TWI762484B

TWI762484B - 抗ｐｄ１抗體分子、其製造方法及其用於癌症治療之用途

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Publication number: TWI762484B
Application number: TW106116226A
Authority: TW
Inventors: 馬可仕賽特; 依佛羅倫斯; 歐特瑪沙佛; 梅蘭妮烏姆; 琴－法蘭寇斯佛汀; 史卡特布勞德; 凱斯Ａ賈納達; 盧卡斯查爾威斯基; 華特卡洛大衛森; 班卡古塔; 普利彥卡古塔; 洛奇歐Ｋ波瑞; 約瑟夫羅伯特二世沃斯卡; 海光肖; 丹青楊
Original assignee: 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司
Priority date: 2016-05-18
Filing date: 2017-05-17
Publication date: 2022-05-01
Also published as: MY193112A; KR102419412B1; JP2020007340A; CY1123977T1; UA127200C2; JP2019522460A; EP3458478A1; BR112018072986A2; TW201806974A; EP3848393A1; AU2017266298A1; IL262892B1; JP6585801B2; KR20220103806A; CA3020649A1; AU2017266298B2; HUE053452T2; KR20190006177A; PL3458478T3; IL262892B2

Abstract

本發明係關於新穎抗PD1抗體分子及抗LAG3抗體分子。本發明亦係關於編碼該等抗體分子之核酸；關於製備該等抗體分子之方法；關於表現或能夠表現該等抗體分子之宿主細胞；關於包含該等抗體分子之組合物；且關於該等抗體分子或該等組合物之用途，尤其用於癌症疾病領域中之治療目的。

Description

抗PD1抗體分子、其製造方法及其用於癌症治療之用途

癌症係以異常局部細胞生長為特徵且具有遍及體內擴散之潛能之疾病。在發達國家，其係第二大常見死因。在男性中，最常見類型之癌症係肺癌、***癌、結腸直腸癌及胃癌，且在女性中，最常見類型係乳癌、結腸直腸癌、肺癌及子宮頸癌。儘管存活機會主要取決於癌症之類型及鑑別之階段，但對於肺癌而言10年總體存活率為約5%。

在過去，治療腫瘤性癌症的最常用方式(稱為「腫瘤學」)係藉助手術、輻射治療或使用化學治療藥物進行。然而，最近幾年，癌症免疫療法已顯示作為腫瘤學之治療方式提供了很大希望。

癌症免疫療法係腫瘤學中使用免疫系統來治療癌症之分支，其與直接切除或治療腫瘤之現有的常用治療方法形成鮮明對比。此治療概念係基於對T細胞表面上用於抑制該等細胞之免疫功能之多種蛋白質之鑑別。在該等蛋白質中列示了PD1。

PD1(程式性細胞死亡1)係表現於T細胞上之細胞表面受體蛋白。該蛋白質用作「免疫檢查點」抑制劑，亦即，其用於調節免疫系統中之細胞之活性以便調控並限制自體免疫疾病。最近已瞭解許多癌症可藉由修飾「免疫檢查點」抑制劑且由此避免檢測來保護自身免受免疫系統之影響。

就PD1而言，此蛋白質具有兩種配體PD-L1及PD-L2，該等配體與該細胞表面受體相互作用。在結合後，PD-1誘導負調控T細胞反應之細胞內信號。

如上文所詳述，PD1係T細胞活性之關鍵調節劑。最近已顯示在一系列不同的癌症情形中，可使用拮抗性PD-1抗體分子尼沃魯單抗(nivolumab)及派姆單抗(pembrolizumab)來刺激免疫系統且藉此治療癌症。

淋巴球活化基因-3(LAG3；CD223)係主要表現於經活化T細胞之細胞表面上且亦在NK及樹突細胞之子集上發現之I型跨膜蛋白。LAG3與CD4密切相關，該CD4係T輔助細胞活化之輔受體。兩種分子具有四個細胞外Ig樣結構域，且對於該兩種分子之功能活性而言該兩種分子需要結合至其配體(II類主要組織相容性複合體(MHC))。在結合至MHC-II之後，LAG3誘導負調控T細胞反應之細胞內信號。最近研究已揭示LAG3及PD1在腫瘤浸潤淋巴球(TIL)上共表現，表明其可促成腫瘤介導之免疫抑制。認為長期暴露於抗原導致T細胞藉助稱為「耗竭」之過程的進展性失活。耗竭之T細胞通常共表現負調節諸如PD1及LAG3等受體。

儘管PD1拮抗性單株抗體尼沃魯單抗及派姆單抗之臨床結果令人鼓舞，但高達70%之治療患者對治療沒有反應。利用患者源性T細胞以及來自同源腫瘤小鼠模型之臨床前數據已證實腫瘤源性T細胞除PD1以外通常表現其他抑制性受體。在活體外及活體內模型中，使用拮抗性單株抗體分子對PD1及LAG3之組合中和增加了T細胞之再活化且與單獨PD1中和相比改良了腫瘤排斥。基於該等結果，預計LAG3之中和將增強拮抗性PD1 mAb之效能。

然而，現有抗PD1抗體分子遭受與大部分患者不能對治療產生反應相關之問題。因此業內需要鑑別在與先前技術現有抗體藥劑單獨使用或與其他治療分子、尤其對其他T細胞檢查點抑制劑具有拮抗性之其他分子組合使用時相比時，具有可管控副作用譜之更有效PD1拮抗性單株抗體。

根據此背景，本發明者設法生成較已知分子具有改良之治療特性之其他抗PD1抗體及抗LAG3抗體。

根據第一態樣，提供抗PD1抗體分子。如本文進一步闡述，本發明之抗PD1抗體分子具有較其他抗PD1抗體驚人且有利的性質。尤其地，其較參考抗PD1抗體分子證實改良之T細胞活化及更長之終末半衰期。如將瞭解，該等性質對於用於治療癌症之抗PD1抗體分子而言係合意的。

本發明亦提供編碼抗PD1抗體分子之核酸分子、表現載體、宿主細胞及製備本發明之抗PD1抗體分子之方法。本發明亦提供包含本發明之抗PD1抗體分子之醫藥組合物。本文所揭示之抗PD-1抗體分子可用於治療癌性病症，包括實體及軟組織腫瘤。

更特定而言，本發明之抗PD1抗體分子包含：(a)包含SEQ ID NO：1(hcCDR1)、SEQ ID NO：2(hcCDR2)及SEQ ID NO：3(hcCDR3)之胺基酸序列之重鏈CDR且具有包含SEQ ID NO：4(lcCDR1)、SEQ ID NO：5(lcCDR2)及SEQ ID NO：6(lcCDR3)之胺基酸序列之輕鏈CDR；或，b)包含SEQ ID NO：7(hcCDR1)、SEQ ID NO：8(hcCDR2)及SEQ ID NO：9(hcCDR3)之胺基酸序列之重鏈CDR且具有包含SEQ ID NO：10(lcCDR1)、SEQ ID NO：11(lcCDR2)及SEQ ID NO：12(lcCDR3)之胺基酸序列之輕鏈CDR；或(c)包含SEQ ID NO：13(hcCDR1)、SEQ ID NO：14(hcCDR2)及SEQ ID NO：15(hcCDR3)之胺基酸序列之重鏈CDR且具有包含SEQ ID NO：16(lcCDR1)、SEQ ID NO：17(lcCDR2)及SEQ ID NO：18(lcCDR3)之胺基酸序列之輕鏈CDR。

根據本發明之另一態樣，亦提供抗LAG3抗體分子。如本文進一步闡述，本發明之抗LAG3抗體分子具有較其他抗LAG3抗體分子驚人且有利的性質。尤其地，其證實在與本發明之抗PD1抗體分子組合使用時較參考抗PD1抗體分子及抗LAG3抗體分子具有改良之T細胞活化。如將瞭解，該等性質對於用於治療癌症之抗LAG3抗體分子而言係合意的。

本發明亦提供編碼抗體分子之核酸分子、表現載體、宿主細胞及製備抗LAG3抗體分子之方法。本發明亦提供包含本發明之抗LAG3抗體分子之醫藥組合物。本文所揭示之抗LAG3抗體分子可用於治療癌性病症，包括實體及軟組織腫瘤。

根據較佳實施例，本發明之抗LAG3抗體分子結合包含胺基酸序列LLRRAGVT(SEQ ID NO：111)及/或YRAAVHLRDRA(SEQ ID NO：112)之人類LAG3之表位。本文提供測定抗體所結合表位之方法。

根據較佳實施例，本發明之抗LAG3抗體分子包含(a)包含SEQ ID NO：39(hcCDR1)、SEQ ID NO：40(hcCDR2)及SEQ ID NO：41 (hcCDR3)之胺基酸序列之重鏈CDR且具有包含SEQ ID NO：42(lcCDR1)、SEQ ID NO：43(lcCDR2)及SEQ ID NO：44(lcCDR3)之胺基酸序列之輕鏈CDR；或(b)包含SEQ ID NO：45(hcCDR1)、SEQ ID NO：46(hcCDR2)及SEQ ID NO：47(hcCDR3)之胺基酸序列之重鏈CDR且具有包含SEQ ID NO：48(lcCDR1)、SEQ ID NO：49(lcCDR2)及SEQ ID NO：50(lcCDR3)之胺基酸序列之輕鏈CDR。

根據本發明之另一態樣，亦提供治療癌症之方法，其中本發明之抗PD1抗體分子可與本發明之抗LAG3抗體分子組合使用。本發明之該等態樣之實施例包括其中抗LAG3抗體係與抗PD1抗體分子同時、並行、依序、相繼、交替或分開投與。本發明之該等態樣之他實施例包括其中抗PD1抗體分子係與抗LAG3抗體分子同時、並行、依序、相繼、交替或分開投與。本發明之該等態樣之他實施例包括其中本發明抗體分子之該等使用可與其他治療劑組合。

自本發明之以下詳細闡述及自隨附申請專利範圍將明瞭涉及本發明抗體分子之其他態樣、實施例、使用及方法。

本發明提供容許更有效治療若干癌症類型(例如肺癌，尤其NSCLC)之新穎抗體分子。

圖1：抗PD1抗體分子之可變結構域之胺基酸序列.77E11係鼠類前體抗體之名稱。PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5係如本文所定義之抗PD1抗體。CDR序列加有下劃線。VK 77E11(SEQ ID NO：113)；VK PD1-1(SEQ ID NO：20)；VK PD1-2；(SEQ ID NO：22)；VK PD1-3(SEQ ID NO：24)；VK PD1-4,(SEQ ID NO：26)；VK PD1-5(SEQ ID NO：28)；VH 77E11(SEQ ID NO：114)；VH PD1-1(SEQ ID NO：19)；VH PD1-2；(SEQ ID NO：21)；VH PD1-3(SEQ ID NO：23)；VH PD1-4,(SEQ ID NO：25)；VH PD1-5(SEQ ID NO：27)。

圖2：藉由抗PD1抗體分子對PD1結合至人類PD1-L1/L2之抑制.(A)顯示本發明之抗PD1抗體誘導阻斷PD-L1結合至表現於CHO細胞表面上之人類PD-1。(B)顯示本發明之抗PD1抗體誘導阻斷PD-L2結合至表現於CHO細胞表面上之人類PD-1。

圖3：抗PD1抗體分子對抗原特異性T細胞反應之刺激.顯示本發明之抗PD1抗體刺激來自四個個別供體之破傷風特異性CD4記憶體T細胞產生干擾素-γ(IFN-γ)之能力。為進行此分析，在破傷風類毒素存在下擴增來自源於健康供體之PBMC之T細胞並將其與加載有破傷風類毒素之自體成熟樹突細胞(DC)一起共培養2天。在PD1-1及PD1-3存在下將共培養步驟以類似方式再重複一次。在該另一共培養步驟結束時，藉由ELISA評價上清液之IFN-γ含量。

圖4：在hPD-1敲入小鼠模型中抗PD1抗體分子之活體內效能.顯示來自具有結腸癌細胞系(MC38)之小鼠之個別腫瘤生長曲線。利用(A)PBS q3or4d、(B)同型q3or4d、(C)PD1-3 q3or4d或(D)PD1-3作為單一劑量治療小鼠。以10mg/kg給予PD1-3及同型。

圖5：抗PD1抗體分子之臨床前藥物動力學 繪製在靜脈內投藥之後PD1抗體之藥物動力學參數對投與至食蟹猴之劑量之圖形。(A)曲線下面積(AUC)、(B)最大血漿濃度(c_max)、(C)血漿清除率(CL)、(D)末期之消除半衰期(t_1/2,z)。

圖6：抗LAG3抗體分子之可變結構域之胺基酸序列.496G6係鼠類前體抗體之名稱。LAG3-1、LAG3-2、LAG3-3、LAG3-4及LAG3-5係如本文所定義之抗LAG3抗體。VK 496G6(SEQ ID NO：117)；VK LAG3-1(SEQ ID NO：52)；VK LAG3-2；(SEQ ID NO：54)；VK LAG3-3(SEQ ID NO：56)；VK LAG3-4,(SEQ ID NO：58)；VK LAG3-5(SEQ ID NO：60)；VH 496G6(SEQ ID NO：118)；VH LAG3-1(SEQ ID NO：51)；VH LAG3-2；(SEQ ID NO：53)；VH LAG3-3(SEQ ID NO：55)；VH LAG3-4,(SEQ ID NO：57)；VH LAG3-5(SEQ ID NO：59)。

圖7：藉由抗LAG3抗體分子對人類LAG3結合至MHCII之抑制.顯示所指示LAG3 mAb及對照mAb阻斷重組體LAG3與表現於Raji細胞表面上之MHCII之結合之功效。

圖8：藉由抗PD1抗體分子及抗LAG3抗體分子對抗原特異性T細胞反應之刺激.(A)顯示相對於飽和量之派姆單抗(Keytruda(R))之PD1/LAG3 mAb組合之倍數增加%。將固定100nM濃度之PD1-3及尼沃魯單抗(Opdivo(R))與增加量之LAG3 mAb(以黑色線顯示之LAG3-1或以虛線顯示之具有與BMS-986016(拮抗性LAG3抗體)相同之胺基酸序列之參考抗體分子)組合。(B)顯示相對於派姆單抗(Keytruda(R))活性之本發明之PD1/LAG3 mAb分子組合之倍數增加%。評價100nM之PD1及200nM之LAG3 mAb之組合mAb活性之水準。藉由單因子ANOVA隨後圖基事後測試(Tukey post hoc test)使用Graph Pad Prism實施統計測試。

圖9：在同源腫瘤模型中PD1及LAG3抗體之組合療法之活體內效能.顯示每週兩次利用工具抗體以10mg/kg之劑量治療之具有腫瘤之小鼠的個別生長曲線。(A)利用PBS、抗LAG3、抗PD1或抗PD1及抗LAG3之組合治療具有結腸癌(MC38)之小鼠。利用PD1同型、抗PD1或抗PD1及抗LAG3之組合治療具有黑色素瘤(B16-F10)(B)、肺癌(LL/2)(C)、結腸癌(Colon-26)(D)或乳癌(4T1)(E)腫瘤之小鼠。

