CN110536964A

CN110536964A - 反义寡核苷酸和糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物

Info

Publication number: CN110536964A
Application number: CN201880017237.7A
Authority: CN
Inventors: 但马刚; 冈田贤; 津村弥来
Original assignee: First And Third Common Co; NAT UNIVERSITY OF CORP HIROSHI; National Research And Development Corp National Center For Maternity Medical Research
Current assignee: First And Third Common Co; NAT UNIVERSITY OF CORP HIROSHI; National Research And Development Corp National Center For Maternity Medical Research
Priority date: 2017-03-10
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2019-12-03
Also published as: KR102520654B1; EP3594346A1; EP3594346A4; TW201833325A; JP7048574B2; JP2024009169A; US11963974B2; TW202321453A; WO2018164275A1; JP2022093334A; US20200246369A1; TWI793110B; JPWO2018164275A1; KR20190127781A

Abstract

提供一种新的反义寡核苷酸和糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物。本申请发明提供一种反义寡核苷酸，其与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的包含第42911000位的碱基、第42911004位的碱基和第42911005位的碱基中的至少1个碱基区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

Description

反义寡核苷酸和糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物

技术领域

本发明涉及反义寡核苷酸和糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物。

背景技术

糖原贮积病Ia型是伴有先天性代谢异常的疾病，所述先天性代谢异常由催化内源性血糖供给通路的最终阶段的酶、即“葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)”的功能下降所引起。糖原贮积病Ia型的主要治疗方法为淀粉质的频繁进食法，并且组合使用针对酸中毒的柠檬酸制剂、针对高尿酸血症的尿酸合成抑制剂等，但远未达到纠正由代谢障碍所致的各种异常所见的的程度，当病情长期进展时，也有时达到形成肝癌、肾衰竭的情况。在这样的肝癌发生病例中，会选择肝移植，在肾衰竭病例中会选择肾移植(非专利文献1)。

已知在日本的糖原贮积病Ia型患者中，约9成的患者的该疾病的责任基因(responsible gene)、即作为编码G6Pase的基因的G6PC中具有编码区DNA的第648位的碱基-鸟嘌呤 (G)被置换为胸腺嘧啶(T)的共通变异(c.648G>T)(非专利文献2)。该变异不引起氨基酸置换，周围序列成为异位剪接受***点而发生异常剪接，其结果是产生缩短了91碱基对的转录产物(非专利文献3)。近年来，关于剪接变异还获知了利用与该区域的碱基序列互补的核酸衍生物“反义寡核苷酸(ASO)”而恢复正常的转录的技术(非专利文献4)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:Chou JY et al.,J Inherit Metab Dis 38:511-519,2014.

非专利文献2:Akanuma J et al.,Am J Med Genet 91:107-12,2000.

非专利文献3:Kajihara S et al.,Am J Hum Genet 57:549-55,1995.

非专利文献4:Havens MA et al.,WIREs RNA 4:247-66,2013.

发明内容

发明要解决的课题

截至目前为止，尚不存在针对糖原贮积病Ia型的特异性治疗药。本发明是鉴于上述问题而进行的，其目的在于，提供新的反义寡核苷酸和糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物。

用于解决课题的手段

本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，发现通过在糖原贮积病Ia型患者的细胞中添加以c.648G>T变异型G6PC基因的前mRNA的序列为靶序列的反义寡核苷酸，可抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接、产生具有正常的碱基长度的基因转录产物，从而完成了本发明。即，本发明包含以下的任一方式。

＜1＞一种反义寡核苷酸，其与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的包含第 42911000位的碱基、第42911004位的碱基和第42911005位的碱基中的至少1个碱基区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

＜2＞一种糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物，包含反义寡核苷酸作为药效成分，上述反义寡核苷酸与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的包含第42911000位的碱基、第42911004位的碱基和第42911005位的碱基中的至少1个碱基区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

发明的效果

本发明提供一种新的的反义寡核苷酸、以及包含该反义寡核苷酸作为药效成分的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物。本发明对于糖原贮积病Ia型的预防或治疗有效。

附图说明

图1是示出由c.648G>T的变异而产生的、G6PC的前mRNA的异常剪接区域的图。

图2是示出健康对照被检者来源(泳道1～3)和GSD-Ia的患者来源(泳道4～6)的嵌套式PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果的图。

图3是示出嵌套式PCR产物的直接测序结果的图。图3的(a)示出泳道1～3中的单一条带(305bp)的序列。图3的(b)示出泳道5和6中的单一条带(214bp)和泳道4中的较短条带(214bp)的序列。图3的(c)示出泳道4中的较长条带(305bp)的序列。

图4是示出添加各种LNA ASO(LNA01～13)和不添加LNA ASO(空白)样品的嵌套式PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果的图。

图5是示出嵌套式PCR产物的直接测序结果的图。图5的(a)示出不添加LNA ASO 样品的嵌套式PCR产物的序列。图5的(b)示出各种LNA ASO添加样品的嵌套式PCR 产物的c.648G>T附近的波形。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行详细说明。

〔术语的说明〕

“葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)”催化糖异生和糖原分解的最后一步的由葡萄糖-6-磷酸 (G6P)向葡萄糖和磷酸的水解，另外是对维持葡萄糖稳定性而言重要的酶蛋白。另外，“G6PC”为编码G6Pase的基因(基因座17q21)。

“糖原贮积病(glycogen storage diseases、以下也称为GSD)”是指：由于糖原代谢通路的酶或运载蛋白的基因异常而导致的、糖原的合成或分解紊乱的疾病，已知有11种类型。 G6PC基因的突变会引起糖原贮积病Ia型(GSD-Ia)。

“糖原贮积病Ia型(也称为GSD-Ia)”是最具代表性的糖原贮积病，发生率为每100,000 新生儿中约1人。另外，也作为冯·吉尔克病而为人所知。GSD-Ia是由于G6Pase的先天性缺损而发生的基因疾病。糖原贮积病Ia型由于责任基因的纯合或复合杂合突变而发病。

就GSD-Ia而言，由于G6Pase的缺损，肝脏的由糖原以及由糖异生而产生游离葡萄糖的能力受损。以伴有肝脏和肾脏中的糖原和脂肪的蓄积的重度空腹低血糖为特征。由糖原和糖异生前体所产生的过剩量的葡萄糖-6-磷酸不产生葡萄糖而是进入糖酵解***，从而发生血中的乳酸、尿酸、胆甾醇和甘油三酯的继发性上升。应答基因G6PC在肝脏、肾脏和小肠中表达，因此随着糖原的蓄积，这些组织会慢性受损。从而，罹患GSD-Ia的患者无法维持葡萄糖稳定性，显示反复性低血糖症、慢性乳酸酸中毒、生长障碍、肝损伤、肾肥大症、高脂血症、高尿酸血症、肝脏肥大、血中的氨基转移酶持续上升和肾小球滤过偏高等。进一步地，这些症状常常引发肝脏的多发性腺瘤、蛋白尿，最坏的情况下有时引发恶性肝肿瘤和慢性肾衰竭。

本说明书中，“蛋白质”也可以称为“多肽”。“蛋白质”包含氨基酸以肽键键合而成的结构，进一步地，还可以包含例如糖链或异戊间二烯基等结构。在没有明确记载的情况下，“蛋白质”包括含有可以与天然存在的氨基酸同样地起作用的、天然存在的氨基酸的已知类似体的多肽。

本说明书中，“核酸”包括：由任意的纯粹的核苷酸和/或修饰核苷酸构成的多聚核苷酸，例如cDNA、mRNA、总RNA、hnRNA等。

本说明书中，“基因”可以与“多聚核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”替换使用。“多聚核苷酸”是指核苷酸的聚合物。因此，本说明书中的术语“基因”中，不仅包含双链DNA，还包含构成其的正义链和反义链之类的各单链DNA、RNA(mRNA等)。

本说明书中，“寡核苷酸”是指：规定个数的核苷酸聚合而成的核苷酸的聚合物。本说明书中，述及“寡核苷酸”时，其长度没有限定，但是是指“多聚核苷酸”中的具有较短的核苷酸链的核酸。另外，“反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotide、也称为ASO)”是具有与靶核酸序列(相当于正义序列)杂交、从而调节由包含该靶核酸序列的核酸序列所编码的靶基因的表达的功能的寡核苷酸的总称。

本说明书中，“DNA”包括例如通过克隆、化学合成技术或它们的组合而得到的cDNA、基因组DNA等。即，DNA可以是包含于动物的基因组的形态的、包括内含子等非编码序列在内的“基因组”形DNA，另外也可以是使用逆转录酶、聚合酶经由mRNA而得到的cDNA，即不含内含子等非编码序列的“转录”形DNA。

“前mRNA”也称为mRNA前体，是指包含外显子和内含子这两者的RNA。“mRNA”是指内含子被除去、外显子彼此结合而成的RNA。由该mRNA来翻译蛋白质。

本说明书中，“靶序列”是指：反义寡核苷酸所杂交的靶核酸序列的部分、即反义寡核苷酸通过互补而形成杂交体的序列。

本说明书中，“预防”是指防止罹患疾患、疾病或障碍。另外，“治疗”是指：使已经罹患的疾患、疾病或障碍或伴随于此的症状缓和、或将其除去。

本说明书中，“健康”是指未罹患糖原贮积病Ia型。另外，本说明书中，“健康”也包括例如由于具有G6Pase的缺损等情况等而具有罹患糖原贮积病Ia型的风险、但尚未产生临床症状的情况。

〔1.反义寡核苷酸〕

近年来，使用反义寡核苷酸的基因治疗已经逐渐作为用于修正特定种类的遗传缺陷的有效的选择方法而被建立起来。mRNA的异常剪接可成为ASO疗法的有效的靶[参考文献1]。

本发明中，提供一种反义寡核苷酸，其与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的包含第42911000位的碱基、第42911004位的碱基和第42911005位的碱基中的至少1 个碱基区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

就糖原贮积病Ia型而言，有报道指出，G6PC的编码区DNA的第648位的碱基G(鸟嘌呤)被置换为T(胸腺嘧啶)而成的变异体(c.648G>T)是在日本、韩国、台湾和中国等东亚各国中被特异性观察到的主要变异[参考文献2]。

该变异在以前的记载方法中作为727G>T而为人所知，不是氨基酸变异的主要因素，但是使作为异位剪接受***点的、G6PC的编码区DNA的第652位的碱基-腺嘌呤(A)至第653位的鸟嘌呤(G)的序列(c.652_653AG)活化，从而产生外显子5的第563位的G (c.563G、此后也同样地记载)至c.653G的91bp缺失(序列号5)(实施例的图1)。从而，当存在影响前mRNA的剪接机制的突变时，该突变会引起前mRNA的异常剪接，产生不同于由通常的前mRNA生成的mRNA的异常mRNA或mRNA片段。其结果是，正常的 G6Pase转录产物的产生被抑制。

