TWI606836B - 牛至萃取物用於製備抗氧化之組成物之用途 - Google Patents

Description

牛至萃取物用於製備抗氧化之組成物之用途

本發明係有關於一種牛至萃取物用於製備抗氧化之組成物之用途，尤其係指一具有清除自由基能力之牛至萃取物，將其用於製備化妝材料組成物或醫藥組成物，可有效達到抗氧化、抗老化之功效。

按，人類與外界環境接觸的第一層防護-皮膚，最容易遭受外來刺激與紫外線的傷害，當不斷受到有害化學物質、過度光照以及代謝而產生的自由基攻擊時，會進一步導致皮膚細胞受損老化或黑色素生成。研究指出，因紫外線產生之各種自由基會引起皮脂或脂質之過氧化、蛋白變性、酵素阻礙等，短期內可能引發皮膚炎症，長期則可能引發皮膚老化或癌化等。再者，自由基或過氧化物質與異位性皮膚炎或接觸皮膚炎、乾癬等之皮膚疾病亦有關連。因此，皮膚老化或皮膚疾病與自由基顯然深具相關性，如何保養皮膚以減緩皮膚老化速度，係美妝保養品廠商之研發重點。

傳統中草藥針對美容保養，多為一些補氣活血、調整體質的溫補藥物，亦有少許單、複方直接使用於皮膚美白、除痘、消炎等用途。但是對於中草藥萃取物中之有效成分之機制分析與其於化粧品中之配方設 計應用，仍是國內化粧保養品產業需積極開發的重點。如能開發傳統中草藥成為低劑量、高效能之抗氧化之化粧保養產品，將有助於提升化粧品科技產業。

牛至(學名Origanum vulgare)又名滇香薷、五香草、暑草，是唇形科牛至屬中的一種植物，具有芳香性，地中海區將此當作香料。先前的研究證實牛至含有很多的精油成分其主要係應用於抗菌方面，鮮少有關於牛至於皮膚保養的研究探討，據此，本發明人致力於研究牛至各種功用，例如本發明人於中華民國專利案公告第I386232號「來自牛至(Origanum vulgare)之新化合物及其用途」即揭示一種新化合物-牛至苷(origanoside)，其可應用於美白或抗老化之組合物；然，該牛至苷於實際實施使用時之抗氧化能力仍然有限。因此，如何進一步研發出更具抗氧化效力之牛至萃取物，乃相關領域發明人思及之方向。

本發明係有關於一種牛至萃取物用於製備抗氧化之組成物之用途，其係指一具有清除自由基能力之牛至萃取物，將其用於製備化妝材料組成物或醫藥組成物，可達到抗氧化、抗老化之功效。

為了達到上述實施目的，本發明一種牛至萃取物用於製備抗氧化之組成物之用途，其係將一有效劑量之一牛至萃取物投予至一所需個體，以清除DPPH及ABTS自由基，其中牛至萃取物係以第一有機溶劑萃取一牛至材料所獲得之第一萃取物；第一萃取物進一步利用第二有機溶劑萃取，以劃分出一第一有機相以及一第二有機相，其中第一有機相具有一第 二萃取物，且第二有機相具有一第一剩餘物，再利用一第三有機溶劑萃取第一剩餘物，以劃分出一第三有機相以及第一水相，其中第三有機相具有一第三萃取物，且第一水相具有一第二剩餘物，第三萃取物係具有170~200mg/g總酚含量或850~900mg/g總黃酮含量，將一有效劑量之第三萃取物投予至一所需個體，以清除自由基。

於本發明之一實施例中，牛至萃取物進一步清除超氧陰離子及一氧化氮自由基。

於本發明之一實施例中，有效劑量可例如為為10~100μg/mL，較佳可例如為20~100μg/mL。

於本發明之一實施例中，有機溶劑係選自酯類、醇類、烷類及鹵烷所構成之族群；其中，第一有機溶劑為體積百分比95%的乙醇溶液，第二有機溶劑為體積比1：1的正己烷/95%甲醇溶液，且第三有機溶劑為體積比2：1的乙酸乙酯/水溶液。

