JP2022552323A - 組換え操作された、リパーゼ／エステラーゼ欠損哺乳動物細胞株 - Google Patents
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Abstract
リパーゼ／エステラーゼの発現および／または活性が減少した哺乳動物細胞株、ならびにこれらを産生するための方法が提供される。また、ポリソルベート安定性が向上した、ポリソルベートおよび当該哺乳動物細胞において産生された組換えタンパク質を含む組成物も提供される。【選択図】なし
Description
本発明は、操作された哺乳動物細胞株、それを産生する方法、当該細胞株において組換えタンパク質を産生する方法、および当該細胞株において産生された組換えタンパク質を含む組成物に関する。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞は、治療用タンパク質、ペプチド、およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む、組換えタンパク質を産生するためにバイオ医薬品業界において広範に使用されている。バイオ製品の製造プロセスでは、組換えタンパク質を含有する安全で効果的な薬物、診断、および／または研究試薬製品を産生するために、同時に産生された宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去または減少させる必要がある。バイオ製品製造において組換えタンパク質を精製するために、多種多様な精製技術が利用されてきた。しかしながら、ＨＣＰは、哺乳動物細胞において産生された組換えタンパク質から分離することが困難であり得る。したがって、ＨＣＰは、特に治療用バイオ製品の製造において、組換えタンパク質の産生に重大な課題を提示し得る。バイオ製品の製造のために使用される哺乳動物細胞における問題のあるＨＣＰの発現または活性のいずれかを減少させるための方法は、組換えタンパク質の製造に必要な精製プロセスの複雑さを大幅に減少させることができる。ＨＣＰが減少した細胞株を使用すると、多くの場合、より安定した、より安全な、および／またはより効果的な組換えタンパク質ベースの薬物、診断法、および／または診断研究試薬が得られる。
組換えタンパク質製品の産生では、生物医学製剤においてポリソルベートが、多くの場合、製造、出荷、および保管中のタンパク質の安定性を向上させるために使用される。ポリソルベートは、特に界面応力に起因する凝集および粒子形成、ならびに有効成分の表面接着を減少させることにより、バイオ製品の安定性を向上させることができる。しかしながら、特定のリパーゼ／エステラーゼの存在下でのポリソルベート（これはポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステルである）は、分解を受けて長鎖脂肪酸を放出する可能性がある。これは、例えば、エステル加水分解によって発生する可能性がある。ポリソルベート分解は、医薬品有効成分（ＡＰＩ）を保護する際の界面活性剤の有効性を低下させ、時間の経過とともに製剤の濁りおよび粒子形成を引き起こし、製品を非準拠にし、その貯蔵寿命を制限する可能性があり、ポリソルベート分解生成物は、患者の安全性リスクに対してリスクを示す場合がある。ポリソルベート洗浄剤の酵素分解の原因となる細胞リパーゼ／エステラーゼを低下させるか、または排除することによって、ポリソルベート洗浄剤を含有する組換え産生されたバイオ製品製剤の貯蔵寿命を増加させることができる。廃棄物を減少させ、流通ネットワークを有効にする組換え製品の効率的な供給には、貯蔵寿命の増加が重要である。
国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５３４８２、ＷＯ２０１６／１３８４６７、ＷＯ２０１８／０３９４９９、およびＷＯ２０１５／０９５５６８は、様々なリパーゼ／エステラーゼを含む、哺乳動物細胞における問題のあるＨＣＰの発現を減少させる方法を記載している。しかしながら、どのリパーゼ／エステラーゼが、ポリソルベート分解に関連する特定の問題を引き起こすかは、多くの場合、不明確である。したがって、組換えタンパク質産生法およびポリソルベート含有バイオ製品製剤における残留哺乳動物細胞リパーゼ／エステラーゼ活性の問題により効果的に対処する、操作されたリパーゼ／エステラーゼ欠損哺乳動物細胞に対する重大な必要性が依然として存在する。本発明は、とりわけ、ポリソルベート分解宿主細胞タンパク質汚染物質が著しく少ないバイオ製品の製造を可能にし、ポリソルベート含有バイオ製品製剤における安定性を著しく向上させる、遺伝子操作された宿主細胞を提供する。
一態様では、少なくとも１つの内因性パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ（ＰＰＴ）、ならびにリソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＡ２、およびホスホリパーゼＤからなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰの減少した発現、ならびに／または活性を有する、哺乳動物細胞が提供される。
別の態様では、タンパク質製剤中のポリソルベート分解を減少させるための方法であって、
（ａ）宿主細胞を修飾して、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）タンパク質の発現を減少させるか、または排除するステップと、
（ｂ）宿主細胞を修飾して、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）、および／またはホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）の発現を減少させるか、または排除するステップと、
（ｃ）細胞にバイオ製品をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップと、
（ｄ）宿主細胞から目的のタンパク質を含むタンパク質画分を抽出するステップと、
（ｅ）タンパク質画分を、プロテインＡアフィニティー（ＰＡ）クロマトグラフィーもしくは別のアフィニティークロマトグラフィー法、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、クロマトグラフィー媒体と接触させるステップと、
（ｆ）媒体から目的のタンパク質を収集するステップと、
（ｇ）バイオ製品を脂肪酸エステルと混合するステップと、
（ｈ）任意選択により、緩衝液を添加するステップと、
（ｉ）任意選択により、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を添加するステップとを含む、方法が提供される。
（ａ）宿主細胞を修飾して、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）タンパク質の発現を減少させるか、または排除するステップと、
（ｂ）宿主細胞を修飾して、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）、および／またはホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）の発現を減少させるか、または排除するステップと、
（ｃ）細胞にバイオ製品をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップと、
（ｄ）宿主細胞から目的のタンパク質を含むタンパク質画分を抽出するステップと、
（ｅ）タンパク質画分を、プロテインＡアフィニティー（ＰＡ）クロマトグラフィーもしくは別のアフィニティークロマトグラフィー法、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、クロマトグラフィー媒体と接触させるステップと、
（ｆ）媒体から目的のタンパク質を収集するステップと、
（ｇ）バイオ製品を脂肪酸エステルと混合するステップと、
（ｈ）任意選択により、緩衝液を添加するステップと、
（ｉ）任意選択により、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を添加するステップとを含む、方法が提供される。
別の態様では、タンパク質製剤中の凝集または粒子形成を減少させるための方法であって、
（ａ）宿主細胞を修飾して、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）タンパク質の発現を減少させるか、または排除するステップと、
（ｂ）宿主細胞を修飾して、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）、および／またはホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）の発現を減少させるか、または排除するステップと、
（ｃ）細胞に目的のバイオ製品をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップと、
（ｄ）宿主細胞から目的のタンパク質を含むタンパク質画分を抽出するステップと、
（ｅ）タンパク質画分を、プロテインＡアフィニティー（ＰＡ）クロマトグラフィーもしくは別のアフィニティークロマトグラフィー法、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、クロマトグラフィー媒体と接触させるステップと、
（ｆ）媒体から目的のタンパク質を収集するステップと、
（ｇ）目的のタンパク質を脂肪酸エステルと混合するステップと、
（ｈ）任意選択により、緩衝液を添加するステップと、
（ｉ）任意選択により、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を添加するステップとを含む、方法が提供される。
（ａ）宿主細胞を修飾して、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）タンパク質の発現を減少させるか、または排除するステップと、
（ｂ）宿主細胞を修飾して、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）、および／またはホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）の発現を減少させるか、または排除するステップと、
（ｃ）細胞に目的のバイオ製品をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップと、
（ｄ）宿主細胞から目的のタンパク質を含むタンパク質画分を抽出するステップと、
（ｅ）タンパク質画分を、プロテインＡアフィニティー（ＰＡ）クロマトグラフィーもしくは別のアフィニティークロマトグラフィー法、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、クロマトグラフィー媒体と接触させるステップと、
（ｆ）媒体から目的のタンパク質を収集するステップと、
（ｇ）目的のタンパク質を脂肪酸エステルと混合するステップと、
（ｈ）任意選択により、緩衝液を添加するステップと、
（ｉ）任意選択により、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を添加するステップとを含む、方法が提供される。
別の態様では、安定な製剤化したバイオ製品を産生するための方法であって、
（ａ）宿主細胞を修飾して、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）タンパク質の発現を減少させるか、または排除するステップと、
（ｂ）宿主細胞を修飾して、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）、および／またはホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）の発現を減少させるか、または排除するステップと、
（ｃ）細胞にバイオ製品をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップと、
（ｄ）宿主細胞からバイオ製品を含むタンパク質画分を抽出するステップと、
（ｅ）タンパク質画分を、プロテインＡアフィニティー（ＰＡ）クロマトグラフィーもしくは別のアフィニティークロマトグラフィー法、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、クロマトグラフィー媒体と接触させるステップと、
（ｆ）媒体からバイオ製品を収集するステップと、
（ｇ）バイオ製品を脂肪酸エステルと混合するステップと、
（ｈ）任意選択により、緩衝液を添加するステップと、
（ｉ）任意選択により、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を添加するステップとを含む、方法が提供される。
（ａ）宿主細胞を修飾して、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）タンパク質の発現を減少させるか、または排除するステップと、
（ｂ）宿主細胞を修飾して、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）、および／またはホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）の発現を減少させるか、または排除するステップと、
（ｃ）細胞にバイオ製品をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップと、
（ｄ）宿主細胞からバイオ製品を含むタンパク質画分を抽出するステップと、
（ｅ）タンパク質画分を、プロテインＡアフィニティー（ＰＡ）クロマトグラフィーもしくは別のアフィニティークロマトグラフィー法、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、クロマトグラフィー媒体と接触させるステップと、
（ｆ）媒体からバイオ製品を収集するステップと、
（ｇ）バイオ製品を脂肪酸エステルと混合するステップと、
（ｈ）任意選択により、緩衝液を添加するステップと、
（ｉ）任意選択により、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を添加するステップとを含む、方法が提供される。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体の実施形態には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体、またはコンジュゲート抗体が含まれる。抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ）、および任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）であってもよい。
本開示の例示的な抗体は、４つのポリペプチド鎖：鎖間ジスルフィド結合を介して架橋される２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）から構成される免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体である。４つのポリペプチド鎖の各々のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１２５個以上のアミノ酸の可変領域を含む。４つのポリペプチド鎖の各々のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を含有する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域から構成される。ＩｇＧアイソタイプは、さらにサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）に分割され得る。
ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域にさらに細分され得る。ＣＤＲはタンパク質の表面上に露出しており、抗原結合特異性のための抗体の重要な領域である。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されており、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。本明細書では、重鎖の３つのＣＤＲを「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称し、軽鎖の３つのＣＤＲを「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称する。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。アミノ酸残基のＣＤＲへの割り当ては、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６，９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７－９４８（１９９７））、Ｎｏｒｔｈ（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６（２０１１））、またはＩＭＧＴ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能な国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：２０９－２１２を参照のこと）に記載されているものを含む、周知のスキームに従って行われ得る。
本開示の実施形態はまた、本明細書で使用される場合、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ｓｃＦａｂ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｄ断片などの、抗原または抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する抗体の少なくとも一部を含む、Ｆｃ断片、または抗原結合断片を含むが、これらに限定されない、抗体断片も含む。
本明細書で使用される場合、「脂肪酸ヒドロラーゼ」または「ＦＡＨ」という用語は、カルボニル基で切断してカルボン酸生成物を生成する任意の加水分解酵素を指すことを意図し、そのカルボン酸は、親油性またはそうでなければ疎水性であるＲ基を含む。場合によっては、カルボン酸生成物は脂肪酸である。
「ポリソルベート」という用語は、ポリエトキシル化ソルビタンの脂肪酸エステルである非イオン性界面活性剤を指す。生物医学製剤で使用されるポリソルベートの例には、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート４０（ＰＳ４０）、ポリソルベート６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート６５（ＰＳ６５）、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物中のポリソルベートの濃度は、本発明の組成物中で、約０．０１重量％～約１重量％、好ましくは約０．０１重量％～約０．１０重量％、より好ましくは約０．０１重量％～約０．０５重量％、さらにより好ましくは約０．０２重量％～約０．０５重量％であってもよい。
本明細書で使用される場合、「リパーゼ／エステラーゼ」という用語は、「エステラーゼ」および「リパーゼ」の両方からなる哺乳動物細胞酵素の群を意味することを意図する。「エステラーゼ」は、脂肪酸エステルを脂肪酸およびアルコールに切断する脂肪酸ヒドロラーゼの亜属である。「リパーゼ」は、脂質（脂肪、ワックス、ステロール、グリセリド、およびリン脂質）を切断するエステラーゼの亜属である。「ホスホリパーゼ」は、リン脂質を切断するリパーゼの亜属である。
パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）は、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼファミリーのメンバーであり、リソソーム分解中の脂質修飾タンパク質の異化に関与し、脂肪酸パルミテートから形成されたチオエステルをタンパク質におけるシステイン残基から切断するリソソーム酵素である。一実施形態では、チャイニーズハムスターＰＰＴ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＰＰＴ１は、配列番号８の結合／切断領域核酸配列でＺＦＮによって修飾される。リソソームリパーゼ、リパーゼＡ、リソソーム酸およびコレステロールエステラーゼとしても知られている、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）は、リソソームで機能する細胞内リパーゼである。ＬＡＬは、コレステリルエステル結合の切断を触媒する。一実施形態では、チャイニーズハムスターＬＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＬＡＬは、配列番号７の結合／切断領域核酸配列でＺＦＮによって修飾される。
リポタンパク質リパーゼアイソフォームＸ２（本明細書ではＬＰＬと称される）は、実質細胞によって分泌され、毛細管腔の内皮細胞に関連するグリコシル化ホモ二量体である。一実施形態では、チャイニーズハムスターＬＰＬは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＬＰＬは、配列番号６の結合／切断領域核酸配列でＺＦＮによって修飾される。
グループＸＶリソソームホスホリパーゼＡ２アイソフォームＸ１（本明細書ではＬＰＬＡ２と称される）は、主要な脂質代謝酵素のファミリーのメンバーであり、膜リン脂質のｓｎ－２位から脂肪酸を切断する。一実施形態では、チャイニーズハムスターＬＰＬＡ２は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＬＰＬＡ２は、配列番号５の結合／切断領域核酸配列でＺＦＮによって修飾される
ＰＬＤ３は、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）脂質シグナル伝達酵素スーパーファミリーのメンバーである。ＰＬＤファミリーのメンバーは、ホスファチジルコリンを加水分解して、ホスファチジン酸およびコリンを生成することが知られている。ＰＬＤ３は、Ｎ－グリコシル化ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、他のＰＬＤファミリーのメンバー（例えば、ＰＬＤ１およびＰＬＤ２）にホスホジエステル加水分解活性を付与することが示されているＨＫＤモチーフを保持する。一実施形態では、チャイニーズハムスターＰＬＤ３は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＰＬＤ３は、配列番号１０の結合／切断領域核酸配列でＺＦＮによって修飾される。
「哺乳動物細胞」および「宿主細胞」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、組換えＤＮＡ技術を使用するバイオ製品の産生において一般的に使用される哺乳動物細胞を指す。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）、ならびにＮＳ０およびＳｐ２／０細胞を含むマウス骨髄腫細胞は、タンパク質発現のために一般的に使用される哺乳動物細胞である。好ましくは、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ－３、ＤＵＫＸ－Ｘ１１、ＤＧ４４、ＣＨＯＫ１ＳＶまたはＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯを含むが、これらに限定されない、ＣＨＯである。親細胞株はまた、組換えバイオ製品ポリペプチドの重要な品質特性もしくは他の翻訳後修飾、または組換えバイオ製品をコードする遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝子の挿入、ノックアウトまたはノックダウンによって修飾され得る。実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（グルタミンシンテターゼ）、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＦＵＴ８ノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、またはＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ ＧＳノックアウト細胞（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。ＣＨＯ ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ ＦＵＴ８ノックアウト（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。実施形態では、宿主細胞は、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５、ＨＴ１０８０、ＮＢ３２４Ｋ、ＦＬＹＲＤ１８、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、Ｙ０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１およびＣＯＳ７）、ＱＣ１－３、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（商標）（ＣＨＯＫ１ＳＶ ＦＵＴ８－ＫＯ）、ＣＨＯ ＧＳノックアウト、Ｘｃｅｅｄ（商標）（ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ）、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ ＤＸＢ１１、もしくはＣＨＯＺＮ細胞、またはそれらに由来する任意の細胞である。
本明細書において「親細胞株」という用語は、タンパク質発現を操作するために一般的に使用される哺乳動物細胞を発現する非トランスジェニックタンパク質生成物を指す。本発明のいくつかの実施形態では、親細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、またはＮＳ０細胞株である。好ましくは、親細胞株は、ＧＳ－ＣＨＯ（ＣＨＯＫ１ＳＶまたはＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ）細胞株を含むが、これらに限定されない、ＣＨＯ細胞株である。
「生成物を発現する細胞株」という用語は、少なくとも１つのバイオ製品をコードする１つ以上の遺伝子が挿入され、そのようなタンパク質または複数のタンパク質を発現することができる「親細胞株」を指す。好ましくは、「生成物を発現する細胞株」は、抗体、またはその抗原結合断片を発現する。
「インデル」という用語は、細胞のゲノムにおける核酸塩基の挿入または欠失を指す。
本明細書で使用される場合、「バイオ製品」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して遺伝子操作された哺乳動物細胞に由来する目的の組換えタンパク質ベースの製品を指す。例えば、バイオ製品には、抗体、その抗原結合断片、ワクチン、成長因子、サイトカイン、ホルモン、ペプチド、酵素、融合タンパク質が含まれ得る。好ましくは、バイオ製品は、治療的、診断的、工業的、および／または研究用途に有用である。
「不活性化された遺伝子」という用語は、１）変更されていない野生型遺伝子によって最初にコードされたタンパク質の検出可能なレベルを発現しない、かつ／または２）変更された遺伝子によってコードされたタンパク質が、変更されていない野生型遺伝子によって最初にコードされたタンパク質と比較して、表現型的に非機能的である、ように変更されている遺伝子を指す。
「破壊された遺伝子」という用語は、１）変更されていない野生型遺伝子が最初にコードしたタンパク質の発現が減少している、かつ／または２）変更された遺伝子によってコードされたタンパク質の活性が、変更されていない野生型遺伝子によってコードされたタンパク質の活性と比較して、減少している、ように変更されている遺伝子を指す。
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために交換可能に使用される。ポリマーは線状または分枝状であってもよく、それは修飾されたアミノ酸を含んでもよく、それは非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語はまた、自然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。また、定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、および当該技術分野で既知の他の修飾を含有するタンパク質も含まれる。タンパク質の例には、抗体、ペプチド、酵素、受容体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤、サイトカイン、Ｆｃ融合タンパク質（例えば、目的のペプチド／タンパク質に遺伝的に結合しているＩｇＧのＦｃドメイン）、イムノアドヘシン分子などが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の一態様では、少なくとも１つの内因性パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ（ＰＰＴ）、ならびにリソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＡ２、およびホスホリパーゼＤからなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰの減少した発現、ならびに／または活性を有する、哺乳動物細胞が提供される。本発明の別の態様では、哺乳動物細胞は、少なくとも１つのバイオ製品を発現するようにさらに修飾される。バイオ製品は、例えば、１）ポリペプチド、２）抗体、もしくはその抗原結合断片を含むが、これに限定されない、その断片、または３）Ｆｃ融合タンパク質を含むが、これに限定されない、タンパク質－タンパク質融合であってもよい。
本発明の一態様では、内因性パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）、ならびにリソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）、およびホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰの減少した発現、ならびに／または活性を有する、哺乳動物細胞が提供される。
本発明の一態様では、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）タンパク質、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）タンパク質、ホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）タンパク質、およびパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコード配列において修飾を有し、その修飾が、当該修飾のうちのいずれも有しない細胞の発現レベルと比較して、修飾を有する細胞においてＬＡＬタンパク質、ＬＰＬタンパク質、ＬＰＬＡ２タンパク質、およびＰＰＴ１タンパク質の発現レベルを低下させる、哺乳動物細胞が提供される。
本発明の別の態様では、哺乳動物細胞は、少なくとも１つのバイオ製品を発現するようにさらに修飾される。バイオ製品は、例えば、１）ポリペプチド、２）抗体、もしくはその抗原結合断片を含むが、これに限定されない、その断片、または３）Ｆｃ融合タンパク質であってもよい。
本発明の別の態様では、内因性ＰＰＴ、ならびにＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つの他のポリソルベート分解ＨＣＰをコードする細胞の遺伝子が修飾され、それによって内因性ＰＰＴ１および他の分泌ＨＣＰの発現ならびに／または活性が減少している、哺乳動物細胞が提供される。好ましくは、内因性ＰＰＴ１、ならびにＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰの活性ならびに／または発現は、実質的に減少しているか、または完全に排除されている。別の態様では、内因性ＰＰＴ１、ならびにＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰをコードする遺伝子が、それらのＨＣＰの発現ならびに／または活性が減少するように修飾されている、哺乳動物細胞を産生するための方法が提供される。好ましくは、内因性ＰＰＴ１、ならびにＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰの活性ならびに／または発現は、実質的に減少しているか、または完全に排除されている。本発明の別の態様では、本明細書に記載される哺乳動物細胞の実施形態において組換えタンパク質を産生する方法が提供される。本明細書に記載される哺乳動物細胞の実施形態から産生された材料は、加水分解ポリソルベート分解を示さないか、または著しく減少させ、関連するリパーゼ活性を、（脂肪分解活性アッセイなどで）本質的に測定することができない。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞から産生されたバイオ製品は、修飾のうちのいずれも有しない本質的に類似の細胞において産生された同じバイオ製品のポリソルベート分解活性と比較して、実質的に減少したポリソルベート分解活性を有するプロテインＡ結合画分を提供する。いくつかの実施形態では、対応する修飾されていない生成物を発現する細胞株で産生された同じバイオ製品から生じるインタクトなポリソルベートの分解と比較した、本発明の生成物を発現する細胞株で産生されたバイオ製品から生じるインタクトなポリソルベートの分解の減少は、約２０％以上、２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、または約８０％以上である。いくつかの実施形態では、対応する修飾されていない生成物を発現する細胞株で産生された同じバイオ製品から生じるインタクトなポリソルベートの分解と比較した、本発明の生成物を発現する細胞株で産生されたバイオ製品から生じるインタクトなポリソルベートの分解の減少は、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、または８０％以上である。
いくつかの実施形態では、対応する修飾されていない生成物を発現する細胞株で産生された同じバイオ製品から生じるインタクトなポリソルベートの分解と比較した、本発明の生成物を発現する細胞株で産生されたバイオ製品から生じるインタクトなポリソルベートの分解の減少は、約２０％～約８０％、約３０％～約７５％、約３５％～約７０％、約４０％～約６５％、または約４５％～約６０％である。
いくつかの実施形態では、対応する修飾されていない生成物を発現する細胞株で産生された同じバイオ製品から生じるインタクトなポリソルベートの分解と比較した、本発明の生成物を発現する細胞株で産生されたバイオ製品から生じるインタクトなポリソルベートの分解の減少は、２０％～８０％、３０％～７５％、３５％～７０％、４０％～６５％、および４５％～６０％である。
本発明の一態様では、遺伝子編集方法を利用して、内因性ＰＰＴ１をコードする遺伝子、ならびにＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰをコードする遺伝子を標的として、例えば、ゲノム遺伝子座の修飾、挿入、または欠失のために、それらを編集、破壊、および／または不活性化する。いくつかの実施形態では、内因性宿主細胞タンパク質、ＰＰＴ１、ならびにＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰの一方または両方の対立遺伝子は、本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のゲノムからノックアウトされる。例えば、遺伝子編集方法には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびメガヌクレアーゼシステムの使用が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の一態様では、ＬＡＬタンパク質、ＬＰＬタンパク質、ＬＰＬＡ２タンパク質、および内因性ＰＰＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列における修飾を含む、組換え操作された哺乳動物細胞が提供される。本発明の別の態様では、修飾は、修飾を欠く細胞、例えば、野生型哺乳動物細胞の発現レベルと比較して、ＬＡＬタンパク質、ＬＰＬタンパク質、ＬＰＬＡ２タンパク質、およびＰＰＴ１タンパク質の発現レベルを低下させる。
いくつかの実施形態では、標的ＨＣＰ遺伝子は、遺伝子欠失によって編集、破壊、および／または不活性化される。本明細書で使用される場合、「遺伝子欠失」は、遺伝子から、または遺伝子に近接したＤＮＡ配列の少なくとも一部を除去することを指す。いくつかの実施形態では、遺伝子欠失に供される配列は、遺伝子のエクソン配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子欠失に供される配列は、遺伝子のプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子欠失に供される配列は、遺伝子の隣接配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子欠失に供される配列は、標的化されたＨＣＰのシグナルペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、標的ＨＣＰ遺伝子配列の一部は、標的ＨＣＰ遺伝子から、または標的ＨＣＰ遺伝子に比較的近接した領域から除去される。いくつかの実施形態では、完全な標的ＨＣＰ遺伝子配列は、染色体から除去される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、標的ＨＣＰ遺伝子に近接した遺伝子欠失を含む。いくつかの実施形態では、標的ＨＣＰ遺伝子は、遺伝子欠失によって編集、破壊、および／または不活性化され、遺伝子配列中の少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対の欠失は、非機能的遺伝子産物をもたらす。いくつかの実施形態では、標的ＨＣＰ遺伝子は、遺伝子欠失によって編集、破壊、および／または不活性化され、遺伝子配列の少なくとも１つのヌクレオチドの欠失は、もはやもとの遺伝子産物の機能もしくは活性を有しないか、または機能不全である遺伝子産物をもたらす。
いくつかの実施形態では、標的ＨＣＰ遺伝子は、遺伝子付加または置換によって編集、破壊、および／または不活性化される。本明細書で使用される場合、「遺伝子付加」または「遺伝子置換」は、１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対の挿入または置換を含む、標的ＨＣＰ遺伝子配列の変更を指す。いくつかの実施形態では、標的ＨＣＰ遺伝子のイントロン配列が変更される。いくつかの実施形態では、標的ＨＣＰ遺伝子のエクソン配列が変更される。いくつかの実施形態では、標的ＨＣＰ遺伝子のプロモーター配列が変更される。いくつかの実施形態では、標的ＨＣＰ遺伝子の隣接配列が変更される。いくつかの実施形態では、標的ＨＣＰのシグナルペプチドをコードする配列が変更される。いくつかの実施形態では、１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対が、標的ＨＣＰ遺伝子配列に付加される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの連続したヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対が、標的ＨＣＰ遺伝子配列に付加される。いくつかの実施形態では、標的ＨＣＰ遺伝子が、遺伝子付加または置換によって不活性化され、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対の標的ＨＣＰ遺伝子配列への付加または置換が、非機能的遺伝子産物をもたらす。いくつかの実施形態では、標的ＨＣＰ遺伝子が、遺伝子不活性化によって不活性化され、少なくとも１つのヌクレオチドの標的ＨＣＰ遺伝子配列への組み込みまたは置換が、もはやもとの遺伝子産物の機能もしくは活性を有しないか、または機能不全である遺伝子産物をもたらす。
