UA119643C2 - Антисмисловий олігомер та кон'югат, направлений на пропротеїн конвертазу субтилізин/кексин типу 9 (pcsk9) - Google Patents

Антисмисловий олігомер та кон'югат, направлений на пропротеїн конвертазу субтилізин/кексин типу 9 (pcsk9) Download PDF

Info

Publication number
UA119643C2
UA119643C2 UAA201600243A UAA201600243A UA119643C2 UA 119643 C2 UA119643 C2 UA 119643C2 UA A201600243 A UAA201600243 A UA A201600243A UA A201600243 A UAA201600243 A UA A201600243A UA 119643 C2 UA119643 C2 UA 119643C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
group
oligomer
conjugate
nucleotides
dna
Prior art date
Application number
UAA201600243A
Other languages
English (en)
Inventor
Нанна Альбек
Нанна Альбэк
Май Хедтьорн
Май Хедтёрн
Марі Ліндхольм
Мари Линдхольм
Нільс Фіскер Нільсен
Нильс Фискер Нильсен
Андреас Петрі
Андреас Пэтри
Якоб Равн
Original Assignee
Рош Інновейшен Сентер Копенгаген А/С
Рош Инновэйшен Сентер Копенгаген А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2013/073858 external-priority patent/WO2014076195A1/en
Application filed by Рош Інновейшен Сентер Копенгаген А/С, Рош Инновэйшен Сентер Копенгаген А/С filed Critical Рош Інновейшен Сентер Копенгаген А/С
Publication of UA119643C2 publication Critical patent/UA119643C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/554—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being a steroid plant sterol, glycyrrhetic acid, enoxolone or bile acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Винахід стосується кон'югата антисмислового олігонуклеотиду, який містить антисмисловий олігомер з 16-20 нуклеотидів в довжину, який містить безперервну послідовність з 16 нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини, де зазначений антисмисловий олігомер являє собою LNA гепмер і щонайменше одне кон'югатне угрупування, направлене на рецептор асіалоглікопротеїнів, ковалентно приєднане до олігомера. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, яка містить вказаний кон’югат, застосуванню кон’югата антисмислового нуклеотиду як лікарського засобу, такого як засіб для лікування гіперхолестеринемії або спорідненого розладу, вибраного з групи, що складається з атеросклерозу, гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, сімейної гіперхолестеринемії, наприклад, придбання функціональних мутацій в PCSK9, дисбалансу холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ)/ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ), дисліпідемій, наприклад сімейної гіперліпідемії (сімейної комбінованої гіперліпідемії (СКГ)) або сімейної гіперхолестеринемії (СГХС), придбаної гіперліпідемії, статин-резистентної гіперхолестеринемії, коронарної артеріальної хвороби (КАХ) та ішемічної хвороби серця (ІХС); та способу інгібування PCSK9 in vitro в клітині, експресуючій PCSK9.

Description

атеросклерозу, гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, сімейної гіперхолестеринемії, наприклад, придбання функціональних мутацій в РОБ5КОУ, дисбалансу холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ЛОІВЩ)//ліпопротеїнів низької щільності (ЛІПНЩ), дисліпідемій, наприклад сімейної гіперліпідемії (сімейної комбінованої гіперліпідемії (СКГ)) або сімейної гіперхолестеринемії (СГХС), придбаної гіперліпідемії, статин-резистентної гіперхолестеринемії, коронарної артеріальної хвороби (КАХ) та ішемічної хвороби серця (ІХС); та способу інгібування РОКУ /п
Ууйго в клітині, експресуючій РОБКОУ.
ОБЛАСТЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід відноситься до олігомерних сполук та їх кон'югатів, направлених на мРНК пропротеїну конвертази субтилізин/кексин типу 9 (РСБКУ) в клітині, що призводить до пониженої експресії РСЗКУ. Зниження експресії РСЗКУ корисно для ряду захворювань, таких як гіперхолестеринемія і споріднені розлади.
ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Пропротеїн конвертаза субтилізин/кексин типу 9 (РСЗКУ) став відомий як терапевтична мішень для зниження холестерину ліпопротеїнів низької щільності (холестерину ЛЛНЩ). РСОЗКО збільшує розпад рецептора ЛЛНЩ, що призводить в результаті до високого вмісту холестерину
ЛІИНЩ у індивідів з високою активністю РОКУ.
У статті Гіпапоїт еї аї., МоіІесшаг Тпегару (2012); 20 2, 376-381 описано два антисмислові нуклеотиди замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК), направлених на РОБКО, які забезпечують пролонговане зниження холестерину ЛІНЩ у нелюдиноподібних приматів після насичуючої дози (20 мг/кг) і чотирьох щотижневих підтримувальних доз (5 мг/кг). Вживані сполуки були 14- мер 5РО5001 (5ЕО ІО МО 1) і 13-мер 5РС4061. 5РОС5001 також розкрито в УМО 2011/009697.
Ефективність цих інгібіторів РОЗКОУО пов'язана з їх малою довжиною (Кгієед еї аї., МоїІесшіаг
Тпегару Мисівїс Асіаз (2012) 1, еб).
У МО 2007/146511 описані короткі біциклічні (ЗНК) гепмерні антисмислові олігонуклеотиди, які, очевидно, є ефективнішими і менш токсичнішими, ніж сполуки більшої довжини. Виявилось, що ілюстративні сполуки мають довжину 14 нуклеотидів (нт).
Згідно із статтею мап Роеїдеебві еї аї. (Атегісап Уошигпаї ої Кідпеу Різеазе, 2013 Осі; 62(4): 796-800) введення антисмислового олігонуклеотиду ЗНК 5РО5001 в клінічних випробуваннях на людині може привести в результаті до гострого ушкодження нирок.
Згідно з публікаціями ЕР 198438181, Зеїй еї а!., Мисівіс Асіа5 Зутровішт Зегіеєх 2008 Мо. 52 553-554 і Бмлау;7е еї аї., Мисієїс Асій Кезеагсп 2007, мо! 35, рр. 687-700 олігонуклеотиди ЗНК викликають значну гепатотоксичність у тварин. Згідно УМО 2007/146511 токсичності олігонуклеотидів ЗНК можна уникнути шляхом використання гепмерів ЗНК, настільки коротких, як 12-14 нуклеотидів у довжину. У ЕР 198438181 рекомендовано використання 6'-заміщених біциклічних нуклеотидів для зменшення гепатотоксичного потенціалу олігонуклеотидів ЗНК.
Згідно із статтею Надедогп еї аї., Мисіеіс Асі Тпегарешіс5 2013, гепатотоксичний потенціал антисмислового олігонуклеотиду можна передбачити на основі його послідовності і патерну модифікації.
Олігонуклеотидні кон'югати широко оцінювали на використання в малих інтерферуючих РНК (міР НК), де їх вважали істотними для одержання достатньої ефективності іп мімо. Наприклад,
УМО 2004/044141 відноситься до модифікованих олігомерних сполук, які модулюють генну експресію за допомогою біохімічного шляху РНК-інтерференції. Олігомерні сполуки включають одне або більше кон'югатних угрупувань, які можуть модифікувати або посилити фармакокінетичні і фармакодинамічні властивості приєднаної олігомерної сполуки.
У УМО 2012/083046 описано угрупування, що направляє фармакокінетичний модулятор кластера галактози, для мігРНК.
Навпаки, одноланцюгові антисмислові олігонуклеотиди зазвичай вводять терапевтично без кон'югації або включення в препарат. Основними тканинами-мішенями для антисмислових олігонуклеотидів є печінка і нирки, хоча широкий ряд інших тканин також доступний для антисмислового методу, включаючи лімфатичний вузол, селезінку і кістковий мозок.
МО 2005/086775 відноситься до направленого доставлення терапевтичних засобів в конкретні органи з використанням терапевтичного хімічного угрупування, відщеплюваного лінкера і міченого домена. Відщеплюваний лінкер може бути, наприклад, дисульфідною групою, пептидом або олігонуклеотидним доменом, що розщеплюється ферментом рестрикції.
МО 2011/126937 відноситься до направленого внутрішньоклітинного доставлення олігонуклеотидів за допомогою кон'югації з низькомолекулярними лігандами.
УМО 2009/025669 відноситься до полімерних (поліетиленгліколевих) лінкерів, що містять піридилдисульфідні угрупування. Див. також 2пао еї а!., Віосопіцдасе Спет. 2005 16 758-766.
У статті Спайіп еї аї.,, Віосопіпдагє Спет. 2005 16 827-836 описані модифіковані холестерином моно-, ди- і тетрамірні олігонуклеотиди, використовувані для включення антисмислових олігонуклеотидів в катіонні ліпосоми з одержанням дендримерної системи доставлення. Холестерин кон'югують з олігонуклеотидами за допомогою лізинового лінкера.
Інші нерозщеплювані холестеринові кон'югати використані для направлення міРнНК і антагомирів в печінку, див., наприклад, зоцї5спеск еї аї., Майшге 2004 мої. 432 173-178 і Кгтеїді еї аї., Маїште 2005 мої 438, 685-689. Виявлено, що для частково фосфоротіолованих міРНК і антагомирів застосування холестерину як направляючої молекули печінки істотно для активності іп мімо.
ОБ'ЄКТ ВИНАХОДУ
Таким чином, існує необхідність в антисмислових сполуках, направлених на РОБКУО, які є такими ж ефективними, як 5РОС5БО0О1, але мають понижений ризик токсичності, зокрема, понижену ниркову токсичність.
Згідно із даним винаходом ця мета досягнута шляхом ідентифікації нових послідовностей
РСОБКОУО людини, які частково ефективні для направлення з використанням антисмислового методу (5ЕО ІЮ МО 33 і 5БЕО ІЮ МО 34), а також більш довгих варіантів послідовності ЗРС5001, які зберігають значну ефективність або мають поліпшену ефективність в порівнянні з ЗРС5001 без проблем токсичності. Антисмислові нуклеотиди за винаходом можуть бути додатково вдосконалені шляхом застосування кон'югатів, для яких виявлено, що вони значно посилюють терапевтичний індекс антисмислових олігонуклеотидів ЗНК.
Сполуки за даним винаходом є сильними і нетоксичними інгібіторами РО5КО, корисними при лікуванні гіперхолестеринемії і споріднених розладів.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Олігомер за винаходом може містити від 10 до 22, наприклад, від 12 до 18 нуклеотидів в довжину, які являють собою або а) послідовність з 10-16 суміжних нуклеотидів, яка комплементарна відповідній довжині ЗЕО ІЮ МО 33 або 34 або 45, або Б) послідовність з 16 суміжних нуклеотидів, яка комплементарна відповідному відрізку довжини 5ЕО ІЮ МО 31.
У винаході запропонований кон'югат антисмислового олігонуклеотиду, що містить олігомер, згідно з винаходом і щонайменше одне угрупування, що відрізняється від нуклеотиду або відрізняється від полінуклеотиду, ковалентно приєднане до олігомеру.
У винаході також запропоновано кон'югат антисмислового олігонуклеотиду, олігомер (А), що містить, згідно з винаходом і щонайменше одне угрупування, що відрізняється від нуклеотиду або відрізняється від полінуклеотиду, ковалентно приєднане до олігомеру, (С), необов'язково за допомогою лінкерної ділянки (В та/або МУ), розташованої між безперервною нуклеотидною послідовністю олігомеру і кон'югатним угрупуванням.
У деяких овтіленнях у винаході також запропоновано кон'югат антисмислового олігонуклеотиду, що містить олігомер з 10-22, наприклад, з 12-18 нуклеотидів в довжину, де олігомер містить а) послідовність з 10-16 суміжних нуклеотидів, яка комплементарна відповідній довжині ЗЕО ІЮ МО 33 або 34 або 45 або Б) послідовність з 16 суміжних нуклеотидів, яка комплементарна відповідному відрізку довжини ЗЕО ІЮ МО 31.
У винаході також запропоновано сполуку, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23 і 24.
У винаході запропонована фармацевтична композиція, яка містить олігомер або кон'югат згідно з винаходом і фармацевтично прийнятний розчинник, носій, сіль або ад'ювант.
У винаході запропоновані олігомер або кон'югат або фармацевтична композиція згідно з винаходом, вживані як лікарський засіб, наприклад, для лікування гіперхолестеринемії або спорідненого розладу, такого як розлад, вибраний з групи, що складається з атеросклерозу, гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, сімейної гіперхолестеринемії, наприклад, придбання функціональних мутацій в РОБКОУ, дисбалансу холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ЛІПВщЩ)/у/ліпопротеїнів низької щільності (ЛЛНЩ), дисліпідемії, наприклад, сімейної гіперліпідемії (сімейної комбінованої гіперліпідемії (СКГ)) або сімейної гіперхолестеринемії (СГХС), придбаної гіперліпідемії, статин-резистентної гіперхолестеринемії, коронарній артеріальній хворобі (КАХ) та ішемічній хворобі серця (ІХС).
У винаході запропоновано застосування олігомеру або кон'югата або фармацевтичної композиції за винаходом для одержання лікарського засобу для лікування гіперхолестеринемії або спорідненого розладу, такого як розлад, вибраний з групи, атеросклерозу, гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, сімейної гіперхолестеринемії, наприклад, придбання функціональних мутацій в РОБКО, дисбалансу холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ЛІПВщЩ)/у/ліпопротеїнів низької щільності (ЛЛНЩ), дисліпідемії, наприклад, сімейної гіперліпідемії (сімейної комбінованої гіперліпідемії (СКГ)) або сімейної гіперхолестеринемії (СГХС), придбаної гіперліпідемії, статин-резистентної гіперхолестеринемії, коронарної артеріальної хворобі (КАХ) таішемічної хворобі серця (ІХС).
У винаході запропоновано спосіб лікування гіперхолестеринемії або спорідненого розладу, такого як розлад, вибраний з групи, атеросклерозу, гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, сімейної гіперхолестеринемії, наприклад, придбання функціональних мутацій в РОБКОУ, дисбалансу холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ЛІИВЩ)/У/ліпопротеїнів низької щільності (ЛОНЩ), 60 дисліпідемій, наприклад, сімейної гіперліпідемії (сімейної комбінованої гіперліпідемії (СКГ)) або сімейної гіперхолестеринемії (СГХС), придбаної гіперліпідемії, статин-резистентної гіперхолестеринемії, коронарній артеріальній хворобі (КАХ) та ішемічній хворобі серця (ІХС).
У винаході запропоновано спосіб інгібування іп мімо або іп міго РСБКОУ в клітині, експресуючій РОЗКО, де спосіб включає введення олігомеру або кон'югата або фармацевтичної композиції згідно з винаходом в клітину так, щоб інгібувати РОЗКУ в клітині.
У винаході також запропоновано олігомер згідно з винаходом, такий як олігомер ЗНК, що містить ділянку з 10-22, наприклад, з 12-18, наприклад, 13, 14, 15, 16 або 17 суміжних нуклеозидів, зв'язаних фосфоротіоатним зв'язком (тобто ділянка А, яка в характерному випадку комплементарна відповідній ділянці послідовності-мішені, такої як 5ЕО ІЮ МО 46), і що додатково містить від 1 до б нуклеозидів ДНК, що примикає до олігомеру ЗНК, де міжнуклеозидні зв'язки між ДНК та/або нуклеозидом (нуклеозидами), що примикає до ДНК, фізіологічно лабільні, як і фосфодіефірні зв'язки. Такий олігомер ЗНК може знаходитися у формі кон'югата, як розкрито в цьому документі, або може бути, наприклад, проміжною сполукою для використання на наступній стадії кон'югації. При кон'югації кон'югат може, наприклад, бути або містити стерин, такий як холестерин або токоферол, або може бути або містити (не нуклеотидний) вуглевод, наприклад, кон'югат саїІМАс або інший кон'югат, як розкрито в цьому документі.
У винаході також запропоновано гепмерний олігомер, що містить щонайменше один нуклеотид СЕТ, такий як (5)-СЕТ, з 10-22, наприклад, 12-18, наприклад, 13, 14, 15, 16 або 17 нуклеотидів в довжину, який направлений (тобто має послідовність, комплементарну відповідній ділянці) на РОСБКУ людини.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
Фіг. 1: Приклади кон'югатів три-саіІМАс, які можна застосовувати. Кон'югати 1-4 ілюструють 4 відповідні угрупування кон'югатів саїІМАс, а кон'югати Та-4а відносяться до тих же кон'югатів з додатковим лінкерним угрупуванням (У), яке використовують для зшивання кон'югата з олігомером (ділянкою А або з біо-відщеплюваним лінкером, таким як ділянка В). Хвиляста лінія є ковалентним зв'язком з олігомером.
Фіг. 2: Приклади холестеринового і токоферольного кон'югатних угрупувань. Кон'югати 5а і ба відносяться до тих же кон'югатів з додатковим лінкерним угрупуванням (У), яке
Зо використовують для зшивання кон'югата з олігомером (ділянкою А або з біо-відщеплюваним лінкером, таким як ділянка В). Хвиляста лінія є ковалентним зв'язком з олігомером.
Фіг. З: Конкретні сполуки ЗНК. Бета-О-окси-ЗНК ідентифіковані надрядковим знаком (осКкей) після букви, підрядковий знак 5 є фосфоротіоатним зв'язком, надрядковим знаком Ме, передуючим заголовній букві С, позначає 5-метилцитозин-ЗНК, не-ЗНК нуклеотиди є нуклеотидуми ДНК (без надрядкового знаку І).
Фіг. 4: Приклади холестеринових кон'югатів сполук ЗНК. Бета-О-окси-ЗНК ідентифіковані надрядковим знаком "- (ІосКеа) після букви, підрядковий знак є є фосфоротіоатним зв'язком, надрядковим знаком Ме, передуючим заголовній букві С, позначає 5-метилцитозин-ЗНК, не-ЗНК нуклеотиди є нуклеотидуми ДНК (без надрядкового знаку І).
Фіг. 5: Приклади кон'югатів саіМмМАс сполук ЗНК. Кон'югати по суті відповідають Соп|2а на фігурі де хвиляста лінія замінена олігомером ЗНК. Бета-О-окси-ЗНК ідентифіковані надрядковим знаком - (ІосКеа) після букви, підрядковий знак 5 є фосфоротіоатним зв'язком, надрядковим знаком Ме, передуючим заголовній букві С, позначає 5-метилцитозин-ЗНК, не-ЗНК нуклеотиди є нуклеотидуми ДНК (без надрядкового знаку Г).
Фіг. БА: Детальна структура ЗЕО ІО МО 18.
Фіг. 58: Детальна структура ЗЕО ІО МО 19.
Фіг. 6: Приклад кон'югатної групи ЕАМ.
Фіг. 7: Кон'югати ЗНК-РАМ з розщеплюваними фосфодіефірними зв'язками і без них. Бета-О- окси-ЗНК ідентифіковані надрядковим знаком - (ІосКеа) після букви, підрядковий знак в є фосфоротіоатним зв'язком, надрядковим знаком Ме, передуючим заголовній букві С, позначає 5- метилцитозин-ЗНК, не-ЗНК нуклеотиди є нуклеотидуми ДНК (без надрядкового знаку І).
Фіг. 8: Гепмери проти РОКУ, ранжовані за активністю іп міїго.
Фіг. 9: Вибрані гепмери проти РОБКО, ранжовані за активністю іп міїго.
Фіг. 10: Активність вибраних сполук проти РОЗКУ іп міїго і обчислення ІСбо.
Фіг. 11: Дані АЇ Т іп мімо для вибраних кон'югатів проти РЕСЗКОУ.
Фіг. 12: Необмежуюча ілюстрація сполук за винаходом. Міжнуклеозидний зв'язок Ї може бути, наприклад, фосфодіефірним, фосфоротіоатним, фосфородитіоатним, боранофосфатним або метилфосфатним, наприклад, фосфодіефірним. РО є фосфодіефірним зв'язком. Сполука а) має ділянку В з однією ДНК (або РНК), де зв'язок між першою і другою ділянкою є Ро. бо Сполука Бр) має дві ДНК/РНК (таких як ДНК) нуклеозиду, пов'язаних фосфодіефірним зв'язком.
Сполука с) має три ДНК/РНК (таких як ДНК) нуклеозиду, пов'язаних фосфодіефірними зв'язками. У деяких втіленнях винаходу ділянка В може бути додатково подовжена додатковими фосфодіефірними ДНК/РНК (такими як нуклеозиди ДНК). Кон'югатна група (Магкеа Х, інакше в цьому документі ділянка С) проілюстрована на лівій стороні кожної сполуки (наприклад, холестерин, СаїІМАс, Соп)1-4, Та-4а і 5 або 6) і може бути необов'язково ковалентно приєднана до кінцевого нуклеозиду ділянки В за допомогою фосфорної нуклеозидної зв'язуючої групи, такої як фосфодіефірна, фосфоротіоатна, фосфородитіоатна, боранофосфатна або метилфосфатна, або може бути пов'язана за допомогою альтернативного зв'язку, наприклад, тіазольного зв'язку (див. І. в сполуках 4), е) і М.
Фіг. 13. Необмежуюча ілюстрація сполук за винаходом, де сполуки містять необов'язковий лінкер (У) між третьою (кон'югатною) ділянкою (Х) і другою ділянкою (ділянкою В).
Номенклатура така ж, як на фіг. 12. Відповідні лінкери розкриті в цьому документі і включають, наприклад, алкільні лінкери, наприклад, С6 лінкери. У сполуках а), Б) і с) лінкер між Х і ділянкою
В приєднаний до ділянки В за допомогою фосфорної нуклеозидної зв'язуючої групи, такої як фосфодіефірна, фосфоротіоатна, фосфородитіоатна, боранофосфатна або метилфосфатна, або може бути пов'язана за допомогою альтернативного зв'язку, наприклад, триазольного зв'язку (1). У цих сполуках Гі є міжнуклеозидним зв'язком між першою (А) і другою ділянками (В). Сполуки 4), е) і УЖ додатково містять лінкер (У) між ділянкою В і кон'югатною групою, і ділянка У може бути пов'язана з ділянкою В за допомогою, наприклад, фосфорної нуклеозидної зв'язуючої групи, такої як фосфодіефір, фосфоротіоат, фосфородитіоат, боранофосфат або метилфосфат, або в деяких втіленнях триазольного зв'язку. На додаток або альтернативно Х може бути активуючою групою або реакційною групою. Х може бути ковалентно приєднаний до ділянки В за допомогою фосфорної нуклеозидної зв'язуючої групи, такої як фосфодіефір, фосфоротіоат, фосфородитіоат, боранофосфат або метилфосфат, або може бути пов'язана за допомогою альтернативного зв'язку, наприклад, триазольного зв'язку.
Фіг. 14. Сайленсинг мРНК РОБ5КО кон'югатами з холестерином іп мімо. Мишам ін'єктували одноразову дозу 10 мг/кг некон'югованого антисмислового олігонуклеотиду ЗНК (540) або еквімолярні кількості антисмислових олігонуклеотидів ЗНК, кон'югованих з холестерином з різними лінкерами, і убивали на добу 1, 3, 7 і 10 після дозування. РНК виділяли з печінки і нирок
Зо і піддавали РОСБКОУ-специфічної кількісної полімеразної ланцюгової реакції із зворотною транскрипцією (ЗТ-ДПЛР) А. Кількісне визначення мРНК РСОБКУЗ із зразків печінки нормалізовано за ВАСТ і показано у вигляді відсотка середнього значення еквівалентних контролів з фізіологічним розчином В. Кількісне визначення мРНК РОБЗКУ із зразків нирок нормалізовано за
ВАСТ і показано у вигляді відсотка середнього значення еквівалентних контролів з фізіологічним розчином.
Фіг. 15. Експресія Кіт-1 з дослідження безпеки на щурах (див. Приклад 5).
Фіг. 16: РОБЗКУ в сироватці і холестерин ЛИНЩ в зразках від яванських макак, ін'єктованих чотири рази (одна ін'єкція/тиждень) 0,5 або 1,5 мг/кг/"тиждень ЗЕО ІО 2 і 18.
Фіг. 17. РОБЗКУ в сироватці і холестерин ЛІИНЩ в зразках від яванських макак, ін'єктованих чотири рази (одна ін'єкція/тиждень) 0,5 або 1,5 мг/кг/"тиждень ЗЕО І З і 19.
ВІДОМОСТІ, ЩО ПІДТВЕРДЖУЮТЬ МОЖЛИВІСТЬ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ
Далі розкриті різні елементи винаходу під окремими заголовками. Зрозуміло, що для одержання сполуки за винаходом втілення винаходу з одного елементу можна комбінувати з втіленнями винаходу з інших елементів (наприклад, як проілюстровано на Фіг. 12 і 13).
Олігомер (ділянка А)
Термін "олігомер" або "олігонуклеотид" в контексті даного винаходу відноситься до молекули, утвореної за допомогою ковалентного зв'язку двох або більше нуклеотидів (тобто до олігонуклеотиду). У цьому документі окремий нуклеотид (ланка) може бути також позначений як мономер або ланка. У деяких втіленнях винаходу терміни "нуклеозид", "нуклеотид", "ланка" і "мономер" використовують взаємозамінно. Зрозуміло, що при посиланні послідовність з нуклеотидів або мономерів, на яку посилаються, є послідовність з основ, таких як А, Т, б, С або у.
Олігомер за винаходом може містити від 10 до 22, наприклад, від 12 до 22 нуклеотидів, наприклад, від 12 до 18 нуклеотидів в довжину. Олігомер містить або а) послідовність з 10-16 суміжних нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини 5ЕО ІЮ МО 33 або 34 або 45, або р) послідовність з 16 суміжних нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини 5ЕО ІЮ МО 31.
У деяких втіленнях винаходу олігомер за винаходом містить безперервну нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО 26, 27, 28, 29 і 44.
Сполука (наприклад, олігомер або кон'югат) за винаходом направлена на РОКУ і сама по собі здатна до знижуючої регуляції експресії або до інгібування РО5КО, такого як РОБКУ у людини або в клітині, експресуючій РОЗКОУ.
У деяких втіленнях винаходу міжнуклеозидні зв'язки послідовності з 10-16 суміжних нуклеотидів, комплементарній відповідному відрізку довжини 5ЕО ІЮ МО 33 або 34 або 45, можуть бути фосфоротіоатними зв'язками.
У деяких втіленнях винаходу олігомер за винаходом містить послідовність або складається з безперервної нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ї 40. В одному втіленні винаходу олігомер містить послідовність або складається з послідовності, вибраної з а) ЗЕО ІЮ МО 2 або 3, або 5) 5ЗЕО ІЮО МО 4, 5 або 6, або с) ЗЕО ІЮ МО 7 або 8, або 4) ЗЕО ІЮ МО 40.
У деяких втіленнях винаходу олігомер містить 10-16 нуклеозидів, зв'язаних фосфоротіоатним зв'язком.
У деяких втіленнях винаходу олігомер за винаходом містить послідовність з щонайменше 10-16 суміжних нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини 5ЕО ІЮ МО 33 або 34 або 45, або послідовність з 16 суміжних нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини ЗЕО І МО 31, де безперервна нуклеотидна послідовність містить аналоги нуклеотидів. Переважно аналоги нуклеотидів являють собою посилюючі спорідненість аналоги нуклеотидів.
У деяких втіленнях винаходу аналоги нуклеотидів є нуклеотидами з модифікованим цукром, такими як нуклеотиди з модифікованим цукром, незалежно або залежно вибрані з групи, що складається з: ланок замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК); ланок 2'-О-алкіл- РНК, ланок 2'-ОМе-
РНК, ланок 2'-аміно-ДНК і ланок 2'-фтор-ДНК.
У деяких втіленнях винаходу аналоги нуклеотидів містять або являють собою ланки замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК).
У деяких втіленнях винаходу олігомер за винаходом містить або являє собою гепмер, такий як гепмерний олігонуклеотид ЗНК.
У деяких втіленнях винаходу гепмер утримує на кожній стороні (5'ї 3) сегмент-крило з аналогів нуклеотидів в кількості від 2 до 4, переважно аналогів ЗНК.
У деяких втіленнях винаходу олігомер за винаходом містить послідовність з 13, 14, 15 або 16 суміжних нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини 5ЕО ІЮО МО 33 або 34 або 45, або послідовність з 16 суміжних нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини 5ЕО ІЮ МО 31, і може необов'язково містити додаткові 1-6 нуклеотидів, які можуть утворювати або містити біорозщеплювану ділянку з нуклеотидів, таку як нуклеотидфосфатний лінкер. Доцільно ця біорозщеплювана ділянка з нуклеотидів утворена коротким фрагментом (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5 або 6) з нуклеотидів, що являється фізіологічно лабільним. Це може бути досягнуто шляхом використання фосфодіефірних зв'язків з ДНК/РНК нуклеозидами, або, якщо його фізіологічна лабільність може зберігатися, можна використовувати інший нуклеозид.
Фізіологічну лабільність можна виміряти, використовуючи екстракт печінки, як проілюстровано в прикладі 6.
Олігомер за винаходом може, таким чином, складатися з послідовності з 10-16 суміжних нуклеотидів (нт) в довжину, комплементарної відповідному відрізку довжини 5ЕО ІЮ МО 33 або 34 або 45, або з послідовності з 16 суміжних нуклеотидів, комплементарною відповідному відрізку довжини ЗЕО ІЮ МО 31 (перша ділянка або ділянка А). Олігомер за винаходом може містити додаткову ділянку з нуклеотидів. У деяких втіленнях винаходу додаткову ділянку з нуклеотидів містить біорозщеплювану ділянку з нуклеотидів, таку як послідовність нуклеотидфосфатів (друга ділянка, ділянка В), яка може ковалентно зв'язувати ділянку А з ненуклеотидним угрупуванням, такою як кон'югатна група (третя ділянка або ділянка С). У деяких втіленнях винаходу безперервна нуклеотидна послідовність олігомеру за винаходом (ділянка А) ковалентно пов'язана безпосередньо з ділянкою С. У деяких втіленнях винаходу ділянка С є біорозщеплюваною.
Олігомер складається з послідовності або містить послідовність суміжних нуклеотидів з 12- 22, наприклад, з 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 нуклеотидів в довжину, наприклад, з 14-16 нуклеотидів в довжину, наприклад, з 15 або 16 нуклеотидів в довжину. Олігомер може, таким чином, відноситися до об'єднаної довжини ділянки А і ділянки В, наприклад, ділянки А (10-16 нт) і ділянки В (1-6 нт).
У різних втіленнях винаходу сполука за винаходом не містить РНК (ланок). У деяких втіленнях винаходу сполука згідно з винаходом, перша ділянка або перша і друга ділянки разом (наприклад, у вигляді єдиної безперервної нуклеотидної послідовності) є лінійною молекулою бо або синтезуються у вигляді лінійної молекули. Олігомер може, таким чином, бути одноланцюговою молекулою. У деяких втіленнях винаходу олігомер не містить короткі ділянки з, наприклад, щонайменше 3, 4 або 5 суміжних нуклеотидів, які комплементарні еквівалентним ділянкам в межах того ж олігомеру (тобто дуплексів). Олігомер в деяких втіленнях винаходу може бути не (по суті) дволанцюговим. У деяких втіленнях винаходу олігомер по суті є не дволанцюговим, наприклад, являє собою не міРНК.
Послідовності олігомеру
У наведеній нижче таблиці приведені олігомери і кон'югати олігомерів за винаходом і послідовностей-мішеней РОБКОУ за винаходом.
Таблиця 1 . . Положення на гені
Бо Послідовноть Ро слово саме | сок ЕОМ я 1 |ТОСівсаваассСА. | | 777777/71777717171717171717171010117111113643-3656 Г-:ШИ 2 |ААТосійвсаавассСА.Г | | (:::Б | (ХЬ ////////// | 3643-3658. Г7-:ИОЧ
З |ААТосійсаадвассСА./ | | (ЇЇ 77777701 3643-3658 ГГ: 4 |бСюююдадсвай | | 7777/1771 3251-3265 ГГ: 5 |ТОсюююадстої | | (ЇЇ 77777777777777777710/0177111 3251-3266 .Ш-:И 6 (|тоСюююадетої | | (ОО Ї777777777771717171717171710101771111 3251-3266 .ШЧ:ИЬ 7 |ТССюдеюютос | ЇЇ 77777Ї17777771717171С1717111 о 3373-3388..ЙШЧ:У((И 8 |тССюдеюювс | | 77777/71777771717171717171011711113373-3388..ЙШЧ:У(И 9 |ТОСіасааваасССА |такітак//| 77777777 171111 3643-3656 Г-:М ло |ААТосійсаавасССА |такітак/// | 77777777 17111 3643-3658 Г-:ШМ 11 ТААТосіайсаадвассСА |такітак// | 77777777 171111 3643-3658 Г-:ШМ 12 |бСюююаоснос 0 |такітак///| 77717171 171111 3251-3265 ШГ-:ШИ 13 |ТОсіюююадсітос |такітак///| 77171717 171111 3251-3266 .-:ИКО 14 |ТОСюююадсітос 0 |такітак////| 77171717 171111 3251-3266 .-:ИКО 15 Ц|ТССюдеюютосС 0 |такітак///| 77717717 17111 3373-3388..ЙШ:УЯ) 16 |ТССюдеююнос 00 |такітак////| 77717177 17111 3373-3388..ЙШ:УЯ 17 |ТОСіасаваассСА. | | --/-/ 0Їтак | 3643-3656 Щщ( 18 ЩфААТосійсаавассСА. | | (так | 3643-3658 Г-:ШЬ 19 ЩААТосійсаадвассСА.// | | (так | 3643-3658 Г-:ШИ 20 Ц|ССюююадснас | | --( (так | 3251-3265 ШЩГ-:Ш 21 |ТОсюююадсітої | | --( (так | 3251-3266 Г-:ШИ 22 |ТОСюююадстос | | -( (так | 3251-3266 Г-:ШМ 23 |ТССюдеюютосС | | (| (так | 3373-3388..Ш:У 24 |ТССюдеююнос | | --( (так | 3373-33988...:У(Ї) 40 (|Стсююдаався.ї///// | | 7777777 17777171 171111ло0о5-1о1С 41 |Стсююдааєся, | (так | 77777777 177111 л1о005-1017.7СЧС 42 |СТсююдааєсс (так ітак//| 77777771 177111 л1005-1017.7ШЧ 43 |СТсююдаабсс (так ітак//| 77777771 177111 л1005-1017.7ШЧС 25 |Юсійсаавассса.//-/-:/ | | (Г|:::И ЇЇ ЮК 7777/1777 3643-3656 З: 26 |аашюсіясаадвассса.ї/// | | (Г(::К(ЯЇ 7777Ю7Ю7Ю7ю7юЮюЮюЮю/юю///0/0171111о3643-3658 ГГ: 29 Посіюдієюютос | ЇЇ 77777777 171111 3373-3388..ЙШЧ:УЯі 44 |дсююдавдс//// | | 77777711 171111 л1005-1017СЩС зо (ссср рдасСА | | С/ЮСЮСЛЇ17777777ю7юЮюЮСЮ1771111 3643-3656 Г-:ШИ
АЮ 111 32 |ССААОСОСАСАСАВС | | -: ОЇ 7777777777//сссс0000177111 3251-3265 ГГ:
З |ССААОСОСАСАСАОСА|. | || 3251-3266 .-:ШЬО 34 Ц|СОААСАСАСАССАСОА|. | (| 77777701 3373-3388..ЙШ:УС
І 45 |СОСООССАСАВАСЄ | | (|:НОЇ 0/1 лооб-лот
ЗЕО ІО МО 25-29 і 44 являють собою мотиви послідовностей нуклеотидних основ.
ЗЕО ІЮ МО 30-34 і 45 являють собою послідовності-мішені РНК, присутні в МРНК РОБКО людини.
ЗЕО ІЮ МО 1 являють собою 5РО5001.
ЗЕО ІЮ МО 1-24 і 40-43 являють собою олігомери, що містять аналоги нуклеотидів, такі як гепмерні олігомери ЗНК, де рядкові букви є ланками ДНК (нуклеозид/нуклеотид), де прописні букви є ланками ЗНК.
У деяких втіленнях винаходу усі ЗНК С являють собою 5-метилцитозин. У деяких втіленнях винаходу усі ланки ЗНК являють собою бета-О-окси-ЗНК. У деяких втіленнях винаходу усі міжнуклеозидні зв'язки між нуклеозидами 5ЕБЕО І МО 1-24 і 40-43 являють собою фосфоротіоатні зв'язки.
ЗЕО І МО 9-16 і 41-43 містять олігомер (як вказано 5ЕО ІД), а також холестерин кон'югат, який може бути ковалентно пов'язаний з олігомером на 5' або 3' кінці олігомеру, необов'язково за допомогою біорозщеплюваного лінкера, такого як нуклеозидфосфатний лінкер. У деяких втіленнях винаходу холестериновий кон'югат зв'язаний з 5'- кінцем олігомеру.
ЗЕО ІЮ МО 17-24 містять олігомер (як вказано 5ЕО Ід), а також кон'югат саїІМАс, який може бути ковалентно зв'язаний з олігомером на 5' або 3'-кінці олігомеру, необов'язково за допомогою біорозщеплюваного лінкера, такого як нуклеозидфосфатний лінкер або розщеплюваний пептидний лінкер. У деяких втіленнях винаходу кон'югат саЇІМАс зв'язаний на 5'- кінці олігомеру.
Конкретні олігомери і кон'югати, використовувані в цьому документі, проілюстровані на Фіг. З (олігомери), Фіг. 4 (холестеринові кон'югати), Фіг. 5 (кон'югати заіІМАс). Інші приклади кон'югатів, які можна використовувати з олігомером за винаходом, проілюстровані на Фіг. 1 і 2 і описані в розділі Кон'югатні угрупування заїЇМАс.
У таблиці 2 приведені конкретні комбінації олігомеру і кон'югатів.
Таблиця 2
Комбінації олігомер/кон'югат 7 1боп |Сопі2 |Сопіз |Сопій |Сопла |Сопіга |Сопіза |Сопіда:Ч/ 6 1040 |б41 |б42 0сС43 |б44 0сб45 046 |б47 Щщ і 8 Іс60 |с61 |Сб2 |с63 |с64 |с656 |с66 |Сс67 щ 11111111 Їбопіб ////////// |Сопб///////// |Сопіга ///// |Сопіба./77/7/7//7/СЧУУ 776 Щ|048 77777 16497777 1078. 1с79СС 7868 Щ|068 06977777 (06827777 18871
Усі ці комбінації можна візуалізувати шляхом заміщення хвилястої лінії на Фіг. 1 або 2 послідовністю олігомеру. На Фіг. 5 показана комбінація Сопіга з вказаними вище номерами ЗЕО
ІО. Фіг. 5А і 5В являють собою два детальні приклади сполук на Фіг. 5. Слід зазначити, що біорозщеплюваний лінкер (В) може бути присутнім або не бути присутнім між кон'югатним угрупуванням (С) і олігомером (А). Для Сопі!ї-4 і їа-4а сам кон'югат саМАс є біорозщеплюваним, застосування пептидного лінкера в кластері самАс і як такий
Зо біорозщеплюваний лінкер (В) можна використовувати або не використовувати. Проте, попередні дані вказують на те, що включення біорозщеплюваного лінкера (В), такого як нуклеотидфосфатні лінкери, розкриті в цьому документі, може посилити активність таких олігомерних кон'югатів з кластером СаїЇМАс. На фіг. 4 показана комбінація Сопібза з вказаними вище номерами ЗЕО ІО з біорозщеплюваним лінкером (В), що складається з двох мономерів
ДНК С ї А, пов'язаних фосфодіефірним зв'язком. Оскільки при застосуванні з Соп)5 і Соп|б використання біорозщеплюваного лінкера значно посилює активність сполуки, рекомендовано включення біорозщеплюваного лінкера (В), такого як нуклеотидфосфатні лінкери, розкриті в цьому документі.
Терміни "відповідний" і "відповідає" відноситься до порівняння між нуклеотидною послідовністю олігомеру (тобто послідовністю нуклеотидних основ або основ) або безперервною нуклеотидною послідовністю (першою ділянкою/ділянкою А) і зворотним комплементом нуклеїнової кислоти-мішені або його піддільницею (наприклад, 5ЕО ІЮ МО 31, 32, 33, 34 або 45). Аналоги нуклеотидів порівнюють безпосередньо з їх еквівалентом або відповідними нуклеотидами. У переважному втіленні винаходу олігомери (або їх перша ділянка) комплементарні, наприклад, повністю комплементарні ділянці-мішені або її піддільниці (наприклад, 5ЕО ІО МО 31, 32, 33, 34 або 45).
Терміни "зворотний комплемент", "зворотньо комплементарний" і "зворотня комплементарність" при використанні в цьому документі є взаємозамінними з термінами "комплемент", "комплементарний" і "комплементарність".
Термін "комплементарний" означає, що дві послідовності комплементарні у тому випадку, коли послідовність однієї може зв'язуватися з послідовністю іншої в зустрічно-паралельному напрямі, причому 3'-кінець кожної послідовності зв'язується з 5'-кінцем іншої послідовності, а потім кожен А, Т()), о ї С однієї послідовності вирівнюють з Т()), А, С і 5 іншої послідовності відповідно. Зазвичай комплементарна послідовність олігонуклеотиду має щонайменше 9095, переважно 9595, прийнятніше 10095 комплементарність певної послідовності.
