TWI647239B - 抗-pdgfr-貝他抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供結合至血小板衍生生長因子受體貝他(PDGFR-貝他)的抗體及使用該抗體的方法。依據本發明的某些具體例,該等抗體是以高親和力結合至人類PDGFR-貝他的完全人類抗體。本發明抗體可用於治療與PDGFR-貝他訊號傳遞及/或PDGFR-貝他細胞表現有關的疾病和病症,諸如眼疾、纖維化疾病、血管疾病與癌症。
Description
本發明是有關於對人類PDGFR-貝他具有特異性的抗體及其抗原-結合片段,與其使用方法。
血小板衍生生長因子(PDGF)是有效的有絲***促進劑,其以由四種不同同形異構次單位組成的五個不同二聚體構形存在:A、B、C與D。PDGF的五種二聚體形式為AA、BB、AB、CC與DD,其是藉由相應個別PDGF單體的雙硫鍵聯所形成。PDGF配體透過其與PDGF受體(PDGFR)交互作用而展現其生物效用。PDGFR是一種單穿越、穿膜酪胺酸激酶受體,由阿伐(α)受體鏈(PDGFR-阿伐)及/或貝他(β)受體鏈(PDGFR-貝他)以異型二聚體或同型二聚體的方式締合而成。因此,活性PDGFR可由αα、ββ或αβ受體鏈配對組成。PDGFR共有共同的域結構,包括五個細胞外免疫球蛋白(Ig)環、一個穿膜域,以及一個分出去的細胞內酪胺酸激酶(TK)域。二聚體PDGF受體與PDGFR之間交互作用會使得受體鏈二聚體化、受體自磷酸化,以及細胞內訊號轉導。在活體外已顯示ββ受體被PDGF-BB與PDGF-DD活化,而αβ受體被PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD以及PDGF-AB活化,且αα受體被PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC與PDGF-AB活化(參見Andrae et al.(2008)Genes Dev 22(10):1276-1312)。
PDGF訊號傳遞涉入各種人類疾病,包括與病理學新生血管
相關的疾病、血管與纖維化疾病、腫瘤生長與眼疾。因此,PDGF訊號傳遞的抑制劑被提議用於各種治療情況。例如,PDGFR-貝他的抑制劑已被提議用於治療各種疾病與病症(Andrae et al.(2008)Genes Dev 22(10):1276-1312)。PDGFR-貝他抑制劑包括非特異性小分子酪胺酸激酶抑制劑,諸如甲磺酸伊馬替尼、蘋果酸舒尼替尼與CP-6734521,還有抗-PDGFR-β抗體(參見,例如美國專利第7,060,271號;第5,882,644號;第7,740,850號,以及美國專利申請公開案第2011/0177074號)。抗-配體適合體(例如抗-PDGF-B)亦已被提議用於治療用途。但是,現今在技藝中對於PDGF訊號傳遞的高度特異性和有效抑制劑仍存在有需要。
本發明提供結合人類血小板衍生生長因子受體貝他(”PDGFR-貝他”)的抗體。本發明抗體尤其可用於抑制PDGFR-貝他媒介的訊號傳遞,並且用於治療由PDGFR-貝他活性及/或訊號傳遞引起或相關的疾病和病症。本發明抗體亦可用於在於其表面表現高度PDGFR-貝他之細胞中誘導細胞死亡。
本發明抗體可以是全長(例如,IgG1或IgG4抗體)或可含有僅僅抗原-結合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段),且可經修飾而影響功能性,例如減少殘餘效應子功能(Reddy et al.,2000,J.Immunol.164:1925-1933)。
本發明提供抗體或其抗原-結合片段,其包含具有選自由下列SEQ ID NO組成之群的胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR):2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306,與322,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的實質相似序列。
本發明亦提供一種抗體或其抗原-結合片段,其包含具有選自由下列SEQ ID NO組成之群的胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR):10、26、
42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314,與330,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的實質相似序列。
本發明亦提供一種抗體或其抗原-結合片段,其包含選自由下列SEQ ID NO組成之群的HCVR與LCVR(HCVR/LCVR)序列對:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314,以及322/330。
本發明亦提供一種抗體或抗體之抗原-結合片段,其包含一具有選自由下列SEQ ID NO組成之群的胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)域:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312,與328,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的實質相似序列;以及一具有選自由下列SEQ ID NO組成之群的胺基酸序列的輕鏈CDR3(LCDR3)域:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320,與336,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的實質相似序列。
在某些具體例中,該抗體或抗體之抗原-結合部分包含選自由下列SEQ ID NO組成之群的HCDR3/LCDR3胺基酸序列對:8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304、312/320,以及328/336。
本發明亦提供一種抗體或其片段,其進一步包含一具有選自由下列SEQ ID NO組成之群之胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)域:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308,與324,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或
至少99%序列同一性的實質相似序列;一具有選自由下列SEQ ID NO組成之群之胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)域:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310,與326,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的實質相似序列;一具有選自由下列SEQ ID NO組成之群之胺基酸序列的輕鏈CDR1(LCDR1)域:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316,與332,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的實質相似序列;以及一具有選自由下列SEQ ID NO組成之群之胺基酸序列的輕鏈CDR2(LCDR2)域:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318,與334,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的實質相似序列。
本發明的某些非限制性、例示性抗體及抗原-結合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域,各別具有選自由下列SEQ ID NO組成之群的胺基酸序列:4-6-8-12-14-16(例如H1M3299N);20-22-24-28-30-32(例如H1M3305N);36-38-40-44-46-48(例如H1M3310N);52-54-56-60-62-64(例如H1M3361N);68-70-72-76-78-80(例如H2M3363N);84-86-88-92-94-96(例如H2M3365N);100-102-104-108-110-112(例如H2M3368N);116-118-120-124-126-128(例如H2M3373N);132-134-136-140-142-144(例如H2M3374N);148-150-152-156-158-160(例如H4H3094P);164-166-168-172-174-176(例如H4H3095S);180-182-184-188-190-192(例如H4H3096S);196-198-200-204-206-208(例如H4H3097S);212-214-216-220-222-224(例如H4H3098S);228-230-232-236-238-240(例如H4H3099S);244-246-248-252-254-256(例如H4H3102S);260-262-264-268-270-272(例如H4H3103S);276-278-280-284-286-288(例如H4H3104S);292-294-296-300-302-304(例如
H4H3105S);308-310-312-316-318-320(例如H4H3106S);以及324-326-328-332-334-336(例如H4H3107S)。
在一個相關具體例中,本發明包括特異地結合PDGFR-貝他的抗體或抗體之抗原-結合片段,其中該抗體或片段包含選自下列SEQ ID NO組成之群之重鏈與輕鏈可變區(HCVR/LCVR)序列中所含重鏈與輕鏈CDR域:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314,以及322/330。於鑑定HCVR與LCVR胺基酸序列中的CDR的方法及技術為技藝中已知的,且可用於鑑定本文揭示之特定HCVR及/或LCVR胺基酸序列中的CDR。可用於鑑定CDR邊界的例示性習知技術包括,例如Kabat界定法、Chothia界定法以及AbM界定法。在一般性術語中,Kabat界定法是以序列變異性為基礎,Chothia界定法是以結構環區的位置為基礎,而AbM界定法是一種介於Kabat法與Chothia法之間的折衷方法。參見,例如Kabat,”Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991);Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273:927-948(1997);以及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。公開資料庫亦可用來鑑定抗體內的CDR序列。
在另一個態樣中,本發明提供編碼抗-PDGFR-貝他抗體或其抗原-結合片段的核酸分子。帶有本發明核酸之重組表現載體與引入該等載體的宿主細胞,與藉由在容許生產抗體的條件下培養宿主細胞而生產抗體和回收所生產之抗體的方法亦被本發明所含括。
在一個具體例中,本發明提供一種抗體或其片段,其包含選自由下列SEQ ID NO組成之群之核酸序列所編碼的HCVR:1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305,與321,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列。
本發明亦提供一種抗體或其片段,其包含選自由下列SEQ ID NO組成之群之核酸序列所編碼的LCVR:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313,與329,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列。
本發明亦提供一種抗體或抗體之抗原-結合片段,其包含選自由下列SEQ ID NO組成之群之核苷酸序列所編碼的HCDR3域:7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295、311,與327,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列;以及選自由下列SEQ ID NO組成之群之核苷酸序列所編碼的LCDR3域:15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319,與335,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列。
本發明亦提供一種抗體或其片段,其進一步包含選自由下列SEQ ID NO組成之群之核苷酸序列所編碼的HCDR1域:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307,與323,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列;選自由下列SEQ ID NO組成之群之核苷酸序列所編碼的HCDR2域:5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309,與325,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列;自由下列SEQ ID NO組成之群之核苷酸序列所編碼的LCDR1域:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315,與331,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列;以及選自由下列SEQ ID NO組成之群之核苷酸序列所編碼的LCDR2域:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、
237、253、269、285、301、317,與333,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列。
依據某些具體例,該抗體或其片段包含由下列SEQ ID NO的核酸序列所編碼的重鏈與輕鏈CDR序列:1與9(例如H1M3299N)、17與25(例如H1M3305N)、33與41(例如H1M3310N)、49與57(例如H1M3361N)、65與73(例如H2M3363N)、81與89(例如H2M3365N)、97與105(例如H2M3368N)、113與121(例如H2M3373N)、129與137(例如H2M3374N)、145與153(例如H4H3094P)、161與169(例如H4H3095S)、177與185(例如H4H3096S)、193與201(例如H4H3097S)、209與217(例如H4H3098S)、225與233(例如H4H3099S)、241與249(例如H4H3102S)、257與265(例如H4H3103S)、273與281(例如H4H3104S)、289與297(例如H4H3105S)、305與313(例如H4H3106S),或321與329(例如H4H3107S)。
