TWI568730B

TWI568730B - 刻痕（ｎｏｔｃｈ）路徑信號抑制劑化合物

Info

Publication number: TWI568730B
Application number: TW101125459A
Authority: TW
Inventors: 菲利普亞瑟希普斯金; 葛瑞格里艾倫史蒂芬生
Original assignee: 美國禮來大藥廠
Priority date: 2011-07-27
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2017-02-01
Also published as: KR20140026624A; ME02171B; KR101578309B1; EA023044B1; BR112014001600A2; HK1194086A1; JP6027110B2; CA2841178C; HUE027534T2; MY184303A; AR087107A1; JO3148B1; IL229988A; CO6862159A2; PL2736920T3; HRP20150771T1; MX356536B; US8569286B2; NZ618891A; SI2736920T1

Description

刻痕(NOTCH)路徑信號抑制劑化合物

刻痕(NOTCH)信號為在哺乳動物發育及組織穩衡作用中發揮不可或缺作用之保守進化路徑。刻痕受體及配體包含單次跨膜域，在細胞表面上表現，基於此原因，刻痕信號在介導該等表現受體及配體之鄰近細胞之間的通訊上尤為重要。已在齲齒動物及人類中發現4種已知刻痕受體，稱之為刻痕1至刻痕4。該等刻痕受體為由胞外及胞內域組成之雜二聚蛋白質，其在最初係呈單多肽形式合成。受體-配體交互作用引起刻痕受體多肽發生一系列分解蛋白質之裂解反應，其中與γ-分泌酶活性有關。γ-分泌酶活性可自細胞表面裂解刻痕胞內域，其改變位置至細胞核，而形成轉錄因子複合體。刻痕胞內域(NICD)為蛋白質之活性形式。不同刻痕信號功能包括增生、分化、細胞凋亡、血管生成、遷移及自行更新。此等刻痕信號於正常組織發育及維持中之不同角色會在不同形式之癌症中受到異常激活。刻痕信號之致癌功能包括抑制細胞凋亡及促進細胞增生。

γ-分泌酶在一連串的刻痕活化作用中發揮樞轉作用。因此，已積極探討γ-分泌酶之抑制劑於阻斷刻痕受體活化作用上之潛力。WO 98/28268中所例舉之該等化合物(諸如7C-203)為該等γ-分泌酶抑制劑之代表。儘管藥效可靠，但市面上尚未出現刻痕抑制劑之化療劑。

需要尋找具有刻痕路徑信號抑制活性之化合物。此外需要尋找具有γ-分泌酶抑制活性之化合物。亦需要尋找帶有可產生刻痕路徑信號抑制活性之獨特結構特徵之化合物。此外還需要尋找展現刻痕路徑信號抑制活性及理想的體內分佈、代謝及***性之化合物。

本發明之一態樣提供一種如下結構之刻痕信號抑制化合物：或其醫藥可接受鹽或水合物。

本發明之第二態樣提供一種含有4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺或其醫藥可接受鹽或水合物，與醫藥可接受載劑組合之醫藥組合物。於一特定實施例中，該醫藥組合物包含4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺或其醫藥可接受鹽或水合物，以及醫藥可接受載劑及可視需要選用之其他治療成分。

本發明之第三態樣提供一種對有此需要之癌症病患抑制刻痕信號之方法，該方法包括對該病患投與治療有效量之 4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺或其醫藥可接受鹽或水合物。

本發明之第四態樣提供一種對病患治療癌症之方法，該癌症為T細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、頭部及頸部癌、子宮頸癌、***癌、肝癌、鱗狀細胞癌(口腔)、皮膚癌或神經管胚細胞瘤，該方法包括對有此需要之病患投與治療有效量之4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺或其醫藥可接受鹽或水合物。

本發明之第五態樣提供一種對病患治療癌症之方法，該癌症為T細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、乳癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、神經膠質母細胞瘤或結腸直腸癌，該方法包括對有此需要之病患投與治療有效量之4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺或其醫藥可接受鹽或水合物。

本發明之第六態樣提供一種化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺或其醫藥可接受鹽或水合物，其係用於醫療。

本發明之第七態樣提供一種化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺或其醫藥可接受鹽或水合物，其係用於治療癌症，該癌症為T細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、頭部及頸部癌、子宮頸癌、***癌、肝癌、鱗狀細胞癌(口腔)、皮膚癌或神經管胚細胞瘤。

本發明之第八態樣提供一種化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺或其醫藥可接受鹽或水合物，其適用於治療癌症，該癌症為T細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、乳癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、神經膠質母細胞瘤或結腸直腸癌。

本發明之第九態樣提供一種以化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺或其醫藥可接受鹽或水合物於製造用於治療癌症之藥物上之用途，該癌症為T細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、頭部及頸部癌、子宮頸癌、***癌、肝癌、鱗狀細胞癌(口腔)、皮膚癌或神經管胚細胞瘤。

本發明之第十態樣提供一種以化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺或其醫藥可接受鹽或水合物於製造用於治療癌症之藥物上之用途，該癌症為T細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、乳癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、神經膠質母細胞瘤或結腸直腸癌。

術語「病患」意指哺乳動物，及「哺乳動物」包括(但不限於)人類。

「治療有效量」或「有效量」意指對癌症病患抑制刻痕信號(不論破壞標靶癌細胞還是減慢或阻滯病患癌症進展)時所需要該化合物或其醫藥可接受鹽或水合物或含有該化合物或其醫藥可接受鹽或水合物之醫藥組合物的劑量。化合物1或其醫藥可接受鹽或水合物之所預期劑量在0.1至200 mg/病患/天範圍內。預期較佳劑量介於1至175 mg/病患/天範圍內。預期最佳劑量介於5至150 mg/病患/天範圍內。治療病患所需要的準確劑量及治療時間長短可由醫師根據疾病之病況或嚴重度以及個別病患之特殊需要及反應確定。儘管基於每日基礎來表示劑量，然而，可調整投藥療程給予病患最佳療效且控制及改善黏液性腸病(胃腸道中黏液分泌過度且積聚)。除了每日給藥外，亦可適當採用每隔一日給藥(Q2D)；在第一段5日內每隔一日給藥，接著兩日不給藥(T.I.W.)；或每隔3日給藥(Q3D)。每隔一日T.I.W.或每隔3日之給藥療程較佳係伴隨投與(投與化合物1之前，同時或之後)***(dexamethasone)來控制或改善黏液性腸病。

術語「治療」(treatment)、「治療」(treat)及「處理」(treating)意欲包括干預病患所罹患之癌症之全部範圍，諸如，假若實際無法消除癌，則投與活性化合物以減輕或減慢或逆轉該等癥狀中之一或多種癥狀，且延遲癌症進展。待治療之病患為哺乳動物，特定言之指人類。

本發明之化合物較佳係使用醫藥可接受載劑調配成醫藥組合物，並以多種不同途徑投與。較佳地，該等組合物適於口服。該等醫藥組合物及其製備方法為本技藝所熟知。參見：例如，REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(A.Gennaro等人編輯，第19版，Mack Publishing Co.,1995)。於一特定實施例中，該醫藥組合物包含4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺或其醫藥可接受鹽或水合物，以及醫藥可接受載劑及可視需要選用之其他治療成分，特別適用於治療一般或特定類別之癌症。

本發明之化合物可與許多無機及有機酸反應形成醫藥可接受酸加成鹽。該等醫藥可接受鹽及製備其等之習知方法為相關技藝所熟知。參見：例如，P.Stahl等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS：PROPERTIES,SELECTION AND USE,(VCHA/Wiley-VCH,2002)；S.M.Berge等人，「Pharmaceutical Salts,」Journal of Pharmaceutical Sciences，第66卷，編號1，1977年1月。

化合物1或其醫藥可接受鹽或水合物可依據相關技藝熟知之許多程序以及下述程序製得。可依不同方式組合該等特定合成步驟來製備化合物1或其醫藥可接受鹽或水合物。

化合物1命名為：4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺；且亦可命名為：N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-二氫-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-5H-吡啶并[3,2-a][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基乙基]-4,4,4-三氟丁醯胺；及可使用其他名稱明確界定化合物1。

應明瞭化合物1係以單一立體異構體表示。兩個對掌性中心可以產生4種立體異構體。如本文所提及之化合物1亦包括包含化合物1之外消旋混合物。此處，採用(R)-及(S)-之坎-殷高-普利洛(Cahn-Ingold-Prelog)命名法來指示特異性異構體。特異性立體異構體可採用立體定向合成法，使用純或富集對映異構性之起始物質製得。含化合物1之起始物質、中間物或外消旋混合物中任一者的特定立體異構體可依據相關技藝所熟知之技術解析，諸如彼等說明於Stereochemistry of Organic Compounds,E.I.Eliel與S.H. Wilen(Wiley 1994)及Enantiomers,Racemates,and Resolutions,J.,Jacques,A.Collet與S.H.Wilen(Wiley 1991)中者，包括基於掌性固定相之層析法，酵素解析法或分步結晶法或為達該目的所形成非對映異構體(諸如非對映異構體鹽)之層析法。儘管本發明中包涵含本發明化合物之所有混合物，然較佳實施例為化合物1。

