TWI624265B - 川續斷萃取物用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途 - Google Patents

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本發明係有關於一種川續斷萃取物用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，係將一有效劑量之一川續斷萃取物投予至一所需個體，以清除自由基以及螯合亞鐵離子，其中川續斷萃取物係以至少一步驟之有機溶劑萃取製得；藉此，川續斷萃取物可用於製備抗氧化之化妝材料組成物或醫藥組成物，以保護皮膚細胞免於紫外線傷害。

Description

川續斷萃取物用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途
本發明係有關於一種川續斷萃取物用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，尤其係指一具有清除自由基及螯合亞鐵離子等能力之川續斷萃取物，將其用於製備化妝材料組成物或醫藥組成物，可達到抗氧化、抗老化之功效。
按，皮膚係人體內部生理活動的自然反映器，亦是與外界環境接觸的第一層防護。人體內常受到有害化學物質、光照或體內產生的自由基攻擊，例如生物體正常有氧代謝過程中會自然形成許多活性氧物質(reactive oxygen species，ROS)，包括超氧陰離子(superoxide anion radical，O2．)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)、氫氧自由基(hydroxyl radical，OH．)、單重態氧(single oxygen，O2)等，尤其高活躍的自由基係帶有未配對電子，因此非常危險而不穩定，容易攻擊皮膚組織造成皮膚組織老化。因此，如何有效降低皮膚氧化作用以減緩皮膚老化速度，便成為相關領域發明人所思及之方向。
傳統中草藥針對美容保養，多為一些補氣活血、調整體質的溫補藥物，亦有少許單、複方直接使用於皮膚美白、除痘、消炎等用途。 但是對於中草藥萃取物中之有效成分之機制分析與其於化粧品中之配方設計應用，仍是國內化粧保養品產業需積極開發的重點。如能開發傳統中草藥成為低劑量、高效能之抗氧化之化粧保養產品，將有助於提升化粧品科技產業。
川續斷，學名Dipsacus asper Wall，屬多年生草本植物，又稱川斷、續斷、接骨草、南草、鼓捶草、山蘿蔔根、山蘿蔔、屬折、龍豆、和尚頭、滋油菜、六汗等，目前已知川續斷可用以補肝腎、續筋骨、調血脈、益氣力，可治腰背酸痛、足膝無力、胎漏、崩漏、帶下、破癥結瘀血、遺精、婦人乳難，外用可治跌打損傷、刀傷、金瘡、痔漏、癰疽瘡腫。然，目前卻沒有具體研究證實川續斷萃取物於皮膚抗氧化之功效為何。
今，發明人即是鑑於上述現有川續斷萃取物尚缺乏抗氧化作用之研發，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明主要目的為提供一種川續斷萃取物用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，其係指一具有清除自由基以及螯合亞鐵離子能力之川續斷萃取物，將其用於製備化妝材料組成物或醫藥組成物，可達到抑制皮膚氧化作用之功效。
為了達到上述實施目的，本發明一種川續斷萃取物用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，其係將一有效劑量(可例如為50~1000μg/mL，最佳係50~500μg/mL)之一川續斷萃取物投予至一所需個體，以清除DPPH自由基及ABTS自由基及螯合亞鐵離子，其中，川續斷萃 取物係以至少一步驟之有機溶劑萃取製得，再者，有機溶劑係選自酯類、醇類、烷類及鹵烷所構成之族群。
