KR102114865B1 - 신규한 사이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 신규한 사이코스-6-인산 탈인산화 효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 사이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 방법{NOVEL PSICOSE-6-PHOSPHATE PHOSPHATASE, COMPOSITION FOR PRODUCING PSICOSE INCLUDING THE PHOSPHATASE, AND METHOD FOR PRODUCING PSICOSE USING THE PHOSPHATASE}

본 출원은 신규한 사이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

희소당의 일종인 사이코스는 자연계에 드물게 존재하는 단당류로 무화과, 포도, 잭푸르츠 등에 소량 존재한다. 사이코스는 설탕의 약 70% 정도의 감미도를 가지고 있으나 칼로리는 설탕의 5%에 불과하기 때문에 저칼로리 감미료로 이용할 수 있다. 또한 체지방 감소 및 혈당 조절 효과가 인정되고 있다.

초기에는 촉매제 또는 유기용매 조건하에서 화화적 이성질화 반응으로 사이코스를 생산하였으나 생산효율이 매우 낮았다. 이를 대체하고자 에피머화 효소를 이용하여 과당을 에피머화하여 사이코스를 전환하는 생물학적 방법이 개발되었으며, 현재까지 다양한 미생물 종에서 이와 같은 활성을 갖는 효소들이 보고되었다.

효소적 기술을 적용하여 사이코스를 제조할 수 있는 방법으로는 사이코스-3-에피머화 효소(D-psicose-3-epimerase, EC 5.1.3.30) 및 타가토스-3-에피머화 효소(D-tagatose-3-epimerase, EC 5.1.3.31)를 이용하여 과당(D-fructose)을 3-에피머화(3-epimerization, 3번 탄소 에피머화)하여 사이코스(D-psicose)를 생산할 수 있다.

다른 방법으로는 Chan 등(2008. Biochem. 47:9608-9617)은 과당-6-인산(D-fructose-6-phosphate) 및 사이코스-6-인산(D-psicose-6-phosphate)에 대해서 3-에피머화 반응을 수행할 수 있는 스트렙토코커스 파이로제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 리블로스-5-인산-3-에피머화효소(D-ribulose-5-phosphate-3-epimerase) 및 E. coli 유래의 사이코스-6-인산-3-에피머화 효소(D-psicose-6-phosphate-3-epimerase)를 보고하였으며, 이러한 효소들을 이용하여 과당-6-인산에서 사이코스-6-인산을 생성한 후 탈인산화 반응을 통해 사이코스를 제조할 수 있다. 효소 반응에 사용될 수 있는 과당 6-인산은 전분(starch), 말토덱스트린(maltodextrin), 수크로스(sucrose), 포도당 등의 원료들로부터 다양한 효소 조합 반응으로 생성될 수 있다.

상기 효소를 이용하는 단일 효소 반응은 가역적인 반응으로 기질인 과당과 산물인 사이코스 간에 일정 수준의 반응평형(reaction equilibrium)이 존재하며, 반응 효율이 기질의 약 20~35%로 보고되어 있다. 효소의 반응평형으로 인해 고순도의 사이코스를 제조하기 위해서는 효소 반응액에 잔존하는 과당(기질)을 분리해야 하는 추가 정제공정이 필요하다. 따라서 산업화에 적합한 고효율의 경제적인 사이코스 제조 방법이 요구되고 있다.

이러한 배경 하에, 본 출원인은 사이코스를 고효율로 생산하기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구한 결과, 신규한 사이코스-6-인산 탈인산 효소를 발굴하였으며 상기 효소가 다른 당류에 비해 사이코스-6-인산을 고선택적으로 탈인산화시켜 효율적으로 사이코스를 생산하는 것을 확인하여 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 일 목적은 메이오서무스(Meiothermus) 속 균주로부터 유래하고, 사이코스-6-인산을 선택적으로 탈인산화하는 것을 특징으로 하는, 사이코스-6-인산 탈인산화 효소(psicose-6-phosphate phosphatase)를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 일 목적은 본원에 기술된 사이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및/또는 상기 벡터를 발현하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 일 목적은 상기 탈인산효소, 이를 발현하는 형질전환 체 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는 사이코스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 일 목적은 메이오서무스(Meiothermus) 속 균주로부터 유래한 사이코스-6-인산 탈인산화 효소를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 출원의 일 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 하나의 양태로서 메이오서무스(Meiothermus) 속 균주로부터 유래한 사이코스-6-인산 탈인산화 효소를 제공한다.

본 출원의 상기 사이코스-6-인산 탈인산효소는 메이오써머스 실바너스(Meiothermus silvanus), 메이오써머스 타이완엔시스(Meiothermus taiwanensis), 메이오써머스 티미더스(Meiothermus timidus), 메이오써머스 쎄베레우스(Meiothermus cerbereus), 메이오써머스 클리아로필러스(Meiothermus chliarophilus), 메이오써머스 루버(Meiothermus ruber), 메이오써머스 루푸스 (Meiothermus rufus), 메이오써머스 테레(Meiothermus terrae), 메이오써머스 그라나티시우스(Meiothermus granaticius), 메이오써머스 하이포게우스(Meiothermus hypogaeus), 메이오써머스 루터우스(Meiothermus luteus), 메이오써머스 로사세우스(Meiothermus rosaceus), 메이오써머스 로세우스(Meiothermus roseus), 메이오써머스 카테니포만스(Meiothermus cateniformans)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 미생물로부터 유래한 효소인 것을 특징으로 한다.

본 출원의 사이코스-6-인산 탈인산효소는 사이코스-6-인산에 보다 선택적(특이적)으로 탈인산화 반응을 하며, 포도당-1-인산(D-glucose-1-phosphate), 포도당-6-인산(D-glucose-6-phosphate) 또는 과당-6-인산(D-fructose-6-phosphate)에는 비특이적일 수 있다.

본 출원의 사이코스-6-인산 탈인산효소는 pH 5.0 내지 9.0, 구체적으로 pH 6.0 내지 9.0, 보다 구체적으로는 pH 6.5 내지 8.5의 범위의 조건 하에 그 활성이 적합하게 발현될 수 있다. 또한, 본 출원의 사이코스-6-인산 탈인산효소는 40℃ 내지 80℃ 온도, 구체적으로는 40℃ 내지 60℃ 또는 45℃ 내지 55℃의 온도 범위의 조건에서 그 활성이 적합하게 발현될 수 있다.