更详细而言，在作为变异型的G6PC基因的c.648G>T变异型G6PC中，GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列的第42909418位的鸟嘌呤(cDNA(序列号4)的c.562G)的 3’侧的2个碱基、即第42909419位的鸟嘌呤(G)(cDNA(序列号4)的c.562+1G)和第 42909420位的胸腺嘧啶(T)(cDNA(序列号4)的c.562+2T)成为剪接供***点，第42911006 位的胞嘧啶(C)(cDNA(序列号4)的c.654C)的5’侧的2个碱基、即第42911004位的腺嘌呤(A)(cDNA(序列号4)的c.652A)和第42911005位的鸟嘌呤(G)(cDNA(序列号4)的c.653G)成为新的剪接受***点(异位剪接受***点)。即，在c.648G>T变异型G6PC中，产生从GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列的第42909419位的鸟嘌呤至第42911005位的鸟嘌呤被识别为内含子、第42911006位的胞嘧啶至第42914433位的腺嘌呤被识别为外显子的异常剪接，因此，如果抑制使用第42909419位的鸟嘌呤(G)(cDNA (序列号4)的c.562+1G)和第42909420位的胸腺嘧啶(T)(cDNA(序列号4)的c.562+2T) 所构成的剪接供***点、以及第42911004位的腺嘌呤(A)(cDNA(序列号4)的c.652A) 和第42911005位的鸟嘌呤(G)(cDNA(序列号4)的c.653G)所构成的剪接受***点的异常剪接，则异常mRNA的表达量减少，同时基于正常剪接的具有正常的碱基长度的G6PC mRNA的表达得以恢复，结果是正常型G6Pase蛋白的生成得以恢复。即，“具有抑制 c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性”是指具有下述功能中的至少任一种功能：抑制上述的异常剪接以及作为其结果的使异常mRNA的表达量减少、使基于正常剪接的具有正常的碱基长度的G6PC mRNA的表达得以恢复、和生成正常型G6Pase蛋白。

另外，G6PC的碱基序列和G6Pase蛋白的氨基酸序列的信息可以由例如NCBIReference Sequence(RefSeq)、GenBank等获得。例如，作为G6Pase蛋白，具体可列举具有序列号6所示的氨基酸序列的人的G6Pase蛋白的氨基酸序列(RefSeq登录号： NP_000142.2)。

这里，GRCh38/hg38为登录到https://www.ncbi.nlm.nih.gov/等中的人基因组数据的汇编 (RefSeq assembly accession:GCF_000001405.36,GenBank assemblyaccession: GCA_000001405.25)，人第17号染色体区域被示于GenBank登录号:CM000679.2。

进一步地，将人第17号染色体的G6PC区域的碱基序列的基因组DNA的碱基序列示于序列号1。该序列示于RefSeq登录号：NG_011808.1。另外，c.648G>T变异型G6PC的基因组DNA的碱基序列是GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列的第42911000位的碱基由G被置换为T的序列。

需要说明的是，分别地，GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列的第42911000位的碱基对应于序列号1的第15203位的碱基、序列号2或序列号3的第694位的碱基、序列号4的第648位的碱基和序列号13的第728位的碱基；GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列的第42911004位的碱基对应于序列号1的第15207位的碱基、序列号2或序列号3的第698位的碱基、序列号4的第652位的碱基和序列号13的第732位的碱基； GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列的第42911005位的碱基对应于序列号1的第 15208位的碱基、序列号2或序列号3的第699位的碱基、序列号4的第653位的碱基和序列号13的第733位的碱基。

另外，G6PC mRNA的碱基序列示于RefSeq登录号：NM_000151.3(序列号13)。进一步地，G6PC的编码区的碱基序列还示于GenBank登录号：BC130478.1(序列号2)和 BC136369.1(序列号3)。需要说明的是，BC130478.1的序列号2所示的序列是除了在 BC136369.1(序列号3)的第2349位的T与2350位的G之间进一步***了1个碱基T这一点不同以外、其余均相同的序列。

反义寡核苷酸可以是编码上述的变异型G6PC基因的碱基序列的一部分。例如，可基于正常型G6PC或c.648G>T变异型G6PC的基因组DNA、cDNA、前mRNA或mRNA的碱基序列来设计。本发明的反义寡核苷酸与前mRNA分子形成杂交体，在能够剪接的条件下制成双链分子。即，本发明的反义核苷酸在c.648G>T变异型G6PC基因的转录阶段抑制作为一次转录产物的前mRNA的上述异常剪接、将其修复为正常剪接反应。从而，可以表达具有正常的碱基长度的G6PC mRNA、恢复正常型G6Pase蛋白的生成。

本发明中还包含与下述前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性的反义寡核苷酸，所述前mRNA是不同于GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列的人第17号染色体碱基序列中的、包含与上述的GRCh38/hg38 的人第17号染色体碱基序列的第42911000位的碱基、第42911004位的碱基和第42911005 位的碱基对应(相当)的碱基和单核苷酸多态性中的至少1个碱基的区域。在此，“与…对应(相当)的碱基和单核苷酸多态性”是指：不同于GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列的人第17号染色体碱基序列的该碱基和单核苷酸多态性，意味着靶序列中也涵盖了由于人的个体差异等而有若干改变的人第17号染色体碱基序列等。

作为反义核苷酸的具体序列，可以是以上述的异常剪接中使用的异位剪接受***点的周边序列为靶序列的序列。作为一实施方式，反义核苷酸可以是与下述前mRNA的序列杂交的反义核苷酸，所述前mRNA为以GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的第42911000位的碱基、第42911004位的碱基和第42911005位的碱基中的至少1个碱基为基准的、向上游的50个碱基的碱基至向下游的50个碱基为止的区域中所含的序列。换言之，一实施方式的反义寡核苷酸是与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的第 42910951位～第42911054位的碱基(cDNA(序列号4)的c.599G～c.702C)的区域的前 mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性的反义寡核苷酸。作为另一实施方式，可以是与下述前mRNA的序列杂交的反义核苷酸，所述前mRNA为以GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的第42911000位的碱基、第42911004位的碱基和第42911005位的碱基中的至少1个碱基为基准的、向上游的30个碱基的碱基至向下游的30个碱基的区域中所含的序列。换言之，另一实施方式的反义寡核苷酸是与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的第42910971位～第42911034位的碱基(cDNA(序列号4)的c.619A～c.682A)的区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性的反义寡核苷酸。

一实施方式的反义寡核苷酸与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的包含第 42911000位的碱基、第42911004位的碱基和第42911005位的碱基中的1个、2个或全部3个碱基的区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA 的异常剪接的活性。

本发明的反义寡核苷酸的序列按照可阻断成为发生异常剪接的主要因素的异位剪接受***点的方式来选择。

如果使用该反义核苷酸，则通过正常剪接而除去正常的内含子区域、产生编码正常型 G6Pase蛋白的mRNA。本发明的反义寡核苷酸包含能够与上述的靶序列杂交的碱基序列，具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

一实施方式的反义寡核苷酸包含与c.648G>T变异型G6PC的前mRNA序列的外显子5内区域的包含异位剪接受***点的区域充分互补的碱基序列。该反义寡核苷酸抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接，从而可以增加有正常的活性的正常型 G6Pase蛋白的表达。作为这样的反义寡核苷酸的具体序列，可列举例如包含与序列号7杂交的碱基序列(序列号14)的寡核苷酸。序列号7所示的碱基序列是与G6PC的编码区的 DNA的碱基序列(序列号4)的c.648G>T变异型的第630位～第654位一致的序列。

一实施方式的反义寡核苷酸具体为选自以下的(a)～(c)的反义寡核苷酸。

(a)包含序列号14所示的碱基序列的反义寡核苷酸

(b)包含在序列号14所示的碱基基序列中缺失、置换、***和/或添加1～10个、优选1～5个碱基而成的碱基序列且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性的反义寡核苷酸

(c)包含相对于序列号14所示的碱基序列具有60％以上的序列一致性的碱基序列且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性的反义寡核苷酸。在此，序列一致性优选为65％以上，更优选为70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上，特别优选为95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上。

上述(b)和(c)的反义寡核苷酸具体可以称为上述(a)的反义寡核苷酸的变异体。即，意在应对基因簇间的多态性等。

即，一实施方式的反义核苷酸为与G6PC的前mRNA的包含rs80356484(G/T多态性)所示的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism(SNP))的区域互补的反义寡核苷酸且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。rs80356484的rs编号表示National Center for Biotechnology Information的dbSNP数据库 (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)的登录编号，可由网站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi？rs＝80356484&pt＝1ZSlUX0_YR_X1REc5s-B-00w7e7HgeIfXE3I8aMuPnEiTRLgNu)获得。

需要说明的是，对于rs80356484，将包含SNP碱基(c.648G/T)、c.652A和c.653G以及其前后的区域的合计104bp长度的序列(c.599G～c.702C)示于序列号8。第50位的碱基具有多态性。

另外，本发明的进一步的实施方式的反义寡核苷酸具体为选自以下的(d)～(h)中的反义寡核苷酸。

(d)其碱基序列如序列号15(与序列号8杂交的序列)的整体或部分序列所示、并且至少包含序列号15的第50位～第55位所示的全部碱基的反义寡核苷酸

(e)序列的长度为7个碱基以上、10个碱基以上、11个碱基以上、12个碱基以上、 13个碱基以上、14个碱基以上、15个碱基以上、16个碱基以上、17个碱基以上、18个碱基以上、19个碱基以上、20个碱基以上、21个碱基以上、22个碱基以上、23个碱基以上、 24个碱基以上或25个碱基以上的上述(d)的反义寡核苷酸

(f)序列的长度为104个碱基以下、103个碱基以下、102个碱基以下、101个碱基以下、100个碱基以下、90个碱基以下、80个碱基以下、70个碱基以下、60个碱基以下、 50个碱基以下、40个碱基以下、35个碱基以下、30个碱基以下、29个碱基以下、28个碱基以下、27个碱基以下或26个碱基以下的上述(d)或(e)的反义寡核苷酸

(g)相对于上述(d)～(f)中的任一者所述的反义寡核苷酸显示95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性的反义寡核苷酸

(h)优选满足A)序列号15的第50位的碱基为C、B)第51位的碱基为T、C)第 55位的碱基为A的条件中的至少1个、至少2个或3个的上述(d)～(g)中的任一反义寡核苷酸。

需要说明的是，反义寡核苷酸与靶序列杂交不限于在可发生杂交的区域中、反义寡核苷酸的碱基序列与靶序列的碱基序列处于完全互补的关系的情况。一例中，可发生杂交的上述区域为25bp以上时，反义寡核苷酸可以为相对于与该区域的前mRNA的碱基序列完全互补的序列具有60％以上、优选为65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、更优选为85％以上、进一步优选为90％以上、特别优选为95％以上的序列一致性的反义寡核苷酸。或者，可发生杂交的上述区域为25bp以上时，反义寡核苷酸可以为相对于完全互补的上述序列具有10个碱基以下、优选为5个碱基以下、4个碱基以下、更优选为3个碱基以下、进一步优选为2个碱基以下、特别优选为1个碱基的差异的反义寡核苷酸。或者，在另一例子中，可发生杂交的上述区域为7bp以上时，反义寡核苷酸可以为相对于与该区域的前 mRNA的碱基序列完全互补的序列具有优选为2个碱基以下、更优选为1个碱基的差异的反义寡核苷酸。

反义寡核苷酸可以是DNA分子、RNA分子以及DNA与RNA的杂交分子中的任一者。从稳定性的观点出发，有时优选为DNA分子。

本发明的反义寡核苷酸的长度没有特别限定，适合的长度有时会因寡核苷酸的修饰种类等而不同。一实施方式的反义寡核苷酸优选为7～104个碱基，更优选为10～104个碱基，进一步优选为15～64个碱基，特别优选为15～44个碱基，最优选为15～30个碱基。作为另一例示，在本发明的反义寡核苷酸为后述的吗啉代寡核苷酸时，优选为14～30个碱基，特别优选为20～30个碱基。另外，作为另一例示，在本发明的反义寡核苷酸为包含后述的锁定核酸(locked nucleic acids、LNA)的寡核苷酸(即，LNA寡核苷酸)时，优选为7～ 25个碱基，更优选为7～23个碱基，进一步更优选为9～20个碱基，特别优选为10～17 个碱基。

