TWI636063B

TWI636063B - 結合ｉｌ－２３之抗體

Info

Publication number: TWI636063B
Application number: TW103106335A
Authority: TW
Inventors: 凱瑟琳玻迪甘貝勒; 史都華威利斯布萊特; 丹尼爾史考特吉拉德; 克莉絲汀凱奇麗
Original assignee: 美國禮來大藥廠
Priority date: 2013-03-08
Filing date: 2014-02-25
Publication date: 2018-09-21
Also published as: US20170275356A1; FIC20230030I1; EP4311558A2; FR23C1036I1; EA201591368A1; CN105307681B; IL240731A0; TN2015000348A1; US9688753B2; UA123198C2; PE20151529A1; NZ711147A; HUE051357T2; ES2822662T3; EP2964258A1; ZA201505285B; LT2964258T; CL2015002388A1; EP4311558A3; CY1123589T1

Abstract

本發明提供一種結合人類IL-23之p19亞單位且以具有高親和力、選擇性及中和性質為特徵之抗體。該抗體可用於治療或預防選自由下列組成之群之自體免疫或發炎病症：多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、發炎性腸病、關節黏連性脊椎炎、移植物抗宿主病、狼瘡及代謝症候群。該抗體亦可用於治療癌症。

Description

結合IL-23之抗體

本發明係關於結合人類介白素-23(IL-23)之抗體及其用途。

介白素-23(IL-23)係由p19及p40亞單位組成之經二硫化物鍵聯的雜二聚物細胞介素。其係細胞介素之介白素-12(IL-12)家族之一部份。IL-12係70kDa之雜二聚物細胞介素，其係由經共價鍵聯的p40及p35亞單位組成。IL-12在發展保護性先天性及適應性免疫反應及腫瘤監測中起關鍵作用。IL-12亦透過其促進第一型輔助性T(Th1)反應之能力與發炎反應密切相關。然而，隨著相關的細胞介素IL-23之發現，已重新評估IL-12在發炎反應中之功能作用。IL-23係由與IL-12相同的p40亞單位組成，但與p19亞單位共價配對。其中許多用以評估IL-12作用之試劑係針對共有的IL-12/IL-23 p40亞單位，意味著先前歸於IL-12之活動可能係經由IL-23介導。IL-23缺陷小鼠之發展使研究者得以區分IL-12與IL-23之活動，並確定IL-23為自體免疫/發炎反應之基本介體。

功能性IL-23受體係IL-12Rβ1亞單位(與IL-12受體共有)及IL-23R亞單位之雜二聚物。IL-23之受體與詹納斯(Janus)激酶2(Jak2)在組成上有關，且主要活化STAT3，且STAT4活化作用不及IL-12。

IL-23受體係表現在活化/記憶T-細胞及自然殺手(NK)細胞上。單核細胞、巨噬細胞及樹突細胞亦低水平地表現IL-23受體。IL-23支持初始CD4+ T-細胞分化為稱為Th17細胞之新穎亞類細胞並加以維護，Th17細胞係不同於經典Th1及Th2細胞。Th17細胞可產生介白素-17A(IL-17A)及介白素-17F(IL-17F)。Th17細胞產生一系列已知可驅動發炎反應之其他因子，包括已知可驅動發炎反應之腫瘤壞死因子(包括腫瘤壞死因子α(TNF-α))、介白素-6(IL-6)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、CXCL1及CCL20。NK細胞及先天性淋巴細胞(諸如淋巴組織誘導(LTi)樣細胞)表現IL-23受體及視黃酸相關孤兒受體(ROR)γ並響應IL-23而產生IL-17。IL-1β及IL-23亦共同刺激γ-δ T細胞，以在無T細胞受體結合下誘導產生IL-17。

有實質性證據表明IL-23應答細胞與自體免疫發炎性疾病及癌症有關。特定言之，IL-23特異性抑制劑(亦即抑制IL-23但不抑制IL-12之抑制劑)將係尤其有益，因為據假設，抑制IL-23而不影響IL-12可使治療益處最大化，且同時使抑制宿主防禦之風險最小化。

特異性結合IL-23之p19亞單位之抗體係潛在有效抑制劑，參見(例如)WO 2007/024846及WO 2007/027714。WO 2007/024846中所揭示的抗體存在的問題至少係可能產生組織交叉反應性，特定言之，可能結合視網膜組織，此關係到安全問題。此外，WO 2007/024846中所揭示的抗體至少具有次佳物理-化學性質(例如，導致聚集之極端疏水性)，此對以工業規模生產該等抗體造成顯著障礙。此外，尚未批准任何以IL-23之p19亞單位為標靶之抗體用於治療用途。

因此，仍需要IL-23抗體。特定言之，仍需要以高親和力結合IL-23(特定言之，人類IL-23)之p19亞單位，且不結合相關細胞介素家族成員(IL-12)之p40亞單位之IL-23抗體。更特定言之，仍需要以高親和力結合IL-23之p19亞單位，且不顯著展現組織交叉反應性(特定言之，視網膜組織交叉反應性)之IL-23抗體。亦需要具有促進開發、製造或調配之醫藥上可接受的物理-化學性質之IL-23抗體。

本發明提供一種結合人類IL-23之p19亞單位之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)，且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含胺基酸序列LCDR1、LCDR2及 LCDR3，且該HCVR包含胺基酸序列HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中LCDR1係SEQ ID NO：4，LCDR2係SEQ ID NO：5，LCDR3係SEQ ID NO：6，HCDR1係SEQ ID NO：1，HCDR2係SEQ ID NO：2，且HCDR3係SEQ ID NO：3。

在本發明之一實施例中，該抗體包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)，且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR之胺基酸序列係SEQ ID NO：8，且該HCVR之胺基酸序列係SEQ ID NO：7。

在本發明之另一實施例中，該抗體包含兩個輕鏈可變區(LCVR)及兩個重鏈可變區(HCVR)，其中各LCVR之胺基酸序列係SEQ ID NO：8，且各HCVR之胺基酸序列係SEQ ID NO：7。

在本發明之又一實施例中，該抗體包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：10，且該重鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：9。

在本發明之又一實施例中，該抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：10，且各重鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：9。

下文提供本發明抗體之胺基酸序列。

SEQ ID編號

本發明亦提供一種結合人類IL-23之p19亞單位之SEQ ID NO：15 之胺基酸位置81-99及115-140內之構型抗原決定基之抗體。

本發明亦提供一種結合人類IL-23之p19亞單位之SEQ ID NO：15之胺基酸位置81-99及115-140內之構型抗原決定基之抗體，其中該抗體至少接觸SEQ ID NO：15之胺基酸殘基94P、95S、97L、98P、99D、123W、130S、133P及137W。

在本發明之另一實施例中，該抗體對人類IL-23之p19亞單位具選擇性。

當結合至人類IL-23之p19亞單位時，本發明抗體可防止人類IL-23結合IL-23受體之IL-23亞單位。因此，本發明抗體可抑制人類IL-23在IL-23受體之人類IL-23亞單位處之活性。