於本發明之一實施例中，第一有機相為正己烷相，第二有機相為甲醇相，以及第三有機相為乙酸乙酯相。

藉此，牛至萃取物可進一步作為抗氧化之化妝材料組成物或醫藥組成物，提供一較佳抗氧化成分之選擇。

第一圖：本發明較佳實施例之牛至萃取步驟流程圖。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且 具體之瞭解。

首先，本發明一種牛至萃取物用於製備抗氧化之組成物之用途，其係將一有效劑量(可例如為10~100μg/mL，最佳係20~100μg/mL)之一牛至萃取物投予至一所需個體，以有效清除DPPH自由基及ABTS等自由基；其中，牛至萃取物係以至少一步驟之有機溶劑萃取製得；有機溶劑係選自酯類、醇類、烷類及鹵烷所構成之族群。

根據上述之用途，請參閱第一圖，為本發明較佳實施例之牛至萃取步驟流程圖；牛至萃取物係以第一有機溶劑萃取一牛至材料所獲得之第一萃取物；第一萃取物進一步利用第二有機溶劑萃取，以劃分出一第一有機相以及一第二有機相，其中第一有機相具有一第二萃取物，且第二有機相具有一第一剩餘物，再利用一第三有機溶劑萃取第一剩餘物，以劃分出一第三有機相以及第一水相，其中第三有機相具有一第三萃取物，且第一水相具有一第二剩餘物，第三萃取物係具有170~200mg/g總酚含量或850~900mg/g總黃酮含量，將一有效劑量之第三萃取物投予至一所需個體，以清除DPPH、ABTS、超氧陰離子及一氧化氮自由基；其中，第一有機溶劑為體積百分比95%的乙醇溶液，第二有機溶劑為體積比1：1的正己烷/95%甲醇溶液，且第三有機溶劑為體積比2：1的乙酸乙酯/水溶液；第一有機相為正己烷相，第二有機相為甲醇相，以及第三有機相為乙酸乙酯相。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

實驗一：萃取牛至及測試牛至萃取物之細胞毒性

〈萃取牛至〉

首先，關於牛至(Origanum vulgare L.)萃取，係先取得生長於地上部分(aerial part)之牛至加以乾燥，再藉由如第一圖之萃取步驟流程製得不同階段之牛至萃取物(第一萃取物~第五萃取物)。牛至萃取物之萃取步驟，可例如包含：(a)利用第一有機溶劑(可例如為體積百分比95%乙醇溶液)萃取一牛至材料，以獲得一第一萃取物；(b)利用第二有機溶劑(可例如為體積比1：1的正己烷/95%甲醇溶液)萃取第一萃取物，以劃分出一(可例如為正己烷相)以及一第二有機相(可例如為甲醇相)，其中第一有機相具有一第二萃取物，且第二有機相具有一第一剩餘物；(c)利用一第三有機溶劑(可例如為體積比2：1的乙酸乙酯/水溶液)萃取第一剩餘物，以劃分出一第三有機相(可例如為乙酸乙酯相)以及第一水相，其中第三有機相具有一第三萃取物，且第一水相具有一第二剩餘物；以及(d)利用一第四有機溶劑(可例如為體積比1：1的正丁醇/水溶液)萃取第二剩餘物，以劃分出一第四有機相(可例如為正丁醇相)以及一第二水相，其中第四有機相具有一第三剩餘物，且第二水相具有一第四萃取物。再者，將不同階段之牛至萃取物(第一萃取物~第五萃取物)進一步配置成10、20及100μg/mL不同濃度，進行以下試驗。