另外，本发明的反义寡核苷酸可以是天然型的寡核苷酸，也可以是非天然型的寡核苷酸。作为非天然型的寡核苷酸，可列举例如具有吗啉骨架、氨基甲酸酯骨架、硅氧烷骨架、硫醚骨架、亚砜骨架、砜骨架、甲酰基(日语：ホルムアセチル)骨架、硫代甲酰基骨架、亚甲基甲酰基骨架、核糖乙酰基骨架、含链烯的骨架、氨基磺酸酯骨架、磺酸酯骨架、磺酰胺骨架、亚甲基亚氨基骨架、亚甲基肼基骨架、酰胺骨架等修饰骨架的寡核苷酸。从而，作为非天然型的寡核苷酸，可列举：磷酸酰胺吗啉寡核苷酸或磷酸二酰胺吗啉寡核苷酸 (PMO)等吗啉代寡核苷酸；PMO-X、PPMO、肽核酸(PNA)、锁定核酸(locked nucleic acids、LNA)、硫代磷酸酯寡核苷酸、三环-DNA寡核苷酸、三环-硫代磷酸酯寡核苷酸、 2’O-Me修饰寡核苷酸、2’-O，4’-C-乙烯交联型核酸种(ENA)等。这些非天然型的寡核苷酸不易被核酸酶，因此在细胞内可有效地发挥作用。例如，已知吗啉代寡核苷酸提高相对于核酸酶的稳定性、促进向细胞中的引入。吗啉代寡核苷酸具有不是与脱氧核糖环或核糖环结合、而是与吗啉环结合的核酸碱基。另外，LNA的情况下，已知提高对靶核酸的结合亲和性、且具有对核酸酶的耐受性。LNA寡核苷酸可通过将天然型的寡核苷酸中的1个以上的核苷酸置换为LNA来制作。本发明的反义寡核苷酸为LNA寡核苷酸的情况下，相对于每单位寡核苷酸的优选LNA含有比例根据反义寡核苷酸的长度而不同。例如，在LNA 寡核苷酸的长度为10～17个碱基时，优选以优选为20％～55％、更优选为25％～55％、进一步更优选为30％～50％来含有LNA。

另一方面，例如LNA寡核苷酸的长度为7～9个碱基时，优选以优选为40％～100％、更优选为50％～100％、进一步更优选为70％～100％来含有LNA。

一实施方式的反义寡核苷酸为选自上述(d)～(h)中、且核苷酸的一部分或全部为LNA的反义寡核苷酸。另外，一实施方式的反义寡核苷酸为选自上述(d)～(h)、且核苷酸每隔一个碱基为LNA的反义寡核苷酸。一例为包含设为15个碱基长度、3’末端和5’末端的碱基为天然型的核苷酸、每隔1个碱基导入LNA且各碱基间形成硫代磷酸酯键的序列号17、序列号20或序列号23所示的碱基序列的反义寡核苷酸。

进一步地，另外本发明的反义寡核苷酸的5’末端和/或3’末端可以被修饰。作为修饰的例示，可列举三乙二醇(TEG)修饰、六乙二醇(HEG)修饰、十二乙二醇(DODEG)修饰等。或者，构成反义寡核苷酸的碱基与碱基之间可以具有间隔化合物。另外，反义寡核苷酸可以包含1个以上的经修饰的核苷酸、核苷酸间的修饰、或经过改造的1个以上的键等。例如，作为核苷酸间的键的例子，可列举硫代磷酸酯(PS)键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、磷酰胺键、硼代磷酸酯键等。

反义寡核苷酸可以通过公知的基因工程学方法和多聚核苷酸合成方法来得到。具体而言，可使用化学合成、体外转录等公知的方法来制备。

(载体)

本发明还提供整合有可表达本发明的反义寡核苷酸的载体。整合有编码反义寡核苷酸的寡核苷酸的载体没有特别限定，优选为可应用于基因治疗的载体。可列举例如：腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、和逆转录病毒载体等病毒载体；以及，质粒载体等。病毒载体优选为按照自我复制能力缺损的方式改造后的病毒载体。

作为上述载体，优选整合有使上述反义寡核苷酸在被检体细胞中特异性表达的表达调控序列。在此，表达调控序列可列举例如启动子或增强子等。表达载体的构建可以使用公知的基因工程学方法进行。

作为上述载体，优选整合有使上述反义寡核苷酸在给药对象的被检体的靶器官中特异性表达的表达调控序列。在此，表达调控序列可列举例如启动子或增强子。

(宿主细胞)

本发明还提供导入有包含本发明的反义寡核苷酸的载体的宿主细胞。例如，经分离的宿主细胞可以是适合于制作重组细胞的细胞(或细胞株)。在一些例子中，宿主细胞是HEK-293细胞和BHK细胞等哺乳动物细胞。

〔2.抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的方法〕

即，作为本发明的一方式，本发明的反义寡核苷酸和后述的包含本发明的反义寡核苷酸的组合物作为用于抑制c.648G>T变异型G6PC基因的异常剪接的、离体或体内的方法或分子生物学的研究手段来使用当然也是有效的。

因此，本发明还提供一种抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的方法。一实施方式的方法为包含下述步骤的方法，所述步骤为：在离体或体内的细胞中添加上述的反义寡核苷酸，来抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接。本方法可以是进一步包含下述工序的方法，所述工序为：进行前mRNA的剪接的工序、和进行通过前 mRNA的该剪接而产生的mRNA的翻译的工序。需要说明的是，反义寡核苷酸对离体或体内的细胞的添加量和添加后的细胞培养期等可根据细胞的种类或目的等适宜设定。

另外，关于异常剪接是否得到抑制这一点，可以通过调查该剪接区域周边的G6PCmRNA的碱基序列来进行。作为调查序列的方法，可以使用直接测序法等公知的序列确定方法。或者，还可以使用例如嵌套式PCR等公知的多聚核苷酸扩增方法并利用所扩增出的序列长度来判断。

关于异常剪接得到抑制、和恢复具有正常的碱基长度的G6PC mRNA的表达这一点，例如可以如下确认：向被检体的细胞(例如淋巴母细胞)中导入本发明的反义寡核苷酸，以该细胞为试样使用定量RT-PCR等公知的mRNA测定方法来确认。另外，关于正常型 G6Pase蛋白的生成得到恢复这一点，可以以被检体的细胞为试样使用蛋白印迹、ELISA等公知的蛋白质测定方法来确认。需要说明的是，预测通过正常的剪接生成的具有正常的碱基长度的G6PC mRNA的表达量越高则正常型G6Pase蛋白的表达量也越高。

〔3.糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物〕

本发明的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物是如下组合物：包含反义寡核苷酸作为药效成分，上述反义寡核苷酸与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的包含第42911000位的碱基、第42911004位的碱基和第42911005位的碱基中的至少1个碱基区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

本发明的一实施方式的预防或治疗用组合物中所含的反义寡核苷酸如〔1.反义寡核苷酸〕的项目中所述。需要说明的是，在单一的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物中，可以包含多种反义寡核苷酸。另外，本发明的组合物中所含的反义寡核苷酸例如可以以该寡核苷酸本身的状态被包含，也可以是给药于被检体的形态，还可以是作为整合于合适的启动子序列的下游的反义RNA表达载体被摄入被检体的生物体内的形态。

本实施方式的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物抑制c.648G>T变异型G6PC的前 mRNA的异常剪接，因此通过将其给药于被检体，可以预防或治疗糖原贮积病Ia型。由此，使用本实施方式的组合物对例如罹患糖原贮积病Ia型的患者的治疗有用。另外，本发明的组合物可以用于对糖原贮积病Ia型的发病危险性(风险)高的被检体进行治疗性或预防性的处置。

一实施方式的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物包含以上述G6PC的c.648G>T共通变异为靶的反义寡核苷酸，因此可期待实现对具有共通变异的糖原贮积病Ia型患者、即上述包括日本在内的东亚各国的大多数患者的特异性药物疗法。

(溶剂)

作为一实施方式的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物的溶剂的例子，可列举水、缓冲液等，作为缓冲液，具体可列举生理盐水、磷酸缓冲液、林格氏液等。另外，组合物中使用的溶剂可以是上述溶剂中的2种以上的混合物。

(其它成分)

一实施方式的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物可以还包含上述反义寡核苷酸以外的其它成分。该其它成分没有特别限定，可列举例如药学上允许的载体、润滑剂、保存剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂、着色剂、香味剂、甜味剂、抗氧化剂和粘度调整剂等。另外，根据需要也可以加入公知的药剂作为本发明的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物的构成之一，从而构成复合剂。组合物中所含有的这些成分优选具备下述性质：不抑制反义寡核苷酸的功能，并且对成为给药对象的被检体没有实质的不良影响。

作为上述其它成分，可以广泛使用该领域中公知的物质，具体可列举例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、酒精、植物油、聚乙二醇、明胶、***胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、滑石、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮，但不受这些的特别限定。载体的种类可根据组合物的剂型和给药方法等适宜选择。

(剂型)

上述糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物的剂型也没有特别限定，可制成液体、固体或者半固体或半液体。进一步地，也可以制成冻干制剂。可列举例如片剂、丸剂、散剂、液剂、悬浮剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂和注射剂等，优选为注射剂或片剂等经口给药用的剂型。

(给药途径)

作为上述糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物的给药途径，可列举经口、局部、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、经皮等，但不限于这些。

(给药方法)

上述糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物的给药方法没有特别限定，可以通过经口给药、血管内给药、肠内给药之类的方法进行全身给药，也可以通过经皮给药、舌下给药之类的方法进行局部给药。对被检体的给药可以基于公知的方法来进行，具体而言，可列举：向皮下、静脉内、肌肉内、腹腔内、皮内等的直接注射；向鼻腔内、口腔内、肺内、***内、直肠内等的粘膜的喷雾；经口给药；向静脉内或动脉内的血管内给药等。1个优选的给药方法为基于向皮下、静脉内或动脉内的直接注射的全身给药。从易于给药的观点出发，另一优选的给药方法为经口给药。

(给药量和给药期)

上述糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物的给药量(治疗有效量)可根据成为给药对象的被检体的年龄、体重、性别、所给药的剂型、作为目标的糖原贮积病Ia型预防或治疗效果的程度等适宜选择。另外，关于糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物的给药期，也可以适宜选择，使得可得到作为目标的糖原贮积病Ia型预防或治疗效果。

另外，例如可以在不损害糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物的糖原贮积病Ia型预防或治疗效果的限度内，与其它具有糖原贮积病Ia型预防或治疗效果的药品或具有其它效果的药品组合给药。

(给药的对象)

作为成为本发明的组合物的给药对象的被检体，可列举所有动物，优选脊椎动物，更优选为哺乳类。进一步地，作为哺乳类的被检体，除了列举人以外，还可列举家畜类(鸡、猪、马、山羊、绵羊、牛等)、宠物(猫、狗、仓鼠、兔、天竺鼠等)和实验动物(小鼠、大鼠等啮齿类、猴等)，特别优选为人。进一步地，在被检体为人的情况下，尤其优选为东亚(日本、中国、韩国、台湾等)人种。

例示性的被检体为具有糖原贮积病Ia型的患者、或具有糖原贮积病Ia型的发病风险。另外，另一实施方式中，被检体以纯合方式或复合杂合方式具有G6PC的c.648G>T的变异，优选以纯合方式具有。

