CN108341876B - 抗人ceacam5单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人CEACAM5单克隆抗体及其制备方法和应用，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2016129的小鼠杂交瘤细胞系产生。该制备方法为：S1：用人胃癌细胞裂解的全细胞蛋白作为免疫原免疫小鼠；S2：将步骤S1中得到的被免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合；S3：待步骤S2中细胞融合出现细胞克隆后，挑选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系；S4：从步骤S3所述稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系中制得所述抗人CEACAM5单克隆抗体。该单克隆抗体可用于制备治疗恶性肿瘤的组合物。本发明提供的抗人CEACAM5单克隆抗体可以广泛用于流式细胞术、免疫组织化学染色、免疫沉淀等各类常规操作。

Description

抗人CEACAM5单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及一种抗人CEACAM5单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病，针对其的治疗手段目前仍处于研究和探索阶段。继传统的手术治疗、放疗、化疗和免疫治疗之后，以结合基因工程和蛋白质工程技术为代表的靶向抗体药物治疗正成为***的新兴研究领域，受到基础医学和临床医学研究领域科研工作者的广泛关注。其中靶向分子中最重要的一类是肿瘤抗原特异的单克隆抗体(mAb)。

抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)，通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基端(N)和羧基端(C)，靠近N端的可变区(V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR是抗体与抗原决定基互补结合的部位，C区引发抗原抗体识别后的反应。抗体根据FR/C区不同可分为人源、鼠源等，鼠源性抗体在人体内使用时具有免疫原性，易引起人体的免疫反应，这些免疫反应可引起对鼠源性抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。为了克服鼠源性抗体的缺陷，需要构建高亲和力的特异性的嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体。

胃癌的发病率在我国居消化道恶性肿瘤之首，在世界上居第二位，年死亡人数约占恶性肿瘤死亡人数的24％，五年生存率仅约为27％。胃癌患者的诊断发现往往已到晚期，因此预后极差。针对胃癌并无有效的靶向治疗药物。

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是一种膜结合蛋白，一般在胎儿肝肠胰等组织表达。正常分泌入肠道，血清中含量很少。细胞癌变时，血清中水平升高，对胰腺癌、结肠癌早期诊断有辅助意义，对肿瘤的扩散、疗效、复发和预后有一定的参考价值。第四军医大学樊代明教授发现糖基化的CEA对多种消化道癌的敏感性特异性都很高。临床研究表明，糖基化CEA在胃癌组织中的阳性率在80％以上，在结肠癌组织中阳性率在40％以上，在胃癌前病变阳性率在30％以上，在食道癌组织中阳性率在18％以上。同时临床实验结果显示，28例胃癌患者术后血清中糖基化CEA的阳性率比术前明显下，提示糖基化CEA与胃癌发病存在着密切关系(Gadler et al.,Int J Cancer 25(1):91-4，1980)。癌胚抗原相关细胞黏附分子5(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5，CEACAM5)属于免疫球蛋白超家族，在胃癌等多种上皮性肿瘤中高表达，且与血管生成密切相关，可以有效激活肿瘤细胞的增殖过程，抑制肿瘤细胞凋亡。因此，利用CEACAM5的mAb或基因工程抗体阻断CEACAM5的信号转导有望为胃癌等多种上皮性肿瘤的治疗提供新的策略和手段。但是，尽管目前已证实CEACAM5参与胃癌等多种上皮性肿瘤的发生及发展，尤其CEACAM5的功能与其高度的糖基化相关，目前尚无针对此蛋白的糖基化修饰的抗体，严重影响了该分子在胃癌等肿瘤中的诊断及治疗方面的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少针对糖基化CEACAM5的抗体、进而导致无法在胃癌等肿瘤的诊断及治疗中应用该分子这一问题，提供了一种抗人CEACAM5单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明提供的抗人CEACAM5单克隆抗体能够特异性地与糖基化的CEACAM5抗原结合且与糖基化的CEACAM5具有较高的亲和力，为胃癌等多种上皮性肿瘤的治疗和诊断提供了有效地靶向治疗的策略和手段。

