JP5378202B2 - 脳・神経に特異的あるいは神経分化に特異的なバイオマーカー - Google Patents

脳・神経に特異的あるいは神経分化に特異的なバイオマーカー Download PDF

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Description

本発明は、脳・神経に特異的あるいは神経分化に特異的なバイオマーカーとして使用され得る、ポリペプチド及びその部分ペプチド、並びにポリヌクレオチド及びその部分ヌクレオチド；発現ベクター；形質転換体；アンチセンス分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、抗体、及びそれらを含む組成物；哺乳動物細胞又は非ヒト哺乳動物；脳・神経に特異的あるいは神経分化に特異的なバイオマーカーの測定用手段（例、プライマーセット、核酸プローブ、抗体、アプタマー）及び測定方法などを提供する。
ヒトゲノム研究の進展により、ヒトの染色体配列の解析は大幅に進んだが、それによりヒト遺伝子機能の全てが明らかになったわけではない。ヒトでは、遺伝子の多様性がその遺伝子の機能の変化に大きく関連している。実際、ヒトでは、染色体の特定領域から複数のｍＲＮＡが転写され、異なるバリアントを生じることが知られている。
脳・神経に特異的あるいは神経分化に特異的なバイオマーカーとして使用され得る、本発明者らにより今回見出された一連の遺伝子（必要に応じて「脳・神経特異的遺伝子」又は「脳・神経特異的遺伝子１〜１０」と省略）については、既知バリアントが報告されている。例えば、このような既知バリアントとして、脳・神経特異的遺伝子１（Genbankアクセッション番号：NM_133460.1；非特許文献１、２）、脳・神経特異的遺伝子２（Genbankアクセッション番号：NM_005163.1；非特許文献３、４）、脳・神経特異的遺伝子３（Genbankアクセッション番号：NM_181784.1；非特許文献５、６）、脳・神経特異的遺伝子４（Genbankアクセッション番号：NM_003930.3；非特許文献７、８）、脳・神経特異的遺伝子５（Genbankアクセッション番号：NM_000898.3；非特許文献９、１０）、脳・神経特異的遺伝子６（Genbankアクセッション番号：NM_005079.1；非特許文献１１、１２）、脳・神経特異的遺伝子７（Genbankアクセッション番号：NM_001679.2；非特許文献１３、１４）、脳・神経特異的遺伝子８（Genbankアクセッション番号：NM_000431.1；非特許文献１５、１６）、脳・神経特異的遺伝子９（Genbankアクセッション番号：NM_153449.2；非特許文献１７）、脳・神経特異的遺伝子１０（Genbankアクセッション番号：NM_015009.1；非特許文献１８、１９）の既知バリアントが報告されている。
しかしながら、脳・神経特異的遺伝子１〜１０が脳・神経に特異的あるいは神経細胞分化に特異的なバイオマーカーとして有用であり得ること、並びに脳・神経特異的遺伝子１〜１０について、本発明者らにより見出された特定のバリアントが存在することは知られていない。
Ota,T. et al., Nat. Genet. 36 (1), 40-45 (2004) Strausberg, R.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002) Staal, S.P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (14), 5034-5037 (1987) Staal, S.P. et al., Genomics 2 (1), 96-98 (1988) Wakioka, T. et al., Nature 412 (6847), 647-651 (2001) Kato, R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 302 (4), 767-772 (2003) Marie-Cardine, A. et al., FEBS Lett. 435 (1), 55-60 (1998) Kouroku, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 252 (3), 738-742 (1998) Kochersperger, L.M. et al., J. Neurosci. Res. 16 (4), 601-616 (1986) Bach, A.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (13), 4934-4938 (1988) Chen, S.L. et al., Oncogene 12 (4), 741-751 (1996) Byrne, J.A. et al., Genomics 35 (3), 523-532 (1996) Lingrel, J.B. et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 38, 37-89 (1990) Malik, N. et al., J. Biol. Chem. 271 (37), 22754-22758 (1996) Kopito, R.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77 (10), 5738-5740 (1980) Schafer, B.L. et al., J. Biol. Chem. 267 (19), 13229-13238 (1992) Wu, X. et al., Genomics 80 (6), 553-557 (2002) Bach, I. et al., Nat. Genet. 22 (4), 394-399 (1999) Katoh, M. et al., Int. J. Mol. Med. 13 (4), 607-613 (2004)
脳・神経細胞に特異的あるいは神経細胞分化に特異的なバイオマーカーの解析は、例えば、神経細胞の同定又は神経細胞の分化状態の判定用試薬、神経細胞の障害に基づく疾患に対する診断用試薬、及び新たな作用機序を有する、神経細胞の障害に基づく疾患に対する医薬等の開発につながる。本発明は、所定の遺伝子の発現プロファイル解析により得られた知見に基づき、このような試薬及び医薬等を提供すること、並びにこのような試薬及び医薬等の開発に有用な手段を提供することなどを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討した結果、脳・神経に特異的あるいは神経細胞分化に特異的なバイオマーカーとして、脳・神経特異的遺伝子１〜１０を見出した。本発明者らはまた、脳・神経に特異的あるいは神経細胞分化に特異的なバイオマーカーとして使用され得る、脳・神経特異的遺伝子１〜１０の新規バリアントを見出した。従って、脳・神経特異的遺伝子１〜１０及び／又はその新規バリアントを利用することにより、神経細胞の同定、神経細胞の分化状態の判定、神経細胞の障害に基づく疾患に対する診断等が可能になると考えられる。特に、脳・神経特異的遺伝子１〜１０及び／又はその新規バリアントは神経細胞の特定の分化段階で特異的に発現していることから、このような特定の分化段階にある神経細胞の判定精度を高めることができる。また、脳・神経特異的遺伝子１〜１０及び／又はその新規バリアントを利用することにより、神経細胞の障害に基づく疾患等の所定の疾患に対する新規医薬等の開発も可能になると考えられる。
以上の知見に基づき、本発明者らは本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の発明などに関する：
〔１〕以下１）〜１０）のいずれかのポリペプチド又はその特異的な部分ペプチド：
１）配列番号１８若しくは配列番号１０で表されるアミノ酸配列、又はそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
２）配列番号４３で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
３）配列番号５８で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
４）配列番号７４で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
５）配列番号８９若しくは配列番号９９で表されるアミノ酸配列、又はそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
６）配列番号１１８で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
７）配列番号１３３で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
８）配列番号１５２若しくは配列番号１５９で表されるアミノ酸配列、又はそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
９）配列番号１８４若しくは配列番号１９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；あるいは
１０）配列番号２０７、配列番号２１３、配列番号２１９、配列番号２２５、配列番号２３１若しくは配列番号２３６で表されるアミノ酸配列、又はそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
〔２〕該ポリペプチドが以下１）〜１０）のいずれかのポリペプチドである、上記〔１〕のポリペプチド又はその特異的な部分ペプチド：
１）配列番号１８若しくは配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
２）配列番号４３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
３）配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
４）配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
５）配列番号８９若しくは配列番号９９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
６）配列番号１１８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
７）配列番号１３３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
８）配列番号１５２若しくは配列番号１５９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
９）配列番号１８４若しくは配列番号１９０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
１０）配列番号２０７、配列番号２１３、配列番号２１９、配列番号２２５、配列番号２３１若しくは配列番号２３６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
〔３〕異種アミノ酸配列からなるポリペプチドと融合している、上記〔１〕又は〔２〕のポリペプチド又はその特異的な部分ペプチド。
〔４〕以下１）〜１０）のいずれかの部分ペプチドである、脳・神経特異的遺伝子１〜１０によりコードされるポリペプチドに特異的な部分ペプチド：
１）配列番号１２、配列番号１５、配列番号２０若しくは配列番号２２で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
２）配列番号２６４で表されるアミノ酸配列、又はその部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
３）配列番号６０で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド；
４）配列番号２６５で表されるアミノ酸配列、又はその部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
５）配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、若しくは配列番号２６６で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
６）配列番号１２０で表されるアミノ酸配列、又はその部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
７）配列番号１３５、配列番号１３８若しくは配列番号１３９で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
８）配列番号１５６、配列番号１６１若しくは配列番号１６３で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
９）配列番号１８６若しくは配列番号１９２で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；あるいは
１０）配列番号２０９、配列番号２１５、配列番号２２１若しくは配列番号２２７で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド、あるいは配列番号２３８で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド。
〔５〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかのポリペプチド、又は上記〔１〕〜〔４〕のいずれかの特異的な部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔６〕以下１）〜１０）のいずれかのポリヌクレオチド又はその特異的な部分ヌクレオチド：
１）配列番号１６若しくは配列番号８で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
２）配列番号４１で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
３）配列番号５６で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
４）配列番号７２で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
５）配列番号８７若しくは配列番号９７で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
６）配列番号１１６で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
７）配列番号１３１で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
８）配列番号１５０若しくは配列番号１５７で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
９）配列番号１８２若しくは配列番号１８８で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；あるいは
１０）配列番号２０５、配列番号２１１、配列番号２１７、配列番号２２３、配列番号２２９若しくは配列番号２３４で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド。
〔７〕該１）〜１０）のいずれかのポリヌクレオチドが以下１）〜１０）のいずれかのポリヌクレオチドである、上記〔６〕のポリヌクレオチド又はその特異的な部分ヌクレオチド：
１）配列番号１６若しくは配列番号８で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
２）配列番号４１で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
３）配列番号５６で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
４）配列番号７２で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
５）配列番号８７若しくは配列番号９７で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
６）配列番号１１６で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
７）配列番号１３１で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
８）配列番号１５０若しくは配列番号１５７で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
９）配列番号１８２若しくは配列番号１８８で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；あるいは
１０）配列番号２０５、配列番号２１１、配列番号２１７、配列番号２２３、配列番号２２９若しくは配列番号２３４で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド。
〔８〕以下１）〜１０）のいずれかの部分ヌクレオチドである、脳・神経特異的遺伝子１〜１０によりコードされるポリヌクレオチドに特異的な部分ヌクレオチド：
１）配列番号１１、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３９若しくは配列番号４０で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
２）配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号５１若しくは配列番号５５で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
３）配列番号５９、配列番号６１、配列番号６４、配列番号６７若しくは配列番号７１で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
４）配列番号７５、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２若しくは配列番号８６で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
５）配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０４、配列番号１０７、配列番号１１０、配列番号１１４若しくは配列番号１１５で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
６）配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２６若しくは配列番号１３０で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
７）配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１４２、配列番号１４５若しくは配列番号１４９で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
８）配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６６、配列番号１７０、配列番号１７４、配列番号１８０若しくは配列番号１８１で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
９）配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９９、配列番号２０３若しくは配列番号２０４で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；あるいは
１０）配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４２、配列番号２４５、配列番号２４８、配列番号２５１、配列番号２５４、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２若しくは配列番号２６３で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド。
〔９〕上記〔５〕〜〔７〕のいずれかのポリヌクレオチド、又は上記〔６〕〜〔８〕のいずれかの特異的な部分ヌクレオチド、及びそれに機能可能に連結されたプロモーターを含む、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかのポリペプチド、又は上記〔１〕〜〔４〕のいずれかの特異的な部分ペプチドの発現ベクター。
〔１０〕上記〔９〕の発現ベクターが導入された形質転換体。
〔１１〕上記〔７〕又は〔８〕の特異的な部分ヌクレオチドの核酸配列に相補的な核酸配列を含み、かつ脳・神経特異的遺伝子１〜１０によりコードされるいずれかのポリペプチドの発現を抑制し得る、アンチセンス分子。
〔１２〕上記〔７〕又は〔８〕の特異的な部分ヌクレオチドの核酸配列からなるセンス鎖、及びそれに相補的な核酸配列からなるアンチセンス鎖から構成され、かつセンス鎖及びアンチセンス鎖の一方又は双方の５’末端及び／又は３’末端においてオーバーハングを有していてもよい、脳・神経特異的遺伝子１〜１０によりコードされるいずれかのポリペプチドの発現を抑制し得る、ＲＮＡｉ誘導性核酸。
