TWI507205B - 抗ｆｇｆｒ３抗體及使用方法 - Google Patents

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TWI507205B TW099108751A TW99108751A TWI507205B TW I507205 B TWI507205 B TW I507205B TW 099108751 A TW099108751 A TW 099108751A TW 99108751 A TW99108751 A TW 99108751A TW I507205 B TWI507205 B TW I507205B
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Description

抗FGFR3抗體及使用方法
本發明大體係關於分子生物學領域。更特定而言，本發明係關於抗FGFR3抗體及該等抗體之用途。
本申請案主張2009年3月25日申請之美國專利申請案第61/163,222號之優先權，其內容係以引用的方式併入本文中。
纖維母細胞生長因子(FGF)及其受體(FGFR)在胚胎發育、組織穩態及代謝期間起關鍵作用(1-3)。對於人類而言，存在22種FGF(FGF1-14、FGF16-23)及4種具有酪胺酸激酶結構域之FGF受體(FGFR1-4)。FGFR由細胞外配位體結合區(其具有2個或3個免疫球蛋白樣結構域(IgD1-3))、單次跨膜區及細胞質之***酪胺酸激酶結構域組成。
FGFR1、FGFR2及FGFR3各具有2種主要之經替代性剪接之同功異型物，命名為IIIb及IIIc。此等同功異型物不同之處在於處於IgD3之第二部分中之約50個胺基酸，且具有不同之組織分布及配位體特異性。一般而言，IIIb同功異型物可見於上皮細胞中，而IIIc表現於間葉細胞中。在FGFR與硫酸乙醯肝素蛋白聚糖協同結合FGF後，FGFR二聚且在特定酪胺酸殘基處經磷酸化。此促成關鍵接附蛋白(諸如FGFR受質2α(FRS2α))之募集，引起多個信號傳導級聯活化，包括有絲***原活化之蛋白激酶(MAPK)及PI3K-AKT路徑(1、3、4)。因此，FGF及其同源受體以情況依賴性方式調控各種細胞過程，包括增殖、分化、遷移及存活。
特定人類惡性病中涉及異常活化之FGFR(1、5)。詳言之，在約15%至20%之多發性骨髓瘤患者中出現t(4;14)(p16.3;q32)染色體易位，引起FGFR3過度表現且該染色體易位與較短總存活期相關(6-9)。FGFR3亦涉及於在培養物中賦予骨髓瘤細胞株以化學抗性(10)，此與t(4;14)+患者對習知化學治療之不良臨床反應相一致(8)。以突變方式活化之FGFR3的過度表現足以在造血細胞及纖維母細胞(11-14、15)、轉殖基因小鼠模型(16)及鼠類骨髓移植模型(16、17)中誘導致癌轉型。因此，已提議將FGFR3作為多發性骨髓瘤之潛在治療標靶。實際上，若干靶向FGFR之小分子抑制劑已在培養物中及小鼠模型中表現針對FGFR3陽性骨髓瘤細胞之細胞毒性，但其對FGFR3不具選擇性且對某些其他激酶具有交叉抑制活性(18-22)。
已證明FGFR3亦在大部分膀胱癌中過度表現(23、24)。此外，已在60%至70%之乳頭狀膀胱癌及16%至20%肌層侵襲性膀胱癌中鑑別出FGFR3中之體細胞活化之突變(24、25)。在細胞培養實驗中，RNA干擾(11、26)或FGFR3單鏈Fv抗體片段抑制膀胱癌細胞增殖(27)。新近研究表明FGFR3抗體-毒素結合物經由FGFR3介導之向腫瘤中傳遞毒素來削弱膀胱癌細胞株之異種移植物生長(28)。然而，FGFR3信號傳導實際上是否為膀胱腫瘤活體內生長之致癌驅動物仍不清楚。此外，尚未基於活體內模型確定在膀胱癌中靶向FGFR3之治療潛力。關於FGFR3及抗FGFR3抗體之出版物包括美國專利公開案第2005/0147612號；Rauchenberger等人，J Biol Chem 278(40):38194-38205(2003)；WO 2006/048877；Martinez-Torrecuadrada等人，(2008) Mol Cancer Ther 7(4): 862-873；WO 2007/144893；Trudel等人，(2006) 107(10): 4039-4046；Martinez-Torrecuadrada等人，(2005) Clin Cancer Res 11(17): 6280-6290；Gomez-Roman等人，(2005) Clin Cancer Res 11:459-465；Direnzo,R等人，(2007) Proceedings of AACR Annual Meeting，摘要第2080號；WO 2010/002862。
顯然，仍需要具有對於開發作為治療劑而言最佳之臨床屬性的藥劑。本文所述之本發明滿足此需要且提供其他益處。
本文所引用之包括專利申請案及公開案的所有參考文獻皆係以全文引用的方式併入本文中。
本發明係部分基於對多種FGFR3結合劑(諸如抗體及其片段)之鑑別。FGFR3提供重要且有利之治療標靶，且本發明提供基於藥劑與FGFR3之結合的組合物及方法。如本文所述，本發明之FGFR3結合劑提供重要之用於靶向與FGFR3信號傳導路徑之表現及/或活性相關之病理病狀的治療劑及診斷劑。因此，本發明提供與FGFR3結合有關之方法、組合物、套組及製品。
本發明提供結合至FGFR3之抗體。在一態樣中，本發明特徵在於結合FGFR3之經分離抗體。在一些實施例中，抗體結合FGFR3 IIIb同功異型物及/或FGFR3 IIIc同功異型物。在一些實施例中，抗體結合突變型FGFR3(例如，FGFR3 IIIb R248C、S249C、G372C、Y375C、K652E中之一或多者及/或FGFR3 IIIc R248C、S249C、G370C、Y373C、K650E中之一或多者)。在一些實施例中，抗體結合單體FGFR3(例如，單體FGFR3 IIIb及/或IIIc同功異型物)。在一些實施例中，抗體諸如藉由相對於二聚FGFR3形式使單體FGFR3形式穩定來促進單體FGFR3形成。
在一態樣中，本發明提供經分離抗FGFR3抗體，其中該抗體之全長IgG形式以1×10-7 或更強之Kd結合人類FGFR3。如此項技術中所公認，配位體對其受體之結合親和力可使用多種檢定中之任一者來測定且以多種定量值表示。因此，在一實施例中，結合親和力可表示為Kd值且反映固有結合親和力(例如，具有降至最低之親和力作用)。一般且較佳，結合親和力於活體外在無細胞配置或細胞相關配置中量測。此項技術中已知之多種檢定(包括本文所述檢定)中之任一者均可用於獲得結合親和力量測，包括例如Biacore、放射免疫檢定(RIA)及ELISA。在一些實施例中，抗體之全長IgG形式以1×10-8 或更強之Kd，以1×10-9 或更強之Kd，或以1×10-10 或更強之Kd結合人類FGFR3。
一般而言，本發明之抗FGFR3抗體為拮抗劑抗體。因此，在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制FGFR3活性(例如，FGFR3-IIIb及/或FGFR3-IIIc活性)。在一些實施例中，抗FGFR3抗體(一般呈二價形式)不具有實質FGFR3促效劑功能。在一些實施例中，抗FGFR3拮抗劑抗體(一般呈二價形式)幾乎不具有或不具有FGFR3促效劑功能。在一實施例中，本發明之抗體(一般呈二價形式)不展現具有統計顯著性之高於本底水準之FGFR3促效劑活性水準。
在一態樣中，抗體與FGFR3結合可抑制受體與另一受體單元二聚，藉以抑制受體活化(至少部分歸因於缺乏受體二聚)。抑制可為直接或間接的。
在一態樣中，本發明提供不具有實質細胞凋亡活性(例如，不誘導例如移行細胞癌細胞或多發性骨髓瘤細胞(諸如包含FGFR3易位(諸如t(4;14)易位)之多發性骨髓瘤細胞)之細胞出現細胞凋亡)的抗FGFR3抗體。在一些實施例中，抗FGFR3抗體幾乎不具有或不具有細胞凋亡功能。在一些實施例中，FGFR3抗體不展現具有統計顯著性之高於本底水準之細胞凋亡功能。
在一態樣中，本發明提供不誘導實質FGFR3下調之抗FGFR3抗體。在一些實施例中，抗FGFR3抗體幾乎不誘導或不誘導受體下調。在一些實施例中，FGFR3抗體不誘導具有統計顯著性之高於本底水準之受體下調。
在一態樣中，本發明提供具有效應功能之抗FGFR3抗體。在一實施例中，效應功能包含抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。在一實施例中，抗FGFR3抗體(在一些實施例中，為裸抗FGFR3抗體)能夠殺死細胞，在一些實施例中，能夠殺死多發性骨髓瘤細胞(例如包含例如t(4;14)易位之易位的多發性骨髓瘤細胞)。在一些實施例中，抗FGFR3抗體能夠殺死表現每個細胞約10,000個FGFR3分子或10,000個以上FGFR3分子(諸如每個細胞約11,000個、約12,000個、約13,000個、約14,000個、約15,000個、約16,000個、約17,000個、約18,000個或18,000個以上FGFR3分子)之細胞。在其他實施例中，該細胞表現每個細胞約2000個、約3000個、約4000個、約5000個、約6000個、約7000個、約8000個或8000個以上FGFR3分子。
在一態樣中，本發明之抗FGFR3抗體抑制組成性FGFR3活性。在一些實施例中，組成性FGFR3活性為配位體依賴性FGFR3組成性活性。在一些實施例中，組成性FGFR3活性為非配位體依賴性組成性FGFR3活性。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制包含對應於FGFR3-IIIbR248C 之突變的FGFR3。如本文所用，術語「包含對應於FGFR3-IIIbR248C 之突變」應理解為涵蓋FGFR3-IIIbR248C 及FGFR3-IIIcR248C 以及其他在對應於FGFR3-IIIb R248之位置處包含R突變為C之突變的FGFR3形式。一般熟習此項技術者應瞭解如何比對FGFR3序列以鑑別各別FGFR3序列之間之相應殘基，例如比對FGFR3-IIIc序列與FGFR3-IIIb序列以識別FGFR3中對應於FGFR3-IIIb中之R248位置的位置。在一些實施例中，抗FGFR3抗體抑制FGFR3-IIIbR248C 及/或FGFR3-IIIcR248C 。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制包含對應於FGFR3-IIIbK652E 之突變的FGFR3。為方便起見，術語「包含對應於FGFR3-IIIbK652E 之突變」應理解為涵蓋FGFR3-IIIbK652E 及FGFR3-IIIcK650E ，以及其他在對應於FGFR3-IIIb K652之位置處包含K突變為E之突變的FGFR3形式。一般熟習此項技術者應瞭解如何比對FGFR3序列以鑑別各別FGFR3序列之間之相應殘基，例如比對FGFR3-IIIc序列與FGFR3-IIIb序列以鑑別FGFR3中對應於FGFR3-IIIb中之K652位置的位置。在一些實施例中，抗FGFR3抗體抑制FGFR3-IIIbK652E 及/或FGFR3-IIIcK650E 。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制包含對應於FGFR3-IIIbS249C 之突變的FGFR3。為方便起見，術語「包含對應於FGFR3-IIIbS249C 之突變」應理解為涵蓋FGFR3-IIIbS249C 及FGFR3-IIIcS249C ，以及其他在對應於FGFR3-IIIb S249之位置處包含S突變為C之突變的FGFR3形式。在一些實施例中，抗FGFR3抗體抑制FGFR3-IIIbS249C 及/或FGFR3-IIIcS249C 。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制包含對應於FGFR3-IIIbG372C 之突變的FGFR3。為方便起見，術語「包含對應於FGFR3-IIIbG372C 之突變」應理解為涵蓋FGFR3-IIIbG372C 及FGFR3-IIIcG370C ，以及其他在對應於FGFR3-IIIb G372之位置處包含G突變為C之突變的FGFR3形式。在一些實施例中，抗FGFR3抗體抑制FGFR3-IIIbG372C 及/或FGFR3-IIIcG370C 。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制包含對應於FGFR3-IIIbY375C 之突變的FGFR3。為方便起見，術語「包含對應於FGFR3-IIIbY375C 之突變」應理解為涵蓋FGFR3-IIIbY375C 及FGFR3-IIIcY373C ，以及其他在對應於FGFR3-IIIb S249之位置處包含S突變為C之突變的FGFR3形式。在一些實施例中，抗FGFR3抗體抑制FGFR3-IIIbY375C 及/或FGFR3-IIIcY373C 。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制(a)FGFR3-IIIbK652E 及(b)FGFR3-IIIbR248C 、FGFR3-IIIbY375C 、FGFR3-IIIbS249C 及FGFR3-IIIbG372C 中之一或多者。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制(a)FGFR3-IIIcK650E 及(b)FGFR3-IIIcR248C 、FGFR3-IIIcY373C 、FGFR3-IIIcS249C 及FGFR3-IIIcG370C 中之一或多者。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制(a)FGFR3-IIIbR248C 及(b)FGFR3-IIIbK652E 、FGFR3-IIIbY375C 、FGFR3-IIIbS249C 及FGFR3-IIIbG372C 中之一或多者。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制(a)FGFR3-IIIcR248C 及(b)FGFR3-IIIcK650E 、FGFR3-IIIcY373C 、FGFR3-IIIcS249C 及FGFR3-IIIcG370C 中之一或多者。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制(a)FGFR3-IIIbG372C 及(b)FGFR3-IIIbK652E 、FGFR3-IIIbY375C 、FGFR3-IIIbS249C 及FGFR3-IIIbR248C 中之一或多者。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制(a)FGFR3-IIIcG370C 及(b)FGFR3-IIIcK650E 、FGFR3-IIIcY373C 、FGFR3-IIIcS249C 及FGFR3-IIIcR248C 中之一或多者。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制FGFR3-IIIbR248C 、FGFR3-IIIbK652E 、FGFR3-IIIbY375C 、FGFR3-IIIbS249C 及FGFR3-IIIbG372C 。
在一態樣中，抗FGFR3抗體抑制FGFR3-IIIcR248C 、FGFR3-IIIcK650E 、FGFR3-IIIcY373C 、FGFR3-IIIcS249C 及FGFR3-IIIcG370C 。
在一態樣中，本發明提供經分離抗FGFR3抗體，其包含：
(a)至少1個、2個、3個、4個或5個選自以下之高變區(HVR)序列：
(i)　HVR-L1，其包含序列A1-A11，其中A1-A11為RASQDVDTSLA(SEQ ID NO:87)，
(ii)　HVR-L2，其包含序列B1-B7，其中B1-B7為SASFLYS(SEQ ID NO:88)，
(iii) HVR-L3，其包含序列C1-C9，其中C1-C9為QQSTGHPQT(SEQ ID NO:89)，
(iv) HVR-H1，其包含序列D1-D10，其中D1-D10為GFTFTSTGIS(SEQ ID NO:84)，
(v)　HVR-H2，其包含序列E1-E18，其中E1-E18為GRIYPTSGSTNYADSVKG(SEQ ID NO:85)，及
(vi) HVR-H3，其包含序列F1-F20，其中F1-F20為ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQ ID NO:86)；以及
(b)至少1個變異型HVR，其中該變異型HVR序列包含對SEQ ID NO:1-18、48-131及140-145所述之序列之至少一個殘基(至少2個殘基，至少3個或3個以上殘基)的修飾。該修飾宜為取代、***或缺失。
在一些實施例中，HVR-L1變異體在下列位置之任何組合中包含1-6個(1、2、3、4、5或6個)取代：A5(V或D)、A6(V或I)、A7(D、E或S)、A8(T或I)、A9(A或S)及A10(V或L)。在一些實施例中，HVR-L2變異體在下列位置之任何組合中包含1-2個(1或2個)取代：B1(S或G)、B4(F或S或T)及B6(A或Y)。在一些實施例中，HVR-L3變異體在下列位置之任何組合中包含1-6個(1、2、3、4、5或6個)取代：C3(G或S或T)、C4(T或Y或A)、C5(G或S或T或A)、C6(A或H或D或T或N)、C7(Q或P或S)及C8(S或Y或L或P或Q)。在一些實施例中，HVR-H1變異體在下列位置之任何組合中包含1-3個(1、2或3個)取代：D3(S或T)、D5(W或Y或S或T)、D6(S或G或T)。在一些實施例中，HVR-H2變異體在下列位置之任何組合中包含1-6個(1、2、3、4、5或6個)取代：E2(R或S)、E6(Y或A或L或S或T)、E7(A或Q或D或G或Y或S或N或F)、E8(A或D或G)、E9(T或S)、E10(K或F或T或S)、E11(Y或H或N或I)。
在一態樣中，本發明提供經分離抗FGFR3抗體，其包含：
(a)至少1個、2個、3個、4個或5個選自以下之高變區(HVR)序列：
(i)　包含序列RASQX1 X2 X3 X4 X5 X6 A之HVR-L1，其中X1 為V或D，X2 為V或I，X3 為D、E或S，X4 為T或I，X5 為A或S，及X6 為V或L(SEQ ID NO:146)，
(ii)　包含序列X1 ASFLX2 S之HVR-L2，其中X1 為S或G及X2 為A或Y(SEQ ID NO:147)，
(iii)　包含序列QQX1 X2 X3 X4 X5 X6 T之HVR-L3，其中X1 為G、S或T，X2 為T、Y或A，X3 為G、S、T或A，X4 為A、H、D、T或N，X5 為Q、P或S，X6 為S、Y、L、P或Q(SEQ ID NO:148)，
(iv)　包含序列GFX1 FX2 X3 TGIS之HVR-H1，其中X1 為S或T，X2 為W、Y、S或T，X3 為S、G或T(SEQ ID NO:149)，
(v)　包含序列GRIYPX1 X2 X3 X4 X5 X6 YADSVKG之HVR-H2，其中X1 為Y、A、L、S或T，X2 為A、Q、D、G、Y、S、N或F，X3 為A、D或G，X4 為T或S，X5 為K、F、T或S，X6 為Y、H、N或I(SEQ ID NO:150)，及
(vi)　包含序列ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQ ID NO:151)之HVR-H3。
在一些實施例中，HVR-L1包含序列RASQX1 VX2 X3 X4 VA，其中X1 為V或D，X2 為D、E或S，X3 為T或I，X4 為A或S(SEQ ID NO:152)。在一些實施例中，HVR-L3包含序列QQX1 X2 X3 X4 X5 X6 T，其中X1 為S、G或T，X2 為Y、T或A，X3 為T或G，X4 為T、H或N，X5 為P或S，X6 為P、Q、Y或L(SEQ ID NO:153)。在一些實施例中，HVR-H2包含序列GRIYPX1 X2 GSTX3 YADSVKG，其中X1 為T或L，X2 為N、Y、S、G、A或Q，X3 為N或H(SEQ ID NO:154)。
在另一態樣中，本發明特徵在於經分離抗FGFR3抗體，其包含1、2、3、4、5或6個HVR，其中各HVR包含選自以下之序列、由選自以下之序列組成或基本上由選自以下之序列組成：SEQ ID NO:1-18、48-131及140-145，且其中SEQ ID NO:1、7、13、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126或143對應於HVR-H1，SEQ ID NO:2、8、14、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127或144對應於HVR-H2，SEQ ID NO:3、9、15、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128或145對應於HVR-H3，SEQ ID NO:4、10、16、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129或140對應於HVR-L1，SEQ ID NO:5、11、17、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130或141對應於HVR-L2，且SEQ ID NO:6、12、18、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131或142對應於HVR-L3。
在一態樣中，本發明提供包含HVR-H1之抗FGFR3抗體，該HVR-H1包含SEQ ID NO:1、7、13、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126或143之序列。
在一態樣中，本發明提供包含HVR-H2之抗FGFR3抗體，該HVR-H2包含SEQ ID NO:2、8、14、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127或144之序列。
在一態樣中，本發明提供包含HVR-H3之抗FGFR3抗體，該HVR-H3包含SEQ ID NO:3、9、15、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128或145之序列。
在一態樣中，本發明提供包含HVR-L1區之抗FGFR3抗體，該HVR-L1區包含SEQ ID NO:4、10、16、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129或140之序列。
在一態樣中，本發明提供包含HVR-L2區之抗FGFR3抗體，該HVR-L2區包含SEQ ID NO:5、11、17、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130或141之序列。
在一態樣中，本發明提供包含HVR-L3區之抗FGFR3抗體，該HVR-L3區包含SEQ ID NO:6、12、18、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131或142之序列。
在一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:1、2、3；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序含有SEQ ID NO:4、5、6。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:7、8、9；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:10、11、12。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:13、14、15；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:16、17、18。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:48、49、50；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:51、52、53。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:54、55、56；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:57、58、59。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:60、62、63；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:63、64、65。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:66、67、68；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO：69、70、71。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO：72、73、74；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO：75、76、77。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO：78、79、80；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO：81、82、83。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO：84、85、86；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO：87、88、89。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO：90、91、92；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO：93、94、95。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO：96、97、98；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:99、100、101。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:102、103、104；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:105、106、107。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:108、109、110；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:111、112、113。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:114、115、116；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:117、118、119。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:120、121、122；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:123、124、125。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:126、127、128；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:129、130、131。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包含:重鏈可變區，該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:140、141、142；及/或輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中各者按順序包含SEQ ID NO:143、144、145。
如圖1中所指示關於個別HVR(亦即H1、H2或H3)，對SEQ ID NO:1-18、48-131及140-145之胺基酸序列進行編號，該編號與如下文所述之Kabat編號系統相一致。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:132之重鏈可變區，及輕鏈可變區。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:133之輕鏈可變區，及重鏈可變區。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:132之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:133之輕鏈可變區。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:134之重鏈可變區，及輕鏈可變區。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:135之輕鏈可變區，及重鏈可變區。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:139之輕鏈可變區，及重鏈可變區。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:134之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:135之輕鏈可變區。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:136之重鏈可變區，及輕鏈可變區。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:137之輕鏈可變區，及重鏈可變區。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:136之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:137之輕鏈可變區。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:138之重鏈可變區，及輕鏈可變區。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:139之輕鏈可變區，及重鏈可變區。
在另一態樣中，抗FGFR3抗體包括包含SEQ ID NO:138之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:139之輕鏈可變區。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗FGFR3抗體：至少1個、2個、3個、4個、5個及/或6個選自由以下組成之群的高變區(HVR)序列：
(a)包含序列SASSSVSYMH(SEQ ID NO:155)、SASSSVSYMH(SEQ ID NO:156)或LASQTIGTWLA(SEQ ID NO:157)之HVR-L1，
(b)包含序列TWIYDTSILAS(SEQ ID NO:158)、RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO:159)或LLIYAATSLAD(SEQ ID NO:160)之HVR-L2，
(c)包含序列QQWTSNPLT(SEQ ID NO:161)、QQWSSYPPT(SEQ ID NO:162)或QQLYSPPWT(SEQ ID NO:163)之HVR-L3，
(d)　包含序列GYSFTDYNMY(SEQ ID NO:164)、GYVFTHYNMY(SEQ ID NO:165)或GYAFTSYNMY(SEQ ID NO:166)之HVR-H1，
(e)　包含序列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO:167)、WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO:168)或WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO:169)之HVR-H2，及
(f)　包含序列ASPNYYDSSPFAY(SEQ ID NO:170)、ARGQGPDFDV(SEQ ID NO:171)或ARWGDYDVGAMDY(SEQ ID NO:172)之HVR-H3。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗FGFR3抗體：至少1個、2個、3個、4個、5個及/或6個選自由以下組成之群的高變區(HVR)序列：
(a)　包含序列SASSSVSYMH(SEQ ID NO:155)之HVR-L1，
(b)　包含序列TWIYDTSILAS(SEQ ID NO:158)之HVR-L2，
(c)　包含序列QQWTSNPLT(SEQ ID NO:161)之HVR-L3，
(d)　包含序列GYSFTDYNMY(SEQ ID NO:164)之HVR-H1，
(e)　包含序列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO:167)之HVR-H2，及
(f)　包含序列ASPNYYDSSPFAY(SEQ ID NO:170)之HVR-H3。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗FGFR3抗體：至少1個、2個、3個、4個、5個及/或6個選自由以下組成之群的高變區(HVR)序列：
(a)　包含序列SASSSVSYMH(SEQ ID NO:156)之HVR-L1，
(b)　包含序列RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO:159)之HVR-L2，
(c)　包含序列QQWSSYPPT(SEQ ID NO:162)之HVR-L3，
(d)　包含序列GYVFTHYNMY(SEQ ID NO:165)之HVR-H1，
(e)　包含序列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO:168)之HVR-H2，及
(f)　包含序列ARGQGPDFDV(SEQ ID NO:171)之HVR-H3。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗FGFR3抗體：至少1個、2個、3個、4個、5個及/或6個選自由以下組成之群的高變區(HVR)序列：
(a)　包含序列LASQTIGTWLA(SEQ ID NO:157)之HVR-L1，
(b)　包含序列LLIYAATSLAD(SEQ ID NO:160)之HVR-L2，
(c)　包含序列QQLYSPPWT(SEQ ID NO:163)之HVR-L3，
(d)　包含序列GYAFTSYNMY(SEQ ID NO:166)之HVR-H1，
(e)　包含序列WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO:169)之HVR-H2，及
(f)　包含序列ARWGDYDVGAMDY(SEQ ID NO:172)之HVR-H3。
在一態樣中，本發明提供抗FGFR3抗體，其包含：(a)輕鏈，其包含(i)包含序列SASSSVSYMH(SEQ ID NO:155)之HVR-L1，(ii)包含序列TWIYDTSILAS(SEQ ID NO:158)之HVR-L2，及(iii)包含序列QQWTSNPLT(SEQ ID NO:161)之HVR-L3；及/或(b)重鏈，其包含(i)包含序列GYSFTDYNMY(SEQ ID NO：164)之HVR-H1，(ii)包含序列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO：167)之HVR-H2，及(iii)包含序列ASPNYYDSSPFAY(SEQ ID NO：170)之HVR-H3。
在一態樣中，本發明提供抗FGFR3抗體，其包含：(a)輕鏈，其包含(i)包含序列SASSSVSYMH(SEQ ID NO：156)之HVR-L1，(ii)包含序列RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO：159)之HVR-L2，及(iii)包含序列QQWSSYPPT(SEQ ID NO：162)之HVR-L3；及/或(b)重鏈，其包含(i)包含序列GYVFTHYNMY(SEQ ID NO：165)之HVR-H1，(ii)包含序列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO：168)之HVR-H2，及(iii)包含序列ARGQGPDFDV(SEQ ID NO：171)之HVR-H3。
在一態樣中，本發明提供抗FGFR3抗體，其包含： (a)輕鏈，其包含(i)包含序列LASQTIGTWLA(SEQ IDNO：157)之HVR-L1，(ii)包含序列LLIYAATSLAD(SEQ IDNO：160)之HVR-L2，及(iii)包含序列QQLYSPPWT(SEQ IDNO：163)之HVR-L3；及/或(b)重鏈，其包含(i)包含序列GYAFTSYNMY(SEQ ID NO：166)之HVR-H1，(ii)包含序列WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO：169)之HVR-H2，及(iii)包含序列ARWGDYDVGAMDY(SEQ ID NO：172)之HVR-H3。本發明之抗體之一些實施例包含人類化4D5抗體(huMAb4D5-8)(，Genentech，Inc. ，South San Francisco，CA，USA)(亦參見美國專利第6,407,213號及Lee等人，J. Mol. Biol.(2004)，340(5):1073-1093)中如以下SEQ ID NO:173所述之輕鏈可變域。
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr　Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO:173)(對HVR殘基加下劃線)。
在一實施例中，huMAb4D5-8輕鏈可變域序列在位置30、66及91中之一或多個位置處(如上文分別以粗體/斜體所指示之Asn、Arg及His)經修飾。在一特定實施例中，經修飾之huMAb4D5-8序列包含位置30中之Ser、位置66中之Gly及/或位置91中之Ser。因此，在一實施例中，本發明之抗體包括包含以下SEQ ID NO:174中所述之序列的輕鏈可變域:
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ASp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr CySGln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO:174)(對HVR殘基加下劃線)。
關於huMAb4D5-8經取代之殘基係以粗體/斜體指示。
本發明之抗體可包含任何適合之構架可變域序列，只要實質上保留與FGFR3之結合活性即可。舉例而言，在一些實施例中，本發明之抗體包含人類子群III重鏈構架共同序列。在此等抗體之一實施例中，構架共同序列在位置71、73及/或78處包含取代。在此等抗體之一些實施例中，位置71為A、位置73為T及/或位置78為A。在一實施例中，此等抗體包含huMAb4D5-8(，Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)(亦參見美國專利第6,407,213號及第5,821,337號，及Lee等人，J. Mol. Biol.(2004)，340(5):1073-1093)之重鏈可變域構架序列。在一實施例中，此等抗體進一步包含人類κI輕鏈構架共同序列。在一特定實施例中，此等抗體包含如美國專利第6,407,213號及第5,821,337號中所述之huMAb4D5-8之輕鏈HVR序列。在一實施例中，此等抗體包含huMAb4D5-8(，Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)(亦參見美國專利第6,407,213號及第5,821,337號，及Lee等人，J. Mol. Biol.(2004)，340(5):1073-1093)之輕鏈可變域序列。
在一實施例中，本發明之抗體包含重鏈可變域，其中構架序列包含SEQ ID NO:19及203-205、20及206-208、21及209-211、22及212-214、23及215-217、24及218-220、25及221-223、26及224-226、27及227-229、28及230-232、29及233-235、30及236-238、31及239-241、32及242-244、33及245-247、34及248-250、35及251-253、36及254-256，及/或37及257-259之序列，且HVR H1、H2及H3序列分別為SEQ ID NO:13、14及/或15。在另一實施例中，構架序列包含SEQ ID NO:19及203-205、20及206-208、21及209-211、22及212-214、23及215-217、24及218-220、25及221-223、26及224-226、27及227-229、28及230-232、29及233-235、30及236-238、31及239-241、32及242-244、33及245-247、34及248-250、35及251-253、36及254-256，及/或37及257-259之序列，且HVR H1、H2及H3序列分別為SEQ ID NO:48、49及/或50。在另一實施例中，構架序列包含SEQ ID NO:19及203-205、20及206-208、21及209-211、22及212-214、23及215-217、24及218-220、25及221-223、26及224-226、27及227-229、28及230-232、29及233-235、30及236-238、31及239-241、32及242-244、33及245-247、34及248-250、35及251-253、36及254-256，及/或37及257-259之序列，且HVR H1、H2及H3序列分別為SEQ ID NO:84、85及/或86。在另一實施例中，構架序列包含SEQ ID NO:19及203-205、20及206-208、21及209-211、22及212-214、23及215-217、24及218-220、25及221-223、26及224-226、27及227-229、28及230-232、29及233-235、30及236-238、31及239-241、32及242-244、33及245-247、34及248-250、35及251-253、36及254-256，及/或37及257-259之序列，且HVR H1、H2及H3序列分別為SEQ ID NO:108、109及I或110。
在一特定實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域，其中構架序列包含SEQ ID NO:38及260-262、39及263-265、40及266-268，及/或41及269-271之序列，且HVR L1、L2及L3序列分別為SEQ ID NO:16、17及I或18。在另一實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域，其中構架序列包含SEQ ID NO:38及260-262、39及263-265、40及266-268，及/或41及269-271之序列，且HVR L1、L2及L3序列分別為SEQ ID NO:51、52及/或53。在另一實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域，其中構架序列包含SEQ ID NO:38及260-262、39及263-265、40及266-268，及/或41及269-271之序列，且HVR L1、L2及L3序列分別為SEQ ID NO:87、88及/或89。在另一實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域，其中構架序列包含SEQ ID NO:38及260-262、39及263-265、40及266-268，及/或41及269-271之序列，且HVR L1、L2及L3序列分別為SEQ ID NO:111、112及/或113。
在另一態樣中，本發明之抗體包含:包含SEQ ID NO:132之序列的重鏈可變域，及/或包含SEQ ID NO:133之序列的輕鏈可變域。在另一態樣中，本發明之抗體包含:包含SEQ ID NO:134之序列的重鏈可變域，及/或包含SEQ ID NO：135之序列的輕鏈可變域。在另一態樣中，本發明之抗體包含：包含SEQ ID NO：136之序列的重鏈可變域，及/或包含SEQ ID NO：137之序列的輕鏈可變域。在另一態樣中，本發明之抗體包含：包含SEQ ID NO：138之序列的重鏈可變域，及/或包含SEQ ID NO：139之序列的輕鏈可變域。
在一態樣中，本發明提供結合包含下列胺基酸序列，基本上由下列胺基酸序列組成或由下列胺基酸序列組成之多肽的抗FGFR3抗體：LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO：179)及/或SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO：180)。
在一些實施例中，抗體結合包含以下、基本上由以下組成或由以下組成之多肽：成熟人類FGFR3胺基酸序列之胺基酸編號164-178及/或269-283。
在一實施例中，本發明之抗FGFR3抗體特異性結合與序列 LAVPAANTVRFRCPA(SEQ　ID　NO：179)及/或SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ　ID　NO：180)具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%序列一致性或類似性的胺基酸序列。
