JP2020031662A - GFRα3に対するヒト抗体およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒトGFRα3に結合する抗体およびこれを使用する方法を提供すること。【解決手段】本明細書で開示されるある実施形態によれば、上記抗体は、ヒトGFRα3に結合する完全ヒト型抗体である。本開示の抗体は、1以上のGFRα3生物学的活性と関連する疾患および障害の処置(急性もしくは慢性の疼痛状態、または炎症状態の処置が挙げられる)に有用である。本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片をコードする、単離された核酸分子もまた提供される。【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明は、ヒトグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)ファミリー受容体α3(GFRα3)に特異的に結合するヒト抗体およびヒト抗体の抗原結合性断片、ならびにこれら抗体を使用する治療法に関する。
本発明は、ヒトグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)ファミリー受容体α3(GFRα3)に特異的に結合するヒト抗体およびヒト抗体の抗原結合性断片、ならびにこれら抗体を使用する治療法に関する。
関連技術の言及
グリア細胞由来神経栄養因子関連ファミリーは、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(artemin;ARTN)およびパーセフィン(PSPN)から構成される。上記GDNFファミリーの各メンバーは、形質膜と会合したグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー受容体に結合する。この受容体ファミリーは、GDNFファミリー受容体α(GFRα)といわれる。この受容体ファミリーは、4つの異なるGFRα受容体であるGFRα1〜4から構成される。GDNFは、GFRα1に優先的に結合し、NRTNは、GFRα2に優先的に結合し、ARTNは、GFRα3に優先的に結合し、PSPNは、GFRα4に優先的に結合する。各GDNFファミリーリガンドは、RET(「トランスフェクション時に再編成した(rearranged during transfection)」)受容体チロシンキナーゼを介してシグナル伝達し、上記RETは、癌原遺伝子として初めて発見された。RETは、上記リガンドがそのGFRα受容体に最初に結合される場合のみ、GDNFファミリーメンバーによって活性化される(Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383−394)。
グリア細胞由来神経栄養因子関連ファミリーは、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(artemin;ARTN)およびパーセフィン(PSPN)から構成される。上記GDNFファミリーの各メンバーは、形質膜と会合したグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー受容体に結合する。この受容体ファミリーは、GDNFファミリー受容体α(GFRα)といわれる。この受容体ファミリーは、4つの異なるGFRα受容体であるGFRα1〜4から構成される。GDNFは、GFRα1に優先的に結合し、NRTNは、GFRα2に優先的に結合し、ARTNは、GFRα3に優先的に結合し、PSPNは、GFRα4に優先的に結合する。各GDNFファミリーリガンドは、RET(「トランスフェクション時に再編成した(rearranged during transfection)」)受容体チロシンキナーゼを介してシグナル伝達し、上記RETは、癌原遺伝子として初めて発見された。RETは、上記リガンドがそのGFRα受容体に最初に結合される場合のみ、GDNFファミリーメンバーによって活性化される(Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383−394)。
ARTNおよびGFRα3はともに、発生中に高度に発現され、交感神経系発生に関与する。成体では、GFRα3発現は、後根神経節(DRG)の感覚ニューロンに主として限定される(Orozco, O.E., et al., European J. Neuroscience, (2001), 13:2177−2182)。成体マウスでは、アルテミンは、精巣、子宮、甲状腺、前立腺、および精巣上体において、嗅球ならびに腸および腸間膜の細動脈においても発現される(Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383−394; Airaksinen, M.S. et al., Brain, Behavior and Evolution, (2006),
68:181−190)。
68:181−190)。
痛覚過敏症におけるGFRα3およびアルテミンの考え得る役割は、いくつかの研究で既に示された。例えば、齧歯類の後ろ足へのアルテミンタンパク質の注射は、熱痛覚過敏症を引き起こし、この侵害受容は、アルテミンをNGFと共に注射した場合に増強されることが実証された(Malin, S.A., et al., J. Neuroscience, (2006), 26(33): 8588−8599)。他の研究は、アルテミンmRNA発現がマウス炎症モデルにおいてアップレギュレートされることを示した(Elitt, C.M., et al., J. Neuroscience,
(2006), 26(33): 8578−8587)。さらに、他の研究は、アルテミントランスジェニックマウスがTRPV1およびTRPA1の発現を上昇させ、熱さおよび冷たさに対する行動感受性を増大させたことを示した(Elitt, C.M.,
et al., J. Neuroscience, (2006), 26(33): 8578−8587)。さらに、内臓知覚過敏におけるGFRα3の考え得る役割は、GFRα3ノックアウトマウスにおける研究(これによってこれらマウスは、野生型C57BL/6マウスと比較して、TNBS(2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸)での結腸内処置後の内臓知覚過敏の減弱を示した)によって示された(Tanaka,
T., et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. (2011), 300:G418−G424)。膵炎と関連する疼痛におけるアルテミンおよびその受容体GFRα3の考え得る役割はまた、膵頭切除を受けている患者において行われた研究によって示された(Ceyhan, G.O., et al., Gut, (2007), 56:534−544)。前述に基づいて、さらなる研究によって、疼痛/痛覚過敏症および/もしくは過敏症に苦しんでいる患者がGFRα3活性のインヒビターでの処置によって利益を受け得るか否かを決定することが保証される。
(2006), 26(33): 8578−8587)。さらに、他の研究は、アルテミントランスジェニックマウスがTRPV1およびTRPA1の発現を上昇させ、熱さおよび冷たさに対する行動感受性を増大させたことを示した(Elitt, C.M.,
et al., J. Neuroscience, (2006), 26(33): 8578−8587)。さらに、内臓知覚過敏におけるGFRα3の考え得る役割は、GFRα3ノックアウトマウスにおける研究(これによってこれらマウスは、野生型C57BL/6マウスと比較して、TNBS(2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸)での結腸内処置後の内臓知覚過敏の減弱を示した)によって示された(Tanaka,
T., et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. (2011), 300:G418−G424)。膵炎と関連する疼痛におけるアルテミンおよびその受容体GFRα3の考え得る役割はまた、膵頭切除を受けている患者において行われた研究によって示された(Ceyhan, G.O., et al., Gut, (2007), 56:534−544)。前述に基づいて、さらなる研究によって、疼痛/痛覚過敏症および/もしくは過敏症に苦しんでいる患者がGFRα3活性のインヒビターでの処置によって利益を受け得るか否かを決定することが保証される。
GFRα3を結合する抗体は、US 6,861,509に記載される。さらに、US
6,677,135は、全長GFRα3配列を開示しているのに対して、GFRα3分子のスプライスバリアントは、US 7,026,138; US2007/0232535およびUS2006/0216289に記載される。US 7,138,251は、全長GFRα3と99%同一性を有する配列を開示し、この分子に対するヒト化モノクローナル抗体の調製をこの特許で記載している。
6,677,135は、全長GFRα3配列を開示しているのに対して、GFRα3分子のスプライスバリアントは、US 7,026,138; US2007/0232535およびUS2006/0216289に記載される。US 7,138,251は、全長GFRα3と99%同一性を有する配列を開示し、この分子に対するヒト化モノクローナル抗体の調製をこの特許で記載している。
Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383−394
Orozco, O.E., et al., European J. Neuroscience, (2001), 13:2177−2182
Airaksinen, M.S. et al., Brain, Behavior and Evolution, (2006), 68:181−190
Malin, S.A., et al., J. Neuroscience, (2006), 26(33): 8588−8599
Elitt, C.M., et al., J. Neuroscience, (2006), 26(33): 8578−8587
Tanaka, T., et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. (2011), 300:G418−G424
Ceyhan, G.O., et al., Gut, (2007), 56:534−544
発明の簡単な概要
第1の態様において、本発明は、ヒトGFRα3に結合し、その活性を阻害もしくはブロックする、例えば、グリア細胞株由来神経栄養因子アルテミンへのGFRα3の結合をブロックする、そしておそらく、RET受容体チロシンキナーゼのその後の活性化をブロックするおよび/もしくはRETを介するシグナル伝達をブロックするおよび/もしくはRET以外のメディエーターを介するシグナル伝達をブロックする、完全ヒト型(fully
human)モノクローナル抗体(mAb)およびその抗原結合性断片を提供する。上記抗
体もしくはその抗原結合性断片は、任意の感覚刺激(圧力、熱さおよび/もしくは冷たさが挙げられるが、これらに限定されない)に対する痛覚過敏症、アロディニアおよび/もしくは過敏症を処置するために有用であり得る。上記抗体はまた、GFRα3とアルテミンとの相互作用のブロックが望まれる、広い範囲の状態および障害と関連する疼痛/過敏症を処置するために使用され得る。上記抗体はまた、腫瘍細胞の成長、増殖および/もしくは転移を阻害するために使用され得る。
第1の態様において、本発明は、ヒトGFRα3に結合し、その活性を阻害もしくはブロックする、例えば、グリア細胞株由来神経栄養因子アルテミンへのGFRα3の結合をブロックする、そしておそらく、RET受容体チロシンキナーゼのその後の活性化をブロックするおよび/もしくはRETを介するシグナル伝達をブロックするおよび/もしくはRET以外のメディエーターを介するシグナル伝達をブロックする、完全ヒト型(fully
human)モノクローナル抗体(mAb)およびその抗原結合性断片を提供する。上記抗
体もしくはその抗原結合性断片は、任意の感覚刺激(圧力、熱さおよび/もしくは冷たさが挙げられるが、これらに限定されない)に対する痛覚過敏症、アロディニアおよび/もしくは過敏症を処置するために有用であり得る。上記抗体はまた、GFRα3とアルテミンとの相互作用のブロックが望まれる、広い範囲の状態および障害と関連する疼痛/過敏症を処置するために使用され得る。上記抗体はまた、腫瘍細胞の成長、増殖および/もしくは転移を阻害するために使用され得る。
一実施形態では、本発明は、ヒトGFRα3に特異的に結合し、以下の特徴のうちの1つ以上を有する単離された抗体もしくはその抗原結合性断片を提供する:
(i)表面プラズモン共鳴によって測定される場合に約10−8M〜約10−13Mの範囲に及ぶKDを示す;
(ii)約40pM〜約15nMの範囲に及ぶIC50値で、GFRα3のそのリガンドであるアルテミンへの結合のうちの約50〜100%をブロックする能力を示す;
(iii)アルテミンとRETとの混合物で被覆した固体支持体へのGFRα3の結合のうちの約20%〜約100%をブロックする能力を示す;
(iv)約200pM〜約50nMの範囲に及ぶIC50で、RETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する;
(v)骨がん疼痛のin vivoモデルにおいて1つ以上の侵害受容応答を阻害もしくは低減する;
(vi)アルテミン感作熱痛覚過敏(artemin-sensitized thermal hyperalgesia)
をin vivoで阻害もしくは低減する;
(vii)変形性関節症のin vivoモデルにおいてアロディニアを阻害もしくは低減する;
(viii)RETに対する他のGFR共受容体と交差反応しない;
(ix)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)を含む;または
(x)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含む。
(i)表面プラズモン共鳴によって測定される場合に約10−8M〜約10−13Mの範囲に及ぶKDを示す;
(ii)約40pM〜約15nMの範囲に及ぶIC50値で、GFRα3のそのリガンドであるアルテミンへの結合のうちの約50〜100%をブロックする能力を示す;
(iii)アルテミンとRETとの混合物で被覆した固体支持体へのGFRα3の結合のうちの約20%〜約100%をブロックする能力を示す;
(iv)約200pM〜約50nMの範囲に及ぶIC50で、RETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する;
(v)骨がん疼痛のin vivoモデルにおいて1つ以上の侵害受容応答を阻害もしくは低減する;
(vi)アルテミン感作熱痛覚過敏(artemin-sensitized thermal hyperalgesia)
をin vivoで阻害もしくは低減する;
(vii)変形性関節症のin vivoモデルにおいてアロディニアを阻害もしくは低減する;
(viii)RETに対する他のGFR共受容体と交差反応しない;
(ix)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)を含む;または
(x)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含む。
一実施形態では、上記単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群より選択される。
一実施形態では、上記単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片は、ヒトGFRα1ともヒトGFRα2とも交差反応しない。
一実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、
(a)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)と、
(b)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)と、
を含む。
(a)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)と、
(b)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)と、
を含む。
一実施形態では、上記単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片は、約40pM〜約750pMの範囲に及ぶIC50値で、ヒトGFRα3のそのリガンドであるアルテミンへの結合のうちの約50〜95%をブロックする能力を示す。
一実施形態では、上記単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片は、約400pM〜約15nMの範囲に及ぶIC50値で、ヒトGFRα3のそのリガンドであるアルテミンへの結合のうちの約75〜100%をブロックする。
一実施形態では、上記単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片は、約300pM〜約5nMの範囲に及ぶIC50で、ヒトRETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する。
一実施形態では、上記単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片は、約0.7nM〜約2.5nMの範囲に及ぶIC50で、カニクイザルRETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する。
一実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるHCVRアミノ酸配列内に含まれる3種の重鎖CDR(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)と、配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるLCVRアミノ酸配列内に含まれる3種の軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)と、を含む。
一実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)を含む。
一実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)と、を含む。
一実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、381/389および397/405からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対を含む。
一実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号50/58、146/154、210/218および290/298からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対を含む。
一実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、
(a)配列番号4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、383および399からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR1ドメインと、
(b)配列番号6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385および401からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR2ドメインと、
(c)配列番号8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、387および403からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR3ドメインと、
(d)配列番号12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391および407からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR1ドメインと、
(e)配列番号14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、393および409からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR2ドメインと、
(f)配列番号16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、395および411からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR3ドメインと、
を含む。
(a)配列番号4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、383および399からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR1ドメインと、
(b)配列番号6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385および401からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR2ドメインと、
(c)配列番号8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、387および403からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR3ドメインと、
(d)配列番号12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391および407からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR1ドメインと、
(e)配列番号14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、393および409からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR2ドメインと、
(f)配列番号16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、395および411からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR3ドメインと、
を含む。
一実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトGFRα3への特異的結合に関して、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346および354/362、381/389および397/405からなる群より選択される重鎖および軽鎖の配列の対を含む抗体または抗原結合性断片と競合する。
一実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトGFRα3上の、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346および354/362、381/389および397/405からなる群より選択される重鎖および軽鎖の配列の対を含む抗体によって認識されるのと同じエピトープに結合する。
本発明の抗体は、全長(例えば、IgG1またはIgG4抗体)であっても、あるいは抗原結合部分(例えば、Fab、F(ab’)2またはscFv断片)のみを含んでいてもよく、機能性に影響を及ぼすよう、例えば、残存エフェクター機能を排除するよう修飾されていてもよい(Reddyら、2000年、J. Immunol.164巻:1925〜1933頁)。
一実施形態では、ヒトGFRα3に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるHCVRアミノ酸配列内に含有される3種の重鎖CDR(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)を含むHCVRと、および/または配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるLCVRアミノ酸配列内に含有される3種の軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)を含むLCVRとを含む。HCVRおよびLCVRアミノ酸配列内のCDRを同定するための方法および技法は、本技術分野において周知のものであり、本明細書に開示されている規定のHCVRおよび/またはLCVRアミノ酸配列内のCDRの同定に使用することができる。CDRの境界の同定に使用することのできる例示的な慣例として、例えば、Kabat定義、Chothia定義およびAbM定義が挙げられる。一般用語において、Kabat定義は、配列可変性に基づき、Chothia定義は、構造的ループ領域の位置に基づき、AbM定義は、KabatとChothiaアプローチの折衷である。例えば、Kabat、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、National
Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991年);Al−Lazikaniら、J. Mol. Biol.273巻:927〜948頁(1997年);およびMartinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86巻:9268〜9272頁(1989年)を参照されたい。抗体内のCDR配列を同定するために、公開データベースを利用することもできる。
Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991年);Al−Lazikaniら、J. Mol. Biol.273巻:927〜948頁(1997年);およびMartinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86巻:9268〜9272頁(1989年)を参照されたい。抗体内のCDR配列を同定するために、公開データベースを利用することもできる。
一実施形態では、ヒトGFRα3に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片は、
(a)配列番号8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232,248、264、280、296、312、328、344、360、387および403からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR3ドメインと、
(b)配列番号16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、395および411からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR3ドメインと、
を含む。
(a)配列番号8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232,248、264、280、296、312、328、344、360、387および403からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR3ドメインと、
(b)配列番号16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、395および411からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR3ドメインと、
を含む。
一実施形態では、上記の(a)および(b)に記載されるとおりの、ヒトGFRα3に特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片は、
(c)配列番号4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、383および399からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR1ドメインと、
(d)配列番号6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385および401からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR2ドメインと、
(e)配列番号12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391および407からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR1ドメインと、
(f)配列番号14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、393および409からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR2ドメインと、
をさらに含む。
(c)配列番号4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、383および399からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR1ドメインと、
(d)配列番号6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385および401からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR2ドメインと、
(e)配列番号12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391および407からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR1ドメインと、
(f)配列番号14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、393および409からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR2ドメインと、
をさらに含む。
一実施形態では、本発明は、次の特徴のうち1種または複数を示す、ヒトGFRα3に特異的に結合する完全ヒト型モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する:(i)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCVRを含む;(ii)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCVRを含む;(iii)配列番号8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232,248、264、280、296、312、328、344、360、387および403からなる群より選択されるアミノ酸配列または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCDR3ドメイン;ならびに配列番号16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、395および411からなる群より選択されるアミノ酸配列または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCDR3ドメインを含む;(iv)配列番号4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、383および399からなる群より選択されるアミノ酸配列または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCDR1ドメイン;配列番号6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385および401からなる群より選択されるアミノ酸配列または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCDR2ドメイン;配列番号12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391および407からなる群より選択されるアミノ酸配列または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCDR1ドメイン;ならびに配列番号14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、393および409からなる群より選択されるアミノ酸配列または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCDR2ドメインを含む;(v)表面プラズモン共鳴によって測定される場合に約10−8M〜約10−13Mの範囲に及ぶKDを示す;(vi)約40pM〜約15nMの範囲に及ぶIC50値で、GFRα3のそのリガンドであるアルテミンへの結合のうちの約50〜100%をブロックする能力を示す;(vii)アルテミンとRETとの混合物で被覆された固体支持体へのGFRα3の結合のうちの約20%〜約100%をブロックする能力を示す;(viii)約200pM〜約50nMの範囲に及ぶIC50で、RETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する;(ix)骨がん疼痛のin vivoモデルで1つ以上の侵害受容応答を阻害もしくは低減する;(x)アルテミン感作熱痛覚過敏をin vivoで阻害もしくは低減する;(xi)変形性関節症のin vivoモデルでアロディニアを阻害もしくは低減する;(xii)RETに対する他のGFR共受容体と交差反応しない。
一実施形態では、本発明は、表1に示されるもののうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するHCDR3ドメイン;ならびに表1に示されるもののうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するLCDR3ドメインを含む抗体もしくは抗体の抗原結合性断片を提供する。
一実施形態では、本発明は、表1に示されるもののうちのいずれかのアミノ酸配列、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCDR1ドメイン;表1に示されるもののうちのいずれかのアミノ酸配列、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCDR2ドメイン;表1に示されるもののうちのいずれかのアミノ酸配列、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCDR1ドメイン;ならびに表1に示されるもののうちのいずれかのアミノ酸配列、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCDR2ドメインをさらに含む抗体もしくはその断片を提供する。
ある実施形態では、ヒトGFRα3に特異的に結合する抗体もしくは抗体の抗原結合部分は、表1に示されるHCDR3/LCDR3アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるHCDR3/LCDR3アミノ酸配列の対を含む。ある実施形態によれば、上記抗体もしくは抗体の抗原結合部分は、配列番号8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304、312/320、328/336、344/352、360/368、387/395および403/411からなる群より選択されるHCDR3/LCDR3アミノ酸配列の対を含む。
一実施形態では、上記抗体もしくはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号4、6および8のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号12、14および16のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号20、22および24のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号28、30および32のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号36、38および40のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号44、46および48のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号52、54および56のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号60、62および64のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号68、70および72のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号76、78および80のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号84、86および88のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号92、94および96のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号100、102および104のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号108、110および112のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号116、118および120のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号124、126および128のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号132、134および136のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号140、142および144のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号148、150および152のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号156、158および160のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号164、166および168のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号172、174および176のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号180、182および184のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号188、190および192のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号196、198および200のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号204、206および208のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号212、214および216のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号220、222および224のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号228、230および232のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号236、238および240のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号244、246および248のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号252、254および256のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号260、262および264のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号268、270および272のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号276、278および280のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号284、286および288のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号292、294および296のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号300、302および304のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号308、310および312のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号316、318および320のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号324、326および328のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号332、334および336のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号340、342および344のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号348、350および352のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号356、358および360のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号364、366および368のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号383、385および387のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号391、393および395のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号399、401および403のHCDR1、HCDR2およびHCDR3の配列、ならびにそれぞれ、配列番号407、409および411のLCDR1、LCDR2およびLCDR3の配列を含む。
本発明の特定の非限定的な例示的抗体および抗原結合性断片は、それぞれ、表1に示されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3のドメインを含む。
第2の態様では、本発明は、抗GFRα3抗体またはその断片をコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を保有する組換え発現ベクターと、係るベクターが導入された宿主細胞もまた、本発明によって包含されており、抗体の産生を可能にする条件下で該宿主細胞を培養し、産生された抗体を回収することにより抗体を産生する方法も同様である。
一実施形態では、本発明は、配列番号1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、380および396からなる群より選択される核酸配列またはその少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるHCVRを含む抗体またはその断片を提供する。一実施形態では、HCVRは、配列番号49、145、209および289からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、388および404からなる群より選択される核酸配列またはその少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるLCVRをさらに含む。一実施形態では、LCVRは、配列番号57、153、217および297からなる群より選択される核酸配列にコードされる。
一実施形態では、本発明はまた、表1に示される抗体のいずれかからの可変領域内に位置するヌクレオチド配列または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるHCDR3ドメインと、表1に示されるもののいずれかから選択されるヌクレオチド配列または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるLCDR3ドメインとを含む、抗体または抗体の抗原結合性断片を提供する。
一実施形態では、本発明は、表1に示されるもののうちのいずれかのヌクレオチド配列、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるHCDR1ドメイン;表1に示されるもののうちのいずれかのヌクレオチド配列、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるHCDR2ドメイン;表1に示されるもののうちのいずれかのヌクレオチド配列、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるLCDR1ドメイン;ならびに表1に示されるヌクレオチド配列、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるLCDR2ドメインをさらに含む抗体もしくはその断片を提供する。
第3の態様では、本発明は、表2に示す組み合わせによる、VH、DHおよびJH生殖系列配列に由来するヌクレオチド配列セグメントにコードされるHCVRと、VKおよびJK生殖系列配列に由来するヌクレオチド配列セグメントにコードされるLCVRを含む、ヒト抗hGFRα3抗体または抗体の抗原結合断片を特徴とする。
本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗hGFRα3抗体を包含する。一部の適用では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、例えば、抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)機能を増加させるためのフコース部分の除去が有用となり得る(Shieldら、(2002年)、JBC 277巻:26733頁を参照)。他の適用では、補体依存性細胞傷害(CDC)を修飾するために、ガラクトシル化の修飾を行うことができる。
第4の態様では、本発明は、hGFRα3を特異的に結合する組換えヒト抗体もしくはその断片および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物を特徴とする。一実施形態では、本発明は、本発明の抗体もしくは抗体の抗原結合性断片および第2の治療剤との組合せである組成物を特徴とする。上記第2の治療剤は、有利には本発明の抗体もしくはその断片と組合される任意の薬剤、例えば、疼痛を低減し得る薬剤(例えば、オピオイド、モルフィン、COX−2インヒビター、アスピリン、もしくは他の非ステロイド系抗炎症薬、アセトアミノフェン、デュロキセチン、局所麻酔薬、NMDAモジュレーター、カンナビノイド受容体アゴニスト、P2Xファミリーモジュレーター、VR1アンタゴニスト、およびサブスタンスPアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない)であり得る。上記第2の治療剤は、インターロイキン−1(IL−1)インヒビター、例えば、融合タンパク質(US 6,927,044);または抗癲癇薬/抗痙攣薬(例えば、ガバペンチン、プレガバリン、トピラマート);または三環系抗うつ薬(例えば、アミトリプチリン);サイトカインインヒビターもしくはアンタゴニスト(例えば、IL−6、IL−6R、IL−18もしくはIL−18Rに対するアンタゴニスト)、または電位開口型ナトリウムチャネルのインヒビター(例えば、Nav1.7インヒビター、もしくはNav1.8インヒビター、もしくはNav1.9インヒビター);カリウムチャネルもしくはカルシウムチャネルのインヒビター;あるいはNGFインヒビター(低分子インヒビターもしくは抗NGF抗体)、またはGFRα3に対する第2のインヒビターもしくはアンタゴニスト、腫瘍壊死因子(TNF)もしくはTNF受容体インヒビター、TWEAK(TNF関連の弱いアポトーシス誘導物質:TNF−related WEAK inducer of apoptosis)のインヒビター、RETインヒビター、GDNFファミリーリガンドのインヒビター、GFRα1、GFRα2もしくはGFRα4のインヒビター、酸感受性イオンチャネル(例えば、ASIC1もしくはASIC3)のインヒビター、または選択的セロトニン再取り込みインヒビター(SSRI)、またはセロトニンノルエピネフリン再取り込みインヒビター(SNRI)、あるいはプロキネティシン(prekineticin)受容体(例えば、PROK1およびPROK2)のインヒビター、またはカスパーゼインヒビター、p38インヒビター、IKK1/2インヒビター、CTLA−4Ig、あるいはコルチコステロイドであり得る。上記第2の治療剤は、低分子薬物またはタンパク質/ポリペプチドインヒビターであり得る。上記第2の治療剤は、合成であってもよいし、天然由来であってもよい。上記第2の治療剤は、GFRα3に対して特異的な第2の抗体、ポリペプチドアンタゴニスト、GFRα3に対して特異的なsiRNAもしくはアンチセンス分子であり得る。本発明の抗体および薬学的に許容され得る組成物を組合せ療法において用いてよいこと、すなわち、抗体および薬学的に許容され得る組成物は、1種または複数の他の所望の治療薬または医学的手順と同時発生的に、その前に、あるいはその後に投与することができることも認められよう。組合せレジメンにおいて用いるための療法(治療薬または手順)の特定の組み合わせは、所望の治療薬および/または手順の適合性ならびに達成されるべき所望の治療効果を考慮に入れるであろう。用いられている療法が、同じ障害に対する所望の効果を達成することができる(例えば、抗体は、同じ障害の処置に使用されている別の薬剤と同時発生的に投与することができる)、あるいは異なる効果を達成することができる(例えば、いずれかの有害効果の制御)ことも認められよう。本明細書において、特定の疾患または状態の処置または防止に通常投与される追加的な治療剤は、処置されている疾患または状態に適切である。
第5の態様では、本発明は、本発明の抗hGFRα3抗体もしくは抗体の抗原結合部分を使用してhGFRα3活性を阻害するための方法を特徴とし、ここで上記方法は、本発明の1種以上の抗体もしくはその抗原結合性断片、または本発明の1種以上の抗体もしくはその抗原結合性断片を含む薬学的組成物の治療上有効な量を投与する工程を包含する。
第6の態様では、本発明は、GFRα3関連状態もしくは疾患、または上記GFRα3関連状態もしくは疾患と関連する疼痛を処置するための方法を特徴とし、上記方法は、本発明の抗GFRα3抗体もしくは抗体の抗原結合部分、または抗GFRα3抗体もしくはその断片を含む組成物を、それが必要な患者に投与する工程を包含し、ここで上記GFRα3関連状態もしくは疾患は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減されるか、または上記状態もしくは疾患と関連した疼痛は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減される。
一実施形態では、本発明は、GFRα3関連状態もしくは疾患、または上記GFRα3関連状態もしくは疾患と関連する疼痛を処置することにおける使用のための、上記単離された抗体もしくはその抗原結合性断片、または本発明の少なくとも1つの抗体もしくはその抗原結合性断片を含む薬学的組成物を提供し、ここで上記GFRα3関連状態もしくは疾患は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減されるか、または上記状態もしくは疾患と関連した疼痛は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減される。