〔１３〕ＲＮＡｉ誘導性核酸がｓｉＲＮＡである、上記〔１２〕のＲＮＡｉ誘導性核酸。
〔１４〕上記〔２〕〜〔４〕のいずれかの特異的な部分ペプチドに対応する領域を介して、脳・神経特異的遺伝子１〜１０によりコードされるいずれかのポリペプチドに結合し得る、アプタマー。
〔１５〕上記〔２〕〜〔４〕のいずれかの特異的な部分ペプチドに対応する領域を介して、脳・神経特異的遺伝子１〜１０によりコードされるいずれかのポリペプチドに結合し得る、抗体。
〔１６〕抗体が以下ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかである、上記〔１５〕の抗体：
ｉ）ポリクローナル抗体；
ｉｉ）モノクローナル抗体又はその一部；
ｉｉｉ）キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体。
〔１７〕上記〔１５〕又は〔１６〕の抗体を産生する、細胞。
〔１８〕細胞がハイブリドーマである、上記〔１７〕の細胞。
〔１９〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかのポリペプチド、上記〔１１〕のアンチセンス分子、上記〔１２〕又は〔１３〕のＲＮＡｉ誘導性核酸、上記〔１４〕のアプタマー、上記〔１５〕又は〔１６〕の抗体、あるいはそれらの発現ベクター、及び医薬として許容され得る担体を含む、組成物。
〔２０〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかのポリペプチドの発現又は機能が調節された、哺乳動物細胞又は非ヒト哺乳動物。
〔２１〕以下（ａ）又は（ｂ）を含む、脳・神経特異的遺伝子１〜１０によりコードされるいずれかのポリヌクレオチド又はその特異的な部分ヌクレオチドに特異的なプライマーセット：
（ａ）上記〔７〕のポリヌクレオチド、あるいは上記〔７〕又は〔８〕の特異的な部分ヌクレオチドの第１の核酸配列に対応するセンスプライマー；及び
（ｂ）上記〔７〕のポリヌクレオチド、あるいは上記〔７〕又は〔８〕の特異的な部分ヌクレオチドの第２の核酸配列に相補的な核酸配列に対応するアンチセンスプライマー。
〔２２〕以下（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、脳・神経特異的遺伝子１〜１０によりコードされるいずれかのポリヌクレオチド又はその特異的な部分ヌクレオチドに特異的な核酸プローブ：
（ａ）上記〔７〕又は〔８〕の特異的な部分ヌクレオチドの核酸配列に相補的な核酸配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド；又は
（ｂ）上記〔７〕又は〔８〕の特異的な部分ヌクレオチドの核酸配列を含むセンス鎖、及びそれに相補的な核酸配列を含むアンチセンス鎖から構成される二本鎖ポリヌクレオチド。
〔２３〕上記〔１４〕のアプタマー、上記〔１５〕又は〔１６〕の抗体、上記〔２１〕のプライマーセット及び上記〔２２〕の核酸プローブから選ばれる１以上の物質又はセットを含む、脳・神経特異的遺伝子１〜１０によりコードされるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの検出又は定量用試薬又はキット。
〔２４〕神経細胞の分化の判定用試薬又はキットである、上記〔２３〕の試薬又はキット。
〔２５〕哺乳動物から得られた生体試料、あるいは細胞又は組織培養物において、脳・神経特異的遺伝子１〜１０によりコードされるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を測定することを含み、かつ該生体試料又は該培養物が神経細胞又は脳内の組織を含む、該ポリペプチド又はポリヌクレオチドの検出又は定量方法。
〔２６〕哺乳動物から得られた生体試料、あるいは細胞又は組織培養物において、上記〔２〕又は〔３〕のポリペプチドあるいは上記〔７〕のポリヌクレオチドの発現を測定することを含む、該ポリペプチド又は該ポリヌクレオチドの検出又は定量方法。
〔２７〕該生体試料又は該培養物が神経細胞又は脳内の組織を含む、上記〔２６〕の検出又は定量方法。
本発明のポリペプチド及び本発明の部分ペプチドは、例えば、脳・神経に特異的あるいは神経細胞分化に特異的なバイオマーカーとして、並びに本発明のポリペプチド又は既知ポリペプチドを特異的に認識し得る物質、あるいは本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方を包括的に認識し得る物質、及び本発明のポリペプチド又は既知ポリペプチドの機能を特異的に調節し得る物質、あるいは本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の機能を包括的に調節し得る物質の開発に有用であり得る。
本発明のポリヌクレオチド及び本発明の部分ヌクレオチドは、例えば、脳・神経に特異的あるいは神経細胞分化に特異的なバイオマーカーとして、並びに本発明のポリヌクレオチド又は既知ポリヌクレオチドを特異的に認識し得る物質、あるいは本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方を包括的に認識し得る物質、及び本発明のポリペプチド又は既知ポリペプチドの発現を特異的に調節し得る物質、あるいは本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の発現を包括的に調節し得る物質の開発に有用であり得る。
本発明の関連物質（例、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ誘導性核酸、アプタマー及び抗体、並びにそれらの発現ベクター）は、例えば、医薬又は試薬として有用であり得る。
本発明の細胞は、例えば、本発明のポリペプチド及び本発明の部分ペプチド、並びに本発明の抗体の産生に有用であり得る。本発明の細胞はまた、医薬（例、神経細胞の障害に基づく疾患の予防又は治療薬）の開発、脳・神経に特異的あるいは神経細胞分化に特異的なさらなるマーカー遺伝子の同定、及び神経細胞の分化に関連する機構の解析に有用であり得る。
本発明の動物は、例えば、医薬の開発、脳・神経に特異的あるいは神経細胞分化に特異的なさらなるマーカー遺伝子の同定、及び神経細胞の分化に関連する機構の解析に有用であり得る。
本発明の測定用手段（例、プライマーセット、核酸プローブ、抗体、アプタマー）及び測定方法は、例えば、本発明のポリヌクレオチド若しくは既知ポリヌクレオチド、又は本発明のポリペプチド若しくは既知ポリペプチドの特異的な検出及び定量、あるいは本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチド、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の包括的な検出及び定量に有用であり得る。このような手段及び方法はまた、神経細胞の分化状態の判定、並びに医薬、試薬又は食品のスクリーニングに利用できる。
１．脳・神経特異的遺伝子
本発明の遺伝子は、任意の哺乳動物に由来する遺伝子であり得る。哺乳動物としては、例えば、霊長類及びげっ歯類、並びに実験用動物、家畜、使役動物、ペット等が挙げられる。詳細には、哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどが挙げられる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
本発明の遺伝子は、脳内の組織で特異的に発現し得るか、又は特異的に発現し得ない。本発明の遺伝子はまた、既知ポリヌクレオチド及び／又は既知ポリペプチドに比し、脳内の組織で高発現又は低発現し得る。脳内のこのような組織としては、例えば、大脳、大脳皮質、小脳、尾状核、脳梁、海馬、黒質、視床、視床下部、視床下核、下垂体、扁桃などが挙げられる。
本発明の遺伝子は、神経細胞で特異的に発現し得るか、又は特異的に発現し得ない。本発明の遺伝子はまた、既知ポリヌクレオチド及び／又は既知ポリペプチドに比し、神経細胞で高発現又は低発現し得る。このような神経細胞としては、例えば、上記組織中の神経細胞が挙げられる。
以下、本発明により提供される、ポリペプチド及びその部分ペプチド、並びにポリヌクレオチド及びその部分ヌクレオチドについて説明する。
１．１．ポリペプチド及びその部分ペプチド
本発明は、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（必要に応じて「配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列等」と省略）を有するポリペプチドを提供する。
「配列番号Ｘ」は、本明細書中に開示される任意のアミノ酸配列の配列番号を示す。また、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列等を「有する（having）」ポリペプチドとは、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列等「からなる（consisting of）」ポリペプチド、及び当該アミノ酸配列等を「含む（comprising）」ポリペプチドを意味する。
一実施形態では、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列と所定のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列同一性の程度は、約９０％以上、好ましくは約９２％以上、より好ましくは約９５％以上、さらにより好ましくは約９６％以上、最も好ましくは約９７％以上、約９８％以上又は約９９％以上であり得る。アミノ酸配列同一性は自体公知の方法により決定できる。特に断らない場合、アミノ酸配列同一性（％）は、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、例えば、マキシマムマッチング法のコマンドを実行することにより算出される。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。また、アミノ酸配列同一性（％）は、上記によらずに、当該分野で慣用のプログラム（例えば、BLAST、FASTA等）を初期設定で用いて決定することもできる。別の局面では、同一性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Needlemanら(1970) (J. Mol. Biol. 48: 444-453)、Myers及びMiller (CABIOS, 1988, 4: 11-17)のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Needlemanらのアルゴリズムは、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムに組み込まれており、同一性（％）は、例えば、BLOSUM 62 matrix又はPAM250 matrix、並びにgap weight: 16、14、12、10、8、6若しくは4、及びlength weight: 1、2、3、4、5若しくは6のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Myers及びMillerのアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、例えば、PAM120 weight residue table、gap length penalty 12、gap penalty 4を用いることができる。アミノ酸配列同一性の算出については、上記の方法のなかで最も低い値を示す方法を採用してもよい。
別の実施形態では、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が置換、付加、欠失及び挿入から選ばれる１以上の修飾を施されたアミノ酸配列であり得る。修飾されるアミノ酸の数は、１以上であれば特に限定されないが、例えば１〜約５０個、好ましくは１〜約３０個、より好ましくは１〜約２０個、さらにより好ましくは１〜約１０個、最も好ましくは１〜約５個（例、１個又は２個）であり得る。
配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、その特徴的な部分（例、後述の特異的な部分ポリペプチドに対応する部分）を完全に保持し、かつそれ以外の部分（例、既知ポリペプチド中に存在する部分）が、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列の対応部分と実質的に同一であってもよい。あるいは、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、非特徴的な部分が配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列の対応部分と同一であり、かつ特徴的な部分が、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列の対応部分と実質的に同一であってもよい。
本発明のポリペプチドは、既知ポリペプチド（例、既知バリアント）と同種又は異種の機能を有し得る。本発明のポリペプチドまた、既知ポリペプチド（例、既知バリアント）に比し、増強又は低下した機能を有し得る。
詳細には、脳・神経特異的遺伝子１〜１０の新規ポリペプチドは、以下の通りである。
１）脳・神経特異的遺伝子１
D-BRACE3000012.1（配列番号１８）
D-UTERU2026184.1（配列番号１０）
脳・神経特異的遺伝子１の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトジンクフィンガータンパク質４１８（ＺＮＦ４１８）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：２０３１個；タンパク質中のアミノ酸の総数：６７６個；GenBankアクセッション番号：NM_133460.1参照）が報告されている。脳・神経特異的遺伝子１の既知バリアントは、所定の機能（例、転写調節能）を有し得る（例、Ota,T. et al., Nat. Genet. 36 (1), 40-45 (2004) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、脳・神経特異的遺伝子１の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。
２）脳・神経特異的遺伝子２
D-NT2RP8004156.1（配列番号４３）
脳・神経特異的遺伝子２の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトｖ−ａｋｔマウス胸腺腫ウイルスオンコジーンホモログ１（ＡＫＴ１）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１４４３個；タンパク質中のアミノ酸の総数：４８０個；GenBankアクセッション番号：NM_005163.1参照）が報告されている。脳・神経特異的遺伝子２の既知バリアントは、脳・神経特異的遺伝子２の既知バリアントは、所定の機能（例、キナーゼ活性、抗アポトーシス活性、あるいは細胞周期調節能）を有することが報告されている（例、Mirza, A.M. et al., Mol. Cell. Biol. 24 (24), 10868-10881 (2004); Koga, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 324 (1), 321-325 (2004) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、脳・神経特異的遺伝子２の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。
３）脳・神経特異的遺伝子３
D-NT2RI3005525.1（配列番号５８）
脳・神経特異的遺伝子３の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒト出芽関連，ＥＶＨ１ドメイン含有２（ＳＰＲＥＤ２）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１２５７個；タンパク質中のアミノ酸の総数：４１８個；GenBankアクセッション番号：NM_181784.1参照）が報告されている。脳・神経特異的遺伝子３の既知バリアントは、所定の機能（例、ＭＡＰキナーゼ活性化の阻害能、チロシンキナーゼ媒介Ｅｒｋ活性化の阻害能）を有することが報告されている（例、Nobuhisa, I. et al., J. Exp. Med. 199 (5), 737-742 (2004); Kato, R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 302 (4), 767-772 (2003) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、脳・神経特異的遺伝子３の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。
４）脳・神経特異的遺伝子４
D-NT2RP8004592.1（配列番号７４）
脳・神経特異的遺伝子４の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトｓｒｃキナーゼ関連ホスホタンパク質２（ＳＫＡＰ２）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１０８０個；タンパク質中のアミノ酸の総数：３５９個；GenBankアクセッション番号：NM_003930.3参照）が報告されている。脳・神経特異的遺伝子４の既知バリアントは、所定の機能（例、α−シヌクレイン（α-synuclein）リン酸化の阻害能）を有することが報告されている（例、Takahashi, T. et al., J. Biol. Chem. 278 (43), 42225-42233 (2003) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、脳・神経特異的遺伝子４の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。
５）脳・神経特異的遺伝子５
D-NT2RI2014164.1（配列番号８９）
D-BRAMY2029564.1（配列番号９９）
脳・神経特異的遺伝子５の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトモノアミンオキシダーゼＢ（ＭＡＯＢ）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１５６３個；タンパク質中のアミノ酸の総数：５２０個；GenBankアクセッション番号：NM_000898.3参照）が報告されている。脳・神経特異的遺伝子５の既知バリアントは、所定の機能（例、モノアミンオキシダーゼ活性）を有することが報告されている（例、Bach, A.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (13), 4934-4938 (1988) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、脳・神経特異的遺伝子５の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。
６）脳・神経特異的遺伝子６
D-BRHIP2003515.1（配列番号１１８）
脳・神経特異的遺伝子６の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒト腫瘍タンパク質Ｄ５２（ＴＰＤ５２）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：５５５個；タンパク質中のアミノ酸の総数：１８４個；GenBankアクセッション番号：NM_005079.1参照）が報告されている。脳・神経特異的遺伝子６の既知バリアントは、所定の機能（例、アネキシンＶＩとのＣａ２＋依存的な相互作用能）を有することが報告されている（例、Tiacci, E. et al., Blood 105 (7), 2812-2820 (2005) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、脳・神経特異的遺伝子６の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。
７）脳・神経特異的遺伝子７
D-BRACE2044661.1（配列番号１３３）
脳・神経特異的遺伝子７の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトＡＴＰａｓｅ，Ｎａ＋／Ｋ＋輸送性，β３ポリペプチド（ＡＴＰ１Ｂ３）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：８４０個；タンパク質中のアミノ酸の総数：２７９個；GenBankアクセッション番号：NM_001679.2参照）が報告されている。脳・神経特異的遺伝子７の既知バリアントは、所定の機能（例、Ｎａ＋、Ｋ＋等のイオンの存在下におけるＡＴＰの加水分解活性）を有することが報告されている（例、Malik, N. et al., J. Biol. Chem. 271 (37), 22754-22758 (1996) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、脳・神経特異的遺伝子７の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。