本發明抗體並不防止人類IL-23結合IL-23受體之IL-12Rβ1亞單位，且因此不抑制人類IL-23在IL-23受體之IL-12Rβ1亞單位處之活性。

該抗體不會明顯地結合人類IL-23與人類IL-12所共有的p40亞單位。

在本發明之又一實施例中，該抗體對人類IL-23之p19亞單位具有中和活性。

在本發明之又一實施例中，本發明抗體具有小於或等於約90pM之IC₅₀。較佳地，本發明抗體具有小於或等於約74pM之IC₅₀。IC₅₀值係在如描述在實例1中標題為「於小鼠脾細胞中抗體I對人類或食蟹猴IL-23之活體外中和作用」之部份中之活體外小鼠脾細胞分析中測得。

在本發明之又一實施例中，本發明抗體具有選擇性，且對人類IL-23之p19亞單位具有中和活性。

在本發明之又一實施例中，本發明抗體針對人類IL-23之解離平衡常數(K_D)為約10pM至約30pM。較佳地，本發明抗體針對人類IL- 23之K_D為約21pM。K_D值係如實例1中標題為「藉由表面電漿子共振(BIAcore)測量抗體I之結合親和力」之部份所述，在37℃下藉由結合動力學確定。本發明抗體之其他特徵係對人類IL-23之p19亞單位之k_on速率係約2.2 x 10⁶M^-1sec^-1至約2.6 x 10⁶M^-1sec^-1。較佳地，本發明抗體對人類IL-23之p19亞單位之k_on速率係約2.43 x 10⁶M^-1sec^-1。本發明抗體之其他特徵係對人類IL-23之p19亞單位之k_off速率係約0.30 x 10^-4sec^-1至約0.70 x 10^-4sec^-1為特徵。較佳地，本發明抗體對人類IL-23之p19亞單位之k_off速率係約0.52 x 10^-4sec^-1。

本發明抗體以高親和力結合人類IL-23之p19亞單位。出於本發明之目的，術語「高親和力」係指K_D為至少約21pM。K_D值係如實例1中標題為「藉由表面電漿子共振(BIAcore)測量抗體I之結合親和力」之部份所述，在37℃下藉由結合動力學確定。

與某些結合人類IL-23之先前技術抗體不同，本發明抗體不會顯著展現組織交叉反應性。特定言之，本發明抗體不會顯著地結合視網膜組織。

本發明抗體具有醫藥上可接受的物理-化學性質，包括生理及實驗室條件下之醫藥上可接受的溶解度及醫藥上可接受的化學及物理安定性，其中在一系列如實例1中標題為「IL-23抗體之物理-化學性質」之部份中所述之條件下，該抗體仍呈單體形式，且觀察到極少高分子量(HMW)聚集物。

本發明另外提供醫藥組合物，其包含本發明抗體及一或多種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。更特定言之，本發明醫藥組合物另外包含一或多種其他治療劑。

本發明亦提供一種治療或預防患者之病症之方法，其包括向有此需要之患者投與有效量之本發明抗體，其中該病症係選自由下列組成之群之自體免疫或發炎性病症：多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、發炎性腸病、關節黏連性脊椎炎、移植物抗宿主病、狼瘡及代謝症候群。

本發明亦提供一種治療或預防患者之病症之方法，其包括向有此需要之患者投與有效量之本發明抗體，其中該病症係癌症。

本發明亦提供用於治療之本發明抗體。

更特定言之，本發明提供用於治療或預防選自由下列組成之群之自體免疫或發炎性病症之本發明抗體：多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、發炎性腸病、關節黏連性脊椎炎、移植物抗宿主病、狼瘡及代謝症候群。

本發明亦提供用於治療或預防癌症之本發明抗體。

本發明提供一種本發明抗體於製造用以治療或預防選自由下列組成之群之病症之藥劑的用途：多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、發炎性腸病、關節黏連性脊椎炎、移植物抗宿主病、狼瘡及代謝症候群。

本發明亦提供一種本發明抗體於製造用以治療或預防癌症之藥劑之用途。

本發明亦係關於編碼上述本發明抗體之多核苷酸。

在一實施例中，本發明提供一種編碼本發明抗體之多核苷酸，其中HCVR係由SEQ ID NO：11編碼，且LCVR係由SEQ ID NO：12編碼。

在另一實施例中，本發明提供一種編碼本發明抗體之多核苷酸，其中重鏈係由SEQ ID NO：13編碼，且輕鏈係由SEQ ID NO：14編碼。

本發明多核苷酸可呈RNA形式或呈DNA形式，其中DNA包括cDNA及合成DNA。DNA可係雙股或單股。編碼本發明抗體之編碼序列可因遺傳密碼之冗餘性或簡併性而有所不同。

編碼本發明抗體之多核苷酸可包括以下：僅有對應於該抗體之編碼序列；對應於該抗體之編碼序列及其他編碼序列(諸如前導或分泌序列或前蛋白序列)；對應於該抗體之編碼序列及非編碼序列(諸如對應於蛋白質之編碼序列之內含子或非編碼序列5’及/或3’)。因此，術語「編碼抗體之多核苷酸」涵蓋不僅可包含對應於蛋白質之編碼序列之多核苷酸，且亦涵蓋包含其他編碼及/或非編碼序列之多核苷酸。

本發明多核苷酸將在該等序列已以可操作方式與表現控制序列連結後於宿主細胞中表現。表現載體通常可在宿主有機體中作為附加體或作為宿主染色體DNA之組成部份複製。通常，表現載體將包含選擇標記(例如，四環素、新黴素及二氫葉酸還原酶)，以允許檢測彼等經所需DNA序列轉形的細胞。

本發明抗體可輕易地在哺乳動物細胞(諸如CHO、NS0、HEK293或COS細胞)、細菌細胞(諸如大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)或螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescence))或真菌或酵母細胞中生產。該等宿主細胞係利用此項技術中所熟知的技術來培養。

含有受關注多核苷酸序列(例如，編碼抗體之多肽之多核苷酸及表現控制序列)之載體可藉由眾所周知的方法轉移至宿主細胞中，該等方法係根據細胞宿主之類型而有所不同。例如，原核細胞常採用氯化鈣轉形，而其他細胞宿主可使用磷酸鈣處理或電穿孔法。

可使用各種蛋白質純化方法，且此等方法係此項技術中所已知，並描述在(例如)Deutscher,Methods in Enzymology 182：83-89(1990)及Scopes,Protein Purification：Principles and Practice，第3版Springer,NY(1994)中。

另外，本發明提供一種製造可結合人類IL-23之p19亞單位且具有重鏈及輕鏈之抗體之方法，其中該重鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO： 9，且該輕鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：10，該方法包括以下步驟：a)在可表現該等多肽序列之條件下培養重組宿主細胞，其包含編碼由SEQ ID NO：9指定之多肽序列之第一多核苷酸序列及編碼由SEQ ID NO：10指定之多肽序列之第二多核苷酸序列；及b)自該宿主細胞回收包含重鏈及輕鏈之抗體，其中該重鏈之多肽序列係由SEQ ID NO：9指定，且該輕鏈之多肽序列係由SEQ ID NO：10指定。

在上述方法之一實施例中，該編碼由SEQ ID NO：9指定之多肽序列之第一多核苷酸序列及該編碼由SEQ ID NO：10指定之多肽序列之第二多核苷酸序列係相同核苷酸分子之一部份。