进一步地，被检体可以是任意年龄。需要说明的是，糖原贮积病Ia型是可能从婴儿期起发病的疾病，因此期望包括0岁的被检体在内，期望尽量早开始给药。通过从更低的年龄起给药，可以在早期防止生长障碍和肾损伤等。另外，通过疾病的早期预防和早期开始治疗，可以防止发生严重障碍等。

一实施方式的被检体呈现出在包括肝脏、肾脏和小肠在内的1种以上组织中的糖原蓄积在增加、或者上述的糖原贮积病Ia型的至少1个临床症状。

本发明的组合物易于给药且安全性高，因此可以长期给药、或用于对婴幼儿给药。因此，可适宜地用于糖原贮积病Ia型预防或治疗。

〔4.糖原贮积病Ia型(GSD-Ia)的治疗方法〕

本发明的糖原贮积病Ia型的治疗方法包含对被检体给药治疗有效量的上述的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物的工序。一实施方式中，对于成为给药对象的被检体，可以仅将该组合物单独给药或将其作为符合给药目的的药学组合物的一构成成分来给药。

(给药量和给药期)

上述糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物的给药量(治疗有效量)可以根据成为给药对象的被检体的年龄、性别、体重、症状、给药途径、给药次数、和给药期等适宜设定。给药方法、给药量、给药期等如〔3.糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物〕中所记载。

关于上述糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物的给药次数，只要在得到治疗效果的限度内则没有特别限定，例如可以根据被检体的疾病症状的重症度、上述给药量、给药途径、症状、被检体的年龄、性别、体重等适宜设定。

需要说明的是，包含对于临床上健康的被检体，在糖原贮积病Ia型的发病前给药该糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物的工序的、预防给药的方式也包含在本发明的治疗方法的范畴内。即，形成对被检体的生物体给药有效量以上的该组合物的状态、从而预先预防糖原贮积病Ia型的方式。

(组合疗法)

在本发明的糖原贮积病Ia型的治疗方法中，可以进行组合疗法，所述组合疗法组合有本发明的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物以外的用于糖原贮积病Ia型的治疗的药剂 (例如针对酸中毒的柠檬酸制剂、针对高尿酸血症的尿酸合成抑制剂等)的给药、和淀粉质的频繁进食法等以往的疗法中的1种以上。本发明的糖原贮积病Ia型的治疗方法是利用了与以往的糖原贮积病Ia型的治疗不同的机制的新的治疗方法，因此，如果采用本组合疗法，则可以期待组合剂的治疗效果和协同治疗效果。

关于使用上述治疗方法治疗时的被检者的治疗效果，也可以适宜使用〔2.抑制c.648G>T 变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的方法〕中记载的调查有无抑制异常剪接的方法、调查具有正常的碱基长度的G6PC mRNA的表达的方法、调查正常型G6Pase蛋白的表达的方法来调查。生物体的G6Pase蛋白的量可与该生物体所具有的糖原贮积病Ia型的重症度成比例。因此，可以在治疗的各阶段中进行有无治疗效果的检查。

〔5.本发明的具体方式的例示〕

本发明包含以下的任一方式。

＜2＞根据＜1＞所述的反义寡核苷酸，其中，上述反义寡核苷酸与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的第42910951位～第42911054位的碱基区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的反义寡核苷酸，其由7～104个碱基构成。

＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，上述反义寡核苷酸从以下的(a)和(b)中选择。

(a)包含序列号14、序列号17、序列号20或序列号23所示的碱基序列的反义寡核苷酸

(b)包含相对于序列号14、序列号17、序列号20或序列号23所示的碱基序列具有60％以上的序列一致性的碱基序列、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性的反义寡核苷酸。

＜5＞根据＜1＞～＜4＞中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，上述反义寡核苷酸是由 14～30个碱基构成的吗啉代反义寡核苷酸或由7～25个碱基构成的锁定核酸(LNA)反义寡核苷酸。

＜6＞一种糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物，其包含反义寡核苷酸作为药效成分，上述反义寡核苷酸与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的包含第42911000位的碱基、第42911004位的碱基和第42911005位的碱基中的至少1个碱基区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

＜7＞根据＜6＞所述的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物，其中，上述反义寡核苷酸与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的第42910951位～第42911054位的碱基区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

＜8＞根据＜6＞或＜7＞所述的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物，其中，上述反义寡核苷酸由7～104个碱基构成。

＜9＞根据＜6＞～＜8＞中任一项所述的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物，其中，上述反义寡核苷酸为从以下的(a)和(b)中选择的反义寡核苷酸。

＜10＞根据＜6＞～＜9＞中任一项所述的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物，其中，上述反义寡核苷酸为又14～30个碱基构成的吗啉代反义寡核苷酸或由7～25个碱基构成的锁定核酸(LNA)反义寡核苷酸。

如上所述，本发明不限于上述各实施方式，可在权利要求所示的范围内进行各种变更，将分别公开于不同的实施方式的技术手段适宜组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。

实施例

以下对本发明的实施例进行说明。

〔实施例1〕

首先参照附图对c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接部位进行说明。图1 是示出由于c.648G>T的变异而产生的、G6PC的前mRNA的异常剪接区域的图。

G6PC变异体c.648G>T产生缺失了位于外显子5的5’侧的91bp的核苷酸(序列号5)的mRNA。其可能是由于，变异序列“ccttcttcctTttcAG”的所延伸出的聚嘧啶区域具有超过正常序列“ccttcttcctGttcAG”和野生型的剪接受***点“ctttcttccactcAG”的序列的增大的剪接效果。反义寡核苷酸按照阻断外显子5的变异型序列的异位剪接受***点的方式来设计。

＝材料和方法＝

(反义寡核苷酸)

设计了以c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的异位剪接受***点为靶的25mer的吗啉代反义寡核苷酸(mASO)。由Gene Tools,LLC(Philomath,OR)合成了mASO、和长度相同的对照的吗啉代寡核苷酸(mCO)(5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3' (序列号9))，所述mASO被设计为成为c.648G被置换为c.648T的G6PC序列中的、c.630T 至c.654C的序列(5'-TCTCATTACCTTCTTCCTTTTCAGC-3'(序列号7))的互补序列 (5'-GCTGAAAAGGAAGAAGGTAATGAGA-3'(序列号14))。在吗啉代寡核苷酸向细胞的整合中使用Endo-Porter(Gene Tools)。

(患者和细胞株)

从具有临床症状和GSD-Ia的生物学上的异常表型的、日本的婴儿期的患者的血液中分离出白细胞。通过基因组DNA的双向测序查明为c.648G>T的纯合体。

利用Epstein-Barr病毒(EBV)进行转化后，将淋巴母细胞在包含10％胎牛血清(HyClone, Logan,Utah,USA)、100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素的RMPI 1640培养基在37℃、 5％CO₂下维持。准备健康成人来源的另外的细胞作为健康对照。

(反义寡核苷酸的曝露)

将10⁵的细胞再悬浮于包含mASO或mCO中的任一者1.0μmol/L和Endo-Porter 0.8μL 的新鲜的培养基200μL中。在37℃下孵育48小时后，用磷酸缓冲生理盐水洗涤细胞并回收。

(RNA制备、RT-PCR和嵌套式PCR)

用RNeasy kit(Qiagen,Valencia,CA)提取总RNA，通过使用first-strandsynthesis system for RT-PCR(SuperScript；Invitrogen,Carlsbad,CA)的逆转录反应合成cDNA。

然后进行嵌套式PCR，调查mRNA剪接的mASO效果。将嵌套式PCR中使用的引物示于表1。在first PCR中，使用引物组G6PC-F1/G6PC-R来扩增包含c.648G>T的片段。在 secondPCR中，使用另一引物组G6PC-F2/G6PC-R。正常剪接来源的PCR产物的预期尺寸为305bp，异常剪接来源的PCR产物的预期尺寸为214bp。通过琼脂糖凝胶电泳进行分离后，从琼脂糖凝胶中提取PCR产物，使用BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA)和ABI PRISM 310 genetic analyzer(AppliedBiosystems)进行直接测定序列。

[表1]

表1.针对G6PC cDNA的外显子4-外显子5的交界区域的嵌套PCR的引物

*关于引物G6PC-F2和G6PC-R，参照以前的报告[专利文献5]。

＝结果＝

(嵌套式PCR产物的琼脂糖凝胶电泳)

图2是示出健康对照被检者来源(泳道1～3)和GSD-Ia的患者来源(泳道4～6)的嵌套式PCR产物的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。

泳道1～3中观察到约300bp的长度的单一条带，泳道5和6中观察到约200bp的长度的单一条带，两种条带在泳道4中均可观察到。在泳道4的★记号处可见相对长的嵌套式PCR产物的条带。这表明吗啉代反义寡核苷酸使G6PC c.648G>T的异常剪接恢复。

接着，由凝胶中提取图2所示的嵌套式PCR产物，进行直接测序。图3是示出嵌套式PCR产物的直接测序结果的图。图3的(a)示出泳道1～3的单一条带(305bp)的序列。在外显子4的3’末端(c.561_562AG)连接有正常的外显子5(c.563G_753C)。图3的(b) 示出泳道5和6的单一条带(214bp)和泳道4中的相对短的条带(214bp)的序列。在外显子4的3’末端(c.561_562AG)连接有c.654C_753C。这表明缺失了91bp(c.563G_653G)。图3的(c)示出泳道4的相对长的条带(305bp)的序列。虽然被相对短的条带的片段污染，但在外显子4的3’末端(c.561_562AG)连接有c.563G_753C，c.648G被置换为c.648T。

在健康对照样品中，在用mASO或mCO处理的样品间、或在有无处理之间观察不到差异，所有样品均出现约300bp的单一条带。同样地，在有利用mCO的处理或无处理的患者样品中，出现约200bp的单一条带。与此相比，用mASO处理的患者样品中，出现了约 200bp和约300p的2个条带。这暗示了患者样品的正常剪接得到部分恢复(图3)。

健康对照样品中，外显子4和外显子5的结合区域的序列在mASO或mCO中的任一者的处理中均为正常。而患者样品中，有利用mCO的处理或无处理的样品的约200bp的条带中观察到91bp缺失。用mASO处理后的样品的约300bp的条带中包含两种DNA片段。 1种片段表示包含碱基置换c.648T的正常长度的cDNA序列，另1种片段表示包含91bp 的缺失的异常长度的序列。可认为，这是在琼脂糖凝胶电泳工序中，位于上述正常长度的 cDNA片段的下游的异常长度的片段引起的污染。

＝讨论＝

反义寡核苷酸广泛显示出使包括先天性代谢异常在内的各种遗传疾病的剪接变异恢复的作用[参考文献1]。各种ASO分子中，吗啉代ASO可有效地给药到体内、输送。各种ASO分子中，吗啉代ASO可以通过与树状分子运载蛋白结合而有效地给药到体内、输送。对在球蛋白基因的内含子中具有剪接变异的转基因小鼠的、树状分子运载蛋白与吗啉代 ASO的复合体的静脉给药在骨骼肌、肝脏、肾脏和小肠中显示出几乎完全正常的mRNA的恢复。另一方面，在脾脏、心脏、肺和脑中则效果不明显[参考文献3]。由于G6PC仅在肝脏、肾脏和小肠中表达G6Pase，因此基于G6PC c.648G>T变异的GSD-Ia可成为用于基于 ASO的治疗的合适靶点。

一般而言，遗传疾病的变异体大多是散发性的，因此将此种药剂导入到实际使用通常是困难的，也存在不是药物开发的合适靶点的情况，但G6PC c.648G>T变异体的情况下，作为ASO疗法的靶点是合适的。