本发明所用的术语“抗体”是指约150KDa的异源四聚糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同抗体同种型的重链间的二硫键数目不同，每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一段有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。轻链和重链可变区也含有三个高变区，也成为互补决定区或CDR。CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR一般被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始顺序编号，并且通常通过所述具体CDR所在的链来鉴定。具有不同特异性的抗体，即，对不同的抗原有不同的结合位点的抗体具有不同的CDR。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈b-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分b-折叠结构。每天链中的CDR通过FR区紧密地靠在仪器并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位[见Kabat等，NIH Publ.NO.91-3242卷I，647-669页(1991)]。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能。

本发明所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性针对单个抗原位点。并且与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇，不会被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特异性，是从基本均一的抗体群中获得的，不应被解释成需要任何特殊方法来生产抗体。

本发明所用的术语“亲和力”是指抗体对抗原的亲和力。在一个实施方案中，亲和力是通过抗原/抗体的解离速率测量的。

本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题：

本发明第一方面提供了一种抗人CEACAM5单克隆抗体，其由保藏号为CCTCC NO:C2016129的小鼠杂交瘤细胞系产生。

较佳地，所述抗人CEACAM5单克隆抗体的免疫球蛋白为IgG1亚类，κ型轻链。

本发明中，所述小鼠杂交瘤细胞系已于2016年6月23日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO:C2016129，培养物名称是杂交瘤细胞株MG7。

在一个具体的实施方案中，本发明所述抗人CEACAM5单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO:C2016129的小鼠杂交瘤细胞系产生，其免疫球蛋白为IgG1亚类，κ型轻链。

本发明第二方面提供了一种包含前述抗人CEACAM5单克隆抗体的组合物。

较佳地，所述组合物还可以包括药学上可接受的载体。

通常，在所述组合物中前述抗人CEACAM5单克隆抗体的含量为本领域常规的含量，如质量百分比0.001～99.99％。

本发明第三方面提供了一种产生前述抗人CEACAM5单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏号为CCTCC NO:C2016129。

本发明第四方面提供了前述抗人CEACAM5单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

S1：用人胃癌细胞裂解的全细胞蛋白作为免疫原免疫小鼠；

S2：将步骤S1中被免疫的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合；

S3：待步骤S2中细胞融合出现细胞克隆后，挑选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系；

S4：从步骤S3所述稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系中制得前述抗人CEACAM5单克隆抗体。

作为优选方案，步骤S1中，所述人胃癌细胞可以为本领域常规的细胞，如永生化的人胃癌细胞系或从胃癌病人身上分离的胃癌细胞。所述免疫可以为本领域常规的操作，较佳地为免疫3次，第一次和第二次之间间隔4周，第二次和第三次之间间隔2周。

作为优选方案，步骤S2中，所述小鼠骨髓瘤细胞可以为抗体领域使用的常规的小鼠骨髓瘤细胞，如SP2/0细胞。所述融合可以为本领域常规的细胞融合操作，如聚乙二醇介导的细胞融合。

作为优选方案，步骤S3中，所述挑选可以为本领域常规的操作，如对出现的所述细胞克隆进行间接ELISA检测，将阳性克隆的细胞采用有限稀释法进行克隆化，直至获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系。

作为优选方案，步骤S4中，从所述稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系中制备前述抗人CEACAM单克隆抗体的方法可以为本领域常规的操作，如小鼠腹水法。