在一實施例中，本發明提供一種藉由上述方法生產之抗體。

在另一實施例中，該藉由上述方法生產之抗體具有兩條重鏈及兩條輕鏈，其中各重鏈之多肽序列係由SEQ ID NO：9指定，且各輕鏈之多肽序列係由SEQ ID NO：10指定。

本發明抗體係IgG型抗體，且具有四條經由鏈內及鏈間二硫鍵交聯之胺基酸鏈(兩條「重」鏈及兩條「輕」鏈)。當在某些生物系統中表現時，具有人類天然Fc序列之抗體之Fc區域係經糖化。抗體亦可在其他位置經糖化。

各重鏈係由N-端HCVR及重鏈恆定區(「HCCR」)組成。人類重鏈被分為γ、μ、α、δ或ε，並將抗體之同型物分別定義為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。人類IgG抗體可進一步劃分為亞類，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄。

較佳地，本發明抗體包含源自人類IgG₄ Fc區域之Fc部份，因為參與Fc受體所介導的發炎機制或激活補體之能力下降導致效應子功能減弱。

更佳地，本發明抗體含有IgG₄-PAA Fc部份。IgG₄-PAA Fc部份在位置223上之絲胺酸突變為脯胺酸(S223P；SEQ ID NO：9)，在位置229上之***酸突變為丙胺酸(F229A；SEQ ID NO：9)，且在位置230上之白胺酸之突變為丙胺酸(L230A；SEQ ID NO：9)。該S223P突變係鉸鏈突變，其可防止形成半抗體(IgG₄抗體中之半分子發生動態交換之現象)。F229A及L230A突變進一步減弱人類IgG₄同型物之業已較低的效應子功能。

各重鏈類型亦係以具有此項技術中所熟知的序列之特定恆定區為特徵。就IgG而言，重鏈恆定區係由三個結構域(CH1、CH2及CH3)組成。

輕鏈被分類為κ或λ，其等各以此項技術中已知的特定恆定區為特徵。各輕鏈係由LCVR及輕鏈恆定區(「LCCR」)組成。較佳地，本發明抗體包含κ輕鏈。

各輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點。該等HCVR及LCVR區可進一步細分為具有超可變性之區域(稱為互補決定區(「CDR」))，其散佈有較保守區域(稱為框架區(「FR」))。各HCVR及LCVR係由三個CDR及四個FR組成，其等係以如下次序自胺基末端排列至羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。此處，重鏈之三個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」，且輕鏈之三個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」。該等CDR含有大多數與抗原形成特異性相互作用之殘基。當前存在三種用於抗體之CDR分配之系統，其等係用於序列描述。Kabat CDR定義(Kabat等人，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))係基於抗體序列可變性。Chothia CDR定義(Chothia等人，「Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins」,Journal of Molecular Biology,196,901-917(1987)；Al-Lazikani等人，「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins」,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))係基於抗體之三維結構及CDR環之拓撲結構。除HCDR1及HCDR2以外，Chothia CDR定義係與Kabat CDR定義相同。North CDR定義(North等人，「A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations」,Journal of Molecular Biology,406,228-256(2011))係基於具有大量晶體結構之近鄰傳播聚類算法(affinity propagation clustering)。

出於本發明之目的，利用三種方法之共有序列來定義CDR。在輕鏈CDR之情形下，使用Kabat及Chothia CDR定義。在HCDR1之情形下，使用Kabat及Chothia CDR之混合定義。HCDR1之Kabat定義始於重鏈之第一個半胱胺酸後的八個殘基，且長度為五個殘基，而HCDR1之Chothia定義始於該半胱胺酸後的三個殘基，且長度為七個殘基。本發明抗體之HCDR1係由Chothia起始位置及Kabat終止位置定義。在HCDR2之情形下，使用Kabat CDR定義。在HCDR3之情形下，使用North、Kabat及Chothia CDR之混合定義。HCDR3之Kabat定義包含重鏈(用於本發明抗體之SEQ ID NO：13)之殘基95-102，且通常始於半胱胺酸後的三個殘基。HCDR3之Chothia定義與Kabat定義相同。HCDR3之North定義包含重鏈(用於本發明抗體之SEQ ID NO：13)之殘基93-102，且通常緊接著始於半胱胺酸殘基後。本發明抗體之HCDR3係藉由North起始位置及Kabat/Chothia/North終止位置來定義。

表1顯示本發明抗體之示例性CDR分配。

本發明抗體係已設計成具有與源自人類基因組序列之框架及恆定區相同或實質上相同(實質上係人類的)之人源框架、鉸鏈區及恆定區之工程抗體。完全的人類框架、鉸鏈區及恆定區係彼等人類生殖序列以及具有天然體細胞突變之序列及彼等具有工程突變之序列。本發明抗體可包含源自完全的人類框架、鉸鏈或恆定區之含有一或多個胺基酸取代、缺失或添加之框架、鉸鏈或恆定區。另外，本發明抗體較佳在人體內實質上不具有免疫原性。

可單獨或組合地使用各種不同的人類框架序列作為本發明抗體之基礎。較佳地，本發明抗體之框架區係源自人類或實質上人類的(至少95%、97%或99%源自人類)。人源框架區序列可自The Immunoglobulin Factsbook,by Marie-Paule Lafranc,Gerard Lefranc,Academic Press 2001,ISBN 012441351獲得。

本發明抗體之框架序列係作為「供體」可變框架區，且可用以利用此項技術中已知的方法產生具有本文所指定之相同CDR之其他抗體。此外，本發明抗體之框架序列可與其他已知人類框架序列比對，以產生其他抗體。因此，此資訊可用以在此等位置將另一選定的同源人類框架區「回復突變」成供體胺基酸殘基。另外，可在其他人類框架中檢測任何「稀有」胺基酸，以便可在相關位置使用共有序列或供體胺基酸殘基。

生產及純化抗體之方法係此項技術中所熟知，且可見於(例如)Harlow and Lane(1988)Antibodies.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor,New York，第5-8章及第15章中。例如，可利用人類IL-23或其片段使小鼠免疫，且隨後可回收、純化所得抗體，並使用此項技術中所熟知的習知方法測定胺基酸序列。本發明抗體係經工程化，以含有一或多個包圍源自非人類抗體之CDR之人類框架區。人類框架生殖序列可自ImMunoGeneTics(IMGT)經由其網站http：//imgt.cines.fr獲得或自The Immunoglobulin Facts Book by Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc,Academic Press,2001,ISBN 012441351獲得。用於本發明抗體之特定生殖輕鏈框架包括02。