一実施形態では、本発明は、GFRα3関連状態もしくは疾患、または上記GFRα3関連状態もしくは疾患と関連した疼痛を処置するための医薬の製造における、本発明の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片、または本発明の少なくとも1つの抗体を含む薬学的組成物の使用を提供し、ここで上記GFRα3関連状態もしくは疾患は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減されるか、または該状態もしくは疾患と関連した疼痛は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減される。
一実施形態では、上記GFRα3関連状態もしくは疾患は、急性疼痛、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、機能性疼痛症候群、関節炎、膵炎、変形性関節症、群発頭痛、三叉神経痛、ヘルペス神経痛、全身性神経痛、神経変性性障害、運動障害、神経内分泌障害、運動失調症、内臓痛、急性痛風、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパチー、坐骨神経痛、背部痛、頭頚部痛、重篤なもしくは難治性の疼痛、突出痛、術後痛、遺伝性肢端紅痛症、歯痛、鼻炎、がん疼痛、複合性局所疼痛症候群(CRPS)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎)および膀胱障害からなる群より選択される。
一実施形態では、上記機能性疼痛症候群は、慢性腰痛、過敏性腸症候群(IBS)、線維筋痛症(FM)、慢性疲労症候群、腹痛、顎関節症(TMJD)、膀胱痛症候群(間質性膀胱炎)、機能性胃腸管障害/症候群、機能性胸痛症候群、片頭痛および緊張型頭痛、慢性骨盤痛症候群、前立腺痛症候群(慢性前立腺炎)、多種化学物質過敏症ならびに湾岸戦争症候群からなる群より選択される。
一実施形態では、上記がん疼痛は、子宮内膜がん、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、肝臓がん、膵臓がん、結腸がん、胃がん、子宮がん、卵巣がん、腎臓がん、非小細胞肺がん、脳がん、白血病、リンパ腫、骨がんおよびがんの転移と関連する疼痛からなる群より選択されるがんと関連する。
一実施形態では、抗体または抗原結合断片は、第2の治療剤と組み合わせて患者に投与される。
一実施形態では、上記第2の治療剤は、オピオイド、COX−2インヒビター、局所麻酔薬、NMDAモジュレーター、カンナビノイド受容体アゴニスト、P2Xファミリーモジュレーター、VR1アンタゴニスト、サブスタンスPアンタゴニスト、第2のGFRα3アンタゴニスト、サイトカインもしくはサイトカイン受容体アンタゴニスト、神経成長因子(NGF)インヒビター(低分子インヒビターもしくは抗NGF抗体)、アスピリン、NSAID、ステロイド、モルフィン、選択的セロトニン再取り込みインヒビター(SSRI)、セロトニンノルエピネフリン再取り込みインヒビター(SNRI)、三環系抗うつ薬(tricyclic)、電位開口型ナトリウムチャネル(Nav)のインヒビター、カルシウムチャネルインヒビター、カリウムチャネルインヒビター、腫瘍壊死因子(TNF)もしくはTNF受容体インヒビター、TWEAK(TNF関連の弱いアポトーシス誘導物質)のインヒビター、RETインヒビター、GDNFファミリーリガンドのインヒビター、酸感受性イオンチャネル(ASIC1もしくはASIC3)のインヒビター、抗痙攣薬(ガバペンチンもしくはプレガバリン)、プロキネティシン受容体(PROK1およびPROK2)のインヒビター、カスパーゼインヒビター、p38インヒビター、IKK1/2インヒビター、CTLA−4Igおよびコルチコステロイドからなる群より選択される。
一実施形態では、上記第2のGFRα3アンタゴニストは、有機低分子、GFRα3に対して特異的な第2の抗体、ポリペプチドアンタゴニスト、GFRα3に対して特異的なsiRNAもしくはアンチセンス分子である。
一実施形態では、上記サイトカインもしくはサイトカイン受容体アンタゴニストは、インターロイキン−1(IL−1)アンタゴニスト、IL−6アンタゴニスト、もしくはIL−18アンタゴニストである。
上記処置される障害は、hGFRα3活性の除去、阻害もしくは低減によって改善されるか、よくなるか、阻害されるかもしくは防止される、任意の疾患もしくは状態である。本発明の治療法によって処置可能な特定の集団としては、急性、慢性、虚血性、ニューロパチー、もしくは炎症性の疼痛、過敏症(例えば、内臓、熱、もしくは機械的刺激(mechanical)の過敏症)、慢性膵炎、関節炎、片頭痛、群発頭痛、三叉神経痛、ヘルペス神経痛、全身性神経痛、癲癇もしくは癲癇状態、筋緊張症、不整脈、運動障害、神経内分泌障害、運動失調症、炎症性腸疾患、脾臓炎症、胃痛、***部炎(trigonitis)、類線維腫(fibroids)、腹膜炎、便意切迫感(faecal urgency)、失禁、直腸過敏症(rectal hypersensitivity)、内臓痛、変形性関節症疼痛、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパチー、神経根性疼痛、坐骨神経痛、背部痛、頭頚部痛、突出痛、術後痛、がん疼痛、または化学療法誘発性疼痛から選択される疾患、障害、もしくは状態が挙げられる。本発明の治療法によって処置可能な他の状態としては、ヒルシュスプルング病、遺伝性肢端紅痛症、膀胱障害、鼻炎、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、肝臓がん、膵臓がん、結腸がん、胃がん、子宮がん、卵巣がん、腎臓がん、血液の(血液由来の)がん(例えば、白血病もしくはリンパ腫)、骨がん、またはがんの転移と関連する疼痛(例えば、骨へのがんの転移と関連する疼痛)が挙げられる。本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片はまた、以下の状態を処置するために使用され得る:非悪性の急性の、慢性の、もしくは骨折の骨疼痛;関節リウマチ、脊柱管狭窄症;神経障害性腰痛症(neuropathic low back pain);筋筋膜性疼痛症候群;膵臓の疼痛(pancreatic);慢性頭痛;緊張型頭痛;糖尿病性ニューロパチー;HIV関連ニューロパチー;シャルコー・マリー・トゥースニューロパチー(Charcot−Marie Tooth neuropathy);遺伝性感覚性ニューロパチー;末梢神経損傷;神経腫痛(painful neuromas);異所性の近位および遠位の分泌(proximal and distal discharge);神経根症;化学療法誘発性神経障害性疼痛;放射線療法誘発性神経障害性疼痛;***切除術後疼痛;中枢性疼痛;脊髄損傷疼痛;脳卒中後疼痛;視床痛;複合性局所疼痛症候群(CRPS、反射***感神経性ジストロフィーとしても公知);幻肢痛;難治性疼痛;急性筋骨格性疼痛;関節痛;急性痛風疼痛;機械的刺激による腰痛症(mechanical low back pain);頚部痛;腱炎;損傷性/運動性の疼痛;腹痛;腎盂腎炎;虫垂炎;胆嚢炎;腸閉塞;ヘルニア;他;胸痛(心臓痛を含む);骨盤痛、腎疝痛、急性の陣痛(acute obstetric pain)(陣痛を含む);帝王切開の疼痛;熱傷および外傷の疼痛;子宮内膜症;帯状疱疹疼痛;鎌状赤血球貧血(sickle cell anemia);急性膵炎;突出痛;口腔顔面痛(副鼻腔痛、歯痛を含む);多発性硬化症の疼痛;癩病の疼痛;ベーチェット病の疼痛;有痛脂肪症;静脈炎の疼痛; ギラン・バレー疼痛;痛む足と動く足症候群(painful legs and moving toes);ハグルンド症候群;ファブリー病の疼痛;膀胱および尿生殖器疾患;ならびに過活動膀胱(hyperactivity bladder)が挙げられる。一実施形態において、本発明の抗体は、機能性疼痛症候群を処置するために使用され得、ここで上記機能性疼痛症候群は、慢性腰痛、過敏性腸症候群(IBS)、線維筋痛症(FM)、慢性疲労症候群、腹痛、顎関節症(TMJD)、膀胱痛症候群(間質性膀胱炎)、機能性胃腸管障害/症候群、機能性胸痛症候群、片頭痛および緊張型頭痛、慢性骨盤痛症候群、前立腺痛症候群(慢性前立腺炎)、多種化学物質過敏症ならびに湾岸戦争症候群からなる群より選択される。
本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片はまた、腫瘍細胞の成長/増殖、または腫瘍細胞の転移を阻害するために使用され得る。ある実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、がん、または「がんと関連する疼痛」もしくは「がん関連疼痛」(例えば、子宮内膜がん、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、肝臓がん、膵臓がん、結腸がん、胃がん、子宮がん、卵巣がん、腎臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、脳がん、血液の(血液由来の)がん(例えば、白血病もしくはリンパ腫)、骨がん、またはがんの転移と関連する疼痛(例えば、骨へのがんの転移と関連する疼痛)が挙げられるが、これらに限定されない)を処置するために使用され得る。「がん関連疼痛」としてはまた、がん状態(例えば、腎細胞癌、膵臓癌、頭頸部がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、甲状腺がん、もしくは黒色腫)とより一般に関連する疼痛が挙げられる。本発明の抗体はまた、がん治療もしくは抗がん医療処置によって引き起こされるかもしくはこれらと関連する疼痛(例えば、化学療法誘発性神経障害性疼痛(例えば、パクリタキセル(タキソールTM)、ドセタキセル(タキソテール(登録商標));ニトロソウレア、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エピルビシン、5−フルオロウラシル、トポテカン、イリノテカン、カルムスチン、エストラムスチン、および白金ベースの化学療法化合物(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、およびイプロプラチン)での処置によって引き起こされるかもしくは上記処置と関連する疼痛))を処置もしくは防止するために有用である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
以下の特徴:
(i)表面プラズモン共鳴によって測定される場合に約10−8M〜約10−13Mの範囲に及ぶKDを示す;
(ii)約40pM〜約15nMの範囲に及ぶIC50値で、GFRα3のそのリガンドアルテミンへの結合のうちの約50〜100%をブロックする能力を示す;
(iii)アルテミンおよびRETの混合物で被覆した固体支持体へのGFRα3の結合のうちの約20%〜約100%をブロックする能力を示す;
(iv)約200pM〜約50nMの範囲に及ぶIC50で、RETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する;
(v)骨がん疼痛のin vivoモデルにおける1以上の侵害受容応答を阻害もしくは低減する;
(vi)アルテミン感作熱痛覚過敏をin vivoで阻害もしくは低減する;
(vii)変形性関節症のin vivoモデルでのアロディニアを阻害もしくは低減する;
(viii)RETの他のGFR共受容体と交差反応しない;
(ix)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)を含む;または
(x)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含む、
のうちの1つ以上を有する、GFRα3に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目2)
前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、項目1に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。(項目3)
前記抗体は、ヒトGFRα1ともヒトGFRα2とも交差反応しない、項目1または2のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目4)
前記抗体は、(a)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)、ならびに(b)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含むヒトモノクローナル抗体である、項目1〜3のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目5)
前記抗体は、約40pM〜約750pMの範囲に及ぶIC50値で、ヒトGFRα3のそのリガンドアルテミンへの結合のうちの約50〜95%をブロックする能力を示す、項目1〜4のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目6)
前記抗体もしくはその抗原結合性断片は、約400pM〜約15nMの範囲に及ぶIC50値で、ヒトGFRα3のそのリガンドアルテミンへの結合のうちの約75〜100%をブロックする、項目1〜4のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目7)
前記抗体もしくはその抗原結合性断片は、約300pM〜約5nMの範囲に及ぶIC50で、ヒトRETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する、項目1〜4のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目8)
前記抗体もしくはその抗原結合性断片は、約0.7nM〜約2.5nMの範囲に及ぶIC50で、カニクイザルRETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する、項目1〜4のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目9)
ヒトGFRα3に特異的に結合する単離された抗体もしくはその抗原結合性断片であって、ここで該抗体は、配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるHCVRアミノ酸配列内に含まれる3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2およびHCDR3);ならびに配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるLCVRアミノ酸配列内に含まれる3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)を含む、単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目10)
前記抗体もしくは抗原結合性断片は、配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)を含む、項目9に記載される単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目11)
前記抗体もしくは抗原結合性断片は、配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含む、項目9または10のいずれかに記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目12)
配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、381/389および397/405からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対を含む、項目9〜11のいずれか1項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目13)
配列番号50/58、146/154、210/218および290/298からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対を含む、項目12に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目14)
(a)配列番号4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、383および399からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR1ドメイン;
(b)配列番号6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385および401からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR2ドメイン;
(c)配列番号8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、387および403からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR3ドメイン;
(d)配列番号12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391および407からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR1ドメイン;
(e)配列番号14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、393および409からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR2ドメイン;ならびに
(f)配列番号16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、395および411からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR3ドメイン
を含む、項目9〜12のいずれか1項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目15)
ヒトGFRα3への特異的結合について、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346および354/362、381/389および397/405からなる群より選択される重鎖配列および軽鎖配列の対を含む抗体もしくは抗原結合性断片と競合する、単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目16)
配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346および354/362、381/389および397/405からなる群より選択される重鎖配列および軽鎖配列の対を含む抗体によって認識される、ヒトGFRα3上の同じエピトープを結合する単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目17)
項目9〜14のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片をコードする、単離された核酸分子。
(項目18)
項目17に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
(項目19)
抗GFRα3抗体もしくはその抗原結合性断片を生成する方法であって、該方法は、項目18に記載の発現ベクターを単離された宿主細胞へと導入する工程、該細胞を該抗体もしくはその断片の生成を可能にする条件下で増殖させる工程、およびそのように生成された該抗体を回収する工程を包含する、方法。
(項目20)
項目1〜16のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片および薬学的に許容され得るキャリアもしくは希釈剤を含む、薬学的組成物。
(項目21)
GFRα3関連状態もしくは疾患、または該GFRα3関連状態もしくは疾患と関連した疼痛を処置するための方法であって、該方法は、項目1〜16のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片を、その必要な患者に投与する工程を包含し、ここで該GFRα3関連状態もしくは疾患は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減されるか、または該状態もしくは疾患と関連した疼痛は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減される、方法。(項目22)
前記GFRα3関連状態もしくは疾患は、急性疼痛、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、機能性疼痛症候群、関節炎、膵炎、変形性関節症、群発頭痛、三叉神経痛、ヘルペス神経痛、全身性神経痛、神経変性性障害、運動障害、神経内分泌障害、運動失調症、内臓痛、痛風、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパチー、坐骨神経痛、背部痛、頭頚部痛、重篤なもしくは難治性の疼痛、突出痛、術後痛、遺伝性肢端紅痛症、歯痛、鼻炎、がん疼痛、複合性局所疼痛症候群(CRPS)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎)および膀胱障害からなる群より選択される、項目21に記載の方法。(項目23)
前記機能性疼痛症候群は、慢性腰痛、過敏性腸症候群(IBS)、線維筋痛症(FM)、慢性疲労症候群、腹痛、顎関節症(TMJD)、膀胱痛症候群(間質性膀胱炎)、機能性胃腸管障害/症候群、機能性胸痛症候群、片頭痛および緊張型頭痛、慢性骨盤痛症候群、前立腺痛症候群(慢性前立腺炎)、多種化学物質過敏症ならびに湾岸戦争症候群からなる群より選択される、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記がん疼痛は、子宮内膜がん、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、肝臓がん、膵臓がん、結腸がん、胃がん、子宮がん、卵巣がん、腎臓がん、非小細胞肺がん、脳がん、白血病、リンパ腫、骨がんおよびがんの転移と関連する疼痛からなる群より選択されるがんと関連する、項目22に記載の方法。
(項目23)
前記抗体もしくは抗原結合性断片は、第2の治療剤と組み合わせて前記患者に投与される、項目21に記載の方法。
(項目24)
前記第2の治療剤は、オピオイド、COX−2インヒビター、局所麻酔薬、NMDAモジュレーター、カンナビノイド受容体アゴニスト、P2Xファミリーモジュレーター、VR1アンタゴニスト、サブスタンスPアンタゴニスト、第2のGFRα3アンタゴニスト、サイトカインもしくはサイトカイン受容体アンタゴニスト、神経成長因子(NGF)インヒビター(低分子インヒビターもしくは抗NGF抗体)、BDNF、TrkA、TrkBもしくはp75のインヒビター、アスピリン、NSAID、ステロイド、モルフィン、選択的セロトニン再取り込みインヒビター(SSRI)、セロトニンノルエピネフリン再取り込みインヒビター(SNRI)、三環系抗うつ薬、電位開口型ナトリウムチャネル(Nav)のインヒビター、カルシウムチャネルインヒビター、カリウムチャネルインヒビター、腫瘍壊死因子(TNF)もしくはTNF受容体インヒビター、TWEAK(TNF関連の弱いアポトーシス誘導物質)のインヒビター、RETインヒビター、GDNFファミリーリガンドのインヒビター、GFRα1、GFRα2もしくはGFRα4のインヒビター、酸感受性イオンチャネル(ASIC1もしくはASIC3)のインヒビター、抗痙攣薬(ガバペンチンもしくはプレガバリン)、プロキネティシン受容体(PROK1およびPROK2)のインヒビター、カスパーゼインヒビター、p38インヒビター、IKK1/2インヒビター、CTLA−4Igおよびコルチコステロイドからなる群より選択される、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記第2のGFRα3アンタゴニストは、有機低分子、ポリペプチドアンタゴニスト、GFRα3に対して特異的な第2の抗体、GFRα3に対して特異的なsiRNAもしくはアンチセンス分子である、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記サイトカインもしくはサイトカイン受容体アンタゴニストは、インターロイキン−1(IL−1)アンタゴニスト、IL−6アンタゴニスト、もしくはIL−18アンタゴニストである、項目24に記載の方法。
(項目27)
項目1〜16のいずれか1項に従う抗体もしくはその抗原結合性断片および項目24に記載の第2の治療剤および薬学的に許容され得るキャリアもしくは希釈剤を含む、薬学的組成物。
(項目28)
GFRα3関連状態もしくは疾患、または該GFRα3関連状態もしくは疾患と関連する疼痛を処置することにおいて使用するための項目1〜16のいずれか1項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片、または項目20もしくは項目27のいずれかに記載の薬学的組成物であって、ここで該GFRα3関連状態もしくは疾患は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減されるか、または該状態もしくは疾患と関連した疼痛は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減される、方法。
(項目29)
項目28に記載の使用のための単離された抗体もしくはその抗原結合性断片であって、ここで前記GFRα3関連状態もしくは疾患は、急性疼痛、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、機能性疼痛症候群、関節炎、膵炎、変形性関節症、群発頭痛、三叉神経痛、ヘルペス神経痛、全身性神経痛、神経変性性障害、運動障害、神経内分泌障害、運動失調症、内臓痛、痛風、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパチー、坐骨神経痛、背部痛、頭頚部痛、重篤なもしくは難治性の疼痛、突出痛、術後痛、遺伝性肢端紅痛症、歯痛、鼻炎、がん疼痛、複合性局所疼痛症候群(CRPS)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎)および膀胱障害からなる群より選択される、抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目30)
GFRα3関連状態もしくは疾患、または該GFRα3関連状態もしくは疾患と関連した疼痛を処置するための医薬の製造における項目1〜16のいずれか1項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片、または項目20もしくは27のいずれかに記載の薬学的組成物の使用であって、ここで該GFRα3関連状態もしくは疾患は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減されるか、または該状態もしくは疾患と関連した疼痛は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減される、使用。
(項目31)
前記GFRα3関連状態もしくは疾患は、急性疼痛、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、機能性疼痛症候群、関節炎、膵炎、変形性関節症、群発頭痛、三叉神経痛、ヘルペス神経痛、全身性神経痛、神経変性性障害、運動障害、神経内分泌障害、運動失調症、内臓痛、痛風、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパチー、坐骨神経痛、背部痛、頭頚部痛、重篤なもしくは難治性の疼痛、突出痛、術後痛、遺伝性肢端紅痛症、歯痛、鼻炎、がん疼痛、複合性局所疼痛症候群(CRPS)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎)および膀胱障害からなる群より選択される、項目30に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片の使用。
他の実施形態は、次の詳細な説明の総説から明らかになるであろう。
(項目1)
以下の特徴:
(i)表面プラズモン共鳴によって測定される場合に約10−8M〜約10−13Mの範囲に及ぶKDを示す;
(ii)約40pM〜約15nMの範囲に及ぶIC50値で、GFRα3のそのリガンドアルテミンへの結合のうちの約50〜100%をブロックする能力を示す;
(iii)アルテミンおよびRETの混合物で被覆した固体支持体へのGFRα3の結合のうちの約20%〜約100%をブロックする能力を示す;
(iv)約200pM〜約50nMの範囲に及ぶIC50で、RETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する;
(v)骨がん疼痛のin vivoモデルにおける1以上の侵害受容応答を阻害もしくは低減する;
(vi)アルテミン感作熱痛覚過敏をin vivoで阻害もしくは低減する;
(vii)変形性関節症のin vivoモデルでのアロディニアを阻害もしくは低減する;
(viii)RETの他のGFR共受容体と交差反応しない;
(ix)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)を含む;または
(x)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含む、
のうちの1つ以上を有する、GFRα3に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目2)
前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、項目1に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。(項目3)
前記抗体は、ヒトGFRα1ともヒトGFRα2とも交差反応しない、項目1または2のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目4)
前記抗体は、(a)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)、ならびに(b)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含むヒトモノクローナル抗体である、項目1〜3のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目5)
前記抗体は、約40pM〜約750pMの範囲に及ぶIC50値で、ヒトGFRα3のそのリガンドアルテミンへの結合のうちの約50〜95%をブロックする能力を示す、項目1〜4のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目6)
前記抗体もしくはその抗原結合性断片は、約400pM〜約15nMの範囲に及ぶIC50値で、ヒトGFRα3のそのリガンドアルテミンへの結合のうちの約75〜100%をブロックする、項目1〜4のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目7)
前記抗体もしくはその抗原結合性断片は、約300pM〜約5nMの範囲に及ぶIC50で、ヒトRETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する、項目1〜4のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目8)
前記抗体もしくはその抗原結合性断片は、約0.7nM〜約2.5nMの範囲に及ぶIC50で、カニクイザルRETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する、項目1〜4のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目9)
ヒトGFRα3に特異的に結合する単離された抗体もしくはその抗原結合性断片であって、ここで該抗体は、配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるHCVRアミノ酸配列内に含まれる3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2およびHCDR3);ならびに配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるLCVRアミノ酸配列内に含まれる3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)を含む、単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目10)
前記抗体もしくは抗原結合性断片は、配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)を含む、項目9に記載される単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目11)
前記抗体もしくは抗原結合性断片は、配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含む、項目9または10のいずれかに記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目12)
配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、381/389および397/405からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対を含む、項目9〜11のいずれか1項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目13)
配列番号50/58、146/154、210/218および290/298からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対を含む、項目12に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目14)
(a)配列番号4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、383および399からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR1ドメイン;
(b)配列番号6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385および401からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR2ドメイン;
(c)配列番号8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、387および403からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR3ドメイン;
(d)配列番号12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391および407からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR1ドメイン;
(e)配列番号14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、393および409からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR2ドメイン;ならびに
(f)配列番号16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、395および411からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR3ドメイン
を含む、項目9〜12のいずれか1項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目15)
ヒトGFRα3への特異的結合について、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346および354/362、381/389および397/405からなる群より選択される重鎖配列および軽鎖配列の対を含む抗体もしくは抗原結合性断片と競合する、単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目16)
配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346および354/362、381/389および397/405からなる群より選択される重鎖配列および軽鎖配列の対を含む抗体によって認識される、ヒトGFRα3上の同じエピトープを結合する単離された抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目17)
項目9〜14のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片をコードする、単離された核酸分子。
(項目18)
項目17に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
(項目19)
抗GFRα3抗体もしくはその抗原結合性断片を生成する方法であって、該方法は、項目18に記載の発現ベクターを単離された宿主細胞へと導入する工程、該細胞を該抗体もしくはその断片の生成を可能にする条件下で増殖させる工程、およびそのように生成された該抗体を回収する工程を包含する、方法。
(項目20)
項目1〜16のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片および薬学的に許容され得るキャリアもしくは希釈剤を含む、薬学的組成物。
(項目21)
GFRα3関連状態もしくは疾患、または該GFRα3関連状態もしくは疾患と関連した疼痛を処置するための方法であって、該方法は、項目1〜16のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片を、その必要な患者に投与する工程を包含し、ここで該GFRα3関連状態もしくは疾患は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減されるか、または該状態もしくは疾患と関連した疼痛は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減される、方法。(項目22)
前記GFRα3関連状態もしくは疾患は、急性疼痛、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、機能性疼痛症候群、関節炎、膵炎、変形性関節症、群発頭痛、三叉神経痛、ヘルペス神経痛、全身性神経痛、神経変性性障害、運動障害、神経内分泌障害、運動失調症、内臓痛、痛風、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパチー、坐骨神経痛、背部痛、頭頚部痛、重篤なもしくは難治性の疼痛、突出痛、術後痛、遺伝性肢端紅痛症、歯痛、鼻炎、がん疼痛、複合性局所疼痛症候群(CRPS)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎)および膀胱障害からなる群より選択される、項目21に記載の方法。(項目23)
前記機能性疼痛症候群は、慢性腰痛、過敏性腸症候群(IBS)、線維筋痛症(FM)、慢性疲労症候群、腹痛、顎関節症(TMJD)、膀胱痛症候群(間質性膀胱炎)、機能性胃腸管障害/症候群、機能性胸痛症候群、片頭痛および緊張型頭痛、慢性骨盤痛症候群、前立腺痛症候群(慢性前立腺炎)、多種化学物質過敏症ならびに湾岸戦争症候群からなる群より選択される、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記がん疼痛は、子宮内膜がん、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、肝臓がん、膵臓がん、結腸がん、胃がん、子宮がん、卵巣がん、腎臓がん、非小細胞肺がん、脳がん、白血病、リンパ腫、骨がんおよびがんの転移と関連する疼痛からなる群より選択されるがんと関連する、項目22に記載の方法。
(項目23)
前記抗体もしくは抗原結合性断片は、第2の治療剤と組み合わせて前記患者に投与される、項目21に記載の方法。
(項目24)
前記第2の治療剤は、オピオイド、COX−2インヒビター、局所麻酔薬、NMDAモジュレーター、カンナビノイド受容体アゴニスト、P2Xファミリーモジュレーター、VR1アンタゴニスト、サブスタンスPアンタゴニスト、第2のGFRα3アンタゴニスト、サイトカインもしくはサイトカイン受容体アンタゴニスト、神経成長因子(NGF)インヒビター(低分子インヒビターもしくは抗NGF抗体)、BDNF、TrkA、TrkBもしくはp75のインヒビター、アスピリン、NSAID、ステロイド、モルフィン、選択的セロトニン再取り込みインヒビター(SSRI)、セロトニンノルエピネフリン再取り込みインヒビター(SNRI)、三環系抗うつ薬、電位開口型ナトリウムチャネル(Nav)のインヒビター、カルシウムチャネルインヒビター、カリウムチャネルインヒビター、腫瘍壊死因子(TNF)もしくはTNF受容体インヒビター、TWEAK(TNF関連の弱いアポトーシス誘導物質)のインヒビター、RETインヒビター、GDNFファミリーリガンドのインヒビター、GFRα1、GFRα2もしくはGFRα4のインヒビター、酸感受性イオンチャネル(ASIC1もしくはASIC3)のインヒビター、抗痙攣薬(ガバペンチンもしくはプレガバリン)、プロキネティシン受容体(PROK1およびPROK2)のインヒビター、カスパーゼインヒビター、p38インヒビター、IKK1/2インヒビター、CTLA−4Igおよびコルチコステロイドからなる群より選択される、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記第2のGFRα3アンタゴニストは、有機低分子、ポリペプチドアンタゴニスト、GFRα3に対して特異的な第2の抗体、GFRα3に対して特異的なsiRNAもしくはアンチセンス分子である、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記サイトカインもしくはサイトカイン受容体アンタゴニストは、インターロイキン−1(IL−1)アンタゴニスト、IL−6アンタゴニスト、もしくはIL−18アンタゴニストである、項目24に記載の方法。
(項目27)
項目1〜16のいずれか1項に従う抗体もしくはその抗原結合性断片および項目24に記載の第2の治療剤および薬学的に許容され得るキャリアもしくは希釈剤を含む、薬学的組成物。
(項目28)
GFRα3関連状態もしくは疾患、または該GFRα3関連状態もしくは疾患と関連する疼痛を処置することにおいて使用するための項目1〜16のいずれか1項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片、または項目20もしくは項目27のいずれかに記載の薬学的組成物であって、ここで該GFRα3関連状態もしくは疾患は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減されるか、または該状態もしくは疾患と関連した疼痛は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減される、方法。
(項目29)
項目28に記載の使用のための単離された抗体もしくはその抗原結合性断片であって、ここで前記GFRα3関連状態もしくは疾患は、急性疼痛、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、機能性疼痛症候群、関節炎、膵炎、変形性関節症、群発頭痛、三叉神経痛、ヘルペス神経痛、全身性神経痛、神経変性性障害、運動障害、神経内分泌障害、運動失調症、内臓痛、痛風、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパチー、坐骨神経痛、背部痛、頭頚部痛、重篤なもしくは難治性の疼痛、突出痛、術後痛、遺伝性肢端紅痛症、歯痛、鼻炎、がん疼痛、複合性局所疼痛症候群(CRPS)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎)および膀胱障害からなる群より選択される、抗体もしくはその抗原結合性断片。
(項目30)
GFRα3関連状態もしくは疾患、または該GFRα3関連状態もしくは疾患と関連した疼痛を処置するための医薬の製造における項目1〜16のいずれか1項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片、または項目20もしくは27のいずれかに記載の薬学的組成物の使用であって、ここで該GFRα3関連状態もしくは疾患は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減されるか、または該状態もしくは疾患と関連した疼痛は、重篤度もしくは発生の頻度において防止されるか、改善されるか、もしくは低減される、使用。
(項目31)
前記GFRα3関連状態もしくは疾患は、急性疼痛、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、機能性疼痛症候群、関節炎、膵炎、変形性関節症、群発頭痛、三叉神経痛、ヘルペス神経痛、全身性神経痛、神経変性性障害、運動障害、神経内分泌障害、運動失調症、内臓痛、痛風、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパチー、坐骨神経痛、背部痛、頭頚部痛、重篤なもしくは難治性の疼痛、突出痛、術後痛、遺伝性肢端紅痛症、歯痛、鼻炎、がん疼痛、複合性局所疼痛症候群(CRPS)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎)および膀胱障害からなる群より選択される、項目30に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性断片の使用。
他の実施形態は、次の詳細な説明の総説から明らかになるであろう。
詳細な説明
本方法について記載する前に、記載されている特定の方法および実験条件は変動し得るため、本発明が、係る方法および条件に限定されないことを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本明細書において使用されている用語法が、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、限定を企図しないことも理解されたい。
本方法について記載する前に、記載されている特定の方法および実験条件は変動し得るため、本発明が、係る方法および条件に限定されないことを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本明細書において使用されている用語法が、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、限定を企図しないことも理解されたい。
他に断りがなければ、本明細書において使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または検査において、本明細書に記載されている方法および材料と類似または同等のいかなる方法および材料を使用してもよいが、好ましい方法および材料を次に説明する。
定義
「GFRα3」もしくは「hGFRα3」とは、本明細書において用いられる場合、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)のファミリーに属する、アルテミンのグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカータンパク質受容体をいう。これは、そのリガンドであるアルテミンにいったん結合した後、受容体チロシンキナーゼRET(「rearranged during transfection」)の活性化を媒介するGDNFファミリー受容体αタンパク質のうちの1つである。GFRαファミリーの4つのメンバーが今までのところ認識されている(GFRα−1〜4 (Lindsay RM et al., Neuron, (1996), 17:571−574; Airaksinen, MS, et al., Mol. Cell Neurosci., (1999), 13:313−325))。GFRα3は、GDNFファミリー受容体α3 GPI結合受容体、もしくはグリア細胞株由来神経栄養因子受容体α3としても当該分野で公知である。表現「GFRα3」もしくは「hGFRα3」、またはこれらの断片は、本明細書において用いられる場合、非ヒト種に由来する(例えば、「マウスGFRα3」、「ラットGFRα3」、もしくは「サルGFRα3」)と特定されなければ、ヒトGFRα3タンパク質もしくはその断片をいう。さらに、「GFRα3」もしくは「hGFRα3」は、本明細書において用いられる場合、配列番号374(Genbankアクセッション番号NM_001496)に示される核酸配列によってコードされ、配列番号375(Genbankアクセッション番号NP_001487.2)に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヒトGFRα3、またはその生物学的に活性な断片をいう。そのシグナル配列は、配列番号375のアミノ酸残基1〜31にまたがり、成熟タンパク質は、配列番号375のアミノ酸残基32〜382にまたがるのに対して、C末端プロ領域は、配列番号375のアミノ酸残基383〜400にまたがる。GPI切断部位は、配列番号375のアミノ酸残基374(アスパラギン)で見いだされる。ヒトアルテミンのアミノ酸配列は、アクセッション番号Q5T4W7としてGenbankで見いだされ、myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを有する(アクセッション番号Q5T4W7のアミノ酸A108〜G220由来の)ヒトアルテミンのアミノ酸配列は、配列番号369として示される(配列番号369のアミノ酸残基114〜141は、myc−mycヘキサヒスチジンタグである)。
「GFRα3」もしくは「hGFRα3」とは、本明細書において用いられる場合、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)のファミリーに属する、アルテミンのグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカータンパク質受容体をいう。これは、そのリガンドであるアルテミンにいったん結合した後、受容体チロシンキナーゼRET(「rearranged during transfection」)の活性化を媒介するGDNFファミリー受容体αタンパク質のうちの1つである。GFRαファミリーの4つのメンバーが今までのところ認識されている(GFRα−1〜4 (Lindsay RM et al., Neuron, (1996), 17:571−574; Airaksinen, MS, et al., Mol. Cell Neurosci., (1999), 13:313−325))。GFRα3は、GDNFファミリー受容体α3 GPI結合受容体、もしくはグリア細胞株由来神経栄養因子受容体α3としても当該分野で公知である。表現「GFRα3」もしくは「hGFRα3」、またはこれらの断片は、本明細書において用いられる場合、非ヒト種に由来する(例えば、「マウスGFRα3」、「ラットGFRα3」、もしくは「サルGFRα3」)と特定されなければ、ヒトGFRα3タンパク質もしくはその断片をいう。さらに、「GFRα3」もしくは「hGFRα3」は、本明細書において用いられる場合、配列番号374(Genbankアクセッション番号NM_001496)に示される核酸配列によってコードされ、配列番号375(Genbankアクセッション番号NP_001487.2)に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヒトGFRα3、またはその生物学的に活性な断片をいう。そのシグナル配列は、配列番号375のアミノ酸残基1〜31にまたがり、成熟タンパク質は、配列番号375のアミノ酸残基32〜382にまたがるのに対して、C末端プロ領域は、配列番号375のアミノ酸残基383〜400にまたがる。GPI切断部位は、配列番号375のアミノ酸残基374(アスパラギン)で見いだされる。ヒトアルテミンのアミノ酸配列は、アクセッション番号Q5T4W7としてGenbankで見いだされ、myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを有する(アクセッション番号Q5T4W7のアミノ酸A108〜G220由来の)ヒトアルテミンのアミノ酸配列は、配列番号369として示される(配列番号369のアミノ酸残基114〜141は、myc−mycヘキサヒスチジンタグである)。
GFRα3は、GFRαファミリーの他のメンバーに構造的におよび機能的に類似であるが、GFRα3は、上記4つのファミリーメンバーのうちで最も関連性が遠い。GFRα1およびGFRα2は、約50%同一性を共有する(Sanicola, M. et al., PNAS, USA, (1997), 94:6238−43; Klein, RD, et al., (1997), Nature, 387:717−21; Buj−Bello, A. et al., Nature (1997),
387:721−4; Baloh, RH, et al., Neuron, (1997), 18:793−802)。その一方で、GFRα3は、これらタンパク質とそれぞれ、32%および37%の同一性を共有するに過ぎない(Masure, S.