８）脳・神経特異的遺伝子８
D-3NB692002462.1（配列番号１５２）
D-BRCAN2027778.1（配列番号１５９）
脳・神経特異的遺伝子８の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１１９１個；タンパク質中のアミノ酸の総数：３９６個；GenBankアクセッション番号：NM_000431.1参照）が報告されている。脳・神経特異的遺伝子８の既知バリアントは、所定の機能（例、メバロン酸キナーゼ活性）を有することが報告されている（例、Hogenboom, S. et al., J. Cell. Sci. 117 (PT 4), 631-639 (2004) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、脳・神経特異的遺伝子８の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。
９）脳・神経特異的遺伝子９
D-NT2RI3001005.1（配列番号１８４）
D-NT2RI3005261.1（配列番号１９０）
脳・神経特異的遺伝子９の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒト溶質キャリアファミリー２(促進性グルコーストランスポータ），メンバー１４（ＳＬＣ２Ａ１４）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１５６３個；タンパク質中のアミノ酸の総数：５２０個；GenBankアクセッション番号：NM_153449.2参照）が報告されている。脳・神経特異的遺伝子９の既知バリアントは、所定の機能（例、グルコース輸送能）を有し得る（例、Wu, X. et al., Genomics 80 (6), 553-557 (2002) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、脳・神経特異的遺伝子９の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。
１０）脳・神経特異的遺伝子１０
D-OCBBF2010718.1（配列番号２０７）
D-OCBBF3004194.1（配列番号２１３）
D-NT2RP8000826.1（配列番号２１９）
D-NT2RP7007268.1（配列番号２２５）
D-BRAWH3008172.1（配列番号３３１）
D-BRAWH3011965.1（配列番号２３６）
脳・神経特異的遺伝子１０の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトＰＤＺドメイン含有ＲＩＮＧフィンガー３（ＰＤＺＲＮ３）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：３２０１個；タンパク質中のアミノ酸の総数：１０６６個；GenBankアクセッション番号：NM_015009.1参照）が報告されている。脳・神経特異的遺伝子１０の既知バリアントは、所定の機能（例、ニューロリギン（neuroligin）等の細胞表面タンパク質に対する、そのＰＤＺドメインを介した結合能）を有し得る（例、Meyer,G. et al., Neuropharmacology 47 (5), 724-733 (2004) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、脳・神経特異的遺伝子１０の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。
本発明のポリペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドを特異的に認識し得る物質、本発明のポリペプチドを特異的に認識し得ない物質、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方を包括的に認識し得る物質の開発、並びに本発明のポリペプチドの機能を特異的に調節し得る物質、本発明のポリペプチドの機能を特異的に調節し得ない物質、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の機能を包括的に認識し得る物質の開発に有用であり得る。
本発明はまた、部分ペプチドを提供する。
「部分ペプチド」は、所定の有用性（例、免疫原性又は抗原性ペプチド、特定のドメインを有する機能性ペプチドなどとしての用途）を有し得る、対象ポリペプチドから選ばれる少なくとも６個、好ましくは少なくとも８個、より好ましくは少なくとも１０個、さらにより好ましくは少なくとも１２個、最も好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基からなる。
「本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列」とは、本発明のポリペプチド（例、新規バリアント）中に挿入されているが既知ポリペプチド（例、既知バリアント）中で欠失しているアミノ酸配列をいう。一方、「既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列」とは、既知ポリペプチド（例、既知バリアント）中に挿入されているが本発明のポリペプチド（例、新規バリアント）中で欠失しているアミノ酸配列をいう。これらの挿入アミノ酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。
「本発明のポリペプチドの欠失アミノ酸配列」とは、本発明のポリペプチド（例、新規バリアント）中で欠失しているが既知ポリペプチド（例、既知バリアント）中に挿入されているアミノ酸配列をいう。一方、「既知ポリペプチドの欠失アミノ酸配列」とは、既知ポリペプチド（例、既知バリアント）中で欠失しているが本発明のポリペプチド（例、新規バリアント）中に挿入されているアミノ酸配列をいう。これらの欠失アミノ酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。「本発明のポリペプチドの欠失アミノ酸配列」は、「既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列」と同義であり得、「既知ポリペプチドの欠失アミノ酸配列」は、「本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列」と同義であり得る。
本発明の部分ペプチドは、ａ）本発明のポリペプチドを既知ポリペプチドから識別可能である、本発明のポリペプチドの特異的な部分ペプチド（必要に応じて「特異的な部分ペプチドＡ」と省略）、ｂ）既知ポリペプチドを本発明のポリペプチドから識別可能である、既知ポリペプチドの特異的な部分ペプチド（必要に応じて「特異的な部分ペプチドＢ」と省略）、又はｃ）本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に共通する部分ペプチド（必要に応じて「共通部分ペプチド」と省略）であり得る。これらの特定の部分ペプチドは、本発明者らの知見により、作製する、又はマーカーとして利用する動機付けが生まれるものの、このような知見なしには、これらを作製する、又はマーカーとして利用する動機付けはない。脳・神経特異的遺伝子１〜１０によりコードされるポリペプチドに特異的な部分ペプチドである、特異的な部分ペプチドＡ及びＢを、必要に応じて「本発明の特異的な部分ペプチド」又は「特異的な部分ペプチド」と省略する。
本発明の特異的な部分ペプチドＡは、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列等を有するポリペプチド中にのみ存在し、かつ既知ポリペプチド中に存在しない部分ペプチドである。このような特異的な部分ペプチドＡとしては、例えば、ｉ）本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド、ｉｉ）本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその末端部分アミノ酸配列及びその隣接アミノ酸配列からなる部分ペプチド、並びにｉｉｉ）エクソンの欠失に起因して形成される、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側及びＣ末端側に存在する双方のアミノ酸配列が連結したアミノ酸配列からなる部分ペプチドが挙げられる。
上記ｉ）の特異的な部分ペプチドＡは、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる。このような部分アミノ酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。
上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡは、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその末端部分アミノ酸配列及びその隣接アミノ酸配列からなる。このような末端部分アミノ酸配列としては、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列中のＮ末端部分に対応するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｎ末端部分アミノ酸配列Ａ」と省略）、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列中のＣ末端部分に対応するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｃ末端部分アミノ酸配列Ａ」と省略）が挙げられる。このような隣接アミノ酸配列としては、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側に存在するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｎ末端隣接アミノ酸配列Ａ」と省略）、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＣ末端側に存在するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｃ末端隣接アミノ酸配列Ａ」と省略）が挙げられる。従って、上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡは、Ｎ末端隣接アミノ酸配列Ａの所定の位置から本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列の所定の位置にわたるアミノ酸配列からなる部分ペプチド、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列の所定の位置からＣ末端隣接アミノ酸配列Ａの所定の位置にわたるアミノ酸配列からなる部分ペプチド、あるいはＮ末端隣接アミノ酸配列Ａの所定の位置からＣ末端隣接アミノ酸配列Ａの所定の位置にわたる、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列全体を含むアミノ酸配列からなる部分ペプチドであり得る。上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡに含まれる、挿入アミノ酸配列（又はＮ末端若しくはＣ末端部分アミノ酸配列Ａ）あるいは隣接アミノ酸配列（又はＮ末端若しくはＣ末端隣接アミノ酸配列Ａ）中のアミノ酸残基数は、上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。このような末端部分アミノ酸配列及びこのような隣接アミノ酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。
上記ｉｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡは、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側及びＣ末端側に存在する双方のアミノ酸配列が連結したアミノ酸配列（本発明のポリペプチドでは、エクソンの欠失に起因して、これらのアミノ酸配列は連結している）からなる、既知ポリペプチドに存在しない部分ペプチドである。上記ｉｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡに含まれる、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側及びＣ末端側に存在する各アミノ酸配列中のアミノ酸残基数はそれぞれ、上記ｉｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば、少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。
本発明の特異的な部分ペプチドＡは、例えば、本発明のポリペプチドを特異的に検出するための標的として、及び脳・神経に特異的あるいは神経分化に特異的なマーカーとして有用であり得る。本発明の特異的な部分ペプチドＡはまた、本発明のポリペプチドを特異的に認識し得る物質、又は本発明のポリペプチドを特異的に認識し得ない物質の開発、あるいは本発明のポリペプチドの機能を特異的に調節し得る物質、又は本発明のポリペプチドの機能を特異的に調節し得ない物質の開発に有用であり得る。
本発明の特異的な部分ペプチドＢは、既知ポリペプチド中にのみ存在し、かつ配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列等を有するポリペプチド中に存在しない部分ペプチドである。このような特異的な部分ペプチドＢとしては、例えば、ｉ）既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド、ｉｉ）既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその末端部分アミノ酸配列及びその隣接アミノ酸配列からなる部分ペプチド、ｉｉｉ）エクソンの欠失に起因して形成される、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側及びＣ末端側に存在する双方のアミノ酸配列が連結したアミノ酸配列からなる部分ペプチドが挙げられる。
上記ｉ）の特異的な部分ペプチドＢは、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる。このような部分アミノ酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。
上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢは、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその末端部分アミノ酸配列及びその隣接アミノ酸配列からなる。このような末端部分アミノ酸配列としては、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列中のＮ末端部分に対応するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｎ末端部分アミノ酸配列Ｂ」と省略）、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列中のＣ末端部分に対応するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｃ末端部分アミノ酸配列Ｂ」と省略）が挙げられる。このような隣接アミノ酸配列としては、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側に存在するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｎ末端隣接アミノ酸配列Ｂ」と省略）、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＣ末端側に存在するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｃ末端隣接アミノ酸配列Ｂ」と省略）が挙げられる。従って、上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢは、Ｎ末端隣接アミノ酸配列Ｂの所定の位置から既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列の所定の位置にわたるアミノ酸配列からなる部分ペプチド、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列の所定の位置からＣ末端隣接アミノ酸配列Ｂの所定の位置にわたるアミノ酸配列からなる部分ペプチド、あるいはＮ末端隣接アミノ酸配列Ｂの所定の位置からＣ末端隣接アミノ酸配列Ｂの所定の位置にわたる、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列全体を含むアミノ酸配列からなる部分ペプチドであり得る。上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢに含まれる、挿入アミノ酸配列（又はＮ末端若しくはＣ末端部分アミノ酸配列Ｂ）あるいは隣接アミノ酸配列（又はＮ末端若しくはＣ末端隣接アミノ酸配列Ｂ）中のアミノ酸残基数は、上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。このような末端部分アミノ酸配列及びこのような隣接アミノ酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。
上記ｉｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢは、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側及びＣ末端側に存在する双方のアミノ酸配列が連結したアミノ酸配列（既知ポリペプチドでは、エクソンの欠失に起因して、これらのアミノ酸配列は連結している）からなる、本発明のポリペプチドに存在しない部分ペプチドである。上記ｉｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢに含まれる、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側及びＣ末端側に存在する各アミノ酸配列中のアミノ酸残基数はそれぞれ、上記ｉｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば、少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。
本発明の特異的な部分ペプチドＢは、例えば、既知ポリペプチドを特異的に検出するための標的として、及び脳・神経に特異的又は神経分化に特異的なマーカーとして、あるいはこれらに非特異的なマーカーとして有用であり得る。本発明の特異的な部分ペプチドＢはまた、既知ポリペプチドを特異的に認識し得る物質、又は既知ポリペプチドを特異的に認識し得ない物質の開発、あるいは既知ポリペプチドの機能を特異的に調節し得る物質、又は既知ポリペプチドの機能を特異的に調節し得ない物質の開発に有用であり得る。
本発明の共通部分ペプチドは、本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に存在する、非特異的な部分ペプチドであり得る。このような部分ペプチドは、本明細書中の開示から明らかである。本発明の共通部分ペプチドは、例えば、本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方を包括的に検出するための標的として、及び脳・神経に特異的又は神経分化に特異的なマーカーとして、あるいはこれらに非特異的なマーカーとして有用であり得る。本発明の共通部分ペプチドはまた、本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方を包括的に認識し得る物質、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の機能を包括的に調節し得る物質の開発に有用であり得る。
本発明のポリペプチド又はその特異的な部分ペプチドは、異種アミノ酸配列からなるポリペプチドと融合していてもよい。このようなポリペプチドとしては、精製又は可溶化を容易にするポリペプチドが挙げられる。詳細には、このようなポリペプチドとしては、ヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧ、ＩｇＧ分子のＦｃ領域が挙げられる。
本発明のポリペプチド及びその部分ペプチドは塩の形態で提供されてもよい。塩としては、例えば、無機塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、リジン、オルニチン）又は酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。
