промивання і запуск збирання даних мас-спектрометром і насосів ВЕРХ. Охолоджуваний за допомогою ефекту Пельт'є бокс (4 "С) містив два автоматичних клапани впуску (б-портовий для ін'єкції ї 10-портовий для відмивання), знесолюючий картридж (пептидну мікропастку з ВгиКег-
Міспгот) і колонку ВЕРХ (Рогозпей 120 ЕС-С18, 1х50 мм, 2,7 мкМ із Адіїепї Тесппоіодієв).
Дейтерування починали за допомогою 5-кратного розведення СЕАСАМ5, тАб або комплексу
РВ5 у 020. Для гасіння зворотного обміну і відновлення дисульфідних містків протягом 2 хв. при 4 "С використовували 2М спансі, 0,8М ТСЕР, 1М гліцин.
Білки розщеплювали протеазами пепсином і непентезином, і пептиди знесолювали з використанням насоса ВЕРХ Аодіепі ТесппоЇодіеє з ТЕА 0,03 95 у воді при 100 мкл/хв. Потім пептиди розділяли з використанням іншого насоса ВЕРХ Адіепі ТесппоІодіез у 15-100 90 градієнті В у 20 хв. (А: ТЕА 0,03 95 у воді; В: ацетонітрил 90 95, ТЕА 0,03 95 у воді). Маси пептидів вимірювали з використанням мас-спектрометра з електророзпиленням-ТОЕ (Адіїєепі 6210).
Пептиди ідентифікували за допомогою тандемної МС (МСМС) з використанням ВгиКег
АРЕХ-О ЕТМ5 (9,4 Т) і ВгиКег 12 Т 5оїагіх.
Для одержання даних використовували програмне забезпечення Оаїа Апаїузіх (Вгикег) і
Маз55 Нип'іег (Адіїепі ТесппоЇодієх). Для обробки даних МСМС використовували бВаїа Апаїувів і
Мазсої (Маїгіх Зсіепсе). Для обробки даних НОХ використовували програмне забезпечення
Ма55 Нипіег і НО Ехатіпег (5іегга Апа/Пуїіс5).
Експерименти НОХ повторювали щонайменше три рази.
Приклад 10.4. Результати
Ідентифікація і відбір пептидів
При дейтеруванні дисульфідні містки залишали інтактними для збереження зв'язаної з ними структурної інформації. Для переваги протеолізу й ідентифікації пептидів містки відновлювали
ТСЕР після стадії гасіння при низькому рН і низькій температурі. Використовуючи МСМС після розщеплення комплексу СЕАСАМ5-Раб, було можливо ідентифікувати велику кількість пептидів, бо одержаних з цих трьох білкових ланцюгів. Після експериментів НОХ вибирали тільки експерименти, що дають гарну якість сигналу: 25, 30 і 20 пептидів з антигену СЕАСАМ5-АЗ-В3З, важкого ланцюга Бар МАБбБ2 МНтТамітс і легкого ланцюга МАБбБ2 МНТамі с, відповідно. Ці пептиди перекривають 89 95, 77 95 ії 68 95 послідовностей антигену СЕАСАМ5-АЗ-ВЗ3, важкого ланцюга Бар МАБ2 МНІТамі1с і легкого ланцюга МАБ2 МНТамі с, відповідно (таблиця 25).
Неперекриті області ланцюгів Бар в основному знаходилися в їх С-кінцевих частинах.
Таблиця 25
Перекриття послідовності дейтерованими пептидами 1-18; 1-22; 1-23; 1-19; 23-35; 36-51; 35-49; 50-70; 36-43; 44-51; 36-51; 36-49;
СЕАСАМ5-АЗ-ВЗ /|50-67; 37-49; 44-49; 59-67; 71-89; 93-107; 108-115; 128-143; 128-142; 143- 157; 130-143; 130-142; 140-143; 163-186
Важкий ланцюг гар 1-6; 1-20; 1-19; 1-17; 1-18; 4-18; 5-20; 5-18; 24-29; 27-32; 27-29; 34-46; 47-68;
МАВ? УНІамі с 48-68; 50-68; 69-86; 84-93; 88-98; 92-104; 100-109; 110-115; 116-136; 111-
З 128; 149-158; 151-158; 159-177; 162-177; 167-177; 187-206
МАБр2 МНтТІаміїс |131; 127-145; 133-144; 136-145; 136-143; 136-144; 143-161; 144-151; 146-151
Усі 8 залишків аспарагіну, що є потенційними ділянками глікозилування, були ідентифіковані в декількох пептидах з сІСМАс, що залишився після ендо-Н-деглікозилування. Зокрема, М114 виявлений у пептиді 108-115. У перших експериментах (не використовувалися для НОХ), М166 виявлений в обох формах (з СІСМАс і без сІСМАс). Це може пояснювати гетерогенність, що спостерігається при мас-спектрометрії СЕАСАМ5-АЗВЗ після деглікозилування, що відповідає 7 і 8 СІСМАс.
Ідентифікація епітопа і паратопа
Вільний антиген, вільний Раб і їх комплекс піддавали дейтеруванню протягом 2 хв. або 20 хв. при 4 "С або 20 хв. при кімнатній температурі (26 "С). Враховуючи залежність кінетики обміну атомів водню амідів від температури (приблизно З-кратне зростання обміну зі збільшенням на 10 "С), остання умова еквівалентна 200 хв. дейтерування при 4 "С.
Епітоп
Порівнювали кінетику включення дейтерію у 25 відібраних пептидів СЕАСАМ5-АЗВЗ, коли антиген був дейтерований у вільній формі і коли він знаходився в комплексі з Раб. Декілька пептидів не продемонстрували якої-небудь значимої відмінності в НОХ (АНОХ) в обох станах.
На відміну від цього деякі з них (108-115 і 128-143) продемонстрували значиму АНОХ. Другу область перекривали 5 різних пептидів: 128-142, 128-143, 130-142, 130-143 ї 140-143, що демонструють через 2 хв. дейтерування ЛНОХ 13-15:-2 95 (до 1,6--0,2 0).
Порівнюючи 128-142 з 130-142 і 128-143 з 130-143, автори в кожному випадку не знайшли якого-небудь значимої зміни АНОХ (1,3-1,4 О для перших двох пептидів і 1,6 для останніх двох через 2 хвилини дейтерування), що означає, що аміди УУ129 ї К130, імовірно, не входять у епітоп. На відміну від цього, при порівнянні 128-142 з 128-143 ії 130-142 з 130-143, автори
Зо знайшли невелику зміну АНОХ (приблизно 0,2 Ю), що означає, що амід Е143 є залученим. АНОХ у пептиді 140-143 (приблизно 0,3 Ю) означає, що аміди М141 або І 142 також можуть бути залученими. З 9 амідів від І131 до 0140, деякі з них залучені в епітоп "у середньому приблизно розділяли 1 АНОХ).
Ці відмінності у включенні дейтерію вказують на те, що епітоп знаходиться в конкретних областях (амідах), тобто в пептидах з послідовностями 5САМІМІ (5ЕБЕО ІО МО:76) і
ІМЕАТРОСОНТОМІ Е (ЗЕО І МО:77).
Паратоп
Кінетику включення дейтерію у 30 відібраних пептидів важкого ланцюга Раб порівнювали, коли Раб був дейтерований у вільній формі і коли він знаходився в комплексі з антигеном.
Майже всі пептиди не демонстрували яких-небудь значимих АНОХ в обох станах. Тільки один пептид (100-109) через 200 хв. дейтерування демонстрував АНОХ: 11--2 95 (0,7-0,2 Ю). Область (аміди) 101-109 важкого ланцюга бар МАБ2 МУНТамі с залучена в паратоп.
Кінетику включення дейтерію для 20 відібраних пептидів легкого ланцюга Раб порівнювали, коли Раб був дейтерований у вільній формі і коли він знаходився в комплексі з антигеном.
Майже всі пептиди не демонстрували яких-небудь значимих АНОХ в обох станах. Тільки два пептиди (47-54 і 87-104) демонстрували відмінності. Через 20 хв. дейтерування воно складало
10-2 95 (0,6--0,2 2) для першого пептиду і 5-2 Фо (0,9--0,2 О) для другого пептиду, відповідно.
Області 48-54 і 88-104 легкого ланцюга МАБ2 МУНТІамі 1с залучені в паратоп. список ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «1105 5АМОРЕІ «120» АНТИТІЛА до СЕАСАМ5 І ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ «1305 ЕВ2012/065 «1505 ЕРІ2306444 «1515 2012-11-20 «1605 90 «1705 РавепсІпПп уекгквзіоп 3.5 «2105 1 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 1 б1у Рпе ТПг Рпе бБег бБег Туг Аїа 1 5 «2105 702 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 2
І1е бек бек біу бі1у бек Тук І1е 1 5 «2105 3 «2115 13 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 З
Аза Акуд Рго Аїа Туг Тук б1у АвБп Рго Аїа Меє Авр Туг 1 5 10 60 «2105 14
«2115 6 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 4 сіп Авп Уаї о1у ТПг Авп 1 5 «2105 Мм5 «2115» 120 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» УМНіа гуманізованого антитіла МАБ2 «4005 5 бі Маї біп Гей сбіп бій бек с1у Рго сіу Геш Уа1 пув Рго сб1у 01У 1 в) 10 15 зек Гец бек Іец бек Сув А1ї1а Аїа бек сіу Рпе Уа1 Рібе бек бек Туг 20 25 30
Зо
Авр Меє бек Тер Уаі Агуд біп ТПг Рго б1п Агуд с1у Гей бій Тер Уаї
З5
Аза Тукг І1їе бек бек біу б1у с1у Іїе ТПг Туг АТа Рго бек ТПг Уаї бо 40 пув б1у Акуд Рпе ТПг Уа1і! бек Акуд Авр АБп Аза Ппув Авп ТПг Гей Туг 65 70 75 80
Тец біп Меє Авп бек Гей ТПг бек біц Авр ТПг АТїа Уаї Тук Тук Сув 45 85 90 95
Аза Аза Нів Туг Рре бі1іу бек бек біу Рго Рпе Аза Тугє Тер 01у сіп 100 105 110 50 бі1у ТПпг Геип Уа1і ТПг Уа1 Бек 5ег 115 120 55 «2105 6 «2115 10 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність 60 «2205
«223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 6 сіп біп Тук Авп бек Тук Рго Тецй Тукє Тіг 1 5 10 «2105 7 «2115 8 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 7 б1у Рпе Уа1ї РпПе бек Бек Тукг Авр 1 5 «2105 8 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучний «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ
Зо «4005 8
І1е бек бек біу б1у б1у Ше Тс 1 5
З5 «2105 13 «2115 13 «212» БІЛОК «2135 Штучний «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 19
Аза Аза Нів Тукг РрПе біу бек бек біу Рго Рпе Аза Туг 1 5 10 «2105 10 «2115 6 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 10 (516) січ Авп І1е Рре бек Туг 1 5
«2105 11 «2115 526 «212» БІЛОК «213» Ношто варієпь «4005 11
Мен сі1у Нів Гей бек АТїа Рго Гец Нів Агуд Уаі Агд Уаії Рго Тгр сіп 1 5 10 15 сб1у Гей Гей Гей ТПг Аїа бек Гей Гей ТПг Рпе Тер Ап Рго Рго ТЕГ 20 25 30
ТПгЕ Аїа сбіп Гей ТПг ТБг бій бек Месє Рго Рпе Ап Уаі Аїа бій щу 35 40 45 пув бій Маї Геш Гей Гецп Уаї Нів Авп Гей Рго сіп сбіп Тей Рпбе 01У 50 55 бо
Тук Бек Тер Тук Мпув біу біцш Акд Уаі Авр б1у АБп Акд біп чІ1е Уаї 65 70 75 80 сі1у Тук Аїа І1е с1у ТПг сбіп сбіп Аза ТПг Рго сіу Рго Аїа Авп 5ег 85 90 95
Зо б1у Акд бій ТПпг І1їе Тук Рго Авп Аїа Бек Гей Гей І1е сСіп Авп Уаї 100 105 110
З5
ТПгЕ біп Авп Авр о ТБг біу Роре Тук ТПг Гец біп Уаії І1е Гув Бек Авр 115 120 125
Тен Маі АБп біц сій Аза ТПг сіу біп Рпе Ні Уаії Тук Рго сій Гей 130 135 140
Ркго Ппув Рго бек І1е бек Бек Авп АвБп бек Авп Рго Уа1і бій Авр Гув 145 150 155 160
Авр Аза Уаії Аза РоПе ТПг Сув біц Рго бій ТПг біп Авр Тс Тпг Туг 165 170 175
Тецп Тер Тер І1е Авп Авп біп бек Гей Рго Уа1і бек Рго Агд Іец біп 180 185 190
Тецп бек Авп с1іу Авп Агуд Тпг Гей ТпПг Гей Гей бек Уаї ТБг Агд Авп 195 200 205 (516) Авр ТПг с1іу Рго Тук біцш Сув біц Іїе біп Авп Рго Уаії бек Аза Авп 210 215 220
Акуд Бек Авр Рго Уаі! ТПг ІТецй Авп Уа! ТПг Тук с1у Рго Авр ТПг Рго 225 230 235 240
ТПгЕ Іїе бек Рго бек Авр ТПг Туг Тук Агуд Рго біу Аїа АвБп Гей 5ег 245 250 255
Тецп бек Сув Ту Аза Аїа бек Авп Рго Рго Аїа сіп Тукг бек Тгр Іей 260 265 270
І1е Авп біу ТПг Рре біп біп бек ТПг біп бій Гей Рпе Іїе Рго Авп 275 280 285
І1е ТБПг Уаї Авп Авп бек біу бек Тук ТПг Сув Нів Аза Авп Авп бег 290 295 300
Уаї ТпПг с1у Сув Авп Агуд ТБг ТпПг о Уа1! пуб ТБПг І1е І1е Уаі ТПпг с1ци 305 310 315 320
Пен бек Рго Уаії Уаі Аїа Ппув Ркго біп І1е Ппу5 Аїа бек Гув ТПг Тіг 325 330 335
Уаї ТпПг б1у Авр Гув Авр бек Уаі Авп Гей ТПг Сув Бек ТПг Авп Авр
Зо 340 345 350
ТПг с1у Іїе Бек Іїе Агкд Тгр Рпе Робе пуб Авп о біп бек Іецй Рго 5бег 355 3З6о 365
З5 зек біц Акуд Меє Гув ІТецй бек біп б1у АвБп ТПг ТПг Гей бег І1е Авп 370 375 380
Ркго Уаі пув Агд б1іцшц АвБр Аза сіу ТПг Тук Тер Сув бі Уа1 Ропе Авп 385 390 395 400
Рго І1їе бек Пув АБп о біп бек Авр Рго І1е Меє Гей Авп Уаї Авп Туг 405 410 415
Ап Аза Гей Рго біп б1іц АвБп о біу Іїец бек Рго б1у Аїа І1е Аїа 0Щ1У 420 425 430
І1е Уаї Іїе с1у Уаії УМаї Аїа їец Уаі Аїа гей І1їе Аза Уаї Аїа Іей 435 440 445
А1їа Сув РіПе Гец Ні Рпе б1у Ппув ТПг б1у Агуд Аза Бек Авр біп Агд 450 455 460 (516) Авр Гечп ТПг бій Нів пуб Рго бек Уаї бек Авп Нів ТПг б1п Авр Нів 465 470 475 480 век Авп Авр Рго Рго АБп оГув Месє АвБп обіц Уа1ї ТПг Туг Бек ТПг Ієц 485 490 495
Авп о Рпе бі Аїа сіп біп Рко ТПг біп Рко ТбПг бек Азїа бек Рго бек 500 505 510
Тецп ТПпг Аза ТПг бій І1їе Іїе Туг Бек бій Уаї пув пув сіп з1і5 520 525 «2105 12 «2115 13 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 12 біп Нів Нів Тук с1у ТПг Рго Рпе ТПг 1 5 «2105 13 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ
З5 «4005 13 б1у Рпе ТПг Рпе бБег Агуд Туг Аїа 1 5 «2105 14 «2115 7 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 14
І1е бек бек бі1у б1у Авр ТПг 1 5 «2105 15 «2115 13 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність 60 «220» «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ
«4005 15
Аза Акуд Уаії Авп о Туг Туг Авр бек бек РпПе Іецй Авр Тгр 1 5 10 «2105 16 «2115 6 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 16 біп Авп Уаі о1у ТПг Авп 1 5 «2105 17 «2115 107 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» УП1 гуманізованого антитіла МАБр2 «4005 17
Зо
Авр І1е сіп Месє ТПг о біп бек Рго Аза Бек Гей бек Аза бек Уаі с1У 1 5 10 15
Авр ТПг оУаї ТПг І1е ТПг Сув Агуд Аїа бек бій АБп чІ1е Рпе бек Туг 20 25 30
Тец А1їа Тер Тук біп біп пув Рго сіу Ппув бек Ркго Гув Гецп Іеци Уаї 35 40 45
Тук Авп о ТПг пуб ТБг Іец А1ї1а сіц сіу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех щЩ1У 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг біп Рпе бек Іїецй ТПг І1ї1е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе сіу Бек Тук Тук Сув біп Нів Нів Тук с1у ТПг Рго РБе 85 90 95
ТПЕ Ррпе с1іу бек біу ТПг Гпув Геп бі І1е Гув 100 105 «2105 18 бо «2115 10 «212» БІЛОК
«2135 Штучна послідовність «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 18 біп бі1іп Ту Авп Авп Тук Рго Гей Тук ТЕПг 1 5 10 «2105 19 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 19 б1у Рпе ТПг Рпе бек бек Тук Авр 1 5 «2105 ч20 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» фрагмент антитіла «4005 20
ІТ1е бек бБег Тук б1у б1у Агд ТЕПг 1 5 «2105 21 «2115 13 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 21
А1а Аза Нів Туг Рпе сіу ТПкК бек біу Рго Рпе Аїа Туг 1 5 10 «2105 222 «2115 6 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 60 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ
«4005 щД 22 бі АБп чІ1е Тук Бек Туг 1 5 «2105 23 «2115 107 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» УШ1а гуманізованого антитіла МАБр2 «4005 23
Авр І1е сіп Месє ТПг о біп бек Рго Аза бек ІТецй бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 5 10 15
Авр Акуд Уаї ТіПг І1е Тс Сув Агуд Аза Бек бій Авп І1е Ріе бек Туг 20 25 30
Тем Аїа Тгр Тук сіп біп Ппув Рко біу Ппув Бек Рго ТУув ТІецй Гей Уаї
Тук Авп о ТПг пуб ТБг Іец А1ї1а бій сіу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех щЩ1У
Зо 50 з9 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе бек Іецй ТПг І1ї1е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80
З5 бі Авр Рпе Аїа ТПг Тук Тук Сув біп Нів Нів Тук с1у ТПг Рго РБе 85 90 95 40
ТПЕ Рпе сіу бек біу ТПг Гув Гец біц І11е Гув 100 105 45 «2105 24 «2115 9 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 24 сіп Нів Нів Тук с1у І1е Рго Робе ТіПг 1 5 «2105 25 бо «2115 8 «212» БІЛОК
«2135 Штучна послідовність «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 25 сб1у Рпе Азїа РпПе бек бек Тук Авр 1 5 «2105 26 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 26
І1е Авп бек біу б1у б1у Ше Тс 1 5 «2105 27 «2115 13 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 27
ТПгЕ Аїа Нів Тук РіПе сСіу бек бек біу Рго Рпе Аза Туг 1 5 10 «2105 28 «2115 56 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 28 січ АвБп І1е Тук бек Туг 1 5 «2105 ч29 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» УП1і1с гуманізованого антитіла МАБр2 60 «4005 29
Авр І1е сіп Месє ТПг о біп бек Рго Аза Бек Гей бек Аза бек Уаі с1У 1 5 10 15
Авр Агуд Уаі ТПг І1е ТПг Сув Агуд Аїа бек бій АБп чІ1е Рпе бек Туг 20 25 30
Тец А1їа Тер Тук біп біп пув Рго сіу Ппув бек Рго пуб Гей Іец Уаї 35 40 45
Тук Авп ТПг Агуд ТБг Іец Азї1а сбіц сіу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех щЩ1У 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе бБег ІТецй ТПг І1ї1е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аїа ТПг Тук Тук Сув біп Нів Нів Тук с1у ТПг Рго РБе 85 90 95
ТПЕ Ррпе с1іу бек біу ТПг Гпув Геп бі І1е Гув 100 105 «2105 30
Зо «2115 9 «212» БІЛОК «2135 Штучний «220» «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «4005 30 біп Нів Нів Тук с1у ТПг Рго Рпе ТПг 1 5 «2105 31 «2115» 120 «212» БІЛОК «2135 Штучний «220» «223» фрагмент антитіла «4005 31 бі Маї Меє Гей Уаі бі бек сі1у сіу с1у Гей Уа1 пув Рго сб1у 01У 1 5 10 15 зек Гей пув ІТец бек Сув А1ї1а Аза бек с1іу Рпе ТПг Рібе бек бек Туг 20 25 30 (516) А1їа Меє бек Тер Уаі Агд сіп ТПг Рго бій Гуз Агд Гей сій Тгр Уаї 35 40 45
Аза ТПг І1їе бек бек біу бі1іу Бек Тук Іїе Тук Тук Гец Авр бек Уаї 50 55 бо пув б1у Акуд Рпе ТПг І1їе бБег Акуд Авр АБп Аза Ппув Авп ТПг Гей Туг 65 70 75 80
Тецп біп Меє бек Бек Гей Агуд бек бій Авр ТПг Аїа Меєсє Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Акуд Рго Аїа Тугк Тук б1у АвБп Рго А1їа Меє Авр Тугє Тер 01у сіп 100 105 110 бі1у ТПг бек Уа1і ТПг Уа1 Бек 5ег 115 120 «2105 32 «211» 108 «212» БІЛОК «2135 Штучний «220» «223» фрагмент антитіла «4005 32
Зо
Авр І1ї1е Гец Месє ТПг біп бек біп Гпув Рре Меє бек ТПг бек Уаі1і ШУ 1 5 10 15
Авр Агуд Уаі бек Уаії ТПг Сув пуб Аїа бек біп АБп Уаі с1у ТБг Авп 20 25 30
Ууаї Аза Тер Тук біп сбіп Пув Рго сіу біп бек Рго Гув Рго Гей Ше 35 40 45
Тук Бек Аїа бек Тут Агд Тук бек біу Уаі Рго Авр Агд Рпе ТПг щ1У 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1е бек Авп Уа1і сіп б5ег 65 70 75 80 бі Авр Теп Аза бій Тук Рпе Сув біп біп Туг Авп бек Тукг Рго Іей 85 90 95
Тук ТПг Рпе сіу сі1у с1у ТПКг Ппув Гей сі І1е Гуз 100 105 «2105 33 60 «2115» 120 «212» БІЛОК
«2135 Штучна послідовність «223» фрагмент антитіла «4005 33 бі Маї біп Гей сбіп бі бек сіу сіу Уаі Гей Уа1 пув Рго сб1у 01У 1 5 10 15 зек Гей пув ІТец бек Сув А1ї1а Аза бек б1у Рпе Уа1і РПе Бек бек Туг 20 25 30