一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９などのカスパーゼタンパク質と、目的の配列に相補的である、ガイド配列と称される、ヌクレオチド配列を含むＲＮＡ配列と、を含む。カスパーゼおよびＲＮＡ配列は、哺乳動物細胞のＤＮＡ配列を特定する複合体を形成し、その後、カスパーゼのヌクレアーゼ活性により、ＤＮＡ鎖の切断が可能になる。カスパーゼアイソタイプは、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有する。ＣＲＩＳＰＲシステムで使用されるガイドＲＮＡ配列およびガイドＲＮＡ配列の数の設計により、遺伝子の特定のストレッチの除去および／またはＤＮＡ配列の付加が可能になる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、およびメガヌクレアーゼシステムからなる群から選択される少なくとも１つのゲノム編集システムを使用して、内因性ＰＰＴ１をコードする遺伝子、ならびにＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰをコードする遺伝子を編集、破壊、および／または不活性化することを含む。
一般に、ＴＡＬＥＮシステムは、１つ以上の制限ヌクレアーゼおよび２つ以上のタンパク質複合体を含み、ＤＮＡ配列の認識およびその後の二本鎖ＤＮＡの切断を可能にする。ＴＡＬＥＮシステムのタンパク質複合体は、各々が特定のヌクレオチドを認識する多数の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および制限ヌクレアーゼのドメインを含む。一般に、ＴＡＬＥＮシステムは、各々がＴＡＬＥおよび制限ヌクレアーゼのドメインを含む、２つのタンパク質複合体が、制限ヌクレアーゼの２つのドメイン（各タンパク質複合体から１つ）が、活性ヌクレアーゼを形成し、特定のＤＮＡ配列を切断することを可能にする方法でＤＮＡ配列に個別に結合するように設計されている。ＴＡＬＥＮシステムで切断されるタンパク質複合体および配列の数の設計により、遺伝子の特定のストレッチの除去および／またはＤＮＡ配列の付加が可能になる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＴＡＬＥＮシステムを使用して、内因性ＰＰＴ１をコードする遺伝子、ならびにＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰをコードする遺伝子を編集、破壊、および／または不活性化することを含む。
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞が、減少したレベルの内因性ＰＰＴ１、ならびに減少したレベルの、ＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰを有する、哺乳動物細胞を産生する方法は、ＴＡＬＥＮシステムを使用して、内因性ＰＰＴ１、ならびに他の標的ＨＣＰ遺伝子（すなわち、ＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３）のうちの少なくとも１つを編集、破壊、および／または不活性化することを含む。
一般に、ＺＦＮシステムは、１つ以上の制限ヌクレアーゼおよび２つ以上のタンパク質複合体を含み、ＤＮＡ配列の認識およびその後の二本鎖ＤＮＡの切断を可能にする。ＺＦＮシステムのタンパク質複合体は、各々が特定のヌクレオチドコドンを認識する多数のジンクフィンガー、および制限ヌクレアーゼのドメインを含む。一般に、ＺＦＮシステムは、各々がジンクフィンガーおよび制限ヌクレアーゼのドメインを含む、２つのタンパク質複合体が、制限ヌクレアーゼの２つのドメイン（各タンパク質複合体から１つ）が、活性ヌクレアーゼを形成し、特定のＤＮＡ配列を切断することを可能にする方法でＤＮＡ配列に個別に結合するように設計されている。ＺＦＮシステムで切断されるタンパク質複合体および配列の数の設計により、遺伝子の特定のストレッチの除去および／またはＤＮＡ配列の付加が可能になる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＺＦＮシステムを使用して、内因性ＰＰＴ１をコードする遺伝子、ならびにＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰをコードする遺伝子を編集、破壊、ならびに／または不活性化することを含む。
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞が、減少したレベルの内因性ＰＰＴ１、ならびに減少したレベルの、ＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰを有する、哺乳動物細胞を産生する方法は、ＺＦＮシステムを使用して、内因性ＰＰＴ１、ならびに他の標的ＨＣＰ遺伝子（すなわち、ＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３）のうちの少なくとも１つを編集、破壊、および／または不活性化することを含む。
一般に、メガヌクレアーゼシステムは、１つ以上のメガヌクレアーゼを含み、ＤＮＡ配列の認識およびその後の二本鎖ＤＮＡの切断を可能にする。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、メガヌクレアーゼシステムを使用して、内因性ＰＰＴ１をコードする遺伝子、ならびにＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰをコードする遺伝子を編集、破壊、および／または不活性化することを含む。
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞が、減少したレベルの内因性ＰＰＴ１、ならびに減少したレベルの、ＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＰを有する、哺乳動物細胞を産生する方法は、メガヌクレアーゼシステムを使用して、内因性ＰＰＴ１、ならびに他の標的ＨＣＰ遺伝子（すなわち、ＬＡＬ、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、およびＰＬＤ３）のうちの少なくとも１つを編集、破壊、および／または不活性化することを含む。
本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、それらの細胞で産生される抗体のグリコシル化パターンを変更するためのさらなるゲノム修飾を含むことができる。減少したフコシル化などのグリコシル化パターンの変更は、抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を増加させることが示されている。例えば、ＦＵＴ８（フコシルトランスフェラーゼ８、またはａ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ）の両方の対立遺伝子をノックアウトした宿主細胞は、増強されたＡＤＣＣ活性を有する抗体を産生することができる（米国特許第６９４６２９２号を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、抗体のフコシル化を減少させる遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、例えば、ＦＵＴ８ゲノム遺伝子座の修飾、挿入、または欠失のために、編集、破壊、および／または不活性化されたＦＵＴ８遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＦＵＴ８の一方または両方の対立遺伝子は、本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のゲノムからノックアウトされる。このようなＦＵＴ８ノックアウト宿主細胞で産生された抗体は、増加したＡＤＣＣ活性を有し得る。グリコシル化に関与する他の酵素には、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ、ＧＤＰ－ケト－６－デオキシマンノース３，５－エピメラーゼ４，６－レダクターゼ、ＧＤＰ－ベータ－Ｌ－フコースピロホスホリラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ、およびフコキナーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、これらの酵素のうちの１つ以上をコードする不活性化された遺伝子を含み得る。一実施形態では、チャイニーズハムスターＦＵＴ８は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）はまた、それらが発現する組換えタンパク質の安定性に影響を及ぼすさらなるゲノム修飾を含むことができる。例えば、カテプシンＤ（ＣａｔＤ）は、Ｆｃ融合組換えタンパク質の分解に関与するＣＨＯ ＨＣＰとして同定されている（Ｒｏｂｅｒｔ，Ｆ．；ｅｔ ａｌ．“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｆｃ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＣＨＯ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２００９，１０４（６），１１３２－１１４１を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、例えば、ＣａｔＤゲノム遺伝子座の修飾、挿入、または欠失のために、編集、破壊、および／または不活性化されたＣａｔＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｔＤの一方または両方の対立遺伝子は、本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のゲノムからノックアウトされる。このようなノックアウト宿主細胞で産生された組換えタンパク質は、産生の間に分解をほとんど受けない可能性がある。一実施形態では、チャイニーズハムスターＣａｔＤは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣａｔＤは、配列番号１３の結合／切断領域核酸配列でＺＦＮによって修飾される。
本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）はまた、それらが発現する組換えタンパク質の不均質性に影響を及ぼすさらなるゲノム修飾を含むことができる。例えば、カルボキシペプチダーゼＤ（ＣｐＤ）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４モノクローナル抗体アイソタイプからＣ末端リジンを切断することができる（国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５３４８２を参照のこと）。これにより、電荷バリアントがもたらされる可能性があり、製造管理戦略が複雑になる可能性がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、例えば、ＣｐＤゲノム遺伝子座の修飾、挿入、または欠失のために、編集、破壊、および／または不活性化されたＣｐＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤの一方または両方の対立遺伝子は、本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のゲノムからノックアウトされる。このようなノックアウト宿主細胞で産生された組換えタンパク質は、低下した電荷バリアント不均質性を有し得る。一実施形態では、チャイニーズハムスターＣｐＤは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣｐＤは、配列番号１５の結合／切断領域核酸配列でＺＦＮによって修飾される。
本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）はまた、組換えタンパク質を製造する際に使用される下流のプロセスに影響を及ぼすさらなるゲノム修飾を含むことができる。例えば、ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）およびペルオキシレドキシン－１（ＰＲＤＸ１）は、タンパク質捕捉クロマトグラフィー後にＣＨＯ細胞で産生された組換えタンパク質における汚染物質として同定されたＨＣＰである（ＷＯ２０１６／１３８４６７およびＤｏｎｅａｎｕ，Ｃ．；ｅｔ ａｌ．“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｏｓｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｏｎｌｉｎｅ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．”ｍＡｂｓ ２０１２，４（１），２４－４４を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、例えば、ゲノム遺伝子座または複数の遺伝子座の修飾、挿入、または欠失のために、編集、破壊、および／または不活性化された、ＰＬＢＬ２およびＰＲＤＸ１からなる群のタンパク質の一方または両方をコードする遺伝子または複数の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＰＬＢＬ２およびＰＲＤＸ１からなる群のタンパク質の一方または両方をコードする遺伝子または複数の遺伝子の一方または両方の対立遺伝子は、本明細書に記載される操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のゲノムからノックアウトされる。このようなノックアウト宿主細胞で産生された組換えタンパク質は、野生型と比較して低下したＨＣＰ汚染物質を有し得、より少ない下流の精製ステップを必要とし得る。一実施形態では、チャイニーズハムスターＰＬＢＬ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＰＬＢＬ２は、配列番号１７の結合／切断領域核酸配列でＺＦＮによって修飾される。一実施形態では、チャイニーズハムスターＰＲＤＸ１は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＰＲＤＸ１は、配列番号１９の結合／切断領域核酸配列でＺＦＮによって修飾される。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、タネズマブである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２００４／０５８１８４を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、レブリキズマブである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２００５／０６２９６７を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ミリキズマブである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１４／１３７９６２を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ソラネズマブである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２００１／６２８０１を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ドナネマブである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１２／０２１４６９を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ザゴテネマブ（ｚａｇｏｔｅｎｅｍａｂ）である組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１６／１３７８１１を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ラムシルマブである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２００３／０７５８４０を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ガルカネズマブである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１１／１５６３２４を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、イキセキズマブである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２００７／０７０７５０を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、デュラグルチドである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２００５／０００８９２を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ネシツムマブである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２００５／０９０４０７を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、オララツマブである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２００６／１３８７２９を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、セツキシマブである組換えタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、アンジオポエチン２ ｍＡｂである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１５／１７９１６６を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質である組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１６／１７８９０５を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ＣＤ２００Ｒアゴニスト抗体である組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０２０／０５５９４３を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、エピレグリン／形質転換成長因子アルファ（エピレグリン／ＴＧＦα）ｍＡｂである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１２／１３８５１０を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、アンジオポエチン様３／８（ＡＮＧＰＴＬ ３／８）抗体である組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０２０／１３１２６４を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）抗体アゴニストである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１８／２１３１１３を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ＣＸＣケモカイン受容体１／２（ＣＸＣＲ１／２）リガンド抗体である組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１４／１４９７３３を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、成長／分化因子１５（ＧＤＦ１５）アゴニストである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１９／１９５０９１を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、インターロイキン３３（ＩＬ－３３）抗体である組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１８／０８１０７５を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド－３８（ＰＡＣＡＰ３８）抗体である組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１９／０６７２９３を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）抗体アゴニストである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１７／０２５０１６を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ピログルタメート－Ａｂｅｔａ（Ｎ３ｐＧ Ａｂｅｔａとも呼ばれるｐＧｌｕ－Ａｂｅｔａ）ｍＡｂである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１２／０２１４６９を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、腫瘍壊死因子アルファ／インターロイキン２３（ＴＮＦα／ＩＬ－２３）二重特異性抗体である組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１９／０２７７８０を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、抗α－シヌクレイン抗体である組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０２０／１２３３３０を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、分化２２６（ＣＤ２２６）アゴニスト抗体のクラスターである組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０２０／０２３３１２を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、モノカルボン酸輸送体１（ＭＣＴ１）抗体である組換えタンパク質をコードする（例えば、ＷＯ２０１９／１３６３００を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）中和抗体である組換えタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、抗Ｆｃガンマ受容体ＩＩＢ（ＦｃｇＲＩＩＢまたはＦｃγＲＩＩＢ）抗体である組換えタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、抗インターロイキン３４（ＩＬ－３４）抗体である組換えタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、分化１９（ＣＤ１９）抗体の抗クラスターである組換えタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、骨髄細胞２（ＴＲＥＭ２）抗体で発現されるトリガリング受容体である組換えタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、リラキシン類似体である組換えタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、本発明の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、タネズマブ、レブリキズマブ、ミリキズマブ、ソラネズマブ、ドナネマブ、ザゴテネマブ（ｚａｇｏｔｅｎｅｍａｂ）、ラムシルマブ、ガルカネズマブ、イキセキズマブ、デュラグルチド、ネシツムマブ、オララツマブ、セツキシマブ、アンジオポエチン２ ｍＡｂ、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質、ＣＤ２００Ｒアゴニスト抗体、エピレグリン／ＴＧＦα ｍＡｂ、ＡＮＧＰＴＬ ３／８抗体、ＢＴＬＡ抗体アゴニスト、ＣＸＣＲ１／２リガンド抗体、ＧＤＦ１５アゴニスト、ＩＬ－３３抗体、ＰＡＣＡＰ３８抗体、ＰＤ－１アゴニスト抗体、Ｎ３ｐＧ Ａｂｅｔａ ｍＡｂとも呼ばれるｐＧｌｕ－Ａｂｅｔａ、ＴＮＦα／ＩＬ－２３二重特異性抗体、抗α－シヌクレイン抗体、ＣＤ２２６アゴニスト抗体、ＭＣＴ１抗体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体、ＦｃｇＲＩＩＢ抗体、ＩＬ－３４抗体、ＣＤ１９抗体、ＴＲＥＭ２抗体、およびリラキシン類似体からなる群から選択される組換えタンパク質をコードする。
本発明の実施形態はまた、ポリソルベートと、タネズマブ、レブリキズマブ、ミリキズマブ、ソラネズマブ、ドナネマブ、ザゴテネマブ（ｚａｇｏｔｅｎｅｍａｂ）、ラムシルマブ、ガルカネズマブ、イキセキズマブ、デュラグルチド、ネシツムマブ、オララツマブ、セツキシマブ、アンジオポエチン２ ｍＡｂ、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質、ＣＤ２００Ｒアゴニスト抗体、エピレグリン／ＴＧＦα ｍＡｂ、ＡＮＧＰＴＬ ３／８抗体、ＢＴＬＡ抗体アゴニスト、ＣＸＣＲ１／２リガンド抗体、ＧＤＦ１５アゴニスト、ＩＬ－３３抗体、ＰＡＣＡＰ３８抗体、ＰＤ－１アゴニスト抗体、Ｎ３ｐＧ Ａｂｅｔａ ｍＡｂとも呼ばれるｐＧｌｕ－Ａｂｅｔａ、ＴＮＦα／ＩＬ－２３二重特異性抗体、抗α－シヌクレイン抗体、ＣＤ２２６アゴニスト抗体、ＭＣＴ１抗体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体、ＦｃｇＲＩＩＢ抗体、ＩＬ－３４抗体、ＣＤ１９抗体、ＴＲＥＭ２抗体、およびリラキシン類似体からなる群から選択されるバイオ製品と、を含む、医薬組成物であって、バイオ製品が、本発明の組換え哺乳動物細胞によって産生される、医薬組成物を提供する。様々な実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート４０（ＰＳ４０）、ポリソルベート６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート６５（ＰＳ６５）、またはそれらの組み合わせである。本発明の医薬組成物中のポリソルベートの濃度は、本発明の組成物中で、約０．０１重量／体積（ｗ／ｖ）％～約１重量／体積（ｗ／ｖ）％、好ましくは約０．０１重量／体積（ｗ／ｖ）％～約０．１０重量／体積（ｗ／ｖ）％、より好ましくは約０．０１重量／体積（ｗ／ｖ）％～約０．０５重量／体積（ｗ／ｖ）％、さらにより好ましくは約０．０２重量／体積（ｗ／ｖ）％～約０．０５重量／体積（ｗ／ｖ）％であってもよい。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。本発明の細胞株を使用して産生されたバイオ製品を含む医薬組成物は、当該技術分野で周知の方法によってさらに製剤化され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａ／Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５），（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）。
図面の簡単な説明
図１：ＰＰＴ１の存在下でのＰＳ８０モノオレエートエステルの温度依存性分解を経時的に示すグラフであり、これは、ＰＰＴ１がＰＳ８０を温度依存的に経時的に分解することを示す。
図２：対照（Ａ）、ならびに（Ｂ）ＬＡＬ－１ｐｐｍ、（Ｃ）ＬＰＬ－１ｐｐｍ、（Ｄ）ＰＰＴ１－１ｐｐｍ、および（Ｅ）ＬＰＬＡ２－０．１ｐｐｍを別々に添加した、製剤化されたｍＡｂ試料中でＰＳ８０モノオレエートエステルの分解を経時的に示すグラフであり、製剤中に存在するＰＳ８０モノオレエートエステルが、製剤化されたｍＡｂ対照より、これらのタンパク質の存在下で、より大きな程度で経時的に分解することを示す。
図３：対照試料（Ａ）中および０．２５ＵＮ／ｍＬのＰＬＤ４（Ｂ）、２．５ＵＮ／ｍＬのＰＬＤ４（Ｄ）、０．２５ＵＮ／ｍＬのＰＬＤ７（Ｃ）、および２．５ＵＮ／ｍＬのＰＬＤ７（Ｅ）の存在下でのＰＳ８０モノオレエートエステルの分解を経時的に示すグラフ。このデータは、ＰＬＤファミリーのメンバーがＰＳ８０を経時的に分解する能力を定性的に示す。
図１：ＰＰＴ１の存在下でのＰＳ８０モノオレエートエステルの温度依存性分解を経時的に示すグラフであり、これは、ＰＰＴ１がＰＳ８０を温度依存的に経時的に分解することを示す。
図２：対照（Ａ）、ならびに（Ｂ）ＬＡＬ－１ｐｐｍ、（Ｃ）ＬＰＬ－１ｐｐｍ、（Ｄ）ＰＰＴ１－１ｐｐｍ、および（Ｅ）ＬＰＬＡ２－０．１ｐｐｍを別々に添加した、製剤化されたｍＡｂ試料中でＰＳ８０モノオレエートエステルの分解を経時的に示すグラフであり、製剤中に存在するＰＳ８０モノオレエートエステルが、製剤化されたｍＡｂ対照より、これらのタンパク質の存在下で、より大きな程度で経時的に分解することを示す。
図３：対照試料（Ａ）中および０．２５ＵＮ／ｍＬのＰＬＤ４（Ｂ）、２．５ＵＮ／ｍＬのＰＬＤ４（Ｄ）、０．２５ＵＮ／ｍＬのＰＬＤ７（Ｃ）、および２．５ＵＮ／ｍＬのＰＬＤ７（Ｅ）の存在下でのＰＳ８０モノオレエートエステルの分解を経時的に示すグラフ。このデータは、ＰＬＤファミリーのメンバーがＰＳ８０を経時的に分解する能力を定性的に示す。
本発明の範囲を限定することなく、以下の調製物および実施例は、本明細書に記載される方法および組成物を作製および使用する手段を当業者に提供する。
実施例１－ＰＰＴ１のポリソルベート加水分解活性の特徴付け
液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）によるポリソルベート分解分析－一般手順Ａ
ＬＣＭＳ分析を、Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＮＡＰＴ（登録商標）Ｇ２－Ｓｉ質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｉクラス）、カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬＲＰ－Ｓ ２．１×５０ｍｍ、１０００Å、５μｍ粒径、移動相：Ａ－水中の０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｂ－アセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡで実施する。標準溶液を、２％ＰＳ８０および１０ｍＭクエン酸緩衝液を用いて調製し、０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２５、０．０５％のＰＳ８０溶液を得る。ポリソルベートモノオレエートについてＬＣＭＳ抽出イオンクロマトグラムによって試料中のインタクトなＰＳ８０を定量化するために、１０ｍＭクエン酸緩衝液中での調製したＰＳ８０溶液の標準曲線を得る。標準曲線を使用して、各試料についてのモノオレエートエステルとしてインタクトなＰＳ８０の相対パーセント（％）を、時間＝ゼロに対して計算する。
液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）によるポリソルベート分解分析－一般手順Ａ
ＬＣＭＳ分析を、Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＮＡＰＴ（登録商標）Ｇ２－Ｓｉ質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｉクラス）、カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬＲＰ－Ｓ ２．１×５０ｍｍ、１０００Å、５μｍ粒径、移動相：Ａ－水中の０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｂ－アセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡで実施する。標準溶液を、２％ＰＳ８０および１０ｍＭクエン酸緩衝液を用いて調製し、０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２５、０．０５％のＰＳ８０溶液を得る。ポリソルベートモノオレエートについてＬＣＭＳ抽出イオンクロマトグラムによって試料中のインタクトなＰＳ８０を定量化するために、１０ｍＭクエン酸緩衝液中での調製したＰＳ８０溶液の標準曲線を得る。標準曲線を使用して、各試料についてのモノオレエートエステルとしてインタクトなＰＳ８０の相対パーセント（％）を、時間＝ゼロに対して計算する。
実施例１ａ－ＰＰＴ１の存在下でのポリソルベート８０の分解
ポリソルベート８０（ＰＳ８０）およびＰＰＴ１の試料を、以下のように調製する。１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の０．０２ｗ／ｖ％のＰＳ８０ ０．５ｍＬを、ＰＰＴ１の０．３ｍｇ／ｍＬ溶液（組換え発現により調製）５．６μＬと混合し、試料を、研究期間の間、４、１５、２５、および３５℃に維持する。これらの溶液の試料（５０μＬ）を時間間隔で採取し、ＬＣＭＳ分析のために水中の５％ギ酸５μＬと混合する。モノオレエートエステルとして残存しているインタクトなＰＳ８０の割合を、一般手順Ａを使用してＬＣＭＳによって経時的にモニターする。これらのデータを図１に示し、ＰＰＴ１が温度依存的にＰＳ８０を経時的に分解することを示す。
ポリソルベート８０（ＰＳ８０）およびＰＰＴ１の試料を、以下のように調製する。１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の０．０２ｗ／ｖ％のＰＳ８０ ０．５ｍＬを、ＰＰＴ１の０．３ｍｇ／ｍＬ溶液（組換え発現により調製）５．６μＬと混合し、試料を、研究期間の間、４、１５、２５、および３５℃に維持する。これらの溶液の試料（５０μＬ）を時間間隔で採取し、ＬＣＭＳ分析のために水中の５％ギ酸５μＬと混合する。モノオレエートエステルとして残存しているインタクトなＰＳ８０の割合を、一般手順Ａを使用してＬＣＭＳによって経時的にモニターする。これらのデータを図１に示し、ＰＰＴ１が温度依存的にＰＳ８０を経時的に分解することを示す。
実施例１ｂ－ＬＡＬ、ＬＰＬ、ＰＰＴ１、およびＬＰＬＡ２を添加したｍＡｂ製剤試料中でのポリソルベート８０の分解
製剤化したｍＡｂ（抗体１、０．０３ｗ／ｖ％のＰＳ８０を含む、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０）の試料に、１ｐｐｍのＬＡＬ、ＬＰＬ、およびＰＰＴ１、ならびに０．１ｐｐｍのＬＰＬＡ２（組換え発現から得た）を別々に添加する。試料を、研究期間の間、３７℃でインキュベートする。各試料を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で１：２の比で希釈し、次いで一般手順Ａを使用してＬＣＭＳによって分析する。モノオレエートエステルとして残存しているインタクトなＰＳ８０の経時的な割合を、表１および図２に示す。
製剤化したｍＡｂ（抗体１、０．０３ｗ／ｖ％のＰＳ８０を含む、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０）の試料に、１ｐｐｍのＬＡＬ、ＬＰＬ、およびＰＰＴ１、ならびに０．１ｐｐｍのＬＰＬＡ２（組換え発現から得た）を別々に添加する。試料を、研究期間の間、３７℃でインキュベートする。各試料を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で１：２の比で希釈し、次いで一般手順Ａを使用してＬＣＭＳによって分析する。モノオレエートエステルとして残存しているインタクトなＰＳ８０の経時的な割合を、表１および図２に示す。
これらのデータは、製剤中に存在するＰＳ８０モノオレエートエステルが、製剤化したｍＡｂ対照より、これらのタンパク質の存在下で、より大きな程度で経時的に分解することを示す。
この実施例におけるデータを合わせると、これらのタンパク質（ＬＡＬ、ＬＰＬ、ＰＰＴ１、およびＬＰＬＡ２）が、溶液中のＰＳ８０を経時的に分解する能力が示される。
実施例２－Ｆｃ融合タンパク質製剤中のＰＰＴ１の同定
Ｆｃ融合タンパク質（Ｆｃ融合タンパク質１）の２つの別々の培養バッチを、プロテインＡクロマトグラフィーに供する。プロテインＡの主流のアリコート（２５μＬ）を、１Ｍのトリス－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８（５μＬ）、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ水（１７２μＬ）、タンパク質標準混合物（０．８μＬ）、および２．５ｍｇ／ｍＬのウシｒ－トリプシン（２μＬ）と混合する。試料を、１６時間、３７℃でインキュベートする。試料を、５０ｍｇ／ｍＬのジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液２μＬと混合し、次いで９０℃で１０分間加熱する。試料を１０，０００ｇで２分間遠心分離し、上清をバイアルに移す。次いで、試料を、Ｈ２Ｏ（５μＬ）中の５％ＴＦＡで酸性化し、ＬＣＭＳによって分析する。ＬＣＭＳ分析を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｐｌｕｓ質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ、カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒径、移動相：Ａ－水中の０．１０％ギ酸（ＦＡ）、Ｂ－アセトニトリル中の０．１０％ＦＡで、カラムを氷水に浸して実施する。この実験では、ＰＰＴ１を、０．５±０．１ｐｐｍ（ｎ＝２）での非標的プロテオミクス（ＤＤＡ）アプローチによるプロテインＡ精製後のＦｃ融合タンパク質１の試料中で同定する。
Ｆｃ融合タンパク質（Ｆｃ融合タンパク質１）の２つの別々の培養バッチを、プロテインＡクロマトグラフィーに供する。プロテインＡの主流のアリコート（２５μＬ）を、１Ｍのトリス－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８（５μＬ）、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ水（１７２μＬ）、タンパク質標準混合物（０．８μＬ）、および２．５ｍｇ／ｍＬのウシｒ－トリプシン（２μＬ）と混合する。試料を、１６時間、３７℃でインキュベートする。試料を、５０ｍｇ／ｍＬのジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液２μＬと混合し、次いで９０℃で１０分間加熱する。試料を１０，０００ｇで２分間遠心分離し、上清をバイアルに移す。次いで、試料を、Ｈ２Ｏ（５μＬ）中の５％ＴＦＡで酸性化し、ＬＣＭＳによって分析する。ＬＣＭＳ分析を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｐｌｕｓ質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ、カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒径、移動相：Ａ－水中の０．１０％ギ酸（ＦＡ）、Ｂ－アセトニトリル中の０．１０％ＦＡで、カラムを氷水に浸して実施する。この実験では、ＰＰＴ１を、０．５±０．１ｐｐｍ（ｎ＝２）での非標的プロテオミクス（ＤＤＡ）アプローチによるプロテインＡ精製後のＦｃ融合タンパク質１の試料中で同定する。
実施例３－組換え操作されたＬＰＬＡ２、ＬＡＬ、ＬＰＬ、およびＰＰＴ１ノックアウトＣＨＯ細胞株の生成