用於本發明抗體之特定生殖重鏈框架區包括VH1-69。

可利用已知方法來製備及純化本發明工程抗體。例如，可選殖編碼重鏈(例如，由SEQ ID NO：9指定之胺基酸序列)及輕鏈(例如，由SEQ ID NO：10指定之胺基酸序列)之cDNA序列並設計成GS(麩胺醯胺合成酶)表現載體。然後，可將工程化免疫球蛋白表現載體穩定地轉染於CHO細胞中。抗體之哺乳動物表現通常將導致Fc區之高度保守N-糖化位點糖化。可藉由表現特異性結合人類IL-23之抗體驗證穩定的選殖體(clones)。可在無血清培養基中擴增陽性選殖體，以在生物反應器中生產抗體。可藉由習知技術純化其中分泌有抗體之培養基。例如，可將培養基方便地施加於已經相容緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝鹽水)平衡之蛋白質A或G瓊脂糖FF管柱上。清洗該管柱以移除非特異性結合組分。藉由(例如)pH梯度溶離結合抗體，並藉由(例如)SDS-PAGE檢測抗體溶離份，然後收集抗體。該抗體可利用常用技術進行濃縮及/或無菌過濾。可藉由常用技術(包括尺寸排除、疏水相互作用、離子交換或羥磷灰石層析)有效移除可溶性聚集物及多聚物。產物可立即冷凍在(例如)-70℃下或可經冷凍乾燥。

本發明抗體係單株抗體。本文所使用之「單株抗體」或「mAb」係指源自單一拷貝或選殖體(包括例如任何真核、原核或噬菌體選殖體)之抗體，而非指其生產方法。可藉由例如融合瘤技術、重組技術、噬菌體呈現技術、合成技術(例如CDR-移植)或其組合或此項技術中已知的其他技術生產其單株抗體。

在本發明之另一實施例中，提供呈分離形式之抗體或編碼該抗體之核酸。

本發明抗體或包含其之醫藥組合物可藉由非經腸途徑(例如皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內或經皮)投與。

本發明醫藥組合物可由此項技術中熟知的方法(例如Remington：The Science and Practice a/Pharmacy，第19版(1995),(A.Gennaro等人，Mack Publishing Co.)製備，且包含本文所揭示的抗體及一或多種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。例如，本發明抗體可用諸如檸檬酸鈉、檸檬酸、聚山梨醇酯80、氯化鈉及蔗糖之劑調配，且然後所得組合物可經冷凍乾燥並儲存在2℃-8℃。然後，冷凍乾燥組合物可在投與前用無菌注射用水復水。

本文所使用之術語「結合人類IL-23之p19亞單位」係指本發明抗體與SEQ ID NO：15之胺基酸序列所示之人類IL-23之p19亞單位上之抗原決定基可檢測的相互作用。本發明抗體與人類IL-23之p19亞單位間之相互作用係如實例1中標題為「藉由表面電漿子共振(BIAcore)測量抗體I之結合親和力」之部份中所述藉由在37℃結合動力學測量。

本文所使用之術語「抗原決定基」係指緊接在一起位於蛋白質(抗原)表面上並與抗體相互作用之胺基酸殘基。有兩大類抗原決定基：線性抗原決定基及構型抗原決定基。

本文所使用之術語「線性抗原決定基」係指蛋白質之一特定區域之連續初始胺基酸序列。

本文所使用之術語「構型抗原決定基」係指與本發明抗體接觸之抗原胺基酸序列之不連續部份。構型抗原決定基係由天然蛋白質之結構及序列定義；此等抗原決定基可係連續或非連續。該抗原決定基之組分可位於蛋白質之不同部份上，該等部份在折叠天然蛋白質結構中係彼此靠近。在本文中，本發明抗體結合SEQ ID NO：15之胺基酸位置81-99及115-140內之構型抗原決定基，其中該抗體至少接觸SEQ ID NO：15之胺基酸殘基94P、95S、97L、98P、99D、123W、130S、133P及137W。然而，構型抗原決定基並不侷限於此等胺基酸殘基，且可包含SEQ ID NO：15之胺基酸位置81-99及115-140內之其他胺基酸殘基。

本文所使用之術語「不會顯著地結合視網膜組織」係指本發明抗體不會與人類及食蟹猴視網膜組織發生明顯的相互作用。本發明抗體與人類及食蟹猴視網膜組織間之相互作用係在如實例1中標題為「視網膜組織交叉反應性：藉由免疫組織化學法進行之活體外分析」之部份中所述之免疫組織化學分析中經評估。本文所使用之術語「顯著地」係指肉眼評估人類及食蟹猴視網膜組織，以確定本發明抗體是否結合該人類及食蟹猴視網膜組織。

本文關於本發明抗體所使用之術語「選擇性」係指抗體結合人類IL-23之p19亞單位，但不結合人類IL-23及人類IL-12所共有的p40亞單位。

本文所使用之術語「中和」係指「中和抗體」，且意指抑制人類IL-23之生物活性。測量IL-23生物活性之一或多種指示物(其係利用小鼠脾細胞生物分析(參見實例1中標題為「於小鼠脾細胞中抗體I對人類或食蟹猴IL-23之活體外中和作用」之部份)或人類IL-23中和分析(參見實例1中標題為「人類IL-23之中和：急性、局部」之部份)測得)可評估對人類IL-23之生物活性之此抑制作用。

本文所使用之術語「K_D」意指特定抗體-抗原相互作用之解離常數。其係藉由以下公式算得：K_off/K_on=K_D

本文所使用之術語「k_on」意指正向反應或複合物形成反應之締合速率常數或具體反應速率，且以單位M^-1sec^-1計。

本文所使用之術語「k_off」意指抗體自抗體/抗原複合物解離之解離速率常數或具體反應速率，且以單位sec^-1計。

本文所使用之術語「IC₅₀」意指在實例1之標題為「於小鼠脾細胞中抗體I對人類或食蟹猴IL-23之活體外中和作用」之部份中所述之生物分析中，本發明抗體中和IL-23對小鼠脾細胞之50%生物活性所需的有效濃度。

本文所使用之術語「多核苷酸」意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可係單股或雙股。

本文所使用之術語「單離」係指蛋白質、肽或核酸不含或實質上不含見於細胞環境中之其他大分子物質。

本文所使用之術語「實質上不含」意指受關注蛋白質、肽或核酸係佔所存在的大分子物質之80%以上(以莫耳計)，較佳90%以上，及更佳95%以上。

「患者」係哺乳動物，較佳係人類。

術語「治療」係指減緩、中斷、阻止、緩和、制止、減輕或逆轉既有症狀、失調症、病症或疾病之發展或嚴重度。

本文所使用之術語「有效量」係指在向患者單次或多次投藥時，為接受治療之患者提供所需效果之本發明抗體之用量或劑量。熟習此項技術之主治醫師可容易地藉由考量諸如下列之許多因素確定有效量：哺乳動物之種類；其體型、年齡及一般健康狀況；所涉及的具體疾病；該疾病之嚴重程度；個別患者之反應；所投與的特定抗體；投與模式；所投與製劑之生物利用率特性；所選擇的給藥方案；任何併用藥物之使用。