本發明包括抗-PDGFR-貝他抗體,其具有經修飾的糖化型態。在一些應用中,移除非所欲糖化位點的修飾可能是有用的,或例如移除存在於寡糖鏈上的岩藻糖部分以增加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)功能的抗體(參見Shield et al.(2002)JBC 277:26733)。在其他應用中,可以進行半乳糖化修飾以修飾補體依賴性細胞毒性(CDC)。
在另一個態樣中,本發明提供一種醫藥組成物,其包含特異地結合PDGFR-貝他的重組人類抗體或其片段,以及醫藥學上可接受載劑。在一個相關態樣中,本發明特徵為一種組成物,其為抗-PDGFR-貝他抗體與第二治療劑的組合。在一個具體例中,該第二治療劑可以是任一種有利與抗-PDGFR-貝他抗體組合的藥劑。可有利與抗-PDGFR-貝他抗體組合的例示性藥劑包括,但不限於抑制PDGFR-貝他活性的其他藥劑(包括其他抗體或其抗原-結合片段、肽抑制劑、小分子拮抗劑等),及/或不直接結合PDGFR-貝他但仍會干擾、阻斷或減弱PDGFR-貝他媒介之訊號傳遞的藥劑。涉及本發明抗-PDGFR-貝他抗體的其他組合療法及共調配揭示於本文他處。
在又另一個態樣中,本發明提供使用本發明抗-PDGFR-貝他抗體或抗體之抗原-結合部分抑制PDGFR-貝他活性的治療方法,其中該治療方法包含投與治療有效量之醫藥組成物,該醫藥組成物含有本發明抗體或抗體之抗原-結合片段。待治療病症為任一種藉由移除、抑制或降低PDGFR-貝他活性或訊號傳遞而被增進、改善、抑制或預防的疾病或病況。本發明抗-PDGFR-貝他抗體或抗體片段可作用為阻斷PDGFR-貝他與PDGFR-貝他結合夥伴(例如PDGF配體)間的交互作用,或以其他方式抑制PDGFR-貝他的訊號傳遞活性。
本發明亦包括本發明抗-PDGFR-貝他抗體或抗體之抗原結合部分在製造用以在患者中治療與PDGFR-貝他活性相關或由PDGFR-貝他活性所致的疾病和病症之藥物的用途。
其他具體例將因為檢閱下面詳細說明而變得清楚。
圖1為顯示PDGF配體阻斷分析結果的直方圖,其中PDGFR-貝他被捕獲於生物感測器表面上且PDGF配體(BB、DD或AB)在以本發明的各種抗-PDGFR-貝他抗體或對照抗體處理之後被施加至表面上。結果顯示為RU。
圖2為顯示抗體交叉-競爭分析結果的矩陣圖,其中第一抗-PDGFR-貝他抗體(mAb#1)被施加至經PDGFR-貝他塗覆之感測器尖端,接著以第二抗-PDGFR-貝他抗體(mAb#2)處理。各個測試抗體組合的結合反應(數值-0.01至0.36)被繪出。帶有黑色字體之淺灰色盒表示自我競爭的結合反應。無關乎抗原結合順序之以兩個方向競爭的抗體被強調為帶有白色字體的黑色盒。無競爭,暗示不同結合區,表示為帶有黑色字體的白色盒。
在說明本發明之前,應理解本發明不限於所述特定方法以及實驗條件,因為這些方法以及條件可能會改變。亦應理解本文中所用術語僅供說明特定具體例之用,而不是限制性的,因為本發明的範疇將僅會受
到隨附申請專利範圍所限制。
除非另有定義,否則所有本文使用的技術以及科學術語具有與本發明所屬技藝中具有通常技藝者普遍理解的相同意思。如本文所用,術語”約”,當使用在有關特定引用的數值時,表示該數值可自所引用的數值起改變達不超過1%。舉例而言,如本文所用,詞句”約100”包括99與101以及其間的所有數值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
儘管任何類似或等同於本文所述的方法以及材料可應用於實施或測試本發明,現將說明較佳的方法以及材料。本說明書內提及的全部專利案、申請案與非專利案公開資料以其整體併入本文做為參考資料。
詞句”血小板衍生生長因子受體貝他”、”PDGFRβ”、”PDGFR-貝他”、”PDGFRb”與類似者,如本文所用,意指人類PDGFR-貝他蛋白,其具有SEQ ID NO:341的胺基酸序列(亦參見UniProt accession No.P09619)。除非明確指明來自非人類物種(例如,”小鼠PDGFR-貝他”、”猴PDGFR-貝他”等),否則在本文中提到所有蛋白質、多肽以蛋白質片段欲意指個別蛋白質、多肽或蛋白質片段的人類形式。
如本文所用,”結合PDGFR-貝他的抗體”或”抗-PDGFR-貝他抗體”包括結合PDGFR-貝他蛋白之可溶性片段(例如PDGFR-貝他的所有或部分細胞外域)及/或細胞表面表現之PDGFR-貝他的抗體及其抗原-結合片段。詞句”細胞表面表現的PDGFR-貝他”表示一種在活體外或活體內被表現在細胞表面上的PDGFR-貝他蛋白或部分,使得PDGFR-貝他蛋白的至少一部分(例如SEQ ID NO:341的胺基酸33至532)暴露於細胞膜的細胞外側,並且對於抗體之抗原-結合部分來說是可接近的。”細胞表面表現的PDGFR-貝他”包括在ββ受體同型二聚體中的PDGFR-貝他分子還有在αβ受體異型二聚體中的PDGFR-貝他分子。可溶性PDGFR-貝他分子包括,例如單體或二聚體PDGFR-貝他建構物,如本文實例3中所述(例如,"PDGFRb.mmh",SEQ ID
NO:337[單體]、"PDGFRb.mFc",SEQ ID NO:338[二聚體]與"PDGFRb.hFc",SEQ ID NO:339[二聚體]),或與其實質相似的建構物。
術語”抗體”,如本文所用,意指特異結合至抗定抗原(例如PDGFR-貝他)或與特定抗原交互作用的任一種抗原-結合分子或分子複合體,其包含至少一個互補決定區(CDR)。術語”抗體”包括免疫球蛋白分子,其含有4個多肽鏈,藉由雙硫鍵交互連結的兩個重(H)鏈以及兩個輕(L)鏈,以及其集合體(例如IgM)。各個重鏈含有一個重鏈可變區(此處縮寫為HCVR或VH)以及一個重鏈恆定區。重鏈恆定區含有三個結構域,CH1、CH2以及CH3。各個輕鏈含有一個輕鏈可變區(此處縮寫為LCVR或VL)以及一個輕鏈恆定區。輕鏈恆定區含有一個結構域(CL1)。VH與VL區可進一步分成具有超變異性的區域(命名為互補決定區(CDR)),散佈有較為守恆的區域(命名為骨架區(FR))。各個VH與VL由三個CDR以及四個FR所構成,按下列順序從胺基端往羧基端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明的不同具體例中,抗-PDGFR-貝他抗體(或其抗原-結合部分)的FR可能與人類生殖系序列相同,或可以經天然或人工修飾。胺基酸一致序列可以依據並行分析兩個或多個CDR來定義。
術語”抗體”,如本文所用,亦包括完整抗體分子的抗原-結合片段。如本文所用,術語抗體的”抗原-結合部分”、抗體的”抗原-結合片段”及類似者包括任何天然、以酵素所得到的、合成的或經遺傳工程的多肽或糖蛋白,其特異結合抗原而形成複合體。抗體的抗原-結合片段可以使用任何適當的標準技術(諸如蛋白分解消化或涉及操作並表現編碼抗體可變與視情況恆定域之DNA的重組遺傳工程技術)而衍生自例如完整抗體分子。這樣的DNA是已知的及/或易於從例如商業來源、DNA庫(包括,例如噬菌體-抗體庫)獲得或可合成。DNA可以被定序且以化學的方式或使用分子生物技術來操作,例如將一或多個可變及/或恆定域排成適當構形,或引入會產生半胱胺酸殘基的密碼子、修飾、添加或刪除胺基酸等。
抗原-結合片段的非限制性實施例包括:(i)Fab片段;(ii)F(ab’)2片段;(iii)Fd片段;(iv)Fv片段;(v)單鏈Fv(scFv)分子;(vi)dAb片段;與(vii)由模擬抗體的超變異區之胺基酸殘基所構成的最小辨識單元(例如單離的互補決定區(CDR),諸如CDR3肽),或限制FR3-CDR3-FR4肽。其他經工程化的分子(諸如域特異性抗體、單域抗體、域刪除抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小調節分子免疫藥物(SMIP)及鯊魚可變IgNAR域)亦含括在如本文所用詞句”抗原-結合片段”中。
抗體的抗原-結合片段典型含有至少一個可變域。可變域可以是任何大小與胺基酸組成,且通常含有至少一個鄰近一或多個骨架序列或在一或多個骨架序列中的CDR。在帶有與VL域締合之VH域的抗原-結合片段中,VH以及VL域可相對另一者位在適當排列處。舉例而言,可變區是二聚體且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。或者,抗體的抗原-結合片段可含有單體VH或VL域。
在某些具體例中,抗體的抗原-結合片段可含有至少一個共價連結至少一個恆定域的可變域。可以在本發明抗體的抗原-結合片段中發現到的可變與恆定域的非限制例示性構形包括:(i)VH-CH1;(ii)VH-CH2;(iii)VH-CH3;(iv)VH-CH1-CH2;(v)VH-CH1-CH2-CH3;(vi)VH-CH2-CH3;(vii)VH-CL;(viii)VL-CH1;(ix)VL-CH2;(x)VL-CH3;(xi)VL-CH1-CH2;(xii)VL-CH1-CH2-CH3;(xiii)VL-CH2-CH3;以及(xiv)VL-CL。在可變與恆定域的任一種構形中(包括上面列示的任一種例示性構形),可變域與恆定域可以是彼此直接連結或藉由完整或部分樞紐或連接子區域而連結。樞紐區是由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所構成,它在單一多肽分子中的相鄰可變及/或恆定域間產生彈性或半彈性鍵聯。此外,本發明抗體的抗原-結合片段可包含上列可變域與恆定域構形的任一者彼此及/或與一或多個單體VH或VL域以非共價締合(例如藉由雙硫鍵(等))所形成的同型
二聚體或異型二聚體(或其他集合體)。
就完整抗體分子而言,抗原-結合片段可以是單特異性或多特異性(例如雙特異性)。抗體的多特異性抗原-結合片段典型包含有至少兩個不同可變域,其中各個可變域能夠特異結合至個別抗原或相同抗原上的不同表位。任一種多特異性抗體形式,包括此處所揭示的例示性雙特異性抗體形式,可使用該技藝中可取得之慣用技術而改造成使用於本發明抗體的抗原-結合片段中。
本發明抗體可透過補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)作用。”補體依賴性細胞毒性”(CDC)意指在補體存在的情況下,表現抗原的細胞因為本發明抗體之故而溶解。”抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性”(ADCC)意指細胞媒介的反應,其中表現Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺手(NK)細胞、嗜中性球與巨噬細胞)辨識在目標細胞上的結合抗體且從而造成目標細胞溶解。CDC與ADCC可以使用技藝中熟知並可用的分析來測定(參見,例如美國專利第5,500,362號與第5,821,337號,以及Clynes et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656)。抗體恆定區對於抗體固定補體以及媒介細胞依賴性細胞毒性的能力來說是重要的。因此,可以依據對於抗體媒介細胞毒性來說是否樂見來選定抗體的同型。
在某些具體例中,本發明抗-PDGFR-貝他抗體為人類抗體。術語”人類抗體”,如本文所用,欲包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括不被人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或定位突變或藉由活體內體突變所引入的突變),例如在CDR以及尤其在CDR3中。但是,術語”人類抗體”,如本文所用,不意欲要包括已被移植至人類骨架序列上之衍生自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列的抗體。
本發明抗體在一些具體例中可以是重組人類抗體。術語”重
組人類抗體”,如本文所用,欲包括所有藉由重組方法所製備、表現、產生或分離的人類抗體,諸如使用被轉染至宿主細胞中之重組表現載體而被表現的抗體(進一步說明如下)、分離自重組組合型人類抗體庫的抗體(進一步說明如下)、分離自人類免疫球蛋白基因經轉殖的動物(例如小鼠)的抗體(參見,例如Taylor et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295),或藉由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之方法所製備、表現、產生或分離的抗體。此等重組人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區及恆定區。但是,在某些具體例中,此等重組人類抗體經活體外致突變(或,當使用人類Ig序列基因經轉殖的動物時為活體內體細胞致突變),而因此該等重組抗體之VH區與VL區的胺基酸序列為可能在活體內人類抗體生殖系本中非天然存在的序列,儘管它們是衍生自人類生殖系VH與VL序列且與其相關。
人類抗體以兩種與樞紐異質性相關的形式存在。在一種形式中,免疫球蛋白分子包含約150-160kDa的穩定四鏈建構物,其中二聚體藉由鏈間重鏈雙硫鍵而被約束在一起。在第二種形式中,二聚體不是經由鏈間雙硫鍵連結,且形成一個由共價偶合輕鏈及重鏈組成的約75-80kDa分子(半抗體)。此等形式即使是在親和力純化之後也非常難以分離。
第二種形式在各種完整IgG同型中的出現頻率是因為(但不限於)與抗體之樞紐區同型有關的結構差異。在人類IgG4樞紐的樞紐區中,單個胺基酸置換可能將第二種形式的出現明顯降低至一般使用人類IgG1樞紐所觀察到的程度(Angal et al.(1993)Molecular Immunology 30:105)。本發明含括具有一或多個在樞紐CH2或CH3區中的突變的抗體,其可能是所要的,例如在製造時增進所欲抗體形式的產率。
本發明抗體可以是經單離抗體。”經單離抗體”,如本文所用,表示一種已被鑑定且由其天然環境的至少一組分中被分離及/或回收而來的抗體。例如,已被分離或由生物的至少一組分中,或由其中天然存在
或天然生產之抗體的組織或細胞來的抗體就本發明之目的來說是一種”經單離抗體”。經單離抗體亦包括在重組細胞內的原位抗體。經單離抗體是已進行至少一個純化或分離步驟的抗體。依據某些具體例,經單離的抗體基本上不含其他細胞物質及/或化學品。
本發明包括中和及/或阻斷抗-PDGFR-貝他抗體。”中和”或”阻斷”抗體,如本文所用,欲意指一種結合至PDGFR-貝他而(i)干擾PDGFR-貝他或PEGFR-貝他片段與PDGF配體(例如PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD、PDGF-AB等)之間交互作用;(ii)干擾ββ及/或αβ受體二聚體形成;及/或(ii)抑制PDGFR-貝他的至少一種生物功能的抗體。由PDGFR-貝他中和或阻斷抗體所致的抑制不必然是完全的,只要其可使用適當分析被測得即可。偵測PDGFR-貝他抑制的例示性分析於本文工作實例中說明。