特に断りのない限り、使用される細胞培養培地は、８ｍＭグルタミンが補充された無血清細胞培養培地を指す。さらに、特に断りのない限り、使用される哺乳動物細胞は、グルタミンシンターゼ欠損ＣＨＯ（ＧＳ－ＣＨＯ）細胞株である。
特に断りのない限り、使用される細胞培養培地は、８ｍＭグルタミンが補充された無血清細胞培養培地を指す。さらに、特に断りのない限り、使用される哺乳動物細胞は、グルタミンシンターゼ欠損ＣＨＯ（ＧＳ－ＣＨＯ）細胞株である。
細胞株の操作は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって構築された、各標的ＨＣＰ遺伝子に対して特異的であるように設計されたオーダーメードのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）試薬（ＣｏｍｐｏＺｒ（登録商標）カスタムジンクフィンガーヌクレアーゼ、カタログ番号ＣＳＴＺＦＮ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の使用によって達成する。ＬＰＬＡ２、ＬＰＬ、ＬＡＬ、およびＰＰＴ１についてのＺＦＮ結合／切断領域核酸配列を表２に示す。
遺伝子破壊のための細胞の調製－一般手順Ｂ
細胞を含有するバイアルを、氷の薄片だけが残るまで３６℃の水浴中で解凍する。振とうフラスコ培養で細胞を細胞培養培地に播種する。親細胞株の培養物を、細胞培養培地に継代培養し、３日／４日のスケジュールで維持および継代する。上記のように、細胞培養物を、３０ｍＬの適切な維持培地中に０．２×１０６ｖｃ／ｍＬの播種密度で播種する。トランスフェクションの日に、細胞を計数し、適切な体積の細胞を収集する。
細胞を含有するバイアルを、氷の薄片だけが残るまで３６℃の水浴中で解凍する。振とうフラスコ培養で細胞を細胞培養培地に播種する。親細胞株の培養物を、細胞培養培地に継代培養し、３日／４日のスケジュールで維持および継代する。上記のように、細胞培養物を、３０ｍＬの適切な維持培地中に０．２×１０６ｖｃ／ｍＬの播種密度で播種する。トランスフェクションの日に、細胞を計数し、適切な体積の細胞を収集する。
ＺＦＮトランスフェクションおよびバルク培養物回収－一般手順Ｃ
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）技術および関連するｃＧＭＰ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キットＶ（カタログ番号ＶＧＡ－１００３，Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してＺＦＮトランスフェクションを実施する。簡単に説明すると、単一のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ試薬（２～４．５×１０６ｖｃ）に十分な細胞を、遠心分離によって収集する。上清を完全に除去した後、細胞ペレットを、製造業者のプロトコルに従って、補足物を添加した、１００μＬのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液Ｖ中に懸濁する。懸濁した細胞を粉砕により穏やかに混合し、ＺＦＮ ｍＲＮＡ［Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって生成されたカスタムＺＦＮキットの一部］のアリコートを含有するバイアルに移す。次いで細胞／ｍＲＮＡ混合物を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キットに提供されている２ｍｍキュベットに移し、そのキュベットを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）デバイスに挿入し、細胞をエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後、細胞をキュベット内で室温で３０～６０秒間静置し、次いでそれらを、滅菌トランスファーピペットを使用して、３ｍＬの細胞培養培地を含有する、ラベル付き６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎカタログ番号３５１１４６，Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）のウェルに移す。トランスフェクトされた細胞を、加湿インキュベーター内で静止させた６ウェルプレートに３６℃、６％ＣＯ２で１～４日間維持し、その後、それらを、生存率が９０％を超えるまで、１２５ｒｐｍで振とうしながら、３６℃、６％ＣＯ２で細胞培養培地中での振とうフラスコ培養に移す。トランスフェクションから細胞を完全に回収してから（振とうフラスコ培養での生存率によって測定）、ＦＡＣＳ技術を使用してバルク培養物を単一細胞選別する。
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）技術および関連するｃＧＭＰ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キットＶ（カタログ番号ＶＧＡ－１００３，Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してＺＦＮトランスフェクションを実施する。簡単に説明すると、単一のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ試薬（２～４．５×１０６ｖｃ）に十分な細胞を、遠心分離によって収集する。上清を完全に除去した後、細胞ペレットを、製造業者のプロトコルに従って、補足物を添加した、１００μＬのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液Ｖ中に懸濁する。懸濁した細胞を粉砕により穏やかに混合し、ＺＦＮ ｍＲＮＡ［Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって生成されたカスタムＺＦＮキットの一部］のアリコートを含有するバイアルに移す。次いで細胞／ｍＲＮＡ混合物を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キットに提供されている２ｍｍキュベットに移し、そのキュベットを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）デバイスに挿入し、細胞をエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後、細胞をキュベット内で室温で３０～６０秒間静置し、次いでそれらを、滅菌トランスファーピペットを使用して、３ｍＬの細胞培養培地を含有する、ラベル付き６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎカタログ番号３５１１４６，Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）のウェルに移す。トランスフェクトされた細胞を、加湿インキュベーター内で静止させた６ウェルプレートに３６℃、６％ＣＯ２で１～４日間維持し、その後、それらを、生存率が９０％を超えるまで、１２５ｒｐｍで振とうしながら、３６℃、６％ＣＯ２で細胞培養培地中での振とうフラスコ培養に移す。トランスフェクションから細胞を完全に回収してから（振とうフラスコ培養での生存率によって測定）、ＦＡＣＳ技術を使用してバルク培養物を単一細胞選別する。
各標的ＨＣＰについてのＺＦＮトランスフェクションは、単一細胞選別の前に１回実施することができる。代替的に、任意の特定の標的ＨＣＰについてのＺＦＮトランスフェクションを２回実施し、２回目のＺＦＮトランスフェクションの前に完全な細胞の回収を行うことができる。１ラウンドより多くのＺＦＮトランスフェクションは、それぞれの標的ＨＣＰに２対立遺伝子変異を含有する細胞の数を増加させ、スクリーニングをより効率的にすることができる。
バルク培養物中のＺＦＮを介した標的ＨＣＰ配列修飾の検出－一般手順Ｄ
トランスフェクションの２～７日後、部分的から完全に回収したＺＦＮバルク培養物からの細胞を評価のために収集して、トランスフェクトされたＺＦＮの活性を評価する。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）変異検出アッセイ（ＭＤＡ）（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｃ．、Ｏｍａｈａ，ＮＥ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、標的ＨＣＰ部位で修飾を生成する際のＺＦＮ手順の効率を検出する。簡単に説明すると、ＣｏｍｐｏＺｒ（登録商標）カスタムジンクフィンガーヌクレアーゼキット（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に提供されているプライマーを使用して、ＺＦＮ結合領域をＰＣＲ増幅させる。次いでＰＣＲ産物を変性し、再アニーリングする。ＭＤＡキットに提供されているＣｅｌ－Ｉエンドヌクレアーゼ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ）を使用して、天然または野生型配列およびインデルを含有するものからなるＰＣＲ産物のアニーリングに由来する、ＤＮＡミスマッチ「バブル」を検出する。なぜならＣｅｌ－Ｉは、ミスマッチのこれらの「バブル」を認識し、ＤＮＡを切断するからである。Ｃｅｌ－Ｉ消化後、次いで生成物を、２％または４％ＴＢＥアガロースゲル（Ｒｅｌｉａｎｔ Ｇｅｌ，Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で分離する。ＤＮＡミスマッチの「バブル」がない場合、ＤＮＡ切断は発生せず、ＰＣＲ産物を表す、１つのバンドのみが存在する。ＺＦＮ活性を表す、いずれかの非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が発生した場合、切断産物が、２つ（またはそれ以上）のバンドの形態でゲル上に観察される。ＭＤＡにおいて陽性反応を示すＺＦＮバルク培養物のみを、単一細胞選別への処理に進ませる。
トランスフェクションの２～７日後、部分的から完全に回収したＺＦＮバルク培養物からの細胞を評価のために収集して、トランスフェクトされたＺＦＮの活性を評価する。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）変異検出アッセイ（ＭＤＡ）（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｃ．、Ｏｍａｈａ，ＮＥ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、標的ＨＣＰ部位で修飾を生成する際のＺＦＮ手順の効率を検出する。簡単に説明すると、ＣｏｍｐｏＺｒ（登録商標）カスタムジンクフィンガーヌクレアーゼキット（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に提供されているプライマーを使用して、ＺＦＮ結合領域をＰＣＲ増幅させる。次いでＰＣＲ産物を変性し、再アニーリングする。ＭＤＡキットに提供されているＣｅｌ－Ｉエンドヌクレアーゼ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ）を使用して、天然または野生型配列およびインデルを含有するものからなるＰＣＲ産物のアニーリングに由来する、ＤＮＡミスマッチ「バブル」を検出する。なぜならＣｅｌ－Ｉは、ミスマッチのこれらの「バブル」を認識し、ＤＮＡを切断するからである。Ｃｅｌ－Ｉ消化後、次いで生成物を、２％または４％ＴＢＥアガロースゲル（Ｒｅｌｉａｎｔ Ｇｅｌ，Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で分離する。ＤＮＡミスマッチの「バブル」がない場合、ＤＮＡ切断は発生せず、ＰＣＲ産物を表す、１つのバンドのみが存在する。ＺＦＮ活性を表す、いずれかの非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が発生した場合、切断産物が、２つ（またはそれ以上）のバンドの形態でゲル上に観察される。ＭＤＡにおいて陽性反応を示すＺＦＮバルク培養物のみを、単一細胞選別への処理に進ませる。
蛍光活性化細胞選別による単一細胞選別－一般手順Ｅ
回収したバルク培養物を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）技術によって選別する。単一細胞クローニングのためのプロトコルおよび方法は、当該技術分野で周知である。クローニングのために、セルソーター（ＭｏＦｌｏ（商標）ＸＤＰ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、当該技術分野で周知の方法に従って、前方および側方散乱方向のレーザー回折を測定することによって、単一の生細胞を同定および選別する（例えば、Ｋｒｅｂｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｏｎｅ ｒｏｕｎｄ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）ｃａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅ ａ ｃｌｏｎａｌｌｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．”ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｊ １３（４）：６－１９を参照のこと）。
回収したバルク培養物を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）技術によって選別する。単一細胞クローニングのためのプロトコルおよび方法は、当該技術分野で周知である。クローニングのために、セルソーター（ＭｏＦｌｏ（商標）ＸＤＰ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、当該技術分野で周知の方法に従って、前方および側方散乱方向のレーザー回折を測定することによって、単一の生細胞を同定および選別する（例えば、Ｋｒｅｂｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｏｎｅ ｒｏｕｎｄ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）ｃａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅ ａ ｃｌｏｎａｌｌｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．”ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｊ １３（４）：６－１９を参照のこと）。
細胞を、動物成分を含まない選別培地（Ｅｘ－Ｃｅｌｌ ＣＨＯクローニング培地、ＳＡＦＣ Ｃ６３６６）＋２０％馴化細胞培養培地＋フェノールレッド（Ｓｉｇｍａ Ｐ０２９０））を含有する９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５－３０７５）に選別する。馴化細胞培養培地を調製するために、親細胞を、１×１０６ｖｃ／ｍＬの密度でグルタミンを含まない細胞培養培地に播種し、振とうフラスコ内で３６℃、６％ＣＯ２、１２５ｒｐｍで２０～２４時間インキュベートする。培養物を遠心分離して細胞を除去し、馴化培地を、滅菌０．２２μｍフィルターを通して濾過する。単一細胞選別の７～１０日後、すべてのプレートにウェル当たり５０μＬの細胞培養培地を供給する。単一細胞選別の１４～１５日後、クローン増殖についてプレートを分析する。増殖は、ＣｌｏｎｅＳｅｌｅｃｔ Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用してソートプレートをイメージングするか、もしくはミラーを使用して手動で、および／または赤からオレンジ／黄色への培地の色の変化を観察することによって決定する。
ＺＦＮを介した標的ＨＣＰ配列修飾についてのクローン由来細胞株のスクリーニング－一般手順Ｆ
クローン由来細胞株（ＣＤＣＬ）は、目に見えるコロニーになるので、回収したＺＦＮバルク培養物に由来する９６ウェルプレートから選択し、細胞培養培地を含有するディープ９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８０２７１）に移す。クローン由来細胞株を、１５０μＬの細胞培養培地を含有するディープウェルプレートに統合する。培養物を、スクリーニングおよび特徴付けが完了するまで、３日／４日のフィード／パススケジュールで静的条件下で細胞培養培地にて維持する。
クローン由来細胞株（ＣＤＣＬ）は、目に見えるコロニーになるので、回収したＺＦＮバルク培養物に由来する９６ウェルプレートから選択し、細胞培養培地を含有するディープ９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８０２７１）に移す。クローン由来細胞株を、１５０μＬの細胞培養培地を含有するディープウェルプレートに統合する。培養物を、スクリーニングおよび特徴付けが完了するまで、３日／４日のフィード／パススケジュールで静的条件下で細胞培養培地にて維持する。
クローン由来細胞株（ＣＤＣＬ）を、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ＭＤＡを使用してインデルについてスクリーニングする。ゲノムＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ ９６ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ２３７１，Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して各細胞株から単離する。ＺＦＮ ＰＣＲ反応を、製造業者のプロトコルに従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して実施する。ＭＤＡ消化産物を、２％ＴＢＥアガロースゲル上で分離する。ＭＤＡにおいて陽性であると同定された細胞株を、一般手順Ｇまたは一般手順Ｈのいずれかによって特徴付けする。
ＲＴ－ＰＣＲを使用したＣＤＣＬのインデルの特徴付け－一般手順Ｇ：
ＣＤＣＬを、標的遺伝子ＲＴ－ＰＣＲ反応を使用してＺＦＮ ＰＣＲ産物のシーケンシングによって特徴付けする。全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４００４、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用して各々の潜在的なＫＯ細胞株から単離する。逆転写反応を、製造業者のプロトコルに従って、ＲＴ－ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号１８０８０－０５１、Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して行い、続いてＰＣＲ反応を、製造業者のプロトコルに従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して行う。ＲＴ－ＰＣＲ産物を、１％ＴＡＥアガロースゲル上で分離し、変化したＲＴ－ＰＣＲ産物を有する細胞株を同定する。処理を進ませるために選択した細胞株はＲＴ－ＰＣＲ産物を欠き、ＬＣＭＳによって標的ＨＣＰタンパク質を含有しない。
ＣＤＣＬを、標的遺伝子ＲＴ－ＰＣＲ反応を使用してＺＦＮ ＰＣＲ産物のシーケンシングによって特徴付けする。全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４００４、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用して各々の潜在的なＫＯ細胞株から単離する。逆転写反応を、製造業者のプロトコルに従って、ＲＴ－ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号１８０８０－０５１、Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して行い、続いてＰＣＲ反応を、製造業者のプロトコルに従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して行う。ＲＴ－ＰＣＲ産物を、１％ＴＡＥアガロースゲル上で分離し、変化したＲＴ－ＰＣＲ産物を有する細胞株を同定する。処理を進ませるために選択した細胞株はＲＴ－ＰＣＲ産物を欠き、ＬＣＭＳによって標的ＨＣＰタンパク質を含有しない。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用したＣＤＣＬのインデルの特徴付け－一般手順Ｈ：