定義

根據本文中之其他說明，將明瞭本發明之以上及其他態樣及實施例。

除非另有說明或定義，否則所用之所有術語皆具有其業內常用含義，此為熟習此項技術者所明瞭。例如參考標準手冊，例如Sambrook等人，「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(第2版)，第1卷至第3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin,「Genes IV」,Oxford University Press,New York,(1990)，及Roitt等人，「Immunology」(第2版),Gower Medical Publishing,London,New York(1989)，以及參考本文所引用之一般背景技術。此外，除非另有指示，否則可實施且已以本身已知之方式實施未詳細特定闡述之所有方法、步驟、技術及操作，如熟習此項技術者所明瞭。再次參考(例如)標準手冊、上文所提及之一般背景技術及其中引用之其他參考文獻。

本文所用冠詞「一(a及an)」係指一個或一個以上(即指至少一個)的該冠詞之文法受詞。

除非上下文另有明確指示，否則術語「或」在本文中用於意指術語「及/或」且可與該術語「及/或」互換使用。

「約」及「大約」通常應意指慮及量測之性質或精密度，所測得之量之可接受之誤差度。實例性誤差度在給定值或值範圍之20%(%)內，通常在10%內，且更通常在5%內。

「抗體分子」或「抗體」(在本文中同義使用)係可在脊椎動物之血液或其他體液中發現之γ球蛋白，且藉由免疫系統用於鑑別及中和外來物，例如細菌及病毒。其通常由基本結構單元(各自具有兩條大的重鏈及兩條小的輕鏈)製得，以形成(例如)具有一個單元之單體，具有兩個單元之二聚體或具有五個單元之五聚體。抗體分子可藉由非共價相互作用結合至稱為抗原之其他分子或結構。此結合在抗體分子將僅以高親和力結合至特定結構之意義上係特異性的。抗原中由抗體分子識別之獨特部分稱為表位或抗原性決定子。抗體分子中結合至表位之部分在抗體之所謂的可變結構域或可變區(Fv)中有時稱為互補位及殘基。可變結構域包含三個所謂的互補決定區(CDR)，該等互補決定區係由框架區(FR)間隔開。

在本發明之上下文中，所提及之CDR係基於Chothia(Chothia及Lesk，J.Mol.Biol.1987,196：901-917)以及Kabat(E.A.Kabat、T.T.Wu、H.Bilofsky、M.Reid-Miller及H.Perry，Sequence of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda(1983))之定義。

在一些實施例中，抗體分子具有重鏈恆定區，該重鏈恆定區選自(例如)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE之重鏈恆定區；尤其選自(例如)(例如，人類)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之重鏈恆定區。在另一實施例中，抗體分子具有輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區選自(例如)(例如，人類)κ或λ之輕鏈恆定區。恆定區可改變(例如突變)以改質抗體之性質(例如，增加或減少以下中之一或多者：Fc受體結合、抗體醣基化、半胱胺酸殘基之數量、效應細胞功能及/或補體功能)。在一些實施例中，抗體具有效應物功能且可固定補體。在其他實施例中，抗體不招募效應細胞或固定補體。在某些實施例中，抗體已減少或沒有結合Fc受體之能力。舉例而言，抗體可為不支持與Fc受體結合之同型或亞型、片段或其他突變體，例如其具有經誘變或缺失之Fc受體結合區。

在一些實施例中，抗體恆定區有改變。改變抗體恆定區之方法為業內已知。抗體具有改變之功能，例如改變之對效應物配體(例如細胞上之FcR)之親和性，或可藉由用不同殘基替代抗體之恆定部分中之至少一個胺基酸殘基來產生補體之C1組份(例如，參見EP 388,151 A1、美國專利第5,624,821號及美國專利第5,648,260號，所有該等案件之內容皆以引用方式併入本文中)。亦涵蓋在人類IgG4中穩定抗體結構之胺基酸突變(例如S228P(EU命名法，Kabat命名法中之S241P))。可闡述類似形式之改變，該等類似形式之改變若應用至鼠類或其他物種免疫球蛋白則可減少或消除該等功能。

本文所用術語「可變結構域」意指抗體分子中基本上由4個「框架區」組成之區，該等框架區在業內及下文中分別稱作「框架區1」或「FR1」；「框架區2」或「FR2」；「框架區3」或「FR3」及「框架區4」或「FR4」；該等框架區雜有3個「互補決定區」或「CDR」，該等互補決定區在業內及下文中分別稱作「互補決定區1」或「CDR1」；「互補決定區2」或「CDR2」及「互補決定區3」或「CDR3」。因此，可如下指示免疫球蛋白可變結構域之通用結構或序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變結構域藉由攜帶抗原結合位點賦予抗體對抗原之特異性。

術語「可變重鏈(或VH)」及「可變輕鏈(或VL)」係指分別來自抗體分子之重鏈或輕鏈之可變結構域。

業內已進一步研發抗體分子且使其成為醫學及技術中之通用工具。因此，在本發明之上下文中，術語「抗體分子」或「抗體」不僅包括如可在自然界中發現包含(例如)兩條輕鏈及兩條重鏈之抗體，且另外涵蓋包含至少一個具有與抗原具有結合特異性且與抗體分子之可變結構域具有結構類似性之互補位之所有分子。

因此，本發明之抗體分子包括單株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、抗體之片段(尤其Fv、Fab、Fab’、或F(ab’)₂片段)、單鏈抗體、尤其單鏈可變片段(scFv)、小模組免疫醫藥劑(Small Modular Immunopharmaceutical，SMIP)、結構域抗體、奈米抗體、雙價抗體。

單株抗體(mAb)係胺基酸序列一致之單特異性抗體。其可藉由融合瘤技術自代表產生特異性抗體之B細胞與骨髓瘤(B細胞癌症)細胞之融合之純系之雜交細胞系(稱為融合瘤)產生(Kohler G、Milstein C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature 1975；256：495-7)。或者，單株抗體可在宿主細胞中藉由重組表現產生(Norderhaug L、Olafsen T、Michaelsen TE，Sandlie I.(1997年5月)。「Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.」.J Immunol Methods 204(1)：77-87。

對於在人類中應用，通常期望降低最初源自其他物種(如小鼠)之抗體之免疫原性。此可藉由嵌合抗體之構築或藉由稱為「人類化」之過程進行。在此背景下，「嵌合抗體」應理解為包含源自一種物種(例如小鼠)之序列部分(例如可變結構域)與源自不同物種(例如人類)之序列部分(例如恆定結構域)之融合之抗體。「人類化抗體」係包含最初源自非人類物種之可變結構域且其中某些胺基酸已突變以使得該可變結構域之總體序列更類似於人類可變結構域之序列的抗體。抗體嵌合化及人類化之方法為業內所熟知(Billetta R、Lobuglio AF.「Chimeric antibodies」.Int Rev Immunol.1993；10(2-3)：165-76；Riechmann L、Clark M、Waldmann H、Winter G(1988).「Reshaping human antibodies for therapy」.Nature：332：323)。

此外，已研發出藉由(例如)噬菌體展示或使用轉基因動物基於源自人類基因體之序列產生抗體之技術(WO 90/05144；D.Marks、H.R.Hoogenboom、T.P.Bonnert、J.McCafferty、A.D.Griffiths及G.Winter(1991)「By-passing immunisation.Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage.」J.Mol.Biol.,222,581-597；Knappik等人，J.Mol.Biol.296：57-86,2000；S.Carmen及L.Jermutus,「Concepts in antibody phage display」.Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2)：189-203；Lonberg N、Huszar D.「Human antibodies from transgenic mice」.Int Rev Immunol.1995；13(1)：65-93；Brüggemann M、Taussig MJ.「Production of human antibody repertoires in transgenic mice」.Curr Opin Biotechnol.1997年8月；8(4)：455-8)。在本發明之上下文中，該等抗體係「人類抗體」。

本發明之抗體分子亦包括分子中保留抗原結合性質之片段，如Fab、Fab’或F(ab’)₂片段。該等片段可藉由(例如)蛋白水解消化而片段化抗體分子或藉由重組表現該等片段獲得。舉例而言，可藉助常規技術(例如使用木瓜酶或胃蛋白酶)實現抗體分子消化(WO 94/29348)。木瓜酶消化抗體通常產生兩個一致的抗原結合抗體片段，其稱作Fab片段，其各自具有單一抗原結合位點及殘留Fc片段。胃蛋白酶治療產生F(ab')₂。在Fab分子中，可變結構域各自融合至較佳人類起源之免疫球蛋白恆定結構域。因此，重鏈可變結構域可融合至CH₁結構域(所謂的Fd片段)，且輕鏈可變結構域可融合至CL結構域。Fab分子可藉由在宿主細胞中重組表現各別核酸產生，參見下文。

已研發出多種用於將抗體分子之可變結構域或源自該等可變結構域之分子置於不同分子環境中之技術。根據本發明，彼等亦應視為「抗體」。一般而言，該等抗體分子之大小小於天然抗體分子，且可包含單一胺基酸鏈或若干胺基酸鏈。舉例而言，單鏈可變片段(scFv)係抗體分子之重鏈及輕鏈之可變區與短的連接體、通常絲胺酸(S)或甘胺酸(G)連接在一起之融合(WO 88/01649；WO 91/17271；Huston等人；International Reviews of Immunology，第10卷，1993,195-217)。「單一結構域抗體」或「奈米抗體」在單一Ig樣結構域中具有抗原結合位點(WO 94/04678；WO 03/050531,Ward等人，Nature.1989年10月12日；341(6242)：544-6；Revets等人Expert Opin Biol Ther.5(1)：111-24,2005)。可將一或多種對相同抗原或不同抗原具有結合特異性之單一結構域抗體連接在一起。雙價抗體係由兩個包含兩個可變結構域之胺基酸鏈組成之二價抗體分子(WO 94/13804,Holliger等人，Proc Natl Acad Sci U S A.1993年7月15日；90(14)：6444-8)。抗體樣分子之其他實例係免疫球蛋白超家族抗體(IgSF；Srinivasan及Roeske,Current Protein Pept.Sci.2005,6(2)：185-96)。不同概念產生所謂的小模組免疫醫藥劑(SMIP)，該小模組免疫醫藥劑包含連接至單鏈鉸鏈及不含恆定結構域CH1之效應物結構域之 Fv結構域(WO 02/056910)。

抗體分子可融合(作為融合蛋白)或以其他方式連接(藉由共價鍵或非共價鍵)至對抗體分子之性質具有期望影響之其他分子實體。舉例而言，尤其在單鏈抗體或結構域抗體之情形下，可期望改良抗體分子之藥物動力學性質，例如在體液(例如血液)中之穩定性。就此而言，已研發出多種尤其用於延長該等抗體分子在循環中之半衰期之技術，例如聚乙二醇化(WO 98/25971；WO 98/48837；WO 2004081026)，使抗體分子融合或以其他方式共價附接至對血清蛋白(如白蛋白)具有親和性之另一抗體分子(WO 2004041865；WO 2004003019)，或以具有所有或部分血清蛋白(如白蛋白或運鐵蛋白)之融合蛋白表現抗體分子(WO 01/79258)。

術語「表位」及「抗原決定簇」可互換使用，其係指由抗原結合分子(例如本發明之抗體分子)且更特定而言由該等分子之抗原結合位點識別之大分子(例如多肽)的一部分。表位界定抗體分子之最小結合位點，且因此代表抗體分子之特異性之靶標。

可「結合」、「結合至」、「特異性結合」或「特異性結合至」某一表位、抗原或蛋白質(或其至少一部分、片段或表位)、「對其具有親和性」及/或「對其具有特異性」之抗體分子據稱係「針對(against或directed against)該表位、抗原或蛋白質或關於該表位、抗原或蛋白質為「結合」分子。

通常，術語「特異性」通常係指特定抗原結合分子或抗原結合蛋白(例如免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變結構域)可結合之不同類型抗原或表位的數量。抗原結合蛋白之特異性可基於其親和力及/或親合力測定。親和力由抗原與抗原結合蛋白之解離平衡常數(K_D)代表，其係表位與抗原結合蛋白上之抗原結合位點之間之結合強度的量度：K_D值愈小，則表位與抗原結合分子之間之結合強度愈強(或者，親和力亦可表示為親和力常數(K_A)，其係1/K_D)。如熟習此項技術者所明瞭(例如，基於本文其他揭示內容)，視目標特異性抗原而定，可以本身已知方式測定親和力。親合力係抗原結合分子(例如本發明之抗體)與相關抗原之間之結合強度之量度。親合力與表位與其在抗原結合分子上之抗原結合位點之間之親和力及抗原結合分子上存在之相關結合位點的數量有關。

通常，抗原結合蛋白(例如本發明之抗體分子)將以如下解離常數(K_D)結合：10E-5莫耳/公升(M)至10E-14莫耳/公升(M)或更少，且較佳10E-7莫耳/公升(M)至10E-14莫耳/公升(M)或更少，更佳10E-8莫耳/公升至10E-14莫耳/公升，且甚至更佳10E-11至10E-13(如在(例如)業內已知之Kinexa分析中測得)，及/或以如下締合常數(K_A)結合：至少10E7 ME-1、較佳至少10E8 ME-1、更佳至少10E9 ME-1、例如至少10E11 ME-1。大於10E-4 M之任一K_D值通常視為指示非特異性結合。較佳地，本發明之抗體將以小於500nM、較佳小於200nM、更佳小於10nM、例如小於500pM之K_D結合至期望抗原。抗原結合蛋白與抗原或表位之特異結合可以本身已知之任一適宜方式來確定，包括(例如)本文所闡述之分析、斯卡查德分析(Scatchard analysis)及/或競爭性結合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夾心競爭分析)及其業內本身已知之不同變化形式。

抗體分子之結合親和性可藉由稱為親和力成熟之過程增強(Marks等人，1992,Biotechnology 10：779-783；Barbas等人，1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813；Shier等人，1995,Gene 169：147-155)。因此，本發明亦涵蓋親和力成熟抗體。

術語「競爭」或「交叉競爭」在本文中可互換使用，其係指抗體分子干擾抗體分子(例如本發明之抗PD1或LAG3抗體分子)與靶標(例如人類PD1或LAG3)結合之能力。干擾結合可為直接或間接的(例如，藉助抗體分子或靶標之別位調節)。抗體分子能干擾另一抗體分子與靶標結合之程度及因此其是否可視為競爭可使用競爭結合分析(例如，FACS分析、ELISA或BIACORE分析)來確定。在一些實施例中，競爭結合分析係定量競爭分析。在一些實施例中，在競爭結合分析(例如，本文所闡述之競爭分析)中，當第一抗PD1或LAG3抗體分子與靶標之結合降低10%或更多、例如20%或更多、30%或更多、40%或更多、50%或更多、55%或更多、60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、98%或更多、99%或更多時，將該第一抗體分子視為與另一抗PD1或LAG3抗體分子競爭結合至靶標。

