CN113698480B - 一组il-23单克隆抗体及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫治疗和分子免疫学领域；具体涉及抗IL‑23的单克隆抗体及其医药用途。本发明通过杂交瘤技术获得了阻断IL‑23功能的单克隆抗体，并成功地对其进行了人源化改造。所述抗体在制备应用于调节IL‑23的作用、水平以及机体免疫力的相关药物，尤其是治疗自身免疫疾病相关药物方面具有广阔的应用前景。

Description

一组IL-23单克隆抗体及其医药用途
技术领域
本发明属于免疫治疗和分子免疫学领域，涉及IL-23抗体及其用途，具体地，本发明涉及IL-23的单克隆抗体。
技术背景
白介素23(interleukin-23,IL-23)是IL-12细胞因子家族成员，由IL-23A(p19)和IL-12B (p40)两个亚基组成的异源二聚体(Oppmann B,et al.,(2000)Immunity,13:715-25)。IL-23主要由活化的巨噬细胞和树突状细胞产生，也可由非免疫细胞，如角质形成细胞和滑膜细胞分泌。IL-23被异源二聚体受体蛋白复合物识别，该复合物由IL-23R和IL-12Rβ2蛋白组成，分别结合p19和p40亚基(Parham C,et al.,(2002)J Immunol.,168:5699-708)。
IL-23受体的信号转导由JAK家族成员介导；JAK2与IL-23R结合，tyrk2与IL-12β结合(Vignali DAA,et al.,(2012)Nat Immunol.,13:722-8)。IL-23受体存在于多种细胞表面，能够促进巨噬细胞和树突状细胞自分泌IL-23，并通过刺激TNF和IL-1β的分泌增强巨噬细胞中CD40的表达(Cua DJ,et al.,(2003)Nature,421:744-8)，诱导树突状细胞抗原呈递(Belladonna ML,et al.,(2002)J Immunol.,168:5448-544)。IL-23除了影响初始T细胞分化为 Th-17外，还在Th-17的激活中发挥重要作用(Yang XO,et al.,(2007)J Biol Chem.,282:9358- 63；Stritesky GL,et al.,(2008)J Immunol.,181:5948-55)。
IL-23是参与机体免疫调控的重要细胞因子。体内IL-23水平的失调会造成免疫功能紊乱，导致自身免疫疾病，如牛皮癣(Lee,et al.,(2004)J Exp Med.,199:125-30)，克隆恩病 (Neurath,et al.,(2007)Nat Med.,13:26-8)，多发性硬化(Cau,et al.,(2003)Nautre, 421:744-48),炎症性肠道疾病(Aden K,et al.,(2016)Cell Rep.,16:2208-18)。临床试验数据表明，针对IL-23的抗体可有效改善银屑病和克隆恩病临床症状，显著改善患者的病情 (Paul C,et al.,(2014)Br J Dermatol.,170:425-34；Machado A,et al.,(2018)BioDrugs.,32:119- 28)。因此，研发高效的IL-23中和抗体将具有重要的社会价值和广阔的市场前景。
发明内容
为解决上述问题，本发明采用杂交瘤技术获得了IL-23单克隆抗体，并成功对其进行了人源化改造。该抗体在制备应用于阻断或调节IL-23水平、以及治疗自身免疫疾病的相关药物方面有巨大的应用前景。
本发明提供的鼠源或人源化IL-23抗体或功能性片段，包括了重链序列和轻链序列。重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分为SEQ ID NO：1、2。重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4、5，轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7、8。
进一步，抗人IL-23抗体或片段经过改造后，成为人源化抗体。
分离的核酸分子：编码上述的抗体或功能性片段。
抗人IL-23人源化抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：9、10，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：11、12、13。
表达载体，包含表达上述抗体的核酸分子。
药物组合物，其包含上述的抗体或其功能片段，以及药用载体。
上述的抗体或其功能性片段，核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物在制备影响IL-23免疫功能药物中的用途