相較於抗體所衍生而來之對應生殖系序列,本文揭示的抗-PDGFR-貝他抗體可在重鏈及輕鏈可變域之骨架及/或CDR區中含有一或多個胺基酸置換、***及/或刪除。此等突變可透過將本文所揭示之胺基酸序列與可得自例如公用抗體序列資料庫的生殖系序列相比對而容易確認。本發明包括抗體及其抗原-結合片段,其等是衍生自本文所揭示的任一胺基酸序列,其中一或多個骨架及/或CDR區中的一或多個胺基酸突變成該抗體所源自的生殖系序列之對應殘基,或另一人類生殖系序列的對應殘基,或對應生殖系殘基的守恆性胺基酸置換(諸如序列改變在本文中全意指為”生殖系突變”)。本技藝中具有通常技術者從本文揭示的重鏈與輕鏈可變區序列開始,可輕易製造出許多含有一或多個個別生殖系突變或其組合的抗體及抗原-結合片段。在某些具體例中,VH及/或VL域中的所有骨架及/或CDR殘基突變回復成在抗體衍生而來之原有生殖系序列中所發現的殘基。在其他具體例中,僅有某些殘基突變回復成原有生殖系序列,例如僅有在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中所發現的突變殘基,或僅有CDR1、CDR2或CDR3中所發現的突變殘基。在其他具體例中,骨架及/或CDR殘基的一或
多者突變成不同生殖系序列的對應殘基(亦即,不同於抗體原有衍生而來之生殖系序列的生殖系序列)。此外,本發明抗體可含有兩個或更多個骨架及/或CDR區中之生殖系突變的組合,例如其中某些個別殘基突變成特定生殖系序列的對應殘基,而不同於原有生殖系序列的某些其他殘基維持原狀或突變成不同生殖系序列的對應殘基。在得到後,含有一或多個生殖系突變的抗體及抗原-結合片段可針對一或多種所要特性(諸如結合特異性增進、結合親和力增加、拮抗或促效生物特性增進或提高(視情況而定)、免疫原性降低等)來進行簡易測試。以此一般方式所得到的抗體及抗原-結合片段含括在本發明中。
本發明亦包括抗-PDGFR-貝他抗體,該抗體含有本文揭示之具有一或多個守恆性置換的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列任一者的變異體。例如,本發明包括具有HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的抗-PDGFR-貝他抗體,該抗體相對於本文揭示之任一HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列具有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少等的守恆性胺基酸置換。
術語”表位(epitope)”意指一個與已知為抗原決定簇(paratope)之抗體分子的可變區中的特定抗原結合位點交互作用的抗原決定基。單獨一個抗原可能有超過一個表位。因此,不同抗體可結合至抗原的不同區域且可能具有不同的生物效用。表位可以是具有構像或線性的。構像表位可透過在空間上並列的胺基酸由不同線性多肽鏈的區段所產生。線性表位是由多肽鏈中的相鄰胺基酸殘基所產生。在某些情況下,表位可包括抗原上的醣類、磷氧基或磺醯基的部分。
當意指核酸或其片段時,”實質同一性”或”實質相同”表示若藉由任何序列同一性的已知演算法(諸如FASTA、BLAST或Gap,如上所述)來測定時,當在有適當核苷酸***或刪除的情況下與另一核酸(或其互補股)最佳排列時,在至少約95%,及更佳至少約96%、97%、98%或99%核苷酸
鹼基中有核苷酸序列同一性。在某些情況下,與參考核酸分子具有實質同一性的核酸分子可編碼具有與參考核酸分子所編碼之多肽相同或實質類似胺基酸序列的多肽。
當應用於多肽時,術語”實質相似性”或”實質相似”表示當兩個肽序列最佳地排列時(諸如按照程式GAP或BESTFIT使用內定空位權重),共有至少95%序列同一性,甚至更佳至少98%或99%序列同一性。較佳地,不相同的殘基位置因為守恆性胺基酸置換而有所差異。”守恆性胺基酸置換”是一種胺基酸殘基置換成另一種帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈(R基團)的胺基酸殘基。一般來說,守恆性胺基酸置換大體上不會改變蛋白質的官能性質。在兩或多個胺基酸序列彼此因為守恆性置換而有所不同的情況下,序列同一性百分率或相似性程度可以向上調整而校正置換的守恆性質。用來做這個調整的方法對於習於該技藝者來說是熟知的。參見,例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331,併入本文做為參考資料。帶有具類似化學性質的側鏈之胺基酸群組的實例包括(1)脂肪族側鏈:甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸與異白胺酸;(2)脂肪族-羥基側鏈:絲胺酸與蘇胺酸;(3)含醯胺的側鏈:天門冬醯胺酸與麩醯胺酸;(4)芳族側鏈:***酸、酪胺酸與色胺酸;(5)鹼性側鏈:離胺酸、精胺酸與組胺酸;(6)酸性側鏈:天門冬胺酸與麩胺酸;以及(7)含硫側鏈為半胱胺酸與甲硫胺酸。較佳的守恆性胺基酸置換群為:纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、***酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、天門冬胺酸-麩胺酸,以及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。或者,守恆性置換可以是任何在Gonnet et al.(1992)Science 256:1443-1445中揭示的PAM250對數-相似矩陣中具有正值的變化。”中度守恆”置換是任何在PAM250對數-相似矩陣中具有非負值的改變。
有關多肽的序列相似性,其亦可意指為序列同一性,典型是使用序列分析軟體來測量。蛋白質分析軟體使用分派給各種置換、刪除以及其他修飾(包括守恆性胺基酸置換)的相似性的測量法來配對相似序列。例
如,GCG軟體含有諸如Gap與Bestfit的程式,它們可以與內定參數一起用來決定關係相近之多肽(諸如來自於不同物種之生物的同源性多肽)或野生型蛋白質與其突變蛋白質之間的序列同源性或序列同一性。參見,例如GCG第6.1版。多肽序列也可以使用採內定或建議參數的FASTA(一種在GCG第6.1版中的程式)來比對。FASTA(例如FASTA2與FASTA3)提供查詢以及研究序列之間最佳重疊區域的排列以及百分率序列同一性(Pearson(2000)上文)。當要將本發明的序列與含有大量來自不同生物之序列的資料庫比對時,另一個較佳的演算法是電腦程式BLAST,特別是BLASTP或TBLASTN,使用內定參數。參見,例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410以及Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402,各自併入本文做為參考資料。
本發明含括帶有pH依賴性結合特性的抗-PDGFR-貝他抗體。舉例而言,本發明抗-PDGFR-貝他抗體在酸性pH下相較於在中性pH下可表現出對PDGFR-貝他的結合降低。或者,本發明抗-PDGFR-貝他抗體在酸性pH下相較於在中性pH下可表現出對其抗原的結合提高。詞句”酸性pH”包括低於約6.2的pH值,例如約6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0,或更低。如本文所用,詞句”中性pH”表示約7.0至約7.4的pH。詞句”中性pH”包括約7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35,與7.4的pH值。
在某些情況下,本發明”在酸性pH下相較於在中性pH下對PDGFR-貝他的結合降低”以在酸性pH下抗體結合至PDGFR-貝他的KD值與在中性pH下抗體結合至PDGFR-貝他的KD值的比率(或反之亦然)來表示。例如,若抗體或其抗原-結合片段表現酸性/中性KD比率為約3.0或更高時,抗體或其抗原-結合片段可視為表現”在酸性pH下相較於在中性pH下對PDGFR-貝他的結合降低”。在某些例示性具體例中,本發明抗體或其抗原-
結合片段的酸性/中性KD比率為約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更高。
具有pH依賴性結合特性的抗體可以針對在酸性pH下相較於在中性pH下降低(或增高)對特定抗原的結合,例如藉由篩選抗體群而獲得。此外,在胺基酸層次修飾抗原-結合域可能產生帶有pH依賴性特性的抗體。例如,透過將抗原-結合域(例如CDR內)的一或多個胺基酸置換成組胺酸殘基,可獲得在酸性pH下相對於中性pH具有抗原-結合降低的抗體。
依據本發明的某些具體例,提供包含Fc域的抗-PDGFR-貝他抗體,該Fc域包含一或多個例如在酸性pH下相較於中性pH提高或減少抗體對FcRn受體之結合的突變。例如,本發明含括在Fc域的CH2或CH3區中之突變的抗-PDGFR-貝他抗體,其中該(等)突變增加Fc域在酸性環境中(例如在吞噬小體中,其中pH範圍約5.5至約6.0)對FcRn的親和力。此等突變可增加抗體當被投與給動物時的血清半衰期。此等Fc修飾的非限制性實例包括,例如在下列位置處的修飾:250(例如E或Q);250與428(例如L或F);252(例如L/Y/F/W或T),254(例如S或T),與256(例如S/R/Q/E/D或T);在位置428及/或433處(例如H/L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如H/F或Y)的修飾:在位置250及/或428處的修飾;或在位置307或308(例如308F、V308F),與434處的修飾。在一個具體例中,該修飾包含428L(例如M428L)與434S(例如N434S)修飾;428L、259I(例如V259I),與308F(例如V308F)修飾;433K(例如H433K)與434(例如434Y)修飾;252、254,與256(例如252Y、254T,與256E)修飾;250Q與428L修飾(例如T250Q與M428L);以及307及/或308修飾(例如308F或308P)。
例如,本發明含括包含Fc域的抗-PDGFR-貝他抗體,該Fc
域包含一或多對或一或多群選自由下列組成之群的突變:250Q與248L(例如T250Q與M248L);252Y、254T與256E(例如M252Y、S254T與T256E);428L與434S(例如M428L與N434S);以及433K與434F(例如H433K與N434F)。前述Fc域突變以及本文揭示之抗體可變域中其他突變的所有可能組合預想落在本發明的範疇內。
本發明包括抗-PDGFR-貝他抗體及其抗原-結合片段,其以高親和力結合可溶性單體或二聚體PDGFR-貝他分子。例如,本發明包括以少於約30nM的KD結合單體PDGFR-貝他的抗體及抗體之抗原-結合片段(例如在25℃或37℃下),如藉由表面電漿共振所測定,例如使用如本文實例3中定義的分析形式。在某些具體例中,本發明抗體或抗原-結合片段以少於約25nM、少於約20nM、少於約15nM、少於約10nM、少於約5nM、少於約2nM,或少於約1nM的KD結合單體PDGFR-貝他,如藉由表面電漿共振所測定,例如使用如本文實例3中定義的分析形式或實質相似的分析。
本發明亦包括以少於約250pM的KD結合二聚體PDGFR-貝他的抗體及其抗原-結合片段(例如在25℃或37℃下),如藉由表面電漿共振所測定,例如使用如本文實例3中定義的分析形式。在某些具體例中,本發明抗體或抗原-結合片段以少於約240pM、少於約230pM、少於約220pM、少於約210pM、少於約200pM、少於約190pM、少於約180pM、少於約170pM、少於約160pM、少於約150pM、少於約140pM、少於約130pM、少於約120pM、少於約110pM,或少於約100pM的KD結合二聚體PDGFR-貝他,如藉由表面電漿共振所測定,例如使用如本文實例3中定義的分析形式或實質相似的分析。
本發明亦包括阻斷一或多個PDGF配體(例如PDGF-BB、-AB、-CC,或-DD)結合至PDGFR-貝他的抗-PDGFR-貝他抗體及其抗原-結合片段。例如,本發明包括在活體外以少於約300pM的IC50值阻斷PDGF-BB
結合至單體PDGFR-貝他的抗-PDGFR-貝他抗體,如藉由以ELISA為主的免疫分析所測定,例如使用如本文實例4(A)中定義的分析形式或例如使用如本文實例4(B)中定義之分析形式的即時生物分析或實質相似的分析。在某些具體例中,本發明抗體或抗原-結合片段在活體外以少於約280pM、少於約260pM、少於約240pM、少於約220pM、少於約200pM、少於約180pM、少於約160pM、少於約150pM、少於約140pM、少於約130pM、少於約120pM、少於約110pM、少於約100pM、少於約90pM、少於約80pM或少於約75pM的IC50值阻斷PDGF-BB結合至單體PDGFR-貝他,如藉由以ELISA為主的免疫分析所測定,例如使用如本文實例4(A)中定義的分析形式或例如使用如本文實例4(B)中定義之分析形式的即時生物分析或實質相似的分析。
本發明亦包括抑制細胞表面表現之PDGFR-貝他之PDGF配體媒介活化的抗-PDGFR-貝他抗體及其抗原-結合片段。例如,本發明包括以少於約500pM的IC50值抑制細胞表面表現之PDGFR-貝他的PDGF-BB、或PDGF-DD媒介活化的抗-PDGFR-貝他抗體及其抗原-結合片段,如在以細胞為主的阻斷生物分析中所測定,例如使用如本文實例6中定義的分析形式或實質相似的分析。在某些具體例中,本發明抗體或抗原-結合片段以少於約400pM、少於約350pM、少於約300pM、少於約250pM、少於約200pM、少於約150pM、少於約100pM、少於約90pM、少於約80pM、少於約70pM、少於約60pM、少於約50pM、少於約40pM,或少於約30pM的IC50阻斷細胞表面表現之PDGFR-貝他的PDGF-BB、或PDGF-DD媒介活化,如在以細胞為主的阻斷生物分析中所測定,例如使用如本文實例6中定義的分析形式或實質相似的分析。
本發明亦包括內化至表現PDGFR-貝他之細胞中的抗-PDGFR-貝他抗體及其抗原-結合片段。例如,本發明包括有效內化至表現PDGFR-貝他之細胞中的抗-PDGFR-貝他抗體及其抗原-結合片段,如使用如本文實例7中定義的以細胞為主的抗體內化分析或實質相似的分析所測定。
本發明抗體可具有前述生物特性的一或多者,或其任何組合。本發明抗體的其他生物特性對於習於技藝者來說從檢視本揭示內容(包括本文的工作實例在內)將變得清楚。