本発明のポリペプチド及びその部分ペプチドは、自体公知の方法により作製できる。例えば、本発明のポリペプチド及びその部分ペプチドは、１）発現部位から回収してもよく、２）本発明のポリペプチド及びその部分ペプチドを発現する後述の形質転換体又はその培養上清から回収してもよく、３）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いる無細胞系により合成してもよく、あるいは４）有機化学的に合成（例、固相合成）してもよい。本発明のポリペプチド及びその部分ペプチドは、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、抗体の使用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法などにより適宜精製される。
１．２．ポリヌクレオチド及びその部分ヌクレオチド
本発明は、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列（必要に応じて「配列番号Ｙで表される核酸配列等」と省略）を有するポリヌクレオチドを提供する。
「配列番号Ｙ」は、本明細書中に開示される任意の核酸配列の配列番号を表す。また、配列番号Ｙ等を「有する」ポリヌクレオチドとは、配列番号Ｙ等「からなる」ポリヌクレオチド、あるいは当該核酸配列等を「含む」ポリヌクレオチドを意味する。
「核酸配列Ｙ１」とは、配列番号Ｙで表される核酸配列において、コーディング部分（即ち、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体又はその一部）に対応する核酸配列を示す。換言すれば、「核酸配列Ｙ１」とは、配列番号Ｙで表される核酸配列がコーディング部分のみに対応する核酸配列からなる場合、配列番号Ｙで表される核酸配列を示し、配列番号Ｙで表される核酸配列がコーディング部分及び非コーディング部分の双方に対応する核酸配列を含む場合、コーディング部分のみに対応する核酸配列を示す。
「核酸配列Ｙ２」とは、配列番号Ｙで表される核酸配列において、非コーディング部分（例、５’又は３’非翻訳領域）に対応する核酸配列を示す。換言すれば、「核酸配列Ｙ２」とは、配列番号Ｙで表される核酸配列が非コーディング部分のみに対応する核酸配列からなる場合、配列番号Ｙで表される核酸配列を示し、配列番号Ｙで表される核酸配列が非コーディング部分及びコーディング部分の双方に対応する核酸配列を含む場合、非コーディング部分のみに対応する核酸配列を示す。
従って、「配列番号Ｙ」で表される核酸配列は、ｉ）核酸配列Ｙ１（配列番号Ｙで表される核酸配列全体がコーディング部分に対応する核酸配列である場合）、ｉｉ）核酸配列Ｙ２（配列番号Ｙで表される核酸配列全体が非コーディング部分に対応する核酸配列である場合）、あるいはｉｉｉ）核酸配列Ｙ１及び核酸配列Ｙ２を含む核酸配列（配列番号Ｙで表される核酸配列がコーディング部分及び非コーディング部分に対応する核酸配列を含む場合）のいずれかにより表現できる。
一実施形態では、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と実質的に同一の核酸配列は、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と所定の配列同一性を有する核酸配列であり得る。核酸配列同一性の程度は、約９０％以上、好ましくは約９２％以上、より好ましくは約９５％以上、さらにより好ましくは約９６％以上、最も好ましくは約９７％以上、約９８％以上又は約９９％以上であり得る。核酸配列同一性は自体公知の方法により決定できる。例えば、核酸配列同一性（％）は、上述したアミノ酸配列同一性（％）と同様の方法により決定できる。
別の実施形態では、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と実質的に同一の核酸配列は、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２において１以上のヌクレオチドが置換、付加、欠失及び挿入から選ばれる１以上の修飾を施された核酸配列であり得る。修飾されるヌクレオチドの数は、１以上であれば特に限定されないが、例えば１〜約１００個、好ましくは１〜約７０個、より好ましくは１〜約５０個、さらにより好ましくは１〜約３０個、最も好ましくは１〜約２０個、１〜約１０個又は１〜約５個（例、１個又は２個）であり得る。
さらに別の実施形態では、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と実質的に同一の核酸配列は、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２に相補的な核酸配列に対してハイストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであり得る。ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件は、既報の条件を参考に設定することができる（例、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 6.3.1-6.3.6 (1999) 参照）。例えば、ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％SDS／50〜65℃での１回又は２回以上の洗浄が挙げられる。
配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と実質的に同一の核酸配列は、その特徴的な部分（例、後述の特異的な部分ヌクレオチドに対応する部分）を完全に保持し、かつそれ以外の部分（例、既知ポリヌクレオチド中に存在する部分）が、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２の対応部分と実質的に同一であってもよい。あるいは、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と実質的に同一の核酸配列は、非特徴的な部分が配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２の対応部分と同一であり、かつ特徴的な部分が、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２の対応部分と実質的に同一であってもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードし得る。従って、本発明のポリヌクレオチドは、それによりコードされるポリペプチドが本発明のポリペプチドと同様の機能を示し得るようなポリヌクレオチドであり得る。
詳細には、脳・神経特異的遺伝子１〜１０についてのポリヌクレオチドの核酸配列Ｙ、及びそのＯＲＦ対応部分（核酸配列ＹにおけるＹａ〜Ｙｂ番目のヌクレオチド残基）の配列番号Ｙ、及びＹａ〜Ｙｂ番目は、以下の通りである。
１）脳・神経特異的遺伝子１
D-BRACE3000012.1（配列番号１６又は配列番号１７、及び４６５〜２５５８番目）
D-UTERU2026184.1（配列番号８又は配列番号９、及び１９１〜２１１９番目）
２）脳・神経特異的遺伝子２
D-NT2RP8004156.1（配列番号４１又は配列番号４２、及び１３１〜１３８７番目）
３）脳・神経特異的遺伝子３
D-NT2RI3005525.1（配列番号５６又は配列番号５７、及び４５〜１２９２番目）
４）脳・神経特異的遺伝子４
D-NT2RP8004592.1（配列番号７２又は配列番号７３、及び６２０〜１１８３番目）
５）脳・神経特異的遺伝子５
D-NT2RI2014164.1（配列番号８７又は配列番号８８、及び１６２〜１３９７番目）
D-BRAMY2029564.1（配列番号９７又は配列番号９８、及び１４３〜１６５７番目）
６）脳・神経特異的遺伝子６
D-BRHIP2003515.1（配列番号１１６又は配列番号１１７、及び８４〜７０７番目）
７）脳・神経特異的遺伝子７
D-BRACE2044661.1（配列番号１３１又は配列番号１３２、及び２９７〜８７８番目）
８）脳・神経特異的遺伝子８
D-3NB692002462.1（配列番号１５０又は配列番号１５１、及び３４３〜９５１番目）
D-BRCAN2027778.1（配列番号１５７又は配列番号１５８、及び５２〜１０８６番目）
９）脳・神経特異的遺伝子９
D-NT2RI3001005.1（配列番号１８２又は配列番号１８３、及び２２〜１６２９番目）
D-NT2RI3005261.1（配列番号１８８又は配列番号１８９、及び２２〜１６２９番目）
１０）脳・神経特異的遺伝子１０
D-OCBBF2010718.1（配列番号２０５又は配列番号２０６、及び１４４〜２４９５番目）
D-OCBBF3004194.1（配列番号２１１又は配列番号２１２、及び１２９〜２４８０番目）
D-NT2RP8000826.1（配列番号２１７又は配列番号２１８、及び９５〜２４６１番目）
D-NT2RP7007268.1（配列番号２２３又は配列番号２２４、及び９５〜２４６１番目）
D-BRAWH3008172.1（配列番号２２９又は配列番号３３０、及び２８１〜２４５２番目）
D-BRAWH3011965.1（配列番号２３４又は配列番号２３５、及び３００〜１５７４番目）
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識し得る物質、本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識し得ない物質、又は本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方を包括的に認識し得る物質の開発、並びに本発明のポリペプチドの発現を特異的に調節し得る物質、本発明のポリペプチドの発現を特異的に調節し得ない物質、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の発現を包括的に調節し得る物質の開発に有用であり得る。
本発明はまた、部分ヌクレオチドを提供する。
「部分ヌクレオチド」とは、所定の有用性（例、プローブ、プライマー、免疫原性又は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、特定のドメインを有する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドなどとしての用途）を有し得る、対象ポリヌクレオチドから選ばれる少なくとも１５個、好ましくは少なくとも１６個、より好ましくは少なくとも１８個、さらにより好ましくは少なくとも２０個、最も好ましくは少なくとも２２個、２３個、２４個又は２５個の連続するヌクレオチド残基からなる。
「本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列」とは、本発明のポリヌクレオチド（例、新規バリアント）中に挿入されているが既知ポリヌクレオチド（例、既知バリアント）中で欠失している核酸配列をいう。一方、「既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列」とは、既知ポリヌクレオチド（例、既知バリアント）中に挿入されているが本発明のポリヌクレオチド（例、新規バリアント）中で欠失している核酸配列をいう。これらの挿入核酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。
「本発明のポリヌクレオチドの欠失核酸配列」とは、本発明のポリヌクレオチド（例、新規バリアント）中で欠失しているが既知ポリヌクレオチド（例、既知バリアント）中に挿入されている核酸配列をいう。一方、「既知ポリヌクレオチドの欠失核酸配列」とは、既知ポリヌクレオチド（例、既知バリアント）中で欠失しているが本発明のポリヌクレオチド（例、新規バリアント）中に挿入されている核酸配列をいう。これらの欠失核酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。「本発明のポリヌクレオチドの欠失核酸配列」は、「既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列」と同義であり得、「既知ポリヌクレオチドの欠失核酸配列」は、「本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列」と同義であり得る。
本発明の部分ヌクレオチドは、ａ）本発明のポリヌクレオチドを既知ポリヌクレオチドから識別可能である、本発明のポリヌクレオチドの特異的な部分ヌクレオチド（必要に応じて「特異的な部分ヌクレオチドＡ」と省略）、ｂ）既知ポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドから識別可能である、既知ポリヌクレオチドの特異的な部分ヌクレオチド（必要に応じて「特異的な部分ヌクレオチドＢ」と省略）、又はｃ）本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方に共通する部分ヌクレオチド（必要に応じて「共通部分ヌクレオチド」と省略）であり得る。これらの特定の部分ヌクレオチドは、本発明者らの知見により、作製する、又はマーカーとして利用する動機付けが生まれるものの、このような知見なしには、これらを作製する、又はマーカーとして利用する動機付けはない。脳・神経特異的遺伝子１〜１０によりコードされるポリヌクレオチドに特異的な部分ヌクレオチドである、特異的な部分ヌクレオチドＡ及びＢを、必要に応じて「本発明の特異的な部分ヌクレオチド」又は「特異的な部分ヌクレオチド」と省略する。
本発明の特異的な部分ヌクレオチドＡは、配列番号Ｙで表される核酸配列等を有するポリヌクレオチド中にのみ存在し、かつ既知ポリヌクレオチド中に存在しない部分ヌクレオチドである。このような特異的な部分ヌクレオチドＡとしては、例えば、ｉ）本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド、ｉｉ）本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその末端部分核酸配列及びその隣接核酸配列からなる部分ヌクレオチド、並びにｉｉｉ）エクソンの欠失に起因して形成される、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’及び３’に存在する双方の核酸配列が連結した核酸配列からなる部分ヌクレオチドが挙げられる。
上記ｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡは、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその部分核酸配列からなる。このような部分核酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。
上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡは、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその末端部分核酸配列及びその隣接核酸配列からなる。このような末端部分核酸配列としては、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列中の５’末端部分に対応する核酸配列（必要に応じて「５’末端部分核酸配列Ａ」と省略）、本発明のポリペプチドの挿入核酸配列中の３’末端部分に対応する核酸配列（必要に応じて「３’末端部分核酸配列Ａ」と省略）が挙げられる。このような隣接核酸配列としては、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’に存在する核酸配列（必要に応じて「５’隣接核酸配列Ａ」と省略）、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して３’に存在する核酸配列（必要に応じて「３’隣接核酸配列Ａ」と省略）が挙げられる。従って、上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡは、５’隣接核酸配列Ａの所定の位置から本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列の所定の位置にわたる核酸配列からなる部分ヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列の所定の位置から３’隣接核酸配列Ａの所定の位置にわたる核酸配列からなる部分ヌクレオチド、あるいは５’隣接核酸配列Ａの所定の位置から３’隣接核酸配列Ａの所定の位置にわたる、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列全体を含む核酸配列からなる部分ヌクレオチドであり得る。上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡに含まれる、挿入核酸配列（又は５’末端若しくは３’末端部分核酸配列Ａ）あるいは隣接核酸配列（又は５’末端若しくは３’末端隣接核酸配列Ａ）中のヌクレオチド残基数は、上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。このような末端部分核酸配列及びこのような隣接核酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。
上記ｉｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡは、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’及び３’に存在する双方の核酸配列が連結した核酸配列（本発明のポリヌクレオチドでは、エクソンの欠失に起因して、これらの核酸配列は連結している）からなる、既知ポリヌクレオチドに存在しない部分ヌクレオチドである。上記ｉｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡに含まれる、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’及び３’に存在する各核酸配列中のヌクレオチド残基数はそれぞれ、上記ｉｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。
本発明の特異的な部分ヌクレオチドＡは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを特異的に検出するための標的として、及び脳・神経に特異的又は神経分化に特異的なマーカーとして有用であり得る。本発明の特異的な部分ヌクレオチドＡはまた、本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識し得る物質、又は本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識し得ない物質の開発、あるいは本発明のポリペプチドの発現を特異的に調節し得る物質、又は本発明のポリペプチドの発現を特異的に調節し得ない物質の開発に有用であり得る。
本発明の特異的な部分ヌクレオチドＢは、既知ポリヌクレオチド中にのみ存在し、かつ配列番号Ｘで表される核酸配列等を有するポリヌクレオチド中に存在しない部分ヌクレオチドである。このような特異的な部分ヌクレオチドＢとしては、例えば、ｉ）既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド、ｉｉ）既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその末端部分核酸配列及びその隣接核酸配列からなる部分ヌクレオチド、ｉｉｉ）エクソンの欠失に起因して形成される、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’及び３’に存在する双方の核酸配列が連結した核酸配列からなる部分ヌクレオチドが挙げられる。
上記ｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢは、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその部分核酸配列からなる。このような部分核酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。
上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢは、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその末端部分核酸配列及びその隣接核酸配列からなる。このような末端部分核酸配列としては、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列中の５’末端部分に対応する核酸配列（必要に応じて「５’末端部分核酸配列Ｂ」と省略）、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列中の３’末端部分に対応する核酸配列（必要に応じて「３’末端部分核酸配列Ｂ」と省略）が挙げられる。このような隣接核酸配列としては、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’に存在する核酸配列（必要に応じて「５’隣接核酸配列Ｂ」と省略）、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して３’に存在する核酸配列（必要に応じて「３’隣接核酸配列Ｂ」と省略）が挙げられる。従って、上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢは、５’隣接核酸配列Ｂの所定の位置から既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列の所定の位置にわたる核酸配列からなる部分ヌクレオチド、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列の所定の位置から３’隣接核酸配列Ｂの所定の位置にわたる核酸配列からなる部分ヌクレオチド、あるいは５’隣接核酸配列Ｂの所定の位置から３’隣接核酸配列Ｂの所定の位置にわたる、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列全体を含む核酸配列からなる部分ヌクレオチドであり得る。上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢに含まれる、挿入核酸配列（又は５’末端若しくは３’末端部分核酸配列Ｂ）あるいは隣接核酸配列（又は５’末端若しくは３’末端隣接核酸配列Ｂ）中のヌクレオチド残基数は、上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。このような末端部分核酸配列及びこのような隣接核酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。