本发明获得了如下有益效果：本发明采用重组IL-23作为抗原免疫小鼠，将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后获得杂交瘤细胞。通过对大量杂交瘤细胞的多次克隆及筛选后，得到一些单克隆杂交瘤细胞株。这些杂交瘤细胞株能够产生和人IL-23特异性结合的单克隆抗体(图1)，有效阻断人IL-23与IL-23R的结合(图2)。通过RT-PCR(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction，反转录-聚合酶链式扩增)克隆编码抗体轻链和重链可变区的基因，采用互补决定簇嫁接(complementarity-determining regionsgraft，CDR-graft) 方法构建人源化抗体。体外功能试验表明，这些人源化的IL-23抗体能特异性结合人IL-23 蛋白(图3)和猴IL-23蛋白(图4)，可以有效阻断人IL-23与IL-23R的结合(图5),抑制人外周血淋巴细胞(PBMC)的INF-γ产生(图6)，抑制小鼠脾细胞分泌mIL-17(图7a图 7b)，并且活性高于阳性对照抗体。本专利中阳性对照抗体的序列来自专利US20170362316 (Guselkumab)。在银屑病小鼠模型中，人源化IL-23抗体能显著降低小鼠IL-17mRNA水平并改善小鼠耳朵组织结构。以上实验结果表明，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包含本发明所述单克隆抗体或其偶联物，在制备应用于阻断IL-23功能的药物、以及在预防和治疗或者辅助治疗自身免疫性疾病的药物方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1：用ELSIA测定IL-23杂交瘤抗体与人IL-23蛋白结合的EC50；
图2：用ELSIA测定IL-23杂交瘤抗体阻断人IL-23与IL-23R结合的IC50；
图3：用ELSIA测定IL-23人源化抗体与人IL-23蛋白结合的EC50；
图4：用ELSIA测定IL-23人源化抗体与猴IL-23蛋白结合的EC50；
图5：用ELSIA测定IL-23人源化抗体阻断人IL-23与IL-23R结合的IC50；
图6：IL-23人源化抗体对小鼠脾细胞分泌IL-17的抑制作用；
图7a：人源化IL-23抗体对人PBMC分泌INF-γ的抑制作用；
图7b：人源化IL-23抗体的突变体对人PBMC分泌INF-γ的抑制作用；
图8a：在银屑病小鼠模型中IL-23人源化抗体对小鼠IL-17mRNA水平的影响；
图8b：在银屑病小鼠模型中IL-23人源化抗体对鼠耳朵横切片HE组织染色的影响。
具体实施方式
实施例1
IL-23杂交瘤抗体的制备
用携带组氨酸标签的人IL-23(IL-23-His)作为抗原，与等体积完全弗氏佐剂(Sigma,Cat. No.:F5581)充分乳化后，经皮下免疫6-8周龄Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，抗原免疫量为50μg/只。随后每隔2周，用相同剂量的抗原与不完全弗氏佐剂(Sigma,Cat.No.:F5506)充分乳化后，经皮下免疫小鼠三次。三次免疫后测定小鼠血清效价，融合前3天经腹腔进行加强免疫。以PEG Hybri-Max(Sigma,Cat.No.:7181)作为融合剂，将小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞按照4:1的比例混合。将融合后的细胞加入到96孔板中 (1×105细胞/孔)，每孔含有0.1mL 1×HAT(Invitrogen,Cat.No.:21060-017)培养基。在第3天加入0.1mL HT(Invitrogen,Cat.No.:11067-030)培养基，在第7天吸掉96孔板中的培养基，补加0.2mL新鲜的HT培养基。在第9天，收取上清液进行ELISA检测。
与IL-23结合的抗体ELISA筛选。用IL-23-His蛋白包被96孔ELISA板(Corning,Cat. No.:9018)，置室温过夜，用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次后，加入封闭缓冲液(PBS+1％BSA(Sigma,Cat.No.:V90093))孵育1小时；洗涤96孔板3次；加入杂交瘤上清液孵育1小时，洗涤3次；每孔加入100μL 1:10000倍稀释的羊抗鼠IgG二抗(Thermo,Cat.No.:31432)，室温孵育1小时后洗涤3次；每孔加入100μL TMB(北京百奥赛博，Cat.No.:ES-002)显色3分钟，再加入100μL/孔的终止液(2N H2SO4)终止反应，用Tecan Spark酶标仪测定各样品的OD450信号。