亦已發現化合物1係呈阻轉異構體或特異性立體構像形式存在。於水溶液中，環境溫度下於24小時後，藉由¹H NMR及LC-MS偵測到8至9%之阻轉異構體2(次要阻轉異構體)與阻轉異構體1(主要阻轉異構體)達成平衡。於有機溶劑中，環境溫度下於24小時之後，藉由¹H NMR及LC-MS偵測到約1至2%之阻轉異構體2與阻轉異構體1達成平衡。雖然可經¹H NMR及LC-MS分析法偵測，卻無法分離阻轉異構體2。

在合成本發明化合物中用為初起始物質之該等化合物係習知者，且若無法在市面上取得時，可輕易地利用所提供的特定參考文獻，藉由彼等熟習本技藝者常用之標準程序，或可參見一般參考書來合成。

已知程序及方法之實例包括彼等述於一般參考書中者，諸如：Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers Inc,1989；Compendium of Organic Synthetic Methods，第1至10卷，1974-2002,Wiley Interscience；Advanced Organic Chemistry,Reactions Mechanisms,and Structure，第5版，Michael B.Smith與Jerry March,Wiley Interscience,2001；Advanced Organic Chemistry，第4版，部分B，Reactions and Synthesis,Francis A.Carey and Richard J.Sundberg,Kluwer Academic/Plenum Publishers,2000等及本文所引用的參考文獻。

該等中間物及化合物1係利用SymaxDraw第3.2版繪圖程序，根據統一採用之IUPAC名稱，依據結構式命名。

製法1

(2S)-2-(4,4,4-三氟丁醯基胺基)丙酸苄酯

於環境溫度在氮氣條件下，在含4,4,4-三氟丁酸(7.131 g,48.7 mmol)之二氯甲烷(162 mL)溶液中依序添加L-丙胺酸苄酯鹽酸鹽(7.00 g,32.5 mmol)、二異丙基乙胺(28.30 mL,162.3 mmol)、1-羥基苯并***水合物(7.46 g,48.7 mmol)及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(9.33 g 48.7 mmol)且攪拌20小時。添加20%檸檬酸水溶液(150 mL,162 mmol)，使混合物攪拌5分鐘，繼而分離層。使用二氯甲烷(100 mL)萃取水相。利用飽和碳酸氫鈉水溶液(150 mL)洗滌已合併的有機相，經過硫酸鎂乾燥然後濃縮。依據急驟層析法使用己烷：乙酸乙酯(4：1至2：1)洗脫純化殘餘物，得到標題化合物之白色固形物(9.22 g,30.4 mmol,94%)。MS(m/z)：304(M+1)；[α]_Na ²⁵=-44.6°(c=5.0，甲醇)。

製法2

(2S)-2-(4,4,4-三氟丁醯基胺基)丙酸

於環境溫度下，將鈀/碳(5%,1.76 g,0.8 mmol)一次添加全量至含(2S)-2-(4,4,4-三氟丁醯基胺基)丙酸苄酯(8.80 g,29 mmol)之甲醇(88 mL)的溶液。混合物經過脫氣(真空/氮氣)，充填氫氣(1大氣壓)且於氫氣(29 mmol)下攪拌5小時。經過Celite®過濾，使用甲醇洗滌濾餅然後濃縮濾液，得到標題化合物之白色固形物(6.11g,28.7 mmol,99%)。MS(m/z)：214(M+1)；[α]_Na ²⁵=-24.7°(c=5.0，甲醇)。

製法3

2-(2-溴苯基)乙酸甲酯

以7分鐘時間依序添加二甲基甲醯胺(2.1 mL,27.3 mmol)與亞硫醯氯(52.3 mL,717.8 mmol)至經由環境溫度水浴冷卻之含2-溴苯基乙酸(150.0 g,683.6 mmol)之二氯甲烷(1.50 L)溶液。使混合物攪拌5小時，以5分鐘時間添加甲醇(41.5 mL,1.0 mol)。鼓泡氮氣透過溶液過夜。濃縮得到全收量產率之標題化合物之無色油狀物(166.0 g,724.7 mmol)。1H NMR(300 MHz,CDCl₃)：7.57(d,J=7.9 Hz, 1H),7.30-7.26(m,2H),7.19-7.12(m,1H),3.80(s,2H),3.72(s,3H)。

製法4

2-[2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼-2-基)苯基]乙酸甲酯

利用3次真空/氮氣循環，將含2-(2-溴苯基)乙酸甲酯(156.6 g,684 mmol)、雙(頻哪醇根基)二硼(194.9 g,752 mmol)及乙酸鉀(135.6 g,1.4 mol)之N-甲基吡咯啶酮(940 mL)的懸浮液脫氣。添加(1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵)氯化鈀(II)(11.4 g,13.7 mmol)，然後於80℃下加熱。15小時後，添加(1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵)氯化鈀(II)(11.4 g,13.7 mmol)且於90℃下攪拌24小時。冷卻至環境溫度且倒至冰與水之混合物(3 L)上，然後添加甲基第三丁基醚(1 L)。攪拌混合物，藉由Celite®墊過濾，然後分離層。使用甲基第三丁基醚(2×500 mL)萃取水相。使用水(2×500 mL)、鹽水(500 mL)洗滌已合併的有機相，經過硫酸鈉乾燥然後濃縮。依據急驟層析法利用己烷：乙酸乙酯(9：1)洗脫純化殘餘物，得到標題化合物之白色固形物(160.6 g,581.6 mmol,85%)。MS(m/z)：277(M+1)。

製法5

5,7-二氫吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮

將碳酸鉀(235.7 g,1.71 mol)添加至含2-胺基-3-溴吡啶(88.5 g,511.7 mmol)之1,4-二噁烷(550 mL)與水(550 mL)的溶液。利用3次真空/氮氣循環將混合物脫氣，添加乙酸鈀(II)(6.4 g,28.4 mmol)及三-第三丁基鏻四氫硼酸鹽(16.5 g,56.9 mmol)且於88℃在氮氣條件下攪拌。以3分鐘時間逐滴添加含2-[2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼-2-基)苯基]乙酸甲酯(157.0 g,568.5 mmol)之1,4-二噁烷(550 mL)的溶液且於88℃下使混合物攪拌20分鐘。使混合物冷卻至50℃，添加水(100 mL)，然後分離層。利用乙酸乙酯(2×100 mL)萃取水相，經過硫酸鈉乾燥已合併的有機相，然後濃縮。使經濃縮之物質溶解於N-甲基吡咯啶酮(314 mL)中，在冰浴中冷卻然後逐滴添加硫酸(314 mL,5.9 mol)以維持約45℃之溫度。於140℃下攪拌混合物90分鐘。冷卻至環境溫度，添加冰(4 kg)，繼而分批添加50%之NaOH水溶液鹼化，直到溶液為pH 7至8。使懸浮液冷卻至10至15℃，過濾出固形物，繼而使用水(2 L)、己烷(1 L)及甲基第三丁基醚(1 L)洗滌。於40℃在真空條件下乾燥。產物使用10%甲醇/二氯甲烷溶液混合物處理及趁熱過濾(×4)。濃縮已合併的濾液，得到標題化合物之淺棕色固形物(85 g,404.3 mmol,71%)。MS(m/z)：211(M+1)。

製法6

5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮

將碳酸銫(186.6 g,572.7 mmol)、(2-溴乙氧基)-第三丁基二甲基矽烷(88.0 mL,409.1 mmol)及碘化鈉(6.1 g,40.9 mmol)添加至含5,7-二氫吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮(86.0 g,409.1 mmol)之二甲基甲醯胺(860 mL)懸浮液中，且於70℃下攪拌20小時。使混合物冷卻至環境溫度，倒至冰與水(100 mL)上，添加乙酸乙酯(200 mL)。藉由Celite®過濾混合物，然後利用乙酸乙酯(100 mL)洗滌。濾液經過分層，使用乙酸乙酯(2×50 mL)萃取水相。使用水(2×100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌已合併的有機相，經過硫酸鈉乾燥然後濃縮。使物質溶解於四氫呋喃(1.28 L)中，添加與鈀結合之Silia®(Silia® bond palladium)清除劑(16.7 g)且於環境溫度下攪拌20小時。經過二氧化矽墊過濾，使用四氫呋喃(200 mL)洗滌，然後濃縮，得到全收量之標題化合物，其為會結晶之淺棕色油狀物(155 g,420.6 mmol)。 MS(m/z)：369(M+1)。