在一態樣中，本發明之抗FGFR3抗體結合至FGFR3 IIIb多肽之殘基154、155、158、159、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、177、202、205、207、210、212、214、216、217、241、246、247、248、278、279、280、281、282、283、314、315、316、317及/或318中之至少一個、兩個、三個、四個或任何數目直至所有之殘基，或FGFR3 IIIc多肽之等效殘基。一般熟習此項技術者應瞭解如何比對FGFR3序列以鑑別各別FGFR3序列之間之相應殘基。兩個或兩個以上殘基之組合可包括FGFR3 IIIb多肽之殘基154、155、158、159、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、177、202、205、207、210、212、214、216、217、241、246、247、248、278、279、280、281、282、283、314、315、316、317及/或318中之任一者，或FGFR3 IIIc多肽之等效殘基。在一些實施例中，抗FGFR3抗體結合至FGFR3 IIIb多肽之殘基158、159、169、170、171、173、175、205、207及/或315中之至少一個、兩個、三個、四個或任何數目直至所有之殘基，或FGFR3 IIIc多肽之等效殘基。在一些實施例中，抗FGFR3抗體結合至FGFR3 IIIb多肽之殘基158、170、171、173、175及/或315中之至少一個、兩個、三個、四個或任何數目直至所有之殘基，或FGFR3 IIIc多肽之等效殘基。
在一態樣中，本發明提供與上述抗體中之任一者競爭結合至FGFR3的抗FGFR3抗體。在一態樣中，本發明提供結合至FGFR3上與上述抗體中之任一者所結合之抗原決定基相同或類似之抗原決定基的抗FGFR3抗體。
如此項技術中所知，且如下文更詳細描述，界定抗體高變區之胺基酸位置/邊界可視上下文及此項技術中已知之各種定義(如下所述)而有所不同。可變域內之一些位置可視作雜交高變位置，因為此等位置按一組準則可視作處於高變區內，而按另一組不同準則可視作處於高變區之外。此等位置中之一或多者亦可見於擴展高變區內(如下文進一步定義)。
在一些實施例中，該抗體為單株抗體。在其他實施例中，該抗體為多株抗體。在一些實施例中，該抗體係選自由嵌合抗體、親和力成熟抗體、人類化抗體及人類抗體組成之群。在某些實施例中，抗體為抗體片段。在一些實施例中，抗體為Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 或scFv。
在一些實施例中，FGFR3抗體為包含Fc區之單臂抗體(亦即重鏈可變域及輕鏈可變域形成單一抗原結合臂)，其中該Fc區包含第一及第二Fc多肽，其中該第一及第二Fc多肽以複合物形式存在且形成Fc區，使該抗體片段之穩定性相較於包含該抗原結合臂之Fab分子增加。參見例如WO 2006/015371。
在一個實施例中，該抗體為嵌合抗體，例如包含非人類供體之抗原結合序列移植至異源非人類、人類或人類化序列(例如構架及/或恆定域序列)之抗體。在一個實施例中，非人類供體為小鼠。在另一實施例中，抗原結合序列為合成的，例如藉由突變誘發(例如噬菌體呈現篩選等)獲得。在一個特定實施例中，本發明之嵌合抗體具有鼠類V區及人類C區。在一個實施例中，鼠類輕鏈V區係融合至人類κ輕鏈。在另一實施例中，鼠類重鏈V區係融合至人類IgG1 C區。
本發明之人類化抗體包括在構架區(FR)中具有胺基酸取代之抗體及在所移植之CDRs中有改變之親和力成熟變異體。CDR或FR中經取代之胺基酸不限於供體或接受體抗體中所存在之胺基酸。在其他實施例中，本發明之抗體進一步在Fc區中包含胺基酸殘基之改變，使得效應功能改良，包括CDC及/或ADCC功能及B細胞殺死增強。本發明之其他抗體包括具有改良穩定性之特定改變的抗體。在其他實施例中，本發明之抗體在Fc區中包含胺基酸殘基之改變，使得效應功能減弱，例如CDC及/或ADCC功能減弱及/或B細胞殺死減弱。在一些實施例中，本發明之抗體特徵在於與人類補體因子Clq及/或自然殺手(NK)細胞上之人類Fc受體之結合減少(諸如不結合)。在一些實施例中，本發明之抗體特徵在於與人類FcγRI、FcγRIIA及/或FcγRIIIA之結合減少(諸如不結合)。在一些實施例中，本發明之抗體屬於IgG類(例如IgG1或IgG4)且包含至少一個突變在E233、L234、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331及/或P329(根據EU索引編號)中。在一些實施例中，該等抗體包含突變L234A/L235A或D265A/N297A。
當抗體包含Fc區時，可改變與其附接之碳水化合物。舉例而言，具有缺乏岩藻糖之成熟碳水化合物結構附接於抗體Fc區之抗體係於美國專利申請案第US 2003/0157108號(Presta,L.)中描述。亦參見US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。在附接於抗體Fc區之碳水化合物中具有平分型N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)之抗體於WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)及美國專利第6,602,684號(Umana等人)中提及。在附接於抗體Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體係於WO 1997/30087(Patel等人)中報導。關於附接於抗體Fc區之碳水化合物經改變的抗體，亦參見WO 1998/58964(Raju，S.)及WO 1999/22764(Raju，S.)。關於具有經修飾之糖基化的抗原結合分子，亦參見US 2005/0123546(Umana等人)。在一態樣中，本發明提供包含本文所提供之抗原結合序列中之任一者的FGFR3結合多肽，其中該等FGFR3結合多肽特異性結合至FGFR3，例如人類及/或短尾獼猴及/或小鼠FGFR3。
本發明之抗體結合(諸如特異性結合)FGFR3(例如FGFR3-IIIb及/或FGFR3-IIIc)，且在一些實施例中，其可調節(例如抑制)FGFR3信號傳導之一或多個方面(諸如FGFR3磷酸化)；及/或破壞任何生物學上相關之FGFR3及/或FGFR3配位體生物路徑；及/或治療及/或預防腫瘤、細胞增殖性病症或癌症；及/或治療或預防與FGFR3表現及/或活性(諸如FGFR3表現及/或活性增強)相關之病症。在一些實施例中，FGFR3抗體特異性結合至由FGFR3(例如人類或小鼠FGFR3)組成或基本上由其組成之多肽。在一些實施例中，抗體以1×10-7 M或更強之Kd特異性結合FGFR3。
在一些實施例中，本發明之抗FGFR3抗體不為美國專利公開案第2005/0147612號中所述之抗FGFR3抗體(例如抗體MSPRO2、MSPRO12、MSPRO59、MSPRO11、MSPRO21、MSPRO24、MSPRO26、MSPRO28、MSPRO29、MSPRO43、MSPRO55) ； Rauchenberger等人，J Biol Chem 278(40)：38194-38205(2003)中所述之抗體；PCT公開案第WO 2006/048877號中所述之抗體(例如抗體PRO-001)；Martinez-Torrecuadrada等人，Mol Cancer Ther (2008) 7(4)： 862-873中所述之抗體(例如scFvαFGFR3　3C) ； Direnzo，R等人，(2007) Proceedings of AACR Annual Meeting，摘要第2080號中所述之抗體(例如D11)；或WO 2010/002862中所述之抗體(例如抗體15D8、27H2、4E7、2G4、20B4)。
在一態樣中，本發明提供包含一或多種本發明抗體及載劑的組合物。在一實施例中，該載劑為醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明提供編碼本發明之FGFR3抗體之核酸。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明之核酸的載體。
在另一態樣中，本發明提供包含一或多種本發明核酸及載劑的組合物。在一實施例中，該載劑為醫藥學上可接受之載劑。
在一態樣中，本發明提供包含本發明之核酸或載體的宿主細胞。載體可為任何類型，例如重組載體，諸如表現載體。可使用多種宿主細胞中之任一者。在一實施例中，宿主細胞為原核細胞，例如大腸桿菌。在另一實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
在另一態樣中，本發明提供製備本發明之抗體的方法。舉例而言，本發明提供製備抗FGFR3抗體(其如本文所定義包括全長抗體及其片段)之方法，該方法包含在適合之宿主細胞中表現編碼該抗體之本發明重組載體，及回收該抗體。在一些實施例中，該方法包含培養包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞以使核酸表現。在一些實施例中，該方法進一步包含自宿主細胞培養物中回收抗體。在一些實施例中，自宿主細胞培養基中回收抗體。在一些實施例中，該方法進一步包含將經回收之抗體與醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或製備包含人類化抗體之醫藥調配物之載劑組合。
在一態樣中，本發明提供一種製品，其包含一容器及該容器內所含之組合物，其中該組合物包含一或多種本發明FGFR3抗體。在一實施例中，該組合物包含本發明之核酸。在另一實施例中，包含抗體之組合物進一步包含載劑，該載劑在一些實施例中為醫藥學上可接受之載劑。在一實施例中，本發明之製品進一步包含向個體投與組合物(例如抗體)之說明書(諸如本文所述之任何方法的說明書)。
在另一態樣中，本發明提供一種套組，其包含：包含組合物的第一容器，該組合物包含一或多種本發明抗FGFR3抗體；及包含緩衝液之第二容器。在一實施例中，該緩衝液為醫藥學上可接受之緩衝液。在一實施例中，包含抗體之組合物進一步包含載劑，該載劑在一些實施例中為醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，套組進一步包含向個體投與組合物(例如抗體)之說明書。
在另一態樣中，本發明提供用作藥劑之本發明抗FGFR3抗體。
在另一態樣中，本發明提供用於治療或預防諸如與FGFR3活化及/或表現(在一些實施例中，為過度表現)相關之病理病狀之病症的本發明抗FGFR3抗體。在一些實施例中，該病症為癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症。在一些實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症為多發性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細胞癌)、乳癌或肝癌。
在另一態樣中，本發明提供用於治療或預防諸如骨骼病症之病症的本發明抗FGFR3抗體。在一些實施例中，該病症為軟骨發育不全、軟骨生成減退、侏儒症、致死性骨發育不全(thantophoric dysplasia，TD；臨床形式TD1及TDII)或顱骨聯合症候群。
在另一態樣中，本發明提供用於降低細胞增殖之本發明抗FGFR3抗體。
在另一態樣中，本發明提供用於殺死細胞之本發明抗FGFR3抗體。在一些實施例中，該細胞為多發性骨髓瘤細胞。在一些實施例中，藉由ADCC殺死細胞。在一些實施例中，抗體為裸抗體。在一些實施例中，該細胞過度表現FGFR3。
在另一態樣中，本發明提供用於消除(depleting)諸如多發性骨髓瘤細胞之細胞的本發明抗FGFR3抗體。在一些實施例中，藉由ADCC殺死細胞。在一些實施例中，抗體為裸抗體。在一些實施例中，該細胞過度表現FGFR3。
在另一態樣中，本發明提供本發明之抗FGFR3抗體之用途，其係用於製備治療性及/或預防性處理諸如與FGFR3活化及/或表現(在一些實施例中，為過度表現)相關之病理病狀之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症。在一些實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症為多發性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細胞癌)、乳癌或肝癌。在一些實施例中，該病症為骨骼病症，例如軟骨發育不全、軟骨生成減退、侏儒症、致死性骨發育不全(TD；臨床形式TD1及TDII)或顱骨聯合症候群。
在一態樣中，本發明提供本發明之核酸之用途，其係用於製備治療性及/或預防性處理諸如與FGFR3活化及/或表現(在一些實施例中，為過度表現)相關之病理病狀之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症。在一些實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症為多發性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細胞癌)、乳癌或肝癌。在一些實施例中，該病症為骨骼病症，例如軟骨發育不全、軟骨生成減退、侏儒症、致死性骨發育不全(TD；臨床形式TD1及TDII)或顱骨聯合症候群。
在另一態樣中，本發明提供本發明之表現載體之用途，其係用於製備治療性及/或預防性處理諸如與FGFR3活化及/或表現(在一些實施例中，為過度表現)相關之病理病狀之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症。在一些實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症為多發性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細胞癌)、乳癌或肝癌。在一些實施例中，該病症為骨骼病症，例如軟骨發育不全、軟骨生成減退、侏儒症、致死性骨發育不全(TD；臨床形式TD1及TDII)或顱骨聯合症候群。
在另一態樣中，本發明提供本發明之宿主細胞之用途，其係用於製備治療性及/或預防性處理諸如與FGFR3活化及/或表現(在一些實施例中，為過度表現)相關之病理病狀之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症。在一些實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症為多發性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細胞癌)、乳癌或肝癌。在一些實施例中，該病症為骨骼病症，例如軟骨發育不全、軟骨生成減退、侏儒症、致死性骨發育不全(TD；臨床形式TD1及TDII)或顱骨聯合症候群。
在另一態樣中，本發明提供本發明之製品之用途，其係用於製備治療性及/或預防性處理諸如與FGFR3活化及/或表現(在一些實施例中，為過度表現)相關之病理病狀之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症。在一些實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症為多發性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細胞癌)、乳癌或肝癌。在一些實施例中，該病症為骨骼病症，例如軟骨發育不全、軟骨生成減退、侏儒症、致死性骨發育不全(TD；臨床形式TD1及TDII)或顱骨聯合症候群。
在一態樣中，本發明亦提供本發明之套組之用途，其係用於製備治療性及/或預防性處理諸如與FGFR3活化及/或表現(在一些實施例中，為過度表現)相關之病理病狀之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症。在一些實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症為多發性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細胞癌)、乳癌或肝癌。在一些實施例中，該病症為骨骼病症，例如軟骨發育不全、軟骨生成減退、侏儒症、致死性骨發育不全(TD；臨床形式TD1及TDII)或顱骨聯合症候群。
在另一態樣中，本發明提供本發明之抗FGFR3抗體用於製備抑制細胞增殖之藥劑的用途。在另一態樣中，本發明提供本發明之抗FGFR3抗體用於製備殺死細胞之藥劑的用途。在一些實施例中，該細胞為多發性骨髓瘤細胞。在一些實施例中，藉由ADCC殺死細胞。在一些實施例中，抗體為裸抗體。在一些實施例中，該細胞過度表現FGFR3。
在另一態樣中，本發明提供本發明之抗FGFR3抗體用於製備消除諸如多發性骨髓瘤細胞之細胞之藥劑的用途。在一些實施例中，藉由ADCC殺死細胞。在一些實施例中，抗體為裸抗體。在一些實施例中，該細胞過度表現FGFR3。
本發明提供適用於調節與FGFR3表現及/或信號傳導(諸如表現及/或信號傳導增強，或表現及/或信號傳導不當)相關之病症的方法及組合物。
本發明之方法可用於影響任何適合之病理狀態。例示性病症係描述於本文中且包括選自由以下組成之群的癌症：非小細胞肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、睪丸癌、子宮內膜癌、頭頸部癌症、腦癌(例如神經母細胞瘤或腦膜瘤)、皮膚癌(例如黑素瘤、基底細胞癌或鱗狀細胞癌)、膀胱癌(例如移行細胞癌)、乳癌、胃癌、結腸直腸癌(CRC)、肝細胞癌、子宮頸癌、肺癌、胰臟癌、***癌及血液科惡性病(例如T細胞急性淋巴母細胞白血病(T-ALL)、B細胞急性淋巴母細胞白血病(B-ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B細胞惡性病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)及多發性骨髓瘤)。在一些實施例中，該病症為侵襲性移行細胞癌。在一些實施例中，該病症為多發性骨髓瘤。其他例示性病症包括骨骼病症，諸如軟骨發育不全、軟骨生成減退、侏儒症、致死性骨發育不全(TD；臨床形式TD1及TDII)或顱骨聯合症候群。
在某些實施例中，該癌症表現FGFR3、擴增型FGFR3，易位型FGFR3及/或突變型FGFR3。在某些實施例中，該癌症表現活化之FGFR3。在某些實施例中，該癌症表現易位型FGFR3(例如t(4;14)易位)。在某些實施例中，該癌症表現組成性FGFR3。在一些實施例中，組成性FGFR3在酪胺酸激酶結構域及/或近膜結構域及/或配位體結合域中包含突變。在某些實施例中，該癌症表現非配位體依賴性FGFR3。在一些實施例中，該癌症表現配位體依賴性FGFR3。
在一些實施例中，該癌症表現包含對應於FGFR3-IIIbs248c 之突變的FGFR3。在一些實施例中，該癌症表現FGFR3-IIIbs248 C及/或 FGFR3-IIIcs2 48c 。
在一些實施例中，該癌症表現包含對應於FGFR3-IIIbK652E 之突變的FGFR3。在一些實施例中，該癌症表現FGFR3-IIIbK652E 及/或 FGFR3-IIIcK650E 。
FGFR3包含對應於FGFR3-IIIbs249c 之突變。在一些實施例中，該癌症表現FGFR3-IIIbs249c 及/或FGFR3-IIIcs249c 。
在一態樣中，該癌症表現包含對應於FGFR3-IIIbG372c 之突變的FGFR3。在一些實施例中，該癌症表現FGFR3-IIIbG372c 及/或FGFR3-IIIcG370c 。
在一態樣中，該癌症表現包含對應於FGFR3-IIIbY375c 之突變的FGFR3。在一些實施例中，該癌症表現FGFR3-IIIbY375c 及/或 FGFR3-IIIcY373c 。
在一些實施例中，該癌症表現(a)FGFR3-IIIbK652E 及(b)FGFR3-IIIbR248c 、FGFR3-IIIbY375c 、FGFR3-IIIbs249c 及FGFR3-IIIbG372c 中之一或多者。
在一些實施例中，該癌症表現(a)FGFR3-IIIbR248c 及(b)FGFR3-IIIbK652E 、FGFR3-IIIbY375c 、FGFR3-IIIbs249c 及FGFR3-IIIbG372c 中之一或多者。
在一些實施例中，該癌症表現(a)FGFR3-IIIbG372C 及(b)FGFR3-IIIbK652 E、FGFR3-IIIbY375C 、FGFR3-IIIbS249C 及FGFR3-IIIbR248C 中之一或多者。
在一些實施例中，該癌症表現FGFR3-IIIbR248C 、FGFR3-IIIbK652E 、FGFR3-IIIbY375C 、FGFR3-IIIbS249C 及FGFR3-IIIbG372C 。
在某些實施例中，癌症表現含量相對於對照樣品(例如正常組織樣品)或對照含量增加之磷酸化FGFR3、磷酸化FRS2及/或磷酸化MAPK。
在一些實施例中，該癌症(例如在細胞表面上)表現每個細胞約10,000個FGFR3分子或10,000個以上FGFR3分子(諸如11,000個、12,000個、13,000個、14,000個、15,000個、16,000個、17,000個、18,000個或18,000個以上FGFR3受體)。在一些實施例中,該癌症表現約13000個FGFR3分子。在其他實施例中，該癌症表現約5000個、6000個、7000個、8000個或8000個以上FGFR3分子。在一些實施例中，該癌症表現少於約4000個、3000個、2000個、1000個或1000個以下FGFR3分子。在一些實施例中，該癌症表現少於約1000個FGFR3分子。
在一實施例中，在本發明方法中所靶向之細胞為癌細胞。舉例而言，癌細胞可為選自由以下組成之群的細胞：乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞(例如非小細胞肺癌細胞)、甲狀腺癌細胞、多發性骨髓瘤細胞、睪丸癌細胞、乳頭狀癌細胞、結腸癌細胞、胰臟癌細胞、卵巢癌細胞、子宮頸癌細胞、中樞神經系統癌細胞、骨原性肉瘤細胞、腎癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞(例如移行細胞癌細胞)、胃癌細胞、頭頸部鱗狀癌細胞、黑素瘤細胞、白血病細胞、多發性骨髓瘤細胞(例如包含t(4:14)FGFR3易位之多發性骨髓瘤細胞)及結腸腺瘤細胞。在一實施例中，在本發明方法中所靶向之細胞為過度增殖性及/或增生性細胞。在另一實施例中，在本發明方法中所靶向之細胞為發育不良之細胞。在另一實施例中，在本發明方法中所靶向之細胞為轉移性細胞。
在一態樣中，本發明提供抑制個體體內細胞增殖之方法，該方法包含向該個體投與有效量之抗FGFR3抗體以減少細胞增殖。
在一態樣中，本發明提供在個體體內殺死細胞之方法，該方法包含向該個體投與有效量之抗FGFR3抗體以殺死細胞。在一些實施例中，該細胞為多發性骨髓瘤細胞。在一些實施例中，藉由ADCC殺死細胞。在一些實施例中，抗體為裸抗體。在一些實施例中，該細胞過度表現FGFR3。
在一態樣中，本發明提供在個體體內消除細胞(諸如多發性骨髓瘤細胞)之方法，該方法包含向該個體投與有效量之抗FGFR3抗體以殺死細胞。在一些實施例中，藉由ADCC殺死細胞。在一些實施例中，抗體為裸抗體。在一些實施例中，該細胞過度表現FGFR3。
在一態樣中，本發明提供治療或預防骨骼病症之方法。在一些實施例中，該病症為軟骨發育不全、軟骨生成減退、侏儒症、致死性骨發育不全(TD；臨床形式TD1及TDII)或顱骨聯合症候群。
本發明之方法可進一步包含額外治療步驟。舉例而言，在一實施例中，方法進一步包含使所靶向之細胞及/或組織(例如癌細胞)暴露於輻射治療或化學治療劑之步驟。
在一態樣中，本發明提供包含以下之方法：投與有效量之抗FGFR3抗體與有效量之另一治療劑(諸如抗血管生成劑、另一抗體、化學治療劑、細胞毒性劑、免疫抑制劑、前藥、細胞激素、細胞毒性放射線治療、皮質類固醇、止吐劑、癌症疫苗、鎮痛劑或生長抑制劑)之組合。舉例而言，將抗FGFR3抗體與抗癌劑或抗血管生成劑組合用於治療各種贅生性或非贅生性病狀。在特定實例中，抗FGFR3抗體與以下各物組合使用：萬珂(velcade)、雷利米得(revlimid)、他莫西芬(tamoxifen)、來曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、安美達錠(anastrozole)、伊立替康(irinotecan)、西妥昔單抗(cetuximab)、氟維斯群(fulvestrant)、長春瑞濱(vinorelbine)、貝伐單抗(bevacizumab)、長春新鹼(vincristine)、順鉑(cisplatin)、吉西他濱(gemcitabine)、甲胺喋呤(methotrexate)、長春鹼(vinblastine)、卡鉑(carboplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、培美曲唑(pemetrexed)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、小紅莓(doxorubicin)、硼替佐米(bortezomib)、來那度胺(lenalidomide)、***(dexamethasone)、美法侖(melphalin)、強的松(prednisone)、長春新鹼及/或沙立度胺(thalidomide)。
視待治療之特定癌症適應症，可將本發明之組合治療與諸如化學治療劑之其他治療劑或諸如放射線治療或手術之其他治療組合。多種已知化學治療劑可用於本發明之組合治療中。較佳使用彼等對於治療特定適應症而言標準的化學治療劑。欲用於組合中之各治療劑的劑量或頻率較佳同於或低於在不與其他藥劑一起使用時相應藥劑之劑量或頻率。
在另一態樣中，本發明提供本文所述之任何抗FGFR3抗體，其中該抗FGFR3抗體包含可偵測標記物。在另一態樣中，本發明提供本文所述之任何抗FGFR3抗體與FGFR3之複合物。在一些實施例中，該複合物為活體內或活體外複合物。在一些實施例中，該複合物包含癌細胞。在一些實施例中，抗FGFR3抗體經可偵測標記。
本發明於本文中提供適用於例如治療或預防與FGFR3表現及/或活性(諸如表現及/或活性增強或表現及/或活性不當)相關之疾病病況的抗FGFR3抗體。在一些實施例中，本發明之抗體係用於治療腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症。
在另一態樣中，本發明之抗FGFR3抗體可用作偵測及/或分離FGFR3(諸如偵測各種組織及細胞類型中之FGFR3)之試劑。
本發明進一步提供製備及使用抗FGFR3抗體及編碼抗FGFR3抗體之聚核苷酸的方法。
一般技術
本文所述或所提及之技術及程序一般為熟習此項技術者熟知，且通常使用習知之方法，諸如以下文獻中所述之廣泛利用之方法加以使用：Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N. Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. M. Ausubel等人編，(2003))；系列METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH(M. J. MacPherson，B. D. Hames及G. R. Taylor編，(1995))；Harlow及Lane編，(1988) ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，及ANIMAL CELL CULTURE(R. I. Freshney編，(1987))。
定義
「經分離」抗體為已經鑑別且自其自然環境之組分分離及/或回收的抗體。其自然環境之污染組分為會干擾抗體之診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，該抗體將經純化至(1)如藉由勞立法(Lowry method)所測定，大於95重量%之抗體，且最佳大於99重量%之抗體；(2)足以藉由使用旋轉杯測序儀獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或(3)使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色劑在還原條件或非還原條件下藉由SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)測定達到均質性。由於抗體自然環境之至少一種組分將不存在，故經分離抗體包括原位處於重組細胞內之抗體。然而，經分離抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
「經分離」核酸分子為經鑑別且與至少一種污染核酸分子(在該核酸之然來源中通常與該污染核酸分子締合)分離的核酸分子。經分離核酸分子不同於自然界中所見之形式或配置。因此，經分離核酸分子與存在於天然細胞中之核酸分子不同。然而，經分離核酸分子包括通常表現該核酸之細胞中所含之核酸分子(例如抗體編碼核酸)，其中例如該核酸分子之染色體位置不同於其在天然細胞中之染色體位置。
術語「根據Kabat之可變域殘基編號」或「根據Kabat之胺基酸位置編號」或其變化形式係指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)中用於抗體編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可能含有與縮短之可變域之FR或CDR或向可變域之FR或CDR中之***相對應的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括在H2之殘基52後***之單個胺基酸(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82後***之殘基(例如，根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。可藉由將抗體序列與「標準」Kabat編號序列之同源區比對來確定既定抗體之殘基的Kabat編號。
如本文所用之片語「實質上類似」或「實質上相同」表示兩個數值(一般一數值與本發明之抗體相關而另一數值與參考/比較抗體相關)之間存在足夠高之類似度，以致熟習此項技術者可認為在由該等值(例如Kd值)所量測之生物學特徵之情形中該兩個值之間的差異幾乎無或無生物學意義及/或統計顯著性。該兩個值之間的差異以參照/比較抗體之值計較佳小於約50%、較佳小於約40%、較佳小於約30%、較佳小於約20%、較佳小於約10%。
「結合親和力」一般係指分子(例如抗體)之單個結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用的總強度。除非另有指示，否則如本文所用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示。Kd理想地為1×10-7 、1×10-8 、5×10-8 、1×10-9 、3×10-9 、5×10-9 或甚至1×10-10 或更強。親和力可藉由此項技術中已知之常見方法(包括本文所述之彼等方法)來量測。低親和力抗體一般緩慢地結合抗原且趨於輕易解離，而高親和力抗體一般較快地結合抗原且趨於保持結合較長時間。多種量測結合親和力之方法在此項技術中已知，其任一者均可用於本發明目的。以下描述特定說明性實施例。
在一實施例中，本發明之「Kd」或「Kd值」係藉由放射性標記之抗原結合檢定(RIA)量測，該檢定係用相關抗體之Fab型式及其抗原如由下列檢定所述來進行：藉由在連續滴定之未標記抗原存在下使Fab與最低濃度之(125 I)-標記之抗原平衡，接著以塗有抗Fab抗體之板捕捉所結合之抗原來量測Fab對抗原之溶液結合親和力(Chen等人，(1999)J.Mol.BioI.293：865-881)。為確立用於檢定之條件，用含5 μg/ml捕捉抗Fab抗體(Cappel Labs)之50 mM碳酸鈉(pH 9.6)塗布微量滴定板(Dynex)隔夜，且隨後在室溫下(約23℃)用含2%(w/v)牛血清白蛋白之PBS阻斷2至5小時。在無吸附劑板(Nunc編號：269620)中，將100 pM或26 pM[125 I]-抗原與相關Fab(例如符合Presta等人，(1997)Cancer Res.57：4593-4599中對抗VEGF抗體(即Fab-12)之評定)之連續稀釋液混合。接著培育相關Fab隔夜；然而，培育可持續較長之時段(例如65小時)以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉板中以在室溫下培育(例如歷時1小時)。接著移除溶液且用含0.1% Tween-20之PBS洗滌該板8次。當板乾燥時，添加每孔150微升閃爍體(MicroScint-20；Packard)，且在Topcount γ計數儀(Packard)上對該等板進行計數歷時10分鐘。選擇提供小於或等於20%最大結合之各Fab濃度用於競爭性結合檢定。根據另一實施例，Kd或Kd值係藉由在25℃下使用BIAcoreTM -2000或BIAcoreTM -3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)使用表面電漿共振檢定以約10反應單元(RU)之固定抗原CM5晶片來量測。簡言之，根據供應商之說明書用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)使羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5，BIAcore Inc.)活化。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 μg/ml(約0.2 μM)，之後以每分鐘5 μl之流動速率進行注射以達成約10反應單元(RU)之偶合蛋白。注射抗原後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。為進行動力學量測，在25℃下以每分鐘約25 μl之流動速率注射於含0.05% Tween 20之PBS(PBST)中之Fab之兩倍連續稀釋液(0.78 nM至500 nM)。在一些實施例中，對表面電漿共振檢定法使用下列修改：將抗體固定於CM5生物感測器晶片上以達成約400 RU，且為進行動力學量測，在25℃下以每分鐘約30 μl之流動速率注射於PBST緩衝液中之標靶蛋白(例如FGFR3-IIIb或FGFR3-IIIc)之兩倍連續稀釋液(自67 nM起始)。締合速率(kon )及解離速率(koff )係使用簡單1對1朗繆耳結合模型(simple one-to-one Langmuir binding model)(BIAcore評估軟體版本3.2)藉由同時擬合締合及解離感測器圖譜來計算。根據比率koff /kon 來計算平衡解離常數(Kd)。參見例如Chen，Y.等人，(1999) J. Mol. Biol. 293:865-881。若由上述表面電漿共振檢定測定締合速率超過106 M-1 S-1 ，則締合速率可藉由使用螢光淬滅技術來測定，該技術如光譜儀(諸如裝備有終止-流動之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌式紅色光析管之8000系列SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic))所量測在增加濃度之抗原存在下，量測在25℃下PBS(pH 7.2)中之20 nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295 nm；發射=340 nm，16 nm帶通)增加或降低。
本發明之「締合速率」或「kon 」亦可在25℃下使用BIAcoreTM -2000或BIAcoreTM -3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，用上文所述之相同表面電漿共振技術以約10反應單元(RU)之固定抗原CM5晶片測定。簡言之，根據供應商之說明書用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)使羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5，BIAcore Inc.)活化。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋成5 μg/ml(約0.2 μM)，之後以每分鐘5微升之流動速率注射以達成約10反應單元(RU)之偶合蛋白。注射抗原後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。為進行動力學量測，在25℃下以每分鐘約25 μ1之流動速率注射於含0.05% Tween 20之PBS(PBST)中之Fab之兩倍連續稀釋液(().78 nM至500 nM)。在一些實施例中，對表面電漿共振檢定法使用下列修改：將抗體固定於CM5生物感測器晶片上以達成約400 RU，且為進行動力學量測，在25℃下以每分鐘約30 μ1之流動速率注射於PBST緩衝液中之標靶蛋白(例如FGFR3-IIIb或FGFR3-IIIc)之兩倍連續稀釋液(以67 nM起始)。締合速率(kon )及解離速率(koff )係使用簡單1對1朗繆耳結合模型(BIAcore評估軟體版本3.2)藉由同時擬合締合及解離感測器圖譜來計算。根據比率koff /kon 來計算平衡解離常數(Kd)。參見例如Chen，Y. 等人，(1999)J. Mol.Biol.293：865-881。然而，若由上述表面電漿共振檢定測定締合速率超過106 M-1 S-1 ，則締合速率可藉由使用螢光淬滅技術來測定，該技術如光譜儀(諸如裝備有終止-流動之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌式紅色光析管之8000系列SLM-Aminco分光光度計(Thermo Spectronic))所量測在增加濃度之抗原存在下，量測在25℃下PBS(pH 7.2)中之20 nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295 nm；發射=340 nm，16 nm帶通)增加或降低。
如本文所用之術語「載體」意欲指能夠轉運其所連接之另一核酸的核酸分子。一種類型之載體為「質體」，其係指可接合其他DNA區段之環狀雙股DNA環。另一種類型之載體為噬菌體載體。另一種類型之載體為病毒載體，其中其他DNA區段可接合至病毒基因組中。某些載體能夠在引入其之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中之後整合至宿主細胞基因組中，從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其可操作地連接之基因表現。在本文中將此等載體稱作「重組表現載體」(或簡稱為「重組載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體常為質體形式。在本說明書中，由於質體為最常用之載體形式，故「質體」與「載體」可互換使用。
如本文可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸的聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物，或為可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在組裝聚合物之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸之序列可雜有非核苷酸組分。可在合成後諸如藉由將聚核苷酸與標記物結合來對聚核苷酸進一步修飾。其他類型之修飾包括例如「封端」；一或多個天然存在之核苷酸經類似物取代；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵聯(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酸、胺基甲酸酯等)之聚核苷酸及具有帶電鍵聯(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之聚核苷酸、含有側接部分(諸如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L-離胺酸等))之聚核苷酸、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素(psoralen)等)之聚核苷酸、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)之聚核苷酸、含有烷化劑之聚核苷酸、具有經修飾之鍵聯(例如α變旋異構核酸等)之聚核苷酸以及聚核苷酸之未修飾形式。另外，通常存在於糖中之任何羥基皆可例如經膦酸酯基、磷酸酯基置換，經標準保護基保護或經活化以製備與其他核苷酸之額外鍵聯；或可與固體或半固體支撐物結合。5'及3'末端OH可經磷酸化或經具有1至20個碳原子之胺或有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之核糖或去氧核糖之類似形式，包括例如2'-O-甲基-核糖、2'-O-烯丙基核糖、2'-氟-核糖或2'-疊氮基-核糖；碳環糖類似物；α-變旋異構糖；差向異構糖，諸如***糖、木糖或來蘇糖；哌喃糖；呋喃糖；景天庚酮糖(sedoheptulose)；非環狀類似物及基本核苷類似物(諸如甲基核糖苷基)。一或多個磷酸二酯鍵聯可經替代性連接基團置換。此等替代性連接基團包括(但不限於)磷酸酯置換為P(O)S(「硫醇酯」)、P(S)S(「二硫醇酯」)、(O)NR2 (「醯胺化物」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 (「甲縮醛」)之實施例，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚(-O-)鍵聯之經取代或未經取代之烷基(1-20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。並非聚核苷酸中之所有鍵聯均需相同。上述描述適用於本文所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文所用之「寡核苷酸」一般係指長度一般(但不一定)小於約200個核苷酸之短、一般為單股、一般為合成之聚核苷酸。術語「寡核苷酸」與「聚核苷酸」並不相互排斥。上文有關聚核苷酸之描述同樣且完全地適用於寡核苷酸。
關於肽或多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」係定義為在比對序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比後，且在不將任何保守性取代視作序列一致性之一部分下，候選序列中與特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比。為測定胺基酸序列一致性百分比之目的而進行之比對可以此項技術範圍內之多種方式來達成，例如使用公開可用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定適用於量測比對之參數，包括在所比較之序列全長中達成最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性百分比值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生，其中用於ALIGN-2程式之完整原始碼係於下表A中提供。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech，Inc.創作且原始碼已以與使用者文件一起歸檔於美國版權辦公室(U.S. Copyright Office，Washington D.C.，20559)，在其中其係以美國版權寄存號第TXU510087號登記。ALIGN-2程式可經Genentech，Inc.，South San Francisco，California公開獲到或可根據例如WO 2007/001851中所提供之原始碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯以用於UNIX操作系統，較佳數位UNIX V4.0D上。所有序列比較參數係由ALIGN-2程式設定且不改變。
在使用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下，既定胺基酸序列A與既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性百分比(其可替代地表述為既定胺基酸序列A與既定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列一致性百分比)係如下計算：
100乘分數X/Y
其中X為A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評為一致匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B中胺基酸殘基的總數。應瞭解，在胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A與B之胺基酸序列一致性百分比將不等於B與A之胺基酸序列一致性百分比。
在一些實施例中，2個或2個以上胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%一致性。在一些實施例中，2個或2個以上胺基酸序列具有至少95%、97%、98%、99%或甚至100%一致性。除非另外特別說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性百分比值皆如先前剛敍述之段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
除非另外特別或在上下文中指示，否則如本文所用之術語「FGFR3」係指任何天然或變異型(天然或合成)FGFR3多肽(例如FGFR3-IIIb同功異型物或FGFR3-IIIc同功異型物)。術語「天然序列」特別涵蓋天然存在之截短形式(例如細胞外域序列或跨膜次單位序列)、天然存在之變異形式(例如替代性剪接形式)及天然存在之對偶基因變異體。術語「野生型FGFR3」一般指包含天然存在之FGFR3蛋白之胺基酸序列的多肽。術語「野生型FGFR3序列」一般指天然存在之FGFR3中所見之胺基酸序列。