Під терміном "відповідний аналог нуклеотиду" і "відповідний нуклеотид" мають на увазі вказівку на те, що нуклеотид в аналозі нуклеотиду і нуклеотид, що зустрічається в природі, ідентичні. Наприклад, коли 2-дезоксирибозна ланка нуклеотиду зв'язана з аденіном, "відповідний аналог нуклеотиду" містить пентозну ланку (що відрізняється від 2-дезоксирибози) зв'язану з аденіном.
Термін "нуклеотидна основа" відноситься до угрупування нуклеотиду, що є основою, і охоплює як такі, що зустрічаються в природі, варіанти, і такі, що не зустрічаються в природі.
Таким чином, "нуклеотидна основа" охоплює не лише відомі пуринові і піримідинові гетероцикли, але також їх гетероциклічні аналоги і таутомери. Зрозуміло, що ДНК- або РНК- нуклеозиди ділянки В можуть мати таку, що зустрічається в природі та/або таку, що не зустрічається в природі нуклеотидну основу (основи).
Приклади нуклеотидних основ включають без обмежень аленін, гуанін, цитозин, тимідин,
Зо урацил, ксантин, гіпоксантин, 5-метилцитозин, ізоцитозин, псевдоізоцитозин, 5-бромурацил, 5- пропінілурацил, б-амінопурин, 2-амінопурин, інозин, діамінопурин ії 2-хлор-6-амінопурин. У деяких втіленнях винаходу нуклеотидні основи можуть бути незалежно вибрані з групи, що складається з аденіну, гуаніну, цитозину, тимідину, урацилу, 5-метилцитозину. У деяких втіленнях винаходу нуклеотидні основи можуть бути незалежно вибрані з групи, що складається з аденіну, гуаніну, цитозину, тимідину і 5-метилцитозину.
У деяких втіленнях винаходу щонайменше одна з нуклеотидних основ, присутніх в олігомері, є модифікованою нуклеотидною основою, вибраною з групи, що складається з 5- метилцитозину, ізоцитозину, псевдоіїзоцитозину, 5-бромурацилу, 5-пропінілурацилу, 6- амінопурину, 2-амінопурину, інозину, діамінопурину і 2-хлор-6-амінопурину.
Мішень
Доцільно олігомер за винаходом здатний до модуляції експресії гена РОБКУ. Переважно олігомер здатний до знижуючої регуляції експресії гена РОКУ. В цьому відношенні олігомер за винаходом може впливати на експресію РОЗКО, в характерному випадку в клітини ссавця, такої як клітина людини, наприклад, клітина печінки. У деяких втіленнях винаходу олігомери за винаходом зв'язуються з нуклеїновою кислотою-мішенню, та їх дією на експресію є її зниження щонайменше на 1095 або 2095 в порівнянні з нормальним рівнем експресії (наприклад, з рівнем експресії клітини тварини або людини, обробленої фізіологічним розчином), прийнятніше щонайменше 3095, 4095, 5095, 6090, 7095, 8095, 9095 або 9595 інгібування в порівнянні з нормальним рівнем експресії. У деяких втіленнях винаходу таку модуляцію спостерігають при використанні приблизно від 0,04 до 25 нМ, наприклад, від 0,8 до 20 нМ концентрації сполуки за винаходом. У деяких втіленнях винаходу таку модуляцію спостерігають при використанні від 0,01 до 15 мг/кг, наприклад, від 0,05 до 10 мг/кг, наприклад, від 0,1 до 7,5 мг/кг, наприклад, від 0,25 до 5 мг/кг, наприклад, концентрації 0,5 і 2,5 мг/кг сполуки за винаходом. У тому ж або в іншому втіленні винаходу інгібування експресії складає менше 10095, як, наприклад, менше 9895 інгібування, менше 9595 інгібування, менше 9095 інгібування, менше 8095 інгібування, наприклад, менше 7095 інгібування. Модуляцію рівня експресії можна визначити шляхом виміру рівнів білку, наприклад, способами, такими як електрофорез в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (ДСН-ПААГ) з наступним Вестерн-блотингом з використанням відповідних антитіл, що індукуються проти білку-мішені. Альтернативно модулювання рівнів бо експресії можна визначити шляхом виміру рівнів МРНК, наприклад, за допомогою Нозерн-
блотинга або кількісної полімеразної ланцюгової реакції із зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР).
При виміюванні за допомогою рівнів мРНК рівень знижуючої регуляції при використанні належного дозування, наприклад, концентрації від 0,04 до 25 нМ, наприклад, від 0,8 до 20 нМ, в деяких втіленнях винаходу в характерному випадку складає рівень до 10-2095 від нормальних рівнів у відсутність сполуки за винаходом.
Таким чином, у винаході запропоновано спосіб знижуючої регуляції або інгібування експресії білку та/"або мРНК РОЗКУ в клітині, експресуючій білок та/"або мРНК РОБЗКУО, де згаданий спосіб включає введення в клітину олігомеру або кон'югата згідно з винаходом для знижуючої регуляції або інгібування експресії білку талабо мРНК РОБЗКОУ в клітині. Доцільно клітина є клітиною ссавця, такою як клітина людини. Введення в деяких втіленнях винаходу можна здійснювати іп міго. Введення в деяких втіленнях винаходу можна здійснювати іп мімо.
Термін "нуклеїнова кислота-мішень" при використанні в цьому документі відноситься до ДНК або РНК, що кодує поліпептид РО5КОУ ссавця, такий як РОЗКУ людини, такий як номер доступу
Національного центру біотехнологічної інформації (МСВІ; Майопа! Сепіег тог ВіоїесппоЇоду
Іптогтаїіоп) ММ 174936 5ЕО ІЮО МО: 46. Нуклеїнові кислоти, кодуючі РОЗКОУ або його варіанти, що зустрічаються в природі, і утворені з них РНК-нуклеїнові кислоти, переважно мРНК, таку як пре-мРНК, хоча переважно зрілу мРНК. У деяких втіленнях винаходу, наприклад, при використанні в дослідженні або діагностиці, "нуклеїнова кислота-мішень" може бути кКДНК або синтетичним олігонуклеотидом, утвореним з вищезгаданих ДНК- або РНК-нуклеїнових кислот- мішеней. Олігомер згідно з винаходом переважно здатний до гібридизації з нуклеїновою кислотою-мішенню. Повинно бути зрозуміло, що 5ЕО ІЮ МО: 46 являє собою послідовність
КДНК, і як така відповідає послідовності зрілої мРНК-мішені, хоча урацил в послідовностях кДНК замінений тимідином.
Термін "його варіант, що зустрічається в природі" відноситься до варіантів поліпептидної або нуклеїново-кислотної послідовності РСБКУ, існуючої в природі в межах певної таксономічної групи, такої як ссавець, наприклад, миша, мавпа і переважно людина. У характерному випадку при посиланні на «варіанти, що зустрічаються в природі» полінуклеотиду термін може також охоплювати будь-який алельний варіант ДНК генома, кодуючою РОБКО, яка знаходиться на хромосомі 4 в локусі 4 С7, в результаті хромосомної транслокації або дуплікації,
Зо і утворену від нього РНК, таку як мРНК. «Варіанти, що зустрічаються в природі», можуть також включати варіанти, утворені в результаті альтернативного сплайсингу мРНК РОЗКОУ. При посиланні на конкретну поліпептидну послідовність, термін, наприклад, також включає форми білку, що зустрічаються в природі, які можуть, таким чином, зазнавати процесинг, наприклад, за допомогою ко- або посттрансляційних модифікацій, таких як відщеплення сигнального пептиду, протеолітичне розщеплювання, глікозилювання і т.д.
У деяких втіленнях винаходу олігомер (або його ділянка з суміжних нуклеотидів) вибраний з однієї з послідовностей або містить одну з послідовностей, вибраних з групи, що складається з
ЗЕО І МО: 28 або 29 або 44 або її підпослідовність з щонайменше 10 суміжних нуклеотидів, де олігомер (або його ділянка з суміжних нуклеотидів) може необов'язково містити одне, два або три помилкові спаровування в порівнянні з послідовністю.
У деяких втіленнях винаходу послідовність-мішень вибрана з послідовностей, або містить послідовності або складається з послідовностей, вибраних з групи, що складається з ЗЕО ІЮ
МО 31, 32, 33, 34 або 45, або підпослідовності з щонайменше 10 суміжних нуклеотидів 5ЕО ІЮ
МО: 33, 34 або 45.
У деяких втіленнях винаходу підпослідовність може складатися з 11, 12, 13, 14, 15 або 16 суміжних нуклеотидів, наприклад, від 12 до 16 нуклеотидів. Доцільно в деяких втіленнях винаходу підпослідовність має таку ж довжину, як безперервна нуклеотидна послідовність олігомеру за винаходом (необов'язково за винятком ділянки В, коли ділянка В не комплементарна мішені).
Проте визнано, що в деяких втіленнях винаходу нуклеотидна послідовність олігомеру може містити додаткові 5' або 3' нуклеотиди, наприклад, незалежно 1, 2, 3, 4, 5 або 6 додаткових нуклеотидів на 5 та/або 3 кінці, які не комплементарні послідовності-мішені, і такі некомплементарні олігонуклеотиди можуть формувати ділянку В. В цьому відношенні олігомер за винаходом в деяких втіленнях винаходу може містити безперервну нуклеотидну послідовність, фланковану на 5' та/або 3' кінці додатковими нуклеотидами. У деяких втіленнях винаходу додаткові 5' або 3' нуклеотиди є нуклеотидами, що зустрічаються в природі, такими як
ДНК або РНК. У деяких втіленнях винаходу додаткові 5' або 3' нуклеотиди можуть являти собою ділянку 0, на яку посилаються в контексті гепмерних олігомерів в цьому документі.
У деяких втіленнях винаходу олігомер згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до 5ЕБЕО ІЮ МО: 27 або її підпослідовність з щонайменше 10 або 12 нуклеотидних основ.
У деяких втіленнях винаходу олігомер згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до 5ЕБЕО ІЮ МО: 28 або її підпослідовність з щонайменше 10 або 12 нуклеотидних основ. У переважному втіленні винаходу олігомер згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до ЗЕО ІЮО МО: 5 або 6. В іншому переважному втіленні винаходу кон'югат олігомеру згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до ЗЕО ІЮ МО: 13 або 14 або 21 або 22.
У деяких втіленнях винаходу олігомер згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до 5ЕБЕО ІЮ МО: 29 або її підпослідовність з щонайменше 10 або 12 нуклеотидних основ. У переважному втіленні олігомер згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 7 або 8. В іншому переважному втіленні винаходу кон'югат олігомеру згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 15 або 16 або 23 або 24.
У деяких втіленнях винаходу олігомер згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до 5ЕБЕО ІЮ МО: 44 або її підпослідовність з щонайменше 10 або 12 нуклеотидних основ. У переважному втіленні винаходу олігомер згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до ЗЕ ІЮ МО: 40. В іншому переважному втіленні винаходу кон'югат олігомеру згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 41, 42 або 43.
У деяких втіленнях винаходу олігомер згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до ЗЕО ІЮ МО: 26. У переважному втіленні винаходу олігомер згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 2 або 3. В іншому переважному втіленні винаходу кон'югат олігомеру згідно з винаходом складається з нуклеотидної послідовності або містить нуклеотидну послідовність відповідно до ЗЕО ІЮ МО: 10 або 11 або 18 або 19.
Довжина
Олігомери можуть містити послідовність або складатися з безперервної нуклеотидної послідовності сумарної довжини 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 або 22 суміжних нуклеотидів. Відрізки довжини можуть включати, наприклад, ділянку А або ділянку А і В.
У деяких втіленнях винаходу олігомери містять або складаються з безперервної нуклеотидної послідовності сумарної довжини 10-22, наприклад, 12-18, наприклад, 13-17 або 12-16, наприклад, 13, 14, 15, 16 суміжних нуклеотидів. Переважно олігомер ділянки А містить або складається з безперервної нуклеотидної послідовності з 14 суміжних нуклеотидів в довжину, прийнятніше з 15 суміжних нуклеотидів в довжину і найприйнятніше з 16 суміжних нуклеотидів в довжину.
У деяких втіленнях винаходу олігомер згідно з винаходом складається з не більше 22 нуклеотидів, наприклад, не більше 20 нуклеотидів, наприклад, не більше 18 нуклеотидів, наприклад, 15, 16 або 17 нуклеотидів. У деяких втіленнях винаходу олігомер за винаходом містить менше 20 нуклеотидів.
Аналоги нуклеотидів
Термін "нуклеотид" при використанні в цьому документі відноситься до глікозиду, що містить цукрове угрупування, угрупування основи і ковалентно зв'язану групу, таку як фосфатна або фосфоротіоатна міжнуклеотидна зв'язуюча група, і охоплює як нуклеотиди, що зустрічаються в природі, такі як ДНК або РНК, нуклеотиди, і такі що не зустрічаються в природі, які містять модифіковані цукрові угрупування та/або угрупування основ, які також називають в цьому документі "аналогами нуклеотидів". У цьому документі окремий нуклеотид (ланка) може також називатися мономером або нуклеїново-кислотною ланкою.
В області біохімії термін "нуклеозид" широко використовують як такий, що відноситься до глікозиду, який містить цукрове угрупування і угрупування основи. Ковалентний зв'язок між двома нуклеозидами може називатися міжнуклеозидним зв'язком. Альтернативно термін міжнуклеозидний зв'язок може використовуватися для характеризації зв'язку між нуклеотидами олігомеру.
Як має бути зрозуміло звичайному фахівцю в цій області техніки, 5' нуклеотид бо олігонуклеотиду не містить 5' міжнуклеотидну зв'язуючу групу, хоча може містити або не містити кінцеву групу, таку як фосфодіефір або фосфоротіоат, для кон'югації лінкера (В або У або кон'югатне угрупування).
Нуклеотиди, що не зустрічаються в природі, включають нуклеотиди, що мають модифіковані цукрові угрупування, такі як біциклічні нуклеотиди або 2'-модифіковані нуклеотиди, такі як 2'- 5 заміщені нуклеотиди. "Аналоги нуклеотидів" є варіантами природних нуклеотидів, таких як ДНК- або РНК- нуклеотиди, в результаті модифікацій в цукрових угрупуваннях та/або угрупуваннях основ.
Аналоги можуть бути такими, що в принципі виключно "мовчать" або "еквівалентними" природним нуклеотидум в контексті олігонуклеотиду, тобто не мають функціональної дії на той шлях, за допомогою якого олігомер інгібує експресію гена-мішені. Такі "еквівалентні" аналоги можуть бути, проте, корисними, якщо, наприклад, вони можуть бути простіше і дешевше одержані або стабільніші в умовах зберігання або одержання, або є кінцевою міткою або міткою.
Переважно, проте, щоб аналоги мали функціональну дію на шлях, за допомогою якого олігомер інгібує експресію гена-мішені; наприклад, шляхом одержання підвищеної зв'язуючої спорідненості (посилення спорідненості) до мішені та/або підвищеній стійкості до внутрішньоклітинних нуклеаз та/або підвищеній легкості транспортування в клітину. Конкретні приклади аналогів нуклеозидів описані, наприклад, в статтях Егеіег 55 Айтапп; Мисі. Асій Кезв., 1997, 25, 4429-4443 і ОпІтапп; Сиїт. Оріпіоп іп Огид ЮОемеІюортенпі, 2000, 3(2), 293-213, і на схемі 1:
Схема 1 б г В б - В В- В ь- В чо Шк ран Її ох БА : ї Н х 9 пов йо бо гази чі а ї х санях о тя оно Оу Хе Онр-о
Фосфоротіввх ХО -Метня Ф-МО 1-0 -Фусв з « ї ден Ї х їх ев В ге в м Ще в В х гул ви У и
В; і А ан ке о ДО ви: сер їу й їн я з ана а
У х я
МН
2УАР яма СеМА пНк 2 : з т
В. щем, В - 228 з в.8 5 еВ сіті, З У М.
Ех оче у оо Серго ні 7 Й зн
Морфрозіне 2 -Е-АМК З'явихирорачідае
Ж (З рідвеаков нумо я в ул осно а сереВНу
Бориса
Олігомер може, таким чином, містити просту послідовність або складатися з простої послідовності нуклеотидів, що зустрічаються в природі - переважно 2'-дезоксирибонуклеотидів (як правило, званої в цьому документі "ДНК"), але також, можливо, рибонуклеотидів (як правило, званої в цьому документі "РНК") або комбінації таких нуклеотидів, що зустрічаються в природі, і одного або більше нуклеотидів, що не зустрічаються в природі, тобто аналогів нуклеотидів. Такі аналоги нуклеотидів можуть відповідним чином посилювати спорідненість олігомеру до послідовності-мішені. Приклади відповідних і переважних аналогів нуклеотидів наведені в М/О 2007/031091 або приведені в цьому документі за допомогою посилання.
Включення в олігомер аналогів, що посилюють спорідненість, нуклеотидів, таких як ЗНК або 2'-заміщені цукри, може дати можливість зменшення розміру олігомеру, що специфічно зв'язується, а також може зменшити верхню межу розміру олігомеру, до якого відбувається неспецифічне або аберантне зв'язування.
У деяких втіленнях винаходу олігомер містить щонайменше 2 аналоги нуклеотидів. У деяких втіленнях винаходу олігомер містить 3-8 аналогів нуклеотидів, наприклад, б або 7 аналогів нуклеотидів.
Приклади аналогів нуклеотидів включають модифікацію цукрового угрупування з одержанням 2'-заміщеної групи або з одержанням біциклічної структури, яка посилює зв'язуючу спорідненість, а також може забезпечити підвищену стійкість до нуклеаз.
У деяких втіленнях винаходу аналоги нуклеотидів, присутні всередині антисмислового олігомеру за даним винаходом (наприклад, в ділянках Х' і М", згаданих в розділі "Конструкція гепмера"), незалежно вибрані з, наприклад: ланок 2'-О-алкіл- РНК, ланок 2-ОМе-РНК, ланок 2'-
О-алкіл-ДНК, ланок 2'-аміно-ДНК, ланок 2'-фтор-ДНК, ланок ЗНК, ланок арабінонуклеїнової кислоти (АНК), ланок 2'-фтор-АНК, ланок НМА, ланок ІНК (інтеркалуючій нуклеїнової кислоти -
СНгізіепзеп, 2002. Мисі. Асіа5. Ве5. 2002 30: 4918-4925, включена в цей документ за допомогою посилання) і ланок 2'МОЕ.
У деяких втіленнях винаходу аналоги нуклеотидів являють собою 2'-О-метоксиетил-РНК (2'МОЕ), мономери 2'"-фтор-ДНК або аналоги нуклеотидів ЗНК, і антисмисловий олігонуклеотид за даним винаходом може сам по собі містити аналоги нуклеотидів, незалежно вибрані з цих трьох типів аналога, або може містити тільки один тип аналога, вибраний з трьох типів. У деяких втіленнях винаходу щонайменше один з аналогів нуклеотидів являє собою 2'-МОБ-РНК, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 ланок нуклеотидів 2'-«МОБ-РНК. У деяких втіленнях винаходу щонайменше один з аналогів нуклеотидів є 2'-фтор-ДНК, наприклад, 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10 ланок нуклеотидів 2'-фтор-ДНК.
Переважним аналогом нуклеотиду є ЗНК, наприклад, окси-ЗНК (наприклад, бета-О-окси-ЗНК і альфа-Ї-окси-ЗНК) та/або аміно-«ЗНК (наприклад, бета-О-аміно-ЗНК ї альфа-ї -аміно-ЗНК) та/або тіо-ЗНК (наприклад, бета-О-тіо-ЗНК ї альфа-Ї -тіо-ЗНК) та/(або ЕМА (наприклад, бета-О-
ЕМА і альфа-І-ЕМА). Найбільш прийнятна бета-О-окси-ЗНК.
У деяких втіленнях винаходу в антисмисловому олігонуклеотиді за даним винаходом або в його безперервній нуклеотидній послідовності присутній тільки один з описаних вище типів аналогів нуклеотидів.
У деяких втіленнях винаходу антисмисловий олігонуклеотид за даним винаходом містить щонайменше одну ланку замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК), наприклад, 1, 2, 3,4,5,6, 7 або 8 ланок ЗНК, наприклад, від З до 7 або від 4 до 8 ланок ЗНК. У безумовно найбільш прийнятних втіленнях винаходу щонайменше один з аналогів нуклеотидів є замкненою нуклеїновою кислотою (ЗНК); наприклад, щонайменше 3, або щонайменше 4, або щонайменше 5, або щонайменше б, або щонайменше 7 або 8 з аналогів нуклеотидів можуть бути ЗНК. У деяких втіленнях винаходу всі аналоги нуклеотидів можуть бути ЗНК.
У деяких втіленнях винаходу антисмисловий олігонуклеотид за даним винаходом може містити і аналоги нуклеотидів (переважно ЗНК), і ланки ДНК. Переважно сума об'єднаних аналогів нуклеотидів (переважно ЗНК) і ланок ДНК складає 10-25, наприклад, 10-24, переважно 10-20, наприклад, 10-18, навіть прийнятніше 12-16. У деяких втіленнях винаходу нуклеотидна послідовність антисмислового олігонуклеотиду за даним винаходом, наприклад, безперервна нуклеотидна послідовність, складається з щонайменше одного аналога нуклеотиду (переважно
ЗНК), а інші нуклеотидні ланки є ланками ДНК. У деяких втіленнях винаходу антисмисловий олігонуклеотид за даним винаходом містить тільки аналоги нуклеотидів ЗНК і нуклеотиди (такі як РНК або ДНК, найприйнятніше нуклеотиди ДНК), що зустрічаються в природі, необов'язково з модифікованими міжнуклеотидними зв'язками, такими як фосфоротіосат.
Зрозуміло, що при посиланні на переважний мотив нуклеотидної послідовності або переважну нуклеотидну послідовність, що складаються тільки з нуклеотидів, олігомери за винаходом, які визначені цією послідовністю, можуть включати відповідний аналог нуклеотиду замість одного або більше нуклеотидів, присутніх в цій послідовності, таких як ланки ЗНК або інші аналоги нуклеотидів, які підвищують стабільність дуплексу/температуру плавлення (Тт) дуплексу олігомер/мішень (тобто аналогів нуклеотидів, що посилюють спорідненість).
Аналіз Тт: Дуплекси олігонуклеотид: олігонуклеотид і РНК-мішень (РО) розводять до З ММ в 500 мл води без РНК-аз і змішують з 500 мл 2х Тт-буфера (200 мМ Масі, 0,2 мМ етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТА), 20 мМ фосфат Ма, рН 7,0). Розчин нагрівають до 95"С протягом З хв, а потім дають можливість відпалу при кімнатній температурі протягом 30 хв.
Температури плавлення (Тят) дуплексів вимірюють на спектрофотометрі Гатрда 40 ОМ/ЛЛ/5, обладнаному пристроєм програмування температури Пельтьє РТРб, з використанням програми бо РЕ Тетріаб (Регкіп ЕІтег). Температуру різко піднімають з 207С до 957С, а потім різко знижують до 25"С, реєструючи поглинання при 260 нм. Для оцінки Тт дуплексу використовують першу похідну і локальні максимуми і плавлення, і відпалу.
У деяких втіленнях винаходу які-небудь помилкові спаровування між нуклеотидною послідовністю олігомеру і послідовністю-мішенню переважно виявляються в ділянках зовні від аналогів нуклеотидів, що посилюють спорідненість, таких як ділянка У, на яку посилаються в розділі "Конструкція гепмера", та/л"або в положенні немодифікованих нуклеотидів, наприклад,
ДНК, в олігонуклеотиді та/або в ділянках, що знаходяться в 5' або 3' положенні до безперервної нуклеотидної послідовності.
ЗнНК
Термін "ЗНК" відноситься до біциклічного аналога нуклеозиду, який містить місточковий зв'язок між 2" і 4" положенням в рибозному кільці (2'-4" біциклічний аналог нуклеотиду) і відомий як "замкнена нуклеїнова кислота"). В літературі на ЗНК іноді посилаються як на місточкову або біциклічну нуклеїнову кислоту (ВМА; Бгіддеа писієїс асій або бБісусіїс писієїс асіа), і ці два терміни можна використовувати взаємозамінно. Термін ЗНК може відноситися до мономеру ЗНК або при використанні в контексті "олігонуклеотид ЗНК" ЗНК відноситься до олігонуклеотиду, що містить один або більше таких біциклічних аналогів нуклеотидів. У деяких аспектах біциклічні аналоги нуклеозидів є нуклеотидами ЗНК, ї ці терміни можна, таким чином, використовувати взаємозамінно, і вони є такими втіленнями винаходу, які характеризуються також присутністю лінкерної групи (такої як місточкова група) між С2'ї С4" рибозного цукрового кільця.
У деяких втіленнях винаходу антисмисловий олігонуклеотид за даним винаходом може містити обидві з бета-О-окси-ЗНК і одної або більше наступних ланок ЗНК: тіо-ЗНК, аміно-ЗНК, окси-ЗНК, 5'-єметил-ЗНК та/або ЕМА або в бета-О, або в альфа-Ї конфігураціях або їх комбінацій. У деяких втіленнях винаходу усі цитозинові ланки ЗНК є 5'-метил-цитозином. У деяких втіленнях винаходу щонайменше одним аналогом нуклеозиду, присутнім в першій ділянці (Х), є біциклічний аналог нуклеозиду, наприклад, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8 (за винятком нуклеозидів ДНК та/або РНК ділянки У) аналогів нуклеозидів з модифікованим цукром, наприклад, біциклічних аналогів нуклеозидів, таких як ЗНК, наприклад, бета-0О-Х-ЗНК або альфа-їЇ -Х-ЗНК (де Х є окси, аміно або тіо) або інші ЗНК, розкриті в цьому документі, включаючі
Ко) без обмеження СЕТ, СМОЕ або 5'-Ме-ЗНК.
У деяких втіленнях винаходу ЗНК, використовувана в олігонуклеотидних сполуках за винаходом, переважно має структуру загальної формули ІІ: мк я я я кофе кт Ден
ХК р
І ва Щ й ж пеня формула |Ї де М вибраний з групи, що складається з -0-, -СНгО-, -5-, -МН-, М(Не) та/або -СНо-; 27 і 2" незалежно вибрані з міжнуклеотидного зв'язку, КМ, кінцевої групи або захисної групи; В становить угрупування природної або синтетичної нуклеотидної основи (нуклеотидну основу), і
В" вибраний з атома водню і С.-4-алкілу; 2, Ве, Ве, ВУ і Ве не обов'язково незалежно вибрані з групи, що складається з атома водню, не обов'язково заміщеного Сі-12-алкілу, не обов'язково заміщеного Сг-12-алкенілу, не обов'язково заміщеного Сг-12-алкінілу, гідрокси, С:-12-алкокси, С2-12- алкоксиалкілу, Сг-іг-алкенілокси, карбокси, Сі-12-алкоксикарбонілу, Сі-12-алкілкарбонілу, формілу, арилу, арилокси-карбонілу, арилокси, арилкарбонілу, гетероарилу, гетероарилокси- карбонілу, гетероарилокси, гетероарилкарбонілу, аміно, моно- і ди(С:-в-алкіл)аміно, карбамоїлу, моно- і ди(С:-в-алкіл)-аміно-карбонілу, аміно-С:-6-алкіл-амінокарбонілу, моно- і ди(Сі-6- алкіл)аміно-С.і-в-алкіл-амінокарбонілу, Сі-в-алкіл-карбоніламіно, карбамідо, С:-в-алканоїлокси, сульфоно, С:-в-алкілсульфонілокси, нітро, азидо, сульфанілу, С:-в-алкілтіо, атома галогену, інтеркаляторів ДНК, фотохімічно активних груп, термохімічно активних груп, хелатуючих груп, груп-репортерів і лігандів, де арил і гетероарил можуть бути не обов'язково заміщеними, і де два приєднаних до одного і того ж атому замісника Ка і БЕ? разом можуть означати не обов'язково заміщений метилен («СНг); і Е" вибраний з атома водню і С:-4-алкілу. В деяких втіленнях винаходу Ра, НЄ, Ве, ВЗ і 22 не обов'язково незалежно вибрані з групи, що складається з атома водню і Сі-є алкілу, такого как метил. Для всіх хіральних центрів асиметричні групи можуть знаходитися або в К, або в 5 орієнтації, наприклад, два ілюстративні стереохімічні ізомери включають бета-0О і альфа-1!. ізоформи, які можна проілюструвати таким чином:
Ж Ж
Ша ЩІ
Конкретні ілюстративні ланки ЗНК показані нижче: іч КЗ ря хз пісок ЗНК з: ВС секев- ЗК 2 й в й в у сто Унтної ж Й гак й о КІ !
В-р-то-ЗНК ЯМА 2 їх В
Дня. бро
З ЩА рама ЗНЕ
Термін "тіо-ЗНК" включає замкнений нуклеотид, в якому У в приведеній вище загальній формулі вибраний з З або -СНо-5-. Тіо-ЗНК може знаходитися і в бета-О-, і в альфа-ї- конфігурації.
Термін "аміно-ЗНК" включає замкнений нуклеотид, в якому У в приведеній вище загальній формулі вибраний з -М(Н)-, М(В)-, СН»-М(Н)- ї -СН»-М(В)-, де К вибраний з атома водню і Сч1.-4- алкілу. Аміно-ЗНК може знаходитися і в бета-О-, і в альфа-І -конфігурації.
Термін "окси-ЗНК" включає замкнений нуклеотид, в якому ХУ в приведеній вище загальній формулі є -О-. Окси-ЗНК може знаходитися і в бета-О-, і в альфа-Ї -конфігурації.
Термін "ЕМА" включає замкнений нуклеотид, в якому М в приведеній вище загальній формулі є - СНо-О- (де атом кисню -СН»-О- приєднаний в 2'-положенні відносно основи В). Ке позначає атом водню або метил.
У деяких ілюстративних втіленнях винаходу ЗНК вибрана з бета-О-окси-ЗНК, альфа-Ї -окси-
ЗНК, бета-О-аміно-ЗНК і бета-О-тіо-ЗНК, зокрема, бета-О-окси-ЗНК.
При використанні в цьому документі "біциклічні нуклеозиди" відносяться до модифікованих нуклеозидів, що містять біциклічне цукрове угрупування. Приклади біциклічних нуклеозидів включають без обмеження нуклеозиди, що містять місточковий зв'язок між 4 і 2' атомами рибозильного кільця. У деяких втіленнях винаходу сполуки, запропоновані в цьому документі, включають один або більше біциклічних нуклеозидів, де місток містить 4-2 біциклічні нуклеозиди. Приклади таких 4-2" біциклічних нуклеозидів включають без обмежень одну з формул: 4-(СН»ег)-О-2" (ЗНК); 2-(СН2г)-5-2; 4-(СНег)2-0-2" (ЕМА); 4-СН(СНз)-0О-2 і 42-СН(СН2ОСН)-
Ко) О-2 та їх аналоги (див. патент О5 7,399,845, опублікований 15 липня 2008 р.); 4-С(СНз)(СНз)-О- 2" та її аналоги (див. опубліковану міжнародну заявку на патент РСТ МО 2009/006478, опубліковану 8 січня 2009 р.); 4-СН»АМ(ОСНЗ)-2' та її аналоги (див. опубліковану міжнародну заявку на патент РСТ УМО 2008/150729, опубліковану 11 грудня 2008 р.); 4-СНо-О-М(СНз)-2" (див. опубліковану заявку на патент 05 2004/0171570, опубліковану 2 вересня 2004); 4-СНе-
М(2К)-О-27, де К позначає Н, Сі-Сіо алкіл або захисну групу (див. патент 05 7,427,672, опублікований 23 вересня 2008 р.); 4-СНо-С(НуСНЗз)-2 (див. Спайорайднуауа, еї аї, 9. Огу. Снет., 2009, 74, 118-134); ії 4-СНо-С(-СН»г)-2" та її аналоги (див. опубліковану міжнародну заявку на патент РСТ УМО 2008/154401, опубліковану 8 грудня 2008 р.). Також див., наприклад, статті: зЗіпдой єї аі., Спет. Соттип., 1998, 4, 455-456; КовнкКіп еї а!., Темапеагоп, 1998, 54, 3607-3630;
Ууапіезівдії сеї аї., Ргос. Маї). Асад. осі. 0.5. А., 2000, 97, 5633-5638; Китаг еї аї., Віоогд. Мед.
Спет. І еїї., 1998, 8, 2219-2222; Зіпднп еї аї!., У. Огу. Спет., 1998, 63, 10035-10039; бііїмавіама єї аІ,, У. Ат. Спет. бос, 129(26) 8362-8379 (ди. 4, 2007); ЕІауаді еї аї., Сит. Оріпіоп Іпуепв. Югидв, 2001, 2, 558-561; Вгаазсн евї а!., Спет. Віої, 2001, 8, 1-7; Огат єї аї, Ст. Оріпіоп Мої. Тнег., 2001, 3, 239-243; патенти ОБ МоМо 6,670,461, 7,053,207, 6,268,490, 6,770,748, 6,794,499, 7,034,133, 6,525,191, 7,399,845; опубліковані міжнародні заявки РСТ УМО 2004/106356, УМО 94/14226, УМО 2005/021570 ї УМО 2007/1 34181; публікації патентів О5 МоМо 05 2004/0171570, 005 2007/0287831 і 05 2008/0039618; і патенти 05 серійні МоМо 12/129,154, 60/989,574, 61/026,995, 61/026,998, 61/056,564, 61/086,231, 61/097,787 і 61/099,844; і міжнародні заявки РСТ /МоМо
РСТ/О52008/064591, РСТ/О52008/066154 і РСТ/О52008/068922. Кожен з вказаних вище біциклічних нуклеозидів може бути одержаний так, що він має одну або більше стереохімічних конфігурацій цукру, що включають, наприклад, а-І -рибофуранозу і бета-О-рибофуранозу (див. міжнародну заявку РСТ ЮКО8/00393, опубліковану 25 березня 1999 як УМО 99/14226).
У деяких втіленнях винаходу біциклічні цукрові угрупування нуклеозидів ЗНК включають без обмежень сполуки, що мають щонайменше один місточковий зв'язок між 4 і 2" положенням пентозофуранозильного цукрового угрупування, де такі місточкові зв'язки незалежно містять 1 або від 2 до 4 зв'язаних груп, незалежно вибраних з -ІСіВаХНь)|-, -С(Ва)-С(Аь)-, -С(Ва)-М-, - 20. Фб(-МВа)-, -С(-0)-, -С(-5)-, -О-, -5І(Ва)2-, -5(-0)х- і -М(Ва)-; де: х дорівнює 0, 1 або 2; п дорівнює 1,2, З або 4; кожний Ка і Кь незалежно позначає Н, захисну групу, гідроксил, С1-С:2 алкіл, заміщений С1-Сі2 алкіл, С2-С12 алкеніл, заміщений С2-С:12 алкеніл, С2-С:12 алкініл, заміщений С2-
Сі2 алкініл, С5-Сго арил, заміщений С5-Сго арил, гетероциклічний радикал, заміщений гетероциклічний радикал, гетероарил, заміщений гетероарил, С5-С7 аліциклічний радикал, заміщений С5-С7 аліциклічний радикал, атом галогену, 09:, Мт, 51, Мз, СО0У)ї, ацил (С(50)-
Н), заміщений ацил, СМ, сульфоніл (5(-0)2-)1) або сульфоксил (5(-0)-)1); і кожний «1 і 92 незалежно позначає Н, С:-Сє алкіл, заміщений С1-С:2 алкіл, Сг-С1і2 алкеніл, заміщений С2-С12 алкеніл, С2-С:і2 алкініл, заміщений С2-С:і2 алкініл, Се-Сго арил, заміщений С5-Сго арил, ацил (С(-О0)-Н), заміщений ацил, гетероциклічний радикал, заміщений гетероциклічний радикал, Сі-
Сі2 аміноалкіл, заміщений С1-С:12 аміноалкіл або захисну групу.
У деяких втіленнях винаходу місточковий зв'язок циклічного цукрового угрупування являє собою -ІС(НахАБ-, -ІС(Ва)хАь)н-О-, -С(НаНь)-М(Н)-О- або -С(ВаНь)-О-М(В)-. У деяких втіленнях винаходу місточковий зв'язок являє собою 4-СНе2-2, 4-(СНг)»-2,. 4-(СН2г)з-2, 4-СНо-О-2, 4- (СНг)2-0-2, 4-СНо-О-М(В)-2 ії 4-СНоАМ(В)-О-2-, де кожний К незалежно позначає Н, захисну групу або С.:-Сі2 алкіл.
У деяких втіленнях винаходу біциклічні нуклеозиди додатково визначені ізомерною конфігурацією. Наприклад, нуклеозид, що містить місточковий зв'язок 4'-2'-метилен-окси, може знаходитися в а-Ї конфігурації або в бета-О конфігурації. Раніше а-І -метиленокси (4-СНег-0О-2')
ВМА включали в антисмислові олігонуклеотиди, які проявляли антисмислову активність (Егіедеп еїаї, Мисівіс Асід5 Незеагси, 2003, 21, 6365-6372).
У деяких втіленнях винаходу біциклічні нуклеозиди включають без обмежень (А) а-і-
Метиленокси (4-СНг2-0-2)3 ВМА, (В) бета-О-Метиленокси (4-СНг2-0-2) ВМА, (С) Етиленокси (4"- (СНг)2-0О-2) ВМА, (0) Аміноокси (4"-СН2-О-М(А)-2) ВМА, (Е) Оксиаміно (4-СН2-М(А)-О-2) ВМА, (Р)
Метил(метиленокси) (4-СН(СНз)-0О-23 ВМА, (б) метилен-тіо (4-СНг-5-23 ВМА, (Н) метилен- аміно (4-СНо-М(Н)-2) ВМА, (І) метилкарбоциклічну (4-СНо.-СН(СНаз)-2) ВМА і (9 пропіленкарбоциклічну (4-(СН?г)з-2) ВМА, як зображено нижче.
ше ни ши то в У о ше и д- 7 ;
Е е Та ема, лек, »
І-ї ФІ о ї-о мах закл 2 : ; : ; ше щи: Е КК ВХ ши кут ху ку и т 7 т тра о ге (в) ов ов
ФО ї- пу" еф де Вх позначає угрупування основи, і КЕ незалежно позначає Н, захисну групу або С1-С2 алкіл. 5 У деяких втіленнях винаходу біциклічний нуклеозид визначений формулою І:
Тато В
ШО вх
СО Зн г ше в і, де:
Вх позначає гетероциклічне угрупування основи; -Фа-О5-Ос- позначає -СН2-М(АНе)-СНе-, -С(-0)-М(Ае)-СНе-, -СН»-О-М(Вс)-, -СН»-М(Вс)-О- або -
М(Ас)-О-СНе;
Ве позначає С.1-Сі2 алкіл або аміно-захисну групу; і
Та ії Ть кожен незалежно позначає Н, гідрокси-захисну групу, кон'югатну групу, реакційну фосфорну групу, фосфорне угрупування або ковалентне приєднання до іммобілізуючого носія.
У деяких втіленнях винаходу біциклічний нуклеозид визначений формулою ІІ:
Ето о, дх цс; а г тео і
Ть Й де:
Вх позначає гетероциклічне угрупування основи;
Та ії Ть кожен незалежно позначає Н, гідрокси-захисну групу, кон'югатну групу, реакційну фосфорну групу, фосфорне угрупування або ковалентне приєднання до іммобілізуючого носія; 7а позначає С:і-Св алкіл, Се-Сє алкеніл, Со-Св алкініл, заміщений С:1-Сє алкіл, заміщений С2-Св алкеніл, заміщений С2-Сє алкініл, ацил, заміщений ацил, заміщений амід, тіол або заміщений тіол.
У деяких втіленнях винаходу кожна із заміщених груп незалежно є моно- або полізаміщеною групами замісників, незалежно вибраними з атома галогену, оксо, гідроксилу Ос, Ма, Бус, Мз,
С(-Хує ії МОеС(-Х)Мусуа, де кожен с, Уа і де незалежно позначає Н, С1-Сє алкіл або заміщений
С:-Свалкіл, і Х позначає О або Мус.
У деяких втіленнях винаходу біциклічний нуклеозид визначений формулою ПП: ї, о хору"
Фото і ї НН де:
Вх позначає гетероциклічне угрупування основи;
Та і Ть кожен незалежно позначає Н, гідроксил-захисну групу, кон'югатну групу, реакційну фосфорну групу, фосфорне угрупування або ковалентне приєднання до іммобілізуючого носія;
Ва позначає С1-Св алкіл, Со-Св алкеніл, С2-Сє алкініл, заміщений С.1-Свє алкіл, заміщений С2-
Св алкеніл, заміщений С2-Св алкініл або заміщений ацил (С(-0)-).