본 출원의 사이코스-6-인산 탈인산효소의 분자량은 약 20 kDa 내지 약 28 kDa, 구체적으로 약 22kDa 내지 약 26kDa, 보다 구체적으로는 약 24kDa일 수 있다.

본 출원의 사이코스-6-인산 탈인산효소는 상기 효소 자체 또는 이를 발현하는 DNA(예컨대, 본 출원의 서열번호 5 내지 8의 염기 서열)를 균주에 형질전환시키고, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주로는 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterum glutamicum), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등이 있다.

본 출원의 일 구현 예에 따르면, 본 출원의 사이코스-6-인산 탈인산효소는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지거나 이들 각각과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%, 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 상동성 또는 동일성을 갖는 서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함하는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함하는 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

또한, 본 출원의 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함하는 사이코스-6-인산 탈인산화 효소와 상응하는 활성을 가지는 단백질이라면 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열 앞뒤에 단백질 변이에 아무런 영향을 주지 않는 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(synonymous mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하고, 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또한 본 출원의 범위 내에 속한다.

본 출원은 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 사이코스-6-인산 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산을 제공한다.

본 출원에서 용어, "핵산"은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다 (참조문헌: Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

구체적으로, 본 출원의 사이코스-6-인산 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산은 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 본 출원의 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함하는 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 범위에 포함될 수 있음은 자명하다.

본 출원의 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함하는 효소는, 메이오써머스 실바너스(Meiothermus silvanus), 메이오써머스 타이완넨시스(Meiothermus taiwanensis), 메이오써머스 티미더스(Meiothermus timidus) 또는 메이오써머스 쎄베레우스(Meiothermus cerbereus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 미생물로부터 유래한 효소인 것을 특징으로 한다.

본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.

용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.

본 출원은 또 다른 양태로서, 본원에 기재된 사이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 본 출원의 사이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산 또는 본 출원의 사이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 출원에서 용어 "벡터"는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 사이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 pET24a(+)-Mcer-A6Pase, pET24a(+)-Mtai-A6Pase, pET24a(+)-Msil-A6Pase 또는 pET24a(+)-Mtim-A6Pase일 수 있다.

본 출원에서 "형질전환"이란 용어는 표적 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현될 수 있도록 하는 것을 의미한다. 재조합된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 그 자체로 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 출원의 벡터로 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 코리네속 미생물, 에스케리키아속 미생물 또는 세라티아속 미생물일 수 있고, 구체적으로 대장균(E. coli)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 형질전환체는 E. coli BL21(DE3)/Mcer-A6Pase, E. coli BL21(DE3)/Mtai-A6Pase, E. coli BL21(DE3)/Msil-A6Pase 또는 E. coli BL21(DE3)/Mtim-A6Pase 일 수 있다.

본 출원의 또 다른 일 예로서, 상기 사이코스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 사이코스 생산용 조성물을 제공한다.

상기 사이코스 생산용 조성물은, 사이코스 제조 경로에 관여하는 효소 및/또는 기질[(i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 과당-6-인산-3-에피머화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및/또는 (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제]; 상기 사이코스 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물; 또는 상기 사이코스 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로 본 출원의 사이코스-6-인산 탈인산화 효소를 이용하여 사이코스를 생산할 수 있다면, 본 출원의 사이코스 생산용 조성물에 포함되는 효소 및 사이코스 생산에 이용되는 기질이 제한되지 않는다.

본 출원의 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는 포스페이트(phosphate)를 포도당에 인산화 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질은 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 상기 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질은 서열번호 18의 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.

본 출원의 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7)는 포스페이트를 포도당에 인산화 전이시켜 수크로스로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.

본 출원의 전분 액당화 효소인 α-아밀라아제(a-amylase, EC 3.2.1.1), 풀루란아제(pullulanse, EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(glucoamylase, EC 3.2.1.3) 및 이소아밀라아제(isoamylase)는 전분 또는 말토덱스트린을 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.

본 출원의 수크라아제(sucrase, EC 3.2.1.26)는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.

본 출원의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2)는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질은 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질은 서열번호 20의 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.

포도당인산화효소(glucokinase)는 포도당에 인산을 전이시켜 포도당-6-인산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당인산화효소는 폴리포스페이트 의존형 포도당인산화 효소일 수 있고 보다 구체적으로, 서열번호 21 또는 22의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당-6-인산-이성화효소는 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 상기 포도당-6-인산-이성화효소는 서열번호 24의 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.

본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 과당-6-인산을 사이코스-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.

본 출원의 사이코스 생산용 조성물은 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환시키는 활성을 가지는 단백질(예컨대, 4-a-글루카노트랜스퍼라아제 등)을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환시키는 활성을 가지는 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 효소일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다. 본원의 사이코스 생산용 조성물은 당해 사이코스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제에는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 및 등장화제 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원의 사이코스 생산용 조성물은 금속이온 또는 금속염을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 금속은 Ni, Mg, Co, Mn, Fe 및 Zn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 사이코스 생산용 조성물은 금속염을 추가로 포함할 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 NiSO₄, MgSO₄, MgCl₂, NiCl₂, CoSO₄, CoCl₂, MnCl₂, FeSO₄ 및 ZnSO₄로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 출원의 다른 양태는, 사이코스-6-인산에, 메이오서무스(Meiothermus) 속 균주로부터 유래한 사이코스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 사이코스-6-인산을 사이코스로 전환하는 단계를 포함하는 사이코스의 제조 방법에 관한 것이다.

전술한 양태에서 사이코스-6-인산 탈인산효소에 관한 사항은, 본 양태인 사이코스 제조방법에 있어서 동일하게 적용될 수 있다.

구체적으로, 상기 메이오서무스 속 균주 유래 사이코스-6-인산 탈인산효소는 메이오써머스 실바너스(Meiothermus silvanus), 메이오써머스 타이완엔시스(Meiothermus taiwanensis), 메이오써머스 티미더스(Meiothermus timidus), 메이오써머스 쎄베레우스(Meiothermus cerbereus), 메이오써머스 클리아로필러스(Meiothermus chliarophilus), 메이오써머스 루버(Meiothermus ruber), 메이오써머스 루푸스 (Meiothermus rufus), 메이오써머스 테레(Meiothermus terrae), 메이오써머스 그라나티시우스(Meiothermus granaticius), 메이오써머스 하이포게우스(Meiothermus hypogaeus), 메이오써머스 루터우스(Meiothermus luteus), 메이오써머스 로사세우스(Meiothermus rosaceus), 메이오써머스 로세우스(Meiothermus roseus), 및 메이오써머스 카테니포칸스(Meiothermus cateniformans)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 미생물로부터 유래한 효소일 수 있다.