除非另外特別或在上下文中指示，否則如本文所用之術語「FGFR3配位體」(可互換稱作「FGF」)係指任何天然或變異型(天然或合成)FGFR3配位體(例如，FGF1、FGF2、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17、FGF18、FGF23)多肽。術語「天然序列」特別涵蓋天然存在之截短形式(例如細胞外域序列或跨膜次單位序列)、天然存在之變異形式(例如替代性剪接形式)及天然存在之對偶基因變異體。術語「野生型FGFR3配位體」一般指包含天然存在之FGFR3配位體蛋白之胺基酸序列的多肽。術語「野生型FGFR3配位體序列」一般指天然存在之FGFR3配位體中所見之胺基酸序列。
「FGFR3活化」係指FGFR3受體之活化或磷酸化。一般而言，FGFR3活化引起信號轉導(例如，其係由FGFR3受體中使FGFR3或受質多肽中之酪胺酸殘基磷酸化的細胞內激酶結構域所引起)。FGFR3活化可藉由FGFR配位體結合至相關FGFR3受體所介導。FGFR3配位體(例如FGF1或FGF9)結合至FGFR3可活化FGFR3之激酶結構域，從而引起FGFR3中酪胺酸殘基磷酸化及/或引起其他受質多肽中酪胺酸殘基磷酸化。
如本文所用之術語「組成性」(如例如應用於受體激酶活性)係指受體不依賴於配位體或其他活化分子之存在的連續信號傳導活性。視受體之性質，所有活性均可為組成性活性或受體之活性可藉由結合其他分子(例如配位體)而進一步活化。一般技術者熟知引起受體活化之細胞事件。舉例而言，活化可包括寡聚(例如二聚、三聚等)成較高級受體複合物。複合物可包含單一蛋白質物質，亦即均聚複合物。或者，複合物可包含至少兩種不同之蛋白質物質，亦即雜聚複合物。複合物形成可由例如受體之正常或突變形式在細胞表面上過度表現而引起。複合物形成亦可由受體中之特異性突變而引起。
如本文所用之術語「非配位體依賴性」(如例如應用於受體信號傳導活性)係指信號傳導活性不依賴於配位體之存在。具有非配位體依賴性激酶活性之受體不一定排除配位體結合至彼受體以使激酶活性產生額外活化。
如本文所用之術語「配位體依賴性」(如例如應用於受體信號傳導活性)係指信號傳導活性依賴於配位體之存在。
片語「基因擴增」係指在特定細胞或細胞株中形成基因或基因片段之多個複本的方法。經複製區域(一段經擴增DNA)通常稱為「擴增子」。通常，所產生之信使RNA(mRNA)之量(亦即基因表現程度)亦與由所表現之特定基因製成之複本的數目成比例增加。
「酪胺酸激酶抑制劑」為在某種程度上抑制酪胺酸激酶之酪胺酸激酶活性的分子(諸如FGFR3受體)。
「呈現FGFR3表現、擴增或活化」之癌症或生物樣品為在診斷性測試中表現(包括過度表現)FGFR3，具有擴增之FGFR3基因及/或以其他方式展現FGFR3活化或磷酸化之癌症或生物樣品。
「呈現FGFR3活化」之癌症或生物樣品為在診斷性測試中展現FGFR3活化或磷酸化之癌症或生物樣品。此活化可直接(例如藉由ELISA量測FGFR3磷酸化)或間接測定。
「呈現組成性FGFR3活化」之癌症或生物樣品為在診斷性測試中展現FGFR3組成性活化或磷酸化之癌症或生物樣品。此活化可直接(例如藉由ELISA量測c-FGFR3磷酸化)或間接測定。
「呈現FGFR3擴增」之癌症或生物樣品為在診斷性測試中具有擴增之FGFR3基因之癌症或生物樣品。
「呈現FGFR3易位」之癌症或生物樣品為在診斷性測試中具有易位之FGFR3基因的癌症或生物樣品。FGFR3易位之實例為t(4;14)易位，其存在於一些多發性骨髓瘤腫瘤中。
本文之「磷酸化ELISA檢定」為在酶聯結免疫吸附劑檢定(ELISA)中使用試劑(通常為抗體)偵測磷酸化之FGFR3、受質或下游信號傳導分子來評估一或多種FGFR3、受質或下游信號傳導分子之磷酸化的檢定。在一些實施例中，使用偵測磷酸化之FGFR3或pMAPK的抗體。可較佳對來自新鮮或冷凍生物樣品之細胞溶胞物進行該檢定。
「呈現非配位體依賴性FGFR3活化」之癌症或生物樣品為在診斷性測試中展現FGFR3之非配位體依賴性活化或磷酸化的癌症或生物樣品。此活化可直接(例如藉由ELISA量測FGFR3磷酸化)或間接測定。
「呈現配位體依賴性FGFR3活化」之癌症或生物樣品為在診斷性測試中展現FGFR3之配位體依賴性活化或磷酸化的癌症或生物樣品。此活化可直接(例如藉由ELISA量測FGFR3磷酸化)或間接測定。
「呈現非配位體依賴性FGFR3活化」之癌症或生物樣品為在診斷性測試中展現FGFR3之非配位體依賴性活化或磷酸化的癌症或生物樣品。此活化可直接(例如藉由ELISA量測FGFR3磷酸化)或間接測定。
「FGFR3過度表現或擴增」之癌細胞為FGFR3蛋白或基因之含量相較於相同組織類型之非癌細胞顯著較高之細胞。此過度表現可由基因擴增或由增強之轉錄或轉譯引起。可在診斷性或預後性檢定中藉由評估細胞表面上存在之FGFR3蛋白含量增加(例如經由免疫組織化學檢定；IHC)來測定FGFR3過度表現或擴增。或者或另外，可例如經由螢光原位雜交(FISH；參見1998年10月公開之WO 98/45479)、南方墨點法或聚合酶鏈反應(PCR)技術(諸如定量即時PCR(qRT-PCR))來量測細胞中編碼FGFR3之核酸的含量。除上述檢定以外，熟練專業人員亦可利用各種活體內檢定。舉例而言，可使患者體內之細胞暴露於視情況經可偵測標記物(例如放射性同位素)標記之抗體，且可例如藉由外部掃描放射能或藉由分析取自先前暴露於該抗體之患者的活組織檢查來評估抗體與在患者體內細胞之結合。
如本文所用之術語「突變」意謂特定蛋白質或核酸(基因、RNA)之胺基酸或核酸序列分別相對於野生型蛋白質或核酸的差異。突變型蛋白質或核酸可由基因之一個對偶基因(異種接合子)或兩個對偶基因(同種接合子)表現，或可見於基因之一個對偶基因(異種接合子)或兩個對偶基因(同種接合子)上，且可為體細胞或生殖系突變型蛋白質或核酸。在本發明中，突變一般為體細胞突變。突變包括序列重排，諸如***、缺失及點突變(包括單一核苷酸/胺基酸多形現象)。
「抑制」為與參考值相比減少或降低活性、功能及/或量。
當藥劑模擬相關多肽(例如FGFR配位體，諸如FGF1或FGF9)之至少一種功能活性時，藥劑具有「促效劑活性或功能」。
如本文所用之「促效劑抗體」為模擬相關多肽(例如FGFR配位體，諸如FGF1或FGF9)之至少一種功能活性的抗體。
蛋白質「表現」係指基因中所編碼之資訊向信使RNA(mRNA)轉化且接著向蛋白質轉化。
本文中「表現」相關蛋白質(諸如FGF受體或FGF受體配位體)之樣品或細胞為編碼蛋白質之mRNA或蛋白質(包括其片段)經測定存在於樣品或細胞中的樣品或細胞。
「免疫結合物」(可互換稱作「抗體-藥物結合物」或「ADC」)意謂抗體結合至一或多種細胞毒性劑，該一或多種細胞毒性劑諸如化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之蛋白質毒素，酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(亦即放射結合物)。
如本文所用之術語「Fc區」一般指包含免疫球蛋白重鏈之C末端多肽序列之二聚體複合物，其中C末端多肽序列為可藉由番木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得之序列。Fc區可包含天然或變異Fc序列。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc序列的邊界可能變化，但人類IgG重鏈Fc序列通常定義為自大約位置Cys226處之胺基酸殘基或自大約位置Pro230處延伸至Fc序列之羧基末端。免疫球蛋白之Fc序列一般包含2個恆定域(即CH2域及CH3域)且視情況包含CH4域。可例如在抗體純化期間或藉由對編碼抗體之核酸重組工程改造移除Fc區之C末端離胺酸(根據EU編號系統，為殘基447)。因此，包含本發明之具有Fc區之抗體的組合物可包含具有K447之抗體、所有K447皆移除之抗體或有及無K447殘基之抗體的混合物。
本文之「Fc多肽」意謂一種構成Fc區之多肽。可自任何適合之免疫球蛋白(諸如IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 次型、IgA、IgE、IgD或IgM)獲得Fc多肽。在一些實施例中，Fc多肽包含一部分或全部野生型鉸鏈序列(一般在其N末端處)。在一些實施例中，Fc多肽不包含功能性或野生型鉸鏈序列。
「阻斷」抗體或抗體「拮抗劑」為抑制或降低所結合之抗原之生物活性的抗體。較佳阻斷抗體或拮抗劑抗體完全抑制抗原之生物活性。
「裸抗體」為未結合至諸如細胞毒性部分或放射性標記之異源分子的抗體。
具有指定抗體之「生物學特徵」的抗體為具有彼抗體之一或多種生物學特徵，使其與結合相同抗原之其他抗體相區分之抗體。
為篩選與相關抗體所結合之抗原上之抗原決定基結合之抗體，可進行常規交叉阻斷檢定，諸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow及David Lane編(1988)中所述之檢定。
為增加含有本發明之胺基酸序列之抗體或多肽的半衰期，可如例如美國專利5,739,277中所述將救助受體結合抗原決定基附接至抗體(尤其抗體片段)上。舉例而言，可將編碼救助受體結合抗原決定基之核酸分子同框連接至編碼本發明多肽序列之核酸上，使得藉由經工程改造之核酸分子表現之融合蛋白包含救助受體結合抗原決定基及本發明之多肽序列。如本文所用之術語「救助受體結合抗原決定基」係指IgG分子(例如IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 )之Fc區中負責增加IgG分子之活體內血清半衰期之抗原決定基(例如，Ghetie等人，Ann. Rev. Immunol . 18:739-766(2000)，表1)。在Fc區中具有取代且血清半衰期增加之抗體亦於WO 00/42072、WO 02/060919；Shields等人，J. Biol. Chem. 276:6591-6604(2001)；Hinton，J. Biol. Chem. 279:6213-6216(2004))中描述。在另一實施例中，亦可例如藉由附接其他多肽序列來增加血清半衰期。舉例而言，可將適用於本發明方法之抗體或其他多肽附接至血清白蛋白或結合至FcRn受體或血清白蛋白結合肽之一部分血清白蛋白上，以使血清白蛋白結合至該抗體或多肽，例如此等多肽序列係揭示於WO 01/45476中。在一較佳實施例中，欲附接之血清白蛋白肽包含DICLPRWGCLW之胺基酸序列(SEQ ID NO:183)。在另一實施例中，藉由此等方法增加Fab之半衰期。關於血清白蛋白結合肽序列，亦參見Dennis等人，J. Biol. Chem. 277:35035-35043(2002)。
「片段」意謂較佳含有參考核酸分子或多肽之整個長度之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或95%以上的多肽或核酸分子之一部分。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90個或100、200、300、400、500、600個或600個以上核苷酸或10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、190、200個或200個以上胺基酸。
如本文所用關於本發明抗體之片語「幾乎無或無促效劑功能」意謂例如在向個體投藥後，抗體不引起生物學上有意義量之促效劑活性。如此項技術中所瞭解，可定量或定性地測定活性量，只要可在本發明之抗體與參考對應物之間進行比較即可。可根據此項技術中已知之任何檢定或技術(包括例如本文所述者)量測或偵測活性。可同時或單獨測定本發明之抗體及其參考對應物之活性量。在一些實施例中，本發明之二價抗體不具有實質促效劑功能。
術語「細胞凋亡」及「細胞凋亡活性」以廣泛意義使用，且係指通常伴隨一或多種特徵性細胞改變之哺乳動物細胞死亡之有序或受控形式，該等特徵性細胞改變包括細胞質濃縮、質膜微絨毛喪失、核分段、染色體DNA降解或粒線體功能喪失。可使用此項技術中已知之技術，例如藉由細胞活力檢定、FACS分析或DNA電泳，且更尤其藉由磷脂結合蛋白V之結合、DNA斷裂、細胞皺縮、內質網擴張、細胞破碎及/或膜囊(稱作細胞凋亡體)形成來測定及量測此活性。
術語「抗體」與「免疫球蛋白」在最廣泛意義上可互換使用，且包括單株抗體(例如全長或完整單株抗體)、多株抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要其展現所需之生物活性即可)，且亦可包括某些抗體片段(如本文更詳細地描述)。抗體可為人類抗體、人類化抗體及/或親和力成熟抗體。
術語「可變」係指以下事實：抗體間可變域之某些部分的序列廣泛不同且該等部分用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。然而，可變性在整個抗體可變域中並非均勻分布。其集中於輕鏈及重鏈可變域中稱為互補決定區(CDR)或高變區之三個區段中。可變域之較高度保守之部分稱為構架(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含四個FR區，主要採用β摺疊構型，由三個CDR連接，該等CDR形成連接β摺疊結構的環，且在一些情況下形成β摺疊結構之一部分。各鏈中之CDR藉由FR區緊接地固持在一起，且與另一鏈中之CDR一起幫助形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，National Institute of Health，Bethesda，MD(1991))。恆定域並不直接涉及抗體與抗原之結合，但其展現出各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。
番木瓜蛋白酶對抗體之消化產生兩個各具有單一抗原結合位點之相同抗原結合片段(稱作「Fab」片段)，及殘餘「Fc」片段，其名稱反映其易於結晶之能力。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原之F(ab')2 片段。
「Fv」為含有完全抗原識別位點及結合位點之最小抗體片段。在雙鏈Fv物質中，此區域係由緊密、非共價締合之一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域之二聚體組成。在單鏈Fv物質中，一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域可經可撓性肽連接子共價連接，從而使輕鏈與重鏈可締合成與雙鏈Fv物質類似之「二聚」結構。在此構型中各可變域之3個CDR相互作用以界定VH-VL二聚體表面上之抗原結合位點。總體而言，6個CDR賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使單個可變域(或僅包含三個對抗原具有特異性之CDR之一半Fv)亦能夠識別且結合抗原，但親和力低於整個結合位點。
Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab'片段因在重鏈CH1域之羧基末端處添加有包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸的若干殘基而不同於Fab片段。Fab'-SH在本文中表示恆定域之半胱胺酸殘基攜有游離硫醇基之Fab'。F(ab')2 抗體片段最初係以Fab'片段對之形式產生，在該等片段對之間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段之其他化學偶合亦已知。
任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」可基於其恆定域之胺基酸序列可歸屬於兩種明顯不同之類型(稱作K及λ)之一。
視重鏈恆定域之胺基酸序列而定，免疫球蛋白可歸屬於不同類別。有5種主要類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中幾類可進一步分成子類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別免疫球蛋白之次單位結構及三維構型為熟知的。「抗體片段」僅包含完整抗體之一部分，其中該部分較佳保留至少一種，較佳大部分或所有通常與當該部分存在於完整抗體中時相關之功能。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。在一實施例中，抗體片段包含完整抗體之抗原結合位點且因此保留結合抗原之能力。在另一實施例中，抗體片段(例如包含Fc區之抗體片段)保留至少一種通常與當Fc區存在於完整抗體中時相關之生物功能，諸如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合。在一實施例中，抗體片段為具有實質上類似於完整抗體之活體內半衰期的單價抗體。舉例而言，此抗體片段可包含連接於能夠賦予該片段以活體內穩定性之Fc序列的抗原結合臂。
在本文中使用時，術語「高變區」、「HVR」或「HV」係指抗體可變域之序列高變且/或形成結構上確定之環的區域。一般而言，抗體包含六個高變區；三個在VH中(H1、H2、H3)且三個在VL中(L1、L2、L3)。多種高變區描繪正在使用且涵蓋於本文中。Kabat互補決定區(CDR)係基於序列可變性且最常使用(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。而Chothia指結構環之位置(Chothia及Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。AbM高變區代表KabatCDR與Chothia結構環之間的折衷，且由OXford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用。「接觸」高變區係基於對可用複雜晶體結構之分析。來自此等高變區中之每一者的殘基如下所示。
高變區可包含如下「擴展高變區」：VL中之24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)及89-97(L3)；及VH中之26-35(H1)、50-65或49-65(H2)及93-102、94-102或95-102(H3)。此等定義中之每一者之可變域殘基均係根據Kabat等人(同上)編號。
「構架」或「FR」殘基為除如本文所定義之高變區殘基外的彼等可變域殘基。
非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式為含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在極大程度上，人類化抗體為來自受體之高變區之殘基經來自具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(供體抗體；諸如小鼠、大鼠、家兔或非人類靈長類動物)之高變區之殘基置換的人類免疫球蛋白(受體抗體)。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基係經相應之非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含受體抗體或供體抗體中未見之殘基。可進行此等修飾以進一步改良抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含實質上全部至少一個且通常兩個可變域，其中全部或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等高變環，且全部或實質上全部FR為人類免疫球蛋白序列之彼等FR。人類化抗體視情況亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常人免疫球蛋白恆定區之至少一部分。關於其他細節，參見Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；及Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)。亦參見下列評述文章及其中所引用之參考文獻：Vaswani及Hamilton，Ann. Allergy，Asthma ＆ Immunol. 1:105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc. Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle及Gross，Curr. Op. Biotech. 5:428-433(1994)。
「嵌合」抗體(免疫球蛋白)具有重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列相同或同源，而鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體之相應序列相同或同源；以及此等抗體之片段(只要其展現所需生物活性即可)(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。如本文所用之人類化抗體為嵌合抗體之子集。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之VH及VL域，其中此等結構域存在於單一多肽鏈中。一般而言，scFv多肽在VH與VL域之間進一步包含多肽連接子，其使得scFv能夠形成抗原結合之所需結構。關於對scFv之評述，參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第113卷，Rosenburg and Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(1994)。
「抗原」為抗體可選擇性結合之預定抗原。標靶抗原可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其他天然存在或合成之化合物。標靶抗原較佳為多肽。
術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)中重鏈可變域(VH)與輕鏈可變域(VL)連接。藉由使用過短而不允許同一鏈上兩個結構域之間配對的連接子，迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，90:6444-6448(1993)中。
「人類抗體」為具有與由人類產生之抗體之胺基酸序列對應的胺基酸序列及/或使用如本文所揭示之製備人類抗體之任何技術製得的抗體。此人類抗體之定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「親和力成熟」抗體為在一或多個CDR中具有一或多處變化以致與不具有彼等變化之親本抗體相比，抗體對抗原之親和力得以改良的抗體。較佳親和力成熟抗體對標靶抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳(picomolar)親和力。使用此項技術中已知之程序產生親和力成熟抗體。Marks等人，Bio/Technology 10:779-783(1992)描述藉由VH及VL域洗牌(shuffling)親和力成熟。以下文獻描述CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發：Barbas等人，Proc Nat. Acad. Sci，USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人，Gene 169:147-155(1995)；Yelton等人，J. Immunol. 155:1994-2004(1995)；Jackson等人，J. Immunol. 154(7):3310-9(1995)；及Hawkins等人，J. Mol. Biol. 226:889-896(1992)。
抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異Fc區)之彼等生物活性，且其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；及B細胞活化。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式，其中結合於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上存在之Fc受體(FcR)上的經分泌之Ig使此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜有抗原之標靶細胞且隨後以細胞毒素殺傷標靶細胞。抗體「配備」細胞毒性細胞且絕對為此殺死作用所需。介導ADCC之初級細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現係概述於Ravetch及Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)之第464頁上的表3中。為評定相關分子之ADCC活性，可進行活體外ADCC檢定，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號或Presta美國專利第6,737,056號中所述之檢定。適用於該等檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在活體內，例如在動物模型中(諸如Clynes等人，PNAS(USA) 95:652-656(1998)中所揭示)評定相關分子之ADCC活性。
「人類效應細胞」為表現一或多個FcR且執行效應功能之白血球。該等細胞較佳至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包括周邊血液單核細胞(PBMC)、自然殺手(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球；其中PBMC及NK細胞較佳。效應細胞可自自然來源(例如血液)分離。
「Fc受體」或「FcR」描述與抗體Fc區結合之受體。較佳FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳之FcR為結合IgG抗體之FcR(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括此等受體之對偶基因變異體及替代性剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活性受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，該兩者具有類似胺基酸序列且主要不同之處在於其細胞質域。活性受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)。(參見評述M. in Daron，Annu. Rev. Immunol . 15:203-234(1997))。FcR係於以下文獻中評述：Ravetch及Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)。本文之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括有待將來鑑別之彼等FcR。該術語亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母本IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J. Immunol . 117:587(1976)及Kim等人，J. Immunol. 24:249(1994))且調控免疫球蛋白之穩定。WO 00/42072(Presta)描述與FcR之結合改良或降低之抗體變異體。彼專利公開案之內容係特別以引用的方式併入本文中。亦參見Shields等人，J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001)。
量測與FcRn之結合的方法為已知的(參見例如Ghetie1997，Hinton2004)。人類FcRn高親和力結合多肽與人類FcRn之活體內結合及血清半衰期可例如在表現人類FcRn之轉殖基因小鼠或經轉染之人類細胞株中，或在經投與Fc變異體多肽之靈長類動物中檢定。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下溶解標靶細胞。藉由補體系統之第一組分(C1q)與結合至同源抗原之抗體(屬於適當子類)結合來引發經典補體路徑之活化。為評定補體活化，可進行例如如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163(1996)中所述之CDC檢定。
Fc區胺基酸序列經改變且C1q結合能力增強或降低之多肽變異體係於美國專利第6,194,551B1號及WO 99/51642中描述。彼等專利公開案之內容係特別以引用的方式併入本文中。亦參見Idusogie等人，J. Immunol . 164:4178-4184(2000)。
術語「包含Fc區之多肽」係指諸如抗體或免疫黏附素之包含Fc區之多肽。可例如在多肽純化期間，或藉由重組工程改造編碼多肽之核酸來移除Fc區之C末端離胺酸(根據EU編號系統，為殘基447)。因此，包含本發明之具有Fc區之多肽的組合物可包含具有K447之多肽、所有K447皆移除之多肽或有及無K447殘基之多肽的混合物。
出於本文之目的，「受體人類構架」為包含源自人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之VL或VH構架之胺基酸序列的構架。「源自」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之受體人類構架可包含其相同胺基酸序列或可含有預先存在之胺基酸序列變化。若存在預先存在之胺基酸變化，則較佳存在不超過5處，且較佳4處或4處以下或3處或3處以下預先存在之胺基酸變化。當預先存在之胺基酸變化存在於VH中時，較佳彼等變化僅在位置71H、73H及78H中之三者、兩者或一者處；舉例而言，彼等位置處之胺基酸殘基可為71A、73T及/或78A。在一實施例中，VL受體人類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。
「人類共同構架」為代表所選人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之子群。一般而言，該序列子群為如Kabat等人中之子群。在一實施例中，對於VL，子群為如Kabat等人中之子群κI。在一實施例中，對於VH，子群為如Kabat等人中之子群III。
「VH子群III共同構架」包含自Kabat等人之可變重鏈子群III中之胺基酸序列獲得的共同序列。在一實施例中，VH子群III共同構架胺基酸序列包含以下各序列中之至少一部分或全部：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:184)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:185)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:186)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:187)。
「VL子群I共同構架」包含自Kabat等人之可變輕鏈κ子群I中之胺基酸序列獲得的共同序列。在一實施例中，VH子群I共同構架胺基酸序列包含以下各序列中之至少一部分或全部:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:188)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:189)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:190)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:191)。
如本文所用之「抗體突變體」或「抗體變異體」係指物種依賴性抗體之一或多個胺基酸殘基已經修飾之抗體胺基酸序列變異體。此等突變體必需與物種依賴性抗體具有小於100%序列一致性或類似性。在一實施例中，抗體突變體將具有與物種依賴性抗體之重鏈或輕鏈可變域之胺基酸序列具有至少75%，更佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%胺基酸序列一致性或類似性的胺基酸序列。相對於此序列之一致性或類似性在本文中定義為在比對序列且必要時引入間隙達成最大序列一致性百分比後，候選序列中與物種依賴性抗體殘基一致(亦即相同殘基)或類似(亦即來自基於共同側鏈特性之同一組的胺基酸殘基，參見下文)之胺基酸殘基的百分比。N末端、C末端或內部擴展、刪除、或向可變域以外之抗體序列中***中均不應視作影響序列一致性或類似性。
「病症」或「疾病」為將自以本發明之物質/分子或方法治療獲益的任何病狀。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患所述病症之彼等病理病狀。本文中待治療之病症的非限制性實例包括惡性及良性腫瘤、癌瘤、母細胞瘤及肉瘤。
「治療」係指治療性處理及預防性或預防措施。需要治療者包括已罹患良性、癌前期或非轉移性腫瘤者，以及需預防癌症發生或復發者。
術語「治療有效量」係指治療或預防哺乳動物之疾病或病症之治療劑的量。在癌症之情況下，治療有效量之治療劑可減少癌細胞數目；降低原發腫瘤尺寸；抑制(亦即在某種程度上減緩且較佳終止)癌細胞浸潤至周邊器官中；抑制(亦即在某種程度上減緩且較佳終止)腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生長；及/或在某種程度上減輕一或多種與病症相關之症狀。藥物達到可防止癌細胞生長及/或殺死現有癌細胞之程度，則其可為細胞生長抑制劑及/或細胞毒性劑。對於癌症治療，可例如藉由評定存活持續時間、疾病進展時間(TTP)、反應率(RR)、反應持續時間及/或生活質量來量測活體內功效。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述通常特徵在於失調之細胞生長的哺乳動物生理病狀。此定義包括良性及惡性癌症。「早期癌症」或「早期腫瘤」意謂不具侵襲性或轉移性或歸類為0、I或II期癌症之癌症。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤(包括髓母細胞瘤及視網膜母細胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤及滑膜細胞肉瘤)、神經內分泌腫瘤(包括類癌、胃泌素瘤及胰島細胞癌)、間皮瘤、神經鞘瘤(包括聽神經瘤)、腦膜瘤、腺癌、黑素瘤及白血病或淋巴惡性病。此等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)；包括小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌及肺鱗狀癌之肺癌；腹膜癌；肝細胞癌；包括胃腸癌之胃癌；胰臟癌；神經膠母細胞瘤；子宮頸癌；卵巢癌；肝癌(liver cancer)；膀胱癌；肝腫瘤(hepatoma)；乳癌(包括轉移性乳癌)；結腸癌；直腸癌；結腸直腸癌；子宮內膜癌或子宮癌；唾液腺癌；腎癌；***癌；陰門癌；甲狀腺癌；肝癌(hepatic carcinoma)；肛門癌；陰莖癌；睪丸癌；食道癌；膽道腫瘤以及頭頸部癌及多發性骨髓瘤。
術語「癌前期」係指通常在癌症之前或發展成癌症之病狀或生長。「癌前期」生長將具有特徵在於異常細胞週期調控、增殖或分化之細胞，其可藉由細胞週期調控、細胞增殖或分化之標記物來確定。
「發育不良」意謂組織、器官或細胞之任何異常生長或發育。發育不良較佳為高級或癌前期。
「轉移」意謂癌症自其原發部位擴散至身體之其他位置。癌細胞可離開原發腫瘤，滲透至***及血管中，通過血流循環且在體內其他位置處之正常組織遠處病灶中生長(轉移)。轉移可為局部或遠位轉移。轉移為連續過程，隨腫瘤細胞自原發腫瘤離開、通過血流行進且停留在遠端部位而定。在新部位處，細胞建立血液供應且可生長以形成危急生命之腫塊。
腫瘤細胞中之刺激性與抑制性分子路徑兩者皆調控此行為，且腫瘤細胞與遠端部位中宿主細胞之間的相互作用亦為顯著的。
「非轉移性」意謂癌症為良性的或保持於原發部位處且並未滲透至***或血管系統中或除原發部位以外之組織中。一般而言，非轉移性癌症為任何0、I或II期癌症，且有時為III期癌症。
「原發腫瘤」或「原發癌症」意謂初始癌症而並不意謂位於個體體內之另一組織、器官或位置處之轉移病灶。
「良性腫瘤」或「良性癌症」意謂保持侷限於初始部位處且不具有浸潤、侵襲或轉移至遠端部位之能力的腫瘤。
「腫瘤負荷」意謂體內癌細胞之數目、腫瘤尺寸或癌症之量。腫瘤負荷亦稱為腫瘤負載。
「腫瘤數目」意謂腫瘤之數目。
「個體」意謂哺乳動物，包括(但不限於)人類或非人類哺乳動物，諸如牛、馬、犬、綿羊或貓。較佳，個體為人類。
術語「抗癌治療」係指適用於治療癌症之治療。抗癌治療劑之實例包括(但不限於)例如化學治療劑；生長抑制劑；細胞毒性劑；用於放射治療之藥劑；抗血管生成劑；細胞凋亡劑；抗微管蛋白劑及其他治療癌症之藥劑；抗CD20抗體；血小板衍生生長因子抑制劑(例如GleevecTM (甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate))；CO X-2抑制劑(例如塞內昔布(celecoxib))；干擾素；細胞激素；結合一或多種以下標靶之拮抗劑(例如中和抗體)：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或 VEGF受體；TRAIL/Apo2；及其他生物活性及有機化學劑等。其組合亦包括於本發明中。
如本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或防止細胞發揮功能及/或引起細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素(例如I131 、I125 、Y90 及Re186 )、化學治療劑及毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段。
「化學治療劑」為適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括：烷化劑，諸如塞替派(thiotepa)及CYTOXAN環磷醯胺；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethyIenemelamine)、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；乙醯精寧(acetogenin)(尤其布拉他辛(buIlatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康(topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin)；卡利斯塔叮(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizeIesin)合成類似物)；念珠藻環肽(cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡米辛(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；盤克斯塔叮(pancratistatin)；沙考的汀(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、鹽酸二氯甲基二乙胺氧化物(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽固醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀脲(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如刺孢黴素(calicheamicin)，尤其刺孢黴素γ1I及刺孢黴素ωI1(參見例如Agnew，Chem Intl. Ed. Engl. ，33：183-186(1994))；達米辛(dynemicin)，包括達米辛A；雙膦酸鹽類，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)；艾斯帕米辛(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、克拉斯米辛(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、奧斯拉米辛(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基(oxo)-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN小紅莓(包括N-嗎啉基-小紅莓、氰基N-嗎啉基-小紅莓、2-N-吡咯啉基-小紅莓及去氧小紅莓)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睪酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanoIone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺劑，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如夫羅林酸(frolinic acid)；乙醯葡醛酯(aceglatone)；醛磷醯胺醣苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗鳥胺酸(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；羅尼達寧(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及胺沙托辛(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比達摩(mopidanmol)；硝拉維林(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；足葉草酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣複合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙基胺；單端孢黴烯族毒素(trichothecenes)(尤其T-2毒素、弗納庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及蛇形菌毒素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；***糖苷(arabinoside；「Ara-C」)；環磷醯胺；塞替派；紫杉烷類(taxoids)，例如TAXOL太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM 無克列莫佛(Cremophor)經白蛋白工程改造之太平洋紫杉醇奈米顆粒調配物(Ametican Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)及TAXOTERE多西他賽(doXetaXel)(Rhone-Poulenc Rorer， Antony， France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼；NAVELBINE長春瑞濱；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基蝶呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(Camptosar、CPT-11)(包括伊立替康及5-FU及甲醯四氫葉酸之治療方案)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(difluoro metlhylornithine，D M FO)；類視黃素，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；VELCADE硼替佐米；REVLIMID來那度胺；甲醯四氫葉酸(LV)；奧沙利鉑(oxaliplatin)，包括奧沙利鉑治療方案(FOLFOX)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR之降低細胞增殖之抑制劑(例如埃羅替尼(erlotinib)(TarcevaTM ))及VEGF-A之降低細胞增殖之抑制劑，以及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
此定義亦包括用以調控或抑制對腫瘤之激素作用的抗激素劑，諸如抗***及選擇性***受體調節劑(SERM)，包括例如他莫西芬(包括NOLVADEX他莫西芬)、雷洛昔芬(ralocifene)、曲洛昔芬(drolocifene)、4-羥基他莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬鹽酸鹽(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON托瑞米芬(FARESTON‧toremifene)；抑制調控腎上腺中***產生之芳香酶之芳香酶抑制劑，諸如4(5)-咪唑、胺魯米特、MEGASE乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN依西美坦、弗米斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、RIVISOR伏羅唑(vorozole)、FEMARA來曲唑及ARIMIDEX安美達錠；及抗雄激素劑，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑制異常細胞增殖中所涉及之信號傳導路徑中之基因(諸如PKC-α、Raf及H-Ras)表現的反義寡核苷酸；核糖核酸酶，諸如VEGF表現抑制劑(例如ANGIOZYME核糖核酸酶)及HER2表現抑制劑；疫苗，諸如基因治療疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIXrmRH；長春瑞濱及艾斯帕米辛(參見美國專利第4,675,187號)；及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