Авр Меє бек Тгр Уаі Агуд біп ТПг Рго бій Гув Агд Гей бій Тер Уаї 35 40 45
А1їа Тук І1їе бек бек сіу сіу с1у Іїе ТБг Тук Рпре Рго Авр ТіПг Уаї 50 55 бо біп б1у Акуд Рпе ТПг Уа1і бек Агуд Авр Авп Аїа Гпув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80
Тецп біп Меє Авп бек Гей Гпув Бек бій Авр ТПг Аїа І1е Тук Тук Сув 85 90 95
Зо
Аза Аза Нів Туг Рре бі1іу бек бек біу Рго Рпе Аза Тугє Тер 01у сіп 100 105 110
З5 сбі1у ТПпг Гей Уаі ТПг Уа1 бек Аїа 115 120 40 «2105 34 «2115 107 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність 45 «220» «223» фрагмент антитіла «4005 34 50 Авр чІ1е сіп Меє ТПг сбіп бек Рго Аїа бек ІТецй бек Аїа бек Уаі 1У 1 5 10 15 бі Тс Уаї ТПпг чІ1е ТПг Сув Агуд Аза Бек бій Авп І1І1е Рібе бег Туг 55 20 25 30
Тец А1їа Тер Тук біп біп пув сбіп с1у Ппув бек Рго біп Гей Гей Уаї 60
Тук Авп о ТПг пуб ТБг Іец А1ї1а сіц сіу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех щЩ1У 50 55 бо
Ззек с1іу бек біу ТПг біп Рпе бек Гей пуб Іїе Авп бек Іецй сіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе сіу Бек Тук Тук Сув біп Нів Нів Тук с1у ТПг Рго РБе 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу бек біу ТПгЕ Гув ІТеп сій І1е Гув 100 105 «2105 35 «211» 119 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» фрагмент антитіла «4005 35 бі Маї Гпув Гей Уаі бі бек сі1у сіу с1у Гей Уа1 пув Рго сб1у 01У 1 5 10 15
Зо зек Гей ТПг Іец Рго Сув Аза Аза бек б1і1у Рпе ТПг Рпе бБег Агд Туг 20 25 30
А1їа Меє бек Тер Уаі Агд сіп ТПг Рго бій Гуз Агд Гей сій Тгр Уаї 35 40 45
А1їа бек І1їе бек бек біу б1у Авр ТПг Тук Тук Рго Авр Бек Уа1ї! Гув 50 55 бо б1у Акуд Рпе ТПг Уаії Бек Агуд Авр АБп Аза Агуд Авп о ч11е Гецй РіПе Іей 65 70 75 80 біп Меє бек бек Гей Агуд бек бій Авр ТПг сіу Меє Тук Тук Суб А1а 85 90 95
Акуд Уаі1 Авп о Туг Туг Авр бек бек РПе ТІец Авр Тгр Тгр О1у сбіп с01У 100 105 110
ТПЕ ТрПг Гей ТБбг Уаї бек 5ег 115 «2105 36 60 «211» 108 «212» БІЛОК
«2135 Штучна послідовність «223» фрагмент антитіла «4005 36
Авр І1е Уаї Месє ТПг біп бек біп Агуд Рпе Меє бек ТПг Гец сбіц с1У 1 5 10 15
Авр Акуд Уаї бек Уа1і ТПг Сув пув Аза бек біп АвБп Уаі о1у ТПг Авп 20 25 30
Ууаї Аза Тер Тук біп сбіп Пув Рго сіу сіп бек Рго ув Аї1а еп Ше 35 40 45
Тук Бек Аїа бек Туг Агуд Тук Бек сіу Уаі Рго АвБр Агд Рпе ТіПг с1Уу 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1е бек Авп Уа1і сіп б5ег 65 70 75 80 бі Авр Теп Аза бій Тук Рпе Сув біп біп Туг Авп Авп Туг Рго Іей 85 90 95
Зо
Тук ТПкЕ Рпе сіу сіу сбіу ТП пув Гец біц І11е Гув 100 105
З5 «2105 37 «2115» 120 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» фрагмент антитіла «4005 37 бі Маї біп Ге Уаі сій бек сіу сіу с1іу Гей Уаії Гпув Рго б01у щу 1 5 10 15 зек Гечп пув Гей бек Сув Аїа Аза бек біу Робе ТПг Ррпе бек бек Туг 20 25 30
Авр Меє бек Тер Уаі Агд біп ТПг Рго бій пув Агд Гец бі Тгр Уаї 35 40 45
Аза Рпе І1е бек бек Тук бі1у б1у Агд ТПг Туг Ту Аза Авр ТПг Уаї 50 55 бо 60 пув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп Аза Тув АБп о ТПг Іец Туг 65 70 75 80
Пе біп Мес бек бек Гей Гув бек біц Авр ТПг Аїа Меє Ріпе Тук Сув 85 90 95
Аза Аза Нів Тукг Рре б1у ТПг бек сіу Рго Рпе Аза Туг Тгр с1у сіп 100 105 110 сбі1у ТПпг Гей Уаі ТПг Уа1 бек Аїа 115 120 «2105 38 «2115 107 «212» БІЛОК «2135 Штучний «220» «223» фрагмент антитіла «4005 38
Авр І1е сіп Месє ТПг о біп бек Рго Аза бек ІТецй бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 5 10 15
Зо бі Тс Уаї ТПпг чІ1е ТПг Сув Агуд Аза Бек бій Авп І1І1е Тук бек Туг 20 25 30
Рпе Аїа Ткгр Тук біп сбіп пув біп с1у Пув бек Рго біп Гечп Іецй Уаї 35 40 45
Тук Авп Аїа пуб І1е Іїец Аї1а сіц сіу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех щЩ1У 50 з9 бо зек сіу бек біу ТПг біп Рпе бек ІТец Гув І1е Авп Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе сіу ТПг Тук Тук Сув сбіп Нів Нів Тук с1і1у І1е Рго РіПе 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу бек біу ТПг Гув Гец біц Іецй Гув 100 105 «2105 39 «2115» 120 «212» БІЛОК «2135 Штучний 60 «2205 «223» фрагмент антитіла
«4005 39 біц Гей біп Ге Уаі бій бек сіу сіу Уаії Іецй Уаії гув Рго б01у щу 1 5 10 15 зек Гей пув ІТец бек Сув Азї1а Аїа бек б1у Рпе Аза РПе Бек бек Туг 20 25 30
Авр Меє бек Тер Уаі Агуд біп ТПг Рго бій пув Агд Гец бі Тгр Уаї 35 40 45
ТПЕ Тук Іїе Авп бек сіу сіу б1у Іїе ТПг Тук Тук Рго Авр ТПг Уаї1! 50 55 бо пув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бБег Агуд Авр Авп Аза Агуд Авп о ТБПг Іец Туг 65 70 75 80
Тецп біп Ме бек Бек Гей Гпув Бек бій Авр ТПг Аїа І1е Тук Тук Сув 85 90 95
ТПгЕ АТїа Нів Тук РіПе сіу бек бек сіу Рго Рбе Аїа Туг Тгр СШ1у сіп 100 105 110
Зо сбі1у ТПпг Гей Уаі ТПг Уа1 бек Аїа 115 120 «2105 40 «2115 107 «212» БІЛОК «2135 Штучний «220» «223» фрагмент антитіла «4005 40
Авр чІ1е сіп Меє ТПг сбіп бек Рго Аїа бек ІТей бек Аза бек Уа1і 01Уу 1 5 10 15 бі Тс Уаї ТПпг чІ1е ТПг Сув Агуд Аза Бек бій Авп І1І1е Тук бек Туг 20 25 30
Тец А1їа Тер Тук біп біп пув сбіп с1іу Ппув бек Рго біп Гец Іец Уаї 35 40 45
Тук Авп Аза пуб ТПг ІТец ТПг біц біу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех 0Щ1У 50 55 бо (516) Ззек б1іу бек біу ТПг біп Рпе бек Гей Туз І1е АБп бек Гей біп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе сіу Бек Тук Тук Сув біп Нів Нів Тук с1у ТПг Рго РБе 85 90 95
ТПЕ Ррпе с1іу бек біу ТПг Гпув Геп бі І1е Гув 100 105 «2105 41 «211» 449 «212» БІЛОК «2135 Штучний «220» «223» фрагмент антитіла «4005 41 бі Маї Меє ге Уаі бій бек сіу сбіу б1у Іїецп Уаії пув Рго б01у щу 1 в) 10 15 зек Гей пув ІТец бек Сув А1ї1а Аза бек б1і1у Рпе ТПг Ропе бек бек Туг 20 25 30
Аза Меє бек Тр Уаі Агуд біп ТПг Рго бій Гув Агд Гей бій Тер Уаї
Зо
Аза ТПг І1їе бек бек біу бі1у бек Тук І1е Тук Тук Гей Авр бек Уаї бо 35 пув б1у Акуд Рпе ТПг І1їе бек Акуд Авр АБп Аза Ппув Авп ТПг Гей Туг 65 70 75 80
Тецп біп Меє бек Бек Гей Акуд Бек бій Авр ТПг Аїа Меєсє Тук Тук Сув 40 85 90 95
Аза Акуд Рго Аїа Тугк Тук б1у АвБп Рго А1їа Меє Авр Тугє Тер 01у сіп 100 105 110 45 бі1у ТПг бек Уа1і ТПг Уа1 бек бек Аза Бек ТПг Ппув сіу Ркго бек Уаї 115 120 125 50
Рпе Рго Гец Аза Рго бек бек пуб бек ТПг бек сі1у с1у ТПг Аза Аї1а 130 135 140 55 Тем біу Сув Гецп Уаії Ппув Авр Тук Рібе Рго бій Рго Уа1! ТПг Уаї 5екг 145 150 155 160
ТЕр Авп бек сіу Аїа Гец ТПг бек сіу Уаії Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї 60 165 170 175
Тецп біп бек бек с1іу Гей Тук Бек Гей бек бек Уа1! Уаї ТіПг Уаї1ї Рго 180 185 190
Ззек бек бек Гей с1у ТПг сіп ТПк Туг Іїе Сув Авп Уаі Авп Нів Гуз 195 200 205
Ркго Бек Авп ТПг Гуз Маї Авр о Гув пув УМаї бій Рго Ппув Бек Сув Авр 210 215 220
Тпув ТП Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Гей Гец сС1у с1Уу 225 230 235 240
Ркго Бек Уаії Рпе Іїецй Рпе Рго Ркго Гув Рго Гув Авр ТПг Ге Меє Те 245 250 255 зек Агуд ТПг Рго біц УМаї ТПг Сув Уаії Уаї Уаї Авр Уа1і Бек Нів сіц 260 265 270
Авр Рго сій Уа1! Ппув Рре Авп Тгр Тук Уаі Авр сі1у Уаії сій Уаї Нів 275 280 285
Авп Аза пуб ТПг Губв Рго Агд біц бі біп Туг Авп о бБег ТПг Туг Агд
Зо 290 295 300
Уаї Уаї Бек Уаії Гей ТПг Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гец Авп о б1у Гув 305 310 315 320
З5 бі Тук Гпув Сув Ппув Уа1 Бек Авп Гпув Аїа Гей Рго Аза Рго І1е с1іц 325 330 335
Тпув ТПг І1їе бек Ппув Аїа пув с1іу біп Рго Агуд бій Рго біп Уа1ї! Туг 340 345 350
ТПЕ Гей Рго Рго бек Агуд Авр бі Гецп ТпПг о пув Авп обіп Уаї бек Геч 355 3З6о 365
ТПЕ Сув Гей Уа1ї Ппув бі1у Робе Туг Рго бБег Авр І1е А1ї1а Уаі сій Тгр 370 375 380 бі бек АвБп сіу біп Рго бій Авп Авп о Тук Ппув Тс ТБг Рго Рго Уаї 385 390 395 400
Тец Авр бек Авр сіу Бек Рпе Рпе Гей Туг бек Ппув Гей ТПг Уаі1і Авр 405 410 415 (516) пув бек Агуд Тер біп біп б1у Авп Уаї Ріре бек Сув бек Уаї Меє Нів 420 425 430 бі Азїа Гей Нів Авп о Нів Туг ТПг о біп пув бек ТІецй бек Гецй бек Рго 435 440 445 у «2105 42 «2115» 215 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» фрагмент антитіла «4005 42
Авр І1ї1е Гец Месє ТПг біп бек біп пуб Роре Меє бек ТПг бек Уаії с1У 1 в) 10 15
Авр Акуд Уаї бек Уа1і ТПг Сув пув Аза бек біп АвБп Уаі о1у ТПг Авп 20 25 30
Ууаї Аза Тер Тук біп сбіп Пув Рго сіу сіп бек Рго Пув Рго Гей І1є
Зо
Тук Бек Аїа бек Тут Агд Тук бек біу Уаі Рго Авр Агд Рпе ТПг щ1У бо 35 Ззек с1іу бек біу ТПгЕ Авр Рпе ТПг Гей ТПг І1їе бек Авп Уаї сіп 5ег 65 70 75 80 бі Авр Теп Аза бій Тук Рпе Сув біп біп Туг Авп бек Тукг Рго Іей 40 85 90 95
Тук ТПкЕ Рпе сіу сіу біу ТБПгЕ Гув ІТейп бій Іїе Ппув Агд ТпПг Уа1 А1а 100 105 110 45
Аза Ркго бек Уаі! Рпе І1е Рпе Рго Рго бек Авр бій сбіп Гей Ппув б5ег 115 120 125 50 бі1у ТПпг Азїа бек Уа1і Уа1 Сув Гей Гей Авп АвБп Ропе Туг Рго Агд с1ци 130 135 140 55 А1їа Ппув Уаї біп Ткр Ппув Уаі Авр Авп Аза Тей сіп бек с1у Авп 5ег 145 150 155 160 біп бій бек Уаі ТП бі біп Авр Бек ГПув Авр бек ТПг Тукг бек Ієей 60 165 170 175 зек Бек ТПг Іец ТПг ІГецйп бек їув Аза Авр Тук бій Ппув Нів Ппув Уаї 180 185 190
Тухк Аїа Сув бі Ма! ТПЕ Ні сбіп сіу ГПпеп бек бек Рго Уаї! ТПг Тув 195 200 205 зек Рпе Авп Агд біу б1іц Сув 210 215 «2105 43 «211» 449 «212» БІЛОК «2135 Штучний «220» «223» фрагмент антитіла «4005 43 бі Маї біп Гей сбіп бі бек сіу сіу Уаі Гей Уа1 пув Рго сб1у 01У 1 5 10 15 зек Гей пув ІТец бек Сув А1ї1а Аза бек б1у Рпе Уа1і РПе Бек бек Туг 20 25 30
Зо
Авр Меє бек Тгр Уаі Агуд біп ТПг Рго бій Гув Агд Гей бій Тер Уаї 35 А1їа Тук І1їе бек бек сіу сіу с1у Іїе ТБг Тук Рпре Рго Авр ТіПг Уаї бо біп б1у Акуд Рпе ТПг Уа1і бек Агуд Авр Авп Аїа Гпув Ап о ТПг Іец Туг 40 65 70 75 80
Тецп біп Меє Авп бек Гей Гпув Бек бій Авр ТПг Аїа І1е Тук Тук Сув 85 90 95 45
Аза Аза Нів Туг Рре бі1іу бек бек біу Рго Рпе Аза Тугє Тер 01у сіп 100 105 110 50 бі1у ТПпг Гей Уаі ТПг Уаі1і! бек Аза Аза Бек ТПг Ппув с1іу Ркго бек Уаї 115 120 125 55 Рпе Рго Гемй Аза Рго бек бек Ппув бек ТіПг бек сіу с1у ТПг Аїа А1а 130 135 140
Тец б1у Сув Гей Уаії Ппув Авр Тук Рпе Рго бій Ркго Уаї ТіПг Уаї1ї 5ег (516) 145 150 155 160
ТЕр Авп бек сіу Аїа Гец ТПг бек сіу Уаії Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї 165 170 175
Пес біп бек бек с1у Пеп Туг бек Гей бек бек Уаі Уа1ї ТіПг Уаї Ркго 180 185 190 зек бек бек Іец біу ТПг біп ТП Тук І1ї1е Сув Авп Уа1і Авп Нів Гув 195 200 205
Ркго Бек Авп о ТПг Гуз Маї Авр о Гув пув Маї бій Рго Ппув бек Суб Авр 210 215 220
Тпув ТП Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Гей Гец сС1у с1Уу 225 230 235 240
Ркго Бек Уаії РпПе Іїецй Рпе Рго Рго Гув Рго Гув Авр ТПг Гец Меє І1е 245 250 255 век Акад ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув Уаї Уа1ї Уаї Авр Уаї бек Нів с1ци 260 265 270
Авр Ркго сіц Уаї Гуз Рпе Авп о Тгр Тук Уаі Авр сіу Уаї біц Уаї Нів
Зо 275 280 285
Авп Аза пуб ТПг Губв Рго Агд біц бі біп Туг Авп о бБег ТПг Туг Агд 290 295 300
З5
Уаї Уаї Бек Уаі Гей ТПг Уаї Гец Ні біп Авр Тер Гей АвБп о1Уу Гув 305 310 315 320 бі Тук Гпув Сув Ппув Уа1 Бек Авп Гпув Аїа Гей Рго Аза Рго І1е с1іц 325 330 335 пув ТПг І1е Бек Ппув Аїа Пув сб1у біп Рго Акуд бій Рго сбіп Уаі1ї Туг 340 345 350
ТПЕ Гей Рго Рго бек Агд Авр бій Гей ТПг Гпув АвБп обіп Уаї бек Іецй 355 360 365
ТПЕ Сув Гей Уаї пув бі1у РоПе Туг Рго бБег Авр І1е А1ї1а Уаії сій Тгр 370 375 380 бі бек АвБп сіу біп Рго бій Авп Авп о Тук Ппув Тс ТБг Рго Рго Уаї 385 390 395 400 (516) Тем Авр Бек Авр сіу бек РіПе РібПе Гей Тук бек Пув Тем ТПг Уаї Авр 405 410 415
Тпув век Агд Тер біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув бек Уа! Меє Нів 420 425 430 сі Аїа Гецш Нів Авп Нів Туг ТПг біп пуб бек Гей бек ІГецй бек Рго 435 440 445 сову «2105 44 «2115» 214 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» фрагмент антитіла «4005 44
Авр І1е сіп Месє ТіПг о біп бек Рго Аза бек ІТецй бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 5 10 15 бі Тс Уаї ТПпг чІ1е ТПг Сув Агуд Аза Бек бій Авп І1І1е Рібе бег Туг 20 25 30
Зо
Тец А1їа Тер Тук біп біп пув сбіп с1іу Ппув бек Рго біп Гец Іец Уаї 35 ТУуУк Авп оТпПг о пув ТБг Геп Аїа сбіц с1іу Уа1і Рго Бек Агд Рпе бек 01Уу бо зек сіу бек біу ТПг біп Рпе бек ІТец Гув І1е Авп Бек Гей сбіп Рго 40 65 70 75 80 бі Авр Рпе сіу Бек Тук Тук Сув біп Нів Нів Тук с1у ТПг Рго РБе 85 90 95 45
ТПЕ Рпе сіу бек сіу ТБПг їув Гей сіц І1е гув5 Агд ТПпг Уаі Аза Аза 100 105 110 50
Ркго Бек Уаії Ріпе І1е Рпе Рго Рго бек Авр бій сбіп Гей пув Бех щу 115 120 125 55 ТПг АТа бек Уа1ї Уа1ї Сув Гецп Гей Авп Авп Рібе Туг Рго Агд сій Аїа 130 135 140 пув Маї біп Тер пув Уаі Авр АвБп Аза Гей біп бек с1у Авп бек біп (516) 145 150 155 160 бі бек Уаії ТП бі біп Авр бек Пув Авр бек ТПг Тукг бек Іец 5ег 165 170 175 зек ТпПг Ген ТПг Гей бек пув Аза Авр Тук бій Ппув Нів Ппув Уа1ї! Туг 180 185 190
А1їа Сув біц Уаї ТБгЕ Нів біп сіу Іецй бек бек Рго Уа1і ТПг Ппув бег 195 200 205
Рпе Авп Агд сбіу б1іц Сув 210 «2105 45 «211» 448 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» фрагмент антитіла «4005 45 бі Маї Гпув Гей Уаі бі бек сі1у сіу с1у Гей Уа1 пув Рго сб1у 01У 1 5 10 15
Зо зек Гей ТПг Іец Рго Сув А1ї1а Аїа бек б1і1у Рпе ТПг Рібе бег Агд Туг 20 25 30
А1їа Меє бек Тер Уаі Агд сіп ТПг Рго бій Гуз Агд Гей сій Тгр Уаї 35 40 45
Аза бек І1ї1е бек бек бі1у б1у Авр ТПг Тук Тук Рго Авр бек Уа1ї! Гув 50 55 бо б1у Акуд Рпе ТПг Уаії Бек Агуд Авр АБп Аза Агуд Авп о ч11е Гецй РіПе Іей 65 70 75 80 біп Меє бек бек Гей Агуд Бек бій Авр ТПг біу Меє Тук Тук Сув Аїа 85 90 95
Акуд Уаі1 Авп о Туг Туг Авр бек бек РПе Тец Авр Тгр Тгр О1у сбіп Щ1У 100 105 110
ТПг ТрПг Гей ТБбг о Уа! бек Бек Аїа бек ТПг Ппув с1у Рго бек Уа1! РіПе 115 120 125
Рго Гец Аза Ркго бек бек Гпув бек ТПг бек бі1у с1у ТПг Аїа Аїа Гей (516) 130 135 140 с1у Сув Геп Уаі Ппув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уа1! ТПг Уаї бек Тгр 145 150 155 160
Авп бек с1іу Аїа Гей ТПг бек сіу Уаії Нів ТПг Рре Рго Аїа Уаі1! Іецй 165 170 175 біп бек бек сіу Гей Тук Бек Гей бек Бек Уа1 Уа1 ТБПг Уаї Рго 5ег 180 185 190 зек Бек Гец біу ТПг біп ТПпг Тук І1е Сув Авп Уаі Авп Нів Гпув Рго 195 200 205 зек Авп ТПг Гуз Маії Авр о Гпув їГув Маї бій Рго Ппув Бек Сув Авр Гув 210 215 220
ТПЕ Нів ТПкг Сув Рго Рго Суб Рго Аза Рго біц Іец Іец с1у с1у Рго 225 230 235 240 зек Уаії Рібпе Гей Рре Рго Рго Ппув Рго їув Авр ТПг Гей Меє І1е 5ег 245 250 255
Акуд ТЕ Рго біц Уаї ТПпг Сув Уаії Уаї Маї Авр Уаі Бек Нів бій Авр
Зо 260 265 270
Ркго сіц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі Авр с1у Уаі бі Уа1ї Нів Авп 275 280 285
З5
А1їа пув ТПг пуб Рго Агкд бій біц біп Тук Авп обБег ТПг Туг Агд Уаї 290 295 300
Уаї бек Уаії гейш ТПг Уа1ї Ггец Нів сіп Авр Тгр Гец АвБп о б1у Гув с1и 305 310 315 320
Тук Ппув Сув Пув Ма! бек Авп пув Аїа Гей Рго Аїа Рго І1е сі Тув 325 330 335
ТПгЕ Іїе Бек пув Аїа пув біу біп Рго Агд біц Рго біп Уаї Тугє ТПг 340 345 350
Тецп Ркго Рго Бек Агуд Авр бій Гей ТПг Гпув Авп о біп Уаї бек Гей ТЕПг 355 36о0 365
Сув Гешп УМаї Ппув с1у Рпе Тукг Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї сі Тгр с1ц 370 375 380 (516) век Авп біу біп Рго бій Ап Авп Туг ГПув ТПг Тбкг Рго Рго Уаі1! Іецй 385 390 395 400
Авр Бек Авр біу бек РПе Рпе Гец Туг бек пуб Гей ТПг Уа1і Авр Гув 405 410 415 зек Акад Тер біп сбіп сб1іу Авп Уаії Рпе бек Сув бек Уа! Меє Нів с1ци 420 425 430
А1ї1а гей Нів Авп о Нів Тук ТПг біп губ бек Гей бек Гей бБег Рго 1У 435 440 445 «2105 46 «2115» 215 «212» БІЛОК «2135 Штучний «220» «223» фрагмент антитіла «4005 46
Авр І1е Уаї Меєсє ТПг біп бек біп Агуд Рпбе Меє бек ТПг Гешй бі Щ1У 1 5 10 15
Авр Акуд Уаї бек Уа1і ТПг Сув пув Аза бек біп АвБп Уаі о1у ТПг Авп 20 25 30
Зо
Ууаї Аза Тер Тук біп сбіп Пув Рго сіу біп бек Рго ув Аї1а еп Ше 35 Тук Бек Аїа бек Туг Агуд Тук Бек сіу Уаі Рго АвБр Агд Рпе ТіПг с1Уу бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1е бек Авп Уа1і сіп б5ег 40 65 70 75 80 бі Авр Теп Аза бій Тук Рпе Сув біп біп Туг Авп Авп Туг Рго Іей 85 90 95 45
Тук ТПкЕ Рпе сіу сіу біу ТБПЕ Пув Гец біц І1е Гу5 Агуд ТПпг Уаї Аїа 100 105 110 50
Аза Ркго бек Уаі! Рпе І1е Рпе Рго Рго бек Авр бій сбіп Гей Ппув б5ег 115 120 125 55 сіу ТБг АТїа бек Уаії Уа1ї Сув Гей Гей АБп Авп Рпе Туг Рго Агд сі1ц 130 135 140
А1їа пув Уаії біп Тер Гуз Маї Авр АБп Азїа Тецп біп бек с1у Авп б5ег (516) 145 150 155 160 біп бій бек Уаі ТП біш біп Авр бек Пув Авр бек ТПг Тукг бек Ієей 165 170 175
Ззек бек ТПг Гей ТПг Гей бек пув Аїа Авр Тук біцш Ппув Нів Тув Уаї 180 185 190
Тук Аїа Сув сій Уаї ТПг Ні сіп сіу Пец бек бек Ркго Уа1і ТПг Гув 195 200 205 зек Рпе Авп Агд біу б1іц Сув 210 215 «2105 47 «211» 449 «212» БІЛОК «2135 Штучний «220» «223» фрагмент антитіла «4005 47 бі Маї біп Гей Уаі бі бек сі1у сіу с1у Гей Уа1 пув Рго сб1у 01У 1 5 10 15
Зо зек Гей пув ІТец бек Сув А1ї1а Аза бек с1іу Рпе ТПг Рібе бек бек Туг 20 25 30
Авр Меє бек Тер Уаі Агд сіп ТПг Рго бій Гуз Агд Гей сій Тгр Уаї 35 40 45
Аза Рпе І1е бек бек Тук б1у с1у Агуд ТПг Тук Туг Аза Авр ТПг Уаї 50 55 бо пув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гпув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80
Тецп біп Ме бек Бек Гей Гпув бек бій Авр ТПг Аїа Меє Ропе Тук Сув 85 90 95
Аза Аза Нів Тукг Рре б1у ТПг бек біу Рго Рпе Аза Тугє Тер 01у сіп 100 105 110 сіу ТК Гецп Уаї ТПг Уаї бек Аїа Аза бек ТПкг о Ппув біу Рго Бек Уаї 115 120 125