方法2：

加熱5,7-二氫吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮(22.5 g,106.9 mmol)與二甲基甲醯胺(500 mL)之混合物達100℃維持5分鐘。冷卻至40℃，添加碳酸銫(104.3 g,320.1 mmol)及(2-溴乙氧基)-第三丁基二甲基矽烷(29.9 mL,138.9 mmol)且於環境溫度下攪拌過夜。加熱至60℃維持約2小時，然後冷卻至環境溫度。使殘餘物分配在乙酸乙酯(1 L)與水(3 L)之間，利用乙酸乙酯(2×500 mL)反萃取水層，使用鹽水(2×500 mL)洗滌已合併的有機相。經過硫酸鈉乾燥已合併的有機相，然後濃縮。依據急驟層析使用乙酸乙酯：己烷(0：100至100：0)洗脫純化殘餘物，得到標題化合物之油狀物(39.4 g,106.9 mmol,89%)。MS(m/z)：369(M+1)。

製法7

5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7-羥基亞胺基-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮

於-5℃下將2-甲基正丙-2-醇鉀(66.1 g,588.8 mmol)添加至含5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并 [2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮(155.0 g,420.6 mmol)之四氫呋喃(1.6 L)的溶液，且攪拌10分鐘。於-5℃下逐滴添加亞硝酸異戊酯(61.9 mL,462.6 mmol)且使混合物攪拌10分鐘。傾倒至冰/水(2 L)上，且利用乙酸乙酯(3×200 mL)萃取。使用鹽水(200 mL)洗滌已合併的有機相，經過硫酸鈉乾燥。添加甲苯(1 L)，然後濃縮(×3)，獲得標題化合物之黏稠棕色油狀物(160.0 g,402.5 mmol,96%)。MS(m/z)：398(M+1)。

製法8

(7S)-7-胺基-5-(2-羥乙基)-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮

分批將三氟乙酸(124.0 mL,1.64 mol)添加至在環境溫度水浴中之含5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7-羥基亞胺基-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮(155.0 g,389.9 mmol)之二氯甲烷(620 mL)與甲醇(310 mL)混合物的溶液。分批添加鋅(76.5 g,1.2 mol)，以使內部溫度維持在33至38℃。於環境溫度下攪拌15小時。藉由Celite®過濾混合物，使用10%甲醇/二氯甲烷(100 mL)洗滌，然後濃縮濾液。添加二氯甲烷(0.5 L)及冰(500 g)，攪拌並由50%之NaOH水溶液鹼化。濾出固形物，對濾液進行層之分離。使用二氯甲烷(2×100 mL)萃取水相，且濃縮已合併的有機相。使固形物於己烷中形成漿液，然後過濾且於高度真空條件下乾燥，獲得標題化合物外消旋異構體之淡黃色固形物(74.0 g,274.8 mmol,71%)。於Chiralpak® AD管柱上使用乙醇(0.2%二甲基乙胺)：乙腈(0：100至100：0)洗脫純化該物質，得到標題化合物之白色固形物(35.0 g,130 mmol,33.3%)。MS(m/z)：270(M+1)；[α]_Na ²⁵=+187.83°(c=6.9，甲醇)。

製法9

7-疊氮基-5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮

利用己烷洗滌氫化鉀(約2勺，35重量%含於礦物油中)，繼而傾倒移除油，添加四氫呋喃(60 mL)且冷卻至-78℃。取含2,4,6-參(1-甲基乙基)-苯磺醯基疊氮化物(37.6 g,121.6 mmol)之四氫呋喃(60 mL)溶液經過硫酸鈉乾燥45分鐘。以15分鐘時間將疊氮化物溶液倒入氫化鉀懸浮液中。移走冷浴，且使其升至環境溫度保持45分鐘；該乾燥之溶液暫置一旁備用。使二異丙基胺(17.0 mL,121.0 mmol)與四氫呋喃(50 mL)之溶液冷卻至-78℃，以5分鐘時間逐滴添加正丁基鋰(52.1 mL,130.3 mmol)。移走冷浴且任其升溫15分鐘，然後回冷卻至-78℃。以5至10分鐘時間，經由導管加至-78℃之含5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮(34.3 g,93.1 mmol)之四氫呋喃(400 mL)溶液中。於-78℃下攪拌1小時後，移走冷浴且任其升溫15分鐘(至約-45℃)。冷卻至-78℃，以5至10分鐘時間經由導管添加該經乾燥之2,4,6-參(1-甲基乙基)-苯磺醯基疊氮化物溶液。移走冷卻浴並以1小時時間升溫至-5至0℃。在冰/水浴中冷卻，然後以13分鐘時間逐滴添加乙酸(26.7 mL,465.3 mmol)。以65分鐘時間升溫至環境溫度，然後使用飽和碳酸氫鈉溶液(1 L)淬滅。使用乙酸乙酯(600 mL)及水(2 L)稀釋反應，分離層，使用乙酸乙酯(2×400 mL)反萃取水相。使用飽和碳酸氫鈉水溶液(500 mL)及鹽水(500 mL)洗滌已合併的有機相，經過硫酸鈉乾燥然後濃縮。依據急驟層析法使用乙酸乙酯：己烷(0：100至100：0)洗脫純化殘餘物，得到標題化合物之油狀物(39.8 g,92.3 mmol,99%)。MS(m/z)：410(M+1)。

製法10

7-胺基-5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮

將鈀/碳(2.2 g,1.0 mmol,5%載於碳上)添加至經氮沖洗之含7-疊氮基-5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮(39.8 g,92.3 mmol)之乙醇(923 mL)的溶液。抽真空/填充氫氣3次，繼而於環境溫度在氫(1大氣壓)條件下攪拌過夜。經過Celite®過濾，使用乙醇及乙酸乙酯沖洗，然後濃縮，得到標題化合物之透明油狀物(36.6 g,89.9 mmol,97%)。MS(m/z)：384(M+1)。

製法11

N-[(1S)-2-[[5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁酯

使7-胺基-5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮(36.3 g,89.9 mmol)、二氯甲烷(360 mL)、三乙胺(16.3 mL,116.9 mmol)、3-羥基***并[4,5-b]吡啶(15.9 g,116.9 mmol)及(2S)-2-(第三丁氧基羰基胺基)丙酸(22.5 g,116.9 mmol)之混合物冷卻至0℃。添加1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(22.4 g,116.9 mmol)，5分鐘後升溫至環境溫度過夜。使用水(500 mL×2)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×300 mL)、鹽水(300 mL)洗滌，接著經過硫酸鈉乾燥然後濃縮。依據急驟層析法使用異丙醇：己烷(5：95至10：90)洗脫純化殘餘物，得到標題化合物之白色發泡體(43.14 g,77.77 mmol,86.50%)。MS(m/z)：555(M+1)。

製法12

(2S)-2-胺基-N-[5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]丙醯胺

以5分鐘時間將三氟乙酸(30 mL,396.76 mmol)添加至0℃之N-[(1S)-2-[[5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁酯(5.56 g,10.0 mmol)與二氯甲烷(30 mL)之溶液，且使其升溫，並於環境溫度下攪拌5小時。依據急驟層析法藉由SCX®管柱 (Isolute SCX-2×6)使用甲醇接著乙酸乙酯：甲醇(2 N氨)(1：1)洗脫純化殘餘物，得到全收量之標題化合物之白色固形物(3.48 g,10.2 mmol)。MS(m/z)：341(M+1)。

實例1

4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺

依序將(2S)-2-(4,4,4-三氟丁醯基胺基)丙酸(28.9 g,135.7 mmol；基本上如上述製法2中所述製得)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(29.7 g,155.1 mmol)添加至0℃之含(7S)-7-胺基-5-(2-羥乙基)-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮(34.8 g,129.2 mmol)之二氯甲烷(696 mL)之懸浮液，攪拌5分鐘。添加1-羥基苯并***單水合物(24.7 g,155.1 mmol)，使其攪拌1小時，然後升溫至環境溫度。添加(2S)-2-(4,4,4-三氟丁醯基胺基)丙酸(0.6 g,2.6 mmol)且於環境溫度下攪拌15分鐘。添加水(600 ml)，過濾出白色固形物，然後對濾液進行層之分離。使用水(3×200 mL)洗滌有機層，經過硫酸鈉乾燥然後濃縮，得到淺棕色發泡體。使該物質在50%甲基第三丁基醚/己烷(500 mL)中形成漿液，過濾出固形物，於高真空條件下乾燥，得到65 g固形物。