该变异所引起的异常剪接最初在罹患患者的肝脏组织中被报道[参考文献4]，然后报道了在利用EBV的转化淋巴母细胞中也成功地观察到[参考文献5]。发现这些之后，获知该变异体等位基因频率在东亚人群中非常高(表2)。日本中，罹患人群的80～85％为G6PCc.648G>T的纯合体，其余主要为c.648G>T的杂合体和散发性的变异[参考文献5、6]。

[表2]

表2.关于东亚人群中的G6PC c.648G＞T变异频度的截至目前为止的报告

*我们认为，这两个研究中，部分患者有重复。

由此，可认为日本人中的GSD-Ia患者的约95％在至少1个等位基因中具有该变异。根据台湾[参考文献7]、中国[参考文献8]和韩国[参考文献9]的关于该变异的检测的几个报告，具有c.648G>T中的至少1个等位基因的患者的比例在韩国人中为92.3％、在中国人中为88.6％。

这些见解暗示了：基于单一的ASO的治疗药对上述所列挙的国家的GSD-Ia患者的大部分是有效的。关于ASO是否改善了在罹患患者中所观察到的病理学变化这一点，例如可以通过建立具有c.648G>T变异型G6PC的GSD-Ia患者来源的人工多能性干细胞(inducedpluripotent stem(iPS)cells)细胞系、并且使这些细胞分化为显示出在细胞内蓄积糖原的肝细胞样细胞的方法等进行确认[参考文献10]。

如上所述，本发明得到了建立新的GSD-Ia型特异性药物的、非常有效的见解。

＝实施例1的参考文献的一览＝

[参考文献1]M.A.Havens,D.M.Duelli,M.L.Hastings,Targeting RNA splicingfor disease therapy,Wiley Interdiscip.Rev.RNA 4(3)(2013)247-266.

[参考文献2]J.Y.Chou,B.C.Mansfield,Mutations in the Glucose-6-Phosphatase-α(G6PC) gene that cause type Ia glycogen storage disease,Hum.Mutat.29(7)(2008)921-930.

[参考文献3]Y.F.Li,P.A.Morcos,Design and synthesis of dendriticmolecular transporter that achieves efficient体内delivery of morpholinoantisense oligo,Bioconjugate Chem.19(7) (2008)1464-1470.

[参考文献4]S.Kajihara,S.Matsuhashi,K.Yamamoto,K.Kido,K.Tsuji,A.Tanae,S. Fujiyama,T.Itoh,K.Tanigawa,M.Uchida,Y.Setoguchi,M.Motomura,T.Mizuta,T.Sakai, Exon redefinition by a point mutation within exon 5of the glucose-6-phosphatase gene is the major cause of glycogen storage disease type Ia inJapan,Am.J.Hum.Genet.57(3)(1995) 549-555.

[参考文献5]J.Akanuma,T.Nishigaki,K.Fujii,Y.Matsubara,K.Inui,K.Takahashi,S. Kure,Y.Suzuki,T.Ohura,S.Miyabayashi,E.Ogawa,K.Iinuma,S.Okada,K.Narisawa, Glycogen storage disease type 1a:molecular diagnosis of 51Japanese patients and characterization of splicing mutations by analysis ofectopically transcribed mRNA from lymphoblastoid cells,Am.J.Med.Genet.91(2)(2000)107-112.

[参考文献6]J.Kido,K.Nakamura,S.Matsumoto,H.Mitsubuchi,T.Ohura,Y.Shigematsu, T.Yorifuji,M.Kasahara,R.Horikawa,F.Endo,Current status ofhepatic glycogen storage disease in Japan:clinical manifestations,treatmentsand long-term outcomes.J.Hum.Genet.58 (5)(2013)285-292.

[参考文献7]S.C.Chiang,Y.M.Lee,M.H.Chang,T.R.Wang,T.M.Ko,W.L.Hwu,Glucose-6-phosphatase gene mutations in Taiwan Chinese patients with glycogenstorage disease type 1a,J.Hum.Genet.45(4)(2000)197-199.

[参考文献8]W.J.Qiu,X.F.Gu,J.Ye,L.S.Han,Y.F.Zhang,X.Q.Liu,Moleculargenetic analysis of glycogen storage disease type Ia in 26Chinese patients,J.Inherit.Metab.Dis.26(8) (2003)811-812.

[参考文献9]C.S.Ki,S.H.Han,H.J.Kim,S.G.Lee,E.J.Kim,J.W.Kim,Y.H.Choe,J.K. Seo,Y.J.Chang,J.Y.Park,Mutation spectrum of the glucose-6-phosphatasegene and its implication in molecular diagnosis of Korean patients withglycogen storage disease type Ia,Clin. Genet.65(6)(2004)487-489.

[参考文献10]S.T.Rashid,S.Corbineau,N.Hannan,S.J.Marciniak,E.Miranda,G. Alexander,I.Huang-Doran,J.Griffin,L.Ahrlund-Richter,J.Skepper,R.Semple,A.Weber,D.A. Lomas,L.Vallier,Modeling inherited metabolic disorders of theliver using human induced pluripotent stem cells,J.Clin.Invest.120(9)(2010)3127-3136.

〔实施例2〕

尝试了使用LNA反义寡核苷酸、即包含在给药于生物体时可期待效果的锁核苷酸(locked nucleic acid，LNA)的反义寡核苷酸来抑制异常剪接。

＝材料和方法＝

(LNA反义寡核苷酸)

在下述条件下设计了以c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的异位剪接受***点为靶点的15mer的LNA反义寡核苷酸(LNA ASO)。按照成为c.648G被置换为c.648T 的G6PC的序列中的、c.639C至c.665G的区域中所含的15mer的序列的互补序列的方式设计了7种LNA ASO。将7种LNA ASO分别设为LNA01、LNA03、LNA05、LNA07、 LNA09、LNA11和LNA13。合成通过委托合成(株式会社GENEDESIG，大阪府茨木市) 来进行。

(LNAASO的设计条件)

·设为15碱基长度，每隔1个碱基导入LNA(表3的网格线部位)。

·3’末端和5’末端的碱基为天然DNA。

·各碱基间形成硫代磷酸酯(PS)键。

·将设计区域每次推移2个碱基来进行设计。

[表3]

表3.实施例2中使用的15mer的LNA反义寡核苷酸

	5’-TCCGATGGCGAAGCTGAAAAGGAAGAAG-3’	(序列号16)
			LNA01	5’-CTGAAAAGGAAGAAG-3’	(序列号17)
LNA03	5’-AGCTGAAAAGGAAGA-3’	(序列号18)
			LNA05	5’-GAAGCTGAAAAGGAA-3’	(序列号19)
LNA07	5’-GCGAAGCTGAAAAGG-3’	(序列号20)
			LNA09	5’-TGGCGAAGCTGAAAA-3’	(序列号21)
LNA11	5’-GATGGCGAAGCTGAA-3’	(序列号22)
			LNA13	5’-CCGATGGCGAAGCTG-3’	(序列号23)

(细胞株)

从已鉴定为c.648G＞T变异后的糖原贮积病Ia型患者(纯合体)中，收集外周血淋巴细胞，使其感染EBV而建立永生化淋巴细胞的细胞系，通过与实施例1同样的方法进行维持。

(转染)

在按照最终浓度9mM的方式添加CaCl₂、按照最终浓度1μM的方式分别添加了LNA01～13而成的新鲜培养基200μL中再悬浮4.5×10⁴个细胞，接种于表面包被有聚-D- 赖氨酸的微孔板(96孔)(Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA)中。将不添加LNA的孔作为空白。在37℃下培养7天而达到铺满后，用磷酸缓冲生理盐水洗涤细胞并回收。

(RNA制备、RT-PCR和嵌套式PCR)

从回收的细胞中提取总RNA，合成cDNA。接着进行嵌套式PCR，由G6PC外显子4 与外显子5的结合区域扩增包含c.648G＞T的变异部位和异位剪接受***点(c.652_653AG) 的区域的序列，从而调查mRNA剪接的LNAASO效果。嵌套式PCR使用与实施例1中所用的引物组相同的引物组来进行。

与实施例1同样地，正常剪接来源的PCR产物的预期尺寸为305bp(正常长度)，异常剪接来源的PCR产物的预期尺寸为214bp(缺失长度)。通过琼脂糖凝胶电泳进行分离后，将凝胶上的缺失长度的条带和正常长度的条带一起从琼脂糖凝胶中进行DNA提取，进行直接测序。

需要说明的是，实施例2的RNA提取、cDNA的合成方法、琼脂糖凝胶电泳和直接测序使用与实施例1相同的方法。

＝结果＝

(嵌套式PCR产物的琼脂糖凝胶电泳)

在各种LNA ASO添加样品中观察到两者的条带。这表明LNA ASO使G6PC c.648G>T的异常剪接得到恢复，可预期：正常长度的条带越深则LNA ASO从异常剪接中恢复的效果越高。

图5是示出嵌套式PCR产物的直接测序结果的图。图5的(a)示出不添加LNA ASO(LNA00)样品的嵌套式PCR产物的序列。图5的(b)示出各种LNA ASO添加样品的嵌套式PCR产物的c.648G>T附近的波形。

＝考察＝

据报道，LNA ASO与此外的各种结构的寡核苷酸相比作用强、不依赖于导入药剂或物理刺激而是自然地被摄入("gymnosis"或"free-uptake")细胞中而发挥反义效果[参考文献 12,13]，实施例2中用该方法进行了研究。

在EBV永生化淋巴细胞的细胞系中，虽有一定量的c.648G>T变异型G6PC的异常剪接所引发的表达，但是也自发地产生了基于正常剪接的正常型的表达产物。

LNA01～LNA13中，特别是LNA01、LNA07和LNA13由于在上述的琼脂糖凝胶电泳中得到的、正常长度的条带的浓淡相对于缺失长度的条带的浓淡与从凝胶提取的缺失条带来源的波高和正常长度的条带来源波高的相对关系之间显示出相关性，因此认为特别有望作为LNA ASO的候补。

＝实施例2的参考文献的一览＝

[参考文献11]Shimo T,Tachibana K,Saito K,Yoshida T,Tomita E,Waki R,Yamamoto T, Doi T,Inoue T,Kawakami J,Obika S,Design and evaluation of lockednucleic acid-based splice-switching oligonucleotides离体,Nucleic Acids Res.42(12)(2014)8174-8187.

[参考文献12]Soifer HS,Koch T,Lai J,Hansen B,Hoeg A,Oerum H,Stein CA,Silencing of gene expression by gymnotic delivery of antisenseoligonucleotides,Methods Mol.Biol.815 (2012)333-346.

[参考文献13]Hori S,Yamamoto T,Waki R,Wada S,Wada F,Noda M,Obika S,Ca2+ enrichment in culture medium potentiates effect of oligonucleotides,NucleicAcids Res.43(19) (2015)e128.