本发明第五方面提供了前述抗人CEACAM5单克隆抗体在制备治疗恶性肿瘤的组合物中的应用。

较佳地，所述恶性肿瘤为选自胃癌、胰腺癌、结肠癌和食道癌中的一种或多种；更佳地，所述恶性肿瘤为胃癌。

所述组合物可以为本领域常规的组合物，较佳地，为药物组合物；更佳地，所述药物组合物包括前述抗人CEACAM5单克隆抗体和药学上可接受的载体。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的有益效果在于：本发明提供的抗人CEACAM5单克隆抗体能够特异性地与糖基化的人CEACAM5抗原结合，并且与糖基化的CEACAM5具有较高的亲和力和抗原特异性，可以广泛用于流式细胞术、免疫组织化学染色、免疫沉淀等各类常规操作，为胃癌等多种上皮性肿瘤的治疗和诊断提供了有效的靶向治疗的策略和手段。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1、小鼠抗人CEACAM5单抗MG7-Ab与不同细胞裂解液与人肝脏裂解液Western杂交结果；

图2、小鼠抗人CEACAM5单抗MG7-Ab与KATOIII细胞裂解液免疫沉淀结果；

图3、商品化的抗人CEACAM5单抗与本发明小鼠抗人CEACAM5单抗MG7-Ab与KATOIII细胞裂解液免疫共沉淀结果；

图4、商品化的抗人CEACAM5单抗与本发明小鼠抗人CEACAM5单抗MG7-Ab与外源过表达CEACAM5的HEK293T细胞裂解液Western杂交结果；

图5、将KATOIII细胞内的CEACAM5的表达用shRNA沉默后，单抗MG7-Ab与商品化抗体Western杂交后的结果；

图6、小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体的细胞免疫荧光检测流式细胞检测结果；

图7、小鼠抗人CEACAM5单抗MG7-Ab检测胃癌组织石蜡切片中人CEACAM5的免疫组化结果；

图8、商品化的抗人CEACAM5单抗与小鼠抗人CEACAM5单抗MG7-Ab与HEK293T细胞中过表达的糖基化与去糖基化的人CEACAM5蛋白Western杂交结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明人经过广泛而深入的研究，发现用裂解人胃癌细胞所得到的总蛋白去免疫小鼠后，可以获得一批胃癌特异性的单抗，其中命名为MG7-Ab的抗体在胃癌的组织和血清中的表达平均水平很高，后通过蛋白质组学技术检测，发现此抗体识别的抗原是人CEACAM5。在此基础上，发明人利用杂交瘤技术进一步制得了纯化的该抗人CEACAM5的单克隆抗体，确认了该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的DNA序列和相应蛋白序列以及包含在内的CDR序列，并发现该抗体不仅与抗原亲和力较强，而且能够特异性地识别糖基化的CEACAM5，为该单克隆抗体的人源化重组抗体提供了支持，从而完成了本发明。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明所用到的SP2/0、SGC7091、KATOIII、MCF7、HEK293T与MKN45均购自中科院上海细胞库。

商品化抗人CEACAM5的单抗购自美国Abcam公司，货号为ab4451，免疫动物为小鼠(Mus musculus)。

以下实施例中MG7-Ab指代本发明小鼠抗人CEACAM5单抗，Anti-CEA指代商品化抗人CEACAM5单抗。产生所述单抗MG7-Ab的小鼠杂交瘤细胞系已于2016年6月23日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO:C2016129，培养物名称是杂交瘤细胞株MG7。

实施例1本实施例涉及小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体的制备

mAb的制备方法参照《细胞和分子免疫学实验技术》第一版金伯泉第四军医大学出版社2002，P9-P17记载的方法，步骤如下：

(1)裂解人胃癌细胞MKN-46-9，提取裂解液的全细胞蛋白；

(2)用步骤(1)获得的全细胞蛋白按50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠3次；初次免疫，使用弗氏完全佐剂，第2次免疫使用弗氏不完全佐剂，间隔4周，均为皮下多点注射，第3次免疫为腹腔注射，与第2次免疫间隔2周；