本文所揭示之組合物及方法涵蓋具有指定序列或與該等指定序列基本上一致或類似之序列(例如，與指定序列至少85%、90%、95%一致或更高程度一致之序列)之多肽及核酸。在胺基酸序列之情形中，術語「基本上一致」在本文中用於指第一胺基酸含有足夠或最少數量之i)與第二胺基酸序列中之所比對胺基酸殘基一致之胺基酸殘基，或ii)第二胺基酸序列中之所比對胺基酸殘基之保守取代，使得第一及第二胺基酸序列可具有共同結構結構域及/或共同功能活性。舉例而言，含有與參照序列(例如本文提供之序列)具有至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99一致性%之共同結構結構域之胺基酸序列。在核苷酸序列之情形中，術語「實質上一致」在本文中用於指第一核酸序列含有足夠或最少數量之與另一核酸序列中之所比對核苷酸一致之核苷酸，使得第一及第二核苷酸序列編碼具有共同功能活性之多肽或編碼共同結構多肽結構域或共同功能多肽活性。舉例而言，與參照序列具有至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99一致性%之核苷酸序列。

術語「一致」或「一致性百分比」在兩個或更多個核酸或多肽序列之情形中係指兩個或更多個序列或子序列在針對最大對應性比較及比對時係相同的或具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基。為測定一致性%，出於最佳比較目的對序列進行比對(例如，可將空位引入第一胺基酸或核酸序列之序列中用於與另一胺基或核酸序列進行最佳比對)。然後比較相應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之位置由與第二序列中之相應位置相同之胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則該等分子在該位置係一致的。兩個序列之間之一致性%隨該等序列共有之一致位置數變化而變化(即，一致性%=一致位置之數量/位置(例如，重疊位置)之總數×100)。在一些實施例中，在若適當將空位引入所比較之兩個序列(例如，不包括延伸超過所比較序列之其他序列)內之後，該兩個序列具有相同長度。舉例而言，當比較可變區序列時，不考慮前導序列及/或恆定結構域序列。對於兩個序列之間之序列比較，「相應」CDR係指兩個序列中相同位置之CDR(例如，每一序列之CDR-H1)。

可使用數學算法實現兩個序列之間一致性%或類似性%之測定。較佳地，用於比較兩個序列之數學算法之非限制性實例係如在Karlin及Altschul，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中改編之Karlin及Altschul，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268之算法。將此一算法納入Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215：403-410之NBLAST及XBLAST程式中。BLAST核苷酸檢索可利用NBLAST程式(評分=100，字長=12)實施以獲得與編碼所關注蛋白質之核酸同源之核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可利用XBLAST程式(評分=50，字長=3)實施以獲得與所關注蛋白質同源之胺基酸序列。為獲得加空位比對用於比較目的，如Altschul等人1997,Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述利用加空位BLAST。或者，可使用PSI-Blast實施迭代檢索，從而檢測分子之間之遠距離關係(同上)。在利用BLAST、加空位BLAST及PSI-Blast程式時，可使用各別程式(例如，XBLAST及NBLAST)之缺省參數。用於比較序列之數學算法之另一較佳非限制性實例係Myers及Miller,CABIOS(1989)之算法。將此一算法納入ALIGN程式(版本2.0)中，該程式係GCG序列比對軟體包之一部分。當利用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120加權殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4。用於序列分析之其他算法為業內已知且包括ADVANCE及ADAM，如Torellis及Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10：3-5中所闡述；及FASTA，如Pearson及Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-8中所闡述。在FASTA內，ktup係設置檢索究之敏感度及速度之控制選項。若ktup=2，則藉由察看比對殘基對來發現所比較兩個序列中之類似區；若ktup=1，則檢查單一比對胺基酸。對於蛋白質序列可將ktup設為2或1，或對於DNA序列將其設為1至6。若ktup未指定，則缺省值對於蛋白質為2且對於DNA為6。或者，可使用CLUSTAL W算法實施蛋白質序列比對，如Higgins等人，Methods Enzymol.266：383-402所闡述。

將根據標準的三個字母或一個字母胺基酸代碼指示胺基酸殘基，如業內通常所知並認可。在比較兩個胺基酸序列時，術語「胺基酸差異」係指與第二序列相比在參照序列位置處的所指示數量之胺基酸殘基的***、缺失或取代。在取代之情形下，該(等)取代較佳為保守胺基酸取代，此意指胺基酸殘基經具有類似化學結構且對多肽之功能、活性或其他生物性質具有極小或基本上無影響之另一胺基酸殘基替代。該等保守胺基酸取代已為業內自(例如)WO1998/49185所熟知，其中保守胺基酸取代較佳係以下群組(i)-(v)內之一個胺基酸經同一群組中之另一胺基酸殘基取代的取代：(i)小的脂肪族、非極性或輕微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)極性、帶負電荷之殘基及其(不帶電荷)醯胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)極性、帶正電荷之殘基：His、Arg及Lys；(iv)大的脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳香族殘基：Phe、Tyr及Trp。尤佳保守胺基酸取代係如下：Ala取代為GIy或取代為Ser；Arg取代為Lys；Asn取代為Gln或取代為His；Asp取代為GIu；Cys取代為Ser；Gln取代為Asn；Glu取代為Asp；Gly取代為Ala或取代為Pro；His取代為Asn或取代為Gln；Ile取代為Leu或取代為Val；Leu取代為Ile或取代為Val；Lys取代為Arg、取代為Gln或取代為Glu；Met取代為Leu、取代為Tyr或取代為Ile；Phe取代為Met、取代為Leu或取代為Tyr；Ser取代為Thr；Thr取代為Ser；Trp取代為Tyr；Tyr取代為Trp或取代為Phe；Val取代為Ile或取代為Leu。

術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」(若單鏈)在本文中可互換使用。

術語「核酸序列」、「核酸」、「核苷酸序列」或「多核苷酸序列」及「多核苷酸」可互換使用。

本文所用術語「經分離」係指自其原始或天然環境(例如，若其為天然存在則為天然環境)移出之材料。例如，活動物中存在之天然多核苷酸或多肽並非分離的，但藉由人類介入自天然系統中之一些或所有共存材料分離之相同多核苷酸或多肽係分離的。該等多核苷酸可為載體之一部分及/或該等多核苷酸或多肽可為組合物之一部分，且由於該載體或組合物並非其在自然界中發現所處之環境之一部分而仍經分離。

較佳地，核酸將為表現載體之一部分，其中該核酸分子可操作連接至至少一個調節序列，其中該調節序列可為啟動子、增強子、或終止子序列、且最佳異源啟動子、增強子或終止子序列。

關於抗PD1抗體之本發明實施例

如上文所詳述，PD1在調控T細胞活性及因此免疫系統活性中起重要作用。在一系列不同癌症情形中已顯示拮抗性抗PD1抗體分子可增加T細胞活性，藉此活化免疫系統以攻擊腫瘤且因此治療癌症。

然而，現有抗PD1抗體分子遭受與副作用亦及大部分患者不能對治療產生反應相關之問題。因此，業內需要鑑別在與先前技術相比時具有改良之治療指數之替代抗PD1抗體分子。該等分子可以單一療法使用，亦及與其他治療劑、尤其T細胞活性之其他調節劑組合使用。

鑒於此背景，本發明者尋求生成其他抗PD1抗體。自針對PD1之前體鼠類抗體(稱為77E11)開始，本發明者製備了5種人類化衍生物，該等衍生物係本發明之標的抗PD1抗體分子。本發明之抗PD1抗體分子稱為PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。

使用活體外T細胞活化分析(在實例4中進一步闡述)，本發明者檢查了本發明之代表性抗PD1抗體之功能特徵。如在實例12及圖8中可看出，與參考抗PD1/LAG3抗體組合相比，所測試抗體在與抗LAG3抗體組合時能將T細胞活化誘導至更高程度，此表明其較參考抗PD1抗體具有更加合意之治療活性。

如可瞭解，本發明之抗PD1抗體較先前技術參考抗PD1抗體更有效地誘導T細胞活化之此驚人能力表明，其能夠用於以較先前技術參考抗PD1抗體更低之劑量量來治療癌症，此可容許用於治療應用且具有更少不期望之副作用。

受到該數據之鼓勵，本發明者進一步研究本發明之抗PD1抗體分子之各種其他功能特徵。活體內藥物動力學性質之確定包括在此評價內。如實例7中所概述且如圖5中所顯示，如在食蟹猴中所量測，對於本發明之抗PD1抗體以1mg/kg之靜脈內劑量之實例所觀察到之終末消除半衰期較參考先前技術抗PD1抗體高1.5倍至2倍。

與業內已知之抗PD1抗體相比，此表明本發明之抗PD1抗體具有11天之血清半衰期。此與在0.3-3mg/kg之劑量範圍內通常具有4天至6天之半衰期之已知之參考抗PD1抗體分子形成對比，如自隨附實例可看出。所主張抗體分子之此驚人特徵可容許利用本發明抗體以較業內之彼等抗體更少之頻率治療患者，此可翻譯成必須提供之抗體量降低，形式為投與頻率降低或欲使用抗體之量降低。考慮到如上文所論述抗PD1抗體分子可在患者中誘導不期望之副作用，那麼本發明之抗PD1抗體可具有較先前技術顯著且驚人之臨床優點。

因此，本發明之第一態樣提供抗PD1抗體分子，其包含：(a)包含SEQ ID NO：1(hcCDR1)、SEQ ID NO：2(hcCDR2)及SEQ ID NO：3(hcCDR3)之胺基酸序列之重鏈CDR且具有包含SEQ ID NO：4(lcCDR1)、SEQ ID NO：5(lcCDR2)及SEQ ID NO：6(lcCDR3)之胺基酸序列之輕鏈CDR；或，(b)包含SEQ ID NO：7(hcCDR1)、SEQ ID NO：8(hcCDR2)及SEQ ID NO：9(hcCDR3)之胺基酸序列之重鏈CDR且具有包含SEQ ID NO：10(lcCDR1)、SEQ ID NO：11(lcCDR2)及SEQ ID NO：12(lcCDR3)之胺基酸序列之輕鏈CDR；或，(c)包含SEQ ID NO：13(hcCDR1)、SEQ ID NO：14(hcCDR2)及SEQ ID NO：15(hcCDR3)之胺基酸序列之重鏈CDR且具有包含SEQ ID NO：16(lcCDR1)、SEQ ID NO：17(lcCDR2)及SEQ ID NO：18(lcCDR3)之胺基酸序列之輕鏈CDR。

如上文所概述，本發明之抗PD1抗體分子稱為PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。本文提供容許容易地鑑別本發明之特異性抗PD1抗體分子之個別胺基酸序列之序列表。在實例2中在表1中提供匯總。

除如本文所闡述之CDR序列以外，本發明抗體分子包括免疫球蛋白框架區(FR)序列。該等序列較佳在人類中無免疫原性，且因此較佳為人類或人類化FR序列。適宜的人類或人類化FR序列為業內已知。自本文所顯示之實施例可獲得揭示完整抗體分子及藉此CDR序列以及FR序列之尤佳FR序列。

製備本發明第一態樣之抗體分子之方法已為業內熟知，且熟習此項技術者能夠容易地製備具有本發明第一態樣之特徵之抗體分子。該等方法之實例於下文中提供。

為產生包含兩條完整重鏈及兩條完整輕鏈之抗體，如IgG1或IgG4類型之彼等，參見Norderhaug等人，J Immunol Methods 1997,204(1)：77-87；Kipriyanow及Le Gall,Molecular Biotechnology 26：39-60,2004； Shukla等人，2007,J.Chromatography B,848(1)：28-39。

藉由在宿主細胞(如大腸桿菌(E.coli)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)或哺乳動物細胞系(例如CHO或NS0))中重組表現編碼scFv構築體之核酸而產生功能scFv分子來製造scFv抗體之製程亦為人已知(Rippmann等人，Applied and Environmental Microbiology 1998,64(12)：4862-4869；Yamawaki等人，J.Biosci.Bioeng.2007,104(5)：403-407；Sonoda等人，Protein Expr.Purif.2010,70(2)：248-253)。

為免生疑問，下文針對本發明之第一態樣列示之特定實施例中之每一者亦可視為本發明之獨立態樣。

本發明第一態樣之較佳實施例係其中該抗體分子係人類化抗體分子。

本發明第一態樣之另一較佳實施例係其中該抗體分子係單株抗體、Fab、F(ab')2、Fv或scFv。

術語「人類化」、「Fab」、「F(ab')2」、「Fv」及「scFv」已為業內熟知且在本文中進一步論述於說明書之定義部分中。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恆定區組成之群之重鏈恆定區。較佳地，重鏈恆定區係具有S241P突變之IgG4。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有為κ或λ之輕鏈恆定區。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含與SEQ ID NO：19、21、23、25及27中之任一者至少85%一致之胺基酸序列之重鏈可變結構域。較佳地，該抗體分子具有包含SEQ ID NO：19、21、23、25及27中之任一者之胺基酸序列之重鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含與SEQ ID NO：20、22、24、26及28中之任一者至少85%一致之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。較佳地，該抗體分子具有包含SEQ ID NO：20、22、24、26及28之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

計算胺基酸序列一致性之方法已為業內熟知且在本文中進一步論述於說明書之定義部分中。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之重鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之重鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之重鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之重鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之重鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列之重鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之重鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列之重鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之重鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之重鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子具有包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之輕鏈。

對於所有上述實施例，應瞭解藉由使用術語「包含(comprising)」，意欲亦包括其中各別結構域或分子由所指示胺基酸序列「組成」之實施例。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子能以小於10nM之解離常數(KD)結合至人類PD1。

在一些實施例中，抗PD1抗體分子能以高親和力結合至人類PD1及食蟹猴PD1。在一些實施例中，高親和力係指小於10nM(例如9nM、8nM、7nM、6nM或更低)之K_D，如藉由SPR所量測。使用SPR測定K_D之方案係於隨附實例中提供。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子不結合至小鼠PD1。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子能減少人類PD-L1/L2與人類PD1之結合。確定人類PD-L1/L2與人類PD1之結合之分析係於隨附實例中提供。

在一些實施例中，抗PD1抗體分子能以小於10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM或4nM或更低之IC₉₀抑制配體PD-L1及PD-L2結合至PD1。測定IC₉₀之方案係於隨附實例中提供。

在較佳實施例中，抗PD1抗體分子能增強抗原特異性T細胞反應。測定抗原特異性T細胞反應之分析於實例4中提供。

本發明之另一態樣提供編碼本發明第一態樣中之任一者之抗PD1抗體分子之重鏈可變結構域及/或輕鏈可變結構域之經分離核酸分子。

較佳地，核酸分子包含分別編碼SEQ ID NO 19、21、23、25或27之重鏈可變結構域之SEQ ID NO：71、73、75、77或79之核苷酸序列。較佳核酸分子包含分別編碼SEQ ID NO 20、22、24、26或28之輕鏈可變結構域之SEQ ID NO：72、74、76、78或80之核苷酸序列。

本發明之另一態樣提供含有包含編碼本發明之抗PD1抗體分子之重鏈可變結構域及/或輕鏈可變結構域之核苷酸序列之DNA分子的表現載體。較佳地，表現載體含有DNA分子，該DNA分子包含SEQ ID NO：71及/或SEQ ID NO：72之核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：73及/或SEQ ID NO：74之核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：75及/或SEQ ID NO：76之核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：77及/或SEQ ID NO：78之核苷酸序列或包含SEQ ID NO：79及/或SEQ ID NO：80之核苷酸序列。