實例

以下實例進一步說明本發明。然而，應瞭解，闡述該實例係作為闡明而非限制之用，且一般技術者可作出各種修改。

實例1

抗體製法

該實例之抗體I包含兩條重鏈及兩條輕鏈，各重鏈具有由SEQ ID NO：9指定之胺基酸序列，且各輕鏈具有由SEQ ID NO：10指定之胺基酸序列。抗體I可如下進行製備及純化。用分泌抗體之表現系統瞬時或穩定地轉染適宜的宿主細胞(諸如HEK 293或CHO)，該表現系統使用最佳的預定HC：LC載體比或同時編碼重鏈(SEQ ID NO：9)及輕鏈(SEQ ID NO：10)之單一載體系統。其中已分泌抗體之澄清培養基係利用許多常用技術中之任一者來純化。例如，可將培養基方便地施加於已經相容緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH7.4))平衡之蛋白質A或G管柱上。清洗該管柱以移除非特異性結合組分。藉由(例如)pH梯度(諸如pH6.8之0.1M磷酸鈉緩衝液至pH2.5之0.1M檸檬酸鈉緩衝液)溶離結合抗體。中和抗體溶離份(例如藉由添加1/10體積pH為8.0之1M TRIS)，藉由(諸如)SDS-PAGE進行檢測，且然後收集。可選擇其他純化方法，端看預期用途而定。該抗體可利用常用技術進行濃縮及/或無菌過濾。可藉由常用技術(包括尺寸排除、疏水相互作用、離子交換或羥磷灰石層析)有效移除可溶性聚集物及多聚物。該抗體在此等層析步驟後之純度係大於99%。產物可立即冷凍在-70℃下或可經冷凍乾燥。

藉由表面電漿子共振(BIAcore)測量結合親和力

利用BIAcore生物感測器2000及BIAevaluation軟體，以1：1結合質量傳遞模型來測定抗體對人類、食蟹猴或兔子IL-23之親和力(K_D)。經由游離胺基將捕獲蛋白(蛋白質A，Calbiochem)偶聯至CM4生物感測器晶片之流動池1及2上之羧基，該晶片使用N-乙基-N-(二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺(EDC)與N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)之混合物。以80 μL/分鐘之流速，使用含有0.01M HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、0.005%界面活性劑P20之緩衝液監測流動池。抗體I係捕獲在流動池2上，總共得到40至60個反應單位(RU)。然後將濃度遞增的IL-23之多個循環注射於流動池1及2上(就人類及猴IL-23而言係0.62nM至30nM，且就兔子IL-23而言係30nM至240nM)，然後在各循環間使用甘胺酸-HCl(pH1.5)進行再生步驟。使用流動池1作為對照以監測IL-23之非特異性結合，且該數據反映流動池2減去流動池1。各循環包括抗體捕獲步驟，繼而以某一濃度注射IL-23，解離時間為30分鐘，然後進行再生。其中注射緩衝劑以取代IL-23之兩個循環係作為基線減法之對照，並校正與抗體I自蛋白質A表面解離相關之漂移。親和力係在37℃下測得。用人類、猴或兔IL-23進行該分析兩次。利用333nM小鼠IL-23、200nM大鼠IL-23、333nM人類IL-12、500nM人類IL-27或833nM人類IL-35測試抗體I兩次。

利用1：1結合質量傳遞模型評估各抗原之締合速率(k _on)及解離速率(k _off)。根據關係式K_D=k _off/k _on自結合動力學算出親和力(K_D)。

利用該方法，抗體I與人類、食蟹猴及兔子IL-23產生濃度相依性結合反應。使用捕獲於晶片表面上之80-100個反應單位之抗體I，結合IL-23係在30nM(人類及猴)及240nM(兔子)之濃度下達到飽和。在測試條件下，人類、猴或兔子IL-23對抗體I之結合親和力(K_D)分別係21、55或53,000pM(表1)。在此等條件下，小鼠IL-23、大鼠IL-23、人類IL-12、人類IL-27或人類IL-35不結合抗體I。

IL-23結合IL-23受體之活體外抑制

經由游離胺基將重組人類IL-23R/Fc偶聯至CM4生物感測器晶片之流動池2上之羧基，該晶片使用N-乙基-N-(二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺(EDC)與N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)之混合物。利用相同方法將重組人類IgG₁ Fc(R&D Systems,Inc.)偶聯至相同晶片之流動池1。利用相同方法將小鼠抗-6X HIS抗體(R&D Systems,Inc.)偶聯至相同晶片之流動池4。利用小鼠抗-6X HIS預捕獲含有HIS標記之人類IL-12Rβ1/Fc(R&D Systems,Inc.)。以30μL/分鐘之流速，使用含有0.01M HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、0.005%界面活性劑P20之緩衝液監測流動池。在添加或未添加16X莫耳過量之抗體I之情況下，預培育重組人類IL-23達90分鐘。以150μL之總體積將各組合注射於流動池1、2 及4上，然後在各測試間使用甘胺酸-HCl(pH1.5)進行再生步驟。使用流動池1作為對照來監測IL-23對該晶片之非特異性結合。利用BIAevaluation軟體繪製個別結合感應圖之覆蓋圖。

利用活體外功能分析，抗體I中和人類IL-23。此外，抗體I阻止IL-23結合IL-23R/Fc。表3中的數據顯示：(A)IL-23結合IL-23R/Fc；(B)抗體I/IL-23複合物不結合IL-23R/Fc；(C)IL-23結合IL-12Rβ1/Fc；且(D)抗體I/IL-23複合物結合IL-12Rβ1/Fc。

因此，抗體I中和IL-23，因為其抑制IL-23結合IL-23R亞單位。此外，抗體I不抑制IL-23結合IL-12Rβ1亞單位。

於小鼠脾細胞中抗體I對人類或食蟹猴IL-23之活體外中和作用

為評估抗體I，使用產生約50%最大產量之IL-17之人類或食蟹猴IL-23濃度(16pM)。評估抗體I在800,000至4.4pM範圍內之劑量反應。在添加至細胞中前，在37℃下，使抗體I或IgG₄對照抗體與人類或食蟹猴IL-23在獨立孔中組合90分鐘(培育前混合物)。

經IL-23及IL-2刺激之C57BL/6小鼠脾細胞產生IL-17(Aggarwal,S.等人，「Interleukin-23 Promotes a Distinct CD4 T Cell Activation State Characterized by the Production of Interleukin-17」，Journal of Biological Chemistry,278(3)：1910-19142003)。以5x10⁶WBC/mL將小鼠脾細胞再懸浮於分析培養基(具有L-麩胺醯胺之RPMI1640，其含有10%FBS、1%非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉、100U/mL盤尼西林(penicillin)、100μg/ml鏈黴素(streptomycin)、0.00035% 2-巰基乙醇、 50ng/mL人類IL-2)中，並以100μL/孔之體積分配於96孔培養板中。以100μL/孔分配抗體I/IL-23之培育前混合物，並在37℃下培育於5%CO₂中。四十八小時後，使用來自R&D Systems(DY421)之商業ELISA套組，根據該套組中之說明書測試培養上清液之mIL-17，各稀釋濃度使用兩個孔。利用數據之4參數曲線擬合測得IC₅₀。

小鼠脾細胞響應人類或食蟹猴IL-23而產生IL-17。抗體I中和人類或食蟹猴IL-23。人類IL-23之IC₅₀計算值係82±11pM，且食蟹猴IL-23之IC₅₀計算值係120±14pM，就各者而言，n=2(表4)。此等結果顯示，抗體I可在活體外中和人類或食蟹猴IL-23。