본 출원의 제조방법에서 사이코스-6-인산 탈인산화 효소는 본원에 기술된 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지거나 포함하는 효소일 수 있다.

본 출원의 방법은 사이코스-6-인산을 사이코스로 전환하는 단계 이전, 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 과당-6-인산-3-에피머화 효소, 상기 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 사이코스-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 출원의 방법은 상기 과당-6-인산을 사이코스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 출원의 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 출원의 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 출원의 방법은 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 출원의 방법은 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 출원은 또 다른 일 양태로서, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 이노시톨-모노-포스파타아제; 과당-6-인산-3-에피머화효소; 포도당-6-인산-이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 사이코스의 제조방법을 제공한다.

본 출원의 제조방법에 따른 사이코스 제조에 있어서 각 기질과 효소의 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, 구체적으로 pH 6.0 내지 9.0, 보다 구체적으로는 pH 6.5 내지 8.5의 범위의 조건에서 수행될 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 30℃ 내지 80℃, 35℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 30 ℃ 내지 70℃, 35℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 65℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 55℃ 또는 45℃ 내지 55℃ 온도 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 0.1시간 내지 36시간 동안, 0.1시간 내지 24시간 동안, 0.1시간 내지 12시간 동안, 0.1시간 내지 6시간 동안, 0.2시간 내지 36시간 동안, 0.2시간 내지 24시간 동안, 0.2시간 내지 12시간 동안, 0.2시간 내지 6시간 동안, 0.3시간 내지 36시간 동안, 0.3시간 내지 24시간 동안, 0.3시간 내지 12시간 동안, 0.3시간 내지 6시간 동안, 0.4시간 내지 36시간 동안, 0.4시간 내지 24시간 동안, 0.4시간 내지 12시간 동안, 0.4시간 내지 6시간 동안, 0.5시간 내지 36시간 동안, 0.5시간 내지 24시간 동안, 0.5시간 내지 12시간 동안, 0.5시간 내지 6시간 동안, 1시간 내지 48시간 동안, 1시간 내지 36시간 동안, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 12시간 동안, 1시간 내지 6시간 동안, 3시간 내지 48시간 동안, 3시간 내지 36시간 동안, 3시간 내지 24시간 동안, 3시간 내지 12시간 동안, 3시간 내지 6시간 동안, 6시간 내지 48시간 동안, 6시간 내지 36시간 동안, 6시간 내지 24시간 동안, 6시간 내지 12시간 동안, 12시간 내지 48시간 동안, 12시간 내지 36시간 동안, 12시간 내지 24시간 동안, 18시간 내지 48시간 동안, 18시간 내지 36시간 동안 또는 18시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.

상기 접촉 조건은 예컨데, 사이코스-6-인산 탈인산화 효소에 의해 사이코스 제조 시에 적용할 수 있다. 상기 접촉은 완충용액의 존재하에 실시할 수 있으며, 예컨대, 인산나트륨 또는 Tris-HCl 완충용액을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 사이코스-6-인산 탈인산화 효소에 관한 접촉은 pH 6 내지 9의 조건, 구체적으로는 Tris-HCl 완충용액 중에서 실시할 수 있다.

본 출원의 방법은 사이코스를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 정제는 특별히 제한되지 아니하며, 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 크로마토그래피, 분별 결정 및 이온 정제 등을 들 수 있다. 상기 정제 방법은 하나만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다. 예를 들어, 크로마토그래피를 통해 사이코스 생성 반응물을 정제할 수 있으며, 상기 크로마토그래피에 의한 당의 분리는 분리하고자 하는 당과 이온 수지에 부착된 금속 이온 사이의 약한 결합력의 차이를 이용하여 수행될 수 있다.

또한, 본 출원은 본 출원의 정제하는 단계의 전 또는 후에 탈색, 탈염 또는 둘 다를 실시하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 불순물 없이 보다 정제된 사이코스 반응물을 얻을 수 있다.

본 출원의 신규한 사이코스-6-인산 탈인산 효소는 내열성이 있어 사이코스-6-인산을 사이코스로 전환하는 경로를 산업적으로 수행할 수 있고, 경제적인 원료인 포도당 또는 전분(예컨대, 말토덱스트린)을 사용하여 사이코스 합성 경로의 진행을 가능하게 하며, 비가역 반응 경로인 사이코스-6-인산 탈인산화 반응에 의하여 사이코스 생산을 가능하게 하는 바 사이코스로의 전환율을 현저히 높일 수 있다.

또한, 본 출원의 사이코스 제조방법은 사이코스-6-인산에 대한 기질 특이성이 높은 사이코스-6-인산 탈인산 효소를 이용하기 때문에 사이코스 전환율 상승에 따른 고농도의 사이코스 반응 결과물을 포함함으로 분리정제 공정을 단순화 또는 제거할 수 있는바, 제조방법이 간단하면서도 경제적인 이점이 있다.

도 1은 발현 및 정제된 사이코스-6-인산 탈인산 재조합 효소(SM: 단백질 사이즈 마커, Mcer: pET24a(+)-Mcer-A6Pase, Mtai: pET24a(+)-Mtai-A6Pase, Msil: pET24a(+)-Msil-A6Pase, Mtim: pET24a(+)-Mtim-A6Pase)의 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 분석결과이다.
도 2는 사이코스-6-인산 탈인산 반응을 위하여 정제된 재조합 효소들(Mcer: Mcer-A6Pase, Mtai: Mtai-A6Pase, Msil: Msil-A6Pase, Mtim: Mtim-A6Pase, Kpn: Klebsiella pneumonia 유래의 haloacid dehalogenase-like hydrolase)의 사이코스 6-인산에 대한 탈인산 효소활성(%) 비교 결과이다.
도 3은 다양한 pH 조건에서의 정제된 재조합 효소들(Mcer: Mcer-A6Pase, Mtai: Mtai-A6Pase, Msil: Msil-A6Pase, Mtim: Mtim-A6Pase)의 사이코스 6-인산에 대한 탈인산 효소활성(%)의 비교 결과이다.

이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 내열성 사이코스-6-인산 탈인산화 효소를 생산하는 형질전환 균주의 제조

Meiothermus 속 미생물로부터 사이코스-6-인산을 탈인산화하여 사이코스를 생산하는 탈인산화 효소 활성을 가질 것으로 예상되는 유전자를 선발하고, 상기 유전자를 포함한 재조합 발현벡터 및 형질전환체를 제조하였다.