如本申請案所用之術語「前藥」係指醫藥活性物質之前驅體或衍生形式，其與母體藥物相比對腫瘤細胞之細胞毒性較小且能夠酶促活化或轉化為更具活性之母體形式。參見例如Wilman，「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」Biochemical Society Transactions ，14，第375-382頁，第615次會議Belfast(1986)及Stella等人，「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,」Directed Drug Delivery ，Borchardt等人(編)，第247-267頁，Humana Press(1985)。本發明之前藥包括(但不限於)含磷酸酯基之前藥、含硫代磷酸酯基之前藥、含硫酸酯基之前藥、含肽之前藥、經D-胺基酸修飾之前藥、糖基化前藥、含有β-內醯胺之前藥、含有視情況經取代之苯氧基乙醯胺之前藥或含有視情況經取代之苯乙醯胺之前藥、5-氟胞嘧啶及其他5-氟尿苷前藥，其可轉化為更具活性之無細胞毒性藥物。可衍生成用於本發明之前藥形式的細胞毒性藥物之實例包括(但不限於)上文所述之彼等化學治療劑。
「放射治療」意謂使用定向γ射線或β射線對細胞誘導足夠之損害以限制細胞正常發揮功能之能力或完全破壞細胞。應瞭解此項技術中已知多種測定治療劑量及持續時間的方式。典型治療以單次投藥形式提供且典型劑量範圍為每天10至200單位(Gray)。
「生物樣品」(可互換地稱作「樣品」或「組織或細胞樣品」)涵蓋自個體獲得之多種樣品類型且可用於診斷或監測檢定中。該定義涵蓋血液及生物來源之其他液態樣品；固態組織樣品，諸如活組織檢查試樣或組織培養物或自其獲得之細胞，及其子代。該定義亦包括在獲得後已以任何方式加以處理之樣品，諸如藉由以試劑處理、溶解或增濃某些組分(諸如蛋白質或聚核苷酸)或出於切片目的嵌埋於半固體或固體基質中。術語「生物樣品」涵蓋臨床樣品，且亦包括培養物中之細胞、細胞上清液、細胞溶胞物、血清、血漿、生物流體及組織樣品。生物樣品之來源可為如來自新鮮、冷凍及/或保存之器官或組織樣品或活組織檢查或抽出物之固體組織；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊髓液、羊水、腹膜液或間質液；來自個體之妊娠或發育中之任何時間的細胞。在一些實施例中，生物樣品係獲自原發或轉移性腫瘤。生物樣品可含有不與自然界中之組織天然混雜之化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩衝液、固定劑、營養素、抗生素或其類似物。
出於本文之目的，組織樣品之「切片」意謂單一部分或單片組織樣品，例如自組織樣品切割之組織或細胞薄片。應瞭解，可獲取多個組織樣品切片且根據本發明對其進行分析。在一些實施例中，對同一組織樣品切片進行形態學及分子層面上之分析，或關於蛋白質及核酸對其進行分析。
當在本文中使用時「標記物」一詞係指直接或間接結合或融合至諸如核酸探針或抗體之試劑且促成對所結合或融合之試劑之偵測的化合物或組合物。標記物可為自身可偵測(例如放射性同位素標記或螢光標記)或在酶標記之情況下，可催化發生可偵測之受質化合物或組合物化學變化。
本發明之.組合物及方法
本發明涵蓋組合物，包括醫藥組合物，其包含抗FGFR3抗體；及包含編碼抗FGFR3抗體之序列的聚核苷酸。如本文所用之組合物包含一或多種結合至FGFR3之抗體及/或一或多種包含編碼一或多種結合至FGFR3之抗體之序列的聚核苷酸。此等組合物可進一步包含此項技術中熟知之適合載劑，諸如醫藥學上可接受之賦形劑(包括緩衝液)。
本發明亦涵蓋經分離抗體及聚核苷酸實施例。本發明亦涵蓋實質上純的抗體及聚核苷酸實施例。
本發明亦涵蓋使用抗FGFR3抗體(如本文所述或如此項技術中所知)治療例如多發性骨髓瘤或移行期癌瘤(例如侵襲性移行期癌瘤)之病症的方法。
組合物
本發明之抗FGFR3抗體較佳為單株抗體。本發明之範疇內亦涵蓋本文所提供之抗FGFR3抗體之Fab、Fab'、Fab'-SH及F(ab')2 片段。此等抗體片段可藉由諸如酶促消化之傳統方式產生，或可藉由重組技術產生。此等抗體片段可為嵌合或人類化抗體片段。此等片段適用於達成下文所述之診斷及治療目的。
單株抗體可自實質上均質之抗體群體(亦即除可少量存在之可能天然存在之突變外，構成該群體之個別抗體相同)獲得。因此，修飾語「單株」指示抗體不為離散抗體之混合物的特徵。
本發明之抗FGFR3單株抗體可使用首先由Kohler等人，Nature， 256:495(1975)描述之融合瘤方法製得或可藉由重組DNA方法(美國專利第4,816,567號)製得。
在融合瘤方法中，使小鼠或其他適合宿主動物(諸如倉鼠)免疫以誘出產生或能夠產生特異性結合至用於免疫之蛋白質之抗體的淋巴細胞。針對FGFR3之抗體可藉由多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射FGFR3及佐劑而於動物體內產生。可使用此項技術中熟知之方法製備FGFR3，其中一些方法於本文中進一步描述。舉例而言，下文描述人類及小鼠FGFR3之重組產生。在一實施例中，用融合至免疫球蛋白重鏈Fc部分之FGFR3使動物免疫。在一較佳實施例中，用FGFR3-IgG1融合蛋白使動物免疫。通常針對FGFR3與單磷醯基脂質A(MPL)/海藻糖二柯諾黴菌酸酯(trehalose dicrynomycolate，TDM)(Ribi Immunochem. Research，Inc.，Hamilton，MT)之免疫原性結合物或衍生物使動物免除，且在多個部位處皮內注射溶液。兩週後使動物增強免疫。7至14天後，對動物進行取血且檢定血清之抗FGFR3力價。使動物增強免疫直至力價達到平穩階段。
或者，可使淋巴細胞活體外免疫。接著使用適合融合劑(諸如聚乙二醇)將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞(Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice ，第59-103頁(Academic Press，1986))。
接種由此製備之融合瘤細胞，並使其在較佳含有一或多種抑制未融合之親本骨髓瘤細胞生長或存活之物質的適合培養基中生長。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質阻止缺乏HGPRT之細胞生長。
較佳骨髓瘤細胞為有效融合，支持所選產生抗體之細胞穩定高量產生抗體且對諸如HAT培養基之培養基敏感之骨髓瘤細胞。其中，較佳骨髓瘤細胞株為鼠類骨髓瘤株，諸如源自可自沙克生物研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center)，(San Diego，California USA)獲得之MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤之彼等細胞株及可由美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)，(Rockville，Maryland USA)獲得之SP-2或X63-Ag8-653細胞。亦已描述產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株(Kozbor，J.Immunol .，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniqueS and Applications ，第51-63頁(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
在生長融合瘤細胞之培養基中檢定針對FGFR3之單株抗體的產生。較佳藉由免疫沈澱或藉由活體外結合檢定(諸如放射免疫檢定(RIA)或酶聯結免疫吸附劑檢定(ELISA))測定由融合瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性。
單株抗體之結合親和力可例如由Munson等人，Anal.Biochem .，107：220(1980)之史卡查分析來測定。
在鑑別出產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞後，可藉由限制稀釋程序對純系進行次選殖且藉由標準方法使該等純系生長(Goding，Monoclonal Antibodies： Principles and Practice ，第59-103頁(Academic Press，1986))。用於此目的之適合培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，融合瘤細胞可在活體內在動物中以腹水腫瘤形式生長。
合適地藉由習知免疫球蛋白純化程序自培養基、腹水或血清分離出由次純系分泌之單株抗體，該等純化程序諸如蛋白質A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
本發明之抗FGFR3抗體可藉由使用組合文庫篩選具有所需活性之合成抗體純系製得。原則上，藉由篩選含有呈現與噬菌體鞘蛋白融合之抗體可變區(Fv)之各種片段的噬菌體之噬菌體文庫來選擇合成抗體純系。藉由針對所需抗原進行親和層析來淘選該等噬菌體文庫。將表現能夠結合所需抗原之Fv片段之純系吸附至抗原且由此與文庫中之非結合性純系分離。接著自抗原溶離結合性純系，且可藉由額外之抗原吸附/溶離循環進一步增濃。本發明之任何抗FGFR3抗體可藉由設計適合之抗原篩選程序以選擇相關噬菌體純系，隨後使用來自相關噬菌體純系之Fv序列及以下文獻中所述之適合恆定區(Fc)序列建構全長抗FGFR3抗體純系來獲得：Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest ，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷。
抗體之抗原結合域係由兩個具有約110個胺基酸之可變(V)區形成，該兩個可變區各來自輕(VL)鏈及重(VH)鏈，兩者皆提供三個高變環或互補決定區(CDR)。如Winter等人，Ann. Rev. Immunol. ，12：433-455(1994)中所述，可以VH與VL經由可撓性短肽共價連接之單鏈Fv(scFv)片段形式或以各自與恆定域融合且非共價相互作用之Fab片段形式，在噬菌體上功能性呈現可變域。如本文所用，scFv編碼噬菌體純系以及Fab編碼噬菌體純系統稱為「Fv噬菌體純系」或「Fv純系」。
可單獨藉由聚合酶鏈反應(PCR)選殖VH及VL基因譜系且使其在噬菌體文庫中隨機重組，接著如Winter等人，Ann. Rev. Immunol .，12: 433-455(1994)中所述，可搜尋結合抗原之純系。來自經免疫來源之文庫無需建構融合瘤即可提供針對免疫原之高親和力抗體。或者，如Griffiths等人，EMBO J， 12: 725-734(1993)所述，天然譜系可經選殖以在無任何免疫作用下即提供針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原的單一來源之人類抗體。最終，如Hoogenboom及Winter，J. Mol. Biol. ，227: 381-388(1992)所述，亦可藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高變CDR3區且實現活體外重排來以合成方式製得天然文庫。
使用絲狀噬菌體，藉由使抗體片段與次要鞘蛋白pIII融合來呈現抗體片段。抗體片段可例如如Marks等人 ，J. Mol. Biol. ，222: 581-597(1991)中所述，呈現為單鏈Fv片段，其中VH域與VL域藉由可撓性多肽間隔子連接於同一多肽鏈上；或例如如Hoogenboom等人，Nucl. Acids Res. ，19: 4133-4137(1991)中所述，呈現為Fab片段，其中一個鏈與pIII融合而另一個分泌至細菌宿主細胞周質內，其中藉由置換一些野生型鞘蛋白而組裝呈現於噬菌體表面上之Fab-鞘蛋白結構。
一般而言，編碼抗體基因片段之核酸係獲自由人類或動物之採集之免疫細胞。若需要偏重於抗FGFR3純系之文庫，則以FGFR3使個體免疫以產生抗體反應，且回收脾細胞及/或循環B細胞、其他周邊血淋巴細胞(PBL)以用於建構文庫。在一較佳實施例中，偏重於抗FGFR3純系之人類抗體基因片段文庫可藉由在攜有功能性人類免疫球蛋白基因陣列(且缺乏功能性內源性抗體產生系統)之轉殖基因小鼠中產生抗FGFR3抗體反應以使得FGFR3免疫引起B細胞產生針對FGFR3之人類抗體來獲得。下文描述產生人類抗體之轉殖基因小鼠的產生。
可藉由使用適合篩選程序分離表現FGFR3特異性膜結合抗體之B細胞，例如藉由FGFR3親和層析進行細胞分離，或使細胞吸附至螢光染料標記之FGFR3，隨後進行流動式活化細胞分選(FACS)來獲得抗FGFR3反應性細胞群之額外增濃。
或者，使用來自未經免疫供體之脾細胞及/或B細胞或其他PBL提供可能抗體譜系之較好呈現，且亦允許使用FGFR3不具抗原性之任何動物(人類或非人類)物種來建構抗體文庫。對於併有活體外抗體基因建構之文庫而言，自個體採集幹細胞以提供編碼未經重排之抗體基因區段的核酸。相關免疫細胞可自多種動物物種獲得，諸如人類、小鼠、大鼠、兔類、狼、犬科、貓科、豬、牛、馬及鳥類物種等。
自相關細胞中回收編碼抗體可變基因區段(包括VH及VL片段)之核酸且使其擴增。在重排之VH及VL基因文庫之情況下，可如Orlandi等人，Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)， 86: 3833-3837(1989)中所述，藉由自淋巴細胞分離基因組DNA或mRNA，隨後用與重排之VH及VL基因之5'及3'末端匹配之引子進行聚合酶鏈反應(PCR)來獲得所需DNA，從而製得用於表現之不同V基因譜系。可如Orlandi等人，(1989)及Ward等人，Nature ，341: 544-546(1989)中所述，利用在藉由編碼成熟V域之外顯子之5'末端處的反向引子以及基於J-區段內之正向引子，自cDNA及基因組DNA擴增V基因。然而，為了自cDNA擴增，如Jones等人，Biotechnol. ，9: 88-89(1991)中所述，反向引子亦可基於前導外顯子中，且如Sastry等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)， 86: 5728-5732(1989)中所述，正向引子亦可處於恆定區內。為使互補性最大化，可如Orlandi等人(1989)或Sastry等人(1989)中所述，可在引子中併入簡併性。較佳，例如如Marks等人，J. Mol. Biol. ，222: 581-597(1991)之方法中所述或如Orum等人，Nucleic Acids Res. ，21: 4491-4498(1993)之方法中所述，可藉由使用靶向各V-基因家族之PCR引子以擴增免疫細胞核酸樣品中存在之所有可用之VH及VL配置來使文庫多樣性最大化。為將經擴增之DNA選殖至表現載體中，可如Orlandi等人(1989)中所述，在PCR引子內一端以標籤形式引入稀有限制性位點；或如Clackson等人，Nature ，352: 624-628(1991)中所述，用經標記之引子進行進一步PCR擴增引入稀有限制性位點。
以合成方式重排之V基因譜系可於活體外自V基因區段獲得。大部分人類VH基因區段已經選殖且測序(報導於Tomlinson等人，J. Mol. Biol.， 227: 776-798(1992)中)，且已經定位(報導於Matsuda等人，Nature Genet.， 3: 88-94(1993)中)；如Hoogenboom及Winter，J. Mol. Biol.， 227: 381-388(1992)中所述，可使用此等經選殖之區段(包括H1及H2環之所有主要構形)，利用編碼具有不同序列及長度之H3環的PCR引子產生不同VH基因譜系。如Barbas等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，89: 4457-4461(1992)中所述，亦可製得所有序列多樣性集中於具有單一長度之長H3環中的VH譜系。人類Vκ及Vλ區段已經選殖且測序(報導於Williams及Winter，Eur. J. Immunol. ，23: 1456-1461(1993)中)且可用於製得合成性輕鏈譜系。基於一系列VH及VL摺疊以及L3及H3長度的合成V基因譜系將編碼具有顯著結構多樣性之抗體。擴增編碼V-基因之DNA後，可根據Hoogenboom及Winter，J. Mol. Biol. ，227: 381-388(1992)之方法活體外重排生殖系V基因區段。
可藉由以若干方式將VH與VL基因譜系組合於一起來建構抗體片段之譜系。各譜系可形成於不同載體中，且例如如Hogrefe等人，Gene， 128:119-126(1993)中所述將載體重組，或藉由組合感染在活體內(例如，Waterhouse等人，Nucl. Acids Res.， 21:2265-2266(1993)中所述之loxP系統)進行。活體內重組方法利用Fab片段之雙鏈性質來克服大腸桿菌轉型效率對文庫規模所造成之限制。天然VH及VL譜系係單獨選殖，將一者選殖至噬菌粒中且將另一者選殖至噬菌體載體中。接著藉由含有噬菌粒之細菌的噬菌體感染使得各細胞含有不同組合來組合兩個文庫，且使文庫規模僅受所存在之細胞數目(約1012 個純系)限制。兩個載體皆含有活體內重組信號，以使得VH及VL基因重組於單一複製子上且共封裝於噬菌體病毒粒子中。此等大型文庫提供大量具有良好親和力(Kd -1 為約10-8 M)之不同抗體。
或者，可例如如Barbas等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，88:7978-7982(1991)中所述，將該等譜系依序選殖至同一載體中；或可例如如Clackson等人，Nature ，352:624-628(1991)中所述，藉由PCR將該等譜系組裝在一起且接著選殖。亦可使用PCR組裝用編碼可撓性肽間隔子之DNA將VH DNA與VL DNA接合在一起以形成單鏈Fv(scFv)譜系。在另一種技術中，如Embleton等人，Nucl. Acids Res. ，20:3831-3837(1992)中所述，使用「細胞內PCR組裝」藉由PCR將VH基因與VL基因在淋巴細胞內組合且接著選殖已連接基因之譜系。
由天然文庫產生之抗體(天然或合成)可具有中等親和力(Kd -1 為約106 至107 M-1 )，但如Winter等人(1994)(同上)中所述，亦可藉由建構次級文庫及自次級文庫中再選擇來活體外模擬親和力成熟。舉例而言，可藉由以Hawkins等人，J. Mol. Biol. ，226: 889-896(1992)之方法或以Gram等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA ，89: 3576-3580(1992)之方法，使用易錯聚合酶(Leung等人，Technique ，1:11-15(1989)中所報導)在活體外隨機引入突變。另外，可藉由例如使用以攜有跨相關CDR之隨機序列的引子進行之PCR使所選個體Fv純系中之一或多個CDR隨機突變，且篩選較高親和力純系來進行親和力成熟。WO 96/07754(1996年3月14日公開)描述在免疫球蛋白輕鏈之互補決定區中誘導突變以形成輕鏈基因文庫的方法。另一有效方法係如Marks等人，Biotechnol. ，10:779-783(1992)中所述，將由噬菌體呈現所選擇之VH域或VL域與自未經免疫之供體獲得之天然存在之V域變異體譜系重組且以若干輪鏈再洗牌(chain reshuffling)針對較高親和力來篩選。此技術允許產生親和力在10-9 M範圍內之抗體及抗體片段。
FGFR3核酸及胺基酸序列在此項技術中為已知的。編碼FGFR3之核酸序列可使用FGFR3之所需區域之胺基酸序列來設計。如此項技術中所熟知，FGFR3有兩種主要之剪接之同功異型物，FGFR3 IIIb及FGFR3 IIIc。FGFR3序列在此項技術中為熟知的且可包括UniProKB/Swiss-Prot寄存編號：P22607(FGFR3 IIIc)或P22607_2(FGFR3 IIIb)之序列。FGFR3突變已經鑑別且在此項技術中為熟知的且包括下列突變(參考UniProKB/Swiss-Prot寄存編號：P22607(FGFR3 IIIc)或P22607_2(FGFR3 IIIb)中所示之序列)：
FGFR3-IIIb　FGFR3 IIIc
R248C　R248C
S249C　S249C
G372C　G370C
Y375C　Y373C
G382R　G380R
K652E　K650E
編碼FGFR3之核酸可藉由此項技術中已知之多種方法製備。此等方法包括(但不限於)藉由Engels等人，Agnew .Chem. Int. Ed. Engl .，28: 716-734(1989)中所述之任何方法(諸如三酯、亞磷酸酯、胺基磷酸酯及H-膦酸酯方法)進行化學合成。在一實施例中，使用表現宿主細胞較佳之密碼子來設計編碼FGFR3之DNA。或者，可將編碼FGFR3之DNA自基因組或cDNA文庫中分離。
在建構編碼FGFR3之DNA分子後，將DNA分子可操作地連接於表現載體(諸如質體)中之表現控制序列，其中該控制序列係由經載體轉型之宿主細胞識別。一般而言，質體載體含有獲自可與宿主細胞相容之物種之複製及控制序列。載體通常攜有複製位點以及編碼能夠在經轉型細胞中提供表型選擇之蛋白質的序列。適用於在原核及真核宿主細胞中表現之載體在此項技術中為已知，且一些載體將在本文中進一步描述。可使用真核生物體(諸如酵母)或獲自多細胞生物體(諸如哺乳動物)之細胞。
視情況，將編碼FGFR3之DNA可操作地連接於分泌性前導序列，從而使宿主細胞分泌表現產物至培養基中。分泌性前導序列之實例包括stII、大腸桿菌素(ecotin)、lamB、疱疹GD、lpp、鹼性磷酸酶、轉化酶及α因子。蛋白質A之36個胺基酸前導序列亦適用於本文中(Abrahmsen等人，EMB O J .，4: 3901(1985))。
用上文所述之本發明之表現或選殖載體轉染宿主細胞且較佳使宿主細胞轉型，並將其於習知營養培養基中培養，若適宜，該營養培養基經改質以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。
轉染係指宿主細胞吸收表現載體，而無論是否實際上表現任何編碼序列。多種轉染方法(例如CaPO4 沈澱及電穿孔)為一般技術者所知。一般當在宿主細胞中出現任何有關此載體運作之指示時，認為轉染成功。轉染方法在此項技術中為熟知，且一些方法將於本文中進一步描述。
轉型意謂將DNA引入生物體中使得DNA可作為染色體外元件或由染色體成分複製。視所用之宿主細胞而定，使用適於此等細胞之標準技術進行轉型。轉型方法在此項技術中為熟知，且一些方法將於本文中進一步描述。
用於產生FGFR3之原核宿主細胞可如Sambrook等人(同上)中一般描述培養。
用於產生FGFR3之哺乳動物宿主細胞可於多種培養基中培養，該培養基在此項技術中為熟知的且其中一些培養基在本文中描述。
本發明中所提及之宿主細胞涵蓋活體外培養物中之細胞以及宿主動物體內之細胞。
FGFR3之純化可使用此項技術公認之方法完成，其中一些方法在本文中描述。
可將經純化之FGFR3附接於適合基質上，諸如瓊脂糖珠粒、丙烯醯胺珠粒、玻璃珠粒、纖維素、各種丙烯酸系共聚物、羥基甲基丙烯酸酯凝膠、聚丙烯酸及聚甲基丙烯酸系共聚物、耐綸(nylon)、中性及離子性載體及其類似物，以用於噬菌體呈現純系之親和層析分離。FGFR3蛋白附接至基質可藉由Methods in Enzymology ，第44卷(1976)中所述之方法完成。使蛋白配位體附接於多醣基質(例如瓊脂糖、聚葡萄糖或纖維素)上之常用技術涉及用鹵化氰活化載體且隨後使肽配位體之一級脂族或芳族胺與經活化之基質偶合。
或者，可使用FGFR3塗布吸附板之孔，可使FGFR3表現於附著於吸附板之宿主細胞上或FGFR3可用於細胞分選，或可與生物素結合以便用塗有抗生蛋白鏈菌素之珠粒捕捉，或可用於淘選噬菌體呈現文庫之任何其他此項技術中已知之方法中。
在適於使噬菌體顆粒之至少一部分與吸附劑結合之條件下，使噬菌體文庫樣品與固定之FGFR3接觸。通常，選擇包括pH值、離子強度、溫度及其類似條件之條件以模擬生理條件。洗滌結合至固相之噬菌體且接著例如如Barbas等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA ，88: 7978-7982(1991)中所述藉由酸溶離；或例如如Marks等人，J. Mol. Biol.， 222: 581-597(1991)中所述藉由鹼溶離；或例如以類似於Clackson等人，Nature ，352：624-628(1991)之抗原競爭方法之程序藉由FGFR3抗原競爭來溶離。在單輪選擇中噬菌體可增濃20-1,000倍。此外，可使經增濃之噬菌體在細菌培養物中生長且再進行數輪選擇。
選擇效率視多種因素而定，包括洗滌期間之解離動力學及單個噬菌體上之多個抗體片段可否同時與抗原嚙合。可藉由使用短時間洗滌、多價噬菌體呈現及抗原在固相中較高塗布密度來保留具有快速解離動力學(及較弱結合親和力)之抗體。高密度不僅經由多價相互作用使噬菌體穩定，且亦有利於使已解離之噬菌體再結合。可藉由使用長時間洗滌及單價噬菌體呈現(如Bass等人，Proteins ，8：309-314(1990)及WO 92/09690中所述)及低抗原塗布密度(如Marks等人，Biotechnol. ，10：779-783(1992)中所述)來促進具有緩慢解離動力學(及優良結合親和力)之抗體的選擇。
可能在對FGFR3具有不同親和力，甚至略有不同之親和力之噬菌體抗體之間進行選擇。然而，所選抗體之隨機突變(例如，如上文所述之一些親和力成熟技術中所進行)可能會產生許多突變體，大部分結合於抗原，而有一些具有較高親和力。使用限制FGFR3，可能競爭淘汰極少之高親和力噬菌體。為保留所有較高親和力突變體，可將噬菌體與過量經結合生物素之FGFR3一起培育，但經結合生物素之FGFR3的莫耳濃度低於FGFR3之標靶莫耳親和力常數。接著可用塗有抗生蛋白鏈菌素之順磁珠粒捕捉高親和力結合噬菌體。此「平衡捕捉」允許根據抗體之結合親和力來選擇抗體，其靈敏度允許自極大過量之具有較低親和力之噬菌體分離出親和力僅高兩倍之突變體純系。亦可操縱在洗滌結合至固相之噬菌體中所使用之條件以基於解離動力學進行區分。
可基於活性選擇FGFR3純系。在一實施例中，本發明提供阻斷FGFR3受體與其配位體(諸如FGF1及/或FGF9)結合之FGFR3抗體。可藉由以下來選擇對應於該等抗FGFR3抗體之Fv純系：(1)如上文所述自噬菌體文庫中分離FGFR3純系，且視情況藉由使經分離噬菌體純系群體在適合細菌宿主中生長來擴增該群體；(2)選擇分別需要阻斷活性及不需要阻斷活性之FGFR3及第二蛋白質；(3)將抗FGFR3噬菌體純系吸附至固定之FGFR3；(4)使用過量之第二蛋白質溶離識別FGFR3結合決定子的任何不當純系，該等FGFR3結合決定子與第二蛋白質之結合決定子重疊或共享；及(5)將步驟(4)後仍吸附之純系溶離。視情況可藉由將本文所述之選擇程序重複一或多次進一步增濃具有所需阻斷/非阻斷特性之純系。
使用習知程序(例如藉由使用經設計以自融合瘤或噬菌體DNA模板特異性擴增相關重鏈及輕鏈編碼區之寡核苷酸引子)可輕易地分離編碼本發明之源自融合瘤之單株抗體或噬菌體呈現Fv純系的DNA且進行測序。分離後，即可將DNA置於表現載體中，接著將該等表現載體轉染至在其他情況下不會產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以在重組宿主細胞中獲得所需單株抗體之合成。關於在細菌中重組表現編碼抗體之DNA的評述文章包括Skerra等人，Curr. Opinionin Immunol .，5: 256(1993)及Pluckthun，Immunol. Revs ，130:151(1992)。
可將編碼本發明Fv純系之DNA與編碼重鏈及/或輕鏈恆定區之已知DNA序列(例如適當DNA序列可由Kabat等人(同上)獲得)組合以形成編碼全長或部分長度重鏈及/或輕鏈之純系。應瞭解，任何同型之恆定區均可用於此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且該等恆定區可自任何人類或動物物種獲得。如本文所用之「嵌合」抗體及「雜交」抗體之定義中包括源自一種動物(諸如人類)物種之可變域DNA且接著與另一動物物種之恆定區DNA融合以形成「雜交」全長重鏈及/或輕鏈之編碼序列的Fv純系。在一較佳實施例中，源自人類可變DNA之Fv純系與人類恆定區DNA融合以形成全長或部分長度之所有人類重鏈及/或輕鏈之編碼序列。
亦可例如藉由以人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列代替源自融合瘤純系之同源鼠類序列，來修飾編碼本發明之源自融合瘤之抗FGFR3抗體的DNA(例如Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，81:6851-6855(1984)之方法)。可藉由使非免疫球蛋白多肽之所有或部分編碼序列共價接合至免疫球蛋白編碼序列來進一步修飾編碼源自融合瘤或Fv純系之抗體或片段的DNA。以此方式製備具有本發明之源自Fv純系或融合瘤純系之抗體之結合特異性的「嵌合」或「雜交」抗體。
抗體片段
本發明涵蓋抗體片段。在某些情況下，使用抗體片段而非整個抗體具有優勢。較小尺寸之片段允許快速清除且可致使更易接近實體腫瘤。
已開發出各種用於產生抗體片段之技術。傳統上，此等片段可經由完整抗體之蛋白水解消化來獲得(參見，例如Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)；及Brennan等人，Science，229:81(1985))。然而，此等片段現在可由重組宿主細胞直接產生。Fab、Fv及ScFv抗體片段皆可在大腸桿菌中表現且自大腸桿菌分泌，從而允許輕易地產生大量此等片段。可自上文所論述之抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。或者，可直接自大腸桿菌回收Fab'-SH片段且以化學方式偶合以形成F(ab')2 片段(Carter等人，Bio/Technology 10:163-167(1992))。根據另一方法，F(ab')2 片段可直接自重組宿主細胞培養物中分離。於美國專利第5,869,046號中描述活體內半衰期增加之包含救助受體結合抗原決定基殘基之Fab及F(ab')2 片段。產生抗體片段之其他技術為熟練之專業人員所顯而易見。在其他實施例中，所選之抗體為單鏈Fv片段(scFv)(參見例如WO 93/16185；美國專利第5,571,894號及第5,587,458號)。Fv及sFv為唯一具有完整組合位點而缺乏恆定區之物質；因此，其適用於在活體內使用期間減少非特異性結合。可建構sFv融合蛋白以使效應蛋白於sFv之胺基或羧基末端處融合。參見Antibody Engineering，Borrebaeck編(同上)。例如如美國專利第5,641,870號中所述，抗體片段亦可為「線性抗體」。此等線性抗體片段可為單特異性或雙特異性抗體。
人類化抗體
本發明涵蓋人類化抗體。在此項技術中已知各種用於使非人類抗體人類化之方法。舉例而言，人類化抗體中可引入一或多個來自非人類來源之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基常稱為「輸入」殘基，其通常獲自「輸入」可變域。人類化基本上可遵循Winter及同事之方法(Jones等人，(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等人，(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen等人， (1988)Science 239:1534-1536)藉由用高變區序列取代人類抗體之相應序列來進行。因此，此等「人類化」抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上小於完整之人類可變域已經來自非人類物種之相應序列所取代。實務上，人類化抗體通常為一些高變區殘基及可能一些FR殘基經齧齒動物抗體中類似位點之殘基所取代的人類抗體。
欲用於製備人類化抗體之人類可變域(輕鏈及重鏈)之選擇對於降低抗原性而言極為重要。根據所謂之「最佳擬合」方法，針對已知人類可變域序列之整個文庫篩選齧齒動物抗體之可變域序列。接著將最接近齧齒動物序列的人類序列當作人類化抗體之人類構架(Sims等人，(1993)J. Immunol. 151：2296；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol. 196：901)。另一方法使用源自所有人類抗體特定輕鏈或重鏈子群之共同序列的特定構架。同一構架可用於若干不同人類化抗體(Carter等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ，89：4285；Presta等人，(1993)J. Immunol .，151：2623)。
另外重要的是，使抗體在保留對抗原之高親和力及其他適宜生物特性下人類化。為達成此目標，根據一種方法，藉由使用親本序列及人類化序列之三維模型來分析親本序列及各種概念上之人類化產物的方法來製備人類化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可用且為熟習此項技術者所熟悉。可用說明及呈現所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。對此等呈現之檢查允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列發揮功能過程中可能起到的作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自受體及輸入序列選擇FR殘基並將其組合，以便達成所需抗體特徵，諸如增加對標靶抗原之親和力。一般而言，高變區殘基直接且最實質性地涉及對抗原結合的影響。
人類抗體
可藉由將選自源自人類之噬菌體呈現文庫之Fv純系可變域序列與如上文所述之已知人類恆定域序列組合來建構本發明之人類抗FGFR3抗體。或者，可藉由融合瘤方法製得本發明之人類單株抗FGFR3抗體。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株已由例如KozborJ. Immunol. ，133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications ，第51-63頁(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；及Boerner等人，J. Immunol .，147:86(1991)描述。
目前有可能產生能夠在免疫後在不產生內源性免疫球蛋白的情況下產生完全人類抗體譜系之轉殖基因動物(例如小鼠)。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈接合區(JH)基因之同型合子缺失會致使內源性抗體產生之完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此生殖系突變小鼠中將會使得在抗原攻毒後產生人類抗體。參見例如Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA， 90: 2551(1993)；Jakobovits等人，Nature， 362: 255(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.， 7:33(1993)。
亦可使用基因洗牌(gene shuffling)以自非人類(例如齧齒動物)抗體衍生人類抗體，其中人類抗體與初始非人類抗體具有類似親和力及特異性。根據此方法(其亦稱作「抗原決定基印記法(epitope imprinting)」)，如上文所述由噬菌體呈現技術獲得之非人類抗體片段之重鏈或輕鏈可變區用人類V域基因譜系置換，形成非人類鏈/人類鏈scFv或Fab嵌合體之群體。用抗原進行選擇造成非人類鏈/人類鏈嵌合scFv或Fab分離，其中人類鏈使得初始噬菌體呈現純系中相應非人類鏈移除時遭破壞之抗原結合位點恢復，亦即抗原決定基決定(印記)人類鏈搭配物之選擇。當重複此過程以置換其餘非人類鏈時，獲得人類抗體(參見1993年4月1日公開之PCT WO 93/06213)。不同於傳統上藉由CDR移植來使非人類抗體人類化，此技術提供不具非人類來源之FR或CDR殘基的完全人類抗體。
雙特異性抗體
雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株抗體，較佳為人類或人類化抗體。在本發明中，一種結合特異性係針對FGFR3，而另一種係針對任何其他抗原。例示性雙特異性抗體可結合FGFR3之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於使細胞毒性劑定位於表現FGFR3之細胞。此等抗體具有FGFR3結合臂及結合細胞毒性劑(例如沙伯甯(saporin)、抗干擾素-α、長春花屬生物鹼(vinca alkaloid)、蓖麻毒素A鏈(ricin A chain)、甲胺喋呤或放射性同位素半抗原)之臂。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2 雙特異性抗體)。
在此項技術中已知製備雙特異性抗體之方法。傳統上，雙特異性抗體之重組產生係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對共表現，其中兩個重鏈具有不同特異性(Milstein及Cuello,Nature ,305：537(1983))。因為免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配，故此等融合瘤(四源雜交瘤(quadromas))產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一者具有正確雙特異性結構。通常該正確分子藉由親和層析步驟進行之純化相當繁瑣，且產物產率低。類似程序揭示於1993年5月13日公開之WO 93/08829及Traunecker等人，EMBOJ. ,10：3655(1991)。
根據一種不同且較佳之方法，使具有所需結合特異性之抗體可變域(抗體-抗原結合位點)與免疫球蛋白恆定域序列融合。融合較佳為與包含鉸鏈區、CH2及CH3區之至少一部分之免疫球蛋白重鏈恆定域之融合。較佳含有輕鏈結合所必需之位點的第一重鏈恆定區(CH1)存在於至少一種融合體中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA***各別表現載體中且共轉染至適合宿主生物體中。在建構中所用之3個多肽鏈之不等比率提供最佳產率之實施例中，此將為調整3個多肽片段之相互比例提供較大靈活性。然而，當相等比率之至少兩個多肽鏈之表現引起高產率時，或當該等比率不具有特定意義時，有可能將兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列***一種表現載體中。
在此方法之一較佳實施例中，雙特異性抗體係由在一個臂中具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈及另一個臂中之雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發現由於免疫球蛋白輕鏈僅於一半雙特異性分子中存在提供一種簡便之分離方式，故此不對稱結構有助於所需雙特異性化合物與不合需要之免疫球蛋白鏈組合分離。此方法係揭示於WO 94/04690中。關於產生雙特異性抗體之其他細節，參見例如Suresh等人，Methods in Enzymology ，121:210(1986)。
根據另一方法，可將一對抗體分子之間的界面工程改造以使自重組細胞培養物中回收之雜二聚體的百分比最大化。較佳界面包含抗體恆定域之CH 3域之至少一部分。在此方法中，一或多個來自第一抗體分子之界面的小胺基酸側鏈經較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換。藉由將大胺基酸側鏈置換為較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)可在第二抗體分子之界面上產生與大側鏈尺寸相同或類似之補償性「空腔」。此提供一種使雜二聚體之產率增加超過其他不合需要之最終產物(諸如均二聚體)的機制。
雙特異性抗體包括交聯或「異源結合」抗體。舉例而言，異源結合物中之一種抗體可與抗生物素蛋白偶合，另一者與生物素偶合。此等抗體據稱例如可使免疫系統細胞靶向不合需要之細胞(美國專利第4,676,980號)且可用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/00373及EP 03089)。異源結合抗體可使用任何適合之交聯方法製得。適合之交聯劑及多種交聯技術在此項技術中為熟知的且係於美國專利第4,676,980號中揭示。
自抗體片段產生雙特異性抗體之技術亦已描述於文獻中。舉例而言，可使用化學鍵聯製備雙特異性抗體。Brennan等人，Science ，229: 81(1985)描述將完整抗體蛋白質裂解產生F(ab')2 片段之程序。在二硫醇錯合劑亞砷酸鈉存在下還原此等片段以穩定鄰近二硫醇且防止分子間形成二硫鍵。接著將所產生之Fab'片段轉化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接著藉由用巰基乙胺還原將一種Fab'-TNB衍生物再轉化為Fab'-硫醇，且將其與等莫耳量之另一Fab'-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作選擇性固定酶之試劑。
新近發展已促成自大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，可將該等片段化學偶合形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J. Exp. Med. ，175: 217-225(1992)描述完全人類化雙特異性抗體F(ab')2 分子之產生。各Fab'片段係單獨地由大腸桿菌分泌且對其進行活體外定向化學偶合以形成雙特異性抗體。由此形成之雙特異性抗體能夠結合至過度表現HER2受體之細胞及正常人類T細胞，並且觸發人類細胞毒性淋巴細胞針對人類***腫瘤標靶之溶解活性。
亦已描述各種直接自重組細胞培養物製造且分離雙特異性抗體片段之技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(Kostelny等人，J. Immunol. ，148(5):1547-1553(1992))。藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽連接於兩種不同抗體之Fab'部分。在鉸鏈區還原抗體均二聚體以形成單體，且接著將其再氧化以形成抗體雜二聚體。此方法亦可用於產生抗體均二聚體。Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，90:6444-6448(1993)所述之「雙功能抗體」技術提供製造雙特異性抗體片段之替代機制。該等片段包含重鏈可變域(VH)經連接子連接至輕鏈可變域(VL)，該連接子過短而使同一鏈上之兩個結構域之間無法配對。因此，迫使一個片段之VH及VL域與另一個片段之互補VL及VH域配對，從而形成兩個抗原結合位點。亦已報導藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體來製造雙特異性抗體片段之另一策略。參見Gruber等人，J. Immunol. ，152:5368(1994)。
涵蓋具有兩價以上之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人，J. Immunol. 147: 60(1991)。
多價抗體
多價抗體可比二價抗體更快地由表現抗體所結合之抗原的細胞內化(及/或分解代謝)。本發明之抗體可為具有三個或三個以上抗原結合位點之多價抗體(不為IgM類別)(例如四價抗體)，其可藉由重組表現編碼抗體多肽鏈之核酸而輕易地製造。多價抗體可包含二聚化結構域及三個或三個以上抗原結合位點。較佳二聚化結構域包含Fc區或鉸鏈區(或由其組成)。在此情形下，抗體將包含Fc區及三個或三個以上處於Fe區胺基末端之抗原結合位點。本文中之較佳多價抗體包含三個至約八個，但較佳四個抗原結合位點(或由其組成)。多價抗體包含至少一個多肽鏈(且較佳兩個多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或兩個以上可變域。舉例而言，多肽鏈可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，Fc為Fc區之一個多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。舉例而言，多肽鏈可包含：VH-CH1-可撓性連接子-VH-CH1-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文之多價抗體較佳進一步包含至少兩個(且較佳四個)輕鏈可變域多肽。本文之多價抗體可例如包含約兩個至約八個輕鏈可變域多肽。本文所涵蓋之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視情形進一步包含CL域。
抗體變異體
在一些實施例中，涵蓋對本文所述之抗體之胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。抗體之胺基酸序列變異體係藉由將適合核苷酸變化引入抗體核酸中或藉由肽合成來製備。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列內殘基缺失及/或***及/或取代。進行缺失、***及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需之特徵。可在製造序列時將胺基酸變化引入本發明之抗體胺基酸序列中。
如Cunningham及Wells(1989)Science，244：1081-1085所述，適用於鑑別抗體之較佳作為突變誘發位置之某些殘基或區域的方法稱作「丙胺酸掃描突變誘發」。此處，鑑別出一個殘基或一組標靶殘基(例如，帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且置換為中性或帶負電之胺基酸(最佳為丙胺酸或聚丙胺酸)以影響胺基酸與抗原之相互作用。接著藉由在取代位點處或針對取代位點引入另外或其他變異體來改進對取代表現功能敏感性之彼等胺基酸位置。因此，雖然引入胺基酸序列變異之位點預先確定，但突變本身之性質無需預先確定。舉例而言，為分析既定位點處突變之效能，在標靶密碼子或區域處進行ala掃描或隨機突變誘發，且針對所需活性篩選所表現之免疫球蛋白。
胺基酸序列***物包括長度範圍為1個殘基至含有100個或100個以上殘基之多肽之胺基及/或羧基末端融合體，以及序列內***單個或多個胺基酸殘基。未端***物之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體或與細胞毒素多肽融合之抗體。抗體分子之其他***變異體包括抗體之N末端或C末端與酶(例如，對於ADEPT)或增加抗體之血清半衰期之多肽的融合體。