將水(195 mL)及碳酸氫鉀(14.0 g,140.0 mmol)添加至10℃之含前面所獲得固形物(65.0 g,140.0 mmol)之甲醇(195 mL)的溶液且於環境溫度下攪拌29小時。濃縮，然後利用二氯甲烷(3×50 mL)萃取。使用水(3×20 mL)洗滌已合併的有機相，經過硫酸鈉乾燥然後濃縮。依據急驟層析法使用甲醇：二氯甲烷(98：2，7 N氨溶液)洗脫純化殘餘物。藉由50%甲基第三丁基醚/己烷濕磨該物質，然後藉由甲基第三丁基醚(500 ml)濕磨。使用甲基第三丁基醚(200 mL)及己烷(200 mL)洗滌固形物，然後於高真空條件下乾燥，得到標題化合物之灰白色固形物(42.0 g,90.4 mmol,65%)。MS(m/z)：270(M+1)；[α]_Na ²⁵=-153.40°(c=5.0，甲醇)。

方法2：

將1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(2.50 g,13.0 mmol)添加至0℃之(2S)-2-胺基-N-[5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]丙醯胺(3.4 g,10.0 mmol)、二氯甲烷(40 mL)、3-羥基***并[4,5-b]吡啶(1.8 g,13.0 mmol)、4,4,4-三氟丁酸(1.9 g,13.0 mmol)及三乙胺(1.8 mL,13.0 mmol)之混合物。讓其攪拌且升溫至環境溫度過夜。添加水(40 mL)，且分溶在二氯甲烷(100 mL)與水(50 mL)之間。進行層之分離，使用二氯甲烷反萃取水相，使用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×100 mL)洗滌已合併的有機層。使用二氯甲烷(25 mL)反萃取碳酸氫鹽層，經過硫酸鈉乾燥已合併的有機層然後濃縮。依據急驟層析法使用甲醇(2 N氨)：二氯甲烷(0：100至5：95)洗脫純化殘餘物，得到3.77 g非對映異構體混合物。於Chiralpak®AD管柱上利用乙醇(0.2%二甲基乙胺)：乙腈(0：100至100：0)洗脫純化該物質，得到標題化合物之白色固形物(1.7 g,3.7 mmol,37%)。MS(m/z)：465(M+1)。

製法13

2-(2-溴苯基)乙酸甲酯

於氮氛圍下將2-溴苯乙酸(500.0 g,2.33 mol)與甲醇(5.0 L)組合。於20至35℃下逐滴添加濃硫酸(185.8 mL)，然後在攪拌下升溫達60至65℃保持3至4小時。使反應混合物冷卻至45℃然後在低於45℃下減壓濃縮至約750 mL之容積。使該反應混合物冷卻至10至30℃，接著添加二氯甲烷(2.5 L)。使用氫氧化鈉(7%,380.0 mL)調整pH達成7至8，繼而進行層之分離。有機相在低於45℃下減壓濃縮至乾燥，得到標題化合物之黃色油狀物(516.5 g,97.0%)。

製法14

5,7-二氫吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮

在攪拌及室溫下，將2-(2-溴苯基)乙酸甲酯(1.0 kg,4.36 mol)、二噁烷(11.0 L)及N-甲基-2-吡咯啶酮(7.0 L)組合。將雙(頻哪醇根基)二硼(1.2 kg,4.58 mol)及乙酸鉀(855.9 g,8.72 mol)添加至該混合物，然後藉由輸送氮氣通過該溶液脫氣該溶液2至3小時。於氮氛圍下添加[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(II)二氯甲烷加合物(71.2 g,97.2 mmol)，然後加熱該反應混合物至80至90℃維持18至20小時，獲得2-[2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼-2-基)苯基]乙酸甲酯之溶液，其無需分離即可使用。使該反應混合物冷卻至15至25℃然後添加2-胺基-3-溴吡啶(675.0 g,3.90 mol)及含三鹼價磷酸鉀(2.41 kg,11.3 mol)之水(3.0 L)溶液。藉由輸送氮氣通過該溶液脫氣該溶液2至3小時，然後添加[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(II)二氯甲烷加合物(106.8 g,130.8 mmol)，然後加熱反應混合物至80至90℃維持18至40小時。使該反應混合物冷卻至50至60℃，接著慢慢添加由飽和碳酸氫鈉(13.0 L)、飽和氯化鈉(13.0 L)及水(13.0 L)組成之溶液。於50至60℃下使該混合物攪拌2至3小時，冷卻至15至25℃然後再攪拌18至20小時。濾出所得固形物，繼而使用水(2×2.0 L)洗滌濾餅。將該等固形物轉移至乾淨反應容器，添加乙酸乙酯(5.0 L)，然後加熱該混合物至60至70℃保持2至3小時。使該溶液冷卻至15至25℃然後使其攪拌1至2小時，接著過濾所得固形物。利用乙酸乙酯(2×750 mL)洗滌濾餅，然後於真空條件下乾燥所得固形物，得到標題化合物之灰白色固形物(644.0 g,68.1%)。

製法15

添加含在乙腈(340.0 mL)中之5,7-二氫吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮(33.8 g,0.16 mol)且於20至30℃下攪拌0.5至1小時。添加碳酸銫(104.6 g,0.32 mol)及(2-溴乙氧基)-第三丁基二甲基矽烷(42.2 g,0.18 mol)，繼而加熱反應混合物至70至80℃保持18至20小時。使該反應混合物冷卻至20至25℃且經過矽藻土(50.6 g)過濾。使用乙腈(2×50.6 mL)洗滌濾餅，然後於減壓條件下濃縮濾液，達到約67.5 mL之總容積。添加甲苯(152 mL)，活性炭(2.53 g)且加熱該混合物至60至70℃維持1至2小時。使該混合物冷卻至25至35℃然後經過矽藻土(50.6 g)過濾該反應混合物。使用甲苯(17.0 mL)沖洗濾餅，然後於減壓條件下濃縮，得到標題化合物之淺棕色油狀物，靜置時會結晶(56.8 g,92.2%)。

製法16

將5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮(30.0 g,0.08 mol)與甲苯(300.0 mL)組合，使反應混合物冷卻至-10至0℃。添加第三丁醇鉀(18.2 g,0.16 mol)、亞硝酸異戊酯(13.34 g,0.11 mol)，然後攪拌3至5小時。將反應混合物轉移至乙酸乙酯(210 mL)與水(510 mL)之冷(0至5℃)兩相溶液，且攪拌15至30分鐘。使反應混合物升溫至15至25℃然後進行層之分離。使用另一份體積的乙酸乙酯(120 mL)及甲基第三丁基醚(120 mL)萃取水層，且合併有機層。於減壓條件下濃縮該有機相，達到約60至90 mL之溶液體積，然後添加甲苯(240 mL)及乙酸乙酯(75 mL)。藉由矽膠(45.0 g)過濾溶液，使用甲苯(210 mL)與乙酸乙酯(60 mL)之混合物沖洗該矽膠，然後於減壓條件下濃縮濾液，達到約75 mL之體積。添加庚烷(120 mL)然後濃縮該混合物，達到約60 mL之體積，接著過濾所得固形物。使用庚烷(25 mL)洗滌濾餅且於真空條件下乾燥，得到標題化合物之黃色固形物(28.3 g,72.5%)。

製法17

7-胺基-5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7H-吡多并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮

在高壓鍋中，於氮氛圍下，將5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7-羥基亞胺基-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮(206.0 g,0.52 mol)與四氫呋喃(2.3 L)組合。將阮來鎳(Raney nickel)(232.0 g，1.13重量/重量當量)添加至反應混合物，然後引入氫氛圍(87 psi)。於60至65℃下使該反應混合物攪拌24小時。經過矽藻土過濾該混合物，然後使用四氫呋喃(500 mL)洗滌過濾助劑。濃縮濾液，得到標題化合物之棕色油狀物(196.0 g,93.2%)。MS(m/z)：384(M+1)。

製法18

N-[(1S)-2-[[5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁酯

於氮氛圍下，將7-胺基-5-[2-(第三丁基(二甲基)矽烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-6-酮(166.0 g,0.43 mol)、二氯甲烷(2.2 L)及L-Boc-丙胺酸(106.4 g,0.56 mol)組合。添加羥基苯并***(1.46 g,10.8 mmol)及三乙胺(102.5 mL,0.74 mol)，維持內部溫度低於30℃。分批添加1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺(128.2 g,0.67 mol)且於20至30℃下攪拌維持16至18小時。依據矽膠層析法(300 g矽膠)使用二氯甲烷(498 mL×2)洗脫純化反應混合物。合併二氯甲烷溶液，然後使用水(2×3.3 L)洗滌該溶液。於減壓條件下濃縮有機相，達到300 mL至400 mL之體積，然後添加乙酸乙酯(664.0 mL)。於減壓條件下濃縮混合物，達到300至400 mL之體積，然後添加乙酸乙酯(664 mL)。於減壓條件下濃縮該混合物，達到300至400 mL之體積，然後添加乙酸乙酯(1.3 L)。添加四-正丁基氟化銨三水合物(149.4 g,0.47 mol)且於20至30℃下攪拌16至18小時。添加氯化鈉之水溶液(20%,1.6 L)，進行層之分離，然後再次使用氯化鈉水溶液(20%,1.6 L)洗滌有機相。濃縮有機相，達到約800至900 mL之體積，然後於20至30℃下攪拌該混合物12至16小時。過濾所得固形物，使用乙酸乙酯(91.3 mL)洗滌濾餅。藉由矽膠層析(300 g矽膠)，使用乙酸乙酯(2x500 mL)洗脫純化濾液，得到標題化合物之黃色油狀物(82.6 g,85.2% de,100% ee，產率51.2%)。MS(m/z)：441(M+1)。