本發明包括與人類PDGFR-貝他細胞外域內(例如PDGFR-貝他細胞外域的Ig域1、2、3、4及/或5內)發現的一或多個胺基酸交互作用的抗-PDGFR-貝他抗體。Ig域1至3(例如SEQ ID NO:337的胺基酸1至277)已知涉入配體結合。本發明包括與Ig域1(例如SEQ ID NO:337的胺基酸1至88)、Ig域2(例如SEQ ID NO:337的胺基酸97至178)及/或Ig域3(例如SEQ ID NO:337的胺基酸182至277)中發現的一或多個胺基酸交互作用,並從而有效阻斷受體/配體交互作用的抗-PDGFR-貝他抗體。在本發明的某些例示性具體例中,提供與Ig域2(例如SEQ ID NO:337的胺基酸37至178;參見例如實例8)特異地交互作用的抗體。抗體結合的表位可由具有3或更多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)在PDGFR-貝他細胞外域中的胺基酸單一連續序列組成。或者,表位可由在PDGFR-貝他細胞外域中的數個非連續胺基酸(或胺基酸序列)組成。
可使用技藝中具有通常技術者所熟知的各種技術來決定一個抗體是否會與多肽或蛋白質中的”一或多個胺基酸交互作用”。例示性技術包括,例如Harlow and Lane的”Antibodies”所述的慣用交叉-阻斷分析(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)、丙胺酸掃描突變分析、肽墨點分析(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248:443-463)及肽切割分析。此外,可以採用諸如表位切除、表位抽出以及化學修飾抗原的方法(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。另一種可用於鑑別與抗體交互作用之多肽中的胺基酸的方法為透過質譜偵測氫/氘交換。在一般性術語中,氫/氘交換法涉及將感興趣的蛋白質標記氘,然後透過將抗體結合至經氘標記的蛋白質。
接下來,蛋白質/抗體複合體被轉移至水中以容許氫-氘交換在受抗體保護之
殘基(其維持經氘標記)以外的所有殘基發生。在抗體解離後,目標蛋白質被進行蛋白酶切割與質譜分析,從而揭開經氘標記的殘基,其對應於抗體交互作用的特定胺基酸。參見,例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259;Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
本發明進一步包括結合至與本文所述特定例示性抗體任一者(例如H1M3299N、H1M3305N、H1M3310N、H1M3361N、H2M3363N、H2M3365N、H2M3368N、H2M3373N、H2M3374N、H4H3094P、H4H3095S、H4H3096S、H4H3097S、H4H3098S、H4H3099S、H4H3102S、H4H3103S、H4H3104S、H4H3105S、H4H3106S、H4H3107S等)相同之表位的抗-PDGFR-貝他抗體。相同地,本發明亦包括與本文所述特定例示性抗體任一者(例如H1M3299N、H1M3305N、H1M3310N、H1M3361N、H2M3363N、H2M3365N、H2M3368N、H2M3373N、H2M3374N、H4H3094P、H4H3095S、H4H3096S、H4H3097S、H4H3098S、H4H3099S、H4H3102S、H4H3103S、H4H3104S、H4H3105S、H4H3106S、H4H3107S等)競爭結合至PDGFR-貝他的抗-PDGFR-貝他抗體。例如,本發明包括與一或多個如本文實例5中定義之”第1群”抗體(例如H4H3365N、H4H3374N、H4H3103S與H4H3094P)交叉競爭結合至PDGFR-貝他的抗-PDGFR-貝他抗體。本發明亦包括與一或多個如本文實例5中定義之”第2群”抗體(例如H4H3099S、H4H3107S、H4H3305N與H4H3310N)交叉競爭結合至PDGFR-貝他的抗-PDGFR-貝他抗體。
吾人可容易地藉由使用技藝中已知或本文例舉的慣常方法決定一個抗體是否會與參考抗-PDGFR-貝他抗體結合至相同的表位,或與參考抗-PDGFR-貝他抗體競爭結合。例如,為決定一測試抗體是否會結合至與本發明參考抗-PDGFR-貝他抗體相同的表位,容許該參考抗體結合至PDGFR-貝他蛋白(例如PDGFR-貝他細胞外域的可溶性部分或細胞表面表現的PDGFR-貝他)。接著,評估測試抗體結合至PDGFR-貝他分子的能力。若測試抗體能夠在參考抗-PDGFR-貝他抗體飽合結合之後結合至PDGFR-
貝他,則可推論該測試抗體結合至與參考抗-PDGFR-貝他抗體不同的表位。另一方面,若測試抗體無法在參考抗-PDGFR-貝他抗體飽合結合後結合至PDGFR-貝他分子,則該測試抗體可能結合至與本發明參考抗-PDGFR-貝他抗體所結合之表位相同的表位。接而可進行其他慣常實驗(例如肽突變與結合分析)以確認觀察測試抗體沒有結合是因為結合至與參考抗體相同的表位,或若沒有觀察到結合是因為空間障礙(或另一現象)。這類實驗係使用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞儀或技藝中可供使用的其他任何定量或定性抗體結合分析來進行。依據本發明的某些具體例,若例如在一個競爭性結合分析中測量一個過量1-、5-、10-、20-或100-倍的抗體抑制另一個抗體達至少50%,但較佳75%、90%或甚至99%,則兩個抗體結合至相同(或重疊)表位(參見,例如Junghans et al.,Cancer Res.1990:50:1495-1502)。或者,若基本上所有在抗原中會減少或消除一個抗體結合的胺基酸突變也會減少或消除另一個抗體結合,則兩個抗體被視為是結合至相同表位。若減少或消除一個抗體結合之僅有一部份胺基酸突變也會減少或消除另一個抗體結合,則兩個抗體被視為具有”重疊的表位”。
為測定一個抗體是否與參考抗-PDGFR-貝他抗體競爭結合(或交叉競爭結合),以兩個方面來進行上述結合方法學:在第一個方面,容許參考抗體在飽和條件下結合至PDGFR-貝他分子(例如PDGFR-貝他細胞外域的可溶性部分或細胞表面表現的PDGFR-貝他),繼而評估測試抗體對PDGFR-貝他分子的結合。在第二個方面,容許測試抗體在飽和條件下結合至PDGFR-貝他分子,繼而評估參考抗體對PDGFR-貝他分子的結合。若在兩個方面中,僅有第一(飽和)抗體能夠結合至PDGFR-貝他分子,則推斷測試抗體與參考抗體競爭結合至PDGFR-貝他(參見例如在本文實例5中所述的分析形式,其中可溶性PDGFR-貝他蛋白被捕獲在感測器尖端而經PDGFR-貝他塗覆的感測器尖端依序且以兩種結合順序以參考抗體[mAb#1]與測試抗-PDGFR-貝他抗體[mAb#2]處理)。如技藝中具有通常技術者所了解,與參
考抗體競爭結合之抗體不必然會結合至與參考抗體相同的表位,但可能會在空間上藉由結合重疊或相鄰表位來阻礙參考抗體的結合。
用於生成單株抗體(包括完全人類單株抗體)的方法為技藝中已知的。任何此等已知方法可用於本發明中以製造特異地結合至人類PDGFR-貝他的人類抗體。
使用VELOCIMMUNETM技術或任何其他用於生成完全人類單株抗體的已知方法,首先分離出帶有人類可變區以及小鼠恆定區之對PDGFR-貝他具高親和力的嵌合抗體。如同在下面實驗節中,鑑定抗體的特徵並且篩選所欲的特性,包括親和力、選擇性、表位等。若需要的話,小鼠恆定區取代成所欲的人類恆定區(例如野生型或經修飾IgG1或IgG4)以生成完全人類抗-PDGFR-貝他抗體。儘管篩選出的恆定區可能會依據特定用途、可變區中的高親和力抗原-結合以及目標特異性特性而改變。在某些情況下,完全人類抗-PDGFR-貝他抗體從抗原-陽性B細胞被直接分離出來。
本發明的抗-PDGFR-貝他抗體以及抗體片段含括帶有由那些所述抗體變化而來,但仍保有結合人類PDGFR-貝他能力之胺基酸序列的蛋白質。當與親代序列相較之下,此等變異抗體以及抗體片段包含有一或多個胺基酸添加、刪除或置換,但仍展現出基本上與所述抗體相等的生物活性。同樣地,當與所揭示的序列相較之下,編碼本發明抗-PDGFR-貝他抗體之DNA序列含括具有一或多個核苷酸添加、刪除或置換,但仍編碼基本上與本發明之抗-PDGFR-貝他抗體或抗體片段生物等效的抗-PDGFR-貝他抗體或抗體片段的序列。上面詳述此等變異胺基酸以及DNA序列的實例。
舉例而言,若兩個抗原-結合蛋白或抗體是藥學等效物或藥學代用品,當它們以相同莫耳劑量在類似實驗條件下投與的吸收速率與程度未顯示出明顯差異(不論是單一劑量或多劑量),它們被視為生物等效的。
若一些抗體在它們的吸收程度上相等但在它們的吸收速率上沒有,它們將會被視為等效物或藥學代用品但不被視為生物等效,因為此等在吸收速率上的差異是有目的並且在歸類時被反映出來,對於在例如長期使用上維持有效生體藥物濃度來說不是必要的,並且就所研究的特定藥物產品來說被視為在醫學上沒有差異。
在一個具體例中,若兩個抗原-結合蛋白在臨床上就其安全性、純度以及效力而言並無有意義的差異,它們是生物等效的。
在一個具體例中,若患者在參考產品與生物產品之間可以改變一或多次而沒有預期增高不良反應的風險(包括與持續治療而沒有這樣改變的情況下相比,在免疫原性上的臨床顯著變化,或減低有效性)時,它們是生物等效的。
在一個具體例中,若兩個抗原-結合蛋白就條件或使用條件來說均是藉由共同的機制或作用機制而作用達致此等機制已知的程度,它們是生物等效的。
生物等效性可以藉由活體內和活體外方法證明。生物等效性測量法包括,例如(a)在人類或其他哺乳動物體內的活體內測試,其中隨著時間函數測量抗體或其代謝物在血液、血漿、血清或其他生物液中的濃度;(b)已使用人類活體內生物可利用性數據校正並且可合理預測的活體外測試;(c)在人類或其他哺乳動物體內的活體內測試,其中隨著時間函數測量抗體(或其目標)之適當急性藥理學效用;以及(d)在已證實抗體的安全性、效力或生物可利用性或生物等效性的充分控制臨床試驗中。
本發明抗-PDGFR-貝他抗體的生物等效變異體可以藉由例如,製造各種殘基或序列置換,或刪除不是生物活性所必需的末端或內部殘基或序列而建構。舉例而言,對於生物活性來說不是必要的半胱胺酸殘基可以被刪除或取代為其他會在再復性之後防止不必要或不正確分子內雙硫橋形成的胺基酸。在其他上下文中,生物等效抗體可包括抗-PDGFR-貝他
抗體變異體,其含有會修飾抗體之糖化特性的胺基酸變化(例如消除或移除糖化的突變)。
依據某些具體例,本發明提供結合至人類PDGFR-貝他而不會結合至其他物種的PDGFR-貝他的抗-PDGFR-貝他抗體。本發明亦包括結合至人類PDGFR-貝他以及一或多個非人類物種的PDGFR-貝他的抗-PDGFR-貝他抗體。舉例而言,本發明的抗-PDGFR-貝他抗體可以結合至人類PDGFR-貝他並且視情況可能結合或不結合至小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、食蟹獼猴、狨猿、恆河猴或黑猩猩PDGFR-貝他的一或多者。依據本發明的某些例示性具體例,提供特異地結合人類PDGFR-貝他(例如單體及/或二聚體hPDGFR-貝他建構物)或食蟹獼猴(例如食蟹獼猴)PDGFR-貝他(例如單體及/或二聚體mfPDGFR-貝他建構物)的抗-PDGFR-貝他抗體(參見,例如本文實例3)。
本發明含括接合至一治療部分(”免疫接合物”)(諸如細胞毒素、化學治療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素)的抗-PDGFR-貝他單株抗體。細胞毒性劑包括任何對細胞有害的藥劑。用於形成免疫接合物的適當細胞毒性劑以及化學治療劑的實例在該技藝中是已知的(參見例如WO 05/103081)。
本發明的抗體可以是單特異性、雙特異性或多特異性。多特異性抗體可以是對一個目標多肽的不同表位具有特異性或者可能含有對超過一個目標多肽具有特異性的抗原-結合域。參見例如Tutt et al.,1999,J.Immunol.147:60-69;Kufer et al.,2004,Trends Biotechnol.22:238-244。本發明的抗-PDGFR-貝他抗體可以連結至另一個功能性分子(例如另一個肽或蛋白質)或與該另一個功能性分子共表現。舉例而言,抗體或其片段在功能上
可以連結(例如,藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體,諸如另一個抗體或抗體片段,以產生帶有第二種結合特異性的雙特異性或多特異性抗體。舉例而言,本發明包括雙特異性抗體,其中免疫球蛋白的一臂對於人類PDGFR-貝他或其片段具有特異性,而免疫球蛋白的另一臂對第二治療目標具有特異性或接合至一個治療部分。
可用於本發明上下文的例示性雙特異性抗體形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3域以及第二Ig CH3域,其中第一與第二Ig CH3域因為至少一個胺基酸而彼此有別,以及其中與缺乏該胺基酸差異的雙特異性抗體相較之下,至少一個胺基酸差異會減低該雙特異性抗體結合至蛋白質A。在一個具體例中,該第一Ig CH3域結合蛋白質A而該第二Ig CH3域含有一個會減低或消除蛋白質A結合的突變,諸如H95R修飾(按照IMGT外顯子編號;按照EU編號為H435R)。該第二CH3可進一步包含有Y96F修飾(按照IMGT;按照EU為Y436F)。可以在第二CH3中發現到的更多修飾包括:在IgG1抗體的情況下,D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(按照IMGT;按照EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I);在IgG2抗體的情況下,N44S、K52N以及V82I(IMGT;按照EU為N384S、K392N以及V422I);以及在IgG4抗體的情況下,Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(按照IMGT;按照EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。上述雙特異性抗體形式方面的變異在本發明範圍中是可預想的。
可用於本發明中的其他例示性雙特異性形式包括,但不限於以scFv為基礎或雙抗體雙特異性形式、IgG-scFv融合體、雙可變域(DVD)-Ig、四價體瘤、洞中紐、共用輕鏈(例如帶有洞中鈕的共有輕鏈)、CrossMab、CrossFab、(SEED)體、白胺酸拉鍊、Duobody、IgG1/IgG2、雙重作用Fab(DAF)-IgG,以及Mab2雙特異性形式(關於前面形式的回顧參見,例如Klein et al.2012,mAbs 4:6,1-11與其中引用的參考文獻)。雙特異性抗體
可以使用肽/核酸接合來構築,例如其中帶有直角化學反應性的非天然胺基酸被用來生成定點抗體-寡核苷酸接合物,其之後自我組裝成具有限定組成、價數與幾何學的多聚體複合體(參見,例如Kazane et al.,J. Am.Chem.Soc.[Epub:Dec.4,2012])。