(3)步骤(2)免疫完成后7-10天采血，用间接ELISA法检测效价；细胞融合前3天腹腔注射免疫原进行加强免疫；加强免疫3天后取小鼠脾细胞和对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0计数，制备免疫脾细胞悬液，将SP2/0细胞与脾细胞按1:5的比例混合进行细胞融合，融合试剂为聚乙二醇。融合后细胞悬液加入含有饲养细胞(正常BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔板，37℃、5％CO₂孵箱培养；

(4)待细胞克隆出现后，用间接ELISA法检测，挑选针对CEACAM5具有特异反应性的阳性细胞克隆，采用有限稀释法进行克隆化，以连续2次克隆化检测阳性率为100％为标准，直至获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系；

(5)取步骤(4)获得的稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系，按小鼠腹水制备方法制备包含单克隆抗体的腹水；

(6)将步骤(5)制得的腹水用45％饱和硫酸铵沉淀，采用QFF阴离子交换层析法纯化后，SDS-PAGE鉴定纯化的抗体。

所制得的抗体经过测定属IgG1亚类，κ型轻链，经过纯化后纯度达到95％。将所获得的抗体命名为MG7-Ab。

实施例2本实施例涉及小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体的免疫印迹检测

采用免疫印迹方法检测小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体与胃癌细胞系SGC7901、KATOIII细胞裂解液与非胃癌细胞系MCF7、HEK293T、AD293、A2780、N38细胞裂解液和人肝脏组织裂解液中的CEACAM5结合能力，方法参照《细胞和分子免疫学实验技术》第一版金伯泉第四军医大学出版社2002，P53-P55记载的方法，以小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗小鼠抗体为二抗，Alpha Innotech FluorChem FC2成像***(AlphaInnotech,USA)分析Western杂交的结果。

如图1所示，本发明小鼠抗人CEACAM5单抗MG7-Ab可以与胃癌细胞系KATOIII的裂解液产生反应，在约180KD处形产生条带，而与非胃癌细胞的裂解液在180KD处没有产生条带，提示该180KD蛋白是MG7-Ab在胃癌细胞系中的一个特应性对应抗原。

实施例3本实施例涉及小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体结合抗原的鉴定

采用免疫沉淀(IP)的方法对抗体MG7-Ab结合的抗原进行鉴定，IP的步骤如下：1)10cm培养板常规培养KATOIII细胞至90％融合，加入1ml IP裂解缓冲液(Pierce IP LysisBuffer,Prod#87788,含蛋白酶抑制剂Roche cOmplete Tablets Mini,EDTA-free)，冰上裂解30分钟,13,000×g，4℃离心10分钟后取上清。2)取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加protein A/G琼脂糖珠(20mg/ml)进行预清除，4℃旋转孵育2小时。3)1000×g，4℃离心1分钟后取上清，此为预清除后的细胞IP裂解液。4)将40mg protein A/G琼脂糖珠放入1ml Ep管中用PBS清洗三遍后用1mlPBS重悬，加入10μg一抗或对照抗体，4℃旋转孵育2小时。5)1000×g，4℃离心1分钟后弃上清。此为结合了一抗的protein A/G琼脂糖珠。6)将预清除后的细胞IP裂解液加入结合了一抗的protein A/G琼脂糖珠，每管1ml。4℃旋转孵育12小时。8)1000×g，4℃离心1分钟后弃上清，用IP裂解液4℃匀速旋转清徐3次，每次5分钟，再用PBS溶液清洗2次。9)免疫沉淀反应后，1000×g，4℃离心1分钟后弃上清，将琼脂糖珠离心至管底，将上清小心吸去，加入30μl的2×SDS上样缓冲液(含20mM DTT)，100℃加热5分钟。冷却至室温。10)40,000×g离心20分钟，上清即为IP产物。