上記ｉｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢは、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’及び３’に存在する双方の核酸配列が連結した核酸配列（既知ポリヌクレオチドでは、エクソンの欠失に起因して、これらの核酸配列は連結している）からなる、本発明のポリヌクレオチドに存在しない部分ヌクレオチドである。上記ｉｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢに含まれる、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’及び３’に存在する各核酸配列中のヌクレオチド残基数はそれぞれ、上記ｉｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。
本発明の特異的な部分ヌクレオチドＢは、例えば、既知ポリヌクレオチドを特異的に検出するための標的として、及び脳・神経に特異的又は神経分化に特異的なマーカーとして、あるいはこれらに非特異的なマーカーとして有用であり得る。本発明の特異的な部分ヌクレオチドＢはまた、既知ポリヌクレオチドを特異的に認識し得る物質、又は既知ポリヌクレオチドを特異的に認識し得ない物質の開発、あるいは既知ポリペプチドの発現を特異的に調節し得る物質、又は既知ポリペプチドの発現を特異的に調節し得ない物質の開発に有用であり得る。
本発明の共通部分ヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方に存在する、非特異的な部分ヌクレオチドであり得る。このような部分ヌクレオチドは、本明細書中の開示から明らかである。本発明の共通部分ヌクレオチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方を包括的に検出するための標的として、及び脳・神経に特異的又は神経分化に特異的なマーカーとして、あるいはこれらに非特異的なマーカーとして有用であり得る。本発明の共通部分ヌクレオチドはまた、本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方を包括的に認識し得る物質、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の発現を包括的に調節し得る物質の開発に有用であり得る。
本発明のポリヌクレオチド及びその部分ヌクレオチドは、本発明のポリペプチド又は本発明の部分ペプチドをコードし得る。本発明のポリヌクレオチド又は本発明の部分ヌクレオチドはまた、異種核酸配列からなるポリヌクレオチドと融合していてもよい。このような異種核酸配列としては、上述の異種アミノ酸配列をコードするものが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチド及びその部分ヌクレオチドは、塩の形態で提供されてもよい。塩としては、上述のものが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチド及びその部分ヌクレオチドは、自体公知の方法により作製できる。例えば、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と同一の核酸配列は、所定の組織又は細胞を用いてクローニングできる。また、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と実質的に同一の核酸配列は、上記の通りクローニングしたポリヌクレオチドに変異を導入することにより作製できる。変異導入法としては、例えば、合成オリゴヌクレオチド指定突然変異導入法、gapped duplex法、ランダムに点突然変異を導入する方法（例えば、亜硝酸若しくは亜硫酸での処理）、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスマッチプライマー法が挙げられる。
２．関連物質
本発明は、本発明のポリペプチド及び本発明の部分ペプチド、並びに本発明のポリヌクレオチド及び本発明の部分ヌクレオチドに基づき開発が可能となる一連の関連物質を提供する。以下に記載される本発明の関連物質は、例えば、医薬として有用であり得る。本発明の関連物質が医薬である場合、対象疾患は、例えば、神経細胞の障害に基づく疾患であり得る。詳細には、このような疾患としては、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、虚血性脳疾患（例、脳卒中）、てんかん、脳外傷、運動神経疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経毒物の障害に起因する疾患などが挙げられる。
２．１．アンチセンス分子
本発明は、アンチセンス分子を提供する。
アンチセンス分子の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス分子は、天然型のリン酸ジエステル結合を有するものであっても、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドであってもよい。アンチセンス分子の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。アンチセンス分子の長さは、転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５個のヌクレオチド程度、長いもので転写産物の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約１５個以上のヌクレオチド、好ましくは約１５個〜約１００個のヌクレオチド、より好ましくは約１８個〜約５０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス分子は、転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
本発明のアンチセンス分子は、本発明の部分ヌクレオチド（例、本発明の特異的な部分ヌクレオチドＡ及びＢ、本発明の共通部分ヌクレオチド）に対応する核酸配列に相補的な核酸配列を含み得る。従って、本発明のアンチセンス分子は、本発明のポリヌクレオチドに特異的なアンチセンス分子、既知ポリヌクレオチドに特異的なアンチセンス分子、又は本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方に共通するアンチセンス分子であり得る。本発明のアンチセンス分子は、本発明のポリペプチド又は既知ポリペプチドの発現の特異的な抑制、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の発現の包括的な抑制に有用であり得る。
２．２．ＲＮＡｉ誘導性核酸
本発明は、ＲＮＡｉ誘導性核酸を提供する。
ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）効果を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはＲＮＡである。ＲＮＡｉ効果とは、ｍＲＮＡと同一の核酸配列又はその部分配列を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する現象をいう。ＲＮＡｉ効果を得るには、例えば、少なくとも２０以上の連続する標的ｍＲＮＡと同一の核酸配列（又はその部分配列）を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが好ましい。２本鎖構造は、異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられるが、ｓｉＲＮＡが好ましい。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを誘導できる限り特に制限されないが、例えば２１〜２７塩基長、好ましくは２１〜２５塩基長であり得る。
本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸は、本発明の部分ヌクレオチド（例、本発明の特異的な部分ヌクレオチドＡ及びＢ、本発明の共通部分ヌクレオチド）に対応する核酸配列からなるセンス鎖、及びそれに相補的な核酸配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ポリヌクレオチドであり得る。本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸はまた、センス鎖及びアンチセンス鎖の一方又は双方の５’末端及び／又は３’末端においてオーバーハングを有していてもよい。オーバーハングは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’末端及び／又は３’末端における１〜数個（例、１、２又は３個）の塩基の付加により形成されたものであり得る。本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的なＲＮＡｉ誘導性核酸、既知ポリヌクレオチドに特異的なＲＮＡｉ誘導性核酸、又は本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方に共通するＲＮＡｉ誘導性核酸であり得る。本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸は、本発明のポリペプチド又は既知ポリペプチドの発現の特異的な抑制、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の発現の包括的な抑制に有用であり得る。
２．３．アプタマー
本発明は、アプタマーを提供する。
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性（又は阻害活性）を有するポリヌクレオチドをいう。本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ヌクレオチド又はそれらの混合物であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態であり得る。アプタマーの長さは特に限定されず、通常、約１６〜約２００個のヌクレオチドであり得るが、例えば約１００個のヌクレオチド以下であり、好ましくは約５０個のヌクレオチド以下であり、より好ましくは約４０個のヌクレオチド以下であり得る。また、本発明のアプタマーの長さは、例えば約１８個、約２０個、約２５個又は約３０個ヌクレオチド以上であってもよい。アプタマーは、結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化、Ｓ−アリル化及びアミノ化が挙げられる（例、Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635参照）。アプタマーはまた、プリン、ピリミジンが改変されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換が挙げられる。また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、リン酸基が、チオエート、ジチオエート又はアミデートで置換されていてもよい。アプタマーは、既報（例えば、Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510）に従って作製できる。
本発明のアプタマーは、本発明の部分ペプチドに対応する領域を介して、本発明のポリペプチド、既知ポリペプチド、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に特異的に結合し得る。従って、本発明のアプタマーは、本発明のポリペプチドに特異的なアプタマー、既知ポリペプチドに特異的なアプタマー、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に共通するアプタマーであり得る。このような特異的なアプタマーは、例えば、（ａ）本発明のポリペプチド又はその特異的な部分ペプチドに結合し、かつ既知ポリペプチドに結合しないポリヌクレオチド、（ｂ）既知ポリペプチド又はその特異的な部分ペプチドに結合し、かつ本発明のポリペプチドに結合しないポリヌクレオチド、あるいは（ｃ）本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方又は本発明の共通部分ペプチドに結合するポリヌクレオチドを、ＳＥＬＥＸ法により選抜することで作製できる。
２．４．抗体
本発明は、抗体を提供する。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体（抗血清）、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプであってもよいが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭである。
例えば、ポリクローナル抗体は、上記抗原（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を、市販のアジュバント（例えば、完全又は不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作成することができる。例えば、マウスに上記抗原を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1、P3X63Ag8など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法でも電圧パルス法であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡ又はＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、又はマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清及び動物の腹水から取得することができる。
本発明の抗体はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であってもよい。
キメラ抗体は、その可変領域及び定常領域が互いに異なる動物種のイムノグロブリンに由来するモノクローナル抗体を意味する。例えば、キメラ抗体は、その可変領域がマウスイムノグロブリン由来の可変領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であるマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体であり得る。ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明における組換キメラモノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。
キメラ抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体は、既報（例、実験医学(臨時増刊号), Vol. 6, No.10, 1988及び特公平3-73280号公報）に従って作製できる。詳細には、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離した該マウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＨ遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）の下流に、ヒトイムノグロブリンをコードするＤＮＡから取得したＣＨ遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、また該ハイブリドーマから単離したマウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＬ遺伝子（Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）の下流にヒトイムノグロブリンをコードするＤＮＡから取得したＣＬ遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、各々発現可能なように配列して１つ又は別々の発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製することができる。
ヒト化抗体は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、例えば、その超可変領域の相補性決定領域の一部又は全部がマウスモノクローナル抗体に由来し、その可変領域の枠組領域及びその定常領域がヒトイムノグロブリンに由来するヒト型モノクローナル抗体を意味する。超可変領域の相補性決定領域は、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相補的に直接結合する部位である３つの領域（Complementarity-determining region；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）であり、可変領域の枠組領域は、該３つの相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された４つの領域（Framework；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）である。換言すれば、例えばマウスモノクローナル抗体の超可変領域の相補性決定領域の一部又は全部以外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と置き代わったモノクローナル抗体を意味する。
ヒト化抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する組換えヒト化抗体は、既報（例、特表平4-506458号公報及び特開昭62-296890号公報）に従って作製できる。詳細には、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、少なくとも１つのマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子に対応する少なくとも１つのマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離し、またヒトイムノグロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ鎖遺伝子と、マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離する。単離した該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＨ鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに導入し、同様に該マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＬ鎖遺伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクターに導入する。又は、該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＨ鎖遺伝子とマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＬ鎖遺伝子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入することもできる。このようにして作製された発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりヒト化抗体産生細胞を得、該細胞を培養することにより培養上清中から目的のヒト化抗体を得ることができる。
ヒト抗体は、イムノグロブリンを構成するＨ鎖及びＬ鎖の可変領域及び定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体を意味する。