本發明提供包含有本發明抗-PDGFR-貝他抗體或其抗原-結合片段的醫藥組成物。本發明的醫藥組成物可與適當載體、賦形劑以及其他提供改善輸送、遞送、耐受性以及類似者的藥劑一起調配。可以在對於藥學化學家來說為熟悉的處方書中找到大量適當的配方:Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。這些配方包括,例如粉末、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含有囊泡的脂質(陽離子或陰離子)(諸如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA接合物、無水吸收糊劑、水包油與油包水乳劑、乳化卡波蠟(各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠以及含有卡波蠟的半固體混合物。亦參見Powell et al.”Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
投與給患者的抗體劑量可以視患者的年齡與身材、目標疾病、病況、投藥途徑以及類似者而改變。較佳劑量通常是依據體重或體表面積來計算。當本發明抗體用於在成人患者體內治療與PDGFR-貝他活性有關的病況或疾病時,通常以約0.01至約20mg/kg體重、更佳約0.02至約7、約0.03至約5、或約0.05至3mg/kg體重的單一劑量靜脈內投與本發明抗體是有益的。可以視病況的嚴重性調整治療頻率以及持續時間。用於投與抗-PDGFR-貝他抗體的有效劑量與時間表可按經驗來決定;例如,可透過定期評估來監測患者進展,並據此調整劑量。此外,劑量的物種間標度可使用技藝中已知的方法來進行(例如Mordenti et al.,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
已知有各種不同的遞送系統並且可用於投與本發明的醫藥組成物,例如囊封在脂質體內、微粒、微膠囊、能夠表現本發明抗體或其他治療性蛋白質的重組細胞、受體媒介的胞吞作用(參見,例如Wu et al.,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。本發明抗體及其他治療活性成分也藉由基因療法技術被遞送。引入的方法包括,但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上以及口服途徑。組成物可以藉由任何習知途徑來投與,例如藉由輸注或團注、藉由透過上皮或黏膜內襯(例如口腔黏膜、直腸以及小腸黏膜等)吸收,並且可以與其他具有生物活性的藥劑一起投與。投藥可以是全身性或局部的。
本發明的醫藥組成物可以使用標準注射針與注射器來皮下或靜脈內遞送。此外,關於皮下遞送,筆型遞送裝置很容易應用於遞送本發明的醫藥組成物。這樣的一種筆型遞送裝置可以是重複使用或拋棄式。可重複使用的筆型遞送裝置通常使用含有醫藥組成物的可換式卡匣。一旦卡匣內的所有醫藥組成物被投藥且卡匣空了,空的卡匣可易於丟棄並且置換成含有醫藥組成物的新卡匣。那麼就可以重複使用筆型遞送裝置。就拋棄式筆型遞送裝置來說,沒有可換式卡匣。更確切地來說,拋棄式筆型遞送裝置在裝置的貯器內預先填充醫藥組成物供選購。一旦貯器沒有醫藥組成物,整個裝置就被丟棄。
許多可重複使用的筆型以及自動注射遞送裝置在皮下遞送本發明之醫藥組成物方面有實用性。實例包括,但不限定於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM pen(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM pen、HUMALOGTM pen、HUMALIN 70/30TM pen(Eli Lilly and Co.,Indianapois,IN)、NOVOPENTM I、II與III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM pen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、
OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany),僅舉幾個為例。在皮下投遞本發明之醫藥組成物方面有實用性的拋棄式筆型遞送裝置的實例包括,但不限於SOLOSTARTM pen(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)以及HUMIRATM Pen(Abbott Labs,Abbott Park IL),僅舉幾個為例。
在某些情況下,醫藥組成物以控制釋放系統的方式被投遞。在一個具體例中,可使用泵(參見Langer,上文;Sefton 1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一具體例中,可使用聚合材料;參見Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又另一個具體例中,控制釋放系統被置放在組成物目標鄰近處,因此僅需要全身性劑量的一部分(參見,例如Goodson,1984,Medical Applications of Controlled Release,上文,vol.2,pp.115-138中)。其他控制釋放系統在Langer,1990,Science 249:1527-1533的回顧中被討論。
可注射製品可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等的劑型。此等可注射製品可依照公知方法製備。例如,可注射製品可例如,藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於習知用於注射的無菌水性介質或油性介質中來製備。有關用於注射的水性介質,例如有生理食鹽水、含有葡萄糖與其他助劑的等張溶液等,其可與適當助溶劑(諸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化菎麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等組合使用。有關油性介質,採用例如芝麻油、大豆油等,其可與助溶劑(諸如安息酸苯甲酯、苯甲醇等)組合使用。由此製備的注射劑較佳地被填充於適當安瓿中。
有利地,上述供口服或非經口使用的醫藥組成物被製備為呈
適於活性成分投藥之單位劑量的劑型。此等呈單位劑量之劑型包括,例如錠劑、丸劑、囊劑、注射劑(安瓿)、栓劑等。在一個單位劑量中,所含前述抗體的數量通常每劑型約5至約500mg;尤其是呈注射型式,前述抗體就其他劑型而言較佳含有約5至約100mg以及約10至約250mg。
本發明的抗體尤其可應用於治療、預防及/或改善任何與PDGFR-貝他表現、訊號傳遞或活性相關或由PDGFR-貝他表現、訊號傳遞或活性媒介,或可藉由阻斷PDGFR-貝他與PDGFR-貝他配體(例如PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD、PDGF-AB等)交互作用,或以其他方式抑制PDGFR-貝他活性及/或訊號傳遞的疾病或病症。例如,本發明提供藉由對有需要此治療的患者投與如本文所述抗-PDGFR-貝他抗體(或包含抗-PDGFR-貝他抗體的醫藥組成物)治療眼疾、纖維化疾病(纖維化)、血管疾病及/或癌症(腫瘤生長抑制)的方法。在本文所述的治療方法中,抗-PDGFR-貝他抗體可以做為單一療法(亦即作為唯一的治療劑)或與一或多種其他治療劑(本文他處所述的實例)組合投與。
可藉由投與本發明抗-PDGFR-貝他抗體而被治療的例示性眼疾包括老年性黃斑退化(例如”溼”AMD)、滲出性AMD(exudative AMD)、糖尿病視網膜病變(例如增生性糖尿病視網膜病變)、視網膜靜脈阻塞性疾病(諸如中央視網膜靜脈阻塞(CRVO))、虹膜新生血管、新生血管性青光眼、青光眼的手術後纖維化、增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、脈絡膜新生血管、視神經盤新生血管、角膜新生血管、視網膜新生血管、玻璃體新生血管、血管翳、翼狀贅片、黃斑水腫、糖尿病黃斑水腫(DME)、血管視網膜病變、視網膜退化、葡萄膜炎,以及眼睛的發炎性疾病。
可藉由投與本發明抗-PDGFR-貝他抗體而被治療的例示性纖維化疾病包括肺纖維化(例如原發性肺纖維化、博來黴素-誘發的肺纖維化、石綿-誘發的肺纖維化,以及阻塞性支氣管炎症候群)、慢性氣喘、與急
性肺損傷以及急性呼吸窘迫有關的纖維化(例如細菌性肺炎誘發的纖維化、創傷誘發的纖維化、病毒性肺炎誘發的纖維化、人工呼吸器誘發的纖維化、非肺部敗血症誘發的纖維化以及抽吸誘發的纖維化)、矽肺病、放射線誘發的纖維化、慢性阻塞性肺病(COPD)、眼纖維化(例如眼纖維化瘢痕)、皮膚纖維化(例如硬皮症)、肝纖維化(例如肝硬化、酒精誘發的肝纖維化、非酒精性肝炎(NASH)、膽管損傷、原發性膽汁性肝硬化、感染或病毒誘發的肝纖維化[例如慢性HCV感染]、自體免疫肝炎)、腎臟(腎)纖維化、心臟纖維化、動脈粥狀硬化、支架再狹窄,以及骨髓纖維化。
可藉由投與本發明抗-PDGFR-貝他抗體而被治療的例示性血管疾病包括血管增生性疾病、肺動脈高壓、再狹窄、血管瘢痕等。
本發明亦包括藉由向有需要此治療的患者投與如本文所述抗-PDGFR-貝他抗體治療癌症、抑制腫瘤生長、促進腫瘤退行、抑制轉移,及/或抑制病理學血管新生(例如與腫瘤生長有關之血管新生)的方法。例如,本發明抗體與抗原-結合片段可用來治療,例如源於下列的原發性及/或轉移性腫瘤:腦與腦膜、口咽、肺與支氣管樹、胃腸道、男性與女性生殖道、肌肉、骨、皮膚及附器、結締組織、胰臟、免疫系統、造血細胞與骨髓、肝臟與尿道,及專門感覺器官(諸如眼)。在某些具體例中,本發明抗體及抗原-結合片段用來治療一或多種下列癌症:腎細胞癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌(例如腦部、口腔、口咽、鼻咽、下咽、鼻腔、副鼻竇、喉部、唇等的癌症)、***癌、尿道膀胱癌、惡性神經膠質瘤、骨肉瘤、造骨細胞瘤、骨軟骨瘤、結腸直腸癌、胃癌(例如帶有MET擴增的胃癌)、惡性間皮瘤、星狀細胞瘤、神經膠質母細胞瘤、髓母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌、結締組織腫瘤、卡波西氏肉瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌或黑色素瘤。
本發明包括組成物以及治療調配物,其包含本文所述抗
-PDGFR-貝他抗體的任一者與一或多種其他治療活性組分組合;以及包含向有需要的個體投與此組合的治療方法。
本發明抗-PDGFR-貝他抗體可與例如VEGF拮抗劑共調配及/或組合投與,VEGF拮抗劑為例如”VEGR-trap”,諸如阿柏西普(aflibercept)或如US 7,087,411中所列其他VEGF-抑制融合蛋白、抗-VEGF抗體或其抗原結合片段(例如,貝伐單抗(bevacizumab)、藍尼單抗(ranibizumab))、VEGF受體的小分子激酶抑制劑(例如,舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib)),或抗-VEGF受體抗體。抗-PDGFR-貝他抗體也可以與PDGF配體拮抗劑(例如,抗-PDGF-BB抗體、抗-PDGF-DD抗體、抗-PDGF-CC抗體、抗-PDGF-AB抗體,或其他PDGF配體拮抗劑,諸如適合體[例如,抗-PDGF-B適合體,諸如FovistaTM,Ophthotech Corp.,Princeton,NJ]、反義分子、核酶、siRNA、肽體、指向對抗PDGF配體的奈米抗體或抗體片段)組合。在其他具體例中,本發明抗-PDGFR-貝他抗體可與EGFR拮抗劑(例如,抗-EGFR抗體[例如西妥昔單抗(cetuximab)或帕尼單抗(panitumumab)]或EGFR的小分子抑制劑[例如吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)])、另一個EGFR家族成員(諸如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4)的拮抗劑(例如抗-ErbB2、抗-ErbB3或抗-ErbB4抗體或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制劑)、對EGFRvIII具有特異性的拮抗劑(例如特異地結合EGFRvIII的抗體)、cMET拮抗劑(例如抗-cMET抗體)、IGF1R拮抗劑(例如抗-IGF1R抗體),或B-raf抑制劑(例如維羅非尼(vemurafenib)、索拉非尼、GDC-0879、PLX-4720)共調配及/或組合投與。在某些情況下,本發明抗-PDGFR-貝他抗體可與PDGFR-阿伐抑制劑(例如抗-PDGFR-阿伐抗體)、DLL4拮抗劑(例如揭示於US 2009/0142354中的抗-DLL4抗體,諸如REGN421)、Ang2拮抗劑(例如揭示於US 2011/0027286中的抗-Ang2抗體,諸如H1H685P)等組合、共投與及/或組合投與。可有利地與本發明抗-PDGFR-貝他抗體組合投與的其他藥劑包括細胞激素抑制劑,包括結合至諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、
IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18的細胞激素或其個別受體的小分子細胞激素抑制劑與抗體。
本發明抗-PDGFR-貝他抗體也可以與抗病毒劑、抗生素、止痛劑、皮質類固醇、類固醇、氧氣、抗氧化劑、金屬螯合劑、IFN-珈瑪,及/或NSAID組合投與及/或共調配。本發明抗-PDGFR-貝他抗體也可以做為治療方案的一部分來投與,該治療方案包括放射線治療及/或習知化學療法(例如在治療癌症或抑制腫瘤生長的方法中)。
上述其他治療活性成分的任一者可與本發明抗-PDGFR-貝他抗體任一者組合投與以供治療任何投與抗-PDGFR-貝他抗體為有利的疾病或病症,包括例如本文所提及之眼疾、纖維化疾病、血管疾病及/或癌症。例如,在治療眼疾(例如溼AMD、糖尿病視網膜病變、CRVO或任何本文所述的其他眼疾)中,本發明抗-PDGFR-貝他抗體可以與VEGF拮抗劑共投與,及/或組合投與,VEGF拮抗劑為例如”VEGF-trap”,諸如阿柏西普或如US 7,087,411中所列其他VEGF-抑制融合蛋白,或抗-VEGF抗體或其抗原結合片段(例如,貝伐單抗或藍尼單抗)。
其他治療活性成分也可以在投與本發明抗-PDGFR-貝他抗體之前被投與給個體。例如,若第一組分在第二組分投與前1週、72小時、60小時、48小時、36小時、24小時、12小時、6小時、5小時、4小時、3小時、2小時、1小時、30分鐘、15分鐘、10分鐘、5分鐘,或少於1分鐘投與,則第一組分可以被視為在第二組分”之前”投與。在其他具體例中,其他治療活性組分可以在本發明抗-PDGFR-貝他抗體投與之後被投與給個體。例如,若第一組分在第二組分投與後1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時投與,則第一組分可以被視為在第二組分”之後”投與。在又其他具體例中,其他治療活性組分可以和本發明抗-PDGFR-貝他抗體投與同時被投與給個體。就本發明之目的而言,”同時投與”包括,例如