較佳地，表現載體另外包含分別編碼重鏈之恆定結構域及/或輕鏈之恆定結構域之核酸分子、較佳DNA分子，該核酸分子係連接至分別編碼重鏈可變結構域及/或輕鏈可變結構域之核酸分子、較佳DNA分子。

在尤佳實施例中，可使用兩個表現載體，其中一者用於表現重鏈，另一者用於表現輕鏈，該兩個表現載體然後可均轉染至宿主細胞中用於重組蛋白表現。

較佳地，表現載體將為包含可操作連接至至少一個調節序列之該(等)核酸分子之載體，其中該調節序列可為啟動子、增強子或終止子序列，且最佳異源啟動子、增強子或終止子序列。

本發明之核酸可以本身已知之方式(例如，藉由自動DNA合成及/或重組DNA技術)基於本文所給出之關於本發明抗體之胺基酸序列的資訊製備或獲得。

在另一態樣中，本發明係關於宿主細胞，其具有編碼本發明抗PD1抗體分子之重鏈之表現載體及編碼本發明抗PD1抗體分子之輕鏈之表現載體。

根據尤佳實施例，該等宿主細胞係諸如哺乳動物細胞等真核細胞。在另一實施例中，該等宿主細胞係細菌細胞。其他有用細胞係酵母細胞或其他真菌細胞。

適宜哺乳動物細胞包括(例如)CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞及諸如此類。然而，亦可使用業內用於表現異源蛋白之兩棲動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞及任何其他細胞。

關於抗LAG3抗體分子及與抗PD1抗體之組合之本發明實施例

亦已顯示拮抗性抗PD1抗體與靶向其他免疫細胞檢查點抑制劑之抗體分子之組合可加強拮抗性抗PD1抗體之抗癌性質。一種該檢查點抑制劑稱為LAG3。

與PD1一樣，LAG3在介導T細胞活性中似乎起作用。此外，業內已知PD1路徑及LAG3之雙重阻斷較阻斷任一單獨分子對抗腫瘤免疫性更有效。

鑒於此背景，本發明者尋求生成可單獨或與本發明之抗PD1抗體分子組合使用之其他抗LAG3抗體分子。自針對LAG3之前體鼠類抗體(稱為496G6)開始，本發明者製備了五種人類化衍生物，該等衍生物係本發明之標的抗LAG3抗體分子。本發明之抗LAG3抗體分子稱為LAG3-1、LAG3-2、LAG3-3、LAG3-4及LAG3-5。

使用活體外T細胞活化分析(進一步概述於實例12中)，本發明者檢查了本發明之代表性抗LAG3抗體分子之功能特徵。如在實例12及圖8中可看出，本發明之抗LAG3抗體分子與本發明之抗PD1抗體分子之組合驚人地優於業內已知之參考抗PD1/LAG3抗體組合。

如可瞭解，本發明抗LAG3抗體分子與本發明抗PD1抗體分子之組合之此優越性表明其能夠用於以較先前技術抗體治療更低之劑量量來治療癌症，此可容許用於治療應用且具有更少不期望之副作用。

考慮到如上文所論述抗PD1抗體分子及抗LAG3抗體分子可在患者中誘導不期望之副作用，那麼本發明之抗PD1抗體及抗LAG3抗體可因使用更低劑量及/或更不頻繁之投與方案而可具有較先前技術顯著且驚人的臨床優點。

受到該數據之鼓舞，本發明者進一步研究了本發明之抗LAG3抗體分子之各種其他功能特徵。此評價包括確定由本發明之抗LAG3抗體分子之實例結合之表位。如在實例11中可看出，本發明者確定本發明之抗LAG3抗體分子可結合至人類LAG-3之兩個不同區LLRRAGVT(SEQ ID NO：111)及/或YRAAVHLRDRA(SEQ ID NO：112)。

據本發明者最熟知，已知之先前技術抗LAG3抗體皆沒有與本發明之抗LAG3抗體分子相同之表位結合特性。儘管不希望受限於任何具體理論，但本發明者推測在與先前技術分子相比時本發明抗LAG3抗體分子與本發明抗PD1抗體之組合之驚人改良之有效性可歸因於本發明之抗LAG3抗體分子之表位結合特性。

因此，本發明之另一態樣提供經分離抗LAG3抗體分子，其中該抗LAG3抗體分子結合包含胺基酸序列LLRRAGVT(SEQ ID NO：111)及/或 YRAAVHLRDRA(SEQ ID NO：112)之人類LAG3之表位。該等分子在本文中稱為「本發明抗LAG3抗體分子」。

製備本發明之具有表位結合特徵之抗LAG3抗體分子之方法為業內所熟知。

生成抗體及抗體片段之方法為業內所熟知。舉例而言，可經由若干方法中之任一者生成抗體，該等方法採用誘導活體內產生抗體分子、篩選免疫球蛋白文庫(Orlandi等人，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：3833-3837；Winter等人1991,Nature 349：293-299)或藉由培養物中之細胞系生成單株抗體分子。該等方法包括(但不限於)融合瘤技術、人類B細胞融合瘤技術及艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus，EBV)-融合瘤技術(Kohler等人1975.Nature 256：4950497；Kozbor等人1985.J.Immunol.Methods 81：31-42；Cote等人1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030；Cole等人1984.Mol.Cell.Biol.62：109-120)。

使用該等方法，熟習此項技術者可以常規方式製備具有對LAG3具有必需特異性之結合位點之抗體。然後可使用表位定位來篩選候選者抗體分子，以確定該等候選者抗體分子是否結合至與本發明抗LAG3抗體所需表位序列相同之表位序列。該等表位定位方法在業內已為人熟知且係常規的且可被熟習此項技術者容易地採用。此外，在本說明書之實例11中提供該方法之實例。

為免生疑問，亦可將下文針對本發明抗LAG3抗體所列示之特定實施例中之每一者視為本發明之獨立態樣。

另一較佳實施例係其中該抗體分子係單株抗體、Fab、F(ab')2、Fv或scFv。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恆定區組成之群之重鏈恆定區。較佳地，重鏈恆定區係具有S241P突變之IgG4。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有為κ或λ之輕鏈恆定區。

另一較佳實施例係其中該抗LAG3抗體分子包含：(a)包含SEQ ID NO：39(hcCDR1)、SEQ ID NO：40(hcCDR2)及SEQ ID NO：41(hcCDR3)之胺基酸序列之重鏈CDR且具有包含SEQ ID NO：42(lcCDR1)、SEQ ID NO：43(lcCDR2)及SEQ ID NO：44(lcCDR3)之胺基酸序列之輕鏈CDR；或，(b)包含SEQ ID NO：45(hcCDR1)、SEQ ID NO：46(hcCDR2)及SEQ ID NO：47(hcCDR3)之胺基酸序列之重鏈CDR且具有包含SEQ ID NO：48(lcCDR1)、SEQ ID NO：49(lcCDR2)及SEQ ID NO：50(lcCDR3)之胺基酸序列之輕鏈CDR。

如上文所概述，本發明之抗LAG3抗體分子稱為LAG3-1、LAG3-2、LAG3-3、LAG3-4及LAG3-5。本文提供容許容易地鑑別本發明之特異性抗LAG3抗體分子之個別胺基酸序列之序列表。在實例9中在表6中提供匯總。

製備本發明抗LAG3抗體分子之方法已為業內熟知，且熟習此項技術者能夠容易地製備抗體分子。上文關於本發明之第一態樣提供了該等方法之實例。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含與SEQ ID NO：51、53、55、57及59中之任一者至少85%一致之胺基酸序列之重鏈可變結構域。較佳地，該抗體分子具有包含SEQ ID NO：51、53、55、57及59中之任一者之胺基酸序列之重鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有輕鏈可變結構域包含與SEQ ID NO：52、54、56、58及60中之任一者至少85%一致之胺基酸序列。較佳地該抗體分子具有包含SEQ ID NO：52、54、56、58及60之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之重鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之重鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之重鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之重鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之重鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之重鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之重鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之重鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之重鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之重鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列之輕鏈。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子具有包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之輕鏈。

對於所有上文實施例，應瞭解藉由使用術語「包含(comprising)」，亦意欲其中包括各別分子或結構域由所指示胺基酸序列「組成」之實施例。

在較佳實施例中，抗LAG3抗體分子能以小於1nM之解離常數(KD)結合至人類LAG3。

在一些實施例中，抗LAG3抗體分子能以高親和力結合至人類LAG3及食蟹猴LAG3。在一些實施例中，高親和力係指小於0.5nM(例如0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM或更低)之K_D，如藉由SPR所量測。使用SPR測定K_D之方案係於隨附實例中提供。

在另一實施例中，抗LAG3抗體分子不結合至小鼠LAG3。

在另一實施例中，抗LAG3抗體分子能具有以下性質中之一或多者：(i)結合至食蟹猴LAG3；(ii)缺乏至鼠類LAG3之結合；(iii)抑制LAG3結合至MHC II；及(iv)刺激免疫反應。

本發明之另一態樣提供本發明之抗LAG3抗體分子，其用於醫學中。

本發明之另一態樣提供編碼本發明抗LAG3抗體分子之重鏈可變結構域及/或輕鏈可變結構域之經分離核酸分子。較佳核酸分子包含分別編碼 SEQ ID NO：51、53、55、57或59之重鏈可變結構域之SEQ ID NO：91、93、95、97或99之核苷酸序列。較佳核酸分子包含分別編碼SEQ ID NO：52、54、56、58或60之輕鏈可變結構域之SEQ ID NO：92、94、96、98或100之核苷酸序列。

本發明之另一態樣提供含有包含編碼本發明抗LAG3抗體分子之重鏈及/或輕鏈之核苷酸序列之DNA分子之表現載體。較佳表現載體含有DNA分子，該DNA分子包含SEQ ID NO：101及/或SEQ ID NO：102之核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：103及/或SEQ ID NO：104之核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：105及/或SEQ ID NO：106之核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：107及/或SEQ ID NO：108之核苷酸序列或包含SEQ ID NO：109及/或SEQ ID NO：110之核苷酸序列。

本發明之核酸可以本身已知之方式(例如，藉由自動DNA合成及/或重組DNA技術)基於本文所給出之關於本發明抗體之胺基酸序列的資訊製備或獲得，如上文關於本發明之抗PD1抗體進一步闡述。

在另一態樣中，本發明係關於宿主細胞，其具有編碼本發明抗LAG3抗體分子之重鏈之表現載體及編碼本發明抗LAG3抗體分子之輕鏈之表現載體。

根據尤佳實施例，該等宿主細胞係諸如哺乳動物細胞等真核細胞，例如上文已結合抗PD1抗體實施例闡述之彼等。在另一實施例中，該等宿主細胞係細菌細胞。其他有用細胞係酵母細胞或其他真菌細胞。

關於包括抗PD1抗體及抗LAG3抗體之醫藥組合物、多部分套組、方法及用途之本發明實施例.

本發明之另一態樣提供多部分套組，其包含本發明之抗PD1抗體分子及抗LAG3抗體分子。較佳抗LAG3抗體分子係本發明之抗LAG3抗體分子。

本發明之另一態樣提供多部分套組，其包含本發明之抗LAG3抗體分子及抗PD1抗體分子。較佳抗PD1抗體分子係本發明之抗PD1抗體分子。或者，可在該多部分套組中使用另一抗PD1抗體，例如派姆單抗或尼沃魯單抗。

本發明之另一態樣提供包含本發明之抗PD1抗體分子之醫藥組合物。本發明之實施例係其中醫藥組合物進一步包含抗LAG3抗體分子。較佳抗LAG3抗體分子係本發明之抗LAG3抗體分子。

本發明之另一態樣提供包含本發明之抗LAG3抗體分子之醫藥組合物。本發明之實施例係其中醫藥組合物進一步包含抗PD1抗體分子。較佳抗PD1抗體分子係本發明之抗PD1抗體分子。或者，可在該醫藥組合物中使用另一抗PD1抗體，例如派姆單抗或尼沃魯單抗。

熟習此項技術者將明瞭，基於上文因此亦揭示用於使用上文所闡述之本發明抗體分子治療疾病(如下文更詳細的指定)之醫藥組合物，以及使用該等本發明之醫藥組合物或抗體分子治療疾病(如下文更詳細的指定)之方法。

為免生疑問，多部分套組及本發明醫藥組合物可包含如上文所闡述之本發明特異性抗PD1抗體分子及/或本發明抗LAG3抗體分子中之任一者。

當本發明之抗PD1抗體分子及本發明之抗LAG3抗體分子同時經由相同投與途徑投與時，其可作為不同醫藥調配物或組合物或作為組合之醫藥調配物或組合物之一部分投與。而且，當本發明抗PD1抗體分子及本發明抗LAG3抗體分子欲作為組合治療方案之一部分使用時，該等抗體中之每一者可以與當單獨使用一種抗體時所用之量相同之量並根據與其方案相同之方案來投與，且該組合使用可或可不引起協同效應。然而，當組合使用抗體引起協同效應時，亦可降低抗體中之一者或二者之量，同時仍達成期望之治療作用。此可用於(例如)避免、限制或減輕與當該等抗體中之一或多者以其常用量使用時其之使用相關之任何不期望副作用，同時仍獲得期望之藥理學或治療效應。

醫藥組合物、投與方法、劑量

本發明進一步係關於用於治療疾病(如下文更詳細的指定)之醫藥組合物，其中該等組合物包含至少一種本發明抗體分子。本發明進一步涵蓋使用至少一種如前文所闡述之本發明抗體分子或醫藥組合物治療疾病(如下文更詳細的指定)之方法，且進一步涵蓋用於藉由使用該等本發明抗體分子或醫藥組合物治療該等疾病之藥劑之製備。

本發明之抗體分子及/或包含其之組合物可以任一適宜方式投與有需要之患者，此取決於欲使用之特定醫藥調配物或組合物。因此，本發明之抗體分子及/或包含其之組合物可(例如)經靜脈內(i.v.)、經皮下(s.c.)、經肌內(i.m.)、經腹膜內(i.p.)、經皮、經口、經舌下(例如以置於舌下且在舌下吸附穿過黏膜進入毛細血管網中之舌下錠劑、噴霧或滴劑之形式)、經鼻(內)(例如以鼻噴霧及/或氣溶膠之形式)、經局部、藉助栓劑、藉由吸入或任何其他適宜方式以有效量或量或劑量來投與。

根據適於治療及/或緩和欲治療或緩和之疾病、病症或病況之治療方案投與本發明抗體分子及/或包含其之組合物。臨床醫師通常將能夠確定適宜治療方案，此取決於諸如以下等因素：欲治療或緩和之疾病、病症或病況、疾病之嚴重性、其症狀之嚴重性、欲使用之本發明之特定抗體分子、欲使用之特定投與途徑及醫藥調配物或組合物、患者之年齡、性別、重量、飲食、一般狀況及臨床醫師所熟知之類似因素。通常，治療方案將包含以治療有效量或劑量投與一或多種本發明抗體分子或一或多種包含其之組合物。