У деяких втіленнях винаходу біциклічний нуклеозид визначений формулою ІМ:
За щі о
Т.О Кк їк- «ВХ отв) ее
М їУ
Ов де:
Вх позначає гетероциклічне угрупування основи;
Та і Ть кожен незалежно позначає Н, гідроксил-захисну групу, кон'югатну групу, реакційну фосфорну групу, фосфорне угрупування або ковалентне приєднання до іммобілізуючого носія;
Ва позначає С:-Свє алкіл, заміщений С1-Св алкіл, Се-Св алкеніл, заміщений С2-Сє алкеніл, С2-
Св алкініл, заміщений С2-Свє алкініл; кожний дь, дс і діа незалежно позначає Н, атом галогену, С1-
Св алкіл, заміщений С:-Сє алкіл, Со-Свє алкеніл, заміщений С2-Свє алкеніл, Со-Св алкініл або заміщений С2-Св алкініл, Сі--Сє алкоксил, заміщений С2о-Св алкоксил, ацил, заміщений ацил, С1-
Св аміноалкіл або заміщений С.1-Свє аміноалкіл.
Зо У деяких втіленнях винаходу біциклічний нуклеозид визначений формулою У:
Че ху е
ТОК --ч нх
А О-ТЬ/
Я
ЧЕ "
Ох де:
Вх позначає гетероциклічне угрупування основи;
Та і Ть кожен незалежно позначає Н, гідроксил-захисну групу, кон'югатну групу, реакційну фосфорну групу, фосфорне угрупування або ковалентне приєднання до іммобілізуючого носія;
Да, дЧь, Дс і дєкожний незалежно позначає атом водню, атом галогену, С1-Сі12 алкіл, заміщений С1-
Сі» алкіл, Со-С12 алкеніл, заміщений С2-Сі2 алкеніл, С2-С12 алкініл, заміщений С2-Сі2 алкініл, С1-
Сі2г5 алкокси, заміщений С1-С12 алкокси, Оу, 59), 50), Оггі, Мк, Мз, СМ, С(-0303)), С(-О)МО Мк,
Фб(-09), О-б(-0)М9ОЮк, М(Н)С(-МН)ІМУЮЮ М(НС(-О)МОЮкю або М(Н)С(-5)МУ Кк; або де і де разом позначають -С(до)(дн); до і дн кожний незалежно позначає Н, атом галогену, Сі- Сі» алкіл або заміщений С-:-Сі2 алкіл.
Синтез і одержання мономерів метиленокси (4-СН2-0-2)3 ВМА аденіну, цитозину, гуаніну, 5- метил-цитозину, тиміну і урацилу в поєднанні з їх властивостями олігомеризації і розпізнавання нуклеїнових кислот описані (див., наприклад, статтю Кознпкіп еї аї., Темгапеагоп, 1998, 54, 3607- 3630). ВМА та їх одержання також описані в документах УМО 98/39352 ії УМО 99/14226.
Аналоги метиленокси (4-СНг-0О-23 ВМА, метиленокси (4-СНг-О-2") ВМА ії 2'-тід-ВМА також одержані (див., наприклад, статтю Киптаг еї аї., Вісогд. Мей. Спет. І ей., 1998, 8, 2219-2222).
Одержання замкнених аналогів нуклеозидів, що містять олігодезоксирибонуклеотидні дуплекси, як субстрати для полімераз нуклеїнових кислот також описано (див., наприклад, Умепдеї еї аї.,
МО 99/14226). Крім того, на рівні техніки описаний синтез 2'-аміно-ВМА, нового конформаційно- обмеженого аналога олігонуклеотиду з високою спорідненістю (див., наприклад, 5іпоп еї аї.,..
Ог9. Спет., 1998, 63, 10035-10039). Крім того, раніше описані 2'-аміно- і 2'-метиламіно-ВМА і термостабільність їх дуплексів з комплементарними РНК і ДНК.
У деяких втіленнях винаходу біциклічні нуклеозиди визначені формулою МІ: » З
ГО ; ра о яВх са ді м щі
Фо де:
Вх позначає гетероциклічне угрупування основи;
Та і Ть кожен незалежно позначає Н, гідроксил-захисну групу, кон'югатну групу, реакційну фосфорну групу, фосфорне угрупування або ковалентне приєднання до іммобілізуючого носія; кожен ді, ду, дк і ді незалежно позначає Н, атом галогену, С1-С12 алкіл, заміщений С1-Сі2 алкіл,
С2-Сі2 алкеніл, заміщений С2-С1і2 алкеніл, С2-С12 алкініл, заміщений С2-С12 алкініл, С1-С12 алкоксил, заміщений С2- Сі2 алкоксил, 03), 59, 50), 5О2), Мк, Ма, СМ, С(-0)09), С(-О)Мук,
Зо Фб(-09), О-С(-О)МОЮКк, М(Н)ІС(Т-МНІМОЮЮ М(НС(-О)МмМОЮкю або (НС(-5)МОУЮК і ді др або дії дк разом позначають -С(до) (дю), де До і дн кожен незалежно позначає Н, атом галогену, С1-Сі2 алкіл або заміщений С.-Св алкіл.
Описані інші карбоциклічні біциклічні нуклеозиди, що мають місточковий зв'язок 4"-(СН?г)з-2, і алкенільний аналог, місточковий зв'язок 4-СН-СН-СНе-2' (див., наприклад, Егеїег еї аї, Мисієїс
Асіаз Везєагсі, 1997, 25(22), 4429-4443 і АІраєек еї аї, 9. Огд. Спет., 2006, 71, 7731-77 40).
Синтез і одержання карбоциклічних біциклічних нуклеозидів у поєднанні з їх олігомеризацією і біохімічними дослідженнями також описані (див., наприклад, Згімавіама еї аї, У. Ат. Спет. 50б. 2007, 129(26), 8362-8379).
При використанні в цьому документі "4-2 біциклічний нуклеозид" або "4-2 біциклічний нуклеозид" відноситься до біциклічних нуклеозидів, що містять кільце фуранози, що містить місток, що сполучає 2" атом вуглецю і 4" атом вуглецю.
При використанні в цьому документі "моноциклічні нуклеозиди" відносяться до нуклеозидів, що містить модифіковані цукрові угрупування, що є не біциклічними цукровими угрупуваннями.
У деяких втіленнях винаходу цукрове угрупування або аналог цукрового угрупування нуклеозиду може бути модифіковане або заміщене в будь-якому положенні.
При використанні в цьому документі "2'-модифікований цукор" означає фуранозильний цукор, модифікований в 2" положенні. У деяких втіленнях винаходу такі модифікації включають замісники, вибрані з: галогеніду, що включає без обмежень заміщений і незаміщений алкокси, заміщений і незаміщений тіоалкіл, заміщений і незаміщений аміноалкіл, заміщений і незаміщений алкіл, заміщений і незаміщений аліл і заміщений і незаміщений алкініл. У деяких втіленнях винаходу 2" модифікації вибрано із замісників, що включають без обмежень:
ОКСНе)О|тптСнНз, О(СНег),МН», О(СНег),СН», Оо(СнНУ,ОМН»,, осно -ОМ(Н)СНз і о(СнНУОМ(СНег)пСНзі|г, де п і т дорівнюють від 1 до приблизно 10. Інші 2'-групи замісників також можуть бути вибрані з: С1-С12 алкілу; заміщеного алкілу; алкенілу; алкінілу; алкарилу; аралкілу; О-алкарилу або О-аралкілу; ЗН; ЗСНз; ОСМ; СІ; Вг; СМ; СЕз; ОСЕз; 5БОСН»; 502СНз;
ОМО»; МО»; Ма; МН»:; гетероциклоалкіл; гетероциклоалкарил; аміноалкіламіно; поліалкіламіно; заміщеного силілу; КЕ; відщеплювану групу; групу-репортер; інтеркалятор; групу для поліпшення фармакокінетичних властивостей і групу для поліпшення фармакодинамічних властивостей антисмислової сполуки, а також інші замісники, що мають подібні властивості. У деяких втіленнях винаходу модифіковані нуклеозиди містять бічний ланцюг 2'-МОЕ (див., наприклад,
ВакКег еї аї., 9. Віої. Спет., 1997, 272, 1 1944-12000). Описано, що таке заміщення 2'-МОЕ має поліпшену зв'язуючу спорідненість в порівнянні з немодифікованими нуклеозидами і з іншими модифікованими нуклеозидами, такими як 2'-О-метил-, О-пропіл- і О-амінопропіл-. Також показано, що олігонуклеотиди, що мають замісник 2'-МОЕ, є антисмисловими інгібіторами експресії генів з перспективними ознаками для застосування іп мімо (див., наприклад, Магіп, Р.,
Не/у. Спіт. Асіа, 1995, 78, 486-504; Аптапп еї аї., Снпітіа, 1996, 50, 168-176; Айптапп еї аї.,
Віоспет. бос. Тгапз., 1996, 24, 630-637; і Айтапп еї аї., Мисіеозіде5 Мисіеоїіде5, 1997, 16, 917- 926).
При використанні в цьому документі "тетрагідропірановий модифікований нуклеозид" або "ТТ модифікований нуклеозид" означає нуклеозид, тетрагідропірановий "цукор", що має, заміщуючий пентафуранозильний залишок в звичайних нуклеозидах (сурогат цукру).
Модифіковані ТГП нуклеозиди включають нуклеозиди, на які посилаються в цій області техніки як на гекситолову нуклеїнову кислоту (НМА, Ппехйо! писієїс асід), анитолову нуклеїнову кислоту (АМА, апійої! писієїс асід), манитолову нуклеїнову кислоту(див. статтю ІГештапп, С. Віоогд. апа
Мед. Спет. (2002) 10:841- 854), фтор-НМА (Б-НМА) або сполуки, визначені формулою Х: ча з де -
Че я -еДВХ й я В 5 ї,
Фосмуза Х де незалежно для кожного із згаданих щонайменше одного тетрагідропіранового аналога нуклеозиду формули Х:
Вх позначає гетероциклічне угрупування основи;
Тз і Та кожен незалежно позначає міжнуклеозидну зв'язуючу групу, що зв'язує тетрагідропірановий аналог нуклеозиду з антисмисловою сполукою, або один з Тз і Т4 позначає міжнуклеозидну зв'язуючу групу, що зв'язує тетрагідропірановий аналог нуклеозиду з антисмисловою сполукою, а інший з Тз і Т4 позначає Н, захисну групу гідроксилу, групу, пов'язану з кон'югатом, або 5' або 3'-кінцеву групу; ді д2 Яз да д5, де і д7 кожний незалежно позначає Н, С:-Свє алкіл, заміщений Сі-Свє алкіл, Се-Сє алкеніл, заміщений С2-Св алкеніл, С2-Св алкініл або заміщений С2-Св алкініл; і один з К: і Ко позначає атом водню, а інший вибраний з атома галогену, заміщеного або незаміщеного алкокси, Муї9г, 51, Мз, ОС(-Х)Уї, ОС(-Х)МУ о»,
МозС(-Х)МУ 1» ії СМ, де Х позначає О, 5 або М;, і кожен «., 9» і дз незалежно позначає Н або С.1-
Св алкіл.
У деяких втіленнях винаходу запропоновані модифікованні ТГП нуклеозиди формули Х, де
Дт, Чи, Ор, Дь ДО», де і ди кожен позначає Н. У деяких втіленнях винаходу щонайменше один з дт,
Оп, Ор, Де, З», дк і Ди відрізняється від Н. У деяких втіленнях винаходу щонайменше один з дт, Оп,
Ор, аг, д5, ді ди позначає метил. У деяких втіленнях винаходу запропоновані ТГП нуклеозиди формули Х, де один з Кі і К» позначає РЕ. У деяких втіленнях винаходу Кі позначає атом фтору, а Ко позначає Н, К: позначає метокси, а Ко позначає Н, і Кі позначає метоксиетокси, а Ко позначає Н.
При використанні в цьому документі "2'-модифікований" або "2'--заміщений" відноситься до нуклеозиду, що містить цукор, який містить замісник в 2' положенні, що відрізняється від Н або
ОН. 2'-Модифіковані нуклеозиди включають без обмеження нуклеозиди з не місточковими 2'- замісниками, такими як аліл, аміно, азидо, тіо, О-аліл, О-С1-С1о алкіл, -ОСЕз, О-(СНг)2-О-СН»з, 2'-
О(СНг»СН», О-(СНг)2-О-М(Ат) (Ви) або О-СНо-С(-0)-М(Ат)(Ни), де кожний Кт і Ки незалежно позначає Н, або заміщений або незаміщений С1-С:о алкіл. 2-Модифіковані нуклеозиди можуть додатково містити інші модифікації, наприклад, в інших положеннях цукру та/або в нуклеотидній основі.
При використанні в цьому документі "2'-Е" відноситься до цукру, що містить групу фтор в 2- положенні.
При використанні в цьому документі "2'-ОМе" або "2-ОСНз" або "2'-О-метил" кожен відноситься до нуклеозиду, що містить цукор, який містить групу, -ОСНз в 2'-положенні цукрового кільця.
При використанні в цьому документі "олігонуклеотид" відноситься до сполуки, що містить безліч зв'язаних нуклеозидів.
У деяких втіленнях винаходу один або більше з безлічі нуклеозидів модифікований. У деяких втіленнях винаходу олігонуклеотид містить один або більше рибонуклеозидів (РНК) та/або дезоксирибонуклеозидів (ДНК).
У цій області техніки також відомо багато інших біциклічних і трициклічних кільцевих систем сурогатів цукрів, які можна використовувати для модифікації нуклеозидів для включення в антисмислові сполуки (див., наприклад, оглядову статтю І ештапп, 9.С., Віоогдапіс апа Медісіпаї!
Спетівігу, 2002, 10, 841-854). Такі кільцеві системи можуть зазнавати різні додаткові заміщення для посилення активності. Способи одержання модифікованих цукрів також відомі фахівцям в цій області техніки. У нуклеотидів, що мають модифіковані цукрові угрупування, зберігаються угрупування нуклеотидних основ (природні, модифіковані або їх комбінації) для гібридизації з відповідною нуклеїновою кислотою-мішенню.
У деяких втіленнях винаходу антисмислові сполуки містять один або більше нуклеотидів, що мають модифіковані цукрові угрупування. У деяких втіленнях винаходу модифіковане цукрове угрупування є 2-МОБ. У деяких втіленнях винаходу модифіковані 2'--МОЕ нуклеотиди сконструйовані у вигляді гепмерного мотиву. У деяких втіленнях винаходу модифіковане цукрове угрупування є сСЕї У деяких втіленнях винаходу модифіковані СсЕї нуклеотиди сконструйовані за допомогою сегментів-крил гепмерного мотиву.
У деяких втіленнях винаходу в ЗНК В" і 2? разом означають бірадикал -О-СН(СНгОСНЗ)- (2'О-метоксиетил-біциклічні нуклеїнові кислоти - 5еїй аї аї., 2010, 9. Огд. Спет) або в К-, або в з-конфігурації.
Зо У деяких втіленнях винаходу в ЗНК В" і 2? разом означають бірадикал -0- СН(СНоСН5З)- (2'О-етил-біциклічні нуклеїнові кислоти - Зеїй аї аї.,, 2010, 9. Огд. Спет) або в Е-, або в 5- конфігурації.
У деяких втіленнях винаходу в ЗНК К" і К? разом означають бірадикал -0О-СН(СНз)- або в В- , або в 5-конфігурації. У деяких втіленнях винаходу КЕ" і В- разом означають бірадикал -О- СНе-
О-Сно- (Зепт аг а!., 2010, 9. Огу. Снет).
У деяких втіленнях винаходу в ЗНК К" і ЕК? разом означають бірадикал -0О-МАВ-СНз- (Беїй аї а!., 2010, 9. Огу. Спет).
У деяких втіленнях винаходу ланки ЗНК мають структуру, вибрану з наступної групи: г 5 50 СНз о | В о | в о | в (Ф) о) в)
З Н З
(К,5)-СЕї (К,5)-СМОЕ (К,5)-5'-Ме-І МА
Включення аналогів нуклеотидів, що посилюють спорідненість, в олігомер, такий як ЗНК або 2'-заміщені цукри, може дати можливість зменшення розміру олігомеру, що специфічно зв'язується, і може також зменшити верхню межу розміру олігомеру, до якого відбувається неспецифічне або аберантне зв'язування.
Автори винаходу оцінили нефротоксичність сполуки СЕТ (використовуючи (5)-СЕТ з послідовністю (Сполука ІЮ 6/411847 МО 2009/12495 і порівняльна сполука бета-О-окси-ЗНК (6/392063 УМО 2009/12495) і виявили, що сполуки СЕТ викликають несподівано високу нейротоксичність в порівнянні з контролем бета-О-окси-ЗНК. Дослідження було дослідженням однієї дози з умертвінням через З доби (методологію див. в прикладі 41 ЕР1984381, хоча автори винаходу використовували мишей ММК). Нефротоксичність була підтверджена гістологічним аналізом. Зокрема, ознаки нейротоксичності автори винаходу спостерігали при нижчих дозах сполуки СЕТ в порівнянні з дозами, при яких була відмічена сироваткова аланінамінотрансфераза (АТ), що вказує на те, що нефротоксичність сполук СЕТ може бути особливою проблемою. Таким чином, застосування кон'югатів за даним винаходом, таких як тривалентні кон'югати заїІМАс, у високій мірі корисно при зменшенні нефротоксичності сполук
ЗНК, таких як сполуки СЕТ.
У деяких втіленнях винаходу олігомер містить щонайменше 1 аналог нуклеозиду. У деяких втіленнях винаходу олігомер містить щонайменше 2 аналоги нуклеотиду. У деяких втіленнях винаходу олігомер містить 3-8 аналогів нуклеотидів, наприклад, 6 або 7 аналогів нуклеотидів. У безумовно найбільш прийнятних втіленнях винаходу щонайменше один з аналогів нуклеотидів є замкненою нуклеїновою кислотою (ЗНК); наприклад, щонайменше 3, або щонайменше 4, або щонайменше 5, або щонайменше 6, або щонайменше 7 або 8 з аналогів нуклеотидів може бути
ЗНК. У деяких втіленнях винаходу всі аналоги нуклеотидів можуть бути ЗНК.
Повинно бути зрозуміло, що при посиланні на переважний мотив нуклеотидної послідовності або нуклеотидну послідовність, яка складається тільки з нуклеотидів, олігомери за винаходом, які визначені цією послідовністю, можуть містити відповідний аналог нуклеотиду замість одного або більше нуклеотидів, присутніх в згаданій послідовності, таких як ланки ЗНК або інші аналоги нуклеотидів, які підвищують стабільність дуплексу/І т дуплексу олігомер/мішень (тобто аналоги нуклеотидів, що посилюють спорідненість).
Переважний аналог нуклеотиду є ЗНК, такою як окси-ЗНК (такою як бета-О-окси-ЗНК і альфа-ї -окси-ЗНК) та/або аміно-ЗНК (такою як бета-О-аміно-ЗНК і альфа-ї -аміно-ЗНК) та/або тіо-ЗНК (такою як бета-О-тіо-ЗНК і альфа-Іі -тіо-ЗНК) та/або ЕМА (такою як бета-О- ЕМА і альфа-
ІЇ-ЕМА).
У деяких втіленнях винаходу олігомер за винаходом, такий як ділянка А, може містити ланки
ЗНК та інші аналоги нуклеотидів. Додаткові аналоги нуклеотидів, присутні в межах олігомеру за винаходом, незалежно вибрані, наприклад, з: ланок 2'-О-алкіл-РНК, ланок 2"- аміно-ДНК, ланок 2"-фтор-ДНК, ланок ЗНК, ланок арабінонуклеїнової кислоти (АНК), ланок 2'- фтор-АНК, ланок
НМА, ланок ІМА (інтеркалуючої нуклеїнової кислоти - стаття Спгібїепзеп, 2002. Мисі. Асіа5. Кев. 2002 30: 4918-4925, включена в цей документ за допомогою посилання) і ланок 2"'"МОЕ. У деяких втіленнях винаходу в олігомері за винаходом, наприклад, в першій ділянці, або в безперервній нуклеотидній послідовності присутній тільки один тип аналогів нуклеотидів.
У деяких втіленнях винаходу олігомер згідно з винаходом (ділянка А) може, таким чином, містити щонайменше одну ланку замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК), наприклад, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7 або 8 ланок ЗНК, наприклад, 3-7 або 4-8 ланок ЗНК або 3, 4, 5, 6 або 7 ланок ЗНК. У деяких втіленнях винаходу всі аналоги нуклеотидів є ЗНК. У деяких втіленнях винаходу олігомери можуть містити обидві з бета-О-окси-ЗНК і одну або більше наступних ланок ЗНК: тіо-ЗНК, аміно-ЗНК, окси-ЗНК та/або ЕМА або в бета-0, або в альфа-їЇ. конфігураціях або їх комбінації. У деяких втіленнях винаходу усі цитозинові ланки ЗНК є 5'-метил-цитозином. У деяких втіленнях винаходу олігомер (такий як перші і необов'язково другі ділянки) може містити обидві ланки ЗНК і ДНК. У деяких втіленнях винаходу сума комбінованих ланок ЗНК і ДНК складає 10-25, наприклад, 10-24, переважно 10-20, наприклад, 10-18, наприклад, 12-16. У деяких втіленнях винаходу за винаходом нуклеотидна послідовність олігомеру, його першої ділянки, така як безперервна нуклеотидна послідовність, складається з щонайменше однієї ланки ЗНК, а інші нуклеотидні ланки є ланками ДНК. У деяких втіленнях винаходу олігомер або його перша ділянка містить тільки ЗНК, аналоги нуклеотидів і нуклеотиди (такі як нуклеотиди РНК або ДНК, найприйнятніше ДНК), що зустрічаються в природі, необов'язково з модифікованими міжнуклеотидними зв'язками, такими як фосфоротіоат.
Рекрутинг РНКази
Відомо, що олігомерна сполука може функціонувати за допомогою розщеплювання мРНК- мішені, не опосередкованої РНКазою, наприклад, шляхом стеричного утруднення трансляції або іншими способами. У деяких втіленнях винаходу олігомери за винаходом здатні до рекрутингу ендорибонуклеази (РНКази), такої як РНКаза Н.
Переважно, щоб такі олігомери, такі як ділянка А або безперервна нуклеотидна послідовність, що містять ділянку з щонайменше 4, наприклад, щонайменше 5, наприклад, щонайменше б, наприклад, щонайменше 7 послідовних нуклеотидних ланок, наприклад, щонайменше 8 або щонайменше 9 послідовних нуклеотидних ланок (залишків), що включають 7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 або 16 послідовних нуклеотидів, які при формуванні в дуплексі з комплементарною РНК-мішенню здатні до рекрутингу РНКази (таких як ланки ДНК).
Безперервна послідовність, здатна до рекрутингу РНКази, може бути ділянкою У", на яку посилаються в контексті гепмера, як розкрито в цьому документі. У деяких втіленнях винаходу розмір безперервної послідовності, здатної до рекрутингу РНКази, такий як ділянка У", може бути більше, наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 нуклеотидних ланок.
У ЕР 1222309 запропоновані способи визначення активності РНКази Н іп міїго, які можна використовувати для визначення здатності до рекрутингу РНКази Н. Олігомер вважають здатним до рекрутингу РНКази Н, якщо при забезпеченні комплементарної РНК-мішені він має початкову швидкість реакції, виміряної в пікомоль (пмоль)/л/хв, складовій щонайменше 195, наприклад, щонайменше 595, наприклад, щонайменше 1095 або більше 2095 від початкової швидкості реакції, визначеної з використанням тільки ДНК-олігонуклеотиду, що має таку ж послідовність основ, але що містить тільки ДНК-мономери без 2'-заміщень з фосфоротіоатними зв'язуючими групами між усіма мономерами в олігонуклеотиді, використовуючи методологію, запропоновану в прикладах 91-95 ЕР 1222309.
У деяких втіленнях винаходу олігомер вважають по суті нездібним до рекрутингу РНКази Н, якщо при забезпеченні комплементарної РНК-мішені він має початкову швидкість реакції, виміряної в пмоль/л/хв, менше 195, наприклад, менше 595, наприклад, менше 1095 або менше 20965 початкової швидкості реакції, визначеної при використанні тільки ДНК-олігонуклеотиду без 2'-заміщень з фосфоротіоатними зв'язуючими групами між усіма мономерами в олігонуклеотиді, використовуючи методологію, запропоновану в прикладах 91-95 ЕР 1222309.
В інших втіленнях винаходу олігомер вважають здатним до рекрутингу РНКази Н, якщо при забезпеченні комплементарної РНК-мішені і РНКази Н початкова швидкість реакції РНКази Н, виміряна в пмоль/л/хв, складає щонайменше 2095, наприклад, щонайменше 4095, наприклад, щонайменше 6095, наприклад, щонайменше 8095 від початкової швидкості реакції при використанні тільки ДНК-олігонуклеотиду без 2'-заміщень з фосфоротіоатними зв'язуючими групами між усіма мономерами в олігонуклеотиді, використовуючи методологію, запропоновану в прикладах 91-95 ЕР 1222309.
У характерному випадку ділянка олігомеру, яка формує послідовні нуклеотидні ланки, які при формуванні в дуплекс з комплементарною РНК-мішенню здатні до рекрутингу РНКази, складається з нуклеотидних ланок, які формують ДНК/РНК-подібний дуплекс з РНК-мішенню.
Олігомер за винаходом, такий як перша ділянка, може містити нуклеотидну послідовність, що містить і нуклеотиди, і аналоги нуклеотидів, і можуть набувати форми, наприклад, гепмера.
Зо Конструкція гепмера
У деяких втіленнях винаходу олігомер за винаходом, такий як перша ділянка, містить або являє собою гепмер. Гепмерний олігомер є олігомером, що містить безперервний відрізок з нуклеотидів, здатний до рекрутингу РНКази, такий як РНКаза Н, наприклад, ділянка з щонайменше 6 або 7 ДНК-нуклеотидів, на який в цьому документі посилаються як на ділянку (У), де ділянка У фланкована з 5' і 3' кінців ділянками з аналогів нуклеотидів, що посилюють спорідненість, наприклад, 1-6 аналогів нуклеотидів в 5'і 3' напрямі до безперервного відрізку нуклеотидів, здатних до рекрутингу РНКази, де на ці ділянки посилаються як на ділянки Х'(Х) і 2 (2) відповідно. Ділянки Х'і 2" можуть бути також позначені терміном "сегменти-крила" гепмера. Гепмерні ділянки розкриті в документах МО 2004/046160, УМО 2008/113832 і УМО 2007/146511.
У деяких втіленнях винаходу мономери, здатні до рекрутингу РНКази, вибрані з групи, що складається з мономерів ДНК, мономерів альфа-Ї -ЗНК, С4"-алкілованих мономерів ДНК (див. документи РСТ/ЕР2009/050349 і Мезієг єї аї., Віоогд. Мед. Спет. Гей. 18 (2008) 2296-2300, включені в цей документ за допомогою посилання) і нуклеотидів незамкненої нуклеїнової кислоти (ОМА; ипійпКей писівїс асій) (див. статтю РБіийег еї аї., Мої. Віозувзі., 2009, 10, 1039, включену в цей документ за допомогою посилання). ОМА є незамкненою нуклеїновою кислотою, де, як правило, С-С зв'язок С2-С3 рибози видалений з утворенням незамкнутого залишку "цукру". Переважно гепмер містить (полі)нуклеотидну послідовність формули (5'- 3) Х- У- 2, де ділянка Х (Х) (5 ділянка) складається з щонайменше одного або містить щонайменше один аналог нуклеотиду, наприклад, щонайменше одна ланка ЗНК, наприклад, від 1-6 аналогів нуклеотидів, таких як ланки ЗНК, і ділянка У" (У) складається з щонайменше чотирьох або містить щонайменше чотири або щонайменше п'ять послідовних нуклеотидів, здатних до рекрутингу РНКази (при формуванні в дуплекс з комплеменарною молекулою РНК, такою як
МРНК-мішень), таких як нуклеотиди ДНК, і ділянка 2 (2) (3' ділянка) складається з щонайменше одного або містить щонайменше один аналог нуклеотиду, наприклад, щонайменше одна ланка
ЗНК, наприклад, від 1-6 аналогів нуклеотидів, таких як ланки ЗНК.
У деяких втіленнях винаходу ділянка Х' складається з 1, 2, 3, 4, 5 або 6 аналогів нуклеотидів, таких як ланки ЗНК, наприклад, від 2-5 аналогів нуклеотидів, таких як 2-5 ланок ЗНК, наприклад,
З або 4 аналоги нуклеотидів, таких як З або 4 ланки ЗНК; та/або ділянка 2 складається з 1, 2, 3,
4, 5 або 6 аналогів нуклеотидів, таких як ланки ЗНК, наприклад, від 2-5 аналогів нуклеотидів, таких як 2-5 ланок ЗНК, наприклад, З або 4 аналоги нуклеотидів, таких як З або 4 ланки ЗНК.
У деяких втіленнях винаходу У" складається з або містить 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 послідовних нуклеотидів, здатних до рекрутингу РНКази, або від 4-12, або від 6-10, або від 7-9, наприклад, 8 послідовних нуклеотидів, здатних до рекрутингу РНКази. У деяких втіленнях винаходу ділянка У складається з щонайменше одної або містить щонайменше одну нуклеотидну ланку ДНК, наприклад, 1-12 ланок ДНК, переважно від 4-12 ланок ДНК, прийнятніше від 6-10 ланок ДНК, наприклад, від 7-10 ланок ДНК, прийнятніше 8, 9 або 10 ланок
ДНК.
У деяких втіленнях винаходу ділянка Х' складається з З або 4 або містить З або 4 аналоги нуклеотидів, таких як ЗНК, ділянка Х' складається з 7, 8, 9 або 10 ланок ДНК, їі ділянка 7 складається з З або 4 аналогів нуклеотидів, таких як ЗНК. Такі конструкції включають (Х'- У- 2 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, А-7-3. У переважному втіленні винаходу гепмер являє собою гепмер 3-9-4, навіть прийнятніше гепмер являє собою гепмер 3-10-3.
Додаткові гепмерні конструкції розкриті в документі УМО 2004/046160, включеному в цей документ за допомогою посилання. МО 2008/113832, яка просить пріоритет відносно попередньої заявки 5 60/977,409, включена в цей документ за допомогою посилання, відноситься до "короткомірних гепмерних олігомерів. У деяких втіленнях винаходу олігомери, представлені в цьому документі, можуть бути такими короткомірними гепмерами.
У деяких втіленнях винаходу олігомер, наприклад, ділянка Х", складається з безперервної нуклеотидної послідовності з сумарно 10, 11, 12, 13 або 14 нуклеотидних ланок, де безперервна нуклеотидна послідовність включає або має формулу (5- 3) Х- У- 7, де: Х' складається з 1, 2 або 3 ланок аналогів нуклеотидів, таких як ланки ЗНК; У" складається з 7, 8 або 9 суміжних нуклеотидних ланок, здатних до рекрутингу РНКази при формуванні в дуплекс з комплементарною молекулою РНК (такою як мРНК-мішень); і 2" складається з 1, 2 або 3 аналогів нуклеотидів, таких як ланки ЗНК.
У деяких втіленнях винаходу Х' складається з 1 ланки ЗНК. У деяких втіленнях винаходу Х' складається з 2 ланок ЗНК. У деяких втіленнях винаходу Х' складається з З ланок ЗНК. У деяких втіленнях винаходу 2" складається з 1 ланки ЗНК. У деяких втіленнях винаходу 2 складається з 2 ланок ЗНК. У деяких втіленнях винаходу 2" складається з З ланок ЗНК. У деяких втіленнях винаходу У" складається з 7 нуклеотидних ланок. У деяких втіленнях винаходу У складається з 8 нуклеотидних ланок. У деяких втіленнях винаходу У" складається з 9 нуклеотидних ланок. У деяких втіленнях винаходу ділянка У складається з 10 нуклеозидних мономерів. У деяких втіленнях винаходу У" складається з 1-10 або містить 1-10 мономерів ДНК. У деяких втіленнях винаходу У" містить від 1-9 ланок ДНК, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або 9 ланок ДНК. У деяких втіленнях винаходу У складається з ланок ДНК. У деяких втіленнях винаходу У містить щонайменше одну ланку ЗНК, що знаходиться в альфа-! -конфігурації, наприклад, 2, 3,4,5,6, 7, 8 або 9 ланок ЗНК в альфа-Ї! -конфігурації. У деяких втіленнях винаходу У" містить щонайменше одну ланку альфа-Ї -окси-ЗНК, або де всі ланки ЗНК в альфа- І -конфігурації є ланками альфач-і - окси-ЗНК. У деяких втіленнях винаходу число нуклеотидів, присутніх в Х'- У"- 7, вибране з групи, що складається з (ланки аналогів нуклеотидів - ділянка У" - ланки аналогів нуклеотидів): 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, або; 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9- 3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-4, або; 1-10-1, 1-10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 2-10-3, 3-10-2.
У деяких втіленнях винаходу число нуклеотидів в Х'"- У"- 2" вибране з групи, що складається 3: 2- 7-1,1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4 і 4-7-3. У деяких втіленнях винаходу кожна з ділянок Х і
У складається з трьох мономерів ЗНК, і ділянка У" складається з 8, або 9, або 10 нуклеозидних мономерів, переважно мономерів ДНК. У деяких втіленнях винаходу обоє з Х' і 2" складаються з двох ланок ЗНК кожен, і У" складається з 8 або 9 нуклеотидних ланок, переважно ДНК ланок. У різних втіленнях винаходу інші гепмерні конструкції включають конструкції, де ділянки Х' та/або 2 складаються з 3, 4, 5 або 6 аналогів нуклеозидів, таких як мономери, що містять цукор 2-0- метоксиетил-рибозу (2'-МОЕ), або мономери, що містять цукор 2- фтор-дезоксирибозу, і ділянка У" складається з 8, 9, 10, 11 або 12 нуклеозидів, таких як мономери ДНК, де ділянки Х'-
У- 2 мають 3-9-3, 3-10-3, 5-10-5 або 4-12-4 мономерів. Додаткові гепмерні конструкції розкриті в документі УМО 2007/146511А2, включеному в цей документ за допомогою посилання.
Гепмери ЗНК: гепмер ЗНК є гепмерним олігомером (ділянка А), що містить щонайменше один нуклеотид ЗНК. 5ЕО ІО МО 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 і 40 є гепмерними олігомерами ЗНК.
Олігомери з безперервною послідовністю з 10-16 нуклеотидів, яка комплементарна відповідному відрізку довжини ЗЕО ІЮО МО 33 або 34 або 45, можуть також бути гепмерними бо олігомерами, такими як гепмери ЗНК.
Міжнуклеотидні зв'язки
Нуклеозидні мономери олігомерів (наприклад, перша і друга ділянки), описані в цьому документі, з'єднують разом за допомогою міжнуклеозидних зв'язуючих груп. Доцільно кожен мономер зв'язують з 3- примикаючими мономерами за допомогою зв'язуючої групи.
Звичайному фахівцеві в цій області техніки повинно бути зрозуміло, що в контексті даного винаходу 5'-мономер на кінці олігомеру не утримує 5'-зв'язуючу групу, хоча він може містити або не містити 5'-кінцеву групу або зв'язуючу групу для кон'югації.
Терміни "зв'язуюча група" або "міжнуклеозидний зв'язок" призначені для позначення групи, здатної до ковалентного зв'язування разом двох нуклеотидів. Конкретні і переважні приклади включають фосфатні групи і фосфоротіоатні групи. Міжнуклеозидний зв'язок можна використовувати взаємозамінно з міжнуклеотидним зв'язком.
Нуклеотиди олігомеру за винаходом або його безперервну нуклеотидную послідовність сполучають разом за допомогою зв'язуючих груп. Доцільно кожен нуклеотид зв'язують з 3'- примикаючими нуклеотидами за допомогою зв'язуючої групи.
Відповідні міжнуклеотидні зв'язки включають зв'язки, перераховані в межах об'єму УМО 2007/031091, наприклад, міжнуклеотидні зв'язки, перераховані в першому параграфі сторінки 34 документи МО 2007/031091 (включеного в цей документ за допомогою посилання). У деяких втіленнях винаходу, де вони є зв'язками, що відрізняються від фосфодіефірного зв'язку (зв'язків) ділянки В (де вона присутня), переважно модифікувати міжнуклеотидний зв'язок з її нормального фосфодіефіру з одержанням зв'язку, стійкішого до дії нуклеаз, такого як фосфоротіоат або боранофосфат, де ці два зв'язки здатні розщеплюватися РНКазою Н, що також дає можливість антисмислового інгібування при зниженні експресії гена-мішені.
У деяких втіленнях винаходу олігомер за даним винаходом містить один або більше нуклеозидних зв'язків, вибраних з групи, що складається 3 фосфоротіоатного, фосфородитіоатного і боранофосфатного зв'язків.
Переважними можуть бути міжнуклеотидні зв'язки, які запропоновані в цьому документі, що містять сірку (5), такі як фосфоротіоат або фосфородитіоат. Фосфоротіоатні міжнуклеотидні зв'язки також переважні, зокрема, для першої ділянки, наприклад, в гепмерах, міксмерах, антимирних олігомерах, що перемикають сплайсинрг, і тоталмерах.
Зо Термін "міксмер" відноситься до олігомерів, що містять як такі, що зустрічаються в природі, нуклеотиди, і такі, що не зустрічаються в природі, де, в протилежність гепмерам, тейлмерам і хедмерам, відсутня безперервна послідовність із понад 5, а в деяких втіленнях винаходу не більше ніж 4 послідовних, наприклад, не більше трьох послідовних нуклеотидів, що зустрічаються в природі, таких як ланки ДНК.
Термін "тоталмер" відноситься до однониткового олігомеру, який містить тільки такі, що не зустрічаються в природі нуклеозиди, такі як аналоги нуклеозидів з модифікованим цукром.
Для гепмерів міжнуклеотидні зв'язки в олігомері можуть бути, наприклад, фосфоротіоатним або боранофосфатним, щоб дати можливість розщеплювання РНК-мішені РНКазою Н.
Фосфоротіоат переважний для поліпшеної стійкості до нуклеаз і з інших причин, таким як простота одержання.
В одному аспекті, за винятком фосфодіефірного зв'язку між першою і другою ділянкою і необов'язково усередині ділянки В, інші міжнуклеотидні зв'язки олігомеру за винаходом, нуклеотиди та/або аналоги нуклеотидів зв'язані один з одним за допомогою фосфоротіоатних груп. У деяких втіленнях винаходу щонайменше 5095, наприклад, щонайменше 7095, наприклад, щонайменше 8095, наприклад, щонайменше 9095, наприклад, усі міжнуклеозидні зв'язки між нуклеозидами в першій ділянці відрізняються від фосфодіефіру (фосфату), наприклад, вибрані з групи, що складається з фосфоротіоатної, фосфородитіоатної або боранофосфатної. У деяких втіленнях винаходу щонайменше 5095, наприклад, щонайменше 7095, наприклад, щонайменше 8095, наприклад, щонайменше 9095, наприклад, усі міжнуклеозидні зв'язки між нуклеозидами в першій ділянці є фосфоротіоатом.
МО 09124238 відноситься до олігомерних сполук, що мають щонайменше один біциклічний нуклеозид, приєднаний до 3' або 5' кінця за допомогою нейтрального міжнуклеозидного зв'язку.
Олігомери за винаходом можуть, таким чином, мати щонайменше один біциклічний нуклеозид, приєднаний до 3' або 5' кінця нейтральним міжнуклеозидним зв'язком, таким як один або більше фосфотриефір, метилфосфонат, ММІ, амід-3, формацеталь або тіоформацеталь. Інші зв'язки можуть бути фосфоротіоатом.
Кон'югати олігомерів (ділянка С)
Наступний аспект винаходу являє собою кон'югат антисмислового олігонуклеотиду, олігомер, що містить, за винаходом і щонайменше одне ненуклеотидне або неполінуклеотидне бо угрупування (С), ковалентно приєднане до олігомеру (А), необов'язково за допомогою лінкерної ділянки, розташованої між безперервною послідовністю олігомеру і кон'югатним угрупуванням (В та/або хХ).
Репрезентативні кон'югатні угрупування, які використані з олігонуклеотидами, можуть включати ліпофільні молекули (ароматичні і неароматичні), включаючи стероїдні молекули; білки (наприклад, антитіла, ферменти, сироваткові білки); пептиди; вітаміни (водорозчинні або жиророзчинні); полімери (водорозчинні або жиророзчинні); малі молекули, що включають лікарські засоби, токсини, молекули-репортери і ліганди рецепторів; вуглеводні комплекси; комплекси, що розщеплюють нуклеїнові кислоти; хелатори металів (наприклад, порфірини, тексафірини, краун-ефіри і т.д.); інтеркалятори, включаючи гібридні фотонуклеази/нтеркалятори; зшиваючі агенти (наприклад, фотоактивні, окисно-відновно- активні) та їх комбінації і похідні. Різні відповідні кон'югатні угрупування, їх одержання і зв'язок з олігомерними сполуками запропоновані, наприклад, в М/О 93/07883 і в патенті 5 Мо 6,395,492, причому кожен з документів повністю включений в цей документ за допомогою посилання.