人類IL-23之中和作用：急性、局部

將動物(來自Jackson Labs之C57BL/六隻雌性，八週齡)圈養起來(在送達最少72小時後)，並在實驗前及整個研究期間正常餵養。用電動剪毛器剪去小鼠背部之毛髮，且在3天後，小鼠(n=10隻/組)接受皮下注射抗體I或IgG₄同型對照抗體(0.54mg/小鼠)。在接下來的2天，使用29-號針在背部一側的某一位置為小鼠皮內注射人類IL-23(1μg/50μL，用無菌鹽水稀釋)。在背部另一側使用無菌鹽水作為媒劑對照。在最後注射人類IL-23後24小時處死小鼠，並移除經IL-23注射側及經無菌鹽水注射側之皮膚樣品(保持遠離毛髮邊界至少5mm)。將皮膚樣品直接冷凍於液氮中，以備mRNA研究用。

藉由在Lysing Matrix A振盪管(Qbiogene Inc./Bio101 Systems)中進行均質化，及隨後使用RNeasy Mini套組(Qiagen,Inc.)進行清除，自冷凍皮膚組織單離出總RNA。自260nm下之分光光度吸收值測得RNA濃度。利用高容量cDNA反轉錄套組(PE Applied Biosystems)將RNA反轉錄為cDNA。一式三份地在ABI Prism 7900HT(PE Applied Biosystems)上進行所有反應，以測定所分析mRNA之相對豐度。用於小鼠IL-17A(Mm00439618_m1)、小鼠IL-17F(Mm00521423_m1)及小鼠角蛋白-16(Mm00492979_g1)之引物探針組係自PE Applied Biosystems獲得。18S及GAPD均係作為內生對照經測量，以將基因表現水平之可變性標準化。利用Delta(Δ-Δ)Ct法分析表現數據。個別Ct值係作為三次測量之平均值算出。進行兩次實驗。視需要使用非配對t-檢驗。P<0.05被視為具有統計顯著性。

為探究全身投與抗體I是否可中和對人類IL-23之局部反應，將人類IL-23蛋白質皮內注射至小鼠中，以研究皮膚接觸IL-23之下游影響。每日以鹽水溶液處理的野生型小鼠之皮膚不顯示可檢測濃度的小鼠IL-17A或小鼠IL-17F。

然而，注射人類IL-23會誘導小鼠IL-17A及小鼠IL-17F之mRNA表現(表5)。用抗體I而非同型對照抗體處理可消除由人類IL-23誘導的IL-17A及IL-17F mRNA表現。

此外，注射人類IL-23會誘導與角蛋白-16(一種增殖相關性細胞角蛋白)表現增加相關之表皮增厚。藉由投與抗體I可顯著抑制角蛋白-16之誘導(就同型對照抗體而言，小鼠角蛋白-16之誘導倍率為5.21±2.72，而就抗體I而言，該誘導倍率為1.23±0.72；p=0.0003)。

此等結果一起顯示，抗體I在急性局部活體內分析中有效抑制人類IL-23誘導產生小鼠IL-17A、IL-17F及角蛋白-16 mRNA。

視網膜組織交叉反應性：藉由免疫組織化學法進行之活體外分析

在低溫器上將新鮮冷凍人類及食蟹猴視網膜組織切片(5-7μm厚)。在室溫下將該等切片固定在丙酮中達約10分鐘，使其在室溫下隔夜乾燥，並儲存在約-80℃下直至使用。隨後將丙酮固定載玻片拿出冷凍器，並使其在室溫下隔夜乾燥。接下來的步驟係在室溫下進行。在1X Morphosave^TM中培育該等載玻片約15分鐘，以保持形態。在1X PBS中清洗該等載玻片10分鐘，然後在室溫下於0.3%H₂O₂/1X PBS中培育約20分鐘，以淬滅內源性過氧化酶活性。培育後，在1X PBS中清洗該等載玻片兩次，歷時約5分鐘。藉由在抗生物素蛋白及生物素溶液中連續培育(每次約15分鐘)來阻斷內源性生物素。在生物素中培育後，用阻斷抗體溶液阻斷該等組織切片達30分鐘。以最佳濃度(2.5或5μg/mL)或五倍於最佳濃度(25μg/mL)，將抗體I或對照人類IgG₄施加於切片上，並在室溫下培育1小時。然後沖洗該等載玻片，並與生物素化小鼠抗人類IgG₄抗體(2.5μg/mL)一起培育30分鐘。用鏈黴親和素-生物素-辣根過氧化物酶共軛物及二胺基聯苯胺色原體受質檢測結合的一級/二級抗體複合物。

在所有的實驗中，使用經人類IL-23轉染的CHO細胞作為陽性對照樣品。使用親代CHO(未轉染)細胞作為陰性對照樣品，且不進行染色。在經同型對照抗體(人類IgG₄)染色之連續切片中未觀察到有結合。抗體I不會顯著地結合視網膜組織。

抗體I之抗原決定基定位：丙胺酸掃描

利用酵母展示抗原進行抗原決定基定位之背景

實施抗原決定基定位研究係為了確定人類IL-23 p19亞單位(SEQ ID NO：15)中用於抗體I結合所需之特異性胺基酸。抗體I之抗原決定基定位係藉助丙胺酸掃描及酵母展示平臺完成。

藉由在PyMOL中進行分析識別人類IL-23之p19亞單位之曝露胺基酸位置。表6中顯示IL-23之p19亞單位之曝露或部份曝露位置。本研究略去彼等經測定為未曝露的位置，亦即只有人類IL-23之p19亞單位之曝露或部份曝露的胺基酸位置才會突變。因此，並未研究所有位置。

雖然僅對IL-23之p19亞單位進行抗原決定基定位(不對IL-23之p40亞單位進行抗原決定基定位，因為抗體I不會顯著地結合p40亞單位)，但人類IL-23之p19亞單位及p40亞單位必須共同表現在酵母展示平臺中。

構築人類IL-23之p19亞單位之單一酵母展示丙胺酸突變體，並測定抗體結合，以鑑別出抗原決定基。藉由測量抗體突變體與野生型酵母展示抗原相比之親和力，可測定胺基酸側鏈對抗體結合之能量貢獻。

構建突變體庫

將p40基因選殖於可溶性表現質體pYKY中，其具有尿嘧啶選擇標記。將p19亞單位基因選殖於酵母展示質體pEMD3中，其在N-端包含色胺酸選擇標記及V5標記，且在C-端包含GPDL2錨定蛋白質，從而允許在色胺酸可選擇標記下展現於酵母表面上。用於選殖之限制位點：在pYKY質體中係XhoI及BamHI，且在pEMD3質體中係AvrII及XmaI。

在每一曝露位置上引入丙胺酸突變，並用V5抗體及抗體I測試雙陽性染色。利用定點誘變(Kunkel誘變)將p19丙胺酸突變體組構築於pEMD3質體內。簡而言之，在轉形於CJ236(New England Biolabs)中後產生pEMD3載體之含尿嘧啶ssDNA。使該轉形之單一選殖體生長隔夜，且在經M13K07輔助噬菌體(New England Biolabs)感染後拯救出ssDNA，並利用QIAprep spin M13套組純化ssDNA。在對尿嘧啶模板之莫耳比為20：1下，藉由以下方式使編碼丙胺酸突變之寡核苷酸退火：在85℃下變性5分鐘，歷時1小時斜降至55℃，在55℃下保持5分鐘，然後在冰上冷卻。然後用T4聚合酶、T4連接酶及dNTP(Invitrogen)完成第二鏈合成。將該反應電穿孔於Top10大腸桿菌(Invitrogen)中，並挑選出單一菌落，利用QIAprep miniprep套組(Qiagen)製得dsDNA，並藉由定序確認突變。然後將p19突變體及p40 pYKY質體共轉形於BJ5464酵母(ATCC)中，並生長於不含色胺酸及尿嘧啶之完全基本培養基中。