於本發明之一實施例中，川續斷萃取物之萃取步驟，係包含：步驟一：利用第一有機溶劑萃取一川續斷材料，以獲得一第一萃取物；步驟二：利用第二有機溶劑萃取第一萃取物，以劃分出一第一有機相以及一第二有機相，其中第一有機相具有一第二萃取物，且第二有機相具有一第一剩餘物；步驟三：利用一第三有機溶劑萃取第一剩餘物，以劃分出一第三有機相以及第一水相，其中第三有機相具有一第三萃取物，且第一水相具有一第二剩餘物；以及步驟四：利用一第四有機溶劑萃取第二剩餘物，以劃分出一第四有機相以及一第二水相，其中第四有機相具有一第四萃取物，且第二水相具有一第三剩餘物。
於本發明之一實施例中，第一有機溶劑為乙醇溶液、第二有機溶劑為正己烷/甲醇溶液、第三有機溶劑為乙酸乙酯/水溶液，而第四有機溶劑為正丁醇/水溶液。
於本發明之一實施例中，第一有機溶劑為體積百分比95%的乙醇溶液，第二有機溶劑為體積比1：1的正己烷/95%甲醇溶液，第三有機溶劑為體積比2：1的乙酸乙酯/水溶液，且第四有機溶劑為體積比1：1的正丁醇/水溶液。
於本發明之一實施例中，第一有機相為正己烷相，第二有機相為甲醇相，第三有機相為乙酸乙酯相，以及第四有機相為正丁醇相。
藉此，川續斷萃取物可進一步作為抗氧化之化妝材料組成物或醫藥組成物，提供一較佳抗氧化組合物之選擇。
第一圖：本發明較佳實施例之川續斷萃取步驟流程圖
第二圖：細胞內活性氧生成之測定
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
首先，本發明一種川續斷萃取物用於製備抗氧化之組成物的用途，其係將一有效劑量(可例如為50~1000μg/mL，最佳係50~500μg/mL)之一川續斷萃取物投予至一所需個體，以清除DPPH自由基及ABTS自由基及螯合亞鐵離子；其中，川續斷萃取物係以至少一步驟之有機溶劑萃取製得；有機溶劑係選自酯類、醇類、烷類及鹵烷所構成之族群。
再者，根據上述之用途，請參閱第一圖，為本發明較佳實施例之川續斷萃取步驟流程圖，可包含：步驟一(S1)：利用第一有機溶劑(可例如為體積百分比95%乙醇溶液)萃取一川續斷材料，以獲得一第一萃取物；步驟二(S2)：利用第二有機溶劑(可例如為體積比1：1的正己烷/95%甲醇溶液)萃取第一萃取物，以劃分出一第一有機相(可例如為正己烷相)以及一第二有機相(可例如為甲醇相)，其中第一有機相具有一第二萃取物，且第二有機相具有一第一剩餘物；步驟三(S3)：利用一第三有機溶劑(可例如為體積比2：1的乙酸乙酯/水溶液)萃取第一剩餘物，以劃分出一第三有機相(可例如為乙酸乙酯 相)以及第一水相，其中第三有機相具有一第三萃取物，且第一水相具有一第二剩餘物；以及步驟四(S4)：利用一第四有機溶劑(可例如為體積比1：1的正丁醇/水溶液)萃取第二剩餘物，以劃分出一第四有機相(可例如為正丁醇相)以及一第二水相，其中第四有機相具有一第四萃取物，且第二水相具有一第三剩餘物。藉此，由上述方法萃取而得之川續斷萃取物可作為抗氧化之化妝材料組成物或醫藥組成物。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
首先，關於川續斷(Dipsacus asper Wall)萃取，係先取得生長於地上部分(aerial part)之川續斷加以乾燥，再藉由如上述萃取步驟流程製得不同階段之川續斷萃取物(第一萃取物~第四萃取物)，進一步配置成50、100、500及1000μg/mL不同濃度，進行以下試驗。
〈細胞存活度試驗〉
採用MTT assay檢測。將細胞(1×104/well)培養在96-well盤，並在37℃及5% CO2培養箱中培養至少24小時。加入不同濃度的川續斷萃取物以及於指定的時間作用，達反應時間，移除舊的培養液，以PBS清洗一次，並換上新的培養液，加入10μL的MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)溶液反應，於37℃、5% CO2反應4小時後移除培養液，加入100μl的DMSO溶解formazan沉澱物，最後於波長570nm下測定吸光值(BioTek,SynergyTM2,USA)。
結果如表一所示，於HaCaT人類皮膚角質細胞株或B16小鼠 黑色素瘤細胞株處理50~500μg/mL的川續斷萃取物，細胞具有較高的存活率，當川續斷萃取物之濃度為1000μg/mL，細胞存活率大量下降，表示較佳川續斷萃取物之濃度為50~500μg/mL。