抗-PDGFR-貝他抗體與其他治療活性成分以單一劑型投與給個體,或以分散劑型彼此在約30分鐘或少於30分鐘內投與給個體。若以分散劑型投與時,則各個劑型可以經由相同路徑投與(例如,抗-PDGFR-貝他抗體與其他治療活性成分可以玻璃體內、皮下等被投與);或者,各個劑型可以經由不同路徑被投與(例如抗-PDGFR-貝他抗體可以玻璃體內被投與,而其他治療活性成分可以全身性地被投與)。在任何情況下,就本揭示內容目的而言,以單一劑型、藉由相同路徑以分散劑型,或藉由不同路徑以分散劑型投與組分全都被視為”同時投與”。就本揭示內容目的而言,在投與其他治療活性組分”之前”、”同時”或”之後”投與抗-PDGFR-貝他抗體(如上文定義的彼等術語)被視為抗-PDGFR-貝他抗體”組合”其他治療活性成分投與。
本發明包括醫藥組成物,其中本發明抗-PDGFR-貝他抗體與一或多種本文他處所述的其他治療活性成分共調配。
本發明亦包括含有PDGF拮抗劑與VEGF拮抗劑組合的其他治療組成物。PDGF拮抗劑依據本發明的這個態樣包括PDGF受體拮抗劑以及PDGF配體拮抗劑。同樣地,VEGF拮抗劑依據本發明的這個態樣包括VEGF受體拮抗劑以及VEGF配體拮抗劑。
依據本發明的某些具體例,多劑量之抗-PDGFR-貝他抗體(或包含抗-PDGFR-貝他抗體與本文所述其他治療活性劑任一者組合的醫藥組成物)可在一段限定時間裡被投與給個體。依據本發明此態樣的方法包含依序將多劑量之本發明抗-PDGFR-貝他抗體投與給個體。如本文所用,”依序投與”表示各劑量的抗-PDGFR-貝他抗體在不同時間點被投與給個體,例如在由預定間隔(例如數小時、數天、數週或數月)所分開的不同天。本發明包括含有將單一起始劑量之抗-PDGFR-貝他抗體,接而為一或多個第二劑量的抗-PDGFR-貝他抗體,以及視情況一或多個第三劑量的抗-PDGFR-貝他抗體依序投與給患者的方法。
術語”起始劑量”、”第二劑量”及”第三劑量”意指投與本發明抗-PDGFR-貝他抗體的時間順序。因此,”起始劑量”是在治療方案開始時被投與的劑量(亦意指為”基線劑量”);”第二劑量”為在起始劑量之後被投與的劑量;而”第三劑量”為在第二劑量之後被投與的劑量。起始劑量、第二劑量與第三劑量可全都含有相同數量之抗-PDGFR-貝他抗體,但通常會在投與頻率有所不同。但是,在某些具體例中,起始劑量、第二劑量及/或第三劑量中所含有之抗-PDGFR-貝他抗體數量將會在治療期間彼此改變(例如調高或調低,若需要的話)。在某些具體例中,兩個或更多個(例如2、3、4或5)劑量在治療方案開始被投與作為”加載體量”,接著以較不頻繁的方式投與後續劑量(例如”維持劑量”)。
在本發明的某些例示性具體例中,各第二劑量及/或第三劑量在緊接先前劑量之後1至26(例如1、1½、2、2½、3、3½、4、4½、5、5½、6、6½、7、7½、8、8½、9、9½、10、10½、11、11½、12、12½、13、13½、14、14½、15、15½、16、16½、17、17½、18、18½、19、19½、20、20½、21、21½、22、22½、23、23½、24、24½、25、25½、26、26½或更久)週被投與。片語”緊接先前劑量”,如本文所用,表示多次投與的順序,抗-PDGFR-貝他抗體劑量在順序上於下一個劑量投與之前被投與給患者而沒有任何***的劑量。
依據本發明此態樣的方法可含有將任一數目的第二劑量及/或第三劑量抗-PDGFR-貝他抗體投與給患者。例如,在某些具體例中,僅有單一第二劑量被投與給患者。在其他具體例中,兩個或更多個(例如,2、3、4、5、6、7、8或更多)第二劑量被投與給患者。同樣地,在某些具體例中,僅有單一第三劑量被投與給患者。在其他具體例中,兩個或更多個(例如,2、3、4、5、6、7、8或更多)第三劑量被投與給患者。
在涉及多個第二劑量的具體例中,各個第二劑量可以與其他第二劑量相同的頻率被投與。例如,各個第二劑量可在緊接先前劑量之後1
至2週或1至2個月被投與給患者。同樣地,在涉及多個第三劑量的具體例中,各個第三劑量可以與其他第三劑量相同的頻率被投與。例如,各個第三劑量可在緊接先前劑量之後2至12週被投與給患者。在本發明的某些具體例中,第二劑量及/或第三劑量投與給患者的頻率可能隨著治療方案過程而改變。投與頻率也可在治療過程期間遵循臨床檢驗由臨床醫師依據個別患者的需要來予以調整。
本發明包括投藥方案,其中以第一頻率(例如一週一次、每兩週一次、每三週一次、一個月一次、每兩個月一次等)對患者投與2至6個加載劑量,接著以較低的頻率對患者投與兩個或更多個維持劑量。例如,依據本發明的這個態樣,若加載劑量以一個月一次的頻率投與,則每六週一次、每兩個月一次、每三個月一次等對患者投與維持劑量。
本發明的抗-PDGFR-貝他抗體也可以用來偵測及/或測量樣本中的PDGFR-貝他或表現PDGFR-貝他的細胞,例如供診斷之用。舉例而言,抗-PDGFR-貝他抗體或其片段可以用來診斷特徵在於PDGFR-貝他異常表現(例如表現過度、表現不足、表現缺乏等)的病況或疾病。有關PDGFR-貝他的例示性診斷分析可包含,例如使得自於一患者的樣本與本發明抗-PDGFR-貝他抗體接觸,其中抗-PDGFR-貝他抗體標定有可偵測標誌或報導分子。或者,未標定的抗-PDGFR-貝他抗體可以組合本身可被偵測到標定之二級抗體一起使用於診斷應用。可偵測到的標誌或報導分子可以是放射性同位素,諸如3H、14C、32P、35S或125I;螢光或化學發光部分,諸如螢光素異氰酸鹽或玫瑰紅;或諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶,或螢光素酶的酵素。可用來偵測或測量樣本中的PDGFR-貝他的特定例示性分析包括酵素連結免疫分析法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)以及螢光-活化細胞分選(FACS)。
依據本發明,可用於PDGFR-貝他診斷分析中的樣本包括任
何可得自於患者的組織或體液樣本,其在正常或病理狀態下含有可偵測數量的PDGFR-貝他蛋白或其片段。一般來說,測量PDGFR-貝他在一個自健康患者(例如未罹患與異常PDGFR-貝他濃度或活性有關之疾病或病況的患者)所得到之特定樣本中的濃度以在開始時建立基線,或標準PDGFR-貝他濃度。PDGFR-貝他的這個基線濃度接而可以與得自於被懷疑帶有與PDGFR-貝他相關疾病或病況之個體的樣本中所測得的PDGFR-貝他濃度來比對。
圖1為顯示PDGF配體阻斷分析結果的直方圖,其中PDGFR-貝他被捕獲於生物感測器表面上且PDGF配體(BB、DD或AB)在以本發明的各種抗-PDGFR-貝他抗體或對照抗體處理之後被施加至表面上。結果顯示為RU。
圖2為顯示抗體交叉-競爭分析結果的矩陣圖,其中第一抗-PDGFR-貝他抗體(mAb#1)被施加至經PDGFR-貝他塗覆之感測器尖端,接著以第二抗-PDGFR-貝他抗體(mAb#2)處理。各個測試抗體組合的結合反應(數值-0.01至0.36)被繪出。帶有黑色字體之淺灰色盒表示自我競爭的結合反應。無關乎抗原結合順序之以兩個方向競爭的抗體被強調為帶有白色字體的黑色盒。無競爭,暗示不同結合區,表示為帶有黑色字體的白色盒。
提出下列實例俾以將如何製造與使用本發明方法和組成物之完整揭示內容以及說明提供給技藝中具有通常技術者,且不欲限制發明人就其發明所視為的範疇。已盡力確保所用數字(例如數量、溫度等)的正確性,但可能產生某些實驗誤差與偏差。除非另有指明,否則份為重量份,分子量為平均分子量,溫度為攝氏度,而壓力為大氣壓或近乎大氣壓。
包含PDGFR-貝他外域的免疫原與佐劑一起被直接投與給VELOCIMMUNE®小鼠以刺激免疫反應,VELOCIMMUNE®小鼠包含編碼人類免疫球蛋白重鏈與κ輕鏈可變區的DNA。藉由PDGFR-貝他-特異性免疫分析監控抗體免疫反應。當達到所欲的免疫反應時,收取脾臟細胞並且與小鼠骨髓瘤細胞融合以保留其活力並形成融合瘤細胞株。篩選並挑選融合瘤細胞株而鑑定出會生產PDGFR-貝他-特異性抗體的細胞株。使用此技術,獲得數種抗-PDGFR-貝他嵌合抗體(亦即具有人類可變域及小鼠恆定域的抗體);以這個方式所製造的例示性抗體命名如下:H1M3299N、H1M3305N、H1M3310N、H1M3361N、H2M3363N、H2M3365N、H2M3368N、H2M3373N以及H2M3374N。嵌合抗體的人類可變域接著被選殖至人類恆定域,以做出如本文所述的完全人類抗-PDGFR-貝他抗體。
如U.S.2007/0280945A1中所述,亦在不融合至骨髓瘤細胞的情況下直接由抗原-陽性B細胞分離抗-PDGFR-貝他抗體。使用這個方法,獲得數個完全人類抗-PDGFR-貝他抗體(亦即具有人類可變域與人類恆定域的抗體);以這個方式所製造的例示性抗體命名如下:H4H3394P、H4H3095S、H4H3096S、H4H3097S、H4H3098S、H4H3099S、H4H3102S、H4H3103S、H4H3104S、H4H3105S、H4H3106S、H4H3107S。
依據本實例方法所產生的例示性抗-PDGFR-貝他抗體的某些生物活性詳細描述於下文實例中。
表1顯示所選抗-PDGFR-貝他抗體的重鏈與輕鏈可變區胺基酸序列對及其對應抗體標識符號。
表1
抗體在本文中通常以下列命名法來意指:Fc前綴(例如”H1M”、”H2M”、”H4H”),接著是數字標識符號(例如表1中所示的”3299”、”3363”或”3094”),然後為”P”、”N”或”S”字尾。因此,依據這個命名法,抗體在本文可參照為例如”H1M3299N”、”H2M3363N”、”H4H3094”等。本文中所用抗體命名的H1M、H2M及H4H前綴表示抗體的特定Fc區同型。例如,”H1M”抗體具有小鼠IgG1 Fc,而”H4H”抗體具有人類IgG4 Fc。如同技藝中具有通常技術者所理解,具有特定Fc同型的抗體可轉換成帶有不同Fc同型的抗體(例如,帶有小鼠IgG1 Fc的抗體可轉換成帶有人類IgG4的抗體等),但在任何情況下,可變域(包括CDR)-由表1中所示數字標識符號所指-維持相同,且預期結合特性相同或實質相似而不論Fc域的本質為何。
抗-PDGFR-貝他對照抗體被納入下面實例中以供比對目的。對照抗體在本文命名為對照I:人類抗-PDGFR-貝他抗體,帶有如US 7,740,850中所列”2C5”的重鏈與輕鏈可變域序列。
抗原結合至選定經純化抗-人類PDGFR-貝他單株抗體的結合親和力與動力學常數是使用即時表面電漿共振生物感測器(Biacore T100,GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)在25℃與37℃下來進行測定。表示為小鼠Fc(前綴H1M;H2M)或人類Fc(前綴H4H)的抗體被捕獲在其對應抗-Fc感測器表面(Mab捕獲形式)上。不同濃度的可溶性單體PDGFR-貝他建構物(hPDGFRb.mmh[SEQ ID NO:337]、食蟹獼猴PDGFRb.mmh[SEQ ID NO:340])或二聚體PDGFR-貝他建構物(人類PDGFRb.mFc[SEQ ID NO:338]或人類PDGFRb.hFc[SEQ ID NO:339])以50μL/min的流速注射通過捕獲於表面上的抗-PDFR-貝他單株抗體。動力學締合(ka)與解離(kd)速率常數是藉由使用Scrubber 2.0曲線擬合軟體處理並將數據擬合至1:1結合模型而被確定。如下由動力學速率常數計算結合解離平衡常數(KD)與解離半衰期(t1/2):KD(M)=kd/ka;且t1/2(min)=(ln2/(60*kd)。不同抗-PDGFR-貝他單株抗體的動力學結合參數顯示於表2至5中。(NB=在使用條件下觀察到無結合;NT=未測試)。
表4:在37℃下,抗-PDGFR-貝他抗體(小鼠Fc形式)對單體與二聚體PDGFR-貝他建構物的結合特性
如表2-5中所示,本發明的數種抗-PDGFR-貝他抗體對人類與食蟹獼猴PDGFR-貝他建構物表現的親和力低於奈米莫耳濃度。此外,數個純系顯示對PDGFR-貝他建構物的結合比參考(對照1)抗體還緊密(KD較低)。
首先使用以ELISA為主的免疫分析評估某些本發明抗-人類PDGFR-貝他抗體阻斷受體結合至其配體PDGF-BB的能力。簡言之,以人類PDGF-BB(2μg/mL)塗覆盤。在室溫(25℃)下將250pM經生物素化的可溶性hPDGFR-beta.mmh(”biot-hPDGFR-beta-mmh”,SEQ ID NO:337)與經連續稀釋的抗-PDGFR-貝他抗體(0-100nM)預先混合歷時1小時。經平衡PDGFR-貝他/抗體溶液被添加至經配體塗覆的盤,容許培育歷時1小時,然後洗滌。結合biot-hPDGFR-beta-mmh的位準是使用HRP接合卵白素來偵測。使用Prism軟體分析數據,而IC50值計算為達到hPDGFR-beta-mmh結合至配體降低50%所需的抗體數量。亦可計算最大阻斷值並反映抗體相對於基線的阻斷能力。依據劑量曲線以定量250pM biot-hPDGFR-beta-mmh來測量的吸光度被定義為0%阻斷,而未添加PDGFR-貝他的吸光度被定義為100%。含有最高抗體濃度的孔的吸光度決定最大阻斷百分率。結果顯示於表6中。(”E”表示抗體為增強劑,亦即在某些濃度的抗體存在下的訊號比抗體不存在還高)。
如表6中所示,本發明的數種抗體有效地阻斷PDGFR-貝他與其天然配體PDGF-BB交互作用,其中IC50值範圍約7.6nM(H1M3299N)至約66pM(H4H3107S),而某些抗體提高受體-配體交互作用(例如,H4H3097S、H4H3098S與H4H3102S)。
亦使用即時SPR生物感測器分析(Biacore 3000)評估選定抗-人類PDGFR-貝他抗體阻斷配體(PDGF-BB、PDGF-DD與PDGF-AB)結合至人類PDGFR-貝他的能力。
簡言之,400RU的可溶性人類PDGFR-beta.mFc(SEQ ID NO:338)被捕獲於經多株兔抗-小鼠Fc抗體(GE Healthcare Life Sciences,
Piscataway,NJ)衍生化(共價偶合)的Biacore感測器表面上。以300nM的選定抗-PDGFR-貝他抗體使得經捕獲表面飽和歷時4分鐘,接著在25℃下注射30nM配體(PDGF-BB、PDGF-DD或PDGF-AB)歷時又4分鐘。在整個分析過程中監控即時結合反應,並與捕獲抗體不存在下當施加PDGF配體於經衍生化捕獲對照表面測得的結合反應相比對。結果繪示於圖1中。
如圖1中可見,當與無抗體對照相比,所有抗體表現阻斷PDGF-BB和PDGF-AB配體的能力,其中少數抗體能夠有效阻斷PDGF-DD。要注意的是,抗體H4H3094P、H4H3374N以及對照I,當配體被施加在Biacore感測器表面上時表現最少量的RU反應。
進行交叉競爭分析以評估選定抗體與另一者競爭結合至人類PDGFR-貝他的能力。簡言之,可溶性人類PDGFR-beta.mmh(SEQ ID NO:337)被捕獲於抗-五-his Octet感測器尖端(ForteBio Corp.,Menlo Park,CA)。以第一抗-PDGFR-貝他抗體(Mab #1;50μg/mL)使各個經PDGFR-beta.mmh塗覆的感測器尖端飽和歷時5分鐘。接著,以第二抗-PDGFR-貝他抗體(Mab #2)的溶液使各個感測器尖端飽和。監控Mab #2結合至與Mab #1預複合的PDGFR-beta.mmh的即時反應。在25℃下以1000rpm的流速在Octet RED384生物感測器上於Octet HBST緩衝液中依據製造商的使用說明(ForteBio Corp.,Menlo Park,CA)進行所有分析。結果繪示於圖2中。