et al., Eur. J. Biochem., (1998), 251:622−30; Nomoto, S. et al. , BBRC, (1998),
244:849−53)。マウスGFRα3のアミノ酸配列は、以下のGenbankアクセッション番号: NP_034410.3を有する。ヒトGFRα1のアミノ酸配列は、以下のGenbankアクセッション番号: NP_005255.1を有し、配列番号376としても見いだされる。カニクイザルGFRα3のアミノ酸配列は、配列番号377に示され、カニクイザルRETのアミノ酸配列は、配列番号378に示される。
387:721−4; Baloh, RH, et al., Neuron, (1997), 18:793−802)。その一方で、GFRα3は、これらタンパク質とそれぞれ、32%および37%の同一性を共有するに過ぎない(Masure, S.
et al., Eur. J. Biochem., (1998), 251:622−30; Nomoto, S. et al. , BBRC, (1998),
244:849−53)。マウスGFRα3のアミノ酸配列は、以下のGenbankアクセッション番号: NP_034410.3を有する。ヒトGFRα1のアミノ酸配列は、以下のGenbankアクセッション番号: NP_005255.1を有し、配列番号376としても見いだされる。カニクイザルGFRα3のアミノ酸配列は、配列番号377に示され、カニクイザルRETのアミノ酸配列は、配列番号378に示される。
用語「抗体」は、本明細書において用いられる場合、ジスルフィド結合によって相互接続された2本の重(H)鎖および2本の軽(L)鎖である、4本のポリペプチド鎖からなる免疫グロブリン分子(すなわち、「完全抗体分子」)と共に、その多量体(例えば、IgM)またはその抗原結合性断片を指すよう企図されている。各重鎖は、重鎖可変領域(「HCVR」または「VH」)および重鎖定常領域(ドメインCH1、CH2およびCH3からなる)からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(「LCVR」または「VL」)および軽鎖定常領域(CL)からなる。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と命名されたより保存された領域が散在する、相補性決定領域(CDR)と命名された超可変性の領域へとさらに細分することができる。各VHおよびVLは、3個のCDRおよび4個のFRで構成されており、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置される。本発明のある特定の実施形態では、抗GFRα3抗体(またはその抗原結合性断片)のFRは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、あるいは天然にまたは人為的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、2種以上のCDRの対比(side−by−side)解析に基づき定義することができる。
1個もしくは複数のCDR残基の置換または1個もしくは複数のCDRの省略も可能である。1個または2個のCDRを結合のために省くことのできる抗体が、科学文献に記載された。Padlanら(1995年、FASEB J.9巻:133〜139頁)は、発表された結晶構造に基づき、抗体とその抗原との間の接触領域を解析し、CDR残基のほんの約5分の1から3分の1が、抗原と実際に接触すると結論づけた。Padlanは、1個または2個のCDRが抗原と接触するアミノ酸を持たない、多くの抗体も発見した(Vajdosら、2002年、J Mol Biol 320巻:415〜428頁も参照)。
抗原と接触していないCDR残基は、分子モデリングによっておよび/または経験的に、Chothia CDR外部に位置するKabat CDRの領域から、以前の研究に基づき同定することができる(例えば、CDRH2における残基H60〜H65は、多くの場合必要とされない)。CDRまたはその残基(複数可)が省略される場合、これは通常、別のヒト抗体配列または係る配列のコンセンサスにおける相当するポジションを占めるアミノ酸に置換される。CDR内の置換のためのポジションおよび置換するためのアミノ酸は、経験的に選択することもできる。経験的な置換は、保存的または非保存的置換となり得る。
本明細書に開示されている、完全ヒト型抗hGFRα3抗体は、相当する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび/またはCDR領域に1個または複数のアミノ酸置換、挿入および/または欠失を含むことができる。係る変異は、本明細書に開示されているアミノ酸配列を、例えば、公開抗体配列データベースから入手できる生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されているアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合性断片を含み、1個または複数のフレームワークおよび/またはCDR領域内の1個または複数のアミノ酸は、相当する生殖系列残基(複数可)へと、または相当する生殖系列残基(複数可)の(天然または非天然の)保存的アミノ酸置換へと逆変異されている(back−mutated)(係る配列変化は、本明細書において、「生殖系列逆変異」と称される)。当業者であれば、本明細書に開示されている重および軽鎖可変領域配列から始めて、1個または複数の個々の生殖系列バック変異またはその組み合わせを含む多数の抗体および抗原結合性断片を容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、VHおよび/またはVLドメイン内のフレームワークおよび/またはCDR残基の全てが、生殖系列配列へと逆変異されている。他の実施形態では、ある特定の残基のみが、例えば、FR1の最初の8アミノ酸の内もしくはFR4の最後の8アミノ酸の内に見出される変異された残基のみが、生殖系列配列へと、またはすべてのフレームワーク領域FR1、FR2、FR3、FR4内、またはCDR1、CDR2もしくはCDR3の内に見出される変異された残基のみが生殖系列逆変異へと、逆変異されている。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび/またはCDR領域内の2個以上の生殖系列逆変異のいかなる組み合わせを含有することもできる、すなわち、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列へと逆変異されるが、生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持される。1個または複数の生殖系列逆変異を含有する抗体および抗原結合性断片を得たら、結合特異性の向上、結合親和性の増加、アンタゴニストまたはアゴニスト性の生物学的特性の向上または増強(場合による)、免疫原性の低下等、1種または複数の所望の特性に関して容易に検査することができる。このような一般的な様式で得られる抗体および抗原結合性断片は、本発明の範囲内に包含される。
用語「ヒト抗体」は、本明細書において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むように企図されている。本発明のヒトmAbは、例えば、CDR、特にCDR3において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にコードされないアミノ酸残基(例えば、in vitroにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘発またはin vivoにおける体細胞変異によって導入された変異)を含むことができる。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書において、別の哺乳動物種(例えば、マウス)の生殖系列に由来するCDR配列がヒトFR配列に移植されたmAbを含むようには企図されていない。本発明の抗ヒトGFRα3抗体は、「抗hGFRα3」もしくは「抗GFRα3」と称され得る。
用語「特異的に結合する」またはその他は、抗体またはその抗原結合性断片が、生理的条件下で相対的に安定的に抗原と複合体を形成することを意味する。特異的な結合は、少なくとも約1×10−6M以下(例えば、より小さいKDはより密接な結合を示す)の平衡解離定数によって特徴付けることができる。2個の分子が特異的に結合するか否か決定するための方法は、本技術分野において周知のものであり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴法その他が挙げられる。しかし、hGFRα3を特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原(例えば、他の種に由来するGFRα3分子)に対する交差反応性を示し得る。さらに、hGFRα3および1種もしくは複数の追加的な抗原に結合する多特異的抗体またはhGFRα3の2種の異なる領域に結合する二重特異性抗体であっても、本明細書において用いられる場合、hGFRα3に「特異的に結合する」抗体とみなされる。
本明細書において用いられる場合、指定された標的分子(例えば、特定のGFRα3ペプチド)に「結合しない」という用語は、上記抗体が、プラズモン共鳴アッセイにおいて25℃で上記標的分子への結合について試験された場合に500nMより大きなKDを示すか、または酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)において25℃で上記標的分子への結合について試験された場合に50nMより大きなEC50を示すか、またはいずれのタイプのアッセイもしくはその等価物においても何ら結合を示さないことを意味する。
用語「高親和性」抗体は、表面プラズモン共鳴法、例えば、BIACORE(商標)または溶液親和性ELISAによって測定される、少なくとも10−9M、好ましくは10−10M、より好ましくは10−11M、さらにより好ましくは10−12MのhGFRα3に対する結合親和性を有するmAbを指す。
用語「遅いオフレート」、「Koff」または「kd」とは、表面プラズモン共鳴法、例えば、BIACORE(商標)によって決定される、1×10−3s−1以下、好ましくは1×10−4s−1以下の速度定数でhGFRα3から解離する抗体を意味する。
用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合性断片」その他は、本明細書において、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、いずれかの天然に存在する、酵素により得ることができる、合成のまたは遺伝子改変したポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。用語、抗体の「抗原結合部分」または「抗体断片」は、本明細書において、hGFRα3に特異的に結合する能力を保持する抗体の1種または複数の断片を指す。
特異的な実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、オピオイド、COX−2インヒビター、局所麻酔薬,サイトカインアンタゴニスト(例えば、IL−1もしくはIL−6インヒビター)、第2のGFRα3インヒビター、NMDAモジュレーター、カンナビノイド受容体アゴニスト、P2Xファミリーモジュレーター、VR1アンタゴニスト、サブスタンスPアンタゴニスト、化学療法剤、もしくは放射性同位体等の治療部分にコンジュゲートすることができる(「イムノコンジュゲート」)。
「単離された抗体」は、本明細書において用いられる場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体(Ab)を実質的に含まない抗体を指すように企図されている(例えば、hGFRα3に特異的に結合する単離された抗体またはその断片は、hGFRα3以外の抗原に特異的に結合するAbを実質的に含まない)。
本明細書において用いられる場合、「中和抗体」(または「GFRα3活性を中和する抗体」)は、それとhGFRα3との結合が、GFRα3の少なくとも1種の生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指すように企図されている。GFRα3の生物学的活性のこのよ阻害は、数種の標準in vitroもしくはin vivoアッセイ(以下の実施例を参照のこと)のうちの1種または複数により、GFRα3生物学的活性の1種または複数の指標を測定することによって評価することができる。
用語「表面プラズモン共鳴法」は、本明細書において、例えば、BIACORE(商標)システム(Pharmacia Biosensor AB、スウェーデン、ウプサラおよびニュージャージー州ピスカタウェイ)を使用した、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変更の検出による、リアルタイム生体分子相互作用の解析を可能にする光学的現象を指す。
用語「KD」は、本明細書において、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すように企図されている。
用語「エピトープ」は、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、2個以上のエピトープを有し得る。よって、異なる抗体は、抗原における異なる区域に結合することができ、異なる生物学的効果を有することができる。用語「エピトープ」はまた、Bおよび/またはT細胞が応答する、抗原における部位を指す。これはまた、抗体によって結合される抗原の領域を指す。エピトープは、構造的エピトープまたは機能的エピトープと定義され得る。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、コンフォメーション性であってもよい。すなわち、非直鎖状アミノ酸から構成されてもよい。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基等、分子の化学的に活性を有する表面グループである決定基を含むことができ、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴および/または特異的な電荷特徴を有することができる。
用語「実質的同一性」または「実質的に同一」は、核酸またはその断片について言及する場合、後述するFASTA、BLASTまたはGAP等、配列同一性のいずれか周知のアルゴリズムによって測定され、適切なヌクレオチド挿入または欠失を用いて別の核酸(またはその相補ストランド)と最適に整列されたときに、ヌクレオチド塩基の少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約95%、96%、97%、98%または99%においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。参照核酸分子に対し実質的同一性を有する核酸分子は、ある特定の事例において、参照核酸分子にコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的類似性」または「実質的に類似の」は、2種のペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を使用してプログラムGAPまたはBESTFIT等により最適に整列されたときに、少なくとも90%配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%、98%または99%配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基ポジションは、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性(例えば、電荷または疎水性)を有する側鎖(R基)を有する別のアミノ酸残基により置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないであろう。2種以上のアミノ酸配列が、保存的置換により互いに異なる場合、類似性のパーセントまたは度合は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整することができる。この調整を行うための手段は、当業者に周知のものである(例えば、Pearson(1994年)Methods Mol. Biol.24巻:307〜331頁を参照)。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例として、1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン;2)脂肪族−ヒドロキシル側鎖:セリンおよびスレオニン;3)アミド含有側鎖:アスパラギンおよびグルタミン;4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン;5)塩基性側鎖:リシン、アルギニンおよびヒスチジン;6)酸性側鎖:アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに7)硫黄含有側鎖:システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置き換えは、Gonnetら(Gonnetら、Science(1992年)256巻:1443 45頁)に開示されているPAM250対数尤度マトリックスにおいて正の値を有するいずれかの変化である。「中程度に保存的」置き換えは、PAM250対数尤度マトリックスにおいて負ではない値を有するいずれかの変化である。
ポリペプチドの配列類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失および他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似の配列を一致させる。例えば、GCGソフトウェアは、デフォルトパラメータにより使用して、異なる生物種由来の相同ポリペプチド等、密接に関係したポリペプチドの間、あるいは野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定することのできるGAPおよびBESTFIT等のプログラムを含有する。例えば、GCGバージョン6.1を参照されたい。ポリペプチド配列は、デフォルトまたは推奨されるパラメータを用いてFASTAを使用して比較することもできる。GCGバージョン6.1におけるプログラムFASTA(例えば、FASTA2およびFASTA3)は、アライメントならびに問い合わせおよび検索配列間の最良の重複の領域のパーセント配列同一性を提供する(Pearson(2000年)上記参照)。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用したコンピュータプログラムBLAST、特にBLASTPまたはTBLASTNである(例えば、Altschulら、(1990年)J. Mol. Biol.215巻:403 410頁および(1997年)Nucleic Acids Res.25巻:3389 402頁を参照)。
特異的な実施形態では、本発明の方法における使用のための抗体または抗体断片は、単一特異性、二重特異性または多特異性となり得る。多重特異性抗体は、1種の標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的となり得る、あるいは2種以上の標的ポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。本発明の文脈において使用することのできる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第1の免疫グロブリン(Ig)CH3ドメインおよび第2のIg CH3ドメインの使用に関与し、第1および第2のIg CH3ドメインは、少なくとも1個のアミノ酸が互いに異なり、少なくとも1個のアミノ酸差は、アミノ酸差を欠く二重特異性抗体と比較して、プロテインAへの二重特異性抗体の結合を低下させる。一実施形態では、第1のIg CH3ドメインは、プロテインAに結合し、第2のIg CH3ドメインは、H95R修飾(IMGTエクソンナンバリングによる;EUナンバリングによるH435R)等、プロテインA結合を低下または消失させる変異を含有する。第2のCH3は、Y96F修飾(IMGTによる;EUによるY436F)をさらに含むことができる。第2のCH3内に見出すことのできるさらなる修飾は、IgG1 mAbの場合、D16E、L18M、N44S、K52N、V57MおよびV82I(IMGTによる;EUによるD356E、L358M、N384S、K392N、V397MおよびV422I);IgG2 mAbの場合、N44S、K52NおよびV82I(IMGT;EUによるN384S、K392NおよびV422I);ならびにIgG4 mAbの場合、Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79QおよびV82I(IMGTによる;EUによるQ355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419QおよびV422I)を含む。上に記載されている二重特異性抗体フォーマットにおけるバリエーションは、本発明の範囲内であるとみなされる。
語句「治療有効量」とは、これを投与した目的であるところの所望の効果を生じる量を意味する。正確な量は、処置の目的に依存し、当業者であれば、公知の技法を使用して確認することができるであろう(例えば、Lloyd(1999年)The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compoundingを参照)。
用語「機能性疼痛症候群」とは、全世界の人口のうちの最大15%までに影響を及ぼす、慢性的な症状がベースの症候群をいう。それらは、身体の種々の領域に関する慢性疼痛および不快感によって特徴付けられる。上記症状を十分に説明し得る一般的に認められた構造的な、炎症性の、もしくは生化学的な異常は、全く同定されていない。患者は、大いに低下したクオリティー・オブ・ライフを示すが、処置選択肢は限られており、新規な治療アプローチの開発は、期待外れであった。このカテゴリーに入る一般的障害のうちのいくつかとしては、慢性腰痛、過敏性腸症候群(IBS)、線維筋痛症(FM)、慢性疲労症候群、機能性腹痛症候群、顎関節症(TMJD)、膀胱痛症候群(間質性膀胱炎)、機能性胃腸管障害/症候群、機能性直腸疼痛症候群(functional rectal
pain syndrome)、機能性胸痛症候群、片頭痛および緊張型頭痛、慢性骨盤痛症候群、前立腺痛症候群(慢性前立腺炎)、多種化学物質過敏症、ならびに湾岸戦争症候群が挙げられる。
pain syndrome)、機能性胸痛症候群、片頭痛および緊張型頭痛、慢性骨盤痛症候群、前立腺痛症候群(慢性前立腺炎)、多種化学物質過敏症、ならびに湾岸戦争症候群が挙げられる。
一般的説明
グリア細胞株由来神経栄養因子関連ファミリーは、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NRTN)、パーセフィン(PSPN)、およびアルテミン(ARTN)を含む。GDNFファミリータンパク質は、感覚ニューロン、腸ニューロン、交感神経および副交感神経のニューロン、ならびに種々の非神経組織の発生および維持に差次的に関与している(Henderson, C.E., et al., (1994), Science 266:1062−1064; Kotzbauer, P.T. et al., (1996), Nature 384:467−470; Springer, J.E., et al. (1994), Exp. Neurol. 127:167−170; Schaar. D.G., et al., (1993), Exp. Neurol. 124:368−371)。GDNFは、ドパミン作動性ニューロン、ノルアドレナリン作動性ニューロン、および脊髄運動ニューロンの特に強力な生存因子である(Yan, Q. et al. (1995), Nature, 373:341−344; Henderson, C.E., et al., (1994), Science, 266:1062−1064; Buj−Bello, A. et al., (1995), Neuron, 15:821−828)。他のGDNFファミリー増殖メンバーは、神経系の外で機能を有する(Trupp, M. et al., (1995), J. Cell Biol. 130:137−148; Kotzbauer, P.T. et al., (1996), Nature 384:467−470; Springer, J.E., et al. (1994), Exp. Neurol. 127:167−170; Schaar. D.G., et al., (1993), Exp. Neurol. 124:368−371)。例えば、NRTN、ARTN、およびPSPNはまた、発生中の腎臓で発現される。GDNFはまた、腎臓形態形成および***形成の調節において神経系の外で重要な役割を有する(Airaksinen, M.S. et al., (2002), Nature Reviews 3:383−392)。
グリア細胞株由来神経栄養因子関連ファミリーは、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NRTN)、パーセフィン(PSPN)、およびアルテミン(ARTN)を含む。GDNFファミリータンパク質は、感覚ニューロン、腸ニューロン、交感神経および副交感神経のニューロン、ならびに種々の非神経組織の発生および維持に差次的に関与している(Henderson, C.E., et al., (1994), Science 266:1062−1064; Kotzbauer, P.T. et al., (1996), Nature 384:467−470; Springer, J.E., et al. (1994), Exp. Neurol. 127:167−170; Schaar. D.G., et al., (1993), Exp. Neurol. 124:368−371)。GDNFは、ドパミン作動性ニューロン、ノルアドレナリン作動性ニューロン、および脊髄運動ニューロンの特に強力な生存因子である(Yan, Q. et al. (1995), Nature, 373:341−344; Henderson, C.E., et al., (1994), Science, 266:1062−1064; Buj−Bello, A. et al., (1995), Neuron, 15:821−828)。他のGDNFファミリー増殖メンバーは、神経系の外で機能を有する(Trupp, M. et al., (1995), J. Cell Biol. 130:137−148; Kotzbauer, P.T. et al., (1996), Nature 384:467−470; Springer, J.E., et al. (1994), Exp. Neurol. 127:167−170; Schaar. D.G., et al., (1993), Exp. Neurol. 124:368−371)。例えば、NRTN、ARTN、およびPSPNはまた、発生中の腎臓で発現される。GDNFはまた、腎臓形態形成および***形成の調節において神経系の外で重要な役割を有する(Airaksinen, M.S. et al., (2002), Nature Reviews 3:383−392)。
GDNFファミリーの各メンバーは、形質膜と動的に会合したグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカータンパク質受容体に優先的に結合する(すなわち、そのリガンドである)。上記GDNFファミリー受容体αファミリーは、4つの異なる受容体:GFRアルファ1(GFRα1、GDNFR−α);GFRアルファ2(GFRα2/TrnR2/GDNFR−β/NTNR−α/RETL2);GFRアルファ3(GFRα3);およびGFRアルファ4(GFRα4)から構成される。GDNFは、GFRα1に優先的に結合し、NRTNは、GFRα2に優先的に結合し、ARTNは、GFRα3に優先的に結合し、PSPNは、GFRα4に優先的に結合する(Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383−394)。
GFRα2は、皮質、前脳基底部(basal forebrain)、および嗅球の特定の層では高度に発現され、黒質、小脳、および運動核においては不十分にしか発現されない。GFRα3は、胎仔および成体のマウス神経、交感神経節および感覚神経節、腸、心臓、脳、肺および心臓で発現される。GFRα4は、成体の種々の脳領域において、ならびに精巣および心臓を含むいくつかの末梢組織において低レベルで発現される。上記GDNFファミリーメンバー結合で優先されるのは、GFRα1にはGDNF;GFRα2にはニュールツリン;GFRα3にはアルテミン;およびGFRα4にはパーセフィンであると上記で示されている一方で、リガンド受容体対形成は、厳密ではない(Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383−394)。例えば、GDNFは、GFRα1に結合するより低い効率で、GFRα2およびGFRα3に結合する。
上記GDNFファミリーリガンドは、典型的には、しかし排他的にではなく、それらのシグナルを、リガンド、そのGFRα受容体およびその受容体チロシンキナーゼc−Retから構成される多成分複合体を介して伝達する。Retは、これらリガンドシグナル伝達複合体の共通するエレメントである。Retは、ホスホイノシトール−3キナーゼ(PI3−K)/PDK/AKT(PKB)経路およびRas/Raf/MEK/ERK経路の活性化を介して抗アポトーシスシグナルを強力に活性化する癌原遺伝子である。Retはまた、細胞内カルシウムを上昇させ、従来のおよび新規なプロテインキナーゼC(PKC)ファミリーのメンバーの活性化を促進する、ホスホリパーゼCγ(PLCγ)を活性化し得る。GDNFファミリーリガンド受容体複合体は、Retを介するシグナル伝達に制限されない。GDNF:GFRα1は、RETを欠いている細胞においてNCAMに結合し得、FynおよびFAKを活性化し得る。いくつかの条件下では、GDNF:GFRα複合体は、srcキナーゼを直接活性化する。
本発明のある実施形態では、GFRα3の3つの球状システインリッチドメインのうちのいずれか1つ以上(1つ、2つ、もしくは3つ)、またはそれらの断片は、GFRα3を結合してその機能を阻害するか、またはそのリガンド(例えば、アルテミン)へ結合する能力を阻害する抗体を調製するために使用され得る。ある実施形態では、GFRα3に対して特異的な本発明の抗体は、GFRα3上のリガンド結合ドメインに結合し得、よって、リガンド(アルテミン)−GFRα3複合体の、RETへの結合をブロックし得る。ヒトGFRα3の全長アミノ酸配列は、配列番号375として示される。ヒトGFRα3をコードする核酸は、配列番号374に示される。ドメイン1は、配列番号375の残基44〜124にまたがり;ドメイン2は、配列番号375の残基162〜239にまたがり;ドメイン3は、配列番号375の残基248〜340にまたがる。(配列番号375もしくはGenbank NP_001487.2のいずれかを参照のこと)。
これらドメイン1、2、もしくは3のうちのいずれか、またはそれらに由来する断片は、GFRα3に特異的に結合し、その活性を、もしくはGFRα3と関連した少なくとも1つの機能を阻害する抗体を調製するために使用され得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、GFRα3に特異的に結合し、GFRα3によって媒介されるシグナル伝達を妨げ得る。ある実施形態では、上記GFRα3に特異的に結合する抗体は、GFRα3のそのリガンド(例えば、アルテミン)への結合を妨げ得る(Wang, X. et al. Structure, (2006), 14:1083−1092)。ある実施形態では、上記GFRα3に特異的に結合する抗体は、RET受容体チロシンキナーゼの活性化を妨げ得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、RET受容体チロシンキナーゼの活性化を妨げることなく、GFRα3に特異的に結合し得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、GFRα3に特異的に結合し得、RETを介するかもしくはRET以外のメディエーターを介するシグナル伝達を妨げ得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、腫瘍細胞の成長/増殖を阻害するために使用され得、よって、あるがん/悪性腫瘍、またはそのようながん/悪性腫瘍と関連する疼痛、またはそのようながん/悪性腫瘍の転移と関連する疼痛を処置するために有用であり得る(Tang, J−Z, et al. Mol Cancer Ther (2010), 9(6): 1697−1708; Kang, J. et al. Oncogene, (2009), 28:2034−2045; Ceyhan, G.O. et al. Annals of Surgery, (2006), 244(2):274−281; Banerjee, A., et al. Breast Cancer Res (2011), 13:R112; Pandey, V. et al., Endocrinology, (2010), 151(3):909−920; Kang, J. et al.,
Oncogene, (2010), 29:3228−3240; Li, S. et al. J Biomed Sci (2011), 18:24を参照のこと)。ある特定の実施形態では、GFRα3に特異的に結合する抗体は、前述の領域の断片、または本明細書に記載されている領域のNもしくはC末端のいずれか一方もしくは両方から指定の領域を約10〜約50アミノ酸残基超えて延長するペプチドを使用して調製することができる。ある特定の実施形態では、GFRα3特異的抗体の調製において、前述の領域またはその断片のいかなる組み合わせを使用してもよい。上記のように、長さ、すなわちhGFRα3の3つのドメインを含むアミノ酸残基の数は、抗hGFRα3特異的抗体の調製のために、全長ドメインもしくはその断片のN末端もしくはC末端のいずれか、またはその両方から伸びる約10〜50アミノ酸残基が変動し得る。