多肽之糖基化通常為N-連接型或O-連接型。N-連接型係指碳水化合物部分附接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)為使碳水化合物部分酶促附接至天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，多肽中此等三肽序列中任一者之存在產生潛在糖基化位點。O-連接之糖基化係指糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者附接至羥基胺基酸，最常附接至絲胺酸或蘇胺酸，然而亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
適宜地藉由改變胺基酸序列，以使其含有一或多個上述三肽序列來實現向抗體中添加糖基化位點(針對N-連接型糖基化位點)。該改變亦可藉由在初始抗體之序列中進行一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基之添加或取代而產生(針對O-連接型糖基化位點)。
當抗體包含Fc區時，可改變與其附接之碳水化合物。舉例而言，具有缺乏岩藻糖之成熟碳水化合物結構附接於抗體Fc區之抗體於美國專利申請案第US 2003/0157108號(Presta，L.)中描述。亦參見US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。在附接於抗體Fc區之碳水化合物中具有平分型N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)之抗體在WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)及美國專利第6,602,684號(Umana等人)中提及。在附接於抗體Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體係於WO 1997/30087(Patel等人)中報導。關於附接於抗體Fc區之碳水化合物經改變之抗體，亦參見WO 1998/58964(Raju，S.)及WO 1999/22764(Raju，S.)。關於具有經修飾之糖基化的抗原結合分子，亦參見US 2005/0123546(Umana等人)。
本文之較佳糖基化變異體包含Fc區，其中附接於Fc區之碳水化合物結構缺乏岩藻糖。此等變異體具有改良之ADCC功能。視情況，Fc區進一步包含一或多處進一步改良ADCC之胺基酸取代，例如Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)之取代。與「脫岩藻糖化」或「岩藻糖缺乏」之抗體有關之出版物的實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；Okazaki等人，J. Mol. Biol . 336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614(2004)。產生脫岩藻糖化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻糖化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta，L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其實例11)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8 基因剔除CHO細胞(Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614(2004))。
另一類型變異體為胺基酸取代變異體。在此等變異體中，抗體分子中之至少一個胺基酸(至少2個、至少3個、至少4個或4個以上)殘基經不同殘基置換。雖然最為關注之用於取代突變誘發之位點包括高變區，但亦涵蓋FR變化。表1中在標題「較佳取代」下展示保守性取代。若此等取代引起生物活性改變，則可引入表1中命名為「例示性取代」或如下文關於胺基酸類別所進一步描述之更具實質性之變化且篩選產物。
可藉由選擇在以下方面作用顯著不同之取代來實現對抗體之生物特性之實質修飾：維持(a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如摺疊或螺旋構形；(b)分子在標靶位點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈體積。可根據共同側鏈特性將天然存在之殘基分組：
(1)　疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)　中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)　酸性：asp、glu；
(4)　鹼性：his、lys、arg；
(5)　影響鏈取向之殘基：gly、pro；及
(6)　芳族：trp、tyr、phe。
非保守性取代將需要將此等類別中之一者之成員更換成另一類別。
一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，所選用於進一步開發之所得變異體相對於產生其之親本抗體而言生物特性有所改良。產生此等取代變異體之適宜方式涉及使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言之，使若干高變區位點(例如6-7個位點)突變以在各位點處產生所有可能之胺基酸取代。自絲狀噬菌體顆粒以與各顆粒內所封裝之M13之基因III產物之融合體形式呈現由此產生之抗體。接著如本文所揭示針對生物活性(例如結合親和力)篩選噬菌體呈現之變異體。為鑑別供修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描突變誘發以鑑別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。或者或另外，可有益地分析抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基及鄰近殘基為根據本文詳述之技術進行取代的候選者。在產生此等變異體後，即如本文所述對變異體組進行篩選，且可選擇在一或多個相關檢定中具有優良特性之抗體用於進一步開發。
編碼抗體之胺基酸序列變異體的核酸分子係藉由此項技術中已知之多種方法來製備。此等方法包括(但不限於)自天然來源分離(在天然存在之胺基酸序列變異體之情況下)，或藉由對早期製備之抗體變異體或非變異體形式進行寡核苷酸介導(或定點)之突變誘發、PCR突變誘發及盒式突變誘發來製備。
可能需要在本發明之免疫球蛋白多肽之Fc區中引入一或多處胺基酸修飾，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置(包括鉸鏈半胱胺酸位置)包含胺基酸修飾(例如取代)的人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
根據本說明書及此項技術之教示，預期在一些實施例中，本發明之方法中所用之抗體可能例如在Fc區中相較於野生型對應物抗體包含一或多處變化。然而，此等抗體仍保留與其野生型對應物相比實質上相同之為治療效用所需之特徵。舉例而言，吾人認為可在Fc區中產生引起C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)變化(亦即改良或減弱)之某些改變，例如如WO 99/51642中所述。關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan & WinterNature 322:738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。WO 00/42072(Presta)及WO 2004/056312(Lowman)描述與FcR之結合經改良或減弱之抗體變異體。此等專利公開案之內容係特別以引用的方式併入本文中。亦參見Shields等人，J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001)。US 2005/0014934A1(Hinton等人)中描述半衰期增加且與新生兒Fc受體(FcRn)之結合改良之抗體，其中FcRn負責將母體IgG轉移至胎兒體內(Guyer等人，J. Immunol. 117:587(1976)及Kim等人，J. Immunol. 24:249(1994))。此等抗體包含具有一或多處改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。Fc區胺基酸序列經改變且Clq結合能力增加或降低之多肽變異體係於美國專利第6,194,551B1號、WO 99/51642中描述。彼等專利公開案之內容係特別以引用的方式併入本文中。亦參見Idusogie等人，J. Immunol. 164:4178-4184(2000)。
抗體衍生物
本發明之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且易於得到之額外非蛋白質部分。適於衍生抗體之部分較佳為水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中之穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或非分支鏈。附接至抗體之聚合物之數目可不同，且若附接一個以上聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)以下之考慮來確定：待改良之抗體之特定特性或功能、抗體衍生物是否可在指定條件下用於治療等。
篩選具有所需特性之抗體
可藉由此項技術中已知之各種檢定(其中一些於本文中揭示)對本發明抗體之物理/化學特性及生物功能進行表徵。在一些實施例中，抗體特徵在於以下任何一或多者：降低或阻斷FGF(諸如FGF1及/或FGF9)結合、降低或阻斷FGFR3活化、降低或阻斷FGFR3下游分子信號傳導、破壞或阻斷FGFR3與配位體(例如FGF1、FGF9)結合、降低或阻斷FGFR3二聚、促進單體FGFR3形成、結合至單體FGFR3，及/或治療及/或預防腫瘤、細胞增殖性病症或癌症；及/或治療或預防與FGFR3表現及/或活性(諸如FGFR3表現及/或活性增強)相關之病症。在一些實施例中，針對增強之FGFR3活化、增強之FGFR3下游分子信號傳導、細胞凋亡活性、FGFR3下調及效應功能(例如ADCC活性)篩選抗體。
可進一步藉由一系列檢定對經純化之抗體進行表徵，該等檢定包括(但不限於)N末端測序、胺基酸分析、未變性尺寸排除高壓液相層析(HPLC)、質譜、離子交換層析及番木瓜蛋白酶消化。
在本發明之某些實施例中，分析本文所產生之抗體的生物活性。在一些實施例中，測試本發明抗體之抗原結合活性。此項技術中已知且可用於本文中之抗原結合檢定包括(但不限於)使用諸如西方墨點法之技術之任何直接或競爭性結合檢定、放射免疫檢定、ELISA(酶聯結免疫吸附劑檢定)、「夾心」免疫檢定、免疫沈澱檢定、螢光免疫檢定及蛋白質A免疫檢定。以下實例部分中提供說明性抗原結合及其他檢定。
若需要抑制細胞生長之抗FGFR3抗體，則可以量測對細胞生長之抑制的活體外及/或活體內檢定測試候選抗體。若需要促進或不促進細胞凋亡之抗FGFR3抗體，則可以量測細胞凋亡之檢定測試候選抗體。用於分析癌細胞生長及/或增殖或測定癌細胞細胞凋亡之方法在此項技術中熟知且一些方法係描述且例示於本文中。測定細胞生長及/或增殖及/或細胞凋亡之例示性方法包括例如BrdU併入檢定、MTT、[3H]-胸苷併入(例如TopCount檢定(PerkinElmer))、細胞活力檢定(例如CellTiter-Glo(Promega))、DNA斷裂檢定、卡斯蛋白酶活化檢定、錐蟲藍排除、染色質形態檢定及其類似檢定。
在一實施例中，本發明涵蓋具有效應功能之抗體。在某些實施例中，量測抗體之Fc活性。可進行活體外及/或活體內細胞毒性檢定以確定CDC及/或ADCC活性降低/缺乏。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合檢定，以確保抗體缺乏FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC之初級細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR於造血細胞上之表現係於Ravetch及Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)之第464頁上之表3中概述。評定相關分子之ADCC活性之活體外檢定之實例係於美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中描述。偵測ADCC活性之檢定亦例示於本文中。適用於此等檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在活體內(例如在諸如Clynes等人，PNAS(USA)95:652-656(1998)中所揭示之動物模型中)評定相關分子之ADCC活性。亦可進行Clq結合檢定以確定抗體不能結合Clq且因此缺乏CDC活性。為評定補體活化，可進行例如如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163(1996)中所述之CDC檢定。亦可使用此項技術中已知之方法(例如實例部分中所述之彼等方法)進行FcRn結合測定及活體內清除率/半衰期測定。
若需要結合單體FGFR3之抗FGFR3抗體，則可以量測與單體FGFR3之結合及對單體FGFR3形成之促進的檢定(諸如活體外檢定)測試候選抗體。此等檢定在此項技術中已知，且一些檢定係描述且例示於本文中。
若需要抑制FGFR3二聚之抗FGFR3抗體，則可以例如如本文所述及所例示之二聚檢定測試候選抗體。
在一些實施例中，測定候選抗體之FGFR3促效劑功能。用於評定FGFR3抗體之促效劑功能或活性的方法在此項技術中已知且一些方法亦描述且例示於本文中。
在一些實施例中，例如使用本文所述及所例示之方法測定FGFR3抗體促進FGFR3受體下調之能力。在一實施例中，將FGFR3抗體與適合之測試細胞(例如膀胱癌細胞株(例如RT112))一起培育，且在適合時段後，採集細胞溶胞物且分析其總FGFR3含量。亦可使用FACS分析來分析在與候選FGFR3抗體一起培育後表面FGFR3受體含量。
載體、宿主細胞及重.組方法
為重組產生本發明之抗體，分離編碼該抗體之核酸且將其***可複製之載體中以便進一步選殖(擴增DNA)或表現。可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)輕易地分離編碼抗體之DNA且測序。可利用多種載體。對載體之選擇部分視欲使用之宿主細胞而定。一般而言，較佳宿主細胞具有原核或真核(一般為哺乳動物)來源。應瞭解任何同型之恆定區均可用於此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此等恆定區可自任何人類或動物物種獲得。
a.使用原核宿主細胞產生抗體：
i.載體建構
可使用標準重組技術獲得編碼本發明抗體之多肽組分的聚核苷酸序列。可自抗體產生細胞(諸如融合瘤細胞)中分離所需聚核苷酸序列且進行測序。或者，可使用核苷酸合成器或PCR技術合成聚核苷酸。獲得後，將編碼多肽之序列***在原核宿主中能夠複製並表現異源聚核苷酸之重組載體中。可獲得且此項技術中已知之許多載體均可用於本發明目的。對適合載體之選擇將主要視***載體中之核酸之尺寸及欲經載體轉型之特定宿主細胞而定。各載體含有多種組分，此視其功能(異源聚核苷酸擴增或表現，或兩者)及其與存在其之特定宿主細胞的相容性而定。載體組分一般包括(但不限於)：複製起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸***物及轉錄終止序列。
一般而言，與此等宿主聯合使用含有源自與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列的質體載體。載體通常攜有複製位點以及能夠於經轉型細胞中提供表型選擇之標記序列。舉例而言，通常使用pBR322(源自大腸桿菌物種之質體)轉型大腸桿菌。pBR322含有編碼安比西林(ampicillin，Amp)及四環素(tetracycline，Tet)抗性之基因，且因此提供鑑別經轉型細胞之簡便方式。pBR322、其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可含有或經修飾含有可由微生物體使用以表現內源性蛋白之啟動子。用於表現特定抗體之pBR322衍生物之實例於Carter等人之美國專利第5,648,237號中詳細描述。
此外，可與此等宿主聯合使用含有與宿主微生物相容之複製子及控制序列的噬菌體載體作為轉型載體。舉例而言，可利用諸如λGEM.TM.-11之噬菌體製得可用於轉型諸如大腸桿菌LE392之敏感宿主細胞之重組載體。
本發明之表現載體可包含兩種或兩種以上編碼各多肽組分之啟動子-順反子對。啟動子為位於順反子上游(5')調節其表現之未經轉譯之調控序列。原核啟動子通常分為兩類，即誘導型及組成型。誘導型啟動子為在其控制下回應於培養條件之變化(例如有或無營養素存在，或溫度變化)引發順反子之轉錄水準增加的啟動子。
大量可由多種潛在宿主細胞識別之啟動子為熟知的。所選啟動子可藉由經限制酶消化將該啟動子自來源DNA移除且將所分離之啟動子序列***本發明之載體中而可操作地連接至編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA。可使用天然啟動子序列及多種異源啟動子引導標靶基因擴增及/或表現。在一些實施例中，由於與天然標靶多肽啟動子相比，異源啟動子一般允許所表現之標靶基因達成較大程度轉錄及較高產率，故而使用異源啟動子。
適於與原核宿主一起使用之啟動子包括PhoA啟動子、β-聚半乳糖酶及乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統及雜交啟動子(諸如tac或trc啟動子)。然而，在細菌中具有功能性之其他啟動子(諸如其他已知之細菌或噬菌體啟動子)亦適用。其核苷酸序列已公開，從而使得熟練工作人員能夠使用連接子或接附蛋白將其可操作地接合至編碼標靶輕鏈及重鏈之順反子(Siebenlist等人，(1980) Cell 20: 269)以提供任何所需之限制性位點。
在本發明之一態樣中，重組載體內之各順反子皆包含引導所表現之多肽跨膜易位之分泌信號序列組分。一般而言，信號序列可為載體之組分，或其可為***載體中之標靶多肽DNA之一部分。出於本發明之目的所選擇之信號序列應為可由宿主細胞識別及加工(亦即由信號肽酶分解)之信號序列。對於不識別及加工異源多肽之天然信號序列的原核宿主細胞而言，信號序列係經選自例如由以下組成之群的原核信號序列取代：鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定性腸毒素II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP。在本發明之一實施例中，表現系統之兩種順反子中所用之信號序列為STII信號序列或其變異體。
在另一態樣中，本發明之免疫球蛋白的產生可於宿主細胞之細胞質中進行，且因此無需在各順反子內均存在分泌信號序列。就此而言，免疫球蛋白輕鏈及重鏈在細胞質內表現、摺疊且組裝形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大腸桿菌trxB-菌株)提供有利於二硫鍵形成之細胞質條件，從而允許所表現之蛋白次單位適當摺疊及組裝。Proba及Pluckthun Gene，159:203(1995)。
適於表現本發明抗體之原核宿主細胞包括古細菌類(Archaebacteria)及真細菌類(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性(Gram-negative)或革蘭氏陽性(Gram-positive)生物體。適用細菌之實例包括埃希氏桿菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、桿菌屬(Bacilli)(例如枯草桿菌(B. subtilis ))、腸內菌屬(Enterobacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(例如綠膿桿菌(P. aeruginosa ))、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium )、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans )、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、志賀桿菌屬(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobia)、透明顫菌(Vitreoscilla)或副球菌屬(Paracoccus)。在一實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一實施例中，使用大腸桿菌細胞作為本發明之宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第2卷(Washington，D.C.: American Society for Microbiology，1987)，第1190-1219頁；ATCC寄存編號:27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 ΔfhuA(ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR之菌株33D3(美國專利第5,639,635號)。其他菌株及其衍生物(諸如大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌RV308(ATCC 31,608))亦適用。此等實例為說明性的而不具限制性。用於建構具有確定基因型之任何上述細菌之衍生物的方法在此項技術中為已知的且係描述於例如Bass等人，Proteins，8:309-314(1990)中。一般需要考慮複製子在細菌細胞中之可複製性來選擇適合細菌。舉例而言，當使用熟知之質體(諸如，pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)提供複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌屬(Serratia)或沙門氏桿菌屬(Salmonella)可適用作宿主。宿主細胞通常應分泌最少量之蛋白水解酶，且可能需要將額外蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。
ii　抗體產生
用上述表現載體使宿主細胞轉型，且將其於習知營養培養基中培養，若適宜，該營養培養基經改質以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。
轉型意謂將DNA引入原核宿主中使得DNA可作為染色體外元件或由染色體成分複製。視所用之宿主細胞而定，使用適於此等細胞之標準技術進行轉型。使用氯化鈣之鈣處理一般用於含有實質細胞壁障壁之細菌細胞。另一轉型方法使用聚乙二醇/DMSO。所使用之另一技術為電穿孔。
使用於產生本發明多肽之原核細胞在此項技術中已知且適於培養所選宿主細胞之培養基中生長。適合培養基之實例包括加有必需營養補充劑之Luria培養液(LB)。在一些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之建構所選之選擇劑，以選擇性地允許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，將安比西林添加至培養基中以使表現安比西林抗性基因之細胞生長。
亦可包括除碳、氮及無機磷酸鹽來源外之任何必需補充劑，其以適合濃度單獨或以與另一補充劑或培養基(諸如，複合氮源)之混合物形式引入。視情況，培養基可含有一或多種選自由以下組成之群的還原劑：麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巰乙酸酯、二硫赤藻糖醇及二硫蘇糖醇。
將原核宿主細胞在適合之溫度下培養。對於大腸桿菌生長，舉例而言，較佳溫度在約20℃至約39℃、更佳約25℃至約37℃之範圍內，甚至更佳為約30℃。培養基之pH值可為約5至約9之範圍內的任何pH值，主要視宿主生物體而定。對於大腸桿菌，pH值較佳為約6.8至約7.4，且更佳為約7.0。
若本發明之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適於活化該啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本發明之一態樣中，使用PhoA啟動子控制多肽轉錄。因此，在磷酸鹽限制性培養基中培養經轉型之宿主細胞以供誘導。磷酸鹽限制性培養基較佳為C.R.A.P培養基(參見例如Simmons等人，J. Immunol. Methods(2002)，263:133-147)。如此項技術中所知，可根據所用之載體構築體使用多種其他誘導劑。
在一實施例中，本發明之所表現之多肽係分泌至宿主細胞之周質中且自其中回收。蛋白質回收通常涉及一般藉由諸如滲透壓衝擊、音波處理或溶解之方式使微生物碎裂。細胞碎裂後，則可藉由離心或過濾來移除細胞碎片或整個細胞。蛋白質可例如藉由親和樹脂層析進一步純化。或者，可將蛋白質轉運至培養基中且在其中分離。可將細胞自培養物中移除，且將培養物上清液過濾且濃縮以進一步純化所產生之蛋白質。可使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點檢定之通常已知之方法進一步分離且鑑別所表現之多肽。
在本發明之一態樣中，藉由醱酵製程進行大量抗體生產。各種大規模饋料分批醱酵程序可用於產生重組蛋白。大規模醱酵具有至少1000公升之生產量，較佳具有約1,000至100,000公升之生產量。此等醱酵器使用葉輪攪拌器來分配氧氣及營養素，尤其葡萄糖(較佳之碳/能量來源)。小規模醱酵一般係指在容量不超過約100公升且可在約1公升至約100公升範圍內之醱酵器中進行的醱酵。
在醱酵製程中，通常在細胞已於適合條件下生長至所需密度(例如，OD550為約180-220，在此階段細胞處於早期生長停滯期)後開始誘導蛋白質表現。如此項技術中已知且如上文所述，可根據所用之載體構築體使用多種誘導劑。可在誘導前使細胞生長較短之時段。通常誘導細胞約12-50小時，不過可使用較長或較短之誘導時間。
為改良本發明多肽之產率及品質，可改變各種醱酵條件。舉例而言，為改良所分泌之抗體多肽之適當組裝及摺疊，可使用過度表現伴隨蛋白之額外載體共轉型宿主原核細胞，該等伴隨蛋白諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及/或DsbG)或FkpA(具有伴隨蛋白活性之肽基脯胺醯基順，反-異構酶)。已證實伴隨蛋白有助於細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白質之適當摺疊及溶解度。Chen等人，(1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605；Georgiou等人，美國專利第6,083,715號；Georgiou等人，美國專利第6,027,888號；Bothmann及Pluckthun(2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及Pluckthun，(2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等人，(2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
為使所表現之異源蛋白質(尤其對蛋白水解敏感之蛋白質)之蛋白水解降至最低，某些缺乏蛋白水解酶之宿主菌株可用於本發明。舉例而言，宿主細胞株可經修飾以實現編碼已知細菌蛋白酶之基因的基因突變，該等細胞蛋白酶諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合。可使用一些大腸桿菌蛋白酶缺乏性菌株且其於例如Joly等人，(1998)，同上；Georgiou等人，美國專利第5,264,365號；Georgiou等人，美國專利第5,508,192號；Hara等人，Microbial Drug Resistance，2:63-72(1996)中描述。
在一實施例中，使用缺乏蛋白水解酶且經過度表現一或多種伴隨蛋白之質體轉型的大腸桿菌菌株作為本發明之表現系統中之宿主細胞。
iii.抗體純化
可使用此項技術中已知之標準蛋白純化方法。以下程序為例示性適合純化程序：免疫親和管柱或離子交換管柱部分分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、矽石或陽離子交換樹脂(諸如DEAE)層析、聚焦層析、SDS-PAGE、硫酸銨沈澱及使用例如Sephadex G-75之凝膠過濾。
在一態樣中，使用固定於固相上之蛋白質A對本發明之全長抗體產物進行免疫親和純化。蛋白質A為來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas )之41 kD細胞壁蛋白，其以高親和力結合至抗體之Fc區。Lindmark等人，(1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。固定蛋白質A之固相較佳為包含玻璃或矽石表面之管柱，更佳為受控微孔玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，管柱已塗有諸如甘油之試劑以試圖防止污染物之非特異性黏附。
作為純化之第一步驟，將如上所述源自細胞培養物之製劑塗覆至固定蛋白質A之固相上以使得相關抗體特異性結合至蛋白質A。接著洗滌固相以移除未與固相特異性結合之污染物。最後，藉由溶離自固相回收相關抗體。
b.　使用真核宿主細胞產生抗體：
載體組分一般包括(但不限於)以下之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。
(i)　信號序列組分
用於真核宿主細胞之載體亦可含有信號序列或其他在相關成熟蛋白或多肽之N末端具有特異性裂解位點之多肽。所選擇之異源信號序列較佳為由宿主細胞識別及加工(亦即由信號肽酶分解)之信號序列。在哺乳動物細胞表現中，可用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純性疱疹gD信號。
此前驅區域之DNA在閱讀框架中接合至編碼抗體之DNA。
(ii)　複製起點
一般而言，哺乳動物表現載體無需複製起點組分。舉例而言，通常可使用SV40起點僅係因為其含有早期啟動子。
(iii)　選擇基因組分
表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選標記物。典型之選擇基因編碼滿足以下之蛋白質：(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如安比西林、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤或四環素)之抗性；(b)補充營養缺陷(必要時)；或(c)供應不能自複合培養基獲得之關鍵營養素。
選擇方案之一實例利用使宿主細胞生長停滯之藥物。經異源基因成功轉型之彼等細胞會產生賦予藥物抗性之蛋白質且因此在選擇方案中倖存。此顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及潮黴素(hygromycin)。
適用於哺乳動物細胞之可選擇標記物的另一實例為能夠鑑別吸收抗體核酸之細胞之彼等標記物，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及金屬硫蛋白-II(較佳靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧酶等。
舉例而言，首先藉由在含有甲胺喋呤(Mtx)(DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中培養所有轉型體來鑑別經DHFR選擇基因轉型之細胞。在使用野生型DHFR時，適合之宿主細胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(例如，ATCC CRL-9096)。
或者，可藉由使細胞在含有可選擇標記物之選擇劑(諸如胺基醣苷抗生素，例如卡那黴素(kanamycin)、新黴素或G418)之培養基中生長來選擇經編碼抗體之DNA序列、野生型DHFR蛋白及另一可選擇標記物(諸如胺基醣苷3'-磷酸轉移酶(APH))轉型或共轉型之宿主細胞(尤其為含有內源性DHFR之野生型宿主)。參見美國專利第4,965,199號。
(iv)　啟動子組分
表現及選殖載體通常含有由宿主生物體鑑別且可操作地連接於抗體多肽核酸之啟動子。已知用於真核生物之啟動子序列。實際上所有真核基因皆具有位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處之富含AT區。在多種基因之轉錄開始上游70至80個鹼基處發現的另一序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大多數真核基因之3'端處為AATAAA序列，該序列可為向編碼序列之3'端添加poly A尾的信號。所有此等序列皆合適地***真核表現載體中。
可例如藉由獲自以下之啟動子來控制哺乳動物宿主細胞中自載體之抗體多肽轉錄：病毒(諸如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿病毒40(SV40))基因組；異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)；熱休克啟動子，其限制條件為此等啟動子與宿主細胞系統相容。
宜以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制片段形式獲得SV40病毒之早期及晚期啟動子。宜以HindIII E限制片段形式獲得人類細胞巨大病毒之即刻早期啟動子。於美國專利第4,419,446號中揭示使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體於哺乳動物宿主中表現DNA之系統。美國專利第4,601,978號中描述此系統之改良。或者，可使用勞氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)長末端重複序列作為啟動子。
(v)　強化子元件組分
由較高等真核生物對編碼本發明抗體多肽之DNA的轉錄通常可藉由將強化子序列***載體中來增強。現已知多種來自哺乳動物基因(血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)之強化子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點後側上之SV40強化子(bp 100-270)、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、複製起點後側上之多形瘤強化子及腺病毒強化子。關於用於活化真核啟動子之強化元件，亦參見Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。可將強化子在抗體多肽編碼序列之5'或3'位置處剪接至載體中，但其較佳位於啟動子之5'位點處。
(vi) 轉錄.終止組分
真核宿主細胞中使用之表現載體通常亦含有為終止轉錄及穩定mRNA所必需之序列。此等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5'及偶而3'未經轉譯之區域獲得。此等區域含有在編碼抗體之mRNA之未經轉譯部分中以聚腺苷酸化片段形式轉錄的核苷酸區段。一種適用之轉錄終止組分為牛生長激素聚腺苷酸化區域。參見WO 94/11026及其中所揭示之表現載體。
(vii) 宿主細胞之選擇及轉型
適用於選殖或表現本文載體中之DNA之宿主細胞包括本文所述之較高級真核生物細胞，包括脊椎動物宿主細胞。使脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中繁殖已成為一種常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞株(在懸浮培養物中生長而經次選殖之293或293細胞，Graham等人，J. Gen. Virol.36：59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))；小鼠塞特利細胞(mouse sertoli cell)(TM4，Mather，Biol. Reprod. 23:243-251(1980))；猴腎細胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌細胞株(Hep G2)。
用上述用於產生抗體之表現或選殖載體使宿主細胞轉型，且將其於習知營養培養基中培養，若適宜，該營養培養基經改質以便誘導啟動子、選擇轉型子或擴增編碼所需序列之基因的。
(viii)培養宿主細胞
用於產生本發明抗體之宿主細胞可在多種培養基中培養。市售培養基，諸如漢姆氏F10(Ham's F10)(Sigma)、最低必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜貝卡氏經改良伊格培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)(Sigma)適用於培養宿主細胞。另外，可使用Ham等人，Meth. Enz. 58:44(1979)；Barnes等人，Anal. Biochem. 102:255(1980)；美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第4,560,655號；或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利Re. 30,985中所述之任何培養基作為宿主細胞之培養基。
任何此等培養基皆可視需要補充有激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM 藥物)、微量元素(定義為通常以在微莫耳範圍內之最終濃度存在之無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源。亦可包括熟習此項技術者已知之適合濃度的任何其他必需補充劑。培養條件(諸如溫度、pH值及其類似條件)為先前選擇用於表現之宿主細胞所用的條件,且為一般技術者所顯而易見的。
(ix )抗體純化
當使用重組技術時,抗體可於細胞內產生或直接分泌至培養基中。若抗體於細胞內產生,則作為第一步驟,例如藉由離心或超濾移除微粒碎片(宿主細胞或已溶解之片段)。在抗體分泌至培養基中時,一般首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自此等表現系統之上清液。在任何先前步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白質水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。
可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化自細胞製備之抗體組合物，其中親和層析為較佳純化技術。蛋白質A作為親和配位體之適用性視存在於抗體中之任何免疫球蛋白Fc域之種類及同型而定。蛋白質A可用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等人，J. Immunol. Meth. 62:1-13(1983))。推薦蛋白質G用於所有小鼠同型及人類γ3(Guss等人，EMBO J. 5:15671575(1986))。雖然親和配位體所附接之基質最常為瓊脂糖，但亦可利用其他基質。與瓊脂糖相比，機械穩定性基質(諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允許達成較快流動速率及較短處理時間。當抗體包含CH3域時，Bakerbond ABXTM 樹脂(J. T. Baker，Phillipsburg，NJ)適用於純化。視待回收之抗體而定，亦可利用其他蛋白質純化技術，諸如離子交換管柱部分分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、矽石層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)上進行之肝素SEPHAROSETM 層析、聚焦層析、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。
在任何初步純化步驟之後，可使用pH值介於約2.5-4.5之間的溶離緩衝液對包含相關抗體及污染物之混合物進行低pH值疏水性相互作用層析，較佳在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)下進行。
免疫結合物
本發明亦提供免疫結合物(可互換地稱作「抗體-藥物結合物」或「ADC」)，其包含本文所述之任何抗FGFR3抗體與細胞毒性劑(諸如化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段))或放射性同位素(亦即放射性結合物)結合。
使用抗體-藥物結合物以在治療癌症中局部傳遞細胞毒性劑或細胞生長抑制劑(亦即殺死或抑制腫瘤細胞之藥物)(Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz及Springer(1997)Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172；美國專利第4,975,278號)可允許將藥物部分靶向傳遞至腫瘤中，且細胞內積聚於其中，而全身性投與此等未結合之藥劑可能會對正常細胞以及設法消除之腫瘤細胞產生不可接受之毒性程度(Baldwin等人，(1986)Lancet(1986年3月15日)第603-05頁；Thorpe，(1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications，A. Pinchera等人(編)，第475-506頁)。從而應設法在最小毒性下達到最大功效。多株抗體及單株抗體已經報導皆適用於此等策略(Rowland等人，(1986) Cancer Immunol. Immunother.，21:183-87)。此等方法中所用之藥物包括道諾黴素、小紅莓、甲胺喋呤及長春地辛(Rowland等人，(1986)同上)。抗體-毒素結合物中所用之毒素包括細菌毒素(諸如白喉毒素)；植物毒素(諸如蓖麻毒素)；小分子毒素(諸如格爾德黴素(geldanamycin))(M andler等人，(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandler等人，(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler等人，(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、類美登素(EP 1391213；Liu等人，(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)及刺孢黴素(Lode 等人，(1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等人，(1993) Cancer Res. 53:3336-3342)。該等毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制來實現其細胞毒性及細胞生長抑制作用。有些細胞毒性藥物在與大抗體或蛋白質受體配位體結合時趨於變得無活性或具較低活性。
ZEVALIN(替伊莫單抗替烏克坦(ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)為抗體-放射性同位素結合物，其係由針對見於正常及惡性B淋巴細胞表面上之CD20抗原之鼠類IgG1 κ單株抗體與111 In或90 Y放射性同位素藉由硫脲連接子-螯合劑結合而組成(Wiseman等人，(2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等人，(2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等人，(2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等人，(2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。儘管ZEVALIN具有針對B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)之活性，但在大多數患者中投藥會導致嚴重及長期血細胞減少症。MYLOTARGT M(吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)為一種由hu CD33抗體連接至刺孢黴素而組成之抗體藥物結合物，其於2000年批准用於注射治療急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000) 25(7):686；美國專利第4,970,198號；第5,079,233號；第5,585,089號；第5,606,040號；第5,6937,62號；第5,739,116號；第5,767,285號；第5,773,001號)。康圖單抗美坦辛(Cantuzumab mertansine)(Immunogen，Inc.)是一種由huC242抗體經由二硫化物連接子SPP連接至類美登素藥物部分DM1而組成的抗體藥物結合物，其正進入治療表現CanAg之癌症(諸如結腸癌、胰臟癌、胃癌及其他癌症)之II期試驗。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)為一種由抗***特異性膜抗原(PSMA)單株抗體連接至類美登素藥物部分DM1而組成之抗體藥物結合物，其正開發作為***腫瘤之可能治療。奧瑞他汀(auristatin)肽、奧瑞他汀E(AE)及單甲基奧瑞他汀(monomethylauristatin；MMAE)(海兔毒素之合成類似物)與嵌合單株抗體cBR96(對癌瘤之Lewis Y具有特異性)及cAC10(對血液科惡性病之CD30具有特異性)結合(Doronina等人，(2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)且正在治療開發中。