구체적으로, Genbank에 등록된 메이오서무스 속 미생물 중 메이오써머스 쎄베레우스(Meiothermus cerbereus) DSM11376, 메이오써머스 타이완엔시스(Meiothermus taiwanensis) DSM14542, 메이오써머스 실바너스 (Meiothermus silvanus) DSM9946 및 메이오써머스 티미더스(Meiothermus timidus) DSM17022의 유전자 서열들을 대상으로 사이코스-6-인산 탈인산화 효소로 예상되는 유전자를 선발하고, 상기 유전자의 아미노산 서열(서열번호 1, 2, 3, 4) 및 뉴클레오타이드 서열(서열번호 5, 6, 7, 8) 정보를 바탕으로 정방향 프라이머(서열번호 9, 10, 11, 12) 및 역방향 프라미어(서열번호 13, 14, 15, 16)를 고안하여 합성하였다.

상기 합성된 프라이머를 이용하여 M. cerbereus DSM11376, M taiwanensis DSM14542, M. silvanus DSM9946 및 M. timidus DSM17022의 게노믹(genomic) DNA를 주형으로 PCR 반응 (94℃에서 1분, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 반응시키는 조건을 하나의 사이클로 하여 32 사이클)을 실시하여 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 PCR 정제 키트(purification kit, Quiagen)를 이용하여 정제하고, 제한효소 NdeI과 xhoI을 사용하여 pET24a(+)(novagen, USA) 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 합성하였다. pET24a(+)-Mcer-A6Pase, pET24a(+)-Mtai-A6Pase, pET24a(+)-Msil-A6Pase 및 pET24a(+)-Mtim-A6Pase라 명명된 재조합 발현 벡터가 합성되었다.

상기 재조합 벡터를 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 형질전환 균주를 E. coli BL21(DE3)/Mcer-A6Pase, E. coli BL21(DE3)/Msil-A6Pase, E. coli BL21(DE3)/Mtai-A6Pase 및 E. coli BL21(DE3)/Mtim-A6Pase 로 각각 명명하고, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 11월 22일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12171P, KCCM12172P, KCCM12173P, 및 KCCM12174P를 각각 부여받았다.

실시예 2: 사이코스 제조 경로에 필요한 효소 및 기질의 제조

실시예 2-1: 사이코스 제조 경로에 필요한 효소 제조

써모토가속 미생물 유래 본 출원의 사이코스 제조 경로에 필요한 내열성 효소인 α-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase), 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase), 포도당-6-인산-이성화효소(glucose-6-phosphate-isomerase) 및 과당-6-인산-3-에피머화효소(fructose-6-phosphate-3-epimerase)를 제공하기 위하여 상기 효소들로 예상되는 유전자(상기 효소들의 기재 순서대로 각각 ct1, ct2, tn1 및 fp3e)를 선발하였다.

상기 선발한 유전자의 염기서열[상기 효소들의 기재 순서대로 각각 서열번호 18, 20, 24 및 26] 및 아미노산 서열[상기 효소들의 기재 순서대로 각각 서열번호 17, 19, 23 및 25]을 기반으로 정방향 프라이머(forward primer) 서열번호 29, 31, 33 및 35 및 역방향 프라이머(reverse primer) 서열번호 30, 32, 34 및 36을 고안하여 합성하고, 이를 이용하여 써모토가 네아폴리타나 또는 써모토가 마리티마의 염색체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 68℃에서 2분 동안 중합하였고, 상기 반응들은 25회 반복한 조건을 사용하여 각 효소의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 각 효소 유전자는 제한효소 Nde 및 Xho을 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen사)에 삽입하여 각각 pET21a-CJ_ct1, pET21a-CJ_ct2, pET21a-CJ_ tn1 및 pET21a-CJ_fp3e라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다. 상기 재조합 발현벡터를 통상적인 형질전환 방법(참조: Sambrook et al. 1989)으로 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 형질전환된 미생물을 제조하고 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1(KCCM11990P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2(KCCM11991P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1(KCCM11992P) 및 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_fp3e(KCCM11848P)로 명명하였다. 상기 균주들은 부다페스트 조약 하에 2017년 3월 20일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 KCCM11990P, KCCM11991P, 및 KCCM11992P의 수탁번호를 각각 부여받았으며, 2016년 6월 23일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCMP11848P를 부여 받았다.

실시예 2-2: 사이코스 제조 경로에 필요한 기질 제조

전분, 말토덱스트린, 수크로스, 포도당-1-인산, 포도당, 포도당-6-인산, 과당-6-인산으로부터 본 출원의 효소의 기질인 사이코스-6-인산을 수득할 수 있는바, 상기 기질 간에 전환이 가능하다는 것은 당업자에게 알려져 있다. 이에 다양한 기질을 토대로 사이코스-6-인산 생성을 확인하였다.

구체적으로, 수크로스에 수크라아제 등 효소를 처리하여 포도당으로 전환하는 과정은 이미 공지되어 있는바, 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래 내열성의 α-글루칸 포스포릴라아제(서열번호 17)를 이용하여 전분 및 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산 제조를 확인 하였다.

상기 제조된 포도당에 데이노코커스 지오써말리스(Deinococcus geothermalis) 유래 내열성 포도당인산화효소(서열번호 21), 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila) 유래 내열성 포도당인산화효소(서열번호 22)를 처리하였고, 포도당-1-인산에 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래 내열성의 포스포글루코무타아제(서열번호 19)를 처리하여, 각각 포도당-6-인산으로 전환되는 것을 전환을 확인하였다.

상기 제조된 포도당-6-인산에 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래 내열성의 포도당-6-인산-이성화효소(서열번호 23)를 처리하여 과당-6-인산이 생성되는 것을 확인하였으며, 여기에 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래 내열성의 과당-6-인산-3-에피머화 효소(서열번호 25)를 처리하여 본 발명의 효소의 기질인 사이코스-6-인산이 생성되는 것을 확인하였다.

이를 통해, 다양한 기질에 효소를 처리하여 사이코스-6-인산으로 전환시킬 수 있음을 확인하였는 바, 다양한 물질로부터 사이코스-6-인산을 수득하는 단계가 본 발명의 효소를 이용하여 사이코스-6-인산을 사이코스로 전환시키기 전에 수행될 수 있음이 자명하다.