Рпе Рго Гец Аза Рго бек бек пуб бек ТПг бек сі1у с1у ТПг Аза Аї1а (516) 130 135 140
Тец б1у Сув Гей Уаії Ппув Авр Тук Рпе Рго бій Ркго Уаї ТіПг Уаї1ї 5ег 145 150 155 160
ТЕр Авп бек с1у Аїа Гецп ТПг бек сіу Уаії Нів ТПг Рре Рго Аїа Уаї1! 165 170 175
Тецп біп бек бек с1іу Гей Тук Бек Гей бек бек Уа1! Уаї ТіПг Уаї1ї Рго 180 185 190 зек бек бек Іец біу ТПг біп ТП Тук І1ї1е Сув Авп Уа1і Авп Нів Гув 195 200 205
Ркго Бек Авп ТПг Гуз Маї Авр о Гув пув УМаї бій Рго Ппув Бек Сув Авр 210 215 220
Тпув ТП Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Гей Гец сС1у с1Уу 225 230 235 240
Рго Бек Уа1і Рібе Гецй Рпе Рго Рго Пув Рго Гув Авр ТПкг Гей Меє І1е 245 250 255 зек Агуд ТПг Рго біц УМаї ТПг Сув Уаії Уаї Уаї Авр Уа1і Бек Нів сіц
Зо 260 265 270
Авр Ркго сій Уаї пуб Рбе Авп о Тгр Туг Уаі Авр б1у Уаі сі Уаї Нів 275 280 285
З5
Авп Аза пуб ТПг Губв Рго Агд біц бі біп Туг Авп о бБег ТПг Туг Агд 290 295 300
Уаї Уаї Бек Уаії Гей ТПг Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гец Авп о б1у Гув 305 310 315 320 сі Тук Ппув Сув Ппув Уа1ї бек Авп Гув Аїа Гей Рго Аза Рго І1е сі1ц 325 330 335
Тпув ТПг І1їе бек Ппув Аїа пув с1іу біп Рго Агуд бій Рго біп Уа1ї! Туг 340 345 350
ТПЕ Гей Рго Рго бек Агд Авр бій Гей ТПг Гпув АвБп обіп Уаї бек Іецй 355 3З6о 365
ТПЕ Сув Гей Уаї пув біу Рое Туг Рго бБег Авр І1е А1ї1а Уаії сій Тгр 370 375 380 (516) бій бек АБп о б1іу біп Ркго бій Авп Авп оТук Ппув ТПг ТБг Рго Рго Уаї 385 390 395 400
Тец Авр бек Авр сіу Бек Рпе Рпе Гей Тук бек Ппув Гей ТПг Уаіїі Авр 405 410 415 пув бек Агуд Тер біп біп б1у Авп Уаї Рре бек Сув бек Уаї Меє Нів 420 425 430 бі Азїа Гей Нів Авп о Нів Тукг ТПг о біп пув бек Гей бек Гец бег Рго 435 440 445 сову «2105 48 «2115» 214 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» фрагмент антитіла «4005 48
Авр І1е сіп Месє ТПг о біп бек Рго Аза бек ІТецй бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 5 10 15
Зо бі Тс Уаї ТПпг чІ1е ТПг Сув Агуд Аза Бек бій Авп І1е Тук бек Туг 20 25 30
Рпе Аїа Ткгр Тук біп сбіп пув біп с1у Пув бек Рго біп Гечп Іецй Уаї 35 40 45
Тук Авп Аза пув І1е Іїец Аї1а сіц сіу Уаі Ркго бек Агкд Ріе бег 01Уу 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг біп Рпе бек ІТец Гув І1е Авп Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе сіу ТПг Тук Тук Сув сбіп Нів Нів Тук б1у І1е Рго Ріе 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу бек сіу ТПг Гуз Гей сіц Гец Гуз Агд ТПпг Уаії Аза Аїа 100 105 110
Рго Бек Уаії Рібе І1е Ррбе Рго Рго бек Авр біц біп Гей Ппув бБег 1У 115 120 125
ТПг Аїа бек Уаї Уаї Сув Іїец Гей Авп Авп Робе Туг Рго Агд сій Аїа (516) 130 135 140 пув Маї біп Тер пув Уаі Авр Авп Аза Гец біп бек б1у АвБп бек сіп 145 150 155 160 бій бек Уаії ТПг сій біп Авр бек Гув Авр бек ТПг Туг бек Гей 5ег 165 170 175 зек ТПг Гец ТПг Іец бек Гпув АТа Авр Тук біп Ппув Нів Ппув Уа1 Туг 180 185 190
А1їа Сув біц Уаї ТБгЕ Нів біп сіу Іецй бек бек Рго Уа1і ТПг Ппув бег 195 200 205
Рпе Авп Агд сбіу б1іц Сув 210 «2105 149 «211» 449 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» фрагмент антитіла «4005 49
Зо біц Гей біп Гей Уаі бі бек сіу сіу Уаі Гей Уа1 пув Рго сб1у 01У 1 5 10 15 зек Гечп пув Гей бек Сув Аїа Аза бек біу Рпбе Аза РПе бек бек Туг 20 25 30
Авр Меє бек Тгр Уаі Агуд біп ТПг Рго бій Гув Агд Гей бій Тер Уаї 35 40 45
ТПг Тук Іїе Авп бек біу біу сіу Ії1е ТПг Тук Тук Рго Авр ТПг Уаї 50 55 бо пув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Агуд Авр АвБп Аза Агуд Авп о ТБПг Іец Туг 65 70 75 80
Тецп біп Ме бек Бек Гей Гпув Бек бій Авр ТПг Аїа І1е Тук Тук Сув 85 90 95
ТПЕ АТа Нів Тук Рібе сіу Бек бек б1іу Рго Рпе Аїа Туг Тер 01у сіп 100 105 110 бі1у ТПпг Гей Уаі ТПг Уаі1і! бек Аза Аза Бек ТПг Ппув с1іу Ркго бек Уаї 60 115 120 125
Рпе Рго Гец Аза Рго бек бек пуб бек ТПг бек сі1у с1у ТПг Аза Аї1а 130 135 140
Тем біу Сув Гецп Уаії Ппув Авр Тук Рібе Рго бій Рго Уа1! ТПг Уаї 5екг 145 150 155 160
ТЕр Авп бек сіу Аїа Гец ТПг бек сіу Уаії Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї 165 170 175
Тецп біп бек бек с1іу Гей Тук Бек Гей бек бек Уа1! Уаї ТіПг Уаї1ї Рго 180 185 190 зек бек бек Іец біу ТПг біп ТП Тук І1ї1е Сув Авп Уаі Авп Нів Гув 195 200 205
Ркго Бек Авп ТПг Гуз Маї Авр о Гув пув УМаї бій Рго Ппув Бек Сув Авр 210 215 220
Пув ТПкг Нів ТП о Сув Ркго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іей Гецп сС1іу с1Уу 225 230 235 240
Ркго Бек Уаії Рпе Іїецй Рпе Рго Ркго Гув Рго Гув Авр ТПг Ге Меє Те
Зо 245 250 255 зек Агуд ТПг Рго біц УМаї ТПпг Сув Уаії Уаї Уаї Авр Уаї бек Нів бій 260 265 270
З5
Авр Ркго сій Уаї пуб Рбе Авп о Тгр Туг Уаі Авр б1у Уаі сі Уаї Нів 275 280 285
Авп Аза пуб ТПг пуб Рго Агд біц бі біп Тук Авп о бек ТПг Туг Агд 290 295 300
Уаї Уаї Бек Уаї Гей ТБПг Уаї Іїей Нів сбіп Авр Тер Тей АБп о1Уу Гув 305 310 315 320 бі Тук Гпув Сув Ппув Уа1 Бек Авп Гув Аза Тїец Рго Аї1а Рго ІШе сСі1и 325 330 335
Тпув ТПг І1їе бек Ппув Аїа пув с1іу біп Рго Агуд бій Рго біп Уа1ї! Туг 340 345 350
ТПЕ Гей Рго Рго бБег Агд Авр біцп Гей ТПг Гпув Авп о біп Уаї бек Іей 355 3З6о 365 (516) ТПЕ Сув Гей Уаї Ппув с1у Рпе Туг Рго бек Авр І1їе Аїа Уаї сі Ткгр 370 375 380 бі бек АвБп сіу біп Рго бій Авп Авп о Туг Ппув Тс ТБг Рго Рго Уаї 385 390 395 400
Тем Авр Бек Авр сіу бек РіПе РібПе Гей Тук бек Пув Тем ТПг Уаї Авр 405 410 415
Тпув век Агд Тер біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув бек Уа! Меє Нів 420 425 430 бі Азїа Гей Нів Авп о Нів Тукг ТПг о біп пув бек Гей бек Гец бег Рго 435 440 445 сову «2105 50 «2115» 214 «212» БІЛОК «2135 Штучний «220» «223» фрагмент антитіла «4005 50
Зо
Авр І1е сіп Месє ТПг о біп бек Рго Аза бек ІТецй бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 5 10 15
Сі Тк Уаї ТрПг Іїе ТБг Сув Агуд Аїа бек бій АвБп І1е Тук бек Туг 20 25 30
Тец А1їа Тер Тук біп біп пув сбіп с1іу Ппув бек Рго біп Гец Іец Уаї 35 40 45
Тук Авп Аза пуб ТПг ІТец ТПг бій сбі1у Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех 0Щ1У 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг біп Рпе бек ІТец Гув І1е Авп Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе сіу Бек Тук Тук Сув біп Нів Нів Тук с1у ТПг Рго РБе 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу бек біу ТПЕ пуб Гецп біц Іїе Муз Агуд ТПг Уаії Аїа Аї1а 100 105 110
Ркго Бек Уаії Ріпе І1е Рпе Рго Рго бек Авр бій сбіп Гей пув Бех щу 60 115 120 125
ТПг Аїа бек Уаї Уаї Сув Іїец Гей Авп Авп Робе Туг Рго Агд сій Аїа 130 135 140 пув Маії біп Тер пув Уа1і Авр Авп Аза Гей біп бек сб1у АвБп бек сіп 145 150 155 160 бі бек Уаії ТП бі біп Авр бек Пув Авр бек ТПг Тукг бек Іец 5ег 165 170 175 зек ТПг Гец ТПг Іец бек Гпув Аза Авр Тук біп Ппув Нів Ппув Уа1 Туг 180 185 190
А1їа Сув біц Уаї ТБгЕ Нів біп сіу Іецй бек бек Рго Уа1і ТПг Ппув бег 195 200 205
Рпе Авп Агд сбіу б1іц Сув 210 «2105 51 «2115» 120 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність
Зо «2205 «223» фрагмент антитіла «4005 ч406м51 сій Маї біп Гецп сіп бій бек б1іу Рго сб1у Гешп Уаі Пув Рго б1у С01У 1 5 10 15 зек Гец бек Іец бек Сув А1ї1а Аїа бек б1у Рпе Уа1і РПе Бек бек Туг 20 25 30
Авр Меє бек Тер Уаі Агд біп ТБПг Рго б1п Агуд Агд Гей бі Тер Уаї 35 40 45
Аза Тук І1їе бек бек біу бі1у бі1у І1е ТПг Тук Рпе Рго Бек ТПг Уаї бо 50 пув б1у Акуд Рпе ТПг Уа1і Бек Агуд Авр Авп Аїа Гпув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80 55 Пе біп Мес Авп бек Гей ТПг бек бій Авр ТПг Аїа І1е Туг Тук Сув 85 90 95
Аза Аза Нів Тукг РрПе біу бек бек біу Рго Рпе Аза Туг Тгр с1у сіп 60 100 105 110 сбі1у ТПпг Гей Уаі ТПг Уа1 бек Аїа 115 120 «2105 чьюБ52 «2115 702 «212» БІЛОК «213» Ношто варієпь «4005 Д 52
Меє сій Бек Рго бек АТа Рго Рго Нів Агуд Тгр Сув Іїе Рго Тер сіп 1 5 10 15
Акд Гей Ггец Гец ТПг Аза бек Гец ІТецйп ТП Рпе Тгр АвБп Рго Рго ТЕГ 20 ТПЕ АТїа Ппув Гей ТПг І1е бій бек ТБПг Рго Рбе Авп Уаі Аїа сі Щ1У пув біц Уаї Гей Гей Ггеш Уа1і Нів Авп Гей Рго сіп Ні Гей Рое с1Уу 25 50 55 бо
Тук Бек Тер Тук Мпув біу біц Агд Уаі Авр с1у АБп Агуд біп І1е І1е 65 70 75 80
Зо сі1у Тук Маії І1е с1у ТПг сбіп сбіп Аза ТПг Рго сіу Рго Аїа Туг 5ег 85 90 95
З5 сб1у Акд бій І1їе Іїе Тук Рго Авп Аїа Бек Гей Гей І1е сбіп АБп І1е 100 105 110 40 І1їе біп Авп Авр ТПг сб1у Рпе Тук ТПг ІТей Нів Уаії І1їе Пув бек Авр 115 120 125
Тец Маі АБп бій бі Аїа ТПг сіу сбіп Рпе Акуд Уа1 Тук Рго сій Іей 45 130 135 140
Ркго Ппув Рго бек І1е бек Бек Авп АвБп бек Пув Рго Уа1і бій Авр Гув 145 150 155 160
Авр Аза Уаії Аза РоПе ТПг Сув біц Рго бій ТПг біп Авр Аїа ТПг Туг 165 170 175
Тецп Тер Тер Уаі Авп Авп біп бек Гей Рго Уа1і бек Рго Агд Іец біп 180 185 190 (516) Пен бек АвБп о б1іу Авп Акуд ТБг Гей ТБг Гей Рре Ап Уа! ТПг Агд Авп 195 200 205
Авр ТПг Аїа бек Тук пув Сув біц ТП біп Авп Рго Уаі бБег Аїа Аг4д 210 215 220
Агдуд Бек Авр бек Уаії Іїе Гей Авп Уаі Гей Тук сб1у Рго Авр Аїа Рго 225 230 235 240
ТПЕгЕ Іїе Бек Рго Гец Авп ТПг бек Туг Агуд бек біу бій АвБп Гецй Авп 245 250 255
Тец бек Сув Нів Аза Аїа бек Авп Рго Рго Аїа сіп Тук бек Тгр РБПе 260 265 270
Уаї Авп сб1у ТПг Рбе сіп біп бек ТПг сбіп біц їец Роре І1е Рго Авп 275 280 285
І1е ТБПг Уаї Авп Авп бек біу бек Туг ТПг Сув біп Аза Нів Авп бег 290 295 300
Авр ТПг о с1у Тей АБп Агуд ТПс Того оУаї ТБг Тс І1е ТПс Уаї Туг А1а 305 310 315 320 біц Рко Рго Ппув Рго Рпе Іїе ТПг Бек Авп Авп бек Авп Рго Уа! бій
Зо 325 330 335
Авр бій Авр Аза Уаії Аза їецп ТПг Сув бій Рго бій І1е сбіп Ап о ТПг 340 345 350
З5
ТПЕ Тук Гей Тер Тер Уаії АвБп Авп о біп бег Гец Рго Уаі! бек Рго Аг4д 355 3З6о 365 теп біп Гей Бек Авп Авр Авп Агуд ТпПг Гей ТпПг Гей Гей бек Уаії! ТЕПг 370 375 380
Агуд Авп о Авр оУа1! сб1у Рго Тук сбіц Сув с1у І1е сбіп Авп сій Іецй 5ег 385 390 395 400
Уаї Авр Нів Бек Авр Рго Уаії Іїе Гей Авп Уаї Іец Тук б1у Рго Авр 405 410 415
Авр Ркго ТПг І1е бек Ркго бек Тук ТПг Тук Тук Агд Рго б1у Уа1і1 Авп 420 425 430
Тецп бек Гей бек Сув Нів Аїа Аза Бек Авп Рго Рго Аїа сбіп Туг 5бег 435 440 445 (516) Тер геп Іїе Авр с1у АБп Іїе сбіп сбіп Нів ТбПг біп сбіц Гей Рпе І1е 450 455 460 век Авп І1е ТПг біцш Гув АвБп бек біу Гей Тук ТПг Сув біп Аїа Авп 465 470 475 480
Авп бек Аза бек сбіу Нів бек Агуд ТПг ТБПг Уаї Ппув ТПг І1е ТіПг Уаї 485 490 495 зек Аїа біц Тец Ркго Гув Рго бек І1е бек бек Авп Авп бег КТув Рго 500 505 510
Ууаї бій Авр пув Авр Аїа Уаії Аїа Рпе ТПг Сув біц Рго б1п Аз1а сіп 515 520 525
АвпоТПЕ ТБг Тук Тец Тгр Тер Уаі АвБп с1іу біп Бек Гей Рго Уаії 5ег 530 535 540
Рго Агд Пец біп ІТец бек Авп біу АвБп Агуд ТПг Гей ТПг Гей Ропе Авп 545 550 555 560
Уа1ї ТЕ Агуд Авп Авр Азїа Агуд Аза Тук Уа1і Сув сб1у І1е сбіп Авп 5бег 565 570 575
Уаї бек Аза Авп Акуд бек Авр Рго Уа1 ТПг Ггец Авр Уаї Іецй Тує ШУ
Зо 580 585 590
Рго Авр ТПг Рго І1е І1е бек Рго Рго Авр Бек бек Тукг Гец бег 01Уу 595 бо 605
З5
Аза Авп о Гец Авп о Тец бек Сув Нів бек Аза Бек Авп Рго Бек Рго сіп 610 615 620
Тук Бек Тер Агуд І1е АвБп біу І1е Рго біп біп Ні ТПг біп Уаї Гей 625 630 635 640
Рпе Іїе Аїа Гуз І1е ТП Рго Авп Ав5п Авп о б1іу ТПг Тук Аїа Сув Ріре 645 650 655
Уаї Бек Авп Ггеш Аза ТПг с1у Агуд Авп Авп о бег І1е Уаі Гув Бек Ше бо бе5 670
ТПг Уа1 Бек Аїа бек біу ТПг Бек Рго біу Гец бек Аї1а с1у Аїа ТПг 675 68 685
Ууаї сб1у Іїе Меє Іїе сіу Уаї гей Уа1 сіу Уаї Аїа Іец І1е 690 695 700 60 «2105 53
«2115» 654 «212» БІЛОК «2135 Масаса Тавсісціагів «4005 53 біп Гей ТПпг І1їе бі Бек Агуд Рго Рпе А5п Уаі1 Аїа сіц с1у пув б1іц 1 5 10 15
Уаї Гей гейш Ггеш Аза Нів Авп Уа1і бек сбіп Авп Тец Рпе с1у Ту Ше 20 25 30
Тер Тук пув с1у бій Агуд Уаії Авр Аза бек Акуд Агу І1е с1у бек Сув 35 40 45
Ууаї І1їе Агу ТПг сіп сбіп І1е ТПг Рго сіу Рго Аїа Ні бек сб1у Аг4д 50 з9 бо бі Тс І1е Авр Рпе Ап Аїа бек Гей Гей Іїе сбіп АвБп Уаі ТПпгЕ сіп 65 70 75 80 зек Авр ТПг біу бек Тук ТПг І1е біп Уаї І1е пув бій Авр Гей Уаї 85 90 95
Зо
Авп о сбіц бі Аза ТБ б1у біп Рбе Агуд Уаї Тук Рго біц Тецй Рго Гу 100 105 110
Рго Тук І1е ТПг Бек Авп Авп бек Авп Рго І1е біц Авр Гув АвБр А1а 115 120 125
Ууаї Аїа гей ТПг Сув сій Рго бі ТП біп Авр ТпПгс ТП Тукг Гей Тгр 130 135 140
ТЕр Уаі1 Авп Авп обіп бег Тец Рго Уаії бек Рго Агд Іец бій Іец 5ег 145 150 155 160 век Авр АвБп Агд ТПг ТІТецй ТПг о Уаі Рпе Ап І1їе Рго Агд АвБп АБр ТЕГ 165 170 175
ТПг Бек Тук Ппув Сув біц ТБ біп Авп о Рго Уа! бек Уаі Агд Агд 5ег 180 185 190
Авр Рго Уа1і ТБПг Гец Авп Уаі Гей Тук сб1у Рго АвБр Аза Рго ТПг І1е 195 200 205 зек Рго Гец АвБп о ТПг Рго Туг Агд Аї1а б1у бій Тук Гей Авп Гей ТЕГ (516) 210 215 220
Сув Нів Аза Азїа Бек Авп Рго ТПг Аза біп Тук Рібе Тер Рібе Уаї1ї Авп 225 230 235 240 сі1у Тк Рре біп сбіп бек ТПг біп бій Гешп Рпе І1їе Рго АБп І1е Тіг 245 250 255
Уаї Авп Авп бек сіу бек Тук Меє Сув біп Аїа Нібв АвБп бек Аїа ТПг 260 265 270 б1у Гей АвБп Агуд ТпПг ТпПг Уа1! ТпПг Аза Іїе ТпПг Уа1 Туг Аза сій Іей 275 280 285
Ркго Ппув Рго Туг І1е ТПг бБег Авп АвБп бек АвБп Рго Іїе бій Авр Гув 290 295 300
Авр Аза Уаї ТіПг Іец ТПг Сув біц Рго бій ТПг біп Авр Тс Тпг Туг 305 310 315 320
Тем Тер Тгр Маії Авп Авп о біп Акуд Гей бек Уаії бек бек Агуд Гей сі1ц 325 330 335
Тецп век Авп Авр Ап Агуд Тпг Гей Тпг Уаі Рпе Ав5п І1І1е Рго Агд Авп
Зо 340 345 350
Авр ТПг ТБЕ Ре Тук б1іцп Сув біц ТБ біп Авп Рго Уаі Бек Уа1 Агд 355 3З6о 365
З5
Акуд Бек Авр Рго Уаі! ТПг ІТецй Авп Уаії Іецйп Тук с1у Рго Авр Аїа Рго 370 375 380
ТПгЕ Іїе Бек Рго Гец Авп о ТПг Рго Туг Агуд Аїа б1у бій АвБп Гей АвБп 385 390 395 400
Тем бек Сув Нів Аїа Аза бек Авп Рго Аї1а Аза сіп Тук Роре Тгр Ріе 405 410 415
Уаї Авп сб1у ТПг Рбе сіп біп бек ТПг сбіп біц їец Роре І1е Рго Авп 420 425 430
І1е ТБг Уаї Авп Авп бек біу бек Тук Меє Сув сбіп Аза Нів Авп бег 435 440 445
Аза ТПг с1і1у Гец АвБп Агуд ТпПг Тс Уаії Тс Аза чІ1е ТПг Уа1 Тук Уаї 450 455 460 (516) січ Гей Рго Ппув Рго Туг І1е бек бек АБп Авп бек Авп Рго І1е сі1ц 465 470 475 480
Авр пув Авр Аза Уа1! ТПг Теп ТПг Сув б1ц Рго Уаі Аза бій Авп ТП г 485 490 495
ТПЕ Тук Гей Тер Тгр Маії Авп АвБп о біп бек Гей бек Уаї Бек Рго Аг4д 500 505 510
Тецп біп Гей бек Авп б1іу Авп Агуд І1їе Гей ТПг Гей Гей бек Уаії! ТЕПг 515 520 525
Ак Авп о Авр о ТБПг біу Рго Тук біц Сув б1у І1е сбіп Авп Бек бій б5ег 530 535 540
Аза пув Агд бБег Авр Рго Уа! ТПг Іец АвБп Уа! ТПг Тук о1у Рго Авр 545 550 555 560
ТПЕ Рго Іїе І1їе бек Рго Рго Авр Гец бек Туг Агуд Бек о1у Аїа Авп 565 570 575
Тем Авп Гей бек Сув Нів бек Авр бек АБп Рго бек Рго біп Туг 5ег 580 585 590
ТЕр гец Іїе Авп сіу ТБПг Іец Акуд біп Нів ТБг біп Уаі1і Гей Робе І1е
Зо 595 (51048) 605 зек Мпув І1е ТПг бек АвБп Авп АвБп обіу Азїа Туг Аїа Сув Рпе Уа1і1 5ег 610 615 620
З5
Ап о гей Аїа ТПг о б1у Агуд АБп о Авп обег І1е Уа1 Ппув Авп І1е бек Уаї 625 630 635 640 зек бек біу Авр бек Аза Рго біу бек бек біу Гей бек Аїа 645 650 «2105 ч54 «2115» 214 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» антитіло «4005 54
Авр чІ1е сіп Меє ТПг сбіп бек Рго Аїа бек ІТей бек Аза бек Уа1і 01Уу 1 в) 10 15 бі Тс Уаї ТПпг чІ1е ТПг Сув Агуд Аза Бек бій Авп І1І1е Рібе бег Туг 60 20 25 30
Тец А1їа Тер Тук біп біп пув сбіп с1іу Ппув бек Рго біп Гец Іец Уаї 35 40 45
ТУкг Авп о ТпПг Акуд ТБг Ге Аза бі с1іу Уа1і Рго Бек Агд Рпе бек 01Уу 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг біп Рпе бек ІТец Гув І1е Авп Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе сіу Бек Туг Тук Сув біп Нів Нів Тук с1у ТПг Ркго РІГе 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу бек сіу ТБПг їув Гей сіц І1е гув5 Агд ТПпг Уаі Аза Аза 100 105 110
Ркго Бек Уаії Ріпе І1е Рпе Рго Рго бек Авр бій біп Гей пув бег 01Уу 115 120 125
ТПг АТа бек Уа1ї Уа1ї Сув Гецп Гей Авп Авп Рібе Туг Рго Агд сій Аїа 130 135 140 пув Маї біп Тер пув Уаі Авр АвБп Аза Гей біп бек б1у АвБп бек сіп
Зо 145 150 155 160 бі бек Уаії ТП бі біп Авр бек Пув Авр бек ТПг Тукг бек Іец 5ег 165 170 175
З5 зек ТПг Гец ТПг Іец бек ув Аза Авр Тук бій Ппув Нів Ппув Уа1ї! Туг 180 185 190
А1їа Сув біц Уаї ТБгЕ Нів біп сіу Іецй бек бек Рго Уа1і ТПг Ппув бег 195 200 205
Рпе Ап Акуд б1у бій Сув 210 «2105 щМО55 «2115 107 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» антитіло «4005 5:55
Авр І1е сіп Месє ТПг о біп бек Рго Аза бек ІТецй бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 60 1 в) 10 15
Авр ТПг Уаї ТіПг І1е Тпг Суб Агуд Азїа бек бій АБп І1е РПпе бек Туг 20 25 30
Тем Аїа Тгр Тук сіп біп Ппув Рко біу Ппув Бек Рго ТУув ТІецй Гей Уаї 35 40 45
Тук Авп ТПг Агуд ТБг Іец Азї1а сбіц сіу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех щЩ1У 50 з9 бо зек сіу бек біу ТПг біп Рпе бек ІТецй ТПг І11е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе сіу Бек Тук Тук Сув біп Нів Нів Тук с1у ТПг Рго РБе 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу бек біу ТПг Гув Гец біц І11е Гув 100 105 «2105 56 «211» 418 «212» БІЛОК «213» Ношто варієпь
Зо «220» «221» ДОМЕН «222» (1)..(394) «223» позаклітинний домен СЕАСАМ1І людини
З5 «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (395)..(418) «223» розширення з Нібз-міткою 40 «4005 МЯ56 біп Гей ТПг Тпг обі бек Меє Рго Рпе Авп Уаі Аза сіц с1у Гпув с1и 1 5 10 15 45
Уаї Гей гей ге Уа1! Нів Авп Гей Рго біп біп їец Рпе с1у Тук 5бег 20 25 30 50
ТЕр Тук пув с1у біц Агд Уаі Авр бі1у АБп Акуд біп І1е Уаї сі1у Туг 55 Аї1а чІ1е с1у ТБг біп сбіп Аїа ТП Рго с1іу Рго А1їа Авп бек б1у Агд бо біц Тс І1е Туг Рго Авп Аза бек Гец Гец І1е біп АвБп Уа! ТПпгЕ сіп (516) 65 70 75 80