適用於產生免疫結合物之化學治療劑係描述於本文中(例如上文)。可用之酶促活性毒素及其片段包括：白喉A鏈、白喉毒素之無結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa ))、蓖麻毒素A鏈、相思子鹼毒素A鏈(abrin A chain)、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐蛋白(Aleurites fordii protein)、康乃馨蛋白、洋商陸蛋白(Phytolaca americana protein)(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑(momordica charantia inhibitor)、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草抑制劑(sapaonaria officinalis inhibitor)、白樹素(gelonin)、有絲***素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。可使用多種放射性核種產生放射性結合抗體。實例包括212 Bi、131 I、131 In、90 Y及186 Re。可使用多種雙功能蛋白偶合劑製造抗體與細胞毒性劑之結合物，該等蛋白偶合劑諸如3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鹽衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science，238: 1098(1987)中所述製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO 94/11026。
本文亦涵蓋抗體與一或多種小分子毒素(諸如刺孢黴素、類美登素、海兔毒素、奧羅他汀(aurostatin)、單端孢黴烯族毒素及CC1065以及此等毒素之具有毒素活性之衍生物)之結合物。
i.　美登素及類美登素
在一些實施例中，免疫結合物包含本發明抗體(全長或片段)與一或多個類美登素分子之結合物。
類美登素為藉由抑制微管蛋白聚合起作用之有絲***抑制劑。美登素最先係自東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata )分離(美國專利第3,896,111號)。隨後，發現某些微生物亦產生類美登素，諸如美登醇及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。合成美登醇及其衍生物及類似物係揭示於例如美國專利第4,137,230號；第4,248,870號；第4,256,746號；第4,260,608號；第4,265,814號；第4,294,757號；第4,307,016號；第4,308,268號；第4,308,269號；第4,309,428號；第4,313,946號；第4,315,929號；第4,317,821號；第4,322,348號；第4,331,598號；第4,361,650號；第4,364,866號；第4,424,219號；第4,450,254號；第4,362,663號；及第4,371,533號中。
類美登素藥物部分為抗體藥物結合物中具有吸引力之藥物部分，原因在於：(i)其相對易於藉由醱酵或對醱酵產物進行化學修飾、衍生化來製備；(ii)其易於經適合經由非二硫化物連接子與抗體結合之官能基衍生化；(iii)其在血漿中穩定；及(iv)其對多種腫瘤細胞株皆有效。
含有類美登素之免疫結合物、製備其之方法及其治療用途係揭示於例如美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1中，其揭示內容係以引用的方式明確併入本文中。Liu等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623(1996)描述包含連接至針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242之類美登素(命名為DM1)的免疫結合物。已發現該結合物對所培養之結腸癌細胞具有高度細胞毒性且在活體內腫瘤生長檢定中展示出抗腫瘤活性。Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)描述類美登素經由二硫化物連接子與結合人類結腸癌細胞株上之抗原之鼠類抗體A7結合，或與結合HER-2/neu致癌基因之另一鼠類單株抗體TA.1結合之免疫結合物。在活體外，測試TA.1-類美登素結合物對每個細胞表現3×105 個HER-2表面抗原之人類乳癌細胞株SK-BR-3之細胞毒性。藥物結合物達成與游離類美登素藥物類似之細胞毒性程度，該細胞毒性程度可隨增加每個抗體分子類美登素分子之數目而增加。A7-類美登素結合物在小鼠中展示出低全身細胞毒性。
可藉由以化學方式使抗體連接於類美登素分子而不顯著降低抗體或類美登素分子之生物活性來製備抗體-類美登素結合物。參見例如美國專利第5,208,020號(其揭示內容係以引用的方式明確併入本文中)。平均每個抗體分子結合3-4個類美登素分子已展示出增強對標靶細胞之細胞毒性而對抗體功能或溶解度無不利影響的功效，但預期甚至1個毒素分子/抗體分子即可使細胞毒性增強超過使用裸抗體。類美登素在此項技術中為熟知的，且可藉由已知技術合成或自天然來源分離。適合之類美登素係於例如美國專利第5,208,020號及上文提及之其他專利及非專利出版物中揭示。較佳之類美登素為美登醇及在美登醇分子之芳環中或其他位置處經修飾之美登醇類似物(諸如各種美登醇酯)。
此項技術中已知用於製造抗體-類美登素結合物的多種連接基團，包括例如美國專利第5,208,020號或EP專利0 425 235 B1；Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)；及美國專利申請案第10/960,602號(2004年10月8日申請)中所揭示之彼等連接基團，其揭示內容係以引用的方式明確併入本文中。包含連接子組分SMCC之抗體-類美登素結合物可如美國專利申請案第10/960,602號(2004年10月8日申請)中所揭示製備。連接基團包括二硫基、硫醚基、酸不穩定性基團、光不穩定性基團、肽酶不穩定性基團或酯酶不穩定性基團，如上文所鑑別之專利中所揭示，二硫基及硫醚基較佳。額外連接基團係描述及例示於本文中。
抗體與類美登素之結合物可使用多種雙官能蛋白偶合劑製得，該等蛋白偶合劑諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。尤其較佳之偶合劑包括提供二硫化物鍵聯之3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)(Carlsson等人，Biochem. J. 173:723-737(1978))及4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二醯亞胺酯(SPP)。
視連接類型而定，可將連接子附接於類美登素分子之各個位置。舉例而言，可藉由使用習知偶合技術與羥基反應形成酯鍵聯。反應可發生於具有羥基之C-3位置、經羥基甲基修飾之C-14位置、經羥基修飾之C-15位置及具有羥基之C-20位置處。在一較佳實施例中，鍵聯係形成於美登醇或美登醇類似物之C-3位置處。
ii. 　奧瑞他汀及 海兔毒素
在一些實施例中，免疫結合物包含本發明抗體與海兔毒素或海兔毒素之肽類似物及衍生物奧瑞他汀之結合物(美國專利第5,635,483號及第5,780,588號)。已展示海兔毒素及奧瑞他汀干擾微管動力學、GTP水解以及核及細胞***(Woyke等人，(2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)且具有抗癌活性(美國專利第5,663,149號)及抗真菌活性(Pettit等人，(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)。海兔毒素或奧瑞他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基)末端或C(羧基)末端附接至抗體(WO 02/088172)。
例示性奧瑞他汀實施例包括「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」，美國第10/983,340號(2004年11月5日申請，其揭示內容係以全文引用的方式明確併入本文中)中所揭示的N末端連接之單甲基奧瑞他汀藥物部分DE及DF。
通常，基於肽之藥物部分可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。可例如根據肽化學領域中熟知之液相合成方法(參見E. Schroder及K. Lubke，「The Peptides,」第1卷，第76-136頁，1965，Academic Press)來製備此等肽鍵。奧瑞他汀/海兔毒素藥物部分可根據以下文獻之方法來製備：美國專利第5,635,483號及第5,780,588號；Pettit等人，(1989)J. Am. Chem. Soc. 111：5463-5465；Pettit等人，(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit，G.R.等人，Synthesis，1996，719-725；及Pettit等人，(1996)J. Chem. Soc. Perkin Trans.15：859-863。亦參見Doronina(2003)Nat. Biotechnol. 21(7)：778-784；「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands，」美國第10/983,340號(2004年11月5日申請)，其係以全文引用的方式併入本文中(例如揭示連接子及製備結合至連接子之單甲基纈胺酸化合物(諸如MMAE及MMAF)之方法)
iii .刺孢黴素
在其他實施例中，免疫結合物包含本發明抗體與一或多個刺孢黴素分子之結合物。刺孢黴素家族之抗生素能夠以次皮莫耳濃度使雙股DNA斷裂。關於刺孢黴素家族之結合物的製備，參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號、及第5,877,296號(皆頒予American Cyanamid Company)。可使用之刺孢黴素之結構類似物包括(但不限於)γ1 I 、α2 I 、α3 I 、N-乙醯基-γ1 I 、PSAG及θ1 1 (Hinman等人，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode等人，Cancer Research 58：2925-2928 (1998)；及American Cyanamid之上述美國專利)。可結合抗體之另一抗腫瘤藥物為QFA，其為抗葉酸劑。刺孢黴素與QFA皆具有細胞內作用位點且不易於跨越質膜。因此，細胞經由抗體介導之內化作用吸收此等藥劑會極大增強其細胞毒性作用。
iv.其他細胞毒性劑
可與本發明抗體結合之其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲佐菌素(streptozoicin)、長春新鹼及5-氟尿嘧啶，美國專利第5,053,394號及第5,770,710號中所述之統稱為LL-E33288複合物之藥劑家族以及艾斯帕米辛(美國專利第5,877,296號)。
可用之酶促活性毒素及其片段包括：白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋白、康乃馨蛋白、洋商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹素、有絲***素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及黴菌毒素。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。
本發明進一步涵蓋抗體與具有核分解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶，諸如去氧核糖核酸酶；DNase)之間所形成的免疫結合物。
為選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。可使用多種放射性同位素產生放射性結合抗體。實例包括At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re1 88 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素。當結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc99m 或I123 ；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，又諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可以已知方式將放射性標記或其他標記併入結合物中。舉例而言，肽可經生物合成，或可藉由使用適合之胺基酸前驅物進行化學胺基酸合成(例如涉及以氟-19代替氫)來合成。諸如tc99m 或I123 、Re186 、Re188 及In111 之標記可經由肽中之半胱胺酸殘基附接。可經由離胺酸殘基附接釔-90。可使用IODOGEN方法(Fraker等人，(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)併入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal，CRC Press 1989)詳細描述其他方法。
抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白偶合劑製得，該等蛋白偶合劑諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞肽酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science 238:1098(1987)中所述製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO 94/11026。連接子可為促成細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子或含二硫化物之連接子(Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本發明之化合物明確涵蓋(但不限於)用以下，交聯試劑製備的ADC：市售(例如購自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)之BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB及SVSB((4-乙烯碸)苯甲酸丁二醯亞胺酯)。參見2003-2004應用手冊及目錄(Applications Handbookand Catalog)第467-498頁。
v.製備抗體藥物結合物
在本發明之抗體藥物結合物(ADC)中，抗體(Ab)經由連接子(L)與一或多個藥物部分(D)結合，例如每個抗體結合約1至約20個藥物部分。式I之ADC可藉由若干途徑，使用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件或試劑來製備，包括：(1)使抗體之親核基團與二價連接子試劑反應，經由共價鍵形成Ab-L，隨後與藥物部分D反應；及(2)使藥物部分之親核基團與二價連接子試劑反應，經由共價鍵形成D-L，接著與抗體之親核基團反應。額外製備ADC之方法係描述於本文中。
Ab-(L-D)p 　I
連接子可由一或多種連接子組分構成。例示性連接子組分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(「MC」)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」)、丙胺酸-***酸(「ala-phe」)、對胺基苯甲氧基羰基(「PAB」)、4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二醯亞胺酯(「SPP」)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸N-丁二醯亞胺酯(「SMCC」)及(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸N-丁二醯亞胺酯(「SIAB」)。額外連接子組分在此項技術中已知且一些係描述於本文中。亦參見「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」美國第10/983,340號(2004年11月5日申請)，其內容係以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，連接子可包含胺基酸殘基。例示性胺基酸連接子組分包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性二肽包括：纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-***酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。構成胺基酸連接子組分之胺基酸殘基包括天然存在之彼等胺基酸殘基以及次要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物(諸如瓜胺酸)。胺基酸連接子組分可經設計且最佳化其藉由特定酶(例如腫瘤相關蛋白酶；組織蛋白酶B、C及D；或纖維蛋白溶酶蛋白酶)之酶促裂解的選擇性。
抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N末端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺、硫醇及羥基具有親核性且能夠與包括以下之連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基鹵化物及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。某些抗體具有可還原之鏈間二硫化物，亦即半胱胺酸橋。可藉由用諸如DTT(二硫蘇糖醇)之還原劑進行處理而使抗體具有與連接子試劑結合之反應性。因此，各半胱胺酸橋在理論上將形成兩個反應性硫醇親核體。可經由使離胺酸與2-亞胺基硫雜環戊烷(陶特氏試劑(Traut's reagent))反應，使胺轉化為硫醇而將額外親核基團引入抗體中。可藉由引入一個、兩個、三個、四個或四個以上半胱胺酸殘基(例如製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之突變型抗體)而將反應性硫醇基引入抗體中。
本發明之抗體藥物結合物亦可藉由修飾抗體以引入可與連接子試劑或藥物上之親核取代基反應之親電子部分而產生。可將糖基化抗體之糖例如以過碘酸鹽氧化試劑氧化以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛或酮基。所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵聯，或可例如經硼氫化物試劑還原形成穩定胺鍵聯。在一實施例中，使糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉反應可於蛋白質中產生可與藥物上之適合基團反應之羰基(醛及酮)(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白質可與偏過碘酸鈉反應，產生醛而非第一胺基酸(Geoghegan及Stroh，(1992)Bioconjugate Chem. 3:138-146；美國專利第5,362,852號)。此醛可與藥物部分或連接子親核試劑反應。
同樣，藥物部分上能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵之親核基團包括(但不限於)：胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫代半卡巴腙、肼羧酸酯及芳基醯肼基團，該等連接子部分及連接子試劑包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基鹵化物及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。
或者，可例如藉由重組技術或肽合成製成包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白。DNA之長度可包含編碼結合物之兩個部分的各別區域，該等區域可彼此相鄰或由編碼不破壞結合物之所需特性之連接子肽之區域分開。
在另一實施例中，抗體可與「受體」(諸如抗生蛋白鏈菌素)結合以用於腫瘤預靶向，其中向個體投與抗體-受體結合物，隨後使用清除劑將未結合之結合物自循環系統中移除，且接著投與與細胞毒性劑(例如，放射性核苷酸)結合之「配位體」(例如，抗生物素蛋白)。
使用抗FGFR3抗體之方法
本發明特徵在於使用FGFR3抗體作為意欲由此治療劑活性提供有益作用之特定治療方案之一部分。本發明尤其適用於治療處於各期之各種類型之癌症。
術語癌症涵蓋多種增生性病症，包括(但不限於)癌前期生長、良性腫瘤及惡性腫瘤。良性腫瘤保持侷限於初始部位處且不具有浸潤、侵襲或轉移至遠端部位之能力。惡性腫瘤會侵襲且損傷其周圍的其他組織。其亦可獲得離開初始部位且通常經由血流或經由淋巴系統(淋巴結位於其中)擴散至身體其他部分(轉移)之能力。根據產生原發腫瘤之組織類型對原發腫瘤進行分類；根據產生癌細胞之組織類型對轉移性腫瘤進行分類。惡性腫瘤之細胞隨時間推移變得更加異常且表現得更不像正常細胞。癌細胞外觀方面之此變化係稱作腫瘤分級，且癌細胞係描述為良好分化(低級)、中度分化、不良分化或未分化(高級)。良好分化細胞表現相當正常且類似於產生其之正常細胞。未分化細胞為其異常程度以使其不再有可能確定細胞起源的細胞。
癌症分期系統描述癌症在解剖學上已擴散之程度且試圖將具有類似預後及治療之患者歸為同一分期組。可進行若干測試以幫助對癌症進行分期，包括活組織檢查及某些成像測試，諸如胸部X射線、***X射線攝像(mammogram)、骨骼掃描、CT掃描及MRI掃描。亦使用血液測試及臨床評估來評估患者之總體健康狀況且偵測癌症是否已擴散至某些器官。
為對癌症進行分期，美國癌症聯合委員會(American Joint Committee on Cancer)首先使用TNM分類系統以字母分類排列癌症，尤其實體腫瘤。癌症係表示為字母T(腫瘤尺寸)、N(可觸知淋巴結)及/或M(轉移)。T1、T2、T3及T4描述遞增之原發性病灶尺寸；N0、N1、N2、N3指示進行性發展之淋巴結受累；以及M0及M1反映有或無遠位轉移存在。
在亦稱為總體分期分組或羅馬數字分期之第二分期方法中，將癌症分成0至IV期，其中併入原發性病灶尺寸以及淋巴結擴散及遠位轉移之存在。在此系統中，將病例分組為由羅馬數字I至IV表示之四期或歸類為「復發型」。對於某些癌症，0期係稱為「原位」或「Tis」，諸如對於乳癌，稱為乳腺管原位癌或小葉原位癌。高級腺瘤亦可分類為0期。一般而言，I期癌症為通常可治癒之小局部癌症，而IV期通常表示不可施行手術之癌症或轉移性癌症。II期及III期癌症通常局部發展及/或展現局部淋巴結受累。一般而言，分期數字愈高則指示疾病愈嚴重，包括腫瘤尺寸愈大及/或癌症擴散至附近淋巴結及/或鄰近原發腫瘤之器官。雖然明確定義此等分期，但各類別癌症之定義不同且為熟習此項技術者所知。
許多癌症登記處，諸如美國國家癌症機構監管、流行病學與最終結果計畫(NCI's Surveillance，Epidemiology，and End Results Program，SEER)使用總結分期。此系統係用於所有類型之癌症。其將癌症病例分成五個主要類別：
原位 為早期癌症，其僅存在於其開始之細胞層中。
局部化 為侷限於其開始之器官，而無擴散跡象之癌症。
區域性 為已擴散出初始(原發性)部位到達附近淋巴結或器官及組織之癌症。
遠位 為已自原發性部位擴散至遠位器官或遠位淋巴結之癌症。
未知 係用於描述無足夠資訊來指示分期之病例。
另外，癌症在已移除原發腫瘤之後數月或數年復發係常見的。在已根除所有可見腫瘤後復發之癌症係稱作復發型疾病。在原發腫瘤區域內復發之疾病為局部復發，而以轉移形式復發之疾病係稱為遠位復發。
腫瘤可為實體腫瘤或非實體腫瘤或軟組織腫瘤。軟組織腫瘤之實例包括白血病(例如慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、成人急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、成熟B細胞急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴細胞性白血病、幼淋巴細胞性白血病或毛細胞白血病)或淋巴瘤(例如非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤或霍奇金氏病)。實體腫瘤包括任何除血液、骨髓或淋巴系統以外之身體組織的癌症。實體腫瘤可進一步分成上皮細胞起源之實體腫瘤及非上皮細胞起源之實體腫瘤。上皮細胞實體腫瘤之實例包括胃腸道、結腸、***、***、肺、腎、肝、胰臟、卵巢、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、膽囊、唇、鼻咽、皮膚、子宮、雄性生殖器、泌尿器、膀胱及皮膚之腫瘤。非上皮起源之實體腫瘤包括肉瘤、腦腫瘤及骨腫瘤。腫瘤之其他實例係描述於定義部分中。
在一些實施例中，例如在治療之前及/或治療期間及/或治療之後對本文之患者進行診斷性測試。一般而言，若進行診斷性測試，則可自需要治療之患者獲得樣品。若個體患有癌症，則樣品可為腫瘤樣品或其他生物樣品，諸如生物流體，包括(但不限於)血液、尿、唾液、腹水或諸如血清及血漿之衍生物，及其類似物。
本文之生物樣品可為經固定之樣品，例如經福馬林(formalin)固定、經石蠟包埋(FFPE)之樣品，或冷凍樣品。
各種用於測定mRNA或蛋白質表現之方法包括(但不限於)基因表現分析、包括定量即時PCR(qRT-PCR)之聚合酶鏈反應(PCR)、微陣列分析、基因表現連續分析(SAGE)、MassARRAY、藉由大規模平行標籤測序(MPSS)進行基因表現分析、蛋白質組研究、免疫組織化學(IHC)等。較佳定量mRNA。較佳使用聚合酶鏈反應(PCR)技術或藉由微陣列分析進行此mRNA分析。若使用PCR，則較佳PCR形式為定量即時PCR(qRT-PCR)。在一實施例中，若例如與同一腫瘤類型之其他樣品相比，上述基因中之一或多者的表現處於中值或中值以上，則認為其為陽性表現。可基本上在量測基因表現同時測定中值表現水準，或可之前已測定中值表現水準。
使用經固定、經石蠟包埋之組織作為RNA來源分析基因表現之代表性方案之步驟(包括mRNA分離、純化、引子延長及擴增)係於各種已出版之期刊文章中提供(例如，Godfrey等人，J. Molec. Diagnostics 2: 84-91(2000)；Specht等人，Am. J. Pathol. 158: 419-29(2001))。簡言之，代表性方法開始時先切割約10微克厚之經石蠟包埋之腫瘤組織樣品的切片。接著提取RNA且移除蛋白質及DNA。必要時可在分析RNA濃度之後包括RNA修復及/或擴增步驟，且使用基因特異性啟動子來逆轉錄RNA，隨後進行PCR。最後，基於在所檢查之腫瘤樣品中所鑑別的特徵基因表現模式分析資料，鑑別可用於患者之最佳治療選項。
可直接或間接確定對基因或蛋白質表現之偵測。
可(直接或間接)測定癌症中FGFR3之表現或易位或擴增。各種診斷/預後檢定皆可用於此目的。在一實施例中，可藉由IHC分析FGFR3過度表現。可對來自腫瘤活組織檢查之經石蠟包埋之組織切片進行IHC檢定，且符合如下之FGFR3蛋白染色強度準則：
得分0：未觀測到染色或在少於10%之腫瘤細胞中觀測到膜染色。
得分1+：在超過10%之腫瘤細胞中偵測到模糊/勉強可感知之膜染色。該等細胞之僅部分細胞膜經染色。
得分2+：在超過10%之腫瘤細胞中觀測到弱至中度完全膜染色。
得分3+：在超過10%之腫瘤細胞中觀測到中度至強完全膜染色。
在一些實施例中，FGFR3過度表現評定得分為0或1+之彼等腫瘤可表徵為不過度表現FGFR3，而得分為2+或3+之彼等腫瘤可表徵為過度表現FGFR3。
在一些實施例中，可根據對應於每個細胞表現之FGFR3分子之複本數目的免疫組織化學得分對過度表現FGFR3之腫瘤進行評級，且可以生物化學方式測定：0=每個細胞0-90個複本，1+=每個細胞至少約100個複本，2+=每個細胞至少約1000個複本，3+=每個細胞至少約10,000個複本。
或者或另外，可對經福馬林固定、經石蠟包埋之腫瘤組織進行FISH檢定以確定腫瘤中FGFR3擴增或易位之存在及/或程度(若存在)。
可直接(例如，藉由磷酸化ELISA測試或其他偵測磷酸化受體之方式)或間接(例如，藉由偵測活化之下游信號傳導路徑組分、偵測受體二聚體(例如均二聚體、雜二聚體)、偵測基因表現概況及其類似者)測定FGFR3活化。
類似地，可直接或間接(例如，藉由偵測與組成性活性相關之受體突變，藉由偵測與組成性活性相關之受體擴增及其類似者)偵測組成性FGFR3及/或非配位體依賴性或配位體依賴性FGFR3。
用於偵測核酸突變之方法在此項技術中為熟知的。通常(但並不一定)擴增樣品中之標靶核酸以提供所需量之物質以確定是否存在突變。擴增技術在此項技術中為熟知的。舉例而言，擴增產物可能涵蓋或可能不涵蓋編碼相關蛋白質之所有核酸序列，只要經擴增產物包含疑似具有突變之特定胺基酸/核酸序列位置即可。
在一實例中，可藉由使來自樣品之核酸與能夠特異性雜交至編碼突變型核酸之核酸且偵測該雜交之核酸探針接觸來確定突變之存在與否。在一實施例中，可例如以放射性同位素(3 H、32 P、33 P等)、螢光劑(若丹明(rhodamine)，螢光等)或顯色劑可偵測地標記探針。在一些實施例中，探針為反義寡聚物，例如PNA、N-嗎啉基-胺基磷酸酯、LNA或2'-烷氧基烷氧基。探針可為約8個核苷酸至約100個核苷酸，或約10至約75個核苷酸，或約15至約50個核苷酸，或約20至約30個核苷酸。在另一態樣中，在用於鑑別樣品中之FGFR3突變之套組中提供本發明之核酸探針，該套組包含特異性雜交至或鄰近於編碼FGFR3之核酸中之突變位點的寡核苷酸。該套組可進一步包含基於使用該套組進行雜交測試之結果，以FGFR3拮抗劑治療患有含有FGFR3突變之腫瘤之患者的說明書。
亦可藉由比較擴增核酸之電泳遷移率與編碼野生型FGFR3之相應核酸之電泳遷移率來偵測突變。遷移率差異指示擴增核酸序列中存在突變。可藉由任何適合之分子分離技術，例如在聚丙烯醯胺凝膠上測定電泳遷移率。
亦可使用酶促突變偵測(EMD)分析核酸以偵測突變(Del Tito等人，Clinical Chemistry 44:731-739，1998)。EMD使用噬菌體解離酶T4 核酸內切酶VII，其沿雙股DNA掃描直至其偵測且裂解由諸如點突變、***及缺失之核酸改變引起之鹼基對錯配所致之結構變形為止。藉由例如凝膠電泳偵測到由解離酶裂解所形成之兩個短片段指示存在突變。EMD方法之優點在於由單一方案鑑別直接由擴增反應所檢定之點突變、缺失及***；消除樣品純化之需要；縮短雜交時間且增加信雜比。可檢定含有達20倍過量之正常核酸與尺寸達4 kb之片段的混合樣品。然而，EMD掃描無法鑑別突變陽性樣品中發生之特定鹼基變化，因此必要時通常需要額外測序程序來鑑別特定突變。如美國專利第5,869,245號所表明，可類似於解離酶T4 核酸內切酶VII使用CEL I酶。
另一用於偵測突變之簡便套組為類似於用於偵測HFE、TFR2及FPN1基因中引起血色病(Haemochromatosis)之多個突變之血色病StripAssayTM (Viennalabs http://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf)的反向雜交測試條。此檢定係基於PCR擴增後之序列特異性雜交。對於單一突變檢定，可應用基於微定量板之偵測系統，而對於多突變檢定，可使用測試條可作為「大陣列」。套組可包括用於樣品製備、擴增及突變偵測之即用試劑。多重擴增方案提供便利且允許測試體積極有限之樣品。使用直接StripAssay形式，可在不到5小時內在無昂貴設備之情況下完成對二十及二十個以上突變之測試。自樣品分離DNA，且一般在單一(「多重」)擴增反應中活體外擴增(例如，藉由PCR)標靶核酸且對其進行生物素標記。接著使擴增產物選擇性雜交至諸如測試條之固體支撐物上所固定之寡核苷酸探針(具有野生型及突變體特異性)，其中探針以平行線或條帶形式固定在該固體支撐物上。使用抗生蛋白鏈菌素-鹼性磷酸酶及有色受質來偵測結合之經結合生物素之擴增子。此檢定可偵測本發明之所有突變或其任何子集。關於特定突變體探針條帶，可能有以下3種信號傳導模式之一：(i)指示正常核酸序列之僅野生型探針條帶，(ii)指示異種接合基因型之野生型及突變體探針條帶，及(iii)指示同種接合突變體基因型之僅突變體探針條帶。因此，在一態樣中，本發明提供偵測本發明之突變之方法，其包含自樣品分離及/或擴增標靶FGFR3核酸序列，使得擴增產物包含配位體；使擴增產物與包含配位體之可偵測結合搭配物之探針接觸且該探針能夠特異性雜交至本發明之突變；及接著偵測該探針與該擴增產物之雜交。在一實施例中，配位體為生物素且結合搭配物包含抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素。在一實施例中，結合搭配物包含可用有色受質偵測之鹼性抗生蛋白鏈菌素。在一實施例中，將探針固定於例如測試條上，其中與不同突變互補之探針彼此分離。或者，以放射性同位素標記經擴增核酸，在該情況下探針無需包含可偵測標記。
野生型基因之改變涵蓋所有突變形式，諸如***、倒位、缺失及/或點突變。在一實施例中，突變為體細胞突變。體細胞突變為僅出現於某些組織中(例如腫瘤組織中)，且不在生殖系中遺傳之彼等突變。生殖系突變可見於身體任何組織中。
可藉由此項技術中熟知且適於腫瘤之特定類型及位置之方法獲得包含標靶核酸之樣品。常使用活組織檢查來獲得代表性腫瘤組織碎片。或者，可以已知或認為含有相關腫瘤細胞之組織/流體形式間接獲得腫瘤細胞。舉例而言，可藉由切除、支氣管鏡檢查、細針抽吸、支氣管刷檢或自痰液、胸膜液或血液獲得肺癌病灶之樣品。可自腫瘤或諸如尿、痰液或血清之其他身體樣品偵測突變基因或基因產物。可將上述用於偵測腫瘤樣品中之突變標靶基因或基因產物之相同技術應用於其他身體樣品。癌細胞自腫瘤脫落且出現於此等身體樣品中。藉由篩選此等身體樣品，可達成對諸如癌症之疾病的簡單早期診斷。另外，藉由測試此等身體樣品之突變標靶基因或基因產物可更輕易地監測治療之進展。
增濃組織製劑中之腫瘤細胞之方式在此項技術中為已知的。舉例而言，可自石蠟或恆冷箱切片分離組織。亦可藉由流動式細胞測量術或雷射捕捉顯微解剖來分離癌細胞與正常細胞。此等技術以及其他分離腫瘤與正常細胞之技術在此項技術中為熟知的。若腫瘤組織受到正常細胞高度污染，則可能較難於偵測突變，但已知使污染及/或假陽性/陰性結果降至最低之技術，其中一些係描述於下文中。舉例而言，亦可評定樣品中已知與相關腫瘤細胞(而非相應正常細胞)有關之生物標記(包括突變)之存在與否，或反之亦然。
可藉由使用此項技術中熟知之技術對標靶核酸進行分子選殖且對核酸進行測序來實現對標靶核酸中點突變之偵測。或者，可使用諸如聚合酶鏈反應(PCR)之擴增技術直接自來自腫瘤組織之基因組DNA製劑擴增標靶核酸序列。接著可測定經擴增序列之核酸序列且由其鑑別突變。擴增技術在此項技術中為熟知的，例如，如以下文獻中所述之聚合酶鏈反應：Saiki等人，Science 239:487，1988；美國專利第4,683,203號及第4,683,195號。
應注意，對適合引子之設計及選擇為此項技術中已確立之技術。
亦可使用此項技術中已知之連接酶鏈反應來擴增標靶核酸序列。參見例如Wu等人，Genomics，第4卷，第560-569頁(1989)。另外，亦可使用稱為對偶基因特異性PCR之技術。參見例如Ruano及Kidd，Nucleic Acids Research，第17卷，第8392頁，1989。根據此技術，使用在3'末端雜交至特定標靶核酸突變之引子。若特定突變不存在，則無法觀測到擴增產物。如歐洲專利申請公開案第0332435號及Newton等人，Nucleic Acids Research，第17卷，第7頁，1989中所揭示，亦可使用擴增阻礙突變系統(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)。亦可藉由選殖、測序及擴增來偵測基因之***及缺失。另外，可使用該基因或周圍標記基因之限制片段長度多形現象(RFLP)探針來對對偶基因之改變或多形片段內之***評分。亦可使用單股構形多形現象(SSCP)分析來偵測對偶基因之鹼基變化型變異體。參見例如Orita等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA第86卷，第2766-2770頁，1989及Genomics，第5卷，第874-879頁，1989。亦可使用如此項技術中已知用於偵測***及缺失之其他技術。
亦可基於基因之野生型表現產物之改變來偵測野生型基因之改變。此等表現產物包括mRNA以及蛋白質產物。可藉由擴增mRNA且對其進行測序或經由對由mRNA製得之cDNA進行分子選殖來偵測點突變。可使用此項技術中熟知之DNA測序技術來測定所選殖之cDNA的序列。亦可經由聚合酶鏈反應(PCR)對cDNA進行測序。
錯配為並非100%互補之雜交核酸雙鏈體。缺乏完全互補性可能歸因於缺失、***、倒位、取代或讀框轉移突變。可使用錯配偵測來偵測標靶核酸中之點突變。儘管此等技術與測序相比可能較不靈敏，但其較易於對大量組織樣品進行。錯配裂解技術之實例為核糖核酸酶保護方法，其係詳細描述於Winter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，第82卷，第7575頁，1985，及Meyers等人，Science，第230卷，第1242頁，1985中。舉例而言，本發明之方法可涉及使用與人類野生型標靶核酸互補之經標記RNA探針(riboprobe)。將RNA探針與源自組織樣品之標靶核酸黏接(雜交)於一起且隨後以能夠偵測雙鏈體RNA結構中之一些錯配之酶核糖核酸酶A消化。若由核糖核酸酶A偵測到錯配，則其在錯配位點處進行裂解。因此，當在電泳凝膠基質上分離經黏接之RNA製劑時，若已偵測到錯配且其已藉由核糖核酸酶A裂解，則將發現RNA產物小於RNA探針與mRNA或DNA之全長雙鏈體RNA。RNA探針無需為標靶核酸mRNA或基因之全長，而可為標靶核酸之一部分，其限制條件在於其涵蓋疑似突變之位置。若RNA探針僅包含一區段之標靶核酸mRNA或基因，則必要時可能需要使用許多此等探針來篩選整個標靶核酸序列之錯配。
可以類似方式使用DNA探針以例如經由酶促或化學裂解來偵測錯配。參見例如Cotton等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，第85卷，4397，1988；及Shenk等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，第72卷，第989頁，1975。或者，可藉由錯配雙鏈體相對於匹配雙鏈體之電泳遷移率變化來偵測錯配。參見例如Cariello，Human Genetics，第42卷，第726頁，1988。使用RNA探針或DNA探針，可在雜交之前擴增可能含有突變之標靶核酸mRNA或DNA。亦可使用南方雜交來偵測標靶核酸DNA之變化，特別在變化為大體重排(諸如缺失及***)時。
亦可使用對偶基因特異性探針來篩選已擴增之標靶核酸DNA序列。此等探針為核酸寡聚物，其各者皆含有具有已知突變之標靶核酸基因區域。舉例而言，一種寡聚物之長度可為約30個核苷酸，其對應於標靶基因序列之一部分。藉由使用一組此等對偶基因特異性探針，可篩選標靶核酸擴增產物以鑑別標靶基因中先前已鑑別之突變的存在。可例如在耐綸過濾器上使對偶基因特異性探針與經擴增標靶核酸序列進行雜交。在嚴格雜交條件下與特定探針之雜交指示腫瘤組織中存在與對偶基因特異性探針中相同之突變。
亦可藉由篩選相應野生型蛋白質之改變來偵測野生型標靶基因之改變。舉例而言，可使用對標靶基因產物具有免疫反應性之單株抗體來篩選組織，該等單株抗體為例如已知結合至基因產物(蛋白質)之特定突變位置的抗體。舉例而言，所使用之抗體可為結合至缺失之外顯子或結合至包含標靶蛋白質之缺失部分之構形抗原決定基的抗體。缺少同源抗原將指示突變。亦可使用對突變對偶基因之產物具有特異性之抗體來偵測突變基因產物。可自噬菌體呈現文庫中鑑別抗體。可以此項技術中已知之任何適宜形式進行此等免疫檢定。此等檢定包括西方墨點法、免疫組織化學檢定及ELISA檢定。可使用任何用於偵測改變之蛋白質的方式來偵測野生型標靶基因之改變。
引子對適用於使用諸如聚合酶鏈反應之核酸擴增技術來測定標靶核酸之核苷酸序列。單股DNA引子對可黏接至標靶核酸序列內或其周圍之序列，以引發標靶序列之擴增。亦可使用對偶基因特異性引子。此等引子僅黏接至特定突變標靶序列且因此將僅在作為模板之突變標靶序列存在下擴增產物。為促進對經擴增序列之後續選殖，引子可具有附加至其末端之限制酶位點序列。此等酶及位點在此項技術中為熟知的。引子本身可使用此項技術中熟知之技術合成。一般而言，可使用市售之寡核苷酸合成器製成引子。對特定引子之設計完全處於此項技術之技術範圍內。
核酸探針適用於多種目的。其可用於與基因組DNA進行南方雜交且可用於以上已論述之用於偵測點突變之核糖核酸酶保護方法中。可使用探針來偵測標靶核酸擴增產物。其亦可用於使用其他技術來偵測與野生型基因或mRNA之錯配。可使用酶(例如S1核酸酶)、化學物質(例如羥胺或四氧化鋨及哌啶)或相較完全匹配雜交體，錯配雜交體之電泳遷移率之變化來偵測錯配。此等技術在此項技術中為已知的。參見Novack等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，第83卷，第586頁，1986。一般而言，探針與激酶結構域外部之序列互補。可使用整個核酸探針組來構成偵測標靶核酸中之突變的套組。該套組允許與大區域之相關標靶序列雜交。該等探針可彼此重疊或鄰近。
若使用RNA探針來偵測與mRNA之錯配，則其一般與標靶基因之mRNA互補。由於RNA探針與有義股互補，所以其並不編碼相應基因產物，因此其為反義探針。一般將以放射性、比色或螢光物質標記RNA探針，此可藉由此項技術中已知之任何方式實現。若使用RNA探針來偵測與DNA之錯配，則其可具有極性、有義或反義。類似地，亦可使用DNA探針來偵測錯配。
在一些情況下，癌症過度表現或不過度表現FGFR3。可在診斷性或預後性檢定中，藉由評估細胞表面上存在之受體蛋白含量增加(例如經由免疫組織化學檢定；IHC)來測定受體過度表現。或者或另外，可例如經由螢光原位雜交(FISH；參見1998年10月公開之WO 98/45479)、南方墨點法或聚合酶鏈反應(PCR)技術(諸如即時定量PCR(RT-PCR))來量測細胞中編碼受體之核酸含量。除上述檢定以外，熟練專業人員亦可利用各種活體內檢定。舉例而言，可使患者體內之細胞暴露於視情況經可偵測標記(例如放射性同位素)標記之抗體，且可例如藉由外部掃描放射能或藉由分析獲自先前暴露於該抗體之患者的活組織檢查來評估患者體內抗體與細胞之結合。
化學治療劑
本發明之組合治療可進一步包含一或多種化學治療劑。組合投藥包括使用各別調配物或單一醫藥調配物進行共投藥或同時投藥，以及以任一次序連續投藥，其中較佳有一段時間兩種(或所有)活性劑同時發揮其生物活性。
化學治療劑(若投與)通常以其已知劑量投與，或其劑量由於藥物之組合作用或可歸因於投與抗代謝物化學治療劑之不利副作用而視情況有所降低。可根據製造商之說明書或如熟練專業人員憑經驗所確定來使用此等化學治療劑之製劑及給藥時程。
可組合之各種化學治療劑係揭示於本文中。
在一些實施例中，欲組合之化學治療劑係選自由以下組成之群：來那度胺(雷利米得)；蛋白體抑制劑(諸如硼替佐米(萬珂)及PS342)；紫杉類(包括多烯紫杉醇及太平洋紫杉醇)；長春花屬(諸如長春瑞濱或長春鹼)；鉑化合物(諸如卡鉑或順鉑)；芳香酶抑制劑(諸如來曲唑、阿那曲唑(anastrazole)或依西美坦)；抗***劑(例如氟維斯群或他莫西芬)；依託泊苷；塞替派；環磷醯胺；培美曲唑；甲胺喋呤；脂質體小紅莓；聚乙二醇化脂質體小紅莓；卡培他濱；吉西他濱；美爾莎林(melthalin)；小紅莓；長春新鹼；COX-2抑制劑(例如塞內昔布)；或類固醇(例如***及強的松)。在一些實施例(例如涉及治療t(4；14)+多發性骨髓瘤之實施例)中，組合***與來那度胺；或***，或硼替佐米，或長春新鹼；小紅莓與***；或沙立度胺與***；或脂質體小紅莓、長春新鹼與***；或來那度胺與***；或硼替佐米與***；或硼替佐米、小紅莓與***。在一些實施例(例如涉及膀胱癌之實施例)中，組合吉西他濱與順鉑；或紫杉烷(例如太平洋紫杉醇、多烯紫杉醇)，或培美曲唑，或甲胺喋呤、長春鹼、小紅莓與順鉑；或卡鉑，或絲裂黴素C與5-氟尿嘧啶之組合；，或順鉑；或順鉑與5-氟尿嘧啶。
調配物、劑量及投藥
將以符合優良醫藥實踐之方式調配、給予及投與用於發明之治療劑。在此上下文中所考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定個體、個別患者之臨床病狀、病症之誘因、藥劑傳遞部位、投藥方法、投藥時程、欲組合之藥劑的藥物-藥物相互作用及醫師已知之其他因素。
使用此項技術中已知之標準方法，藉由將具有所需純度之活性成分與視情況選用之生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備治療調配物(Remington's Pharmaceutical Sciences(第20版)，A. Gennaro編，2000，Lippincott，Williams& Wilkins，Philadelphia，PA)。可接受之載劑包括生理食鹽水或緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或PEG。
視情況且較佳為該調配物含有醫藥學上可接受之鹽，較佳為氯化鈉，且較佳為約生理濃度。視情況，本發明之調配物可含有醫藥學上可接受之防腐劑。在一些實施例中，防腐劑濃度在0.1%至2.0%(通常為v/v)之範圍內。適合之防腐劑包括醫藥技術中已知之防腐劑。苯甲醇、苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯為較佳防腐劑。視情況，本發明之調配物可包括濃度為0.005%至0.02%之醫藥學上可接受之界面活性劑。