〈細胞存活度測試(MTT assay)〉

將1×10⁴/well人類皮膚角質化細胞株(HaCaT)培養在96孔盤(96-well multiplate)，並放置37℃及5% CO₂的培養箱中培養至少24小時。評估 牛至萃取物對皮膚細胞是否具細胞毒性：加入1μL不同濃度(10、20和100μg/mL)的牛至萃取物或牛至苷(origanoside)於細胞，以及於37℃作用72小時之後，移除舊的培養液，以PBS清洗一次，並換上新的培養液，每孔細胞加入10μL的MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(5mg/ml)溶液反應，於37℃、5% CO₂反應4小時，之後移除上清液，加入100μL的二甲亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解MTT甲臢(MTT formazan；MTT四氮唑被還原後之產物)沉澱物，震盪10分鐘後，於波長570nm下測定吸光值(BioTek，Synergy^TM2，USA)以計算細胞存活度；各組樣本數值為3(n=3)。其中，關於製備牛至苷(origanoside)之技術已為習知技藝中眾所皆知之知識，可以中華民國專利案公告第I386232號「來自牛至(Origanum vulgare)之新化合物及其用途」據以實施，容於此不加以贅述。

結果請參閱表一，除了100μg/mL的第二萃取物與100μg/mL的第五萃取物之外，於HaCaT人類皮膚角質細胞株處理10~100μg/mL的牛至萃取物或牛至苷，細胞皆具有很高(約七成以上)的存活率，表示10~100μg/mL的牛至萃取物對細胞的毒性很低。

實驗二：牛至萃取物於清除DPPH及ABTS自由基能力之試驗

〈清除DPPH‧自由基試驗〉

1,1-二苯基-2-苦醯肼基(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH‧)自由基係一種穩定的自由基，在波長517nm有最大吸光值。藉由加入樣品乙醇溶液後測量其517nm吸光值變化，即可換算出濃度下之自由基抑制率。當顏色由藍紫轉為淡黃色，吸光值也隨之降低，因此可藉由517nm下吸光值的變化，來評估抗氧化物清除自由基的能力。將配製成不同濃度(10、20和100μg/mL)的牛至萃取物或牛至苷(origanoside)，依序加入90mL新鮮配置的100μM DPPH乙醇溶液，以分光光度計檢測517nm之吸光值，其中，維生素C(ascorbic acid)係作為對照標準品。當吸光值越低表示樣品清除DPPH自由基的能力越強，以[1-(樣品於517nm之吸光值/未添加樣品之控制組於517nm之吸光值)]×100%得到清除效應百分率(scavenging effects %)。

結果請參閱表二，牛至萃取物具有清除DPPH自由基的能力，尤其係牛至第一萃取物、第三萃取物、第四萃取物及第五萃取物在濃度100μg/mL具有高達九成的DPPH自由基清除能力；值得注意的是，上述牛至萃取物清除DPPH自由基的能力皆較牛至苷佳。

〈清除ABTS陽離子自由基試驗〉

2,2’-次偶氮基-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)在過氧化酶(peroxidase)的催化下，會產生ABTS‧⁺自由基，而呈現穩定的藍綠色。因此藉由加入抗氧化物參與反應，ABTS‧⁺得以還原成ABTS而抑制藍綠色生成，並經由測定734nm吸光值的變化，可評估抗氧化物的抗氧化能力。將2.45mM K₂S₂O₈和7mM ABTS溶液混合後，避光靜置16~18小時後，反應產生自由基，接續取1.5μL不同濃度之萃取物混合3.5μL ddH₂O及145μL ABTS與K₂S₂O₈混合溶液，靜置20分鐘，以分光光度計檢測734nm之吸光值。當吸光值越低表示樣品清除ABTS自由基的能力越強。再以不同濃度的水溶性維生素E(trolox)抗氧化劑清除ABTS．⁺陽離子自由基的能力作為標準曲線。以[1-(樣品於734nm之吸光值/未添加樣品之控制組於734nm之吸光值)]×100%得到清除效應百分率(scavenging effects %)。