将上述富集的与MG7-Ab结合的抗原进行质谱分析，IP产物质谱上样前跑SDS-PAGE，凝胶处理步骤如下：

I.胶内酶解

(1)将每个泳道的蛋白条带平行分割成3～4块胶块，每个胶块切碎成约1mm×1mm的小胶块,装入1.5mL的EP管中；

(2)胶块脱色：加入200-400μL 25mM NH₄HCO₃/30％ACN，涡旋震荡10min，离心，吸去液体，重复两次；

(3)脱水：加100μl 100％乙腈，涡旋震荡10～15min。吸去液体后真空抽干；

(4)还原：加100μl 20mMDTT，56℃孵育1h，吸去DTT溶液；

(5)封闭：加50μl 50mM碘乙酰胺(indoacetamide)，室温孵育20min烷基化，吸去液体；

(6)脱水：加200μl 100％乙腈，涡旋震荡10～15min。吸去液体，真空抽干约25min；

(7)酶解：加约50μl 10ng/μl trypsin/10mM NH₄HCO₃以覆盖胶块，4℃放置30-60min。再加20-30μl 10mM NH₄HCO₃覆盖膨胀后的胶块。37℃过夜酶解。

(8)肽段回收：加150μl 60％ACN/0.1％TFA，超声15min。转移液体到新的EP管中，重复洗脱两次。

(9)12000rpm离心10min，收集上清，放入真空干燥仪中抽干液体，-20℃储存。

II.除盐：

(1)加入100％乙腈200μl中性溶液活化Millipore C18ZipTip。离心100g×1min后弃去上清。

(2)加入反相液相色谱流动相A溶液，用来平衡Millipore C18ZipTip，。离心100g×1min后弃去上清。该步实验重复3次。

(3)加入待脱盐样品，离心100g×1min后弃去上清。

(4)反相液相色谱流动相A溶液洗涤样品。离心100g×1min后弃去上清。该步实验重复3次。

(5)加入70％乙腈200μl，离心100g×1min，流出液即为纯化样品。

(6)将样品Speed Vac离心抽真空干燥至干粉状。

(7)加12μl 2％乙腈/98％H₂O/0.1％TFA溶解样品，上LC-MS分析样品。

结果见图2，与阴性对照细胞系HEK293T相比，KATOIII细胞裂解液中存在与MG7-Ab相结合的180KD的蛋白，且可以明显被MG7抗体所富集。对免疫沉淀所富集的与MG7-Ab相结合的分子量为180KD的抗原进行质谱分析表明，该抗原即为CEACAM5。

实施例4本实施例涉及小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体的免疫沉淀和Western杂交检测

分别用胃癌细胞系SGC7901、MKN45和KATOIII细胞进一步对MG7-Ab进行免疫沉淀检测；用过表达人CEACAM5的HEK293T和CEACAM5的表达被RNAi沉默的KATOIII细胞对MG7-Ab进行Western杂交检测，使用抗人CEACAM5的商品化抗体作为阳性对照。IP的步骤同实施例3中所记载；Western杂交的步骤如下：1)将细胞系用含有蛋白酶抑制剂的IP裂解液进行冰上裂解，15分钟后提取蛋白，Bradford方法定量，加入SDS上样缓冲液，煮沸样品5min使其变性；2)进行SDS-PAGE电泳，恒流，25mA，蛋白上样量为30μg；3)半干法进行电转膜，将经过电泳分离后的蛋白转移至硝酸纤维素滤膜(NC)上，恒压，20V，30分钟；4)5％脱脂奶粉封闭3分钟；5)弃掉牛奶，滴加2.5％脱脂牛奶稀释的一抗，4℃孵育过夜或室温3小时孵育；6)1×TBST洗膜3次，每次5min，加对应的HRP标记的二抗，室温孵育1h；7)1×TBST洗膜3次，每次10min，在Western blot成像仪的暗室中均匀滴加ECL发光液进行显色捕捉成像。