产业上的可利用能性

本发明例如可以用于糖原贮积病Ia型的预防或治疗。

序列表

<110> 国立研究开发法人国立成育医疗研究中心（NATIONAL CENTER FOR CHILDHEALTH AND DEVELOPMENT）

国立大学法人广岛大学（HIROSHIMA UNIVERSITY）

<120> 反义寡核苷酸和糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物

<130> FSP1V191680ZX

<150> JP2017-046766

<151> 2017-03-10

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19572

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

ctgcaattac aggtgccagc cacctcactg ggctattttt tttttttttt ttgaaatagg 60

gtctctttct gtcacccagg ctggagtgta atggtgtgat ctcggctcgc tgcaacttcc 120

acctcctggg ttcgagggat tctcttgcct cagcctcctg agtagctggg attacaggcg 180

cccaccacta cacctggcta atttttgtat ttttagtaga gatggggttt caccatgttg 240

gtcaggctgg tcttgaactc ttgaccttgg gtgatccacc cacctcagcc tcccaaaatg 300

cttggattac aggcgtgagc cactgcacct ggccaatttt tgtatttttt gtagagatgg 360

ggtttcacca tgttggctag gctggtctca aactcctaag ctcaagtgat ccaccaacct 420

cagcctctca aagtgctggg tttacaggtg tgagccatcg caccaggccg tgactatttt 480

aaataaaaaa cccttgagag gttttttcac ccttgggagc ctggaagaga ttttttcccc 540

tatctttcac ctataaagat aggactggcc gggcatggtg gctcatgctt gtaatctcag 600

cactttggga ggccgaggcg ggtggatcac ctgaggtcag gagttcgaga ccagcctggc 660

ccaacatggc aaaaccccat ctctactaaa aatacaaaaa ttaatcgggc ctggtggcac 720

atgcctgtaa tcccagctac ttggggggct gaggcacagg aatcggtgga tctcaggagg 780

cagaggttgc agtgagccaa gatcatcgca ttgcactcca gcctgggcaa caagagtgat 840

actccgtctc aaaaaaaaaa aaaaaaaagg actgacacaa aagaacaatt gttcttctcc 900

ttcctttatc ccattatcca tcacagaaaa gaagaccaaa aatgtaacca taaaaaagtc 960

tcaacagacc ctttttcaag acaatgactg tctctgagga ccatttaaaa tccagggaga 1020

actatttaca agttaatttc tgttcctcga tccaatcatt ctccctctgc ccttcgacag 1080

aattcctctt ctcctccttc ccataacctg tttttaacag gatccaagcc acccattctt 1140

tctgcaacct caagatggtg gatgagcttc catacctcac tgggaagttg gatcttcatt 1200

cttaagcctc ccatgtatac atgttaaata catttgtaat ctttttctca tattaattaa 1260

tctgccttat gtcagtgact tttcagcgaa cttgtaggta gtcactcaca taaggatcct 1320

ccagtttaca tagttttgta aatgtcaggt caccctgtcc cactagacca ccaaggtcct 1380

ggaggacacc tgggatttaa cttttttttt tttttttttt tttgagacag tctcgctctg 1440

tcactgaggc tggagtgcag tgtcaggatc tccactcact gcaacctcca cctcccgggt 1500

ttaagtgatt ctcctgcttc agcctcccga gtagctgaga ctacaggtgc ccctcatcat 1560

acccggctaa tttttatatt tttagtagag atggggtttt gctatattgg ccaggctggt 1620

cttaaactcc tgacctcagg tgatccaccc tcctcagcct cccaaagtgc tgggattaca 1680

ggcgtgagcc accatgccca gcctggcttt taacttttaa ttcctcagag agccaggcat 1740

ggtgctttgc tcaggaaatg ttggttgaat taaaccggag cacttcttga aaagggaaaa 1800

taacaaagag ttagaaggag atggcgggaa cccctctctg gagatagttc tttaaattag 1860

tggattctgc agggcactgt tgctcatacc tgtaatccca gcattttggg aggccaaggc 1920

aggaggacca cctgatgccg ggagtttgag accagtctgg gcaatgtaga gagaccccca 1980

tctccacaaa aaataaaaag ttagctgggt ttggtggtgt gcgcctgtag gcccagctac 2040

ccagagactg atgcaaaacg atcccttaag cccaggagac tgaggctgca gtgagctgtg 2100

atggtgccac cgcactccag cctgggtaac agagtgagac cccgtctcaa ataaacagat 2160

aaatgagtgg attctcagca aaacttctag ccactcgcct catatatcca caagaccttt 2220

gagaatccac ggtgtctcga tgcagtcagc tttctaacaa gctggggcct cacctgtttt 2280

cccacggata aaaacgtgct ggaggaagca gaaaggggct ggcaggtgga aagatgagga 2340

ccagctcatc gtctcatgac tatgaggttg ctctgatcca gagggtcccc ctgcctggtg 2400

gcccaccgcc aggaagactc ccactgtccc tggatgccca gagtgggatg tcaactccat 2460

cacttatcaa ctccttatcc ataggggtat tcttcctgag gcgtctcaga aaacagggcc 2520

ctccccatat gctgaccaca taatagaacc cctcccaact cagagaccct ggctgctagc 2580

tgccctggca tgacccagac agtggccttt gtatatgttt ttagactcac cttgactcac 2640

ctctgaccat agaaactctc atcccagagg tcactgcaat agttactcca caacagaggc 2700

ttatctgggt agagggaggc tccctaccta tggcccagca gccctgacag tgcagatcac 2760

atatacccca cgccccagca ctgcctgcca cgcatgggct tactttacac ccacccacag 2820

tcaccaacac attacctgct ctccaaggtt aggcgtggca ggagaagttt gcttggacca 2880

gcagaaacca tgcagtcaag gacaactgga gtcagcatgg gctgggtgcg agcccttggt 2940

ggggtgggga ggagactcca ggtcatacct cctggaggat gttttaatca tttccagcat 3000

ggaatgctgt caacttttgc cacagattca ttagctctga gtttcttttt tctgtcccca 3060

gctacccctt acatgtcaat atggacttaa tgatgggaaa ttcaggcaag tttttaaaca 3120

ttttattccc cctggctctt atcctcaaaa aatgcatgaa tttggaggca gtggctcatg 3180

cctgtaatcc caatgctttg ctaggttgag gcgggaggat cacttgaagc caggaatttg 3240

agaccagcct gggccgcata gtgagacccc gtttctacaa aaataaataa ataaataata 3300

aataatagtg atatgaagca tgattaaata gccctatttt ttaaaatgca tgagttcgtt 3360

acctgattca ttccctggtt cctttcacag tcctccgtga cccaagtgtt agggttttgg 3420

tctctctact atttgtaggc tgatatatag tatacacaca cacacacaca cacatataca 3480

cacacacagt gtatcttgag ctttcttttg tatatctaca cacatatgta taagaaagct 3540

caagatatag aagccctttt tcaaaaataa ctgaaagttt caaactcttt aagtctccag 3600

ttaccatttt gctggtattc ttatttggaa ccatacattc atcatattgt tgcacagtaa 3660

gactatacat tcattatttt gcttaaacgt atgagttaaa acacttggcc aggcatggtg 3720

gttcacacct gtaatcccag agctttggga agccaagact ggcagatctc ttgagctcag 3780

gaattcaaga ccagcctggg caacatggaa aaaccccatc tctacaaaag atagaaaaat 3840

tagccaggca tggtggcgtg tgcctgtggt cccagctact caggaggctg aggtgggagg 3900

atcacattag cccaggaggt tgaggctgca gtgagccgtg attatgccac tgcactccag 3960

cctgggagac agagtgagac cctgtttcaa aaaaaagaga gagaaaattt aaaaaagaaa 4020

acaacaccaa gggctgtaac tttaaggtca ttaaatgaat taatcactgc attcaaaaac 4080

gattactttc tggccctaag agacatgagg ccaataccag gaagggggtt gatctcccaa 4140

accagaggca gaccctagac tctaatacag ttaaggaaag accagcaaga tgatagtccc 4200

caatacaata gaagttacta tattttattt gttgtttttc ttttgttttg ttttgttttg 4260

ttttgttttg ttttagagac tggggtcttg ctcgattgcc caggctgtag tgcagcggtg 4320

ggacaatagc tcactgcaga ctccaactcc tgggctcaag caatcctcct gcctcagcct 4380

cctgaatagc tgggactaca agggtacacc atcacacaca ccaaaacaat tttttaaatt 4440

tttgtgtaga aacgagggtc ttgctttgtt gcccaggctg gtctccaact cctggcttca 4500

agggatcctc ccacctcagc ctcccaaatt gctgggatta caggtgtgag ccaccacaac 4560

cagccagaac tttactaatt ttaaaattaa gaacttaaaa cttgaatagc tagagcacca 4620

agatttttct ttgtccccaa ataagtgcag ttgcaggcat agaaaatctg acatctttgc 4680

aagaatcatc gtggatgtag actctgtcct gtgtctctgg cctggtttcg gggaccagga 4740

gggcagaccc ttgcactgcc aagaagcatg ccaaagttaa tcattggccc tgctgagtac 4800

atggccgatc aggctgtttt tgtgtgcctg tttttctatt ttacgtaaat caccctgaac 4860

atgtttgcat caacctactg gtgatgcacc tttgatcaat acattttaga caaacgtggt 4920

ttttgagtcc aaagatcagg gctgggttga cctgaatact ggatacaggg catataaaac 4980

aggggcaagg cacagactca tagcagagca atcaccacca agcctggaat aactgcaagg 5040

gctctgctga catcttcctg aggtgccaag gaaatgagga tggaggaagg aatgaatgtt 5100

ctccatgact ttgggatcca gtcaacacat tacctccagg tgaattacca agactcccag 5160

gactggttca tcttggtgtc cgtgatcgca gacctcagga atgccttcta cgtcctcttc 5220

cccatctggt tccatcttca ggaagctgtg ggcattaaac tcctttgggt agctgtgatt 5280

ggagactggc tcaacctcgt ctttaagtgg taagaaccat atagagagga gatcagcaag 5340

aaaagaggct ggcattcgct ctcgcaatgt ctgtccatca gaagttgctt tccccaggct 5400

attcaggaag ccacgggcta ctcatgcttc caacccctct ctctgacttt ggatcatcta 5460

cataaagggg gaagacagaa aaaatcctac cagtgagttg aaaatacagg aaagcctatt 5520

tcatatgggt taaagggtag gacagttgaa tttcgtgaaa agtctgagtt atataggctt 5580

tgagcaaaga gttttattag tatgaagcag aagaggtaac ataaagaaag atgtatgggg 5640

ccaggcatgg tggctcacac ctgtaatccc agcactttgg gaggccgagg tgggcgaatc 5700

actcctgggt gaactcagga gttcaagacc agcctgggca acatggcgaa actccatctc 5760

tacaaaaaca ttacgaaaat tagctgggcg tgttggtgct gtagtcccag ctactcagga 5820

ggctgaggtg agaggcggag gaggttgcag tgagtcaaga tcatgccact gcactccagc 5880

ctgggcaaca gagtaagacc ctgtctcaaa aaaaaaaaaa agatagatga tgtatgctgt 5940

atgaaaaaag gaaacacaca gatgattcaa cagcctgttt tgtggggtaa tgaaaagtca 6000

ccctgggaac tgggctccag ccctcgttct gccacccacc aactacatgt ccttggcaag 6060

tcatatcaat tatctgagtt tctgttttat aatctacaaa taggttatct ctggcagctt 6120

aataataatc agggttaaca tttattaaac agtgtgtgcc agtccatgtg ctatgtgctt 6180

ttctgtgagg tagttactgc tatttacaga aacagtagat gcagagacca aggtgctgag 6240

ttaaatgatt aggccaacaa ggttagtaca tgccgagcca ggatggaagc ccaggtaggc 6300

aggctggctt ccgcggcaat gctcttatga actatgttac gtccagtgct gataaactga 6360

ctctctgggg agcaggggaa agccctgagt ttagcatttg ccaatttcta tcacgtaaac 6420

attcccattc tggccacttt ctttctttct ttcttttgtt tgtttgtttg agatggagtc 6480

tcgcactgtt gcctggctgg agtgcaatgg tgcaatctca gctcactgca acctctgcct 6540

ctccggttca agtgattctc ctgcctcagc ctcccaagta gctgggatta caggtgcccg 6600

ccaccatgcc cagctaattt tttttgtatt tttagtagag acatggtttc actatgttga 6660

ctaggctggt ctcgaactcc tgacctcatg atctgcctgc cttggcctcc ctaagtgcta 6720

ggattacagg cgtgagccac tacacccagc cgcatgattc taaaaaataa aaagatgaag 6780

tgttattcca aacatctgat ctccattgaa gaaccatgca atctctctgg gttgatagag 6840