少於0.1nM的結合反應以黑色或灰色遮蔽顯示於圖2中並表示相應抗體對互相競爭結合至PDGFR-貝他。大於0.2nM的結合反應(在圖2中以白色盒顯示)表示互相不競爭結合至PDGFR-貝他的抗體對。
本實例的結果指出,本發明抗-PDGFR貝他抗體依據表位結合特性分成兩個不同”群”:第1群包括對照I、H4H3365N、H4H3374N、H4H3103S與H4H3094P。第2群包括H4H3099S、H4H3107S、H4H3305N與
H4H3310N。這個實例的結果暗示,第1群抗體在PDGFR-貝他上結合至與第2群抗體不同的區域。
為了進一步對本發明抗-PDGFR-貝他抗體進行特徵鑑定,發展出一種藉由其已知結合配體中的兩者PDGF BB與PDGF DD偵測PDGFR-貝他活化的生物分析。PDGFR-貝他受體與其配體之間的交互作用對於引起不同細胞過程(增生、存活、遷移與型態形成)是必要的(Hoch and Soriano,2003,Development 130:5769-4784)。PDGF受體為受體酪胺酸激酶且是由阿伐與貝他受體在被PDGF BB和DD活化之後進行同型或異型二聚體而形成。在活化之後,引起自磷酸化並誘發數種訊號轉導路徑級聯,包括Ras-MAPK(有絲***促進劑-活化蛋白激酶)路徑。
為了偵測經由配體結合至PDGFR貝他活化MAPK訊號轉導路徑,生成穩定HEK293細胞株以表現全長人類PDGFR-貝他與螢光酶報導分子(血清反應性要素[SRE-螢光酶])。HEK293/hPDGFR-貝他細胞被植入96孔盤並維持在含有0.1% FBS的低血清培養基中過夜。在培育之後,經連續稀釋1:3的PDGF BB或PDGF DD以100nM至0.002nM的濃度被添加至細胞,以測定劑量反應。為了檢驗配體活化的MAPK訊號傳遞級聯的抑制,抗體以1:3連續稀釋且以100nM至0.002nM濃度被添加至細胞。PDGF BB與PDGF DD濃度維持不變分別在250pM與400pM且在5.5小時之後偵測螢光酶活性。PDGF BB與PDGF DD活化人類PDGFRb,EC50分別為0.04-1.11nM與0.34-1.82nM。針對各個抗體測定抑制50% PDGFR-貝他媒介訊號傳遞所需抗體濃度(IC50)。結果歸納於表7中。(NB=無阻斷;同型1=小鼠IgG陰性對照不相干抗體;同型2=人類IgG陰性對照不相干抗體)。
表7:抗-PDGFR-貝他抗體阻斷PDGF-BB與PDGF-DD配體活化的IC
50
值
如表7中所示,本發明抗-PDGFR-貝他抗體中的數者有效阻斷配體依賴性PDGFR-貝他活化,其中IC50在低於奈米莫耳濃度的範圍內。此外,小鼠IgG(同型1)與人類IgG(同型2)陰性對照均不會阻斷受體的配體活化。
為了研究抗體媒介的受體內化,使用經工程化以表現人類
PDGFR-貝他的細胞(HEK293/SRE-luc/PDGFRb細胞)進行實驗。簡言之,將20,000個HEK293/SRE Luc/PDGFRb細胞/孔置放於完全培養基(10%FBS、Pen/Strep/Glut、NEAA和G418於DMEM中)過夜並在4℃下以10μg/ml抗-PDGFR-貝他抗體染色歷時30分鐘。洗滌細胞兩次並在4℃下以Dylight 488接合的Fab山羊抗-人類IgG二級抗體(10μg/ml;Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)染色歷時30分鐘。接著,在37℃下培育細胞歷時2小時,以容許受體內化。藉由在4℃下將經洗滌細胞與抗-Alexa fluor 488(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)一起培育歷時45分鐘來淬滅Alexa-488螢光,俾以區別表面結合的抗體與被內化抗體。使用ImageXpress Micro XL(Molecular Devices LLC,Sunnyvale,CA)排攝影像並使用Columbus軟體(Perkin Elmer,Waltham,MA)進行點分析。相對內化是藉由比較各個抗體的淬滅染色(亦即內化抗體)與對照1抗體者來計算。結果歸納於表8中。
如表8中所示,所有研究的抗-PDGFR-貝他抗體在這個分析形式中顯示強烈的內化,反映抗體在各種治療情況下能夠有效靶定表現PDGFR-貝他的細胞。
PDGFR-貝他的細胞外部分由5個Ig樣C2型域(稱為D1-D5)組成。
D1至D3對於高親和力配體結合來說是必要的。在這個實例中,進行實驗來確定本發明抗-PDGFR-貝他抗體確實與哪個細胞外域交互作用。
關於這個實驗,使用四種不同PDGFR-貝他細胞外域建構物:D1(SEQ ID NO:342)、D1-D2(SEQ ID NO:343)、D1-D3(SEQ ID NO:344),以及D1-D4(SEQ ID NO:345),還有全長PDGFR-貝他。藉由表面電漿共振(Biacore)測試四種不同抗-PDGFR-貝他抗體對不同建構物的結合。簡言之,150-200RU的抗-PDGFR貝他抗體經由抗-人類Fc CM5晶片而被捕獲。接著,個別域建構物或全長PDGFR貝他以50nM濃度被施加至抗體結合的表面。測定各種抗體結合至不同域建構物的能力。結果顯示於表9中。(-)=觀察到無結合;(+)=觀察到結合;ND=未測定。
如表9中所歸納,所有抗體結合至全長PDGFR-貝他。兩種抗體H4H3094P與H4H3374N被測定到結合至域2。有趣的是,依據ELISA免疫分析,這兩種抗體也是配體阻斷劑,確認域2對配體(PDGF-BB)結合來說至為重要。其他兩種例示性測試抗體H4H3099S和H4H3305N不結合至任一域建構物,暗示就高親和力結合來說,這些抗體本身需要域4與5及/或域5之間的胺基酸。
在活體內視網膜外被細胞耗盡模型中測試兩種例示性抗-PDGFR貝他抗體H4H3374N和H4H3094P。外被細胞為表現PDGFR-貝他的平滑肌樣細胞。表現在內皮細胞上的PDGF-B對於招募外被細胞至新形成血管至為關鍵,因而促使血管新生與血管結構建立。但是,外被細胞與內皮之間的交互作用,以及PDGF-B/PDGFR-貝他訊號傳遞在病理學血管新生期間中斷,造成血管形成未能受到控制。在眼疾中,這個新生血管導致視覺疾病與眼盲。
在第一個實驗中,人化PDGFR-貝他幼小鼠被皮下(s.c.)注射3mg/kg H4H3374N、H4H3094P、對照I(2C5)或人類Fc(hFc),以觀察阻斷PDGF-B/PDGFR-貝他訊號傳遞在新形成血管分布方面的影響。簡言之,在出生後第2天(P2),將人化PDGFR-貝他幼鼠皮下注射3mg/kg的hFc對照或PDGFR-貝他抗體。在出生後第5天,犧牲幼鼠。收取雙眼並在4% P.F.A.中固定歷時1小時。以PBS洗滌眼睛3次且解剖視網膜同時移除玻璃狀體管。在室溫下以製備於抗體稀釋血清(ADS;1% BSA於0.05% Triton-X-100之PBS中)中的兔抗-NG2硫酸軟骨素一級抗體將視網膜染色O/N。在培育之後,所有視網膜於PBS中洗滌3次歷時15分,且接而在4℃下以經螢光素標記的加納籽植物凝集素以及經山羊抗-兔alexa 594標記的二級(製備於ADS中)染色O/N。在培育之後,所有視網膜再次於PBS中洗滌3次歷時15分。視網膜被平放於載玻片上且在沒有DAPI的情況下使用Fluoromount-GTM蓋上蓋玻片。
使用Nikon 80i螢光顯微鏡使視網膜成像。使用Adobe Photoshop與Fovea分析影像。針對各處理組測量平均NG2陽性區(對hFc進行常規化)。均以盲化模式進行成像與分析。使用單因子變異數分析於prism軟體中完成統計分析。結果歸納於表10-11中。
如表10-11中所示,在經抗-PDGFR-貝他抗體處理的小鼠中,平均視網膜NG2陽性區域相較於hFc降低。相對於hFc,抗體H4H3374N和H4H3094P的NG2陽性區域明顯降低(p<0.001)。此外,相較於H4H3094P和對照I抗體,H4H3374N在NG2陽性區域表現的降低最大。
在不同組的實驗中,C57BI/6幼小鼠在P2被皮下(SC)注射抗-小鼠PDGFR-貝他抗體”mAb39”(帶有被稱為APB5的抗體可變區,參見Uemura et al.,J.Clin.Invest.2002;110(11):1619-1628),劑量為50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg,或6.25mg/kg,或50mg/kg的Fc作為對照(研究1)。在P5使用兔抗-NG2硫酸軟骨素蛋白醣評估對外被細胞覆蓋的影響。在發育中的視網膜血管中,mAb3912.5mg/kg的所有劑量抑制血管外被細胞覆蓋。
在另一個研究(研究2)中,P2幼鼠被SC注射25mg/kg的mAb39或對照。在P5收取視網膜並以加納籽植物凝集素(”GS Lectin I”,Vector Labs)染色。在25mg/kg劑量下,mAb39相較於對照適度地降低血管化視網膜區域以及血管密度。
在不同組的實驗(研究3)中,幼鼠的左眼在P4被玻璃體內(IVT)注射5μg(0.5μl)的mAb39或對照並在P6收集。單次玻璃體內抗-PDGFR-貝他抗體投藥幾乎完全地耗盡壁細胞(mural cells)並對視網膜血管分化及型態形成產生明顯影響,例如不規則血管管徑。進行其他實驗來研究PDGFR-貝他中和作用在成鼠眼睛中的影響。具體而言,成鼠左眼IVT注射mAb39(5μg或10μg)或對照(5μg或10μg)。48小時後收集眼睛並以抗-NG2與GS Lectin I染色。在成鼠中,mAb39沒有產生任何外被細胞喪失或任何血管型態變化的證據。
這些研究共同證實,PDGFR-貝他的選擇性藥理學中和作用有效促使外被細胞耗盡並使得血管型態與發育中視網膜新生血管生長發生改變。相對地,這個相同抑制在成鼠視網膜中對於已建立血管分布中的成熟外被細胞與血管似乎沒有任何影響。
透過與玻璃體內(IVT)阿柏西普一起在帶有新生血管老年性黃斑退化(AMD)之患者中藉由玻璃體內注射遞送本發明抗-PDGFR-貝他抗體來進行第1期臨床研究,以測試本發明抗-PDGFR-貝他抗體的安全性。阿柏西普(亦已知為VEGFR1R2-Fc△C1(a))的胺基酸序列,以及編碼阿柏西普的核酸序列列示於WO2012/097019中,其揭示內容以其整體併入本文做為參考資料。
本研究主要目的在於探究玻璃體內(IVT)抗-PDGFR-貝他抗體在帶有新生血管AMD的患者中的安全性。次要目的在於發現IVT抗-PDGFR-貝他在帶有新生血管AMD的患者中對於角膜新生血管(CNV)的解剖學效用,並確定抗-PDGFR-貝他與阿柏西普在人類體內的藥動學。本研究
另一個目的在於確認經這些藥劑處理的個體體內,對抗抗-PDGFR-貝他抗體及/或阿柏西普之抗體存在。
這個研究的目標群為年齡50歲或更年長的男性和女性,且帶有新生血管AMD。約3-6名患者加入四個計劃組中。計畫總共有15-24名患者。六名患者加入最大耐受劑量(MTD)(若經鑑定)或最高劑量位準。
這個研究的主要納入要件如下:(1)年齡50歲或更年長的男性或女性;以及(2)相對於AMD為次要的活性視窩下CNV,包括影響視窩的近視窩病灶,如在研究眼部中藉由FA所表示。
主要排除要件如下:(1)在研究開始(第1天)的8週內於研究眼部中的IVT抗-VEGF療法;(2)任何使用PDGF或PDGFR抑制劑的先前治療;(3)在研究眼部內眼內壓大於或等於25mmHg;(4)在眼部中有感染性眼瞼炎、角膜炎、鞏膜炎或結膜炎的跡象;(5)在篩選診療的3個月內於眼部中有任何眼內發炎/感染;(6)當下在研究眼部中於篩選評估時可看到的虹膜新生血管、玻璃體出血,或牽引性視網膜剝離;(7)在眼部中因為AMD以外的任何原因造成的CNV跡象;(8)在眼部中有糖尿病視網膜病變或糖尿病黃斑水腫的跡象;(9)無法獲得影像、FA或OCT以提供CNV,例如因為介質濁度、對螢光染料過敏或缺少靜脈可接近(venous access);以及(10)在第1天的六週內有全身性(IV)抗-VEGF投藥。
在第1天/基線(第2次診療)之前至多2週,在篩選診療時評估患者的研究適格性。在第1天/基線(第2次診療),患者在接受研究藥物第一
次給藥之前經歷安全性評估。
適格患者將參與開放參與的組別。起始組接受抗-PDGFR-貝他/阿柏西普(以0.2mg:2mg共調配)。在第1天與第29天(±3天),患者接受注射抗-PDGFR-貝他/阿柏西普。
抗-PDGFR-貝他/阿柏西普的劑量將基於在先前組別期間評估的安全性和耐受性來遞增(從第一名患者開始,第一次給藥到那組最後一名患者的第二次給藥後2週,或約第六週)。同樣,在其他患者給藥前,於第一次給藥後觀察參與各組的第一名患者歷時至少1週。在數據已被檢視之後,遞增至次一劑量組。不允許患者內劑量遞增。
在研究診療時評估患者的眼部與全身安全性(包括眼部檢驗、實驗室評估等)以及有效性(OCT、FA/FP和BCVA,使用4-公尺ETDRS程序)且將追蹤至第24週。
四種不同抗-PDGFR-貝他/阿柏西普共調配物被投與給患者。共調配物歸納於表12中。
不同抗-PDGFR-貝他/阿柏西普共調配物將經由IVT注射被投遞且注射體積為50μl。如上所述,患者將接受兩次個別共調配物的投與。第一次投與將會是在第1天,而第二次投與將會是在第29天。
研究的主要評估指標為研究藥物的安全性。次要評估指標為:(1)在第8週以及第12週時,中心視網膜厚度相對於基線的變化(藉由OCT測量);(2)在第8週以及第12週時,帶有視網膜液完全解析之患者的比率(藉由OCT測量);(3)在第8週以及第12週時,CNV面積相對於基線的變化(藉由OCT測量);(4)在第8週以及第12週時,CNV大小相對於基線的變化(藉由FA測量);(5)在第8週以及第12週時,洩漏面積相對於基線的變化(藉由FA測量);(6)BCVA相對於基線的變化;以及(7)抗-藥物抗體的藥動學以及發生。
本發明就範圍來說並不受到此處所述的特定具體例囿限。更確切地說,除了此處所述者以外,本發明的各種修飾對於那些習於技藝者來說由前面發明說明以及隨附圖式來說是清楚的。此等修飾意欲落在隨附申請專利範圍的範疇內。
<110> 再生元醫藥公司
<120> 抗-PDGFR-貝他抗體及其用途
<130> 9850A
<140> TBA
<141> 隨附申請
<150> 61/750,437
<151> 2013-01-09
<150> 61/863,452
<151> 2013-08-08
<150> 61/909,421
<151> 2013-11-27
<160> 345
<170> 用於Windows第4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
<400> 4
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成
<400> 7
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
<210> 9
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<223> 合成
<400> 260
<210> 261
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 261
<210> 262