結果請參閱表三，除了第二萃取物之外，牛至萃取物(第一萃取物、第三萃取物、第四萃取物及第五萃取物)皆具有極佳清除ABTS自由基的能力，尤其係第三萃取物具有最佳的自由基清除能力；10μg/mL和20μg/mL第三萃取物之清除ABTS自由基能力為43.0±4.9和60.7±1.5，而10μg/mL和20μg/mL牛至苷之清除ABTS自由基能力為20.2±0.7和54.8±0.7，因此，第三萃取物清除ABTS自由基的能力較牛至苷佳。

實驗三：牛至萃取物於清除超氧陰離子及一氧化氮自由基能力之試驗

〈超氧陰離子自由基(superoxide anion radical，O₂‧^-)清除能力測定〉

將配製成不同濃度(10、20和100μg/mL)之牛至萃取物樣品 以及芸香甘(rutin)進行自由基清除能力之測定；其中，不同濃度的芸香甘係作為對照標準品。240μM PMS：秤取0.75mg PMS加入ddH₂O定量至10mL避光置於冰上備用。1872μM NADH：秤取13.9mg加入ddH₂O定量至10mL避光置於冰上備用。600μM nitroblue tetrazolium(NBT)：秤取4.9mg加入ddH₂O定量至10mL避光置於冰上備用。取2μL的不同濃度牛至萃取物分別加入25μL的PMS(0.24mM)、NADH(1.872mM)和NBT(0.6mM)反應5分鐘後，再加入100μL的DMSO於560nm測其吸光值變化；各組樣本數值為3(n=3)。實驗原理係藉由PMS與NADH作用生成超氧陰離子自由基，可進一步將NBT還原成藍黑色產物，此產物在560nm波長時有最大吸光值，若樣品與超氧陰離子反應，會減少藍黑色產物產生，吸光值將會降低，因此其吸光值愈低，表示試樣清除超氧陰離子的能力愈強。

結果如表四，牛至萃取物皆具有極佳清除超氧陰離子的能力，尤其係第一萃取物及第三萃取物清除超氧陰離子之能力最佳，僅需濃度10μg/mL之第一萃取物即可達到九成以上清除超氧陰離子的能力，而第三萃取物僅需濃度10μg/mL即可達到八成以上清除超氧陰離子的能力。

〈一氧化氮自由基清除能力測定〉

取98μL硝普鈉(sodium nitroprusside)(25mM)加入2μL不同濃度(10、20、100μg/mL)之牛至萃取物在25℃培養150分鐘，再加入100μL革利士試劑(Griess Reagent，含0.1% naphthylenediamine dihydrochloride、5% phosphoric acid和1% sulfanilamine)，在560nm下測吸光值；其中，芸香甘(rutin)係作為對照組。

結果如表五，牛至萃取物皆具有極佳清除一氧化氮(NO)自由基的能力，尤其係第三萃取物之清除能力最佳，僅需濃度10μg/mL之第三萃取物即可達到七成以上清除NO自由基的能力，而濃度100μg/mL之第三萃取物可達到將近九成之清除能力。

實驗四：牛至萃取物於總酚含量及總黃酮含量之測定

〈總酚含量測定〉

將不同濃度(10、20、100μg/mL)之牛至萃取物各取50μL加入250μL的10倍稀釋酚類試劑(10-fold diluted，Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)經震盪混合後，靜置5分鐘，再加入200μL碳酸鈉溶液(7.5% w/v Na₂CO₃)及500μL二次去離子水，於室溫避光1小時後，以分光光度計測波長760nm吸光值。對照沒食子酸(gallic acid)標準品製作之校正曲線，換算每克萃取物樣品中相當於多少沒食子酸(mg/g sample)。