ＭＤＡ陽性ＣＤＣＬを、さらなる維持のために９６ウェルディープウェルプレートに統合する。統合するときに、「異常な」ＰＣＲおよび／またはＭＤＡの結果を示す細胞株を、ＧＥＮＥＷＩＺによって提供されている次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して特徴付けする。標的ＨＣＰ遺伝子座において許容可能な２対立遺伝子のインデルを含有する細胞株を、ＬＣＭＳによって評価し、標的ＨＣＰタンパク質を含有しない細胞株を次に進める。
ＭＤＡ陽性ＣＤＣＬを、さらなる維持のために９６ウェルディープウェルプレートに統合する。統合するときに、「異常な」ＰＣＲおよび／またはＭＤＡの結果を示す細胞株を、ＧＥＮＥＷＩＺによって提供されている次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して特徴付けする。標的ＨＣＰ遺伝子座において許容可能な２対立遺伝子のインデルを含有する細胞株を、ＬＣＭＳによって評価し、標的ＨＣＰタンパク質を含有しない細胞株を次に進める。
ノックアウト細胞株のスケーリングおよびバンキング－一般手順Ｉ：
最初のスクリーニング／特徴付け作業に基づいて、さらなる評価が必要なＣＤＣＬを、９６ウェルディープウェルプレート（ＤＷＰ）から振とうフラスコにスケーリングし、研究細胞バンク（ＲＣＢ）を生成する。ＤＷＰから、適切なウェルからの細胞を、３ｍＬの細胞培養培地を含有する６ウェルプレートの適切にラベル付けしたウェルに移す。スケーリングしたＣＤＣＬを、加湿インキュベーター内で静止させた６ウェルプレートに３６℃、６％ＣＯ２で３～４日間維持し、その後、それらを、１２５ｒｐｍで振とうしながら、３６℃、６％ＣＯ２で１５ｍＬの細胞培養培地を含有する振とうフラスコに移す。振とうフラスコ培養物を少なくとも１回継代して、バンキングに好適な細胞集団を構築する。各細胞株について、Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｎｓｔｒｕｍ（９０：１０の細胞培養培地：ＤＭＳＯ）中でバイアル当たり１０～１３×１０６ｖｃで３～１０バイアルＲＣＢを生成する。バイアルを、－８０℃で発泡スチロールラックの「サンドイッチ」に少なくとも２４時間置いて、細胞を制御された速度で凍結できるようにする。バイアルが完全に凍結したら、それらを－８０℃で保管する。
最初のスクリーニング／特徴付け作業に基づいて、さらなる評価が必要なＣＤＣＬを、９６ウェルディープウェルプレート（ＤＷＰ）から振とうフラスコにスケーリングし、研究細胞バンク（ＲＣＢ）を生成する。ＤＷＰから、適切なウェルからの細胞を、３ｍＬの細胞培養培地を含有する６ウェルプレートの適切にラベル付けしたウェルに移す。スケーリングしたＣＤＣＬを、加湿インキュベーター内で静止させた６ウェルプレートに３６℃、６％ＣＯ２で３～４日間維持し、その後、それらを、１２５ｒｐｍで振とうしながら、３６℃、６％ＣＯ２で１５ｍＬの細胞培養培地を含有する振とうフラスコに移す。振とうフラスコ培養物を少なくとも１回継代して、バンキングに好適な細胞集団を構築する。各細胞株について、Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｎｓｔｒｕｍ（９０：１０の細胞培養培地：ＤＭＳＯ）中でバイアル当たり１０～１３×１０６ｖｃで３～１０バイアルＲＣＢを生成する。バイアルを、－８０℃で発泡スチロールラックの「サンドイッチ」に少なくとも２４時間置いて、細胞を制御された速度で凍結できるようにする。バイアルが完全に凍結したら、それらを－８０℃で保管する。
実施例３ａ－ＬＰＬＡ２ノックアウトＣＨＯ細胞株
ＣＨＯ細胞を、一般手順Ｂに従って遺伝子破壊のために調製する。次いで細胞を、一般手順Ｃに従って単一のＺＦＮトランスフェクションおよびバルク培養物回収に供する。一般手順Ｄを使用して、バルク培養物の配列修飾を検出する。ＭＤＡにおいて陽性反応を示すバルク培養物を、一般手順Ｅに従って単一細胞選別へ処理を進ませる。それから得られたクローン由来細胞株を、一般手順Ｆに従って標的ＨＣＰ配列修飾についてスクリーニングする。インデルを一般手順Ｇに従って特徴付けし、ＬＣＭＳによって検出可能な量のＬＰＬＡ２タンパク質を含有しない細胞株を選択する。一般手順Ｉに従ってＲＣＢを生成して、ＬＰＬＡ２ノックアウトＣＨＯ細胞株を得る。
ＣＨＯ細胞を、一般手順Ｂに従って遺伝子破壊のために調製する。次いで細胞を、一般手順Ｃに従って単一のＺＦＮトランスフェクションおよびバルク培養物回収に供する。一般手順Ｄを使用して、バルク培養物の配列修飾を検出する。ＭＤＡにおいて陽性反応を示すバルク培養物を、一般手順Ｅに従って単一細胞選別へ処理を進ませる。それから得られたクローン由来細胞株を、一般手順Ｆに従って標的ＨＣＰ配列修飾についてスクリーニングする。インデルを一般手順Ｇに従って特徴付けし、ＬＣＭＳによって検出可能な量のＬＰＬＡ２タンパク質を含有しない細胞株を選択する。一般手順Ｉに従ってＲＣＢを生成して、ＬＰＬＡ２ノックアウトＣＨＯ細胞株を得る。
実施例３ｂ－ＬＰＬＡ２／ＬＰＬノックアウトＣＨＯ細胞株
実施例３ａからのＬＰＬＡ２ノックアウトＣＨＯ細胞を、一般手順Ｂに従って遺伝子破壊のために調製する。次いで細胞を、一般手順Ｃに従って２回のＺＦＮトランスフェクションおよびバルク培養物回収に供する。一般手順Ｄを使用して、バルク培養物の配列修飾を検出する。ＭＤＡにおいて陽性反応を示すバルク培養物を、一般手順Ｅに従って単一細胞選別へ処理を進ませる。それから得られたクローン由来細胞株を、一般手順Ｆに従って標的ＨＣＰ配列修飾についてスクリーニングする。インデルを一般手順Ｈに従って特徴付けし、ＬＣＭＳによって検出可能な量のＬＰＬタンパク質を含有しない細胞株を選択する。一般手順Ｉに従ってＲＣＢを生成して、ＬＰＬＡ２／ＬＰＬノックアウトＣＨＯ細胞株を得る。
実施例３ａからのＬＰＬＡ２ノックアウトＣＨＯ細胞を、一般手順Ｂに従って遺伝子破壊のために調製する。次いで細胞を、一般手順Ｃに従って２回のＺＦＮトランスフェクションおよびバルク培養物回収に供する。一般手順Ｄを使用して、バルク培養物の配列修飾を検出する。ＭＤＡにおいて陽性反応を示すバルク培養物を、一般手順Ｅに従って単一細胞選別へ処理を進ませる。それから得られたクローン由来細胞株を、一般手順Ｆに従って標的ＨＣＰ配列修飾についてスクリーニングする。インデルを一般手順Ｈに従って特徴付けし、ＬＣＭＳによって検出可能な量のＬＰＬタンパク質を含有しない細胞株を選択する。一般手順Ｉに従ってＲＣＢを生成して、ＬＰＬＡ２／ＬＰＬノックアウトＣＨＯ細胞株を得る。
実施例３ｃ－ＬＰＬＡ２／ＬＰＬ／ＬＡＬノックアウトＣＨＯ細胞株
実施例３ｂからのＬＰＬＡ２／ＬＰＬノックアウトＣＨＯ細胞を、一般手順Ｂに従って遺伝子破壊のために調製する。次いで細胞を、一般手順Ｃに従って２回のＺＦＮトランスフェクションおよびバルク培養物回収に供する。一般手順Ｄを使用して、バルク培養物の配列修飾を検出する。ＭＤＡにおいて陽性反応を示すバルク培養物を、一般手順Ｅに従って単一細胞選別へ処理を進ませる。それから得られたクローン由来細胞株を、一般手順Ｆに従って標的ＨＣＰ配列修飾についてスクリーニングする。インデルを一般手順Ｈに従って特徴付けし、ＬＣＭＳによって検出可能な量のＬＡＬタンパク質を含有しない細胞株を選択する。一般手順Ｉに従ってＲＣＢを生成して、ＬＰＬＡ２／ＬＰＬ／ＬＡＬノックアウトＣＨＯ細胞株を得る。
実施例３ｂからのＬＰＬＡ２／ＬＰＬノックアウトＣＨＯ細胞を、一般手順Ｂに従って遺伝子破壊のために調製する。次いで細胞を、一般手順Ｃに従って２回のＺＦＮトランスフェクションおよびバルク培養物回収に供する。一般手順Ｄを使用して、バルク培養物の配列修飾を検出する。ＭＤＡにおいて陽性反応を示すバルク培養物を、一般手順Ｅに従って単一細胞選別へ処理を進ませる。それから得られたクローン由来細胞株を、一般手順Ｆに従って標的ＨＣＰ配列修飾についてスクリーニングする。インデルを一般手順Ｈに従って特徴付けし、ＬＣＭＳによって検出可能な量のＬＡＬタンパク質を含有しない細胞株を選択する。一般手順Ｉに従ってＲＣＢを生成して、ＬＰＬＡ２／ＬＰＬ／ＬＡＬノックアウトＣＨＯ細胞株を得る。
実施例３ｄ－ＬＰＬＡ２／ＬＰＬ／ＬＡＬ／ＰＰＴ１ノックアウトＣＨＯ細胞株
実施例３ｃからのＬＰＬＡ２／ＬＰＬ／ＬＡＬノックアウトＣＨＯ細胞を、一般手順Ｂに従って遺伝子破壊のために調製する。次いで細胞を、一般手順Ｃに従って２回のＺＦＮトランスフェクションおよびバルク培養物回収に供する。一般手順Ｄを使用して、バルク培養物の配列修飾を検出する。ＭＤＡにおいて陽性反応を示すバルク培養物を、一般手順Ｅに従って単一細胞選別へ処理を進ませる。それから得られたクローン由来細胞株を、一般手順Ｆに従って標的ＨＣＰ配列修飾についてスクリーニングする。インデルを一般手順Ｈに従って特徴付けするが、細胞株のうちのいずれも、標的化されたＰＰＴ１領域において２対立遺伝子変異を含有しない。１または２対立遺伝子インデルを含有する細胞株をＬＣＭＳによって評価し、ＬＣＭＳ評価によって検出可能な量のＰＰＴ１タンパク質を含有しない細胞株を次に進める。一般手順Ｉに従ってＲＣＢを生成して、ＬＰＬＡ２／ＬＰＬ／ＬＡＬ／ＰＰＴ１ノックアウトＣＨＯ細胞株を得る。
実施例３ｃからのＬＰＬＡ２／ＬＰＬ／ＬＡＬノックアウトＣＨＯ細胞を、一般手順Ｂに従って遺伝子破壊のために調製する。次いで細胞を、一般手順Ｃに従って２回のＺＦＮトランスフェクションおよびバルク培養物回収に供する。一般手順Ｄを使用して、バルク培養物の配列修飾を検出する。ＭＤＡにおいて陽性反応を示すバルク培養物を、一般手順Ｅに従って単一細胞選別へ処理を進ませる。それから得られたクローン由来細胞株を、一般手順Ｆに従って標的ＨＣＰ配列修飾についてスクリーニングする。インデルを一般手順Ｈに従って特徴付けするが、細胞株のうちのいずれも、標的化されたＰＰＴ１領域において２対立遺伝子変異を含有しない。１または２対立遺伝子インデルを含有する細胞株をＬＣＭＳによって評価し、ＬＣＭＳ評価によって検出可能な量のＰＰＴ１タンパク質を含有しない細胞株を次に進める。一般手順Ｉに従ってＲＣＢを生成して、ＬＰＬＡ２／ＬＰＬ／ＬＡＬ／ＰＰＴ１ノックアウトＣＨＯ細胞株を得る。
実施例４－ＬＰＬＡ２／ＬＰＬ／ＬＡＬ／ＰＰＴ１ノックアウトＣＨＯ細胞株と対照において発現された製剤化したｍＡｂ中のポリソルベート安定性の比較
Ｆｃ融合タンパク質（Ｆｃ融合タンパク質１）および抗体（抗体２）を、ＬＰＬＡ２、ＬＰＬ、ＬＡＬ、およびＰＰＴ１がノックアウトされた、生成物を発現するＣＨＯ細胞株（「リパーゼ／エステラーゼＫＯ細胞株」と称される）から産生し、また、対照として、ＬＰＬＡ２、ＬＰＬ、ＬＡＬ、またはＰＰＴ１がノックアウトされていない、生成物を発現するＣＨＯ細胞株から産生する。Ｆｃ融合タンパク質１は、プロテインＡクロマトグラフィー、低ｐＨウイルス不活性化、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、および接線流ろ過（ＴＦＦ）濃縮によって処理し、その後、０．０２％ＰＳ８０で製剤化する。抗体２は、プロテインＡクロマトグラフィー、低ｐＨウイルス不活性化、ＣＥＸクロマトグラフィー、およびＴＦＦ濃縮によって処理し、その後、０．０２％ＰＳ８０で製剤化する。Ｆｃ融合タンパク質１および抗体２の製剤化した試料を、研究期間の間、２５℃に維持し、一般手順Ａを使用して、ＬＣＭＳ分析のために直接使用して、モノオレエートエステルとして残存しているインタクトなＰＳ８０の割合を経時的にモニターする。結果を表３に列挙し、ＫＯ細胞株を使用して産生したＦｃ融合タンパク質１および抗体２におけるＰＳ８０が、対照試料よりも安定であることを示す。
Ｆｃ融合タンパク質（Ｆｃ融合タンパク質１）および抗体（抗体２）を、ＬＰＬＡ２、ＬＰＬ、ＬＡＬ、およびＰＰＴ１がノックアウトされた、生成物を発現するＣＨＯ細胞株（「リパーゼ／エステラーゼＫＯ細胞株」と称される）から産生し、また、対照として、ＬＰＬＡ２、ＬＰＬ、ＬＡＬ、またはＰＰＴ１がノックアウトされていない、生成物を発現するＣＨＯ細胞株から産生する。Ｆｃ融合タンパク質１は、プロテインＡクロマトグラフィー、低ｐＨウイルス不活性化、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、および接線流ろ過（ＴＦＦ）濃縮によって処理し、その後、０．０２％ＰＳ８０で製剤化する。抗体２は、プロテインＡクロマトグラフィー、低ｐＨウイルス不活性化、ＣＥＸクロマトグラフィー、およびＴＦＦ濃縮によって処理し、その後、０．０２％ＰＳ８０で製剤化する。Ｆｃ融合タンパク質１および抗体２の製剤化した試料を、研究期間の間、２５℃に維持し、一般手順Ａを使用して、ＬＣＭＳ分析のために直接使用して、モノオレエートエステルとして残存しているインタクトなＰＳ８０の割合を経時的にモニターする。結果を表３に列挙し、ＫＯ細胞株を使用して産生したＦｃ融合タンパク質１および抗体２におけるＰＳ８０が、対照試料よりも安定であることを示す。
実施例５－モノクローナル抗体製剤中のＰＬＤ３の同定
プロテインＡ捕捉、低ｐＨウイルス不活性化、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、および接線流ろ過（ＴＦＦ）による１５０ｍｇ／ｍＬの濃度への濃縮によって処理した１ｍｇの抗体３を含有する試料を、トリス－ＨＣｌ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８、５μＬ）および水と混合して、１９５μＬの体積にする。各溶液を５μＬのトリスピンおよびタンパク質標準混合物（２０μＬの２．５ｍｇ／ｍＬのｒ－ウシトリプシン、２０μＬのタンパク質標準混合物および６０μＬの水）で３７℃で一晩処理する。各試料を１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ、５０ｍｇ／ｍＬ、２μＬ）と混合し、９０℃で１０分間加熱し、白い沈殿物を観察する。次いで試料を１３０００ｇで２分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣバイアルに移す。本質的に実施例２に記載されているように、ＬＣＭＳ分析の前に、試料を水中の１０％ギ酸５μＬで酸性化する。この実験では、ＰＬＤ３を、１７±６ｎｇ／ｍｇ（ｎ＝２）の抗体３で抗体３の試料中で同定する。
プロテインＡ捕捉、低ｐＨウイルス不活性化、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、および接線流ろ過（ＴＦＦ）による１５０ｍｇ／ｍＬの濃度への濃縮によって処理した１ｍｇの抗体３を含有する試料を、トリス－ＨＣｌ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８、５μＬ）および水と混合して、１９５μＬの体積にする。各溶液を５μＬのトリスピンおよびタンパク質標準混合物（２０μＬの２．５ｍｇ／ｍＬのｒ－ウシトリプシン、２０μＬのタンパク質標準混合物および６０μＬの水）で３７℃で一晩処理する。各試料を１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ、５０ｍｇ／ｍＬ、２μＬ）と混合し、９０℃で１０分間加熱し、白い沈殿物を観察する。次いで試料を１３０００ｇで２分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣバイアルに移す。本質的に実施例２に記載されているように、ＬＣＭＳ分析の前に、試料を水中の１０％ギ酸５μＬで酸性化する。この実験では、ＰＬＤ３を、１７±６ｎｇ／ｍｇ（ｎ＝２）の抗体３で抗体３の試料中で同定する。
実施例６－ＰＬＤ４およびＰＬＤ７のポリソルベート加水分解活性の特徴付け
ＰＬＤ３と同様に、ＰＬＤ４およびＰＬＤ７は、ホスホリパーゼＤファミリーのメンバーである。ＰＬＤ４およびＰＬＤ７の加水分解活性を、本質的に実施例１に記載されている方法で評価する。０．０２％ＰＳ８０を含有する試料を、ミリリットル当たり０．２５および２．５単位（ＵＮ／ｍＬ）のＰＬＤ４およびＰＬＤ７と３５℃でインキュベートし、モノオレエートエステルとして残存しているインタクトなＰＳ８０の割合を、一般手順Ａを使用してＬＣＭＳによって経時的にモニターする。これらの条件下で３５時間のインキュベーション後、ＰＳ８０は、２．５ＵＮ／ｍＬのＰＬＤ４およびＰＬＤ７の存在下で、それぞれ、３０％超および８０％超、加水分解する。これらのデータを図３に示し、ＰＬＤファミリーのメンバーが、ＰＳ８０を経時的に分解する能力を定性的に示す。
ＰＬＤ３と同様に、ＰＬＤ４およびＰＬＤ７は、ホスホリパーゼＤファミリーのメンバーである。ＰＬＤ４およびＰＬＤ７の加水分解活性を、本質的に実施例１に記載されている方法で評価する。０．０２％ＰＳ８０を含有する試料を、ミリリットル当たり０．２５および２．５単位（ＵＮ／ｍＬ）のＰＬＤ４およびＰＬＤ７と３５℃でインキュベートし、モノオレエートエステルとして残存しているインタクトなＰＳ８０の割合を、一般手順Ａを使用してＬＣＭＳによって経時的にモニターする。これらの条件下で３５時間のインキュベーション後、ＰＳ８０は、２．５ＵＮ／ｍＬのＰＬＤ４およびＰＬＤ７の存在下で、それぞれ、３０％超および８０％超、加水分解する。これらのデータを図３に示し、ＰＬＤファミリーのメンバーが、ＰＳ８０を経時的に分解する能力を定性的に示す。
配列表
配列番号１－チャイニーズハムスターパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）
ＭＡＳＰＧＳＲＷＬＬＡＶＳＬＬＰＷＣＣＡＡＷＳＬＧＨＬＮＰＰＳＬＴＰＬＶＩＷＨＧＭＧＤＳＣＣＮＰＩＳＭＧＡＩＫＫＭＶＥＫＥＩＰＧＩＹＶＬＳＬＥＩＧＫＮＭＭＥＤＶＥＮＳＦＦＬＮＶＮＳＱＶＭＭＶＣＱＩＬＥＫＤＰＫＬＱＱＧＹＮＡＩＧＦＳＱＧＧＱＦＬＲＡＶＡＱＲＣＰＳＰＲＭＩＮＬＩＳＶＧＧＱＨＱＧＶＦＧＬＰＲＣＰＧＥＳＳＨＶＣＤＦＩＲＫＭＩＮＡＧＡＹＳＫＶＶＱＬＲＬＶＱＡＱＹＷＨＤＰＩＫＥＤＶＹＲＮＨＳＩＦＬＡＤＩＮＱＥＲＣＶＮＥＴＹＫＫＮＬＭＡＬＮＫＦＶＭＶＫＦＬＮＤＳＩＶＤＰＶＤＳＥＷＦＧＦＹＲＳＧＱＡＫＥＴＩＰＬＱＥＳＴＬＹＴＥＤＲＬＧＬＫＱＭＤＫＡＧＫＬＶＦＬＡＫＥＧＤＨＬＱＬＳＫＥＷＦＮＡＹＩＩＰＦＬＫ
配列番号２－チャイニーズハムスターリソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）
ＭＱＩＬＧＬＶＶＣＬＦＬＳＶＬＬＳＧＲＰＴＧＳＩＰＨＶＤＰＥＡＮＭＮＶＴＥＭＩＲＹＷＧＹＰＳＥＥＨＭＩＱＴＥＤＧＹＩＬＧＶＨＲＩＰＨＧＲＫＮＨＳＨＫＧＰＫＰＶＶＹＬＱＨＧＦＬＡＤＳＳＮＷＶＴＮＳＤＮＳＳＬＧＦＩＬＡＤＡＧＦＤＶＷＬＧＮＳＲＧＮＴＷＳＬＫＨＲＴＬＳＩＳＱＤＥＦＷＡＦＳＦＤＥＭＡＫＹＤＬＰＡＳＩＹＹＩＶＮＫＴＧＱＥＱＶＹＹＶＧＨＳＱＧＴＴＩＧＦＩＡＦＳＱＩＰＥＬＡＫＫＩＫＭＦＦＡＬＡＰＶＶＦＬＮＦＡＬＳＰＶＩＫＩＳＫＷＰＥＶＩＩＥＤＬＦＧＨＫＱＦＦＰＱＳＡＫＬＫＷＬＳＴＨＶＣＮＲＶＶＬＫＫＬＣＴＮＶＦＦＬＩＣＧＦＮＥＫＮＬＮＥＳＲＶＮＶＹＴＳＨＳＰＡＧＴＳＶＱＮＬＲＨＷＧＱＩＡＫＨＨＭＦＱＡＦＤＷＧＳＫＡＫＮＹＦＨＹＮＱＴＣＰＰＶＹＤＬＫＤＭＬＶＰＴＡＬＷＳＧＤＨＤＷＬＡＤＰＳＤＶＮＩＬＬＴＱＩＰＮＬＶＹＨＫＲＬＰＤＷＥＨＬＤＦＬＷＧＬＤＡＰＷＲＭＹＮＥＩＶＮＬＬＲＫＹＱ
配列番号３－チャイニーズハムスターリポタンパク質リパーゼアイソフォームＸ２（ＬＰＬ）
ＭＥＳＫＡＬＬＬＶＡＬＧＶＷＬＱＳＬＴＡＳＱＧＸＡＡＡＤＧＧＲＤＦＴＤＩＥＳＫＦＡＬＲＴＰＤＤＴＡＥＤＮＣＨＬＩＰＧＩＡＥＳＶＳＮＣＨＦＮＨＳＳＫＴＦＶＶＩＨＧＷＴＶＴＧＭＹＥＳＷＶＰＫＬＶＡＡＬＹＫＲＥＰＤＳＮＶＩＶＶＤＷＬＹＲＡＱＱＨＹＰＶＳＡＧＹＴＫＬＶＧＮＤＶＡＲＦＩＮＷＭＥＥＥＦＮＹＰＬＤＮＶＨＬＬＧＹＳＬＧＡＨＡＡＧＶＡＧＳＬＴＮＫＫＶＮＲＩＴＧＬＤＰＡＧＰＮＦＥＹＡＥＡＰＳＲＬＳＰＤＤＡＤＦＶＤＶＬＨＴＦＴＲＧＳＰＧＲＳＩＧＩＱＫＰＶＧＨＶＤＩＹＰＮＧＧＴＦＱＰＧＣＮＩＧＥＡＩＲＶＩＡＥＲＧＬＧＤＶＤＱＬＶＫＣＳＨＥＲＳＩＨＬＦＩＤＳＬＬＮＥＥＮＰＳＫＡＹＲＣＮＳＫＥＡＦＥＫＧＬＣＬＳＣＲＫＮＲＣＮＮＶＧＹＥＩＮＫＶＲＡＫＲＳＳＫＭＹＬＫＴＲＳＱＭＰＹＫＶＦＨＹＱＶＫＩＨＦＳＧＴＥＳＤＫＱＬＮＱＡＦＥＩＳＬＹＧＴＶＡＥＳＥＮＩＰＦＴＬＰＥＶＳＴＮＫＴＹＳＦＬＩＹＴＥＶＤＩＧＥＬＬＭＭＫＬＫＷＫＳＤＳＹＦＳＷＳＤＷＷＳＳＰＧＦＶＩＥＫＩＲＶＫＡＧＥＴＱＫＫＶＩＦＣＡＲＥＫＶＳＨＬＱＫＧＫＤＳＡＶＦＶＫＣＨＤＫＳＬＫＫＳＧ