Oncogene, (2010), 29:3228−3240; Li, S. et al. J Biomed Sci (2011), 18:24を参照のこと)。ある特定の実施形態では、GFRα3に特異的に結合する抗体は、前述の領域の断片、または本明細書に記載されている領域のNもしくはC末端のいずれか一方もしくは両方から指定の領域を約10〜約50アミノ酸残基超えて延長するペプチドを使用して調製することができる。ある特定の実施形態では、GFRα3特異的抗体の調製において、前述の領域またはその断片のいかなる組み合わせを使用してもよい。上記のように、長さ、すなわちhGFRα3の3つのドメインを含むアミノ酸残基の数は、抗hGFRα3特異的抗体の調製のために、全長ドメインもしくはその断片のN末端もしくはC末端のいずれか、またはその両方から伸びる約10〜50アミノ酸残基が変動し得る。
抗体の抗原結合性断片
他に特に記されていなければ、用語「抗体」は、本明細書において、2本の免疫グロブリン重鎖および2本の免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子(すなわち、「完全抗体分子」)ならびにその抗原結合性断片を包含するものと理解されたい。用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合性断片」その他は、本明細書において、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、いずれかの天然に存在する、酵素により得ることができる、合成のまたは遺伝子改変されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。用語、抗体の「抗原結合部分」または「抗体断片」は、本明細書において、hGFRα3に特異的に結合する能力を保持する抗体の1種または複数の断片を指す。抗体断片は、Fab断片、F(ab’)2断片、Fv断片、dAb断片、CDRを含有する断片または単離されたCDRを含むことができる。抗体の抗原結合性断片は、例えば、完全抗体分子に由来することができ、タンパク質分解による消化、または抗体可変および(任意選択で)定常ドメインをコードするDNAの操作および発現を含む組換え遺伝子操作技法等、いずれかの適した標準技法を使用する。係るDNAは、公知であるおよび/または例えば、商業的供給源、DNAライブラリー(例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む)から容易に入手することができる、あるいは合成することができる。DNAを配列決定し、化学的にまたは分子生物学的技法を使用することにより操作して、例えば、1個または複数の可変および/または定常ドメインを適した構成へと配置する、またはコドンを導入する、システイン残基を作出する、アミノ酸を修飾、付加もしくは欠失させること等ができる。
他に特に記されていなければ、用語「抗体」は、本明細書において、2本の免疫グロブリン重鎖および2本の免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子(すなわち、「完全抗体分子」)ならびにその抗原結合性断片を包含するものと理解されたい。用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合性断片」その他は、本明細書において、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、いずれかの天然に存在する、酵素により得ることができる、合成のまたは遺伝子改変されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。用語、抗体の「抗原結合部分」または「抗体断片」は、本明細書において、hGFRα3に特異的に結合する能力を保持する抗体の1種または複数の断片を指す。抗体断片は、Fab断片、F(ab’)2断片、Fv断片、dAb断片、CDRを含有する断片または単離されたCDRを含むことができる。抗体の抗原結合性断片は、例えば、完全抗体分子に由来することができ、タンパク質分解による消化、または抗体可変および(任意選択で)定常ドメインをコードするDNAの操作および発現を含む組換え遺伝子操作技法等、いずれかの適した標準技法を使用する。係るDNAは、公知であるおよび/または例えば、商業的供給源、DNAライブラリー(例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む)から容易に入手することができる、あるいは合成することができる。DNAを配列決定し、化学的にまたは分子生物学的技法を使用することにより操作して、例えば、1個または複数の可変および/または定常ドメインを適した構成へと配置する、またはコドンを導入する、システイン残基を作出する、アミノ酸を修飾、付加もしくは欠失させること等ができる。
抗原結合性断片の非限定例として、(i)Fab断片;(ii)F(ab’)2断片;(iii)Fd断片;(iv)Fv断片;(v)単鎖Fv(scFv)分子;(vi)dAb断片;および(vii)抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位(例えば、単離された相補性決定領域(CDR))が挙げられる。ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびミニボディ等の他の操作された分子も、本明細書における表現「抗原結合性断片」の内に包含されている。
抗体の抗原結合性断片は、典型的には、少なくとも1個の可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、いかなるサイズまたはアミノ酸組成のものであってもよく、一般に、1個または複数のフレームワーク配列に隣接した、またはこれとインフレームの少なくとも1個のCDRを含むであろう。VLドメインと会合したVHドメインを有する抗原結合性断片において、VHおよびVLドメインは、いずれかの適した配置において互いに対して位置することができる。例えば、可変領域は二量体となり、VH−VH、VH−VLまたはVL−VL二量体を含有することができる。あるいは、抗体の抗原結合性断片は、単量体VHまたはVLドメインを含有することができる。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも1個の定常ドメインに共有結合により連結された少なくとも1個の可変ドメインを含有することができる。本発明の抗体の抗原結合性断片内に見出すことのできる可変および定常ドメインの非限定的な例示的構成として、(i)VH−CH1;(ii)VH−CH2;(iii)VH−CH3;(iv)VH−CH1−CH2;(v)VH−CH1−CH2−CH3;(vi)VH−CH2−CH3;(vii)VH−CL;(viii)VL−CH1;(ix)VL−CH2;(x)VL−CH3;(xi)VL−CH1−CH2;(xii)VL−CH1−CH2−CH3;(xiii)VL−CH2−CH3;および(xiv)VL−CLが挙げられる。上に列挙する例示的構成のいずれかを含む、可変および定常ドメインのいずれかの構成において、可変および定常ドメインは、互いに直接的に連結されていても、完全または部分的ヒンジまたはリンカー領域により連結されていてもよい。ヒンジ領域は、少なくとも2個(例えば、5、10、15、20、40、60個以上)のアミノ酸からなることができ、これにより、単一ポリペプチド分子における隣接する可変および/または定常ドメインの間に可撓性または半可撓性連結がもたらされる。さらに、本発明の抗体の抗原結合性断片は、互いにおよび/または1個または複数の単量体VHまたはVLドメインと非共有結合的に会合した(例えば、ジスルフィド結合(複数可)により)、上に列挙する可変および定常ドメイン構成のうちいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体(または他の多量体)を含むことができる。
完全抗体分子と同様に、抗原結合性断片は、単一特異性または多重特異性(例えば、二重特異性)となり得る。抗体の多重特異的抗原結合性断片は、典型的には、少なくとも2個の異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別々の抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができるであろう。本明細書に開示されている例示的な二重特異性抗体フォーマットを含むいずれかの多重特異的抗体フォーマットは、本技術分野において利用できる慣用的な技法を使用して、本発明の抗体の抗原結合性断片の文脈における使用に適合させることができる。
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は、本技術分野において公知である。本発明の文脈において、いずれかの係る公知の方法を使用して、ヒトGFRα3に特異的に結合するヒト抗体を作製することができる。
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は、本技術分野において公知である。本発明の文脈において、いずれかの係る公知の方法を使用して、ヒトGFRα3に特異的に結合するヒト抗体を作製することができる。
VELOCIMMUNE(商標)技術またはモノクローナル抗体を生成するための他の任意の公知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、GFRα3に対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。後述する実験セクションにおける通り、抗体は、親和性、選択性、エピトープ等を含む望ましい特徴に対して特徴付けされ、選択される。マウス定常領域を所望のヒト定常領域と置き換えて、本発明の完全ヒト型抗体、例えば、野生型または修飾型IgG1またはIgG4を生成する。選択される定常領域は、特定の用途に応じて変動し得るが、高親和性抗原結合および標的特異性特徴は、可変領域に属する。
一般に、本発明の抗体は、非常に高い親和性を保有し、典型的には、固相に固定化されたまたは溶液相における抗原への結合により測定された場合の、約10−13から約10−8Mまで、または約10−12から約10−9MまでのKDを保有する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域と置き換えて、本発明の完全ヒト型抗体を生成する。選択される定常領域は、特定の用途に応じて変動し得るが、高親和性抗原結合および標的特異性特徴は、可変領域に属する。
生物学的同等物 本発明の抗GFRα3抗体および抗体断片は、記載されている抗体のアミノ酸配列から変動するがGFRα3に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。係るバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較してアミノ酸の1個または複数の付加、欠失または置換を含むが、記載されている抗体の生物学的活性と基本的に同等な生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗GFRα3抗体コードDNA配列は、開示されている配列と比較してヌクレオチドの1個または複数の付加、欠失または置換を含むが、本発明の抗GFRα3抗体または抗GFRα3抗体断片と基本的に生物学的に同等である抗GFRα3抗体または抗GFRα3抗体断片をコードする配列を包含する。
2種の抗原結合タンパク質または抗体が、例えば、同じモル濃度の用量にて類似の実験条件下、単回用量または複数回用量のいずれかとして投与された際に、その吸収の速度および程度が有意差を示さない薬学的同等物または薬学的代替物である場合、両者は生物学的に同等であるとみなされる。いくつかの抗体が、その吸収の程度において同等であるが、その吸収速度においては同等ではない場合において、これら抗体は、同等物または薬学的代替物であるとみなされ、そして係る吸収速度における差が意図的であり、標識において反映され、例えば慢性使用における有効な体内薬物濃度の到達に必須ではなく、試験される特定の薬物製品にとって医学的に無意味であるとみなされるため、これらが生物学的に同等であると依然としてみなされ得る。
一実施形態では、2種の抗原結合タンパク質は、その安全性、純度および効力において臨床的に有意義な差がない場合、生物学的に同等である。
一実施形態では、参照産物および生物学的産物の間で切り替えない継続的療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減弱化を含む有害効果のリスクにおいて増大が予想されずに、患者に対して、参照産物および生物学的産物の間でこのような切り替えを1回または複数回行うことができる場合、2種の抗原結合タンパク質は、生物学的に同等である。
一実施形態では、2種の抗原結合タンパク質が両者共に、使用条件(単数または複数)に対し共通の作用機序(単数または複数)によって、係る機序が公知の程度まで作用する場合、2種の抗原結合タンパク質は、生物学的に同等である。
生物学的同等性は、in vivoおよび/またはin vitro方法によって示すことができる。生物学的同等性の測定は、例えば、(a)時間の関数として血液、血漿、血清または他の生体液における抗体またはその代謝物の濃度を測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるin vivo検査;(b)ヒトin vivoバイオアベイラビリティデータと相関され、これを合理的に予測するin vitro検査;(c)時間の関数として抗体(またはその標的)の適切な急性薬理学的効果を測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるin vivo検査;および(d)抗体の安全性、有効性またはバイオアベイラビリティまたは生物学的同等性を確立する十分に制御された臨床治験における検査を含む。
本発明の抗GFRα3抗体の生物学的に同等なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うことによりまたは生物学的活性に必要とされない末端もしくは内部残基もしくは配列を欠失させることにより、構築することができる。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基を欠失または他のアミノ酸と置き換えて、復元における不要なまたは不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することができる。他の文脈において、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特徴を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異を含む抗GFRα3抗体バリアントを含むことができる。
Fcバリアントを含む抗GFRα3抗体
本発明のある実施形態によれば、抗GFRα3抗体が提供され、上記抗GFRα3抗体は、1以上の変異(これは、(例えば、中性pHと比較した場合、酸性pHで)FcRn受容体への抗体結合を増強するかもしくは減少させる)を含むFcドメインを含む。例えば、本発明は、上記FcドメインのCH2領域もしくはCH3領域に変異を含む抗GFRα3抗体を包含し、ここで上記変異は、酸性環境において(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲であるエンドソームにおいて)FcRnに対するFcドメインの親和性を増大させる。このような変異は、動物に投与される場合に、上記抗体の血清半減期の増大を生じ得る。このようなFc改変の非限定的例としては、以下が挙げられる:例えば、250位での改変(例えば、EもしくはQ);250位および428位での改変(例えば、LもしくはF);252位での改変(例えば、L/Y/F/WもしくはT)、254位での改変(例えば、SもしくはT)、および256位での改変(例えば、S/R/Q/E/DもしくはT);または428位および/もしくは433位での改変(例えば、H/L/R/S/P/QもしくはK)ならびに/または434位での改変(例えば、H/FもしくはY);あるいは250位および/もしくは428位での改変;あるいは307位もしくは308位での改変(例えば、308F、V308F)、ならびに434位での改変。一実施形態では、上記改変は、428Lの改変(例えば、M428L)および434Sの改変(例えば、N434S);428L、259Iの改変(例えば、V259I)、および308Fの改変(例えば、V308F);433Kの改変(例えば、H433K)および434の改変(例えば、434Y);252、254、および256の改変(例えば、252Y、254T、および256E);250Qおよび428Lの改変(例えば、T250QおよびM428L);ならびに307および/もしくは308の改変(例えば、308Fもしくは308P)を含む。
本発明のある実施形態によれば、抗GFRα3抗体が提供され、上記抗GFRα3抗体は、1以上の変異(これは、(例えば、中性pHと比較した場合、酸性pHで)FcRn受容体への抗体結合を増強するかもしくは減少させる)を含むFcドメインを含む。例えば、本発明は、上記FcドメインのCH2領域もしくはCH3領域に変異を含む抗GFRα3抗体を包含し、ここで上記変異は、酸性環境において(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲であるエンドソームにおいて)FcRnに対するFcドメインの親和性を増大させる。このような変異は、動物に投与される場合に、上記抗体の血清半減期の増大を生じ得る。このようなFc改変の非限定的例としては、以下が挙げられる:例えば、250位での改変(例えば、EもしくはQ);250位および428位での改変(例えば、LもしくはF);252位での改変(例えば、L/Y/F/WもしくはT)、254位での改変(例えば、SもしくはT)、および256位での改変(例えば、S/R/Q/E/DもしくはT);または428位および/もしくは433位での改変(例えば、H/L/R/S/P/QもしくはK)ならびに/または434位での改変(例えば、H/FもしくはY);あるいは250位および/もしくは428位での改変;あるいは307位もしくは308位での改変(例えば、308F、V308F)、ならびに434位での改変。一実施形態では、上記改変は、428Lの改変(例えば、M428L)および434Sの改変(例えば、N434S);428L、259Iの改変(例えば、V259I)、および308Fの改変(例えば、V308F);433Kの改変(例えば、H433K)および434の改変(例えば、434Y);252、254、および256の改変(例えば、252Y、254T、および256E);250Qおよび428Lの改変(例えば、T250QおよびM428L);ならびに307および/もしくは308の改変(例えば、308Fもしくは308P)を含む。
例えば、本発明は、250Qおよび248L(例えば、T250QおよびM248L);252Y、254Tおよび256E(例えば、M252Y、S254TおよびT256E);428Lおよび434S(例えば、M428LおよびN434S);ならびに433Kおよび434F(例えば、H433KおよびN434F)からなる群より選択される変異の1以上の対もしくは群を含むFcドメインを含む抗GFRα3抗体を包含する。前述のFcドメイン変異の全てのあり得る組み合わせ、ならびに本明細書で開示される抗体可変ドメイン内の他の変異は、本発明の範囲内であると企図される。
抗体の生物学的特徴
一般に、本発明の抗体は、GFRα3の3つの球状システインリッチドメイン(1、2または3)のいずれか1つまたは複数への結合により機能することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、hGFRα3のシステインリッチドメインのうちの少なくとも1つに位置するエピトープに結合することができる。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号375の残基約44〜残基約124の範囲のGFRα3のドメイン1のアミノ酸残基に結合することができる。ある実施形態では、本発明の抗体は、配列番号375の残基約162〜残基約239の範囲のGFRα3のドメイン2のアミノ酸残基に結合することができる。ある実施形態では、本発明の抗体は、配列番号375の残基約248〜残基約340の範囲のGFRα3のドメイン3のアミノ酸残基に結合することができる。ある実施形態では、本発明の抗体は、リガンド結合ドメインとして作用するドメインのうちのいずれか1つの中のある領域に結合し、従って、上記リガンド(例えば、アルテミン)のその部位への結合を妨げることによって、GFRα3活性をブロックもしくは阻害することによって機能し得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、GFRα3のドメインのうちの1つにあるリガンド結合部位に結合し得、RETへのアルテミン−GFRα3複合体のその後の結合を妨げ得る。一実施形態では、本発明の抗体は、リガンドとGFRα3との間の特異性において役割を決定し得るかもしくは果たし得るアルテミン−GFRα3複合体の中のエピトープのうちのいずれか1つ以上(例えば、配列番号375の残基167〜184の範囲に及ぶ領域にある)に結合し得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、アルテミンとGFRα3との間の特異性を担うドメイン2の残基のうちの1つ以上(例えば、配列番号375の167位(met)、176位(asp)および/もしくは184位(glu)のアミノ酸残基)に結合し得、そのような結合において、その受容体へのリガンド結合を妨げ得、その後、RET受容体チロシンキナーゼを介するかまたはRET以外のシグナル伝達メディエーターもしくはモジュレーターを介するシグナル伝達を妨げ得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、GFRα3の膜結合形態に、もしくはGFRα3の可溶性形態に結合し得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、GFRα3を結合し得るが、GFRα1とも、GFRα2とも、GFRα4とも交差反応しない。ある実施形態では、本発明の抗体は、二重特異性抗体であり得る。本発明の二重特異性抗体は、1つのドメインの1つのシステインリッチ領域中の1つのエピトープに結合し得、hGFRα3の第2のドメインの1つのシステインリッチ領域にも結合し得る。ある実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、同じドメイン内の2つの異なる領域に結合し得る。ある実施形態では、本発明の二重特異性抗体の一方のアームが、hGFRα3の1つのドメインの1つのシステインリッチ領域に結合し得、そして他方のアームが、RETに、もしくはRET以外のモジュレーターに結合し得る。ある実施形態では、上記二重特異性抗体は、GFRα3の中の1つのドメインおよびGFRα1もしくはGFRα2の中の1つのドメインを結合し得る。
一般に、本発明の抗体は、GFRα3の3つの球状システインリッチドメイン(1、2または3)のいずれか1つまたは複数への結合により機能することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、hGFRα3のシステインリッチドメインのうちの少なくとも1つに位置するエピトープに結合することができる。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号375の残基約44〜残基約124の範囲のGFRα3のドメイン1のアミノ酸残基に結合することができる。ある実施形態では、本発明の抗体は、配列番号375の残基約162〜残基約239の範囲のGFRα3のドメイン2のアミノ酸残基に結合することができる。ある実施形態では、本発明の抗体は、配列番号375の残基約248〜残基約340の範囲のGFRα3のドメイン3のアミノ酸残基に結合することができる。ある実施形態では、本発明の抗体は、リガンド結合ドメインとして作用するドメインのうちのいずれか1つの中のある領域に結合し、従って、上記リガンド(例えば、アルテミン)のその部位への結合を妨げることによって、GFRα3活性をブロックもしくは阻害することによって機能し得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、GFRα3のドメインのうちの1つにあるリガンド結合部位に結合し得、RETへのアルテミン−GFRα3複合体のその後の結合を妨げ得る。一実施形態では、本発明の抗体は、リガンドとGFRα3との間の特異性において役割を決定し得るかもしくは果たし得るアルテミン−GFRα3複合体の中のエピトープのうちのいずれか1つ以上(例えば、配列番号375の残基167〜184の範囲に及ぶ領域にある)に結合し得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、アルテミンとGFRα3との間の特異性を担うドメイン2の残基のうちの1つ以上(例えば、配列番号375の167位(met)、176位(asp)および/もしくは184位(glu)のアミノ酸残基)に結合し得、そのような結合において、その受容体へのリガンド結合を妨げ得、その後、RET受容体チロシンキナーゼを介するかまたはRET以外のシグナル伝達メディエーターもしくはモジュレーターを介するシグナル伝達を妨げ得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、GFRα3の膜結合形態に、もしくはGFRα3の可溶性形態に結合し得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、GFRα3を結合し得るが、GFRα1とも、GFRα2とも、GFRα4とも交差反応しない。ある実施形態では、本発明の抗体は、二重特異性抗体であり得る。本発明の二重特異性抗体は、1つのドメインの1つのシステインリッチ領域中の1つのエピトープに結合し得、hGFRα3の第2のドメインの1つのシステインリッチ領域にも結合し得る。ある実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、同じドメイン内の2つの異なる領域に結合し得る。ある実施形態では、本発明の二重特異性抗体の一方のアームが、hGFRα3の1つのドメインの1つのシステインリッチ領域に結合し得、そして他方のアームが、RETに、もしくはRET以外のモジュレーターに結合し得る。ある実施形態では、上記二重特異性抗体は、GFRα3の中の1つのドメインおよびGFRα1もしくはGFRα2の中の1つのドメインを結合し得る。
より具体的には、本発明の抗GFRα3抗体は、以下の特徴のうちの1つ以上を示し得る:
(i)表面プラズモン共鳴によって測定される場合に、約10−8M〜約10−13Mの範囲に及ぶKDを示す;
(ii)約40pM〜約15nMの範囲に及ぶIC50値で、GFRα3のそのリガンドであるアルテミンへの結合のうちの約50〜100%をブロックする能力を示す;
(iii)アルテミンとRETとの混合物で被覆した固体支持体へのGFRα3の結合のうちの約20%〜約100%をブロックする能力を示す;
(iv)約200pM〜約50nMの範囲に及ぶIC50で、RETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する;
(v)骨のがん疼痛のin vivoモデルにおいて1以上の侵害受容応答を阻害もしくは低減する;
(vi)アルテミン感作熱痛覚過敏をin vivoで阻害もしくは低減する;
(vii)変形性関節症のin vivoモデルでアロディニアを阻害もしくは低減する;
(viii)RETの他のGFR共受容体と交差反応しない;
(ix)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)を含む;あるいは
(x)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含む。
(i)表面プラズモン共鳴によって測定される場合に、約10−8M〜約10−13Mの範囲に及ぶKDを示す;
(ii)約40pM〜約15nMの範囲に及ぶIC50値で、GFRα3のそのリガンドであるアルテミンへの結合のうちの約50〜100%をブロックする能力を示す;
(iii)アルテミンとRETとの混合物で被覆した固体支持体へのGFRα3の結合のうちの約20%〜約100%をブロックする能力を示す;
(iv)約200pM〜約50nMの範囲に及ぶIC50で、RETのアルテミン依存性活性化をブロックもしくは阻害する;
(v)骨のがん疼痛のin vivoモデルにおいて1以上の侵害受容応答を阻害もしくは低減する;
(vi)アルテミン感作熱痛覚過敏をin vivoで阻害もしくは低減する;
(vii)変形性関節症のin vivoモデルでアロディニアを阻害もしくは低減する;
(viii)RETの他のGFR共受容体と交差反応しない;
(ix)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)を含む;あるいは
(x)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含む。
本発明のある抗GFRα3抗体は、in vitroアッセイにおいてGFRα3活性を阻害もしくは弱め得る。本発明の抗体がGFRα3に結合し、単独のもしくはRETの存在下のそのリガンドであるアルテミンへの結合を阻害する能力は、当業者に公知の任意の標準的な方法(結合アッセイ、またはGFRα3のその受容体であるアルテミンへの結合を阻害することによって、RETの活性化を抗体がブロックするか否かを決定するためのアッセイ(例えば、本明細書で記載されるもの)を含む)を使用して測定され得る。GFRα3活性を測定するための非限定的な例示的in vitroアッセイは、下記の実施例4および5で例証される。
本発明は、GFRα3(配列番号375に示されるとおり)のシステインリッチ球状ドメイン、もしくは1つ以上のその断片に結合する抗GFRα3抗体およびその抗原結合性断片を含む。GFRα3に特異的な抗体は、追加的な標識または部分を含有していなくてもよく、あるいはN末端またはC末端標識または部分を含有していてもよい。一実施形態では、標識または部分は、ビオチンである。結合アッセイにおいて、標識(あるとすれば)の位置は、ペプチドが結合している表面に対するペプチドの配向性を決定することができる。例えば、表面が、アビジンでコーティングされている場合、N末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのC末端部分が表面に対し遠位となるように配向されるであろう。
一実施形態では、本発明は、hGFRα3を特異的に結合しかつhGFRα3活性を中和する、完全ヒト型モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を提供し、ここで上記抗体もしくはその断片は、以下の特徴のうちの1つ以上を示す:(i)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381および397からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCVRを含む;(ii)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389および405からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCVRを含む;(iii)表1に示される重鎖もしくは軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3の配列のうちのいずれか1つ以上およびこれらの組み合わせを含む;(iv)他のGFRα受容体(GFRα1、GFRα2およびGFRα4を含む)に結合することなく、および/または上記他のGFRα受容体をブロックすることなく、GFRα3への結合に、および/またはその活性をブロックするのに特異的である;(v)GFRα3のシステインリッチ球状ドメインのうちのいずれか1つ以上に対する結合特異性を示す;(vi)RET受容体チロシンキナーゼの活性化およびそれを介したシグナル伝達をブロックする;(vii)アルテミン感作熱痛覚過敏をin vivoで阻害もしくは低減する;(viii)変形性関節症のin vivoモデルにおけるアロディニアを阻害もしくは低減する;または骨のがん疼痛のin vivoモデルにおいて1以上の侵害受容応答を阻害もしくは低減する。
エピトープマッピングおよび関連技術
当業者に公知の様々な技法を使用して、抗体が、ポリペプチドまたはタンパク質内の「1個または複数のアミノ酸と相互作用」するか否か決定することができる。例示的な技法として、例えば、Antibodies、Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harb.、NY)に記載されているアッセイ等、慣用的なクロスブロッキングアッセイが挙げられ、この技術が実施され得る。他の方法として、アラニン走査変異解析、ペプチドブロット解析(Reineke(2004年)Methods Mol Biol 248巻:443〜63頁)、ペプチド切断解析結晶学試験およびNMR解析が挙げられる。加えて、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出および化学修飾等の方法を用いることができる(Tomer(2000年)Protein Science 9巻:487〜496頁)。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することのできる別の方法は、質量分析により検出される水素/重水素交換である。一般用語において、水素/重水素交換方法は、目的のタンパク質を重水素標識するステップと、続いて抗体を重水素標識タンパク質に結合させるステップを含む。次に、タンパク質/抗体複合体を水に移すと、抗体複合体によって保護されるアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質/抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持することができ、したがって、界面に含まれていないアミノ酸と比較して相対的により高い質量を示す。抗体の解離後に、標的タンパク質を、プロテアーゼ切断および質量分析による解析に付し、これにより、抗体が相互作用する特異的なアミノ酸に相当する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ehring(1999年)Analytical Biochemistry 267巻(2号):252〜259頁;EngenおよびSmith(2001年)Anal. Chem.73巻:256A〜265A頁を参照されたい。