실시예 3: 내열성 사이코스-6-인산 탈인산화 효소의 생산 및 정제

상기 실시예 1에서 제조한 E. coli BL21(DE3)/Mcer-A6Pase, E. coli BL21(DE3)/Mtai-A6Pase, E. coli BL21(DE3)/Msil-A6Pase 및 E. coli BL21(DE3)/Mtim-A6Pase로부터 사이코스-6-인산 탈인산화 효소를 생산하기 위하여, 4종의 E. coli BL21(DE3)를 LB-카나마이신(Kanamycin) 5 ml 배지(Difco)에 접종하고, 600 nm에서 측정한 흡광도가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200 rpm으로 진탕배양하였다. 이후, 상기 진탕배양한 배양액을 500 ml LB-카나마이신 배지에 접종하고, 600 nm에서의 흡광도가 0.7이 되었을 때 0.5 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가한 후 37℃, 150 rpm 조건에서 16시간 동안 본 배양하였다.

상기 본 배양한 배양액은 8000 rpm에서 20분간 원심분리하여 균체만을 회수하고, 0.85 %(w/v) NaCl로 2회 세척한 다음, 용해완충액(lysis buffer, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0, 300 mM NaCl)에 혼탁시킨 후, 음파진동기를 사용하여 4℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 13,000 rpm으로 4에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 회수한 후, 미리 상기 용해 완충액으로 평형시킨 Ni-NTA 컬럼(Ni-NTA Superflow, Qiagen)에 적용하고, 250 mM 이미다졸(imidazole)이 함유된 완충용액(50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH 7.0)을 순차적으로 흘려주어 정제된 사이코스-6-인산 탈인산화 효소를 획득하였다. 상기 4종의 Mcer-A6Pase, Mtai-A6Pase, Msil-A6Pase 및 Mtim-A6Pase는 SDS-PAGE 결과, 단량체의 크기가 약 24kDa임을 확인하였다(도 1).

실시예 4: 내열성 사이코스-6-인산 탈인산화 효소의 활성 확인

4종의 탈인산화 효소 Mcer-A6Pase, Mtai-A6Pase, Msil-A6Pase 및 Mtim-A6Pase가 사이코스-6-인산을 기질로 하여 탈인산화된 사이코스를 생산하며, 사이코스-6-인산에 특이적인지 여부를 확인하였다.

사이코스 6-인산 시약은 구입이 어려운 점에서 프럭토스 6-인산 에피머화 효소를 이용하여 프럭토스 6-인산으로부터 사이코스 6-인산을 생성시킨 후, 효소 반응액을 정제과정 없이 A6Pase의 효소반응의 기질로 사용하였다. 프럭토스 6-인산 에피머화 효소의 반응 조건은 1%의 D-프럭토스 6-인산 및 0.1 mM ZnSO₄이 포함된 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.0)에 프럭토스 6-인산 에피머화 효소를 첨가하고 50℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응 후 용액은 프럭토스 6-인산과 사이코스 6-인산을 각각 약 0.7 중량%, 0.3 중량%로 포함하였다. 프럭토스 6-인산 에피머화 효소 반응용액(프럭토스 6-인산과 사이코스 6-인산 혼합 용액) 50 중량%, 0.1mM MgCl₂가 포함된 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.0) 50 중량%에 각각의 사이코스 6-인산 탈당화 효소를 첨가하고 50℃에서 30분 동안 반응시켰다.

글루코스 1-인산에 대한 효소의 활성을 평가하기 위해 0.5 중량% 글루코스 1-인산, 0.1mM MgCl₂가 포함된 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.0)에서 상기 제조된 각각의 사이코스 6-인산 탈당화 효소를 첨가하고 50℃에서 30분 동안 반응시켰다

이후, 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시킨 후, HPLC 분석을 통하여 사이코스 생성을 확인하였다. 상기 HPLC 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector(Agilent 1260 RID)를 이용하였고, 이동상 용매는 물을 사용하였으며, 온도는 80℃, 유속은 0.6 ml/min으로 수행하였다. 인산화 기질에 대한 효소활성(%)은 '탈인산화 생성물의 양/인산화 기질의 양 X 100 '으로 계산하였다. 대조군으로 사이코스 6-인산을 탈인산화 시키는 클레브시엘라 폐렴균(Klebsiella pneumonia) 유래의 haloacid dehalogenase-like hydrolase(Kpn HAD)를 사용하였다.

그 결과, 4종의 탈인산화 효소 Mcer-A6Pase, Mtai-A6Pase, Msil-A6Pase 및 Mtim-A6Pase는 사이코스 6-인산의 탈인산화 역가가 확인되었으며, 기존에 알려진 사이코스-6-인산 탈인산효소 Kpn HAD와 비교시에도, 사이코스-6-인산에 대해 더 높은 탈인산화 반응성을 나타내는 것을 확인하였다(도 2). 또한 글루코스-1-인산에 대한 탈인산화 활성은 거의 없어 본 발명의 효소가 다른 당 대비 사이코스-6-인산에 대한 선택성 및 특이성을 갖는 것을 확인하였다.

실시예 5: pH에 따른 탈인산화 효소의 활성 확인

반응 용액이 4종의 탈인산화 효소(Mcer-A6Pase, Mtai-A6Pase, Msil-A6Pase 및 Mtim-A6Pase)의 활성에 미치는 영향을 알아보고자 다양한 pH 범위(pH 6-9)에서 활성을 비교하였다. 효소 반응에 사용된 완충용액을 제외하고 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 활성을 측정하였다. pH 6, 7은 인산나트륨 완충용액, pH 7, 8, 9는 Tris-HCl 완충용액을 사용하였으며, 완충용액의 농도는 50 mM이다.

그 결과, 4종의 탈인산화 효소(Mcer-A6Pase, Mtai-A6Pase, Msil-A6Pase 및 Mtim-A6Pase)는 인산나트륨 완충용액보다는 상대적으로 Tris-HCl 완충용액에서 사이코스-6-인산의 탈인산화 활성이 높았다. 또한 Mcer-A6Pase, Mtai-A6Pase는 pH 7에서 가장 높은 활성을 보이는 반면, Msil-A6Pase, Mtim-A6Pase는 pH 8에서 가장 높은 역가가 확인되었다(도 3).