ヒト抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、ヒト抗体は、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、既報（Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; 特表平4-504365号公報；国際出願公開WO94/25585号公報；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; 及び特表平6-500233号公報）に従って作製できる。
本発明の抗体はまた、前述の本発明の抗体（例、モノクローナル抗体）の一部であり得る。このような抗体としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ断片、単鎖抗体が挙げられる。
本発明の抗体は、本発明の部分ペプチドに対応する領域を介して、本発明のポリペプチド、既知ポリペプチド、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に特異的に結合し得る。従って、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体、既知ポリペプチドに特異的な抗体、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に共通する抗体であり得る。このような特異的な抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの特異的な部分ペプチド、既知ポリペプチドの特異的な部分ペプチド、又は本発明の共通部分ペプチドを、抗原として用いることにより作製できる。
２．５．発現ベクター
本発明は、上述の物質の発現ベクターを提供する。
本発明の発現ベクターは、発現されるべき目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は発現されるべき目的ポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。「プロモーターがポリヌクレオチドに機能可能に連結されている」とは、プロモーターが、その制御下にあるポリヌクレオチド自体の発現又はポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現を可能とするように、該遺伝子をコードするポリヌクレオチドに結合していることを意味する。
本発明の発現ベクターのバックボーン（backbone）としては、所定の細胞で目的の物質を産生できるものであれば特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。発現ベクターを医薬として用いる場合、哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
宿主細胞として原核生物細胞を用いる場合、原核生物細胞を宿主細胞として利用可能な発現ベクターが用いられ得る。このような発現ベクターは、例えば、プロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明のポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、終止コドン、ターミネーター領域、複製起点等のエレメントを含み得る。細菌中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーター−オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター及びShine-Dalgarno (SD) 配列を含むものである。これらのエレメントについては、自体公知のものを用いることができる。
また、宿主細胞として真核生物細胞を用いる場合、真核生物細胞を宿主細胞として利用可能な発現ベクターが用いられ得る。この場合、使用されるプロモーターは、哺乳動物等の真核生物で機能し得るものであれば特に制限されない。ポリペプチドの発現を目的とする場合、このようなプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。ポリヌクレオチドの発現を目的とする場合、プロモーターは、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）であり得る。
本発明の発現ベクターはさらに、転写開始及び転写終結のための部位、及び転写領域において翻訳に必要とされ得るリボソーム結合部位、複製起点並びに選択マーカー遺伝子（例、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール）などを含み得る。本発明の発現ベクターは、自体公知の方法により作製できる（例、Molecular Cloning, 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989）参照)。
３．組成物
本発明は、上述の物質を含む組成物を提供する。
本発明の組成物は、上述の物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与（例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明の組成物の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇである。
本発明の組成物は、本発明のポリペプチドの発現又は機能の調節（例、促進又は抑制）を可能とする。本発明の組成物は、例えば、医薬（例、上述したような疾患の予防又は治療薬）、試薬又は食品として有用であり得る。
４．細胞
本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の部分ペプチドを産生する形質転換体、本発明の抗体の産生細胞、及び本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現又は機能が調節された細胞を提供する。
４．１．形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明のポリペプチド又は本発明の部分ペプチドを発現する、本発明の発現ベクターで形質転換された細胞であり得る。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、発現ベクターに適合し、目的のポリヌクレオチド又はポリペプチド等を発現し得るものであれば特に限定されず、例えば、初代培養細胞又は細胞株が挙げられる。詳細には、このような宿主細胞としては、例えば、大腸菌、バチルス属菌（例、枯草菌）、放線菌等の原核生物細胞、並びに酵母、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞（例、上述の哺乳動物に由来する細胞：例、ＣＨＯ細胞）等の真核生物細胞が挙げられる。本発明の形質転換体は、自体公知の方法により作製できる（例、Molecular Cloning, 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989）参照)。
形質転換体の培養は、自体公知の方法により液体培地等の栄養培地中で行われ得る。培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが挙げられ、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機又は有機物質が挙げられ、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類などを添加してもよい。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のポリペプチドが大量に生産されるように適宜選択される。培養温度は、例えば３０〜３７℃である。
４．２．抗体産生細胞
本発明の抗体の産生細胞は、本発明の抗体を産生する任意の細胞であり得る。本発明の抗体産生細胞としては、上述のハイブリドーマ、及び上述の抗体の発現ベクターが導入された形質転換細胞が挙げられる。本発明の抗体産生細胞が形質転換細胞である場合、形質転換細胞の作製に用いられる発現ベクター及び宿主細胞、並びに細胞培養等の詳細は、上述と同様であり得る。
４．３．本発明のポリペプチドの発現又は機能が調節された細胞
本発明は、本発明のポリペプチドの発現又は機能が調節された細胞を提供する。
本発明の細胞は、単離及び／又は精製されたものであり得る。本発明の細胞は、上述の組織に由来する細胞、又は上述の種類の細胞であり得る。本発明の細胞は、上述の哺乳動物に由来し得る。本発明の細胞は、初代培養細胞又は細胞株、あるいは正常細胞、又は上述の疾患を有する哺乳動物に由来する細胞であり得る。本発明の細胞は、本発明のポリペプチドの発現又は機能が特異的に調節された細胞であり得る。本発明の細胞は、本発明のポリペプチドの発現又は機能の調節（例、促進、抑制）により、神経細胞に関連する作用、又は神経細胞に関連する表現型が変化し得る。本発明の細胞は、本発明のポリペプチドの発現が一過的に調節された細胞、又は当該発現が恒常的に調節された細胞（例、ホモ接合性又はヘテロ接合性欠損細胞）であり得る。本発明の細胞はまた、形質転換体又は非形質転換体であり得る。
本発明の細胞は、例えば、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリペプチドの発現又は機能を調節し得る上述の物質（例、本発明のポリペプチド、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸、抗体、又はこれらの発現ベクター）で細胞を処理することにより作製できる。本発明の細胞はまた、後述の遺伝子導入動物又は遺伝子欠損（いわゆるノックアウト）動物から細胞を単離及び／又は精製することにより作製できる。
本発明のポリペプチドの発現又は機能が調節された細胞は、例えば、医薬（例、上述したような疾患の予防又は治療薬）、試薬又は食品の開発、脳・神経に特異的あるいは神経細胞分化に特異的なさらなるマーカー遺伝子の同定、及び神経細胞の分化に関連する機構の解析に有用であり得る。これらは、例えば、マイクロアレイ、プロテインチップ（例、抗体チップ、又はサイファージェン社製チップ等の非抗体チップ）等を用いて本発明の細胞における発現プロファイルを測定し、対照細胞の発現プロファイルと比較することを含む、発現プロファイル解析により行われ得る。本発明の細胞はまた、上述したような疾患のモデル細胞として有用であり得る。
５．動物
本発明は、本発明のポリペプチドの発現又は機能が調節された動物を提供する。
本発明の動物は、ゲノムの改変を伴う、又は伴わない動物であり得る。本発明の動物の種は、例えば、上述の非ヒト哺乳動物と同様であり得る。
一実施形態では、本発明の動物は、ゲノムの改変を伴う遺伝子導入動物であり得る。本発明の遺伝子導入動物は、本発明のポリペプチドを発現し得る。本発明の遺伝子導入動物はまた、本発明のポリペプチドを上述の細胞又は組織特異的に発現し得る。
本発明の遺伝子導入動物は、自体公知の方法により作製できる。より詳細には、本発明の遺伝子導入動物は、例えば、発生の初期段階において、動物の受精卵又はその他の細胞（例、未受精卵、***又はそれらの前駆細胞）に、所定のプロモーター（例、上述の細胞又は組織に非特異的又は特異的なプロモーター）に機能可能に連結された本発明のポリヌクレオチド（例、本発明の発現ベクターの形態でもよい）を導入することにより作製できる。遺伝子の導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、リン酸カルシウム共沈殿法、マイクロインジェクション法が挙げられる。本発明の遺伝子導入動物はまた、このように作製された動物と同種の他の動物（例、上述したような疾患のモデル動物）との交配により作製される動物であってもよい。
別の実施形態では、本発明の動物は、ゲノムの改変を伴う遺伝子欠損動物であり得る。本発明の遺伝子欠損動物は、本発明のポリペプチドを発現し得ない。本発明の遺伝子欠損動物はまた、本発明のポリペプチドを上述の細胞又は組織特異的に発現し得ない。
本発明の遺伝子欠損動物は、自体公知の方法により作製できる。より詳細には、本発明の遺伝子欠損動物は、脳・神経特異的遺伝子を特異的に欠損する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いて作製され得る。このようなＥＳ細胞は、例えば、所定のターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、該ターゲティングベクターが導入されたＥＳ細胞から、相同組換えを生じたＥＳ細胞を選別することにより作製できる。
ターゲティングベクターとしては、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの特異的な発現不全を引き起こすような相同組換えを誘導し得るターゲティングベクターが用いられ得る。このようなターゲティングベクターは、脳・神経特異的遺伝子に相同又は特異的に相同な第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチド（該ポリヌクレオチドのうち少なくとも一方は、脳・神経特異的遺伝子のスプライシングドナーシグナルを含み、かつ該シグナルにおいて、少なくとも１つのアイソフォームを生じるスプライシングを不能とするような変異を含む）、並びに必要に応じて選択マーカーを含む。脳・神経特異的遺伝子のスプライシングドナーシグナル、及び該シグナルにおける少なくとも１つのアイソフォームを生じるスプライシングを不能とするような変異は、当業者であれば、容易に決定することができる。第一及び第二のポリヌクレオチドは、脳・神経特異的遺伝子に関連するゲノムＤＮＡに対して、相同組換えを生じるのに十分な程度の配列同一性及び長さを有するポリヌクレオチドである。第一及び第二のポリヌクレオチドは、特定のアイソフォームの特異的な欠損がもたらされるように選択される。選択マーカーとしては、ポジティブ選択マーカー（例、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＢＰＨ）遺伝子、ブラスティシジンＳデアミナーゼ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子）、ネガティブ選択マーカー（例、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴＡ）遺伝子）などが挙げられる。ターゲティングベクターは、ポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカーのいずれか一方、又は両方を含むことができる。ターゲティングベクターはまた、２以上のリコンビナーゼ標的配列（例、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムで用いられるｌｏｘＰ配列、酵母由来のＦＬＰ／ＦＲＴシステムで用いられるＦＲＴ配列）を含んでいてもよい。本発明はまた、このようなターゲティングベクターを提供する。
ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する方法としては、自体公知の方法が用いられ得る。このような方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法／リポソーム法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。ターゲティングベクターが細胞中に導入されると、当該細胞中で脳・神経特異的遺伝子に関連するゲノムＤＮＡの相同組換えが生じる。ＥＳ細胞は、任意の動物の胚盤胞から分離した内部細胞塊をフィーダー細胞上で培養することにより樹立してもよいが、既存のＥＳ細胞を利用してもよい。
相同組換えが生じたＥＳ細胞を選別するため、ターゲティングベクター導入後の細胞がスクリーニングされる。例えば、ポジティブ選別、ネガティブ選別等により選別を行った後に、遺伝子型に基づくスクリーニング（例えば、ＰＣＲ法、サザンブロットハイブリダイゼーション法）を行う。また、得られたＥＳ細胞の核型分析をさらに行うことも好ましい。核型分析では、選別されたＥＳ細胞において染色体異常がないことが確認される。核型分析は、自体公知の方法により行うことができる。なお、ＥＳ細胞の核型は、ターゲティングベクターの導入前に予め確認しておくことが好ましい。
本発明の遺伝子欠損動物は、上記のように得られたＥＳ細胞を胚に導入することにより得られたキメラ胚を動物に移植し、次いで、得られたキメラ動物を交配させることにより作製できる。胚としては、例えば胚盤胞、８細胞期胚などが挙げられる。胚はホルモン剤（例えばＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧ及びＬＨ作用を有するｈＣＧを使用）等により過***処理を施した雌動物を、雄動物と交配させること等により得ることができる。ＥＳ細胞を胚に導入する方法としては、マイクロマニピュレーション法、凝集法などが挙げられる。
キメラ胚が移植される動物は好ましくは偽妊娠動物である。偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮等により去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。キメラ胚が導入された動物は、妊娠し、キメラ動物を出産する。次いで、出生した動物がキメラ動物か否かが確認される。出生した動物がキメラ動物であるか否かは自体公知の方法により確認でき、例えば、体色や被毛色で判別できる。また、判別のために、体の一部からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行ってもよい。交配は好ましくは、野生型動物とキメラ動物との間で、又はキメラ動物同士で行われ得る。脳・神経特異的遺伝子の欠損が、キメラ動物の生殖系列細胞へ導入され、脳・神経特異的遺伝子を欠損するヘテロ接合体子孫が得られたか否かは、自体公知の方法により種々の形質を指標として確認でき、例えば、子孫動物の体色や被毛色により判別できる。また、判別のために、体の一部からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行ってもよい。さらに、このようにして得られたヘテロ接合体同士を交配させることにより、ホモ接合体を作製できる。本発明の遺伝子欠損動物はまた、このように作製された動物と同種の他の動物（例、神経細胞の障害に基づく疾患のモデル動物、遺伝子改変動物）との交配により作製される動物であってもよい。
さらに別の実施形態では、本発明の動物は、ゲノムの改変を伴わない動物であり得る。このような動物は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリペプチドの発現又は機能を調節し得る上述の物質（例、本発明のポリペプチド、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸、抗体、又はこれらの発現ベクター）で動物を処置することにより作製できる。このような動物はまた、局所的な処置により、本発明のポリペプチドを上述の組織特異的に発現し得る動物又は発現し得ない動物であり得る。動物の処置は、本発明の組成物で言及したような方法を用いて行われ得る。
本発明の動物は、例えば、医薬（例、上述したような疾患の予防又は治療薬）、試薬又は食品の開発、脳・神経に特異的あるいは神経細胞分化に特異的なさらなるマーカー遺伝子の同定、及び神経細胞の分化に関連する機構の解析に有用であり得る。これらは、例えば、マイクロアレイ、プロテインチップ（例、抗体チップ、又はサイファージェン社製チップ等の非抗体チップ）等を用いて本発明の動物における発現プロファイル（特に神経細胞又は脳内の組織の発現プロファイル）を測定し、対照動物の発現プロファイルと比較することを含む、発現プロファイル解析により行われ得る。本発明の動物はまた、上述したような疾患のモデル動物として有用であり得る。
６．測定用手段及び測定方法
本発明は、標的ポリヌクレオチド及びポリペプチドの測定用手段（例、プライマーセット、核酸プローブ、抗体、アプタマー）及び測定方法を提供する。
６．１．プライマーセット及びその使用方法
本発明のプライマーセットは、本発明のポリヌクレオチド又は既知ポリヌクレオチドの特異的な検出及び定量、あるいは本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方の包括的な検出及び定量に使用できる。例えば、このような検出及び定量は、生体試料からの総ＲＮＡの調製後、ＰＣＲ（例、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）（例、WO00/28082参照）、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）（例、WO00/56877参照）等の遺伝子増幅法を利用して行うことができる。遺伝子増幅法の種類に応じて必要とされるプライマー数が異なるため、プライマー数は特に限定されないが、例えば、本発明のプライマーセットは、センス及びアンチセンスプライマーから構成される２以上のプライマーを含み得る。２以上のプライマーは、予め混合されていても、混合されていなくてもよい。センス及びアンチセンスプライマーはそれぞれ、標的領域を特異的に増幅し得るようなサイズである限り特に限定されないが、１２個（例えば少なくとも約１５個、好ましくは少なくとも約１８個、より好ましくは少なくとも約２０個など）の連続するヌクレオチド残基からなる。センス及びアンチセンスプライマーは、それらにより増幅されるポリヌクレオチドのサイズが視認的に検出される場合には、視認的に検出可能であるように設計され得る。視認的に検出可能なサイズは、特に限定されないが、例えば少なくとも約５０個、好ましくは少なくとも７０個、より好ましくは少なくとも約１００個、さらにより好ましくは少なくとも約１５０個、最も好ましくは少なくとも約２００個、約３００個、約４００個、約５００個又はそれ以上のヌクレオチド残基長であり得る。センス及びアンチセンスプライマーはまた、それらにより増幅されるポリヌクレオチドが視認的に検出される必要はなく、リアルタイムＰＣＲにおいて汎用されるように、蛍光シグナル等により検出されてもよい。