通常，為治療及/或緩和本文所提及之疾病、病症及病況且端視欲治療之特定疾病、病症或病況、欲使用之本發明之特定抗體分子之效能、特定投與途徑及所使用之特定醫藥調配物或組合物而定，本發明之抗體分子通常將以以下之量連續地(例如藉由輸注)或更佳以單一劑量(例如一週兩次、每週或每月劑量；參見下文)投與：介於0.005mg/公斤體重/劑量與20.0mg/公斤體重/劑量之間、較佳介於0.05mg/kg/劑量與10.0mg/kg/劑量之間且更佳介於0.5mg/kg/劑量與10mg/kg/劑量之間，但可端視(尤其)前述參數而顯著變化。因此，在一些情形下，使用低於上文給出之最低劑量可能已足矣，而在其他情形下可能不得不超出上限。當大量投與時，可適當地將其分成眾多較小劑量在一天中不同時間投與。

端視本發明之特定抗體分子及其特定藥物動力學及其他性質而定，其可每天、每兩天、每三天、每四天、每五天或每六天、每週、每月及諸如此類投與。投與方案可包括長期、每週治療。「長期」意指持續至少兩週且較佳若干月或年。

可使用任一適宜活體外分析、基於細胞之分析、活體內分析及/或本身已知之動物模型或其任一組合來測試本發明抗體分子及包含其之組合物之效能，此視所涉及之特定疾病而定。適宜分析及動物模型將為熟習此項技術者所明瞭，且包括(例如)下文實例中所用之分析及動物模型。

調配物

對於醫藥使用，可將本發明抗體分子調配為包含以下之醫藥製劑：(i)至少一種本發明抗體(即本發明抗PD1抗體或本發明抗LAG3抗體或兩種類型之本發明抗體一起)及(ii)至少一種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑，及(iii)視情況一或多種其他藥理學活性多肽及/或化合物。「醫藥上可接受」意指各別材料在向個體投與時不顯示任何生物效應或其他方面不期望之效應，且不以有害方式與含有其之醫藥組合物之任一其他組份(例如醫藥活性成分)相互作用。特定實例可參見標準手冊，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，USA(1990)。例如，本發明抗體可經調配，並以任一本身已知用於習用抗體及抗體片段及其他醫藥活性蛋白質之方式投與。因此，根據另一實施例，本發明係關於含有至少一種本發明抗體及至少一種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑及視情況一或多種其他藥理學活性物質之醫藥組合物或製劑。

用於非經腸投與(例如靜脈內、肌內、皮下注射或靜脈內輸注)之醫藥製劑可為(例如)包含活性成分且視情況在另一溶解或稀釋步驟之後適於輸注或注射之無菌溶液、懸浮液、分散液、乳液或粉劑。適於該等製劑之載劑或稀釋劑包括(例如，但不限於)無菌水及醫藥上可接受之水性緩衝液及溶液(例如生理磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及漢克氏溶液(Hank's solution))；水油；甘油；乙醇；二醇，例如丙二醇；以及礦物油、動物油及植物油，例如花生油、大豆油；以及其適宜混合物。

本發明之抗體分子之溶液亦可含有防止微生物生長之防腐劑，例如抗細菌及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯(p-hydroxybenzoate、paraben)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thiomersal)、乙二胺四乙酸(之鹼金屬鹽)及諸如此類。在許多情形下，較佳應包括等滲劑，例如糖、緩衝液或氯化鈉。視情況，可使用乳化劑及/或分散劑。可(例如)藉由形成脂質體、藉由維持所需粒徑(在分散液之情形下)或藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。亦可添加其他延遲吸收之試劑，例如單硬脂酸鋁及明膠。可將溶液填充至注射小瓶、安瓿、輸注瓶及諸如此類中。

在所有情形下，最終劑量形式必須在製造及儲存之條件下為無菌、流體且穩定。無菌可注射溶液係藉由以下方式製得：將所需量之活性化合物納入視需要具有上文所列舉其他成份之適當溶劑中，隨後過濾滅菌。在使用無菌粉劑製備無菌可注射溶液之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥技術，此產生存於先前經無菌過濾之溶液中之活性成份加上任一額外期望成份之粉劑。

通常，水性溶液或懸浮液將較佳。通常，適於治療性蛋白(例如本發明抗體)之調配物係緩衝蛋白質溶液，例如包括適宜濃度(例如0.001mg/ml至400mg/ml、較佳0.005mg/ml至200mg/ml、更佳0.01mg/ml至200mg/ml、更佳1.0mg/ml至100mg/ml，例如1.0mg/ml(i.v.投與)或 100mg/ml(s.c.投與))蛋白質之溶液；及水性緩衝液，例如：-磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4，-其他磷酸鹽緩衝液，pH 6.2至8.2，-乙酸鹽緩衝液，pH 3.2至7.5，較佳pH 4.8至5.5 -組胺酸緩衝液，pH 5.5至7.0，-琥珀酸鹽緩衝液，pH 3.2至6.6，及-檸檬酸鹽緩衝液，pH 2.1至6.2，及視情況鹽(例如NaCl)及/或糖(例如蔗糖及海藻糖)及/或其他多元醇(例如甘露醇及甘油)用於提供溶液之等滲性。

較佳緩衝蛋白質溶液為包括溶解於25mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5)中之約0.05mg/ml本發明抗體且藉由添加220mM海藻糖調節至等滲之溶液。另外，該等溶液中可包括其他試劑，例如清潔劑，例如0.02% Tween-20或Tween-80。用於皮下施用之調配物可包括顯著更高濃度之本發明抗體，例如高達100mg/ml或甚至超過100mg/ml。然而，熟習此項技術者將明瞭，上文所給成分及其量僅代表一個較佳選項。其替代及變化形式將為熟習此項技術者立即瞭解，或可容易地自上文揭示內容設想到。

根據本發明之另一態樣，本發明抗體分子可與可用於投與抗體之裝置(例如注射器、注射筆、微幫浦或其他裝置)組合使用。

治療用途

本發明之另一態樣提供治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與治療有效量之本發明抗PD1抗體分子。在較佳實施例中，該方法進一步包含向該患者投與抗LAG3抗體分子。較佳抗LAG3抗體分子係本發明之抗LAG3抗體分子。

本發明之另一態樣提供本發明之抗PD1抗體分子，其用於治療癌症之方法中。在較佳實施例中，該態樣進一步包含另外使用抗LAG3抗體分子。較佳抗LAG3抗體分子係本發明之抗LAG3抗體分子。

本發明之另一態樣係本發明之抗PD1抗體分子之用途，其用於製備用以治療癌症之醫藥組合物。在較佳實施例中，該態樣進一步包含另外使用抗LAG3抗體分子。較佳抗LAG3抗體分子係本發明之抗LAG3抗體分子。

在實施例中，抗PD1抗體分子係與抗LAG3抗體分子同時、並行、依序、相繼、交替或分開投與。

本發明之另一態樣提供治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與治療有效量之本發明之抗LAG3抗體分子。在較佳實施例中，該方法進一步包含向該患者投與抗PD1抗體分子。較佳抗LAG3抗體分子係本發明之抗PD1抗體分子。

本發明之另一態樣提供本發明之抗LAG3抗體分子，其用於治療癌症之方法中。在較佳實施例中，該態樣進一步包含另外使用抗PD1抗體分子。較佳抗PD1抗體分子係本發明之抗PD1抗體分子。

本發明之另一態樣係本發明之抗LAG3抗體分子用於製備用以治療癌症之醫藥組合物之用途。在較佳實施例中，該態樣進一步包含另外使用抗PD1抗體分子。較佳抗PD1抗體分子係本發明之抗PD1抗體分子。

在實施例中，抗LAG3抗體分子係與抗PD1抗體分子同時、並行、依序、相繼、交替或分開投與。

為免生疑問，本發明之醫學用途態樣可包含如上文所闡述之本發明特異性抗PD1抗體分子及/或本發明抗LAG3抗體分子中之任一者。

由於本發明抗體之生物性質，本發明抗體適於治療特徵在於細胞增殖過量或異常之疾病，例如癌症。

本文所用術語「癌症」意欲包括所有類型之癌性生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉化細胞、組織或器官，不論侵襲性之組織病理類型或階段如何。癌性病症之實例包括(但不限於)實體腫瘤、血液癌症、軟組織腫瘤及轉移性病灶。實體腫瘤之實例包括各種器官系統之惡性病(例如，肉瘤)及癌(包括腺癌及鱗狀細胞癌)，例如之彼等影響肝、肺、***、淋巴、胃腸(例如，結腸)、泌尿生殖道(例如，腎、尿路上皮細胞)、***及咽。腺癌包括諸如大多數結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺之非小細胞癌、小腸癌及食管癌等惡性病。鱗狀細胞癌包括例如在肺、食管、皮膚、頭頸區、口腔、肛門及子宮頸中之惡性病。在一個實施例中，癌症係黑色素瘤，例如晚期黑色素瘤。亦可使用本文所闡述之方法及組合物治療或預防上述癌症之轉移性病灶。

可使用本文所揭示之抗體分子抑制生長之實例性癌症包括通常對免疫療法有反應之癌症。

例如，以下癌症、腫瘤及其他增殖疾病可利用本發明抗體來治療，但不限於該等癌症：頭頸癌；肺癌，例如非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌(SCLC)；縱膈之贅瘤，例如神經性腫瘤及間質性腫瘤；胃腸(GI)道之癌症，例如食管、胃(胃癌)、胰臟、肝及膽道系統(包括(例如)肝細胞癌(HCC))及小腸及大腸(包括(例如)結腸直腸癌)之癌症；***之癌症；睪丸之癌症；婦科癌症，例如卵巢之癌症；***之癌症，例如乳癌、激素受體陽性乳癌、Her2陽性乳癌及三陰性乳癌；內分泌系統之癌症；軟組織之肉瘤，例如纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)；骨之肉瘤，例如骨髓瘤、骨肉瘤、尤因氏腫瘤(Ewing's tumor)、纖維肉瘤、骨軟骨瘤、成骨細胞瘤及軟骨胚細胞瘤；間皮瘤；皮膚之癌症，例如基底細胞癌、鱗狀細胞癌、默克爾細胞癌(Merkel's cell carcinoma)及黑色素瘤；中樞神經系統及腦之贅瘤，例如星細胞瘤、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、神經胚細胞瘤及視網膜母細胞瘤；淋巴瘤及白血病，例如B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、T細胞非霍奇金氏淋巴瘤(T-cell non-Hodgkin lymphomas)、慢性B細胞淋巴球性白血病(B-CLL)、慢性T細胞淋巴球性白血病(T-CLL)、霍奇金氏病(HD)、大顆粒性淋巴球白血病(LGL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性/骨髓樣白血病(AML)、急性淋巴/淋巴母細胞性白血病(ALL)、多發性骨髓瘤(MM)、漿細胞瘤及骨髓發育不良症候群(MDS)；及未知原發位點之癌症。

在較佳實施例中，本發明之癌症係肺癌、較佳非小細胞肺癌(NSCLC)。

以在體內之特定定位/起源為特徵之上文所提及所有癌症、腫瘤、贅瘤等皆意欲包括原發性腫瘤及自該等原發性腫瘤衍生之轉移性腫瘤。

若患者患有特徵在於具有高的PD-L1表現及/或其中癌症被抗腫瘤免疫細胞(例如腫瘤浸潤性淋巴球)浸潤之癌症，則該患者更可能對利用本發明抗體分子(如本文所闡述)之治療有反應。因此，本發明之實施例係其中欲治療之患者患有特徵在於具有高的PD-L1表現及/或其中癌症被抗腫瘤免疫細胞浸潤之癌症。

此外，若患者患有特徵在於具有高突變負荷之癌症，則該患者更可能對利用本發明抗體分子(如本文所闡述)之治療有反應。可評價突變負荷多高之實例包括確定癌症之特徵是否在於具有微衛星不穩定性或較差DNA失配修復效率。認為該等癌症更具免疫原性且因此更可能對利用免疫調節治療方案(例如本發明之抗體分子)之治療有反應。因此，本發明之實施例係其中欲治療之患者患有特徵在於具有高突變負荷之癌症。

本發明抗體分子可在一線、二線或任何其他線治療之情形中用於治療方案中。

本發明抗體分子可用於預防、短期或長期治療上文所提及疾病，其視情況亦與放射療法及/或手術組合使用。

當然，上文亦包括本發明抗體分子在藉由向有需要之患者投與治療有效劑量來治療上文疾病之各種方法中之用途，以及該等抗體分子用於製造用以治療該等疾病之藥劑之用途，以及包括該等本發明抗體分子之醫藥組合物，以及包括該等本發明抗體之藥劑之製備及/或製造，及諸如此類。

與其他活性物質或治療之組合

本發明抗體分子或本發明抗PD1抗體及本發明抗LAG3抗體之組合可單獨或與一或多種其他治療劑組合使用，該等其他治療劑尤其選自化學治療劑(如DNA損害劑)或抑制癌細胞中之血管生成、信號轉導路徑或有絲***檢查點之治療活性化合物。

其他治療劑可與視情況作為同一醫藥製劑之組份同時投與，或在投與抗體分子之前或之後投與。

在某些實施例中，其他治療劑可為(但不限於)一或多種選自EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLK及PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、Ras、KSP、PDK1、PTK2、IGF-R或IR之抑制劑之群之抑制劑。

其他治療劑之其他實例係CDK、Akt、src/bcr abl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90之抑制劑、刺蝟拮抗劑、JAK/STAT、Mek、mTor、NFkappaB、蛋白酶體、Rho之抑制劑、wnt信號傳導之抑制劑或泛蛋白化路徑之抑制劑或Notch信號傳導路徑之另一抑制劑。

Aurora抑制劑之實例係(但不限於)PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。

PLK抑制劑之實例係GSK-461364。

raf抑制劑之實例係BAY-73-4506(亦為VEGFR抑制劑)、PLX 4032、RAF-265(另外亦為VEGFR抑制劑)、索拉菲尼(sorafenib)(另外亦為VEGFR抑制劑)及XL 281。

KSP抑制劑之實例係伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK 246053A、GSK-923295、MK-0731及SB-743921。

src及/或bcr-abl抑制劑之實例係達沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、伯舒替尼(bosutinib)、XL 228(亦為IGF-1R抑制劑)、尼羅替尼(nilotinib)(亦為PDGFR及cKit抑制劑)、伊馬替尼(imatinib)(亦為cKit抑制劑)及NS-187。

PDK1抑制劑之實例係BX-517。

Rho抑制劑之實例係BA-210。

PI3激酶抑制劑之實例係PX-866、BEZ-235(亦為mTor抑制劑)、XL 418(亦為Akt抑制劑)、XL-147及XL 765(亦為mTor抑制劑)。

cMet或HGF之抑制劑之實例係XL-184(亦為VEGFR、cKit、Flt3之抑制劑)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(亦為VEGFR之抑制劑)、MGCD-265(亦為VEGFR、Ron、Tie2之抑制劑)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102及AV-299。

c-Myc抑制劑之實例係CX-3543。

Flt3抑制劑之實例係AC-220(亦為cKit及PDGFR之抑制劑)、KW 2449、來他替尼(lestaurtinib)(亦為VEGFR、PDGFR、PKC之抑制劑)、TG-101348(亦為JAK2之抑制劑)、XL-999(亦為cKit、FGFR、PDGFR及VEGFR之抑制劑)、舒尼替尼(sunitinib)(亦為PDGFR、VEGFR及cKit之抑制劑)及坦度替尼(tandutinib)(亦為PDGFR及cKit之抑制劑)。