Авп о Авр оТПг біу Роре Тук ТПг їец біп Уаї І1їе Ппув Бек Авр Гей Уаї 85 90 95
АБп обіц бій Аза ТПг б1іу біп Рбе Нів Уаі! Тук Рго бій Гей Рго Гув 100 105 110
Ркго Бек І1е бек Бек АвБп Авп бБег Авп о Рго Уаі сій Авр Гув Авр Аїа 115 120 125
Ууаї Аза Рпе ТПг Сув сій Рго біц ТП біп Авр ТпПгс ТП Тукг Гей Тгр 130 135 140
ТЕр Іїе Авп Авп о біп бек Тец Рго Уаії бек Рго Агд Іец біп Гец 5ег 145 150 155 160
Авп ос1у Авп Агуд Тс Тецй ТПг Гей Гей бек Уаі ТПг Агуд Ап Авр То г 165 170 175 с1у Рго Тук біц Сув бій І1їе біп Авп Рго Уаії бек Аза АвБп Агд 5ег 180 185 190
Авр Ркго Уаії ТіПг Іец Авп о Уаї ТПг Тук б1у Рго Авр ТПг Рго ТПг Те
Зо 195 200 205 зек Рго Бек Авр ТПг Тук Туг Агд Рго бі1у А1ї1а АБп Гей бБег Гей б5ег 210 215 220
З5
Сув Тук А1ї1а Аза Бек Авп Рго Рго Аїа біп Туг бек Тер Гец І1е Авп 225 230 235 240 бі1у ТПпЕ Рпе сіп сбіп Бек ТПг сбіп бій Гей Рпе І1їе Рго АвБп І1е ТЕГ 245 250 255
Уа1 Авп Авп бек с1іу бек Тук ТПг Сув Нів Аза Авп Авп бек Уа1ї! ТЕГ 260 265 270 сб1у Сув Авп Агуд ТпПг ТпПг о Уа1ї пув ТПг Іїе Іїе Уа1! ТБг біц Іец 5ег 275 280 285
Ркго Уаії Уаї Аїа пуб Рго біп І1е Гу5 Аза бек Ппув ТПг ТПг Уа1 ТЕГ 290 295 300 б1у Авр Гув Авр Бек Уа1і Авп Гей ТПг Сув Бек ТПг Авп Авр ТПг 01У 305 310 315 320 (516) І1їе бек Іїе Агуд Тгр Рпе Рпе Ппуб5 Ап о біп бек Гей Рго бек бек с1іц 325 330 335
Аку Меє пуб Гец бек біп б1у Авп ТП ТБПг Гей бек Іїе Авп Рго Уаї 340 345 350 цув Агкуд біц Авр Аїа с1іу ТПг Туг Тгр Сув бій Уаі Рібе АБп Рго Пе 355 3З6о 365 зек Мпув Авп о біп бек Авр Рго І1е Меє ІТецй Авп Уаі Авп Туг Авп Аїа 370 375 380
Тец Ркго біп сій Авп б1іу Гей бек Рго сіу Бек сіу бек сіу бек 01Уу 385 390 395 400
Тец АБп Авр І1е Рпе біш Аза сіп пув Іїе сій Тер Нів Нів Нів Нів 405 410 415
Нів Нів «2105 557 «211» 418 «212» БІЛОК «2135 Масаса Тавсісціагів
Зо «220» «221» ДОМЕН «222» (1)..(394) «223» позаклітинний домен СЕАСАМІ яванскої макаки
З5 «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (395)..(418) «223» розширення з Нібз-міткою 40 «4005 57 біп Гей ТПпг І1їе бі Бек Агуд Рго Рпе А5п Уаі1 Аїа сіц с1у пув б1іц 1 5 10 15 45
Уаї Гей гей Ггеш Аза Нів Авп Гей бек біп Авп їец І1е сб1у Тук Авп 20 25 30 50
Тер Нів пув с1іу біц Агкуд Уаі Авр Аза пуб Агд Тецй І1е Уаії Аїа Туг 55 Уаї І1е сбіц ТПК пув біп ТПг Тс Рго с1іу Рго Аїа Нів бек с01у Агд бо бі Меє І1е Туг Бек Ап Аза бек Гей Гей Іїе сіп Авп Уаї ТіПг сіп (516) 65 70 75 80
Авп о Авр оТПг біу бек Тук ТПг Гец біп УМаї І1ї1е Ппув с1у Авр Іец Уаї 85 90 95
АБп обіц бій Аза ТПг сб1у біп Рбе Агуд Уаї Тук Рго бі Гецй Рго Тув 100 105 110
Рго Авп о І1е ТПг І1е АБп АвБп о бБег АвБп о Рго Уаі бій Авр Гув Авр Уаї 115 120 125
Уаї ТПпгЕ Рпе ТПг Сув біц бек біц Аза сбіп Авр ТПг Тс Тук Геч Тгр 130 135 140
Тер Уаі1 Авп Авп о біп бек Тецй Рго Уаі бек Бек Агд Гей біп Гец б5ег 145 150 155 160
Авп ос1іу Авп о Гпув ТБПг Тецй ТПг Гец ІТец бек Уаі Гей Агуд Авп Авр ТЕГ 165 170 175 с1у Рго Тук біц Сув бій І1їе біп Авп Рго Уаі бек Аїа Авп Агд 5ег 180 185 190
Авр Ркго Уаії ТіПг Іец Авп о Уаї ТПг Тук б1у Рго Авр ТПг Рго ТПг Те
Зо 195 200 205 зек Рго бек Авр ТПг Тук Тугк Агуд Рго сбіу Аїа Ап Гей бег Іец 5ег 210 215 220
З5
Сув век Аї1а Азїа Бек Авп Рго Рго Аїа біп Туг бек Тер Гец І1е Авп 225 230 235 240 бій Тк Рре біп сбіп бек ТПг біп біц Гецп Рпе І1їе Рго АБп І1е Тіг 245 250 255
Уа1 Авп Авп бек с1іу бек Тук ТПг Сув Нів Аза Авп Авп бек Уа1ї! ТЕГ 260 265 270 б1у Акуд АБп Агуд ТпПг ТПг Уа1ї Ппув Меє Іїе Іїе Уа1 бек біц сіп 5ег 275 280 285
Тец Маї Уаї Аза сбіп Рго сбіп Іїе Ппув Аїа бек Ппув ТПг ТПг Уаї Тс 290 295 300 бі Авр Гув Авр о Тук Уа1і Авп Гей ТПг Сув Бек ТПг Авп Авр ТПг 01У 305 310 315 320 (516) І1їе бек Іїе бек Тер Рпе Рпе Пув Авр біп бек Гей Рго бек бек с1іц 325 330 335
Аку Меє пуб Гец бек біп Авр АБп Аза ТПг Гей бек Іїе Авп Рго Уаї 340 345 350 цув Агкуд біц Авр Аїа с1іу АвБп Туг бек Сув бій Уаі Рібе Авп Гей Те 355 3З6о 365 зек Мпув Авп Агд бек Авр Рго І1е Уа! Іецйп І1е Уаі Авп Туг Авп Авп 370 375 380
Агуд Аїа сбіп біц АвБп о І1е Тецй Рго Аїа Сі1іу бек бі1у Бек с1у Бех щу 385 390 395 400
Тец АБп Авр І1е Рпе біш Аза сіп пув Іїе сій Тер Нів Нів Нів Нів 405 410 415
Нів Нів «2105 58 «2115 675 «212» БІЛОК «213» Ношто варієпь
Зо «220» «221» ДОМЕН «222» (1)..(651) «223» позаклітинний домен СЕАСАМ5 людини
З5 «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (652)..(675) «223» розширення з Нібз-міткою 40 «4005 58
Тпув Гей ТПг І1їе бій Бек ТПг Рго Рпе Авп Уаі1 Аза сіц с1у пув б1іц 1 5 10 15 45
Уаї Гей гей ге Уа1! Нів Авп Гей Рго Ссіп Нів їец Рпе сб1у Тук 5бег 20 25 30 50
ТЕр Тук пув с1у біц Агкд Уаі Авр с1іу АвБп Агд біп І1е І1е сС1Уу Туг 55 Уаї І1е с1у ТПК сбіп біп Аза ТПг Рго сіу Рго Аїа Туг Бек с01у Агк4д бо біц І1е І1е Туг Рго Авп Аза бек Гей Гей Іїе сіп АвБп І1е І1е сіп (516) 65 70 75 80
Авп о Авр оТПг біу Рое Тук ТПг їец Ні Уаї І1їе Ппув Бек Авр Гей Уаї 85 90 95
АБп обіц бій Аза ТПг сб1у біп Рбе Агуд Уаї Тук Рго бі Гецй Рго Тув 100 105 110
Ркго Бек І1е бек Бек АвБп Авп бек Гу Рго Уаі сій Авр Гпув Авр Аїа 115 120 125
Ууаї Аза Рпе ТПг Сув бій Рго бій ТБг біп Авр Аза ТПг Тук Ге Тгр 130 135 140
ТЕр Уаі1 Авп Авп обіп бег Тец Рго Уаії бек Рго Агд Іец біп Гец 5ег 145 150 155 160
Авп ос1у Авп Агуд Тс Тецй ТПг Гец Роре АвБп Уа! ТПг Агуд Ап Авр То г 165 170 175
А1їа бек Тук їув Сув бій ТПК біп Авп Ркго Уаії Бек Аїа Агд Акд 5ег 180 185 190
Авр Бек Уаї І1ї1е Іецшц АвБп Уаї Гец Тук б1у Рго Авр Аза Рго ТПг Іе
Зо 195 200 205 зек Рго Гец АвБп о ТПг бек Туг Агд бек бі1у бій Авп Гей Авп Гей б5ег 210 215 220
З5
Сув Нів Аза Азїа бек Авп Рго Рго Аїа біп Туг Бек Тер Рібе Уа1і Авп 225 230 235 240 бі1у ТПпЕ Рпе сіп сбіп Бек ТПг сбіп бій Гей Рпе І1їе Рго АвБп І1е ТЕГ 245 250 255
Уа1 Авп Авп бек с1іу бек Туг ТПг Сув біп Аїа Нів Авп бек Авр ТЕПг 260 265 270 б1у Гей АвБп Агуд ТПг ТпПг о Уа1! ТПпс Тс Іїе ТПг Уа1! Туг Аза бій Рго 275 280 285
Ркго Ппув Рго РоПе І1е ТПг бек Авп АвБп бек Авп Рго Уаії біц АБр б1ц 290 295 300
Авр Аза Уаії Аїа Іїецйп ТПг Сув біц Рго б1п І1е сбіп АвБп ТПг ТпПг Туг 305 310 315 320 (516) Тем Тер Тгр Маії Авп Авп о біп бек Гей Рго Уа1і бек Рго Агд Геч сіп 325 330 335
Тецп век Авп Авр Авп Агуд Тпг Гей ТпПг Гей Гей бек Уаї ТБг Агд Авп 340 345 350
Авр Уаї с1іу Ркго Тук біцш Сув с1у І1е біп Авп бій Гей бек Уаії Авр 355 3З6о 365
Нів Бек Авр Рго Уаії І1е Іїец Авп Уаї Гец Тук б1у Рго Авр АвБр Рго 370 375 380
ТПЕ Іїе Бек Рго бек Тук ТПг Тук Тук Агуд Рго сіу Уа1і Авп Гец 5ег 385 390 395 400
Тец бек Сув Нів Аза Аїа бек Авп Рго Рго Аїа сіп Тукг бек Тгр Іей 405 410 415
І1е Авр б1у АБп І1е біп сбіп Нів ТПпг о біп бій Гей Рпе Іїе Бек Авп 420 425 430
І1їе ТПг біц Гпув АБп о бек с1у Геп Тугк ТБг Сув біп Аза Авп Авп бег 435 440 445
Аза бек сіу Нів Бек Агуд ТПг ТПг оУаї Гув ТПг І1ї1е ТПг Уа1і бек Аї1а
Зо 450 455 460 біц Гей Рго Ппув Рго Бек Іїе Бек Бек Авп Авп бек пуб Рго Уаії бій 465 470 475 480
З5
Авр пув Авр Аза Уаі Аза Рпе ТПг Сув бій Рго бій Аза біп Авп ТП г 485 490 495
ТПЕ Тук Гей Тер Тер Уаі Авп сіу біп бек Гец Рго Уаії бек Рго Аг4д 500 505 510
Пес біп Ге бек Авп с1у АвБп Акуд ТБг Гей ТПг Гей Рібе Авп Уаї Тіг 515 520 525
Ак Авп о Авр Аза Агуд Аза Тук Уаії Сув б1у І1е сбіп Авп Бек Уа1ї! 5ег 530 535 540
Аза Авп Агуд бег Авр Рго Уа! ТПг Іец Авр Уаї Гей Тук с1у Рго Авр 545 550 555 560
ТПЕ Рго Іїе Іїе бек Рго Рго Авр бБекг бек Туг Іец бек б1у Аїа Авп 565 570 575 (516) Тем Авп Гей бек Сув Нів бек Аза бек АБп о Рго бек Рго біп Туг 5ег 580 585 590
ТЕр Агуд І1ї1е Авп сіу І1е Рго сбіп сіп Ні ТПг біп Уаї еп Рпе Пе 595 бо 605
А1їа Ппув І1їе ТБг Рго АБп о Авп Авп о с1іу ТБг Туг Аїа Сув Рпе Уа1! 5ег 610 615 620
Ап о гей Аїа ТПг б1у Агуд АБп о Авп обег І1е Уаі Ппув Бек Іїе ТПг Уаї 625 630 635 640 зек Аїа бек біу ТПг бек Рго біу Іец бек А1їа бек сіу Бек с1іу бБег 645 650 655 сб1у Гей АвБп Авр Іїе Рпе сіц Аза сбіп пув Ії1е сіц Тегр Нів Нів Нів 6бво 665 670
Нів Нів Нів 675 «2105 59 «2115» 678 «212» БІЛОК «2135 Масаса Тавсісціагів
Зо «220» «221» ДОМЕН «222» (1)..(654) «223» позаклітинний домен СЕАСАМО5 яванскої макаки
З5 «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (655)..(678) «223» розширення з Нібз-міткою 40 «4005 59 біп Гей ТПпг І1їе бі Бек Агуд Рго Рпе А5п Уаі1 Аїа сіц с1у пув б1іц 1 5 10 15 45
Уаї Гей гей Ггеш Аза Нів Авп Уа1і бек сбіп Авп їец Рпе с1у Тук Ше 20 25 30 50
ТЕр Тук Ппув с1у біц Агд Уаі Авр Аза бБег Агд Агуд І1е с1у Бек Сув 55 Уаї І1ї1е Агд ТПкК сіп біп І11е ТБПг Рго с1іу Рго Аїа Нів бек б1у Агд бо бі Тс І1е Авр Рпе Ап Аза бек Гей Гей Іїе сіп Авп Уаї ТіПг сіп 65 70 75 80 60 зек Авр ТПг біу бек Тук ТПг І1е біп Уаї І1ї1е Ппув біц Авр Іец Уаї 85 90 95
АБп обіц бій Аза ТПг сб1у біп Рбе Агуд Уаї Тук Рго бі Гецй Рго Тув 100 105 110
Ркго Тук І1е ТПг бек АвБп Авп бБег АвБп о Рго Іїе сій Авр Гув АБр А1а 115 120 125
Ууаї Аза гей ТПг Сув бій Рго бій ТБг біп Авр Тс Тс Тукє Геч Тгр 130 135 140
Тер Уаі1 Авп Авп о біп бек Тецй Рго Уаі Бек Рго Агд Гей біц Гец 5ег 145 150 155 160 век Авр Авп Агд ТПг о Тецй ТПг о Уаі! Рре АБп о І1е Рго Агд АвБп Авр Тог 165 170 175
ТПЕ Бек Тук Пув Сув біц ТПг сіп Авп Рго Уаі! бек Уаі Агуд Агд 5ег 180 185 190
Авр Ркго Уаії ТБПг Іец Авп о Уаї Гец Тук б1у Рго Авр Аза Рго ТПг Іе
Зо 195 200 205 зек Рго Гец АвБп о ТПг Рго Туг Агуд Аїа с1і1у бій Тук Гей Авп Гей ТЕГ 210 215 220
З5
Сув Нів Аза Аза Бек Авп Рго ТПг Аза біп Тук Рібе Тер Рібе Уаї1ї Авп 225 230 235 240 бі1у ТПпЕ Рпе сіп сбіп Бек ТПг сіп бій Гей Рпе І1їе Рго АвБп І1е ТЕГ 245 250 255
Уа1 Авп Авп бек с1іу бек Тук Мес Суб сбіп Аїа Нів АвБп бек Аїа ТЕПг 260 265 270 б1у Гей АвБп Агуд ТпПг ТпПг Уа1! ТпПг Аза Іїе ТпПг Уа1 Туг Аза сій Іей 275 280 285
Ркго Ппув Рго Туг І1е ТПг бБег Авп АвБп бек АвБп Рго Іїе бій Авр Гув 290 295 300
Авр Аза Уаї ТіПг Іец ТПг Сув біц Рго бій ТПг біп Авр Тс Тпг Туг 305 310 315 320 (516) Тем Тер Тгр Маії Авп Авп о біп Акуд Гей бек Уаії бек бек Агуд Гей сі1ц 325 330 335
Тецп век Авп Авр Ап Агуд Тпг Гей Тпг Уаі Рпе Ав5п І1І1е Рго Агд Авп 340 345 350
Авр ТПг Тбг Рбе Тук біц Сув бій ТПг о біп Авп Рго Уаі! бек Уа1і Агд 355 360 365
Акуд Бек Авр Рго Уаі! ТПг ІТецй Авп Уаії Іецйп Тук с1у Рго Авр Аїа Рго 370 375 380
ТПгЕ Іїе Бек Рго Гец Авп о ТПг Рго Туг Агуд Аїа б1у бій АвБп Гей АвБп 385 390 395 400
Тец бек Сув Нів Аза Аїа бек Авп Рго Аіїа Аїа сіп Тук Робе Тгр РБПе 405 410 415
Уаї Авп сб1у ТПг Рбе сіп біп бек ТПг сбіп біц їец Роре І1е Рго Авп 420 425 430
І1їе ТПг Уаї Авп АвБп о бек сіу бек Тук Меє Сув біп Аїа Нів Авп 5бег 435 440 445
Аза ТПг с1і1у Гец АвБп Агуд ТпПг Тс Уаії Тс Аза чІ1е ТПг Уа1 Тук Уаї
Зо 450 455 460 біц Гей Ркго Ппув Рго Туг Іїе Бек Бек Авп Ап бБег Ап Рго І1е бій 465 470 475 480
З5
Авр пув Авр Аза Уа1! ТПг Теп ТПг Сув б1ц Рго Уаі Аза бій Авп ТП г 485 490 495
ТПЕ Тук Гей Тер Тер Уаі АвБп Авп о біп бег ТГец бек Уаії бек Рго Аг4д 500 505 510
Пес біп Ге бек Авп с1у АБп Акуд І1е Гей ТПг Гей Гей бек Уаї Тіг 515 520 525
Ак Авп о Авр о ТБПг біу Рго Тук біц Сув б1у І1е сбіп Авп Бек бій б5ег 530 535 540
Аза пув Агкд бБег Авр Рго Уа! ТПг Іец Авп Уаі! ТПг Тук о1у Рго Авр 545 550 555 560
ТПЕ Рго Іїе Іїе бек Рго Рго Авр Гей бег Туг Агд бек б1у Аїа Авп 565 570 575 (516) Тем Авп Гей бек Сув Нів бек Авр бек АБп о Рго бек Рго біп Тук 5ег 580 585 590
ТЕр гец Іїе Авп сіу ТБПг Іец Агуд біп Ні ТБг біп Уаї Іїеп Рпе Пе 595 бо 605 зек Ппув І1е ТПг Бек Авп Авп Авп сіу Аїа Туг А1їа Сув Ріре Уаї 5ег 610 615 620
Ап о гей Аїа ТПг б1у Агуд АБп о Авп обег І1е Уаі Ппув Авп І1їе бек Уаї 625 630 635 640 зек бек біу Авр бек Аза Рго біу бек бек біу Гей бБег Аїа бег 01Уу 645 650 655 зек сіу бек біу Тец АБп Авр ТІ1е Рпбе б1іп Аза сіп гув Іїе сій Тгр 6бво 665 670
Нів Нів Нів Нів Нів Нів 675 «2105 60 «2115 317 «212» БІЛОК «213» Ношто варієпь
Зо «220» «221» ДОМЕН «222» (1)..(293) «223» позаклітинний домен СЕАСАМб людини
З5 «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (294)..(317) «223» розширення з Нібз-міткою 40 «4005 60
Тпув Гей ТПг І1їе бій Бек ТПг Рго Робе Авп Уаі1 Аїа сіц с1у пув б1іц 1 5 10 15 45
Уаї Гей Гей Ггеш Аза Нів Авп Гей Рго сбіп АвБп Агуд І1е сб1у Тук 5бег 20 25 30 50
ТЕр Тук пув с1у біц Агуд Уа1і Авр с1іу Авп бег ІТец І1е Уаі сС1у Туг 55 Уаї І1е с1у ТПК сбіп біп Аза ТПг Рго сіу Рго Аїа Туг Бек с01у Агк4д бо біц Тс І1е Туг Рго Авп Аза бек Гей Гей Іїе сіп Авп Уаї ТіПг сіп (516) 65 70 75 80
Авп о Авр оТПг біу Роре Тук ТПг їец біп Уаї І1їе Ппув Бек Авр Гей Уаї 85 90 95
АБп обіц бій Аїа ТПг сб1іу біп Рпбе Нів Уаї Тук Рго бі Гецй Рго Тув 100 105 110
Ркго Бек І1е бек Бек АвБп Авп бБег Авп о Рго Уаі сій Авр Гув Авр Аїа 115 120 125
Ууаї Аза Рпе ТПг Сув бій Рго біц Уаі1 сіп Авп Тс Тс Тук Гечцп Тгр 130 135 140
Тер Уаі1і Авп сіу біп бек Тец Ркго Уаї бек Рго Агд Іец біп Гец 5ег 145 150 155 160
Авп осіу Авп Меє ТПг ІТецй ТПг Гец Іец бек Уаі Гув Агуд Авп Авр Аїа 165 170 175 сіу бек Тук біц Сув бій І1їе біп АвБп Рго Аза бек Аза АвБп Агд 5ег 180 185 190
Авр Ркго Уаії ТБПг Іец Авп о Уаї Гец Тук б1у Рго Авр с1у Рго ТПг Іе
Зо 195 200 205 зек Рго бек пуб Аза АБп о Туг Агд Рго бі1у бій АвБп Гей Авп Гей б5ег 210 215 220
З5
Сув Нів Аза Азїа бек Авп Рго Рго Аїа біп Туг бек Тер Робе І1е Авп 225 230 235 240 бі1у ТПпЕ Рпе сіп сбіп Бек ТПг сбіп бій Гей Рпе І1їе Рго АвБп І1е ТЕГ 245 250 255
Уа1 Авп Авп бек с1іу бек Тук Мес Суб сбіп Аїа Нів АвБп бек Аїа ТЕПг 260 265 270 б1у Гей Авп Агуд ТПг ТПг о Уа1! ТПпс Меє Іїе ТПг Уа1 бек сіу бек А1а 275 280 285
Ркго Уаії Гпец бек Аза бек біу бек біу бек б1у Гей Авп Авр І1е Ріє 290 295 300 бі Аза сбіп пув Іїе бій Тер Нів Нів Нів Нів Нів Нів 305 310 315 60 «2105 61
«2115 317 «212» БІЛОК «2135 Масаса Тавсісціагів «220» «221» ДОМЕН «222» (1)..(293) «223» позаклітинний домен СЕАСАМб яванскої макаки «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (294)..(317) «223» розширення з Нібз-міткою «4005 61 біп Гей ТПпг І1їе бі Бек Агуд Рго Рпе А5п Уаі1 Аїа сіц с1у пув б1іц 1 5 10 15
Уаї Гей гей Ггеш Аза Нів Авп Гей Рго біп Авп ТПг Іец б1у Рпе Авп 20 25 30
ТЕр Тук пув с1у біц Агкд Уаі Авр Аза пуб Агд ІТецйц І1е Уаії Аїа Туг
Зо Уаї І1е с1у ТПК сбіп біп ТПг Тег Рго с1іу Рго Аїа Нів Бек с01у Аг4д бо бі Меє І1е Туг Бек Ап Аза бек Гей Гей Іїе сіп Авп Уаї ТіПг сіп 35 65 70 75 80
Авп о Авр оТПг біу бек Тук ТПг Гец біп Маї І1їе пув с1у Авр Гей Уаї 85 90 95 40
ТП біш бій Аза ТБПг б1іу Агуд Рбе Тгр Уаї Тук Ркго бій Гей Рго Гув 100 105 110 45
Ркго Тук І1е ТПг бек АвБп Авп бБег АвБп о Рго Уаі сій Авр Гув Авр Аїа 115 120 125 50 Уа1 Авр Рпе ТпПг Сув бій Рго Авр І1е Нів бек ТПг ТПг Тук Геч Тер 130 135 140
Тер Уаі1 Авп Авр біп бек Тец Рго Уаії бек Рго Агд Іец біп Гец 5ег 55 145 150 155 160
Авп ос1іу Авп Агуд Тс Тецй ТПг о Гец ІТец бек Уаі Гув Агуд Авп Авр Аїа 165 170 175 60 сб1у Аї1а Тук сій Сув біш Іїе сбіп Авп Рго Уаі Бек Аза Авп Іец 5бег 180 185 190
Авр Рго Уаії І1їе Гей Авп Уаі Гецп Тук с1іу Рго Авр Уаії Рго ТПг І1е 195 200 205 ек Рго бек Авп бек АвБп о Туг Агд Рго бі1у бій АвБп Гей Ап Гец б5ег 210 215 220
Сув Нів Аза Азїа Бек Авп Рго ТПг Аза біп Туг бек Тер Рібе Уаі1ї Авп 225 230 235 240 бі1у ТПпЕ Рпе сіп сбіп бек ТПг біп сій Гей Робе І1е Рго АБп І1е ТПг 245 250 255
Уаї Авп Авп бек сіу бек Тук Меє Сув біп Аїа Туг АвБп бек Аїа ТПг 260 265 270 с1у Гей АвБп Агуд ТПг ТБг Уа! Меє Меє Іїе ТБПг Уаї бек с1іу бек Аї1а 275 280 285
Ркго сіу Пец бек А1їа бек біу бек біу бек б1у Гей Авп Авр І1е Ріє
Зо 290 295 300 бі Аза сбіп пув І1їе бій Тер Нів Нів Нів Нів Нів Нів 305 310 315
З5 «2105 562 «2115 322 «212» БІЛОК «213» Ношто зарієпв «220» «221» ДОМЕН «222» (1)..(298) «223» позаклітинний домен СЕАСАМВ людини «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (299)..(322) «223» розширення з Нібз-міткою «4005 62 сіп Гей ТЕ Іїе сій Аза УМаї Ркго бек АБп Аїа Аїа сій с1у Ппув сі1ц 1 5 10 15
Уаї Гей гей ге Уа1! Нів Авп Гей Рго сбіп Авр Рго Агд б1у Тук Авп 60 20 25 30
ТЕр Тук пув с1іу біц ТБг Уаії Авр Аза АвБп Агуд Агд І1е І1е сС1Уу Туг 35 40 45
Уаї І1е Бек АвБп біп біп І1е ТПг Рго сіу Рго Аїа Туг Бек Авп Аг4д 50 55 бо бі ТК І1е Туг Рго Авп Аза бек Гей Гей Меє Агуд Авп Уаї ТПг Агд 65 70 75 80
Авп о Авр оТПг біу бек Тук ТПг Гец біп Уаії І1ї1е Гпув Гей Авп Тецй Меє 85 90 95 зек біц біц Уаї Тпг б1у біп Рре бек Уаії Нів Рго бій ТПкг Рго Гув 100 105 110
Ркго Бек І1е бек бек АвБп Авп бБег Авп о Рго Уаі сій Авр пуб АБр А1а 115 120 125
Уа1ї Аїа Рре ТпПг Сув бій Рго бій ТП біп Авп ТБг Тк Тук Геч Тер 130 135 140
Тер Уаі1і Авп сіу біп бек Тецй Рго Уаі бек Рго Агд Гей біп Гец б5ег
Зо 145 150 155 160
Авп ос1іу Авп Агуд Тс Тецй ТПг о ТГец ІТец бек Уаі ТПг Агуд Ап Авр Уаї 165 170 175
З5 б1у Ркго Тук бій Сув біш Іїе біп Авп Рго Аїа бек Аза АвБп Рпе 5ег 180 185 190
Авр Ркго Уаії ТБПг Іец Авп о Уаї Гец Тук б1у Рго Авр Аза Рго ТПг Іе 195 200 205 зек Рго бек Авр ТПг Тук Тук Нів Аїа сі1у Маї Авп Гей Ап Гей 5ег 210 215 220
Сув Нів Аза Аїа Бек Авп Рго Рго Бек біп Туг бек Тер бек Уаі Авп 225 230 235 240 бі1у ТПпЕ Рпе сіп сбіп Ту ТПг сіп пуб Гей Рпе І1їе Рго АвБп І1е ТЕГ 245 250 255
ТПЕ Ппув Авп бек сіу бек Туг Аїа Сув Нів ТПг ТПг АБп бек Аїа ТПг 260 265 270 (516) с1у Агуд АБп Агуд Тпг ТБг о Уаї Агуд Мес І1е ТПг Уаії бек Авр А1а Гей 275 280 285
Ууаї біп с1іу Бек Бек Рго сіу Гей бек Аза бек біу бек б1у бек ШУ 290 295 300