Кон'югати олігонуклеотидів та їх синтези також описані у вичерпних оглядах Мапопйагап,
Апіізепзе Огид Тесппоіоду, Ргіпсірієв5, Бігаіедієв, апа Арріїсайопв, 5.Т. СтоокКе, єд., Сн. 16, Магсеї
ОеккКег, Іпс., 2001, ії Мапопагап, Апіїзепхе апа Мисівїс Асій Огид ЮОемеІортепі, 2002, 12, 103, кожен з яких повністю включений в цей документ за допомогою посилання.
У деяких втіленнях винаходу олігомер за винаходом направлений на печінку, тобто після системного введення сполуки накопичується в клітинах печінки (таких як гепатоцити). Напрямок на печінку можна значно посилити шляхом приєднання кон'югатного угрупування (С). Проте з метою одержання максимальної ефективності олігомеру часто бажано, щоб кон'югатне (або напрямне угрупування) було пов'язано з олігомером за допомогою біорозщеплюваного лінкера (В), такого як нуклеотидфосфатний лінкер. Таким чином, бажано використовувати кон'югатне угрупування, що посилює захоплення і активність в гепатоцитах. Посилення активності може бути наслідком посиленого захоплення, або може бути наслідком посиленої ефективності сполуки в гепатоцитах.
У деяких втіленнях винаходу олігомерна сполука є олігомером ЗНК, таким як гепмер, або, наприклад, антисмисловий олігомер ЗНК (на який в цьому документі можуть посилатися як на ділянку А), що містить антисмисловий олігомер, необов'язково біорозщеплюваний лінкер, такий
Зо як ділянка В, і вуглеводний кон'югат (на який можуть посилатися як на ділянку С).
Антисмисловий олігомер ЗНК може складати 7-30, наприклад, 8-26 нуклеозидів в довжину, і він містить щонайменше одну ланку (нуклеозид) ЗНК.
У деяких втіленнях винаходу кон'югат являє собою або може містити вуглевод, або містить вуглеводну групу. У деяких втіленнях винаходу вуглевод вибраний з групи, що складається з галактози, лактози, н-ацетилгалактозаміну, манози і манозо-б6-фосфату. У деяких втіленнях винаходу кон'югатна група являє собою або може містити манозу або манозо-6-фосфат.
Вуглеводні кон'югати можна застосовувати для посилення доставлення або активності у ряді тканин, таких як печінка та/або м'язи. Див., наприклад, ЕР 1495769, УМО 99/65925, Мапод еї аї.,
Віосопіцщд Спет (2009) 20(2): 213-21, 7аїверіп 6. ОгеїзКауа Спет Віодімегв. (2004) 1(10): 1401-17.
У деяких втіленнях винаходу вуглеводне угрупування є нелінійним вуглеводним полімером.
У деяких втіленнях винаходу олігомерна сполука є олігомером ЗНК, наприклад, антисмисловим олігомером ЗНК (на який в цьому документі можуть посилатися як на ділянку А), що містить антисмисловий олігомер, ділянку В, як визначено в цьому документі, і кон'югатне угрупування, направлене на рецептор асіалоглікопротеїну, таке як угрупування сзаМАс (на яке можуть посилатися як на ділянку С). Вуглеводне угрупування може бути мультивалентним, як, наприклад, 2, 3, 4 або 4 ідентичних або неідентичних вуглеводних угрупування можуть бути ковалентно сполучені з олігомером, необов'язково за допомогою лінкера або лінкерів (таких як ділянка У).
Кон'югатні угрупування саіМмАс
У деяких втіленнях винаходу вуглеводне угрупування є нелінійним вуглеводним полімером.
Вуглеводне угрупування може бути, проте, мультивалентним, як, наприклад, 2, 3, 4 або 4 ідентичних або неідентичних вуглеводних угрупування можуть бути ковалентно зв'язані з олігомером, необов'язково за допомогою лінкера або лінкерів. У деяких втіленнях у винаході запропонований кон'югат, олігомер за винаходом, що містить, і вуглеводне кон'югатне угрупування. У деяких втіленнях у винаході запропонований кон'югат, олігомер за винаходом, що містить, і кон'югатне угрупування, направлене на угрупування рецептора асіалоглікопротеїну, таке як угрупування СЗаіМАс, яке може формувати частину додаткової ділянки (на яке посилаються як на ділянку С).
У винаході також запропоновані антисмислові олігонуклеотиди ЗНК, кон'юговані з бо угрупуванням, направленим на рецептор асіалоглікопротеїну. У деяких втіленнях винаходу кон'югатне угрупування (таке як третя ділянка або ділянка С) містить угрупування, направлене на рецептор асіалоглікопротеїну, таке як галактоза, галактозамін, М-форміл-галактозамін, М- ацетилгалактозамін, М-пропіоніл-галактозамін, М-н-бутаноїл-галактозамін і М- ізобутаноїлгалактозамін. У деяких втіленнях винаходу кон'югат містить галактозний кластер, такий як тример М-ацетилгалактозаміну. У деяких втіленнях винаходу кон'югатне угрупування містить саїіМАс (М-ацетилгалактозамін), такий як моновалентний, двовалентний, тривалентний або чотиривалентний сСаіМАс. Тривалентні кон'югати (сзамАс можна застосовувати для направлення сполуки в печінку. Кон'югати (замАс використані з метилфосфонатом і антисмисловими олігонуклеотидами пептидної нуклеїнової кислоти (ПНК) (наприклад, 05 5,994517 і Наподеїапа еї аї!., Віосопіцд Спет. 1995 Мом - ЮОес;6(6):695- 701) і вІРНК (наприклад,
УМО 2009/126933, МО 2012/089352 і МО 2012/083046). Посилання на СаїІМАс і на конкретні кон'югати, використовувані там, включені в цей документ за допомогою посилання. У УМО 2012/083046 розкриті 5іРНК з кон'югатними угрупуваннями саіМАс, що містять розщеплювані фармакокінетичні модулятори, які підходять для застосування в даному винаході, де переважні фармакокінетичні модулятори є С16 гідрофобними групами, такими як пальмітоїл, гексадец-8- еноїл, олеїл, (9Е,12Е)-октадека-9,12-діеноїл, діоктаноїл і С16-С20 ацил. Розщеплювані фармакокінетичні модулятори "046 можуть також бути холестерином.
Направляючі угрупування (кон'югатні угрупування) можуть бути вибрані з групи, що складається з: галактози, галактозаміну, М-форміл-галактозаміну, М-ацетилгалактозаміну, М- пропіонілгалактозаміну, М-н-бутаноїл-галактозаміну, М-ізобутаноїлгалактозаміну, галактозного кластера і тримера М-ацетилгалактозаміну, і можуть мати фармакокінетичний модулятор, вибраний з групи, що складається з: гідрофобної групи, що має 16 або більше атомів вуглецю, гідрофобної групи, що має 16-20 атомів вуглецю, пальмітоїлу, гексадец-8-еноїлу, олеїлу, (9Е,12Е)-октадека-9,12-діеноїлу, діоктаноїлу, С16-С20 ацилу і холестерину. Деякі кластери саіМмАс, розкриті в "046, включають: (Е)-гексадец-в-еноїлу (С16), олеїлу (С18), (9Е,12Е)- октадека-9,12-діеноїлу (С18), октаноїлу (С8), додеканоїлу (С12), С-20 ацилу, С24 ацилу, діоктаноїлу (2хС8). Направне угрупування - направне угрупування фармакокінетичного модулятора може бути пов'язане з полінуклеотидом за допомогою фізіологічно лабільного зв'язку, або, наприклад, дисульфідного зв'язку, або поліетиленгліколевого (ПЕГ) лінкера.
Зо Винахід також відноситься до застосування фосфодіефірних лінкерів між олігомером і кон'югатной групою (у цьому документі на них посилаються як на ділянку В, і доцільно вони розташовані між олігомером ЗНК і вуглеводною кон'югатною групою).
Для направлення на гепатоцити в печінці переважний направляючий ліганд є галактозним кластером.
Галактозний кластер містить молекулу, яка має, наприклад, таку, що містить від двох до чотирьох кінцевих похідних галактози. При використанні в цьому документі термін "похідна галактози" включає і галактозу, і похідні галактози, що мають спорідненість до рецептора асіалоглікопротеїну, рівну або більшу, ніж спорідненість галактози. Кінцева похідна галактози приєднана до молекули за допомогою її С-1 атома вуглецю. Рецептор асіалоглікопротеїну (АБОРІ) експресується, в основному, на гепатоцитах і зв'язує розгалужені глікопротеїни з кінцевою галактозою. Переважний галактозний кластер має три кінцевих галактозаміни або похідні галактозаміну, кожна з яких має спорідненість до рецептора асіалоглікопротеїну.
Прийнятніший галактозний кластер має три кінцевих М-ацетил-галактозаміну. Інші терміни, загальноприйняті в цій області техніки, включають трьохантенну галактозу, тривалентну галактозу і тример галактози. Відомо, що кластери трьохантенної похідної галактози зв'язуються з АБОРІ з більшою спорідненістю, ніж похідна галактози, такою, що має двохантенну і одноантенну структуру (Ваепгідег апа Рієїє, 1980, СеїІ, 22, 611-620; СоппоїПу єї а)ї., 19821. Віо!.
Спет., 257,939-945). Для досягнення нМ спорідненості потрібна мультивалентність. Згідно МО 2012/083046 приєднання одної похідної галактози, що має спорідненість до рецептора асіалоглікопротеїну не забезпечує функціональне доставлення полінуклеотиду РНКі в гепатоцити іп мімо при спільному введенні з полімером доставлення.
Галактозний кластер може містити дві або переважно три похідні галактози, кожна з яких пов'язана з центральною точкою розгалуження. Похідні галактози приєднані до центральної точки розгалуження за допомогою С-1 атомів вуглецю сахаридів. Похідна галактози переважно пов'язана з точкою розгалуження за допомогою лінкера або спейсера. Переважний спейсер є гнучким гідрофільним спейсером (патент 5 5885968; Віеззеп еї аї!. У. Мей. Спегп. 1995 Мої. 39 р. 1538-1546). Переважний гнучкий гідрофільний спейсер є ПЕГ спейсером. Переважний ПЕГ спейсер є ПЕГЗ спейсером. Точка розгалуження може бути будь-якою малою молекулою, яка дає можливість приєднання трьох похідних галактози і додатково дає можливість приєднання 60 точки розгалуження до олігомеру. Ілюстративною групою точки розгалуження є ди-лізин.
Молекула ди-лізину містить три групи амінів, за допомогою яких можуть бути приєднані три похідних галактози і карбоксильна реакційна група, за допомогою якої ди-лізин може бути приєднаний до олігомеру. Приєднання точки розгалуження до олігомеру може відбуватися за допомогою лінкера або спейсера. Переважний спейсер є гнучким гідрофільним спейсером.
Переважний гнучкий гідрофільний спейсер є ПЕГ спейсером. Переважний ПЕГ спейсер є ПЕГЗ спейсером (три етиленові ланки). Галактозний кластер може бути приєднаний до 3' або 5' кінця олігомеру з використанням способів, відомих в цій області техніки.
Переважна похідна галактози є М-ацетил-галактозаміном (саїІМАс). Інші сахариди, що мають спорідненість до рецептора асіалоглікопротеїну, можуть бути вибрані з переліку, що містить: галактозамін, М-н-бутаноїлгалактозамін і М-ізо-бутаноїлгалактозамін. Значення спорідненості різних похідних галактози до рецептора асіалоглікопротеїну вивчено (див., наприклад: Чорвбї, 5.Т. апа Огіскатег, К.ОВ.С. 1996, 271, 6686) або легко визначається з використанням способів, характерних в цій області техніки.
Одне втілення галактозного кластера ан
Її
Ноя
З я ех наб Усе Що на Му ху м дн їх ге -й й ЕЙ нано Ї о
Й се є М хек В ниж шк и з Й за Бу У
З я з і: їх г хе ночі зе я т хх ще Кк х ви ший,
Б й г
Одне вубуеня туману со кисетерах ще ру Метр В, щ й Я їм й дич
Б. ї во ї хто рухому тату ї ? не фоетанфт ов
Щ ж В
І ї 7 де З х дей шко ШЕУ с: КЗ
НК федри рев І
МЕ М
Ме
Галактозний кластер з ПЕГ спейсером між точкою розгалуження і нуклеїновою кислотою
Додаткові приклади кон'югата за винаходом проілюстровані нижче:
А, а нич ни не и чо Ї вже і: пе в ко і і і ї я
Со і: й , ? в ше;
Н я НІ ве Ко ИЙ не отит мать 1 з йешек я ак А І і Пенн
Ї « Не Днтисмисловий опігомуюлестеа НК
ІД ; Н і
КУ п ан ан ак й очи, йняе Х
ВВ у ши зе Ї Я угрупування (
Ки хе 2 Ех Й Ї. ї ве Долота ур ке : М с - 5 Е й ой ее ве і: а. ккд конячку кдкункна яку дня
Й Ї я НКж тис мний ОЛІКОНуклеетя ЯН ще М. оедечий ритодет о ний во 1 що и р йо че
Бже і. '" у МШодатвовий хензютни покори тоди ори кни Й ше гу ру ій є В і АНТМОМНоЛЮВИИ пло
Ше е а й | с і ж т ру ни кр с йнае
ПИВ Ко о В у вв шин ОпИОНуклЕОТИА ЯК он он чат шшшшшк; ; аку са С :
І ох Ши В нак ни й Н охе-ено ен денМ о в Енн є і: Ку х он г де і 4
Жещог В хатні ери | ге М
Бан ща й її
НО рем ев м я денв й б а ьо
Е рин з Же а: г й Кос ох прі В фо ж ме з -
Не рлитькту Н дЕНЯ Я
При використанні в описаних вище кон'югатах кластера саіМАс гідрофобне або ліпофільне (або додаткове кон'югатне) угрупування (тобто фармакокінетичні модулятори) є необов'язковим при використанні олігомерів ЗНК, таких як антисмислові олігонуклеотиди ЗНК.
На фігурах показані конкретні кластери СсСаїЇІМАс, використовувані в даному дослідженні, Соп 1,2, 3, 4 і Соп/та, 2а, За і 4а (які показані з необов'язковим лінкером Сб, що з'єднує кластер саїІМАс в олігомері).
У переважному втіленні винаходу кон'югатне угрупування кон'югата антисмислового олігонуклеотиду містить або складається з Сопі 1, 2, 3, 4 і Соп/1а, 2а, За і 4а. Найприйнятніше кон'югатне угрупування містить або складається з Сопі| 2а.
В іншому переважному втіленні винаходу кон'югат антисмислового олігонуклеотиду вибраний з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 і 24.
Кожне вуглеводне угрупування кластера саіМАс (наприклад, СаіМАс) може бути, таким чином, сполучене з олігомером за допомогою спейсера, такого як (полі)етиленгліколевий (ПЕГ) лінкер, такий як ди-, три-, тетра-, пента-, гексаетиленгліколевий лінкер. Як показано вище, ПЕГ угрупування формує спейсер між галактозним цукровим угрупуванням і пептидним (показаний трилізин) лінкером.
У деяких втіленнях винаходу кластер сафмМАс містить пептидний лінкер, наприклад, трипептид Туг-Азр(Азр) або дипептид Азр(Азхр), який приєднаний до олігомеру (або до ділянки У або ділянки В) за допомогою бірадикального лінкера, наприклад, кластера саіІМАс, який може містити наступні бірадикальні лінкери: ні сн во то, ке
НО НК поети вв, З ре о
С ІФ во ЯМ в З і що ОН щем З
Ще (чик: г Оу ї, а бо не цщ в аз АКА кр
КЕ оинитних ЯК но намодюв олив
Бнае г. м нм и я почне «Мн й г пк 7 Ве
В' позначає бірадикал, переважно вибраний з -С2На-, -СзНе-, -СаНв-, -С5Ніо-, -СеНіг-, 1,4- циклогексилу (-СвН:о-), 1,4-фенілу (-СвеНа-), -С2НаОСегНа-, -СаНаОС2На)2- або -С2НаОСегНа)з-,
Фс(оОсСНне-, -ФК(0)С2НА-, -С(0)ОзНе-, -С(О)СаНв-, -С(О)С5Ніо-, -С(О)СевНі2г-, 1,4-циклогексилу (-
С(О)СвНіо-), 1,4-фенілу (-(0)СеНа-), -С(0)С2НаОС2На-, -Ф(0)С2На(ОС2На)»- або -
Ф(0СНаОС»На)з-.
В деяких втіленнях винаходу К!' позначає бірадикал, переважно вибраний з -С2На-, -СзіНе-, - баНв-, -Сб5Ніо-, -СвНіг-, 1,4-циклогексилу (-СвНіо-), 1,4-фенілу (-СвНа-), -С2НАаОСоНаА, -
СгнЯОСс»НаІ)26- або -С2НаОСег На) з-.
Вуглеводний кон'югат (наприклад, (замМмАс) або вуглеводне лінкерне угрупування
Зо (наприклад, угрупування вуглевод-ПЕГ) можуть бути ковалентно сполучені (зв'язані) з олігомером за допомогою групи точки розгалуження, таким як амінокислота або пептид, який доцільно містить дві або більше амінних груп (наприклад, 3, 4 або 5), таких як лізин, ди-лізин, або три-лізин або тетра-лізин. Молекула три-лізину містить чотири групи амінів, за допомогою яких можуть бути приєднані три вуглеводні кон'югатні групи, такі як похідні галактози (наприклад, СсаіМАс), і додатковий кон'югат, такий як гідрофобне або ліпофильне угрупування/група, і карбоксильну реакційну групу, за допомогою якої три-лізин може бути приєднаний до олігомеру. Додатковий кон'югат, такий як ліпофильне/гідрофобне угрупування, може бути приєднаний до залишку лізину, приєднаного до олігомеру.
Фармакокінетичні модулятори
Сполука за винаходом може додатково містити одне або більше додаткових кон'югатних угрупувань, з яких особливий інтерес представляють ліпофильні або гідрофобні угрупування, наприклад, коли кон'югатна група є вуглеводним угрупуванням. Такі ліпофильні або гідрофобні угрупування можуть діяти як фармакокінетичні модулятори і можуть бути ковалентно зв'язані або з вуглеводним кон'югатом, або з лінкером, що зв'язує вуглеводний кон'югат з олігомером, або з лінкером, що зв'язує множинні вуглеводні кон'югати (мультивалентні кон'югати), або з олігомером, необов'язково за допомогою лінкера, такого як біорозщеплюваний лінкер.
Таким чином, олігомер або кон'югатне угрупування можуть, таким чином, містити фармакокінетичний модулятор, такий як ліпофільні або гідрофобні угрупування. Такі угрупування розкриті в контексті кон'югатів БіРНК в УМО 2012/082046. Гідрофобне угрупування може містити С8-С3б жирну кислоту, яка може бути насиченою або ненасиченою. У деяких втіленнях винаходу можна використовувати С10, С12, С14, С16, С18, 220, 022, С24, С26, С28,
Сс30, 32 і С34. Гідрофобна група може мати 16 або більше атомів вуглецю. Ілюстративні відповідні гідрофобні групи можуть бути вибрані з групи, що містить: стерин, холестерин, пальмітоїл, гексадек-8-еноїл, олеїл, (9Е,12Е)-октадека-9,12-діеноїл, діоктаноїл і С16 С20 ацил.
Згідно УМО'346 гідрофобних груп, що мають менше 16 атомів вуглецю, менш ефективні при посиленні спрямованості полінуклеотиду, але їх можна використовувати в безлічі копій (наприклад, 2х, наприклад, 2х С8 або С10, С12 або С14) для посилення ефективності.
Фармакокінетичні модулятори, корисні як угрупування, що направляють полінуклеотид, можуть бути вибрані з групи, що складається з: холестерину, алкільної групи, алкенільної групи, алкінільної групи, арильної групи, аралкільної групи, аралкенільної групи і аралкінільної групи, кожна з яких може бути нормальною, розгалуженою або циклічною. Фармакокінетичні модулятори переважно є вуглеводнями, що містять тільки атоми вуглецю і водню. Проте можуть бути допустимі заміщення або гетероатоми, що зберігають гідрофобність, наприклад, атом фтору.
Ліпофільні кон'югати
У деяких втіленнях винаходу кон'югатна група є або може містити ліпофільне угрупування, таке як стерин (наприклад, холестерин, холестерил, холестанол, стигмастерин, холанову кислоту і ергостерин). У деяких втіленнях винаходу кон'югат являє собою або містить токоферол (прикладами є Сопі 6 і Соп) ба на Фіг. 2). У деяких втіленнях винаходу кон'югат являє собою або може містити холестерин (прикладами є Сопі 5 і Сопі 5а на фіг. 2).
У деяких втіленнях винаходу кон'югат являє собою або може містити ліпід, фосфоліпід або ліпофільний спирт, такий як катіонний ліпід, нейтральний ліпід, сфінголіпід, і жирну кислоту, таку як стеаринова, олеїнова, елаїдинова, лінолева, ліноленелаїдинова, ліноленова і міристинова кислота. У деяких втіленнях винаходу жирна кислота містить С4-С30 насичений або ненасичений алкільний ланцюг. Алкільний ланцюг може бути нормальним або розгалуженим.
Ліпофільні кон'югатні угрупування можна використовувати, наприклад, для вимірювання гідрофільної природи олігомерної сполуки і посилення проникнення в клітину.
Ліпофільні угрупування включають, наприклад, стерини, станоли і стероїди і споріднені сполуки, такі як холестерин (патент 5 Мо 4,958,013 і І еі5іпдег еї аї., Ргос. Маї!. Асайд. 5сі. ОБ5А, 1989, 86, 6553), тіохолестерин (Обегпаизег еї аїЇ, Мис! Асід5 Кевз., 1992, 20, 533), ланостерин, копростанол, стигмастерин, ергостерин, кальциферол, холева кислота, дезоксихолева кислота, естрон, естрадіол, естратриол, прогестерон, стильбестрол, тестостерон, андростерон, дезоксикортикостерон, кортізон, 17-гідроксикортикостерон, їх похідні і тому подібне. У деяких втіленнях винаходу кон'югат може бути вибраний з групи, що складається з холестерину, тіохолестерину, ланостерину, копростанолу, сигмастерину, ергостерину, кальциферолу, холевої кислоти, дезоксихолевої кислоти, естрону, естрадіолу, естратриолу, прогестерону, стильбестролу, тестостерону, андростерону, дезоксикортикостерону, кортизону і 17- гідроксикортикостерону. Інші ліпофільні кон'югатні угрупування включають аліфатичні групи, такі як, наприклад, прямоланцюгові, розгалужені і циклічні алкіли, алкеніли і алкініли. Аліфатичні групи можуть мати, наприклад від 5 до приблизно 50, від 6 до приблизно 50, від 8 до приблизно 50 або від 10 до приблизно 50 атомів вуглецю. Приклади аліфатичних груп включають ундецил, додецил, гексадецил, гептадецил, октадецил, нонадецил, терпени, борніл, адамантил, їх похідні і тому подібне. У деяких втіленнях винаходу один або більше атомів вуглецю в аліфатичній групі можуть бути заміщені гетероатомом, таким як О, 5 або М (наприклад, геранілоксигексил).
Додаткові відповідні ліпофільні кон'югатні угрупування включають аліфатичні похідні гліцерину, такі як алкілгліцерини, біс(алкіл)гліцерини, трис(алкіл) гліцерини, моногліцериди, дигліцериди і тригліцериди. У деяких втіленнях винаходу ліпофільний кон'югат є ди-гексилдецил-рац- гліцерином або 1,2-ди-О-гексилдецил-рац-гліцерином (Мапопйагап еї аї., Теїігапейдгоп Гек., 1995, 36, 3651; ЗПпеа, еї аїЇ., Мисі. Асій5 Кев5., 1990, 18, 3777) або їх фосфонатами. Насичені і ненасичені жирні функціональні групи, такі як, наприклад, жирні кислоти, жирні спирти, жирні складні ефіри і жирні аміни, можуть також служити як ліпофільні кон'югатні угрупування. У деяких втіленнях винаходу жирні функціональні групи можуть містити від приблизно 6 атомів вуглецю до приблизно 30 або від приблизно 8 до приблизно 22 атомів вуглецю. Приклади жирних кислот включають капринову, каприлову, лауринову, пальмітинову, міристинову, стеаринову, олеїнову, лінолеву, ліноленову, арахідонову, ейкозенову кислоти і тому подібне.
У додаткових втіленнях винаходу ліпофільні кон'югатні групи можуть бути поліциклічними ароматичними групами, що мають від 6 до приблизно 50, від 10 до приблизно 50 або від 14 до приблизно 40 атомів вуглецю. Ілюстративні поліциклічні ароматичні групи включають пірени, пурини, акридини, ксантини, флуорени, фенантрени, антрацени, хіноліни, ізохіноліни, бо нафталіни, їх похідні і тому подібне. Інші відповідні ліпофільні кон'югатні угрупування включають
Зо ментоли, тритили (наприклад, диметокситритил (ОМТ)), феноксазини, ліпоєву кислоту, фосфоліпіди, прості ефіри, тіоефіри (наприклад, гексил-5-тритилтіол), їх похідні і тому подібне.
Одержання ліпофільних кон'югатів олігомерних сполук широко описано в цій області техніки, наприклад, в статтях Заізоп-Вентоагаз єї аі, ЕМВО ., 1991, 10, 1111; Карапом єї а!., РЕВЗ І ей., 1990, 259, 327; Зміпагспик еї аї, Віоспітіє, 1993, 75, 49; Мівнга єї аї., Віоспіт. Віорнув. Асіа, 1995, 1264, 229 і Мапопагап еї аї., Техгапеагоп ГГ ей., 1995, 36, 3651.
Олігомерні сполуки, що містять кон'югатні угрупування, мають спорідненість до ліпопротеїну низької щільності (ЛІЛНЩ), можуть сприяти забезпеченню ефективної системи направленої доставки. Високі рівні експресії рецепторів ЛОНІЩ на пухлинних клітинах робить. ЛИНЩ привабливим носієм для селективного доставлення лікарських засобів в ці клітини (Киптр еї аї.,
Віосопіндаїє Спет., 1998, 9, 341; Рігевіопе, Віосопіпдаїє Спет., 1994, 5, 105; Мівнга, єї аї.,
Віоспіт. Віорпу5. Асіа, 1995, 1264, 229). Угрупування, що мають спорідненість до ЛІИНЩЦ, включають багато ліпофільних груп, таких як стероїди (наприклад, холестерин), жирні кислоти, їх похідні і комбінації У деяких втіленнях винаходу кон'югатні угрупування, що мають спорідненість до ЛІИПНЩ, можуть бути діолеїловими ефірами холевих кислот, таких як хенодезоксихолева кислота і литохолева кислота.
У деяких втіленнях винаходу ліпофільні кон'югати можуть бути або можуть включати біотин.
У деяких втіленнях винаходу ліпофільні кон'югати можуть бути або можуть містити гліцерид або складний ефір гліцериду.
Ліпофільні кон'югати, такі як стерини, станоли і станини, такі як холестерин або такі, як розкрито в цьому документі, можна використовувати для посилення доставлення олігонуклеотиду, наприклад, в печінку ("у характерному випадку в гепатоцити).
У переважному втіленні винаходу кон'югатне угрупування кон'югата антисмислового олігонуклеотиду містить або складається з Соп| 5, Ба, 6 або ба. Прийнятніше кон'югатне угрупування містить або складається з Сопі 5а.
В іншому переважному втіленні винаходу кон'югат антисмислового олігонуклеотиду вибраний з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 41, 42 і 43.
Приведені нижче посилання також відносяться до застосування ліпофільних кон'югатів:
Кобуїапека еї а!., Асіа Віоспіт Рої. (1999); 46(3): 679-91. ЕРеїІрег сеї аї,. Віотагїегіа!5 (2012) 33(25): 599-65); Спіамо єї а!., У Ога Снет (2010) 75(20): 6806-13. Кошакі єї а)І., Сит Мей Спет (2009) 16(35): 4728-42. Содеаиц єї а! 9). Мед. Спет. (2008) 51(15): 4374-6.
Лінкери (наприклад, ділянка В або ХУ)
Зв'язок або лінкер є сполукою між двома атомами, яка зв'язує одну потрібну хімічну групу або сегмент з іншою потрібною хімічною групою, або сегментом за допомогою одного або більше ковалентних зв'язків. Кон'югатні угрупування (або направляючі або блокуючі угрупування) можуть бути приєднані до олігомерної сполуки безпосередньо або за допомогою зв'язуючого угрупування (лінкерного або прив'язуючого), лінкера. Лінкери є біфункціональними угрупуваннями, що служать для ковалентного сполучення третьої ділянки, наприклад, кон'югатного угрупування, з олігомерною сполукою (наприклад, з ділянкою А). У деяких втіленнях винаходу лінкер містить ланцюгову структуру олігомеру з ланок, що повторюються, таких як етиленгліколеві або амінокислотні ланки. Лінкер може мати щонайменше дві функціональні групи, одну для приєднання до олігомерної сполуки, а іншу для приєднання до кон'югатного угрупування. Приклади функціональних груп лінкера можуть бути електрофільними для взаємодії з нуклеофильними групами на олігомері або кон'югатного угрупування або нуклеофільними для взаємодії з електрофільними групами. У деяких втіленнях винаходу функціональні групи лінкера включають аміно, гідроксил, карбонову кислоту, тіол, фосфорамідат, фосфоротіоат, фосфат, фосфіт, ненасичені зв'язки (наприклад, подвійні або потрійні зв'язки) і тому подібне. Деякі приклади лінкерів включають 8-аміно-3,6б-діоксаоктанову кислоту (АБО), сукцинимідил-4-(М-малеімідометил)циклогексан-І-карбоксилат (ЗМО), 6- аміногексанову кислоту (АНЕХ або АНА), б-аміногексилокси, 4-аміномасляну кислоту, 4- аміноциклогексилкарбонову кислоту, сукцинімідил-4-(М-малеімідометил)циклогексан-І-карбокси- (с5МСС), сукцинімідил-мета-малеімідо-бензоїлат (МВ5), сукцинімідил-М-е-малеїімідо- капроїлат (ЕМС5), сукцинімідил-6-(бета-малеімідо-пропіонамідо)гексаноат (5МРН), сукцинімідил-М-(а-малеіїмідоацетат) (АМА5), сукцинімідил-4-(пара-малеімідофеніл)бутират (ЗМРВ), бета-аланін (реїа-АГ А), фенілгліцин (РНО), 4-аміноциклогексанову кислоту (АСНС), бета-(циклопропіллуаланін (бета-СУРК), амінододеканову кислоту (АОС), алілендіоли, полієтиленгліколи, амінокислоти і тому подібне.
У цій області техніки відома широка різноманітність додаткових лінкерних груп, які можуть бути корисні при приєднанні кон'югатних угрупувань до олігомерних сполук. Огляд багатьох з бо корисних лінкерних груп можна знайти, наприклад, в кн. Апіїзепзе Кезеагсіп апа Арріїсайопв, 5.
Т. СтооКе апа В. Герієи, Едз., САС Ргезв5, Воса Наїйоп, Ніа., 1993, р. 303-350. Дисульфідний зв'язок використаний для зв'язування 3'-кінця олігонуклеотиду з пептидом (Согеу, еї аї., Зсіепсе 1987, 238, 1401; исКегтапп, еї аї, У Ат. Спет. 5ос. 1988, 110, 1614; і Согеу, еї аї.,, У Ат. Снет. зоб. 1989, 111, 8524). У статті Меї5оп, еї аї., Мисі. Асіда5 Кев5. 1989, 17, 7187 описаний зв'язуючий реагент для приєднання біотину до 3'-кінця олігонуклеотиду. Цей реагент М-Етос-0О-ОМТ-3- аміно-1,2-пропандіол є у продажу від компанії Сіопіеспй Іарогаїгіезє (Пало Алто, штат
Каліфорнія) під назвою 3'-Атіпе. Він також є у продажу під назвою 3'-Атіпо-Модійег Кеадепі від компанії (зІіеп Кезеагспй Согрогайоп (Стерлінг, штат Вірджинія). Цей реагент також використовували для зв'язування пептиду з олігонуклеотидом, як описано в статті Уцау, еї аї.,
Теїгапейдгоп І ецег5 1991, 32, 879. Подібний комерційний реагент для зв'язування з 5'-кінцем олігонуклеотиду є 5'-Атіпо-Модійег Сб. Ці реагенти є у продажу від компанії Сіеп Кезеагсп
Согрогайоп (Стерлінг, штат Вірджинія). Ці або подібні сполуки були використані дослідниками
Кгієд, еї аї, Апіїзепзе Кезеагсп апа ЮОемеІортепі 1991, 1, 161, для зв'язування флуоресцеїну з 5'- кінцем олігонуклеотиду. Інші сполуки, такі як акридин, приєднані до 3'-кінцевій фосфатній групі олігонуклеотиду за допомогою поліметиленового зв'язку (Ав5зеїїпе, еї аї!., Ргос. Май. Асай. 5бі.
БА 1984, 81, 3297). Будь-які з описаних вище груп можна використовувати у вигляді окремого лінкера або в комбінації з одним або більше додаткових лінкерів.
Лінкери та їх застосування при одержанні кон'югатів олігомерних сполук запропоновано на рівні техніки, наприклад, в документах МУМО 96/11205 і УМО 98/52614 і патентах О5 МоМо 4,948,882; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,580,731; 5,486,603; 5,608,046; 4,587,044; 4,667,025; 5,254,469; 5,245,022; 5,112,963; 5,391,723; 5,510475; 5,512,667; 5,574,142; 5,684,142; 5,770,716; 6,096,875; 6,335,432 і 6, 335,437, МО 2012/083046, кожен з яких повністю включений за допомогою посилання.
При використанні в цьому документі фізіологічно лабільний зв'язок є лабільним зв'язком, який є розщеплюваним в умовах, що зустрічаються в норм, або аналогічних тим, що зустрічаються в організмі ссавця (також званим розщеплюваним лінкером, проілюстрованим як ділянка В на Фіг. 12 ї 13). Фізіологічні лабільні зв'язуючі групи вибрані з груп, що зазнають хімічного перетворення (наприклад, розщеплювання) при знаходженні в певних фізіологічних умовах. Внутрішньоклітинні умови ссавців включають хімічні умови, такі як рН, температура,
Зо окислювальні або відновні умови або агенти, і концентрацію солі, що виявляються або аналогічні тим, що зустрічаються в клітинах ссавців. Внутрішньоклітинні умови ссавців також включають наявність ферментативної активності, в нормі присутньої в клітині ссавця, наприклад, активності протеолітичних або гідролітичних ферментів. У деяких втіленнях винаходу розщеплюваний лінкер чутливий до нуклеази (нуклеазам), яка може, наприклад, експресуватися в клітині-мішені, ії як такий, що детально описано в цьому документі, лінкер може бути короткою ділянкою (наприклад, 1-10) нуклеозидів, пов'язаних фосфодіефірними зв'язками, такими як нуклеозиди ДНК.
Хімічне перетворення (розщеплювання лабільного зв'язку) може бути ініційоване шляхом додавання в клітину фармацевтично прийнятного агента або може відбуватися спонтанно, коли молекула, що містить лабільний зв'язок, досягає відповідного внутрішньо- та/або позаклітинного оточення. Наприклад, рН-лабільний зв'язок може розщеплюватися при проникненні молекули в підкислену ендосому. Таким чином, рН-лабільний зв'язок можна розглядати як ендосомно розщеплюваний зв'язок. Ферментативні розщеплювані зв'язки можуть розщеплюватися під дією ферментів, наприклад, присутніх в ендосомі, або в лізосомі, або в цитоплазмі. Дисульфідний зв'язок може розщеплюватися при проникненні молекули в більшою мірою поновлююче середовище клітинної цитоплазми. Таким чином, дисульфід можна розглядати як цитоплазматично розщеплюваний зв'язок. При використанні в цьому документі рН-лабільний зв'язок є лабільним зв'язком, який селективно розщеплюється в кислих умовах (рН менше 7).
Такі зв'язки можуть також називатися ендосомно лабільними зв'язками, оскільки клітинні ендосоми і лізосоми мають рН менше 7.
Біорозщеплювані кон'югати, пов'язані з олігомером
Олігомерна сполука може необов'язково містити другу ділянку (ділянка В), розташовану між олігомером (на який посилаються як на ділянку А) і кон'югатом (на який посилаються як на ділянку С) (ілюстрації див. на Фіг. 12 і 13). Ділянка В може бути лінкером, таким як розщеплюваний лінкер (на який також посилаються як на фізіологічно лабільний зв'язок).
Чутливі до нуклеаз фізіологічно лабільні зв'язки: В деяких втіленнях винаходу олігомер (на який також посилаються як на олігомерну сполуку) за винаходом (або кон'югат) містить три ділянки: і) перша ділянка (ділянка А), що містить 10-18 суміжних нуклеотидів; ії) друга ділянка (ділянка В), що містить біорозщеплюваний лінкер;
ії) третя ділянка (С), що містить кон'югатне угрупування, направляюче угрупування, активаційне угрупування, де третя ділянка ковалентно пов'язана з другою ділянкою.
У деяких втіленнях винаходу ділянка В може бути нуклеотидфосфатним лінкером.
Наприклад, такі лінкери можна використовувати, коли кон'югат є ліпофільними кон'югатами, такими як ліпід, жирна кислота, стерин, такий як холестерин або токоферол.
Нуклеотидфосфатні лінкери можна також використовувати для інших кон'югатів, наприклад, вуглеводних кон'югатів, таких як заіІМАс.
Пептидні лінкери
У деяких втіленнях винаходу біорозщеплюваний лінкер (ділянка В) є пептидом, таким як трилізиновий пептидний лінкер, який можна використовувати в полібсаІМАс кон'югаті, такому як трисСаїІМАс кон'югаті. Див. також пептидні бірадикали, згадані в цьому документі.
Інші лінкери, відомі в цій області техніки, які можна використовувати, включають дисульфідні лінкери.
Нуклеотидфосфатні лінкери
У деяких втіленнях винаходу ділянка В містить 1-6 нуклеотидів, ковалентно пов'язаних з 5' або 3- нуклеотидом першої ділянки, наприклад, за допомогою міжнуклеозидної зв'язуючої групи, такої як фосфодіефірний зв'язок, де або а. міжнуклеозидний зв'язок між першою і другою ділянкою є фосфодіефірним зв'язком, а нуклеозид другої ділянки, (наприклад, безпосередньо) що примикає до першої ділянки, є або
ДНК, або РНК; та/або р. щонайменше 1 нуклеозид другої ділянки є зв'язаним фосфодіефірним зв'язком нуклеозид
ДНК або РНК;
У деяких втіленнях винаходу ділянка А і ділянка В формують одну безперервну нуклеотидну послідовність з 12-22 нуклеотидів в довжину.
У деяких аспектах міжнуклеозидний зв'язок між першою і другою ділянками можна розглядати як частину другої ділянки.
У деяких втіленнях винаходу між другою і третьою ділянкою знаходиться зв'язуюча группа, що містить фосфор. Фосфорна зв'язуюча група може, наприклад, бути фосфатною (фосфодіефірною), фосфоротіоатною, фосфородитіоатною або боранофосфатною групою. У
Зо деяких втіленнях винаходу ця зв'язуюча группа, що містить фосфор, розташована між другою ділянкою і лінкерною ділянкою, яка приєднана до третьої ділянки. У деяких втіленнях винаходу фосфатна група є фосфодіефіром.
Таким чином, в деяких аспектах олігомерна сполука містить щонайменше дві фосфодіефірні групи, де щонайменше одна є групою відповідно до приведеного вище викладу суті винаходу, а інша розташована між другою і третьою ділянками, необов'язково між лінкерною групою і другою ділянкою.
У деяких втіленнях винаходу третя ділянка є активаційною групою, такою як активаційна група для застосування при кон'югації. У цьому аспекті у винаході також запропоновані активовані олігомери, що містять ділянку А і В і активаційну групу, наприклад, проміжну сполуку, яка підходить для наступного зв'язування з третьою ділянкою, наприклад, відповідною для кон'югації.
У деяких втіленнях винаходу третя ділянка є реакційною групою, такою як реакційна група для застосування при кон'югації. У цьому аспекті у винаході також запропоновані олігомери, що містять ділянку А ії В ії реакційну групу, наприклад, проміжну сполуку, яка підходить для наступного зв'язування з третьою ділянкою, наприклад, відповідною для кон'югації. Реакційна група може в деяких втіленнях винаходу містити амін спиртової групи, такий як група аміну.
У деяких втіленнях винаходу ділянка А містить щонайменше один, наприклад, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або 21 міжнуклеозидний зв'язок, що відрізняється від фосфодіефірного, такого як міжнуклеозидні зв'язки, які (необов'язково незалежно) вибрані з групи, що складається з фосфоротіоатного, фосфородитіоатного і боранофосфатного, і метилфосфатного, такого як фосфоротіоатний. У деяких втіленнях винаходу ділянка А містить щонайменше один фосфоротіоатний зв'язок. У деяких втіленнях винаходу щонайменше 50965, наприклад, щонайменше 7595, наприклад, щонайменше 9095 міжнуклеозидних зв'язків, наприклад, усі міжнуклеозидні зв'язки в межах ділянки А відрізняються від фосфодіефірних, наприклад, є фосфоротіоатними зв'язками. У деяких втіленнях винаходу усі міжнуклеозидні зв'язки в ділянці А відрізняються від фосфодіефірних.