製法19

(2S)-2-胺基-N-[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]丙醯胺

於氮氛圍下將N-[(1S)-2-[[5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁酯(54.0 g,0.12 mol)及乙腈(212.7 mL)組合。逐滴添加鹽酸(317.5 mL,4 N,1.27 mol)以維持內部溫度低於30℃，然後於20至30℃下使反應混合物攪拌16至18小時。添加水(324.0 mL)及二氯甲烷(430 mL)然後進行層之分離。棄置有機層，繼而在水相中添加二氯甲烷(645 mL)，然後使用氫氧化鈉水溶液(20%,252 mL)調整pH至約10。進行層之分離，使用另一份二氯甲烷(2×430 mL)萃取水層，然後合併該等有機相。在低於45℃下減壓濃縮該有機相至約130至150 mL之體積，然後添加四氫呋喃(322 mL)。在低於45℃下減壓濃縮該溶液至約200至220 mL之體積，然後添加另一份體積之四氫呋喃(213 mL)。於減壓條件下濃縮反應混合物，達到約250至270 mL之體積，然後加熱至60至65℃維持2至3小時。使該反應混合物慢慢冷卻至5至15℃且攪拌5至8小時。過濾出所得固形物，使用乙酸乙酯(56 mL)洗滌濾餅。將該等固形物轉移至乾淨反應容器，添加乙酸乙酯(150 mL)，然後加熱至60至65℃維持2至3小時，然後使該溶液慢慢冷卻至5至15℃。於該溫度下攪拌2至3小時，然後過濾收集所得固形物。使用乙酸乙酯(45 mL)洗滌濾餅，然後在烘箱中，在低於60℃下減壓乾燥該等固形物，得到標題化合物之灰白色固形物(21.0 g,99.2% de,100% ee，產率51.0%)。MS(m/z)：341(M+1)。

實例2

4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺水合物

於氮氛圍下將(2S)-2-胺基-N-[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]丙醯胺(45.0 g,132.2 mmol)與二甲基甲醯胺(452.9 mL)組合。冷卻至0至5℃然後添加N-乙基二異丙基胺(77.4 mL,444.0 mmol)、 4,4,4-三氟丁酸(19.9 g,139.3 mmol)及羥基苯并***單水合物(22.3 g,153.1 mmol)。使溶液攪拌5至10 min然後一次添加全量之1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(30.6 g,159.6 mmol)。使反應混合物升溫至20至25℃且攪拌1至2小時。添加乙酸乙酯(1.4 L)及水(1.8 L)然後攪拌0.5至1小時。進行相之分離，接著使用碳酸氫鈉水溶液(5%,1.0 L)洗滌有機層，然後於減壓條件下濃縮該溶液，得到200至300 mL之體積。添加乙醇(522 mL)且於減壓條件下濃縮該溶液，得到為200至300 mL之體積。重複3次。添加乙醇(180 mL)及5%碳酸鉀溶液(34.6 mL)，且於20~25℃下攪拌0.5至1小時。添加水(667 mL)及作為晶種之4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羥乙基)-6-側氧基-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]丁醯胺水合物(0.4 g,0.86 mmol)(晶種可藉由獲自前面幾批產物之固形物產生，或可使用最為人所熟知且為熟習此項相關技藝者所使用的其他方法(諸如少量等分試樣之再結晶)獲得)，且於20至25℃下攪拌2至3小時。過濾並使用乙醇(63 mL)與水(42 mL)之混合物洗滌濾餅兩次。於烘箱中，在低於40℃下減壓乾燥所得固形物，得到標題化合物之白色至灰白色固形物(41.9 g,99.6% de,100% ee，產率65.3%)。MS(m/z)：465(M-H₂O+1)。

實例2之XRPD

於配備CuKα源(λ=1.54060 Å)及Vantec檢測器之Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀上，於35 kV及50 mA下操作，獲得結晶固形物之XRPD圖型。在0.0087°(2θ)之步進及0.5秒/步進之掃描速度，及0.6 mm發散度，5.28 mm固定之反散射片，及9.5 mm檢測狹縫下，在4至40°(2θ)之間掃描樣本。將乾粉堆積於石英樣本固定架上，使用載玻片獲得光滑表面。在結晶學技藝中咸明瞭，對於任何指定結晶形式，繞射峰之相對強度可能隨諸如晶體形態及習性之該等因素之較佳取向而改變。若出現較佳取向之影響時，峰強度會發生改變，但多晶型體之特徵峰位置未改變。(例如，參見：美國藥典(U.S.Pharmacopia)33-國家處方集(National Formulary)第28章<941>Characterization of Crystalline Solids by X-ray Powder Diffraction(XRPD)Official 2010年10月1日至2011年2月1日)。此外，在結晶學技藝中亦咸明瞭，對於任何所指定結晶形式，角峰位置可能有些微變化。例如，由於分析樣本時之溫度或濕度不同、樣本移位、或內標準品之存在或缺乏，峰位置可能偏移。於本實例中，峰位置改變±0.2(2θ)應視為該等可能的變化，沒有妨礙明確識別所指示的結晶形式。可基於不同峰(單位為2θ)(通常係指較主要波峰)之任何獨特組合確認結晶形式。於環境溫度(19至25℃)及相對濕度(20至60%)下收集結晶形式之繞射圖型。

因此，根據使用CuKα輻射之XRPD圖樣，實例2化合物所製得樣本之特徵為具有如下表1所述之繞射峰(2-θ值)。該形式為結晶，且包含位於22.97度位置之波峰與選自由11.96、18.81、20.78及21.07度(2-θ)(繞射角公差為0.2度) 之位置所組成群中之一或多個波峰之組合。

實例2之固態NMR

¹³C交叉極化/魔角旋轉(CP/MAS)NMR(固態NMR或SSNMR)光譜係使用在100.622 MHz之碳頻率下操作且配備Bruker 4 mm三重共振探針(K299551)之Bruker Avance II 400 MHz NMR質譜儀(Lilly tag K299547)獲得。TOSS邊帶消除係與利用SPINAL64去偶聯(70.8 Watts)及RAMP100成型H-核CP脈衝之交叉極化一起使用。採集參數如下：90°質子r.f.脈衝寬度為2.5 μs，接觸時間為3.5 ms，脈衝重複時間為5 s，MAS頻率為10 kHz，光譜寬度為30 kHz，採集時間為34 ms及掃描次數為10,587。另一實驗中化學位移係指金剛烷(δ=29.5 ppm)。¹³C NMR(固態)：δ(ppm)18.65,27.52,28.76,47.66,49.96,55.02,58.88,122.87,126.49,129.73,131.37,132.31,137.28,145.01,149.17,168.53,170.30,175.55。

實例2之卡爾費雪滴定法(Karl Fischer Titration)

使用Brinkmann Methrohm 756 KF電量計進行卡爾費雪滴定法。使用二重複之Hydranol®作為水標準品來測定對照標準品。對樣本進行三次重複試驗，並記錄水之平均百分比，以確定樣本中水含量。實例2之卡爾費雪滴定法平均結果為3.9%水。實例2中1莫耳當量水之理論百分比為3.7%。

癌症日益被認作因一或多個在細胞及組織微環境中調節DNA修補、基因組穩定性、細胞增生、細胞死亡、黏著、血管生成、入侵及轉移之基因的功能發生異常所誘發開始且進展之高度異質性疾病之統稱。「癌症」基因功能之變異或異常可能起因於自然產生之DNA多態性，基因組複本數之變化(藉由擴增、缺失、染色體損失或複製)，基因及染色體結構之變化(藉由染色體移位、倒置或其他導致失調基因表現之重排)，及單點突變。惡性腫瘤可由一種異常性基因功能誘發，且由該相同異常基因功能維持，或由其他異常基因功能維持或加劇惡化。

除了上述基因染色體變異之外，各種癌症亦可包括基因組之表觀遺傳修飾，包括DNA甲基化，基因印記，及組織蛋白之乙醯化、甲基化或磷酸化修飾法。表觀遺傳修飾法可在誘發及/或維持惡性病中發揮作用。