HSP90抑制劑之實例係坦螺旋黴素(tanespimycin)、阿螺旋黴素(alvespimycin)、IPI-504及CNF 2024。

JAK/STAT抑制劑之實例係CYT-997(亦與微管蛋白相互作用)、TG 101348(亦為Flt3之抑制劑)及XL-019。

Mek抑制劑之實例係ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330及XL 518。

mTor抑制劑之實例係替西羅莫司(temsirolimus)、AP-23573(其亦充當VEGF抑制劑)、依維莫司(everolimus)(另外為VEGF抑制劑)。XL-765(亦為PI3激酶抑制劑)及BEZ-235(亦為PI3激酶抑制劑)。

Akt抑制劑之實例係哌立福辛(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立濱(triciribine)。

cKit抑制劑之實例係AB-1010、OSI-930(亦充當VEGFR抑制劑)、AC-220(亦為Flt3及PDGFR之抑制劑)、坦度替尼(亦為Flt3及PDGFR之抑制劑)、阿西替尼(axitinib)(亦為VEGFR及PDGFR之抑制劑)、XL-999(亦為Flt3、PDGFR、VEGFR、FGFR之抑制劑)、舒尼替尼(亦為Flt3、PDGFR、VEGFR之抑制劑)及XL-820(亦充當VEGFR-及PDGFR抑制劑)、伊馬替尼(亦為bcr-abl抑制劑)、尼羅替尼(亦為bcr-abl及PDGFR之抑制劑)。

刺蝟拮抗劑之實例係IPI-609及CUR-61414。

CDK抑制劑之實例係塞利西裡(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(亦抑制VEGFR2及PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509及AG 024322。

蛋白酶體抑制劑之實例係硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)及NPI-0052(亦為NFkappaB之抑制劑)。

NFkappaB路徑抑制劑之實例係NPI-0052。

泛蛋白化路徑抑制劑之實例係HBX-41108。

在較佳實施例中，其他治療劑係抗血管生成劑。

抗血管生成劑之實例係FGFR、PDGFR及VEGFR或各別配體之抑制劑(例如VEGF抑制劑，如哌加他尼(pegaptanib)或抗VEGF抗體貝伐珠單抗(bevacizumab))及沙利竇邁(thalidomide)，該等藥劑選自(但不限於)尼達尼布(nintedanib)、貝伐珠單抗、莫替沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(亦為CDK之抑制劑)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiD(免疫調節藥物)、沙利竇邁衍生物CC-4047、雷利竇邁(lenalidomide)、ENMD 0995、IMC-D11、Ki 23057、布立尼布(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999(亦為cKit及Flt3之抑制劑)、 1B3、CP 868596、IMC 3G3、R-1530(亦為Flt3之抑制劑)、舒尼替尼(亦為cKit及Flt3之抑制劑)、阿西替尼(亦為cKit之抑制劑)、來他替尼(亦為Flt3及PKC之抑制劑)、瓦他拉尼(vatalanib)、坦度替尼(亦為Flt3及cKit之抑制劑)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW 786034、PF-337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR 258、甲苯磺酸索拉菲尼(亦為Raf之抑制劑)、RAF-265(亦為Raf之抑制劑)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(亦為EGFR及Her2之抑制劑)、BAY-57-9352(亦為Raf之抑制劑)、BAY-73-4506(亦為Raf之抑制劑)、XL 880(亦為cMet之抑制劑)、XL-647(亦為EGFR及EphB4之抑制劑)、XL 820(亦為cKit之抑制劑)及尼羅替尼(亦為cKit及brc-abl之抑制劑)。

其他治療劑亦可選自EGFR抑制劑，其可為小分子EGFR抑制劑或抗EGFR抗體。抗EGFR抗體之實例為(但不限於)西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)；小分子EGFR抑制劑之實例為(但不限於)吉非替尼(gefitinib)、阿法替尼(afatinib)、奧希替尼(osimertinib)及奧姆替尼(olmutinib)。EGFR調節劑之另一實例係EGF融合毒素。

在EGFR及Her2抑制劑中，可與本發明抗體分子組合使用的是拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔單抗、曲妥珠單抗(trastuzumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、紮魯木單抗(zalutumumab)、凡德他尼(亦為VEGFR之抑制劑)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626 ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(亦為VEGFR 之抑制劑)、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab。

可有利地與本發明抗體分子組合在療法中之其他藥劑係托西莫單抗(tositumumab)及替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(兩種放射標記之抗CD20抗體)、阿倫單抗(alemtuzumab)(抗CD52抗體)、地諾單抗(denosumab)(破骨細胞分化因子配體抑制劑)、加利昔單抗(galiximab)(CD80拮抗劑)、奧法木單抗(ofatumumab)(CD20抑制劑)、紮木單抗(zanolimumab)(CD4拮抗劑)、SGN40(CD40配體受體調節劑)、利妥昔單抗(rituximab)(CD20抑制劑)或馬帕木單抗(mapatumumab)(TRAIL-1受體激動劑)。

可與本發明抗體分子組合使用之其他化學治療藥物選自(但不限於)激素、激素類似物及抗激素劑(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、氟維司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、乙酸環丙孕酮(cyproterone acetate)、非那雄胺(finasteride)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)、氟氫可的松(fludrocortisone)、氟甲睪酮(fluoxymesterone)、甲羥助孕酮(medroxyprogesterone)、奧曲肽(octreotide)、阿佐普芬(arzoxifene)、帕瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))、芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美坦(formestane))、LHRH激動劑及拮抗劑(例如乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、柳培林(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、組胺瑞林(Histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))、抗代謝物(例如抗葉酸劑，如胺甲喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、嘧啶類似物如5氟尿嘧啶、卡培他濱(capecitabine)、地西他濱(decitabine)、奈拉濱(nelarabine)及吉西他濱(gemcitabine)，嘌呤及腺苷類似物，例如巰嘌呤、硫鳥嘌呤、克拉屈濱(cladribine)及噴司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷、氟達拉濱(fludarabine))；抗腫瘤抗生素(例如蒽環，如多柔比星(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、泛艾黴素(epirubicin)及伊達比星(idarubicin)、絲裂黴素-C(mitomycin-C)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、普卡黴素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹杉瓊(pixantrone)、鏈脲黴素(streptozocin))；鉑衍生物(例如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、卡鉑(carboplatin)、洛鉑(lobaplatin)、沙鉑(satraplatin))；烷基化劑(例如雌氮芥(estramustine)、氮芥(meclorethamine)、美法侖(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、白消安(busulphan)、達卡巴嗪(dacarbazine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、羥基脲、替莫唑胺(temozolomide)、亞硝基脲(例如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine)、噻替派(thiotepa))；抗有絲***劑(例如長春花生物鹼(vinca alkaloid)，例如長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春氟寧(vinflunine)及長春新鹼(vincristine)；及紫杉烷(taxane)，如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)及其調配物、拉洛他賽(larotaxel)；司莫紫杉醇(simotaxel)，及埃博黴素，如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹隆(patupilone)、ZK-EPO)；拓樸異構酶抑制劑(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)，如依託泊苷(etoposide)及凡畢複(etopophos)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、托泊替康 (topotecan)、伊立替康(irinotecan))及各種化學治療劑，例如阿米福汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干擾素α、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)及卟吩姆鈉(porfimer)、貝沙羅汀(bexarotene)、塞來昔布(celecoxib)。

在某些實施例中，其他治療劑可為另一免疫治療劑，例如以下檢查點抑制劑之調節劑：TIM3、PD-L1(例如阿替珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)或德瓦魯單抗(durvalumab))、PD-L2、CTLA-4、VISTA、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、2B4、CEACAM。

在其他實施例中，免疫治療劑可為癌症疫苗。

當欲使用兩種或更多種物質或成分作為組合治療方案之一部分時，其可經由相同投與途徑或經由不同投與途徑基本上同時(即同時、並行)或在不同時間(例如依序、相繼、交替、連續或根據任何其他類交替方案)投與。

當欲經由相同投與途徑同時投與該等物質或成分時，其可作為不同醫藥調配物或組合物或作為組合醫藥調配物或組合物之一部分投與。而且，當欲使用兩種或更多種活性物質或成分作為組合治療方案之一部分時，每一物質或成分可以與當單獨使用化合物或成分時所用之量相同的量並根據與其方案相同之方案投與，且該組合使用可或可不引起協同效應。然而，當組合使用兩種或更多種活性物質或成分引起協同效應時，亦可能降低欲投與物質或成分中之一者、更多者或所有之量，同時仍達成期望治療作用。此可用於(例如)避免、限制或減輕與當該等物質或成分中之一或多者以其常用量使用時其之使用相關之任何不期望副作用，同時仍獲得期望之藥理學或治療效應。

當然，上文包括與上文組合伴侶組合使用之本發明抗體之製備及製備方法。亦包括與本發明抗體組合使用之上文所提及組合伴侶之製備及製備方法。

本發明抗體分子可單獨或與其他治療方案(例如手術及/或放射療法)組合使用。

套組及製造及純化方法

本發明亦涵蓋套組，其包含至少一種本發明抗體及一或多種選自由用於治療如上文所述疾病及病症之其他藥物組成之群之其他組份。

在一個實施例中，套組包括含有有效量之本發明抗PD1抗體分子且呈單位劑型之組合物。在另一實施例中，套組包括含有有效量之本發明抗LAG3抗體分子且呈單位劑型之組合物。在另一實施例中，套組包括含有有效量之本發明抗PD1抗體分子且呈單位劑型之組合物及含有有效量之本發明抗LAG3抗體分子且呈單位劑型之組合物。

在一些實施例中，套組包含含有此一組合物之無菌容器；該等容器可為盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包裝或業內已知之其他適宜容器形式。該等容器可由塑膠、玻璃、層壓紙、金屬箔或其他適於容納藥劑之材料製得。

若期望，與向患有癌症之個體投與一或多種抗體之說明書一起提供本發明之抗體分子或兩種類型之本發明抗體之組合。說明書通常將包括關於使用組合物治療或預防癌症之資訊。在其他實施例中，說明書包括以下中之至少一者：治療劑之闡述；用於治療或預防癌症或其症狀之劑量方案及投與；注意事項；警告；適應症；禁忌；過劑量資訊；不利反應；動物藥理學；臨床研究；及/或參考。說明書可直接印刷於容器上(當存在時)，或以標記施加至容器，或以單獨紙片、小冊子、卡片或文件夾在容器中或與容器一起提供。

本發明進一步提供製造本發明抗體分子之方法，該等方法通常包含以下步驟：-在容許形成本發明抗體之條件下培養包含包括編碼本發明抗體分子之核酸之表現載體之宿主細胞；及，-自培養基回收由宿主細胞表現之抗體分子；及-視情況進一步純化及/或修飾及/或調配本發明之抗體分子。

本發明之核酸可為(例如)包含編碼序列以及調節序列及視情況天然或人工內含子之DNA分子，或可為cDNA分子。其可具有其初始密碼子或可具有特別適於在預期宿主細胞或宿主生物體中表現之最佳化之密碼子使用。根據本發明之一個實施例，本發明核酸呈基本上分離之形式，如上文所定義。

本發明核酸通常將納入表現載體(即在轉染至適宜宿主細胞或其他表現系統中時可提供多肽之表現之載體)中。

為製造本發明抗體，熟習此項技術者可自業內熟知之大量表現系統(例如由Kipriyanow及Le Gall,2004綜述之彼等)選擇。

表現載體包括質粒、反轉錄病毒、黏粒、EBV源游離基因體及諸如此類。表現載體及表現控制序列經選擇以與宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因***單獨載體中。在某些實施例中，將DNA序列***相同表現載體中。

習用載體係編碼功能完整的人類CH(恆定重鏈)或CL(恆定輕鏈)免疫球蛋白序列且適當限制位點經改造使得可易於***及表現任何VH(可變重鏈)或VL(可變輕鏈)序列之彼等，如上文所闡述。對於抗體重鏈，其可為(但不限於)任何IgG同型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或其他免疫球蛋白，包括等位基因變體。

重組表現載體亦可編碼促進宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。可將編碼抗體鏈之DNA選殖至載體中，使得信號肽框內連接至成熟抗體鏈DNA之胺基末端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或來自非免疫球蛋白之異源肽。或者，編碼抗體鏈之DNA序列可已含有信號肽序列。

除抗體鏈DNA序列以外，重組表現載體通常攜載調節序列，視情況異源調節序列，包括啟動子、增強子、終止及多聚腺苷酸化信號，及控制宿主細胞中抗體鏈之表現之其他表達控制元件。啟動子序列之實例(經例示用於在哺乳動物細胞中表現)係源於CMV(例如CMV猿猴病毒40(SV40)啟動子/增強子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))之啟動子及/或增強子、多瘤及強哺乳動物啟動子(例如天然免疫球蛋白及肌動蛋白啟動子)。多聚腺苷酸化信號之實例係BGH聚A、SV40晚期或早期聚A；另一選擇為，可使用免疫球蛋白基因之3'UTR等。

重組表現載體亦可攜載調控宿主細胞中載體複製之序列(例如複製起點)及可選標記物基因。可根據業內熟知之轉染方法(包括脂質體介導之轉染、多價陽離子介導之轉染、原生質體融合、顯微注射、磷酸鈣沈澱、電穿孔或藉由病毒載體之轉移)將編碼本發明抗體之重鏈或其抗原結合部分及/或輕鏈或其抗原結合部分之核酸分子及包含該等DNA分子之載體引入宿主細胞(例如細菌細胞或較高等真核細胞(例如哺乳動物細胞))中。

較佳地，編碼重鏈及輕鏈之DNA分子存在於兩個表現載體上，將該兩個表現載體共轉染至宿主細胞(較佳哺乳動物細胞)中。

可用作供表現用宿主之哺乳動物細胞系已為業內熟知且尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0、SP2/0細胞、HeLa細胞、幼小倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類癌細胞(例如，Hep G2及A-549細胞)、3T3細胞或任何該細胞系之衍生物/後代。可使用其他哺乳動物細胞(包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、猴及齧齒類動物細胞系)或其他真核細胞(包括(但不限於)酵母、昆蟲及植物細胞)或原核細胞(例如細菌)。

本發明抗體分子係藉由將宿主細胞培養足以容許在宿主細胞中表現抗體分子之時間段產生。抗體分子較佳自培養基以經分泌多肽形式回收，或其若(例如)在沒有分泌信號之情況下表現則可自宿主細胞溶解物回收。必需使用為重組蛋白及宿主細胞蛋白質所用之標準蛋白質純化方法以獲得實質上均質之抗體製劑之方式來純化抗體分子。舉例而言，可用於獲得本發明抗體分子之當前技術純化方法包括自培養基或溶解物去除細胞及/或微粒細胞碎片作為第一步驟。然後藉由(例如)在免疫親核性或離子交換管柱上分級、乙醇沈澱、反相HPLC、Sephadex層析、在二氧化矽上或在陽離子交換樹脂上層析自污染物可溶性蛋白質、多肽及核酸純化抗體。作為用於獲得抗體分子製劑之製程中之最後步驟，可如下文針對治療應用所闡述乾燥(例如凍乾)經純化抗體分子。

實例 實例1：結合至PD1且阻斷PDL-1結合至PD1之小鼠抗體之生成.