篩選喪失抗原結合之突變抗原庫

為鑑定抗體抗原決定基，藉由流式細胞計數術篩選喪失抗體結合之突變抗原庫。用兩種抗體使酵母細胞染色，對其中一者進行定位，而對另一者不進行定位。篩選喪失結合第一抗體但保留結合第二抗體之酵母呈現之抗原突變體。保留結合第二抗體可確保突變體係基於抗原決定基中之突變篩選，而非篩選未摺疊或呈現不佳的突變體。

就本分析而言，第一抗體(亦即抗原決定基經定位之抗體)係抗體I，且第二抗體係抗-V5抗體。開始用抗-V5抗體(Invitrogen)及抗體I使酵母染色，隨後用二級山羊抗小鼠IgG_2a(Invitrogen,Alexa Fluor^® 647)檢測抗-V5抗體(表現/呈現)及用山羊抗人類κ RPE(Southern Biotech)檢測抗體I。藉由流式細胞計數術在Becton Dickinson LSRII上分析酵母，其中基於閘控單元藉由光散射、V5/Alexa647及抗體I/PE染色收集50,000事件。利用FACSDiva v6.1.2版軟體實施結合各抗體I及抗-V5抗體之數據分析，該軟體計算雙染色酵母細胞之百分比。

結果

由於所呈現蛋白質之分配，最多50%的酵母將呈現IL-23 p19。雙陽性酵母細胞之檢測顯示研究中的胺基酸位置並未參與抗體I結合IL-23。只有V5染色之檢測顯示該蛋白質表現並呈現於酵母表面上，且研究中的胺基酸位置對抗體I結合重要。其確定，與相鄰殘基相比，顯示雙陽性染色減少>50%之殘基對結合重要。表7中突顯此等殘基。一些位置顯示缺乏V5及抗體I結合，表明該胺基酸殘基可能為蛋白質構型所需。IL-23 p19亞單位(SEQ ID NO：15)中各曝露或部份曝露胺基酸位置之系統研究顯示位置94P、95S、97L、98P、99D、123W、130S、133P及137W對抗體I結合人類IL-23重要，基於V5及抗體I結合之雙陽性染色之量減少(表7)。

亦利用氫-氘交換進行抗原決定基定位。該以氫-氘交換進行的抗原決定基定位結果顯示：抗體I之抗原決定基係位於人類IL-23(SEQ ID NO：15)之殘基81-99及115-140內之構型抗原決定基。

IL-23抗體之物理-化學性質

抗體I具有醫藥上可接受的溶解度、化學安定性及物理安定性。

A.溶解度

需要足夠高溶解度以允許方便地用藥。例如，以1.0mL注射劑向100kg患者投與1mg/kg劑量將需要有100mg/mL之溶解度。此外，亦希望該抗體維持單體狀態而不形成高濃度的高分子量(HMW)聚集體。

在生理樣緩衝液(PBS，pH7.4)中及兩種藥品調配條件(10mM檸檬酸鹽，pH6，±150mM NaCl)下，將抗體I調配成約1mg/mL。以2000 xG使該抗體離心通過Amicon Ultra 30kDa分子量過濾器 (Millipore，UFC803204)來濃縮該抗體，同時維持相同緩衝液條件。繼續離心，直至達到溶解度極限或達到該裝置的最小容納體積。在所有三種條件下均達到大於100mg/mL的溶解度。

在抗體調配物之濃度達到大於100mg/mL後，利用尺寸排除層析法(SEC)評估高分子量(HMW)聚合物是否有所增加。將起始抗體溶液及濃縮抗體溶液注射於TSK3000 SWXL管柱(TOSOH Bioscience)上，該管柱使用由12mM磷酸鹽、500mM NaCl組成之移動相(pH7.4)。在任何測試調配物條件下均未觀察到可溶性聚合物大幅增加(藉由SEC測得HMW聚合物<0.6%)。

B.化學安定性

以1mg/mL將抗體I調配於10mM緩衝液(就pH4、5、6及7而言係10mM檸檬酸鹽；就pH8而言係10mM TRIS)中，並在4、25或40℃下培育4週。藉由SEC(參見上述方法)、陽離子交換層析[CEX；Dionex，使用介於緩衝液A(20mM磷酸鈉，pH5.8，0.36% CHAPS)與緩衝液B(20mM磷酸鈉，pH5.8，0.36% CHAPS，200mM氯化鈉)間之梯度]、CE-SDS(具有蛋白質230晶片之Agilent生物分析儀，在還原條件下進行)監測化學安定性，並藉由LC-MS描述酶硝化物質。

抗體I在pH5-8之間係安定，即使在40℃下歷時4週後亦不會形成聚合物(SEC)。在pH4下，在40℃下觀察到有大量聚合物，而在25℃下沒有(4週)。藉由CE-SDS測得，預期的肽鍵水解或切割在pH4(40℃)下明顯發生。pH4.0下之降解水平係IgG₄抗體所特有。在高於pH4(pH5-8)下，降解水平較低，且不會一直隨時間而變化，因此可能代表背景雜訊。

該假設與LC-MS分析一致，該分析在pH6下未檢測到切割，但在pH4下測量到典型的抗體切割水平。藉由CEX監測帶電變體之變化。起始物質係由三個最小化該分析之解析力之顯著主峰組成。一般而言，25℃及40℃應力樣品係高於4℃對照，但水平未隨培育時間而上升(在許多情形下實際上下降)。pH6.0下之變化百分比(4週，25℃-4℃對照)為2.5%。LC-MS分析顯示，大多數改性係在CDR區域之外，且係處於其他IgG₄抗體之特有水平下。確定CDR內的三個降解位點之變化小於1%(pH6；4週，25℃-4℃對照)。CDR內的降解位點不足亦與在40℃及pH4、6或8下培育四週後BIACore親和力或化學計量未明顯變化一致。

C.物理安定性

i)凍熔安定性

在以下條件下調配抗體I：a)在10mM檸檬酸鹽(pH6.0)中調配成1mg/mL；b)在10mM檸檬酸鹽(pH6.0)、0.02% Tween-80中調配成1mg/mL；c)在10mM檸檬酸鹽(pH6.0)、150mM NaCl中調配成1或50mg/mL；及d)在10mM檸檬酸鹽(pH6.0)、150mM NaCl、0.02% Tween-80中調配成1或50mg/mL。