gccagagtta gtggctctcc ctgatttcgg tgagaaatca ctattccacc atcacgggat 6900

aaaaggcatc ctgactggcg gttgacacct atttccacag tgaaagatat atctagtact 6960

tttaaagggg aagtggtttg tctgagatac tctgtttcaa agtagagagg atacagaaca 7020

agcatctgaa gctatataca tccttacaga gagcaattct gatggaaatg caggccatgt 7080

ttccctgggg ggggctcgtc ctaggggctg gagtgcattc tctgatgtca gaggaaatgc 7140

aagattccct gaggcctgag ggaacccatg gtatatgcaa gtccaagttt caaactgtag 7200

ttccatatgc attcttccag gacaaatact tcttgaggtt aaaaaaaaaa agtcacatag 7260

ctgccatttt atggatttca ggattttttt tttttttttt ttgagatgga gtcttgctct 7320

gtcacccagc ctgtagtgca gtggcataat ctcggctcac ggcaacctcc gcctcccagg 7380

ttcaagcgat tctcttgcct tagcctcccg agtagctggg attacagtca cgcaccacca 7440

catctggcta attctttata ttttttggta gaaacggtgt ttcaccatgt tggccaggct 7500

ggtctcaaac tcctgacctc atgtgatctg cctgccttgg cctcccaaag tgctgagatt 7560

acaggtgtga gccaccgcgc ctgcctggag ttcagaatct tgggcttcat tatttgtgtt 7620

taaatagatc atacagtcag gcacggtggc tcatgcctgt aatcccagca ctttgggagg 7680

ctgaggtggg aggattgcct gagttcagga gatggagacc agcctgggca acatggtgaa 7740

accccgtctc tactaaaaat acaaaaacta gctggatgtg gtggcacaca cctgtagtcc 7800

cagctattca ggaggctgag gtgggaggat cccaggaggt agaggtcaca atgagccgag 7860

attgcgccac tgcactccag gctgggttac tgagccagat cctgtctcaa aaaaaaaaaa 7920

gataatacat tcaaacagtt caaaatgcaa aagttacata cataaggaag tgtcatgaaa 7980

tatctccctc tcacacttct ccccagccac ccagttctcc cttctagagg caacatgtga 8040

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gtgggttttg gatactgact actacagcaa cacttccgtg cccctgataa agcagttccc 8220

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acctcgttta cctgttatgg atgaaactga ccttgagggg acatgaggag agccattcct 8340

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<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

tgcaagggct ctgctgacat cttcctgagg tgccaaggaa atgaggatgg aggaaggaat 60

gaatgttctc catgactttg ggatccagtc aacacattac ctccaggtga attaccaaga 120

ctcccaggac tggttcatct tggtgtccgt gatcgcagac ctcaggaatg ccttctacgt 180

cctcttcccc atctggttcc atcttcagga agctgtgggc attaaactcc tttgggtagc 240

tgtgattgga gactggctca acctcgtctt taagtggatt ctctttggac agcgtccata 300

ctggtgggtt ttggatactg actactacag caacacttcc gtgcccctga taaagcagtt 360

ccctgtaacc tgtgagactg gaccagggag cccctctggc catgccatgg gcacagcagg 420

tgtatactac gtgatggtca catctactct ttccatcttt cagggaaaga taaagccgac 480

ctacagattt cggtgcttga atgtcatttt gtggttggga ttctgggctg tgcagctgaa 540

tgtctgtctg tcacgaatct accttgctgc tcattttcct catcaagttg ttgctggagt 600

cctgtcaggc attgctgttg cagaaacttt cagccacatc cacagcatct ataatgccag 660

cctcaagaaa tattttctca ttaccttctt cctgttcagc ttcgccatcg gattttatct 720

gctgctcaag ggactgggtg tagacctcct gtggactctg gagaaagccc agaggtggtg 780

cgagcagcca gaatgggtcc acattgacac cacacccttt gccagcctcc tcaagaacct 840

gggcacgctc tttggcctgg ggctggctct caactccagc atgtacaggg agagctgcaa 900

ggggaaactc agcaagtggc tcccattccg cctcagctct attgtagcct ccctcgtcct 960

cctgcacgtc tttgactcct tgaaaccccc atcccaagtc gagctggtct tctacgtctt 1020

gtccttctgc aagagtgcgg tagtgcccct ggcatccgtc agtgtcatcc cctactgcct 1080

cgcccaggtc ctgggccagc cgcacaagaa gtcgttgtaa gagatgtgga gtcttcggtg 1140

ttcaaagtca acaaccatgc cagggattga ggaggactac tatttgaagc aatgggcact 1200

ggtatttgga gcaagtgaca tgccatccat tctgccgtcg tggaattaaa tcacggatgg 1260

cagattggag ggtcgcctgg cttattccca tgtgtgactc cagcctgccc tcagcacaga 1320

ctctttcaga tggaggtgcc atatcacgta caccatatgc aagtttcccg ccaggaggtc 1380

ctcctctctc tacttgaata ctctcacaag tagggagctc actcccactg gaacagccca 1440

ttttatcttt gaatggtctt ctgccagccc attttgaggc cagaggtgct gtcagctcag 1500

gtggtcctct tttacaatcc taatcatatt gggtaatgtt tttgaaaagc taatgaagct 1560

attgagaaag acctgttgct agaagttggg ttgttctgga ttttcccctg aagacttact 1620

tattcttccg tcacatatac aaaagcaaga cttccaggta gggccagctc acaagcccag 1680

gctggagatc ctaactgaga attttctacc tgtgttcatt cttaccgaga aaaggagaaa 1740

ggagctctga atctgatagg aaaagaaggc tgcctaagga ggagttttta gtatgtggcg 1800

tatcatgcaa gtgctatgcc aagccatgtc taaatggctt taattatata gtaatgcact 1860

ctcagtaatg ggggaccagc ttaagtataa ttaatagatg gttagtgggg taattctgct 1920

tctagtattt tttttactgt gcatacatgt tcatcgtatt tccttggatt tctgaatggc 1980

tgcagtgacc cagatattgc actaggtcaa aacattcagg tatagctgac atctcctcta 2040

tcacattaca tcatcctcct tataagccca gctctgcttt ttccagattc ttccactggc 2100

tccacatcca ccccactgga tcttcagaag gctagagggc gactctggtg gtgcttttgt 2160

atgtttcaat taggctctga aatcttgggc aaaatgacaa ggggagggcc aggattcctc 2220

tctcaggtca ctccagtgtt acttttaatt cctagagggt aaatatgact cctttctcta 2280

tcccaagcca accaagagca cattcttaaa ggaaaagtca acatcttctc tctttttttt 2340

tttttttttg agacagggtc tcactatgtt gcccaggctg c 2381

<210> 4

<211> 1074

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

atggaggaag gaatgaatgt tctccatgac tttgggatcc agtcaacaca ttacctccag 60

gtgaattacc aagactccca ggactggttc atcttggtgt ccgtgatcgc agacctcagg 120

aatgccttct acgtcctctt ccccatctgg ttccatcttc aggaagctgt gggcattaaa 180

ctcctttggg tagctgtgat tggagactgg ctcaacctcg tctttaagtg gattctcttt 240

ggacagcgtc catactggtg ggttttggat actgactact acagcaacac ttccgtgccc 300

ctgataaagc agttccctgt aacctgtgag actggaccag ggagcccctc tggccatgcc 360

atgggcacag caggtgtata ctacgtgatg gtcacatcta ctctttccat ctttcaggga 420

aagataaagc cgacctacag atttcggtgc ttgaatgtca ttttgtggtt gggattctgg 480

gctgtgcagc tgaatgtctg tctgtcacga atctaccttg ctgctcattt tcctcatcaa 540

gttgttgctg gagtcctgtc aggcattgct gttgcagaaa ctttcagcca catccacagc 600

atctataatg ccagcctcaa gaaatatttt ctcattacct tcttcctgtt cagcttcgcc 660

atcggatttt atctgctgct caagggactg ggtgtagacc tcctgtggac tctggagaaa 720

gcccagaggt ggtgcgagca gccagaatgg gtccacattg acaccacacc ctttgccagc 780

ctcctcaaga acctgggcac gctctttggc ctggggctgg ctctcaactc cagcatgtac 840

agggagagct gcaaggggaa actcagcaag tggctcccat tccgcctcag ctctattgta 900

gcctccctcg tcctcctgca cgtctttgac tccttgaaac ccccatccca agtcgagctg 960

gtcttctacg tcttgtcctt ctgcaagagt gcggtagtgc ccctggcatc cgtcagtgtc 1020

atcccctact gcctcgccca ggtcctgggc cagccgcaca agaagtcgtt gtaa 1074

<210> 5

<211> 91

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

gcattgctgt tgcagaaact ttcagccaca tccacagcat ctataatgcc agcctcaaga 60

aatattttct cattaccttc ttccttttca g 91

<210> 6

<211> 357

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

Met Glu Glu Gly Met Asn Val Leu His Asp Phe Gly Ile Gln Ser Thr

1 5 10 15

His Tyr Leu Gln Val Asn Tyr Gln Asp Ser Gln Asp Trp Phe Ile Leu

20 25 30

Val Ser Val Ile Ala Asp Leu Arg Asn Ala Phe Tyr Val Leu Phe Pro

35 40 45

Ile Trp Phe His Leu Gln Glu Ala Val Gly Ile Lys Leu Leu Trp Val

50 55 60

Ala Val Ile Gly Asp Trp Leu Asn Leu Val Phe Lys Trp Ile Leu Phe

65 70 75 80

Gly Gln Arg Pro Tyr Trp Trp Val Leu Asp Thr Asp Tyr Tyr Ser Asn

85 90 95

Thr Ser Val Pro Leu Ile Lys Gln Phe Pro Val Thr Cys Glu Thr Gly

100 105 110

Pro Gly Ser Pro Ser Gly His Ala Met Gly Thr Ala Gly Val Tyr Tyr

115 120 125

Val Met Val Thr Ser Thr Leu Ser Ile Phe Gln Gly Lys Ile Lys Pro

130 135 140

Thr Tyr Arg Phe Arg Cys Leu Asn Val Ile Leu Trp Leu Gly Phe Trp

145 150 155 160

Ala Val Gln Leu Asn Val Cys Leu Ser Arg Ile Tyr Leu Ala Ala His

165 170 175

Phe Pro His Gln Val Val Ala Gly Val Leu Ser Gly Ile Ala Val Ala

180 185 190

Glu Thr Phe Ser His Ile His Ser Ile Tyr Asn Ala Ser Leu Lys Lys

195 200 205

Tyr Phe Leu Ile Thr Phe Phe Leu Phe Ser Phe Ala Ile Gly Phe Tyr

210 215 220

Leu Leu Leu Lys Gly Leu Gly Val Asp Leu Leu Trp Thr Leu Glu Lys

225 230 235 240

Ala Gln Arg Trp Cys Glu Gln Pro Glu Trp Val His Ile Asp Thr Thr

245 250 255

Pro Phe Ala Ser Leu Leu Lys Asn Leu Gly Thr Leu Phe Gly Leu Gly

260 265 270

Leu Ala Leu Asn Ser Ser Met Tyr Arg Glu Ser Cys Lys Gly Lys Leu

275 280 285

Ser Lys Trp Leu Pro Phe Arg Leu Ser Ser Ile Val Ala Ser Leu Val

290 295 300

Leu Leu His Val Phe Asp Ser Leu Lys Pro Pro Ser Gln Val Glu Leu

305 310 315 320

Val Phe Tyr Val Leu Ser Phe Cys Lys Ser Ala Val Val Pro Leu Ala

325 330 335

Ser Val Ser Val Ile Pro Tyr Cys Leu Ala Gln Val Leu Gly Gln Pro

340 345 350

His Lys Lys Ser Leu

355

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

tctcattacc ttcttccttt tcagc 25

<210> 8

<211> 104

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

gcatctataa tgccagcctc aagaaatatt ttctcattac cttcttcctk ttcagcttcg 60

ccatcggatt ttatctgctg ctcaagggac tgggtgtaga cctc 104

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> 对照反义寡核苷酸

<400> 9

cctcttacct cagttacaat ttata 25

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> First PCR正向引物

<400> 10

ggtgtatact acgtgatggt c 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> Second PCR正向引物