阻断IL-23与IL-23R结合的抗体的ELISA筛选。采用竞争ELISA筛选能够阻断IL-23与IL-23R结合的杂交瘤抗体。用IL-23R-hFc包被96孔ELISA板，孵育过夜，用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween 20)洗涤3次后，加入200μL封闭缓冲液，孵育1小时；洗涤3次后加入100μL杂交瘤上清与IL-23-His-biotin的预混合液，室温孵育1小时；洗涤3次，加入二抗 AvidinHRP(Invitrogen，Cat.No.:18-4100-51)，孵育30分钟，加入TMB显色3分钟，用 100μL/孔的终止液(2N H2SO4)终止反应，用酶标仪测定各样品的OD450信号。
用有限稀释法对IL-23杂交瘤细胞进行亚克隆，随后采用ELISA方法进行检测筛选，获得阳性杂交瘤单克隆。将阳性单克隆杂交瘤置50mL无血清培养基中(Invitrogen,Cat.No.: 12045-076)培养8-9天后，离心收取上清液。用Protein A亲和层析纯化单克隆抗体，纯化后的抗体样品经超滤离心管(Millipore,Cat.No.:ACS500024)换液浓缩后，用BCA方法测定蛋白浓度，用鳌试剂(厦门鲎试剂生物科技股份有限公司)检测抗体样品的内毒素含量。用ELISA方法检测纯化的抗体样品与IL-23的结合及其阻断IL-23与IL-23R结合的活性，具体结果见图1-2，IL-23杂交瘤抗体能够与人IL-23蛋白结合，并抑制人IL-23与IL-23R的结合。IL-23杂交瘤抗体1A12与人IL-23结合的EC50为14.99ng/ml，IL-23杂交瘤抗体1A12阻断人IL-23结合IL-23R的IC50为173.2ng/ml。
实施例2
IL-23抗体可变区基因的克隆
用TRIzon(Cwbiotech,Cat.No.:CW0580)裂解IL-23单克隆杂交瘤细胞株，提取杂交瘤细胞的总RNA。用HiFi Script cDNA合成试剂盒(Cwbiotech,Cat.No.:CW2569)将杂交瘤细胞的RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，用简并引物通过PCR方法(Kettleborough,etal.,(1993)Eur.J.Immunology，23:206-211；Strebe,et al.,(2010)AntibodyEngineering，1:3- 14)扩增抗体的重链和轻链的可变区基因。将PCR扩增产物连接到T/A载体后，转化DH5a 感受态细胞，涂板并置37℃过夜培养。从培养板上挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，测定抗体的基因序列。根据抗体的基因序列，分析其互补决定簇(CDR)和骨架区。抗体的重链和轻链的可变区氨基酸序列和CDR氨基酸序列见表1。
表1.IL-23杂交瘤抗体及CDR区的序列表。
Figure BDA0003269215900000041
实施例3
鼠源IL-23抗体的人源化
采用互补决定簇嫁接法进行IL-23抗体的人源化改造。首先，在IMGT数据库中搜寻与鼠源1A12抗体的轻、重链可变区序列同源性最高的人胚系抗体(germline antibody)序列。 1A12抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV1-27*01，重链可变区人源化选取IGHV3- 21*01。保留鼠源抗体的CDR区，将鼠源抗体的框架区(framework)序列用人胚系抗体的框架区序列置换。建立鼠源抗体的结构模型，逐个对比人源抗体与相应鼠源抗体框架区中每个位点的氨基酸，如果框架区的某个位点采用人的氨基酸序列没有导致CDR区域空间结构的破坏或改变，则该位点使用人的氨基酸序列，否则在该位点使用对应的鼠源序列(即回复突变为鼠源序列)。
根据结构模拟，将1A12抗体人源化重链的第49位Ser回复突变为Ala。将1A12抗体人源化轻链的第48位Ile回复突变为Val。
1A12人源化抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：11。将1A12人源化抗体构建为IgG1亚型。为了增加人源化程度，将重链第49位Ala 突变为Ser，轻链第50位Asn突变为Ala或轻链第52位Lys突变为Ser。人源化抗体的重链和轻链的可变区氨基酸序列见表2。
表2.IL-23人源化抗体的序列表。
Figure BDA0003269215900000051
合成编码1A12人源化抗体轻链和重链，并***到表达载体pcDNA3.1。用抗体轻链和重链表达质粒各0.1mg共转染200毫升293细胞(细胞密度为1×106)，在37度振摇培养6天，离心收集上清液，用Protein A纯化人源化抗体，纯化后的人源化抗体用于活性检测。
实施例4
人源化IL-23抗体的活性检测