У деяких втіленнях винаходу олігомерна сполука є антисмисловим олігонуклеотидом, таким як кон'югат антисмислового олігонуклеотиду. Антисмисловий олігонуклеотид може бути або може містити першу ділянку і необов'язково другу ділянку. У цьому аспекті в деяких втіленнях бо винаходу ділянка В може формувати частину безперервної послідовності нуклеотидних основ,
комплементарної (нуклеїновокислотної) мішені. В інших втіленнях винаходу в ділянці В може бути відсутнім комплементарність мішені.
Альтернативно в деяких втіленнях у винаході запропоновано олігонуклеотид (наприклад, антисмисловий олігонуклеотид), зв'язаний не фосфодіефірним зв'язком, таким як фосфоротіоатний зв'язок, який має щонайменше один кінцевий (5' та/або 3) нуклеозид ДНК або
РНК, пов'язаний з примикаючим нуклеозидом олігонуклеотиду за допомогою фосфодіефірного зв'язку, де кінцевий нуклеозид ДНК або РНК додатково ковалентно пов'язаний з кон'югатним угрупуванням, направляючим угрупуванням або блокуючим угрупуванням, необов'язково за допомогою лінкерного угрупування.
У деяких втіленнях винаходу олігомерна сполука містить антисмисловий олігонуклеотид, такий як кон'югат антисмислового олігонуклеотиду. Антисмисловий олігонуклеотид може бути або може містити першу ділянку і необов'язково другу ділянку. У цьому аспекті в деяких втіленнях винаходу ділянка В може формувати частину безперервної послідовності нуклеотидних основ, комплементарної (нуклеїновокислотної) мішені. У інших втіленнях винаходу в ділянці В може бути відсутнім комплементарність мішені.
У деяких втіленнях винаходу щонайменше два послідовних нуклеозиду другої ділянки є нуклеозидами ДНК (наприклад, щонайменше 3 або 4 або 5 послідовних нуклеотидів ДНК).
У такому втіленні винаходу олігонуклеотид за винаходом може бути описаний згідно з наступною формулою:
Б5-А-РО-В (У)Х-3' або 3'-А-РО-В (М)Х-5' де А є ділянкою А, РО є фосфодіефірним зв'язком, В є ділянкою В, У є необов'язковою зв'язуючою групою, і Х є кон'югатною, направляючою, блокуючою групою або реакційною або активаційною групою.
У деяких втіленнях винаходу ділянка В містить 3'- 5' або 5'- 3": ї) фосфодіефірний зв'язок з 5'- або 3- нуклеозидом ділянки А, ії) нуклеозид ДНК або РНК, такий як нуклеозид ДНК, і її) додатковий фосфодіефірний зв'язок 5-А-РО-В-РО-3 або 3'-А-РО-В-РО-5'
Додатковий фосфодіефірний зв'язок зв'язує нуклеозид ділянки В з одним або більше додаткових нуклеозидів, таких як один або більше нуклеозидів ДНК або РНК, або може
Зо зв'язуватися з Х (являє собою кон'югатну, направляючу або блокуючу групу або реакційну або активаційну групу), необов'язково за допомогою зв'язуючої групи (У).
У деяких втіленнях винаходу ділянка В містить 3-5' або 5-3": ї) фосфодіефірний зв'язок з 5' або 3'-нуклеозидом ділянки А, ії) 2-10 зв'язаних фосфодіефірним зв'язком нуклеозидів ДНК або
РНК, таким як нуклеозид ДНК, і необов'язково ії) додатковий фосфодіефірний зв'язок: 5-А-ІРО-В|п--(М|-Х 3 або 3'-А-І(РО-ВІп -(К-Х 5" 5-А-І(РО-В|п-РО-Г(М|-Х 3' або 3-А--РО-В|п-РО -ГМ|-Х 5 де А є ділянкою А, ІРО - ВіІп є ділянкою В, де п дорівнює 1-10, наприклад, 1,2,3,4, 5,6, 7, 8, 9 або 10, РО є необов'язковою фосфодіефірною зв'язуючою групою між ділянкою В і Х (або У, якщо присутня).
У деяких втіленнях винаходу у винаході запропоновані сполуки відповідно до однієї з (або такі, що містять одну з) наступних формул: 5 |Ділянка АІ-РО-|ділянка ВІ 3" -У-Х 5 |Ділянка АІ-РО-|ділянка ВІ-РО 3 -У-Х 5 |Ділянка АІ-РО-|ділянка ВІ 3 - Х 5 |Ділянка АІ-РО-|ділянка ВІ-РО 3-Х
З |Ділянка АІ-РО-|ділянка ВІ 5" -У-Х
З |Ділянка АІ-РО-|ділянка ВІ-РО 5'-У-Х
З |Ділянка АІ-РО-|ділянка ВІ 5 - Х
З |Ділянка АІ-РО-|ділянка ВІ-РО 5 - Х
Ділянка В може, наприклад, містити або складатися з: 5 ДНК 3
З ДНК 5 5 ДНК-РО-ДНК 3"
З ДНК-РО-ДНК 5" 5 ДНК-РО-ДНК-РО-ДНК 3" 3 ДНК-РО-ДНК-РО-ДНК 5" 5 ДНК-РО-ДНК-РО-ДНК-РО-ДНК 3' 3" ДНК-"О-ДНК-РО-ДНК-РО-ДНК 5" 5 ДНК-РО-ДНК-РО-ДНК-РО-ДНК-РО-ДНК 3" 60 3" ДНК-"О-ДНК-РО-ДНК-РО-ДНК-РО-ДНК 5'
Повинно бути зрозуміло, що в пов'язаних фосфатним зв'язком біорозщеплюваних лінкерах можна використовувати нуклеозиди, що відрізняються від ДНК і РНК. Біорозщеплювані нуклеотидні лінкери можуть бути ідентифіковані з використанням аналізів в прикладі 6.
У деяких втіленнях винаходу сполука за винаходом містить біорозщеплюваний лінкер (на який також посилаються як на фізіологічно лабільний лінкер, чутливі до нуклеаз фізіологічно лабільні зв'язки або чутливий до нуклеаз лінкер), наприклад, нуклеотидфосфатний лінкер (такий як ділянка В) або пептидний лінкер, який зв'язує олігомер (або безперервну нуклеотидну послідовність або ділянку А) з кон'югатним угрупуванням (або ділянкою С).
Чутливість до розщеплювання в аналізах, показаних в прикладі 6, можна використовувати для визначення, чи є лінкер біорозщеплюваним або фізіологічно лабільним.
Біорозщеплювані лінкери згідно із даним винаходом відносяться до лінкерів, чутливих до розщеплювання в тканині-мішені (тобто фізіологічно лабільним), наприклад, в печінці та/або нирці. Переважно, щоб швидкість розщеплювання, спостережувана в тканині-мішені, була вища, ніж виявляється в сироватці крові. Відповідні способи визначення рівня (95) розщеплювання в тканині (наприклад, в печінці або нирці) і в сироватці можна знайти в прикладі 6. У деяких втіленнях винаходу біорозщеплюваний лінкер (на який також посилаються як на фізіологічно лабільний лінкер або чутливий до нуклеаз лінкер), такий як ділянка В, в сполуці за винаходом розщеплюється щонайменше приблизно на 2095, наприклад, розщеплюється щонайменше приблизно на 3095, наприклад, розщеплюється щонайменше приблизно на 4095, наприклад, розщеплюється щонайменше приблизно на 5095, наприклад, розщеплюється щонайменше приблизно на 6095, наприклад, розщеплюється щонайменше приблизно на 7095, наприклад, розщеплюється щонайменше приблизно на 7595 в аналізі гомогенату печінки або нирки прикладу 6. У деяких втіленнях винаходу розщеплювання (950) в сироватці, використовуване в аналізі прикладу 6, складає менш ніж приблизно 3095, менш ніж приблизно 2095, менш ніж приблизно 1095, менш ніж приблизно 595, менш ніж приблизно 195.
У деяких втіленнях винаходу, які можуть бути однаковими або різними, біорозщеплюваний лінкер (на який також посилаються як на фізіологічно лабільний лінкер або чутливий до нуклеаз лінкер), такий як ділянка В, в сполуці за винаходом чутливий до розщеплювання нуклеазою 51.
Чутливість до розщеплювання 51 можна оцінювати, використовуючи 51 нуклеазний аналіз,
Зо показаний в прикладі 6. У деяких втіленнях винаходу біорозщеплюваний лінкер (на який також посилаються як на фізіологічно лабільний лінкер або чутливий до нуклеазам лінкер), такий як ділянка В, в сполуці за винаходом розщеплений щонайменше приблизно на 3095, наприклад, розщеплений щонайменше приблизно на 4095, наприклад, розщеплений щонайменше приблизно на 5095, наприклад, розщеплений щонайменше приблизно на 6095, наприклад, розщеплений щонайменше приблизно на 7095, наприклад, розщеплений щонайменше приблизно на 8095, наприклад, розщеплений щонайменше приблизно на 9095, наприклад, розщеплений щонайменше приблизно на 9595 після 120 хв інкубації з нуклеазою 51 згідно з аналізом, використовуваним в прикладі 6.
Вибір послідовності в другій ділянці:
У деяких втіленнях винаходу ділянка В не формує комплементарну послідовність при вирівнюванні ділянки А і В олігонуклеотиду з комплементарною послідовністю-мішенню.
У деяких втіленнях винаходу ділянка В не формує комплементарну послідовність при вирівнюванні ділянки А і В олігонуклеотиду з комплементарною послідовністю-мішенню. У цьому аспекті ділянка А і В разом можуть формувати одну безперервну послідовність, комплементарну послідовності-мішені.
У деяких втіленнях винаходу послідовність основ в ділянці В вибрана так, щоб забезпечити оптимальний сайт розщеплювання ендонуклеазою на основі переважаючих ферментів ендонуклеазного розщеплювання, присутніх в тканині або клітині-мішені або в субклітинному компартменті. У цьому аспекті шляхом виділення клітинних екстрактів з тканин-мішеней і тканин, що не є мішенями, послідовності для ендонуклеазного розщеплювання для застосування в ділянці В можуть бути вибрані на основі переважної розщеплюючої активності в бажаній клітині-мішені (наприклад, в печінці/гепатоцитах) в порівнянні з клітиною, що не є мішенню (наприклад, в нирці). У цьому аспекті ефективність сполуки для цільової знижуючої регуляції можна оптимізувати для бажаної тканини/клітини.
У деяких втіленнях винаходу ділянка В містить динуклеотидні послідовності АА, АТ, АС, АОС,
ТА, ТТ, ТС, ТО, СА, СТ, СС, СО, СА, СТ, С або со, де С може бути 5-метилцитозином, та/або
Т може бути заміщений О. У деяких втіленнях винаходу ділянка В містить тринуклеотидні послідовності ААА, ААТ, ААС, ААС, АТА, АТТ, АТС, АТО, АСА, АСТ, АСС, АСО, АСА, АСТ, дасС, Ас, ТАА, ТАТ, ТАС, ТАС, ТТА, ТТ, ТС, ТАС, ТСА, ТСТ, ТОС, Тба, ТаА, тат, та, 60 ТОаа, САА, САТ, САС, САС, СТА, Ста, СТО, СТТ, ССА, ССТ, ССС, ССО, сала, сат, бас, бас,
САА, САТ, САС, САС, СТА, ТТ, ТС, СТО, ОСА, ОСТ, ОСС, СО, БА, ОСТ, СОС і БО, де
С може бути 5-метилцитозином та/або Т може бути замінений Ц. У деяких втіленнях винаходу ділянка В містить тетрануклеотидні послідовності АААХ, ААТХ, ААСХ, ААОХ, АТАХ, АТТХ,
АТСХ, АТаХ, АСАХ, АСТХ, АССХ, АСОахХ, АСАХ, ДИТХ, ДОСХ, АСОИХ, ТААХ, ТАТХ, ТАСХ, тТАахХ,ТТАХ, ТТТХ, ТТОХ, ТАОХ, ТСАХ, ТСТХ, ТОСХ, ТСахХ, ТаАХ, ТатХ, Тасх, ТааХ, СААХ,
САТХ, САСХ, САСХ, СТАХ, СТИХ, СТОХ, СТІХ, ССАХ, ССТХ, СССХ, ССаХ, СОАХ, СОИТХ, сасх, СсахХ, аААХ, АТХ, САСХ, САаХ, атАХ, аТтТХх, аь;ТоХх, атах, асСАХ, аСТХ, аССХ,
ССОХ, ОБАХ, СОТХ, БОСХ і БООХ, де Х може бути вибраний з групи, що складається з А, Т,
У, б, С та їх аналогів, де С може бути 5-метилцитозином та/або Т може бути замінений |.
Повинно бути зрозуміло, що при посиланні на (такі, що зустрічаються в природі) нуклеотидні основи А, Т, ШО, б, С вони можуть бути заміщені аналогами нуклеотидних основ, що функціонують як еквіваленти природних нуклеотидних основ (наприклад, пара основ з комплементарним нуклеозидом). У деяких втіленнях винаходу ділянка В не містить Т або |).
Аміноалкільні проміжні сполуки
У винаході додатково запропоновані проміжні олігомери ЗНК, що містять антисмисловий олігомер ЗНК, що містить (наприклад, кінцевий, 5' або 3) аміноалкільний лінкер, такий як С2-
С36 аміноалкільна група, наприклад, С6-С12 аміноалкільна група, що включає, наприклад, Сб і
С12 аміноалкільні групи. Аміноалкільну групу можна приєднати до олігомеру ЗНК як частину олігонуклеотидного синтезу, наприклад, використовуючи (наприклад, захищений) аміноалкілфосфорамідит. Зв'язуюча група між аміноалкілом і олігомером ЗНК може бути, наприклад, фосфоротіоат або фосфодіефір, або одну з інших груп нуклеозидного зв'язку, наприклад, на які посилаються в цьому документі. Аміноалкільна група може бути ковалентно зв'язана, наприклад, з 5' або 3-кінцем олігомеру ЗНК, наприклад, за допомогою групи нуклеозидного зв'язку, такого як фосфоротіоатний або фосфодіефірний зв'язок.
У винаході також запропонований спосіб синтезу олігомеру ЗНК, що включає послідовний синтез олігомеру ЗНК, такий як твердофазний олігонуклеотидний синтез, що включає стадію приєднання аміноалкільної групи до олігомеру, як, наприклад, протягом першого або останнього раунду олігонуклеотидного синтезу. Спосіб синтезу може додатково включати стадію взаємодії кон'югата з аміноалкіл-олігомером ЗНК (стадію кон'югації). Кон'югат може містити відповідні
Зо лінкери та/або групи точки розгалуження і необов'язково додаткові кон'югатні групи, такі як гідрофобні або ліпофільні групи, як описано в цьому документі. Стадію кон'югації можна виконувати в той час, коли олігомер пов'язаний з твердим носієм (наприклад, після олігонуклеотидного синтезу, але до елюювання олігомеру з твердого носія), або послідовно (тобто після елюювання). У винаході запропоновано застосування аміноалкільного лінкера при синтезі олігомеру за винаходом.
Спосіб одержання/синтезу
У винаході запропонований спосіб синтезу (або одержання) олігомерної сполуки, такої як олігомерна сполука за винаходом, де спосіб включає або: а) стадію забезпечення носія (гвердофазного| олігонуклеотидного синтезу Ігтретьої ділянки), до якої приєднують одне з наступного: ї) лінкерної групи (-У-), ії) групи, вибраної з групи, що складається з кон'югата, направлюючої групи, блокуючої групи, реакційної группи (наприклад, амінної або спиртової) або активаційної групи (Х-), ії) групи -Х-Х, і
БЮ) стадію |послідовного| олігонуклеотидного синтеза ділянки В с подальшим синтезом ділянки А, та/або: с) стадію (послідовного| олігонуклеотидного синтеза першої ділянки (А) і другої ділянки (В), де за стадією синтеза слідує а) стадія приєднання третьої ділянки |їІКлЛючення фосфорамідиту) ї) лінкерної групи (-У-), ії) групи, вибраної з групи, що складається з кон'югата, направлюючої групи, блокуючої групи, реакційної группи (наприклад, амінної або спиртової) або активаційної групи (Х-), ії) групи -Ж-Х з подальшим е) відщепленням олігомерної сполуки від (гтвердофазного| носія, де необов'язково зазначений спосіб додатково включає додаткову стадію, вибрану із стадій:
І де третя группа позначає активаційну групу, стадії активації активаційної групи з одержанням реакційної групи з подальшим приєднанням кон'югата, блокуючої або направлюючої групи до реакційної групи, необов'язково за допомогою лінкерної групи (У); 9) де третя ділянка позначає реакційну групу, стадії приєднання кон'югата, блокуючої або направлюючої групи до реакційної групи, необов'язково за допомогою лінкерної групи (У).
Р) де третя ділянка позначає лінкерну групу (У), стадії приєднання кон'югата, блокуючої або направлюючої групи до лінкерної групи (У), де стадії Її), 9) або п) виконують або до, либо після відщеплення олігомерної сполуки від носія олігонуклеотидного синтеза. У деяких втіленнях винаходу спосіб може бути виконаний з використанням стандартної фосфорамідитної хімії, і сама по собі ділянка Х та/або ділянка Х або ділянка Х і М може бути одержана до включення в олігомер у вигляді фосфорамідиту. Будь ласка, див. Фіг. 5-10, які ілюструють необмежувані аспекти способу за винаходом.
У винаході запропонований спосіб синтезу (або одержання) олігомерної сполуки, такої як олігомерна сполуки за винаходом, де спосіб включає: а) стадію послідовного олігонуклеотидного синтезу першої ділянки (А) і другої ділянки (В), де за стадією синтезу йде стадія приєднання третьої ділянки, що містить фосфорамідит ділянки Х (на який також посилаються як на ділянку С) або У, такої як ділянка, що містить групу, вибрану з групи, що складається з кон'югатної групи, направлюючої групи, блокуючої групи, функціональної групи, реакційної групи (наприклад, амінною або спиртовою) або активаційної групи (Х), або групу -У-Х з наступним відщепленням олігомерної сполуки від (гтвердофазного носія.
Проте визнано, що ділянка Х або Х-ху може бути приєднана після відщеплення від твердого носія. Альтернативно спосіб може включати стадії синтезу першої (А) і необов'язково другої ділянки (В) з наступним відщепленням олігомеру від носія і з наступною стадією приєднання третьої ділянки, такої як група Х або Х-У в олігомері. Приєднання третьої ділянки може бути досягнуте, наприклад, шляхом приєднання амінофосфорамідитної ланки на кінцевій стадії синтезу олігомеру (на носії), який після відщеплення від носія використовують для сполучення з групою Х або Х-У, необов'язково за допомогою активаційної групи на групі Х або У (коли присутня). У втіленнях винаходу, де розщеплюваний лінкер є ненуклеотидною ділянкою,
З0 ділянка В може бути ненуклеотидним розщеплюваним лінкером, наприклад, пептидним лінкером, який може формувати частину ділянки Х (на який також посилаються як на ділянку С) або бути ділянкою У (або його частиною).
У деяких втіленнях способу ділянка Х (така як С) або (Х-ХУ), така як кон'югат (наприклад, кон'югат саіМАс) містить активаційну групу (активовану функціональну групу), і в способі синтезу активований кон'югат (або ділянку Х, або Х-У) приєднують до першої і другої ділянкам, таким як аміно-зв'язаний олігомер. Аміногрупу можна приєднувати до олігомеру за допомогою стандартної фосфорамідитної хімії, наприклад, як кінцеву стадію синтезу олігомеру (що в характерному випадку приведе в результаті до аміногрупи на 5' кінці олігомеру). Наприклад, протягом останньої стадії олігонуклеотидного синтезу використовують аміно- алкілфосфорамідит, наприклад, ТЕА-аміно-Сб-фосфорамідит (6-(трифторацетиламіно)-гексил- (2-ціаноетил)-(М, М-діїзопропіл)-фосфорамідит).
Ділянку Х (або ділянку С, на яку посилаються в цьому документі), таку як кон'югат (наприклад, кон'югат саіМАс), можна активувати складноефірним М-гідроксисукцинімидним (МН5) способом, а потім приєднати аміно-зв'язаний олігомер. Наприклад, М-гідроксисукцинімид (МН5) можна використовувати як активуючу групу для ділянки Х (або ділянки С, такої як кон'югат, наприклад, кон'югатне угрупування сзаїІМАСс).
У винаході запропоновано олігомер, одержаний способом за винаходом.
У деяких втіленнях винаходу ділянка Х та/або ділянка Х або ділянка Х і М можуть бути ковалентно сполучені (зв'язані) з ділянкою В за допомогою нуклеозидфосфатного зв'язку, такого як описано в цьому документі, включаючи фосфодіефір або фосфоротіоат, або за допомогою альтернативної групи, такої як триазольна група.
У деяких втіленнях винаходу міжнуклеозидний зв'язок між першою і другою ділянкою є фосфодіефір, зв'язаний з першим (або єдиним) нуклеозидом ДНК або РНК другої ділянки, або ділянка В містить щонайменше один нуклеозид ДНК або РНК, зв'язаний фосфодіефірним зв'язком.
Друга ділянка в деяких втіленнях винаходу може містити додаткові нуклеозиди ДНК або
РНК, які можуть бути зв'язані фосфодіефірним зв'язком. Друга ділянка додатково ковалентно зв'язана з третьою ділянкою, яка може, наприклад, являти собою кон'югат, направляючу групу, реакційну групу та/або блокуючу групу.
У деяких аспектах даний винахід заснований на забезпеченні лабільної ділянки, другої ділянки, зв'язуючої першу ділянку, наприклад, антисмисловий олігонуклеотид, і кон'югат або функціональну групу, наприклад, направляючу або блокуючу групу. Лабільна ділянка містить щонайменше один нуклеозид, зв'язаний фосфодіефірним зв'язком, таким як нуклеозид ДНК або
РНК, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 нуклеозидів, пов'язаних фосфодіефірним зв'язком, таким як ДНК або РНК. У деяких втіленнях винаходу олігомерна сполука містить розщеплюваний (лабільний) лінкер. У цьому аспекті розщеплюваний лінкер переважно присутній в ділянці В (або в деяких втіленнях винаходу між ділянкою А і В).
Альтернативно в деяких втіленнях винаходу у винаході запропоновано олігонуклеотид (наприклад, антисмисловий олігонуклеотид), зв'язаний не фосфодіефірним зв'язком, наприклад, фосфоротіоатним зв'язком, що має щонайменше один кінцевій (5' та/або 3' нуклеозид) ДНК або
РНК, зв'язаний з примикаючим нуклеозидом олігонуклеотиду за допомогою фосфодіефірного зв'язку, де кінцевий нуклеозид ДНК або РНК додатково ковалентно зв'язаний з кон'югатним угрупуванням, направляючим угрупуванням або блокуючим угрупуванням, необов'язково за допомогою лінкерного угрупування.
Композиції
Олігомер або кон'югати олігомеру за винаходом можна застосовувати у фармацевтичних препаратах і композиціях. Доцільно такі композиції містять фармацевтично прийнятний розчинник, носій, сіль або ад'ювант. У документі УМО 2007/031091, включеному за допомогою посилання, запропоновані відповідні і переважні фармацевтично прийнятні розчинник, носій і ад'юванти. Відповідні дози, препарати, шляхи введення, композиції, дозовані форми, комбінації з іншими терапевтичними засобами, пролікарські препарати також запропоновані в документі
УМО 2007/031091, також включеному в цей документ за допомогою посилання.
Застосування
Олігомери або кон'югати олігомерів за винаходом можна застосовувати в якості експериментальних реагентів, наприклад, діагностичних, терапевтичних і профілактичних.
При дослідженнях такі олігомери можна застосовувати для специфічного інгібування синтезу білью»а РО5БКОУ (у характерному випадку шляхом розпаду або інгібування мРНК і за допомогою цього запобігання формуванню білку) в клітинах і у піддослідних тварин, таким
Зо чином, сприяючи функціональному аналізу мішені або оцінці її корисності як мішені для терапевтичного втручання.
У діагностиці такі олігомери можна застосовувати для виявлення і кількісного визначення експресії РОЗКОУ в клітині і тканинах за допомогою Нозерн-блотинга, гібридизації іп-зйи або подібних методів.
Для терапевтичних застосувань тварину або людину, підозрювану на наявність захворювання або розладу, який можна лікувати шляхом модуляції експресії РОЗКОУ, лікують шляхом введення олігомерних сполук відповідно до цього винаходу. Додатково запропоновані способи лікування ссавця, наприклад, лікування людини, підозрюваної на наявність захворювання або стану або схильність до нього, пов'язаної з експресією РСОБКОУ, шляхом введення терапевтично або профілактично ефективної кількості одного або більше олігомерів або композицій за винаходом. Олігомер, кон'югат або фармацевтичну композицію згідно з винаходом в характерному випадку вводять в ефективній кількості.
У винаході також запропоновано застосування сполуки або кон'югата згідно з винаходом, як описано в цьому документі, для одержання лікарського засобу для лікування розладу, на яке посилаються в цьому документі, або для способу лікування розладу, на який посилаються в цьому документі.
У винаході також запропоновано спосіб розладу, на який посилаються в цьому документі, що включає введення пацієнтові, що потребує цього, сполуки згідно з винаходом, як описано в цьому документі, та/або кон'югата згідно з винаходом та/або фармацевтичної композиції згідно з винаходом.
Медичні свідчення
Олігомери, кон'югати олігомерів та інші композиції згідно з винаходом можна застосовувати для лікування станів, пов'язаних з надекспресією або з експресією мутованого варіанту РОБКО.
У винаході додатково запропоновано застосування сполуки за винаходом при одержанні лікарського засобу для лікування захворювання, розладу або стану, на який посилаються в цьому документі.
У загальних рисах один аспект винаходу відноситься до способу лікування ссавця, що страждає або підозрюваного на наявність станів, пов'язаних з аномальними рівнями та/або активністю РСБКОУ, де спосіб включає введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості 60 олігомеру або кон'югата олігомеру, направленого на РОЗКО, що містить одну або більше ланки
ЗНК. Олігомер, кон'югат або фармацевтичну композицію згідно з винаходом в характерному випадку вводять в ефективній кількості.
Захворювання або розлад, на який посилаються в цьому документі, в деяких втіленнях винаходу може бути пов'язано з мутацією в гені РОЗКОУ або в гені, білковий продукт якого асоційований або взаємодіє з РОЗКУ. Таким чином, в деяких втіленнях винаходу мРНК-мішень є мутованою формою послідовності РСБКО.
Аспект потрібного винаходу відноситься до застосування олігомеру (сполуки), як визначено в цьому документі, або кон'югата, як визначено в цьому документі, для одержання лікарського засобу для лікування захворювання, розладу або стану, на який посилаються в цьому документі.
Способи за винаходом переважно застосовують для лікування або профілактики захворювань, викликаних аномальними рівнями та/або активністю РОЗКОУ.
Альтернативно в деяких втіленнях винаходу винахід додатково відноситься до способу лікування аномальних рівнів та/(або активності РСБКОУ, де цей спосіб включає введення олігомеру за винаходом, або кон'югата за винаходом, або фармацевтичної композиції за винаходом пацієнтові, що потребує цього.
Винахід також відноситься до олігомеру, композиції або кон'югата, як визначено в цьому документі, для застосування як лікарського засобу.
Винахід додатково відноситься до застосування сполуки, композиції або кон'югата, як визначено в цьому документі, для одержання лікарського засобу для лікування аномальних рівнів та/або активності РО5КОУ або експресії форм мутантів РОКУ (таких як алельні варіанти, наприклад, пов'язані з одним із захворювань, на які посилаються в цьому документі).
Крім того, винахід відноситься до способу лікування суб'єкта, що страждає на захворювання або стан, таким як ті, на які посилаються в цьому документі.
Пацієнт, що потребує лікування, є пацієнтом, що страждає або ймовірно страждає на захворювання або розлад.
У деяких втіленнях винаходу термін "лікування при використанні в цьому документі відноситься як до лікування існуючого захворювання (наприклад, захворювання або розладу, на який посилаються в цьому документі), так і до запобігання захворюванню, тобто профілактики.
Таким чином, добре відомо, що лікування, на яке посилаються в цьому документі, в деяких втіленнях винаходу може бути профілактичним.
В одному втіленні винахід відноситься до сполук або композицій, що містять сполуки, для лікування гіперхолестеринемії і споріднених розладів або до способів лікування (із застосуванням таких сполук або композицій лікування гіперхолестеринемії і споріднених розладів, де термін "споріднені розлади" при посиланні на гіперхолестеринемію відноситься до одного або більше із станів, вибраних з групи, що складається з атеросклерозу, гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, сімейної гіперхолестеринемії, наприклад, накопичення функціональних мутацій в РОБ5КОУ, дисбалансу ЛІОВЩ/ЛІПНЩ холестерину, дисліпідемій, наприклад, сімейної гіперліпідемії (СКГ) або сімейної гіперхолестеринемії (СГХС), придбаної гіперліпідемії, статин- резистентної гіперхолестеринемії, хворобі коронарних артерій (КАХ) та ішемічної хвороби серця (ІХО).
Комбіновані терапії
У деяких втіленнях винаходу сполука за винаходом призначена для застосування при комбінованому лікуванні з іншим терапевтичним засобом. Наприклад, інгібітори НМОСсСоОА- редуктази, такі як, наприклад, статини, широко застосовують при лікуванні метаболічного захворювання (див. МО 2009/043354, включений в цей документ за допомогою посилання як прикладів комбінованого лікування). Види комбінованого лікування можуть бути іншими гіпохолестеринемичними сполуками, такі як сполука, вибрана з групи, що складається із смол- секвестрантів жовчних кислот (наприклад, холестираміну, колестиполу і гідрохлориду колесевеламу), інгібіторів НМОСоА-редуктази (наприклад, ловастатину, церивастатину, правастатину, аторвастатину, симвастатину, розувастатину і флувастатину), нікотинової кислоти, похідних фібринової кислоти (наприклад, клофібрату, гемфіброзилу, фенофібрату, безафібрату і ципрофібрату), пробуколу, неоміцину, декстротироксину, складних ефірів рослинних станолів, інгібіторів абсорбції холестерину (наприклад, езетимібу), імплитапіду, інгібіторів транспортерів жовчної кислоти (апікальних натрійзалежних транспортерів жовчної кислоти), регулювальників печінкового СУР7а, засобів замісної терапії естрогеном (наприклад, тамоксифену) і протизапальних засобів (наприклад, глюкокортикоїдів). Комбінації із статинами можуть бути особливо переважними.
КОНКРЕТНІ ВТІЛЕННЯ ВИНАХОДУ бо 1. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду, що містить а. антисмисловий олігомер (А) з 12-22 нуклеотидів в довжину, що містить безперервну послідовність з 10-16 нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини 5ЕО 0 МО 30 або 31 або 32 або 33 або 34 або 45, і р. щонайменше одне ненуклеотидне або неполінуклеотидне кон'югатне угрупування (С), ковалентно приєднане до олігомеру (А). 2. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з втіленням 1, де антисмисловий олігомер містить безперервну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО 25, 26, 27, 28, 29 і 44. 3. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 1 або 0, де антисмисловий олігомер направлений на РОБКО. 4. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з 1-3, де антисмисловий олігомер містить аналоги нуклеотидів, що посилюють спорідненість. 5. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з втіленням 1, де аналоги нуклеотидів є нуклеотидами з модифікованим цукром, такими як нуклеотиди з модифікованим цукром, незалежно або залежно вибрані з групи, що складається з: ланок замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК); ланок 2'-
О-алкіл-РНК, ланок 2'-ОМе-РНК, ланок 2'-аміно-ДНК і ланок 2'-фтор-ДНК. 6. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з втіленням 4 або 5, де аналоги нуклеотидів містять або є ланками замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК). 7. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 1-6, де антисмисловий олігомер є гепмером. 8. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з втіленням 7, де гепмер утримує сегмент-крило на кожній стороні (5' і 3) з аналогів нуклеотидів, переважно аналогів ЗНК, в кількості від 2 до 4. 9. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з втіленням 7 або 8, де конструкція гепмера вибрана з групи, що складається з 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-2, 2-8-4, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 3-9-3, 3-9-4, 4-9- 3, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 3-11-3, 3-11-4, 4-11-3 і 4-11- 4. 10. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 7-9, де конструкція гепмера вибрана з групи, що складається з 2-8-3, 3-8-3, 3-9-4, 3-10-3, 2-11-2, 2-11-3 і 3-11-2. 11. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 1-10, де олігомер містить безперервну послідовність з 13, 14, 15 або 16 нуклеотидів. 12. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 1-11, де олігомер містить один або більше нуклеозидних зв'язків, вибраних з групи, що складається з фосфоротіоатної, фосфородитіоатної і боранофосфатної. 13. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 1-12, де олігомер містить або складається з фосфоротіоатних нуклеозидних зв'язків. 14. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 1-13, де олігомер містить безперервну послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕОІЮО МО 1,2,3,4,5,6,718. 15. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 1-14, де кон'югатне угрупування (С) вибране з групи, що складається з вуглеводу, такого як саіМАс або кластер саіМмАс, ліпофільна група, така як ліпід, жирна кислота; стерин, такий як холестерин або токоферол; або статин. 16. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 1-15, де кон'югатне угрупування (С) посилює доставлення та/або захоплення в клітини печінки. 17. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 1-16, де кон'югатне угрупування (С) містить стерин, такий як токоферол, холестерин, наприклад, кон'югати, показані як Сопі 5, Сопі 5а, Сопі 6 або Сопі ба. 18. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду згідно з втіленням 1-17, де кон'югатне угрупування (С) містить вуглевод, наприклад, заіМАс або тривалентних СаїЇМАс, наприклад, кон'югати, показані як Сопі 1, 2, З або 4, або Та, 2а, За або 4а. 19. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду згідно з втіленням 18, де кон'югатне угрупування (С) містить Соп) 2а. 20. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 1-19, вибраний з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 і 24. 21. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 1-20, де антисмисловий олігомер (А) кон'югований з кон'югатним угрупуванням (С) за допомогою лінкерної ділянки, розташованої між безперервною послідовністю олігомеру і кон'югатним угрупуванням (В та/або х). 22. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду згідно з втіленням 21, де лінкер вибраний з групи, що складається з аміноалкільних лінкерів, нуклеотидфосфатних лінкерів і пептидних бо лінкерів.
23. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду згідно з втіленням 21 або 22, де лінкер вибраний з С6-С12 аміноалкільних груп. 24. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду згідно з втіленням 21 або 22, де лінкер є біорозщеплюваним нуклеотидфосфатним лінкером, що містить від 1 до 6 нуклеотидів. 25. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду згідно з будь-яким з втілень 21-24, де лінкер (В) є фосфодіефірним нуклеотидним зв'язком, що містить один або більше суміжних нуклеотидів ДНК, пов'язаних фосфодіефірним зв'язком, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5 або 6 суміжних нуклеотидів ДНК, пов'язаних фосфодіефірним зв'язком, які є суміжними з 5' або 3' кінцем безперервної послідовності олігомеру, і які можуть формувати або не формувати спаровування комплементарних основ з послідовністю-мішенню РОКУ. 26. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду згідно з втіленням 24 або 25, де фосфодіефірний нуклеотидний зв'язок (або біорозщеплюваний лінкер) містить 1, 2 або З нуклеотиди ДНК, пов'язані фосфодіефірним зв'язком, наприклад, два нуклеотиди ДНК, пов'язані фосфодіефірним зв'язком, наприклад, динуклеотид 5' СА 3". 27. Олігомер з 12-22 нуклеотидів в довжину, який містить або а. безперервну послідовність з 16 нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини 5ЕО ІЮ МО 31, або р. безперервну послідовність з 10-16 нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини 5ЕО ІЮО МО 33 або 34 або 45. 28. Олігомер згідно з втіленням 27, який містить безперервну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮО МО 26, 27, 28, 29 і 44. 29. Олігомер згідно з будь-яким одним з втілень 27 або 28, де олігомер направлений на
РОКУ. 30. Олігомер згідно з будь-яким одним з втілень 27-29, де безперервна послідовність містить аналоги нуклеотидів, що посилюють спорідненість. 31. Олігомер згідно з втіленням 30, де аналоги нуклеотидів є нуклеотидами з модифікованим цукром, такі як нуклеотиди з модифікованим цукром, незалежно або залежно вибрані з групи, що складається з: ланок замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК); ланок 2'-О-алкіл-
РНК, ланок 2'-ОМе-РНК, ланок 2'-аміно-ДНК і ланок 2'-фтор-ДНК. 32. Олігомер згідно з втіленням 30 або 31, де аналоги нуклеотидів включають або є ланками замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК). 33. Олігомер згідно з будь-яким одним з втілень 30-32, що являє собою гепмер, такий як гепмерний олігонуклеотид замкненої нуклеїнової кислоти. 34. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з втіленням 33, де гепмер утримує сегмент-крило на кожній стороні (5' і 3) з 2-4 аналогів нуклеотидів, переважно аналогів ЗНК. 35. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з втіленням 32 або 33, де конструкція гепмера вибрана з групи, що складається з 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-2, 2-8-4, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 3-9-3, 3-9-4, 4-9- 3, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 3-11-3, 3-11-4, 4-11-3 і 4-11- 4. 36. Кон'югат олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 33-35, де конструкція гепмера вибрана з групи, що складається з 2-8-3, 3-8-3, 3-9-4, 3-10-3, 2-11-2, 2-11-3 і 3-11-2. 37. Олігомер згідно з будь-яким одним з втілень 27-36, де олігомер містить безперервну послідовність з 13, 14, 15 або 16 нуклеотидів. 38. Олігомер згідно з будь-яким одним з втілень 27-37, де олігомер містить один або більше нуклеозидних зв'язків, вибраних з групи, що складається з фосфоротіоатного, фосфородитіоатного і боранофосфатного. 39. Олігомер згідно з будь-яким одним з втілень 27-38, де олігомер містить фосфоротіоатні нуклеозидні зв'язки або складається з них. 40. Олігомер згідно з будь-яким одним з втілень 27-39, який містить безперервну
БО послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕОІЮ МО2, 3,4,5,6, 718. 41. Фармацевтична композиція, яка містить кон'югат олігомеру або антисмислового олігонуклеотиду згідно з будь-яким одним з втілень 1-40 і фармацевтично прийнятний розчинник, носій, сіль або ад'ювант. 42. Кон'югат олігомеру або антисмислового олігонуклеотиду або фармацевтична композиція згідно з будь-яким одним з втілень 1-40 для застосування як лікарського засобу, наприклад, гіперхолестеринемії або спорідненого розладу, такого як розлад, вибраний з групи, що складається з атеросклерозу, гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, сімейної гіперхолестеринемії, наприклад, накопичення функціональних мутацій в РСОСБКУ, дисбалансу ЛІВЩ/ЛІПНЩ холестерину, дисліпідемій, наприклад, сімейної гіперліпідемії (СКГ) або сімейної гіперхолестеринемії (СГХС), придбаної гіперліпідемії, статин-резистентної гіперхолестеринемії, хворобі коронарних артерій (КАХ) та ішемічної хвороби серця (ІХС). 43. Застосування кон'югата олігомеру або антисмислового олігонуклеотиду або фармацевтичної композиції згідно з будь-яким одним з втілень 1-40 для одержання лікарського засобу для лікування гіперхолестеринемії або спорідненого розладу, такого як розлад, вибраний з групи, що складається з атеросклерозу, гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, сімейної гіперхолестеринемії, наприклад, накопичення функціональних мутацій в РО5КОУ, дисбалансу
ЛИВЩ/ЛІПНЩ холестерину, дисліпідемій, наприклад, сімейної гіперліпідемії (СКГ) або сімейної гіперхолестеринемії (СГХС), придбаної гіперліпідемії, статин-резистентної гіперхолестеринемії, хворобі коронарних артерій (КАХ) та ішемічної хвороби серця (ІХС). 44. Спосіб лікування гіперхолестеринемії або спорідненого розладу, такого як розлад, вибраний з групи, що складається з атеросклерозу, гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, сімейної гіперхолестеринемії, наприклад, накопичення функціональних мутацій в РСОБ5КОУ, дисбалансу
ЛИВЩ/ЛІПНЩ холестерину, дисліпідемій, наприклад, сімейної гіперліпідемії (СКГ) або сімейної гіперхолестеринемії (СГХС), придбаної гіперліпідемії, статин-резистентної гіперхолестеринемії, хворобі коронарних артерій (КАХ) та ішемічної хвороби серця (ІХС), де спосіб включає введення ефективної кількості кон'югата олігомеру або антисмислового олігонуклеотиду або фармацевтичної композиції згідно з будь-яким одним з втілень 1-40 пацієнтові, що страждає або ймовірно страждає гіперхолестеринемією або спорідненим розладом. 45. Спосіб інгібування РОЗКО іп мімо або іп міго в клітині, експресуючій РОБ5КО, де спосіб включає введення в клітину кон'югата олігомеру або антисмислового олігонуклеотиду або фармацевтичної композиції згідно з будь-яким одним з втілень 1-40 так, щоб інгібувати РОЗКОУ в цій клітині.