当業者に公知の様々な技法を使用して、抗体が、ポリペプチドまたはタンパク質内の「1個または複数のアミノ酸と相互作用」するか否か決定することができる。例示的な技法として、例えば、Antibodies、Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harb.、NY)に記載されているアッセイ等、慣用的なクロスブロッキングアッセイが挙げられ、この技術が実施され得る。他の方法として、アラニン走査変異解析、ペプチドブロット解析(Reineke(2004年)Methods Mol Biol 248巻:443〜63頁)、ペプチド切断解析結晶学試験およびNMR解析が挙げられる。加えて、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出および化学修飾等の方法を用いることができる(Tomer(2000年)Protein Science 9巻:487〜496頁)。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することのできる別の方法は、質量分析により検出される水素/重水素交換である。一般用語において、水素/重水素交換方法は、目的のタンパク質を重水素標識するステップと、続いて抗体を重水素標識タンパク質に結合させるステップを含む。次に、タンパク質/抗体複合体を水に移すと、抗体複合体によって保護されるアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質/抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持することができ、したがって、界面に含まれていないアミノ酸と比較して相対的により高い質量を示す。抗体の解離後に、標的タンパク質を、プロテアーゼ切断および質量分析による解析に付し、これにより、抗体が相互作用する特異的なアミノ酸に相当する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ehring(1999年)Analytical Biochemistry 267巻(2号):252〜259頁;EngenおよびSmith(2001年)Anal. Chem.73巻:256A〜265A頁を参照されたい。
用語「エピトープ」とは、B細胞および/もしくはT細胞が応答する抗原上の部位をいう。B細胞エピトープは、連続アミノ酸もしくはタンパク質の三次元折りたたみによって並ぶ非連続アミノ酸のいずれからも形成され得る。近接アミノ酸から形成されるエピトープは典型的には、変性溶媒への曝露において保持されるが、一方、三次フォールディングによって形成されるエピトープは典型的には、変性溶媒による処理において失われる。エピトープは典型的には、独特の空間的コンフォメーションにおいて少なくとも3、より一般的には、少なくとも5または8〜10アミノ酸を含む。
抗原構造に基づく抗体プロファイリング(Antigen Structure−based Antibody Profiling)(ASAP)としても公知の修飾支援プロファイリング(Modification−Assisted Profiling)(MAP)は、化学的にまたは酵素により修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に対する多数のモノクローナル抗体(mAb)をカテゴリー化する方法である(例えば、US2004/0101920を参照されたい)。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープとは明瞭に異なる、あるいはこれと部分的に重複する独特のエピトープを反映することができる。この技術は、特徴付けが遺伝的に別個の抗体に集中され得るような、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にする。ハイブリドーマスクリーニングに適用される場合、MAPは、所望の特徴を有するmAbを産生する希少なハイブリドーマクローンの同定を容易にすることができる。MAPを使用して、本発明の抗体を異なるエピトープに結合する抗体の群へと選別することができる。
特定の実施形態では、上記抗GFRα3抗体もしくは抗体の抗原結合性断片は、GFRα3システインリッチドメイン1、2、もしくは3のうちの少なくとも1つ内のエピトープもしくはその断片を結合し、ここでドメイン1は、配列番号375の残基番号約44〜残基番号約124の範囲に及び;ドメイン2は、配列番号375の残基番号約162〜残基番号約239の範囲に及び;ドメイン3は、配列番号375の残基番号約248〜残基番号約340の範囲に及ぶ。
ある実施形態では、上記抗GFRα3抗体もしくは抗体の抗原結合性断片は、ヒトGFRα3のドメイン1内のエピトープもしくはその断片を結合する。
特定の実施形態では、上記抗GFRα3抗体もしくは抗体の抗原結合性断片は、ヒトGFRα3のドメイン2内のエピトープもしくはその断片を結合する。
特定の実施形態では、上記抗GFRα3抗体もしくは抗体の抗原結合性断片は、ヒトGFRα3のドメイン3内のエピトープもしくはその断片を結合する。
特定の実施形態では、上記抗体もしくは抗体断片は、ドメイン1、2、もしくは3内の、および/または2つの異なるドメイン内のGFRα3の挙げられたエピトープのうちの1つより多くを含むエピトープ(例えば、上記ドメイン1およびドメイン2内の、または上記ドメイン2およびドメイン3内の、または上記ドメイン1およびドメイン3内の、エピトープ)を結合する。
特定の実施形態では、上記抗体は、GFRα3の1つのドメイン内の1つのエピトープおよびGFRα3の異なるドメイン内の別のエピトープを結合する、二重特異性抗体である。一実施形態では、上記抗体は、GFRα3のドメイン1における1つのエピトープおよびGFRα3のドメイン2における別のエピトープを結合する、二重特異性抗体である。一実施形態では、上記抗体は、GFRα3のドメイン1における1つのエピトープおよびGFRα3のドメイン3内の別のエピトープを結合する、二重特異性抗体である。一実施形態では、上記抗体は、GFRα3のドメイン2における1つのエピトープおよびGFRα3のドメイン3内の別のエピトープを結合する、二重特異性抗体である。
本発明はまた、本明細書に記載されている特異的な例示的抗体(例えば、H4H2207N、H4H2212N、H4H2236N3、H4H2243N2、H4H2210N、H4H2234N、H4H2291S、H4H2292S、H4H2293P、H4H2294S、H4H2295S、H4H2296S、H4H2341S、H4H2342P、H4H2344S、H4H2345S、H4H2346S、H4H2350P、H4H2352S、H4H2354S、H4H2355S、H4H2357S、H4H2364S、H1M2243NおよびH1M2236N)のいずれかと同じエピトープに結合する抗GFRα3抗体を包含する。同様に、本発明はまた、GFRα3またはGFRα3断片との結合に関して、本明細書に記載されている特異的な例示的抗体のいずれかと競合する抗GFRα3抗体を包含する。
本技術分野において公知の慣用的な方法を使用することにより、抗体が、参照抗GFRα3抗体と同じエピトープに結合するか、またはこれと結合に関して競合するか否か容易に決定することができる。例えば、被験抗体が、本発明の参照抗GFRα3抗体と同じエピトープに結合するか否か決定するため、飽和条件下で参照抗体をGFRα3タンパク質またはペプチドに結合させる。次に、このGFRα3分子に結合する被験抗体の能力を評価する。被験抗体が、参照抗GFRα3抗体との飽和結合後のGFRα3に結合することができる場合、被験抗体が、参照抗GFRα3抗体とは異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。他方では、被験抗体が、参照抗GFRα3抗体との飽和結合後のGFRα3分子に結合することができない場合、被験抗体は、本発明の参照抗GFRα3抗体によって結合されているエピトープと同じエピトープに結合することができる。
抗体が、結合に関して参照抗GFRα3抗体と競合するか否か決定するため、2種の配向性において上に記載されている結合手法を行う。第1の配向性において、参照抗体を飽和条件下でGFRα3分子に結合させ、続いて、GFRα3分子への被験抗体の結合を評価する。第2の配向性において、被験抗体を飽和条件下でGFRα3分子に結合させ、続いてGFRα3分子への参照抗体の結合を評価する。両方の配向性において、第1の(飽和)抗体のみが、GFRα3分子に結合することができる場合、被験抗体および参照抗体が、GFRα3への結合に関して競合すると結論づけられる。当業者に認められる通り、結合に関して参照抗体と競合する抗体は、参照抗体と同一エピトープに必ずしも結合しないが、重複または隣接するエピトープに結合することにより参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
2種の抗体は、それぞれが抗原への他方の結合を競合的に阻害(遮断)する場合、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、1、5、10、20または100倍過剰な一方の抗体は、競合的結合アッセイにおいて測定して、他方の結合を少なくとも50%だが、好ましくは75%、90%またはさらには99%阻害する(例えば、Junghansら、Cancer Res.1990年50巻:1495〜1502頁を参照)。あるいは、一方の抗体の結合を低下または排除する抗原における基本的にあらゆるアミノ酸変異が、他方の結合を低下または排除する場合、2種の抗体は、同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低下または排除するいくつかのアミノ酸変異が、他方の結合を低下または排除する場合、2種の抗体は、重複するエピトープを有する。
続いて、追加の慣用的な実験法(例えば、ペプチド変異および結合解析)を実行して、観察された被験抗体の結合の欠如が、実際に、参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるか、あるいは立体的遮断(または別の現象)が、観察される結合の欠如の原因であるかを確認することができる。このような選別の実験は、ELISA、RIA、表面プラズモン共鳴法、フローサイトメトリーまたは本技術分野において利用できる他のいずれかの定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを使用して行うことができる。
種選択性および種交差反応性
本発明の特定の実施形態によれば、上記抗GFRα3抗体は、ヒトGFRα3に結合するが、他の種に由来するGFRα3には結合しない。あるいは、本発明の抗GFRα3抗体は、特定の実施形態では、ヒトGFRα3の結合し、1以上の非ヒト種に由来するGFRα3に結合する。例えば、本発明の抗GFRα3抗体は、ヒトGFRα3に結合し得、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルもしくはチンパンジーのGFRα3のうちの1つ以上に結合してもよいし、結合しなくてもよい。
本発明の特定の実施形態によれば、上記抗GFRα3抗体は、ヒトGFRα3に結合するが、他の種に由来するGFRα3には結合しない。あるいは、本発明の抗GFRα3抗体は、特定の実施形態では、ヒトGFRα3の結合し、1以上の非ヒト種に由来するGFRα3に結合する。例えば、本発明の抗GFRα3抗体は、ヒトGFRα3に結合し得、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルもしくはチンパンジーのGFRα3のうちの1つ以上に結合してもよいし、結合しなくてもよい。
イムノコンジュゲート(immunoconjugate)
本発明は、疼痛もしくは炎症を低下させることのできる薬剤、または化学療法薬もしくは放射性同位元素等の治療部分にコンジュゲートされたヒト抗GFRα3モノクローナル抗体(「イムノコンジュゲート」)を包含する。抗GFRα3抗体にコンジュゲートすることのできる治療部分の種類は、処置しようとする状態および達成されるべき所望の治療効果を考慮するであろう。例えば、急性もしくは慢性の疼痛を処置するために、NSAID、オピオイド、もしくはCox−2インヒビターのような薬剤、または局所麻酔剤、または第2のGFRα3インヒビターは、上記GFRα3抗体にコンジュゲートされ得る。あるいは、所望の治療効果が、疼痛のある状態と関連する炎症を処置することである場合、抗炎症剤を上記抗GFRα3抗体(例えば、セレコキシブが挙げられるが、これらに限定されない)またはサイトカインアンタゴニスト(例えば、IL−1もしくはIL−6インヒビター)にコンジュゲートすることは有利であり得る。処置される予定の状態ががん状態である場合、化学療法薬、もしくは放射性同位体を上記GFRα3抗体にコンジュゲートすることは、有益であり得る。イムノコンジュゲートの形成に適した薬剤の例は、本技術分野において公知であり、例えば、WO05/103081を参照されたい。
本発明は、疼痛もしくは炎症を低下させることのできる薬剤、または化学療法薬もしくは放射性同位元素等の治療部分にコンジュゲートされたヒト抗GFRα3モノクローナル抗体(「イムノコンジュゲート」)を包含する。抗GFRα3抗体にコンジュゲートすることのできる治療部分の種類は、処置しようとする状態および達成されるべき所望の治療効果を考慮するであろう。例えば、急性もしくは慢性の疼痛を処置するために、NSAID、オピオイド、もしくはCox−2インヒビターのような薬剤、または局所麻酔剤、または第2のGFRα3インヒビターは、上記GFRα3抗体にコンジュゲートされ得る。あるいは、所望の治療効果が、疼痛のある状態と関連する炎症を処置することである場合、抗炎症剤を上記抗GFRα3抗体(例えば、セレコキシブが挙げられるが、これらに限定されない)またはサイトカインアンタゴニスト(例えば、IL−1もしくはIL−6インヒビター)にコンジュゲートすることは有利であり得る。処置される予定の状態ががん状態である場合、化学療法薬、もしくは放射性同位体を上記GFRα3抗体にコンジュゲートすることは、有益であり得る。イムノコンジュゲートの形成に適した薬剤の例は、本技術分野において公知であり、例えば、WO05/103081を参照されたい。
多重特異的抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多特異性となり得る。多重特異的抗体は、1種の標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的となり得る、あるいは2種以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Tuttら、1991年、J. Immunol.147巻:60〜69頁;Kuferら、2004年、Trends Biotechnol.22巻:238〜244頁を参照されたい。本発明の抗GFRα3抗体は、別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結するまたはこれと同時発現させることができる。例えば、抗体またはその断片は、別の抗体または抗体断片等、1種または複数の他の分子実体へと機能的に連結して(例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合的会合または他の方法により)、第2の結合特異性を有する二重特異性または多特異性抗体を産生することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの一方の腕が、ヒトGFRα3またはその断片に特異的であり、免疫グロブリンの他方の腕が、第2の治療標的に特異的である、あるいは治療部分にコンジュゲートされている、二重特異性抗体を含む。本発明のある実施形態では、免疫グロブリンの一方のアームは、hGFRα3の1つのドメイン上のエピトープもしくはその断片に対して特異的であり、免疫グロブリンの他方のアームは、hGFRα3の第2のドメイン上のエピトープに特異的である。ある実施形態では、免疫グロブリンの一方のアームは、hGFRα3の1つのドメイン上の1つのエピトープに特異的であり、他方のアームは、hGFRα3の同じドメイン上の第2のエピトープに特異的である。
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多特異性となり得る。多重特異的抗体は、1種の標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的となり得る、あるいは2種以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Tuttら、1991年、J. Immunol.147巻:60〜69頁;Kuferら、2004年、Trends Biotechnol.22巻:238〜244頁を参照されたい。本発明の抗GFRα3抗体は、別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結するまたはこれと同時発現させることができる。例えば、抗体またはその断片は、別の抗体または抗体断片等、1種または複数の他の分子実体へと機能的に連結して(例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合的会合または他の方法により)、第2の結合特異性を有する二重特異性または多特異性抗体を産生することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの一方の腕が、ヒトGFRα3またはその断片に特異的であり、免疫グロブリンの他方の腕が、第2の治療標的に特異的である、あるいは治療部分にコンジュゲートされている、二重特異性抗体を含む。本発明のある実施形態では、免疫グロブリンの一方のアームは、hGFRα3の1つのドメイン上のエピトープもしくはその断片に対して特異的であり、免疫グロブリンの他方のアームは、hGFRα3の第2のドメイン上のエピトープに特異的である。ある実施形態では、免疫グロブリンの一方のアームは、hGFRα3の1つのドメイン上の1つのエピトープに特異的であり、他方のアームは、hGFRα3の同じドメイン上の第2のエピトープに特異的である。
本発明の文脈において使用することのできる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第1の免疫グロブリン(Ig)CH3ドメインおよび第2のIg CH3ドメインの使用であって、第1および第2のIg CH3ドメインが、互いに少なくとも1個のアミノ酸が異なり、少なくとも1個のアミノ酸の差異が、アミノ酸の差異を欠く二重特異性抗体と比較してプロテインAへの二重特異性抗体の結合を低下させる使用を含む。一実施形態では、第1のIg CH3ドメインは、プロテインAに結合し、第2のIg CH3ドメインは、H95R修飾(IMGTエクソンナンバリングによる;EUナンバリングによるH435R)等、プロテインA結合を低下または消失させる変異を含有する。第2のCH3は、Y96F修飾(IMGTによる;EUによるY436F)をさらに含むことができる。第2のCH3内に見出すことのできるさらなる修飾は、IgG1抗体の場合、D16E、L18M、N44S、K52N、V57MおよびV82I(IMGTによる;EUによるD356E、L358M、N384S、K392N、V397MおよびV422I);IgG2抗体の場合、N44S、K52NおよびV82I(IMGT;EUによるN384S、K392NおよびV422I);ならびにIgG4抗体の場合、Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79QおよびV82I(IMGTによる;EUによるQ355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419QおよびV422I)を含む。上に記載されている二重特異性抗体フォーマットにおけるバリエーションは、本発明の範囲内であるとみなされる。
治療的投与および製剤
本発明は、本発明の抗GFRα3抗体またはその抗原結合性断片を含む治療組成物を提供する。本発明に従った治療組成物の投与は、製剤に取り込まれて伝達、送達、寛容性その他の向上をもたらす、適した担体、賦形剤および他の薬剤と共になされる投与であろう。多数の適切な製剤は、あらゆる薬剤師に公知の処方集に見出すことができる:Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton, PA。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質(カチオン性またはアニオン性)含有小胞(LIPOFECTIN(商標)等)、DNAコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス(様々な分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲルならびにカーボワックスを含有する半固体混合物を含む。Powellら、「Compendium of excipients for parenteral formulations」PDA(1998年)J Pharm Sci Technol 52巻:238〜311頁も参照されたい。
本発明は、本発明の抗GFRα3抗体またはその抗原結合性断片を含む治療組成物を提供する。本発明に従った治療組成物の投与は、製剤に取り込まれて伝達、送達、寛容性その他の向上をもたらす、適した担体、賦形剤および他の薬剤と共になされる投与であろう。多数の適切な製剤は、あらゆる薬剤師に公知の処方集に見出すことができる:Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton, PA。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質(カチオン性またはアニオン性)含有小胞(LIPOFECTIN(商標)等)、DNAコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス(様々な分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲルならびにカーボワックスを含有する半固体混合物を含む。Powellら、「Compendium of excipients for parenteral formulations」PDA(1998年)J Pharm Sci Technol 52巻:238〜311頁も参照されたい。
抗体の用量は、投与しようとする被験体の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路その他に応じて変動し得る。本発明の抗体が、成体患者において急性または慢性の疼痛、炎症性疼痛、神経障害性疼痛などをもたらす種々の状態および疾患におけるGFRα3活性に伴う疼痛を処置するために使用される場合、通常、約0.01〜約20mg/kg体重、より好ましくは、約0.02〜約7、約0.03〜約5または約0.05〜約3mg/kg体重の単一用量で、本発明の抗体を静脈内投与することが有利である。状態の重症度に応じて、処置の頻度および持続時間を調整することができる。
様々な送達系が公知であり、本発明の薬学的組成物の投与に使用することができ、例えば、リポソーム中のカプセル化、マイクロパーティクル、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することのできる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが挙げられる(例えば、Wuら、(1987年)J. Biol. Chem.262巻:4429〜4432頁を参照)。導入の方法として、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が挙げられるがこれらに限定されない。組成物は、いずれかの簡便な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層(例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜等)を通した吸収により投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与することができる。投与は、全身性であっても局所性であってもよい。
薬学的組成物は、小胞、特に、リポソームにおいて送達することもできる(例えば、Langer(1990年)Science 249巻:1527〜1533頁を参照)。
ある特定の状況において、薬学的組成物は、放出制御系において送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、放出制御系は、組成物の標的に近接して置くことができ、よって、全身性用量の一部分のみを必要とする。
注射用調製物は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴注入等のための剤形を含むことができる。これらの注射用調製物は、公に知られた方法によって調製することができる。例えば、注射用調製物は、例えば、注射のために従来から使用されてきた無菌水性媒体または油性媒体において、上に記載されている抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化することにより調製することができる。注射用の水性媒体として、例えば、アルコール(例えば、エタノール)、ポリアルコール(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤[例えば、ポリソルベート80、水素化ヒマシ油のHCO−50(ポリオキシエチレン(50mol)付加物)]等、適切な可溶化剤と
組み合わせて使用することのできる、生理食塩水、グルコースを含有する等張性溶液および他の補助的薬剤等が存在する。油性媒体として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等、可溶化剤と組み合わせて使用することができる、ゴマ油、ダイズ油等が用いられている。このように調製された注射液は、好ましくは、適切なアンプル内に充填される。
組み合わせて使用することのできる、生理食塩水、グルコースを含有する等張性溶液および他の補助的薬剤等が存在する。油性媒体として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等、可溶化剤と組み合わせて使用することができる、ゴマ油、ダイズ油等が用いられている。このように調製された注射液は、好ましくは、適切なアンプル内に充填される。
本発明の薬学的組成物は、標準的な針およびシリンジにより皮下にまたは静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン型送達装置(pen delivery device)は、本発明の薬学的組成物の送達において容易に適用される。係るペン型送達装置は、再使用可能または使い捨てとなり得る。再使用可能なペン型送達装置は、一般に、薬学的組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空となったら、空のカートリッジを容易に廃棄し、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。続いて、ペン型送達装置を再使用することができる。使い捨てペン型送達装置において、交換可能なカートリッジは存在しない。寧ろ、使い捨てペン型送達装置は、装置内のリザーバーに保たれた薬学的組成物を予め充填した状態で届けられる。リザーバーから薬学的組成物が空になったら、装置全体が廃棄される。
多数の再使用可能なペン型および自動注入送達装置が、本発明の薬学的組成物の皮下送達において適用される。例として、ほんの数例ではあるが、AUTOPEN(商標)(Owen Mumford、Inc.、英国ウッドストック)、DISETRONIC(商標)ペン(Disetronic Medical Systems、スイス、ブルグドルフ)、HUMALOG MIX 75/25(商標)ペン、HUMALOG(商標)ペン、HUMALIN 70/30(商標)ペン(Eli Lilly and Co.、インディアナ州インディアナポリス)、NOVOPEN(商標)I、IIおよびIII(Novo Nordisk、デンマーク、コペンハーゲン)、NOVOPEN JUNIOR(商標)(Novo Nordisk、デンマーク、コペンハーゲン)、BD(商標)ペン(Becton Dickinson、ニュージャージー州フランクリンレイクス)、OPTIPEN(商標)、OPTIPEN PRO(商標)、OPTIPEN STARLET(商標)およびOPTICLIK(商標)(sanofi−aventis、ドイツ、フランクフルト)が挙げられるがこれらに確かに限定されない。本発明の薬学的組成物の皮下送達において適用される使い捨てペン型送達装置の例として、ほんの数例ではあるが、SOLOSTAR(商標)ペン(sanofi−aventis)、FLEXPEN(商標)(Novo Nordisk)およびKWIKPEN(商標)(Eli Lilly)、SURECLICK(商標)自動注入装置(Amgen、カリフォルニア州サウザンドオークス)、PENLET(商標)(Haselmeier、ドイツ、シュトゥットガルト)、EPIPEN(Dey、L.P.)およびHUMIRA(商標)ペン(Abbott Labs、イリノイ州アボットパーク)が挙げられるがこれらに確かに限定されない。
有利には、上に記載されている経口または非経口的使用のための薬学的組成物は、活性成分の用量を適合させるのに適した単位用量の剤形へと調製される。単位用量の係る剤形として、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、注射(アンプル)、坐剤等が挙げられる。含有されている先述の抗体の量は一般に、単位用量の剤形当たり約5〜約500mgである;特に注射形態において、先述の抗体は、約5〜約100mgで、他の剤形では約10〜約250mgで含有されることが好ましい。
抗体の治療的使用
本発明の抗体は、GFRα3活性と関連する任意の疾患、障害、もしくは状態の処置、防止、および/もしくは改善のために、または上記疾患、障害、もしくは状態と関連する少なくとも1つの症状の改善のために、またはこのような疾患、障害、もしくは状態と関連する疼痛を軽減するために、有用である。本発明の抗GFRα3抗体で処置され得る例示的な状態、疾患、および/もしくは障害、ならびに/またはこのような状態、疾患、もしくは障害と関連した疼痛はとしては、以下が挙げられる:急性、慢性、ニューロパチー、もしくは炎症性の疼痛、関節炎、間質性膀胱炎、膵炎、片頭痛、群発頭痛、三叉神経痛、ヘルペス神経痛、全身性神経痛、癲癇もしくは癲癇状態、筋緊張症、不整脈、運動障害、神経内分泌障害、運動失調症、過敏性腸症候群、炎症性腸症候群、便意切迫感、失禁、直腸過敏症、内臓痛、変形性関節症の疼痛、痛風、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパチー、神経根性疼痛、坐骨神経痛、背部痛、頭頚部痛、突出痛、術後痛、がん疼痛(骨がんもしくは膵臓がんと関連した疼痛を含む)。
本発明の抗体は、GFRα3活性と関連する任意の疾患、障害、もしくは状態の処置、防止、および/もしくは改善のために、または上記疾患、障害、もしくは状態と関連する少なくとも1つの症状の改善のために、またはこのような疾患、障害、もしくは状態と関連する疼痛を軽減するために、有用である。本発明の抗GFRα3抗体で処置され得る例示的な状態、疾患、および/もしくは障害、ならびに/またはこのような状態、疾患、もしくは障害と関連した疼痛はとしては、以下が挙げられる:急性、慢性、ニューロパチー、もしくは炎症性の疼痛、関節炎、間質性膀胱炎、膵炎、片頭痛、群発頭痛、三叉神経痛、ヘルペス神経痛、全身性神経痛、癲癇もしくは癲癇状態、筋緊張症、不整脈、運動障害、神経内分泌障害、運動失調症、過敏性腸症候群、炎症性腸症候群、便意切迫感、失禁、直腸過敏症、内臓痛、変形性関節症の疼痛、痛風、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパチー、神経根性疼痛、坐骨神経痛、背部痛、頭頚部痛、突出痛、術後痛、がん疼痛(骨がんもしくは膵臓がんと関連した疼痛を含む)。
本発明の治療法によって処置可能な他の状態としては、遺伝性肢端紅痛症、鼻炎、前立腺がん、乳がん、骨がん、子宮頸がん、もしくは膀胱障害が挙げられた。本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片はまた、以下の状態を処置するために使用され得る:非悪性の急性、慢性、もしくは骨折の骨の疼痛;関節リウマチ、脊柱管狭窄症;神経障害性腰痛症;筋筋膜性疼痛症候群;線維筋痛症;顎関節疼痛;内臓痛(腹痛、膵臓疼痛が挙げられる);慢性頭痛;緊張型頭痛(群発頭痛を含む);糖尿病性ニューロパチー;HIV関連ニューロパチー;シャルコー・マリー・トゥースニューロパチー;遺伝性感覚性ニューロパチー;末梢神経損傷;神経腫痛;異所性の近位および遠位の分泌;神経根症;化学療法誘発性神経障害性疼痛;放射線療法誘発性神経障害性疼痛;***切除術後疼痛;中枢性疼痛;脊髄損傷疼痛;脳卒中後疼痛;視床痛;複合性局所疼痛症候群(CRPS);幻肢痛;難治性疼痛;筋骨格系の疼痛;関節痛;急性痛風疼痛;機械的刺激による腰痛症;頚部痛;腱炎;損傷性/運動性の疼痛;腹痛;腎盂腎炎;虫垂炎;胆嚢炎;腸閉塞;ヘルニア;他;胸痛(心臓痛を含む);骨盤痛、腎疝痛、急性の陣痛(陣痛を含む);帝王切開の疼痛;熱傷および外傷の疼痛;子宮内膜症;帯状疱疹疼痛;鎌状赤血球貧血;急性膵炎;突出痛;口腔顔面痛(副鼻腔痛、歯痛を含む);多発性硬化症の疼痛;癩病の疼痛;ベーチェット病の疼痛;有痛脂肪症;静脈炎の疼痛;ギラン・バレー疼痛;痛む足と動く足症候群;ハグルンド症候群;ファブリー病の疼痛;膀胱および尿生殖器疾患;過活動膀胱。
一実施形態では、本発明の抗体は、機能性疼痛症候群を処置するために使用され得、ここで上記機能性疼痛症候群は、慢性腰痛、過敏性腸症候群(IBS)、線維筋痛症(FM)、慢性疲労症候群(CFS)、腹痛、顎関節症(TMJD)、膀胱痛症候群(間質性膀胱炎)、機能性胃腸管障害/症候群、機能性胸痛症候群、片頭痛および緊張型頭痛、慢性骨盤痛症候群、前立腺痛症候群(慢性前立腺炎)、多種化学物質過敏症ならびに湾岸戦争症候群からなる群より選択される。
本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片はまた、腫瘍細胞の成長/増殖もしくは腫瘍細胞の転移を阻害するために使用され得る。よって、ある実施形態では、本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片は、子宮内膜がん、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、肝臓がん、膵臓がん、結腸がん、胃がん、子宮がん、卵巣がん、腎臓がん、非小細胞肺がん、脳がん、白血病、リンパ腫、骨がん、もしくはがんの転移(例えば、骨へのがんの転移)と関連する疼痛が挙げられるがこれらに限定されないがんを処置するために使用され得る。(Tang, J−Z, et al. Mol Cancer Ther (2010), 9(6): 1697−1708; Kang, J. et al. Oncogene, (2009), 28:2034−2045; Ceyhan, G.O.