采用ELISA方法检测纯化的人源化抗体样品与IL-23的结合，及其阻断IL-23与IL-23R结合的活性，具体方法参考实施例1。人源化抗体的活性测定结果见图3-5。结果表明，人源化IL-23抗体hu1A12结合人IL-23的EC50是8.992ng/mL，结合猴IL-23的EC50 是13.33ng/mL，IL-23人源化抗体hu1A12阻断人IL-23结合人IL-23R的IC50是204.8 ng/mL。
实施例5
IL-23人源化抗体对小鼠脾细胞分泌mIL-17的影响
无菌研磨过滤C57/BL6小鼠脾脏，将新鲜脾细胞离心，用2mL红细胞裂解液重悬细胞并室温静置3分钟，加入50mL RPMI1640完全培养基，颠倒混匀后置于离心机中1500rpm离心5分钟，弃上清，用完全培养基重悬细胞并计数。在96孔板中，加入100μL含有 CD3ε抗体(终浓度：1μg/mL)的脾细胞(4×105/孔)。稀释配制不同浓度的IL-23抗体 (终浓度为20μg/mL，10倍梯度稀释，5-8个浓度)，分别与rhIL-23(终浓度：10 ng/mL)混匀并室温孵育1小时，转移100μL抗体/抗原混合液至对应细胞孔中，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中孵育4天，收集上清液。用IL-17ELISA试剂盒 (R&D Systems,Cat.No.:DY421)检测上清中的mIL-17细胞因子浓度，测定结果见图6。实验数据显示，人源化IL-23抗体具有显著抑制小鼠脾细胞分泌mIL-17的作用，抗体的 IC50是3.266ng/ml，活性优于阳性对照抗体。
实施例6
IL-23人源化抗体对人外周血淋巴细胞(PBMC)分泌细胞因子的影响
在50mL无菌离心管中加入淋巴细胞分离液Histopaque(Sigma,Cat.No.:1077-1)，然后加入等体积的新鲜血液，在室温用1500rpm离心30min。样品在离心管中分成四层，从上至下分别为血浆层，白细胞层，淋巴细胞分离液和红细胞层。将中间的白细胞层收集到新的离心管中，加入5倍体积的洗涤缓冲液(PBS+3％FBS)混匀洗涤，于1500rpm离心 10min，共重复洗涤3次，用洗涤缓冲液重悬细胞并计数。在96孔板中，每孔加入100μL PBMC细胞(1×105)、IL-23(10ng/ml)、IL-18(50ng/ml)以及100μL不同浓度的IL-23抗体 (起始浓度为20μg/mL，10倍系列稀释)，将96孔细胞培养板置于37℃,5％CO2培养箱中孵育48小时，收集上清液。用IFN-γELISA试剂盒(R&D Systems,Cat.No.:DY285) 检测细胞因子的浓度，测定结果见图7a、图7b。实验数据显示，人源化IL-23抗体具有显著抑制PBMC细胞分泌IFN-γ的作用，且活性优于阳性对照抗体。为了增加人源化程度，将轻链第52位Lys突变为Ser，或将重链第49位Ala突变为Ser和轻链第50位Asn突变为 Ala，突变后的抗体仍具有显著抑制PBMC细胞分泌IFN-γ的作用。
实施例7
IL-23人源化抗体在银屑病小鼠模型中的作用
本实验选择7周龄C57BL/6小鼠，随机分成3组，每组5只。第一组仅注射同型对照抗体IgG1(阴性对照)，第二组注射重组人IL-23蛋白和同型对照抗体IgG1，第三组注射重组人IL-23蛋白和IL-23人源化抗体。同型对照抗体IgG1和IL-23人源化抗体通过腹腔注射给药，注射量为3mg/kg，每隔两天注射一次；重组人IL-23蛋白通过30号针头注射到被麻醉的小鼠右耳皮内，注射量为500ng，注射体积为20μL，缓冲液为PBS，隔天接种一次。实验结束，用定量PCR测定右耳组织IL-17的mRNA水平，对小鼠耳朵做组织切片分析。实验结果如图8a和图8b，与同型对照抗体相比，人源化IL-23抗体能显著降低IL-17mRNA 水平，并改善耳朵组织厚度和结构，表明人源化IL-23抗体对IL-23的活性有显著抑制作用。
以上实施例的结果表明，本发明所述的单克隆抗体或者抗原结合片段，以及包含本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段的偶联物在制备阻断IL-23与IL-23R结合的药物、调节 IL-23活性或IL-23表达水平的药物、调节机体免疫的药物、抑制PBMC细胞表达INF-γ的药物、以及在预防和治疗或者辅助治疗自身免疫疾病的药物方面具有良好的应用前景。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即依本发明权利要求书及说明书内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 东大生物技术（苏州）有限公司
<120> 一组IL-23单克隆抗体及其医药用途
<130> 2021
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> artificial
<400> 1