ПРИКЛАДИ
Олігонуклеотиди синтезували на уридинових універсальних носіях з використанням фосфорамідитного методу на синтезаторі Ехреййе 8900/МО55 (МиШріеє ОіїдописіІеоїіае
Зупіпевіз бузієт) або Оїїдотакег 48 в масштабі синтезу 4 або 1 мкмоль відповідно. У кінці синтезу олігонуклеотиди відщеплювали від твердого носія з використанням водного аміаку протягом 5-16 годин при 60 "С. Олігонуклеотиди очищали за допомогою ВЕРХ з оберненою
Зо фазою (ОФ-ВЕРХ) або за допомогою твердофазних екстракцій і характеризували за допомогою надефективної рідинної хроматографії (НВЕРХ), і молекулярну масу додатково підтверджували за допомогою мас-спектрометрії з іонізацією електророзпиленням (ІЕР-МС). Додаткові подробиці див. нижче.
Елонгація олігонуклеотиду
Поєднання В-ціаноетил-фосфорамідитів (ДНК-А(В2), ДНК-С(іби), ДНК-С(В2), ДНК-Т, ЗНК-5- метил-С(В2), ЗНК-А(В2), ЗНК-С(аті), ЗНК-Т або лінкера Сб6-5-5-С6) виконують з використанням розчину 0,1 М 5-0-ЮОМТ-захищеного амідиту в ацетонітрилі і ОСІ (4,5-диціаноїмідазолу) в ацетонітрилі (0,25 М) в якості активатора. Для кінцевого циклу використовували наявний в продажі Сб-зв'язаний холестерин з фосфорамідитом при 0,1 М в ДХМ. Включення тіолових груп для введення фосфоротіоатних зв'язків виконують шляхом використання гідриду ксантану (0,01
М в суміші ацетонітрил/піридин 9:1). Фосфодіефірні зв'язки вводять з використанням 0,02 М йоду в суміші ТГФ/піридин/вода 7:21. Інші реагенти є реагентами, в характерному випадку вживані для олігонуклеотидного синтезу. Для кон'югації потім твердофазного синтезу використовують наявний в продажі Сб-амінолінкер-фосфорамідит на останньому циклі твердофазного синтезу, і після видалення захисту і відщеплення від твердого носія виділяють аміно-зв'язаний незахищений олігонуклеотид. Кон'югати вводять за допомогою активації функціональної групи з використанням стандартних способів синтезу.
Очищення за допомогою ОФ-ВЕРХ:
Неочищені сполуки очищали за допомогою препаративної ОФ-ВЕРХ на колонці Рпепотепех
Уирієг С18 10 мкм, 150х10 мм. Як буфери використовували 0,1 М ацетат амонію рН 8 і ацетонітрил при швидкості струму 5 мл/хв. Зібрані фракції ліофілізували з одержанням очищеної сполуки, в характерному випадку у вигляді білої твердої речовини.
Скорочення:
ОСІ: 4,5-Диціаноїмідазол
ДХМ: Дихлорметан
ДМФ: Диметилформамід
ДМТ: 4,4"- Диметокситритил
ТГФ: Тетрагідрофуран
В: Бензоїл 60 Іби: Ізобутирил
ОФ-ВЕРХ: Високоефективна рідинна хроматографія з оберненою фазою
Сполуки синтезували, як показано в таблиці 1, а також проілюстровано на фігурах.
Приклад 1. Відкриття нового мотиву-мішені РОБКО
Був сконструйований і синтезований 521 антисмисловий олігонуклеотид проти РОКУ, де усі вони містили три замкнуті нуклеїнові кислоти, фланкуючі десять ДНК, тобто конструкцію 16- мірного гепмера ЗНК, де олігонуклеотид специфічний до РО5КОУ людини і приматів. Лінію 15РСЗ клітин людини інкубували протягом трьох діб або з помилково-модифікованими олігонуклеотидами, або з олігонуклеотидами, модифікованими замкненою нуклеїновою кислотою, направленими на РО5КУ людини, при концентрації 0,3 мкМ. Кожен олігонуклеотид проти РСОБКУ тестували в трьох незалежних експериментах. Рівні мРНК РОБКУО кількісно визначали з екстрагованої РНК з використанням ПЛР в реальному часі, як описано, і представляли в нормалізованому вигляді за мРНК В-актином і відносно середніх рівнів в дванадцяти помилково-оброблених зразках на Фіг. 8, де підгрупа найбільш ефективних молекул детально розглянута на Фіг. 9.
Приклад 2. Нокдаун мРНК іп міїго
Лінію 15РСЗ клітин людини інкубували протягом З діб або з помилково-модифікованими олігонуклеотидами, або з олігонуклеотидами, модифікованими замкненою нуклеїновою кислотою, послідовності 5ЕО ІЮ 1-8, направленими на РСБ5БКОУО людини, при концентраціях 0,0012, 0,06, 0,3 ї 1,5 мкМ. Рівні мРНК РОБКОУ кількісно визначали з екстрагованої РНК, використовуючи ПЛР в реальному часі, як описано, і представляли відносно середніх рівнів в чотирьох помилково-оброблених зразках на Фіг. 10. Для кожного олігонуклеотиду ефективність, визначену як половинну максимальну ефективну концентрацію (ЕС5О), визначали методом найменших квадратів за відповідністю рівнянню Хілла в двохпараметричній логістичній формі з фіксованою нижньою межею 095 і фіксованою верхньою межею 10095 як ЕС5О - оцінка ж стандартне відхилення.
Приклад 3. Рівні АЇ ТТ іп мімо
Чотири самиці мишей ММК у віці чотирьох тижнів (компанія Тасопіс, Данія), що важать приблизно 20 г після прибуття, ін'єктували внутрішньовенно один раз або фізіологічним розчином, або олігонуклеотидами, модифікованими замкненою нуклетовою кислотою,
Ко) кон'югованими з холестерином, послідовностей ЗЕО ІО 9-16, направленими на РОКУ людини при дозах 7,5 і 15 мг/кг. Мишей убивали через 7 діб після введення і визначали сироваткові рівні аланінамінотрансферази (АТ) з використанням ферментативного аналізу (Ногіба АВХ
Ріадповійс5). Для кожної експериментальної групи з п'яти мишей обчислювали середні значення і стандартні відхилення і представляли на Фіг. 11 відносно середніх рівнів у мишей, оброблених фізіологічним розчином. Підйоми АЇ Т були відмічені при обох концентраціях для деяких, але не для усіх молекул, кон'югованих з холестерином. Декілька із сполук, таких як ХЕО ІЮ МО 9 і 10, клінічно значущо не збільшували АТ у мишей навіть у разі використання холестерину як кон'югата для посилення захоплення сполук в печінці.
Приклад 4: Дослідження на нелюдиноподібних приматах
Першочергова мета цього дослідження полягала у вивченні вибраних ліпідних маркерів через 7 тижнів після одноразової болюсной ін'єкції сполук ЗНК проти РСБ5КУ яванським макакам і в оцінці потенційної токсичності сполук у мавп. Сполуки, використовувані в цьому дослідженні, мали послідовності 5Е0О ІЮ МО 10 13, 18, 19, 20 і 21, приготовані в стерильному фізіологічному розчині (0,995) при початковій концентрації 0,625 і 2,5 мг/мл.
Використовували самців мавп у віці щонайменше 24 місяців і надавали їм вільний доступ до проточної води і розподіляли по 180 г збільшеного раціону МУ/М(Е) ЗОС ЗНОКТ (бієїех Егапсе, 505, Сен-Гратьєн, Франція) на тварину в добу. Сумарну кількість корму, розподілену в кожну клітину, обчислюють відповідно до числа тварин в клітині на цю добу. Крім того, кожній тварині щодоби давали фрукти або овочі. Тварин акліматизували до умов дослідження протягом періоду щонайменше 14 діб до початку експериментального періоду обробки. Протягом цього періоду проводили попередні дослідження. Тварин дозували внутрішньовенно (і.м.) в одноразовій дозі 0,25, 1,0 або 2,5 мг/кг (ЗЕО ІЮ МО 10, 13, 18 і 21) або в одноразовій дозі 1,0 або 2,5 мг/кг (ЗЕО ІО МО 19 і 20). Об'єм дози складав 0,4 мл/кг Використовували 2 тварини на групу.
Дози препаратів вводили один раз на добу 1. Тварин спостерігали протягом періоду 7 тижнів після обробки і виводили з дослідження на добу 51. Доба 1 відповідають першій добі періоду експерименту. Клінічні спостереження, масу тіла і споживання їжі (на групу) реєструють до і під час дослідження.
Забирання зразків крові і аналізи виконували в наступні моменти часу:
дослідження 1-8 |ВСР,.САро-В,РОЗКОУЗ ОА З ния іван
ОА
ВСР (тошііпе сіїпіса! раїйо!оду) - стандартна клінічна патологія,
І 5В (Іїмег загеїу ріоспетівігу) - біохімічні показники безпеки для печінки,
РК - фармакокінетика,
ОА (оїПег апа/пувів) - інші аналізи,
І (Шріав) - ліпіди.
У вказаних нижче випадках для усіх тварин, що вижили, визначали наступні параметри:
Повна біохімічна панель (повний перелік нижче) - на добу - 8, 151 50,
Безпека для печінки (тільки аспартатамінотрансфераза (АСТ), лужна фосфатаза (ЛФ), аланінамінотрансфераза (АЛТ), загальний білірубін і гамма-глутамілтрансфераза (ГІ)) - на добу 4,8, 22 і 36,
Ліпідограма (загальний холестерин, Х-ЛІВЩ, Х-ЛІПНЩ і тригліцериди) і тільки Аро-В - на добу - 1, 4, 8, 22, 29, 36 і 43.
Кров (приблизно 1,0 мл) брали в пробірки з літієм-гепарином (використовуючи біохімічний аналізатор крові АОМІА 1650): Аро-В, натрій, калій, хлорид, кальцій, неорганічний фосфор, глюкоза, Х-ЛПВЩ, Х-ЛІНЩ, сечовина, креатинін, загальний білірубін, загальний холестерин, тригліцериди, лужна фосфатаза (ЛФ), аланінамінотренсфераза (АЛТ), аспартатамінотрансфераза (АСТ), креатинінкіназа, гамма-глутамілтрансфераза (ГП), лактатдегідрогеназа, загальний білок, альбумін, відношення альбумін/глобулін.
Аналіз РОКУ в крові: Зразки крові на аналіз РО5КОУ збирали на добу -8, -1, 4, 8, 15, 22, 29, 36, 43 і 50. Венозну кров (приблизно 2 мл) збирали з відповідної вени кожної тварини в пробірку для відділення сироватки (551; Зегит Зерагайпуд Тире) і давали можливість згорнутися протягом щонайменше 60 ї- 30 хвилин при кімнатній температурі. Кров центрифугували при 1000 уд протягом 10 хвилин в умовах охолодження (встановлено на підтримку 4 "С). Сироватку переносили в З індивідуальних пробірки і зберігали при -80 "С до аналізу в компанії Спохі АВ,
Франція, використовуючи спосіб твердофазного імуноферментного аналізу (ІФА) (набір для ІФА
Сігсшех Нитап РОБКО, СУ - 8079, підтверджений для зразків від яванського макака).
Інші аналізи: В МУО 2011009697 запропоновані способи наступного аналізу: аналіз мРНК
РОЗКОУ за допомогою кількісної ПЛР (ДПЛР). Інший аналіз включав ІФА білка РОЗКОУ, аналіз
Гр(а) сироватки за допомогою ІФА (Мегсодіа Мо. 10-1106-01), аналіз олігонуклеотидів в тканині і плазмі (вміст лікарського засобу), екстракція зразків, стандартні зразки і зразки контролю якості, визначення вмісту олігонуклеотидів за допомогою ІФА.
Дані для сполук, направлених на РОБКО, приведені в наступній таблиці:
Зо
Макс. вплив Х-
Макс. ввплив РО5КОУ лИвВщ
Значення для (дані позначають (дані позначають дози 2,5 мг/кг процент від значення процент від перед дозуванням) | значення перед дозуванням)
Білок РО5КОУ доба |Білок РОЗКОУ доба
Сполука 4 (процент від 239 (процент від
ЗЕО І значення перед значення перед дозуванням дозуванням 7107 Ї77777717186 777 |777717117715 | бобв(дт5) | 87бе(029) ЩГ 719 Ї777171711755 | 60 | Боба) | во(р
Вказівки на гепатотоксичність або нефротоксичність при сполуках, направлених на РОЗКО, були відсутні. Слід зазначити, що сполуки РОСБКОУ-сСаМмАс призводили до швидкої і високоефективної знижуючої регуляції РОБКОУ, яка підтримувалася протягом тривалого періоду часу (вся тривалість дослідження), ілюструючи, що сполуки, кон'юговані з зЗаїІМАс, ефективніші, як відносно швидкого початкового нокдауну, так і відносно тривалого періоду, що вказує на те, що їх можна дозувати порівняно нечасто і в нижчій дозі, як в порівнянні з некон'югованими початковими сполуками, так і в порівнянні із сполуками, одержаними з використанням альтернативної технології кон'югації, такий як кон'югація з холестерином. 5ЕО ІЮ МО 18 призводила до швидкої і узгодженої знижуючої регуляції РОЗКУ і Х-ЛІОВЩ упродовж усього дослідження (спостережуваною на добу 34 при дозі 2,5 мг/кг при значній знижуючій регуляції
РОБКО, спостережуваній через 48 діб після введення одноразової дози 2,5 мг/кг, де рівень білка
РОБЗКУОУ в плазмі складав 7195 від рівня перед дозуванням).
Приклад 5: Оцінка печінкової і ниркової токсичності у щурів
Сполуки за винаходом можна оцінювати на їх профіль токсичності у гризунів, наприклад, у мишей або щурів. Можна використовувати наведений нижче протокол. Використовували самців щурів лінії М/ієїтаг Нап Сіті: УМ(Нап) у віці приблизно 8 тижнів. У цьому віці самці важили приблизно 250 г. Усі тварини мали вільний доступ до гранульованого збалансованого корму
ЗОМІРЕ В/М-Н (55МІБЕ БЗреліаІдійїеп ЗтЬН, Зост, Німеччина) і до проточної води (профільтрованої через фільтр 0,22 мкм), що міститься в пляшках. Використовували рівень дози 10 і 40 мг/кг/доза (підшкірне введення) і дозували на добу 1 і 8. Тварин піддавали евтаназії на добу 15. Зразки сечі і крові збирали на добу 7 і 14. Обстеження на клінічну патологію проводили на добу 14. Масу тіла визначають перед дослідженням, на першу добу введення і за 1 тиждень до аутопсії. Споживання їжі на групу визначали щодоби. Зразки крові брали з хвостової вени після 6 годин голодування. Проводили наступний аналіз зразків крові: кількість еритроцитів, середній об'єм еритроцитів, об'єм обложених еритроцитів, гемоглобін, середня концентрація гемоглобіну в клітині, кількість тромбоцитів, кількість лейкоцитів, диференціальна кількість лейкоцитів з морфологією клітини, кількість ретикулоцитів, натрій, калій, хлорид,
Зо кальцій, неорганічний фосфор, глюкоза, сечовина, креатинін, загальний білірубін, загальний холестерин, тригліцериди, лужна фосфатаза, аланінамінотрансфераза, аспартатамінотрансфераза, загальний білок, альбумін, відношення альбумін/глобулін.
Проводили анализ сечі: а-глутатіон-5 трансфераза (5571), В-2 мікроглобулін, кальбіндин, кластерин, цистатин С, КІМ-1, остеопонтин, тканинний інгібітор металлопротеїназ (ТІМР; Тіззце
Іппірйог ої МеїаїПоргоївіпазе-1), фактор роста ендотелію сосудів (МЕСЕ; мазсшіаг епаотегїаї дгоулй Тасіог) і нейтрофільний желатиназо-асоційований ліпокалін (МОАГ; пешгорпії деїайпазе- аззосіагей Іросаїйп). Сім аналітів (кальбіндин, кластерин, З5Т-а, КІМ-1, остеопонтин, ТІМР- 1,
МЕСРЕ) кількісно визначали на панелі 1 (панель 1 ниркової токсичності у щурів на магнітних мікроносіях МІН ІРГЕХ? МАР, АКТХІМАС-37К). Три аналіти (В-2 мікроглобулін, цистатин С, ліпокалін-2/МАГ) кількісно визначали на панелі 2 (панель 2 ниркової токсичності у щурів на магнітних мікроносіях МІП ІРГЕХ? МАР, АКТХІМАа-37К). Аналіз на визначення концентрації цих біомаркерів в сечі щурів була заснована на технології І штіпех хМАРУ. Мікроносії, покриті антитілами проти 0-551/Д-2 мікроглобуліну/кальбіндину/кластерину/цистацину /С/КІМ-1/ остеопонтину/ТІМР-1Л/ЕСЕ/МОАЇ, кодували за кольором двома різними флуоресцентними барвниками. Визначали такі параметри (сеча з використанням АЮМІА 1650): Білок в сечі, креатинін в сечі. Кількісні параметри: об'єм, рН (з використанням тестерних смужок 10-Мийівїїх
Зб/аналізатора сечі Сііпйек 500), питома щільність (з використанням рефрактометра).
Напівкількісні параметри (з використанням тестових смужок 10 - Мийівїїх 5С/аналізатора сечі
Сіїпйек 500): білки, глюкоза, кетон, білірубін, нітрил, кров, уробіліноген, цитологія осаду (за допомогою мікроскопічного дослідження). Якісні параметри: зовнішній вигляд, колір. Після умертвіння визначають масу тіла і масу нирок, печінки і селезінки і обчислюють відношення маси тіла до маси органів. Зразки нирок і печінки брали і або заморожували, або зберігали у формаліні. Проводили мікроскопічний аналіз. Дані для експресії Кіт-1 показані на Фіг. 15, де продемонстровано, що всі молекули за винятком 5ЕО ІЮ МО 4 мають нижчий сигнал Кіт - 1 в сечі, ніж БЕО ІЮ МО 1, що демонструє нижчу ниркову недостатність в порівнянні з оригінальною і раніше охарактеризованою некон'югованою молекулою.
Приклад 6. Аналіз розщеплюваних лінкерів
Антисмислові олігомери (АСО), мічені РАМ, з різними лінкерами ДНК/РО піддавали розщеплюванню іп міго, або в нуклеазному екстракті 51 (таблиця нижче), або в гомогенатах печінці або нирок, або в сироватці.
Ме | Зеда(5-3) | Розщеплюваний лінкер (В) | Кон'югат (С)
Заголовні букви є нуклеозидами ЗНК (такими як бета-О-окси ЗНК), рядкові букви є нуклеозидами ДНК. Нижній індекс 5 є фосфоротіоатними міжнуклеозидними зв'язками.
Цитозини ЗНК необов'язково є 5-метил цитозином. Кон'югатне угрупування ГАМ показане на
Фіг. 6, і молекули показані на Фіг. 7.
Мічені РЕАМ АСО 100 мкМ з різними лінкерами ДНКЮ/РО піддавали розщеплюванню іп міїго нуклеазою 51 в нуклеазному буфері (60 од. на 100 мкл) протягом 20 і 120 хвилин (А).
Ферментативну активність зупиняли додаванням етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА) в буферному розчині. Потім розчини піддавали аналізу за допомогою ВЕРХ АЇїЕ на приладі Сіопех
ОШітагїе 3000, використовуючи колонку біопех ОМАрас р-100 і градієнт в діапазоні від 10 мМ до 1 М перхлорату натрію при рН 7,5. Вміст розщеплених і нерозщеплених олігонуклеотидів визначали проти стандарту, використовуючи обидва детектори, детектор флуоресценції при
Зо 615 нм і детектор УФ при 260 нм. 89 1-12 штли и пох ох ПО Сто п
Висновок: Результатом включення лінкерів РО (або ділянки В, на яку посилаються в цьому документі) є відщеплення кон'югата (або групи С), і обидва параметри з довжини та/або послідовності композиції лінкера можна використовувати для модуляції чутливості до нуклеолітичного розщеплювання ділянки В. Послідовність лінкерів ДНК/РО може модулювати швидкість розщеплювання, що спостерігають після 20 хв в нуклеазному екстракті 51. Вибір послідовності для ділянки В (наприклад, для лінкера ДНК/РО) можна, таким чином, також використовувати для модуляції рівня розщеплювання в сироватці і в клітинах тканин-мішеней.
До гомогенатів печінки і нирок додавали точну кількість сполуки ЗЕО ІЮО МО 35 до концентрацій 200 мкг/г тканини. Зразки печінки і нирок, зібрані від мишей ММКІ, гомогенізували в буфері гомогенізації (0,595 Ідераї СА - 630, 25 мМ Трис рН 8,0, 100 мМ Масі, рН 8,0 (доведений 1 н. Маон). Гомогенати інкубували протягом 24 годин при 37 "С, а потім гомогенати екстрагували фенолом - хлороформом. Вміст розщеплених і нерозщеплених олігонуклеотидів в екстракті з печінки ї нирок і з сироватки визначали проти стандарту, використовуючи описаний вище спосіб ВЕРХ :
ІЮ |послідовність| з гомогенатом печінки гомогенатом нирки 24 г в сироватці
ШЕ ЕС ПО: Х ЗОН КОН Те ВО КО НО
Висновок: Результатом включення лінкерів РО (або ділянки В, на яку посилаються в цьому документі) є відщеплення кон'югата (або групи С) в гомогенаті печінці або нирок, але не в сироватці. Чутливість до розщеплювання в аналізах, показаних в прикладі б, можна використовувати для визначення, чи є лінкер біорозщеплюваним або фізіологічно лабільним.
Слід зазначити, що розщеплювання в описаних вище аналізах відноситься до розщеплювання розщеплюваного лінкера, при цьому олігомер або ділянка А повинні залишатися функціонально інтактним.
Приклад 7: Нокдаун мРНК РО5КУ кон'югатами холестерину іп мімо
РОБЗКУО - Сполуки, специфічні для миші
Ме | зед (5-3) (А)
Мишам ММК! ін'єккгували одноразову дозу фізіологічного розчину, або 10 мг/кг некон'югованого антисмислового олігонуклеотиду ЗНК (ЗЕО ІО 40), або еквівалентні кількості антисмислових олігонуклеотидів ЗНК, кон'югованих з холестерином з різними лінкерами і убивали на добу 1-10 відповідно до таблиці 5.
РНК виділяли з печінки і нирок і піддавали дДПЛР з праймерами, специфічними до РОБКУ, і зондом для аналізу нокдауну МРНК РОЗКУ. Результати показані на Фіг. 14.
Висновки: Холестерин, кон'югований з антисмисловим олігонуклеотидом ЗНК до РОКУ з лінкером, що складається з 2 ДНК з фосфодіефірним каркасом (ЗЕО ІО МО 42 і 5ЕО ІО МО 43), показав підвищений нокдаун РОБКУ в печінці (Фіг. 14) в порівнянні з некон'югованою сполукою (ЗЕО ІО МО 40), а також в порівнянні з кон'югатами холестерину із стабільним лінкером (ЗЕО ІЮ
МО 41).
Матеріали і методи:
Схема експерименту: (часігвнтв таовчня Кільнеть -СбИННестать | тіаень доз сновиви СИН МНН руля | дова дова ї пе ВИ месечеко харчування й темі дани п ПЧ ГЕ: ПДАА ттвна В | зе теарян ввення ма добу «В вік тееденнь | дорвания кобв у уееревіння ен и ни и пн и и и и в п ! їм з мелена | івідмотчний Вично - ї вва | 1 :
ШИ пиши ння пн пень у вчи ни он пон пон пня вро 3 ме шов. й знме іш "ж ШЕ і : ; ення пови она знан пи мини нн мно панові нан нн зн зи
Н і зона в : і Н Е ї зро оз 0 МНенсрая ванною І ілзвимя м вода | о рр п про риниин ПИМ мн нин пиши ни тя
Своя з 0 ЯМАОЮУюЯ | вавианне іонних ев Н х вен а п В п а и паст тварина бознкічь харчуванню рчвачь дози кнавуєь ободова ов мив, ДЖ т с: С З, тварина вд Зб колине введення) дозування доба авт ня
І ї 1 1 7 т Щи п пивний нин
В 4 Е 3 мМУнися у в 1 і Н : ї в их : 1 ММК сУСухий БОМ МОЯ оп нннк х ШИ: : в ! ТВ З хори вивімопнрна 12.7 мин Ти? вия ши о; 8. ! і : фея Кн панни ша С нн нн ння панни ви ка віх 3 ммрртачня 1аво жнно «о това з витяг | х т 8.3 з / ; дво БЕо ж МмОоЯ: | | | ' я Ж У і нив сукнй Фивімсннрме біз г 5 | З ' і шо тей вейх і | ! ї ввженттячоох ВЕСНОЮ Мона І ! і 13 | 3-х КУ НМА жсунй ахвімемарно здана Мо а раз З !
Е і хор ТАТ вве і ; ; | ! і ; | пкнадрсятьяи ек х НЕ | :
І тх ої зв 31 ММК ен унне квннолярно ДУ ва! Ох З 53 | з і ; | хор 15 я ! ' :
Н МУ - з Е! МНК рАхмй еф твчя ще : й ! 5 т - | їч Н 34 : же ! З | шен яко зно м | і ми м В ВУ | 7 ! : : хивуисктнния 1 Ба ! зорях 800 | ММНАсума ешімолярно Злам м в с НЕ а Е | : що 11 я ! ! : і; З січня 30 ВЕБ МОЯ. І і і ше в ни Не и НМ ЕК ИМЯ 5 шт
ЇЇ З хор Н 412,7 юеке І Н ; : ; | Курячий 1 ВОНО | І ! і і ! і тр яка з 1 ММКТИСУХКК 0 вріжолярна 1ді вна | м і ШОН 7 ! і І кори Е І мийку ! :
ЕД Ше ня ї відвнегізний розчин - м ва, х За щі зів зр и жом ера
Н : нуютьука 1 00 ВБО ЕМО « і : ї
КЕ зів З ММК тигра : якайаатярня ЯЗ меле їм 5) РПОЯ, ЩІ т В і | хори : 13 меж | | : ! | солдчення 0 ЗВО Ж МО ко І ї і Е
ВЕ: си ШИ Но І от в в т я п в о КА
НЕ ши і 1 вагік ! : | і шк ни: шиє уонеопеня ші | | "шишки ши
ШИ . Гора
Введення дози. Самицям тварин ММРЕЇ, приблизно 20 г після прибуття, дозували 10 мл на кг маси тіла (ВУМ) (відповідно до маси тіла (бодужмеїдні) на добу 0) внутрішньовенно (і.м.) сполуки, включеної у фізіологічний розчин, або одного фізіологічного розчину відповідно до наведеної вище таблиці.
Забирання зразків тканини печінки і нирок. Тварин анестезували 7095 СО2-3095 О» і убивали цервикальною дислокацією відповідно до таблиці 4. Половину великої частки печінки і одну нирку подрібнювали і занурювали в розчин для стабілізації РНК КМАЇїагїег.
Сумарну РНК екстрагували з максимум 10 мг тканини, гомогенізованої за допомогою шарового млина у присутності буфера для виділення РНК з тканин МадмМА Риге ІС (Коспе, Мо за каталогом 03 604 721 001), з використанням набору для виділення клітинної РНК великого об'єму МадМа Риге 96 (Коспе, Мо за каталогом 5467535001) згідно з інструкціями виробника.
Синтез першої нитки виконували, використовуючи реагенти для зворотної транскриптази від компанії Атбіоп згідно з інструкціями виробника.
Для кожного зразка 0,5 мкм сумарної РНК доводили до (10,8 мкл) НгО, що не містить РНКаз, і змішували з 2 мкл випадкових декамерів (50 мкМ) і 4 мкл суміші аМТР (2,5 мМ кожного аМТР) і нагрівали до 70 "С протягом З хв, після чого зразки швидко охолоджували на льоді. До кожного зразка додавали 2 мкл 10х буфера зворотної транскрипції (ЗТ), 1 мкл зворотної траскриптази
ММІМ (100 од./мкл) і 0,25 мкл інгібітору РНКаз (10 од./мкл) з наступною інкубацією при 427 протягом 60 хв, термічною інактивацією ферменту при 95 "С протягом 10 хв, а потім зразок охолоджували до 4 "С. Зразки кКДНК розводили 1:5 і піддавали ЗТ-ДПЛР, використовуючи основну універсальну суміш для швидкої ПЛР Тадтап 2х (компанія Арріїей Віозубіете Мо за каталогом 4364103) і аналіз експресії генів Тадтап (птРСБКУ, МпО0463738 ті і таАсіїп й43523А41Є), слідуючи протоколу виготівників, і проводили реакції в приладі компанії Арріїей
Віозузієтв ВТ- ЗРСК (7500/7900 або МіЇА7) в швидкому режимі.
Приклад 8: Дослідження на нелюдиноподібних приматах; багатократні підшкірні (5.с.) ін'єкції
Мета цього дослідження на нелюдиноподібних приматах полягала в оцінці ефективності і безпеки сполук, направлених проти РОБЗКО, в умовах багатократного введення при введенні сполук шляхом підшкірної ін'єкції (5.с.). Сполуки, використовувані в цьому дослідженні, мали послідовності БЕО ІЮ МО 2, 3, 18 ії 19, приготовані в стерильному фізіологічному розчині (0,990) при початковій концентрації 0,625 і 2,5 мг/мл.
Використовували самиць яванського макака у віці щонайменше 24 місяці і надавали їм вільний доступ до проточної води і розподіляли по 180 г збільшеного раціону МУ/М(Е) 5ОС
ЗНОКТ (Оієїех ЕРгапсе, 505, Сен-Гратьєн, Франція) на тварину в добу. Крім того, кожній тварині щодоби давали фрукти або овочі. Тварин акліматизували до умов дослідження протягом періоду щонайменше 14 діб до початку експериментального періоду обробки. Протягом цього періоду проводили попередні дослідження. Тварин дозували 5.с. один раз на тиждень протягом чотирьох тижнів в дозі 0,5 мг/кг (ЗЕО ІЮ МО 2, 3, 18 ї 19) або 1,5 мг/кг/ін'єкція (ЗЕО ІЮ МО 18 і 19), сумарно чотири ін'єкції за період чотири тижні. Об'єм дози складав 0,4 мл/кг/ін'єкція.
Використовували шість тварин на групу. Після четвертої і останньої дози тварин спостерігали протягом тижня, після чого половину тварин убивали з метою вивчення регуляції транскрипту ароВ в печінці, параметрів ліпідів, гістологічного дослідження печінки і нирок і тканинного розподілу в печінці і нирках. Доба 1 відповідає першій добі експериментального періоду. Клінічні спостереження, масу тіла і споживання їжі (на групу) реєстрували до і під час дослідження.
Зразки крові і тканин відбирали і аналізували в наступні моменти часу: 8 перед 7711118 |Дозування.:5:г: 15 перед 22 перед аутопсія видужали 43 (тварини, що видужали) видужали) видужали) видужали) видужали) реабілітаційна аутопсія
ЕСР: стандартна клінічна патологія, І 5В: біохімічні показники безпеки для печінки, РК: фармакокінетика, ОА: інші аналізи, І: ліпіди
Кров (приблизно 1,0 мл) брали в пробірки з літієм-гепарином (використовуючи біохімічний
Зо аналізатор крові АОМІА 1650): Аро-В, натрій, калій, хлорид, кальцій, неорганічний фосфор,
глюкоза, Х-ЛПВЩ, Х-ЛІНЩ, сечовина, креатинін, загальний білірубін, загальний холестерин, тригліцериди, лужна фосфатаза (ЛФ), аланинамінотренсфераза (АЛТ), аспартатамінотрансфераза (АСТ), креатинінкіназа, гамма-глутамілтрансфераза (ГП), лактатдегідрогеназа, загальний білок, альбумін, відношення альбумін/глобулін.
Аналіз крові: Зразки крові для аналізу АроВ брали тільки у тварин груп 1-16 (тобто тварин, оброблених сполуками, направленими проти АроВ) на добу -8, -1, 4, 8, 15, 22, 29, 36, 43 і 50.
Венозну кров (приблизно 2 мл) збирали з відповідної вени у кожної тварини в пробірку для відділення сироватки (551) і давали можливість згорнутися протягом щонайменше 60 ж 30 хвилин при кімнатній температурі. Кров центрифугували при 1000 д протягом 10 хвилин в умовах охолодження (встановлених на підтримку -4 С). Сироватку переносили в 3 індивідуальних пробірки і зберігали при -80 "С до аналізу білка АроВ за допомогою ІФА.
Інший аналіз: В МО 2010142805 запропоновані способи наступного аналізу: ДПЛР, аналіз
МРНК АроВ. Інші аналізи включають аналіз сироваткового І р(а) за допомогою ІФА (Мегсоаіа Мо. 10-1106-01), аналіз олігонуклеотиду в тканині і сироватці (вміст лікарського засобу), екстракцію зразків, стандартні зразки і зразки контролю якості, визначення вмісту олігонуклеотиду за допомогою ІФА.
Призначеною фармакологічною дією для олігонуклеотиду, направленого проти РОБКО, являється зниження холестерину ЛЛНЩ шляхом зменшення вмісту РО5КО в кровообігу ("РОЗК 9 в сироватці"). Кон'юговані молекули ЗаіМАс продемонстрували посилену ефективність в порівнянні з некон'югованими молекулами при дослідженні обох з РСБ5КУ в сироватці і холестерину ЛИНЩ (Фіг. 16 і Фіг. 17). На Фіг. 16 проілюстровано, що чотири щотижневі ін'єкції 0,5 мг/кгЛн'єкція некон'югованої БЕСО ІЮ МО 2 має лише незначні дії на РО5КОУ в сироватці і холестерин ЛИНЩ, тоді як кон'югати з СаіІМАс того ж гепмера ЗНК (ЗЕО ІО 18) мали сильну знижуючу дію на обидва з РО5КУ в сироватці і холестерину ЛИНЩ. Таке ж співвідношення було відмічене при порівнянні даних для багатократних ін'єкцій 5ЕО ІЮ МО З і БЕО ІО МО 19 (Фіг. 17): лише незначні дії некон'югованої молекули і сильна знижуюча регуляція РОКУ і холестерину
ЛИН в сироватці відповідним кон'югатом саіМАс (5ЕО ІЮО МО 19). Слід зазначити, що дія БЕО
ІЮО 18 ї 19 на РСБ5БКОУО в сироватці і холестерину ЛІНЩ була дозозалежною при великій тривалості дії, при цьому рівні РОЗКОУ в сироватці і холестерину ЛЛНЩ були нижче за середні
Зо базові рівні протягом щонайменше семи тижнів після останньої ін'єкції (остання ін'єкція на добу 22, дані проілюстровані для відновного періоду аж до доби 71).
Вміст олігонуклеотидів в печінці і нирках аналізували через один тиждень після останньої ін'єкції, тобто на добу 29 досліджень. Вміст олігонуклеотидів аналізували, використовуючи ІФА з гіобридизацією (по суті, як описано в статті І іпапоїт еї аїЇ, Мої Тег. 2012 Рер; 20(2): 376-81), використовуючи 5ЕО ІЮО МО 2 для одержання стандартної кривої для зразків від тварин, оброблених ЗЕО І МО 2 і 5ЕО ІЮ МО 18, після контролю, що зміни в результатах не відбувається, якщо для одержання стандартної кривої використовують (кон'юговану) ЗЕО ІЮ МО 18. Таким же шляхом використовували 5ЕО ІО МО З для одержання стандартної кривої для
ЗЕБЕО ІО МО З ії 5ЕБО ІЮ МО 19 після контролю відсутності відмінності результатів при використанні БЕО ІЮ МО 19 для одержання стандартної кривої для аналізу ІФА цих зразків.
С Вміст опігонуклестидів й тканинах через здин тиждень після останньої НЄ
Св Янка 00001101 Мирка 0000) Відношення ! (МК опігонуклертидні гмике олікомуючтестидни печінкалчирка; свіже тканини) 0000 свіжої тканини) : пн се вв се ншШ
БЕОІКОВ Яхббмою 000 ба 0 Я Я Я БО
БОШ НОВ Яма | БА У Па ВИНИ
ВЕСТ МОЯ ЯХЕМИ ОЛЯ бо в мкг нм
ЕСЕ КЕР ТО, ЯКО Миже 272 ода 15,3 І ШІ
Як проілюстровано в таблиці вище, кон'югація ЗЕО ІЮ МО 2 і ЗЕО ІЮ МО 3 призводила в результаті до більш високих відношень печінка/нирка для кон'югованих молекул (ЗЕО ІО МО 181 5О0
ЗЕО ІОЮ 19), ніж для відповідних некон'югованих молекул через один тиждень після останньої ін'єкції коли тварин ін'єктгували 5.6с. один раз на тиждень протягом чотирьох тижнів. З урахуванням того, що ознаки тубулотоксичності продемонстровані з іншими некон'югованими молекулами, направленими проти РОКУ (такими як 5ЕО ІО МО 1, як проілюстровано на Фіг. 15), ї з урахуванням того, що печінка є органом-мішенню для лікування, направленого проти
РСБКОУ, чекають, що зрушення до більш високого відношення печінка/унирки приведе в результаті до підвищеної безпеки кон'югованих ЗЕО ІЮО МО 18 і 19 в порівнянні з некон'югованими 5ЕО ІЮО МО 2 і 3.