et al. Annals of Surgery, (2006), 244(2):274−281; Banerjee, A., et al. Breast Cancer Res (2011), 13:R112; Pandey, V. et
al., Endocrinology, (2010), 151(3):909−920; Kang, J. et al., Oncogene, (2010), 29:3228−3240; Li, S. et al. J Biomed Sci
(2011), 18:24を参照のこと)。
et al. Annals of Surgery, (2006), 244(2):274−281; Banerjee, A., et al. Breast Cancer Res (2011), 13:R112; Pandey, V. et
al., Endocrinology, (2010), 151(3):909−920; Kang, J. et al., Oncogene, (2010), 29:3228−3240; Li, S. et al. J Biomed Sci
(2011), 18:24を参照のこと)。
本発明の抗体はまた、がん関連疼痛を処置もしくは防止するために有用である。「がん関連疼痛」としては、例えば、骨がん疼痛(骨へ転移したがん(例えば、乳がん、前立腺がん、肺がん、肉腫、腎臓がん、多発性骨髄腫など)に由来する疼痛を含む)が挙げられる。「がん関連疼痛」はまた、がん状態(例えば、腎細胞癌、膵臓癌、乳がん、頭頸部がん、前立腺がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、滑膜肉腫、甲状腺がん、もしくは黒色腫)とより一般に関連した疼痛を含む。本発明の抗体はまた、がん治療もしくは抗がん医療処置によって引き起こされるかもしくはこれと関連する疼痛(例えば、化学療法誘発性神経障害性疼痛(例えば、パクリタキセル(タキソールTM)、ドセタキセル(タキソテール(登録商標));ニトロソウレア、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エピルビシン、5−フルオロウラシル、トポテカン、イリノテカン、カルムスチン、エストラムスチン、および白金ベースの化学療法化合物(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、およびイプロプラチン)での処置によって引き起こされるかもしくはこれと関連する疼痛)を処置もしくは防止するために有用である。
組み合わせ療法
組み合わせ療法は、本発明の抗hGFRα3抗体、および例えば、別のGFRα3アンタゴニスト(例えば、抗GFRα3抗体もしくはGFRα3の低分子インヒビター);COX−2インヒビター;局所麻酔薬;NMDAモジュレーター;カンナビノイド受容体アゴニスト;P2Xファミリーモジュレーター;VR1アンタゴニスト;サブスタンスPアンタゴニスト;電位開口型ナトリウムチャネル(Nav)のインヒビター(例えば、Nav1.7アンタゴニスト、もしくはNav1.8アンタゴニスト(例えば、抗Nav1.7もしくは抗Nav1.8抗体または低分子インヒビター))、Nav1.9アンタゴニスト(例えば、抗Nav1.9抗体もしくはNav1.9の低分子インヒビター);カルシウムチャネルインヒビター;カリウムチャネルインヒビター;サイトカインインヒビターもしくはサイトカイン受容体アンタゴニスト(例えば、インターロイキン−1(IL−1)インヒビター(例えば、リロナセプト(「IL−1 trap」;Regeneron)もしくはアナキンラ(KINERET(R), Amgen)、低分子IL−1アンタ
ゴニスト、もしくは抗IL−1抗体);IL−18インヒビター(例えば、低分子IL−18アンタゴニストもしくは抗IL−18抗体);IL−6もしくはIL−6Rインヒビター(例えば、低分子IL−6アンタゴニスト、抗IL−6抗体もしくは抗IL−6受容体抗体);抗癲癇薬/抗痙攣薬(例えば、ガバペンチン、プレガバリン);神経成長因子(NGF)インヒビター(例えば、低分子NGFアンタゴニストもしくは抗NGF抗体);BDNF、TrkA、TrkBもしくはp75のインヒビター;オピオイド;モルフィン;低用量コルヒチン(cochicine);アスピリン、もしくは別のNSAID;ステロイド(例えば、プレドニゾン、メトトレキサートなど);低用量シクロスポリンA;選択的セロトニン再取り込みインヒビター(SSRI);セロトニンノルエピネフリン再取り込みインヒビター(SNRI);三環系抗うつ薬;腫瘍壊死因子(TNF)もしくはTNF受容体インヒビター(例えば、低分子TNFもしくはTNFRアンタゴニストまたは抗TNFもしくはTNFR抗体);TWEAK(TNF関連の弱いアポトーシス誘導物質)のインヒビター;RETインヒビター;GDNFファミリーリガンドのインヒビター;GFRα1、GFRα2もしくはGFRα4のインヒビター;酸感受性イオンチャネル(例えば、ASIC1もしくはASIC3)のインヒビター;尿酸合成インヒビター(例えば、アロプリノール);尿酸排出促進因子(例えば、プロベネシド、スルフィンピラゾン、ベンズブロマロンなど);プロキネティシン受容体(PROK1およびPROK2)のインヒビター;他の炎症インヒビター(例えば、カスパーゼ−1、p38、IKK1/2、CTLA−4Igなどのインヒビター);ならびに/またはコルチコステロイドを含み得る。
組み合わせ療法は、本発明の抗hGFRα3抗体、および例えば、別のGFRα3アンタゴニスト(例えば、抗GFRα3抗体もしくはGFRα3の低分子インヒビター);COX−2インヒビター;局所麻酔薬;NMDAモジュレーター;カンナビノイド受容体アゴニスト;P2Xファミリーモジュレーター;VR1アンタゴニスト;サブスタンスPアンタゴニスト;電位開口型ナトリウムチャネル(Nav)のインヒビター(例えば、Nav1.7アンタゴニスト、もしくはNav1.8アンタゴニスト(例えば、抗Nav1.7もしくは抗Nav1.8抗体または低分子インヒビター))、Nav1.9アンタゴニスト(例えば、抗Nav1.9抗体もしくはNav1.9の低分子インヒビター);カルシウムチャネルインヒビター;カリウムチャネルインヒビター;サイトカインインヒビターもしくはサイトカイン受容体アンタゴニスト(例えば、インターロイキン−1(IL−1)インヒビター(例えば、リロナセプト(「IL−1 trap」;Regeneron)もしくはアナキンラ(KINERET(R), Amgen)、低分子IL−1アンタ
ゴニスト、もしくは抗IL−1抗体);IL−18インヒビター(例えば、低分子IL−18アンタゴニストもしくは抗IL−18抗体);IL−6もしくはIL−6Rインヒビター(例えば、低分子IL−6アンタゴニスト、抗IL−6抗体もしくは抗IL−6受容体抗体);抗癲癇薬/抗痙攣薬(例えば、ガバペンチン、プレガバリン);神経成長因子(NGF)インヒビター(例えば、低分子NGFアンタゴニストもしくは抗NGF抗体);BDNF、TrkA、TrkBもしくはp75のインヒビター;オピオイド;モルフィン;低用量コルヒチン(cochicine);アスピリン、もしくは別のNSAID;ステロイド(例えば、プレドニゾン、メトトレキサートなど);低用量シクロスポリンA;選択的セロトニン再取り込みインヒビター(SSRI);セロトニンノルエピネフリン再取り込みインヒビター(SNRI);三環系抗うつ薬;腫瘍壊死因子(TNF)もしくはTNF受容体インヒビター(例えば、低分子TNFもしくはTNFRアンタゴニストまたは抗TNFもしくはTNFR抗体);TWEAK(TNF関連の弱いアポトーシス誘導物質)のインヒビター;RETインヒビター;GDNFファミリーリガンドのインヒビター;GFRα1、GFRα2もしくはGFRα4のインヒビター;酸感受性イオンチャネル(例えば、ASIC1もしくはASIC3)のインヒビター;尿酸合成インヒビター(例えば、アロプリノール);尿酸排出促進因子(例えば、プロベネシド、スルフィンピラゾン、ベンズブロマロンなど);プロキネティシン受容体(PROK1およびPROK2)のインヒビター;他の炎症インヒビター(例えば、カスパーゼ−1、p38、IKK1/2、CTLA−4Igなどのインヒビター);ならびに/またはコルチコステロイドを含み得る。
投与レジメン
本発明のある特定の実施形態によると、抗GFRα3抗体の複数用量は、定義された時間経過にわたって被験体に投与することができる。本発明のこの態様に係る方法は、GFRα3抗体の複数用量を被験体に逐次的に投与するステップを含む。本明細書において、「逐次的に投与する」は、抗GFRα3抗体の各用量が、異なる時点において、例えば、所定の間隔(例えば、数時間、数日間、数週間または数ヶ月間)によって隔てられた異なる日に被験体に投与されることを意味する。本発明は、抗GFRα3抗体の単一の初回用量と、その後の抗GFRα3抗体の1または複数の二次用量と、任意選択でその後の抗GFRα3抗体の1または複数の三次用量を患者に逐次的に投与するステップを含む方法を含む。
本発明のある特定の実施形態によると、抗GFRα3抗体の複数用量は、定義された時間経過にわたって被験体に投与することができる。本発明のこの態様に係る方法は、GFRα3抗体の複数用量を被験体に逐次的に投与するステップを含む。本明細書において、「逐次的に投与する」は、抗GFRα3抗体の各用量が、異なる時点において、例えば、所定の間隔(例えば、数時間、数日間、数週間または数ヶ月間)によって隔てられた異なる日に被験体に投与されることを意味する。本発明は、抗GFRα3抗体の単一の初回用量と、その後の抗GFRα3抗体の1または複数の二次用量と、任意選択でその後の抗GFRα3抗体の1または複数の三次用量を患者に逐次的に投与するステップを含む方法を含む。
用語「初回用量」、「二次用量」および「三次用量」は、抗GFRα3抗体の投与の時系列を指す。よって、「初回用量」は、処置レジメンの初めに投与される用量であり(「ベースライン用量」とも称される);「二次用量」は、初回用量の後に投与される用量であり;「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初回、二次および三次用量は全て、同じ量の抗GFRα3抗体を含有することができるが、一般に、投与頻度の観点から互いに異なっていてもよい。しかし、ある特定の実施形態では、初回、二次および/または三次用量に含有されている抗GFRα3抗体の量は、処置過程において互いに変動する(例えば、適宜、上方または下方に調整される)。ある特定の実施形態では、処置レジメンの初めに「負荷用量」として2以上の(例えば、2、3、4または5)用量が投与され、続いてより少ない頻度で投与されるその後の用量(例えば、「維持用量」)が投与される。
本発明の例示的な一実施形態では、各二次および/または三次用量は、直前の用量から1〜26(例えば、1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2またはそれより長い)週間後に投与される。語句「直前の用量」は、本明細書において、一連の複数の投与において、介在する用量が存在しない順番において丁度次の用量の投与の前に患者に投与される抗GFRα3抗体の用量を意味する。
本発明の本態様に係る方法は、抗GFRα3抗体のいずれかの数の二次および/または三次用量を患者に投与するステップを含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、単一の二次用量のみが、患者に投与される。他の実施形態では、2もしくはそれより多い(例えば、2、3、4、5、6、7、8もしくはそれより多い)二次用量が、患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単一の三次用量のみが、患者に投与される。他の実施形態では、2以上の(例えば、2、3、4、5、6、7、8もしくはそれより多い)三次用量が、患者に投与される。
複数の二次用量を含む実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与することができる。例えば、各二次用量は、直前の用量の1〜2週間後に患者に投与することができる。同じく、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与することができる。例えば、各三次用量は、直前の用量の2〜4週間後に患者に投与することができる。あるいは、二次および/または三次用量が患者に投与される頻度は、処置レジメンの過程にわたって変動し得る。投与の頻度は、医師によって、個々の患者の必要に応じて処置過程の間に調整することもできる。
抗体の診断的使用
本発明の抗GFRα3抗体を使用して、例えば、診断目的で、試料におけるGFRα3を検出および/または測定することもできる。例えば、抗GFRα3抗体またはその断片は、GFRα3の異常な発現(例えば、過剰発現、過少発現、発現欠除など)によって特徴付けられる状態または疾患を診断するために使用され得る。GFRα3の例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本発明の抗GFRα3抗体と接触させるステップを含むことができ、抗GFRα3抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている。あるいは、未標識の抗GFRα3抗体は、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて診断適用において使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、3H、14C、32P、35Sもしくは125I等、放射性同位元素;フルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミン等、蛍光もしくは化学発光部分;またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼ等、酵素となり得る。試料におけるGFRα3の検出または測定に使用することのできる特異的な例示的アッセイとして、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)および蛍光標識細胞分取(FACS)が挙げられる。
本発明の抗GFRα3抗体を使用して、例えば、診断目的で、試料におけるGFRα3を検出および/または測定することもできる。例えば、抗GFRα3抗体またはその断片は、GFRα3の異常な発現(例えば、過剰発現、過少発現、発現欠除など)によって特徴付けられる状態または疾患を診断するために使用され得る。GFRα3の例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本発明の抗GFRα3抗体と接触させるステップを含むことができ、抗GFRα3抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている。あるいは、未標識の抗GFRα3抗体は、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて診断適用において使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、3H、14C、32P、35Sもしくは125I等、放射性同位元素;フルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミン等、蛍光もしくは化学発光部分;またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼ等、酵素となり得る。試料におけるGFRα3の検出または測定に使用することのできる特異的な例示的アッセイとして、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)および蛍光標識細胞分取(FACS)が挙げられる。
本発明に係るGFRα3診断アッセイにおいて使用することのできる試料は、正常または病的状態における、検出可能な量のGFRα3タンパク質またはその断片を含有する、患者から得ることができるいずれかの組織または流体試料を含む。一般に、健康患者(例えば、異常なGFRα3レベルまたは異常なGFRα3活性に伴う疾患にも状態にも罹患していない患者)から得られる特定の試料におけるGFRα3のレベルを測定して、GFRα3のベースラインまたは標準レベルを最初に確立するであろう。その後、GFRα3のこのベースラインレベルは、GFRα3関連疾患もしくはGFRα3関連状態またはこのような疾患もしくは状態に関連した疼痛を有すると疑われる個体から得られる試料において測定されたGFRα3のレベルに対して比較することができる。
次の実施例は、本発明の方法および組成物を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供できるように示されており、本発明者らが自身の発明として考慮する範囲の限定を企図しない。使用された数(例えば、量、温度等)に対する正確度を確保するための努力をしたが、一部の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。他に断りがなければ、部は、重量部であり、分子量は、平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、圧力は大気圧またはその近辺である。
(実施例1.ヒトGFRα3に対するヒト抗体の生成)
配列番号370、371、372および373として示されるアミノ酸配列を有するGFRα3ペプチドのうちのいずれか1つ、またはその断片を含む免疫原は、ヒトGFRα3に対する抗体を生成するために利用され得る。これらのペプチドを、担体(例えば、KLH)にコンジュゲートし、次いで、ヒト免疫グロブリン重およびカッパー軽鎖可変領域をコードするDNAを含むVELOCIMMUNE(登録商標)マウスに、免疫応答を刺激するためのアジュバントと共に投与した。GFRα3特異的イムノアッセイにより抗体免疫応答をモニターする。所望の免疫応答が達成されたら、脾細胞を収集し、マウス骨髄腫細胞と融合してその生存能を保ち、ハイブリドーマ細胞株を形成する。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、GFRα3特異的抗体を産生する細胞株を同定する。この技法および上に記載されている様々な免疫原を使用して、数種類の抗GFRα3キメラ抗体(すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを保有する抗体)を得た。この方法を用いて生成される抗GFRα3抗体を、H1M2207N、H1M2212N、H1M2236N、H1M2236N3、H1M2243N、H1M2243N2、H1M2210NおよびH1M2234Nと命名した。
配列番号370、371、372および373として示されるアミノ酸配列を有するGFRα3ペプチドのうちのいずれか1つ、またはその断片を含む免疫原は、ヒトGFRα3に対する抗体を生成するために利用され得る。これらのペプチドを、担体(例えば、KLH)にコンジュゲートし、次いで、ヒト免疫グロブリン重およびカッパー軽鎖可変領域をコードするDNAを含むVELOCIMMUNE(登録商標)マウスに、免疫応答を刺激するためのアジュバントと共に投与した。GFRα3特異的イムノアッセイにより抗体免疫応答をモニターする。所望の免疫応答が達成されたら、脾細胞を収集し、マウス骨髄腫細胞と融合してその生存能を保ち、ハイブリドーマ細胞株を形成する。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、GFRα3特異的抗体を産生する細胞株を同定する。この技法および上に記載されている様々な免疫原を使用して、数種類の抗GFRα3キメラ抗体(すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを保有する抗体)を得た。この方法を用いて生成される抗GFRα3抗体を、H1M2207N、H1M2212N、H1M2236N、H1M2236N3、H1M2243N、H1M2243N2、H1M2210NおよびH1M2234Nと命名した。
抗GFRα3抗体は、また、U.S.2007/0280945A1に記載されている通り、骨髄腫細胞に融合することなく抗原陽性B細胞から直接的に単離した。この方法を使用して、数種類の完全ヒト型抗GFRα3抗体(すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを保有する抗体)を得た。この様式で生成された例示的な抗体を、次の通りに命名した:H4H2207N、H4H2212N、H4H2236N、H4H2243N、H4H2210N、H4H2234N、H4H2291S、H4H2292S、H4H2293P、H4H2294S、H4H2295S、H4H2296S、H4H2341S、H4H2342P、H4H2344S、H4H2345S、H4H2346S、H4H2350P、H4H2352S、H4H2354S、H4H2355S、H4H2357SおよびH4H2364S。
本実施例の方法に従って生成された例示的な抗GFRα3抗体の生物学的特性を、下に記す実施例において詳細に説明する。
(実施例2.重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列)
表1は、選択された抗GFRα3抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列の対ならびにその相当する抗体識別子を表記する。抗体は、典型的には、本明細書において次の命名法に従って参照される:Fc接頭語(例えば、「H4H」、「H1M」、「H2M」)、続いて数的識別子(例えば、表1に示す通り「2207」)、続いて「P」、「S」または「N」接尾語。よって、この命名法に従うと、抗体は、例えば、「H4H2207N」と称され得る。本明細書に使用されている抗体名称におけるH4H、H1MおよびH2M接頭語は、抗体の特定のFc領域を示す。例えば、「H2M」抗体は、マウスIgG2 Fcを有し、一方、「H4H」抗体は、ヒトIgG4 Fcを有する。当業者が認識するように、H1MまたはH2M抗体は、H4H抗体に変換することができ、逆もまた同様であるが、いずれの場合においても、表1に示す数的識別子によって示される可変ドメイン(CDRを含む)は、そのままであろう。同じ数的抗体名称を有するが、N、B、SまたはPの接尾語の文字が異なる抗体は、同一CDR配列を有するが、CDR配列の外部の領域(すなわち、フレームワーク領域)において配列バリエーションを有する重鎖および軽鎖を有する抗体を指す。よって、特定の抗体のN、B、SおよびPバリアントは、その重鎖可変領域および軽鎖可変領域内に同一CDR配列を有するが、そのフレームワーク領域内が互いに異なる。
表1は、選択された抗GFRα3抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列の対ならびにその相当する抗体識別子を表記する。抗体は、典型的には、本明細書において次の命名法に従って参照される:Fc接頭語(例えば、「H4H」、「H1M」、「H2M」)、続いて数的識別子(例えば、表1に示す通り「2207」)、続いて「P」、「S」または「N」接尾語。よって、この命名法に従うと、抗体は、例えば、「H4H2207N」と称され得る。本明細書に使用されている抗体名称におけるH4H、H1MおよびH2M接頭語は、抗体の特定のFc領域を示す。例えば、「H2M」抗体は、マウスIgG2 Fcを有し、一方、「H4H」抗体は、ヒトIgG4 Fcを有する。当業者が認識するように、H1MまたはH2M抗体は、H4H抗体に変換することができ、逆もまた同様であるが、いずれの場合においても、表1に示す数的識別子によって示される可変ドメイン(CDRを含む)は、そのままであろう。同じ数的抗体名称を有するが、N、B、SまたはPの接尾語の文字が異なる抗体は、同一CDR配列を有するが、CDR配列の外部の領域(すなわち、フレームワーク領域)において配列バリエーションを有する重鎖および軽鎖を有する抗体を指す。よって、特定の抗体のN、B、SおよびPバリアントは、その重鎖可変領域および軽鎖可変領域内に同一CDR配列を有するが、そのフレームワーク領域内が互いに異なる。
(実施例2.可変遺伝子利用解析)
産生された抗体の構造を解析するために、抗体可変領域をコードする核酸をクローニングして配列決定した。抗体の核酸配列および予測アミノ酸配列から、重鎖可変領域(HCVR)および軽鎖可変領域(LCVR)毎に遺伝子使用を同定した。表2は、本発明に従って選択された抗体の遺伝子使用を表記する。
産生された抗体の構造を解析するために、抗体可変領域をコードする核酸をクローニングして配列決定した。抗体の核酸配列および予測アミノ酸配列から、重鎖可変領域(HCVR)および軽鎖可変領域(LCVR)毎に遺伝子使用を同定した。表2は、本発明に従って選択された抗体の遺伝子使用を表記する。
(実施例3.GFRα3抗体の結合親和性)
25℃および37℃でのリアルタイム表面プラズモン共鳴法バイオセンサー(Biacore T200)アッセイを使用して、抗GFRα3抗体への抗原結合の、結合会合および解離速度定数(それぞれkaおよびkd)ならびに計算された平衡解離定数および解離半減期(それぞれKDおよびt1/2)を決定した。C末端myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを伴って発現されたヒトGFRα3(hGFRα3−mmh;配列番号370、C末端hFcタグ(hGFRα3−hFc;配列番号371)、もしくはC末端mFcタグを伴って発現されたヒトGFRα3(hGFRα3−mFc;配列番号372)のいずれか、ならびにC末端myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを伴って発現されたサルGFRa3(MfGFRα3−mmh;配列番号373)への結合について、抗体を試験した。抗GFRα3抗体を、Biacore CM5センサーチップへの直接アミンカップリングを介して作られた、ヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(GE Healthcare, # BR−1008−38)もしくはマウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体(GE Healthcare, #BR−1008−39)いずれかの表面で捕捉した。反応速度論的実験を、泳動緩衝液およびサンプル緩衝液の両方として、HBS−EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% サーファクタントP20、pH7.4)もしくは0.05% v/v サーファクタントP20を含むPBS緩衝液を使用して行った。ヒトGFRα3−mmhもしくはサルGFRα3−mmhへの結合を、捕捉抗体表面にわたって200〜7.4nM(3倍希釈)の範囲のいくつかの濃度を注入することによって評価した。ヒトGFRα3−mFcもしくはヒトGFRα3−hFcへの結合を、捕捉抗体表面にわたって100〜3.7nM(3倍希釈)の範囲に及ぶいくつかの濃度を注入することによって評価した。抗体−抗原会合を、最大4分間にわたってモニターした一方で、緩衝液中での解離を、最大20分間にわたってモニターした。反応速度論的な結合速度定数(ka)および解離速度定数(kd)を、Scrubber 2.0cカーブ適合ソフトウェアを使用して、データを処理し、1:1結合モデルに適合させることによって決定した。結合解離平衡定数(KD)および解離半減期(t1/2)を、KD(M)=kd/kaおよびt1/2(分)=[ln2/(60*kd)]として反応速度論的速度定数から計算した。
25℃および37℃でのリアルタイム表面プラズモン共鳴法バイオセンサー(Biacore T200)アッセイを使用して、抗GFRα3抗体への抗原結合の、結合会合および解離速度定数(それぞれkaおよびkd)ならびに計算された平衡解離定数および解離半減期(それぞれKDおよびt1/2)を決定した。C末端myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを伴って発現されたヒトGFRα3(hGFRα3−mmh;配列番号370、C末端hFcタグ(hGFRα3−hFc;配列番号371)、もしくはC末端mFcタグを伴って発現されたヒトGFRα3(hGFRα3−mFc;配列番号372)のいずれか、ならびにC末端myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを伴って発現されたサルGFRa3(MfGFRα3−mmh;配列番号373)への結合について、抗体を試験した。抗GFRα3抗体を、Biacore CM5センサーチップへの直接アミンカップリングを介して作られた、ヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(GE Healthcare, # BR−1008−38)もしくはマウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体(GE Healthcare, #BR−1008−39)いずれかの表面で捕捉した。反応速度論的実験を、泳動緩衝液およびサンプル緩衝液の両方として、HBS−EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% サーファクタントP20、pH7.4)もしくは0.05% v/v サーファクタントP20を含むPBS緩衝液を使用して行った。ヒトGFRα3−mmhもしくはサルGFRα3−mmhへの結合を、捕捉抗体表面にわたって200〜7.4nM(3倍希釈)の範囲のいくつかの濃度を注入することによって評価した。ヒトGFRα3−mFcもしくはヒトGFRα3−hFcへの結合を、捕捉抗体表面にわたって100〜3.7nM(3倍希釈)の範囲に及ぶいくつかの濃度を注入することによって評価した。抗体−抗原会合を、最大4分間にわたってモニターした一方で、緩衝液中での解離を、最大20分間にわたってモニターした。反応速度論的な結合速度定数(ka)および解離速度定数(kd)を、Scrubber 2.0cカーブ適合ソフトウェアを使用して、データを処理し、1:1結合モデルに適合させることによって決定した。結合解離平衡定数(KD)および解離半減期(t1/2)を、KD(M)=kd/kaおよびt1/2(分)=[ln2/(60*kd)]として反応速度論的速度定数から計算した。
表3に示されるように、25℃において、全25種の抗GFRα3抗体は、82.0pM〜29.7nMの範囲に及ぶKD値でhGFRα3−mmhに結合した。37℃において、全25種の抗GFRα3抗体は、118pM〜47.3nMの範囲に及ぶKD値でhGFRα3−mmhに結合した。表4に示されるように、25℃において、全23種の抗GFRα3抗体は、2.90pM〜97.2nMの範囲に及ぶKD値でMfGFRα3−mmhに結合した。37℃において、全23種の抗GFRα3抗体は、11.7pM〜145nMの範囲に及ぶKD値でMfGFRα3−mmhに結合した。表5に示されるように、25℃および37℃において、上記23種の抗GFRα3抗体のうちの6種を、hGFRα3−hFcへの結合について試験した一方で、他の17種の抗体を、hGFRα3−mFcへの結合について試験した。25℃において、上記6種の抗GFRα3抗体をhGFRα3−hFcへの結合について試験したところ、7.50pM〜220pMの範囲に及ぶKD値で結合した。37℃において、上記6種の抗GFRα3抗体をhGFRα3−hFcへの結合について試験したところ、41.3pM〜531pMの範囲に及ぶKD値で結合した。25℃において、上記17種の抗GFRα3抗体をhGFRα3−mFcへの結合について試験したところ、0.467pM〜58.4pMの範囲に及ぶKD値で結合した。37℃において、上記17種の抗GFRα3抗体をhGFRα3−mFcへの結合について試験したところ、13.2pM〜106pMの範囲に及ぶKD値で結合した。
(実施例4.抗GFRα3抗体によるヒトアルテミンへのヒトGFRα3結合のブロック)
抗GFRα3抗体が、共受容体ヒトRETの存在下もしくは非存在下でヒトアルテミンへのヒトGFRα3結合をブロックする能力を、2つの異なるブロッキングELISA形式を使用して決定した。
抗GFRα3抗体が、共受容体ヒトRETの存在下もしくは非存在下でヒトアルテミンへのヒトGFRα3結合をブロックする能力を、2つの異なるブロッキングELISA形式を使用して決定した。
第1の形式では、C末端myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを有する組換えヒトアルテミンタンパク質(hアルテミン−mmH;配列番号369)を、PBS緩衝液中で、96ウェルマイクロタイタープレートに2μg/mlで一晩4℃において被覆し、次いで、0.5%(w/v) BSAの溶液でブロックした。120pMで一定量のC末端ヒトFcタグと融合したヒトGFRα3(hGFRα3−hFc;配列番号371)を、種々の量の抗体(連続希釈で0〜約10nMの範囲に及ぶ)と予め混合し、続いて、室温(RT)で1時間インキュベートして、抗体−hGFRα3−hFc結合が平衡に達するようにした。次いで、平衡に達したサンプル溶液を、上記hアルテミン−mmH被覆プレートに移した。1時間の結合の後、上記プレートを洗浄し、次いで、結合したhGFRα3−hFcを、HRPコンジュゲート抗ヒトIgG Fc特異的抗体(Jackson Immunochemical, #109−035−098)を使用して検出し、比色シグナルを、TMB HRP基質(BD Biosciences, #51−2606KCおよび#51−2607KC)を使用して発色させた。吸光度をVictor X5プレートリーダー(Perkin Elmer)で450nmにおいて記録して、hアルテミン−mmHで被覆したプレートに結合し得た予め平衡に達したhGFRα3−hFc−抗体溶液中で遊離hGFRα3−hFcの量を決定した。IC50値(一定の濃度のhGFRα3−hFcからのシグナルを50%低下させるために必要な抗体の濃度として定義される)を、GraphPadのPrismソフトウェアを使用して、上記データから計算した。抗GFRα3抗体の非存在下で120pM hGFRα3−hFcの一定量で測定した吸光度を、0%ブロッキングとして定義し、hGFRα3−hFc添加なしの吸光度を、100%ブロッキングとして定義する。最高の抗体濃度を含むウェル中で認められた吸光度を使用して、表中に示される最大ブロッキング%を計算した。結果を表6にまとめる。
第2のELISA形式では、プレート、サンプルおよびデータを、C末端10ヒスチジンタグ(hRET−10His; R&D Systems, # 1168−CR/CF)を有するhアルテミン−mmHおよびヒトRETの両方をブロッキングELISA実験のために被覆したことを除いて、第1の形式と同様に処理した。96ウェルマイクロタイタープレートを、PBS中の1.2μg/ml hアルテミン−mmHおよび6.9μg/ml hRET−10Hisタンパク質の混合物で一晩4℃において被覆し、次いで、0.5%(w/v) BSAの溶液でブロックした。一定量の、C末端myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを有するビオチン化ヒトGFRα3(ビオチン−hGFRα3−mmH;配列番号370)1nMを、種々の量の抗GFRα3抗体(連続希釈で0〜約100nMの範囲に及ぶ)と予め混合し、続いて、1時間室温でインキュベートして、抗体−ビオチン−hGFRα3−mmH結合が平衡に達するようにした。次いで、平衡に達したサンプルを、被覆したプレートに移した。1時間の結合の後、上記プレートを洗浄し、次いで、結合したビオチン−hGFRα3−mmHを、HRPコンジュゲートストレプトアビジン(Pierce, #N200)を使用して検出し、比色シグナルを、TMB HRP基質を使用して発色させた。各抗体によるIC50値および最大ブロッキングを表6に示す。