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM12171P 20171122 한국미생물보존센터(국외) KCCM12172P 20171122 한국미생물보존센터(국외) KCCM12173P 20171122 한국미생물보존센터(국외) KCCM12174P 20171122 한국미생물보존센터(국외) KCCM11990P 20170320 한국미생물보존센터(국외) KCCM11991P 20170320 한국미생물보존센터(국외) KCCM11992P 20170320 한국미생물보존센터(국외) KCCM11848P 20160623

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> NOVEL PSICOSE-6-PHOSPHATE PHOSPHATASE, COMPOSITION FOR PRODUCING PSICOSE INCLUDING THE PHOSPHATASE, AND METHOD FOR PRODUCING PSICOSE USING THE PHOSPHATASE <130> KPA180998-KR-P1 <150> KR 10-2017-0167873 <151> 2017-12-08 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amio acid sequence of psicose 6-phosphatase from Meiothermus cerbereus <400> 1 Met Lys Leu Lys Ala Leu Leu Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Ala Asp 1 5 10 15 Thr Asp Arg Leu His Glu Gln Ala Trp Leu Glu Gly Leu Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Leu Gln Gly Asp His Thr Phe Tyr Gln Thr Gln Ile Ser Gly Gly 35 40 45 Leu Asn Pro Glu Ile Val Gln Arg Leu Leu Pro Gln Leu Ser Gln Ala 50 55 60 Glu Ala Glu Ala Phe Leu Glu Gln Lys Glu Ala Arg Phe Arg Glu Leu 65 70 75 80 Ala Ser Glu Val Gln Pro Leu Pro Gly Leu Gly Thr Leu Trp Asp Trp 85 90 95 Ala Gln Glu Gln Asn Leu Arg Arg Ala Leu Val Ser Asn Ala Pro Arg 100 105 110 Glu Asn Ala Gln Tyr Leu Leu Lys Arg Leu Gly Leu 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atgatttcat atccctctac gaactcacca ttgaaaggtt caaggattac 240 atggagaaag aagacacctg gttcaacgtg aactaccccg aatgggacga gaagatcgtc 300 tacatgtgta tggagtacgg tttgaccaaa gcccttccga tctactccgg tggtcttgga 360 atcctcgcgg gagaccatct caaatccgca agcgatcttg gacttcctct catagcgatc 420 ggacttctct acaaacatgg atatttcacc cagcagatcg acagagatgg aaaacagata 480 gagattttcc ctgattacaa cccagaggac ttacccatga agcccctgaa ggatgaaaag 540 ggaaaccagg tgatcgtgga ggttcctctc gacagtaccg tggtgaaggc acgtgttttt 600 gaagtgaagg taggaagggt gagtctgtac ctgctcgatc cggacatcga ggaaaacgag 660 gaacgataca gaaagatctg caactacctt tacaacccgg aacccgatgt gagggtctcc 720 caggagatac tcctcggaat tgggggaatg aagcttctca gggctctgaa cctgaaacca 780 ggagtcatcc atctgaacga aggacatccg gcgttctctt ccctcgaaag gataaagaac 840 tacatggaag aaggatattc cttcacagag gcccttgaga tcgtgagaca gacgagtgtg 900 tttacaaccc acacacccgt tcccgctgga cacgacagat ttccctttga cctcgtggaa 960 aagaaacttt cgaaattctt cgaaggattc gaaaagagaa atcttctcat ggatcttggg 1020 aaagatgaaa caggcagttt caacatgacg tatcttgccc tgagaacgtc ctctttcata 1080 aacggcgtga gcaaactgca tgcggaagtt tccagaagga tgttcaaaaa cgtgtggcag 1140 ggtgttcccg tggaggaaat accgatcgaa gggataacga acggcgttca catgggaacc 1200 tggatcaacc gtgagatgag aaaactgtac gacagatatc tcggaagggt atggagagat 1260 cacaccgacc ttgagggtat ctggtacggt gttgacagga ttccagatga agaactctgg 1320 caggctcacc tgagggcaaa gaagagattc atcgagtaca taaaagaatc ggtaagaaga 1380 agaaacgaga gactgggaat cgacgaagat gtgccgaaca tcgatgaaaa ttcgctcatc 1440 ataggttttg caagaaggtt tgccacttac aagagggcag ttctcctgct cagcgatctg 1500 gagagactca agaagatcct caacgatcca gaaagacccg tttacgtggt ctatgcgggg 1560 aaggcccatc caagggacga tgcggggaag gaatttttga aacgcatcta cgaagtctcg 1620 cagatgcctg agttcaaaaa caggatcatc gtactggaaa actacgacat tggaatggca 1680 cggctcatgg tgtcgggagt ggatgtgtgg ctgaacaacc cgagaagacc catggaagca 1740 agtggaacaa gcggaatgaa ggcagcagcc aacggagttc ttaacgcgag tgtttacgat 1800 ggatggtggg ttgaagggta caacggcaga aacggctggg tcataggcga tgaaagcgtt 1860 cttccagaga cggaagtgga cgatcccagg gacgcagaag cactctacga tctcctcgaa 1920 aacgaaatca tcccaaccta ctacgaaaac aaagaaaagt ggatcttcat gatgaaagag 1980 agcataaaga gtgttgctcc aagattcagc accaccagaa tgctcaaaga atacacggag 2040 aagttctaca taaagggact tgtgaacaaa gaatggcttg aaagaaaaga aaacgccgaa 2100 aggtttggtg catggaagga aaggatcctc agaaactgga gcagcgtttc catagaaaga 2160 atcgtccttg aggacacaag gagtgttgag gtgacggtga aactgggaga cctttcacct 2220 gatgatgtac tggttgaact tttgattgga agaggagaaa gcatggaaga tctggagatc 2280 tggaaggtga tacagataag aaagcacaga agggaagggg atctgttcat ctacagttat 2340 gtcaacggtg ccctcggtca tcttggctct ccgggatggt tctacgcggt gagggtgcta 2400 ccttatcatc cgaaacttcc caccagattc ttgccggaga tacctgtggt gtggaaaaag 2460 gttctcgggt ga 2472 <210> 19 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of CT2 <400> 19 Met Ile Gly Tyr Gln Ile Tyr Val Arg Ser Phe Arg Asp Gly Asn Phe 1 5 10 15 Asp Gly Val Gly Asp Phe Lys Gly Leu Lys Gly Ala Ile Ser Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu Leu Gly Val Asp Phe Val Trp Leu 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of CT2 <400> 20 atgataggct accagatcta cgtgagatca ttcagggatg gaaacttcga tggtgtgggg 60 gatttcaaag gattgaaagg tgcgatttcc tacctgaaag aactgggtgt tgattttgtc 120 tggctcatgc ccgtcttttc ctccatttcc ttccacgggt atgacgtggt ggatttttat 180 tctttcaaag ccgagtacgg agacgagaaa gactttagag agatgatcga ggcgttccac 240 gacaacggta taaaagtcgt tctcgatctt cccatccatc atactggttt cctccatgtg 300 tggtttcaga aagccctgaa aggagatcca cactacaggg attattacgt atgggcgagt 360 gaaaaaacgg atctggacga aagaagagag tgggacaacg aaaggatctg gcatcctctg 420 gaggacggaa ggttctacag aggacttttc ggtcccctct cacccgatct gaactacgat 480 aacccgcagg tttttgaaga gatgaagaag gtggtttatc accttcttga aatgggagtg 540 gacggattca gattcgacgc agcaaagcac atgagagata ctctggaaca gaacgttcgc 600 ttttggaggt atttcctctc cgatattgag ggaatattcc ttgcggaaat ctgggcagaa 660 tccaaagttg tggatgaaca cggcaggata ttcggctaca tgctaaattt cgatacctca 720 cactgtatta aggaagcggt gtggaaggaa aacttcaaag tgttgatcga gtcgatcgaa 780 agggccctgg ttggaaaaga ttatctgccg gtgaacttca catcgaacca tgatatgtca 840 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accttgccct tcattattcg ttgagaccac tgaactggaa cgagatgtcg 300 agagaggaaa gaaacggtta tgcgagagtc ttcgtggtgg acaacgtaga tcccgatctc 360 atggcctccg tccttgatag gatagatctg aagacaacgc tgttcaacgt gatctcaaaa 420 tctggatcca cggctgaggt tatggcgaat tactcgatcg caaggggaat cctggaggct 480 aatggtctgg acccgaaaga acacatcctc atcacaacag atccagagaa gggctttttg 540 agaaaagtag tgaaagaaga gggcttcaga agtcttgagg tccctcccgg cgttggagga 600 aggttcagcg tgctgacgcc cgttggcctc ttctctgcca tggcggaggg tatcgacata 660 gaagaactcc acgacggtgc ccgggatgcg ttcgagagat gcaagaagga agacctgttc 720 gaaaatccag cggcgatgat cgccctcaca cactatctct atctgaagag aggaaagagc 780 atctccgtca tgatggccta ctccaacagg atgacctacc tcgtggactg gtacagacag 840 ctgtgggcag aaagtctggg aaagagatac aacctgaaag gagaggaggt cttcacgggt 900 cagaccccgg tgaaggcaat aggagccacc gatcagcact