視所治療之特定適應症之需要，本文之調配物亦可含有一種以上活性化合物，較佳為具有互補活性，且彼此無不利影響之彼等活性化合物。此等分子適宜以有效達成預期目的之量組合存在。
亦可將活性成分截留於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(分別例如羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中，截留於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中，或截留於***液中。此等技術係於Remington's Pharmaceutical Sciences(同上)中揭示。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物品之形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM ，由乳酸-乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林構成之可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物使分子能夠釋放超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質持續較短時段。當囊封之抗體長時間保留於體內時，其可能由於在37℃下暴露於水分而變性或聚集，從而導致生物活性損失及可能之免疫原性變化。視所涉及之機制而定，可設計合理策略以達成穩定化。舉例而言，若發現聚集機制為經由硫基-二硫化物互換形成分子間S-S鍵，則可藉由修飾氫硫基殘基、由酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適合添加劑及開發特定聚合物基質組合物來達成穩定化。
本發明之治療劑根據已知方法向人類患者投與，諸如以快速給藥形式或藉由在一段時間內連續輸液而靜脈內投與，藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、局部或吸入途徑。治療應用中亦可使用離體策略。離體策略涉及以編碼FGFR3拮抗劑之聚核苷酸轉染或轉導自個體獲得之細胞。接著，使經轉染或轉導之細胞返回至個體體內。該等細胞可為多種類型中之任一種，包括(但不限於)造血細胞(例如骨髓細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、T細胞或B細胞)、纖維母細胞、上皮細胞、內皮細胞、角質細胞或肌細胞。
舉例而言，若FGFR3拮抗劑為抗體，則該抗體藉由包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內之任何適合方式投與，且若需要局部免疫抑制治療，則藉由病灶內投藥來投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。另外，抗體適宜由脈衝輸注尤其以遞減之抗體劑量投與。給藥較佳藉由注射進行，最佳靜脈內或皮下注射，部分視投藥為短期投藥或長期投藥而定。
在另一實例中，當病症或腫瘤位置允許時，例如藉由直接注射局部投與FGFR3拮抗劑化合物且可定期重複注射。FGFR3拮抗劑亦可向個體全身性傳遞或直接向腫瘤細胞傳遞，例如傳遞至腫瘤或在手術切除腫瘤之後傳遞至腫瘤床，以避免或降低局部復發或轉移。
通常在規定時段內(通常為數分鐘、數小時、數天或數週，視所選擇之組合而定)進行治療劑之組合投與。組合治療意欲包含以連續方式投與此等治療劑(亦即，其中各治療劑在不同時間投與)以及以實質上同時方式投與此等治療劑或至少兩種治療劑。
治療劑可由相同途徑或由不同途徑投與。舉例而言，組合中之抗FGFR3抗體可藉由靜脈內注射投與，而組合中之化學治療劑可經口投與。或者，例如視特定治療劑而定，可經口投與兩種治療劑或可藉由靜脈內注射投與兩種治療劑。投與治療劑之次序亦視特定藥劑而有所不同。
視疾病類型及嚴重度，無論例如藉由一或多次單獨投與或藉由連續輸注，約1 μg/kg至100 mg/kg之各治療劑皆為向患者投藥之初始候選劑量。典型日劑量可能在約1 μg/kg至約100 mg/kg或100 mg/kg以上之範圍內，視上述因素而定。對於在數天或更長時段中重複投藥而言，視病狀而定，持續治療直至如由上述方法所量測癌症得以治療為止。然而，其他給藥方案可適用。
本申請案涵蓋藉由基因治療投與FGFR3抗體。關於使用基因治療來產生細胞內抗體，參見例如1996年3月14日公開之WO 96/07321。
製品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質的製品。該製品包含容器及在該容器上或與該容器相聯之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納單獨組合物或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一種組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或藥品說明書指示該組合物用於治療諸如癌症之所選病狀。此外，製品可包含(a)內含組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及(b)內含組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示第一及第二抗體組合物可用於治療特定病狀(例如癌症)之藥品說明書。或者或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點看合意之其他物質，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，鑒於上文提供之一般性說明，可實踐各種其他實施例。
實例
材料及方法
細胞株及細胞培養
細胞株RT4係自美國典型細胞培養物保藏中心(American Type Cell Culture Collection)獲得。細胞株RT112、OPM2及Ba/F3係購自德國微生物及細胞培養物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ，(Germany))。多發性骨髓瘤細胞株KMS11係由Kawasaki Medical School(Japan)之Takemi Otsuki博士友情提供。膀胱癌細胞株TCC-97-7係由St James's University Hospital (Leeds，UK)之Margaret Knowles博士慷慨提供。UMUC-14細胞株係自H.B. Grossman博士(現在University of Texas M.D.Anderson Cancer Center，TX)獲得。在5% CO2 、37℃之條件下，用補充有10%胎牛血清(FBS)(Sigma)、100 U/ml青黴素、0.1 mg/ml鏈黴素及L-麩醯胺酸之RPMI培養基維持細胞。
FGFR3s249c 二聚研究
使UMUC-14細胞在不含半胱胺酸之培養基中生長，用R3Mab或DTNB處理3小時，且在還原或非還原條件下對細胞溶胞物進行免疫墨點分析。為進行活體外二聚研究，將FGFR3-IIIbs249c (殘基143至374)選殖至pAcGP67A載體中且使其在T.ni Pro細胞中表現。經由Ni-NTA管柱，隨後藉由Superdex S200管柱純化重組蛋白。以25 mM Tris(pH 7.5)及300 mM NaCl溶離二聚FGFR3s249c 。在37℃下，在下列條件下，培育R3Mab(1μM)與FGFR3s249c 二聚體(0.1μM)：100 mM KH2 PO4 (pH7.5)、25μM DTT、1 mM EDTA及0.75 mg/ml BSA。在指定時間點採集反應物之等分試樣且藉由添加不含β-巰基乙醇之樣品緩衝液停止反應。藉由免疫墨點法分析二聚體-單體。
異種移植研究
所有研究皆經Genentech之實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。雌性nu/nu小鼠或CB17嚴重複合型免疫缺乏症(SCID)小鼠(6-8週大)係購自Charles River Laboratory(Hollister，CA)。雌性無胸腺裸鼠係自美國國家癌症機構-菲德里克癌症中心(National Cancer Institute-Frederick Cancer Center)獲得。在無特定病原體條件下維持小鼠。將RT112 shRNA穩定細胞(7×106 )、RT112(7×106 )、Ba/F3-FGFR3S249C (5×106 )、OPM2(15×106 )或KMS11細胞(20×106 )於HBSS/基質膠(matrigel)(1:1 v/v，BD Biosciences)中以0.2 ml體積皮下植入小鼠側腹中。在無基質膠下植入UMUC-14細胞(5×106 )。使用測徑規每週量測腫瘤兩次，且使用下式計算腫瘤體積：V=0.5 a×b2 ，其中a及b分別為腫瘤之長度及寬度。當平均腫瘤體積達到150-200 mm3 時，將小鼠隨機分組，每組10隻小鼠，且每週用稀釋於HBSS中之R3Mab(0.3-50 mg/kg)或對照人類IgG1腹膜內(i.p)注射處理兩次。僅給與對照動物以媒劑(HBSS)。
統計
混合數據表示為平均值+/- SEM。使用不成對學生t 檢定(Unpaired Student'st test，雙尾)在兩組之間進行比較。在所有實驗中，將P <0.05之值視作具有統計學顯著性。
產生FGFR3 shRNA穩定細胞
如(1)中所述將3個獨立FGFR3 shRNA選殖至pHUSH載體中。用於研究之FGFR3 shRNA之序列如下：shRNA2：5'GATCCCCGCATCAAGCTGCGGCATCATTCAAGAGATGATGCCGCAGCTTGATGCTTTTTTGGAAA(SEQ ID NO:192)；shRNA4：5'-GATCCCCTGCACAACCTCGACTACTATTCAAGAGATAGTAGTCGAG GTTGTGCATTTTTTGGAAA-3'(SEQ ID NO:193)；shRNA6：5'-GATCCCCAACCTCGACTACTACAAGATTCAAGAGATCTTGTAGTAGT CGAGGTTTTTTTTGGAAA-3'(SEQ ID NO:194)。藉由測序確定所有構築體。在吾人先前研究(50)中描述EGFP對照shRNA。
藉由用VSV-G(Clontech Laboratories)及pHUSH-FGFR3 shRNA構築體共轉染GP2-293包裝細胞(Clontech Laboratories，Mountain View，CA)產生含有shRNA之反轉錄病毒，且在轉染後第72小時採集病毒上清液，且藉由離心清除細胞碎片以供轉導實驗。
將RT112細胞維持於含有無四環素之FBS(Clontech Laboratories)的RPMI 1640培養基中，且用反轉錄病毒上清液在4 μg/ml聚凝胺存在下轉導。感染後第72小時，將2 μg/ml嘌呤黴素(Clontech Laboratories)添加至培養基中以選擇表現shRNA之穩定純系。分離穩定細胞，用0.1 μg/ml或1 μg/ml多西環素(Clontech Laboratories)處理4天，且藉由西方墨點分析評定對FGFR3蛋白表現之誘導性敲除。如所述(51)進行細胞週期分析。
選擇對FGFR3具有特異性之噬菌體抗體
使用具有所選互補決定區(H1、H2、H3、L3)之合成多樣性(模擬人類IgG譜系之天然多樣性)的人類噬菌體抗體文庫進行淘選。在M13噬菌體顆粒之表面上以二價形式呈現Fab片段(52)。使用人類FGFR3-IIIb及FGFR3-IIIc之經His標記之IgD2-D3作為抗原。在4℃下用FGFR3-IIIb-His蛋白或FGFR3-IIIC-His蛋白(10 μg/ml)塗布96孔MaxiSorp免疫板(Nunc)隔夜，且用補充有1% BSA之PBST緩衝液(含有0.05% Tween 20之PBS)阻斷1小時。添加抗體噬菌體文庫且在室溫(RT)下培育隔夜。用PBST緩衝液洗滌各板且用50 mM HCl及500 mM NaCl溶離結合之噬菌體30分鐘且用等體積1 M Tris鹼中和。在大腸桿菌XL-1 blue細胞中擴增回收之噬菌體。在後續數輪選擇期間，將噬菌體抗體之培育時間縮短至2小時且逐漸增加板洗滌之嚴格度(53)。藉由噬菌體ELISA及DNA測序鑑別結合至FGFR3之IIIb及IIIc同功異型物兩者之獨特及特異性噬菌體抗體。自所篩選之400個純系當中，選擇4個純系以藉由分別將個別純系之VL及VH區選殖至LPG3及LPG4載體中，使其於哺乳動物細胞中短暫表現，且用蛋白質A管柱純化來重構成全長IgG(54)。選擇純系184.6以用於親和力成熟。
對於親和力成熟，在M13噬菌體表面上單價Fab之噬菌粒呈現(52)用作移植噬菌體Ab之輕鏈(VL)及重鏈(VH)可變域之文庫模板。將終止密碼子併入CDR-L3中。如所述(53)採用軟隨機化策略來進行親和力成熟。選擇兩種不同之CDR環之組合(H1/H2/L3、H3/L3或L1/L2/L3)以供隨機化。為選擇親和力成熟純系，如所述(52)針對FGFR3 IIIb-His蛋白或FGFR3 IIIc-His蛋白分選噬菌體文庫，對其進行第一輪板分選及隨後4輪溶液相分選。在5輪淘選後，如所述(55)使用高通量單點競爭性噬菌體ELISA快速篩選高親和力純系。選擇在10 nM FGFR3-His存在下與在無FGFR3-His存在下450 nm下之吸光度比率較低之純系以進一步表徵。
純系184.6.1、184.6.21、184.6.49、184.6.51、184.6.58、184.6.62及184.6.92顯著降低Ba/F3-FGFR3-IIIb、Ba/F3-FGFR3-IIIc及Ba/F3-FGFR3-S249C細胞株之活力，且純系184.6.52顯著降低Ba/F3-FGFR3-S249C細胞株之活力。增強之抑制活性在親本純系184.6之約50倍(純系184.6.52)至約100倍(純系184.6.1、184.6.21、184.6.49、184.6.51、184.6.58、184.6.62及184.6.92)之範圍內，視所檢定之細胞株而定。使用BIAcore測定純系184.6.1、184.6.58及184.6.62與FGFR3-IIIb及FGFR3-IIIc之結合動力學如下：
純系184.6.1、184.6.58及184.6.62亦展示改良對Ba/F3-FGFR3細胞、RT112細胞及OPM2細胞中之FGFR3下游信號傳導的抑制。
選擇純系184.6.1。將序列修飾N54S在殘基54處引入HVR H2中以改良可製造性，產生純系184.6.1N54S。純系184.6.1與184.6.1N54S呈現相似的結合動力學(以Biacore檢定量測)且在Ba/F3細胞活力檢定中呈現相似的活性。產生額外HVR H2變異體：將N54S引入純系184.6.58中，且將N54G、N54A或N54Q引入純系184.6.1及184.6.58中。此等純系與親本純系184.6.1或184.6.58在Ba/F3細胞活力檢定中展示相似活性。
將另一序列修飾D30E引入純系184.6.1N54S之HVRL1中，產生純系184.6.1NSD30E。純系184.6.1NSD30E與純系184.6.1N54S與親本純系184.6.1或184.6.58展示相似結合動力學且在BA/F3細胞活力檢定中展示相似活性。
如本文所用，「R3Mab」係指抗FGFR3抗體純系184.6.1N54S、184.6.1或184.6。在圖及實驗中使用純系184.6.1N54S，稱作「R3Mab」，例外為產生下圖中所示之結果的實驗中(其中所用之抗體係展示於括號中)：圖9B(純系184.6.1)、圖10(純系184.6)、圖11A及B(純系184.6)、圖13(純系184.6.1)、圖14A(純系184.6.1)、圖14B、G及H(純系184.6)、圖19(純系184.6.1)及圖22B及C(純系184.6.1)。
測定抗體結合親和力之BIAcore/表面電漿共振(SRP)分析
如所述(52)在下列修改下使用BIAcoreTM -3000儀器藉由Biacore/SRP量測R3Mab對FGFR3之結合親和力。將R3Mab直接塗布於CM5生物感測器晶片上以達成約400反應單元(RU)。為進行動力學量測，在25℃下以每分鐘30微升之流動速率注射於PBST緩衝液中之FGFR3-IIIb-His蛋白或FGFR3-IIIc-His蛋白之兩倍連續稀釋液(以67 nM起始)。使用簡單1對1朗繆耳結合模型(BIAcore評估軟體版本3.2)計算締合速率(Kon，M-1 S-1 )及解離速率(Koff，S-1 )。根據比率Koff/Kon來計算平衡解離常數(Kd，M)。
如下藉由Biacore/SRP量測小鼠融合瘤抗體對FGFR3之結合親和力。將人類FGFR3-IIIb或FGFR3-IIIc偶合至BIACORETM CM5感測器晶片之3個不同流槽(FC)FC2、FC3及FC4上以達成約50 RU之反應單元(RU)。藉由使用由製造商提供之方案經由胺基隨機偶合來達成固定。在25℃下藉由以每分鐘30微升之流動速率注射一系列以2倍為增量250 nM至0.48 nM範圍內之溶液來記錄源自融合瘤之抗FGFR3鼠類IgG或Fab片段與此等表面之結合的感測器圖譜。在各次注射之間，使用10 mM甘胺酸-HCl(pH 1.7)作為緩衝液以再生感測器晶片。自在FC2、FC3及FC4處所觀測到之感測器圖譜減去來自參考流槽(FC1)之信號。藉由使用由製造商供應之BIAcore評估軟體(版本3.2)根據一對一朗繆耳結合模型對資料進行非線性回歸擬合來計算動力學常數。
ELISA結合研究
將編碼人類FGFR1-IIIb、FGFR1-IIIc、FGFR2-IIIb及FGFR2-IIIc、FGFR3-IIIb及FGFR3-IIIc以及FGFR4之細胞外域(ECD)之cDNA選殖至基於pRK之載體中以產生人類FGFR-人類Fc嵌合蛋白。藉由短暫轉染中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生重組蛋白且經由蛋白質A親和層析純化。為測試抗體與人類FGFR之結合，在4℃下用50 μl之2 μg/ml FGFR ECD-人類Fc嵌合蛋白塗布Maxisorp 96孔板(Nunc)隔夜。在用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)/3% BSA阻斷後，添加FGFR3抗體且在室溫下培育2小時。使用結合HRP之抗人類Fab及TMB過氧化酶顯色受質(KPL，Gaithersburg，MD)偵測特異性結合之FGFR3抗體。
為測試針對FGFR3之抗體對FGF/FGFR3相互作用之影響，將FGFR3-Fc嵌合蛋白捕捉於塗有抗人類免疫球蛋白Fcγ片段特異性抗體(Jackson Immunoresearch，West Grove PA)之Maxisorp板上。洗滌後，將遞增量之FGFR3抗體添加至板中且培育30分鐘。接著，添加FGF1或FGF9及肝素以在室溫下培育2小時。洗滌各板且與經結合生物素之FGF1特異性多株抗體(BAF232)或經結合生物素之FGF9抗體(BAF273，R&D Systems)一起培育1小時，隨後用抗生蛋白鏈菌素-HRP及TMB偵測。
產生Ba/F3-FGFR3穩定細胞
將編碼全長人類FGFR3 IIIb或FGFR3 IIIc之cDNA選殖至pQCXIP載體(Clontech Laboratories，Mountain View，CA)中以產生pQCXIP-FGFR3-IIIb或pQCXIP-FGFR3-IIIc。經由QuickChange(Stratagene，La Jolla，CA)將特定突變(亦即R248C、S249C、G372C、Y375C及K652E)引入cDNA中。為產生表現野生型或突變型FGFR3之Ba/F3穩定細胞，將各種pQCXIP-FGFR3構築體及VSV-G質體(Clontech Laboratories)共轉染至包裝細胞GP2-293中。用2 μg/ml嘌呤黴素選擇2週後，用結合藻紅素之抗人類FGFR3 mAb(FAB766P，R&D Systems)對表現野生型或突變型FGFR3之細胞進行染色且經由螢光活化細胞分選(FACS)選擇以供功能檢定。為在96孔微量滴定板中進行細胞增殖檢定，使用下列細胞密度：對於表現野生型FGFR3-IIIb及FGFR3-K652E之細胞：每孔5,000個細胞；對於其他：每孔10,000個細胞。細胞接種於補充有10%胎牛血清、10 ng/ml FGF1加上10 μg/ml肝素(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)之RPMI 1640培養基中。添加指定濃度之R3Mab且在FGFR3-IIIb實驗中添加2000至0.49 ng/ml(四倍連續稀釋液)之小鼠融合瘤FGFR3抗體，且在FGFR3-IIIc實驗中添加5000至1.2 ng/ml(四倍連續稀釋液)之小鼠融合瘤FGFR3抗體。培育72小時後，用CellTiter-Glo(Promega，Madison，WI)評定細胞活力。
細胞增殖檢定
為對RT112、RT4及TCC-97-7細胞進行增殖檢定，將每孔3000個細胞接種於96孔微量滴定板中且使其附著隔夜。接著將培養基置換為含有指定濃度之對照物或R3Mab的低血清培養基(0.5% FBS)。培育4天後，將1 μCi之[甲基-3 H]胸苷(PerkinElmer，Waltham，MA)添加至各孔中，且再培育16小時。使用Packard Filtermate收集器將細胞轉移至UniFilter中，且使用TopCount(PerkinElmer)量測併入生長細胞之基因組DNA中之[3 H]-胸苷。在一些情況下，在與抗體一起培育4天後，用CellTiter-Glo(Promega)評定細胞活力。值呈現為四份之平均值+/-SE。
純系生長檢定
按照先前所述之方案(50)評定R3Mab對細胞群落形成的影響。簡言之，將400個UMUC-14細胞於補充有10%胎牛血清之DMEM培養基中接種於6孔板中，允許附著隔夜。接著添加稀釋於0.1% BSA培養基中之R3Mab或對照抗體以達到10 μg/ml之最終濃度。使用等體積之單獨0.1% BSA培養基(空白對照物)作為另一對照物。培育細胞約12天直至對照組之細胞形成實質上大型群落為止。用0.5%結晶紫對群落進行染色且使用GelCount(Oxford，UK)定量群落之數目及尺寸。直徑大於120 μm之群落數目呈現為平均值+/-SEM(n=12)。
免測沈澱及免疫墨點分析
為研究抗體對FGFR3信號傳導之影響，在開始處理前在無血清培養基中使細胞饑餓隔夜。將細胞與稀釋於0.1% BSA(w/v)、RPMI 1640培養基中之抗體或與單獨0.1% BSA培養基(空白對照物)一起培育。在37℃下3小時後，將FGF1(最終濃度為15 ng/ml)及肝素(最終濃度為5-10 μg/ml)添加至一半樣品中。將類似體積之單獨肝素添加至另一半樣品中作為對照物。繼續培育10分鐘。藉由抽吸移除上清液，且用冰冷PBS洗滌細胞，接著將其在補充有1 mM原釩酸鈉及完全蛋白酶抑制劑混合液(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)之RIPA緩衝液(Upstate，Charlottesville，VA)中溶解。藉由離心自溶胞物清除不可溶物質。
使用家兔多株抗體(sc-123，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)使FGFR3免疫沈澱，且藉由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及西方墨點進行分析。用針對磷酸化酪胺酸之單株抗體(4G10，Upstate)評定磷酸化之FGFR3。用針對FGFR3之單株抗體(sc-13121，Santa Cruz Biotechnology)探測總FGFR3。使用下列抗體探測FGFR3信號傳導路徑之磷酸化及活化：抗FGFRY653/654 、抗FRS2αY196 、抗磷酸化p44/42 MAPKT202/Y204 、抗總p44/42 MAPK及抗AKTS473 係獲自Cell Signaling Technology(Danvers，MA)；及抗總FRS2α(sc-8318)係購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。使用化學發光受質(ECL Plus，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)使墨點可見。
抗體抗原決定基定位
為測定R3Mab之抗原決定基，合成覆蓋人類FGFR3之細胞外域(殘基138至310)的13個重疊肽(各者長度為15個胺基酸)。使肽在C-末端處結合生物素，且捕捉於抗生蛋白鏈菌素板(Pierce，Rockford，IL)上隔夜。用 PBS/3% BSA阻斷後，培育含R3Mab之板且使用結合HRP之抗人類IgG(Jackson Immunoresearch)及TMB過氧化酶顯色受質(KPL，Gaithersburg，MD)偵測。
在ELISA檢定中測試小鼠抗人類FGFR3融合瘤抗體1G6、6G1及15B2以鑑別其結合抗原決定基。1G6、6G1及15B2結合至人類FGFR3 IgD2-IgD3(IIIb及IIIc同功異型物兩者)，而5B8僅結合至人類FGFR3-IIIb之IgD2-IgD3。在競爭檢定中，1G6、6G1與15B2彼此競爭結合人類FGFR3，表明1G6、6G1及15B2具有重疊抗原決定基。融合瘤抗體中無一者與噬菌體抗體184.6競爭，表明融合瘤抗體與184.6具有不同抗原決定基。
製備及分子選殖小鼠抗FGFR3抗體1G6、6G1及15B2
每週兩次於各後足墊中用再懸浮於單磷醯基脂質A/海藻糖二柯諾黴菌酸酯佐劑(Corixa，Hamilton，MT)中之2.0 μg FGFR3-IIIb(rhFGFR3(IIIB))/Fc嵌合體(來自R&D Systems，目錄號：1264-FR，批號：CYH025011)或2.0 μg FGFR3-IIIc(rhFGFR3(IIIc))/Fc嵌合體(來自R&D Systems，目錄號：766-FR，批號：CWZ055041)使BALB/c小鼠免疫12次。最終增強免疫後第三天，經由電融合(Hybrimune，Cyto Pulse Sciences，Glen Burnie，Maryland)使腿彎部淋巴結與小鼠骨髓瘤細胞株P3X63Ag.U.1融合。在來自ClonaCell融合瘤選擇套組(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，BC，Canada)之培養基D中使用次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷(HAT)選擇自未融合之腿彎部淋巴結或骨髓瘤細胞選擇融合之融合瘤細胞。最初藉由ELISA針對培養物上清液結合至FGFR3-IIIb及FGFR3-IIIc之能力篩選培養物上清液，且隨後藉由FACS針對相關融合瘤使經轉染之FGFR3-IIIb Ba/F細胞及對照Ba/F得以染色之能力，以及針對抗體阻斷活性篩選相關融合瘤。接著藉由限制稀釋法選殖所選之融合瘤。
使用RNeasy Mini套組(Qiagen，Germany)自產生小鼠抗人類FGFRIII單株抗體1G6及15B2之融合瘤細胞中提取總RNA。使用RT-PCR以下列簡併引子擴增輕鏈可變(VL)域及重鏈可變(VH)域：1G6：輕鏈(LC)正向：5'-GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCWGC-3'(SEQ ID NO:195)重鏈(HC)正向：5'-GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3'(SEQ ID NO:196)6G1：輕鏈(LC)正向:5'-GTCAGATATCGTGCTGACMCARTCTCC-3'(SEQ ID NO:197)重鏈(HC)正向：5'-GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3'(SEQ ID NO:198)15B2：輕鏈(LC)正向:5'-GTACGATATCCAGATGACMCARTCTCC-3'(SEQ ID NO:199)重鏈(HC)正向：5'-GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3'(SEQ ID NO:200)，所有3種純系之輕鏈及重鏈反向引子如下：輕鏈反向：5'-TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3'(SEQ ID NO:201)重鏈反向：5'-ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3'(SEQ ID NO:202)。
正向引子對VL及VH區之N末端胺基酸序列具有特異性。LC及HC反向引子經設計以分別黏接至在物種間高度保守之輕鏈恆定(CL)域及重鏈恆定域1(CH1)中之區域。
將擴增之VL選殖至含有人類K恆定域之pRK哺乳動物細胞表現載體(Shields等人，(2000)J. Biol. Chem. 276:659)中。將經擴增之VH***編碼全長人類IgG1恆定域之pRK哺乳動物細胞表現載體中。使用習知方法測定重鏈及輕鏈之序列。
結晶、結構測定及精修
將人類FGFR3-IIIb ECD(殘基143-374)選殖至pAcGP67A載體(BD Bioscience，San Jose，CA)中，使其產生於T.ni Pro細胞中，且使用Ni-NTA管柱隨後使用尺寸排阻層析純化。使R3Mab Fab表現於大腸桿菌中且連續經蛋白質G親和管柱、SP瓊脂糖管柱及Superdex 75管柱純化。藉由將Fab與過量FGFR3 ECD一起培育產生Fab-FGFR3複合物，且接著將該複合物脫糖基化且經Superdex-200尺寸化管柱以20 mM TrisCl(pH 7.5)及200 mM NaCl緩衝液中純化。混合含有複合物之部分且濃縮至20 mg/ml且用於結晶試驗中。在4℃下使用於結構測定之晶體自下列條件生長：0.1 M二甲胂酸鈉(pH 6.5)、40% MPD及5% PEG8000，使用蒸氣擴散法。使用HKL2000及Scalepack處理資料(56)。使用程式Phaser(57)以及1RY3(FGFR3)及1N8Z(Fab片段)之座標用分子置換分析結構。使用程式Coot(58)完成模型且用程式Refmac(59)將結構精修成20.4%/24.3%之R/Rfree 。將座標及結構因子以寄存編號3GRW寄存於蛋白質資料庫中，且其亦揭示於2009年3月25日申請之USSN 61/163,222中，其內容係以引用的方式併入本文中。
ADCC檢定
藉由對肝素化血液進行菲科爾梯度離心(Ficoll gradient centrifugation)分離出人類PBMC，且以1:100標靶：效應物比率使用多發性骨髓瘤細胞株OPM2或KMS11或膀胱癌細胞株RT112或UMUC-14作為標靶及PBMC作為效應細胞來量測ADCC。在37℃下用R3Mab或對照人類IgG1處理標靶細胞(每孔10,000個細胞)4小時。藉由按照製造商之說明書使用CytoTox-ONE均質膜完整性檢定(Promega，Madison，WI)，量測LDH釋放來測定細胞毒性。結果係使用下式表示為特異性細胞溶解之百分比：細胞毒性(%)=[(實驗溶解-實驗自發溶解)/(標靶最大溶解-標靶自發溶解)]x100，其中自發溶解為在無抗體存在下之非特異性細胞溶解，而標靶最大溶解係由1% Triton X-100誘導。
結果
誘導性shRNA敲除FGFR3在活體內削弱膀胱癌生長
在評定FGFR3在活體內對膀胱腫瘤生長之重要性之前，吾人分析活體外FGFR3敲除作用。若干FGFR3小干擾(si)RNA有效下調表現WT(RT112、RT4、SW780)或突變型(UMUC-14、S249C突變)FGFR3之膀胱癌細胞株中之FGFR3。在培養物中在所有4種細胞株中敲除FGFR3顯著抑制增殖(圖15)。之後，吾人製成表現多西環素誘導性FGFR3 shRNA之穩定RT112細胞株。由多西環素誘導3種獨立之FGFR3 shRNA減少FGFR3表現，而誘導靶向EGFP之對照shRNA則無作用(圖7A)。在無外源FGF存在下，多西環素處理降低由表現不同FGFR3 shRNA而非對照shRNA之細胞對[3 H]-胸苷之併入(圖7B)，確定FGFR3敲除抑制增殖。對指數生長之RT112細胞之進一步分析揭示經多西環素處理72小時敲除FGFR3顯著且特異性降低處於細胞週期之S期及G2期之細胞的百分比，而同時增加處於G1期之細胞(圖7C)。在兩種其他FGFR3 shRNA下觀測到類似作用(圖16A)。未偵測到顯著數目之具有次二倍體DNA內容物之細胞，表明細胞凋亡程度無變化。因此，FGFR3敲除對RT112細胞增殖之抑制作用主要歸因於削弱細胞週期進程。
吾人隨後評估FGFR3敲除對小鼠體內預先形成之RT112腫瘤異種移植物生長之影響。FGFR3敲除實質上且特異性抑制腫瘤生長(圖7D，上部圖示及圖16B)。對第45天腫瘤樣品之分析確定在多西環素誘導FGFR3 shRNA後與對照shRNA相比有效敲除FGFR3(圖7D，下部圖示)。此等結果表明FGFR3在活體外及活體內對於RT112膀胱癌細胞生長皆極為重要。
產生阻斷抗FGFR3單株抗體
為進一步分析FGFR3對腫瘤生長之重要性且探索此受體作為治療標靶之潛能，吾人使用噬菌體呈現方法開發一種拮抗性抗FGFR3單株抗體(稱作R3Mab)。吾人基於此特定抗體阻斷FGFR3之配位體結合及二聚之能力及其不僅抑制WTFGFR3且亦抑制此受體之最普遍之癌症相關性突變體(參見下文)之獨特能力而選擇此特定抗體。R3Mab靶向FGFR3之細胞外IgD2及IgD3結構域，IgD2及IgD3結構域為FGF結合所需且足以結合FGF(4)。R3Mab結合人類FGFR3之IIIb及IIIc同功異型物兩者，但與FGFR1、FGFR2或FGFR4不展示可偵測結合(圖8A)。Biacore分析指示R3Mab對鼠類、短尾獼猴及人類FGFR3-IIIc具有類似之表觀親和力(資料未示)。R3Mab對人類FGFR3之親和力係展示於表2中。
吾人接著測試R3Mab阻斷FGFR3結合至FGF1及FGF9之能力。R3Mab強烈抑制FGF1與FGFR3-IIIb及FGFR3-IIIc結合，半數最大抑制濃度(IC50 )分別為0.3 nM及1.7 nM(圖8B、C)。類似地，R3Mab有效阻斷FGF9結合至FGFR3-IIIb及FGFR3-IIIc，IC50 分別為1.1 nM及1.3 nM(圖8D、E)。
R3Mab抑制WT FGFR3及其最普遍之癌症相關性突變變異體
為分析R3Mab是否抑制由WT或突變型FGFR3所驅使之細胞增殖，吾人利用以下觀測結果：鼠類祖B細胞Ba/F3中之異位FGFR3表現賦予非介白素(IL)-3依賴性、FGF1依賴性增殖及存活(29)。在無FGF1及IL-3存在下，穩定表現WT FGFR3之Ba/F3細胞不能存活，而FGF1極大增強其增殖(圖9A)。R3Mab以劑量依賴性方式特異性阻斷FGF1刺激之Ba/F3-FGFR3細胞增殖(圖9A)。吾人隨後評估R3Mab對此等細胞中之FGFR3信號傳導的影響。FGF1誘導FGFR3磷酸化及活化且誘導p44/42 MAPK同時活化，而R3Mab有效抑制兩種分子活化(圖9B)。
在膀胱癌中，FGFR3中之體細胞活化突變叢集於IgD2與IgD3之間的連接子區、細胞外近膜結構域或激酶結構域中(圖9C)。細胞外錯義取代最常產生不成對之半胱胺酸，導致FGFR3非配位體依賴性二聚。此等突變引起組成性FGFR3活化程度顯著不同，可能歸因於對細胞質激酶結構域取向之影響不同所致(30、31)。最常見突變為S249C、Y375C、R248C、G372C及R652E，其共佔膀胱癌中所有FGFR3突變之98%(32)。吾人推論最佳治療劑應不僅阻斷某些癌症中過度表現之WT FGFR3蛋白且亦阻斷最普遍之腫瘤相關性FGFR3突變體。為進一步評定R3Mab，吾人製成穩定表現5種最常見FGFR3突變變異體中之每一者的Ba/F3細胞株。所有突變體皆以類似含量表現於細胞表面上，且半胱胺酸突變體在無配位體下自發二聚(資料未示)。表現不同半胱胺酸突變體之細胞株對FGF1展現可變之生長反應，與早期研究結果相符(30、31)。如先前所報導(33)，表現FGFR3R248C 之細胞呈現組成性、非配位體依賴性增殖，且對FGF1不具反應性(圖9D)。類似地，最常見突變FGFR3S249C 賦予非配位體依賴性增殖(圖9E)。R3Mab顯著抑制由任一突變體驅使之組成性增殖(圖9D、E)。表現近膜結構域突變FGFR3G372C (圖9F)或FGFR3Y375C (圖9G)之細胞需要FGF1來增殖，且其生長由R3Mab完全阻斷。表現FGFR3K652E 之細胞回應於FGF1展現弱非配位體依賴性增殖及顯著生長(33)。R3Mab不影響FGFR3K652E 之弱基礎活性(資料未示)，但幾乎消除由此突變體介導之配位體誘導之增殖(圖9H)。因此，R3Mab具有抑制WT FGFR3及普遍癌症相關性FGFR3突變體之獨特能力。此外，R3Mab不呈現可偵測之促效劑活性。
作為單方面努力，吾人製得多種小鼠抗人類FGFR3融合瘤抗體且對其進行表徵。融合瘤抗體中無一者可抑制吾人所測試之所有癌症相關性FGFR3突變體(圖17)，且其不與R3Mab共有重疊抗原決定基。
此外，所有融合瘤抗體皆展示促效劑活性，強烈刺激癌症相關性FGFR3突變體R248C及S249C增殖，且展現一定程度之對突變體Y375C及G370C增殖之刺激作用。視所測試之FGFR3突變體而定，如下融合瘤抗體展示不同之拮抗劑及促效水準：
因此，融合瘤抗體對由各種FGFR3突變體驅使之Ba/F3細胞之細胞增殖展現不可預測之不同作用。
對小鼠抗人類FGFR3融合瘤抗體進行表徵
小鼠抗人類FGFR3融合瘤抗體特徵進一步如下：
(1)在測試抗FGFR3鼠類融合瘤抗體抑制FGF1結合至人類FGFR3-IIIb及FGFR3-IIIc同功異型物之能力的檢定中，抗體1G6、6G1及15B2能夠以劑量依賴性方式阻斷FGF1結合至人類FGFR3-IIIb及FGFR3-IIIc同功異型物。當在約2000至0.49 ng/ml下之抗體濃度範圍中測試時，抗體1G6、6G1及15B2以0.69 nM、0.87 nM及0.72 nM之IC50值阻斷FGF1結合至FGFR3-IIIb。當在約5000至1.2 ng/ml之抗體濃度範圍中測試時，抗體1G6、6G1及15B2分別以0.57 nM、3.4 nM及0.7 nM之IC50值阻斷FGF1結合至FGFR3-IIIc。
(2)在測試抗FGFR3鼠類融合瘤抗體抑制FGF9結合至人類FGFR3-IIIb及FGFR3-IIIc同功異型物之能力之檢定中，抗體1G6、6G1及15B2以劑量依賴性方式有效阻斷FGF1結合至人類FGFR3-IIIb及FGFR3-IIIc同功異型物。當在約2000至0.49 ng/m之抗體濃度範圍中測試時，抗體1G6、6G1及15B2分別以0.13 nM、0.16 nM及0.07 nM之IC50值阻斷FGF9結合至FGFR3-IIIb。當在約5000至1.2 ng/ml之抗體濃度範圍中測試時，抗體1G6、6G1及15B2分別以0.13 nM、0.11 nM及0.07 nM之IC50值阻斷FGF9結合至FGFR3-IIIc。
(3)使用Biacore分析測定全長抗FGFR3鼠類融合瘤抗體1G6、6G1及15B2之結合親和力。此分析之結果係展示於表3中。
(4)　在測試抗FGFR3鼠類融合瘤抗體抑制由人類FGFR3-IIIb或FGFR3-IIIc驅使之Ba/F3細胞增殖之能力的檢定中，抗體1G6、6G1及15B2能夠以劑量依賴性方式阻斷由人類FGFR3-IIIb或FGFR3-IIIc驅使之Ba/F3細胞增殖。當在約0.01至100 μg/ml之抗體濃度範圍中測試時，抗體1G6、6G1及15B2分別以3-5 nM、3 nM及6-8 nM之IC50值阻斷由FGFR3-IIIb驅使之Ba/F3細胞增殖，且分別以10-35 nM、24 nM及60 nM之IC50值阻斷由FGFR3-IIIc驅使之Ba/F3細胞增殖。
(5)　在測試抗FGFR3鼠類融合瘤抗體抑制表現人類FGFR3-IIIb之Ba/F3細胞中由FGF1誘導之信號傳導之能力的檢定中，當在約0.25至6.75 μg/ml之抗體濃度範圍中測試時，抗體1G6、6G1及15B2能夠以劑量依賴性方式阻斷表現人類FGFR3-IIIb之Ba/F3細胞中由FGF1誘導之信號傳導。在此實驗中使用25 ng/ml FGF1。在無FGF1存在下，抗體處理對FGFR3活化無影響。
(6)　在測試抗FGFR3鼠類融合瘤抗體抑制表現人類FGFR3-IIIc之Ba/F3細胞中由FGF1誘導之信號傳導之能力的檢定中，當在約0.25至6.75 μg/ml之抗體濃度範圍中測試時，抗體1G6、6G1及15B2能夠以劑量依賴性方式阻斷表現人類FGFR3-IIIc之Ba/F3細胞中由FGF1誘導之信號傳導。在此實驗中使用25 ng/ml FGF1。在無FGF1存在下，抗體處理對FGFR3活化無影響。
R3Mab與FGFR3相互作用之結構基礎
為瞭解R3Mab與FGFR3相互作用之模式，吾人合成一組13個跨越FGFR3-IIIb IgD2及IgD3區之重疊肽且測試其與R3Mab之結合。肽3(殘基164-178)及肽11(殘基269-283)展示特異性結合至R3Mab，其中肽3與R3Mab之相互作用更強(圖10A)，指示FGFR3上之相應區域對於由R3Mab識別為關鍵的。先前對FGFR1與FGF2之複合物之結晶學研究鑑別出參與直接結合於FGF及肝素以及參與受體二聚之關鍵受體殘基(34)。將FGFR3肽3及肽11與FGFR1中之功能性重要位點進行比對揭示此等肽涵蓋對於直接FGF2結合、受體二聚以及與肝素相互作用所必需之相應FGFR1殘基(圖10B)。此等資料指示R3Mab針對FGFR3之抗原決定基與參與配位體締合及受體-受體相互作用之受體殘基重疊。
吾人隨後使R3Mab之Fab片段與人類FGFR3-IIIb之細胞外IgD2-D3區之間的複合物結晶，且在2.1解析度下測定X射線結構(圖10C、D；表4)。在此複合物中，FGFR3及Fab上分別掩埋約14002及15002之溶劑可達之表面積。約80%所掩埋之界面涉及IgD2，而其餘部分需要連接子及IgD3區。在複合物之Fab側，約40%之所掩埋之界面涉及互補決定區(CDR)-H3、20%之CDR-H2、20% CDR-L2，且次要成分來自其他CDR及構架殘基。值得注意的是，CDR-H3之胺基酸(AA)形成2個β-股，其使IgD2之β-摺疊延伸(圖10D)。如先前在各種二聚FGF:FGFR複合物中所鑑別，Fab與構成FGFR3之FGF結合位點之AA以及形成受體二聚界面之殘基相互作用(例如PDB編號：1CVS(34)；及圖10C，呈灰色/陰影線及深灰色之區域)。由結晶學所鑑別之相互作用界面與基於肽之資料(圖18A、B)完全符合。總之，此等結果揭示R3Mab如何抑制配位體結合，且進一步表明R3Mab結合至FGFR3可阻止受體二聚。接觸R3Mab之FGFR3胺基酸係於表5中展示。此結構之結晶學座標係以寄存編號3GRW寄存於蛋白質資料庫中。
a Rsym=Σ|I-<I>|/ΣI。<I>為獨特反射對稱相關觀測結果之平均強度。
b 括號中之數字係指最高解析度殼層。
c R=Σ|Fo-Fc|/ΣFo。Rfree 係如R但針對自所有精修排除之5%反射計算。
吾人將R3Mab-FGFR3結構與先前公開之FGFR3-IIIc與FGF1之複合物之結構進行比較(4、35)(圖10E、10F)。抗體-受體複合物與配位體-受體複合物之重合揭示除FGFR3-IIIc區別於FGFR3-IIIb之區域以外在個別受體結構域中不存在主要構形差異；然而IgD3相對於IgD2之取向完全不同(圖10E，白色及灰色；圖10F，白色及灰色網格)。由於IgD2與IgD3之相對位置對於配位體結合為關鍵的，所以在R3Mab結合後由IgD3採用之交錯構形可提供另一阻止配位體與FGFR3相互作用之機制。
R3Mab抑制膀胱癌細胞中之內源WT及突變型FGFR3
為評定R3Mab能否抑制FGFR3在膀胱癌細胞中之功能，吾人首先分析表現WT FGFR3之RT112及RT4細胞株。R3Mab強烈抑制RT112細胞對[3 H]-胸苷之併入(圖11A)，且對RT4細胞增殖發揮顯著而較適中之抑制作用(圖19A)。為研究R3Mab對FGFR3活化之影響，吾人分析RT112細胞中FGFR3之磷酸化。與Ba/F3-FGFR3細胞之結果相符(圖9B)，R3Mab顯著削弱FGF1誘導之FGFR3磷酸化(圖11B)。吾人隨後分析FRS2α、AKT及p44/42 MAPK(FGFR3信號傳導之3種下游介體)之磷酸化。FGF1強烈活化RT112細胞中之此等分子，而R3Mab顯著削弱此活化(圖11B)。類似地，R3Mab抑制RT4細胞中FGF1誘導之FGFR3及MAPK磷酸化(圖19B)。
吾人隨後研究R3Mab能否抑制人類膀胱癌細胞中內源突變型FGFR3之活化。S249C為膀胱癌中最常見之FGFR3突變(圖9C)。2種可用之細胞株UMUC-14及TCC-97-7攜有突變之FGFR3S249C 對偶基因(參考文獻36且資料未示)。儘管R3Mab在培養物中不影響UMUC-14細胞之指數生長(資料未示)，但其顯著減少此等細胞之純系生長(圖11C)。特定言之，相較於對照抗體，R3Mab使直徑大於120 μm之群落數目減少約77%(圖11D)。此外，R3Mab在培養物中抑制TCC-97-7細胞對[3 H]-胸苷之併入(圖19C)。
S249C突變經報導引起FGFR3之非配位體依賴性活化(26、30)。實際上，UMUC-14細胞及TCC-97-7細胞中FGFR3S249C 得以組成性磷酸化而與FGF1處理無關，然而相較於對照抗體，R3Mab減少兩種細胞株中FGFR3S249C 之組成性磷酸化(圖11E、19D)。
R3Mab抑制FGFR3 S249C 形成二聚體
R3Mab抑制膀胱癌細胞之組成性FGFR3S249C 信號傳導及增殖的能力令人驚奇，因為此突變體可進行二硫化物連接之非配位體依賴性二聚(26、30)。為探索R3Mab如何抑制FGFR3s249C ，吾人分析R3Mab對UMUC-14細胞中此突變體之寡聚狀態的影響。在還原條件下，FGFR3S249C 以約97 kDa之單一色帶形式遷移，與單體大小相符(圖12A)。在非還原條件下，在用對照抗體處理之細胞中，大部分FGFR3S249C 表現為約200 kDa之色帶而與添加FGF1無關，指示組成性二聚狀態(圖12A)。R3Mab處理實質上減少二聚體之量，且同時增加單體(圖12A)。與之一致的是，R3Mab減少TCC-97-7細胞中之FGFR3S249C 二聚體含量而與FGF1處理無關(圖19E)。
R3Mab如何減少膀胱癌細胞中FGFR3S249C 二聚體含量？一種可能的解釋為其可能經由抗體誘導之FGFR3內化及由核內體或溶酶體運輸來破壞FGFR3S249C 二聚體。吾人藉由以藥理學方式干預內飲作用來測試此可能性。儘管實質阻斷FGFR3S249C 內化，但R3Mab亦減少經各種內飲作用抑制劑預先處理之UMUC-14細胞中二聚體之量(圖20A、B)。因此，R3Mab對二聚體之破壞不依賴內飲作用。另一可能的解釋為細胞FGFR3S249C 可能存在動態單體-二聚體平衡；因此，R3Mab與單體FGFR3S249C 之結合可防止二聚體形成從而使平衡朝向單體狀態移動。為分析此可能性，吾人使用非細胞滲透劑5,5'二硫雙2-硝基苯甲酸(DTNB)，其選擇性地與不成對半胱胺酸之游離硫氫基反應且阻斷游離硫氫基(37)。用DTNB處理UMUC-14細胞引起FGFR3S249C 單體積聚而消耗二聚體(圖12B)，指示FGFR3S249C 單體與二聚體之間存在動態平衡。