實驗一：川續斷萃取物於清除自由基能力之試驗
〈清除DPPH．自由基試驗〉
1,1-二苯基-2-苦醯肼基(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH．)自由基係一種穩定的自由基，在波長517nm有最大吸光值。藉由加入樣品乙醇溶液後測量其517nm吸光值變化，即可換算出濃度下之自由基抑制率。當顏色由藍紫轉為淡黃色，吸光值也隨之降低，因此可藉由517nm下吸光值的變化，來評估抗氧化物清除自由基的能力。將配製成不同濃度(50、100、500及1000μg/mL)之川續斷萃取物，依序加入90mL新鮮配置的100μM DPPH乙醇溶液，以分光光度計檢測517nm之吸光值，其中，維生素C(ascorbic acid)係作為對照標準品。當吸光值越低表示樣品清除DPPH．自由基的能力越強，以[1-(樣品於517nm之吸光值/未添加樣品之控制組於517nm之吸光值)]×100%得到清除效應百分率(scavenging effects %)。
結果如表二所示，川續斷萃取物具有清除DPPH．自由基的能力，尤其係川續斷第一萃取物及第三萃取物在濃度500μg/mL以下，就具有高達九成的DPPH．自由基清除能力。
〈清除ABTS陽離子自由基試驗〉
2,2’-次偶氮基-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)在過氧化酶(peroxidase)的催化下，會產生ABTS．+自由基，而呈現穩定的藍綠色。因此藉由加入抗氧化物參與反應，ABTS．+得以還原成ABTS而抑制藍綠色生成，並經由測定734nm吸光值的變化，可評估抗氧化物的抗氧化能力。將2.45mM K2S2O8和7mM ABTS溶液混合後，避光靜置16-18小時後，反應產生自由基，接續取1.5μL不同濃度之萃取物混合3.5μL ddH2O及145μL ABTS與K2S2O8混合溶液，靜置20分鐘，以分光光度計檢測734nm之吸光值。當吸光值越低表示樣品清除ABTS自由基的能力越強。再以不同濃度的水溶性維生素E(trolox)抗氧化劑清除ABTS陽離子自由基的能力作為標準曲線。以[1-(樣品於734nm之吸光值/未添加樣品之控制組於734nm之吸光值)]×100%得到清除效應百分率(scavenging effects %)。
結果如表三所示，川續斷萃取物具有清除ABTS自由基的能力，尤其係川續斷第一萃取物、第三萃取物及第四萃取物在濃度500μg/mL以下，就具有高達九成的ABTS自由基清除能力。
實驗二：川續斷萃取物於螯合亞鐵離子能力之試驗
在多種金屬離子中，亞鐵離子(Fe2+)是最具影響力的促氧化劑，會促進脂質氧化作用的進行。利用亞鐵離子與亞鐵嗪(4,4'-[3-(2-吡啶基)-1,2,4-三嗪-5,6-二基]-二苯磺酸二鈉鹽；4,4'-(3-(2-pyridinyl)-1,2,4-triazine-5,6-diy1)bisbenzenesulfonic acid,disodium salt；ferrozine)的複合物在波長562nm之下會有呈色反應，可以測得樣品對亞鐵離子的螯合能力。當樣品可螯合亞鐵離子時，會造成562nm之吸光值的降低，因此吸光值越低表示樣品的螯合能力越強。取10μL之萃取物並加入930μL二次去離子水及20μL FeCl2靜置30秒後，再加入40μL、5mM ferrozine，反應10分鐘後，以分光光度計檢測562nm之吸光值；其中，EDTA係作為對照標準品。
結果請參閱表四，不同濃度(50、100、500及1000μg/mL)之川續斷萃取物具有螯合亞鐵離子能力，尤其係以第二萃取物及第三萃取物，在濃度500μg/mL以下，就具有高達六成的螯合亞鐵離子能力。
實驗三：川續斷萃取物於還原能力之試驗
將4.8μL不同濃度的川續斷萃取物加入50μL的磷酸鹽緩衝液，其中磷酸鹽緩衝液含有1%赤血鹽(K3Fe(CN)6)，50℃水浴20分鐘後，加入50μL 10% TCA，混合均勻之後，離心10,000轉10分鐘，取25μL上清液和9.1μL 0.1%的三氯化鐵(FeCl3)，最後加入65.9μL ddH2O，於700nm測其 吸光值；其中，維生素C係作為對照標準品。