Як проілюстровано на Фіг. 16 ії Фіг. 18, 5ЕО ІЮО МО 18 ї 19 дозували при фармакологічно релевантних рівнях. Профілі клінічної хімії одних і тих же тварин протягом експериментального періоду і фази одужання продемонстрували відсутність релевантного підвищення параметрів безпеки в печінці або нирках.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«310» Баптаеї5 Реагта й/5 «1502 АНТИСМИСЛОВЕ СІ. гумки ТА їх кОон'югАтТи « НАПРАВЛЕННІ НА ПпРОПРОТЕЇН КОНВЕВТаЗУ сУБТИЛІЗИНКЕКСИМ ТИПУ Я СРСЗКУУ «130: 3341 «ібп» 46 «їТйе» о рахвихій мекзіолй 3,5 «йїйх З «йїїх ЗА «ї22 ДНК «213» ШТУЧНА «0 «233» вмА антисеисловий генверний олігонуклестнд «К2Ї» піс тевкуга «вах 13. (43 с, й «825» фосворотіоатні міжнуклевзидні зв'язки «ггОх «їз вс бедкикге «й» (1,13 «923» МА нуклєюзиан, МА Є пазначанть земетнло Є
КУ І Й
«ках век Теасига «йййх (12..5143 хгйїх іа нуклеозиди, МА С позначають 5-четидй С «ЩЕ 1 тастасавав сек 14 «ій» 2 «йії» 16 «дій» ДК «215» ВУЧНА «дАЦУ «ВИЗ» а антиємисяових гапйпшерням очзігюнуклевтид «20 «алі» віяс Теавиге хана 3, .016) 2, . хЕйїз фосвопоттодтні міжнуклеозидні зв'язки «ай й «авїх вієс Тека каййх С, хакі ЕММА яуклезхиди «аа І «221: тізс бвакиге какаж С33.. С І «ЗИ3» МА зуклесзиди, ЗА С позначають З-метня С «Ще 5 закостівсаа авсоса з «цк З «гі» 16 «213з ДНЕ «21їз шщТУчНА ких «Ейїх МА внтисмисновий гбепмерннй зпіговуклевтид «20»
хаеїв Мі«с тТейтнге «гвЕ» 33.38) ше «283» Фосворотіодтні міжнуклеззидні з язки «ай й «а2іїз пі 5С Тейкоге «йвйж КУ... «2аїх МА нуклерзиди «Кох | . «ві» вс. твавуме «дае (143. .46) «КТ3» МА нуклесзиди, МА С позначанть З-меткл Є «З 3 закосєтасай аассса їй «Ме я «Мі» 15 «217» днк «21їх Штучна «ТЕ й 2, «2аї» НА антисмисповий гермерний злігонуклеотид «вх «281 тів вав хлайв 0). .С и. й «гиїУ фосворотіоатні міхнуклеозидні зв'язки
Сет; М «гйї» ві5с Твакига «вав 3..18) «ЯЗ» БМА нуклеозиди, МА С позначають 5-нетмя С «бо» й «алі» тіесобеатига «ей С. КБУ «ДЗ» БА нуклепчиди «Я Щ чека совя СЕ 15 «ЕМ 5 «1 і хезем ДНЕ «3» ШТУЧНА «воцх «раї» ма антискисловий гепмерний олігонуклеотий «ва. Й кегї» тс. Театцге «вах СК «ба32 НА нуклеозиди кас й «вві трас Тезе хейй» (15045) й І «223» фесфоротісатні міжнуклеозидні зв'язки «ва «вет» с бевтшйге «йййУ С14)..516) хе» Ма нуклеозикди «НМ» Й кустосота осСЕКод Ів «Не б ха3ї» 16 «гї2х ДНК «вії» ЖТУЧНА «илох й «223» ма знтиснисловиВ геймерний олігонуклеватид каВОх й че» тісто ге кажи 1). 03 шк «25» фесфоротіодтні міжнуклеюзидні зв'язки «Бе» хееі» щівс о Теажцге «ве» К..53) «ой» МА муклеозиди, 1ЇМА Є пожначають б-метил С «ок кита» тс тватцге «дж» СА). 6 «й» МА нуклаазиди «ще в хоКЕЧЕчтав ст 15 «Ще У «я» 16 «иїйз ДНК «гії» ШТУЧНА ха «та3» А амтиємИисловий гепмерний опігонуклевтид «вах Й хиєї» зо. тваєнге «аййх СЮ. СН ше І «23» фосфоротзозтні міжнуклеозидні зв'язки ка» І і «вії» щізс Тезкнга «вай 1,3 «23» На нуклеозиди, іМЧА С позначають З-метил Є г: ВИННИЙ севіз іч. Теакцуге «аву 143... 36) «сеї» ВА нуклєозидь. МА С позначають З-метилЛ Є «ЖК 7 тестоотктя сасе 16
С
«їх ії «кий» ДНК «іх ШТУЧНА «дО» Й І «У8їх да йнтисмисловий гаевнерний олігонуклестид «кю і «вої» йт5с Тватуке «айах 31.00 ше «Ф23» феЮесвюоротіоатні міжнуклеззилні зв'язки «Ей» «виї» щіяс беатнов «Ей С.О І «Я» ЇМа муклеожиди, МА С позначають З-метил Є с ИН «лйїх щівс.Тевтиге квЕй 3. «223» МА нуклеозиди, ЧА Є позначають б-метил Є «НЮх В хестТОоціІста ат 16 «аз З «з їй «ей» ДНиК «а» ШТУЧНА «28» кайЗ» кОн'югат МА аветесмисловего гепеерного ослігонунлертиду ва й «вті» шішс. Тезкцга хвайх КІ, й «23» коплектевин-сб «а «гі» івс Тваєнке ям АК , «еаїх фосводівфірні міжнуклеозидні зв'язки «ех й «вйї» вівс Євавуке «ай» 31,45) ше І «22У» фосфоротісвтні міжнукивозидні за'язки
Банки й й «ві» ів отвакиве хай» С..05) 2738» МА нухпвозиди, іМА С пезмачає б-метил Є ха х й «їз ті5с.Тейтике «кі» МА нуклевзидни, МА С позначає З-метил Є «НО» З сасостасвя аасЕси їв «а Зо «м КЕ «й1йз ДНК «кії» ЩТУчНА «ТЕО» , «їх нон'югат МА азнтисмисяового гепмерного влігонуклезтиду «а й «22ї» щізс о тевтоге «вай СК. «23» холастерннесв «ва» пізсотватиге гени КВН Со ПИШИ , «айїх фОосфодіеірні міжнуклеозидні зв'язки «20 «лі» вівсо тема «вай 33, СВ нище й «Фй3» феосфоротісатні кіжнуклеюсзидні зв'язки «аа «21» опієс Тевтнгка «ай С. С «Кеї» вна нуклесзндяЯ «аг , Й «агії» щізкоГеасюге «гай СЮ. КВ) «айїх ма нуклеюзиди, ЩА С позначає Земетми С «ка» 10 галатстає завассєа їх «М 31 кеїїх 18 «еле ДНК каїх ШТУЧНА «ЕВ «баї» кон'югат ММА знтиємислового гепмерного олігонуклеотиду
«ТІ» жівс о Тваснге «ой» (13. «їх холестеринесе «ай І «аг» ізо, геавиге «айе БАЗ й «веЇїх осфодієфірні міжнуклаеаззидні зв'язки «20» «ейІі» пізс.Тваєнге «вол 33) ! «Її» фосвовотіоатні міжнУуклеззидні зв'язки «ах «ват» опівсОтайтвге «й КА.) свг32 іма муклвовидия «ех І «ЕЕ» пізс.Геатиге хеййх С..СІ18Х «23» МА нмуклеозиди, мА Є позначає З-матия С «пд» 31 сазакостає ааваєска їй ха» 13 «211» 47 «Ай ДНК «ев» ШТУЧНА ке» . хе» кон'ютат кА змтисмесловВого геопмерного опігонуклевтиду «31» тікс.Твасике «даю СО.
І «Т232 хоалестерин-сб я й «ві» тіясОТевтцее дак (МН. «г2Я3Ї» фосфодієфірні міжмуклеозидні зв'язки «ай . «Тіз пізс-Тватиге «айг» 3. що ; «23» фасфоротісатні міжнуклеознані зв'язки «ЙО» «21» тізс.Тватуге «аййж С, «23» БМмА нуУукЛЕСЗИДИ, МВА Є пезнанає б-меатини с «Тай «кові» щізс Гезкге «ла 16). СХ «-ййї» КА нуклеОзЗиИди «з 12 садстоатета азс 17 «іх 13 «11» 15 «Вії» ДНК «13» ЖТУЧНА «0 «К2ї» кон'юсат ма знтисмислового гермерного алігонуклеотиду кавц й «йаї» віз. театиге
«оо» С1КОКЮ «З» коластерин-сь «а. й «веї» піс твабуге «ай СВ єї» фосфодієфірні міжнуклесзидні зв'язки «22а» «алі» щі Єватцге «йде 33.43 «Кк» ма нуклеозиди «І Й клі» шіве Геатига «аййв 3.8 п й «ку» фосфоротіозтні міжнуклевзидні зв'язки кс «фії» тек Отака квФгех СМ. (8) «бої» МА нуклебзиди хаййх 13 скахустсуї дасте 18 «30» 16 «ії» «бій» ДНК «233» ЩТУЧНА «ад» «ейї» о кон'югат БА антисмислевого гепмернога олігонуклейтиду
СУ Й й «рі» іє Гейтига «ой» С, «ойї» холастерин-ся «а «ваї» щіжс Тедтига «ай СНАХ кеййїх дфосфодіевірні нішнуклеззидні зя азни сУечО ж «паї» тізє.Теажиге хафим (3. СА шк . «йИї» фосфоротіоатні міжнуклевзидні зв'язки «ва Й «Лі» щік Театике «айях 33.,53 «айхї» МА нуклеозиди, ММА С позначає зЗ-матия ЄС «Фг0» й «221» тівс. Резкиге «ййй» 185). «23» 1А нуклеозиВи «00» М сатастовах зазст о 18 «0» 15 «1» б «ії» ДНК «ах ШТУЧНА «ЕКО» «223» кон'югат (МА антисмаєлового гейнерного опігомукавотиду «ЕЙ «Еі» щівє Гватике «еле С3.. і «КИ» холестерин-сб «я І «а» пе хє Тезе
«Мах 03, «223» фосфодіофірні міжнуклеозидні зв'язки «икОх й сайї» Міс. гезсиге «йййх Г33..С185 Й «283» йесфороетіоатні міжнукавозидні зв'язки
ФТййь «вії» іє Твасуке «йайй» С33..53 "235 БА нуУклеозиди, СА Є пеазначає З-метил Є «йо» | й «ЕХ» щівзс Тезснге «ай С.. КІЗ «Фи3» ща нуУкЛеОВИиДди, МА С позначає зЗеметня Є «ОО» 15 сатсстоцтс ака ї18 «ах їв «їз В «лій» ДНК «Я» ВТУЧчЧНА «ек кйаї» кон'югат іМаА знтисмислового гепмернога олігонуклертиду «КЕЙУ й «айів ві5сотезкцге «й8йх 330,
ФЯйї» холестейин-сь «Нюх й «апа» тібс Тевкигке «віх СНІ й «233» фосфодіафірні міжнуклеозидні зв'язки
Се. ВИ Й кий» щіжс Теваїмка «айв (З.. СА , «323» фосфоротісатні міжнуклеозкані зв'язки «а «і» тіб5с беабцкв «их 53.5 «23 Ма нуклесзиди, їМА С позмачаю 5еметил Є ках «Ке1ї» вИзе Реатшге «вай К37)..183 й «ааї» Юа нуклеззидяи, МА С позначає 5-метил С «00» 16 кассстдвес са їв «302 17 «ії 4 «кій» ДНК «ії» ВТУЧНА «220» , «й2Ї» о нон'югат МА знтисмислевого гепрваерного зпіконУуклестиде «Ай «221» пес Театоге «вам КО. С І «ййї» ОДІМАЄ Сеп'оа «а «КИІз п вє бейтого «іа С.О шо . «кі» фосфоротісовтні міжнуклеозидані зв'язки «2»
«Феї» тівсо Теасцге «вай К.С «гі» МА нуклеозини, БА С позначає З-матнл Є «ех «ЛЕБ» отівсо Теасцуге «айва СО СІ «аї» МА муклесйзиди, МА с позначає З-метня С «0 37 тостасзааа ссса 38 ке 16 «із їй «Кї2х ДНК «2135 ШТУЧНА «ее , «ТЗ» кОн'югат МА внтисмислеавого гепмерного олігонуклевтиду «ак. «гаї» шів5с.їватиге «вію СО «ей» БщіМАЄ Сопіда «лох й Й «теж Міс Тезкиуге «каййю 03,0 ше «23» дюсіоротіоатні ніжнуклеозидні зв'язки «е , «ай» тає Теденге «ф2й» С313..13 «леї» ЩїнА нуклаозиди «а0е І «тах іс.
Театиге «кий СІ, С крайх МА нуклеозиди, МА С позначає З-метий Є «М» ТВ затастасав зассса 16 «М ІЗ «вії» б «їй» ДНК «аїЯх ШТУЧНА «ке І «23їх нен'югат МА знтисмисповогоОо гезмернего плігонукнлейтиду «аю «Зї» жівс Геаємга «ай «ТАЗ» озінАєЄ Сопіда «во «ой» вис тгвавуке «йййх (3. 15 Й Й «02ї» фосворотісатні міжнуклеозидні зв'язки «ее хайї» жіхс, Бевкоге бій (3.3 «ййї» мА нуклесознди «ВЯП Й «б2ї» щізс Теакуге «ака 345.03 «25» МА нуклерзиди, МА С позначає б-метия С «М» 19 ваатоуєтаєма зассей іб5
«210» 20 «8312: 35 чеїдйух ДНК «е3їх ШТУЧНА «820 «8253 хон'югат МА антисмислового гепмерного олігонуклеютиду «а «ейїх щіщЄ Тезснге хадй» См це «823» бвіМАЄ сопіка «Его Й «еаї» і хс Тезтнга «вай КУ. с, «беї» фосфоротіватні міжнуклЛеОоЗиДні Зв'язки
Ок й «ааї» півс.теасиге хвййм С... «таї» Ма нуклеззиди, ма Є позначає з«нетил с хайї» щік. теаруге «ай БІ). . 0153 чаеіУ на нуклевзиди «ОО 8 асіотасоза со 15 хйіз «ії» 16 «212» ДНК «2їЯ»2 ШТУЧНА хг Й «фай» Мон'юкат їМА антисенслового геймерного опігонуклевтиду еайцх | й «веї» тіяс.еашке «алею СОН «аг» БЩіМАЄ Сопіба «ве» Й «ййї» тік Гезтуге «Вей с. «23» МА нУКЛОСІВДИ «вад» й «БИїх тіхсу і вавике «дай У. 0163 ше «223» фесфоротіоатні «іжнуклеознані зв'язки «ее» «Ії» тізс о безкога «вай СІ. .СНО хакі» зма нуклеозиди хапох тастататов ассо 16 «3 й «Кїїх В «23У» ДЕ хаїїх ШТУЧНА «кгЗх окон'югат МА днтисмисловогОо гепеерного злігонуклеотяду «Ей «22ї» шівс.теакоге «вай КО кйй3» баімМАЄ Сопіса
«Та І «айї» жі Тевкуге хеве» (1. СНО о, й «пай» фосфоротіодуні ніжнуклеозидні зв'язки
Кен . й касі тс Геаиге «авт 03,03 «23» Ма нуклевзидн, ММА С позначає З-четия Є «ай «КЕ вжічс о теауцге «важ «4. 1 «віз МА чуклеззиди «Ох 25 тостетока Зстеу 15 ха 23 «г ЗВ «яЩй» ДНК кеїї» ШТУЧНА «КО «283» ком'югат ща антисмисвового гепмевного олтігозуклеотиду их: «еВіж між Тевакуте «вад С. «22ї» саїнає Сепіяа «еВ» й че тес. театиге хайй» 030. с. , «яаї» фосфероттодтні міжнуклеюзидні за'ваин касі» мтс Теакцге «22 (3. І к«леїх Ма нуклевзили, ММА С позначає З-метня С ках, «ей» віє Тевтьге «ей СМ). ЦО «2й3» МА нуклеозиди, МА С позначає 5-метий С «4005 3 состав ста ТЯ 16 «ай» 24 «ії 416 «йі1йх ДНК «2335 ШТУЧНА «ли У» кОоК'ютвт МА антисмислового гепверного олігенУклевтиду «аа» «221» вівс.Геатиге «ках СН «Її» содімає Соміза
ЕЕ Й
«АТ» шівс Гешкиге «ій 3.6) 0, о «авїх Кифоротіовятні міжнуклесзидні за'язки «ай І каві» визс Кваєнга «Вл К.С «2ЙЯ» ЩА мукласзиди. МА с позначає б-метий С ка «бої» щі Зс гвакуге чека» С.. С хі» БМА нуклеозиди, На Є позначає б-щетил Є «М а тесізацссто сус їв хе 28 «й1ї» ій «їй» ДНК сеїї» ШтТЖчнНА посведоватеявнаоєсть «вай» «22їх» мотив нуклеїнової основи «Я» тастасазна сеса за «21Ох 26 «щі» 45 чиїм ДНК «13» ШТУЧНА «ве «223» мотна нуклеїнової основи «і» ЗВ ватескасаа засесв їб «Війх 27 «32 «віх ДНК «2135 ШТУЧНА «во» «да3» Матив нуклеїновеї основи «0» 27 детуєново «Оу 15 «Й 28 «Ії» 16 «1йв ДНК «ії» ШТУЧНА «ее «й23з матна чувлеїнової основи «а й Й тастакаєоа оса і5 «ЕМ» 29 «Киї» 16 «ві» ДНК «йиАЗУ ШТУЧНА «ХК «Ягї» мотив нуклеїнової основи «0 8
Тест ста Кос Есе і6 «Це З «їх 14 «їх ВНК хаї3їмх Мото 5арієйь «Цю 30 задоаниуснец адса 14 «Ох 1 «831» 15 «азам РНК «213» нене зарієн» «ах 1 наваиецсям зусвии 15
«й 3 «312» РНК , «вій» Ношо 5ашівпе «й Ох З р сксазасмеас асаде 15 хе 33 «1їх 16 «аю РНК «еії» ото завів: «НИ» 33 ссвадсисяє всацса 15
БК
«ем» «Ві вВНк «йїЗ НОЩО завїете» «і» 34 позвсасвой совоца їв «МЕ 35 «її» 16 «212» ДНК хаіЯ» ШТУЧНА «ах «83» о кон'югат МА зитиснислоевого гсепверного олігонуклевтиду «гаце «а2і» ві5сотевтиге сх 0323), о, ккоейз фнратіоатні міжнукАавазидні зв'язки «АещЕх «Кі» іс Тезжчна «Вій 1. . «03 РАМ вон'ютат «йаОх й й «Т2і» мівс у тваатаге «фах (4,.(16 | І «вії аБМеФоротіоатні міжнукласлинні зв'язви «лей залі» Вес Театиге «вййх ЩА). . С «2Ї» МА нуклеознам. їМа Є позначає б-метнл Є «агОх Й «їз віБс тезтцаге «йййх 143. 35 «223» НА нуклевзиди, іа С позначає 5-метий с «НЮ» 35 І тсацсаткчу такса її «20» 36 «іх 15 «п1йз» ДН «саду» тична «ех «23» кон'югат їМа янтисчислоного гепмерного опігонуклеатиду «25 , «тої» щтізс Гейтс «ВЕ СВ, І «ай3» и фодієфірві міжнуклеозидні зв'язки
«а «йеї» вія Гезтуге м НВ ЕВ) «223: ВАМ кон'югат «аа й «а2їх візс Теахвке хаййж СХ, 5 ши І «223» фосфоротісвтні міжнуклеозияні зв'язни «ййїм пас. Тезєнне «дай 33..К8 «ий3» іїМа нуклеазиди, ММА С познанвя бЗ-метия Є «а. Й «гі» ис ободінге хеййх (33..15Х «вйї» Ма муклеозиди, МА С позначає 5-метиа Є «00» ЗВ сиесаєтові акоса 15 «МЮУ «21» 34 «212» ДНК хиїЗ» ШТУЧНА «25» кон'югат іа антесмесєвсового гепйпмерного олігонуклеотиду «20 й хРгїз і5с бевхиге «вах НО ; «23» фосюодієвівні міжнуклеозидні зв'язки «а Й «айї» щвівс бватьге «Кай» 3. «айЯ» КАМ кан'югат «830 й «231» візє Геакикеа «й2йз (2..С п І «23» Восворотіовтні міжнуклеозидні зв'язки «дО» «28ї» Міс тедкцка «важ КИ «223» МА нуклесзиди, їМА С нозмначає беметил С «а «23Ї» візстеатуге «Йой КАЗу,. (14) Й «й МА неУклеюзиди, БА С позначає 5-метнл С «00» 3 засатжаока тс 14 «2» В «иїїх 16 «лій ДНЕ «13» ШТУЧНА «Іо» «гй3» ков'ютат МА знтисвислового геймерного опзігонуклевтиду су: ИН ч«иаї» щіБс.театнга кааа» 513..13) оку З с довж. А км в свй У й й «еаїЯ» фосіюдієфірні міжнуклевзидні зв'язки
СУ: жи «йї» і5с Теаїтнгєе
«Ейк СМ. «ейїх КАМ вом'югат «ай» Й «2ї» вис Тежсцге «а» (43.48) «223» фосворотіоятні віжнукнеззидні зв'язки «ах І «212 віб5с безтнга «вва СР... «23» МА нуклесзиди, БЯА Є позначає 5-метипй Є «кг» й «йгії» іс Геабуга «кеай» (34)..016) «223» ММА нуклеззиди, На Є возначає 5-метнл Є «ВО» 38 чпасосаттоад тасса 15 «ій» 35 «2312 13 «їй» ДНК «2332 ШТУЧНА «330» «баї» кон'югат мА зитисмисловако гетавзрного олігенукластиду «вад» «22із пове. Гевтоге «ва» 03. . «ої» фосфоротіовтні міжнуклеозидні зв'язки с Й «ввї» піс Жеатике «вве С. «ФИЗ» КА нуклесзиди, МА С позначає 5-метня С «а, й клеї» пизсотевтика кави К.С «лйЗ» КАМ кон'югат ее «Ф2ї2 визсоТеатнге «аййх (3.03 «бе3» МА нуклеозиди, А С позначає 5-метил Є «ФО» 39 І ефаттетак са 13 «ій 40 «Ві» 13 «217» ДНК «їй» ШТУЧНА «ие «КЗ» вна антиємисловий геймерний олігонуклестий «ах «Рі» тівс безкиге «сввш С, ше й хйЗ» фосфоротісатні ніжвуклеозидні зв'язки «Та чиїм ті5соївахиге
Фев» (11. «веїх їМА нуклеозиди «ве «ай» отічс о Твакцке «ййи» 413. .0433 «ва» МА нуклевзиди, МА Є позмачнає ае«маетил Є ек С зстакоза со 13 «23іОз 4 «вії» 43 хеїйм ДНК «813» ШТУЧНА «ДИВ» «ваїх кон'югат МА зитисмислевогоОо гейпмерного олігонуклеотиду кв г» «251» щі5с, Євасиге «ВІЙ» 1.) Й «ії» хвавстеринн-св «йде й «алі» щіяс Гевтика «ай СЮ. СК шк , «йИЯ» фюосфоротіодтні міжнуклесзиані зв'язки
ВЕУ. «Е2Ох й «й5ї» піз лету» «алею СЮ. хай» БА нуклепВзиИди «о» «ві» ніяс.авкука «фай СУК. С «223 МА нухпепзиди, МА С позначає х-метий с «4005 4 Що істот ооза осо їх «30 й «кіїх «2122 НЕ «віЯх цеРуУчНА «а «їх кон'югат ЩА антисмислового гепмерного олігонукавотиду «авцх й ; «23їз візс Тезтиге «айва» (3.0 «йа3» холастеринесе «а й «221» віз Тевснгв «ай 1 й , «223» фосфодієйвні міжнуклеззиані зв'язки «а «геї» щшізс тевтцге «вра (330.0 «Кі: МА нуклеозиди «аа «айі» півсоітезтнке «ай» К33..С153 й «8223» фосфоротіватні міжнуклесвзилн зв'яаки «аг І «2їз іс Театике хай» 3)..033 «кеі» ММА нуклесозиди, МА Є позначає 5-метияй Є «400» 92 садсстотод явосу 15 «10» 33 «ві і «кій» ДНК «233 ВТУЧНА
С
«223» кон'югят ВКА антиснислового гепмерного оплігонуклевтиду «йЕОх «5і» ві«с.Гваєуке «йййх СМ..0Ю «23» хопестеркн-се «ЕЕ «пої» щізс Тейтшге «а НВ «25» фоєфодієфірні міжнуклеозидні зв'язки «ел» «а23» щіхс. бедтнев «222» К33..К8) «К23У їМмА нуклвозиди «вах «ої» пес, Тезтоге «й 3. кйї3» фосєворотіоятні міжнуклеазидні зв'язки «ве» й «2ї» тізс, Геатнгв «ай (133..6153 «3» БМА нуклеолинни, 1МА С позначає Зе-метил С «Не 4 сте статва аа їх «Ме 44 квіі1» 35 «212» ДЕ киїїУ ШТУЧНА «ках І «Вй3З2 мотив нуклеїнової основи «4002 44 зЕстатоачва ЗсО 13 «лій» 45 «ії» 13 «із ВНЕ й «13 Ноше зарзіенпе «НЮе 45 сасниссаса зас 13 хм 6 «Ме 3733 «БЕХ ДНК , «іх Кошщо зарієпть «НК» 46 зсспатова пекстдекоєю сукгоакетоє деоскссаяо соссваосве ссасасостя БО чащннтксс дсзосвасеє свадосассе атозекосвзо Ясовососся сесосесадтх 120 садапсстзя Фоствдаооя ЯасЗзадссзаа садтвасаст зпсесочосо чассодоасо 180 з реп тоса зЗсадсоЗсес ссаостессй десавоаєтє сосуєдсссс стсасосаєс 230 стестсттда асттсацеєвс ствсасанис єтссссаска сааростсяв засоассосся 300 псосерассу сесасооссї стадотсвсс тезссапває зодсвасстст сесствддесс і їсакусосвє собсавасксс аодсооксся дакчассМї оссветеста ссастостЗо 435 тоскасЕсс ЗдчтесстеВ посасссаху сосною а сззоозсвоє застасдава Б заст ассткосає тссозоажоЯ асосссоос соааоусассє дзосасопва 540 сгсасвиоскас сткссвессае ссуссваєоз азкссотауаа чЧетвссє асствсгац що їсцтєтоаа соуаодацаєє сасстсє адтсадавсо састасєсоє сасседєвод БО ссевоавстає ссоссяабой сасстсаєсв адааксстасвя Бетсі ссак осот єтс та стЯЗстстссЕ оакозадато вотоасувес тоссимасо соссстовяв стоссссвка 780 «сруасвасак сзвосводає сссжскоєст ксЯсссадая сатсссвню азсстодаде Із чавікасссс зссасодтає: созосзовко забассавсс ссссфсода озсзосеско дао опо а єстеставис зссаосатає зовуковеса ссодчозавсє паддосвоцо ав їкакочЧтсвє сзастесвач аатЗзЧсссо аадаооасоя засєссасекс сзсазасаоа 1023 ссадсавноєо сзасвоєсає досаєстаєє тудсавоаах боусаасває сооуатвсса 1058 осопсуоссяа ддотоуєсвас ахосоасвдєє тугоасдєоєє саяастоссва зозайоовоса май сувссацеоо сассстсатв посстуцаоє ттаттсовай задссауєто дсссадесто їй хдовассвся засто ста скоасссстоа сзпоєлазса саоссасєс стсавсассо 100 скстяссався сстодсозу оссооавсо тусточтсас состоассодє зассессооо 13520 асшакоссто сстстаєтесс ссадєсккво стсссозаох сатєзсявЕЄ пдодссасса 1350 зІшессвяод ссвоссаоаТу асесуаавов сво ває сачекссває сестсвкоє 1443 зестстЕтоЄє сесвацоаоао авсаскакто ббасстссав спзетосвоє асстосттка КОЮ тоаксасвово соддзсаса сапостоєта сссасотдос сувсатсЗса зссасоатає 1550 їаїстассоз чсесодаосто весен адссовоасз савастовсс састестсто 1620 ссазавзатоах сазксзатево осот стясуаєсся соч асссссавсс 1650 чавЕдасеос сскдсесссс зоасасссатв оуадсазоссо дсвостаскх тосававсто 1740 їзістсеос асастєтово секзсасевра троссасвоє сессосссеє сасоссссад 150 зЕсаззаєєїт «стос с сссазцККсх ссводватоз чесна сасовосуєя АБО теааескса аудопЗслаз стоуссосс (аоессаєза сестсщаа вага 192а тстакоскає суссвучтоє ксстостає сссапдссва стодсаусує сасасвостс їз сассанскча ззссавсако пусасесесо сосастоєка ссазсяовеє сасусесв 280 сазксосаюв стсссастоЗ бадакодачя асстораєас ссасизасся состав 230а вжосзеззов ссассссазе садізсотеЗ зссасацюя одсслосаєс сасастссх 45 зстоссатос ссслдоїско олатосазая ссваороавасх тодавссссо Зсссстсвца Тахо зоасадчтдас суєпаєстос баддаодост созссстоас тадстосааї дсосессста т28о0 поазвсетссся срсссточаЯ дестасоссоя юасвасас чо зоба 2540 зсфієвосас гасадусаос зссвосуяаЯ падссухтаас зассускоєє зЕСТастасс 2 здазсссоюся ссезукасаЗ вестсссвеЗ аоскссавзку асаессссає сосаудчакоє 2450 зІішсстобфаз аЗОотсадоо остудавсто азсктїзаза соотоссцас сіессстех ХО сесаесежс сакоцестоа сасазоацса сооодовтасЕ сссоссеКс соді 2580 здсстодссс стодетоооо садесксстЕ зсстоадаасе састсастсє зоотосстсе «230 їссссвдосв озоствссао давуєксест ссстсвстоє шроудсасееє ассастсвая «70О сацясеваде ЧЕсТсцВИ ЄНтВссЄ таскесеват Ясуссдаєок ссусосуєаз гм автоааскттї зстазастск соастссзю сазосвхїса ассстсадок сессвсєвао зви цедесазчак хскїєсссако деасавовоаво ечоссовдтао зоадстосадо овсзаасате Ко пстозозвах зафсуктоваа досассзата чссекаксї ссвоставст вгЗозоЗвас «80 ссстпадове ссестовтта атодвоостх аостеестоув зтоосатска десаавадсє КІ почзовкачеї зсосссссоЗ тозжсасяою сстосстео зсстоаза ссасстітає 30650 їстосксКтаХ оскадостеє шссзасазсв сссзазноатао ЯсстусопЗа аясеасвВсс 3520 іїззазвстовс ссордсавтах зсаставтоє зсосвстОєс ксашссаасс сестссяста ЗІ сссодсзовоа стасасаттісу свсссстаст тсзсевоазой воазазсекод авссвоазада за
Чососаксто ссааостсає асазсводаа скавуссаЗа азсосацатї ЗоскоФфкс Зо тдавакссавно сстсттсєка сітїсасссоору стдостсст сатттттасу зпатавсвата 3350 зпоассдосаз очосаасаса пассадчаня сссоосозУу затодсаоаз соус 3320 ацосатоцяд стКЕтІссуе катсасесВО осстоууастся ссоосстодє одвуаоєте зав стазвцосато пссвмюсчоза зудвссавса асо секваЗеасс адескевссе 3540 ваасвадсва асзкскатех совет фсокекстоє СасеТКЕЕЕВ саоурсвасіх зо тІстацасст оЕКІКастІї тотзасттоа арататттає стосу т отадсаттте ЕС таттваїато зісвсїкКІт азаатавава сазасавасо тсїсствас зазавзаавай 72о звазававав в 3731

Claims (1)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду, який містить: а) антисмисловий олігомер (А) з 16-20 нуклеотидів в довжину, який містить безперервну послідовність з 16 нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини ЗЕО ІЮО МО: 31, і де зазначений антисмисловий олігомер являє собою І МА гепмер, і Б) щонайменше одне кон'югатне угрупування (С), направлене на рецептор асіалоглікопротеїнів, ковалентно приєднане до олігомера (А).
2. Кон'югат олігонуклеотиду за п. 1, де послідовність антисмислового олігомера (А) містить безперервну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 26.
З. Кон'югат олігонуклеотиду за будь-яким з пп. 1 або 2, де послідовність антисмислового олігомера (А) містить безперервну послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО:
213.
4. Кон'югат олігонуклеотиду за будь-яким з пп. 1-3, де кон'югатне угрупування (С) включає М- ацетилгалактозамін (саІМАс) угрупування.
5. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за будь-яким з п.п. 1-4, де кон'югатне угрупування (С) містить тривалентне сзаіІМАс угрупування.
6. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за п. 5, де три групи СаІМАс угрупувань приєднані до точки розгалуження, що являє собою дилізин, за допомогою полієтиленгліколевих (ПЕГ) спейсерів.
7. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за будь-яким з пп. 1-6, вибраний з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 18 і 19.
8. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за будь-яким з пп. 1-7, де антисмисловий олігомер (А) кон'югований з кон'югатним угрупуванням (С) за допомогою лінкерної ділянки, розташованої між безперервною послідовністю олігомера і кон'югатним угрупуванням.
9. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за п. 8, де лінкер вибраний з Се-Сігаміноалкільних груп або біорозщеплюваного нуклеотидфосфатного лінкера, що містить від 1 до 6 нуклеотидів. Зо 10. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за будь-яким з пп. 1-9, де безперервна послідовність містить аналоги нуклеотидів, що посилюють спорідненість.
11. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за п. 10, де зазначені аналоги нуклеотидів є нуклеотидами з модифікованим цукром, незалежно або залежно вибрані з групи, що складається з ланок замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК); ланок 2'-О-алкіл-« РНК, ланок 2'-ОМе- РНК, ланок 2'-аміно-ДНК і ланок 2'-фтор-ДНК.
12. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за будь-яким з пп. 1-11, де олігомер містить один або більше нуклеозидних зв'язків, вибраних з групи, що складається з фосфоротіоатного, фосфородитіоатного і боранофосфатного.
13. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за п. 1, де кон'югат олігонуклеотиду складається з ЗЕО ІО МО: 18 або ЗЕО ІО МО: 19 й санмАсХ й й х ер. шк КОХ АСАКОСТО ТА А А А АЦСЬ КВОСЇ МаЬ АБЗ МЕ свт - х М І и НН З х х У Би і КО ція М о З дама СМ о КО» БАКА КК о КО МЕ АК ко ція ,; де індекс - визначає бета-О-окси ЗНК ланку, мес; визначає 5-метилцитозин, індекс з визначає фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок, іде хо нн сема 7 х являє собою Сопі| 2а, направлене на кон'югатне угрупування рецептора асіалоглікопротеїну І ми чу «ум скит пути Ме ж і і ЯМ У і Моя) лах ДЕС шли ни на й й КИ ве Е Е ЖНяє р | ми ше ! Ше ше ши Геній М саду не т з ми їі -А я у Кк ще -,
14. Олігомер з 16-20 нуклеотидів в довжину, що містить безперервну послідовність з 16 нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини 5ЕО ІО МО: 31, де зазначений олігомер являє собою І МА гепмер.
15. Олігомер за п. 14, де безперервна послідовність містить аналоги нуклеотидів, що посилюють спорідненість, незалежно або залежно вибрані з групи, що складається з ланок замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК), ланок 2'-О-алкіл-РНК, ланок 2'-ОМе-РНК, ланок 2'-аміно- ДНК ії ланок 2"-фтор-ДНК.
16. Олігомер за п. 14, який містить послідовність з 16 нуклеотидів, відповідну 5ЕО ІЮ МО: 26.
17. Олігомер за будь-яким з пп. 14-16, де олігомер містить один або більше нуклеозидних зв'язків, вибраних з групи, що складається з фосфоротіоатного, фосфородитіоатного |і боранофосфатного зв'язків.
18. Олігомер за будь-яким з пп. 14-17, який містить безперервну послідовність ЗЕО ІО МО: 2 або
3. Зо 19. Фармацевтична композиція, яка містить олігомер з 16-20 нуклеотидів в довжину, який містить безперервну послідовність з 16 нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини 5ЕО ІЮ МО: 31, де зазначений антисмисловий олігомер являє собою І МА гепмер і фармацевтично прийнятний розчинник, носій, сіль або ад'ювант.
20. Фармацевтична композиція, яка містить кон'югат антисмислового олігонуклеотиду, що містить: а) антисмисловий олігомер (А) з 16-20 нуклеотидів в довжину, який містить безперервну послідовність з 16 нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини ЗЕО ІЮО МО: 31, ї де зазначений антисмисловий олігомер являє собою І МА гепмер і БЮ) щонайменше одне кон'юЮгатне угрупування (С), направлене на рецептор асіалоглікопротеїнів, ковалентно приєднане до олігомера (А), і с) фармацевтично прийнятний розчинник, носій, сіль або ад'ювант.
21. Застосування олігомера з 16-20 нуклеотидів в довжину, який містить безперервну послідовність з 16 нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини ЗЕО ІЮ МО: 31, де зазначений антисмисловий олігомер являє собою І МА гепмер, як лікарського засобу, такого як засіб для лікування гіперхолестеринемії або спорідненого розладу, такого як розлад, вибраний з групи, що складається з атеросклерозу, гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, сімейної гіперхолестеринемії, наприклад, набуття функціональних мутацій в РСОСБКОУ, дисбалансу холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ЛІИВЩ)/У/ліпопротеїнів низької щільності (ЛОНЩ), дисліпідемій, наприклад сімейної гіперліпідемії (сімейної комбінованої гіперліпідемії (СКГ)) або сімейної гіперхолестеринемії (СГХО), набутої гіперліпідемії, статин-резистентної гіперхолестеринемії, коронарної артеріальної хвороби (КАХ) та ішемічної хвороби серця (ІХС).
22. Застосування кон'югата антисмислового олігонуклеотиду, який містить: а) антисмисловий олігомер (А) з 16-20 нуклеотидів в довжину, який містить безперервну послідовність з 16 нуклеотидів, комплементарну відповідному відрізку довжини 5ЕО ІЮ МО: 31, і де зазначений антисмисловий олігомер являє собою І МА гепмер і БЮ) щонайменше одне кон'юЮгатне угрупування (С), направлене на рецептор асіалоглікопротеїнів, ковалентно приєднане до олігомера (А) як лікарського засобу, такого як засіб для лікування гіперхолестеринемії або спорідненого розладу, такого як розлад, вибраний з групи, що складається з атеросклерозу, гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, сімейної гіперхолестеринемії, наприклад, придбання функціональних мутацій в РОБКОУ, дисбалансу холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ЛІПВЩ)/у/ліпопротеїнів низької щільності (ЛІПНЩ), дисліпідемій, наприклад, сімейної гіперліпідемії (сімейної комбінованої гіперліпідемії (СКГ)) або сімейної гіперхолестеринемії (СГХС), придбаної гіперліпідемії, статин-резистентної гіперхолестеринемії, коронарної артеріальної хвороби (КАХ) та ішемічної хвороби серця (ІХС).
23. Спосіб інгібування РОКУ /л у/то в клітині, експресуючій РОЗКОУ, який включає введення в клітину олігомера або кон'югата антисмислового олігонуклеотиду або фармацевтичної композиції за будь-яким з пп. 1-20.
24. Кон'югат олігонуклеотиду за п. 4, де М-ацетилгалактозамін (сзаіМмАс) угрупування являє Зо собою моновалентне, двовалентне, тривалентне або чотиривалентне СаЇІМАс угрупування.
25. Кон'югат олігонуклеотиду за п. 6, де поліетиленгліколеві (ПЕГ) спейсери показані як Сопі 1, 2, Ла або 2а. я а т з Ак пит ут «Ада в АН |: К наз Ї Ї - 2 ЄСавііх по жит ккд? чн и я і н- нах «В п У Ії й т : поки з р; об зичу збут я кНаАє : «ря т нас й в з Ї до 5 тоттьї З. ! А оон Шия ї ших я й ЄСеві 25 | ну ту аб дять в 1 Її КШняхо ов ва щоб хитає Миття 2 и МнАг но і Ше З н п з бе тю бе че и - о дух А не А ша а а и но а УП У х ІЗ ія на А. А | ях Сапрід- Ч ода р о А ання А ї от - рити т риття че | | М- Й Мняко ов шо ито НО в: - Ні а ї р С і З ки и М; У ей не но пав - Хна Е А п од ака и о А пев в о п й п я : ще ОНА Й Шк і: од п н Ї о. ще рий дитини, Ж ря КО в ЄозрІа- ж М па з п В) г Ї й нас ан й е і - на - 4 -х Ак жокок ДА ! нот ом дя Код В - Хнаг ї
! воно го ! ни др кн щеня с З шо ї Н Кк Х ща" не а с с о а с ї й К Що і Є І: х Н Н ї КУ жк ох й КО. ; аа з вх Сані їх Її ; т вен ж й Н свв пері Нори мВ вич ня її КО. : Де В З й ї КЗ а ! й "Й Я ї ї Я Е : її с ії є ! на на ін ши : А х х й і ! Мнає ще! чит» її і ї Фо . й о І Е пов й и ши вк Н ї й ХЕ 7 " Е Вк І: Ж 1 й У 1 Е х ї і ї с Ще: А бек кв ни ень й ше щ і Мед ох М ЕЕ: сСамАсТ бою яз ї нн и зи : Н ї їн ше дня ск інн: ; 1 Во с ке со : Ех п на я і і Мне НН. Н : ї Н і Кк, і ! "вв і і В : і веж з ; А тк х Я : соізи Р вам, вин Ше ши ши ще я шк» і К и : пе ре Ка ско ММ не сн ан ї і ве Ї щи шк ! оеяН ве Н з В ! ї : се ; ко сив -х ! : неси кшШ аи Ше М
Е . соч ВМ нку Щі ін ут Ше Мо Ме: Н До Мене
Фі.
мо М Н ах і Не с а а і Мн СХ ую : і Н у і : тая і й ; ГК о 7 Свтіде ГОНООТ п. А ! Її кі осв в Н х її Кк і ння Я Я ная м щ КГ ЕТ Ме МнАс Ї т - ще А яко : ! Но Бл" в с я ! "вн те я моде ШЕ Севій щ г а | Ї Фу ї ї Я у вань ОМ 1 у, дише ши ше Ше
Не. у» нс ле ши а дити ! ннке М М Е но 1 3 І НВ ні І Ж одини . пекан ка чу І кання в. : ув У і не нях шк щ
Фіг. Е (продовження)
КІ Ще «й я Її ЩЕ ут мотиви щн ї ! ! кнає й я зи в и нь ве о : аж 5 ; і 4 З ! Й Я ї Я : нау й - ї Н серію Я ЇЇ Її -О, хе і лк й в й вини о са т хе с Ж со НА щ н о І дев І С шк ! Но ге ту З ех, ! Ко | І я чк і ще ке з ру им в пу т- р не Що КО нак еко ; Шк: й У Товт ит дин ну Н Кз У Н ї 7 Ем Е : т тя їв Її Н ке су - З о МІЗ о ЖШавіїве зу ши дет Вк КІ поля й ор ше Є І гй : Ї но і З - ; ї я і і вже М уявити "кі й Мнях о ше ї - з й в З с о я і ох ше шо: : зона ; 1 Ї й | і Серпр р ї інн Ї ші й Як З ву ана ї й п й І М Н ї ї ет яКЕА мі о о солеВ Хр я с І х Мндг ї М Й 7 ще м ян Сеедж тк Ї і а і Ті і я ди пеки кн ч сек й ни ОТ он пера тя й пе Виде п т--й фіг. 1 (продовження!
Й : ой Сов шй
М. я ща і з м . Св бе а в ов Ка м а по а г п ше ОК днини НЕ: 1 і Ка ай Х і ! Ії в ! СовібЯає Сповов у ! і ма з що Ка не ет й ся Шк оз ча : х ; Севі бах я пера щи чи Фя пе и Мер ст дух йод до дух Мері, Мер. ді. з ве й, ще я Є зва, С я С І «А ОО щі да : і. п ен иа й с й Мері ме Ма ії АКА ТС А СА А АМС МЕС МЕС. Аі-З ОО НІ АВАНС МЕС АСУ ТЕО Юр З ко мес те ГиУ ТА Ся ТИ БО ща всю а азарт и я ри тр, и. ул 5-1 СУ Ку: «АК, Ї Бей Ї АН, Ї. 1 Еш нд сот и МЕ вит з ект и ус о в со ГО АОС ОМ -Я чо 106 теме мет осо тс, голо ле ме Ммесу КО НІ?