〈總黃酮含量測定〉

取不同濃度(10、20、100μg/mL)之牛至萃取物樣品37μL並加入490μL二次去離子水及3μL亞硝酸鈉溶液(5% w/v NaNO₂)反應6分鐘後；之後，再加入30μL、10%三氯化鋁(AlCl₃)並反應6分鐘後，再加入400μL、4%氫氧化鈉(NaOH)溶液及40μL二次去離子水振盪混合均勻，靜置15分鐘後，以分光光度計測510nm吸光值。以芸香苷(rutin)的標準曲線來換算每克萃取物樣品中相當於多少芸香苷(mg/g sample)。

平均總酚含量及平均總黃酮含量測定結果如表六，每克(g)第一萃取物相當於26.3mg沒食子酸或463.2mg芸香苷；每克第二萃取物相當於20.0mg沒食子酸或50.3mg芸香苷；每克第三萃取物相當於187.1mg沒食子酸或874.5mg芸香苷；每克第四萃取物相當於24.2mg沒食子酸或502.5mg芸 香苷；每克第五萃取物相當於23.4mg沒食子酸或596.2mg芸香苷。由此可知，第三萃取物之總酚含量及黃酮含量最高。

藉由上述實驗證實，牛至萃取物確實具有清除自由基、抗氧化之能力；藉此，牛至萃取物可進一步應用於作為皮膚抗氧化之化妝材料組成物、保養品或醫藥組成物，並且此醫藥組成物可與一皮膚外用劑合併使用。上述“皮膚外用劑”意指一通常在化妝品或醫藥品中被使用的外用成份，包括，但不限於：其他的美白劑、保濕劑、抗氧化劑、紫外線吸收劑、介面活性劑、增稠劑、色料以及皮膚營養劑等等，可例如為濃縮精華液之成分或添加於面膜中，提供使用者以一適當量施予皮膚，進而達到減緩皮膚氧化或老化之功效。

值得注意的是，本發明之牛至萃取物係使用10~100μg/mL，劑量小於10μg/mL之牛至萃取物較難達到明顯的抗氧化作用，而 劑量大於100μg/mL之牛至萃取物雖具良好抗氧化效果，但可能造成使用者皮膚刺激、紅腫、過敏等問題；故，本發明中牛至萃取物之最佳劑量係為10~100μg/mL。

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1.本發明證實天然中草藥牛至萃取物具有低細胞毒性、可清除自由基、具有抗氧化能力，其可用於作為塗抹皮膚之化妝材料組成物、保養品或醫藥組成物，達到抗皮膚細胞老化之功效。

2.本發明藉由實驗數據證實牛至萃取物於抗氧化之效果明顯優於前案牛至苷(origanoside)，故可提供消費者一種更佳的天然抗氧化保養品選擇。

綜上所述，本發明之牛至萃取物用於製備抗氧化之組成物之用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

Claims (5)

1. 一種牛至萃取物用於製備抗氧化之組成物之用途，係以一有效劑量之一牛至萃取物清除DPPH、ABTS、超氧陰離子與一氧化氮自由基，其中該牛至萃取物係以體積百分比95%之乙醇溶液萃取一牛至材料所獲得之一第一萃取物，係具有26.3mg/g總酚含量或463.2mg/g總黃酮含量。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該第一萃取物進一步利用體積比1：1之正己烷/95%甲醇溶液萃取，以劃分出一正己烷相以及一甲醇相，其中該正己烷相具有一第二萃取物且該甲醇相具有一第一剩餘物，再利用體積比2：1之乙酸乙酯/水溶液萃取該第一剩餘物，以劃分出一乙酸乙酯相以及第一水相，其中該乙酸乙酯相具有一第三萃取物，且該第一水相具有一第二剩餘物，該第三萃取物係具有170~200mg/g總酚含量或850~900mg/g總黃酮含量，以一有效劑量之第三萃取物清除自由基。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中該有效劑量係為10-100μg/ml。
4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中該有效劑量係為20-100μg/ml。
5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組成物係作為化妝材料組成物或醫藥組成物。