本発明のプライマーセットは、ａ）本発明のポリヌクレオチドを既知ポリヌクレオチドから識別可能である、本発明のポリヌクレオチドに特異的なプライマーセット（必要に応じて「特異的なプライマーセットＡ」と省略）、ｂ）既知ポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドから識別可能である、既知ポリヌクレオチドに特異的なプライマーセット（必要に応じて「特異的なプライマーセットＢ」と省略）、ｃ）本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドを互いに識別しない、本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方に共通するプライマーセット（必要に応じて「共通プライマーセット」と省略）であり得る。
本発明の特異的なプライマーセットＡは、ｉ）増幅される本発明のポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのサイズが、増幅される既知ポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのサイズと区別できるように設計されたセンス及びアンチセンスプライマー、あるいはｉｉ）本発明のポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのみが増幅され、かつ既知ポリヌクレオチドが増幅されないように設計されたセンス及びアンチセンスプライマーを含み得る。
上記ｉ）のセンス及びアンチセンスプライマーとしては、例えば、ａ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）よりも５’に存在する核酸配列に対応するセンスプライマー、及び当該核酸配列よりも３’に存在する核酸配列に相補的な核酸配列に対応するアンチセンスプライマー、あるいはｂ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）よりも５’に存在する核酸配列に対応するセンスプライマー、及び当該核酸配列よりも３’に存在する核酸配列に相補的な核酸配列に対応するアンチセンスプライマーが好ましい。
上記ｉｉ）のセンス及びアンチセンスプライマーとしては、例えば、ａ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に対応するセンスプライマー、及び所定のアンチセンスプライマー、ｂ）所定のセンスプライマー、及び上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に対応するセンスプライマー、あるいはｃ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に対応するセンス及びアンチセンスプライマーが好ましい。
本発明の特異的なプライマーセットＢは、ｉ）増幅される既知ポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのサイズが、増幅される本発明のポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのサイズと区別できるように設計されたセンス及びアンチセンスプライマー、あるいはｉｉ）既知ポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのみが増幅され、かつ本発明のポリヌクレオチドが増幅されないように設計されたセンス及びアンチセンスプライマーを含み得る。
上記ｉ）のセンス及びアンチセンスプライマーとしては、例えば、ａ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）よりも５’に存在する核酸配列に対応するセンスプライマー、及び当該核酸配列よりも３’に存在する核酸配列に相補的な核酸配列に対応するアンチセンスプライマー、あるいはｂ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）よりも５’に存在する核酸配列に対応するセンスプライマー、及び当該核酸配列よりも３’に存在する核酸配列に相補的な核酸配列に対応するアンチセンスプライマーが好ましい。
上記ｉｉ）のセンス及びアンチセンスプライマーとしては、例えば、ａ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に対応するセンスプライマー、及び所定のアンチセンスプライマー、ｂ）所定のセンスプライマー、及び上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に対応するセンスプライマー、あるいはｃ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に対応するセンス及びアンチセンスプライマーが好ましい。
本発明の共通プライマーセットは、増幅される既知ポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのサイズが、増幅される本発明のポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのサイズと同一であるように設計されたセンス及びアンチセンスプライマーを含み得る。このようなセンス及びアンチセンスプライマーとしては、例えば、増幅される本発明のポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチド、及び増幅される既知ポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドが、上記の特異的な部分ヌクレオチドＡ及びＢの核酸配列を含まないように設計されたセンス及びアンチセンスプライマーが好ましい。
６．２．核酸プローブ及びその使用方法
本発明の核酸プローブは、本発明のポリヌクレオチド又は既知ポリヌクレオチドの特異的な検出及び定量、あるいは本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方の包括的な検出及び定量に使用できる。例えば、このような検出及び定量は、生体試料からの総ＲＮＡの調製後、ノザンブロッティング、本発明の核酸プローブが固定化された核酸アレイなどを利用して行うことができる。核酸プローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸又はそれらのキメラ分子などであり得るが、安定性、簡便性等を考慮するとＤＮＡが好ましい。核酸プローブはまた、１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドのいずれでもよい。核酸プローブのサイズは、標的遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば少なくとも約１５個又は１６個、好ましくは約１５個〜約１０００個、より好ましくは約２０個〜約５００個、さらにより好ましくは約２５個〜約３００個である。本発明の核酸プローブが１本鎖ポリヌクレオチドである場合、本発明の核酸プローブは本発明のアンチセンス分子と同様であり得る。本発明の核酸プローブが２本鎖ポリヌクレオチドである場合、本発明の核酸プローブは、本発明のアンチセンス分子及びそれに相補的なポリヌクレオチド分子から構成され得る。
本発明の核酸プローブは、ａ）本発明のポリヌクレオチドを既知ポリヌクレオチドから識別可能である、本発明のポリヌクレオチドに特異的な核酸プローブ（必要に応じて「特異的な核酸プローブＡ」と省略）、ｂ）既知ポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドから識別可能である、既知ポリヌクレオチドに特異的な核酸プローブ（必要に応じて「特異的な核酸プローブＢ」と省略）、ｃ）本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドを互いに識別しない、本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方に共通する核酸プローブ（必要に応じて「共通核酸プローブ」と省略）であり得る。
本発明の特異的な核酸プローブＡは、上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド（一本鎖ポリヌクレオチド）、又は上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）及び当該核酸配列に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド（二本鎖ポリヌクレオチド）であり得る。
本発明の特異的な核酸プローブＢは、上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド（一本鎖ポリヌクレオチド）、又は上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）及び当該核酸配列に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド（二本鎖ポリヌクレオチド）であり得る。
本発明の共通核酸プローブは、上記の共通部分ヌクレオチドの核酸配列に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド（一本鎖ポリヌクレオチド）、又は上記の共通部分ヌクレオチドの核酸配列及び当該核酸配列に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド（二本鎖ポリヌクレオチド）であり得る。
本発明の核酸プローブは、支持体上に固定された形態で（即ち、アレイとして）提供されてもよい。このような核酸アレイの支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、メンブレン（例えば、ナイロン膜）、ガラス、プラスチック、金属、プレートなどが挙げられる。本発明における核酸アレイの形態としては、自体公知の形態を用いることができ、例えば、支持体上で核酸が直接合成されるアレイ（いわゆるアフィメトリクス方式）、支持体上に核酸が固定化されるアレイ（いわゆるスタンフォード方式）、繊維型アレイ、電気化学的アレイ（ＥＣＡ）が挙げられる。
６．３．抗体及びアプタマー並びにその使用方法
本発明の抗体及びアプタマーは、本発明のポリペプチド、既知ポリペプチド、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の特異的な検出及び定量に使用できる。例えば、このような検出及び定量は、生体試料からの抽出液の調製後、又は生体試料を用いて、免疫学的手法により又は親和性を利用した方法により行なうことができる。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法が挙げられる。親和性を利用した方法は、上述の免疫学的手法に準じて行うことができる。本発明のポリペプチド、既知ポリペプチド、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の測定に用いられる抗体及びアプタマーは、上述の本発明の抗体及びアプタマーと同様であり得る。
本発明の抗体及びアプタマーは、ａ）本発明のポリペプチドを既知ポリペプチドから識別可能である、本発明のポリペプチドに特異的な抗体及びアプタマー（必要に応じて「特異的な抗体及びアプタマーＡ」と省略）、ｂ）既知ポリペプチドを本発明のポリペプチドから識別可能である、既知ポリペプチドに特異的な抗体及びアプタマー（必要に応じて「特異的な抗体及びアプタマーＢ」と省略）、ｃ）本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドを互いに識別しない、本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に共通する抗体及びアプタマー（必要に応じて「共通抗体及びアプタマー」と省略）であり得る。本発明の特異的な抗体及びアプタマーＡは、上記の特異的な部分ペプチドＡ（特に本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列からなる部分ペプチド）に結合し得る。本発明の特異的な抗体及びアプタマーＢは、上記の特異的な部分ペプチドＢ（特に既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列からなる部分ペプチド）に結合し得る。本発明の共通抗体及びアプタマーは、上記の共通部分ペプチドに結合し得る。
本発明の抗体及びアプタマーは、支持体上に固定された形態で（即ち、アレイとして）提供されてもよい。このような核酸アレイの支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチック、金属、プレート（例、マルチウェルプレート）が挙げられる。
６．４．本発明の測定用手段についての補足事項
本発明の測定用手段は、必要に応じて、標識用物質で標識された形態で提供され得る。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。
本発明の測定用手段は、測定用手段に加え、さらなる構成要素を含むキットの形態で提供されてもよい。この場合、キットに含まれる各構成要素は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器に格納された形態で提供され得る。例えば、測定用手段が標識用物質で標識されていない場合、このようなキットは、標識用物質をさらに含み得る。本発明のキットは、２以上の標的遺伝子（例、脳・神経特異的遺伝子と既知遺伝子との組合せ、２以上の脳・神経特異的遺伝子の組合せ）に対する２以上の測定用手段を含み得る。また、本発明の測定用手段がアレイの形態で提供される場合、本発明のアレイは、２以上の標的遺伝子に対する２以上の測定用手段が固定されたものであり得る。本発明のキット及びアレイはまた、ハウスキーピング遺伝子（例、ＧＡＰＤＨ、β-アクチン）について上述したような測定用手段を含み得る。
６．５．本発明の測定方法
本発明はまた、本発明の測定用手段を用いた、標的ポリペプチド又はポリヌクレオチドの検出又は定量方法を提供する。
標的ポリヌクレオチド及びポリペプチドの測定は、上述の方法により、測定用手段の種類に応じて適切に行われ得る。
本発明の方法では、上述の哺乳動物（例、ヒト）から得られた生体試料、あるいは培養物（例、細胞又は組織培養物）における標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現量が測定され得る。生体試料としては、例えば、標的ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの発現細胞又は組織を含む試料、あるいは標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドが分泌又は漏出等される場合には、このような分泌又は漏出等されたポリヌクレオチド又はポリペプチドを含む動物由来試料（例、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、涙液、尿）である限り特に限定されない。生体試料はまた、上述の細胞又は組織（例、神経細胞又は脳内の組織）を含むものであり得る。本発明で用いられる生体試料は、特に断らない限り、哺乳動物から予め採取された生体試料であり得るが、特定の局面では、本発明の方法は、哺乳動物から生体試料を採取することを含み得る。
一実施形態では、本発明の方法は、神経細胞の同定、神経細胞の分化状態の判定、神経細胞の障害に基づく疾患に対する診断（例、発症又は発症可能性の判定）に利用できる。このような方法は、動物から採取した生体試料において標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現量を測定し、測定された発現量又は相対的な発現比率に基づき対象疾患の発症又は発症可能性を評価することを含み得る。例えば、測定された発現量又は相対的な発現比率が、対象疾患に罹患していない哺乳動物（例、正常動物）における発現量と比較される。対象疾患に罹患していない哺乳動物における発現量又は発現比率は、自体公知の方法により決定できる。このような比較により、動物が対象疾患に罹患している可能性があるか否か、あるいは将来的に罹患する可能性が高いか低いかが判断される。特定の疾患を発症した哺乳動物では、当該疾患に関連する遺伝子の発現の変化がしばしば観察されることが知られている。また、特定の疾患の発症前に、特定の遺伝子の発現の変化がしばしば観察されることが知られている。従って、このような解析により、対象疾患の発症又は発症可能性を判断することが可能である。このような方法は、例えば、対象疾患の簡便な判定及び早期の発見に有用であり得る。当然のことながら、本発明の測定用手段及び本発明の試薬又はキットもまた、このような判定に利用され得る。
詳細には、神経細胞又は脳内の組織における脳・神経特異的遺伝子１〜１０の発現プロファイルの変化は、実施例に記載の通りである。従って、本発明のポリヌクレオチド及び本発明の部分ヌクレオチド（例、本発明の特異的な部分ヌクレオチドＡ、本発明の特異的な部分ヌクレオチドＢ、本発明の共通部分ヌクレオチド）、並びに本発明のポリペプチド及び本発明の部分ペプチド（例、本発明の特異的な部分ペプチドＡ、本発明の特異的な部分ペプチドＢ、本発明の共通部分ペプチド）の特異的な測定を可能にする本発明の測定用手段を用いて、脳・神経特異的遺伝子１〜１０の発現の程度及び／又はそれらの相対的な発現比率を評価することにより、神経細胞の同定、神経細胞の分化状態の判定、あるいは神経細胞の障害に基づく疾患に対する診断が可能である。
別の実施形態では、本発明の方法は、医薬、試薬又は食品等のスクリーニングに利用できる。例えば、一方法論では、スクリーニング方法は、被験物質が神経細胞数を調節（例、増加、減少）し得るか否かを評価することを含み得る。神経細胞数と脳・神経特異的遺伝子の発現量は相関し得るので、脳・神経特異的遺伝子の発現量を測定することにより、このようなスクリーニングを行うことができる。別の方法論では、スクリーニング方法は、被験物質が標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含み得る。このようなスクリーニング方法は、例えば、標的の発現又は機能を調節し得る被験物質を選択することを含む、所定の疾患（例、神経細胞の障害に基づく疾患）に対して有効な医薬等のスクリーニング方法、並びに標的の発現又は機能を調節し得ない被験物質を選択することを含む、所定の作用（例、神経細胞の分化調節作用等の副作用）が低減した医薬等のスクリーニング方法として利用できる。スクリーニング方法に供される被験物は、公知又は新規の化合物又は組成物であり得、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分、既存の医薬、試薬又は食品等が挙げられる。スクリーニング方法では、上述したような哺乳動物、細胞及び組織（例、神経細胞及び脳内の組織）、あるいは再構成系（非細胞系）が用いられ得る。スクリーニング方法により得られる医薬等もまた、本発明により提供される。
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
実施例１：ヒトcDNAライブラリー作製と配列解析
（１）改良オリゴキャップ法によるcDNAライブラリーの作製と配列解析
１）mRNA抽出と購入
ヒト組織（下記に示す）より、文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989）記載の方法により全RNAとしてmRNAを抽出した。また、ヒト培養細胞やヒト初代培養細胞（下記に示す）をカタログ記載の方法で培養後、文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989）記載の方法により全RNAとしてmRNAを抽出した。
以下にライブラリー名とその由来の関係を、「ライブラリー名：由来」の順に示した。サブトラクションしたものについては、サブトラクトライブラリーの作り方も示した。
＜ヒト組織よりmRNA抽出＞
NTONG：正常舌(Tongue)；CTONG：舌癌(Tongue, Tumor)；FCBBF：胎児脳(Brain, Fetal)；OCBBF：胎児脳(Brain, Fetal)；PLACE：胎盤(Placenta)；SYNOV：滑膜組織(Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis)；CORDB：臍帯血(Cord blood)。
＜培養細胞よりmRNA抽出＞