ctcagataca gctttacaac 960 gagggcccaa acgacaaagt gataacgttt ttgcggttgg aaaacttcga tagagagatc 1020 ataataccgg acaccggaag agaagagctc aaataccttg caagaaaaag actctctgaa 1080 cttctccttg cagaacagac aggaacagag gaagccctaa ggaaaaacga cagaccgaac 1140 atgaaggtga tcttcgacag actcacctct tacaatgtgg gccagttctt cgcttattat 1200 gaagccgcaa ctgctttcat ggggtatctc ctcgagatca acccgtttga tcagccgggt 1260 gtggaacttg gaaagaagat cacgtttgcc ctcatgggaa gggaaggtta cgaatacgaa 1320 ataaaagatc gcaccaagaa ggtgatcata gaatga 1356 <210> 25 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of FP3E <400> 25 Met Met Val Lys Ile Ala Ala Ser Ile Leu Ala Cys Asp Leu Ala Arg 1 5 10 15 Leu Ala Asp Glu Val Lys Arg Val Glu Glu His Ile Asp Met Val His 20 25 30 Phe Asp Val Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Ile Ser Phe Gly Leu 35 40 45 Pro Val Leu Lys Ala Leu Arg Lys Glu Thr Ser Leu Pro Ile Ser Val 50 55 60 His Leu Met Ile Thr Asn Pro Glu Asp Tyr Val Asp Arg Phe Val Glu 65 70 75 80 Glu Gly Ala Asp Met Val Ala Val His Tyr Glu Thr Thr Pro His Leu 85 90 95 His Arg Ile Val His Arg Ile Lys Asp Leu Gly Ala Lys Ala Phe Val 100 105 110 Ala Leu Asn Pro His Thr Pro Val Phe Leu Leu Ser Glu Ile Ile Thr 115 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ctgagatcat aacggatgtg gatggcgtac tcgtgatgag tgtgaacccg 420 ggcttttctg gtcagagatt cattgcaagg agtctggaaa aaataaggag tctgaagaag 480 atgataaggg atctgggact cgaaacggag atcatggtcg atggtggtgt caacgaagaa 540 aacgcttcta tcttaataaa gaacggtgcg acgatccttg taatggggta cggtatcttc 600 aaaaacgaaa actatgtgga actggtgaga tccatcaagc aggaaagagg ggaatctgct 660 ggctga 666 <210> 27 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of TN2 <400> 27 Met Ile Gly Tyr Gln Ile Tyr Val Arg Ser Phe Arg Asp Gly Asn Phe 1 5 10 15 Asp Gly Val Gly Asp Phe Lys Gly Leu Lys Gly Ala Ile Ser Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu Leu Gly Val Asp Phe Val Trp Leu Met Pro Val Phe Ser Ser 35 40 45 Ile Ser Phe His Gly Tyr Asp Val Val Asp Phe Tyr Ser Phe Lys Ala 50 55 60 Glu Tyr Gly Asp Glu Lys Asp Phe Arg Glu Met Ile Glu Ala Phe His 65 70 75 80 Asp Asn Gly Ile Lys Val Val Leu Asp Leu Pro Ile His His Thr Gly 85 90 95 Phe Leu His Val Trp Phe Gln Lys Ala Leu Lys Gly Asp Pro His Tyr 100 105 110 Arg Asp Tyr Tyr Val Trp Ala Ser Glu Lys Thr Asp Leu Asp Glu Arg 115 120 125 Arg Glu Trp Asp Asn Glu Arg Ile Trp His Pro Leu Glu Asp Gly Arg 130 135 140 Phe Tyr Arg Gly Leu Phe Gly Pro Leu Ser Pro Asp Leu Asn Tyr Asp 145 150 155 160 Asn Pro Gln Val Phe Glu Glu Met Lys Lys Val Val Tyr His Leu Leu 165 170 175 Glu Met Gly Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His Met Arg 180 185 190 Asp Thr Leu Glu Gln Asn Val Arg Phe Trp Arg Tyr Phe Leu Ser Asp 195 200 205 Ile Glu Gly Ile Phe Leu Ala Glu Ile Trp Ala Glu Ser Lys Val Val 210 215 220 Asp Glu His Gly Arg Ile Phe Gly Tyr Met Leu Asn Phe Asp Thr Ser 225 230 235 240 His Cys Ile Lys Glu Ala Val Trp Lys Glu Asn Phe Lys Val Leu Ile 245 250 255 Glu Ser Ile Glu Arg Ala Leu Val Gly Lys Asp Tyr Leu Pro Val Asn 260 265 270 Phe Thr Ser Asn His Asp Met Ser Arg Leu Ala Ser Phe Glu Gly Gly 275 280 285 Leu Ser Glu Glu Lys Val Lys Leu Ser Leu Ser Ile Leu Phe Thr Leu 290 295 300 Pro Gly Val Pro Leu Ile Phe Tyr Gly Asp Glu Leu Gly Met Lys Gly 305 310 315 320 Ile Tyr Arg Lys Pro Asn Thr Glu Val Val Leu Asp Pro Phe Pro Trp 325 330 335 Ser Glu Asn Met Cys Val Glu Gly Gln Thr Phe Trp Lys Trp Pro Ala 340 345 350 Tyr Asn Asp Pro Phe Ser Gly Val Ser Val Glu Tyr Gln Arg Arg Asn 355 360 365 Arg Asp Ser Ile Leu Ser His Thr Met Arg Trp Ala Gly Phe Arg Gly 370 375 380 Glu Asn His Trp Leu Asp Arg Ala Asn Ile Glu Phe Leu Cys Lys Glu 385 390 395 400 Glu Lys Leu Leu Val Tyr Arg Leu Val Asp Glu Gly Arg Ser Leu Lys 405 410 415 Val Ile His Asn Leu Ser Asn Gly Glu Met Val Phe Glu Gly Val Arg 420 425 430 Val Gln Pro Tyr Ser Thr Glu Val Val 435 440 <210> 28 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of TN2 <400> 28 atgataggct accagatcta cgtgagatca ttcagggatg gaaacttcga tggtgtgggg 60 gatttcaaag gattgaaagg tgcgatttcc tacctgaaag aactgggtgt tgattttgtc 120 tggctcatgc ccgtcttttc ctccatttcc ttccacgggt atgacgtggt ggatttttat 180 tctttcaaag ccgagtacgg agacgagaaa gactttagag agatgatcga ggcgttccac 240 gacaacggta taaaagtcgt tctcgatctt cccatccatc atactggttt cctccatgtg 300 tggtttcaga aagccctgaa aggagatcca cactacaggg attattacgt atgggcgagt 360 gaaaaaacgg atctggacga aagaagagag tgggacaacg aaaggatctg gcatcctctg 420 gaggacggaa ggttctacag aggacttttc ggtcccctct cacccgatct gaactacgat 480 aacccgcagg tttttgaaga gatgaagaag gtggtttatc accttcttga aatgggagtg 540 gacggattca gattcgacgc agcaaagcac atgagagata ctctggaaca gaacgttcgc 600 ttttggaggt atttcctctc cgatattgag ggaatattcc ttgcggaaat ctgggcagaa 660 tccaaagttg tggatgaaca cggcaggata ttcggctaca tgctaaattt cgatacctca 720 cactgtatta aggaagcggt gtggaaggaa aacttcaaag tgttgatcga gtcgatcgaa 780 agggccctgg ttggaaaaga ttatctgccg gtgaacttca catcgaacca tgatatgtca 840 aggcttgcga gtttcgaagg agggttgagt gaagagaagg tgaaactctc actttccatt 900 ctgttcacgc ttcccggggt tcctctcata ttctacggag acgaactggg aatgaaagga 960 atctatcgaa aaccgaacac ggaagtcgtg ctggatccgt tcccctggag cgaaaacatg 1020 tgtgttgaag gccagacatt ttggaaatgg cccgcgtata acgatccatt ctccggtgtt 1080 tctgttgagt atcagaggag aaatcgtgat tcgattctct cacacacgat gaggtgggca 1140 ggattcagag gggaaaatca ctggctggac agggcaaaca tcgaatttct gtgcaaagaa 1200 gaaaaactgc tcgtgtacag actggtcgat gaagggcgtt ctctgaaagt gatacacaac 1260 ctgtcgaatg gtgaaatggt gtttgaggga gtgcgcgtac aaccctacag cacggaggtg 1320 gtttga 1326 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of ct1 <400> 29 aggagaaact catatgctga agaaactccc ggag 34 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence ct1 <400> 30 agccccctcg agcccgagaa c 21 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of ct2 <400> 31 aaagggcata tgatcctgtt tggaac 26 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of ct2 <400> 32 ataccagtct cgagcagttt caggatc 27 <210> 33 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of tn1 <400> 33 ttactgaggg catatgaaaa agatggcttt gaaa 34 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of tn1 <400> 34 aagacgcgtc gacttctatg atcaccttct 30 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of fp3e <400> 35 ggaacatatg atggtaaaga tcgccgcttc aatc 34 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of fp3e <400> 36 catactcgag cttcccctct cctatct 27