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Ser Arg Tyr Val Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Pro Glu Arg Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Asn Ile Asn Ser Leu Gln Pro
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<213> artificial
<400> 3
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<212> PRT
<213> artificial
<400> 4
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Ala Lys
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Gly
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<213> artificial
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<213> artificial
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Claims (8)

1.IL-23单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：3；所述重链的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；所述重链的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；所述轻链的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：6；所述轻链的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：7；所述轻链的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：8；其中所述抗原结合片段的重链和轻链包含分别跨越所述抗体的重链和轻链的CDR1到CDR3的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的IL-23单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
3.根据权利要求1所述的IL-23单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链和轻链经过人源化；人源化后的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：9、10；人源化后的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：11、12、13。
4.权利要求1-3任一项所述的IL-23单克隆抗体或其抗原结合片段在制备如下药物中的用途：阻断IL-23与IL-23受体结合的药物、调节IL-23活性或IL-23水平的药物、调节IL-23对机体免疫激活的药物、调节T淋巴细胞的药物或者调节T淋巴细胞中INF-γ表达的药物。
5.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3任一项所述的IL-23单克隆抗体或其抗原结合片段。
6.表达载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求5所述的核酸分子的序列以及与该序列相关的表达调控序列。
7.一种单克隆抗体偶联物，其特征在于，包括单克隆抗体和偶联部分，其中，所述单克隆抗体为权利要求1-3任一项所述的IL-23单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、细胞因子受体片段、酶、荧光素、和生物素中的一种或多种。
8.表达权利要求1-3任一项所述的IL-23单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子、表达载体、宿主细胞在制备如下药物中的用途：阻断IL-23与IL-23受体结合的药物、调节IL-23活性或IL-23水平的药物、调节IL-23对机体免疫激活的药物、调节T淋巴细胞的药物或者调节T淋巴细胞中INF-γ表达的药物。
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