Тем АБп АвБр І1е Рпе сій Аза сбіп Гуз І1е сій Тер Нів Нів Нів Нів 305 310 315 320
Нів Нів «2105 563 «2115 322 «212» БІЛОК «2135 Масаса Тавсісціагів «220» «221» ДОМЕН «222» (1)..(298) «223» позаклітинний домен СЕАСАМ8 яванскої макаки «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (299)..(322) «223» розширення з Нібз-міткою «4005 63
Зо біп Гей ТПпг І1їе бій Аїа Уа1і Рго Бек А5Бп Аїа Аза сіц с1і1у пув б1іц 1 5 10 15
Уаї теп Ггеш Гей Аїа Нів АБп Гей Рго сбіп Авр Рго Гей с1у Тук Авп 20 25 30
ТЕр Тук пув с1іу біц ТБг Уаії Авр Аза АвБп Агуд Агд І1е І1е сС1Уу Туг 35 40 45
Ууаї Іїе Аза ТПг сіп Уа1і Авп І1їе бек сіу Рго Аїа Авр бек сб1у Аг4д 50 55 бо біц ТК І1е Туг Рго Авп Аза ТПг Гей Гей Меє сіп Авп Уаї ТіПг Агд 65 70 75 80
Авп о Авр оТПг біу бек Тук ТПг Гец біп Уаії І1їе ТПг Гей Авп Гей Уаї 85 90 95
АвБп обіц бій Уа! ТПг сб1у біп Рпе бек Уаії Нів Рго бі ТПг Рго Тув 100 105 110
Ркго Бек І1е бек Бек АвБп Авп бБег Авп о Рго Уаі сій Авр Агуд Ар Аїа (516) 115 120 125
Ууаї Аза гей ТПг Сув бій Рго бій ТБг біп Авп Тс Тс Тукє Гечцп Тгр 130 135 140
Тер Маі Авп с1у біп бек Гей Рго Уаі! бек Рго Агуд Гей сбіп Гей 5ег 145 150 155 160
Авр с1у Авп Агуд Тс ІТецй ТПг Гец Тец АвБп Уа! ТПг Агуд Ап Авр То г 165 170 175 б1у Ркго Тук бій Сув біш Іїе сбіп Авп Рго Уа1і бек Уа1ї Авп Ріе 5ег 180 185 190
Авр Ркго Уаії ТБПг Іец Авп о Уаї Гец Тук б1у Рго Авр Аза Рго Ап І1е 195 200 205 зек Рго Бек Авр ТПг Тук Тук Тец Рго біу Уаії Авп Гей Авп Гей б5ег 210 215 220
Сув Нів А1ї1а Аза бек Авп Рго Гей Аїа сбіп Тук бек Ткгр бек Уаії Авп 225 230 235 240 бі1у ТПпЕ Рпе сіп сбіп Нів ТПг сбіп Авп Гей Рпе І1їе Рго АБп І1е ТЕГ
Зо 245 250 255
Аза пув Авп о бек біу бек Тук Аїа Суб Нів Аза ТПг Авп бБег Аїа ТЕПг 260 265 270
З5 бі1у Нів Авп сіу ТПг ТПг Уаі1і Акуд Меє Іїе ТПг Уа1 бек Авр Аїа 5ег 275 280 285
Уаї біп с1іу Бек Бек Рго сіу Гей бек Аза бек біу бек с1у Бех щу 290 295 300
Тем АБп АвБр І1е Рпе сіц Аїа біп Гуз І1е сій Тер Нів Нів Нів Нів 305 310 315 320
Нів Нів «2105 64 «2115 237 «2125 БІЛОК «213» Ношто варієпь «220»
Гс10) «221» ДОМЕН «222» (1)..(213)
«223» позаклітинний домен СЕАСАМ7 людини «221» ДОМЕН «222» (214)..(237) «223» розширення з Нібз-міткою «4005 64
ТПЕ АвБп о І1їе Авр Уа! УМаї Рго Рбе Авп Уаі Аїа бій с1у Ппув сі Уаї 1 5 10 15
Тец Гецп Уаї Уаі Нів Авп бій Бек біп Авп Гей Тук с1іу Туг Авп Тгр
Тук Ппув с1у бій Агкуд Уаії Ні Аза Авп Туг Агуд І1е І1е сі1у Тук Уаї 20
Тпув АБп о І1е бек біп бій Авп Аза Рго сбіу Рго Аза Нів Авп сб1у Агд бо 25 біц Тс І1е Тук Рго Авп сіу ТПг Гей Гей Іїе сіп Авп Уаї ТПг Нів 65 70 75 80
Зо Авп о Авр Аза сіу І1е Тук ТпПг Гецп Нів Уа1! І1е Ппув бій Авзп ТІецй Уаї 85 90 95
Авп обіц біц Уаї ТБ Агуд біп Рбе Тук Уа1 Рпе бек біц Рго Рго Гу
З5 100 105 110
Ркго Бек І1е ТПг бек АвБп Авп Робе АвБп о Рго Уаі сій Авп Гпув Авр Те 115 120 125 40
Уаї Уаї гей ТПг Сув біп Рго біц ТП біп Авп о ТпПс Тс Тук Гей Тгр 130 135 140 45
ТЕр Уаі1 Авп Авп о біп бег ІТец Гей Уаї бек Рго Агд Іецй Іецй Іец 5ег 145 150 155 160 50 ТПЕ Авр Ап Акуд ТБг о ТГец УМаії Гей Гей бек Аїа ТПг Ппув Ап АвБр І1е 165 170 175 б1у Ркго Тук бій Сув біш Іїе сіп Авп Рго Уаі сіу Аїа бБег Агд 5ег 55 180 185 190
Авр Ркго Уаії ТіПг Іец Авп Уаії Агуд Туг бій бек Уаі сбіп Аїа Бек 5ег 195 200 205 60
Рго Авр Гец бег А1їа бек біу бек біу бек б1у Гей Авп Авр І1е Ріє 210 215 220 сі Аза сбіп пу5 Іїе бій Тер Нів Нів Нів Нів Нів Нів 225 230 235 «2105 65 «2115 292 «212» БІЛОК «213» Ношто варієпь «220» «221» ДОМЕН «222» (1)..(286) «223» М-А1-В1 ПСЕАСАМ5 «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (287)..(292) «223» Нів-мітка «4005 65
Тпув Гей ТПг І1їе бій Бек ТПг Рго Рпе Авп Уаі1 Аза сіц с1у пув б1іц 1 5 10 15
Зо
Уаї Гей гей ге Уа1! Нів Авп Гей Рго Ссіп Нів їец Рпе сб1у Тук 5бег 20 25 30
Тер Тук пув с1у бій Агкуд Маі Авр б1у АвБп Акуд біп І1е І1е с1Уу Туг 35 40 45
Ууаї те с1у ТПг сбіп сбіп Аза ТПг Рго сіу Рго Аїа Туг бек б1у Аг4д 50 з9 бо біц І1е І1е Туг Рго Авп Аза бек Гей Гей Іїе сіп АвБп І1е І1е сіп 65 70 75 80
Авп о Авр оТПг біу Рое Тук ТПг їец Ні Уаї І1їе Ппув Бек Авр Гей Уаї 85 90 95
Авп о біц бі Аза ТБг біу біп Рбе Акд Уаі! Тук Ркго бій Гей Рго Гув 100 105 110
Рго Бек І1їе бек бек Авп Авп бек Пув Рго Уаі біц Авр Гув АвБр Аїа 115 120 125
Ууаї Аза Рпе ТПг Сув бій Рго бій ТБг біп Авр Аза ТПг Тук Ге Тгр (516) 130 135 140
Тер Уаі1 Авп Авп о біп бек Тецй Рго Уаі бек Рго Агд Гей сбіп Гец 5ег 145 150 155 160
Авп об1іу Авп Акуд ТЕ Гей Тпс Гей Рпе Авп Уаі! ТПг Агуд Авп Авр Тг 165 170 175
А1їа бек Тук пув Сув біц ТПг біп Авп о Рго Уаі бек Аза Агд Агд 5ег 180 185 190
Авр Бек Уаї І1ї1е Іецшц АвБп Уаї Гец Тук б1у Рго Авр Аза Рго ТПг Іе 195 200 205 зек Рго Гец АвБп о ТПг бек Туг Агд бек біу бій Авп Гей Ап Гец б5ег 210 215 220
Сув Нів Аза Азїа Бек Авп Рго Рго Аїа біп Туг бек Тер Рібе Уаі1ї! Авп 225 230 235 240 сі1у Тк Рре біп сбіп бек ТБПг біп біц Гей Робе І1е Рго АБп І1е ТЕПбг 245 250 255
Уаї Авп Авп бек сіу бек Тук ТпПг Сув біп Аїа Ніб Авп бек Авр ТПг
Зо 260 265 270 сб1у Гей АвБп Агуд ТПг ТпПг о Уа1! ТБбг ТБг І1е Тс Уаї Ту Аза Нів Нів 275 280 285
З5
Нів Нів Нів Нів 290 «2105 6б66 «211» 184 «212» БІЛОК «213» Ношто варієпь «220» «221» ДОМЕН «222» (1)..(178) «223» А?-В2 ПСЕАСАМ5 «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (179)..(184) «223» Нів-мітка «4005 66 біц Рко Рго Ппув Рго Рпе Іїе ТПг Бек Авп Авп бек Авп Рго Уа! бій 60 1 в) 10 15
Авр бій Авр Аза Уаії Аза їецй ТПг Сув біц Рго бій І1е сбіп АБп ОТ 20 25 30
ТПЕ Тук Гей Тер Тгр Маії Авп АБп о біп бек Гей Рго Уаї Бек Рго Аг4д 35 40 45 теп біп Гей Бек Авп Авр Авп Агуд ТпПг о Гец ТБПг Іец ІТецй бек Уа1ї ТПг 50 з9 бо
Акуд Авп о Авр оУаї! біу Рго Тук біц Сув б1у І1е сбіп Авп бій Гей б5ег 65 70 75 80
Уаї Авр Нів Бек Авр Рго Уаї І1е Іїец АвБп Уаії Гей Тук с1у Рго Авр 85 90 95
Авр Ркго ТПг І1е бек Ркго бек Тук ТПг Тук Тук Агд Рго б1у Уа1і1 Авп 100 105 110
Пен бек Гец бек Сув Нів Аїа Аїа Бек Авп Рго Рго Аїа сбіп Тук 5ег 115 120 125
ТЕр Ггец Іїе Авр с1у АБп І1е сіп сіп Ні ТПг біп бій Гей Рпе Пе
Зо 130 135 140 век Авп І1е ТПг біцш Гув АвБп бек с1іу Гей Тук ТПг Сув біп Аїа Авп 145 150 155 160
З5
АвпобБек Аїа бек біу Нів Бек Агд ТПг ТПг о Уаії Ппув ТПг І1їе ТПг Уаї 165 170 175 зек Аїа Нів Нів Нів Нів Нів Нів 180 «2105 67 «2115 193 «212» БІЛОК «213» Ношто варієпь «220» «221» ДОМЕН «222» (1)..(187) «223» АЗ-ВЗ3 ПСЕАСАМ5 «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (188)..(193) «223» Нів-мітка 60 «4005 67 біц Гей Рго Ппув Рго Бек Іїе Бек Бек Авп Авп бек пуб Рго Уаії бій 1 5 10 15
Авр пув Авр Аїа Уаі Аза Рпе ТПг Сув бій Рго біц Аза сбіп АвБп ТЕГ 20 25 30
ТПЕ Тук Гей Тер Тер Уаі Авп сіу біп бек Гец Рго Уаії бек Рго Аг4д 35 40 45
Тецп біп Гей бек Авп б1іу Авп Агуд ТпПг Гей Тпг Гей Робе Ап Уа! ТЕПг 50 55 бо
Ак Авп о Авр Аза Агуд Аза Тук Уаії Сув б1у І1е сбіп Авп Бек Уа1ї! 5ег 65 70 75 80
Аза Авп Агуд бег Авр Рго Уа! ТПг Іец Авр Уаї Гей Тук с1у Рго Авр 85 90 95
ТПЕ Рго Іїе І1їе бек Рго Рго Авр бек бек Туг Гей бек о1у Аїа Авп 100 105 110
Тец АвБп Гей бек Сув Нів бек Аїа Бек Авп Рго бек Рго біп Туг в5ег
Зо 115 120 125
ТЕр Агуд І1ї1е Авп сіу І1е Рго сбіп сіп Ні ТПг біп Уаї еп Рпе Пе 130 135 140
З5
А1їа Ппув І1е ТБг Рго АвБп о АБп Авп о біу Тпг Туг Аза Сув Рпе Уа1ї 5ег 145 150 155 160
Ап о гей Аїа ТПг б1у Агуд АБп о Авп обег І1е Уаі Ппув Бек Іїе ТПг Уаї 165 170 175 зек Аїа бек біу ТПг бек Рго сіу Гей бек Аїа Нів Нів Нів Нів Нів 180 185 190
Нів «2105 68 «2115» 310 «2125 БІЛОК «2135 Масаса Тавсісціагів «220»
Гс10) «221» ДОМЕН «222» (1)..(286)
«223» домен М-А1-В1 СЕАСАМ5 яванскої макаки «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (287)..(310) «223» розширення з Нібз-міткою «4005 68 сіп Гей ТПг Іїе сій бек Агуд Рко Робе АБп Уаі Аїа сій с1у Ппув сі1ц 1 5 10 15
Уаї Гей гейш Ггеш Аза Нів Авп Уа1і бек сбіп Авп Тец Рпе с1у Ту Ше
ТЕр Тук Ппув с1у біц Агд Уаі Авр Аза бБег Агд Агуд І1е с1у Бек Сув 20
Ууаї І1їе Агу ТПг сіп сбіп І1е ТПг Рго сіу Рго Аїа Ні бек сб1у Аг4д бо 25 бі Тс І1е Авр Рпе Ап Аза бек Гей Гей Іїе сіп Авп Уаї ТіПг сіп 65 70 75 80
Зо зек Авр ТПг біу бек Тук ТПг Іїе сіп Уа! І1е Ппув сій Авр Іецй Уаї 85 90 95
Авп о біц бі Аза ТБг біу біп Рбе Акд Уаі! Тук Ркго бій Гей Рго Гув
З5 100 105 110
Ркго Тук І1е ТПг бек АвБп Авп бБег АвБп Рго І1е сій Авр Гув Авр Аїа 115 120 125 40
Ууаї Аза гей ТПг Сув бій Рго бій ТБг біп Авр Тс Тс Тукє Геч Тгр 130 135 140 45
Тер Уаі1 Авп Авп о біп бек Тецй Рго Уаі бек Рго Агкд Гей біц Гец 5ег 145 150 155 160 50 век Авр Авп Агуд ТПг Гей Тпг оУаї Рпбе Авп І1е Рго Агд Ав5п Авр Тог 165 170 175
ТПЕ Бек Тук Ппув Сув біц ТП біп Авп о Рго Уа! бек Уаі1і Агд Агд 5ег 55 180 185 190
Авр Ркго Уаії ТБПг Іец Авп о Уаї Гец Тук б1у Рго Авр Аза Рго ТПг Іе 195 200 205 60 ек Рго Гец АвБп о ТПг Рго Туг Агд Аї1а б1у бій Тук Гей Авп Гей ТЕГ 210 215 220
Сув Нів Аї1а Аза бек Авп Рго ТПг Аїа сбіп Тук Рпе Ткгр Робе Уаї Авп 225 230 235 240 бі1у ТПпЕ Рпе сіп сбіп Бек ТПг біп бій Гец Робе І1е Рго АБп І1е ТПг 245 250 255
Уаї Авп Авп бек сіу бек Тук Меє Сув біп Аїа Нібв АвБп бек Аїа ТПг 260 265 270 б1у Гей АвБп Агуд ТПг Тбг Уа! ТБг Аза І1е ТПг Уаї Туг Аїа Бех щУ 275 280 285 зек сіу бек біу Тец АБп Авр ТІ1е Рпбе б1іп Аза сіп гув Іїе сій Тгр 290 295 300
Нів Нів Нів Нів Нів Нів 305 310 «2105 659
Зо «2115 202 «212» БІЛОК «2135 Масаса Тавсісціагів «2205 «221» ДОМЕН «222» (1)..(178) «223» домен А2-В2 СЕАСАМО яванскої макаки «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (179)..(202) «223» розширення з Нібз-міткою «4005 69 біц Гей Ркго Ппув Рго Туг Іїе ТПг Бек Авп Ап бег Ап Рго І1е б1іц 1 5 10 15
Авр пув Авр Аза Уа1! ТПг Теп ТПг Сув б1ц Рго бій ТПг біп Авр ТЕГ 20 25 30
ТПЕ Тук Гей Тер Тгр Маії Авп АБп о біп Агуд Гей бек Уаї Бек бек Аг4д 35 40 45
Тец біц Гей бек Авп Авр Авп Агуд ТпПг Гей ТПг Уа1! Рібе Ап І1е Рго 60 50 з9 бо
Акуд Авп о Авр о Тс ТБ Ропе Тук біц Сув б1цп ТПг біп Авп Рго Уа1ї! 5ег 65 70 75 80
Уа1 Агуд Агуд Бек Авр Рго Уа! ТПг Гей Авп Уаії Іей Тук о1у Рго Авр 85 90 95
Аза Ркго ТПг І1е бек Рго Гей АвБп ТПг Рго Туг Агуд Аїа о1у бій Авп 100 105 110
Тец АвБп Гей бек Сув Нів Аза Аза бек Ап Рго Аїа Аїа біп Тук РБПе 115 120 125
ТЕр Рпе Уаі1 Авп сіу ТПг Роре сбіп сбіп бег ТПг біп бій Гей Рпе Пе 130 135 140
Рго Авп о І1е ТПг Уаії Авп Авп бек біу бек Тугк Меє Сув сбіп Аїа Нів 145 150 155 160
Авп обБек Аїа ТПг с1у Гей Авп Агуд ТПг ТБг о Уаї ТПг Аза І1е ТіПг Уаї 165 170 175
Тук Уа1 Бек сіу бек біу бек сіу Гей АвБп АвБр І1е Рпе сб1п1 Азїа сіп
Зо 180 185 190 пуб І1е бій Тер Нів Нів Нів Нів Нів Нів 195 200
З5 «2105 70 «2115» 214 «212» БІЛОК «213» Масаса тавсісціагів «220» «221» ДОМЕН «222» (1)..(190) «223» домен АЗ-В3 СЕАСАМО яванскої макаки «220» «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (191)..(214) «223» розширення з Нібз-міткою «4005 70 січ Гей Рго Ппув Рго Туг І1е бек бек АБп Авп бек Авп Рго І1е сі1ц 1 5 10 15
Авр пув Авр Аза Уа1! ТПг Теп ТПг Сув б1ц Рго Уаі Аза бій Авп ТП г 60 20 25 30
ТПЕ Тук Гей Тер Тер Уаі АвБп Авп о біп бег ТГец бек Уаії бек Рго Аг4д 35 40 45
Пес біп Ге бек Авп с1у АБп Акуд І1е Гей ТПг Гей Гей бек Уаї Тіг 50 55 бо
Ак Авп о Авр о ТБПг біу Рго Тук біц Сув б1у І1е сбіп Авп Бек бій б5ег 65 70 75 80
Аза пув Агд бБег Авр Рго Уа! ТПг Іец АвБп Уа! ТПг Тук о1у Рго Авр 85 90 95
ТПЕ Рго Іїе Іїе бек Рго Рго Авр Гей бег Туг Агд бек б1у Аїа Авп 100 105 110
Тец АвБп Гей бек Сув Нів бек Авр Бек Авп Рго бек Рго біп Туг в5ег 115 120 125
Тер Геш Іїе Авп сбіу ТПг Гецп Агуд біп Нів ТБг біп Уаї Гей Рпе І1е 130 135 140 зек Мпув І1е ТПг бек АвБп Авп АвБп обіу Азїа Туг Аїа Сув Рпе Уа1і1 5ег
Зо 145 150 155 160
Ап о гей Аїа ТПг б1у Агуд АБп о Авп обег І1е Уаі Ппув Авп І1їе бек Уаї 165 170 175
З5 зек бек біу Авр бек А1їа Рго бСіу бек бек бі1у Гей Бек Аїа Бех щУ 180 185 190 зек сіу бек біу Тец АБп Авр ТІ1е Рпбе б1іп Аза сіп гув Іїе сій Тгр 195 200 205
Нів Нів Нів Нів Нів Нів 210 «2105 71 «211» 344 «212» БІЛОК «213» Ношто варієпь «4005 71
Мен с1у Рго Рго Бек Аїа Рго Рго Сув Агкуд Гей Нів Уаї Рго Тгр Гу 1 5 10 15 (516) сі Уаї Гецп Гецп ТПг Аїа бек Гей Гей ТПг Рре Тер Авп Рго Рго ТіПг 20 25 30
ТПг Аїа Ппув Гей ТПг І1е біц бек ТБПг Рго Рпбе АБп Уаі Аїа бій щу 35 40 45 пув бій Маї Гешп Гей Гей Аза Нів Авп Гей Рго сбіп Авп Агуд І1е 01У 50 55 бо
Тук Бек Тер Тук Мпув біу біцш Акуд Уаі Авр б1у Авп бек Гей Іїе Уаї 65 70 75 80 сі1у Тук Маії І1е с1у ТПг сбіп сбіп Аза ТПг Рго сіу Рго Аїа Туг 5ег 85 90 95 б1у Акд бій ТПпг І1їе Тук Рго Авп Аїа Бек Гей Гей І1е сСіп Авп Уаї 100 105 110
ТПгЕ біп Авп Авр о ТБг біу Роре Тук ТПг Гец біп Уаії І1е Гув Бек Авр 115 120 125
Те Маі АБп біц бій Аїа ТПг с1іу біп Рпбе Ні Уа1і Тук Рго сій Гец 130 135 140
Ркго Ппув Рго бек І1е бек Бек Авп АвБп бек Авп Рго Уа1і бій Авр Гув
Зо 145 150 155 160
Авр Аза Уаії Аза РоПе ТПг Сув біц Ркго біц Маі біп АвБп ТПг Тс Туг 165 170 175
З5
Тецп Тер Тер Уаі Авп сіу біп бек Гей Рго Уа1і бек Рго Агд Іец біп 180 185 190
Тецп бек Авп сіу Авп Меє ТПг Гей ТПг Гей Гей бек Уа1і Гув Агд Авп 195 200 205
Авр Аїа сіу бек Тук біш Сув біц Іїе біп АБп Рго Аза бек Аза Авп 210 215 220
Акуд Бек Авр Рго Уаі! ТПг ІТецй Авп Уаії Іей Тук с1у Рго Авр б1у Рго 225 230 235 240
ТПЕгЕ Іїе Бек Рго бек пув Аза Авп Туг Агуд Рго біу бій АвБп Гецй АвБп 245 250 255
Тец бек Сув Нів Аза Аїа бек АвБп Рго Рго Аїа біп Тук бек Тгр РПе 260 265 270 (516) І1їе Авп с1іу ТПг Рре сбіп сіп бек ТПг біп бій Гей Рпе І1е Рго Авп 275 280 285
І1е ТБПг Уаї Авп Авп о бек біу Бек Тук Меє Сув сбіп Аза Нібв Авп бег 290 295 300
А1їа ТпПг с1у Тей АБп Агуд ТПс Того оУаї ТБг Меє І1е ТПг Уаі бек 01Уу 305 310 315 320 зек Аза Рго Уаі Іец бек Аї1а Уаі Аза ТПг Уа1і сС1у І1е ТПг І1е с01У 325 330 335
Уаї Гей Аза Агуд Уаі1і Аїа Гей Ше 340 «2105 72 «2115» 265 «212» БІЛОК «213» Ношто зарієпв «4005 72
Ме сіу Бек Рго Бек Аїа Сув Рго Туг Агуд Уаії Суб І1е Рго Тгр сіп 1 в) 10 15 сб1у Гей Гей Гей ТПг Аїа бек Гей Гей ТПг Рпе Тер Ап Гец Рго АвБп 20 25 30
Зо зек Аїа біп ТПг АвБп о І1е Авр Уаії Уаії Рго Рпе АБп Уаі Аїа бій щЩ1У
З5 пув біц Уаї Гей Гей Уаі1і Уаі1і Нів Авп бій бек біп Авп Гец Туг 01Уу бо 40 ТУк АвБп о Тер Туг пув сб1у біц Агкуд Уаї Нів Аза АвБп Туг Агд І1е І1е 65 70 75 80 сбі1у Тук Уаї Ппув Авп Іїе бек біп бій Авп Аза Рго біу Рго Аї1а Ні 45 85 90 95
Авп ос1у Акд біц ТБ І1е Туг Рго АБп біу ТПг Гей Гей Іїе сбіп Авп 100 105 110 50
Уаї ТпПЕгЕ Нів Авп Авр Аїа сіу Рпе Тук ТПг Ггец Нів Уаії І1е Гув с1ци 115 120 125 55
Ап оГец Уаі Авп біц біц Маї ТБг Агуд біп Рпе Туг Уаі Рпе бек сіц 130 135 140 (516) Рго Рго Пув Рго бек Іїе ТПг бек Авп Авп Робе АБп о Рго Уаі бій Авп 145 150 155 160
Туз Авр І1е Уаі Уаі Гей ТПкг Сув біп Рго бій Тбг біп АвБп о Тбг Тс 165 170 175
Тук геп Тер Тер Маі! АБп Авп о біп бек Гей Гец Уа! бек Рго Агд Іец 180 185 190
Тецп Гей Бек ТПг Авр Ап Агуд ТпПг Гей Уа1і! Гей Гец бег Аїа ТПг Гув 195 200 205
Ап о Авр о ч11е сіу Рго Тук бій Сув біц І1е біп АвБп Рго Уаі сС1у Аї1а 210 215 220 зек Агд бБекг Авр Рго Уа! ТПг ІТец Авп Уаі Агуд Туг бі Бек Уа1 сіп 225 230 235 240
Аза бек бек Рго Авр ІТец бек Аїа біу ТПпг Аїа Уаі Бек Іїе Меє Пе 245 250 255 сіу Маї теп Аїа сіу Меє А1а Іецй І1е 260 265 «2105 73
Зо «211» 349 «212» БІЛОК «213» Ношто варієпь «4005 73
З5
Мен с1у Рго Іїе Бек Аїа Рго Бек Сув Агуд Тгр Агд І1е Рго Тгр сіп 1 5 10 15 с1у Гей Гецп Гецп ТПг Аїа бек Гей Робе ТПг Рре Тер Авп Рго Рго ТіПг 20 25 30
ТПгЕ Аїа сіп Гей ТПг І1е б1п Аза Уа! Рго б5ег АБп Аза Аїа сбіц с1Уу 35 40 45 пув біц Уаї Гей Гей Ггеш Уа1і Нів Авп Гей Рго біп Авр Рго Агд 01Уу бо 50
Тук Авп Тер Тук пув біу біц ТБг Уаії Авр Аїа Ап Агуд Агд І1е те 65 70 75 80 55 сбі1у Тук УМаії Іїе Бек Ап біп сбіп І1їе ТПг Рго сіу Рго Аїа Туг 5ег 85 90 95 (516) Авп о Агуд бій ТБг І1е Тук Рго Авп Аза бек Гей Гей Меє Агуд Ап Уаї 100 105 110
ТПгЕ Агуд Авп о Авр о ТБПг біу бек Тук ТПг Ггец біп Уаї І1е Гув Іеч Авп 115 120 125
Пен Меє бек біц сій Уа1ї ТПг сб1у біп Рпе бек Уа1ї! Нів Рго сій Тбг 130 135 140
Ркго Ппув Рго бек І1е бек Бек Авп АвБп бек Авп Рго Уа1і бій Авр Гув 145 150 155 160
Авр Аза Уаії Аза Робе ТПг Сув бій Рго бі ТПг біп Авп о ТБбг Тс Тусг 165 170 175
Тецп Тер Тер Уаі Авп сіу біп бек Гей Рго Уа1і бек Рго Агд Іец біп 180 185 190
Тецп бек Авп с1іу Авп Агуд ТБПг Гей ТБбг Гей Гей бек Уаї ТБг Агд Авп 195 200 205
Авр Уаї с1у Рго Тук біц Сув біц Іїе біп АБп Рго Аза бек Аза Авп 210 215 220
Рпе бек Авр Рго Уаі! ТПг Гей Авп Уаі! Іецйп Тук с1у Рго Авр Аїа Рго
Зо 225 230 235 240
ТПЕгЕ Іїе Бек Рго бек Авр ТПг Тукг Тукг Нів Аза біу УМаї АвБп Гецй Авп 245 250 255
З5
Тец бек Сув Нів Аза Аїа бек Авп Рго Рго бек біп Туг бек Тгр 5ег 260 265 270
Уаї Авп сб1у ТПгЕ Рбе сіп біп Тук ТПг сбіп пув Гец Ропе І1е Рго Авп 275 280 285
І1їе ТПг ТБг пуб АвБп о бек сіу бек Туг Аїа Сув Нів ТПг ТПг Авп о бег 290 295 300
Аза ТПг с1у Агд АвБп Агуд ТпПг ТБг о Уаі Агуд Меє І1е ТПг Уа1і бек Авр 305 310 315 320
А1їа гей Уаї Сіп сі1іу бек бек Рго біу Гей бек Аза Агуд Аїа ТПг Уаї 325 330 335 зек Іїе Месє І1е сС1у Уаї Іейп Аї1а Агд Уаі Аї1а гей Ше 340 345 60 «2105 174
«2115» 120 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» МАБ2 УНад?2 «4005 74 сій Маї біп Гецп Уаі сій бек сі1у сбіу сб1у Геп Уаі сбіп Рго б1у С01У 1 5 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув А1ї1а Аза бек с1іу Рпе Уа1 Рібе бек бек Туг