將此等調配物置於以1℃/min控制的冷凍容器(Nalgene,5100-0001)中，並在-80℃冷凍器中冷藏至少八小時，然後移出，並在室溫下歷時八小時融化。至多重複該凍/融循環三次。在一個及三個凍融循環後移出樣品，並藉由SEC分析HMW聚合物(參見上文部份A中所述SEC法)，並藉由HIAC顆粒計數器(具有低容量附屬裝置之Pacific Scientific型號9703)分析不可溶顆粒形成。在任何測試條件下，三個凍融循環後均未觀察到HMW聚合物形成顯著增加。就1mg/ml調配物而言，僅在不含Tween-80的調配物中觀察到HIAC顆粒數顯著增加。在50mg/ml下，顆粒數係其他表現良好的IgG₄抗體所特有，其中不含 Tween-80之情形下之顆粒數(10微米)係約1500個/mL，且在含有Tween-80之情形下之顆粒數下降至約280。

ii)以高濃度靜置

在以下條件下將抗體調配成50mg/mL：a)10mM檸檬酸鹽，pH6.0，150mM NaCl；及b)10mM檸檬酸鹽，pH6.0，150mM NaCl，0.02% Tween-80使此等調配物在4℃及25℃下靜置4週。4週後，在25℃下測量HIAC顆粒計數(具有低容量附屬裝置之Pacific Scientific型號9703)之變化。

含Tween調配物之HIAC顆粒數(10微米)平均值為290個/mL(270及310)，且不含Tween的調配物之HIAC顆粒數適當較高，平均值為804個/mL(728及880)。此等結果係呈現良好物理安定性之其他IgG₄抗體所特有。亦將此等兩種調配物儲存在玻璃而非標準塑膠eppendorf管中。儲存在玻璃中之樣品之顆粒數小4至8倍(含有及不含Tween之樣品之平均值分別為35及191個/mL)。

SEQ ID列表

重鏈CDR

SEQ ID NO：1 GYKFTRYVMH

SEQ ID NO：2 YINPYNDGTNYNEKFKG

SEQ ID NO：3 ARNWDTGL

輕鏈CDR

SEQ ID NO：4 KASDHILKFLT

SEQ ID NO：5 GATSLET

SEQ ID NO：6 QMYWSTPFT

重鏈可變區

SEQ ID NO：7(抗體I)

輕鏈可變區

SEQ ID NO：8(抗體I)

完整重鏈

SEQ ID NO：9(抗體I)

完整輕鏈

SEQ ID NO：10(抗體I)

核苷酸序列

重鏈可變區

SEQ ID NO：11(抗體I)

核苷酸序列

輕鏈可變區

SEQ ID NO：12(抗體I)

核苷酸序列

完整重鏈

SEQ ID NO：13(抗體I)

核苷酸序列

完整輕鏈

SEQ ID NO：14(抗體I)

蛋白質序列

成熟人類IL-23 p19亞單位之胺基酸序列

SEQ ID NO：15

<110> 美國禮來大藥廠

<120> 結合IL-23之抗體

<130> X19760

<150> 61/774732

<151> 2013-03-08

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 2

<210>3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 6

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 8

<210> 9

<211> 441

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 9

<210> 10

<211> 214

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 10

<210> 11

<211> 345

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 11

<210> 12

<211> 321

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 12

<210> 13

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 13

<210> 14

<211> 642

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 14

<210> 15

<211> 170

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 15

Claims

一種結合人類IL-23之p19亞單位之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)，且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含胺基酸序列LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該HCVR包含胺基酸序列HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中LCDR1係SEQ ID NO：4，LCDR2係SEQ ID NO：5，LCDR3係SEQ ID NO：6，HCDR1係SEQ ID NO：1，HCDR2係SEQ ID NO：2，且HCDR3係SEQ ID NO：3。
如請求項1之抗體，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)，且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR之胺基酸序列係SEQ ID NO：8，且該HCVR之胺基酸序列係SEQ ID NO：7。
如請求項2之抗體，其包含兩個輕鏈可變區(LCVR)及兩個重鏈可變區(HCVR)，其中各LCVR之胺基酸序列係SEQ ID NO：8，且各HCVR之胺基酸序列係SEQ ID NO：7。
如請求項1或2之抗體，其中該輕鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：10，且該重鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：9。
如請求項4之抗體，其包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：10，且各重鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：9。
如請求項1至3中任一項之抗體，其係用於治療自體免疫或發炎病症，其中該病症係選自由下列組成之群：多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、發炎性腸病、關節黏連性脊椎炎、移植物抗宿主病、狼瘡及代謝症候群。
如請求項1至3中任一項之抗體，其係用於治療癌症，其中該癌症係黑色素瘤、結腸癌、卵巢癌、頭頸癌、肺癌、乳癌或胃癌。
一種DNA分子，其包含編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：10之輕鏈多肽之多核苷酸序列。
一種DNA分子，其包含編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：9之重鏈多肽之多核苷酸序列。
一種編碼如請求項1至5中任一項之抗體之分離多核苷酸。
如請求項10之分離多核苷酸，其中該重鏈可變區(HCVR)係由SEQ ID NO：11編碼，且該輕鏈可變區(LCVR)係由SEQ ID NO：12編碼。
如請求項10或11之分離多核苷酸，其中該重鏈係由SEQ ID NO：13編碼，且該輕鏈係由SEQ ID NO：14編碼。
如請求項10之分離多核苷酸，其中該多核苷酸係可操作地連接於表現控制序列。
一種載體，其包含如請求項13之多核苷酸。
一種重組宿主細胞，其包含如請求項8之DNA分子及如請求項9之DNA分子，該細胞可表現包含重鏈及輕鏈之抗體，其中該重鏈包含胺基酸SEQ ID NO：9，且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：10。
一種經如請求項10至12中任一項之多核苷酸轉形之重組宿主細胞，該細胞可表現包含重鏈及輕鏈之抗體，其中該重鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：9，且該輕鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：10。
如請求項16之重組宿主細胞，其中該宿主細胞係選自由下列組成之群之哺乳動物宿主細胞：CHO、NS0、HEK293及COS細胞。
一種生產結合人類IL-23之p19亞單位之包含重鏈及輕鏈之抗體之方法，其中該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：9，且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：10，該方法包括以下步驟：a)如請求項15至17中任一項之重組宿主細胞在表現該抗體之條件下培養；及b)自該宿主細胞回收所表現之抗體。
一種生產結合人類IL-23之p19亞單位之包含重鏈及輕鏈之抗體之方法，其中該重鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：9，且該輕鏈之胺基酸序列係SEQ ID NO：10，該方法包括以下步驟：a)包含編碼SEQ ID NO：9所示之多肽序列之第一多核苷酸序列及編碼SEQ ID NO：10所示之多肽序列之第二多核苷酸序列之重組宿主細胞在表現該等多肽序列之條件下培養；及b)自該宿主細胞回收包含重鏈及輕鏈之抗體，其中該重鏈之多肽序列係SEQ ID NO：9所示，且該輕鏈之多肽序列係SEQ ID NO：10所示。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之抗體及一或多種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。
一種如請求項1至5中任一項之抗體於製造用於治療或預防選自由下列組成之群之病症之藥劑之用途：多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、發炎性腸病、關節黏連性脊椎炎、移植物抗宿主病、狼瘡及代謝症候群。
一種如請求項1至5中任一項之抗體於製造用於治療或預防癌症之藥劑之用途，其中該癌症係黑色素瘤、結腸癌、卵巢癌、頭頸癌、肺癌、乳癌或胃癌。