以免疫原之形式合成及製備人類PD1蛋白之細胞外結構域(ECD)(基因庫登錄號AAO63583.1之胺基酸21-170)。然後遵循標準實驗室免疫技術對小鼠實施免疫且然後用人類PD1 ECD蛋白質加強。

然後自經免疫小鼠收穫血漿且加以篩選以鑑別具有充足的抗PD1免疫球蛋白效價之個體。遵循標準實驗室方法，收穫來自所選小鼠之淋巴球且使其與小鼠骨髓瘤細胞融合以生成融合瘤。隨後使用下文所闡述之分析篩選該等融合瘤，以鑑別產生展現在低nM親和力範圍內結合至人類PD1(ECD)且亦阻斷人類PD-L1與PD1結合之抗體分子之融合瘤細胞系。

選擇產生結合至人類PD1且阻斷結合至人類PD-L1之抗體之若干融合瘤，使用標準PCR引子集分離並選殖抗體可變結構域。

自此研究，鑑別產生展現與人類PD1(ECD)具有低nM結合親和力且亦阻斷PD-L1與PD1結合之單株抗體之鼠類融合瘤細胞系(稱為77E11)。

由77E11產生之單株抗體之可變結構域之胺基酸序列顯示於圖1中。

實例2：人類化抗PD1抗體之生成

遵循業內熟知之PCR及測序方案來鑑別鼠類77E11融合瘤細胞系之V基因。然後使用標準分子生物學技術將V基因融合至最接近匹配之人類種系基因。在77E11之情形下，此產生具有融合至人類Ck及Ch1胺基酸殘基之小鼠Vk及Vh胺基酸殘基之嵌合鼠類/人類抗體分子。

在製備之後，然後使嵌合鼠類/人類抗體經受「人類化」方案。此處，製備嵌合77E11 Fab純系之突變胺基酸文庫。亦製備其他文庫位置以便去除序列不利條件(即已知具有免疫原性或產生潛在製造問題之胺基酸殘基)。該等突變文庫每個V區通常具有5至10個二元(小鼠對人類)位置。可建立若干較小文庫以解決較複雜V區中之特定文庫不利條件。該等文庫係使用業內之標準方法來製備，且可由熟習此項技術者容易地使用。

在完成此階段之後，製備源於初始鼠類77E11 Fab序列之多個不同「人類化」Fab。測試該等人類化Fab結合人類PD1及阻斷PD-L1與PD1相互作用之能力。隨後選擇等於或好於相應嵌合Fab之經遺傳改造之Fab。分析該等Fab之胺基酸序列之人類序列%、可能的免疫原性及所去除序列不利條件。

在選擇最有利的人類化Fab之後，然後將該等Fab置於人類IgG4(Pro)或IgG1KO免疫球蛋白格式中。IgG4(Pro)與規範人類IgG4序列之不同之處在於絲胺酸241變為脯胺酸，已證實此改變可最小化IgG4分子之間之動態Fab臂交換。IgG1KO與規範人類IgG1序列之不同之處在於已知可最小化抗體分子之效應物功能之兩個胺基酸取代(L234A,L235A)。

在完成此研究之後，製備初始嵌合鼠類/人類77E11 Fab之5種不同人類化型式。該等人類化型式稱為：PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。

PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5之CDR之胺基酸序列、VH及VL序列及全部HC及LC序列在此應用結束時呈現於表中。為免生疑問，抗體與其SEQ ID號之間之關係亦呈現於下表中：

實例3：結合至人類PD1且阻斷PD1配體相互作用之抗體

確定源於鼠類77E11融合瘤之代表性人類化抗PD1抗體(如實例2中所闡述)與人類PD1之結合。

使用ProteOn XPR36儀器藉由SPR量測與重組體單體人類PD1之結合親和力。在表面與胺偶合之蛋白質A/G表面上捕獲PD1-1、PD1-2及PD1-3抗體。將人類PD1 ECD以30ul/min之流速注射於所捕獲抗體上達600sec且解離1200sec。人類PD1 ECD之濃度為0nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM及100nM。自原始數據扣除背景且然後將感測圖整體擬合至1：1朗繆爾結合(Langmuir binding)以提供親和力(KD)值。

使用該方案，確定抗體PD1-1、PD1-2及PD1-3結合至人類PD1，如下表中所示。

然後測試本發明PD1抗體阻斷人類PD-L1/2與表現於CHO細胞表面上之人類PD1結合之能力。在本發明抗PD1抗體(PD1-1至PD1-5)存在下與固定濃度之重組生物素標記之PD-L1或PD-L2一起培育表現PD1之CHO細胞。在37℃下將混合物培育1小時。用銪標記之鏈黴抗生物素蛋白檢測結合細胞之PD-L1/L2，且使用Perkin Elmer Victor X4讀板儀量測螢光。數據展示為抑制%。0%抑制係定義為與配體一起且無抗體培育之細胞之螢光值，且100%抑制係定義為僅用細胞且無標記之配體及抗體獲得之信號。在Excel中計算抑制%值且用GraphPad Prism實施曲線擬合。曲線之數據點係一式三份量測之平均值。

配體阻斷之抑制曲線及達成90%抑制所需之mAb濃度(IC₉₀)顯示於圖2及表3中。

自此分析明瞭本發明之人類化PD1抗體展現與PD1有效結合之性質，且亦有效抑制PD-1與PD-L1及PD-L2之相互作用。

實例4：抗PD1抗體對抗原特異性T細胞反應之刺激

隨後測試根據上述方法製備之人類化抗PD1抗體刺激破傷風特異性CD4記憶體T細胞產生細胞介素之能力。

為進行此分析，在破傷風類毒素存在下擴增來自源於健康供體之PBMC之T細胞並將其與加載有破傷風類毒素之自體成熟樹突細胞(DC)共培養2天。在本發明之代表性抗PD1抗體存在下以類似方式再次重複共培養步驟。在第二共培養步驟結束時，藉由ELISA分析上清液之IFN-γ且結果顯示於圖3中。

所測試之所有本發明PD1抗體皆顯示明確劑量依賴性的極其有效的T細胞活化，如藉由IFN-γ釋放所量測。當將本發明PD1抗體與抗LAG3抗體組合時，在與參考先前技術抗PD1抗體組合相比時，可觀察到優良活性(參見實例12及圖8)。

實例5：人類化抗PD1單株抗體之表位定位.

藉由氫氘交換(HDX)實驗分析本發明之代表性抗PD1抗體及具有與尼沃魯單抗相同之胺基酸序列之參考先前技術抗體分子之表位，此揭示抗體表位中個別胺基酸層面之表位差異。

HDX分析顯示本發明抗PD1抗體及參考先前技術抗體分子結合至人類PD1之類似且重疊之區。然而，表位並非一致，其中本發明之代表性PD1抗體結合至如表4中所詳述之另一序列元件。

實例6：在hPD-1敲入小鼠模型中本發明抗PD1抗體分子之活體內效能

該研究之目的係使用具有用人類PD1之相應區替代小鼠PD1之細胞外結構域之遺傳修飾的完全免疫勝任小鼠量測本發明抗PD1抗體分子之效能。此實驗所使用之小鼠C57BL/6NTac-PDCD1 ^{tm(PDCD1)Arte}係由ISIS INNOVATION LIMITED,Oxford,England提供且自現在起其稱為「hPD1敲入小鼠」。

將MC-38細胞皮下注射至hPD1敲入小鼠之側腹中且在細胞注射後第6天開始治療。小鼠每週兩次(q3or4d)以10mg/kg之劑量接受PBS、同型對照或本發明抗PD1抗體分子或僅一次投與PD1-3。

圖4顯示植入MC38之個別hPD1敲入小鼠隨時間之腫瘤體積，且表5匯總在細胞注射後第23天之腫瘤生長抑制(TGI)，且在研究結束時觀察到完全反應。

當(i)腫瘤大小與第一量測相同或小於其且(ii)殘留載體材料(基質膠)之目視檢查顯示無腫瘤組織時，定義完全反應(CR)。可證實PD1-3之單一投藥方案顯示與每週兩次之投藥方案等效之強抗腫瘤效應(TGI=90%；其中2隻小鼠顯示CR)。此研究顯示即便本發明抗PD1抗體分子之單一劑量亦足以達成效能，此可能係較長半衰期之結果。

實例7：本發明抗PD1抗體分子之臨床前藥物動力學.

在食蟹猴中之i.v.單一劑量PK研究中測定本發明抗PD1抗體分子之藥物動力學(PK)性質。

以1mg/kg i.v.之劑量投與之本發明抗PD1抗體分子展現0.28ml/h/kg之平均血漿清除率(CL)。PD1-3之平均分佈體積(Vss)為58ml/kg。PD1-3之平均終末半衰期為11天。

在食蟹猴中1mg/kg之PD1-3之AUC及c_max與在同等劑量範圍內之IgG4Pro PD-1抗體尼沃魯單抗(BMS-936558，在Wang,C.等人，Cancer Immunol.Res.2：846-856,2014中公開)及派姆單抗(MK-3475，在FDA BLA文件125514Orig1s000 Pharmacology Review,2014中公開)之相應參數幾乎一致。

驚人且意外地，針對PD1-3觀察到之終末半衰期較尼沃魯單抗高1.5- 2倍，如圖5中所顯示。此表明本發明抗PD1抗體具有11天之血清半衰期。此與在劑量範圍0.3-3mg/kg內通常具有4天至6天之半衰期之已知參考抗PD1抗體分子形成對比。本發明抗體分子之此驚人特徵可容許利用本發明抗體分子以較業內之彼等更少之頻率治療患者，此可解讀成必須提供之抗體量降低，形式為投與頻率降低或欲使用之抗體量降低。考慮到如上文所論述抗PD1抗體分子可在患者中誘導不期望之副作用，那麼本發明之抗PD1抗體可具有較先前技術顯著且驚人之臨床優點。

實例8：結合至LAG3之小鼠抗體之鑑別

以免疫原形式合成及製備人類LAG3蛋白質之細胞外結構域(ECD)(基因庫登錄號NP_002277之胺基酸23-450)。然後遵循標準實驗室免疫技術對小鼠實施免疫且然後用人類LAG3 ECD蛋白質加強。

然後自經免疫小鼠收穫血漿且加以篩選以鑑別具有充足的抗LAG3免疫球蛋白效價之個體。遵循標準實驗室方法，收穫來自所選小鼠之淋巴球且使其與小鼠骨髓瘤細胞融合以生成融合瘤。

選擇產生特異性結合至人類LAG3之抗體之若干融合瘤，使用標準PCR引子集分離並選殖抗體可變結構域。

自此研究，鑑別產生展現與人類LAG3(ECD)具有低nM結合力之單株抗體之鼠類融合瘤細胞系(稱為496G6)且加以選擇用於進一步研究。

由496G6產生之單株抗體之可變結構域之胺基酸序列顯示於圖6中。

實例9：人類化抗LAG3抗體之生成

在此實例中，提供研發由實例8中所闡述之鼠類融合瘤細胞系496G6產生之單株抗體之人類化衍生物之方法及結果。

遵循業內熟知之PCR及測序方案來鑑別鼠類496G6融合瘤之V基因。然後使用標準分子生物學技術將V基因融合至最接近匹配之人類種系基因。在496G6之情形下，此產生具有融合至人類Ck及Ch1胺基酸殘基之小鼠Vk及Vh胺基酸殘基之嵌合鼠類/人類抗體。

在製備後，然後使嵌合鼠類/人類抗體經受業內熟知之標準「人類化」方案。在此方法中，製備嵌合496G6 Fab純系之突變胺基酸文庫。亦製備其他文庫位置以便去除序列不利條件(即已知具有免疫原性或產生潛在製造問題之胺基酸殘基)。該等突變文庫每個V區通常具有5至10個二元(小鼠對人類)位置。可建立若干較小文庫以解決較複雜V區中之特定不利條件。該等文庫係使用業內之標準方法來製備，且可由熟習此項技術者容易地使用。

在完成此階段之後，製備源於初始鼠類496G6 Fab序列之多個不同「人類化」Fab。測試該等人類化Fab結合人類LAG3及阻斷MHCII與LAG3相互作用之能力。隨後選擇等於或好於相應嵌合Fab之經遺傳改造之Fab。分析該等Fab之胺基酸序列之人類序列%、可能的免疫原性及所去除序列不利條件。

在選擇最有利的人類化Fab之後，然後將該等Fab置於人類IgG4(Pro)免疫球蛋白格式中。IgG4(Pro)與規範人類IgG4序列之不同之處在於絲胺酸241變為脯胺酸，已證實此改變可最小化IgG4分子之間之動態Fab臂交換。

在完成此研究之後，製備初始嵌合鼠類/人類496G6 Fab之5種不同人類化抗體型式。該等人類化抗體型式稱為：LAG3-1、LAG3-2、LAG3-3、LAG3-4及LAG3-5。

LAG3-1、LAG3-2、LAG3-3、LAG3-4、LAG3-5之CDR之胺基酸序列、VH及VL序列及全部HC及LC序列在此應用結束時呈現於表中。為免生疑問，抗體與其SEQ ID號之間之關係亦呈現於下表中：

實例10：結合至人類LAG3並阻斷LAG3配體相互作用之抗體

使用SPR量測與重組單體人類LAG3之結合親和力。

在蛋白質A/G表面上捕獲LAG3-1、LAG3-2、LAG3-3、LAG3-4及LAG3-5抗體。將人類LAG3 ECD-Fc以30ul/min之流速注射於所捕獲抗體上達300sec且解離1800sec。人類LAG3 ECD之濃度為0nM、0.625nM、1.25nM、2.5nM及5nM。自原始數據扣除背景且然後將感測圖整體擬合至1：1朗繆爾結合以提供親和力(KD)值。

使用此方案，確定抗體LAG3-1、LAG3-2、LAG3-3、LAG3-4及LAG-3-5以高親和力結合至人類LAG-3，如下表中所呈現。

使用FACS測試本發明LAG3抗體對重組人類LAG3蛋白質與表現其配體MHC II之Raji細胞結合之阻斷。在室溫(RT)下將融合至人類Fc之重組人類LAG3細胞外結構域(hLAG3-hIgFc)與LAG3抗體LAG3-1、LAG3-2、LAG3-3、LAG3-4及LAG3-5一起培育15分鐘，之後將其添加至Raji細胞中，隨後在4℃下再培育30分鐘。將細胞洗滌3次。使用PE標記之抗人類IgG檢測結合至Raji細胞之HLAG3-mIgFc。利用FACS Canto I(BD Bioscience)實施HLAG3-mIgFc結合之分析。結果匯總於圖7中且證實所測試之所有本發明LAG3抗體皆選擇性且有效地抑制LAG3與MHC II之結合。

實例11：人類化抗LAG3單株抗體之表位定位.