Авр Меє бек Тер Уаі Агуд біп Аїа Рго б1у Ппув с1у Гей бій Тер Уаї 20 зек Тут І1е бек бек бі1у сі1у с1у Іїе ТПг Туг Туг Аїа Авр бек Уаї бо 25 пув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп бек ГПув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80
Зо Пе біп Мес Авп бек Гей Агуд Аї1а біц Авр ТПг Аїа Уа1ї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Аза Нів Туг Рре бі1іу бек бек біу Рго Рпе Аза Тугє Тер 01у сіп
З5 100 105 110 бі1у ТПпг Геип Уа1і ТПг Уа1 Бек 5ег 115 120 40 «2105 175 «2115 107 «212» БІЛОК 45 «2135 Штучна послідовність «220» «223» МАр2 Утад5 50 «4005 75
Авр І1е сіп Месє ТіПг біп бек Рго бек бек ІГецйп бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 5 10 15 55
Авр Акуд Уаї ТіПг І1е Тпг Сув Агуд Азїа бек бій АБп І1е РПпе бек Туг 20 25 30 (516) Тем Аїа Тгр Тук сбіп біп Гпув Ркго сбіу Ппув Аза Рго ГУу5 Іецй Гей Те 35 40 45
Тук Авп ТПг Агуд ТБг о Іец біп бек біу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех 0Щ1У 50 55 бо зек с1іу бек біу ТПгЕ Авр Рпе ТПг Гей ТіПг І1е бек бек Гей біп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аїа ТПг Тук Тук Сув біп Нів Нів Тук с1у ТПг Рго РБе 85 90 935
ТПЕ Рпе сіу сбіп біу ТПгЕ Гув Гец біц І11е Гув 100 105 «2105 76 «2115 7 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» залишки в положеннях 109-115 АЗВЗ3 СЕАСАМО людини «4005 76 зек б1у Аїа АвБп Тецй Авп Гей 1 5
Зо «2105 177 «2115 13 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність
З5 «2205 «223» залишки в положеннях 131-143 АЗВЗ3 СЕАСАМО людини «4005 77
І1е Авп біу І1е Рго біп сбіп Ні ТПг біп Уаї Ге РіГе 1 5 10 «2105 78 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «2205 «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (3)..(3) «223» Хаа являє собою Т, А або У «4005 7Я18 (516) сі1у Робе Хаа Ріре бек бек Туг Авр 1 5
«2105 79 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «2205 «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «2225 4(2)..(2) «223» Хаа являє собою 5 або М (зокрема 5) «2205 «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «2225 (4)..(4) «223» Хаа являє собою У або б (зокрема б) «2205 «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» 47)..(7) «223» Хаа являє собою В або І (зокрема 1) «4005 чМЛ79
І1е Хаа бБег Хаа бі1у с1у Хаа ТЕг 1 5 «2105 80 «2115 13 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «2205 «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «2225 (1)..(1) «223» Хаа являє собою А або т (зокрема А) «2205 «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» 47)..(7) «223» Хаа являє собою Т або 5 (зокрема 5) «4005 80
Хаа Аїа Ні Тук Рпе сіу Хаа бек сб1у Рго Рпе Аїа Туг 1 5 10 «2105 81 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність
Гс10) «2205
«223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «2225 (6)..(6) «223» Хаа являє собою В або 5, зокрема 5 «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «2225 (8)..(8) «223» Хаа являє собою А або 0 «4005 81 б1у Рпе ТПг Рпе бБег Хаа Тук Хаа 1 5 «2105 82 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (6)..(6) «223» Хаа відсутній, являє собою 5 або б (зокрема 5) «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (7)..(7) «223» Хаа являє собою 0, ХУ або І «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (8)..(8) «223» Хаа являє собою Т або І (зокрема Т) «4005 82
І1е бек бек біу б1у Хаа Хаа Хаа 1 5 «2105 83 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «2205
Гс10) «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «2225 (1)..(6)
«223» Хаа являє собою будь-яку амінокислоту «4005 83
Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Тук Авр 1 5 «2105 84 «2115 13 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (1)..11) «223» Хаа являє собою будь-яку амінокислоту «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (2)..(2) «223» Хаа являє собою А або 5 «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (4)..(84) «223» Хаа являє собою У, Е або М «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (7)..(8) «223» Хаа являє собою будь-яку амінокислоту «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (11)..(11) «223» Хаа являє собою будь-яку амінокислоту «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (13)..(13) «223» Хаа являє собою будь-яку амінокислоту «4005 84
Хаа Хаа Нів Хаа Ріпе сіу Хаа Хаа сбіу Рго Хаа Аїа Хаа 1 5 10 «2105 385 «2115 6 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205
Гс10) «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ
«2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (1)..(3) «223» Хаа являє собою будь-яку амінокислоту «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (4)..(84) «223» Хаа являє собою У, Е або М «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (5)..(5) «223» Хаа являє собою будь-яку амінокислоту «4005 85
Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Туг 1 5 «2105 86 «2115 13 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» КОДУЮЧА ПОСЛІДОВНІСТЬ «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (1)..(2) «223» Хаа являє собою будь-яку амінокислоту «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (4)..(84) «223» Хаа являє собою У, Е або М «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (5)..(6) «223» Хаа являє собою будь-яку амінокислоту «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (8)..(9) «223» Хаа являє собою будь-яку амінокислоту «4005 86
Хаа Хаа Нів Хаа Хаа Хаа Рго Хаа Хаа 1 5 «2105 87 «2115 449 «2125 БІЛОК
Гс10) «2135 Штучна послідовність
«223» послідовність важкого ланцюга ПиИМАр2-3 «4005 87 бі Маї біп Гей сбіп бій бек с1у Рго сіу Геш Уа1 пув Рго сб1у 01У 1 5 10 15 зек Гей бек Гей бек Сув Аїа Аза бек біу Робе Уаі! РПе бек бек Туг 20 25 30
Авр Меє бек Тер Уаі Агуд біп ТПг Рго б1п Агуд с1у Гей бій Тер Уаї 35 40 45
Аза Тук І1їе бек бек біу бі1у бі1у І1е ТПг Туг Аза Рго Бек ТПг Уаї 50 55 бо пув б1у Акуд Рпе ТПг Уа1і бек Агуд Авр Авп Аїа Гпув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80
Тец біп Меє Авп бек Гей ТПг Бек бій Авр ТПг АТїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Зо А1ї1а Аза Нів Тук Рпе сіу бек бек с1іу Ркго Рпбе Аїа Туг Тер с1у сіп 100 105 110 бі1у ТПпг Геип Уаі ТПг Уа1 бек бек Аза Бек ТПг Ппув сіу Ркго бек Уаї 115 120 125
Рпе Рго Гец Аза Рго бек бек пуб бек ТПг бек сі1у с1у ТПг Аза Аї1а 130 135 140
Тец б1у Сув Гей Уаії Ппув Авр Тук Рпе Рго бій Ркго Уаї ТіПг Уаї1ї 5ег 145 150 155 160
ТЕр Авп бек сіу Аїа Гец ТПг бек сіу Уаії Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї 165 170 175
Пес біп бек бек с1у Пеп Туг бек Гей бек бек Уаі Уа1! ТПг Уаї Рго 180 185 190 зек бек бек Іец біу ТПг біп ТП Тук І1ї1е Сув Авп Уа1і Авп Нів Гув 195 200 205
Ркго Бек Авп о ТПг Гуз Маї Авр о Гув пув Маї бій Рго Ппув Бек Суб Авр 210 215 220 60
Тпув ТП Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Гей Гец сС1у с1Уу 225 230 235 240
Рго Бек Уа1і РіПе Гецй Рпе Рго Рго Пув Рго Гув Авр ТПг Тей Меє Пе 245 250 255 зек Агуд ТПг Рго біц УМаї ТПг Сув Уаії Уаї Уаї Авр Уа1і Бек Нів сіц 260 265 270
Авр Ркго сіц Уаї Гуз Рпе Авп о Тгр Тугк УМаії Авр сіу Уаї біц Уаї Нів 275 280 285
Авп Аза пуб ТПг Губв Рго Агд біц бі біп Туг Авп о бБег ТПг Туг Агд 290 295 300
Уаї Уаї Бек Уаії Гей ТПг Уаї гейш Нів біп Авр Тер Гей АвБп о1Уу Гув 305 310 315 320 сі Тук Ппув Сув Ппув Уа1ї бек Авп Гув Аїа Гей Рго Аза Рго І1е сі1ц 325 330 335
Тпув ТПг І1їе бек Ппув Аїа Ппув сіу біп Рго Агд біц Рго біп Уаї Туг
Зо 340 345 350
ТПЕ Гей Рго Рго бек Агд Авр бій Гей ТПг Гпув АвБп обіп Уаї бек Іецй 355 3З6о 365
З5
ТПЕ Сув Гей Уаї пув бі1у Робе Туг Рго бБег Авр І1е А1ї1а Уаії сій Тгр 370 375 380 бі бек АвБп сіу біп Рго бій Авп Авп о Тук Ппув Тс ТБг Рго Рго Уаї 385 390 395 400
Тем Авр Бек Авр сіу бек РіПе Рбе Гей Тук бек Пув Тем ТПг Уаї Авр 405 410 415
Тпув век Агд Тер біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув бек Уа! Меє Нів 420 425 430 бі Азїа Гей Нів Авп о Нів Тукг ТПг о біп пув бек Гей бек Гец бег Рго 435 440 445 сову 60 «2105 88
«2115» 214 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» послідовність легкого ланцюга ПИМАр2-3 «4005 88
Авр чІ1е сіп Меє ТПг сбіп бек Рго Аїа бек ІТей бек Аза бек Уа1і 01Уу 1 5 10 15
Авр Акуд Уаї ТіПг І1е Тпг Сув Агуд Азїа бек бій АБп І1е РПпе бек Туг
Тец А1їа Тер Тук біп біп пув Рго с1іу Ппув бек Рго пуб Гей Іец Уаї 20
Тук Авп ТПг Агуд ТБг Іец Азї1а сбіц сіу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех щЩ1У бо 25 зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе бек Іецй ТПг І1ї1е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80
Зо сі Авр Рпе Аза ТПг Тугк Тук Сув біп Нів Нів Тук б1у ТПг Рго Ріе 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу бек сіу ТБПг їув Гей сіц І1е гув5 Агд ТПпг Уаі Аза Аза
З5 100 105 110
Ркго Бек Уаії Ріпе І1е Рпе Рго Рго бек Авр бій сбіп Гей пув Бех щу 115 120 125 40
ТПг Аїа бек Уаї Уаї Сув Іїец Гей Авп Авп Робе Туг Рго Агд сій Аїа 130 135 140 45 пув Маї біп Тер пув Уаі Авр АвБп Аза Гей біп бек с1у Авп бек біп 145 150 155 160 50 бій бек Уаії ТПг сій біп Авр бек Гув Авр бек ТПг Туг бек Гей 5ег 165 170 175 зек ТПг Гец ТПг Іец бек Гпув Аза Авр Тук біп Ппув Нів Ппув Уа1 Туг 55 180 185 190
А1їа Сув біц Уаї ТБгЕ Нів біп сіу Іецй бек бек Рго Уа1і ТПг Ппув бег 195 200 205 60
Рпе Авп Агд сбіу б1іц Сув «2105 89 «211» 449 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» УнН1і-Ідбі важкого ланцюга МАБ2 «4005 89 сій Маї біп Гецп сіп бій бек б1іу Рго сб1у Гешп Уаі Пув Рго б1у С01У 1 5 10 15 зек Гец бек Іец бек Сув Аї1а Аза бек с1іу Рпе Уа1і РПе Бек бек Туг 20 25 30
Авр Меє бек Тер Уаі Агд біп ТБПг Рго б1п Агуд Агуд Гей бій Тер Уаї 35 40 45
Аза Тук І1їе бек бек бі1у б1у сі1у І1е ТПг Тук Рпе Рго Бек ТПг Уаї 50 55 бо
Зо пув б1у Акуд Рпе ТПг Уа1і бек Агуд Авр Авп Аїа Гпув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80
Пе біп Мес Авп бек Гей ТПг бек бій Авр ТПг Аїа І1е Туг Тук Сув 85 90 95
Аза Аза Нів Туг Рре бі1іу бек бек біу Рго Рпе Аза Тугє Тер 01у сіп 100 105 110 бі1у ТПпг Гей Уаі ТПг Уаі1і! бек Аза Аза Бек ТПг Ппув с1іу Ркго бек Уаї 115 120 125
Рпе Рго Гец Аза Рго бек бек пуб бек ТПг бек сі1у с1у ТПг Аза Аї1а 130 135 140
Тец б1у Сув Гей Уаії Ппув Авр Тук Рпе Рго бій Ркго Уаї ТіПг Уаї1ї 5ег 145 150 155 160
ТЕр Авп бек с1у Аїа Гецп ТПг бек сіу Уаії Нів ТПг Рре Рго Аїа Уаї1! 165 170 175
Тецп біп бек бек с1іу Гей Тук Бек Гей бек бек Уа1! Уаї ТіПг Уаї1ї Рго 60 180 185 190 зек бек бек Іец біу ТПг біп ТП Тук І1ї1е Сув Авп Уа1і Авп Нів Гув 195 200 205
Рго Бек Авп ТПг Ппув Маії Авр Ппув Ппув УМа1! бій Рго Ппув бек Сув Авр 210 215 220
Тпув ТП Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Гей Гец сС1у с1Уу 225 230 235 240
Ркго Бек Уаії Рпе Іїецй Рпе Рго Ркго Гув Рго Гув Авр ТПг Ге Меє Те 245 250 255 зек Агуд ТПг Рго біц УМаї ТПг Сув Уаії Уаї Уаї Авр Уа1і Бек Нів сіц 260 265 270
Авр Рго сій Уа1! Ппув Рре Авп Тгр Тук Уаі Авр сі1у Уаії сій Уаї Нів 275 280 285
Авп Аза пуб ТПг Губв Рго Агд біц бі біп Туг Авп о бБег ТПг Туг Агд 290 295 300
Уаї Уаї Бек Уаії Гей ТПг Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гец Авп о б1у Гув 305 310 315 320
Зо бі Тук Гпув Сув Ппув Уа1 Бек Авп Гпув Аїа Гей Рго Аза Рго І1е с1іц 325 330 335
З5
Тпув ТПг І1їе бек Ппув Аїа пув с1іу біп Рго Агуд бій Рго біп Уа1ї! Туг 340 345 350
ТПЕ Гей Рго Ркго бек Агуд Авр біц Гей ТПг Гув АвБп о біп Уаї бек Ге 355 3З6о 365
ТПЕ Сув Гей Уаї пув біу Рое Туг Рго бБег Авр І1е А1ї1а Уаії сій Тгр 370 375 380 бі бек АвБп сіу біп Рго бій Авп Авп о Тук Ппув ТПг ТБг Рго Рго Уаї 385 390 395 400
Тец Авр бек Авр сіу Бек Рпе Рпе Гей Тук бек Ппув Гей ТПг Уаіїі Авр 405 410 415 пув бек Агуд Тер біп біп б1у Авп Уаї Рре бек Сув бек Уаї! Меє Нів 420 425 430 бі Азїа Гей Нів Авп о Нів Тукг ТПг о біп пув бек Гей бек Гец бег Рго 60 435 440 445 сову
«2105 90 «2115» 214 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Уп1іа легкого ланцюга МАБр2 «4005 90
Авр І1е сіп Месє ТПг о біп бек Рго Аза бек ІТецй бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 5 10 15
Авр ТПг Уаї ТіПг І1е Тпг Сув Агуд Аїа бек бій АБп І1е Ріе бек Туг
Тец А1їа Тер Тук біп біп пув Рго с1іу Ппув бек Рго пуб Гей Іец Уаї 20
Тук Авп ТПг Агуд ТБг Іец Аїа сіц сбіу Уа1і Рго Бек Акд Ріе бег 01Уу бо 25 зек сіу бек біу ТПг біп Рпе бек ІТецй ТПг І11е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80
Зо січ Авр Рпе сіу бек Тугк Тук Сув біп Нів Нів Тук сб1у ТПкг Рго Ріе 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу бек сіу ТБПг їув Гей сіц І1е гув5 Агд ТПпг Уаі Аза Аза
З5 100 105 110
Ркго Бек Уаії Ріпе І1е Рпе Рго Рго Бек Авр бі біп Гей пув бег б1Уу 115 120 125 40
ТПг Аїа бек Уаї Уаї Сув Іїец Гей Авп Авп Робе Туг Рго Агд сій Аїа 130 135 140 45 пув Ма1ії біп Тер пув Уа1і Авр АБп Аза Гей біп бек б1у АвБп бек сіп 145 150 155 160 бі бек Уаії ТП бі біп Авр бек Пув Авр бек ТПг Тукг бек Іец 5ег 50 165 170 175 зек ТПг Гец ТПг Іец бек Гпув Аза Авр Тук біп Ппув Нів Ппув Уа1 Туг 180 185 190 55
А1їа Сув біц Уаї ТБгЕ Нів біп сіу Іецй бек бек Рго Уа1і ТПг Ппув бег 195 200 205 (516) Рпе Ап Акуд б1у бій Сув 210

Claims (36)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділене антитіло або його зв'язувальний фрагмент, що зв'язується з доменом АЗ-ВЗ білків СЕАСАМ5 людини і Масаса газсісшагів5, що містить: а) СОВ1-Н послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1, СОК2-Н послідовності 5ЕО 10 МО:2, СОВЗ-Н послідовності зЗЕО ІЮ МО:3; СОР1-І послідовності ЗЕО ІЮО МО:4, СОВ2-Ї. послідовності 5АЗ5 і СОВЗ-Ї. послідовності ЗЕО ІЮ МО:6; або БЮ) СОВ1-Н послідовності ЗЕО ІЮ МО:7, СОК2-Н послідовності ЗЕО ІЮ МО:8, СОМЗ3-Н послідовності ЗЕО ІЮ МО:9; СОР1-Ї. послідовності 5260 ІЮ МО:10, СОВ2-Ї. послідовності МТК або МТЕ і СОКЗ-Ї. послідовності ЗЕО ІЮ МО:12; або с) СОК1-Н послідовності 5ЕО ІЮ МО:13, СОК2-Н послідовності 5ЕО ІЮ МО:14, СОКЗ-Н послідовності 5ХЕО ІЮ МО:15; СОРК1-І. послідовності БЕО ІЮ МО:16, СОК2-Ї. послідовності ЗАЗ5 і СОВЗ-Ї послідовності ЗЕО ІЮ МО:18; або а) СОВ1-Н послідовності ЗЕО ІЮ МО:19, СОК2-Н послідовності 5ЕО І МО:20, СОКЗ-Н послідовності 5ХЕО ІЮ МО:21; СОР1-ІЇ. послідовності 5ЕО ІЮ МО:22, СОК2-Ї. послідовності МАК і СОВЗ-Ї послідовності ЗЕО ІЮ МО:24; або е) СОК1-Н послідовності 5ЕО І МО:25, СОК2-Н послідовності 5ЕО ІЮ МО:26, СОМКЗ-Н послідовності 5ХЕО ІЮ МО:27; СОР1-Ї. послідовності 5ЕО ІЮ МО:28; СОК2-Ї. послідовності МАК і СОВЗ-Ї послідовності зЕО ІЮ МО:30.
2. Виділене антитіло або його зв'язувальний фрагмент за п. 1, що: а) зв'язується з доменом АЗ-ВЗ білків СЕАСАМ5 людини і Масаса газсісціагів; і БЮ) по суті перехресно не реагує з СЕАСАМІ людини, СЕАСАМб6 людини, СЕАСАМ7 людини, СЕАСАМ8 людини, СЕАСАМІ Масаса газсісцшіагіх, СЕАСАМб6 Масаса їазсісшіагіє і СЕАСАМ8 Масаса їазсісціагів, де антитіло або його зв'язувальний фрагмент містить варіабельний домен важкого ланцюга і легкого ланцюга антитіла, вибраного з групи, що складається з: а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО:31 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:32; Зо р) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:33 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:34; с) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:33 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності 5ХЕО ІЮ МО:34, в якому К в положенні 52 замінений на Е; а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності «»ЕО ІЮ МО:35 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:36; е) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО:37 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності БЕО ІЮ МО:З8; і У) антитіла, що містить варіадбельний домен важкого ланцюга послідовності «ЕЕ ІЮ МО:39 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:40.
3. Антитіло або його зв'язувальний фрагмент за п. 1 або 2, що зв'язується з доменом АЗ-В3 СЕАСАМ?5 людини і Масаса їазсісшіагів: а) зі співвідношенням афінності відносно СЕАСАМ5 людини і афінності відносно СЕАСАМ5 Масаса газсісціагі5, що дорівнює «12; або р) з афінністю відносно СЕАСАМ5 людини і/або СЕАСАМ5 Масаса газсісціагі5, що дорівнює «10 НМ, або с)іа, Б.
4. Антитіло або його зв'язувальний фрагмент за п. 1 або 2, що зв'язується з двома областями домена АЗ-ВЗ3 білка СЕАСАМ5 людини, що містить послідовності ЗЕО ІЮ МО:76 і ЗЕО ІЮ МО:77, відповідно.
5. Антитіло або його зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-4, що містить: а) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності «ЕО ІЮ МО:31 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:32; або Юр) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО:33 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:34; або с) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО:35 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:36; або а) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:37 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО:38; або 60 е) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО:39 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:40.
6. Антитіло або його зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-5, що є химерним або гуманізованим антитілом.