結果如表五所示，濃度500~1000μg/mL之川續斷萃取物(尤其係第三萃取物及第四萃取物)具有極佳的還原力。
實驗四：細胞內活性氧(ROS)生成測定之試驗
將1×105cell/mL的細胞數培養在96-well plate中，並在37℃、5% CO2培養箱中生長24小時以上，再加入1μL的川續斷萃取物反應。達反應時間後，移除上清液，以PBS清洗，加入含有0.1mM H2O2之新鮮培養液作用一小時，接著移除培養液，加入含有10μM 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate(DCFH2DA)之新鮮培養液避光作用一小時後，移除培養液，加入定量PBS，於激發光502nm/散色光524nm下測其吸光值(BioTek,SynergyTM2,USA)。
結果請參閱第二圖，加入0.1mM H2O2會增加細胞內活性氧含量(cellular ROS content)；處理500μg/mL之川續斷萃取物則能降低H2O2引起的ROS含量，尤其以第一萃取物及第二萃取物具有較佳抑制活性氧生成之能力。
藉由上述實驗證實，川續斷萃取物確實具有清除自由基、螯合亞鐵離子、抗氧化之能力；藉此，川續斷萃取物可進一步應用於作為皮膚抗氧化之化妝材料組成物、保養品或醫藥組成物，並且此醫藥組成物可與一皮膚外用劑合併使用。上述“皮膚外用劑”意指一通常在化妝品或醫藥品中被使用的外用成份，包括，但不限於：其他的美白劑、保濕劑、抗 氧化劑、紫外線吸收劑、介面活性劑、增稠劑、色料以及皮膚營養劑等等，可例如為濃縮精華液之成分或添加於面膜中，提供使用者以一適當量施予皮膚，進而達到減緩皮膚氧化或老化之功效。
由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：
1.本發明證實天然中草藥川續斷萃取物具有低細胞毒性、可清除自由基、具有還原力、以及螯合亞鐵離子之能力，其可用於作為塗抹皮膚之化妝材料組成物、保養品或醫藥組成物，達到抗皮膚細胞老化之功效。
2.目前坊間鮮少有川續斷保養品，本發明拓展川續斷於抗氧化之應用，提供消費者一種新的天然保養品選擇。
綜上所述，本發明之川續斷萃取物用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

Claims (5)

  1. 一種川續斷萃取物用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，係將一有效劑量之一川續斷萃取物以清除自由基以及螯合亞鐵離子，其中，川續斷萃取物係以下述步驟製得：步驟一：利用一體積百分比95%的乙醇溶液萃取一川續斷不含根之地上部分(aerial part)，以獲得一第一萃取物；步驟二：利用一體積比1：1的正己烷/甲醇溶液萃取該第一萃取物，以劃分出一正己烷相以及一甲醇相，其中該正己烷相具有一第二萃取物，且該甲醇相具有一第一剩餘物；步驟三：利用一體積比2：1的乙酸乙酯/水溶液萃取該第一剩餘物，以劃分出一第三有機相以及第一水相，其中該第三有機相具有一第三萃取物，且該第一水相具有一第二剩餘物；以及步驟四：利用一體積比1：1的正丁醇/水溶液萃取該第二剩餘物，以劃分出一第四有機相以及一第二水相，其中該第四有機相具有一第四萃取物；其中，該川續斷萃取物係為該第一萃取物、該第三萃取物或該第四萃取物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中自由基係為DPPH自由基或ABTS自由基。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該有效劑量係為50~1000μg/mL。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該有效劑量係為50~500μg/mL。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該川續斷萃取物係作為抗氧化之化妝材料組成物或醫藥組成物。
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