配列番号４－チャイニーズハムスターグループＸＶホスホリパーゼＡ２アイソフォームＸ１（ＬＰＬＡ２）
ＭＤＲＨＨＬＴＣＲＡＴＱＬＲＳＧＬＬＶＰＬＬＬＬＭＭＬＡＤＬＡＬＳＶＱＲＨＰＰＶＶＬＶＰＧＤＬＧＮＱＬＥＡＫＬＤＫＰＫＶＶＨＹＬＣＳＫＲＴＤＳＹＦＴＬＷＬＮＬＥＬＬＬＰＶＩＩＤＣＷＩＤＮＩＲＬＶＹＮＲＴＳＲＡＴＱＦＰＤＧＶＤＶＲＶＰＧＦＧＥＴＦＳＬＥＦＬＤＰＳＫＲＴＶＧＳＹＦＨＴＭＶＥＳＬＶＧＷＧＹＴＲＧＥＤＬＲＧＡＰＹＤＷＲＲＡＰＮＥＮＧＰＹＦＬＡＬＲＥＭＩＥＥＭＹＱＭＹＧＧＰＶＶＬＶＡＨＳＭＧＮＭＹＴＬＹＦＬＱＲＱＰＱＡＷＫＤＫＹＩＨＡＦＩＳＬＧＡＰＷＧＧＶＡＫＴＬＲＶＬＡＳＧＤＮＮＲＩＰＶＩＧＰＬＫＩＲＥＱＱＲＳＡＶＳＴＳＷＬＬＰＹＮＨＴＷＳＨＤＫＶＦＶＨＴＰＴＴＮＹＴＬＲＤＹＨＱＦＦＱＤＩＲＦＥＤＧＷＦＭＲＱＤＴＥＧＬＶＥＡＭＭＰＰＧＶＥＬＨＣＬＹＧＴＧＶＰＴＰＤＳＦＹＹＥＳＦＰＤＲＤＰＫＩＣＦＧＤＧＤＧＴＶＮＬＥＳＶＬＱＣＱＡＷＱＳＲＱＥＨＫＶＳＬＱＥＬＰＧＳＥＨＩＥＭＬＡＮＡＴＴＬＡＹＬＫＲＶＬＦＥＰ
配列番号５－ＬＰＬＡ２についてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＴＧＧＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＧＣＧＡＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＡＧ
配列番号６－ＬＰＬについてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧ
配列番号７－ＬＡＬについてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＡＣＣＣＧＡＧＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧＡＣ
配列番号８－ＰＰＴ１についてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＣＧＣＣＴＴＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＧＴＡ
配列番号９－チャイニーズハムスターホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）
ＭＫＰＫＬＭＹＱＥＬＫＶＰＶＥＥＰＡＧＥＬＰＶＮＥＩＥＡＷＫＡＡＥＫＫＡＲＷＶＬＬＶＬＩＬＡＶＶＧＦＧＡＬＭＴＱＬＦＬＷＥＹＧＤＬＨＬＦＧＰＮＱＲＰＡＰＣＹＤＰＣＥＡＶＬＶＥＳＩＰＥＧＬＥＦＰＮＡＴＴＳＮＰＳＴＳＱＡＷＬＧＬＬＡＧＡＨＳＳＬＤＩＡＳＦＹＷＴＬＴＮＮＤＴＨＴＱＥＰＳＡＱＱＧＥＥＩＬＱＱＬＱＡＬＡＰＲＧＶＫＶＲＩＡＶＳＫＰＮＧＰＬＡＤＬＱＳＬＬＱＳＧＡＱＶＲＭＶＤＭＱＫＬＴＨＧＶＬＨＴＫＦＷＶＶＤＱＴＨＦＹＬＧＳＡＮＭＤＷＲＳＬＴＱＶＫＥＬＧＶＶＭＹＮＣＳＣＬＡＲＤＬＴＫＩＦＥＡＹＷＦＬＧＱＡＧＳＳＩＰＳＴＷＰＲＰＦＤＴＲＹＮＱＥＴＰＭＥＩＣＬＮＧＴＰＡＬＡＹＬＡＳＡＰＰＰＬＣＰＳＧＲＴＰＤＬＫＡＬＬＳＶＶＤＳＡＲＳＦＩＹＩＡＶＭＮＹＬＰＴＭＥＦＳＨＰＲＲＦＷＰＡＩＤＤＧＬＲＲＡＡＹＥＲＧＶＫＶＲＬＬＶＳＣＷＧＨＳＥＰＳＭＲＳＦＬＬＳＬＡＡＬＲＤＮＨＴＨＳＤＩＱＶＫＬＦＶＶＰＡＤＥＡＱＡＲＩＰＹＡＲＶＮＨＮＫＹＭＶＴＥＲＡＶＹＩＧＴＳＮＷＳＧＳＹＦＴＥＴＡＧＴＳＬＬＶＴＱＮＧＨＤＧＬＲＳＱＬＥＤＶＦＬＲＤＷＮＳＬＹＳＨＮＬＤＴＡＡＤＳＶＧＮＡＣＲＬＬ
配列番号１０－ＰＬＤ３についてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＴＧＣＧＡＧＴＡＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＧＡＧ
配列番号１１－チャイニーズハムスターフコシルトランスフェラーゼ８（ＦＵＴ８）
ＭＲＡＷＴＧＳＷＲＷＩＭＬＩＬＦＡＷＧＴＬＬＦＹＩＧＧＨＬＶＲＤＮＤＨＰＤＨＳＳＲＥＬＳＫＩＬＡＫＬＥＲＬＫＱＱＮＥＤＬＲＲＭＡＥＳＬＲＩＰＥＧＰＩＤＱＧＴＡＴＧＲＶＲＶＬＥＥＱＬＶＫＡＫＥＱＩＥＮＹＫＫＱＡＲＮＤＬＧＫＤＨＥＩＬＲＲＲＩＥＮＧＡＫＥＬＷＦＦＬＱＳＥＬＫＫＬＫＫＬＥＧＮＥＬＱＲＨＡＤＥＩＬＬＤＬＧＨＨＥＲＳＩＭＴＤＬＹＹＬＳＱＴＤＧＡＧＥＷＲＥＫＥＡＫＤＬＴＥＬＶＱＲＲＩＴＹＬＱＮＰＫＤＣＳＫＡＲＫＬＶＣＮＩＮＫＧＣＧＹＧＣＱＬＨＨＶＶＹＣＦＭＩＡＹＧＴＱＲＴＬＩＬＥＳＱＮＷＲＹＡＴＧＧＷＥＴＶＦＲＰＶＳＥＴＣＴＤＲＳＧＬＳＴＧＨＷＳＧＥＶＫＤＫＮＶＱＶＶＥＬＰＩＶＤＳＬＨＰＲＰＰＹＬＰＬＡＶＰＥＤＬＡＤＲＬＬＲＶＨＧＤＰＡＶＷＷＶＳＱＦＶＫＹＬＩＲＰＱＰＷＬＥＲＥＩＥＥＴＴＫＫＬＧＦＫＨＰＶＩＧＶＨＶＲＲＴＤＫＶＧＴＥＡＡＦＨＰＩＥＥＹＭＶＨＶＥＥＨＦＱＬＬＥＲＲＭＫＶＤＫＫＲＶＹＬＡＴＤＤＰＳＬＬＫＥＡＫＴＫＹＳＮＹＥＦＩＳＤＮＳＩＳＷＳＡＧＬＨＮＲＹＴＥＮＳＬＲＧＶＩＬＤＩＨＦＬＳＱＡＤＦＬＶＣＴＦＳＳＱＶＣＲＶＡＹＥＩＭＱＴＬＨＰＤＡＳＡＮＦＨＳＬＤＤＩＹＹＦＧＧＱＮＡＨＮＱＩＡＶＹＰＨＱＰＲＴＫＥＥＩＰＭＥＰＧＤＩＩＧＶＡＧＮＨＷＮＧＹＳＫＧＶＮＲＫＬＧＫＴＧＬＹＰＳＹＫＶＲＥＫＩＥＴＶＫＹＰＴＹＰＥＡＥＫ
配列番号１２－チャイニーズハムスターカテプシンＤ（ＣａｔＤ）
ＭＱＴＬＧＩＬＬＬＡＶＧＬＬＡＡＳＡＳＡＶＩＲＩＰＬＲＫＦＴＳＩＲＲＴＭＴＥＶＧＧＳＶＥＤＬＩＬＫＧＰＩＴＫＹＳＮＱＳＰＡＥＴＫＧＰＶＳＥＬＬＫＮＹＬＤＡＱＹＹＧＥＩＧＩＧＴＰＰＱＣＦＴＶＶＦＤＴＧＳＳＮＬＷＶＰＳＩＨＣＫＬＬＤＩＡＣＷＩＨＨＫＹＮＳＧＫＳＳＴＦＶＫＮＧＴＳＦＤＩＨＹＧＳＧＳＬＳＧＹＬＳＱＤＴＶＳＶＰＣＫＳＥＱＰＧＧＬＫＶＥＫＱＩＦＧＥＡＩＫＱＰＧＩＴＦＩＡＡＫＦＤＧＩＬＧＭＧＹＰＳＩＳＶＮＮＶＶＰＶＦＤＮＬＭＱＱＫＬＶＥＫＮＩＦＳＦＦＬＮＲＤＰＴＧＱＰＧＧＥＬＭＬＧＧＩＤＳＫＹＹＥＧＥＬＳＹＬＮＶＴＲＫＡＹＷＱＶＨＭＤＱＬＤＶＡＮＧＬＴＬＣＫＧＧＣＥＡＩＶＤＴＧＴＳＬＬＶＧＰＶＤＥＶＫＥＬＱＫＡＩＧＡＶＰＬＩＱＧＥＹＭＩＰＣＥＫＶＳＳＬＰＳＶＴＬＫＬＧＧＫＤＹＥＬＳＰＳＫＹＶＬＫＶＳＱＧＧＫＴＩＣＬＳＧＦＭＧＭＤＩＰＰＰＳＧＰＬＷＩＬＧＤＶＦＩＧＴＹＹＴＶＦＤＲＤＮＮＲＶＧＦＡＫＡＡＴＬ
配列番号１３－ＣａｔＤについてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＣＡＧＴＧＴＣＡＧＡＧＴＴＧＣＴＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴ
配列番号１４－チャイニーズハムスターカルボキシペプチダーゼＤ（ＣｐＤ）
ＡＧＰＬＬＰＧＲＰＱＶＫＬＶＧＮＭＨＧＤＥＴＶＳＲＱＶＬＶＹＬＡＨＥＬＡＳＧＹＲＲＧＤＰＲＬＶＲＬＬＮＩＴＤＶＹＬＬＰＳＬＮＰＤＧＦＥＲＳＲＥＧＤＣＧＬＧＤＳＧＳＰＸＡＰＰＲＲＧＲＤＬＮＲＳＦＰＤＱＦＳＴＧＫＰＰＳＬＤＥＶＰＥＶＲＡＬＩＤＷＩＲＫＮＫＦＶＬＳＧＮＬＨＧＧＳＶＶＡＳＹＰＦＤＤＳＰＤＨＭＡＴＧＩＹＳＫＴＳＤＤＥＶＦＲＹＬＡＫＡＹＡＳＮＨＰＩＭＫＴＧＥＰＨＣＰＧＤＥＤＥＴＦＫＤＧＩＴＮＧＡＨＷＹＤＶＥＧＧＭＱＤＹＮＹＶＷＡＮＣＦＥＩＴＬＥＬＳＣＣＫＹＰＰＡＳＱＬＲＱＥＷＥＮＮＲＥＳＬＩＴＬＩＥＫＶＨＩＧＩＫＧＦＶＫＤＳＶＴＧＡＧＬＥＮＡＴＩＳＶＡＧＩＮＨＮＩＴＴＧＲＦＧＤＦＨＲＬＬＩＰＧＩＹＮＬＴＡＶＳＴＧＹＭＰＬＴＩＨＮＩＲＶＫＥＧＰＡＴＥＭＤＦＳＬＲＰＴＶＴＳＫＶＰＤＳＴＥＡＶＡＴＰＧＴＶＡＶＰＮＩＰＰＧＴＳＳＳＨＱＰＩＱＰＫＤＦＨＨＨＨＦＰＤＭＥＩＦＬＲＲＦＡＮＥＹＰＮＩＴＲＬＹＳＬＧＫＳＶＥＳＲＥＬＹＶＭＥＩＳＤＮＰＧＶＨＥＰＧＥＰＥＦＫＹＩＧＮＭＨＧＮＥＶＶＧＲＥＬＬＬＮＬＩＥＹＬＣＫＮＦＧＴＤＰＥＶＴＤＬＶＲＳＴＲＩＨＬＭＰＳＭＮＰＤＧＹＥＫＳＱＥＧＤＳＶＳＶＶＧＲＮＮＳＮＮＦＤＬＮＲＮＦＰＤＱＦＶＴＩＴＤＰＴＱＰＥＴＩＡＶＭＳＷＩＫＳＹＰＦＶＬＳＡＮＬＨＧＧＳＬＶＶＮＹＰＦＤＤＮＥＱＧＶＡＴＹＳＫＳＰＤＤＡＶＦＱＱＩＡＬＳＹＳＲＥＮＳＱＭＦＱＧＲＰＣＫＤＭＳＩＬＮＥＹＦＬＨＧＩＴＮＧＡＳＷＹＮＶＰＧＧＭＱＤＷＮＹＬＱＴＮＣＦＥＶＴＩＥＬＧＣＶＫＹＰＦＥＫＥＬＰＫＹＷＥＱＮＲＲＳＬＩＱＦＭＫＱＶＨＱＧＶＫＧＦＶＬＤＡＴＤＧＲＧＩＬＮＡＴＬＳＶＡＥＩＮＨＰＶＴＴＹＫＡＧＤＹＷＲＬＬＶＰＧＴＹＫＩＴＡＳＡＲＧＹＮＰＶＴＫＮＶＴＶＲＳＥＧＡＩＱＶＮＦＴＬＶＲＳＳＴＤＡＮＮＥＳＫＫＧＫＧＡＳＴＳＴＤＤＳＳＤＰＴＴＫＥＦＥＡＬＩＫＨＬＳＡＥＮＧＬＥＧＦＭＬＳＳＳＳＤＬＡＬＹＲＹＨＳＹＫＤＬＳＥＦＬＲＧＬＶＭＮＹＰＨＩＴＮＬＴＴＬＧＱＳＡＥＹＲＨＩＷＳＬＥＩＳＮＫＰＮＶＳＥＰＥＥＰＫＩＲＦＶＡＧＩＨＧＮＡＰＶＧＴＥＬＬＬＡＬＡＥＦＬＣＬＮＹＫＫＮＰＶＶＴＱＬＶＤＲＴＲＩＶＩＶＰＳＬＮＰＤＧＲＥＲＡＱＥＫＥＣＴＳＫＩＧＱＴＮＡＲＧＫＤＬＤＴＤＦＴＳＮＡＳＱＰＥＴＫＡＩＩＥＮＬＩＱＫＱＤＦＳＬＳＩＡＬＤＧＧＳＶＬＶＴＹＰＹＤＫＰＶＱＴＶＥＮＫＥＴＬＫＨＬＡＳＬＹＡＮＮＨＰＳＭＨＭＧＱＰＳＣＰＮＫＳＤＥＮＩＰＧＧＶＭＲＧＡＥＷＨＳＨＬＧＳＭＫＤＹＳＶＴＹＧＨＣＰＥＩＴＶＹＴＳＣＣＹＦＰＳＡＡＱＬＰＡＬＷＡＥＮＫＲＳＬＬＳＭＬＶＥＶＨＫＧＶＨＧＬＶＫＤＫＴＧＫＰＩＳＫＡＶＩＶＬＮＤＧＩＫＶＨＴＫＥＧＧＹＦＨＶＬＬＡＰＧＶＨＮＩＮＡＩＡＥＧＹＱＱＱＨＳＱＶＦＶＨＨＤＡＡＳＳＶＬＩＶＦＤＴＤＮＲＩＦＧＬＰＲＥＬＶＶＴＶＳＧＡＴＭＳＡＬＩＬＴＡＣＩＩＷＣＩＣＳＩＫＳＮＲＨＫＤＧＦＨＲＬＲＱＨＨＤＥＹＥＤＥＩＲＭＭＳＴＧＳＫＫＳＬＬＳＨＥＦＱＤＥＴＤＴＥＥＥＴＬＹＳＳＫＨ
配列番号１５－ＣｐＤについてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＧＴＣＡＧＴＧＧＡＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＡＴＣ
配列番号１６－チャイニーズハムスターホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）
ＭＡＡＰＭＤＲＳＰＧＧＲＡＶＲＡＬＲＬＡＬＡＬＡＳＬＴＥＶＬＬＮＣＰＡＧＡＬＰＴＱＧＰＧＲＲＲＱＮＬＤＰＰＶＳＲＶＲＳＶＬＬＤＡＡＳＧＱＬＲＬＶＤＧＩＨＰＹＡＶＡＷＡＮＬＴＮＡＩＲＥＴＧＷＡＹＬＤＬＧＴＮＧＳＹＮＤＳＬＱＡＹＡＡＧＶＶＥＡＳＶＳＥＥＬＩＹＭＨＷＭＮＴＭＶＮＹＣＧＰＦＥＹＥＶＧＹＣＥＫＬＫＳＦＬＥＩＮＬＥＷＭＱＲＥＭＥＬＳＱＤＳＰＹＷＨＱＶＲＬＴＬＬＱＬＫＧＬＥＤＳＹＥＧＲＬＴＦＰＴＧＲＦＴＩＫＰＬＧＦＬＬＬＱＩＡＧＤＬＥＤＬＥＱＡＬＮＫＴＳＴＫＬＳＬＧＳＧＳＣＳＡＩＩＫＬＬＰＧＡＲＤＬＬＶＡＨＮＴＷＮＳＹＱＮＭＬＲＩＩＫＫＹＱＬＱＦＲＱＧＰＱＥＡＹＰＬＩＡＧＮＮＬＶＦＳＳＹＰＧＴＩＦＳＧＤＤＦＹＩＬＧＳＧＬＶＴＬＥＴＴＩＧＮＫＮＰＡＬＷＫＹＶＱＰＱＧＣＶＬＥＷＩＲＮＩＶＡＮＲＬＡＬＤＧＡＴＷＡＤＩＦＫＱＦＮＳＧＴＹＮＮＱＷＭＩＶＤＹＫＡＦＩＰＮＧＰＳＰＧＳＲＶＬＴＩＬＥＱＩＰＧＭＶＶＶＡＤＫＴＥＤＬＹＫＴＴＹＷＡＳＹＮＩＰＦＦＥＩＶＦＮＡＳＧＬＱＤＬＶＡＱＹＧＤＷＦＳＹＴＫＮＰＲＡＱＩＦＱＲＤＱＳＬＶＥＤＭＮＳＭＶＲＬＩＲＹＮＮＦＬＨＤＰＬＳＬＣＥＡＣＩＰＫＰＮＡＥＮＡＩＳＡＲＳＤＬＮＰＡＮＧＳＹＰＦＱＡＬＹＱＲＰＨＧＧＩＤＶＫＶＴＳＦＳＬＡＫＲＭＳＭＬＡＡＳＧＰＴＷＤＱＬＰＰＦＱＷＳＬＳＰＦＲＳＭＬＨＭＧＱＰＤＬＷＴＦＳＰＩＳＶＰＷＤ
配列番号１７－ＰＬＢＬ２についてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＣＧＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＧ
配列番号１８－チャイニーズハムスターペルオキシレドキシン－１（ＰＲＤＸ１）
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配列番号１９－ＰＲＤＸ１についてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＧＡＣ
配列番号１－チャイニーズハムスターパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）
ＭＡＳＰＧＳＲＷＬＬＡＶＳＬＬＰＷＣＣＡＡＷＳＬＧＨＬＮＰＰＳＬＴＰＬＶＩＷＨＧＭＧＤＳＣＣＮＰＩＳＭＧＡＩＫＫＭＶＥＫＥＩＰＧＩＹＶＬＳＬＥＩＧＫＮＭＭＥＤＶＥＮＳＦＦＬＮＶＮＳＱＶＭＭＶＣＱＩＬＥＫＤＰＫＬＱＱＧＹＮＡＩＧＦＳＱＧＧＱＦＬＲＡＶＡＱＲＣＰＳＰＲＭＩＮＬＩＳＶＧＧＱＨＱＧＶＦＧＬＰＲＣＰＧＥＳＳＨＶＣＤＦＩＲＫＭＩＮＡＧＡＹＳＫＶＶＱＬＲＬＶＱＡＱＹＷＨＤＰＩＫＥＤＶＹＲＮＨＳＩＦＬＡＤＩＮＱＥＲＣＶＮＥＴＹＫＫＮＬＭＡＬＮＫＦＶＭＶＫＦＬＮＤＳＩＶＤＰＶＤＳＥＷＦＧＦＹＲＳＧＱＡＫＥＴＩＰＬＱＥＳＴＬＹＴＥＤＲＬＧＬＫＱＭＤＫＡＧＫＬＶＦＬＡＫＥＧＤＨＬＱＬＳＫＥＷＦＮＡＹＩＩＰＦＬＫ
配列番号２－チャイニーズハムスターリソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）
ＭＱＩＬＧＬＶＶＣＬＦＬＳＶＬＬＳＧＲＰＴＧＳＩＰＨＶＤＰＥＡＮＭＮＶＴＥＭＩＲＹＷＧＹＰＳＥＥＨＭＩＱＴＥＤＧＹＩＬＧＶＨＲＩＰＨＧＲＫＮＨＳＨＫＧＰＫＰＶＶＹＬＱＨＧＦＬＡＤＳＳＮＷＶＴＮＳＤＮＳＳＬＧＦＩＬＡＤＡＧＦＤＶＷＬＧＮＳＲＧＮＴＷＳＬＫＨＲＴＬＳＩＳＱＤＥＦＷＡＦＳＦＤＥＭＡＫＹＤＬＰＡＳＩＹＹＩＶＮＫＴＧＱＥＱＶＹＹＶＧＨＳＱＧＴＴＩＧＦＩＡＦＳＱＩＰＥＬＡＫＫＩＫＭＦＦＡＬＡＰＶＶＦＬＮＦＡＬＳＰＶＩＫＩＳＫＷＰＥＶＩＩＥＤＬＦＧＨＫＱＦＦＰＱＳＡＫＬＫＷＬＳＴＨＶＣＮＲＶＶＬＫＫＬＣＴＮＶＦＦＬＩＣＧＦＮＥＫＮＬＮＥＳＲＶＮＶＹＴＳＨＳＰＡＧＴＳＶＱＮＬＲＨＷＧＱＩＡＫＨＨＭＦＱＡＦＤＷＧＳＫＡＫＮＹＦＨＹＮＱＴＣＰＰＶＹＤＬＫＤＭＬＶＰＴＡＬＷＳＧＤＨＤＷＬＡＤＰＳＤＶＮＩＬＬＴＱＩＰＮＬＶＹＨＫＲＬＰＤＷＥＨＬＤＦＬＷＧＬＤＡＰＷＲＭＹＮＥＩＶＮＬＬＲＫＹＱ
配列番号３－チャイニーズハムスターリポタンパク質リパーゼアイソフォームＸ２（ＬＰＬ）
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配列番号４－チャイニーズハムスターグループＸＶホスホリパーゼＡ２アイソフォームＸ１（ＬＰＬＡ２）
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配列番号５－ＬＰＬＡ２についてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＴＧＧＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＧＣＧＡＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＡＧ
配列番号６－ＬＰＬについてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧ
配列番号７－ＬＡＬについてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＡＣＣＣＧＡＧＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧＡＣ
配列番号８－ＰＰＴ１についてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＣＧＣＣＴＴＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＧＴＡ
配列番号９－チャイニーズハムスターホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）
ＭＫＰＫＬＭＹＱＥＬＫＶＰＶＥＥＰＡＧＥＬＰＶＮＥＩＥＡＷＫＡＡＥＫＫＡＲＷＶＬＬＶＬＩＬＡＶＶＧＦＧＡＬＭＴＱＬＦＬＷＥＹＧＤＬＨＬＦＧＰＮＱＲＰＡＰＣＹＤＰＣＥＡＶＬＶＥＳＩＰＥＧＬＥＦＰＮＡＴＴＳＮＰＳＴＳＱＡＷＬＧＬＬＡＧＡＨＳＳＬＤＩＡＳＦＹＷＴＬＴＮＮＤＴＨＴＱＥＰＳＡＱＱＧＥＥＩＬＱＱＬＱＡＬＡＰＲＧＶＫＶＲＩＡＶＳＫＰＮＧＰＬＡＤＬＱＳＬＬＱＳＧＡＱＶＲＭＶＤＭＱＫＬＴＨＧＶＬＨＴＫＦＷＶＶＤＱＴＨＦＹＬＧＳＡＮＭＤＷＲＳＬＴＱＶＫＥＬＧＶＶＭＹＮＣＳＣＬＡＲＤＬＴＫＩＦＥＡＹＷＦＬＧＱＡＧＳＳＩＰＳＴＷＰＲＰＦＤＴＲＹＮＱＥＴＰＭＥＩＣＬＮＧＴＰＡＬＡＹＬＡＳＡＰＰＰＬＣＰＳＧＲＴＰＤＬＫＡＬＬＳＶＶＤＳＡＲＳＦＩＹＩＡＶＭＮＹＬＰＴＭＥＦＳＨＰＲＲＦＷＰＡＩＤＤＧＬＲＲＡＡＹＥＲＧＶＫＶＲＬＬＶＳＣＷＧＨＳＥＰＳＭＲＳＦＬＬＳＬＡＡＬＲＤＮＨＴＨＳＤＩＱＶＫＬＦＶＶＰＡＤＥＡＱＡＲＩＰＹＡＲＶＮＨＮＫＹＭＶＴＥＲＡＶＹＩＧＴＳＮＷＳＧＳＹＦＴＥＴＡＧＴＳＬＬＶＴＱＮＧＨＤＧＬＲＳＱＬＥＤＶＦＬＲＤＷＮＳＬＹＳＨＮＬＤＴＡＡＤＳＶＧＮＡＣＲＬＬ
配列番号１０－ＰＬＤ３についてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＴＧＣＧＡＧＴＡＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＧＡＧ
配列番号１１－チャイニーズハムスターフコシルトランスフェラーゼ８（ＦＵＴ８）
ＭＲＡＷＴＧＳＷＲＷＩＭＬＩＬＦＡＷＧＴＬＬＦＹＩＧＧＨＬＶＲＤＮＤＨＰＤＨＳＳＲＥＬＳＫＩＬＡＫＬＥＲＬＫＱＱＮＥＤＬＲＲＭＡＥＳＬＲＩＰＥＧＰＩＤＱＧＴＡＴＧＲＶＲＶＬＥＥＱＬＶＫＡＫＥＱＩＥＮＹＫＫＱＡＲＮＤＬＧＫＤＨＥＩＬＲＲＲＩＥＮＧＡＫＥＬＷＦＦＬＱＳＥＬＫＫＬＫＫＬＥＧＮＥＬＱＲＨＡＤＥＩＬＬＤＬＧＨＨＥＲＳＩＭＴＤＬＹＹＬＳＱＴＤＧＡＧＥＷＲＥＫＥＡＫＤＬＴＥＬＶＱＲＲＩＴＹＬＱＮＰＫＤＣＳＫＡＲＫＬＶＣＮＩＮＫＧＣＧＹＧＣＱＬＨＨＶＶＹＣＦＭＩＡＹＧＴＱＲＴＬＩＬＥＳＱＮＷＲＹＡＴＧＧＷＥＴＶＦＲＰＶＳＥＴＣＴＤＲＳＧＬＳＴＧＨＷＳＧＥＶＫＤＫＮＶＱＶＶＥＬＰＩＶＤＳＬＨＰＲＰＰＹＬＰＬＡＶＰＥＤＬＡＤＲＬＬＲＶＨＧＤＰＡＶＷＷＶＳＱＦＶＫＹＬＩＲＰＱＰＷＬＥＲＥＩＥＥＴＴＫＫＬＧＦＫＨＰＶＩＧＶＨＶＲＲＴＤＫＶＧＴＥＡＡＦＨＰＩＥＥＹＭＶＨＶＥＥＨＦＱＬＬＥＲＲＭＫＶＤＫＫＲＶＹＬＡＴＤＤＰＳＬＬＫＥＡＫＴＫＹＳＮＹＥＦＩＳＤＮＳＩＳＷＳＡＧＬＨＮＲＹＴＥＮＳＬＲＧＶＩＬＤＩＨＦＬＳＱＡＤＦＬＶＣＴＦＳＳＱＶＣＲＶＡＹＥＩＭＱＴＬＨＰＤＡＳＡＮＦＨＳＬＤＤＩＹＹＦＧＧＱＮＡＨＮＱＩＡＶＹＰＨＱＰＲＴＫＥＥＩＰＭＥＰＧＤＩＩＧＶＡＧＮＨＷＮＧＹＳＫＧＶＮＲＫＬＧＫＴＧＬＹＰＳＹＫＶＲＥＫＩＥＴＶＫＹＰＴＹＰＥＡＥＫ
配列番号１２－チャイニーズハムスターカテプシンＤ（ＣａｔＤ）
ＭＱＴＬＧＩＬＬＬＡＶＧＬＬＡＡＳＡＳＡＶＩＲＩＰＬＲＫＦＴＳＩＲＲＴＭＴＥＶＧＧＳＶＥＤＬＩＬＫＧＰＩＴＫＹＳＮＱＳＰＡＥＴＫＧＰＶＳＥＬＬＫＮＹＬＤＡＱＹＹＧＥＩＧＩＧＴＰＰＱＣＦＴＶＶＦＤＴＧＳＳＮＬＷＶＰＳＩＨＣＫＬＬＤＩＡＣＷＩＨＨＫＹＮＳＧＫＳＳＴＦＶＫＮＧＴＳＦＤＩＨＹＧＳＧＳＬＳＧＹＬＳＱＤＴＶＳＶＰＣＫＳＥＱＰＧＧＬＫＶＥＫＱＩＦＧＥＡＩＫＱＰＧＩＴＦＩＡＡＫＦＤＧＩＬＧＭＧＹＰＳＩＳＶＮＮＶＶＰＶＦＤＮＬＭＱＱＫＬＶＥＫＮＩＦＳＦＦＬＮＲＤＰＴＧＱＰＧＧＥＬＭＬＧＧＩＤＳＫＹＹＥＧＥＬＳＹＬＮＶＴＲＫＡＹＷＱＶＨＭＤＱＬＤＶＡＮＧＬＴＬＣＫＧＧＣＥＡＩＶＤＴＧＴＳＬＬＶＧＰＶＤＥＶＫＥＬＱＫＡＩＧＡＶＰＬＩＱＧＥＹＭＩＰＣＥＫＶＳＳＬＰＳＶＴＬＫＬＧＧＫＤＹＥＬＳＰＳＫＹＶＬＫＶＳＱＧＧＫＴＩＣＬＳＧＦＭＧＭＤＩＰＰＰＳＧＰＬＷＩＬＧＤＶＦＩＧＴＹＹＴＶＦＤＲＤＮＮＲＶＧＦＡＫＡＡＴＬ
配列番号１３－ＣａｔＤについてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＣＡＧＴＧＴＣＡＧＡＧＴＴＧＣＴＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴ
配列番号１４－チャイニーズハムスターカルボキシペプチダーゼＤ（ＣｐＤ）