Claims (18)

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8. 서열번호 1 내지 4 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 사이코스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 사이코스 생산용 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 사이코스 생산용 조성물은,
   (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합,
   (ii) 포스페이트(phosphate),
   (iii) 과당-6-인산-3-에피머화 효소,
   (iv) 포도당-6-인산-이성화효소,
   (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소, 및
   (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상;
   또는
   (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 사이코스 생산용 조성물.
10. 사이코스-6-인산에 서열번호 1 내지 4 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 사이코스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 사이코스-6-인산을 사이코스로 전환하는 단계를 포함하는 사이코스의 제조방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 접촉은 pH 6 내지 9에서 실시하는, 사이코스의 제조방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 방법은 상기 사이코스-6-인산을 사이코스로 전환하는 단계 이전, 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 과당-6-인산-3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 사이코스-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 사이코스의 제조방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 방법은 상기 과당-6-인산을 사이코스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 사이코스의 제조방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 사이코스의 제조방법.
15. 제13항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 사이코스 제조방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 사이코스의 제조방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 사이코스 제조방법.
18. 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 이노시톨-모노-포스파타아제; 과당-6-인산-3-에피머화효소; 포도당-6-인산-이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 및 서열번호 1 내지 4 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 사이코스-6-인산 탈인산화 효소; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 사이코스 제조방법.

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