7. Антитіло або його зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-6, що містить: а) важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІО МО;:41 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:42; або Юр) важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:43 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІО МО:44; або с) важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:45 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:46; або а) важкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІЮО МО:47 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:48; або е) важкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:49 і легкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІО МО:50.
8. Антитіло або його зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-6, який містить: а) важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:51, 5ЕО ІЮ МО:5 або 5ЕО ІЮ МО:74; і р) легкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:17, 5ЕО ІЮ МО:23, 5ЕО ІЮ МО:29, 5ЕО ІО МО:55 або 5ЕО ІЮ МО:75.
9. Антитіло або його зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-8, який містить: а) важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІО МО:51 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:17, або Юр) важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:5 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО І МО:23, або с) важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:5 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:29, або а) важкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:51 і легкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІО МО:55, або е) важкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:74 і легкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІО МО:75.
10. Виділене антитіло або зв'язувальний фрагмент, що зв'язується з доменом АЗ-В3 білків СЕАСАМ5 людини і Масаса газсісціагів, і що містить: Ко) а) важкий ланцюг, що складається з послідовності зЗЕО ІЮ МО:87 і р) легкий ланцюг, що складається з послідовності ЗЕО ІЮ МО:88.
11. Антитіло або його зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-10, що являє собою біспецифічне або мультиспецифічне антитіло.
12. Антитіло або його зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-11, де фрагмент вибраний з групи, що складається з Ем, Раб, Е(аб)2, Рар', азЕм, (азЕм)2, зсЕм, зе(Ем)2 і діатіл.
13. Виділена нуклеїнова кислота, що містить послідовність, що кодує антитіло або його зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-12.
14. Клітина-хазяїн для експресії антитіла або його зв'язувального фрагмента за будь-яким із пп. 1-12, яка була трансформована нуклеїновою кислотою за п. 13.
15. Імунокон'югат, що містить антитіло або його зв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1- 12, кон'югований або пов'язаний щонайменше з одним інгібуючим ріст агентом.
16. Імунокон'югат за п. 15, де вказаний інгібуючий ріст агент являє собою цитотоксичний засіб або радіоактивний ізотоп.
17. Імунокон'югат за п. 15 або 16, де вказаний інгібуючий ріст агент вибраний з групи, що складається з хіміотерапевтичних засобів, ферментів, антибіотиків і токсинів, таких як низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини, таксоїдів, алкалоїдів барвінку, таксанів, майтанзиноїду або аналогів майтанзиноїду, томаміцину або похідних піролобензодіазепіну, похідних криптофіцину, похідних лептопіцину, ауристатину або аналогів доластатину, пролікарських засобів, інгібіторів топоїзомерази ЇЇ ДНК-алкілуючого засобу, антитубулінових засобів і СС-1065 або аналогів СС-1065.
18. Імунокон'югат за пп. 15-17, де вказаний інгібуючий ріст агент являє собою (М--деацетил-ІМе- (З-меркапто-1-оксопропіл)умайтанзин) рм1 або Ме-деацетил-М2-(4-метил-4-меркапто-1- оксопентил)майтанзин (ОМА).
19. Імунокон'югат за будь-яким із пп. 15-18, де антитіло ковалентно зв'язано розщеплюваним або нерозщеплюваним лінкером щонайменше з одним інгібуючим ріст агентом.
20. Імунокон'югат за п. 19, де вказаний лінкер вибраний з групи, що складається з М- сукцинімідилпіридилдитіобутирату (5РОВ), 4-(піридин-2-ілдисульфаніл)-2-сульфомасляної кислоти (сульфо-5РОВ) і сукцинімідил(М-малеїмідометил)циклогексан-1-карбоксилату (ЗМСС).
21. Імунокон'югат за будь-яким із пп. 15-20, де антитіло містить важкий ланцюг з послідовністю 60 ЗЕО ІЮ МО:5 і легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:29.
22. Імунокон'югат за будь-яким із пп. 15-21, де імунокон'югат характеризується відношенням лікарського засобу до антитіла (САК) в діапазоні від 1 до 10.
23. Імунокон'югат за будь-яким із пп. 15-22, де антитіло містить важкий ланцюг, що складається з послідовності ЗЕО ІО МО:87, і легкий ланцюг, що складається з послідовності ЗЕО ІЮ МО:88.
24. Фармацевтична композиція для лікування злоякісного новоутворення, що містить антитіло за будь-яким із пп. 1-12 або імунокон'югат за будь-яким із пп. 15-23 і фармацевтично прийнятний носій.
25. Застосування антитіла або його зв'язувального фрагмента за будь-яким із пп. 1-12 для лікування злоякісного новоутворення.
26. Застосування за п. 25, де злоякісним новоутворенням є злоякісне новоутворення, що експресує СЕАСАМ5.
27. Застосування за п. 25 або 26, де злоякісна пухлина являє собою колоректальний рак, рак шлунка, легень, шийки матки, підшлункової залози, стравоходу, яєчника, щитовидної залози, сечового міхура, ендометрія, молочної залози, печінки, передміхурової залози або шкіри.
28. Застосування імунокон'югата за будь-яким із пп. 15-23 для лікування злоякісного новоутворення.
29. Застосування за п. 28, де злоякісним новоутворенням є злоякісне новоутворення, що експресує СЕАСАМ5.
30. Застосування за п. 28 або 29, де злоякісна пухлина являє собою колоректальний рак, рак шлунка, легень, шийки матки, підшлункової залози, стравоходу, яєчника, щитовидної залози, сечового міхура, ендометрія, молочної залози, печінки, передміхурової залози або шкіри.
31. Застосування антитіла фармацевтичної композиції за п. 24 для лікування злоякісного новоутворення.
32. Застосування за п. 31, де злоякісним новоутворенням є злоякісне новоутворення, що експресує СЕАСАМ5.
33. Застосування за п. 31 або 32, де злоякісна пухлина являє собою колоректальний рак, рак шлунка, легень, шийки матки, підшлункової залози, стравоходу, яєчника, щитовидної залози, сечового міхура, ендометрія, молочної залози, печінки, передміхурової залози або шкіри.
34. Застосування антитіла або його зв'язувального фрагмента за будь-яким із пп. 1-12 для ех Зо мімо детекції експресії СЕАСАМ5 в біологічному зразку, взятому у індивідуума.
35. Застосування за п. 34, де вказане антитіло має детектовану молекулу або речовину.
36. Застосування за п. 34 або 35, яке призначене для діагностики присутності у індивідуума злоякісної пухлини, визначення сприйнятливості пацієнта зі злоякісною пухлиною до терапевтичного засобу, націленого на СЕАСАМ»5, або контролю ефективності терапії злоякісної пухлини, яка несе СЕАСАМУ»5, або детекції рецидиву злоякісної пухлини після терапії злоякісної пухлини, яка несе СЕАСАМ5.
А. Седектваність МАНІ до СТАСКАМХ МК нини піні нин нн п пн нон З, КІ оо А х ККУ СУК тя 2 шт СЕАСАМаА СЕАСАМІ СЕАСАМБ СЕАСАМ? СЕАСАМА В « Селективність МАЯ до СБАСАМУ 30-х пня ав пінні в щх Ж 15-55 пон - ш ш й Я нин о о о о о і по о п аа М, ПЕЗЕЗККК ее ВКАннттутня КМЖЖКА понуляння НН СЕАСАМО СЕАСАМІ СЕАСАМО СЕАСАМ; СЕАСАМО
Фіг. І Початок
С Селективність МАВ до СЕАСА МУ
2. нн 14 щх Я х. г а | І Щ овІ І ше шин ш
0.0-- ИНА, ун ЕН ення ВООВВОВ, нрннн ЕООВЯв дян СЕАСАМО СЕАСАМІ СБАСАМЕ СЕАСАМТ СЕАСАМВ В! , Селективність МАЛО СЕАСАМА г г ФфЕфНІ рн КОД в.о і Комо СЛІДУ до щд ПУ. СЕАСАМО ПЕАСАМІ СЕАСАМЕ СЕАСАМ? СЕАСАМА «Фіг. 1 Продовження Е ; селективність МАВ до СКАСАМУ ад Ко фін сні В КОХ У їх воза нн щу СИ ЕО її С за ення пн о п о п с па ря А им "УЗИ Со ши СЕАСАМО СЕЛСАМІ СТАСАМО СЕАСАМУ СЕДСАМа
Фіг. 1 Кінець
А. Картувавня доменів МАВ на СЕДСА МУ люднни 4 шк нн чна нн Уа ТИНА 5 М Ое ДЕ о Фі -й стеку а МСБАСАМО 5 | ТСЕАСАМО АЙ-ЯІ АЖ | ноеасамв дова ловеве ВСЕАСАМИ АТ ЯЗ НОБАСАМО ДЯ ЗЕ
В . Картунивня домевів МАВ їв СЕАСАМХ людини Б денне тт тент МУ КО
Ж. і о нн пн нн о шк
05. ОКХ КО их РОБАСАМО, 1-85 Е ВССАСАМО АВ ВЕБ І ВСЕАСАМЕ АЗВІ 495685 і ВСБАСАМО ДІ Я ОКАБСАМО л-во 321-498
Фіг. З Початок б. Картування доменів МАВ) на СТ АСАМУ подини є. пн опо поні поп нні опівдні кун ї ча 1 Зо ин пон й о в.
о. . й Ел ку, БОБ Дех 0 ЛСЕАСАМ 1505 001 ПОБАСАМО ДІЯМ 343-330 | НСБАСАМ АВ 499-886 НСБАСАМО АТ 143-337 МСБАСАМ5 АО-ВО, 321-498 ві Картування доменів МАВ на СЕАСАМ5 людини де
- о. ФО я и 8 СХ пен ее . ПСЕАСАВМЯ 1-585 | ВСЕАСАМО ДІВ 1553950 і ПСЕАСАМО. АЗ-ВО 489-685 СКАСАМО АТ 148-837 РСЕАСАМ АО-НО 218 Фіг, 2 Продовження Е Й Картувания доменів МАВУ ва СЕАСАМО подвии З КО КК РСБАСАМЕ 1-586 | ВСЕАСАМУ АТВІ КО Е НОБАСАМЕ АУВа 490-685 пСБАСАМЕ АТ. 143-237 НСЕАСАМЬ ОВО 321-498 Фіг, а Кінець
Д. Картуванен леменів МАВі ва СБАСАМІ СЄуво і пре опт іо тт тт ответ тенет тест нн жютюнння ; леж Же тт У пон ссср вний Ти ДЯ Я Шк . ванни асо Дня гііпкинітндннкини во д. М рок ЗУ зооссосе ВШ ЗСБАСАМО. 1488 оСЕАСАМЕ АНІ НО іксвлОАМЕВ МАЯ-ВІ 120 ССБАСАМЕ АЗ-ВЗ ЗОВ 0 ХСБАСАМО. ово. 11-08 в Кавтування зоменів МАВ ва СБАСАМУ Суво і Ї рр я З С З З Я щи щ ШИНИ 3 М Я їЗ я ЗУ ї Ко 5 клен пкктеннкхккькнна ткани пня 7 с. покину нд канди чннтттнннн а . тек пн ВО ООО В спяяяслея ан ВЕК «СЕАСАМО. 1-08 ССЕАСАМО АНІ 143-300 | есБАСАМУ МАТИ 1-30. ССЕАСАМУ АЗІЯ АЖКВОВ 0 СОБАСАМЯ АВ З01ЩВІ «г, У Почах
С и Картування домевін МАВЗ наст АСАМУ Сула
2.5 пет 2 4 рек Я сит Ф й с. о а - пн нн нн І а 5 в. а АВМ поко Я лож ССЕАСАМЕ, 1-88 | есеАСАМЕ ЛІВІ, 143-320 ФСБАСАМ. МАВА-ВИ. 1-20 обКАСАМЕ АЗ-В3 490-086 00 СОБАСАМО дово 321-498 р Картування доменів МАМ ва СЕАСАМ Суло У що ее се ге Б 5 ч Б с
! . я І Го дося п Бо хе пп ДВО етнос «СЕАСАМЕ ВВ оСБАСАМЕ ДІ-ВІ 343-320 сОБАСАМЕ КАЇН 1320 еСБАСАМЯ АЗ-В3 490-888 0 оСБАСАМО ОВО 321-458
Фіг. 3 Продовження Е Картування доменів МАУ на СЕАСАМ5 Супо МО пиши нн а орех що ше ке ши и щі Ер о ОСЕАСАМО. 1-88 ССЕАСАМО АВТ 143-320 ЗоСЕАСАМУ МАЗІ 1320 СОБАСАМО АЗ-ВЗ3. 459-608 ЄСЕАСАМ Аа 321-498
Фіг. 3 Кінець
ЗБ - що й ж 00 ;
5. в я у і: Бо З і й КІ й що р. хо 500 , аа ва Кк Ко З в я и й вс кв Й о. 750 95 3 35 4 45 5 Доба шісня імхив'ації -ь Контлоль Ї --- ОВМАБА-БРОВ-ОМЯ при 5 мік о СВМАВА-ЗКОВАОМЯ пря б Б Мей ! ак СПМАВОВОВАМА при б можго С. ! - САМА РОВОМ при 5 межг Кочан ОПМАБІ-ЗВОВОМА при 5 мгже Ї як. СНМАБІ-БРОВАЗМА при З. між Го я оВМАЬБ-БРЮВ-ОМА при 5 може Го СИМАНВ-ЗРОВ-ОМИА при 2,5 мг
Фіг. 4
Я во й воо ОА х й в х й К мі в Ф 400 о вла ж Й соти кави й Й Ук ас 295 ня ВЕ ху.
КМ жест: - о- маних пополаввввнини нні попів З го 24 Кк За 30 Доба після імпланта тео Контроль РОочй- оВМАБо-ВРОВАОМЯ при 10 мкг Н -в- СВМАБ2-ЗРОВАСМА при 5 мг ЗО ОВМАВІ-ЗВОВОМЯ при 2.5 маг в сАмМАВОВРОВАОМА при ей мок й пОМАВИЗРОВ-ОМА при 13 мкг - ВУМАВУОРОВ-ОМУ при Б мкг Фо ПоМАВЕЗВРОВАОМА при 25 мкг 0 пимМАр З ЯРОВ-ОМЯ при 1,255 мок Коко помАВо-А-ВРОВАЗМА при 10 меж я ВИМАБІ-Я-ЗРОВАЮМА при 5 мкг «й НОМАБІ-А-ЗРОВ-АЮМА при 2,5 мг/кг зв: ВиИМАБІ-З-ВРОВАОМА при 1,25 мог «ріг. 5 наль КОНтТроОлЬ ОО пОМАНІЗЗРОВ-ОМА при 10 мкг В римМАБО-3-ВеОВ-ОМА при 5 мг/кг "БК ВУМАВО-З8РОВАМА при 2,5 меле що дви 8 чі я я ще І я 4 х .7 й 500- й М не У» й здат к аоо мон й дини ї реж ши Ко; т с : й 200- гай рай "7 сесасн й Ме дян В ох т ІЗ пеня пом пимнннннити питних пипенннннн -5 за За 8 зи «5 Доба після імплантації
Фіг. 6 МмдьЗ уп С БЧКБУВБВООСЗСУКРОСБІТЬВСААБ СЕТ ВАХАМОКВОТЕВКА ВУХО Марі УМ 11) БУМІЧЗЕОООСІУКЕСОБЬКЬОСААБСЕТЕВВУАМОКУВСТРЕКАСЕНУАТІВЗВСОІХТУ У мара УК 11) ЕУОТУКЯСОСЬУКРООВІКІЗСААоОЕТЕВаУВМОНУВОоТеКЕВекКиУаКІВНОСиИ МАО ХН ПУ БОГУ КлСсСУБУКрООоВІКЬЗСААЖСсЕАЕВВХОМОУКОГиКИКоКНУ ХІН КУ Є МмаАде У ї1) БОБОБВОСМЕМиКРОБВЬБКОВІЛАБНЕЖУКЕВХВМІМНУВОТРЕКАСБУЯЗАХКВВСІЕ МАВ УНН ІБ0) РОБЗУКОВБЕТУВЕСМАНМІСКІОМаіВЕКОТОМУХСсААЧМІХОВЕІОННООТТЬТУВ я МАві УВ 1611 БрОБУКСВЕТІДВОМАКиТУХСОМЕВІКЛЕРТАМХ УСВА РАХУСМРАМОУУСОсСТВУТУвА МмАБа мн БІ) ДОоТУКСНЕТІЄКОМАКМТОУБОМОБКВКОТАМЕСААИХЕСТВсУКАУНООСТБУТИВЕ мМдиб УК іаї1) ВОТУКОВЕТІіБКИМАКнЕнПуУгОМаВвіКЗБОТАТЧУСтТАНХЕСИБОРЕАУМОСТЬИТУВА МАІ УВ 51) вся ТУЕКрМАкМТОХ ОоМмМО Каган УЕООНсКи УНИЗУ ТИ ВА Мав: УНН ТР) ВІММТОЧОВЕМаТЕБВОВУЄМТСКА ОМУОТММАЙХООКЕООЗРКАБІУВвВУВУВСУуво Мах З (1) рІТМТОБОКЕМОЖВУСІВУВУТСКАВ ОМУЄТМОАМНУООКРООБРКРІІУВАВУКУВОУРО МАвБа чи (1) пПІОМТОВРАБББАВУСИТУТІТСВАВЕНІХВУКАИХООКОСКОРОБ УМА АЕВУКО МАВ УК (ЗР ВІОМТО5РАББІАБУСЕТМТІТСНАВЕМІЖХВУ АНЕООКОСсИиВРОПЬСМАЖТІТЕСУРО МАБл УМ 11 ПІСОМТОБКАВЗЬБАЗУСЕРТМТКТСВАЕНІЕВІБАНУООКОКОВОБОУМЕКТОБАКОУ ВЕ МА» УНН їБРЬУ вЕТОШСООТОЕТЕТІЗКУОВБІО ЛАКУ СОоМрУМНХвеЖжКооОоТКвІК Мові А с61)5 ВЕТСВОБОТОБТЬТІВМУСЕКІН А ВУКСОМЖНЗЕРЬУТЕСОСТКЦЕЇК МмАБАаА УБ 81) ВЕБОБОБСОСТОЕВОКІМЗІОРЕОГОТУСОВНЕОТРОЕЖТКСООТКЬБЬК МАУ УН 1635) ВЕшОБСБСТОГБІКІМЕБОРЕПЕСВУХСОННУЄТРАЕТЕ СТІК МмАаеИи сн 51) ВЕБОСБОБЖТОКВІЖІМВОРЕВЕсИТХУсОнНнуІтеЕ ЕКО ВОоТКВІК ЧигоЇ ра й чи З пе | оНМАВБІ-ЗРОВ-ОМА К ї к Я со: В Шо 1 х ! | | ап ! З ШЕ шк ше
: а. | і їв і 1 М й й я Мем і г у НІ ї ' ї і Н І: : й й ї їж і і й Н Н ї дух ! | ши ни Мо ! и ; і ї і І; ЩЕ В ше | и ши ше ; ши ше ї : зажи ов р, п шк Я Н х РЕ УК НЕ НЕ НЕ В В пут, ! ! І ; а пішки ше ша» А КЕН МН ко й Дон м-н У щі ПЕ ен М. ЩІ м один т Шах а мае в ване вне а зим в Мав фіг. 8 кі що В їм ! зва ї І спмМАВО-8РОВ-ОМА.
а. і ре і ШИ ше ! БЮ ! І Я і | 5 Е ши ше і і і М і | : ТВО | | | ре Е | ! . | є БМВ і : ! . | : і , ше ши шк ше ши ! ; : і | ; і БОЖКО і | ! ' | меш ! | | ! ' ! ! г ов ї ї В. і і ї рони ни МИ ! рої вва 1 ї НЯ Н : М: НЕ Ц ! Н Ц НИ 1, | Не З Я роя 1001 «о Б, Я нь Ї чвввио А кла ВІК БРА Я ВДЕ КМ, я М оку ко ще ен она Шк й НИ вів ИН вл МкКО зак реч; ра охо 2 ча НК ОХ фіг. 5 пз р як ші і Й і | свмАБа-ЯРОВ-ОМИ і | Н ї каш ши Ше сс: ШИ НД ши ши ше етя і : ; : і і і ше ши ШИ ше ши ! | | ов т 4 їх й Я З миши ши ши и с Ї М: В ї ї Н ши ши ши ши шо шщ- щ ще ши ше с : | ї | і ї ОО 18маа І кї ї НІ М х й . : : 1 Ну і: сщя і і В і Н ІН і ! ре ї - ши ни ки и ! їж ши еп ЩІ Е ій ї І; | ща Н іх Бі НЕ ін Щі й Н І ба 1 ВН 0 М ОО 11 М НМ ком до ВИЗ і А АКА В Я ши мч чи ТИ ри Ме ет ри сут Ж туя КМ яти Мер тут тв ут ТК ва МА на вази інегоі я БАК я ЧО СА реа, хе
Фі. Ю по в тд Й : ! ! ! Бе І й і ва щ- завдя РО смАВ5-ЗРОВ-ОМА ше: ши і і і р маш ше ШИ ШІ но М ГИ ї ї ни ши ше ши ше ве ЕН Я ! і | | | аа? ї ї ї с-ще ШІ Ше М и НИ М й Е В Є | ; Ко ядлку зво | ши ши ши й дв Е НН і її Нй ій і ' ря, я Ії ! ї ! шин ДІШи ши що ЩЕ ввів І : кр. БІ ЕН Я НН і, ї Й руш шен ни и ен а а вай. ин МА НН М НН ВАВ В В КП С ПЕ о ост НКИ Кесліжяї 13 захю мОщ оо що вка ки 15АЖИ хя те ФНр як 182 00 зБОВво Я я з.5.ерпОд ма шо | ! пн Ав 5ООВ-ОМА і ! і Ма ! І І і і ї З Н ві рі | ! се : і ! : : ; ї : : , оздджа СИТА. Н ї С поза : Н чи | ри (ово : Е ЕН : се І : ща 077 плмдвва ВОВИХ ШЕ пу у НВ МОУ ча ПУ ц ІМ: 4 По мух Б, а и змив ШЕ М ЯКА ВХ хі НО Я: Г; ї очні конк м А кі їх мі Кун Мондансї во Сюди Мах З М т Ве м зви
Фіг. 13 кі 15018И Її (ово і і З і! Н ! ше 143 | ниМАВа-1-ЗРОВ-ОМА : і теБ5 ! | : і ! ' Е і Н ї ! еу | | і в ее: СВ . | | ис , Е . Е ! Н |: і ! ; | | ї | | і ; Н ; г ІЗ . і . | : . : ; Ї ниту Е. | 187 ов ! ! ї з ТВА 15Т2ВИ рома ИІ1000001роваюв Бан і НН НЕ РЕЗН ЯН и ле її ши ши ше и ех йони У Ук й р лі я Да В У КН ж Удод ше ОА УЖ АКА с МУ плавала хе хке ре ке я
Фіг. 13 і в-ва ! і зав пимМАра-з- РОВОМ твівов о і мав ше Н Н ї Р і : | : ! і г Вод / | ! : Е В Е ї І і ! о задрд БВ, ! . он г, ее: НИ КО ес: НН ой ин п ПВ тен: ПН НН АНУ ОО В А ТА І; Се Ш С В 1 ха й ше Ач, АК Ж ний Моди Ман сс ад ас не КВ и дату т руту зи КЕ Кр ОВ зу пах й М Б МА БЖ Зх ша Рей я
Фіг. 14 ра ре кое НІЙ що ! : 1535 р2 ; їж ше ово поМАБО-А-ЗРОВ-ОМА с якив ! ! ши ще й ! вд і ре , й | ; | Гозвовев ! : | | | й ! | вра ав Ба? зда Зв ка 0 вию оо мм ато ххх ЗВО ресаоя п нут дея
Фіг. 15
Е Досягнення 5 Кодхе ! їж нн гі Й а шия ли ЕМО в ла Неові ши щи ше вк жи шк ни шк Шк мк Мк Зк Шк Шк Як ЖК З Ж ЖИ і ше шк ща й - й и ше ни і «і й ІЧНЯ Те Т- НИ! НІ Ів! ЩА Ї І 7 НН, НОВ в НН ВАН НАННЯ 23355585 5555 Ж х ЕЖАЕЖІБАї А вах кувжя БВ БЕ 315485 55558555 "Кн КаВАЕх ЕНН НЕНАЧЕ БЕ і ЕНН і яМиАсЯВСО дюкімжжує на о пан аа і п а в в о о а о и ВО ПО В ОО в В в в В ОО Фів ббкигналу, що заакнився, чере ЗО жекуна рах ДОА тт я тт тт тт т тт АК хе пен нн ново я ОК ше з зн хни чшжжщ ши ни ши. г Й чо ж: ке І пиві НН теБНА -А-А НІ з І | ІНН НІ Ії -Щ, ЧІ Ії ШІ ІК Ек о ТІ АН АН в! Ц НН В МК М ЧНІ І МБ м іше «пава ЗНББЕББНОЕВОБО ваних Же Ем в Й, же МЕ ЕВ Її ви ВВЕ ше ЯЕЕЖЕВЕЕ 5 ПЕ УТ УТУт тео сосовУ и УВУ с т- ЖЕКи Ж, 5 в'я і ДЕ несСЕАСАМЕ ВОЮ ГГ сусбАСАМо ЕС Фі? --ее Контроль -а- ОМА ЯРОВОМА присло мо я ВИМАВІ-АОРОВАСНМА при 5 мкг «а ПИМАВІ ЗУ ОВОВАЮМА, при 2,5 мож тов. є в 80- й Що Й обо 5 «о р Ки » Кк З й Кз; т Ку є Гб» ко як е Гобі М. щу й ша а нь З пут ї : т шк у 80 Доба післа імплантації
Фіг. 18
Ше кеюрея 000000 в ПОМАЮОВРОЮВ-ЮВМАЯ пон 5 му - НИМАЮІ-З-ЯРОВ-МЯ при 5 му ск ПІДДАВ З НУВОВ ОМ пки з мету те ПОМАДА З Ви НВРОВНОМ при гм веіче ш 500 Я
К. ; - я 4350 - 1 то у х їх Фо 500 | / де? ЕЕУ й рай й 5 250 Де ре АИВ
0. т КІ 25 За 35 «й Доба пісня імплантації Фіг, 19 па Щі Ж ! і ра і Задай М Е і т х ш мин З ява І ! Е ) - ; ЕН це : ! і зав Ав | у ую | М дих | т ме ! і і І НВ Ох І В г до ! ру» | ке | ще пиши ши ПК ант М я з АЛділььї меха Де Мен А Мн А деонй У УА ЧФиг. 30 чхвов в і за55 і о кН ! і ГАЗ К і зв І І В ! Е ре Е ом. і : і і ! о ! 188 | Ї ; Нижов | Е ЩЕ Й по і І те зва їх І НЕ | | Й рН НЕ | у "НЕ Я і Ї щ. М Іа й Гх кош и ши чи Он Ам ТИ є; МА КА лиді ува 8. ре ї збив - ке сире уже Мо ЦИ. Сх. жд, Руди в Зо; КИ 50Х Ше в я,
Фнг. 31 Винваханання аарізбсльниах доменів важких ламтюгів Мав? 5рО 315 МКО:33 11) ЕУСЦОКОССувикрОоорКрисвАО ЗБУКИВХЮМОКвО ТРК ке вукВНКЕК (БВ) Ман «ЕІ І05 МО:а7 їі); ЕУСЬУВЗОСУКУКОВВОКрУсАВИ КТК НУЮОТРИКАрКНУудЕтаЗжховитТих «60) мер КО ІБ МО:39 (1) ББОБЕЯФОУБТОКРОЗНЕКОВОААУ КАК КВУрМЕСоВОТРЕКНОЕИУТУТНЕСОЗЕЖУХ 150) ігнанімною МНіа ВБО ІЙ ОМОї5 11) БУОМОНЯОСРСЬУКРОСВОВБЯСААЗ ЗЕУКВКВИОИУВОТвЮииКнуА хх ехтуА 501 Гуєанізокане МЕ ЯКО Її ЩО:51 (1) БЕУОБОБЗСрОБУуКрРООЗЬУОСАаВ СЕУКВАЖрКИсНУВОТРЕККОЕВИлУХИВОВОІтХХ ПеНЗІ Гуманмечах УК? ВБО ХО ОМОТ4 3) БУДБУЮЄВОЗЗВІЛОВОСВІВИЕСАНО ВИМОВИ НВО РОКсСЕНУ т НКУ 50 Мар? ЗЕ ІД МОг33 (51) РОТМОСВЕТУВВОПАКМТІУВОМИОрКЗКОТАІУУсвАВЕКОЗЗсвЕв ОО ТЬМ ВА 1129) мабі 5БО ЇбБ ЩО:37 «531 АОТУКОВЕТІЗНОВАКИТЬОМОВЬИВЕОТАНЕ ХО АВК ОТО КУЄ (325) мае ЗЕО ІВ БОСЗВ СБ) УТУКОВЕХЗИСНАВНВИ КИМ ПтвІчУС ТВ КоввоеуаКвсОствУ хв 0 Гомшазєуени ЗНіж ЖЕО ЇВ МО: (01) РОТУКОВЕТУВВОНАКВТОУСКМОХТВКОТАУ с АНІК ОРЕСТ КН ож Туменисане Ні ЗБО І6 0:5і Оіб1) РЕТУКСВЕТУВВОМАКНКХХ ОМС Краснов ОТУТ (МБО) Гіимшнвюває: ОО ВОй ЗВО ЩО МО:Т7а (51 ВОБУКОВЕКТІВНОНІХМІВУТИМУВІААВОТА ЕС В ВИСОТИ ІЗ ! хе Б: Повоження 5 СІК. ню депускануть були яку ковку ІВ ЕВ: Полаження вок. зо динусюдють сідока консеродтивсу заміну зві Полеження в СІВ, ві не люпускають нідких захо
Фіг. 23
Вирівнювання взрійбельних доменів легких лавоюгів Мав ЗО б ОМОї5а (1РБПІОМТО5РАВЬВАБУСЕТУТІТСВАВ ЕНУВВТБАООКОСКЗВОрІМЕ КІНО (60) Хв БО 9 МО:38 ЗБ ОБОМТОФРАНЬВАНУСЕТОТІХСКАЯ ВМІХВХРАХОСКООКОРОУХ МАКІБАЕСТРВ (50) Мава 255 ХО ЩО: (1 БІОМТОВРАБББАВУСЕТУТІ СИВА ВНІЗЧЕАНОСКОсЧКВЕОрУ АЖ ОчКВ (5 Гумаріжонане МУ ОБЖЕБО КО МОКІ? СТР О1ОМТОБКАВСЕАВУСОТУТІТСВАН ВНУКИ АХ ВКОКВЕКЬУ У МКК КАЖУ ЕВ 1551 Бузавіюазна жів ШЕО І ОМКО:ЯЗ 1) 01УМЖОВЕАБВОАВУБВОКУТІ САМ ЕНІЕВ АНІ ОКРОКЗРКБИМУ МЕКТОАБСЯ ЕМ се Тумоліюваза Уріс ББИ ТОЙ МО:23 11 ПІСМУОЗВАБОЗАВУСОВУ ТІТОВА ЕНХЕВЖЬАНООКУЖНРКСЬМУ МЖИТЬВЕСУК 50) Гумакщовани шій БЕО ІОВ ОМО:ЗЯ (13 ФТОМТОЗРАБЬЗАБВУСОТУТІТСВАВ ЕВМІКЕЖСЛИХОКРОКЕРКООУУ МЕАТОВНОУРЕ 59 Гумеюікюачн тЬБ35 ЗО І МО:75 011 ПІОМТОЗРЕЗБОАВЧУСОВУ ТІСНА ЛЬАНУСОКРОКАВКІОЗУ МИТ ЬСВУРа 150) МмавБІ БЕО ХО МО:34 (531 ВУБОЗаяСТОКВІКІМЕЬОРЕНЕсНКТСОНиХОтвЕККоВстТКоЕІМ БО меюя ЗО 10 МОЗ фбБРКЕБаЗОоЗОТОВНЬКІКОІОКБОВСТХ Сов ехВит ов еОкУВ 1107 меш БО ІбОМО:30 1611 КЕБЗСОО5ОТОКОЬКІНВІОРЕОКОВУУСОВНУоТВЕ тро КЬВІК 107, Гхмдиїнвхца 523 0 ББО ІЮ МО:У 16131 КЕЩОВсНЧеТО ЗД тТІВВІОТЕОТСЯХХСУВНХсКяККОсОІКЬвІК СМ) Гуманхювани ЖЬія ВЕО Б ОМО:23 (65) АРНОБСЕОТВІВІТІВО ОРЕОКАТХУУСОВНІСТВЕЖКоВСТИБЕТИ (337) Гукаомізеня ОЖБіс БЕО І МО: БТ) ОБОВУУПЕВЬТІВОСЦуРБОГАКУОСЯНТОТВУТОЗСТЕОЕІК 5197 Зумзніююва ЖЖ БО ІВ ОМО:55 531 БЕВСНОВОсТОКНеРІВВІОрКООоВУсаВНоКвЕи ІТИ КІК (07 Гумаціним іш БО ЇВ МО:75 1Б11БЕБОВЗЗЕОЖОРЕСТІВВСОРЕРЕАТУХ СВ соОстТКоВІК 107
ІВ В.