<400> 11

ttgggattct gggctgtgca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> First/Second PCR反向引物

<400> 12

aagggtgtgg tgtcaatgtg 20

<210> 13

<211> 4169

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 13

atagcagagc aatcaccacc aagcctggaa taactgcaag ggctctgctg acatcttcct 60

gaggtgccaa ggaaatgagg atggaggaag gaatgaatgt tctccatgac tttgggatcc 120

agtcaacaca ttacctccag gtgaattacc aagactccca ggactggttc atcttggtgt 180

ccgtgatcgc agacctcagg aatgccttct acgtcctctt ccccatctgg ttccatcttc 240

aggaagctgt gggcattaaa ctcctttggg tagctgtgat tggagactgg ctcaacctcg 300

tctttaagtg gattctcttt ggacagcgtc catactggtg ggttttggat actgactact 360

acagcaacac ttccgtgccc ctgataaagc agttccctgt aacctgtgag actggaccag 420

ggagcccctc tggccatgcc atgggcacag caggtgtata ctacgtgatg gtcacatcta 480

ctctttccat ctttcaggga aagataaagc cgacctacag atttcggtgc ttgaatgtca 540

ttttgtggtt gggattctgg gctgtgcagc tgaatgtctg tctgtcacga atctaccttg 600

ctgctcattt tcctcatcaa gttgttgctg gagtcctgtc aggcattgct gttgcagaaa 660

ctttcagcca catccacagc atctataatg ccagcctcaa gaaatatttt ctcattacct 720

tcttcctgtt cagcttcgcc atcggatttt atctgctgct caagggactg ggtgtagacc 780

tcctgtggac tctggagaaa gcccagaggt ggtgcgagca gccagaatgg gtccacattg 840

acaccacacc ctttgccagc ctcctcaaga acctgggcac gctctttggc ctggggctgg 900

ctctcaactc cagcatgtac agggagagct gcaaggggaa actcagcaag tggctcccat 960

tccgcctcag ctctattgta gcctccctcg tcctcctgca cgtctttgac tccttgaaac 1020

ccccatccca agtcgagctg gtcttctacg tcttgtcctt ctgcaagagt gcggtagtgc 1080

ccctggcatc cgtcagtgtc atcccctact gcctcgccca ggtcctgggc cagccgcaca 1140

agaagtcgtt gtaagagatg tggagtcttc ggtgtttaaa gtcaacaacc atgccaggga 1200

ttgaggagga ctactatttg aagcaatggg cactggtatt tggagcaagt gacatgccat 1260

ccattctgcc gtcgtggaat taaatcacgg atggcagatt ggagggtcgc ctggcttatt 1320

cccatgtgtg actccagcct gccctcagca cagactcttt cagatggagg tgccatatca 1380

cgtacaccat atgcaagttt cccgccagga ggtcctcctc tctctacttg aatactctca 1440

caagtaggga gctcactccc actggaacag cccattttat ctttgaatgg tcttctgcca 1500

gcccattttg aggccagagg tgctgtcagc tcaggtggtc ctcttttaca atcctaatca 1560

tattgggtaa tgtttttgaa aagctaatga agctattgag aaagacctgt tgctagaagt 1620

tgggttgttc tggattttcc cctgaagact tacttattct tccgtcacat atacaaaagc 1680

aagacttcca ggtagggcca gctcacaagc ccaggctgga gatcctaact gagaattttc 1740

tacctgtgtt cattcttacc gagaaaagga gaaaggagct ctgaatctga taggaaaaga 1800

aggctgccta aggaggagtt tttagtatgt ggcgtatcat gcaagtgcta tgccaagcca 1860

tgtctaaatg gctttaatta tatagtaatg cactctcagt aatgggggac cagcttaagt 1920

ataattaata gatggttagt ggggtaattc tgcttctagt atttttttta ctgtgcatac 1980

atgttcatcg tatttccttg gatttctgaa tggctgcagt gacccagata ttgcactagg 2040

tcaaaacatt caggtatagc tgacatctcc tctatcacat tacatcatcc tccttataag 2100

cccagctctg ctttttccag attcttccac tggctccaca tccaccccac tggatcttca 2160

gaaggctaga gggcgactct ggtggtgctt ttgtatgttt caattaggct ctgaaatctt 2220

gggcaaaatg acaaggggag ggccaggatt cctctctcag gtcactccag tgttactttt 2280

aattcctaga gggtaaatat gactcctttc tctatcccaa gccaaccaag agcacattct 2340

taaaggaaaa gtcaacatct tctctctttt tttttttttt tgagacaggg tctcactatg 2400

ttgcccaggc tgctcttgaa ttcctgggct caagcagtcc tcccacccta ccacagcgtc 2460

ccgcgtagct gggactacag gtgcaagcca ctatgtccag ctagccaact cctccttgcc 2520

tgcttttctt tttttttctt tttttgagac ggcgcaccta tcacccaggc tggagtggag 2580

tggcacgatc ttggctcact gcaacctctt cctcctggtt caagcgattc tcatgtctca 2640

gcctcctcag tagctaggac taccggcgtg caccaccatg ccaggctaat ttttatattt 2700

ttagaatttt agaagagatg ggatttcatc atgttggcca ggctggtctc gaactcctga 2760

cctcaagtga tccacctgcc ttggcctccc aaggtgctag gattacaggc atgagccacc 2820

gcaccgggcc ctccttgcct gtttttcaat ctcatctgat atgcagagta tttctgcccc 2880

acccacctac cccccaaaaa aagctgaagc ctatttattt gaaagtcctt gtttttgcta 2940

ctaattatat agtataccat acattatcat tcaaaacaac catcctgctc ataacatctt 3000

tgaaaagaaa aatatatatg tgcagtattt tattaaagca acattttatt taagaataaa 3060

gtcttgttaa ttactatatt ttagatgcaa tgtgatctga agtttctaat tctggcccaa 3120

ctaaatttct agctctgttt ccctaaacaa ataatttggt ttctctgtgc ctgcattttc 3180

cctttggaga agaaaagtgc tctctcttga gttgaccgag agtcccatta gggataggga 3240

gacttaaatg catccacagg ggcacaggca gagttgagca cataaacgga ggcccaaaat 3300

cagcatagaa ccagaaagat tcagagttgg ccaagaatga acattggcta ccagaccaca 3360

agtcagcatg agttgctcta tggcatcaaa ttgcaacttg agagtagatg ggcagggtca 3420

ctatcaaatt aagcaatcag ggcacacaag ttgcagtaac acaacaagac taggccagct 3480

ctggaatcca gtaactcagt gtcagcaagg ttttgggtta tagttcaaga aagtctaaac 3540

agagccagtc acagcaccaa ggaatgctca agggagctat tgcaggtttc tctgctaaga 3600

gatttatttc atcctgggtg cagggttcga cctccaaagg cctcaaatca tcaccgtatc 3660

aatggatttc ctgagggtaa gctccgctat ttcacacctg aactccggag tctgtatatt 3720

cagggaagat tgcattctcc tactggattt gggctctcag agggcgttgt gggaaccagg 3780

cccctcacag aatcaaatgg tcccaaccag ggagaaagaa aatagtcttt tttttttttt 3840

taatagagat gggggtctca ctatgctgcc caggctggtc ttgaactcct gggttcaagt 3900

gatcctcctg cctcagcctc ccaaagtgct gggattacag tgtgagccac tgcgcttggc 3960

cagaaatggt tttgatctgt ctgaactgaa ccctactgct taggcatagc cccatccttg 4020

ataatctatt tgctcccaag gaccaagtcc aagatcctta caagaaaggt ctgccagaaa 4080

gtaaatactg cccccactcc ctgaagttta tgaggttgat aagaaaacat aacagataaa 4140

gtttattgag tgctaacttt aaaaaaaaa 4169

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 14

gctgaaaagg aagaaggtaa tgaga 25

<210> 15

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 15

gaggtctaca cccagtccct tgagcagcag ataaaatccg atggcgaagc tgaamaggaa 60

gaaggtaatg agaaaatatt tcttgaggct ggcattatag atgc 104

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 16

tccgatggcg aagctgaaaa ggaagaag 28

<210> 17

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 17

ctgaaaagga agaag 15

<210> 18

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 18

agctgaaaag gaaga 15

<210> 19

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 19

gaagctgaaa aggaa 15

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 20

gcgaagctga aaagg 15

<210> 21

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 21

tggcgaagct gaaaa 15

<210> 22

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 22

gatggcgaag ctgaa 15

<210> 23

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 23

ccgatggcga agctg 15

Claims

1.一种反义寡核苷酸，其与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的包含第42911000位的碱基、第42911004位的碱基和第42911005位的碱基中的至少1个碱基区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的第42910951位～第42911054位的碱基区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

3.根据权利要求1或2所述的反义寡核苷酸，其由7～104个碱基构成。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸从以下的(a)和(b)中选择：

5.根据权利要求1～4中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸是由14～30个碱基构成的吗啉代反义寡核苷酸或由7～25个碱基构成的锁定核酸(LNA)反义寡核苷酸。

6.一种糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物，其包含反义寡核苷酸作为药效成分，所述反义寡核苷酸与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的包含第42911000位的碱基、第42911004位的碱基和第42911005位的碱基中的至少1个碱基区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

7.根据权利要求6所述的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物，其中，所述反义寡核苷酸与GRCh38/hg38的人第17号染色体碱基序列中的第42910951位～第42911054位的碱基区域的前mRNA的序列杂交、并且具有抑制c.648G>T变异型G6PC的前mRNA的异常剪接的活性。

8.根据权利要求6或7所述的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物，其中，所述反义寡核苷酸由7～104个碱基构成。

9.根据权利要求6～8中任一项所述的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物，其中，所述反义寡核苷酸为从以下的(a)和(b)中选择的反义寡核苷酸：

10.根据权利要求6～9中任一项所述的糖原贮积病Ia型预防或治疗用组合物，其中，所述反义寡核苷酸为由14～30个碱基构成的吗啉代反义寡核苷酸或由7～25个碱基构成的锁定核酸(LNA)反义寡核苷酸。