為測試R3Mab是否影響此平衡，吾人製得包含FGFR3S249C 之IgD2-D3結構域的可溶性重組蛋白，且藉由尺寸排阻層折分離二聚體。吾人在極低濃度之還原劑(25 μM之DTT)存在下將二聚體與緩衝液或抗體一起培育，且在非還原條件下藉由SDS-PAGE分析受體之寡聚狀態。相較於空白對照物或抗體對照物，R3Mab顯著加速代表單體FGFR3S249C 之約25 kDa色帶之出現而消耗約50 kDa二聚體(圖12C)；實際上，經2小時，在R3Mab存在下二聚體實質上較完全減少。此等結果指示R3Mab使FGFR3S249C 之單體狀態與二聚狀態之間的平衡偏向於單體移動。
R3Mab不促進FGFR3下調
吾人藉由分析經FGFR3抗體處理之細胞中之FGFR3內化及降解來分析R3Mab(純系184.6.1)及抗FGFR3融合瘤抗體對FGFR3下調之影響。用R3Mab或融合瘤抗體1G6或6G1處理表現野生型FGFR3(RT112)或突變型FGFR3(S249C，於TCC97-7中)之膀胱癌細胞株4至24小時，接著採集細胞溶胞物以對總FGFR3含量進行西方墨點分析。用R3Mab處理不減少FGFR3含量，而經融合瘤mab 1G6及6G1處理顯著減少FGFR3含量。此等結果表明R3Mab不促進FGFR3下調，而mab 1G6及6G1確實促進FGFR3受體內化及下調。在單獨實驗中，使用FACS分析來分析表面FGFR3含量。R3Mab(純系184.6.1)處理UMUC-14細胞(含有FGFR3 S249C突變)24小時後，細胞表面FGFR3含量略有增加。此等結果表明R3Mab處理不促進FGFR3下調。
R3Mab在多種腫瘤模型中抑制生長及FGFR3信號傳導
隨後，吾人分析R3Mab在活體內對膀胱癌細胞生長之影響。吾人用RT112細胞(其表現WT FGFR3)注射nu/nu小鼠，使腫瘤長至約150 mm3 之平均體積，且每週2次用媒劑或R3Mab對動物進行給藥。在第27天與媒劑對照物相比，5 mg/kg或50 mg/kg之R3Mab處理分別使腫瘤生長抑制約41%或73%(圖13A)。對處理後第48小時或第72小時收集之腫瘤溶胞物的分析展示R3Mab顯著減少磷酸化FRS2α之含量(圖13B)。有趣的是，經R3Mab處理之腫瘤中總FRS2α蛋白含量亦降低，表明對抑制FGFR3可能進一步導致FRS2α下調。R3Mab亦降低腫瘤中磷酸化MAPK之量，而不影響總MAPK含量(圖13B)。因此，R3Mab抑制RT112腫瘤異種移植物生長同時阻斷藉由WT FGFR3之信號傳導。
吾人隨後研究R3Mab對表現突變型FGFR3之異種移植物生長之影響。R3Mab處理顯著削弱Ba/F3-FGFR3S249C 腫瘤之進展(圖13C)。此外，R3Mab顯著抑制UMUC-14膀胱癌異種移植物生長(圖13D)。為評估R3Mab在活體內是否影響FGFR3S249C 活化，吾人評定在處理後第24小時或第72小時收集之腫瘤溶胞物中之FGFR3S249C 二聚體含量。在非還原條件下，相較於對照組，經R3Mab處理之腫瘤中FGFR3S249C 二聚體之量實質上降低，而如根據在還原條件下所偵測之量判定，總FGFR3S249C 含量幾乎未展示變化(圖13E)。在腫瘤溶胞物中未觀測到明顯之FGFR3S249C 單體積聚，與細胞培養物中之結果形成對比(圖13E相對於12A)。此可能由於此研究中所用之家兔多株抗FGFR3抗體在非還原條件下對單體FGFR3之偵測靈敏度弱(圖21)。重要的是，R3Mab亦顯著抑制UMUC-14腫瘤中MAPK之磷酸化及活化(圖13E)，表明R3Mab在活體內抑制FGFR3S249C 之活性。吾人在任何活體內研究中未觀測到任何顯著體重減輕或其他大體異常。此外，在對小鼠進行之安全性研究中，以類似親和力結合至人類及鼠類FGFR3之R3Mab不對任何器官(包括膀胱)產生任何可察覺之毒性(資料未示)。總之，此等資料指示小鼠對多次暴露於R3Mab可良好耐受。
R3Mab在多發性骨髓瘤異種移植物模型中之抗腫瘤活性涉 及ADCC
為評定R3Mab可否具有用於多發性骨髓瘤之治療潛能，吾人首先測試R3Mab在培養物中對3種t(4;14)+細胞株之增殖及存活的影響。UTMC-2細胞攜有WT FGFR3，而OPM2及KMS11分別具有K650E及Y373C取代(7)。在培養物中，R3Mab完全消除FGF9誘導之UTMC-2細胞增殖(圖22A)。R3Mab中度抑制OPM2細胞生長，但對KMS11細胞增殖不具有明顯作用(圖22B、C)。由於UTMC-2細胞在小鼠體內不形成腫瘤，所以吾人評估R3Mab針對OPM2及KMS11腫瘤之功效。R3Mab幾乎完全消除兩種細胞株之異種移植腫瘤生長(圖14A、B)。
R3Mab在活體外與在活體內針對OPM2及KMS11腫瘤細胞之活性的顯著差異表明R3Mab可能能夠支持Fc介導之針對此等過度表現FGFR3之腫瘤的免疫效應功能之可能性。兩種細胞株皆表現高含量之CD55及CD59(資料未示)，其為兩種補體路徑抑制劑；因此，未觀測到補體依賴性細胞毒性(資料未示)。吾人接著關注ADCC。當抗體結合至其標靶細胞上之抗原且經由其Fc區嚙合免疫效應細胞上所表現之Fcγ受體(FcγR)時出現ADCC(38)。為活體外測試ADCC，吾人將KMS11或OPM2細胞與新鮮分離之人類周邊血液單核細胞(PBMC)在R3Mab或對照抗體存在下一起培育。R3Mab介導針對兩種骨髓瘤細胞株之顯著PBMC細胞溶解活性(圖14C、D)。相比之下，R3Mab不支持對膀胱癌RT112或UMUC-14細胞之細胞溶解(圖14E、F)。如由史卡查分析所量測，相較於膀胱癌細胞株，多發性骨髓瘤細胞表現實質上更多之細胞表面FGFR3(每個細胞多約5-6倍受體；圖23A、B)。
為說明ADCC對R3Mab活體內活性之作用，吾人將先前表徵之D265A/N297A(DANA)突變引入抗體之Fc域中。抗體Fc域中之此雙重取代消除其與FcγR之結合(39)，阻止免疫效應細胞募集。DANA突變在活體外不改變R3Mab與FGFR3結合或R3Mab對FGFR3活性之抑制，其亦不改變R3Mab在小鼠體內之藥物動力學(資料未示)；然而，其實質上消除針對OPM2或KMS11異種移植物之活體內活性(圖14G、H)。相比之下，DANA突變不改變R3Mab針對RT112及UMUC-14膀胱癌異種移植物之抗腫瘤活性(圖24A、B)。總之，此等結果表明Fc依賴性ADCC在R3Mab針對OPM2及KMS11多發性骨髓瘤異種移植物之功效中起重要作用。
其他異種移植物研究
R3Mab(純系184.6.1N54S)特徵進一步如下：
(a)基本上如上文所述使用基於肝癌細胞株(Huh7)之腫瘤異種移植物模型測試R3Mab之活體內功效。當在抗體濃度為5 mg/kg及30 mg/kg下測試時，R3Mab在活體內顯著抑制腫瘤生長。相較於對照動物體內之腫瘤生長，腫瘤生長被抑制約50%。
(b)基本上如上文所述，使用基於表現FGFR3之乳癌細胞株(Cal-51)之腫瘤異種移植物模型測試R3Mab之活體內功效。此功效研究之結果展示當在約1 mg/kg至100mg/kg之抗體濃度範圍中測試時，R3Mab抗體能夠在活體內抑制腫瘤。相較於對照動物體內之腫瘤生長，腫瘤生長被抑制約30%。
討論
FGFR3過度表現與t(4;14)+多發性骨髓瘤患者之不良預後的相關性及若干實驗模型中活化FGFR3之轉型活性已確立FGFR3為重要致癌驅動物，且因此為此血液科惡性病之潛在治療標靶。相比之下，儘管有報導顯示FGFR3突變及/或過度表現在膀胱癌中相當常見(24、25、40)，但FGFR3信號傳導在此上皮惡性病中之關鍵作用未能活體內確立。此外，在膀胱癌中抑制FGFR3的治療潛力仍有待確定。此處，吾人展示遺傳或藥理學干預FGFR3抑制小鼠體內若干人類膀胱癌異種移植物之生長。此等結果表明FGFR3功能在此背景下對於腫瘤生長為關鍵的，強調此受體作為膀胱癌之致癌驅動物及治療標靶的潛在重要性。阻斷FGFR3功能同樣抑制表現WT或突變型FGFR3之異種移植物生長，表明該受體之兩種形式皆顯著促進膀胱腫瘤進展。雖然比在膀胱癌中少見得多，但已在其他實體腫瘤惡性病中鑑別出FGFR3突變或過度表現，包括子宮頸癌(40)、肝細胞癌(41)及非小細胞肺癌(42、43)，表明FGFR3對其他類型之上皮癌的潛在作用。
FGFR3在不同惡性病中之明顯涉及使此受體被鑑別為用於靶向治療之具有吸引力之候選者。雖然已描述可抑制FGFR3激酶活性之小分子化合物(18-22、44)，但FGFR家族中激酶結構域之密切同源性阻礙對FGFR3選擇性抑制劑的開發。所報導之抑制劑缺乏選擇性，使得難以辨別FGFR3對特定癌症類型之生物學的相對作用；此外，可能需對安全性負責，從而限制最大劑量且因此限制對FGFR3之最佳抑制作用。因此，為達成選擇性且特異性靶向FGFR3，吾人轉向基於抗體之策略。吾人推論最佳治療抗體應能夠不僅阻斷WT且亦阻斷普遍之癌症相關性FGFR3突變體。此外，鑒於FGFR3二聚對其活化而言為關鍵的，所以不僅阻斷配位體結合且亦干擾受體二聚之抗體可為較佳。額外合意特性包括支持Fc介導之效應功能之能力及由全長抗體之天然構架所賦予之長血清半衰期。吾人之篩選及工程改造工作集中於鑑別組合所有此等特徵之抗體分子，產生R3Mab。結合研究表明R3Mab能夠與FGF配位體競爭以與FGFR3之IIIb及IIIc同功異型物兩者相互作用。使用經轉染之BaF/3細胞株之其他實驗確定R3Mab阻斷WT及普遍之癌症相關性FGFR3突變體兩者之顯著能力。另外，R3Mab在若干表現WT FGFR3或FGFR3S249C (其為此疾病中最常見之受體突變體)之膀胱癌異種移植物模型中發揮顯著抗腫瘤活性。藥效學研究表明R3Mab在此等模型中之抗腫瘤活性係基於對FGFR3信號傳導之抑制，此由減少FGFR3信號傳導下游介體FRS2α及MAPK之磷酸化所證實。此等資料進一步加強如下結論：如由吾人之FGFR3 shRNA研究所表明，FGFR3為膀胱腫瘤進展所需。
FGFR3突變在膀胱癌中代表實體腫瘤惡性病中一種最常見之蛋白激酶致癌改變，使人聯想到黑素瘤中之常見B-Raf突變(45)。FGFR3中之大部分活化突變產生不成對之半胱胺酸，引起非配位體依賴性受體二聚及各種程度之組成性活化。先前使用單價抗FGFR3 Fab片段之研究指示針對特定FGFR3突變體之抑制活性有差異(46)；然而，未研究此可變作用之分子基礎。相較於單價抗體片段，二價抗體具有誘導抗原叢集之能力，且在受體酪胺酸激酶之情況下，可引起受體寡聚及活化。儘管R3Mab具有全長二價構型，但R3Mab呈現對WT FGFR3及對廣泛範圍之FGFR3突變體的普遍抑制，該等突變體包括配位體依賴性(FGFR3G372 C、FGFR3Y375C )、組成性活性(FGFR3R248 C、FGFR3S249C )或兩者(FGFR3K652E )之變異體。此等結果提出如下問題：R3Mab如何拮抗WT及各種FGFR3突變體(包括二硫化物連接之變異體)？
基於與FGFR1之序列比對，由R3Mab所鑑別之肽抗原決定基與至配位體及肝素之結合以及受體二聚中所涉及之FGFR3殘基重疊。此結論係藉由對R3Mab與FGFR3之細胞外區域之間的複合物進行結晶學研究得以確認。X射線結構揭示抗體結合於對於配位體-受體相互作用以及受體-受體接觸而言關鍵之IgD2及IgD3之區域。因此，R3Mab可能藉由競爭配位體結合及藉由阻止受體二聚兩者來阻斷WT FGFR3。R3Mab可能利用類似機制來抑制具有低組成性活性但需要配位體以完全活化之FGFR3K652E 。此外，R3Mab結合改變FGFR3 IgD3相對於IgD2之相對取向。此研究結果提出如下形式上之可能性：抗體亦可能藉由迫使形成對信號轉導無幫助之構形來抑制受體活化-此觀念需要進一步研究。
為更好瞭解R3Mab如何阻斷具有不成對半胱胺酸之FGFR3變異體，吾人更詳細分析最常見突變體FGFR3s249c 。使用游離硫氫基阻斷劑DTNB之實驗指示在FGFR3s249c 單體與二聚狀態之間存在動態平衡。已報導在NMDA受體之氧化狀態與還原狀態之間存在由內源氧化還原調控子調節之類似平衡(46)。將表現FGFR3s249c 之膀胱癌細胞與R3Mab一起培育致使降低受體二聚體之量且同時增加單體含量。此外，經純化之FGFR3s249c IgD2-D3片段在溶液中形成二聚體；當與R3Mab一起培育時，二聚體不斷消失，同時單體FGFR3s249c 積聚。聯繫結構分析，此等結果表明R3Mab捕捉單體FGFR3s249c 且阻礙其二聚。隨時間推移，R3Mab使平衡朝向單體狀態移動，阻斷組成性受體活性。此機制亦可能解釋R3Mab如何抑制FGFR3之其他半胱胺酸突變體。
此研究之另一重要研究結果為R3Mab在活體內針對t(4；14)+多發性骨髓瘤細胞株OPM2及KMS11之有效抗腫瘤活性。相比之下，R3Mab在培養物中對此等細胞之增殖或存活具有中度至極低之影響。OPM2及KMS11細胞表現相對高細胞表面含量之FGFR3(為RT112及UMUC-14膀胱癌細胞之5-6倍)。此等較高抗原密度可允許R3Mab支持具有FcγR之免疫效應細胞之有效募集及ADCC活化。實際上，在人類PBMC存在下，R3Mab介導OPM2及KMS11細胞而非RT112或UMUC-14膀胱癌細胞之細胞溶解。此外，不能結合FcγR的DANA突變型R3Mab形式在活體內對KMS11或OPM2生長無影響，但仍類似於R3Mab抑制RT112及UMUC-14腫瘤生長。總之，此等資料指示R3Mab具有雙重抗腫瘤活性機制：(a)對於表現較低表面含量之WT或突變型FGFR3之細胞，其阻斷配位體依賴性或組成性信號傳導；(b)對於表現相對高表面含量之FGFR3之細胞，其誘導ADCC。
吾人之結果亦引發一些新問題。首先，尚未知此研究中所測試之膀胱癌細胞株為何對R3Mab呈現可變之敏感性。靶向治療所常見之該種不同反應可能反映個別腫瘤之不同遺傳構成。實際上，Her2-陽性乳癌細胞對抗Her2抗體展示可變之敏感性(48)，各種癌細胞對抗EGFR抗體之反應亦如此(49)。在此上下文中，迫切需要開發具有WT及突變型FGFR3之膀胱癌的其他活體內模型以在動物體內評定對FGFR3分子之敏感性。此外，闡明預測性生物標記物可幫助鑑別可最佳受益於靶向FGFR3之治療的患者。其次，由於R3Mab在吾人所分析之模型中不誘導腫瘤消退，所以將來研究應探索R3Mab能否與已確立之治療劑相協同。
總之，吾人之研究結果暗示WT及突變型FGFR3兩者對於膀胱癌生長皆具有重要性，從而使此受體之活體內致癌性涉及範圍由血液科惡性病擴展至上皮惡性病。此外，吾人之結果表明在腫瘤中可用組合阻斷配位體結合、受體二聚及信號傳導以及藉由ADCC促進腫瘤細胞溶解之能力的全長抗體有效靶向WT及突變型FGFR3兩者。此等結果提供研究對與此受體相關之不同惡性病之基於抗體之靶向FGFR3之治療的有力理論基礎。
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雖然上文已出於清楚理解之目的藉助於說明及實例略為詳細地描述本發明，但不應將該等描述及實例視作限制本發明之範疇。
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圖1A、1B及1C：抗FGFR3抗體之重鏈及輕鏈HVR環序列。該等圖展示重鏈HVR序列H1、H2及H3，及輕鏈HVR序列L1、L2及L3。序列編號如下：純系184.6(HVR-H1為SEQ ID NO：1；HVR-H2為SEQ ID NO：2；HVR-H3為SEQ ID NO：3；HVR-L1為SEQ ID NO：4；HVR-L2為SEQ ID NO：5；HVR-L3為SEQ ID NO：6)；純系184.6.1(HVR-H1為SEQ ID NO：7；HVR-H2為SEQ ID NO：8；HVR-H3為SEQ ID NO：9；HVR-L1為SEQ IDNO:10；HVR-L2為SEQ ID NO:11；HVR-L3為SEQ ID NO:12)；純系184.6.58(HVR-H1為SEQ ID NO:13；HVR-H2為SEQ ID NO:14；HVR-H3為SEQ ID NO:15；HVR-L1為SEQ ID NO:16；HVR-L2為SEQ ID NO:17；HVR-L3為SEQ ID NO:18)；純系184.6.62(HVR-H1為SEQ ID NO:48；HVR-H2為SEQ ID NO:49；HVR-H3為SEQ ID NO:50；HVR-L1為SEQ ID NO:51；HVR-L2為SEQ ID NO:52；HVR-L3為SEQ ID NO:53)；純系184.6.21(HVR-H1為SEQ ID NO:54；HVR-H2為SEQ ID NO:55；HVR-H3為SEQ ID NO:56；HVR-L1為SEQ ID NO:57；HVR-L2為SEQ ID NO:58；HVR-L3為SEQ ID NO:59)；純系184.6.49(HVR-H1為SEQ ID NO:60；HVR-H2為SEQ ID NO:61；HVR-H3為SEQ ID NO:62；HVR-L1為SEQ ID NO:63；HVR-L2為SEQ ID NO:64；HVR-L3為SEQ ID NO:65)；純系184.6.51(HVR-H1為SEQ ID NO:66；HVR-H2為SEQ ID NO:67；HVR-H3為SEQ ID NO:68；HVR-L1為SEQ ID NO:69；HVR-L2為SEQ ID NO:70；HVR-L3為SEQ ID NO:71)；純系184.6.52(HVR-H1為SEQ ID NO:72；HVR-H2為SEQ ID NO:73；HVR-H3為SEQ ID NO:74；HVR-L1為SEQ ID NO:75；HVR-L2為SEQ ID NO:76；HVR-L3為SEQ ID NO:77)；純系184.6.92(HVR-H1為SEQ ID NO:78；HVR-H2為SEQ ID NO:79；HVR-H3為SEQ ID NO:80；HVR-L1為SEQ ID NO:81；HVR-L2為SEQ ID NO:82；HVR-L3為SEQ ID NO:83)；純系184.6.1.N54S(HVR-H1為SEQ ID NO:84；HVR-H2為SEQ ID NO:85；HVR-H3為SEQ ID NO:86；HVR-L1為SEQ ID NO:87；HVR-L2為SEQ ID NO:88；HVR-L3為SEQ ID NO:89)；純系184.6.1.N54G(HVR-H1為SEQ ID NO:90；HVR-H2為SEQ ID NO:91；HVR-H3為SEQ ID NO:92；HVR-L1為SEQ ID NO:93；HVR-L2為SEQ ID NO:94；HVR-L3為SEQ ID NO:95)；純系184.6.1.N54A(HVR-H1為SEQ ID NO:96；HVR-H2為SEQ ID NO:97；HVR-H3為SEQ ID NO:98；HVR-L1為SEQ ID NO:99；HVR-L2為SEQ ID NO:100；HVR-L3為SEQ ID NO:101)；純系184.6.1.N54Q(HVR-H1為SEQ ID NO:102；HVR-H2為SEQ ID NO:103；HVR-H3為SEQ ID NO:104；HVR-L1為SEQ ID NO:105；HVR-L2為SEQ ID NO:106；HVR-L3為SEQ ID NO:107)；純系184.6.58.N54S(HVR-H1為SEQ ID NO:108；HVR-H2為SEQ ID NO:109；HVR-H3為SEQ ID NO:110；HVR-L1為SEQ ID NO:111；HVR-L2為SEQ ID NO:112；HVR-L3為SEQ ID NO:113)；純系184.6.58.N54G(HVR-H1為SEQ ID NO:114；HVR-H2為SEQ ID NO:115；HVR-H3為SEQ ID NO:116；HVR-L1為SEQ ID NO:117；HVR-L2為SEQ ID NO:118；HVR-L3為SEQ ID NO:119)；純系184.6.58.N54A(HVR-H1為SEQ ID NO:120；HVR-H2為SEQ ID NO:121；HVR-H3為SEQ ID NO:122；HVR-L1為SEQ ID NO:123；HVR-L2為SEQ ID NO:124；HVR-L3為SEQ ID NO:125)；純系184.6.58.N54Q(HVR-H1為SEQ ID NO:126；HVR-H2為SEQ ID NO:127；HVR-H3為SEQ ID NO:128；HVR-L1為SEQ ID NO:129；HVR-L2為SEQ ID NO:130；HVR-L3為SEQ ID NO:131)；純系184.6.1.NSD30E(HVR-H1為SEQ ID NO:143；HVR-H2為SEQ ID NO:144；HVR-H3為SEQ ID NO:145；HVR-L1為SEQ ID NO:140；HVR-L2為SEQ ID NO:141；HVR-L3為SEQ ID NO:142)。
根據如下文所述之Kabat編號系統對胺基酸位置進行編號。
圖2A及2B：描繪(A)抗FGFR3抗體184.6.1.N54S、184.6.58及184.6.62之重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列；及(B)抗FGFR3抗體1G6、6G1及15B2之高變區。
圖3A、3B及4：描繪具有如下序列識別符之用於實踐本發明之例示性受體人類共同構架序列：
可變重鏈(VH)共同構架(圖3A、3B) 扣除Kabat CDR之人類VH子群I共同構架(SEQ ID NO:19及203-205)扣除擴展高變區之人類VH子群I共同構架(SEQ ID NO:20及206-208、21及209-211、22及212-214)扣除Kabat CDR之人類VH子群II共同構架(SEQ ID NO:23及215-217)扣除擴展高變區之人類VH子群II共同構架(SEQ ID NO:24及218-220、25及221-223、26及224-226)扣除擴展之人類VH子群II共同構架扣除Kabat CDR之人類VH子群III共同構架(SEQ ID NO:27及227-229)扣除擴展高變區之人類VH子群III共同構架(SEQ ID NO:28及230-232、29及233-235、30及236-238)扣除Kabat CDR之人類VH受體構架(SEQ ID NO:31及239-241)扣除擴展高變區之人類VH受體構架(SEQ ID NO:32及242-244、33及2245-247)扣除Kabat CDR之人類VH受體2構架(SEQ ID NO:34及248-250)扣除擴展高變區之人類VH受體2構架(SEQ ID NO:35及251-253、36及254-256、37及257-259)
可變輕鏈(VL)共同構架(圖4) 人類VLκ子群I共同構架(SEQ ID NO:38及260-262)人類VLκ子群II共同構架(SEQ ID NO:39及263-265)人類VLκ子群III共同構架(SEQ ID NO:40及266-268)人類VLκ子群IV共同構架(SEQ ID NO:41及269-271)
圖5：描繪huMAb4D5-8輕鏈之構架區序列(SEQ ID NO:42-45)及huMAb4D5-8重鏈之構架區序列(SEQ ID NO:46、47、175、176)。上標/粗體之數字指示根據Kabat之胺基酸位置。
圖6：描繪huMAb4D5-8輕鏈之經修飾/變異型構架區序列(SEQ ID NO:42、43、177、45)及huMAb4D5-8重鏈之經修飾/變異型構架區序列(SEQ ID NO:46、47、178及176)。上標/粗體之數字指示根據Kabat之胺基酸位置。
圖7：在膀胱癌細胞RT112中敲除FGFR3可在活體外抑制增殖且誘導G1細胞週期停滯，且在活體內抑制腫瘤生長。將3種不同FGFR3 shRNA選殖至Tet誘導性表現載體中。用嘌呤黴素(puromycin)選擇確立穩定表現FGFR3 shRNA或對照shRNA之RT112細胞。(A)展示使用或未使用多西環素(doxycycline，Dox，0、0.1及1 μg/ml，自左至右)處理之所選純系中之FGFR3表現的代表性墨點。(B)RT112穩定細胞對[3 H]-胸苷之併入。在與[3 H]-胸苷(每孔1 μCi)一起培育16小時之前，在存在或不存在1 μg/ml多西環素下培養RT112穩定純系3天。相對於在無多西環素誘導下細胞所併入之[3 H]-胸苷之計數校正所併入之[3 H]-胸苷之計數。誤差槓表示SEM。(C)RT112穩定細胞之DNA螢光流動式細胞量測直方圖。在存在或不存在1 μg/ml多西環素下培養表現對照shRNA或FGFR3 shRNA4之RT112純系72小時，且用碘化丙錠(PI)對核進行染色。對於FGFR3 shRNA2及FGFR3 shRNA6獲得類似結果(圖16)。(D)在小鼠體內表現對照shRNA之RT112細胞(每個處理組n=9)或表現FGFR3 shRNA4之RT112細胞(每個處理組n=11)之生長。給與小鼠單獨5%蔗糖或補充有1 mg/ml多西環素之5%蔗糖，且每週兩次量測腫瘤尺寸。誤差槓表示SEM。對於FGFR3 shRNA2及FGFR3 shRNA6獲得類似結果(圖16)。下部圖示：自對照shRNA或FGFR3 shRNA4穩定細胞異種移植組織提取之腫瘤溶胞物中FGFR3蛋白之表現。
圖8：R3Mab阻斷FGF/FGFR3相互作用。(A)R3Mab與人類FGFR3之選擇性結合。固定人類FGFR1-4 Fc嵌合蛋白且將其與遞增量之R3Mab一起培育。使用抗人類Fab抗體偵測特異性結合。(B-C)R3Mab阻斷FGF1結合至人類FGFR3-IIIb(B)或FGFR3-IIIc(C)。藉由使用經結合生物素之FGF1特異性多株抗體偵測特異性結合。(D-E)R3Mab阻斷FGF9結合至人類FGFR3-IIIb(D)或FGFR3-IIIc(E)。藉由使用經結合生物素之FGF9特異性多株抗體偵測特異性結合。誤差槓表示平均標準誤(SEM)且有時小於記號。
圖9：R3Mab抑制由野生型及突變型FGFR3驅使之Ba/F3細胞增殖。(A)R3Mab對表現野生型人類FGFR3-IIIb之Ba/F3細胞活力之抑制作用。在不存在FGF1(無FGF1)，或在單獨10 ng/ml FGF1加上10 μg/ml肝素(FGF1)或與對照抗體(對照物)或R3Mab之組合存在下，在培養基中培養細胞。在與抗體一起培育72小時後用CellTiter-Glo(Promega)評定細胞活力。(B)R3Mab抑制Ba/F3-FGFR3-IIIbWT 穩定細胞中FGFR3及MAPK磷酸化。將細胞與對照抗體(Ctrl)、含遞減量之R3Mab(分別為1、0.2、0.04 μg/ml)之PBS或單獨PBS(空白對照物)一起預培育3小時，之後用15 ng/ml FGFl及10 μg/ml肝素(+)或單獨肝素(-)處理細胞10分鐘。對溶胞物進行免疫墨點分析以分別評定在抗體存在下FGFR3及p44/42 MAPK向pFGFRY653/654 及pMAPKThr202/Tyr204 之磷酸化。(C)基於公開資料(32)膀胱癌中FGFR3突變熱點及出現率之示意性圖示(所述之序列編號係基於FGFR3IIIb同功異型物胺基酸序列)。TM為跨膜結構域；TK1及TK2為酪胺酸激酶結構域1及2。(D-H)R3Mab對表現癌症相關之FGFR3突變體之Ba/F3細胞活力的抑制作用。G372C係源自IIIc同功異型物，而其他係源自IIIb同功異型物。用於所有突變體之序列編號係基於FGFR3 IIIb同功異型物胺基酸序列(包括G372C突變體，其應基於FGFR3 IIIc同功異型物胺基酸序列編號為G370C)。如(A)中所述與抗體一起培育72小時後評定細胞活力。誤差槓表示SEM。
圖10：R3Mab之抗原決定基定位及R3Mab Fab片段與人類FGFR3-IIIb之IgD2-D3之間之複合物的晶體結構。(A)藉由13個跨越人類FGFR3之IgD2-D3之肽與R3Mab之結合所測定之抗原決定基。將各經結合生物素之肽捕捉於塗有抗生蛋白鏈菌素之微量滴定孔上且與R3Mab一起培育。使用山羊抗人類IgG抗體偵測特異性結合之R3Mab。(B)人類FGFR3肽3(LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO:179))及11(SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO:180))與人類FGFR1之細胞外片段(肽3：HAVPAAKTVKFKCPS(SEQ ID NO:181)；肽11：SNVEFMCKVYSDPQP(SEQ ID NO:182))之序列比對。參與主要FGF2-FGFR1相互作用、肝素結合及受體-受體締合之FGFR1殘基係分別以粗體、斜體及加下劃線字體展示。FGFR1殘基之功能分配係基於Plotnikov等人(34)。(C)R3Mab Fab(展示為條帶-螺旋線，輕鏈為灰色，重鏈為黑色)與人類FGFR3 IgD2-D3(展示為分子表面，白色)之複合物之結構。基於Plotnikov等人(34)，涉及配位體結合及二聚之受體殘基分別為灰色/陰影線及深灰色。(D)晶體結構之特寫展示Fab之CDR-H3及CDR-H2構成與FGFR3之IgD2及IgD3之主要相互作用位點。(E)FGFR3-IIIc-FGF1複合物(PDB編號：1RY7)與FGFR3-IIIb-Fab複合物重合。FGFR3-IIIc及FGF1分別為灰色及深灰色。FGFR3-IIIb係展示為白色而Fab之輕鏈係展示為淡灰色，重鏈係展示為深灰色。IgD2係用作用於重合之錨。注意到兩個結構之IgD2完全重合且當FGFR3-IIIb與R3Mab結合時FGFR3-IIIb之IgD3採用新構形。(F)FGFR3-IIIc-FGF1複合物(PDB編號：1RY7)與FGFR3-IIIb-Fab複合物重合之另一圖示。FGFR3-IIIc及FGF1係分別展示為灰色/網格紋理之分子表面及深灰色/斑點紋理之分子表面。FGFR3-IIIb係展示為白色而Fab之輕鏈係展示為灰色，重鏈係展示為黑色。IgD2係用作用於重合之錨。注意到兩個結構之IgD2完全重合且當FGFR3-IIIb與R3Mab結合時FGFR3-IIIb之IgD3採用新構形。
圖11：R3Mab抑制表現野生型或突變型FGFR3S249C 之膀胱癌細胞之增殖、純系生長及FGFR3信號傳導。(A)R3Mab抑制膀胱癌細胞株RT112對[3 H]-胸苷之併入。誤差槓表示SEM。(B)與單獨處理介質(空白對照物)或對照抗體(Ctrl)相比，R3Mab(15 μg/ml)阻斷膀胱癌細胞株RT112中經FGF1活化之FGFR3信號傳導。用抗FGFR3抗體使細胞溶胞物免疫沈澱且用抗磷酸化酪胺酸抗體(4G10)評定FGFR3磷酸化。對溶胞物進行免疫墨點分析以偵測AKT(pAKTS473 )及p44/42 MAPK(pMAPKThr202/Tyr204 )之磷酸化。(C)與單獨處理介質(空白對照物)或對照抗體(Ctrl)相比，R3Mab(10 μg/ml)抑制膀胱癌細胞株UMUC-14(具有FGFR3S249C )之純系生長。(D)對(C)中之研究的定量，其報導來自重複12個孔之每孔中直徑大於120 μm之群落數目。誤差槓表示SEM。相對於空白對照物或Ctrl，P ＜3.4×10-9 。(E)R3Mab(15 μg/ml)抑制UMUC-14細胞中之FGFR3磷酸化。如(B)中分析FGFR3磷酸化。注意到FGFR3在此細胞株中組成性磷酸化。
圖12：R3Mab藉由驅使二聚體-單體平衡朝向單體狀態來減少二硫鍵連接之FGFR3S249C 二聚體的穩態程度。(A)R3Mab對UMUC-14細胞中之FGFR3S249C 二聚體的影響。將細胞與R3Mab(15 μg/ml)或對照抗體(Ctrl)一起培育3小時，且在非還原及還原條件下藉由免疫墨點分析來分析整個細胞溶胞物。(B)游離硫氫基阻斷劑DTNB對UMUC-14細胞中之FGFR3S249C 二聚體-單體平衡的影響。用遞增濃度之DTNB處理UMUC-14細胞3小時，且如(A)中分析細胞溶胞物。(C)R3Mab在活體外對純化之重組FGFR3S249C 二聚體的影響。經由尺寸排阻管柱純化由IgD2-D3構成之FGFR3S249C 二聚體，且在37℃下將其與PBS(空白對照物)、對照抗體(Ctrl)或R3Mab一起培育。在所指示之時間收集樣品以供在非還原條件下進行免疫墨點分析。使用抗FGFR3融合瘤抗體6G1偵測FGFR3二聚體-單體(A-C)。
圖13：R3Mab抑制膀胱癌細胞之異種移植物生長及Ba/F3-FGFR3S249C 之同種異體移植物生長。(A)R3Mab相較於媒劑對照物對預先形成之RT112膀胱癌異種移植物生長之影響。每組n=10。(B)R3Mab抑制RT112腫瘤組織中之FGFR3信號傳導。在單獨實驗中，收集經15 mg/kg對照抗體(Ctrl)或R3Mab處理48小時或72小時之RT112異種移植腫瘤(每組n=3)，使其均質化且藉由免疫墨點分析來分析FRS2α及MAPK活化。(C)R3Mab對預先形成之Ba/F3-FGFR3S249C 同種異體移植物生長之影響。每組n=10。(D)R3Mab對預先形成之UMUC-14膀胱癌異種移植物生長之影響，每組n=10。(E)R3Mab對UMUC-14腫瘤組織中FGFR3S249C 二聚體及信號傳導之影響。收集經30 mg/kg對照抗體(Ctrl)或R3Mab處理24小時或72小時之UMUC-14異種移植腫瘤(每組n=3)，使其均質化，且藉由免疫墨點分析來分析FGFR3S249C 二聚體-單體以及MAPK活化。使用抗FGFR3家兔多株抗體sc9007偵測FGFR3二聚體-單體以避免受腫瘤溶胞物中之小鼠IgG干擾。誤差槓表示SEM。
圖14：ADCC有助於R3Mab對t(4;14)陽性多發性骨髓瘤模型之抗腫瘤功效。(A-B)R3Mab對預先形成之OPM2(A)及KMS11(B)骨髓瘤異種移植物生長之影響。每組n=10。(C-F)在細胞培養物中，R3Mab誘導骨髓瘤細胞株OPM2(C)及KMS11(D)或膀胱癌細胞株RT112(E)及UMUC-14(F)之細胞溶解。將骨髓瘤或膀胱癌細胞與新鮮分離之人類PBMC在R3Mab或對照抗體存在下一起培育。藉由量測上清液中所釋放之LDH測定細胞毒性。(G-H)R3Mab或其DANA突變體對預先形成之OPM2(G)及KMS11(H)骨髓瘤異種移植物生長的影響。每組n=10。誤差槓表示SEM且有時小於記號。
圖15：用siRNA敲除FGFR3會抑制膀胱癌細胞株之細胞增殖。在Genentech中設計及合成6至7種不同FGFR3 siRNA及3種非特異性對照siRNA。將膀胱癌細胞株RT112(A)、SW780(B)、RT4(C)及UMUC-14(D)接種於96孔板中(每孔3000個細胞)且允許附接隔夜，且用siRNA與RNAiMax(Invitrogen)之複合物短暫轉染。轉染後第72小時，將[3 H]-胸苷(每孔1 μCi)添加至培養物中(A、C及D)，再培育16小時。用TopCount定量所併入之[3 H]-胸苷。相對於經單獨RNAiMax轉染之細胞(空白對照物)的數據校正數據。誤差槓表示SEM。下部圖示：展示經siRNA轉染之細胞中之FGFR3表現的代表性墨點。(B)在轉染後第96小時用CellTiter-Glo(Promega)量測細胞活力。誤差槓表示SEM。
圖16：在膀胱癌細胞株RT112中敲除FGFR3活體外誘導G1細胞週期停滯，且活體內抑制腫瘤生長。設計3種不同FGFR3 RNA且將其選殖至Tet誘導性shRNA表現反轉錄病毒載體中。用嘌呤黴素選擇確立表現FGFR3 shRNA或對照shRNA之RT112穩定純系。(A)在使用或未使用1 μg/ml多西環素處理72小時後經碘化丙錠(PI)染色之自表現FGFR3 shRNA2或shRNA6之RT112穩定細胞獲得之核的DNA螢光流動式細胞量測直方圖。(B)表現FGFR3 shRNA2-4(每個處理組n=11)或FGFR3 shRNA6-16(每個處理組n=10)之RT112穩定細胞在nu/nu小鼠體內之生長。負載腫瘤小鼠接受單獨5%蔗糖(實心圓形)或5%蔗糖加上1 mg/ml多西環素(實心正方形)，且每週兩次用測徑規量測腫瘤。誤差槓表示SEM。
圖17：抗FGFR3融合瘤抗體16G、6G1及15B2對由野生型及突變型FGFR3驅使之Ba/F3細胞增殖的影響。藉由用人類FGFR3-IIIb/Fc或人類FGFR3-IIIc/Fc嵌合體使BALB/c小鼠免疫產生抗FGFR3融合瘤抗體。在來自ClonaCell融合瘤選擇套組(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，BC，Canada)之培養基D中使用次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷選擇來選擇融合之融合瘤細胞。藉由ELISA針對結合至FGFR3-IIIb及FGFR3-IIIc之能力且藉由FACS針對識別細胞表面FGFR3之能力連續篩選融合瘤抗體。接著藉由限制稀釋法選殖所選之融合瘤。16G、6G1及15B2為用以評定類似於圖9A中所述之對表現野生型或變異型FGFR3之Ba/F3細胞增殖之作用的純系。誤差槓表示SEM。
圖18：對藉由肽圖分析(peptide mapping)與藉由晶體結構分析所測定之R3Mab抗原決定基的比較。(A)由R3MabFab片段與人類FGFR3之細胞外IgD2-D3區段之複合物之結構所揭示之抗原決定基。Fab重鏈及輕鏈接觸之FGFR3殘基分別為黑色及灰色。(B)肽3及11在FGFR3上之位置。
圖19：R3Mab抑制含有野生型或突變型FGFR3S249C 之膀胱癌細胞之增殖及FGFR3信號傳導。(A)R3Mab抑制膀胱癌細胞株RT4之細胞活力。在與抗體一起培育96小時後用CellTiter-Glo(Promega)評定細胞活力。誤差槓表示SEM。(B)R3Mab(15 μg/ml)阻斷膀胱癌細胞株RT4中經FGF1活化之FGFR3信號傳導。(C)R3Mab抑制膀胱癌細胞株RCC-97-7(含有FGFR3S249C )對[3 H]-胸苷之併入。誤差槓表示SEM。(D)R3Mab(15 μg/ml)抑制TCC-97-7細胞中之FGFR3磷酸化。(E)相較對照抗體(Ctrl)，在與R3Mab(15 μg/ml)一起培育3小時後，TCC-97-7細胞中之FGFR3S249C 二聚體減少。
圖20：內飲作用抑制劑對UMUC-14細胞中R3Mab及FGFR3S249C 二聚體之內化的影響。(A)內飲作用抑制劑對R3Mab內化之影響。將UMUC-14細胞在37℃下用各種內飲作用抑制劑或DMSO預處理1小時，在37℃下與R3Mab(15 μg/ml)一起培育3小時以允許內化。使用低pH值洗滌移除細胞表面R3Mab以觀測內化抗體。固定細胞且用經Alexa 488標記之抗人類IgG染色。使用共焦顯微術獲得影像。
(B)內飲作用抑制劑對經R3Mab處理之UMUC-14細胞中之FGFR3S249C 二聚體的影響。將UMUC-14細胞在37℃下用各種內飲作用抑制劑或DMSO預處理1小時，在37℃下與空白對照物(泳道1)、對照抗體(泳道2)或R3Mab(15 μg/ml，泳道3)一起培育3小時。在非還原或還原條件下藉由免疫墨點分析來分析細胞溶胞物之FGFR3蛋白。注意到氯丙嗪(chlorpromazine，網格蛋白介導之內飲作用的抑制劑)及染料木素(genistein，內飲作用泛抑制劑(pan-inhibitor))阻斷R3Mab內化，但對R3Mab誘導之FGFR3S249C 二聚體減少無影響。
圖21：不同抗FGFR3抗體在非還原條件下針對單體及二聚FGFR3S249C 之偵測靈敏度。在用R3Mab(泳道1)、對照IgG1(泳道2)或PBS(泳道3)處理3小時後溶解UMUC-14細胞，且在還原或非還原條件下對細胞溶胞物進行免疫墨點分析。注意到6G1(在Genentech產生之鼠類融合瘤抗體)偵測FGFR3S249C 二聚體及單體兩者，而sc9007(家兔多株抗體，Santa Cruz Biotechnology)或sc13121(鼠類融合瘤抗體，Santa Cruz Biotechnology)優先偵測二聚FGFR3S249C 。
圖22：R3Mab對t(4;14)+多發性骨髓瘤細胞增殖之影響。(A)R3Mab對UTMC-2細胞併入[3 H]-胸苷之抑制作用。使UTMC-2細胞在25 ng/ml FGF9及5 μg/ml肝素或單獨肝素(無FGF9)存在下於含有R3Mab或對照抗體之培養基中生長。培育6天後，添加[3 H]-胸苷培育16小時。相對於在無FGF9及抗體存在下生長之細胞的數據校正數據。(B-C)R3Mab對OPM2(B)及KMS11(C)細胞併入[3 H]-胸苷之影響。用R3Mab或對照抗體處理於1.5% FBS培養基中生長之細胞6天。相對於未經處理之細胞的數據校正數據。誤差槓表示SEM。
圖23：骨髓瘤及膀胱癌細胞中FGFR3之細胞表面表現含量。(A)藉由FACS分析所評定之骨髓瘤細胞及膀胱癌細胞中之細胞表面FGFR3表現。用結合藻紅素之針對人類FGFR3之小鼠mAb(FAB766P，R&D Systems)或結合藻紅素之同型對照小鼠IgG1(BD Pharmingen)對細胞染色。(B)對骨髓瘤細胞及膀胱癌細胞中之FGFR3密度的史卡查分析(Scatchard analysis)。對R3Mab進行放射性碘標記且將其與細胞一起於含有過量未經標記之抗體的懸浮液中培育。在室溫下培育2小時後，藉由離心使細胞形成離心塊且洗滌兩次。測定特異性結合之125 I。受體密度及結合親和力(Kd)表示2次結合實驗之平均值。
圖24：R3Mab或其DANA突變體對膀胱癌細胞之異種移植物生長的影響。(A)R3Mab及其DANA突變體(各50 mg/kg)對預先形成之RT112腫瘤生長之影響。(B)R3Mab及其DANA突變體(各50 mg/kg)對預先形成之UMUC-14腫瘤生長的影響。誤差槓表示SEM。
(無元件符號說明)

Claims (20)

  1. 一種抗FGFR3拮抗劑抗體，其包含：(i)HVR-L1包含胺基酸序列RASQDVDTSLA(SEQ ID NO：87)，(ii)HVR-L2包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：88)，(iii)HVR-L3包含胺基酸序列QQSTGHPQT(SEQ ID NO：89)，(iv)HVR-H1包含胺基酸序列GFTFTSTGIS(SEQ ID NO：84)，(v)HVR-H2包含胺基酸序列GRIYPTSGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：85)；及(vi)HVR-H3包含胺基酸序列ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQ ID NO：86)。
  2. 如請求項1之抗FGFR3拮抗劑抗體，其中該抗體包括包含SEQ ID NO：132之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：133之輕鏈可變區。
  3. 如請求項1或2之抗FGFR3拮抗劑抗體，其中該抗體包括一或多個以下特性：(a)以1×10-8 M或更強之Kd結合人類FGFR3；(b)結合包含胺基酸序列LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO：179)及/或SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO：180)的多肽； (c)抑制FGFR3受體二聚化，藉以抑制該受體活化；且(d)抑制(1)FGFR3-IIIbR248C ，及(2)FGFR3-IIIbK652E 、FGFR3-IIIbY375C 、FGFR3-IIIbS249C 及FGFR3-IIIbG372C 中之一或多者。
  4. 如請求項1或2之抗FGFR3拮抗劑抗體，其中該抗體包括一或多個以下特性：(a)具有抗體依賴性細胞介導之細胞毒性活性；(b)不誘導實質的FGFR3下調(down-regulation)；(c)該抗體之二價形式不具有實質促效劑(agonist)功能；(d)結合FGFR3 IIIb之殘基154、155、158、159、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、177、202、205、207、210、212、214、216、217、241、246、247、248、278、279、280、281、282、283、314、315、316、317及/或318中之一或多者；(e)抑制組成性(constitutive)配位體依賴性FGFR3活性；及(f)抑制組成性非配位體依賴性FGFR3活性。
  5. 如請求項1或2之抗FGFR3拮抗劑抗體，其中該抗體包含構架序列，且其中該構架序列之至少一部分為人類共同構架序列。
  6. 如請求項5之抗FGFR3拮抗劑抗體，其中該抗體包含人類κ子群共同構架序列及/或重鏈人類子群III共同構架序 列。
  7. 如請求項1或2之抗FGFR3拮抗劑抗體，其中該抗體包含Fc區，其中該Fc區包含一或多個胺基酸殘基之改變，使得效應功能減弱。
  8. 如請求項7之抗FGFR3拮抗劑抗體，其中該抗體為IgG1類且包含突變D265A/N297A(根據EU索引編號)。
  9. 如請求項1或2之抗FGFR3拮抗劑抗體，其中該抗體係選自由以下組成之群：單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、親和性成熟抗體(affinity matured antibody)、人類抗體、雙特異性抗體及抗體片段。
  10. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至9中任一項之抗體。
  11. 一種載體，其包含如請求項10之聚核苷酸。
  12. 一種活體外宿主細胞，其包含如請求項11之載體。
  13. 一種製備抗FGFR3抗體之方法，該方法包含培養包含編碼如請求項1至9中任一項之抗體之聚核苷酸的宿主細胞以表現該聚核苷酸，及視需要自該培養物中回收該抗體。
  14. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至9中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  15. 一種如請求項1至9中任一項之抗FGFR3拮抗劑抗體之用途，其係用於製備抑制細胞增殖及/或消除(depleting)癌細胞之藥劑。
  16. 一種如請求項1至9中任一項之抗FGFR3拮抗劑抗體之用途，其係用於製備治療癌症之藥劑。
  17. 如請求項16之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：實體腫瘤、多發性骨髓瘤、膀胱癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、頭頸部癌症、肝癌、乳癌、胃癌、移行細胞癌及結腸直腸癌。
  18. 一種如請求項16之用途，其中該癌症與FGFR3活化及/或過度表現有關。
  19. 一種如請求項1至9中任一項之抗FGFR3拮抗劑抗體之用途，其係用於製備治療或預防骨骼病症之藥劑。
  20. 如請求項19之用途，其中該骨骼病症係選自由以下組成之群：軟骨發育不全、軟骨生成減退、侏儒症、致死性骨發育不全(thantophoric dysplasia)及顱骨聯合症候群。
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