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 262
<210> 263
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 263
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 264
<210> 265
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<210> 267
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<213> 人工序列
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<223> 合成
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<212> DNA
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 274
<210> 275
<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
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<220>
<223> 合成
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 298
<210> 299
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 299
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<211> 6
<212> PRT
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<220>
<223> 合成
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 306
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 310
<210> 311
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<210> 312
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 312
<210> 313
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 313
<210> 314
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 314
<210> 315
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 315
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 316
<210> 317
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 319
<210> 320
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 320
<210> 321
<211> 354
<212> DNA
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<220>
<223> 合成
<400> 321
<210> 322
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 322
<210> 323
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 323
<210> 324
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 324
<210> 325
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 325
<210> 326
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 326
<210> 327
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 327
<210> 328
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 328
<210> 329
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 329
<210> 330
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 330
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 331
<210> 332
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 332
<210> 333
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 333
<210> 334
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 334
<210> 335
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 335
<210> 336
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 336
<210> 337
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 337
<210> 338
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 338
<210> 339
<211> 726
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 339
<210> 340
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 340
<210> 341
<211> 1106
<212> PRT
<213> 智慧人
<400> 341
<210> 342
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPDGFR-beta D1.mmH
<400> 342
<210> 343
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPDGFR-beta D1-D2.mmH
<400> 343
<210> 344
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPDGFR-beta D1-D3.mmH
<400> 344
<210> 345
<211> 396
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPDGFR-beta D1-D4.mmH
<400> 345
Claims (25)
- 一種抗體或其抗原-結合片段,其特異地結合人類血小板衍生生長因子受體貝他(PDGFR-貝他),其中該抗體或其抗原-結合片段包含:三個分別含有SEQ ID NO:132、134與136的重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2與HCDR3);以及三個分別含有SEQ ID NO:140、142與144的輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2與LCDR3),其中該抗體或其抗原-結合片段具有小於約30nM的結合解離平衡常數(KD),如在37℃下於表面電漿共振分析中所測量。
- 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段以少於約10nM的KD特異地結合單體PDGFR-貝他,如在37℃下於表面電漿共振分析中所測量。
- 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段包含含有SEQ ID NO:130的重鏈可變區(HCVR),以及含有SEQ ID NO:138的輕鏈可變區(LCVR),其中該抗體或其抗原-結合片段具有小於約200pM的結合解離平衡常數(KD),如在37℃下於表面電漿共振分析中所測量。
- 如申請專利範圍第1-3項中任一項之抗體或抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段阻斷至少一種PDGF配體結合至PDGFR-貝他。
- 如申請專利範圍第4項之抗體或抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段以少於約300pM的IC50值阻斷PDGF-BB配體結合至可溶性單體PDGFR-貝他,如在25℃下於活體外受體/配體結合分析中所測量。
- 如申請專利範圍第5項之抗體或抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段以少於約150pM的IC50值阻斷PDGF-BB配體結合至可溶性單體PDGFR-貝他,如在25℃下於活體外受體/配體結合分析中所測量。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體或抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段在表現PDGFR-貝他的細胞中抑制PDGF配體媒介的PDGFR-貝他訊號傳遞活化。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體或抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段特異地與PDGFR-貝他細胞外域的Ig域2內的一或多個胺基酸交互作用,其中Ig域2為SEQ ID NO:337的胺基酸97至178。
- 一種特異地結合人類血小板衍生生長因子受體貝他(PDGFR-貝他)的抗體或其抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段包含:(a)具有SEQ ID NO:130之胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR);以及(b)具有SEQ ID NO:138之胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR),其中該抗體或抗原-結合片段包含SEQ ID NO:130/138的HCVR/LCVR胺基酸序列對。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1至9項中任一項之抗體或抗原-結合片段,以及醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
- 一種如申請專利範圍第10項之醫藥組成物的用途,其用於製造治療眼疾的藥物。
- 如申請專利範圍第11項之用途,其中該眼疾是選自由下列組成之群:老年性黃斑退化(AMD)、滲出性AMD、糖尿病視網膜病變、中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、虹膜新生血管、新生血管性青光眼、青光眼的手術後纖維化、增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、脈絡膜新生血管、視神經盤新生血管、角膜新生血管、視網膜新生血管、玻璃體新生血管、血管翳、翼狀贅片、黃斑水腫、糖尿病黃斑水腫(DME)、血管視網膜病變、視網膜退化、葡萄膜炎,以及眼睛的發炎性疾病。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1至9項中任一項之抗體或抗原-結合片段,更包含VEGF拮抗劑,以及醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
- 如申請專利範圍第13項之醫藥組成物,其中該VEGF拮抗劑為抑制VEGF的融合蛋白或抗VEGF抗體或抗-VEGF抗體的抗原結合片段。
- 如申請專利範圍第14項之醫藥組成物,其中該VEGF拮抗劑為阿柏西普(aflibercept)、貝伐單抗(bevacizumab),或藍尼單抗(ranibizumab)。
- 一種如申請專利範圍第13至15項中任一項之醫藥組成物的用途,其用於製造治療眼疾的藥物。
- 如申請專利範圍第16項之用途,其中該眼疾是選自由下列組成之群:老年性黃斑退化(AMD)、滲出性AMD、糖尿病視網膜病變、中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、虹膜新生血管、新生血管性青光眼、青光眼的手術後纖維化、增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、脈絡膜新生血管、視神經盤新生血管、角膜新生血管、視網膜新生血管、玻璃體新生血管、血管翳、翼狀贅片、黃斑水腫、糖尿病黃斑水腫(DME)、血管視網膜病變、視網膜退化、葡萄膜炎,以及眼睛的發炎性疾病。
- 一種(i)如申請專利範圍第1至9項中任一項之抗體或抗原-結合片段;以及(ii)阿柏西普的用途,係用於製造治療老年性黃斑退化(AMD)的藥物。
- 如申請專利範圍第18項之用途,其中該抗體或其抗原-結合片段是在阿柏西普投與給個體之前、同時或之後被投與給個體。
- 如申請專利範圍第18或19項之用途,其中該抗體或其抗原-結合片段與阿柏西普一起以單一調配物形式被投與給個體。
- 如申請專利範圍第18或19項之用途,其中該抗體或其抗原-結合片段與阿柏西普以分散劑型被投與給個體。
- 一種如申請專利範圍第10項之醫藥組成物的用途,係用於製造抑制腫瘤生長的藥物。
- 如申請專利範圍第22項之用途,其中該腫瘤是選自由腎癌、胰臟癌、頭頸癌、乳癌、***癌、結腸癌、胃癌,以及卵巢癌、肺癌與皮膚癌組成之群。
- 一種如申請專利範圍第10項之醫藥組成物的用途,係用於製造治療纖維化的藥物。
- 如申請專利範圍第24項之用途,其中該纖維化病況為肺纖維化、眼纖維化、皮膚纖維化、腎臟纖維化或肝臟纖維化。
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