表6に示されるように、上記23種の抗GFRα3抗体のうちの9種が、第1のELISA形式において43.8pM〜723pMの範囲に及ぶIC50値で、被覆hアルテミン−mmHへの上記hGFRα3−hFc結合のうちの51〜94%をブロックした。上記23種の抗GFRα3抗体のうちの8種は、第1のELISA形式において試験したより高い抗体濃度のうちの多くで、hGFRα3−hFc結合シグナルを増大させた(表6中の「エンハンサー」)。上記第1のELISA形式で試験した23種の抗体のうちの6種は、被覆したhアルテミン−mmHへのhGFRα3−hFc結合シグナルをブロックも増強もしなかった。表6に示されるように、第2のELISA形式に関しては、上記23種の抗GFRα3抗体のうちの17種が、403pM〜14.6nMの範囲に及ぶIC50値で、二重被覆hアルテミン−mmHおよびhRET−10Hisへのビオチン−hGFRα3−mmH結合のうちの75〜100%をブロックした。また、第2のELISA形式において、上記23種の抗GFRα3抗体のうちの5種が、より低い抗体濃度でビオチン−hGFRα3−mmH結合シグナルを増大させたが、hアルテミン−mmHおよびhRET−10Hisへの1nM以上の抗体濃度でビオチン−hGFRα3−mmH結合のうちの28〜95%をブロックした(表6中の「エンハンサー」)。1種の抗GFRα3抗体は、試験したより高い抗体濃度でビオチン−hGFRα3−mmH結合シグナルを増大させた(表6中の「エンハンサー」)。第2のELISA形式では、いかなる濃度でもブロッキングはなかった。
(実施例5.抗GFRα3抗体がリガンドアルテミンによるGFRα3およびRETの活性化をin vitroでブロックする能力の測定)
抗GFRα3抗体がそのリガンドアルテミンによるGFRα3およびRETの活性化をin vitroでブロックする能力を、細胞ベースのアッセイを使用して決定した。ヒトGFRα3(アクセッション番号 NP_001487.2のアミノ酸1〜400)およびヒトRET(アクセッション番号 NP_065681のアミノ酸1〜1072)の両方を安定して発現するように改変したHEK293細胞を作り、次いで、SRE応答性ルシフェラーゼレポーター(SRE−luc; Sabiosciences, CCS−010L)で形質導入した(HEK293/hGFRα3/hRET細胞)。
抗GFRα3抗体がそのリガンドアルテミンによるGFRα3およびRETの活性化をin vitroでブロックする能力を、細胞ベースのアッセイを使用して決定した。ヒトGFRα3(アクセッション番号 NP_001487.2のアミノ酸1〜400)およびヒトRET(アクセッション番号 NP_065681のアミノ酸1〜1072)の両方を安定して発現するように改変したHEK293細胞を作り、次いで、SRE応答性ルシフェラーゼレポーター(SRE−luc; Sabiosciences, CCS−010L)で形質導入した(HEK293/hGFRα3/hRET細胞)。
20,000個のHEK293/hGFRα3/hRET/SRE−luc細胞を、0.5% FBSを含むOptimem(GIBCO, #31985)の中でポリD−リジン被覆96ウェルプレート(Greiner, #35−4620)に播種し、次いで、37℃において5% CO2で一晩増殖させた。次いで、上記細胞を、5pM〜300nMの範囲に及ぶ抗GFRα3抗体の連続希釈物とともに、1時間室温においてインキュベートした。一定用量(100pM)の、C末端myc mycヘキサヒスチジンタグ(配列番号369)を伴って発現させたヒトアルテミンを、次いで上記細胞に添加し、さらに6時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、OneGlo試薬(Promega, #E6051)を添加した後に、Victorルミノメーター(Perkin Elmer)で相対光単位(RLU)として測定した。EC50値およびIC50値を、GraphPad Prismデータ分析ソフトウェアを使用して、12点応答曲線に対して4パラメーターロジスティック方程式(four−parameter logistic equation)から計算した。
23種の抗GFRα3抗体を、これらが上記HEK293/hGFRα3/hRET/SRE−luc細胞のアルテミン依存性活性化を阻害する能力について試験した。表7に示されるように、試験した全23種の抗体は、0.2nM〜48.3nMの範囲に及ぶIC50値でルシフェラーゼ活性をブロックした。23種の抗体のうちの19種は、300nMの濃度でベースラインまでブロックした。上記23種の抗体のうちの4種(H4H2344S、H4H2345S、H4H2346S、およびH4H2354S−1)は、試験したどの抗体濃度でもベースラインまでブロックしなかった。
(実施例6.アルテミン感作カプサイシン熱痛覚過敏症の阻害)
マウスにおいてアルテミン感作熱痛覚過敏を誘発するために、各マウスを、0.5μg
マウス組換えアルテミン(R&D Systems, #1085−AR)の足底内注射で前処置し、24時間後に、DMSO(Sigma−Aldrich, #M−2028)中の100mM溶液から0.5μg カプサイシン(最適に及ばない用量)の足底内注射を施した。熱痛覚過敏症を、Hargreaves試験(ここで動物がその足を引っ込めるまで、注射した足に光線を向ける)を使用して評価した。引っ込めるまでの潜時を、侵害受容の行動尺度として記録する。熱痛覚過敏症は、有意に減少した足引っ込め潜時に基づいて、カプサイシン投与の3日後に一貫してアルテミン感作される。これら研究に関して、引っ込め潜時のベースライン値を、アルテミンもしくはカプサイシンのいずれかを投与する前に測定し、続いて、カプサイシン処置の3日後に2回目の測定を行った。これらのアッセイを行う実験者は、動物の処置群に関して盲検で行った。
マウスにおいてアルテミン感作熱痛覚過敏を誘発するために、各マウスを、0.5μg
マウス組換えアルテミン(R&D Systems, #1085−AR)の足底内注射で前処置し、24時間後に、DMSO(Sigma−Aldrich, #M−2028)中の100mM溶液から0.5μg カプサイシン(最適に及ばない用量)の足底内注射を施した。熱痛覚過敏症を、Hargreaves試験(ここで動物がその足を引っ込めるまで、注射した足に光線を向ける)を使用して評価した。引っ込めるまでの潜時を、侵害受容の行動尺度として記録する。熱痛覚過敏症は、有意に減少した足引っ込め潜時に基づいて、カプサイシン投与の3日後に一貫してアルテミン感作される。これら研究に関して、引っ込め潜時のベースライン値を、アルテミンもしくはカプサイシンのいずれかを投与する前に測定し、続いて、カプサイシン処置の3日後に2回目の測定を行った。これらのアッセイを行う実験者は、動物の処置群に関して盲検で行った。
アルテミン感作痛覚過敏症でのヒト抗GFRα3抗体の効力を評価する全ての実験に関して、マウスGFRα3の代わりにヒトGFRα3の発現についてホモ接合性の成体マウス(「ヒト化GFRα3」)を使用した。雄性および雌性両方のマウスを、処置群にわたって性別のバランスをとって各アッセイにおいて使用した(実験群もしくはコントロール群につき合計で8匹のマウス)。ヒト化GFRα3マウスを、野生型マウスで認められるものに類似のアルテミン誘発性カプサイシン熱痛覚過敏症潜時応答を有することを予め決定した。
6種の抗GFRα3抗体(H4H2212N、H4H2243N2、H4H2292S、H4H2294S、H4H2342P、およびH4H2352S−1)を、モデルで試験した。全ての抗体をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で希釈し、後ろ足へアルテミン注射をする24時間前に、1ml/100g 体重体積中25mg/kgで皮下投与した。各実験では、動物の1群に、アイソタイプコントロール抗体を受けさせた。
各処置群もしくはコントロール群の疼痛感受性を、ベースライン引っ込め潜時のパーセンテージ(BWL%)として定義し、カプサイシン処置なしの彼らのベースライン引っ込め潜時と比較した、カプサイシン処置の3日後の各動物の時間に基づく引っ込め潜時(WL)の分数変化率(fractional change)として計算した:
BWL%=[(WL(カプサイシン)−WL(カプサイシンなし))/WL(カプサイシンなし)]×100
BWL%=[(WL(カプサイシン)−WL(カプサイシンなし))/WL(カプサイシンなし)]×100
BWL%を使用すると、より大きな負の値は、より大きな熱痛覚過敏症を示す。
表8は、カプサイシン注射の3日後に評価したアルテミン感作カプサイシン熱痛覚過敏症モデルでのベースライン引っ込め潜時(BWL%)のパーセンテージに関して、群平均(太字)および平均の標準偏差(斜体)のまとめを示す。
表8に示されるように、抗hGFRα3抗体で処置したマウスは、アイソタイプコントロール抗体で処置したマウスと比較して、BWL%の増大を示した(より小さい負の値もしくは正の値)。4種の抗体(H4H2352S、H4H2243N2、H4H2294S、およびH4H2342P)は、行った全ての実験にわたって熱痛覚過敏症に対して最高の抵抗性を促進した。
(実施例7.GFRα1およびGFRα2との交差反応性に関する抗GFRα3抗体の試験)
抗GFRα3抗体がGDNFファミリー受容体に結合する能力を、Octet Redバイオセンサ(Fortebio, Inc.)を使用して評価した。抗体を、C末端ヒトFcタグおよびヘキサヒスチジンタグを伴って発現させたヒトGFRα1(hGFRα1−hFc−6His, R&D Systems # 714−GR)、C末端ヒトFcタグのみを伴って発現させたヒトGFRα1(hGFRα1−hFc;配列番号376)、C末端ヒトFcタグおよびヘキサヒスチジンタグを伴って発現させたヒトGFRα2(hGFRα2−hFc−6His, R&D Systems #613−FR)、C末端ヒトFcタグを伴って発現させたヒトGFRα3(hGFRα3−hFc,配列番号371)、または無関係のヒトFcタグ化タンパク質のいずれかへの結合に関して試験した。抗原を、5分間で10μg/mL溶液から抗ヒトFcセンサーチップ上に捕捉した。次いで、被覆したセンサーチップを、無関係のヒトFc抗体の100μg/mL溶液で5分間ブロックした。次いで、ブロックしたセンサーチップを、667μMの各抗GFRα3抗体もしくは緩衝液単独を含むウェルに10分間にわたって浸漬した。実験を、HBST+BSA緩衝液(10 mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% w/v サーファクタントP20、0.1mg/mL BSA, pH7.4)を使用して、25℃において流速1000rpmで行った。実験の各工程での結合応答(nmの単位で測定した)をモニターし、記録した。
抗GFRα3抗体がGDNFファミリー受容体に結合する能力を、Octet Redバイオセンサ(Fortebio, Inc.)を使用して評価した。抗体を、C末端ヒトFcタグおよびヘキサヒスチジンタグを伴って発現させたヒトGFRα1(hGFRα1−hFc−6His, R&D Systems # 714−GR)、C末端ヒトFcタグのみを伴って発現させたヒトGFRα1(hGFRα1−hFc;配列番号376)、C末端ヒトFcタグおよびヘキサヒスチジンタグを伴って発現させたヒトGFRα2(hGFRα2−hFc−6His, R&D Systems #613−FR)、C末端ヒトFcタグを伴って発現させたヒトGFRα3(hGFRα3−hFc,配列番号371)、または無関係のヒトFcタグ化タンパク質のいずれかへの結合に関して試験した。抗原を、5分間で10μg/mL溶液から抗ヒトFcセンサーチップ上に捕捉した。次いで、被覆したセンサーチップを、無関係のヒトFc抗体の100μg/mL溶液で5分間ブロックした。次いで、ブロックしたセンサーチップを、667μMの各抗GFRα3抗体もしくは緩衝液単独を含むウェルに10分間にわたって浸漬した。実験を、HBST+BSA緩衝液(10 mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% w/v サーファクタントP20、0.1mg/mL BSA, pH7.4)を使用して、25℃において流速1000rpmで行った。実験の各工程での結合応答(nmの単位で測定した)をモニターし、記録した。
試験した抗GFRα3抗体のうちの6種全てが、上記hGFRα3−hFcタンパク質より1.0nm高い結合を示したが、表9に示されるように、他のGDNFファミリー受容体へのもしくは無関係のヒトFcタグ化タンパク質への測定可能な結合は全く示さなかった。
(実施例8.抗GFRa3抗体がHEK293/MfGFRα3/MfRet/SRE−Lucバイオアッセイでアルテミン刺激をブロックする能力の測定)
抗GFRα3抗体がカニクイザルGFRα3およびカニクイザルRETのそのリガンドアルテミンによる活性化をin vitroでブロックする能力を、細胞ベースのアッセイを使用して決定した。カニクイザルGFRα3(MfGFRα3;配列番号377)およびカニクイザルRET(MfRET;配列番号378)の両方を安定して発現するように改変したHEK293細胞を生成し、次いで、最小のCMVプロモーターおよび血清応答エレメントのタンデム反復の制御下のホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するCignal Lenti SRE Reporter(SA Biosciences, #CLS−010L)で形質導入して、HEK293/MfGFRα3/MfRet/SRE−Luc細胞株を生成した。
抗GFRα3抗体がカニクイザルGFRα3およびカニクイザルRETのそのリガンドアルテミンによる活性化をin vitroでブロックする能力を、細胞ベースのアッセイを使用して決定した。カニクイザルGFRα3(MfGFRα3;配列番号377)およびカニクイザルRET(MfRET;配列番号378)の両方を安定して発現するように改変したHEK293細胞を生成し、次いで、最小のCMVプロモーターおよび血清応答エレメントのタンデム反復の制御下のホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するCignal Lenti SRE Reporter(SA Biosciences, #CLS−010L)で形質導入して、HEK293/MfGFRα3/MfRet/SRE−Luc細胞株を生成した。
バイオアッセイのために、20,000個のHEK293/MfGFRα3/MfRet/SRE−Luc細胞を、0.5% FBSを含むOptimem(GIBCO, #31985)中で、ポリD−リジン被覆96ウェルプレート(Greiner, #35−4620)に播種し、次いで、5% CO2で37℃において一晩増殖させた。次いで、上記細胞を、5pM〜300nMの範囲に及ぶ抗GFRα3抗体の連続希釈物とともに1時間インキュベートした。次いで、一定用量(500pM)の、C末端myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを伴って発現させたヒトアルテミン(ヒトアルテミン−MMH;配列番号369)を、上記細胞に添加し、さらに6時間インキュベートした。用量応答曲線からヒトアルテミン−MMHのEC50値を決定するために、0.5pM〜10nMの範囲に及ぶヒトアルテミン−MMHの連続希釈物を、抗体なしで上記細胞に添加し、6時間、37℃でインキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、OneGlo試薬(Promega, #E6051)を添加した後にVictorルミノメーター(Perkin Elmer)で相対光単位(RLU)として測定した。EC50値およびIC50値を、GraphPad Prismデータ分析ソフトウェアを使用して12点応答曲線に対して4パラメーターロジスティック方程式から計算した。
6種の抗GFRα3抗体を、これらがHEK293/MfGFRα3/MfRET/SRE−luc細胞のアルテミン依存性活性化を阻害する能力について試験した。表10に示されるように、試験した6種全ての抗体が、0.7nM〜2.5nMの範囲に及ぶIC50値でルシフェラーゼ活性を完全にブロックした。ヒトアルテミン−MMHは、EC50値70pMで、上記HEK293/mfGFRα3/mfRet/SRE−LUC細胞株におけるSRE依存性ルシフェラーゼ活性を刺激した。
(実施例9.二重特異性抗GFRα3抗体の生成)
種々の二重特異性抗体を、本発明の方法を実施するにあたって使用するために生成する。例えば、GFRα3特異的抗体を、GFRα3上の別個のエピトープに結合する可変領域が単一の結合分子内に二重のエピトープ特異性を付与するためにいっしょに連結される、二重特異性形式で生成する(「二重特異性因子(bi−specific)」)。適切に設計された二重特異性因子は、GFRα3特異性および結合アビディティーの両方を増大させることによって、GFRα3ブロッキング効力全体を増強し得る。3つのシステイン反復のうちのいずれかの内の個々の異なるエピトープに対して特異性を有するか、または3つのシステイン反復のうちのいずれかの1つのエピトープ内の異なる領域に結合し得る種々の領域は、各可変領域が、別個のエピトープに、もしくは1つのエピトープ内の異なる領域に同時に結合することを可能にする構造的足場の上で対にされる。二重特異性体に関する一例では、1つのシステイン反復内の1つのエピトープに対して特異性を有するバインダー(binder)に由来する重鎖可変領域(VH)は、他の2つのシステイン反復のうちのいずれか内の第2のエピトープに対して特異性を有する一連のバインダーに由来する軽鎖可変領域(VL)と再結合されて、そのVHに対する元の特異性を破壊することなく、元のVHと対になり得る非コグネイト(non−cognate)VLパートナーを同定する。このようにして、単一のVLセグメント(例えば、VL1)は、2つの異なるVHドメイン(例えば、VH1およびVH2)と組み合わされて、2つの結合「アーム」(VH1−VL1およびVH2−VL1)から構成される二重特異性体を生成し得る。単一のVLセグメントの使用は、システムの複雑性を低減し、それによって、上記二重特異性体を生成するために使用されるクローニング、発現、および精製プロセスを単純化し、その効率を増大させる(例えば、USSN13/022759およびUS2010/0331527を参照のこと)。
種々の二重特異性抗体を、本発明の方法を実施するにあたって使用するために生成する。例えば、GFRα3特異的抗体を、GFRα3上の別個のエピトープに結合する可変領域が単一の結合分子内に二重のエピトープ特異性を付与するためにいっしょに連結される、二重特異性形式で生成する(「二重特異性因子(bi−specific)」)。適切に設計された二重特異性因子は、GFRα3特異性および結合アビディティーの両方を増大させることによって、GFRα3ブロッキング効力全体を増強し得る。3つのシステイン反復のうちのいずれかの内の個々の異なるエピトープに対して特異性を有するか、または3つのシステイン反復のうちのいずれかの1つのエピトープ内の異なる領域に結合し得る種々の領域は、各可変領域が、別個のエピトープに、もしくは1つのエピトープ内の異なる領域に同時に結合することを可能にする構造的足場の上で対にされる。二重特異性体に関する一例では、1つのシステイン反復内の1つのエピトープに対して特異性を有するバインダー(binder)に由来する重鎖可変領域(VH)は、他の2つのシステイン反復のうちのいずれか内の第2のエピトープに対して特異性を有する一連のバインダーに由来する軽鎖可変領域(VL)と再結合されて、そのVHに対する元の特異性を破壊することなく、元のVHと対になり得る非コグネイト(non−cognate)VLパートナーを同定する。このようにして、単一のVLセグメント(例えば、VL1)は、2つの異なるVHドメイン(例えば、VH1およびVH2)と組み合わされて、2つの結合「アーム」(VH1−VL1およびVH2−VL1)から構成される二重特異性体を生成し得る。単一のVLセグメントの使用は、システムの複雑性を低減し、それによって、上記二重特異性体を生成するために使用されるクローニング、発現、および精製プロセスを単純化し、その効率を増大させる(例えば、USSN13/022759およびUS2010/0331527を参照のこと)。
あるいは、GFRα3および第2の標的(例えば、RETが挙げられるが、これらに限定されない)の両方を結合する抗体は、本明細書で記載される技術、もしくは当業者に公知の他の技術を使用して、二重特異性形式で調製され得る。細胞外に露出された別個のGFRα3領域に結合する抗体可変領域は、例えば、リガンド(アルテミン)、他のGFRα受容体上の関連部位、もしくはRETに結合する可変領域といっしょに連結されて、単一の結合分子内に二重の抗原特異性を付与する。GFRα3の個々のエピトープに対する特異性を有する種々の領域は、例えば、アルテミンに対する特異性を有する可変領域と組み合わされ、各可変領域が別個の抗原に結合することを可能にする構造的足場で対にされる。
上記二重特異性バインダーは、抗体に関して上記に記載されたアッセイのうちのいずれかで、標的抗原(例えば、GFRα3および/もしくはアルテミン)、他のGFRα受容体、またはRETの結合および機能的ブロックについて試験される。例えば、可溶性タンパク質結合を測定するための標準的方法は、その抗原との二重特異性相互作用を評価するために使用される(例えば、Biacore、ELISA、サイズ排除クロマトグラフィー、多角度レーザー光散乱、直接走査型熱量測定法、および他の方法)。GFRα3を発現する細胞への二重特異性抗体の結合は、細胞上の標的抗原を認識する蛍光標識二次抗体を使用して、フローサイトメトリーによって決定される。ペプチドでの結合実験もまた、表面プラズモン共鳴実験(ここで抗体へのペプチドのリアルタイム結合相互作用は、二重特異性体もしくはペプチドそれぞれが捕捉されるセンサー表面にわたってペプチドもしくは二重特異性体を流すことによって測定される)を使用して行われ得る。二重特異性体によるGFRα3受容体の機能的in vitroブロッキングは、任意のバイオアッセイ(例えば、本明細書で記載されるもの)を使用して、または適切な動物モデル(例えば、本明細書で記載されるもの)において疼痛に対する反応をin vivoで決定することによって、決定される。二重特異性体によるGFRα3もしくはそのリガンドアルテミンの機能的in vitroブロッキングは、任意のバイオアッセイ(例えば、WO2010/077854、もしくはUS2010/0166768に記載されるもの)を使用して、または適切な動物モデル(例えば、本明細書に記載されるもの)での熱刺激への過敏症をin vivoで決定することによって、決定される。
(実施例10.モノクローナル抗マウスGFRα3抗体の表面プラズモン共鳴によって導かれた結合親和性および反応速度論的定数)
抗マウスGFRα3抗体への抗原結合に関する結合の会合速度定数および解離速度定数(それぞれ、kaおよびkd)ならびに計算した平衡解離定数および解離半減期(それぞれ、KDおよびt1/2)を、25℃でリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー(Biacore 3000)アッセイを使用して決定した。抗体を、myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを伴って発現させたマウスGFRα3(mGFRα3−MMH;配列番号379)への結合について試験した。抗マウスGFRα3抗体を、Biacore
CM5センサーチップへの直接アミンカップリングによって作ったヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(GE Healthcare, # BR−1008−38)表面上に捕捉した。反応速度論的実験を、泳動緩衝液およびサンプル緩衝液の両方としてHBS−EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% サーファクタントP20、pH7.4)を使用して行った。マウスGFRα3−MMHへの結合を、捕捉抗体表面にわたって100nM〜6.25nM(2倍希釈)の範囲に及ぶいくつかの濃度を注入することによって評価した。抗体−抗原会合を、最大5分間にわたってモニターした一方で、緩衝液中での解離は、最大10分間にわたってモニターした。反応速度論的会合速度定数(ka)および解離速度定数(kd)を、データを処理しScrubber 2.0c曲線適合ソフトウェアを使用して、1:1結合モデルへと適合させることによって決定した。結合解離平衡定数(KD)および解離半減期(t1/2)を以下のとおり反応速度論的速度定数から計算した:KD(M)=kd/kaおよびt1/2(分)=[ln2/(60×kd)]。
抗マウスGFRα3抗体への抗原結合に関する結合の会合速度定数および解離速度定数(それぞれ、kaおよびkd)ならびに計算した平衡解離定数および解離半減期(それぞれ、KDおよびt1/2)を、25℃でリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー(Biacore 3000)アッセイを使用して決定した。抗体を、myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを伴って発現させたマウスGFRα3(mGFRα3−MMH;配列番号379)への結合について試験した。抗マウスGFRα3抗体を、Biacore
CM5センサーチップへの直接アミンカップリングによって作ったヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(GE Healthcare, # BR−1008−38)表面上に捕捉した。反応速度論的実験を、泳動緩衝液およびサンプル緩衝液の両方としてHBS−EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% サーファクタントP20、pH7.4)を使用して行った。マウスGFRα3−MMHへの結合を、捕捉抗体表面にわたって100nM〜6.25nM(2倍希釈)の範囲に及ぶいくつかの濃度を注入することによって評価した。抗体−抗原会合を、最大5分間にわたってモニターした一方で、緩衝液中での解離は、最大10分間にわたってモニターした。反応速度論的会合速度定数(ka)および解離速度定数(kd)を、データを処理しScrubber 2.0c曲線適合ソフトウェアを使用して、1:1結合モデルへと適合させることによって決定した。結合解離平衡定数(KD)および解離半減期(t1/2)を以下のとおり反応速度論的速度定数から計算した:KD(M)=kd/kaおよびt1/2(分)=[ln2/(60×kd)]。
表11に示されるように、2種の抗マウスGFRα3抗体(M1M6986NおよびM1M6977N)を試験したところ、それぞれ、23.1pMおよび107pMのKD値で、25℃でmGFRα3−MMHに結合した。
(実施例11.マウスGFRα3ブロックELISA)
抗マウスGFRα3抗体が共受容体マウスRETの存在下もしくは非存在下でマウスアルテミンへのマウスGFRα3結合をブロックする能力を、2つの異なるブロッキングELISA形式を使用して決定した。第1の形式では、組換えマウスアルテミン(R&D cat# 1085−AR/CF)タンパク質を、PBS緩衝液中で、96ウェルマイクロタイタープレートに2μg/mL(166nM)で一晩4℃において被覆し、次いで、0.5%(w/v) BSAの溶液でブロックした。一定量(3.5nM)の、C末端myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを有するビオチン化マウスGFRα3(ビオチン−mGFR□3−MMH,配列番号379)を、種々の量の抗体(連続希釈で100nM〜1.6pMの範囲に及ぶ)と予め混合し、続いて、室温(RT)で1時間インキュベートして、抗体−ビオチン−mGFRα3−MMH結合が平衡に達するようにした。次いで、平衡化したサンプル溶液を、mアルテミン被覆プレートに移した。1時間の結合の後、上記プレートを洗浄し、次いで、結合したビオチン−mGFRα3−MMHを、ストレプトアビジン−HRP(Pierce, #N200)を使用して検出し、比色シグナルを、TMB HRP基質(BD Biosciences, #51−2606KCおよび#51−2607KC)を使用して発色させた。吸光度を、Victor X5プレートリーダー(Perkin Elmer)で450nmにおいて記録して、プレートに被覆したmアルテミンに結合できた予め平衡化したビオチン−mGFRα3−MMH−抗体溶液中の遊離ビオチン−mGFRα3−MMHの量を決定した。IC50値(一定濃度のビオチン−mGFRα3−MMHからのシグナルを50%低減するために必要とされる抗体濃度と定義される)を、GraphPadのPrismソフトウェアを使用してデータから計算した。抗マウスGFRα3抗体の非存在下で一定量のビオチン−mGFRα3−MMHにおいて測定した吸光度は、0%ブロックと定義され、ビオチン−mGFRα3−MMH添加なしでの吸光度は、100%ブロックと定義される。最高抗体濃度を含むウェルで認められた吸光度を、表に示される最大ブロッキング%を計算するために使用した。結果を表12にまとめる。
抗マウスGFRα3抗体が共受容体マウスRETの存在下もしくは非存在下でマウスアルテミンへのマウスGFRα3結合をブロックする能力を、2つの異なるブロッキングELISA形式を使用して決定した。第1の形式では、組換えマウスアルテミン(R&D cat# 1085−AR/CF)タンパク質を、PBS緩衝液中で、96ウェルマイクロタイタープレートに2μg/mL(166nM)で一晩4℃において被覆し、次いで、0.5%(w/v) BSAの溶液でブロックした。一定量(3.5nM)の、C末端myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを有するビオチン化マウスGFRα3(ビオチン−mGFR□3−MMH,配列番号379)を、種々の量の抗体(連続希釈で100nM〜1.6pMの範囲に及ぶ)と予め混合し、続いて、室温(RT)で1時間インキュベートして、抗体−ビオチン−mGFRα3−MMH結合が平衡に達するようにした。次いで、平衡化したサンプル溶液を、mアルテミン被覆プレートに移した。1時間の結合の後、上記プレートを洗浄し、次いで、結合したビオチン−mGFRα3−MMHを、ストレプトアビジン−HRP(Pierce, #N200)を使用して検出し、比色シグナルを、TMB HRP基質(BD Biosciences, #51−2606KCおよび#51−2607KC)を使用して発色させた。吸光度を、Victor X5プレートリーダー(Perkin Elmer)で450nmにおいて記録して、プレートに被覆したmアルテミンに結合できた予め平衡化したビオチン−mGFRα3−MMH−抗体溶液中の遊離ビオチン−mGFRα3−MMHの量を決定した。IC50値(一定濃度のビオチン−mGFRα3−MMHからのシグナルを50%低減するために必要とされる抗体濃度と定義される)を、GraphPadのPrismソフトウェアを使用してデータから計算した。抗マウスGFRα3抗体の非存在下で一定量のビオチン−mGFRα3−MMHにおいて測定した吸光度は、0%ブロックと定義され、ビオチン−mGFRα3−MMH添加なしでの吸光度は、100%ブロックと定義される。最高抗体濃度を含むウェルで認められた吸光度を、表に示される最大ブロッキング%を計算するために使用した。結果を表12にまとめる。
第2のELISA形式では、プレート、サンプルおよびデータを、C末端hFcおよびヘキサヒスチジンタグを伴って発現させたマウスRET(mRET−hFc−6His;
R&D cat# 482−RT/CF)およびmアルテミン(R&D cat# 1085−AR/CF)の両方が、ブロッキングELISA実験のために被覆したことを除いて、第1の形式と同様に処理した。96ウェルマイクロタイタープレートを、PBS中の1.2μg/mL(100nM) mアルテミンおよび9.5μg/mL (100nM) mRET−hFc−6Hisタンパク質の混合物で4℃において一晩被覆し、次いで、0.5%(w/v) BSAの溶液でブロックした。一定量(350pM)の、ビオチン−mGFRα3−MMHを、種々の量の抗マウスGFRα3抗体(連続希釈で100nM〜1.6pMの範囲に及ぶ)と予め混合し、続いて、1時間室温でインキュベートして、抗体−ビオチン−mGFRα3−MMH結合が平衡に達するようにした。次いで、平衡に達したサンプルを、被覆したプレートに移した。1時間の結合の後、上記プレートを洗浄し、次いで、結合したビオチン−mGFRα3−MMHを、HRPコンジュゲートストレプトアビジンを使用して検出し、比色シグナルを、TMB HRP基質を使用して発色させた。各抗体によるIC50値および最大ブロッキングを表12に示す。
R&D cat# 482−RT/CF)およびmアルテミン(R&D cat# 1085−AR/CF)の両方が、ブロッキングELISA実験のために被覆したことを除いて、第1の形式と同様に処理した。96ウェルマイクロタイタープレートを、PBS中の1.2μg/mL(100nM) mアルテミンおよび9.5μg/mL (100nM) mRET−hFc−6Hisタンパク質の混合物で4℃において一晩被覆し、次いで、0.5%(w/v) BSAの溶液でブロックした。一定量(350pM)の、ビオチン−mGFRα3−MMHを、種々の量の抗マウスGFRα3抗体(連続希釈で100nM〜1.6pMの範囲に及ぶ)と予め混合し、続いて、1時間室温でインキュベートして、抗体−ビオチン−mGFRα3−MMH結合が平衡に達するようにした。次いで、平衡に達したサンプルを、被覆したプレートに移した。1時間の結合の後、上記プレートを洗浄し、次いで、結合したビオチン−mGFRα3−MMHを、HRPコンジュゲートストレプトアビジンを使用して検出し、比色シグナルを、TMB HRP基質を使用して発色させた。各抗体によるIC50値および最大ブロッキングを表12に示す。
表12に示されるように、試験した抗マウスGFRα3抗体のうち1つのみ(M1M6986N)が、69.1pMのIC50値で、ビオチン−mGFRα3−MMHを被覆mアルテミンプレートへの結合からブロックする能力を示した。試験した他の抗マウスGFRα3抗体(M1M6977N)は、このELISA形式では、測定可能なブロックを何ら示さなかった。試験した両方の抗マウスGFRα3抗体(M1M6986NおよびM1M6977N)は、それぞれ、47.2pMおよび366pMのIC50値で、ビオチン−mGFRα3−MMHをmアルテミンおよびmRET−hFc−6Hisの両方で被覆したプレートへの結合から完全にブロックする能力を示した。