有關人類癌症細胞基因變異之大量資料已經過編譯且維持定期線上更新(參見The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at the US National Cancer Institute(NCI)Cancer Genome Anatomy Project(CGAP)網址：http：//cgap.nci.nih.gov)。該資料庫包括本發明中至少一些惡性病之染色體變異。維爾康姆基金會桑格研究所癌症基因組計畫(The Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project))在「癌症基因人口普查」(參見http：//www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census) 線上詳細提供與腫瘤發生起因有關之所有人類基因及在COSMIC(癌症體細胞突變目錄(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer))資料庫中提供人類癌症之體細胞突變(參見http：//www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic)。包含與多種癌症有關之細胞基因變化之大量資訊的另一資源為「腫瘤學及血液病學相關之遺傳學及細胞遺傳學圖冊(Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology)」(http：//atlasgeneticsoncology.org//Anomalies/Anomliste.html#MDS)。該等資料庫亦包括本發明中至少一些惡性病之染色體變異。

吾人所熟知且例行使用活體檢驗、免疫表型及其他測試法來診斷癌性惡性病。除高解析度之染色體色帶染色法及進一步之染色體成像技術以外，可疑癌症病例之染色體變異可藉由諸如螢光原位雜交(FISH)、染色體核型分析、光譜染色體核型分析(SKY)、多色FISH(M-FISH)、比較性基因組雜交(CGH)、單核苷酸多態性陣列(SNP晶片)及其他診斷之細胞基因分析法及熟習本技藝者熟知且採用之分析測試法判定。

刻痕(Notch)之致癌角色首先報導在人類T細胞白血病中，其涉及刻痕1胞內域至T細胞受體-β啟動子區之移位，從而導致刻痕1胞內域過度表現(Grabher等人Nature Review Cancer,2006(6)：第347至359頁；Weng等人Science,2004(306)：第269至271頁)。小鼠造血前驅細胞內刻痕1胞內域之過度表現導致該小鼠出現類似人類之T細胞急性淋巴母細胞白血病。除T細胞急性淋巴母細胞白血病以外，越來越多的證據顯示，刻痕信號係透過多重機轉(包括受體擴增及配體與/或受體過度表現)在其他癌症中具致癌性，包括急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病及紅血球性白血病。在包括乳癌、卵巢癌(Park等人Cancer Research,2006(66)：第6312至6318頁)、黑素瘤(Gast等人Genes,Chromosomes & Cancer,2010(49)：第733至745頁)、肺癌、非小細胞肺癌(Westhoff等人PNAS,2009(106)：第22293至22298頁)、胰腺癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、頭部及頸部癌、子宮頸癌、***癌、肝癌、鱗狀細胞癌(口腔)、皮膚癌及神經管胚細胞瘤(Ranganathan等人，Nature Review Cancer,2011(11)：第338至351頁及補充資訊S1(表))之許多實體瘤惡性腫瘤中，亦涉及因配體及/或受體突變或過度表現所導致之異常組成型刻痕信號傳導。刻痕信號之抑制作用成為吸引人之目標，可以為罹患由組成型刻痕信號路徑異常活化所誘發癌症之病患提供治療效益。Shih等人Cancer Research,2007(67)第1879至1882頁。

以下活體外及活體內研究證實化合物1對抗各種不同特異性癌細胞系之刻痕路徑信號活性及有效性。該等分析法一般係熟習本技藝者視為人類臨床化療活性之指標。咸信抑制γ-分泌酶裂解刻痕胞內域時，可分別有效對抗刻痕1、刻痕2、刻痕3及刻痕4受體。證實刻痕路徑信號抑制活性及有效性之分析法可實質上依據以下或藉由可提供類似資料之類似分析法完成。

刻痕N1ICD細胞核積聚細胞成像分析法

依5000個細胞/孔，取HEK293△E12細胞(HEK293細胞經過基因改造而可穩定表現小鼠刻痕1 cDNA從而編碼胺基酸1703-2183，NP_032740.3，在其N-端具有23個胺基酸信號肽序列，MPRLLTPLLCLTLLPALAARGLR(SEQ ID NO：1))塗佈於96孔盤中，於37℃，5% CO₂下培養在杜貝卡氏改良依格(Dulbecco's Modified Eagle's)培養基(高葡萄糖與5%胎牛血清)中歷時24小時。使用測試化合物處理細胞，取經過1：3稀釋至1000 nM至0.05 nM範圍內且最終二甲亞碸(DMSO)濃度為0.2%之10種濃度添加。處理24小時後，依序以下步驟處理細胞盤：於室溫(RT)下，依100 μl/孔使用PREFER^TM固定劑固定細胞維持30分鐘；於RT下，依100 μl/孔利用在磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中之0.1% TRITON® X100對細胞進行通透化處理20分鐘；每次使用100 μl/孔之PBS洗滌3次；於37℃下，依50 μl/孔添加兔抗N1ICD(刻痕1胞內域)抗體(依1：2000含在含1%胎牛血清白蛋白之PBS中)並培養1.5小時；每次使用100 μl/孔之PBS洗滌3次；與50 μl/孔之山羊抗兔IgG Alexa 488(依1：1000含在含1%胎牛血清白蛋白之PBS中)培養且於37℃下培養1小時；每次使用100 μl/孔之PBS洗滌3次，依100 μl/孔添加含50 μg/ml RNAse之15 μM碘化丙啶(Propidium Iodide)維持30分鐘，以染色細胞核。利用ACUMEN EXPLORER^TM雷射掃描螢光微量盤細胞計數儀(TTP LABTECH LTD)掃描該等盤，以測定總細胞核計數/孔及總細胞核面積/孔，其螢光在655 nm至705 nm(由與DNA結合之碘化丙啶發射)，及細胞核區中結合N1ICD之抗體之螢光在505 nm至530 nm。該主要分析法輸出數據為細胞核N1ICD之總螢光量對總細胞核面積(經過校正之細胞核N1ICD信號)之比值。以細胞數%對0.2% DMSO對照組細胞收集相對細胞毒性形態。將會隨對應於人類刻痕1中Val1744處之胺基端裂解部位之人類多肽而產生可辨識裂解之刻痕1或N1ICD之抗體。於未經處理之對照組細胞中，自刻痕1產生之N1ICD將會移位並累積於核中。當細胞經過刻痕1裂解抑制性化合物處理時，核N1ICD之信號將會減弱。由針對核N1ICD信號擬合至四參數對數之曲線測定濃度反應及IC₅₀，其中細胞數量%係繪示於細胞毒性形態之同一圖中。基本如上所述進行該分析法，化合物1之平均IC₅₀為0.41 nM(n=7)。化合物在高達1000 nM之濃度仍不會影響細胞數量。