к. т мере мет КЕ т со « « ї. Мф і. СЕ - «о о 8
Фі. З ев, я Сстеьсв не ке нс в Ка В: КА ни ОО яко юта пар ю-Д. з ка чкесетаєтдя Мер. Мерч. Месі. із СВОЯ но он и АН В В п о вою ері е-ї. яд в Таб ст то Ки я хе Му Ме я спонов но зе уй пи и ко о-ї. 1. Ме ще зрос ж о др: У, З че ен ана анна ну ОРОС Н З ша ке ч гак зт кед лех ад ях Кк мя З ; ко ї12 о пор ша в и а А и ема но ще «ме ке и ах 7 ові: до-ї. - зе о ДК о ШИ Спосв що я я р Пи, УК ? ко 14 о
Аев.. І. ке. Т. Му Ми, сені ж уста дя те Мухи жирі тека у СЛОВ ізе ; 4 а М г іх х іх «О, ех НА еНИй У я 4 ше Зк ща 15 еї й ТК р хх Ж, Жені, Вир, ср вч ох р ие и кох ви МЕ. Мет СсвесСе ча я пово Фк 4
Н я ЗаМмАвя й х ї в і: ме їх н ние не й я КА в А С МОЇ АЕОУ 5ЕбІві? нн Фандея У о-ї. Ку що я АБ А, ТОК у АоА у, АС ВО Му. ду щує нк Я х КБ АТАК кт х г щ й яко З 18 м Й й с Ми, рак і9) свімлсо ша д-вк У не ТЕоАК АК Т ОСТ АКА А АКА МНОМ МА ДУ КО т 3» н де, ра ща о свімАсе У і у зер щу ще що які я ЩЕ т, в, ІЙ а, та й З Кей с г Ку В у к Б ж КО 175 20 ЦЕ шк а ня ; саіМмАєЗ - ій у ре що ов РКС ТА ть КО ЕІ ї осв ен і ІЗаНЧАсВ т х в-й й ; є вс ож АН се чЕО 22 н М, Мене наве З ес з НИ у дек
Я. Тек ч де). Ми ро ру ри ру. Му Ме нн ях А що п ЕНН и ИКМКИ ку! я Ся а КО 3 23 М пакасе й 7 З де- ази що ай тк мес мере р оо Су ТУТ Му не з Ь ше и а ви и пи зи пи 5; КО о 24
Фк. 5 т Ж ЛО ит Ж уч - я жк ї КЕ х З у її ше ЖЖ жу ох КН Ваня нн ос ЗИ Ганни ЕУ «ооо Кк щу КЗ ее КУ їх М т ЖК ІК Зх З куки ЖЖ фееуіуу Я во ТЕ г Х шо їх Б ДС ко Е КЕ не шо Х об зд а а НИ ЗВУ ж- Ох де Я КУ х х СУ КУ СЕ КЗ я хх п СИНКУ КК и ШО Хату ОВУ я вх з У ї «Е -к КУ Фо ходу дк. бе бані о жк ДМ СЯ Же ОО СУ Її КУ З Ж Ох Кок 5. й х Ху Я що чу Жук еВ Же й Х ї х р: ЗШ хе р Зм Ще х х ТУ Мова о ке ще Ве Є КЗ І 3 КУ ЩЕ щ х хх пк ве щу Я х Жук КИ КК КИ КИ І КК У КИ і х ще ЖК де ОЖИХ Ж- р же не а шк ех зе Б : дк Б (ЩЕ пу ви вени Же СЕ ше Х г Й СЯ 3 ро Е хх Я хо х хо ЖХА-Є х ї КЗ в нн т ЇХ 5 Ж Х ї їй Ж Кава КИ се З х Ж ЕТ ж КЗ МК, де же дих од я З ЗИ т КУ мне Я хо Їх У Жук ЖЖ кова: ей Я ер - х Же ЖЕ 5. я пе х інн К ше о гук докху кожи ше ДК КЗ ке ї З де ях ЗЕ МЕНА печеня Ман й ОН З ак НН СЯ ех ї ОК с - Трку 535 хх дк 5 5 к СДН жене ше одн ФАХ КУ а К Мішин їз г сих М хо М їх З й ж Х хх кине и, я мое я дже Є дрож КЗ смхм ШТ З ожкнкко пем В де в КУ у БУ я К а З СІЙ х в ТУ я (5 З 5 ї х й х х шк шо У У її « З з У дей з Я и А х х Що Ко - ій ей декіх Х де Ж : Е У; ДЕЙ їх КУ Зе-е еХ Ох шо КМ ех ЦИ М А НКУ х ие З Я де х х У Ж ке Ох х Ж т ДА
ЯК. ЗА
Кей Е до Мити и о В Я БА фесу й М КЗ Фон яву ОЇ в щей КЗ СЯ з і БУ х ДИ НН х жу а Ше ШК сх Ви тож ї Б У Я пд І дере кв ване ДИ я ро Ї
Ж. Ж хх лк у Із г З У « їх ВО ..3 сла ОХ фе тр ДЕ С ення ї- З за ВСЯ З їх Й усе р З у ше Її й пгт Уженцй с м нка М иа чи ве Ф р у Ух Ї х в уеутя ше Хжий ук ще - ТУ ех е 1 Я ях її МУ х З чу Ух х її хни КІ Жоккнм Є у песню які, фонутиттяютя он нн нн нн ; 5 що МУ Жах Му ї КЗ я Же У же Ю ї уки в Ге Жду - ІЗ ш щ А як : 2 кА х їх де Хжхннтнн шо фу, т З Й Ж бе КЗ й КЗ сов ШК З п Ж зо Ж Е В У Жханкн ве ДИ ож г ке 5 йде Зять мк їЗ «ой їх Ї З ой «У хо Ме Б се дл Кк Ж. коням УНК сн яр ОТ мя їх де у ої Ж ее КЗ я У ск Яд х Ян хх й ще а се ЧИ дона сл г ОНИ КНУ 7 туккху у тк ОО У ан Бе Я З Й ї Її їх НЕ НА й с че я тк ту К ї є х їх кжк кий а Б нал ем 0 гі др оцих тк дати іслань ї й Х я че «ї Є я КЗ Ши є ко ІЗ х Ка т х х у у; х Е т Х х Х Кк п « Ж ї і п Ко Є хх Ж х х. хх ран З х с-м х Ме - й ТК х п рн, За деко ж МЕ: я ую и и а НН ре нку ше х х Ж дк й Ох х КЗ т ЖЕ фіг ЗБ ве ян Що шксов ! ж ЦІ ше «КН І р КА не в зе зх й шо Ж ди ен ЗД ШИ Я дк дю авіа ї вах чу и си се и А Сл бу, В В |. Е | : Ще І З в Кс | ї ; дев ов, ї : ЕК дЕНЕ іч ; Хе я І : Е Мк; шк я : шо З ролю, : з Е їв ї
Фіг. 6 - ї- - йо З - з о о ГУ ДІ т й - я ? Є гай - сЗ та р ; ще Х ї «ХЕ щ - ней єЯ й ж ко в - - ї- з ій - ік: ше ох рен її хв йсі Са я о чі. і « й й ЩЕ: пи 7 я ря ве т, ї- сей ще й пе це і ро - іо - та дей с вв Ко 3 щ й рий «о щш « й ГЄ ко ра бо Як) т сей м М У Б о я Х 5 х ее ; а ве ве т р З за й я т Щ -, « Є й ж «а та а КА -а З - а а св те У - то - о пе шо ге М Б й ою г В 5 5 ше В Б зи ьИ в - - їря нії в Ї Ї | ї ігх | З не: пути ре ровно кн фуд ння 00 С нні Й З ; Є й й ї Є , щі щі що є - м Я Е Ж В ; ї і: ї Кк у КЕ Ж Сет щей р ВОК вет: пвіденнех ща г ще певною ах ! ші чн «Ж Б шо в і. ев ВВ ЕВ В З Кемалли дао ли тих нити риття Н КЕ шо її ЕНН Е В Ех ! шо о
0. ! У с : Я Я К ОХ КН Я с БЖ пе ; що ЕКОН Н за ОМ Я і ОХ ох Я Н в і ШО шо п ! пе ООФКК КК Н я ! сю ! ї НКИ З ПЕВ, Я В
Я ПЇ » . вав зем наз зване
ВЕРН СКУ вро» помалкових ш ж бів шо її 6 б 5 В З Е ІІІ Е г т ВОК шЕ: Б ЗІ ї В й я В Й : БоОж ПИТИ ПИ иии ї КС 55: це МОН У З ! З ЕК х І Й Ф ЩА з мо чав: Я щі що З ж і Е й З Е ДОМ: К "8 уеоохо ен З ККУ З і Ес й і Е в У ша З Е 0 0 ШЕ 00 шк ш- 00600 Е В и | Б й й і 7Е КЗ ке т дв св
Фіг. 10
ШИ
Ї. ннненянняннншиняя З Є я ШИ т ще Н -е - Ши - БЕРУ с "БЕ сп М ж МО м ї Шо
Ж. фо по ВОК ; с са с с Кв М де чена -й (нневоі віфуєнесааї
ЩО 5 Ян . ВО со ДИМ у в. нн ша Ін КІ А х ПО КО ВИ вен ЗИТННКОХ СНІ си в і. МКК ЗЕ ІЕЕ ШНЕК ТУ ев КК й З а й кі з Бе - та ВО Коммт івчнощоу зне зн ВЕ Пн ев в. КЕКС ЗО ВАЯ СЕН в НЕК В а ОСА ве зав ев БІ Я хе С У й А Б МУК МКУ КИЯН КК о п ОККО ! А Н Мо ОВ го ОО: п Де ВИ З КВК ШЕ СОКИ А фея
Же Жаба с я КО В ; Мара яд У о сАЗЖ Пер: влямка наприжеє вв ЖК ПЕ КІН ю МВ ПОФИШЕИНИХ о. й С В В НВ ера лемки: снун Ак к В овЕ «і КУБ: КО З г х і и Я БЕ и ЗМК ВОМУ 0 ВВА ОНИ що ПИШЕ
: 5. н ; ь В А а, о ВОМ ні, ПММ КК ОН ОО "Б 553 БО 0 За В А в. о т БОБ ВІН и М ВВ ТЕ ь і і в. за Ва КС: ПИЧНКОНННННе х БАК ВК Шоу ПИПИНХ ПШПИПШИИИИКИ Й КЗ Пед ОБ АЗК ИН ооо З ь гЗ х . | й ' ща Інн ( ЗгЗгтп й А фіг, 35
: сисВресця РНК РСБКЗ в печінці З : і ж ХВ Клин кит па о В : оо Н : Ге с В ву ях ЕД МАЕ ! ; щ її ни ПЕ Инні Й ОК ІВ В їх ш Б БВ З | що. ОЇ є яки жи ижииш Бо От Віш ВІ іш Бі Ш щі жі! сі ші і п сх ит, чт, яхт, ЗЕ ЕЕ ЖЖ Н : і Н ї КН ! : І ї І Н Н ї їх ї : : Н її ! г І : й | т іх ї у ї. ї 15 ї Н Й Ї з т Й 7 Що і
ЩЕ. НЯ доваї й дебая 6 Доба? 5 0 дв неон ВК УНК кв ЗИ и нн нин он нн ! Єкспресів МРНК РОКУ в нирках : У | : Ж СУКНЯ нини нин ви мини мини оман сна в нн В ВІ Е їх З ве у ге хни нан но Па ав ко З е БІВ. Віші ші а БІБ. ВІВ М ин 18 ОБОВ й КОР: т ще 2 довая дві З дез? бод 000 ЕН
UAA201600243A 2013-06-27 2014-06-27 Антисмисловий олігомер та кон'югат, направлений на пропротеїн конвертазу субтилізин/кексин типу 9 (pcsk9) UA119643C2 (uk)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13174092 2013-06-27
EP13192938 2013-11-14
PCT/EP2013/073858 WO2014076195A1 (en) 2012-11-15 2013-11-14 Oligonucleotide conjugates
EP13192930 2013-11-14
EP14153253 2014-01-30
EP14168331 2014-05-14
PCT/EP2014/063757 WO2014207232A1 (en) 2013-06-27 2014-06-27 Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA119643C2 true UA119643C2 (uk) 2019-07-25

Family

ID=52141126

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201600243A UA119643C2 (uk) 2013-06-27 2014-06-27 Антисмисловий олігомер та кон'югат, направлений на пропротеїн конвертазу субтилізин/кексин типу 9 (pcsk9)

Country Status (30)

Country Link
US (7) US9879265B2 (uk)
EP (2) EP3591054A1 (uk)
JP (2) JP6255092B2 (uk)
KR (2) KR101931089B1 (uk)
CN (2) CN112263682A (uk)
AU (1) AU2014300981B2 (uk)
BR (1) BR112015032432B1 (uk)
CA (1) CA2915316C (uk)
CL (1) CL2015003728A1 (uk)
CY (1) CY1122738T1 (uk)
DK (1) DK3013959T3 (uk)
EA (1) EA201592215A1 (uk)
ES (1) ES2770667T3 (uk)
HK (1) HK1221740A1 (uk)
HR (1) HRP20200163T1 (uk)
HU (1) HUE048738T2 (uk)
IL (1) IL242875B (uk)
LT (1) LT3013959T (uk)
MX (2) MX367083B (uk)
MY (1) MY183049A (uk)
NZ (1) NZ715081A (uk)
PE (1) PE20160158A1 (uk)
PH (1) PH12015502761A1 (uk)
PL (1) PL3013959T3 (uk)
PT (1) PT3013959T (uk)
RS (1) RS59986B1 (uk)
SG (2) SG11201510656PA (uk)
SI (1) SI3013959T1 (uk)
UA (1) UA119643C2 (uk)
WO (1) WO2014207232A1 (uk)

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2015151857A (ru) 2008-12-02 2019-01-15 Уэйв Лайф Сайенсес Джапан, Инк. Способ синтеза модифицированных по атому фосфора нуклеиновых кислот
AU2010270714B2 (en) 2009-07-06 2015-08-13 Wave Life Sciences Ltd. Novel nucleic acid prodrugs and methods use thereof
DK2620428T3 (da) 2010-09-24 2019-07-01 Wave Life Sciences Ltd Asymmetrisk hjælpegruppe
CN107365339A (zh) 2011-07-19 2017-11-21 波涛生命科学有限公司 合成官能化核酸的方法
CA2879023C (en) 2012-07-13 2017-03-28 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
CN104661664B (zh) 2012-07-13 2020-07-03 波涛生命科学有限公司 手性控制
RU2650510C2 (ru) 2013-05-01 2018-04-16 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы модулирования экспрессии аполипопротеина c-iii
EP3591054A1 (en) 2013-06-27 2020-01-08 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
EP3095461A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
KR20230152178A (ko) 2014-01-16 2023-11-02 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 디자인
BR112016024850B1 (pt) 2014-05-01 2021-07-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc compostos e composições para modulação da expressão de angptl3 e seus usos
RU2724527C2 (ru) 2014-05-01 2020-06-23 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы модулирования экспрессии рецептора гормона роста
CR20200228A (es) 2014-05-01 2020-07-09 Ionis Pharmaceuticals Inc COMPOSICIONES Y MÈTODOS PARA MODULAR LA EXPRESIÒN DEL FACTOR B DEL COMPLEMENTO (Divisional 2016-0554)
GB201408623D0 (en) 2014-05-15 2014-07-02 Santaris Pharma As Oligomers and oligomer conjugates
CA2982825C (en) 2015-08-06 2023-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Processes for the preparation of galnac acid derivatives
US20210052631A1 (en) * 2015-09-25 2021-02-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
PE20181353A1 (es) 2015-10-09 2018-08-22 Wave Life Sciences Ltd Composiciones oligonucleotidicas y sus metodos
WO2017068087A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide detection method
CN108348478A (zh) 2015-11-06 2018-07-31 Ionis 制药公司 调节载脂蛋白(a)表达
WO2017084987A1 (en) 2015-11-16 2017-05-26 F. Hoffmann-La Roche Ag GalNAc CLUSTER PHOSPHORAMIDITE
UA127432C2 (uk) 2016-03-14 2023-08-23 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Олігонуклеотид для зниження експресії pd-l1
MA45478A (fr) * 2016-04-11 2019-02-20 Arbutus Biopharma Corp Compositions de conjugués d'acides nucléiques ciblés
JP7012033B2 (ja) 2016-06-17 2022-02-10 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー インビトロ腎毒性スクリーニングアッセイ
WO2017216340A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 F. Hoffmann-La Roche Ag In vitro nephrotoxicity screening assay
MA45496A (fr) 2016-06-17 2019-04-24 Hoffmann La Roche Molécules d'acide nucléique pour la réduction de l'arnm de padd5 ou pad7 pour le traitement d'une infection par l'hépatite b
EP3475424A1 (en) 2016-06-22 2019-05-01 ProQR Therapeutics II B.V. Single-stranded rna-editing oligonucleotides
CA3035534A1 (en) * 2016-09-07 2018-03-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
US11400161B2 (en) 2016-10-06 2022-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method of conjugating oligomeric compounds
EP3568479A1 (en) 2017-01-13 2019-11-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating nfkb1 expression
WO2018130585A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating relb expression
US20190345495A1 (en) 2017-01-13 2019-11-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating nfkb2 expression
US20190338286A1 (en) 2017-01-13 2019-11-07 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating rel expression
WO2018130581A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating rela expression
CN110536964A (zh) 2017-03-10 2019-12-03 国立研究开发法人国立成育医疗研究中心 反义寡核苷酸和糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物
JOP20190215A1 (ar) 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
WO2018191278A2 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Arbutus Biopharma Corporation Targeted compositions
MX2019012083A (es) 2017-04-13 2019-11-21 Cadila Healthcare Ltd Nueva vacuna de peptidos contra la pcsk9.
WO2018215049A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for galnac oligonucleotide conjugates
US11273222B2 (en) 2017-05-26 2022-03-15 National Cerebral And Cardiovascular Center Antisense nucleic acid targeting PCSK9
WO2019030313A2 (en) 2017-08-11 2019-02-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATION OF UBE3C EXPRESSION
WO2019038228A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Roche Innovation Center Copenhagen A/S OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATION OF TOM1 EXPRESSION
CN111226114A (zh) 2017-10-13 2020-06-02 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 用部分立体限定的寡核苷酸子文库鉴定反义寡核苷酸改进的立体限定硫代磷酸酯寡核苷酸变体的方法
TWI816066B (zh) 2017-10-16 2023-09-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於降低PAPD5及PAPD7 mRNA以治療B型肝炎感染之核酸分子
JP2021505175A (ja) 2017-12-11 2021-02-18 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス Ｆｎｄｃ３ｂの発現を調節するためのオリゴヌクレオチド
WO2019115417A2 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating rb1 expression
EP3729095A1 (en) 2017-12-21 2020-10-28 F. Hoffmann-La Roche AG Companion diagnostic for htra1 rna antagonists
CA3085406A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides comprising a phosphorodithioate internucleoside linkage
WO2019122282A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Gapmer oligonucleotides comprising a phosphorodithioate internucleoside linkage
CN111448316A (zh) 2017-12-22 2020-07-24 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 新的硫代亚磷酰胺
JP2021511022A (ja) 2018-01-10 2021-05-06 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス Ｐｉａｓ４発現を調節するためのオリゴヌクレオチド
EP3737760A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating gsk3b expression
CA3088112A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
SG11202006142PA (en) 2018-01-12 2020-07-29 Roche Innovation Ct Copenhagen As Alpha-synuclein antisense oligonucleotides and uses thereof
KR20200140240A (ko) 2018-01-12 2020-12-15 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 알파-시누클레인을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그의 용도
CN111615558A (zh) 2018-01-17 2020-09-01 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 用于调节erc1表达的寡核苷酸
WO2019145386A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating csnk1d expression
SG11202007652UA (en) * 2018-02-21 2020-09-29 Bristol Myers Squibb Co Camk2d antisense oligonucleotides and uses thereof
EP3770256A4 (en) * 2018-03-20 2021-12-22 Tokyo Institute of Technology ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE WITH REDUCED TOXICITY
JP7515400B2 (ja) 2018-04-05 2024-07-12 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｂ型肝炎ウイルス感染を治療するためのｆｕｂｐ１阻害剤の使用
PE20210346A1 (es) 2018-07-03 2021-02-25 Hoffmann La Roche Oligonucleotidos para modular la expresion de tau
CA3106288A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for modulating rtel1 expression
WO2020025563A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides comprising a phosphorotrithioate internucleoside linkage
WO2020025527A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides comprising a phosphorotrithioate internucleoside linkage
TW202102516A (zh) 2019-02-20 2021-01-16 丹麥商羅氏創新中心哥本哈根有限公司 膦醯基乙酸酯間隙子寡核苷酸
EP3927716A1 (en) 2019-02-20 2021-12-29 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Novel phosphoramidites
CN113474633A (zh) 2019-02-26 2021-10-01 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 寡核苷酸配制方法
CA3132178A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Aliye Seda Yilmaz-Elis Antisense oligonucleotides for immunotherapy
BR112021019182A2 (pt) 2019-04-03 2022-05-31 Bristol Myers Squibb Co Oligonucleotídeos angptl2 antissenso e seus usos
CN114829601A (zh) 2019-12-19 2022-07-29 豪夫迈·罗氏有限公司 Sbds抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
WO2021122993A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of saraf inhibitors for treating hepatitis b virus infection
EP4077667A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of sept9 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
EP4077668A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of scamp3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
WO2021122921A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of cops3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
MX2022007908A (es) 2019-12-24 2022-07-21 Hoffmann La Roche Combinacion farmaceutica de un oligonucleotido terapeutico que actua sobre hbv y un agonista de tlr7 para el tratamiento de hbv.
EP4081217A1 (en) 2019-12-24 2022-11-02 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical combination of antiviral agents targeting hbv and/or an immune modulator for treatment of hbv
MX2022010980A (es) 2020-03-04 2022-12-02 Verve Therapeutics Inc Composiciones y metodos para el suministro de arn dirigido.
WO2021185765A1 (en) * 2020-03-16 2021-09-23 Argonaute RNA Limited Antagonist of pcsk9
AR122731A1 (es) 2020-06-26 2022-10-05 Hoffmann La Roche Oligonucleótidos mejorados para modular la expresión de fubp1
CN116157522A (zh) 2020-08-21 2023-05-23 豪夫迈·罗氏有限公司 A1cf抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
CR20230308A (es) * 2020-12-11 2023-09-08 Civi Biopharma Inc Entrega oral de conjugados antisentido que tienen por blanco a pcsk9
TW202246500A (zh) 2021-02-02 2022-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於抑制 ｒｔｅｌ１ 表現之增強型寡核苷酸
CA3212650A1 (en) 2021-03-08 2022-09-15 Les Laboratoires Servier Antisense oligonucleotides for inhibiting alpha-synuclein expression
WO2023049294A2 (en) * 2021-09-23 2023-03-30 Sirius Therapeutics, Inc. Polynucleic acid molecules targeting pcsk9 and uses thereof
WO2023111210A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination of oligonucleotides for modulating rtel1 and fubp1
AR128558A1 (es) 2022-02-21 2024-05-22 Hoffmann La Roche Oligonucleótido antisentido
US20230372508A1 (en) * 2022-05-19 2023-11-23 Olix Us, Inc. Linkers coupling functional ligands to macromolecules
CN117563009A (zh) * 2023-09-01 2024-02-20 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种含有核糖环或其衍生结构的GalNAc化合物及其寡核苷酸缀合物

Family Cites Families (146)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2699808A (en) 1944-10-06 1955-01-18 Mark W Lowe Apparatus for peeling tomatoes
US2699508A (en) 1951-12-21 1955-01-11 Selectronics Inc Method of mounting and construction of mounting for low frequency piezoelectric crystals
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4914210A (en) 1987-10-02 1990-04-03 Cetus Corporation Oligonucleotide functionalizing reagents
US4962029A (en) 1987-10-02 1990-10-09 Cetus Corporation Covalent oligonucleotide-horseradish peroxidase conjugate
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US6395492B1 (en) 1990-01-11 2002-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
CA2095212A1 (en) 1990-11-08 1992-05-09 Sudhir Agrawal Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
ATE239484T1 (de) 1991-10-24 2003-05-15 Isis Pharmaceuticals Inc Derivatisierte oligonukleotide mit verbessertem aufnahmevermögen
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
JPH06311885A (ja) 1992-08-25 1994-11-08 Mitsubishi Kasei Corp Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子に相補的なアンチセンス化合物
US6423489B1 (en) 1992-09-10 2002-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus-associated diseases
CA2143678A1 (en) 1992-09-10 1994-03-17 Kevin P. Anderson Compositions and methods for treatment of hepatitis c virus-associated diseases
US6433159B1 (en) 1992-09-10 2002-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus associated diseases
JPH08504559A (ja) 1992-12-14 1996-05-14 ハネウエル・インコーポレーテッド 個別に制御される冗長巻線を有するモータシステム
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JPH10503364A (ja) 1994-05-10 1998-03-31 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション Ｃ型肝炎ウイルスのアンチセンス阻害
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
AU3999495A (en) 1994-10-06 1996-05-02 Buchardt, Dorte Peptide nucleic acid conjugates
MX9709914A (es) 1995-06-07 1998-03-31 Pfizer Derivados de acido bifenil-2-carboxilico-tetrahidro-isoquinolin-6-ilo, su preparacion y el uso de los mismos.
US5684142A (en) 1995-06-07 1997-11-04 Oncor, Inc. Modified nucleotides for nucleic acid labeling
CA2238379A1 (en) 1995-11-22 1997-06-12 The Johns-Hopkins University Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US5656408A (en) 1996-04-29 1997-08-12 Xerox Corporation Coated carrier particles
WO1998023593A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 Pfizer Inc. Apo b-secretion/mtp inhibitory amides
CN1268980A (zh) 1997-03-05 2000-10-04 华盛顿州大学 用于鉴定选择性抑制丙型肝炎病毒复制的试剂的新筛选方法
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US5770716A (en) 1997-04-10 1998-06-23 The Perkin-Elmer Corporation Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same
GB2341390B (en) 1997-05-21 2000-11-08 Univ Leland Stanford Junior Composition and method for enhancing transport across biological membranes
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
EP2253639A1 (en) 1997-09-12 2010-11-24 Exiqon A/S Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleoide analogues
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6335432B1 (en) 1998-08-07 2002-01-01 Bio-Red Laboratories, Inc. Structural analogs of amine bases and nucleosides
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
US6410323B1 (en) 1999-08-31 2002-06-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of human Rho family gene expression
WO2000056748A1 (en) 1999-03-18 2000-09-28 Exiqon A/S Xylo-lna analogues
DE60029314T2 (de) 1999-03-24 2007-07-12 Exiqon A/S Verbesserte Synthese für -2.2.1. I Bicyclo-Nukleoside
EP1178999B1 (en) 1999-05-04 2007-03-14 Santaris Pharma A/S L-ribo-lna analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US20040146516A1 (en) 1999-06-17 2004-07-29 Utah Ventures Ii L.P. Lumen-exposed molecules and methods for targeted delivery
US7029895B2 (en) 1999-09-27 2006-04-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 27411, a novel human PGP synthase
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
JP2003511016A (ja) 1999-10-04 2003-03-25 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチドを補充する高親和性ｒｎアーゼｈの設計
IL139450A0 (en) 1999-11-10 2001-11-25 Pfizer Prod Inc Methods of administering apo b-secretion/mtp inhibitors
JP2003524637A (ja) 1999-12-23 2003-08-19 エクシコン エ／エス Ｌｎａ修飾オリゴヌクレオチドの治療上の使用
CA2399727A1 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Narc-1, subtilase-like homologs
EP1334109B1 (en) 2000-10-04 2006-05-10 Santaris Pharma A/S Improved synthesis of purine locked nucleic acid analogues
WO2002094250A2 (en) 2001-05-18 2002-11-28 Cureon A/S Therapeutic uses of lna-modified oligonucleotides in infectious diseases
US20070173473A1 (en) 2001-05-18 2007-07-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003006475A2 (en) 2001-07-12 2003-01-23 Santaris Pharma A/S Method for preparation of lna phosphoramidites
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7888324B2 (en) 2001-08-01 2011-02-15 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
SI2264172T1 (sl) 2002-04-05 2017-12-29 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligomerne spojine za modulacijo izražanja HIF-1alfa
DE60315444T2 (de) 2002-05-08 2008-04-30 Santaris Pharma A/S Synthese von locked nucleic acid-derivaten
US20050069522A1 (en) 2002-08-12 2005-03-31 Richard Colonno Combination pharmaceutical agents as inhibitors of HCV replication
UA79300C2 (en) 2002-08-12 2007-06-11 Janssen Pharmaceutica Nv N-aryl piperidine substituted biphenylcarboxamides as inhibitors of apolipoprotein b secretion
US7087229B2 (en) 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
AU2003291755A1 (en) 2002-11-05 2004-06-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
AU2003291753B2 (en) 2002-11-05 2010-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
WO2004044141A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
EP1569695B1 (en) 2002-11-13 2013-05-15 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein b expression
EP2752488B1 (en) 2002-11-18 2020-02-12 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense design
FR2848572B1 (fr) 2002-12-12 2005-12-09 Univ Joseph Fourier Molecules inhibitrices de la synthese proteique du virus de l'hepatite c et procede de criblage desdites molecules inhibitrices
MXPA05008319A (es) 2003-02-10 2006-02-28 Santaris Pharma As Compuestos oligomericos para la modulacion de la expresion de survivina.
EP1471152A1 (en) 2003-04-25 2004-10-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Mutations in the human PCSK9 gene associated to hypercholesterolemia
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
DK1495769T3 (da) 2003-07-11 2008-06-23 Lbr Medbiotech B V Mannose-6-phosphat-receptormedieret gentransfer til muskelceller
EP1648914A4 (en) 2003-07-31 2009-12-16 Regulus Therapeutics Inc OLIGOMERIC COMPOUNDS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR MODULATING SMALL NON-CODING RNA
US7427672B2 (en) 2003-08-28 2008-09-23 Takeshi Imanishi Artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type
US20050053981A1 (en) 2003-09-09 2005-03-10 Swayze Eric E. Gapped oligomeric compounds having linked bicyclic sugar moieties at the termini
GB2424887B (en) 2003-11-26 2008-05-21 Univ Massachusetts Sequence-specific inhibition of small RNA function
UA83510C2 (en) 2003-12-09 2008-07-25 Янссен Фармацевтика Н.В. N-aryl piperidine substituted biphenylcarboxamides as inhibitors of apolipoprotein b
AU2004303464B2 (en) 2003-12-23 2009-10-01 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of BCL-2
WO2005073378A1 (en) 2004-01-30 2005-08-11 Santaris Pharma A/S MODIFIED SHORT INTERFERING RNA (MODIFIED siRNA)
ES2380923T3 (es) 2004-04-07 2012-05-21 Exiqon A/S Procedimientos de cuantificación de microARN y ARN interferentes pequeños
PL1747023T5 (pl) 2004-05-04 2017-05-31 Univ Leland Stanford Junior Sposób i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego HCV w komórkach docelowych
WO2006093526A2 (en) 2004-07-21 2006-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
US20080213891A1 (en) 2004-07-21 2008-09-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi Agents Comprising Universal Nucleobases
FR2873694B1 (fr) 2004-07-27 2006-12-08 Merck Sante Soc Par Actions Si Nouveaux aza-indoles inhibiteurs de la mtp et apob
EP1913011B1 (en) 2004-08-04 2016-11-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
CA2576233C (en) 2004-08-10 2016-03-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conjugate comprising an antagomir and a ligand
PT2409713E (pt) 2004-08-10 2015-10-09 Genzyme Corp Oligonucleótidos para utilização em modulação dos níveis de lipoproteínas e colesterol em humanos
EP2377873B1 (en) 2004-09-24 2014-08-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi modulation of ApoB and uses thereof
CA2587411A1 (en) 2004-11-17 2006-05-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of apolipoprotein b
US20060185027A1 (en) 2004-12-23 2006-08-17 David Bartel Systems and methods for identifying miRNA targets and for altering miRNA and target expression
BRPI0607555A2 (pt) 2005-04-19 2009-09-15 Surface Logix Inc inibidores da proteìna microssomal de transferência de triglicirideo e secreção de apo-b
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
AU2006291836B2 (en) 2005-09-15 2012-02-23 Santaris Pharma A/S RNA antagonist compounds for the inhibition of Apo-Bl00 expression
AU2007211080B9 (en) 2006-01-27 2012-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
CA2649045C (en) 2006-04-03 2019-06-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotides
ES2386578T3 (es) 2006-05-05 2012-08-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y procedimientos para modular la expresión de PCSK9
CN101484588B (zh) * 2006-05-11 2013-11-06 阿尔尼拉姆医药品有限公司 抑制pcsk9基因表达的组合物和方法
ES2389737T3 (es) 2006-05-11 2012-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en 5'
EP2052079A2 (en) 2006-07-17 2009-04-29 Sirna Therapeutics Inc. Rna interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
MX2009002859A (es) 2006-09-15 2009-03-30 Enzon Pharmaceuticals Inc Enlazadores biodegradables a base de ester impedido para suministro de oligonucleotidos.
CA2662520A1 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric conjugates containing positively-charged moieties
EP2444494B1 (en) * 2006-10-09 2016-09-28 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Rna antagonist compounds for the modulation of pcsk9
US20100021914A1 (en) 2006-11-23 2010-01-28 Querdenker Aps Oligonucleotides for modulating target rna activity
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
EP2453016A1 (en) 2006-11-27 2012-05-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
WO2008089767A1 (en) 2007-01-26 2008-07-31 Diramo A/S Stacking of optic sensor and microfluidic-chips with optically communication through windows
WO2008109369A2 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tnf gene expression and uses thereof
DK2149605T3 (da) 2007-03-22 2013-09-30 Santaris Pharma As Korte RNA antagonist forbindelser til modulering af det ønskede mRNA
WO2008124384A2 (en) 2007-04-03 2008-10-16 Aegerion Pharmaceuticals, Inc. Combinations of mtp inhibitors with cholesterol absorption inhibitors or interferon for treating hepatitis c
EP2170917B1 (en) 2007-05-30 2012-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
DK2176280T4 (en) 2007-07-05 2015-07-20 Isis Pharmaceuticals Inc 6-Disubstituerede bicykliske nukleinsyreanaloge
CN101816010A (zh) 2007-07-19 2010-08-25 数据匙电子有限公司 Rf令牌和接纳器***与方法
BRPI0721948A2 (pt) 2007-08-20 2014-04-08 Enzon Pharmaceuticals Inc Ligantes poliméricos contendo frações dissulfeto de piridila
WO2009043353A2 (en) 2007-10-04 2009-04-09 Santaris Pharma A/S Micromirs
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
EP2231195B1 (en) 2007-12-04 2017-03-29 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
WO2009090182A1 (en) 2008-01-14 2009-07-23 Santaris Pharma A/S C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides
CA2713379A1 (en) 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
US9290534B2 (en) 2008-04-04 2016-03-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having at least one neutrally linked terminal bicyclic nucleoside
AU2009234266B2 (en) 2008-04-11 2015-08-06 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
WO2009127680A1 (en) * 2008-04-16 2009-10-22 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical composition comprising anti pcsk9 oligomers
WO2009148605A2 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
BRPI0914123A2 (pt) * 2008-07-02 2015-10-20 Enzon Pharmaceuticals Inc antagonistas de rna que alvejam hsp27
AT507215B1 (de) 2009-01-14 2010-03-15 Boehler Edelstahl Gmbh & Co Kg Verschleissbeständiger werkstoff
AU2010241567B2 (en) * 2009-04-29 2013-10-31 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Pharmaceutical compositions comprising EPA and a cardiovascular agent and methods of using the same
JP2012529279A (ja) 2009-06-12 2012-11-22 サンタリス ファーマ アー／エス 新規の強力な抗ａｐｏｂアンチセンス化合物
WO2011009697A1 (en) 2009-07-21 2011-01-27 Santaris Pharma A/S Antisense oligomers targeting pcsk9
WO2011126937A1 (en) 2010-04-06 2011-10-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Targeted intracellular delivery of oligonucleotides via conjugation with small molecule ligands
EP2633046A4 (en) 2010-10-29 2015-05-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING PCSK9 GENES
EP3226459B1 (en) 2010-12-13 2020-11-25 Telefonaktiebolaget LM Ericsson (publ) Exchange of parameters relating to measurement periods
JP2014504295A (ja) * 2010-12-17 2014-02-20 アローヘッド リサーチ コーポレイション ｓｉＲＮＡ用ガラクトースクラスター−薬物動態調節剤標的指向部分
BR122020024394B1 (pt) 2010-12-29 2021-05-11 F. Hoffmann-La Roche Ag conjugado e composição farmacêutica
US9752142B2 (en) * 2011-08-11 2017-09-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomeric compounds comprising 5′-modified deoxyribonucleosides in the gap and uses thereof
US9984408B1 (en) 2012-05-30 2018-05-29 Amazon Technologies, Inc. Method, medium, and system for live video cooperative shopping
CA2893801A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
RU2650510C2 (ru) * 2013-05-01 2018-04-16 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы модулирования экспрессии аполипопротеина c-iii
EP3591054A1 (en) * 2013-06-27 2020-01-08 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9
US9778708B1 (en) 2016-07-18 2017-10-03 Lenovo Enterprise Solutions (Singapore) Pte. Ltd. Dual sided latching retainer for computer modules

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160027042A (ko) 2016-03-09
JP2016523094A (ja) 2016-08-08
BR112015032432A2 (pt) 2017-08-29
JP6255092B2 (ja) 2017-12-27
AU2014300981B2 (en) 2017-08-10
PL3013959T3 (pl) 2020-05-18
KR102226110B1 (ko) 2021-03-10
SI3013959T1 (sl) 2020-04-30
US20240084307A1 (en) 2024-03-14
JP6672245B2 (ja) 2020-03-25
US20180216116A1 (en) 2018-08-02
KR101931089B1 (ko) 2019-03-14
SG10201908122XA (en) 2019-10-30
EP3591054A1 (en) 2020-01-08
CN105358692B (zh) 2020-08-21
CA2915316C (en) 2024-01-02
PE20160158A1 (es) 2016-03-18
IL242875B (en) 2020-02-27
EP3013959B1 (en) 2019-12-04
RS59986B1 (sr) 2020-03-31
KR20180136006A (ko) 2018-12-21
CY1122738T1 (el) 2021-03-12
US10443058B2 (en) 2019-10-15
JP2018064575A (ja) 2018-04-26
AU2014300981A1 (en) 2016-01-21
DK3013959T3 (da) 2020-02-17
US20220025376A1 (en) 2022-01-27
MX2019006284A (es) 2019-08-29
MY183049A (en) 2021-02-09
HK1221740A1 (zh) 2017-06-09
MX367083B (es) 2019-08-05
US20180312847A1 (en) 2018-11-01
ES2770667T3 (es) 2020-07-02
LT3013959T (lt) 2020-03-10
WO2014207232A1 (en) 2014-12-31
CN112263682A (zh) 2021-01-26
CA2915316A1 (en) 2014-12-31
MX2015017601A (es) 2016-04-07
US20200248186A1 (en) 2020-08-06
US10370668B2 (en) 2019-08-06
US11091764B2 (en) 2021-08-17
PT3013959T (pt) 2020-02-04
HUE048738T2 (hu) 2020-08-28
US9879265B2 (en) 2018-01-30
US11739332B2 (en) 2023-08-29
US20160138025A1 (en) 2016-05-19
EA201592215A1 (ru) 2016-05-31
CL2015003728A1 (es) 2016-08-26
BR112015032432B1 (pt) 2023-02-07
EP3013959A1 (en) 2016-05-04
HRP20200163T1 (hr) 2020-08-07
NZ715081A (en) 2022-02-25
PH12015502761A1 (en) 2016-03-21
WO2014207232A4 (en) 2015-03-19
CN105358692A (zh) 2016-02-24
SG11201510656PA (en) 2016-01-28
US10385342B2 (en) 2019-08-20
US20180312846A1 (en) 2018-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA119643C2 (uk) Антисмисловий олігомер та кон'югат, направлений на пропротеїн конвертазу субтилізин/кексин типу 9 (pcsk9)
EP2920307B1 (en) Anti apob antisense conjugate compounds
CN111465694A (zh) 用于抑制细胞中lpa的表达的核酸
JP2017501684A (ja) Ａｐｏｂアンチセンスコンジュゲート化合物
EA043736B1 (ru) Антисмысловые олигомеры и их конъюгаты, направленные на пропротеин конвертазу субтилизин/кексин типа 9 (pcsk9)