ＡＧＰＬＬＰＧＲＰＱＶＫＬＶＧＮＭＨＧＤＥＴＶＳＲＱＶＬＶＹＬＡＨＥＬＡＳＧＹＲＲＧＤＰＲＬＶＲＬＬＮＩＴＤＶＹＬＬＰＳＬＮＰＤＧＦＥＲＳＲＥＧＤＣＧＬＧＤＳＧＳＰＸＡＰＰＲＲＧＲＤＬＮＲＳＦＰＤＱＦＳＴＧＫＰＰＳＬＤＥＶＰＥＶＲＡＬＩＤＷＩＲＫＮＫＦＶＬＳＧＮＬＨＧＧＳＶＶＡＳＹＰＦＤＤＳＰＤＨＭＡＴＧＩＹＳＫＴＳＤＤＥＶＦＲＹＬＡＫＡＹＡＳＮＨＰＩＭＫＴＧＥＰＨＣＰＧＤＥＤＥＴＦＫＤＧＩＴＮＧＡＨＷＹＤＶＥＧＧＭＱＤＹＮＹＶＷＡＮＣＦＥＩＴＬＥＬＳＣＣＫＹＰＰＡＳＱＬＲＱＥＷＥＮＮＲＥＳＬＩＴＬＩＥＫＶＨＩＧＩＫＧＦＶＫＤＳＶＴＧＡＧＬＥＮＡＴＩＳＶＡＧＩＮＨＮＩＴＴＧＲＦＧＤＦＨＲＬＬＩＰＧＩＹＮＬＴＡＶＳＴＧＹＭＰＬＴＩＨＮＩＲＶＫＥＧＰＡＴＥＭＤＦＳＬＲＰＴＶＴＳＫＶＰＤＳＴＥＡＶＡＴＰＧＴＶＡＶＰＮＩＰＰＧＴＳＳＳＨＱＰＩＱＰＫＤＦＨＨＨＨＦＰＤＭＥＩＦＬＲＲＦＡＮＥＹＰＮＩＴＲＬＹＳＬＧＫＳＶＥＳＲＥＬＹＶＭＥＩＳＤＮＰＧＶＨＥＰＧＥＰＥＦＫＹＩＧＮＭＨＧＮＥＶＶＧＲＥＬＬＬＮＬＩＥＹＬＣＫＮＦＧＴＤＰＥＶＴＤＬＶＲＳＴＲＩＨＬＭＰＳＭＮＰＤＧＹＥＫＳＱＥＧＤＳＶＳＶＶＧＲＮＮＳＮＮＦＤＬＮＲＮＦＰＤＱＦＶＴＩＴＤＰＴＱＰＥＴＩＡＶＭＳＷＩＫＳＹＰＦＶＬＳＡＮＬＨＧＧＳＬＶＶＮＹＰＦＤＤＮＥＱＧＶＡＴＹＳＫＳＰＤＤＡＶＦＱＱＩＡＬＳＹＳＲＥＮＳＱＭＦＱＧＲＰＣＫＤＭＳＩＬＮＥＹＦＬＨＧＩＴＮＧＡＳＷＹＮＶＰＧＧＭＱＤＷＮＹＬＱＴＮＣＦＥＶＴＩＥＬＧＣＶＫＹＰＦＥＫＥＬＰＫＹＷＥＱＮＲＲＳＬＩＱＦＭＫＱＶＨＱＧＶＫＧＦＶＬＤＡＴＤＧＲＧＩＬＮＡＴＬＳＶＡＥＩＮＨＰＶＴＴＹＫＡＧＤＹＷＲＬＬＶＰＧＴＹＫＩＴＡＳＡＲＧＹＮＰＶＴＫＮＶＴＶＲＳＥＧＡＩＱＶＮＦＴＬＶＲＳＳＴＤＡＮＮＥＳＫＫＧＫＧＡＳＴＳＴＤＤＳＳＤＰＴＴＫＥＦＥＡＬＩＫＨＬＳＡＥＮＧＬＥＧＦＭＬＳＳＳＳＤＬＡＬＹＲＹＨＳＹＫＤＬＳＥＦＬＲＧＬＶＭＮＹＰＨＩＴＮＬＴＴＬＧＱＳＡＥＹＲＨＩＷＳＬＥＩＳＮＫＰＮＶＳＥＰＥＥＰＫＩＲＦＶＡＧＩＨＧＮＡＰＶＧＴＥＬＬＬＡＬＡＥＦＬＣＬＮＹＫＫＮＰＶＶＴＱＬＶＤＲＴＲＩＶＩＶＰＳＬＮＰＤＧＲＥＲＡＱＥＫＥＣＴＳＫＩＧＱＴＮＡＲＧＫＤＬＤＴＤＦＴＳＮＡＳＱＰＥＴＫＡＩＩＥＮＬＩＱＫＱＤＦＳＬＳＩＡＬＤＧＧＳＶＬＶＴＹＰＹＤＫＰＶＱＴＶＥＮＫＥＴＬＫＨＬＡＳＬＹＡＮＮＨＰＳＭＨＭＧＱＰＳＣＰＮＫＳＤＥＮＩＰＧＧＶＭＲＧＡＥＷＨＳＨＬＧＳＭＫＤＹＳＶＴＹＧＨＣＰＥＩＴＶＹＴＳＣＣＹＦＰＳＡＡＱＬＰＡＬＷＡＥＮＫＲＳＬＬＳＭＬＶＥＶＨＫＧＶＨＧＬＶＫＤＫＴＧＫＰＩＳＫＡＶＩＶＬＮＤＧＩＫＶＨＴＫＥＧＧＹＦＨＶＬＬＡＰＧＶＨＮＩＮＡＩＡＥＧＹＱＱＱＨＳＱＶＦＶＨＨＤＡＡＳＳＶＬＩＶＦＤＴＤＮＲＩＦＧＬＰＲＥＬＶＶＴＶＳＧＡＴＭＳＡＬＩＬＴＡＣＩＩＷＣＩＣＳＩＫＳＮＲＨＫＤＧＦＨＲＬＲＱＨＨＤＥＹＥＤＥＩＲＭＭＳＴＧＳＫＫＳＬＬＳＨＥＦＱＤＥＴＤＴＥＥＥＴＬＹＳＳＫＨ
配列番号１５－ＣｐＤについてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＧＴＣＡＧＴＧＧＡＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＡＴＣ
配列番号１６－チャイニーズハムスターホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）
ＭＡＡＰＭＤＲＳＰＧＧＲＡＶＲＡＬＲＬＡＬＡＬＡＳＬＴＥＶＬＬＮＣＰＡＧＡＬＰＴＱＧＰＧＲＲＲＱＮＬＤＰＰＶＳＲＶＲＳＶＬＬＤＡＡＳＧＱＬＲＬＶＤＧＩＨＰＹＡＶＡＷＡＮＬＴＮＡＩＲＥＴＧＷＡＹＬＤＬＧＴＮＧＳＹＮＤＳＬＱＡＹＡＡＧＶＶＥＡＳＶＳＥＥＬＩＹＭＨＷＭＮＴＭＶＮＹＣＧＰＦＥＹＥＶＧＹＣＥＫＬＫＳＦＬＥＩＮＬＥＷＭＱＲＥＭＥＬＳＱＤＳＰＹＷＨＱＶＲＬＴＬＬＱＬＫＧＬＥＤＳＹＥＧＲＬＴＦＰＴＧＲＦＴＩＫＰＬＧＦＬＬＬＱＩＡＧＤＬＥＤＬＥＱＡＬＮＫＴＳＴＫＬＳＬＧＳＧＳＣＳＡＩＩＫＬＬＰＧＡＲＤＬＬＶＡＨＮＴＷＮＳＹＱＮＭＬＲＩＩＫＫＹＱＬＱＦＲＱＧＰＱＥＡＹＰＬＩＡＧＮＮＬＶＦＳＳＹＰＧＴＩＦＳＧＤＤＦＹＩＬＧＳＧＬＶＴＬＥＴＴＩＧＮＫＮＰＡＬＷＫＹＶＱＰＱＧＣＶＬＥＷＩＲＮＩＶＡＮＲＬＡＬＤＧＡＴＷＡＤＩＦＫＱＦＮＳＧＴＹＮＮＱＷＭＩＶＤＹＫＡＦＩＰＮＧＰＳＰＧＳＲＶＬＴＩＬＥＱＩＰＧＭＶＶＶＡＤＫＴＥＤＬＹＫＴＴＹＷＡＳＹＮＩＰＦＦＥＩＶＦＮＡＳＧＬＱＤＬＶＡＱＹＧＤＷＦＳＹＴＫＮＰＲＡＱＩＦＱＲＤＱＳＬＶＥＤＭＮＳＭＶＲＬＩＲＹＮＮＦＬＨＤＰＬＳＬＣＥＡＣＩＰＫＰＮＡＥＮＡＩＳＡＲＳＤＬＮＰＡＮＧＳＹＰＦＱＡＬＹＱＲＰＨＧＧＩＤＶＫＶＴＳＦＳＬＡＫＲＭＳＭＬＡＡＳＧＰＴＷＤＱＬＰＰＦＱＷＳＬＳＰＦＲＳＭＬＨＭＧＱＰＤＬＷＴＦＳＰＩＳＶＰＷＤ
配列番号１７－ＰＬＢＬ２についてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＣＧＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＧ
配列番号１８－チャイニーズハムスターペルオキシレドキシン－１（ＰＲＤＸ１）
ＭＳＳＧＮＡＫＩＧＹＰＡＰＮＦＫＡＴＡＶＭＰＤＧＱＦＲＤＩＣＬＳＥＹＲＧＫＹＶＶＦＦＦＹＰＬＤＦＴＦＶＣＰＴＥＩＩＡＦＳＤＲＡＥＥＦＫＫＬＮＣＱＶＩＧＡＳＶＤＳＨＦＣＨＬＡＷＩＮＴＰＫＫＱＧＧＬＧＰＭＮＩＰＬＶＳＤＰＫＲＴＩＡＱＤＹＧＶＬＫＡＤＥＧＩＳＦＲＧＬＦＩＩＤＤＫＧＩＬＲＱＩＴＩＮＤＬＰＶＧＲＳＶＤＥＩＬＲＬＶＱＡＦＱＦＴＤＫＨＧＥＶＣＰＡＧＷＫＰＧＳＤＴＩＫＰＤＶＱＫＳＫＥＹＦＳＫＱＫ
配列番号１９－ＰＲＤＸ１についてのＺＦＮ結合／切断核酸配列
ＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＧＡＣ
Claims (39)
- 少なくとも１つの内因性宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、ならびにリポタンパク質リパーゼ、リソソーム酸リパーゼ、ホスホリパーゼＤ、およびホスホリパーゼＡ２からなる群から選択される少なくとも１つの他の内因性ＨＣＰの減少した発現、ならびに／または減少した活性を有する、組換え操作された哺乳動物細胞。
- ＨＣＰパルミトイルタンパク質チオエステラーゼをコードする、破壊された、または不活性化された遺伝子と、リソソーム酸リパーゼタンパク質、リポタンパク質リパーゼタンパク質、ホスホリパーゼＤ、およびホスホリパーゼＡ２タンパク質からなる群から選択されるＨＣＰをコードする、少なくとも１つの破壊された、または不活性化された遺伝子とを含む、請求項１に記載の細胞。
- 前記パルミトイルタンパク質チオエステラーゼが、ＰＰＴ１、ならびにＬＡＬ、ＬＰＬ、ＰＬＤ３およびＬＰＬＡ２からなる群から選択されるＨＣＰをコードする、少なくとも１つの不活性化された遺伝子である、請求項１または２に記載の細胞。
- 前記細胞が、前記リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）タンパク質、前記リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）タンパク質、前記ホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）タンパク質、および前記パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコード配列において修飾を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、前記リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）タンパク質、前記リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）タンパク質、前記ホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）タンパク質、および前記パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコード配列において修飾を含み、前記修飾が、前記修飾のうちのいずれも有しない細胞の発現レベルと比較して、前記修飾を有する細胞において前記ＬＡＬタンパク質、前記ＬＰＬタンパク質、前記ＬＰＬＡ２タンパク質、および前記ＰＰＴ１タンパク質の発現レベルを低下させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、検出可能なレベルの前記ＬＡＬタンパク質、前記ＬＰＬタンパク質、前記ＬＰＬＡ２タンパク質、および前記ＰＰＴ１タンパク質を発現しない、請求項４または５に記載の細胞。
- 前記修飾が、前記特定のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの前記コード配列のエクソン１または２内のヌクレオチド挿入または欠失を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記修飾が、
ａ）前記ＬＰＬ、前記ＬＰＬＡ２、およびＰＰＴ１タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの前記コード配列のエクソン１内のヌクレオチド挿入または欠失、ならびに
ｂ）前記ＬＡＬタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの前記コード配列のエクソン２内のヌクレオチド挿入または欠失を含む、請求項４～７のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記ＰＰＴ１タンパク質が、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の細胞。
- 前記修飾が、配列番号８内のヌクレオチド挿入または欠失を含む、請求項９に記載の細胞。
- 前記ＬＡＬタンパク質が、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の細胞。
- 前記修飾が、配列番号７内のヌクレオチド挿入または欠失を含む、請求項１１に記載の細胞。
- 前記ＬＰＬタンパク質が、配列番号３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の細胞。
- 前記修飾が、配列番号６内のヌクレオチド挿入または欠失を含む、請求項１３に記載の細胞。
- 前記ＬＰＬＡ２タンパク質が、配列番号４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の細胞。
- 前記修飾が、配列番号５内のヌクレオチド挿入または欠失を含む、請求項１５に記載の細胞。
- 前記修飾が、ＰＰＴ１、ＬＡＬ、ＬＰＬ、およびＬＰＬＡ２から構成されるリストからのタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの前記コード配列のエクソン２、エクソン３、またはエクソン４内のヌクレオチド挿入または欠失を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の細胞。
- １つ以上のバイオ製品をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記バイオ製品が、抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗原結合断片、抗原結合タンパク質、タンパク質－タンパク質融合およびＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１８に記載の細胞。
- 前記細胞が、前記修飾のうちのいずれも有しない細胞のポリソルベート分解活性と比較して、実質的に減少したポリソルベート分解活性を有するプロテインＡ結合画分を産生する、請求項４～１９のいずれか一項に記載の細胞。
- インタクトなポリソルベートの分解の前記減少が、３０％以上である、請求項２０に記載の細胞。
- インタクトなポリソルベートの分解の前記減少が、３０％以上である、請求項２０に記載の細胞。
- 前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（グルタミンシンテターゼ）、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＦＵＴ８ノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、またはＣＨＯ由来細胞である、請求項２３に記載の細胞。
- （ａ）未修飾細胞と比較して、減少したレベルのＰＰＴ１を産生するように修飾された宿主細胞から、バイオ製品および複数の宿主細胞タンパク質を含む試料を得るステップ、次いで
（ｂ）前記試料を少なくとも１つの精製ステップに供して、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質を除去するステップを含む、バイオ製品を製造するための方法。 - 前記複数の宿主細胞タンパク質が、（ａ）検出可能な量のＰＰＴ１タンパク質を含まず、（ｂ）検出可能な量の少なくとも１つの他のリパーゼまたはエステラーゼを含まない、請求項２５に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、
ａ）ＰＰＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコード配列における修飾、および
ｂ）リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）、ホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される脂肪酸ヒドロラーゼをコードするポリヌクレオチドのコード配列における修飾を含む、請求項２５または２６に記載の方法。 - 前記精製ステップが、プロテインＡアフィニティー（ＰＡ）クロマトグラフィーもしくは別のアフィニティークロマトグラフィー法、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質製剤中のポリソルベート分解を減少させるための方法であって、
（ａ）宿主細胞を修飾して、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）タンパク質の発現を減少させるか、または排除するステップ、
（ｂ）前記宿主細胞を修飾して、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）、および／またはホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）の発現を減少させるか、または排除するステップ、
（ｃ）前記細胞にバイオ製品をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップ、
（ｄ）前記宿主細胞から目的のタンパク質を含むタンパク質画分を抽出するステップ、
（ｅ）前記タンパク質画分を、プロテインＡアフィニティー（ＰＡ）クロマトグラフィーもしくは別のアフィニティークロマトグラフィー法、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、クロマトグラフィー媒体と接触させるステップ、
（ｆ）前記媒体から目的の前記タンパク質を収集するステップ、
（ｇ）前記バイオ製品を脂肪酸エステルと混合するステップ、
（ｈ）任意選択により、緩衝液を添加するステップ、次いで
（ｉ）任意選択により、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を添加するステップを含む、方法。 - タンパク質製剤中の凝集または粒子形成を減少させるための方法であって、
（ａ）宿主細胞を修飾して、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）タンパク質の発現を減少させるか、または排除するステップ、
（ｂ）前記宿主細胞を修飾して、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）、および／またはホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）の発現を減少させるか、または排除するステップ、
（ｃ）前記細胞に目的のバイオ製品をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップ、
（ｄ）前記宿主細胞から目的のタンパク質を含むタンパク質画分を抽出するステップ、
（ｅ）前記タンパク質画分を、プロテインＡアフィニティー（ＰＡ）クロマトグラフィーもしくは別のアフィニティークロマトグラフィー法、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、クロマトグラフィー媒体と接触させるステップ、
（ｆ）前記媒体から目的の前記タンパク質を収集するステップ、
（ｇ）目的の前記タンパク質を脂肪酸エステルと混合するステップ、
（ｈ）任意選択により、緩衝液を添加するステップ、次いで
（ｉ）任意選択により、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を添加するステップを含む、方法。 - 安定な製剤化したバイオ製品を産生するための方法であって、
（ａ）宿主細胞を修飾して、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）タンパク質の発現を減少させるか、または排除すること、
（ｂ）前記宿主細胞を修飾して、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＤ３（ＰＬＤ３）、および／またはホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）の発現を減少させるか、または排除すること、
（ｃ）前記細胞にバイオ製品をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトすること、
（ｄ）前記宿主細胞から前記バイオ製品を含むタンパク質画分を抽出すること、
（ｅ）前記タンパク質画分を、プロテインＡアフィニティー（ＰＡ）クロマトグラフィーもしくは別のアフィニティークロマトグラフィー法、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、クロマトグラフィー媒体と接触させること、
（ｆ）前記媒体から前記バイオ製品を収集すること、
（ｇ）前記バイオ製品を脂肪酸エステルと混合すること、
（ｈ）任意選択により、緩衝液を添加すること、次いで
（ｉ）任意選択により、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を添加することを含む、方法。 - 前記宿主細胞を修飾して、ＰＰＴ１の前記発現を減少させるか、または排除する前記ステップが、前記ＰＰＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドのエクソン２、エクソン３、またはエクソン４内の少なくとも１つのヌクレオチドを挿入または欠失することを含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＰＰＴ１タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞によって産生された前記ホスホリパーゼのうちのいずれかの前記発現および／または活性が減少している、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記減少した発現および／または活性が、脂肪分解活性についてアッセイすることによって決定される、請求項３４に記載の方法。
- ポリソルベート、および請求項１～２４のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞によって産生されたバイオ製品を含む、医薬組成物。
- ポリソルベート、および請求項２９～３５のいずれか一項に記載の方法によって産生されたバイオ製品を含む、医薬組成物。
- 前記バイオ製品が、タネズマブ、レブリキズマブ、ミリキズマブ、ソラネズマブ、ドナネマブ、ザゴテネマブ（ｚａｇｏｔｅｎｅｍａｂ）、ラムシルマブ、ガルカネズマブ、イキセキズマブ、デュラグルチド、ネシツムマブ、オララツマブ、セツキシマブ、アンジオポエチン２ｍＡｂ、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質、ＣＤ２００Ｒアゴニスト抗体、エピレグリン／ＴＧＦα ｍＡｂ、ＡＮＧＰＴＬ ３／８抗体、ＢＴＬＡ抗体アゴニスト、ＣＸＣＲ１／２リガンド抗体、ＧＤＦ１５アゴニスト、ＩＬ－３３抗体、ＰＡＣＡＰ３８抗体、ＰＤ－１アゴニスト抗体、Ｎ３ｐＧ Ａｂｅｔａ ｍＡｂとも呼ばれるｐＧｌｕ－Ａｂｅｔａ、ＴＮＦα／ＩＬ－２３二重特異性抗体、抗α－シヌクレイン抗体、ＣＤ２２６アゴニスト抗体、ＭＣＴ１抗体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体、ＦｃｇＲＩＩＢ抗体、ＩＬ－３４抗体、ＣＤ１９抗体、ＴＲＥＭ２抗体、およびリラキシン類似体、ならびにポリソルベートからなる群から選択され、前記バイオ製品が、本発明の組換え哺乳動物細胞によって産生される、請求項３７に記載の医薬組成物。
- 請求項２９～３５のいずれか一項に記載の方法によって作製された、バイオ製品。
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