结果如图3～5所示。图3显示商品化的抗人CEACAM5单抗与本发明实施例1制得的单抗MG-Ab均能够富集胃癌细胞系KATOIII中分子量为180KD的蛋白；图4显示，在自身不表达CEACAM5的HEK293T细胞中过表达外源的CEACAM5后商品化的抗人CEACAM5单抗与本发明实施例1制得的单抗MG-Ab均能够与过表达的外源的CEACAM5结合产生杂交的条带；图5显示，将KATOIII细胞内的CEACAM5的表达用shRNA沉默后，单抗MG7-Ab与商品化抗体Western杂交后均没有信号产生。

上述结果结合实施例3的质谱鉴定结果表明，单抗MG7-Ab能够与人CEACAM5特异性地结合，是一种小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体。

实施例5本实施例涉及小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体的效价测定

间接ELISA法测定实施例1中纯化前腹水以及纯化后mAb的相对亲和力。包被抗原为糖基化的人CEACAM抗原，即CEACAM5，待测样品为系列稀释的腹水以及纯化后mAb，检测抗体为羊抗鼠-HRP酶标记抗体，底物使用ABTS。

检测结果表明，实施例1中筛选到的含有单抗的腹水效价为1×10^-7，远高于达到1×10^-5即可以使用的一般水平。

实施例6本实施例涉及小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体的细胞免疫荧光检测

采用间接免疫荧光染色法结合流式细胞术检测单抗MG7-Ab与人胃癌细胞系KATOIII天然CEACAM5分子的结合能力，操作步骤参照《细胞和分子免疫学实验技术》第一版金伯泉第四军医大学出版社2002，P78-80记载的方法，以本发明实施例1制得的小鼠抗人CEACAM5单抗为一抗，以FITC标记的羊抗小鼠抗体为二抗，进行流式细胞仪分析。

检测结果如图6所示，与直接加入免疫荧光二抗的同型对照相比，本发明的小鼠抗人CEACAM5单抗与高表达人CEACAM5的胃癌细胞系KATOIII结合能力明显增强，说明本发明小鼠抗人CEACAM5单抗能够特异性地与胃癌细胞系KATOIII表面的CEACAM5分子结合。

实施例7本实施例涉及小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体的免疫组织化学检测

以实施例1制得的小鼠抗人为一抗，用免疫组织化学方法检测CEACAM5识别胃癌组织石蜡切片中人CEACAM5的能力。免疫组织化学染色的操作步骤参照《病理学技术》第一版(人民卫生出版社，梁英杰)，P367-372。

检测结果如图7所示，CEACAM5分子在胃癌组织中呈异质性表达，图7a、7b、7c和7d的表达强度从弱到强分为-、+、++、+++。CEACAM5分子在胃癌组织中的异质性表达为进一步研究该分子与胃癌的病情、病程及预后的关系提供了理论基础。

实施例8本实施例涉及小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体对糖基化抗原的特异性检测

用N-糖酰胺酶F(PNGase F)处理293T细胞中过表达的外源CEACAM5，每20μg细胞全蛋白中加入500U/μl PNGaseF 1μl，37℃孵育1小时，用实施例1制得的小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体与商品化抗体作为一抗分别进行Western杂交检测，Western步骤同前述。

结果如图8所示，商品化的抗人CEACAM5单克隆抗体与糖基化的与去糖基化的人CEACAM5均能够结合产生条带，而本发明小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体与去糖基化的人CEACAM5不结合，仅与糖基化的人CEACAM5结合产生条带。因此本发明小鼠抗人CEACAM5单克隆抗体能够特异性地识别糖基化的人CEACAM5。

综上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明实施的范围，凡依本发明权利要求范围所述的形状、构造、特征及精神所为的均等变化与修饰，均应包括于本发明的权利要求范围内。

Claims (3)

1.一种抗人CEACAM5单克隆抗体，其特征在于，由保藏号为CCTCC NO:C2016129的小鼠杂交瘤细胞系产生。

2.一种含有权利要求1所述的抗人CEACAM5单克隆抗体的组合物。

3.一种保藏号为CCTCC NO:C2016129的杂交瘤细胞系。

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