該等資料證實化合物1對刻痕1具有親和力，且抑制胞內積聚刻痕1胞內域細胞信號肽。

對人腫瘤細胞系中N1ICD裂解之抑制作用

為了評估化合物1在抑制N1ICD裂解能力上之效價，使用若干種人類腫瘤細胞系。A2780為人類卵巢細胞系(Sigma-Aldrich，編號93112519)；MIA PaCa-2為人類胰臟細胞系(ATCC編號CRL-1420)；BxPC-3為人類胰臟細胞系(ATCC編號CRL-1687)；SW480為人類結腸直腸細胞系(ATCC編號CCL-228)；HCT 116為人類結腸直腸細胞系 (ATCC編號CCL-247)；DLD-1為人類結腸直腸細胞系(ATCC編號CCL-221)；MDA-MB-231為人類乳腺細胞系(ATCC No.HTB-26)；U-87 MG為人類神經膠質母細胞瘤細胞系(ATCC編號HTB-14)；A375為人類惡性黑素瘤細胞系(ATCC編號CRL-1619)；CCRF-CEM為人類急性淋巴母細胞白血病(ALL)細胞系(ATCC編號CCL-119)；SUP-T1為人類T細胞淋巴母細胞白血病細胞系(ATCC編號CRL-1942)；K-562為人類慢性骨髓性白血病(CML)細胞系，其特徵在於存有由Bcr與Abl1基因組成之融合轉錄本(ATCC編號CCL-243)；Jurkat(純系E6-1)為人類急性T細胞白血病細胞系(ATCC編號TIB-152)；MOLT-3為人類急性淋巴母細胞白血病(ALL)細胞系(ATCC編號CRL-1552)；MOLT-4為人類急性淋巴母細胞白血病(ALL)細胞系(ATCC編號CRL-1582)；HEL 92.1.7為人類紅血球性白血病細胞系(ATCC編號TIB-180)。該等細胞系分別獲自以ATCC編號表示之美國菌種培養物保存中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，但其中A2780細胞系則依所出示之目錄編號獲自Sigma-Aldrich。該等細胞係於37℃及5% CO₂與環境濕度下在其各自培養基中生長。針對A2780人類卵巢癌之細胞培養基為含2.05 mM L-麩胺醯胺之RPMI-1640(不含酚紅)，其添加有2 mM L-麩胺醯胺、0.01 mg/ml胰島素及10%胎牛血清(FBS)；針對HCT 116人類結腸直腸癌之細胞培養基為含有1.5 mM L-麩胺醯胺、0.075%碳酸氫鈉及10% FBS之McCoy's 5A；針對SW480人類結腸直腸癌之細胞培養基為含有2.05 mM L-麩胺醯胺、20 mM HEPES及10% FBS之RPMI-1640；針對U-87 MG人類神經膠質母細胞瘤之細胞培養基為含有2 mM L-麩胺醯胺、0.1 mM非必需胺基酸(NEAA)、1 mM丙酮酸鈉及10% FBS之最基本必需培養基/伊氏(Earl's)平衡鹽溶液；針對MIA PaCa-2人類胰腺癌之細胞培養基為不含丙酮酸鈉，但含有高葡萄糖(4500 mg/ml)、4 mM L-麩胺醯胺、2.5%馬血清及10% FBS之杜氏改良依格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagles Medium)(DMEM)；針對K-562人類CML之細胞培養基為含有高葡萄糖(4500 mg/ml)、4 mM L-麩胺醯胺、10 mM HEPES、0.1 mM NEAA、1 mM丙酮酸鈉及10% FBS之DMEM；針對Jurkat(純系E6-1)人類急性T細胞白血病之細胞培養基為含有2.05 mM L-麩胺醯胺、2.5 g/L葡萄糖、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、0.075%碳酸氫鈉及10% FBS之RPMI-1640；針對A-375人類惡性黑素瘤及MDA-MB-231人類***腺癌瘤之細胞培養基為含有高葡萄糖(4500 mg/ml)、4 mM L-麩胺醯胺及10% FBS之DMEM；針對BxPC-3人類胰腺癌、DLD-1人類結腸直腸腺癌、SUP-T1人類淋巴母細胞白血病、MOLT-3人類ALL、Molt-4人類ALL、CCRF-CEM人類ALL及HEL 92.1.7人類紅血球性白血病之細胞培養基為含有2.05 mM L-麩胺醯胺、2.5 g/L葡萄糖、20 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉及10% FBS之RPMI-1640。當達到80至90%匯合度時，利用化合物處理細胞，以依1：3稀釋至50 nM至0.0025 nM範圍內且最終二甲亞碸 (DMSO)濃度為0.01%之10種濃度添加。在處理24小時後，基本上依序以下步驟處理細胞盤：收集經過胰蛋白酶處理後之細胞，使用冰冷PBS洗滌1次，然後於含1×完全錠(Complete tablet)(Roche Complete^TM編號11 697 498 001)及1×蛋白酶抑制劑混合物(Sigma Aldrich P8340)之100 μl冰冷XY溶胞緩衝劑(25 mM Tris pH 7.5、10 μg/ml胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制劑、10 μg/ml抑肽酶、60 mM β-甘油磷酸酯、1% Triton® X-100、10 mM NaF、2.5 mM焦磷酸鹽、150 mM NaCl、15 mM乙二胺四乙酸(EDTA)pH 8.0、5 mM乙二醇-雙(2-胺基***)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)pH 8.0、1 mM釩酸鈉、10 μg/ml亮肽素(Leupeptin)、1 mM二硫蘇糖醇、1 μM微囊藻素(microcystin)LR、10 μg/ml N-對甲苯磺醯基-L-苯基丙胺酸氯甲基酮(TPCK)、2 mM Nα-對甲苯磺醯基-L-精胺酸甲酯鹽酸鹽(TAME)、15 mM 4-硝基苯基磷酸二(三羥甲基胺基甲烷(tris))鹽(PNPP)、0.1 mM 4-(2-胺基乙基)苯磺醯基氟化物鹽酸鹽(AEBSF)、5 mM苄脒、1 μM岡田井酸(Okadaic Acid))中進行細胞裂解。於冰上培養溶胞產物歷時15分鐘，且每隔5分鐘進行短時渦轉，然後於冰上音波處理1分鐘。樣本係於4℃ eppendorf離心機中以30,000 rpm旋轉30分鐘，繼而收集80 μl上清液以供分析。使用Pierce BCA蛋白質分析套組(Pierce BCA Protein Assay Kit^TM)(Thermo Scientific,Rockford,IL)，利用Thermomax^TM分析盤讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)測得總蛋白質濃度。利用訂製之N1ICD酶聯免疫吸收劑分析法(ELISA)測定N1ICD含量。利用已裂解之刻痕1(Val1744)-特異性訂製之兔單株抗體捕捉分析物，且利用C端刻痕1 SULFO-TAG®(Meso Scale Diagnostics,Gaithersburg,Maryland)多株羊抗體(R&D Systems,Minneapolis,MN)偵測。以含有1×完全錠(Roche Complete^TM mini編號11 836 153 001)及1×蛋白酶抑制劑混合物1(Sigma Aldrich P8340)之冰冷ELISA tris溶胞緩衝劑R60TX(Meso Scale Diagnostics,Gaithersburg,Maryland)稀釋溶胞產物至1 μg/μl，且取25 μl添加至該ELISA盤。各取25 μg蛋白溶胞產物於RT下培養1小時，以捕捉分析物且偵測抗體。於扇區成像儀(Sector Imager)6000^TM(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,Maryland)讀取分析盤。減去背景之N1ICD經過校正至總蛋白質，且以相對於媒劑處理組之抑制%表示。使用GraphPad Prism® 4軟體，將濃度反應數據擬合至「4-參數S型劑量效應(可變斜率)」模式，測得IC₅₀值。化合物1在不同腫瘤細胞系中之IC₅₀值示於表1中。

表1中之數據證實化合物1在抑制N1ICD信號肽產生之能力上之效力，其係抑制γ-分泌酶活性及N1ICD信號肽於特異性人類腫瘤細胞系中之積聚結果。

活體內藥效及標的物抑制研究 動物研究

為了評估化合物1於抑制刻痕處理藥效動力學(PD)上之活體內有效性及效果，使用源於若干種細胞系及病患之異種移植模型。對6至8週大的無胸腺雌性裸小鼠(Harlan Laboratories)的後肢皮下注射植入含A2780(2×10⁶)、SW480(6×10⁶)、HCT 116(6×10⁶)、U-87 MG(6×10⁶)及A-375(10×10⁶)細胞之1：1基質膠混合物(0.2 mL體積)。對6至8週大的CD1 nμ/nμ雌小鼠(Charles River實驗室)的後肢皮下注射植入含K-562(6×10⁶)細胞之1：1基質膠混合物(0.2 mL體積)。對6至8週大的CB17嚴重複合型免疫缺陷雌小鼠(Taconic Farms)的後肢皮下注射植入含HEL 92.1.7(7×10⁶)之1：1基質膠混合物(0.2 mL體積)。將源於病患之腫瘤絞碎成1至2 mm碎片且與0.2 ml體積之基質膠(1：1)混合，然後對6至8週大的無胸腺雌性裸小鼠(Harlan實驗室)的後肢皮下注射植入。源於病患之腫瘤模型包括：人類神經膠質母細胞瘤(EL2144)、人類三陰性侵襲型乳管癌(EL1997)及人類結腸癌(EL1989、EL 1986及EL 2056)，樣本係在病患同意及醫院認可之後獲得(來自IU Health,Methodist Hospital,Indianapolis,Indiana,USA 46206)。各組使用總計7至10隻小鼠。在即將植入A2780、SW480、HEL 92.1.7、A-375、K-562及源於病患之腫瘤模型之前，對動物進行照射(450全身照射)。小鼠可自由攝取標準飼料。當腫瘤尺寸達到150±50 mm³時，口服投與(胃管)0.2 mL體積之化合物或媒劑(含在0.25%吐溫(Tween)-80中之1% Na-CMC)開始治療。於治療後的指定時間點，藉由CO₂窒息及頸椎脫臼法殺死動物。移除腫瘤並用於PD反應分析。隨時間監測腫瘤生長及體重，以評估有效性及毒性之徵兆。每週兩次進行二維測量腫瘤，且基於以下公式計算腫瘤體積：(腫瘤體積)=[(L)×(W2)×(Π/6)]，其中L為中軸長度及W為中軸寬度。將腫瘤體積數據轉換為log標度，以修正時間及處理組之間之偏差。使用SAS^TM軟體(8.2版)之MIXED^TM程序，由時間與處理法之雙向重複測量變方分析法來分析該等log體積數據。該等重複測量之相關性模型為空間能力。於各時間點比較處理組與對照組。該MIXED^TM程序亦分別用於各治療組，以計算各時間點之調整過之平均數及標準誤差。兩種分析均解釋於各動物中之自我相關性及在研究初期移去罹患大型腫瘤之動物時所流失之數據。針對於各治療組對時間繪示該等調整過之平均數及標準誤差。抗腫瘤活性係以腫瘤生長抑制百分比(TGI%)表示，且係比較治療組與媒劑處理組之腫瘤體積計算得到。針對於化合物1之腫瘤生長抑制百分比(%TGI)及統計顯著性值(p值)係基本如上所述測得且概述於表2中。