使用「競爭結合」分析來分析本發明之代表性抗LAG3抗體及具有與BMS-986016(先前技術參考抗LAG3抗體分子)相同之胺基酸序列之參考抗體分子之表位。結果顯示未競爭結合至LAG3，此顯示本發明抗LAG3抗體結合至與先前技術參考抗LAG3抗體分子不同之表位。

藉由氫氘交換(HDX)實驗進一步細化本發明之代表性抗LAG3抗體之表位，此揭示抗體表位中個別胺基酸層面之表位差異。

HDX分析顯示本發明之代表性抗LAG3抗體結合至如表8中所詳述之人類LAG3之兩個不同區。

實例12：利用抗PD1抗體及抗LAG3抗體對抗原特異性T細胞反應之刺激.

藉由ELISA且與先前技術抗PD1抗體及抗LAG3抗體相比，測試本發明之個別抗PD1抗體及抗LAG3抗體及該等抗體之組合刺激破傷風特異性CD4記憶體T細胞產生細胞介素之能力。

為進行此分析，在破傷風類毒素存在下擴增來自健康供體PBMC之T細胞並將其與加載有破傷風類毒素之自體成熟樹突細胞(DC)一起共培養2天。在抗PD1、抗LAG3及抗PD1與抗LAG3抗體分子之組合存在下，使用固定量之抗PD1 mAb(200nM)以及增加量之抗LAG3抗體將共培養步驟以類似方式再重複一次。在該另一共培養步驟結束時，分析上清液之IFN-γ分泌。

使用此分析，在4個不同供體中將本發明之抗PD1抗體及抗LAG3抗體之組合與尼沃魯單抗(Opdivo(R))(PD1 mAb)加具有與BMS-986016(LAG3 mAb)相同之胺基酸序列之抗體相比較。增加量之抗LAG3抗體與固定劑量之抗PD1 mAb組合使用。將所顯示數據正規化為在指示為100%之飽和濃度下使用之抗PD1抗體，且結果顯示於圖8中。

此數據證實在與單獨抗PD1 mAb相比時，本發明之抗PD1抗體及抗LAG3抗體之組合使得IFN-γ產生增加1.5-2倍。驚人地，本發明之抗PD1抗體及抗LAG3抗體之組合優於先前技術抗PD1抗體及抗LAG3抗體之組合。

此外，數據顯示在4個供體中之3個中，抗PD1-3(本發明PD1抗體之代表)優於尼沃魯單抗(Opdivo(R))，如在極低抗LAG3 mAB含量下在更高IFN-γ分泌量方面看出(圖8)。

考慮到如上文所論述抗PD1抗體分子及抗LAG3抗體分子可在患者中誘導不期望之副作用，那麼本發明之抗PD1抗體及抗LAG3抗體因使用更低之劑量及/或更不頻繁之投與方案而可具有較先前技術顯著且驚人之臨床優點。

實例13：在同源腫瘤模型中抗PD1抗體及抗LAG3抗體之組合療法之活體內效能

為測試本發明之抗PD1抗體及抗LAG3抗體之組合治療是否在活體內引起優良效能，用抗PD1及抗LAG3 mAb治療若干臨床前腫瘤小鼠模型。端視小鼠腫瘤細胞系之來源在C57BL/6或BALB/c中皮下注射所有小鼠腫瘤細胞系(MC38、Colon-26結腸癌、B16F10黑色素瘤、LL/2(LLC1)路易斯肺癌(Lewis Lung cancer)及4T1乳癌)。在細胞注射後第3天，腹膜內(ip)治療小鼠，隨後每週兩次投藥。所有抗體皆以10mg/kg進行投藥且本發明之抗LAG3及抗PD1抗體之組合各自以10mg/kg進行投藥。此研究中所使用之抗體皆自BioXCell,West Lebanon,NH,USA獲得。對照組係利用大鼠IgG2a抗體(純系2A3)來治療，所使用之抗PD1抗體具有大鼠IgG2aFc部分(純系RMP1-14)，且研究中所使用之抗LAG3係基於大鼠IgG1 Fc部分(純系C9B7W)。每週至少三次量測腫瘤大小之兩個尺寸(長度×寬度)且計算腫瘤體積。若腫瘤之體積達到1500mm³或若腫瘤成為潰瘍，則對動物實施安樂死。

匯總於表9及圖9中之TGI及CR之結果顯示個別小鼠隨時間之腫瘤體積。總之，該研究顯示單獨抗PD1治療在MC 38中顯示效能，但在其他模型測試中不顯示效能。然而，除LL/2模型以外，本發明之抗PD1抗體及抗 LAG3抗體之組合治療實質上改良了抗PD1單一療法之效能，且在研究結束時在MC-38、Colon-26及4T1模型中若干小鼠沒有腫瘤。特別值得注意的是在PD1抗性4T1模型中，該組合對腫瘤生長顯示優良效應且3/5的小鼠完全沒有腫瘤。

實例14：用於s.c.投與之醫藥調配物

可選擇上述本發明抗體分子中之任一者來製造用於皮下施加之醫藥調配物，該醫藥調配物具有如下組成：原料藥：100mg/ml(1nmol/ml至3nmol/ml)

乙酸鹽緩衝液：25mM

海藻糖：220mM

Tween-20：0.02%

將原料藥調配成具有上述組成之溶液，滅菌且儲存在2℃至8℃下。

實例15：用於i.v.投與之醫藥調配物

可選擇上述本發明抗體分子中之任一者來製造用於i.v.施加之醫藥調配物。適宜於本發明抗體之醫藥調配物之實例係如下。

20mL小瓶在由21.5mM乙酸鈉、3.5mM乙酸、240mM海藻糖、0.67mM L-甲硫胺酸、0.04% w/v聚山梨醇酯20及注射用水(WFI)組成之緩衝液中含有20mg/mL本發明抗PD1抗體。

20mL小瓶在由25mM乙酸鹽、240mM海藻糖、0.67mM甲硫胺酸、0.04%(w/v)聚山梨醇酯20(pH 5.5)及注射用水(WFI)組成之緩衝液中含有20mg/mL本發明抗LAG3抗體。

實例16：在人類中之醫藥使用

每兩週至四週藉由靜脈內輸注(100mg至200mg之劑量)將概述於上文實例15中之溶液施加至罹患癌症之有需要之患者(例如人類)。

序列

<110> 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司(Boehringer Ingelheim International GmbH)

<120> 抗PD1抗體分子、其製造方法及其用於癌症治療之用途

<140> 106116226

<141> 2017-05-17

<150> EP 16170174.3

<151> 2016-05-18

<160> 118

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> CDR序列

<400> 2

<210> 3

<211> 11

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<213> 人工序列

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<223> CDR序列

<400> 3

<210> 4

<211> 15

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<213> 人工序列

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<223> CDR序列

<400> 4

<210> 5

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<223> CDR序列

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<210> 6

<211> 9

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<213> 人工序列

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<223> CDR序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> CDR序列

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<223> CDR序列

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<213> 人工序列

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<223> CDR序列

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<223> CDR序列

<400> 11

<210> 12

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<223> CDR序列

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<223> CDR序列

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<210> 14

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<223> CDR序列

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<213> 人工序列

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<223> CDR序列

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<210> 19

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<213> 人工序列

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<223> 免疫球蛋白結構域

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<210> 20

<211> 111

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<213> 人工序列

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<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 20

<210> 21

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 免疫球蛋白結構域

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<213> 人工序列

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<223> 免疫球蛋白結構域

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<213> 人工序列

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<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 23

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<213> 人工序列

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<223> 免疫球蛋白結構域

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<213> 人工序列

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<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 25

<210> 26

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 免疫球蛋白結構域

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<213> 人工序列

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<223> 免疫球蛋白結構域

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<210> 28

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 28

<210> 29

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 29

<210> 30

<211> 218

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<213> 人工序列

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<223> 抗體鏈

<400> 30

<210> 31

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 抗體鏈

<400> 31

<210> 32

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 32

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 抗體鏈

<400> 33

<210> 34

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 34

<210> 35

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 35

<210> 36

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 36

<210> 37

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 37

<210> 38

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 38

<210> 39

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 39

<210> 40

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 40

<210> 41

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 41

<210> 42

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 42

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 43

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 44

<210> 45

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 45

<210> 46

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 46

<210> 47

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 47

<210> 48

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 48

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 49

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR序列

<400> 50

<210> 51

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 51

<210> 52

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 52

<210> 53

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 53

<210> 54

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 54

<210> 55

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 55

<210> 56

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 56

<210> 57

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 57

<210> 58

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 58

<210> 59

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 59

<210> 60

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 60

<210> 61

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 61

<210> 62

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 62

<210> 63

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 63

<210> 64

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 64

<210> 65

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 65

<210> 66

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 66

<210> 67

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 67

<210> 68

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 68

<210> 69

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 69

<210> 70

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 70

<210> 71

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 71

<210> 72

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 72

<210> 73

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 73

<210> 74

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 74

<210> 75

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 75

<210> 76

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 76

<210> 77

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 77

<210> 78

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 78

<210> 79

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 79

<210> 80

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 80

<210> 81

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 81

<210> 82

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 82

<210> 83

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 83

<210> 84

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 84

<210> 85

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 85

<210> 86

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 86

<210> 87

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 87

<210> 88

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 88

<210> 89

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 89

<210> 90

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 90

<210> 91

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 91

<210> 92

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 92

<210> 93

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 93

<210> 94

<211> 254

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 94

<210> 95

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 95

<210> 96

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 96

<210> 97

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 97

<210> 98

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 98

<210> 99

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 99

<210> 100

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 100

<210> 101

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 101

<210> 102

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 102

<210> 103

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 103

<210> 104

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 104

<210> 105

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 105

<210> 106

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 106

<210> 107

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 107

<210> 108

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 108

<210> 109

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 109

<210> 110

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體鏈

<400> 110

<210> 111

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 表位序列

<400> 111

<210> 112

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 表位序列

<400> 112

<210> 113

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 113

<210> 114

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 114

<210> 115

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 表位序列

<400> 115

<210> 116

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 表位序列

<400> 116

<210> 117

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 117

<210> 118

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白結構域

<400> 118

Claims

一種抗PD1抗體分子，其包含：(a)具有如SEQ ID NO：1(hcCDR1)、SEQ ID NO：2(hcCDR2)及SEQ ID NO：3(hcCDR3)所示之胺基酸序列之重鏈CDR及具有如SEQ ID NO：4(lcCDR1)、SEQ ID NO：5(lcCDR2)及SEQ ID NO：6(lcCDR3)所示之胺基酸序列之輕鏈CDR；(b)具有如SEQ ID NO：7(hcCDR1)、SEQ ID NO：8(hcCDR2)及SEQ ID NO：9(hcCDR3)所示之胺基酸序列之重鏈CDR及具有如SEQ ID NO：10(lcCDR1)、SEQ ID NO：11(lcCDR2)及SEQ ID NO：12(lcCDR3)所示之胺基酸序列之輕鏈CDR；或(c)具有如SEQ ID NO：13(hcCDR1)、SEQ ID NO：14(hcCDR2)及SEQ ID NO：15(hcCDR3)所示之胺基酸序列之重鏈CDR及具有如SEQ ID NO：16(lcCDR1)、SEQ ID NO：17(lcCDR2)及SEQ ID NO：18(lcCDR3)所示之胺基酸序列之輕鏈CDR。
如請求項1之抗PD1抗體分子，其包含選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恆定區組成之群之重鏈恆定區。
如請求項2之抗PD1抗體分子，其中該重鏈恆定區係IgG4。
如請求項3之抗PD1抗體分子，其中該重鏈恆定區係具有S241P突變之IgG4。
如請求項1至4中任一項之抗PD1抗體分子，其中該抗體分子具有：(a)具有如SEQ ID NO：19所示之胺基酸序列之重鏈可變結構域及具有如SEQ ID NO：20所示之胺基酸序列之輕鏈可變結構域；(b)具有如SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列之重鏈可變結構域及具有如SEQ ID NO：22所示之胺基酸序列之輕鏈可變結構域；(c)具有如SEQ ID NO：23所示之胺基酸序列之重鏈可變結構域及具有如SEQ ID NO：24所示之胺基酸序列之輕鏈可變結構域；(d)具有如SEQ ID NO：25所示之胺基酸序列之重鏈可變結構域及具有如SEQ ID NO：26所示之胺基酸序列之輕鏈可變結構域；或(e)具有如SEQ ID NO：27所示之胺基酸序列之重鏈可變結構域及具有如SEQ ID NO：28所示之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。
如請求項1至4中任一項之抗PD1抗體分子，其中該抗體分子具有：(a)具有如SEQ ID NO：29所示之胺基酸序列之重鏈及具有如SEQ ID NO：30所示之胺基酸序列之輕鏈；(b)具有如SEQ ID NO：31所示之胺基酸序列之重鏈及具有如SEQ ID NO：32所示之胺基酸序列之輕鏈；(c)具有如SEQ ID NO：33所示之胺基酸序列之重鏈及具有如SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列之輕鏈；(d)具有如SEQ ID NO：35所示之胺基酸序列之重鏈及具有如SEQ ID NO：36所示之胺基酸序列之輕鏈；或(e)具有如SEQ ID NO：37所示之胺基酸序列之重鏈及具有如SEQ ID NO：38所示之胺基酸序列之輕鏈。
一種經分離核酸分子，其編碼如請求項1至6中任一項之抗PD1抗體分子之重鏈可變結構域及/或輕鏈可變結構域。
一種表現載體，其含有包含編碼如請求項1至6中任一項之抗PD1抗體分子之重鏈可變結構域及/或輕鏈可變結構域之核苷酸序列之核酸分子。
一種宿主細胞，其具有編碼如請求項1至6中任一項之抗PD1抗體分子之重鏈之表現載體，及編碼如請求項1至6中任一項之抗PD1抗體分子之輕鏈之表現載體。
一種製造如請求項1至6中任一項之抗PD1抗體分子之方法，其包含以下步驟：在容許形成如請求項1至6中任一項之抗PD1抗體分子之條件下培養如請求項9之宿主細胞；及回收該抗PD1抗體分子。
如請求項10之方法，其另外包含純化該抗PD1抗體分子之步驟。
如請求項10或11之方法，其另外包含將該抗PD1抗體分子調配成醫藥組合物之步驟。
一種如請求項1至6中任一項之抗PD1抗體分子之用途，其用於製造用以治療對PD1拮抗治療有反應之癌症之藥劑。
如請求項13之用途，其中該癌症為實體腫瘤癌症或造血系統之癌症。
如請求項13之用途，其中該癌症為非小細胞肺癌(NSCLC)或小細胞肺癌(SCLC)。
如請求項13至15中任一項之用途，其中該藥劑進一步包含抗LAG3抗體分子，或與抗LAG3抗體分子共同投與。
如請求項16之用途，其中該抗PD1抗體分子係與抗LAG3抗體分子同時、並行、依序、相繼、交替或分開投與。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至6中任一項之抗PD1抗體分子及醫藥上可接受之載劑。
如請求項18之醫藥組合物，其進一步包含抗LAG3抗體分子。
如請求項18或19之醫藥組合物，其進一步包含一或多種其他治療劑。
一種套組，其包含如請求項1至6中任一項之抗PD1抗體分子及抗LAG3抗體分子。
如請求項21之套組，其進一步包含一或多種其他治療劑。