(実施例12.細胞ベースのルシフェラーゼバイオアッセイ)
抗マウスGFRα3抗体がマウスGFRα3およびマウスRETの、そのリガンドマウスアルテミンによる活性化をin vitroでブロックする能力を、細胞ベースのアッセイを使用して決定した。マウスGFRα3(アクセッション番号AAH66202.1のアミノ酸1〜397)およびマウスRET(アクセッション番号NP_033076.2のアミノ酸1〜1115)の両方を安定して発現するように改変されたHEK293細胞を生成し、次いで、SRE応答性ルシフェラーゼレポーター(SRE−luc; Sabiosciences, CCS−010L)で形質導入した(293/mGFRα3/mRET/SRE−luc細胞)。
抗マウスGFRα3抗体がマウスGFRα3およびマウスRETの、そのリガンドマウスアルテミンによる活性化をin vitroでブロックする能力を、細胞ベースのアッセイを使用して決定した。マウスGFRα3(アクセッション番号AAH66202.1のアミノ酸1〜397)およびマウスRET(アクセッション番号NP_033076.2のアミノ酸1〜1115)の両方を安定して発現するように改変されたHEK293細胞を生成し、次いで、SRE応答性ルシフェラーゼレポーター(SRE−luc; Sabiosciences, CCS−010L)で形質導入した(293/mGFRα3/mRET/SRE−luc細胞)。
20,000個の293/mGFRα3/mRET/SRE−luc細胞を、0.5%
FBSを含むOptimem(GIBCO, #31985)の中でポリD−リジン被覆96ウェルプレート(Greiner, #35−4620)に播種し、次いで、37℃において5% CO2で一晩増殖させた。次いで、上記細胞を、3nM〜44nMの範囲に及ぶ抗マウスGFRα3抗体の連続希釈物とともに、1時間室温においてインキュベートした。一定用量(100pM)の、マウスアルテミン(R&D, # 1085−AR/CF)を、次いで上記細胞に添加し、さらに6時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、OneGlo試薬(Promega, #E6051)を添加した後に、Victorルミノメーター(Perkin Elmer)で相対光単位(RLU)として測定した。EC50値およびIC50値を、GraphPad Prismデータ分析ソフトウェアを使用して、12点応答曲線に対して4パラメーターロジスティック方程式から計算した。
FBSを含むOptimem(GIBCO, #31985)の中でポリD−リジン被覆96ウェルプレート(Greiner, #35−4620)に播種し、次いで、37℃において5% CO2で一晩増殖させた。次いで、上記細胞を、3nM〜44nMの範囲に及ぶ抗マウスGFRα3抗体の連続希釈物とともに、1時間室温においてインキュベートした。一定用量(100pM)の、マウスアルテミン(R&D, # 1085−AR/CF)を、次いで上記細胞に添加し、さらに6時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、OneGlo試薬(Promega, #E6051)を添加した後に、Victorルミノメーター(Perkin Elmer)で相対光単位(RLU)として測定した。EC50値およびIC50値を、GraphPad Prismデータ分析ソフトウェアを使用して、12点応答曲線に対して4パラメーターロジスティック方程式から計算した。
表13に示されるように、試験した両方の抗マウスGFRα3抗体(M1M6986NおよびM1M6977N)は、それぞれ、約44nMおよび3nMのIC50値で、293/mGFRα3/mRET/SRE−luc細胞のマウスアルテミン依存性刺激を阻害する能力を示した。
(実施例13、14および15:骨のがん疼痛および変形性関節症の疼痛の動物モデルにおける抗マウスGFRα3抗体の効果)
本明細書で記載される抗体は、アルテミンのGPI結合α受容体であるGFRα3に対する高親和性ヒト抗体である。ヒトGFRα3に対するこれら抗体は、マウスGFRα3と交差反応しないので、これら抗体でのin vivoアッセイは、マウスGFRα3配列をヒトGFRα3の配列で置換するように遺伝的に改変されたマウスでのみ行われうる。アルテミン感作カプサイシンの薬理学的阻害を使用して、これらGFRα3hu/huマウスにおける初期のin vivo実験から、このin vivoアッセイにおいて4種のヒト抗体の効力が明らかになった。効力データの生成を促進するために、マウスGFRα3抗体を、上記ヒト抗体の代わりとして作用するように生成した。内因性GFRα3遺伝子の欠失についてホモ接合性であるC57BL6/129Svミックス系統のマウスを、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞において発現された組換えマウスGFRα3細胞外ドメインで免疫した。GFRα3に対する特異的免疫応答を、上記免疫したマウス由来の血清のイムノアッセイによって確認した。高い特異的免疫応答を示すマウスから脾臓を集め、抗体生成ハイブリドーマ細胞を、標準的なハイブリドーマ手順に倣って、上記単離した脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合することによって生成した。ハイブリドーマ上清を、GFRα3への結合について、およびイムノアッセイ形式で固体表面に被覆したアルテミンもしくはアルテミン/RetのいずれかへのGFRα3の結合をブロックする上記上清の能力について、イムノアッセイでさらにスクリーニングした。上清をまた、それらが細胞ベースのバイオアッセイにおいて、上記GFRα3/Ret共受容体経路のアルテミン刺激をブロックする能力についてスクリーニングした。可変領域抗体配列を、抗体タンパク質が細胞ベースのアッセイにおいて強力なブロッキングを示した選択されたハイブリドーマクローンのPCR増幅によって得、これら配列を、マウスIgG1アイソタイプを伴う全長組換え抗マウスGFRα3抗体を生成するために使用した。2種の抗体を、細胞ベースのアッセイにおいてその強力に阻害したアルテミンシグナル伝達をin vivo試験するために選択した。上記in vitro結合イムノアッセイでは、抗体M1M6986Nは、固体表面に被覆したアルテミンもしくはアルテミン/Retの両方へのGFRα3の結合をブロックした。上記抗体M1M6986Nは、ここでは直接ブロッカーと言われる。抗体M1M6977Nは、被覆したアルテミン/RetへのGFRα3の結合をブロックしたが、上記in vitroイムノアッセイにおいてアルテミンのみへの結合をブロックしなかった。上記抗体M1M6977Nは、ここで間接ブロッカーと言われる。これら2種のマウス抗体M1M6986NおよびM1M6977Nを、アルテミン感作カプサイシン熱痛覚過敏モデル(実施例6に記載される)で試験するために選択した。なぜなら、これら2種の抗体は、効果的なヒト抗体に類似の結合プロフィールおよびブロッキングプロフィールを示したからである。これら2種の抗体を、これらが野生型マウスにおいて痛覚過敏症のアルテミン誘発性感作をin vivoでブロックする能力についてスクリーニングした。それらのヒト抗体対応物と同様に、両方の抗体が、カプサイシン注射の3日後に、カプサイシン熱痛覚過敏症に対するアルテミンの感作効果を有意に阻害した(図1)。
本明細書で記載される抗体は、アルテミンのGPI結合α受容体であるGFRα3に対する高親和性ヒト抗体である。ヒトGFRα3に対するこれら抗体は、マウスGFRα3と交差反応しないので、これら抗体でのin vivoアッセイは、マウスGFRα3配列をヒトGFRα3の配列で置換するように遺伝的に改変されたマウスでのみ行われうる。アルテミン感作カプサイシンの薬理学的阻害を使用して、これらGFRα3hu/huマウスにおける初期のin vivo実験から、このin vivoアッセイにおいて4種のヒト抗体の効力が明らかになった。効力データの生成を促進するために、マウスGFRα3抗体を、上記ヒト抗体の代わりとして作用するように生成した。内因性GFRα3遺伝子の欠失についてホモ接合性であるC57BL6/129Svミックス系統のマウスを、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞において発現された組換えマウスGFRα3細胞外ドメインで免疫した。GFRα3に対する特異的免疫応答を、上記免疫したマウス由来の血清のイムノアッセイによって確認した。高い特異的免疫応答を示すマウスから脾臓を集め、抗体生成ハイブリドーマ細胞を、標準的なハイブリドーマ手順に倣って、上記単離した脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合することによって生成した。ハイブリドーマ上清を、GFRα3への結合について、およびイムノアッセイ形式で固体表面に被覆したアルテミンもしくはアルテミン/RetのいずれかへのGFRα3の結合をブロックする上記上清の能力について、イムノアッセイでさらにスクリーニングした。上清をまた、それらが細胞ベースのバイオアッセイにおいて、上記GFRα3/Ret共受容体経路のアルテミン刺激をブロックする能力についてスクリーニングした。可変領域抗体配列を、抗体タンパク質が細胞ベースのアッセイにおいて強力なブロッキングを示した選択されたハイブリドーマクローンのPCR増幅によって得、これら配列を、マウスIgG1アイソタイプを伴う全長組換え抗マウスGFRα3抗体を生成するために使用した。2種の抗体を、細胞ベースのアッセイにおいてその強力に阻害したアルテミンシグナル伝達をin vivo試験するために選択した。上記in vitro結合イムノアッセイでは、抗体M1M6986Nは、固体表面に被覆したアルテミンもしくはアルテミン/Retの両方へのGFRα3の結合をブロックした。上記抗体M1M6986Nは、ここでは直接ブロッカーと言われる。抗体M1M6977Nは、被覆したアルテミン/RetへのGFRα3の結合をブロックしたが、上記in vitroイムノアッセイにおいてアルテミンのみへの結合をブロックしなかった。上記抗体M1M6977Nは、ここで間接ブロッカーと言われる。これら2種のマウス抗体M1M6986NおよびM1M6977Nを、アルテミン感作カプサイシン熱痛覚過敏モデル(実施例6に記載される)で試験するために選択した。なぜなら、これら2種の抗体は、効果的なヒト抗体に類似の結合プロフィールおよびブロッキングプロフィールを示したからである。これら2種の抗体を、これらが野生型マウスにおいて痛覚過敏症のアルテミン誘発性感作をin vivoでブロックする能力についてスクリーニングした。それらのヒト抗体対応物と同様に、両方の抗体が、カプサイシン注射の3日後に、カプサイシン熱痛覚過敏症に対するアルテミンの感作効果を有意に阻害した(図1)。
(実施例13:骨のがん疼痛の線維肉腫モデル)
(方法論)
(被験体)
C57Bl6バックグラウンド系統の成体雄性マウスを、約12週齢で2回の線維肉腫実験のために使用した。この実験についての結果データを測定する実験者は、データ収集、編集および分析の全体を通じて動物の処置群に対して盲検で行った。
(方法論)
(被験体)
C57Bl6バックグラウンド系統の成体雄性マウスを、約12週齢で2回の線維肉腫実験のために使用した。この実験についての結果データを測定する実験者は、データ収集、編集および分析の全体を通じて動物の処置群に対して盲検で行った。
(骨がんモデル)
骨のがん疼痛を誘発するために、上記マウスに麻酔をかけ、次いで、1.0×106 MC57G線維肉腫細胞を大腿部内に注射した。これら細胞は、C57Bl/6マウス線維肉腫腫瘍株に由来する。腫瘍は、典型的には、骨の破壊が腫瘍移植後14日目までに明らかになるほどにこのモデルで激しく増殖する。移植後7日目、10日目および14日目にX線写真を撮影して、腫瘍増殖および骨の破壊を確認した。骨の破壊を、0は破壊なしを表し、3は、腫瘍の領域における大腿骨の完全な破壊を表すものとして3点スケールでスコア付けした。
骨のがん疼痛を誘発するために、上記マウスに麻酔をかけ、次いで、1.0×106 MC57G線維肉腫細胞を大腿部内に注射した。これら細胞は、C57Bl/6マウス線維肉腫腫瘍株に由来する。腫瘍は、典型的には、骨の破壊が腫瘍移植後14日目までに明らかになるほどにこのモデルで激しく増殖する。移植後7日目、10日目および14日目にX線写真を撮影して、腫瘍増殖および骨の破壊を確認した。骨の破壊を、0は破壊なしを表し、3は、腫瘍の領域における大腿骨の完全な破壊を表すものとして3点スケールでスコア付けした。
(抗体処置)
各動物に、がん細胞移植の前日および7日目に再び投与した30mg/kg s.c.抗体注射を受けさせた。動物を2つもしくは3つの処置群のうちの1つに疑似無作為的に(pseudo−randomly)割り当てた:1)2回の別個の実験においてM2M180Nアイソタイプ(陰性)コントロール抗体、2)2回の別個の実験においてM1M6977N抗マウスGFRα3抗体、または3)2回目の実験のみにおいてM1M6986N抗マウスGFRα3抗体。M1M6986は、アルテミンのGFRα3との相互作用をブロックし、それによってアルテミンの作用の「直接」ブロッカーと考えられる。対照的に、M1M6977Nは、GFRα3/RET複合体を通じてアルテミンの作用を阻害し、従って、「間接」インヒビターと考えられる。
各動物に、がん細胞移植の前日および7日目に再び投与した30mg/kg s.c.抗体注射を受けさせた。動物を2つもしくは3つの処置群のうちの1つに疑似無作為的に(pseudo−randomly)割り当てた:1)2回の別個の実験においてM2M180Nアイソタイプ(陰性)コントロール抗体、2)2回の別個の実験においてM1M6977N抗マウスGFRα3抗体、または3)2回目の実験のみにおいてM1M6986N抗マウスGFRα3抗体。M1M6986は、アルテミンのGFRα3との相互作用をブロックし、それによってアルテミンの作用の「直接」ブロッカーと考えられる。対照的に、M1M6977Nは、GFRα3/RET複合体を通じてアルテミンの作用を阻害し、従って、「間接」インヒビターと考えられる。
(侵害受容の尺度)
骨腫瘍への侵害受容応答を、誘発性機械的(接触性)アロディニアについてはフォンフレイヘア(von Frey Hair)試験を、足で体重を支えようとしているかについては反応速度論的体重負荷(DWB)試験を、および防御行動(guarding behavior)を使用して測定した。フォンフレイ試験結果を、足を引っ込めるために必要な圧力のグラムとして表す。体重負荷結果を、同側足にかけられた体重の%として表す。防御行動を、2分間の期間に対して足を防御するのに費やした時間として表す。
骨腫瘍への侵害受容応答を、誘発性機械的(接触性)アロディニアについてはフォンフレイヘア(von Frey Hair)試験を、足で体重を支えようとしているかについては反応速度論的体重負荷(DWB)試験を、および防御行動(guarding behavior)を使用して測定した。フォンフレイ試験結果を、足を引っ込めるために必要な圧力のグラムとして表す。体重負荷結果を、同側足にかけられた体重の%として表す。防御行動を、2分間の期間に対して足を防御するのに費やした時間として表す。
(結果)
(骨の破壊)
いずれの実験でも骨の破壊スコアに対して抗体処置の有意な効果はなく、このことは、上記抗体処置が骨がん自体の重篤度に対して影響を有しなかったことを示唆する(データは示さず)。
(骨の破壊)
いずれの実験でも骨の破壊スコアに対して抗体処置の有意な効果はなく、このことは、上記抗体処置が骨がん自体の重篤度に対して影響を有しなかったことを示唆する(データは示さず)。
(侵害受容行動)
第1の実験では、線維肉腫注射後にGFRα3抗体処置をした接触性アロディニアにおいて統計的に有意な減少があり(F(1,20)=9.189、p=0.007、図2A)、第2の実験では、効力全体に対して統計的な傾向があった(F(2,29)=3.069、p<0.062、図2B)。個々の比較は、ときおり、第2の研究において有意性を達成した(図2B)。
第1の実験では、線維肉腫注射後にGFRα3抗体処置をした接触性アロディニアにおいて統計的に有意な減少があり(F(1,20)=9.189、p=0.007、図2A)、第2の実験では、効力全体に対して統計的な傾向があった(F(2,29)=3.069、p<0.062、図2B)。個々の比較は、ときおり、第2の研究において有意性を達成した(図2B)。
いずれの実験においても線維肉腫細胞の骨移植後14日目に測定した同側の足への反応速度論的体重負荷に対するGFRα3抗体の統計的に有意な効果はなかったが、第1の実験では、M1M6977N処置での効力に対して統計的傾向が明らかになった(t(10)=2.047、p=0.068、図3A;F(2,28)=1.598、p=0.220、図3B)。
GFRα3抗体は、両方の線維肉腫実験において骨がんを移植した後に、足の防御を有意に減少させた(F(1,20)=12.270、p=0.002、図4A;F(2,29)=3.576、p=0.041、図4B)。
(結論)
抗マウスGFRα3抗体での処置は、接触性アロディニアの防御およびフォンフレイ試験の評価によって測定した場合、この骨のがん疼痛モデルにおいて侵害受容性行動を有意に減少させた。さらに、1つの実験の体重負荷差異では、M1M6977N抗体の効力に対して統計的傾向があった。骨の破壊スコアは、抗マウスGFRα3抗体を受容する群で異ならなかった。このことは、疼痛関連尺度における差異が、がんの重篤度における差異によって説明できなかったことを示唆する。従って、本発明者らのデータは、GFRα3に対する中和抗体が、骨のがん疼痛に対して有効であり得ることを示唆する。肉腫細胞は、骨での転移より原発性腫瘍がより頻度が高く、大部分の骨がんは、他の部位由来の原発性腫瘍の転移からくるので、これら抗体を乳(***)癌誘発性の骨がん疼痛のモデルでも試験した。骨へ転移することが見いだされた最も一般的な腫瘍の中に、***腫瘍および前立腺腫瘍がある。
抗マウスGFRα3抗体での処置は、接触性アロディニアの防御およびフォンフレイ試験の評価によって測定した場合、この骨のがん疼痛モデルにおいて侵害受容性行動を有意に減少させた。さらに、1つの実験の体重負荷差異では、M1M6977N抗体の効力に対して統計的傾向があった。骨の破壊スコアは、抗マウスGFRα3抗体を受容する群で異ならなかった。このことは、疼痛関連尺度における差異が、がんの重篤度における差異によって説明できなかったことを示唆する。従って、本発明者らのデータは、GFRα3に対する中和抗体が、骨のがん疼痛に対して有効であり得ることを示唆する。肉腫細胞は、骨での転移より原発性腫瘍がより頻度が高く、大部分の骨がんは、他の部位由来の原発性腫瘍の転移からくるので、これら抗体を乳(***)癌誘発性の骨がん疼痛のモデルでも試験した。骨へ転移することが見いだされた最も一般的な腫瘍の中に、***腫瘍および前立腺腫瘍がある。
(実施例14:骨のがん疼痛の乳癌モデル)
(方法論)
(被験体)
Balb/cバックグラウンド系統の成体の雄性マウスを、約12週齢で乳癌由来骨がん(mammary carcinoma bone cancer)実験に使用した。この実験の結果データを測定する実験者は、データ収集、編集、および分析全体を通じて、動物の処置群に対して盲検で行った。
(方法論)
(被験体)
Balb/cバックグラウンド系統の成体の雄性マウスを、約12週齢で乳癌由来骨がん(mammary carcinoma bone cancer)実験に使用した。この実験の結果データを測定する実験者は、データ収集、編集、および分析全体を通じて、動物の処置群に対して盲検で行った。
(骨がんモデル)
骨のがん疼痛を誘発するために、上記マウスに麻酔をかけ、次いで、10,000 4T−1乳癌細胞を大腿部内に注射した。これら細胞は、Balb/c乳癌腫瘍株に由来する。腫瘍は、典型的には、注射後18日目までに腫瘍が重篤になるほどにこのモデルにおいて激しく増殖する。移植後10日目、14日目および19日目にX線写真を撮影して、腫瘍増殖および骨の破壊を確認した。骨の破壊を、0は破壊なしを表し、3は、腫瘍の領域における大腿骨の完全な破壊を表すものとして3点スケールでスコア付けした。
骨のがん疼痛を誘発するために、上記マウスに麻酔をかけ、次いで、10,000 4T−1乳癌細胞を大腿部内に注射した。これら細胞は、Balb/c乳癌腫瘍株に由来する。腫瘍は、典型的には、注射後18日目までに腫瘍が重篤になるほどにこのモデルにおいて激しく増殖する。移植後10日目、14日目および19日目にX線写真を撮影して、腫瘍増殖および骨の破壊を確認した。骨の破壊を、0は破壊なしを表し、3は、腫瘍の領域における大腿骨の完全な破壊を表すものとして3点スケールでスコア付けした。
(抗体処置)
各動物に、がん細胞移植の前日およびその後1週間につき2回投与した30mg/kg
s.c.抗体注射を受けさせた。動物を3つの処置群のうちの1つに疑似無作為的に(pseudo−randomly)割り当てた:1)M2M180Nアイソタイプ(陰性)コントロール抗体、2)M1M6977N抗マウスGFRα3抗体、もしくは3)M1M6986N抗マウスGFRα3抗体。M1M6986Nは、アルテミンのGFRα3との相互作用をブロックし、それによって、アルテミンの作用の「直接」ブロッカーと考えられる。対照的に、M1M6977Nは、GFRα3/RET複合体を介してアルテミンの作用を阻害し、従って、「間接」インヒビターと考えられる。
各動物に、がん細胞移植の前日およびその後1週間につき2回投与した30mg/kg
s.c.抗体注射を受けさせた。動物を3つの処置群のうちの1つに疑似無作為的に(pseudo−randomly)割り当てた:1)M2M180Nアイソタイプ(陰性)コントロール抗体、2)M1M6977N抗マウスGFRα3抗体、もしくは3)M1M6986N抗マウスGFRα3抗体。M1M6986Nは、アルテミンのGFRα3との相互作用をブロックし、それによって、アルテミンの作用の「直接」ブロッカーと考えられる。対照的に、M1M6977Nは、GFRα3/RET複合体を介してアルテミンの作用を阻害し、従って、「間接」インヒビターと考えられる。
(侵害受容の尺度)
骨腫瘍への侵害受容応答を、誘発性機械的(接触性)アロディニアについてはフォンフレイヘア試験を、足で体重を支えようとしているかについては反応速度論的体重負荷(DWB)試験を、および防御行動(guarding behavior)を使用して測定した。フォンフレイ試験結果を、足を引っ込めるために必要な圧力のグラムとして表す。体重負荷結果を、同側足にかけられた体重の%として表す。防御行動を、2分間の期間にわたって足を防御するのに費やした時間として表す。
骨腫瘍への侵害受容応答を、誘発性機械的(接触性)アロディニアについてはフォンフレイヘア試験を、足で体重を支えようとしているかについては反応速度論的体重負荷(DWB)試験を、および防御行動(guarding behavior)を使用して測定した。フォンフレイ試験結果を、足を引っ込めるために必要な圧力のグラムとして表す。体重負荷結果を、同側足にかけられた体重の%として表す。防御行動を、2分間の期間にわたって足を防御するのに費やした時間として表す。
(結果)
(骨の破壊)
このモデルでは、骨の破壊スコアに対して抗体処置の有意な効果はなかった。このことは、上記抗体処置が骨がん自体の重篤度に対して影響を有しなかったことを示唆する。
(骨の破壊)
このモデルでは、骨の破壊スコアに対して抗体処置の有意な効果はなかった。このことは、上記抗体処置が骨がん自体の重篤度に対して影響を有しなかったことを示唆する。
(侵害受容行動)
癌の後にGFRα3抗体処置をした接触性アロディニアにおいて統計的に有意な減少があった(F(2,25)=8.626、p=0.001、図5)。
癌の後にGFRα3抗体処置をした接触性アロディニアにおいて統計的に有意な減少があった(F(2,25)=8.626、p=0.001、図5)。
同側足への反応速度論的体重負荷に対するGFRα3抗体の統計的に有意な全体的な効果はなかったが、処置の全体的な効果は、統計学的傾向を達成し、M1M6977Nは、骨に癌細胞を移植して後11日で、事後比較で有意な効果を達成した(A)が、18日では達成しなかった(B)。(11日 F(2,25)=2.939、p=0.071、図6A;18日 F(2,25)=0.149、p=0.862、図6B)。
GFRα3抗体は、このモデルにおいて骨がん移植後に足防御を有意に減少させた(F(2,25)=4.222、p=0.026、図7)。
(結論)
抗マウスGFRα3抗体での処置は、接触性アロディニアの防御およびフォンフレイ試験の評価によって測定したところ、この骨のがん疼痛モデルにおいて侵害受容性行動を有意に減少させた。さらに、1つの時点での体重負荷差異では、REGN1967抗体の有効性が証明された。骨の破壊スコアは、抗マウスGFRα3抗体を受容する群で異ならなかった。このことは、疼痛関連尺度における差異が、がんの重篤度における差異によって説明できなかったことを示唆する。従って、本発明者らのデータは、GFRα3に対する中和抗体が、転移した骨のがん疼痛のこのモデルにおける骨のがん疼痛に対して有効であり得ることを示唆する。
抗マウスGFRα3抗体での処置は、接触性アロディニアの防御およびフォンフレイ試験の評価によって測定したところ、この骨のがん疼痛モデルにおいて侵害受容性行動を有意に減少させた。さらに、1つの時点での体重負荷差異では、REGN1967抗体の有効性が証明された。骨の破壊スコアは、抗マウスGFRα3抗体を受容する群で異ならなかった。このことは、疼痛関連尺度における差異が、がんの重篤度における差異によって説明できなかったことを示唆する。従って、本発明者らのデータは、GFRα3に対する中和抗体が、転移した骨のがん疼痛のこのモデルにおける骨のがん疼痛に対して有効であり得ることを示唆する。
(実施例15.変形骨関節症の疼痛方法論の内側半月動揺(DMM)モデル)
(被験体)
C57Bl6バックグラウンド系統の成体の雄性マウスを、約12週齢で開始するDMM実験のために使用した。この実験の結果データを測定する実験者は、データ収集、編集、および分析全体を通じて、動物の処置群に対して盲検で行った。
(被験体)
C57Bl6バックグラウンド系統の成体の雄性マウスを、約12週齢で開始するDMM実験のために使用した。この実験の結果データを測定する実験者は、データ収集、編集、および分析全体を通じて、動物の処置群に対して盲検で行った。
(DMMモデル)
DMMモデルでは、一方の膝の内側半月を動揺させ、上記動物に16週間にわたって疾患を発症させる。16週間の期間の間に、動物は、接触性アロディニア、初期のヒト変形性関節症に似た損傷した膝における骨体積の増大および骨ミネラル含有量を発生させる。接触性アロディニアを、抗体処置を開始する16週間前にフォンフレイ試験によって動物で確認した。
DMMモデルでは、一方の膝の内側半月を動揺させ、上記動物に16週間にわたって疾患を発症させる。16週間の期間の間に、動物は、接触性アロディニア、初期のヒト変形性関節症に似た損傷した膝における骨体積の増大および骨ミネラル含有量を発生させる。接触性アロディニアを、抗体処置を開始する16週間前にフォンフレイ試験によって動物で確認した。
(抗体処置)
各動物に、DMM手術の16週間後に開始して1週間に1回投与された30mg/kg
s.c.抗体注射を受けさせた。動物を3つの処置群のうちの1つの疑似無作為的に割り当てた:1)M2M180Nアイソタイプ(陰性)コントロール抗体、2)M1M6977N抗マウスGFRα3抗体、もしくは3)M1M6986N抗マウスGFRα3抗体。M1M6986Nは、アルテミンのGFRα3との相互作用をブロックし、それによって、アルテミンの作用の「直接」ブロッカーと考えられる。対照的に、M1M6977Nは、GFRα3/RET複合体を介してアルテミンの作用を阻害し、従って、「間接」インヒビターと考えられる。
各動物に、DMM手術の16週間後に開始して1週間に1回投与された30mg/kg
s.c.抗体注射を受けさせた。動物を3つの処置群のうちの1つの疑似無作為的に割り当てた:1)M2M180Nアイソタイプ(陰性)コントロール抗体、2)M1M6977N抗マウスGFRα3抗体、もしくは3)M1M6986N抗マウスGFRα3抗体。M1M6986Nは、アルテミンのGFRα3との相互作用をブロックし、それによって、アルテミンの作用の「直接」ブロッカーと考えられる。対照的に、M1M6977Nは、GFRα3/RET複合体を介してアルテミンの作用を阻害し、従って、「間接」インヒビターと考えられる。
(侵害受容の尺度)
膝の病状への侵害受容応答を、誘発性機械的(接触性)アロディニアについてフォンフレイヘア試験を使用して測定した。
膝の病状への侵害受容応答を、誘発性機械的(接触性)アロディニアについてフォンフレイヘア試験を使用して測定した。
(結果)
(侵害受容行動)
DMMの後にGFRα3抗体処置をした接触性アロディニアにおいて統計的に有意な減少があった(F(2,27)=21.68、p=0.0001、図8)。
(侵害受容行動)
DMMの後にGFRα3抗体処置をした接触性アロディニアにおいて統計的に有意な減少があった(F(2,27)=21.68、p=0.0001、図8)。
(結論)
マウスGFRα3抗体での処置は、接触性アロディニアに対する統計的に有意な効果を有した。その結果、上記2種のGFRα3抗体で処置した群が、1週間に1回の処置の開始の14日後に始めてアイソタイプコントロールより少ないアロディニアを一貫して示した。これらデータは、GFRα3抗体が慢性ヒト変形性関節症疼痛に対して有効であるという可能性を示唆する。
マウスGFRα3抗体での処置は、接触性アロディニアに対する統計的に有意な効果を有した。その結果、上記2種のGFRα3抗体で処置した群が、1週間に1回の処置の開始の14日後に始めてアイソタイプコントロールより少ないアロディニアを一貫して示した。これらデータは、GFRα3抗体が慢性ヒト変形性関節症疼痛に対して有効であるという可能性を示唆する。
(実施例16.抗GFRα3抗体の交差競合分析)
交差競合アッセイを、Octet RED384バイオセンサー(Fortebio Inc.)を使用して、ヒトGFRα3への結合について互いと競合するように抗体を選択する能力を評価するために行った。実験全体を、Octet HBST緩衝液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%
v/v サーファクタントP20、0.1mg/mL BSA)中で、25℃において流速1000rpmで行った。2種の抗体が、C末端myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを伴って発現させたビオチン化組換えヒトGFRα3(ビオチン−hGFRα3−mmH;配列番号370)上のそれらそれぞれのエピトープへの結合について互いと競合し得るか否かを評価するために、ビオチン−hGFRα3−mmHの10μg/mL溶液の中にチップを1分間浸漬することによって、約1.2nmのビオチン−hGFRα3−mmHをストレプトアビジン被覆Octetセンサーチップ(Fortebio Inc,
# 18−5019)上に最初に捕捉した。次いで、上記抗原被覆センサーチップを、第1の抗GFRα3モノクローナル抗体の25μg/mL溶液を含むウェルの中に4分間入れて、上記ビオチン−hGFRα3−mmH表面を飽和させた。次いで、上記センサーチップを、第2の抗GFRα3モノクローナル抗体の25μg/mL溶液を含むウェルにその後浸漬した。上記センサーチップを、実験の各工程の間に、Octet HBST緩衝液中で洗浄した。リアルタイム結合応答を実験の経過の間にモニターし、あらゆる工程の最後での結合応答を、図9に示されるように記録した。第1の抗体と予め複合体化したビオチン−hGFRα3−mmHへのmAb−2結合の応答を比較し、異なる抗GFRα3モノクローナル抗体の競合/非競合挙動を決定した。
交差競合アッセイを、Octet RED384バイオセンサー(Fortebio Inc.)を使用して、ヒトGFRα3への結合について互いと競合するように抗体を選択する能力を評価するために行った。実験全体を、Octet HBST緩衝液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%
v/v サーファクタントP20、0.1mg/mL BSA)中で、25℃において流速1000rpmで行った。2種の抗体が、C末端myc−myc−ヘキサヒスチジンタグを伴って発現させたビオチン化組換えヒトGFRα3(ビオチン−hGFRα3−mmH;配列番号370)上のそれらそれぞれのエピトープへの結合について互いと競合し得るか否かを評価するために、ビオチン−hGFRα3−mmHの10μg/mL溶液の中にチップを1分間浸漬することによって、約1.2nmのビオチン−hGFRα3−mmHをストレプトアビジン被覆Octetセンサーチップ(Fortebio Inc,
# 18−5019)上に最初に捕捉した。次いで、上記抗原被覆センサーチップを、第1の抗GFRα3モノクローナル抗体の25μg/mL溶液を含むウェルの中に4分間入れて、上記ビオチン−hGFRα3−mmH表面を飽和させた。次いで、上記センサーチップを、第2の抗GFRα3モノクローナル抗体の25μg/mL溶液を含むウェルにその後浸漬した。上記センサーチップを、実験の各工程の間に、Octet HBST緩衝液中で洗浄した。リアルタイム結合応答を実験の経過の間にモニターし、あらゆる工程の最後での結合応答を、図9に示されるように記録した。第1の抗体と予め複合体化したビオチン−hGFRα3−mmHへのmAb−2結合の応答を比較し、異なる抗GFRα3モノクローナル抗体の競合/非競合挙動を決定した。
図9に示されるように、黒字付きの濃い灰色のボックスは、自己競合に関する結合応答を表す。結合の順序とは無関係に、両方の方向で競合する抗体は、黒いボックスと白字で表される。別個の結合エピトープを示唆する抗体間で競合なしは、黒字つきの白いボックスで表される。
9種の抗体(H4H2236N3、H4H2342P、H4H2295S、H4H2294S、H4H2291S、H4H2357S、H4H2355S、H4H2296S、およびH4H2243N2)は、ビオチン−hGFRα3−mmHへの結合について互いと2方向性に競合する。上記9種のうちの8種(H4H2236N3、H4H2342P、H4H2295S、H4H2294S、H4H2291S、H4H2357S、H4H2355S、およびH4H2296S)が、試験したいかなる他の抗GFRα3抗体とも競合しない一方で、H4H2243N2はまた、試験された2種のさらなる抗GFRα3抗体(H4H2212NおよびH4H2352S)と2方向性に競合する。H4H2212NおよびH4H2352Sは、ビオチン−hGFRα3−mmHへの結合について互いと、およびH4H2243N2と2方向性に競合するが、その一方で、H4H2212Nは、試験したいかなる他の抗GFRα3抗体とも競合せず、H4H2352Sはまた、試験したさらなる抗GFRα3抗体(H4H2292S)と2方向性に競合する。試験した1種の抗GFRα3抗体であるH4H2350Pは、ビオチン−hGFRα3−mmHへの結合について試験した抗GFRα3抗体のうちのいずれとも競合しない。
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