N1ICD分析

為了評估腫瘤中之N1ICD含量程度，自冷凍腫瘤切取約75 mg且先絞碎後再均質化(記錄實際質量)。將冷凍腫瘤樣本轉移至裂解基質(Lysing Matrix)-D^TM管中，且再懸浮於包含1×完全錠(Roche Complete^TM編號11697 498 001)及1×蛋白酶抑制劑混合物(Sigma-Aldrich P8340)之冰冷XY溶胞緩衝劑(25 mM Tris pH 7.5、10 μg/ml胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制劑、10 μg/ml抑肽酶、60 mM β-甘油磷酸酯、1% Triton® X-100、10 mM NaF、2.5 mM焦磷酸鹽、150 mM NaCl、15 mM乙二胺四乙酸(EDTA)pH 8.0、5 mM乙二醇雙(2-胺基***)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)pH 8.0、1 mM釩酸鈉、10 μg/ml亮肽素、1 mM二硫蘇糖醇、1 μM微囊藻素LR、10 μg/ml N-對甲苯磺醯基-L-苯基丙胺酸氯甲基酮(TPCK)、2 mM Nα-對甲苯磺醯基-L-精胺酸甲酯鹽酸鹽(TAME)、15 mM 4-硝基苯基磷酸二(三羥甲基胺基甲烷(tris))鹽(PNPP)、0.1 mM 4-(2-胺基乙基)苯磺醯基氟化物鹽酸鹽(AEBSF)、5 mM苄脒、1 μM岡田井酸)中，質量：體積比為75 mg/ml緩衝劑。組織係在Fast Prep FP120均質機(Thermo Scientific,Rockford,IL)中，於4℃下以6.0之速度均質化30秒，接著在冰上培養15分鐘。重複此舉總計2至3個循環，直到完成均勻化為止。溶胞產物係在4℃ eppendorf離心機中，依30,000 rpm旋轉15分鐘，以移去碎屑。移出400 μl上清液並轉移至新eppendorf離心管且經過冷凍/解凍循環。樣本在4℃ eppendorf離心機中，依30,000 rpm再旋轉30分鐘，且收集120 μl上清液以供分析。使用Pierce BCA蛋白質分析套組^TM(Thermo Scientific,Rockford,IL)，利用Thermomax^TM分析盤讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)測得總蛋白質濃度。利用訂製之N1ICD ELISA確定N1ICD含量。利用已裂解之刻痕1(Val1744)-特異性訂製之兔單株抗體捕捉分析物，且藉由C端刻痕1 SULFO-TAG®(Meso Scale Diagnostics,Gaithersburg,Maryland)多株羊抗體(R&D Systems,Minneapolis,MN)偵測。以含有1×完全錠(Roche Complete^TM mini編號11 836 153 001)及1×蛋白酶抑制劑混合物1(Sigma Aldrich P8340)之冰冷ELISA tris溶胞緩衝劑(R60TX)(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,Maryland)稀釋溶胞產物至2 μg/μl，且取25 μl添加至該ELISA盤。各份50 μg蛋白質溶胞產物係於RT下培養1小時，以捕捉分析物且偵測抗體。於扇區成像儀6000^TM(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,Maryland)讀取分析盤。減去背景之N1ICD經過校正至總體蛋白質，且以相對於媒劑處理組之抑制%表示。如藉由Dunett's法針對最後一次投與化合物1後4小時所收穫的腫瘤測得之N1ICD抑制%及統計顯著性值(p值)基本上係如上所述進行分析且概述於表2中。

表2中之數據證實化合物1於多種不同人類腫瘤異種移植模型中可抑制腫瘤生長，及抑制N1ICD裂解。表2中之數據進一步顯示與表1中所述細胞功能活性數據之活體內相關性。

代謝及***

該等化合物證實細胞色素P450(CYP450)代謝及調控作用低或不存在時會降低與病患正在攝取之其他藥療發生不良交互作用而可能導致改變劑量或需要完全停止藥療的可能性。在CYP450代謝導致病患顯著曝露在活性代謝產物時，可能因與多種活性物質相關之較大變異性而產生效價及安全性問題；因此，一般而言以缺乏活性代謝產物之藥物較佳。CYP450代謝及調控作用低或不存在之治療劑為理想，且可在病患中或對病患具有較優異的安全型態。Lynch等人，Am.Fam.Physician,76,391(2007)。無法單純根據活性藥劑之結構來預測與CYP450酵素發生交互作用之可能性。

化合物1並非主要CYP450酵素之抑制劑或誘導劑且亦不會受到最適合氧化性CYP450代謝作用之肝微粒體之任何顯著代謝程度。於大鼠及狗活體內檢測中，在循環或***物中沒有觀察到主要氧化性代謝產物。因此，化合物1幾乎不可能與其他藥療發生基於CYP450的交互作用而導致劑量調整或需要限制或停止針對治療癌症之病患之其他藥療。

對膽管插管大鼠進行化合物1之活體內評估來研究全身藥物動力學(PK)、***及代謝。活體內***出51% IV劑量仍完整不變，大量集中於尿液中，僅低量(母化合物之2%)受到全身作用形成活性N-去烷基化代謝產物：4,4,4-三氟-N-[(1S)-1-甲基-2-側氧基-2-[[(7S)-6-側氧基-5,7-二氫吡啶并[2,3-d][3]苯并氮呯-7-基]胺基]乙基]丁醯胺。大鼠血漿之代謝產物型態顯示不存有其他循環代謝產物。對未接受膽管處理之狗之其他研究亦根據母化合物之***及缺乏主要循環活性代謝產物來支持其顯著之清除率。

針對於化合物1之總體代謝及***數據證實所需之清除機轉(母化合物經尿***，及醯胺水解成無活性及非循環性片段，其不會在與最適合CYP450代謝作用之肝微粒體培養時產生)，以及不存在主要活性循環代謝產物。

於臨床配置中，希望在臨床前觀察到化合物1之清除特性。已知主要藉由氧化性代謝作用消除之化合物基於藥物與合併用藥療及某些果汁/草藥之交互作用、肝病、及個體間之酶活性差異而具有不同曝露程度。以多重清除機轉較佳，因為其等可減小任一消除路徑所出現藥物交互作用之影響。因此，同時藉由***(51%)及代謝(醯胺水解)清除化合物1而沒有產生主要活性循環代謝產物時，係有利於病患。總言之，該等清除特性可降低調整臨床劑量之可能性，並可儘量降低與主要活性循環代謝產物、合併用藥療之投藥及與病患之間CYP450活性差異相關之安全及有效性之可能性。

圖1為實例2化合物之代表性X射線粉末繞射圖樣。

<110> 美國禮來大藥廠

<120> 刻痕(NOTCH)路徑信號抑制劑化合物

<130> X19316

<140> 101125459

<141> 2012-07-13

<150> 61/512016

<151> 2011-07-27

<150> 61/560486

<151> 2011-11-16

<160> 1

<170> 專利案第3.5版

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信號肽

<400> 1

Claims

一種如下結構之化合物：或其醫藥可接受鹽或水合物。
如請求項1之化合物或其醫藥可接受鹽或水合物，其係用於抑制刻痕路徑信號。
如請求項1之化合物或其醫藥可接受鹽或水合物，其係用於治療以下癌症：T細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、頭部及頸部癌、子宮頸癌、***癌、肝癌、鱗狀細胞癌(口腔)、皮膚癌或神經管胚細胞瘤。
如請求項1之化合物或其醫藥可接受鹽或水合物，其係用於治療以下癌症：T細胞急性淋巴母細胞白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、乳癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、神經膠質母細胞瘤或結腸直腸癌。
如請求項1之化合物，其為具有如下特徵之結晶水合物：於環境溫度及相對濕度下使用CuKα輻射之X射線粉末繞射圖型具有2-θ為22.97±0.2度位置之波峰與2-θ為11.96±0.2、18.81±0.2、20.78±0.2或21.07±0.2度位置之一或多個波峰之組合。
如請求項1之化合物或其醫藥可接受鹽。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1之化合物或其醫藥可接受鹽或水合物，與醫藥可接受載劑組合。
一種如請求項1之化合物或其醫藥可接受鹽或水合物於製造用於為有此需要之癌症病患抑制刻痕(Notch)信號之藥物上之用途。
一種如請求項1之化合物或其醫藥可接受鹽或水合物於製造用於治療以下癌症之藥物上之用途：T細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、頭部及頸部癌、子宮頸癌、***癌、肝癌、鱗狀細胞癌(口腔)、皮膚癌或神經管胚細胞瘤。
一種如請求項1之化合物或其醫藥可接受鹽或水合物於製造用於治療以下癌症之藥物上之用途：T細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、乳癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、神經膠質母細胞瘤或結腸直腸癌。