Положецня я СІК, ізо допускають Будь-яку заміну їв -. Положення я СОВ. що лопускаиєть зідьки коносравівоу заміну рій Го Положенця я СОН. що пе лютуєканють вічких замін «Фіг. 53
UAA201506107A 2012-11-20 2013-11-20 Антитіло до ceacam5 і його застосування UA120247C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12306444 2012-11-20
PCT/EP2013/074291 WO2014079886A1 (en) 2012-11-20 2013-11-20 Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120247C2 true UA120247C2 (uk) 2019-11-11

Family

ID=47257727

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201506107A UA120247C2 (uk) 2012-11-20 2013-11-20 Антитіло до ceacam5 і його застосування

Country Status (39)

Country Link
US (4) US9617345B2 (uk)
EP (3) EP3594243A1 (uk)
JP (1) JP6324399B2 (uk)
KR (3) KR102194748B1 (uk)
CN (2) CN104918958B (uk)
AR (1) AR093557A1 (uk)
AU (2) AU2013349733C1 (uk)
BR (1) BR112015010993B1 (uk)
CA (2) CA2889962C (uk)
CL (1) CL2015001321A1 (uk)
CR (1) CR20150258A (uk)
CY (1) CY1119219T1 (uk)
DK (2) DK3199552T3 (uk)
DO (1) DOP2015000110A (uk)
EA (1) EA039377B1 (uk)
EC (1) ECSP15025845A (uk)
ES (2) ES2778823T3 (uk)
HK (1) HK1215444A1 (uk)
HR (2) HRP20170743T1 (uk)
HU (1) HUE033369T2 (uk)
IL (1) IL238559B (uk)
LT (2) LT2922875T (uk)
MA (1) MA38194B1 (uk)
MX (1) MX358321B (uk)
MY (1) MY171100A (uk)
NZ (1) NZ708528A (uk)
PE (1) PE20151180A1 (uk)
PH (1) PH12015501092A1 (uk)
PL (2) PL3199552T3 (uk)
PT (2) PT2922875T (uk)
RS (2) RS60043B1 (uk)
SG (1) SG11201503285TA (uk)
SI (2) SI2922875T1 (uk)
TN (1) TN2015000177A1 (uk)
TW (2) TWI664192B (uk)
UA (1) UA120247C2 (uk)
UY (1) UY35147A (uk)
WO (1) WO2014079886A1 (uk)
ZA (1) ZA201502959B (uk)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2922875T (pt) 2012-11-20 2017-05-31 Sanofi Sa Anticorpos anti-ceacam5 e suas utilizações
US9753036B2 (en) * 2014-04-29 2017-09-05 Edp Biotech Corporation Methods and compositions for screening and detecting biomarkers
WO2016036861A1 (en) * 2014-09-02 2016-03-10 Immunogen, Inc. Methods for formulating antibody drug conjugate compositions
JP7044700B2 (ja) 2015-10-02 2022-03-30 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ｃｅａｘｃｄ３ ｔ細胞活性化抗原結合分子
CA3006529A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
EP3523333B1 (en) * 2016-10-10 2023-12-13 Singapore Health Services Pte Ltd Anti-ceacam6 antibodies and methods of use
UA126388C2 (uk) 2016-11-18 2022-09-28 Астеллас Фарма Інк. Fab-фрагмент антитіла до muc1 людини
CN106749667B (zh) * 2016-12-04 2020-07-14 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 一种抗癌胚抗原的纳米抗体及其应用
CN108341876B (zh) * 2017-01-22 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗人ceacam5单克隆抗体及其制备方法和应用
CN106946989B (zh) * 2017-03-02 2020-02-18 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 抗cea抗原vhh结构域及含有其的双特异性抗体
TWI795415B (zh) * 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎的抗人類ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段
RU2020100072A (ru) * 2017-07-11 2021-08-11 Пфайзер Инк. Иммуногенные композиции, содержащие cea, muc1 и tert
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
PL3765525T3 (pl) 2018-03-13 2023-12-27 Zymeworks Bc Inc. Koniugaty biparatopowe przeciwciało anty-her2 – lek i sposoby stosowania
EP3781592A4 (en) * 2018-04-20 2023-01-11 The Regents of the University of California TREATMENT OF PROSTATE CANCER WITH CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS
AU2019281358A1 (en) 2018-06-03 2021-01-07 Lamkap Bio Beta Ltd. Bispecific antibodies against CEACAM5 and CD47
CN110684108B (zh) * 2018-07-06 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗MG7-Ag的单克隆抗体(CEA37)及其用途
CN110684107B (zh) * 2018-07-06 2021-03-23 中国人民解放军第四军医大学 抗MG7-Ag的单克隆抗体(MGd1)及其用途
US11672826B2 (en) 2018-08-30 2023-06-13 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
WO2020047299A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
CN113365663A (zh) 2018-08-30 2021-09-07 Hcw生物科技公司 单链嵌合多肽和其用途
EP3865154A4 (en) * 2018-10-10 2022-11-09 Astellas Pharma Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING ANTIBODY FAB FRAGMENT COMPLEX AT LABELED ANTI-HUMAN SITE
CN111487411B (zh) * 2019-01-29 2023-05-09 瑞博奥(广州)生物科技股份有限公司 Ceacam1多肽的新应用
CA3129106A1 (en) 2019-02-07 2020-08-13 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
EP3693023A1 (en) 2019-02-11 2020-08-12 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
WO2020216847A1 (en) * 2019-04-23 2020-10-29 Sanofi Stable, low-viscosity antibody formulations and uses thereof
WO2020244528A1 (zh) * 2019-06-04 2020-12-10 上海吉倍生物技术有限公司 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途
US11655302B2 (en) 2019-06-10 2023-05-23 Sanofi Anti-CD38 antibodies and formulations
CA3142887A1 (en) 2019-06-13 2020-12-17 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aminobenzazepine compounds, immunoconjugates, and uses thereof
CN114269903A (zh) 2019-06-21 2022-04-01 Hcw生物科技公司 多链嵌合多肽和其用途
WO2020260326A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
WO2021046112A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aminoquinoline compounds, immunoconjugates, and uses thereof
US20230136228A1 (en) 2019-09-18 2023-05-04 Lamkap Bio Alpha AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd3
BR112022006001A2 (pt) 2019-09-30 2022-07-12 Bolt Biotherapeutics Inc Imunoconjugado, composto de 8-amido-2-aminobenzazepina-ligante, composto de 5-amino-pirazoloazepina-ligante, composto de aminoquinolina-ligante, uso de um imunoconjugado e métodos para tratar câncer e para preparar um imunoconjugado
KR20220088901A (ko) 2019-10-25 2022-06-28 볼트 바이오테라퓨틱스 인코퍼레이티드 티에노아제핀 면역접합체, 및 이의 용도
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
CN115380045A (zh) 2020-02-11 2022-11-22 Hcw生物科技公司 激活调节性t细胞的方法
CA3169231A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 HCW Biologics, Inc. Methods of treating age-related and inflammatory diseases
JP2023519106A (ja) 2020-02-11 2023-05-10 エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド クロマトグラフィー樹脂およびその使用
US20230149557A1 (en) 2020-04-24 2023-05-18 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates and cetuximab
JP2023522395A (ja) 2020-04-24 2023-05-30 サノフイ 抗ｃｅａｃａｍ５抗体コンジュゲートおよびフォルフォックスを含有する抗腫瘍組み合わせ
US20230181755A1 (en) 2020-04-24 2023-06-15 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates, trifluridine and tipiracil
KR20230005257A (ko) 2020-04-24 2023-01-09 사노피 항-ceacam5 항체 접합체 및 folfiri를 함유하는 항종양 병용물
CA3181417A1 (en) 2020-04-29 2021-11-04 HCW Biologics, Inc. Anti-cd26 proteins and uses thereof
US20230293716A1 (en) 2020-05-08 2023-09-21 Bolt Biotherapeutics, Inc. Elastase-substrate, peptide linker immunoconjugates, and uses thereof
CA3184756A1 (en) 2020-06-01 2021-12-09 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
WO2021247003A1 (en) 2020-06-01 2021-12-09 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
CN111690061B (zh) * 2020-06-28 2022-08-23 中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心 人源化抗鼠疫耶尔森菌抗原f1的抗体及应用
CN113278074B (zh) * 2020-08-04 2022-03-29 中山大学附属第五医院 抗ceacam5纳米抗体
AU2021326516A1 (en) 2020-08-13 2023-04-13 Bolt Biotherapeutics, Inc. Pyrazoloazepine immunoconjugates, and uses thereof
IL300500A (en) 2020-08-20 2023-04-01 A2 Biotherapeutics Inc Preparations and methods for the treatment of mesothelin positive cancer
IL300497A (en) 2020-08-20 2023-04-01 A2 Biotherapeutics Inc Compositions and methods for treating CEACAM-positive cancer
US20220202946A1 (en) * 2020-11-10 2022-06-30 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugate formulation
WO2022116079A1 (zh) * 2020-12-03 2022-06-09 上海吉倍生物技术有限公司 一种抗ceacam5的人源化抗体及其制备方法和用途
US20220195066A1 (en) 2020-12-11 2022-06-23 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-cea immunoconjugates, and uses thereof
JP2024501453A (ja) 2020-12-11 2024-01-12 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド 抗ｃｅａイムノコンジュゲート、及びそれらの使用
CN112521509B (zh) * 2020-12-23 2022-07-08 姚雪英 一种抗ceacam5人源化抗体、其缀合物及其用途
WO2022204536A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Bolt Biotherapeutics, Inc. 2-amino-4-carboxamide-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
IL306114A (en) 2021-03-26 2023-11-01 Bolt Biotherapeutics Inc 2-amino-4-carboxamide-benzazepine immunoconjugates and uses thereof
JP2024519078A (ja) * 2021-05-21 2024-05-08 ベイジーン スウィッツァーランド ゲーエムベーハー 抗ｃｅａ抗体及びその使用方法
WO2023057564A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Sanofi IMIDAZO[4,5-c]QUINOLINE-4-AMINE COMPOUNDS AND CONJUGATES THEREOF, THEIR PREPARATION, AND THEIR THERAPEUTIC APPLICATIONS
CA3237142A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates and anti-vegfr-2 antibodies
TW202339804A (zh) 2021-12-02 2023-10-16 法商賽諾菲公司 在癌症療法中用於患者選擇的ｃｅａ測定
WO2023099682A1 (en) 2021-12-02 2023-06-08 Sanofi Ceacam5 adc–anti-pd1/pd-l1 combination therapy
WO2023164610A2 (en) * 2022-02-25 2023-08-31 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods comprising anti-nrp2b antibodies
WO2023168363A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 HCW Biologics, Inc. Method of treating pancreatic cancer
TW202346354A (zh) * 2022-03-09 2023-12-01 德商馬克專利公司 抗ceacam5抗體及其結合物及用途
WO2023180489A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing carcinoembyronic antigen
US20240124607A1 (en) 2022-08-10 2024-04-18 Merck Sharp & Dohme Llc Proteins binding nkg2d, cd16, and ceacam5

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4640A (en) 1846-07-14 Book-lock
US144A (en) 1837-03-11 Improvement in scythe-snaths
US244A (en) 1837-06-30 Edward flint
US4496A (en) 1846-05-02 Machinery for
US192A (en) 1837-05-15 Machine for cutting
US4791A (en) 1846-10-03 john g
US417A (en) 1837-09-28 Endless-ghain horse-power for driving iviaci-iii
US689A (en) 1838-04-13 Julius austin
US4301A (en) 1845-12-11 Ebenezbr barrows
US835A (en) 1838-07-12 X i i i x
US5204A (en) 1847-07-24 james cantelo
US4670A (en) 1846-07-28 Improvement in fish-hooks
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5278056A (en) 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5215534A (en) 1991-12-02 1993-06-01 Lawrence De Harde Safety syringe system
CA2076465C (en) 1992-03-25 2002-11-26 Ravi V. J. Chari Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
CA2156725A1 (en) 1993-02-22 1994-09-01 Warren S. Pear Production of high titer helper-free retroviruses by transient transfection
FR2712812B1 (fr) 1993-11-23 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo.
EP0770628B9 (en) 1994-07-13 2007-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
CN1241944C (zh) 1995-09-11 2006-02-15 协和发酵工业株式会社 抗人白介素－5受体α链的抗体
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
AU7071598A (en) 1997-04-10 1998-10-30 Erasmus University Rotterdam Diagnosis method and reagents
US6629949B1 (en) 2000-05-08 2003-10-07 Sterling Medivations, Inc. Micro infusion drug delivery device
US6659982B2 (en) 2000-05-08 2003-12-09 Sterling Medivations, Inc. Micro infusion drug delivery device
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
ATE499116T1 (de) 2002-08-16 2011-03-15 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
GB0308731D0 (en) 2003-04-15 2003-05-21 Anticancer Therapeutic Inv Sa Method of radiotherapy
WO2004094613A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Ibc Pharmaceuticals Polyvalent protein complex
DK1976880T3 (en) 2005-12-21 2016-09-26 Amgen Res (Munich) Gmbh Pharmaceutical compositions with resistance to soluble cea
KR101528939B1 (ko) 2006-07-18 2015-06-15 사노피 암 치료를 위한 ｅｐｈａ2에 대한 길항제 항체
PE20140614A1 (es) 2007-07-16 2014-05-28 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd79b e inmunoconjugados
SI2195023T1 (en) 2007-08-29 2018-07-31 Sanofi Humanized anti-CXCR5 antibodies, their derivatives and their uses
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
KR20230003298A (ko) 2008-04-30 2023-01-05 이뮤노젠 아이엔씨 가교제 및 그 용도
CA2774260C (en) * 2009-09-16 2018-10-09 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
US9427531B2 (en) 2010-06-28 2016-08-30 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Auto-injector
WO2012117002A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Roche Glycart Ag Cea antibodies
US9248242B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Safety Syringes, Inc. Anti-needle stick safety device for injection device
PT2922875T (pt) 2012-11-20 2017-05-31 Sanofi Sa Anticorpos anti-ceacam5 e suas utilizações
US20140155827A1 (en) 2012-12-03 2014-06-05 Mylan, Inc. Medicament information system and method
TWI595006B (zh) * 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
CN104948958A (zh) * 2015-07-01 2015-09-30 上海顿格电子贸易有限公司 一种利用热敏电阻限流的led灯
CN108341876B (zh) * 2017-01-22 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗人ceacam5单克隆抗体及其制备方法和应用
AU2019292580A1 (en) * 2018-06-29 2021-02-04 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for antibody delivery

Also Published As

Publication number Publication date
RS60043B1 (sr) 2020-04-30
EP3199552A1 (en) 2017-08-02
TN2015000177A1 (en) 2016-10-03
ZA201502959B (en) 2016-01-27
CL2015001321A1 (es) 2015-07-17
MA38194B1 (fr) 2018-12-31
CN109180815B (zh) 2022-06-21
CR20150258A (es) 2015-06-11
AU2013349733A1 (en) 2015-06-11
BR112015010993A2 (uk) 2017-08-22
TW201940519A (zh) 2019-10-16
PL2922875T3 (pl) 2017-08-31
KR20150085828A (ko) 2015-07-24
MA38194A1 (fr) 2018-02-28
AU2018267636A1 (en) 2018-12-13
HUE033369T2 (en) 2017-11-28
EP2922875B1 (en) 2017-03-15
WO2014079886A1 (en) 2014-05-30
US11332542B2 (en) 2022-05-17
MY171100A (en) 2019-09-25
KR20220084193A (ko) 2022-06-21
PL3199552T3 (pl) 2020-06-01
EP3199552B1 (en) 2019-12-25
JP2016506370A (ja) 2016-03-03
US20220340682A1 (en) 2022-10-27
KR102661801B1 (ko) 2024-04-26
KR102408660B1 (ko) 2022-06-15
LT3199552T (lt) 2020-04-10
PT3199552T (pt) 2020-03-25
CN104918958A (zh) 2015-09-16
DK2922875T3 (en) 2017-06-06
EP3594243A1 (en) 2020-01-15
HRP20200415T1 (hr) 2020-06-26
CN104918958B (zh) 2019-12-10
KR20200143527A (ko) 2020-12-23
IL238559B (en) 2018-10-31
RS55987B1 (sr) 2017-09-29
PH12015501092B1 (en) 2015-07-27
TWI664192B (zh) 2019-07-01
UY35147A (es) 2014-06-30
PE20151180A1 (es) 2015-08-12
ES2625742T3 (es) 2017-07-20
JP6324399B2 (ja) 2018-05-16
PT2922875T (pt) 2017-05-31
BR112015010993B1 (pt) 2022-08-30
US20160108131A1 (en) 2016-04-21
EA039377B1 (ru) 2022-01-20
EA201590986A1 (ru) 2016-05-31
SI2922875T1 (sl) 2017-06-30
DOP2015000110A (es) 2015-08-16
AU2013349733C1 (en) 2020-10-01
SI3199552T1 (sl) 2020-06-30
SG11201503285TA (en) 2015-05-28
TW201427997A (zh) 2014-07-16
HK1215444A1 (zh) 2016-08-26
AU2013349733B2 (en) 2018-08-23
DK3199552T3 (da) 2020-03-30
CA2889962C (en) 2023-10-24
CN109180815A (zh) 2019-01-11
HRP20170743T1 (hr) 2017-07-28
US10457739B2 (en) 2019-10-29
KR102194748B1 (ko) 2020-12-23
ES2778823T3 (es) 2020-08-12
CA3207769A1 (en) 2014-05-30
MX358321B (es) 2018-08-14
US20200102401A1 (en) 2020-04-02
PH12015501092A1 (en) 2015-07-27
AR093557A1 (es) 2015-06-10
US9617345B2 (en) 2017-04-11
CA2889962A1 (en) 2014-05-30
EP2922875A1 (en) 2015-09-30
IL238559A0 (en) 2015-06-30
MX2015006374A (es) 2015-10-09
ECSP15025845A (es) 2016-01-29
CY1119219T1 (el) 2018-02-14
US20180022817A1 (en) 2018-01-25
LT2922875T (lt) 2017-06-12
NZ708528A (en) 2020-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA120247C2 (uk) Антитіло до ceacam5 і його застосування
US9670287B2 (en) Anti-human TROP-2 antibody having anti-tumor activity in vivo
US20220233705A1 (en) Combined therapies of activatable immune checkpoint inhibitors and conjugated activatable antibodies
JP2022025071A (ja) グリコシル化ｐｄ－１に対して特異的な抗体およびその使用方法
US8227578B2 (en) Anti-human dlk-1 antibody showing anti-tumor activity in vivo
TWI679022B (zh) 抗-ｐｔｋ７抗體-藥物結合物
EP1979379B1 (en) Carbonic anhydrase ix (g250) antibodies and methods of use thereof
US8017118B2 (en) Anti-hDlk-1 antibody having an antitumor activity in vivo
CN101820910B (zh) 结合细胞内prl-1多肽或prl-3多肽的抗体
UA125717C2 (uk) Конструкція антитіла до flt3 і cd3
EP3404043B1 (en) Anti-cdh3 antibody having high internalization capacity
US20030096285A1 (en) Identifying anti-tumor targets or agents by lipid raft immunization and proteomics
CN113474362B (zh) 对cd44特异性的抗体
EA030182B1 (ru) Антитела, специфические для кадгерина-17
UA119047C2 (uk) Кон'юговане антитіло до ly75 для лікування раку
US9303086B2 (en) Anti-hDlk-1 antibody having an antitumor activity in vivo
WO2012057315A1 (ja) 高い親和性を有する抗cdh3抗体
EP4299589A1 (en) Anti-human cd73 antibody and use thereof
TW201800106A (zh) 新穎之抗ｕｐｋ１ｂ抗體及使用方法
JP7224628B2 (ja) 抗ｍｃ１６抗体