BNGH4：H4細胞(ATCC #HTB-148)；IMR32：IMR32細胞(ATCC #CCL-127)；SKNMC：SK-N-MC細胞(ATCC #HTB-10)；3NB69：NB69細胞(RCB #RCB0480)；BGGI1：GI1細胞(RCB #RCB0763)；NB9N4：NB9細胞(RCB #RCB0477)；SKNSH：SK-N-SH細胞(RCB #RCB0426)；AHMSC：HMSC細胞(間葉細胞, Human mesenchymal cell)；CHONS：軟骨細胞(Chondrocyte)；ERLTF：TF-1細胞(赤白血病細胞, erythroleukemia)；HELAC：HeLa細胞；JCMLC：白血病細胞(Leukemia, myelogenous)；MESTC：間葉系幹細胞(Mesenchyme stem cell)；N1ESE：間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell)；NCRRM：胎生期癌細胞(Embryonal carcinoma)；NCRRP：胎生期癌細胞(Embryonal carcinoma)をレチノイン酸(RA)処理誘導；T1ESE：間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell) をトリコスタチンと５アザシチジン処理誘導；NT2RM：NT2細胞(STARATAGENE #204101)；NT2RP：NT2細胞をレチノイン酸(RA)処理誘導5週間；NT2RI：NT2細胞をRA処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間；NT2NE：NT2細胞をRA処理と生育阻害剤処理により神経分化後、神経を濃縮回収(NT2 Neuron)；NTISM：NT2細胞(STARATAGENE #204101)をRA処理誘導5週間後、生育阻害剤処理を2週間したmRNAから作製したcDNAライブラリーから、未分化NT2細胞のmRNAと重複するｃDNAをSubtract Kit (Invitrogen #K4320-01)を用いてサブトラクトしたライブラリー(NT2RI−NT2RM)。RCBは、理化学研究所ジーンバンク・細胞開発銀行より分譲をうけたものであり、ATCCは、American Type Culture Collectionより分譲をうけたものである。
＜初代培養細胞よりmRNA抽出＞
ASTRO：正常神経膠星状細胞(Normal Human Astrocyte) NHA5732, 宝酒造 #CC2565；DFNES：新生児正常皮膚繊維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblasts (Neonatal Skin); NHDF-Neo) NHDF2564, 宝酒造 #CC2509；MESAN：正常メサンギウム細胞(Normal human mesangial cells) NHMC56046-2, 宝酒造 #CC2559；NHNPC：正常神経前駆細胞(Normal human neural progenitor cells) NHNP5958, 宝酒造 #CC2599；PEBLM：正常末梢血単核細胞(Human peripheral blood mononuclear cells) HPBMC5939, 宝酒造 #CC2702；HSYRA：滑膜細胞HS-RA(Human synoviocytes from rheumatioid arthritis), 東洋紡 #T404K-05；PUAEN：正常肺動脈内皮細胞(Human pulmonary artery endothelial cells), 東洋紡 #T302K-05；UMVEN：正常臍帯静脈内皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells) HUVEC, 東洋紡 #T200K-05；HCASM：正常冠動脈平滑筋細胞HCASMC(Human coronary artery smooth muscle cells), 東洋紡 #T305K-05；HCHON：正常軟骨細胞HC(Human Chondrocytes), 東洋紡 #T402K-05；HHDPC：正常頭髪毛乳頭細胞HDPC(Human dermal papilla cells), 東洋紡#THPCK-001；CD34C：CD34+細胞(AllCells, LLC #CB14435M)；D3OST：CD34+細胞を破骨細胞分化因子(ODF)処理誘導3日間；D6OST：CD34+細胞をODF処理誘導6日間；D9OST：CD34+細胞をODF処理誘導9日間；ACTVT：活性化T細胞(Activated T-cell)；LYMPB：リンパ芽球(Lymphoblast, EB virus transferred B cell)；NETRP：好中球(Neutrophil)。
次いで、以下に示すヒト組織より全RNAとして抽出されたmRNAを購入した。以下にライブラリー名とその由来の関係を、「ライブラリー名：由来」の順に示した。サブトラクションしたものについては、サブトラクトライブラリーの作り方も示した。
＜ヒト組織よりのmRNAを全RNAで購入＞
ADRGL：副腎(Adrenal gland), CLONTECH #64016-1；BRACE：小脳(Brain, cerebellum), CLONTECH #64035-1；BRAWH：全脳(Brain, whole), CLONTECH #64020-1；FEBRA：胎児脳(Brain, Fetal), CLONTECH #64019-1；FELIV：胎児肝臓(Liver, Fetal), CLONTECH #64018-1；HEART：心臓(Heart), CLONTECH #64025-1；HLUNG：肺(Lung), CLONTECH #64023-1；KIDNE：腎臓(Kidney), CLONTECH #64030-1；LIVER：肝臓(Liver), CLONTECH #64022-1；MAMGL：乳腺(Mammary Gland), CLONTECH #64037-1；PANCR：膵臓(Pancreas), CLONTECH #64031-1；PROST：前立腺(Prostate), CLONTECH #64038-1；SALGL：唾液腺(Salivary Gland), CLONTECH #64026-1；SKMUS：骨格筋(Skeletal Muscle), CLONTECH #64033-1；SMINT：小腸(Small Intestine), CLONTECH #64039-1；SPLEN：脾臓(Spleen), CLONTECH #64034-1；STOMA：胃(Stomach), CLONTECH #64090-1；TBAES：乳癌(Breast, Tumor), CLONTECH #64015-1；TCERX：子宮頸管癌(Cervix, Tumor), CLONTECH #64010-1；TCOLN：結腸癌(Colon, Tumor), CLONTECH #64014-1；TESTI：精巣(Testis), CLONTECH #64027-1；THYMU：胸腺(Thymus), CLONTECH #64028-1；TLUNG：肺癌(Lung, Tumor), CLONTECH #64013-1；TOVAR：卵巣癌(Ovary, Tumor), CLONTECH #64011-1；TRACH：気管(Trachea), CLONTECH #64091-1；TUTER：子宮癌(Uterus, Tumor), CLONTECH #64008-1；UTERU：子宮(Uterus), CLONTECH #64029-1；ADIPS：脂肪組織(Adipose), Invitrogen #D6005-01；BLADE：膀胱(Bladder), Invitrogen #D6020-01；BRALZ：アルツハイマー患者大脳皮質(Brain, cortex, Alzheimer), Invitrogen #D6830-01；CERVX：子宮頸管(Cervix), Invitrogen #D6047-01；COLON：結腸(Colon), Invitrogen #D6050-0；NESOP：食道(Esophagus), Invitrogen #D6060-01；PERIC：心膜(Pericardium), Invitrogen #D6105-01；RECTM：直腸(Rectum), Invitrogen #D6110-01；TESOP：食道癌(Esophageal, Tumor), Invitrogen #D6860-01；TKIDN：腎臓癌(Kidney, Tumor), Invitrogen #D6870-01；TLIVE：肝臓癌(Liver, Tumor), Invitrogen #D6880-01；TSTOM：胃癌(Stomach, Tumor), Invitrogen #D6920-01；BEAST：成人***(Adult Breast), STARATAGENE #735044；FEHRT：胎児心臓(Heart, Fetal), STARATAGENE #738012；FEKID：胎児腎臓(Kidney, Fetal), STARATAGENE #738014；FELNG：胎児肺(Lung, Fetal), STARATAGENE #738020；NOVAR：成人卵巣(Adult Ovary), STARATAGENE #735260；BRASW：アルツハイマー患者大脳皮質組織［BRALZ：アルツハイマー患者大脳皮質(Brain, cortex, Alzheimer), Invitrogen #D6830-01］のmRNAから作製したcDNAライブラリーから、全脳組織［BRAWH：全脳(Brain, whole), CLONTECH #64020-1］のmRNAと重複するｃDNAをSubtract Kit (Invitrogen #K4320-01)を用いてサブトラクトしたライブラリー(BRALZ−BRAWH)。
さらに、次に示すヒト組織よりポリA(+) RNAとして抽出・精製されたmRNAを購入した。各組織由来のポリA(+) RNAに、ポリA(-)RNAを混ぜたRNAからcDNAライブラリーを作製した。ポリA(-)RNAは、全脳(Brain, whole), CLONTECH #64020-1の全RNAからポリA(+)RNAをオリゴdTセルロースで除くことにより調製した。以下にライブラリー名とその由来の関係を、「ライブラリー名：由来」の順に示した。
＜ヒト組織よりのmRNAをポリA(+) RNAで購入＞
BRAMY：扁桃(Brain, amygdala), CLONTECH #6574-1；BRCAN：尾状核(Brain, caudate nucleus), CLONTECH #6575-1；BRCOC：脳梁(Brain, corpus callosum), CLONTECH #6577-1；BRHIP：海馬(Brain, hippocampus), CLONTECH #6578-1；BRSSN：黒質(Brain, substantia nigra), CLONTECH #6580-1；BRSTN：視床下核(Brain, subthalamic nucleus), CLONTECH #6581-1；BRTHA：視床(Brain, thalamus), CLONTECH #6582-1。
２）改良オリゴキャップ法によるcDNAライブラリーの作製
それぞれのRNAよりオリゴキャプ法 [M. Maruyama and S. Sugano, Gene, 138: 171-174 (1994)] を改良した方法 (WO 01/04286) によりcDNAライブラリーを作製した。Oligo-cap linker（配列番号：１）及びOligo dT primer（配列番号：２）を用いて、WO 01/04286に記載したようにBAP（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理、TAP（Tobacco Acid Pyrophosphatase）処理、RNAライゲーション、第一鎖cDNAの合成とRNAの除去を行った。次いで、5'（配列番号：３）と3'（配列番号：４）のPCRプライマーを用いPCR (polymerase chain reaction)により2本鎖cDNAに変換し、SfiIで切断した。次いで、通常は2kb以上（場合によっては3kb以上）に分画したcDNA断片をDraIIIで切断したベクターpME18SFL3（GenBank AB009864, Expression vector）にcDNAの方向性を決めてクローニングし、cDNAライブラリーを作製した。
cDNAの５’-末端配列解析に用いたcDNAライブラリー名とその由来の関係を表1-1〜1-6に示した。また、ヒトゲノムにマップ後の各cDNAライブラリーのcDNAの５’-末端配列数も表１に示した。
３）改良オリゴキャップ法で作製したcDNAライブラリーからのｃDNAの5'-末端配列解析
各cDNAライブラリーより取得したcDNAの5'-末端の核酸配列をDNAシーケンシング試薬（BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、DNAシーケンサー（ABI PRISM 3700, PE Biosystems社製）で解析した。得られたデータについてはデータベース化を行った。改良オリゴキャップ法で作製した各cDNAライブラリーの5'-末端の全長率は、平均９０％で高全長率であった（既知mRNAのタンパク質コード領域を指標にして算出した）。
４）全長cDNA核酸配列解析
全長cDNA核酸配列解析に選抜されたcDNAについて各々全長cDNAの核酸配列を決定した。核酸配列は、主にカスタム合成DNAプライマーを用いたダイデオキシターミネーター法によるプライマーウォーキング法によって決定した。すなわち、カスタム合成DNAプライマーを用い、PE Biosystem社製のDNAシーケンシング試薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応後、同社製のシーケンサーを用いてDNA核酸配列を解析した。全長核酸配列は上記方法により決定された部分核酸配列を完全にオーバーラップさせ最終的に確定した。次に、決定された全長cDNA核酸配列から、タンパク質への翻訳領域を推定しアミノ酸配列を求めた。
（２）オリゴキャップ法によるcDNAライブラリーの作製と配列解析
１）オリゴキャップ法によるcDNAライブラリーの作製
ヒト胎児精巣由来のテラトカルシノーマ細胞でレチノイン酸処理により神経細胞に分化可能なNT-2神経前駆細胞（Stratagene社より購入）を、添付のマニュアルにしたがって次のように処理したものを用いた。
・NT-2細胞をレチノイン酸で誘導しないで培養（NT2RM）
・NT-2細胞を培養後、レチノイン酸を添加して誘導後、2日間及び2週間培養（NT2RP）
また、ヒト培養細胞SK-N-MC（ATCC HTB-10）（SKNMC）、ヒト培養細胞Y79 （ATCC HTB-18）（Y79AA）、ヒト培養細胞GI1(RCB RCB0763)（BGGI1）、ヒト培養細胞H4(ATCC HTB-148)（BNGH4）、ヒト培養細胞IMR32(ATCC CCL-127)（IMR32）、ヒト培養細胞NB9(RCB #RCB0477)（NB9N4）をカタログ記載の方法で培養した。RCBは、理化学研究所ジーンバンク・細胞開発銀行より分譲をうけたものであり、ATCCは、American Type Culture Collectionより分譲をうけたものである。
以上の培養細胞をそれぞれ集めて、文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press 1989）記載の方法によりmRNAを抽出した。さらに、オリゴdTセルロースでpoly(A)+ RNAを精製した。
同様に、ヒト胎盤組織（PLACE）、ヒト卵巣癌組織（OVARC）、ヒト10週令胎児より頭部を多く含む組織（HEMBA）、ヒト10週令胎児より胴体部分を多く含む組織（HEMBB）、ヒト乳腺組織（MAMMA）、ヒト甲状腺組織（THYRO）、ヒト血管内皮組織の初代培養細胞（VESEN）より、文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989）記載の方法によりmRNAを抽出した。さらに、オリゴdTセルロースでpoly(A)+ RNAを精製した。
以上の全てのpoly(A)+ RNAよりオリゴキャプ法 [M. Maruyama and S. Sugano, Gene, 138: 171-174 (1994)] により、それぞれcDNAライブラリーを作製した。Oligo-cap linker（配列番号：１）及びOligo dT primer（配列番号：２）を用いて文献 [鈴木・菅野, 蛋白質 核酸 酵素, 41: 197-201 (1996)、 Y. Suzuki et al., Gene, 200: 149-156 (1997)] に書いてあるようにBAP（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理、TAP（Tobacco Acid Phosphatase）処理、RNAライゲーション、第一鎖cDNAの合成とRNAの除去を行った。次いで、5'（配列番号：３）と3'（配列番号：４）のPCRプライマーを用いPCR (polymerase chain reaction)により2本鎖cDNAに変換し、SfiI切断した。次いで、DraIIIで切断したベクターpUC19FL3（NT2RMとNT2RPの一部のみ）又はpME18SFL3（GenBank AB009864, Expression vector）にcDNAの方向性を決めてクローニングし、cDNAライブラリーを作製した。
cDNAの５’-末端配列解析に用いたcDNAライブラリー名とその由来の関係を表1-1〜1-6に示す。また、ヒトゲノムにマップ後の各cDNAライブラリーのcDNAの５’-末端配列数も表1-1〜1-6に示す。
Figure 0005378202
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 ２）オリゴキャップ法で作製したcDNAライブラリーからのcDNAの5'-末端配列解析
各cDNAライブラリーより取得したcDNAの5’-端又は3'-端の核酸配列をDNAシーケンシング試薬（Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit又はBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、DNAシーケンサー（ABI PRISM 377, PE Biosystems社製）でDNA核酸配列を解析した。得られたデータをデータベース化した。オリゴキャップ法で作製した各cDNAライブラリーの5'-末端の全長率は、平均６０％であった（既知mRNAのタンパク質コード領域を指標にして算出した）。
３）全長cDNA核酸配列解析
全長cDNA核酸配列解析に選抜されたcDNAについて各々全長cDNAの核酸配列を決定した。核酸配列は、主にカスタム合成DNAプライマーを用いたダイデオキシターミネーター法によるプライマーウォーキング法によって決定した。すなわち、カスタム合成DNAプライマーを用い、PE Biosystem社製のDNAシーケンシング試薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応後、同社製のシーケンサーを用いてDNA核酸配列を解析した。一部のクローンについては、Licor社製DNAシーケンサーも利用した。また、一部のｃDNAについてはカスタムプライマーを用いずcDNAが含まれるプラスミドをランダムに切断するショットガン法を用いて同様にDNAシーケンサーでDNA核酸配列を決定した。全長核酸配列は上記方法により決定された部分核酸配列を完全にオーバーラップさせ最終的に確定した。次に、決定された全長核酸配列から、タンパク質への翻訳領域を推定しアミノ酸配列を求めた。
実施例２：ゲノムマッピングとクラスタリング
（１）配列データセット
以下の配列をデータセットとして使用した。
・ヒトゲノム配列：UCSC hg 17 (NCBI Build 35)（http://www.genome.ucsc.edu/）
・我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったヒト全長cDNA 19,265配列
・我々が取得し全長cDNA配列解析を行い既存の公共データベース（DDBJ / GenBank / EMBL）に登録済みのヒト全長cDNA配列（アクセッション番号: AB038269, AB045981, AB056476, AB056477, AK000001〜AK002212, AK021413〜AK027260, AK027263〜AK027902, AK054561〜AK058202, AK074029〜AK074481, AK074483〜AK075325, AK075326〜AK075566, AK090395〜AK098842, AK122580〜AK129030, AK129488〜AK131107, AK131190〜AK131575, AK160364〜AK160386, AK172724〜AK172740, AK172741〜AK172866）のうちゲノムマッピングに使用可能な30,754配列
・2005年2月3日までに財団法人かずさDNA研究所のデータベースHUGEに登録されていた2039配列(http://www.kazusa.or.jp/huge/)
・2005年1月30日までにMammalian Gene Collection (http://mgc.nci.nih.gov/) のWebページのFull Length Clone Listに記載され、かつGenBank gbpri (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/) に含まれていたヒト全長cDNA 20,878配列
・2005年1月30日までのGenBank gbpriにDeutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)として登録のあったヒト全長cDNA 9,280配列
・2005年1月31日版のヒトRefSeq配列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/）の構成配列でmRNAとして登録され、かつGenBank gbpri に含まれていたヒト全長cDNA 13,984配列
・2005年1月31日版のヒトRefSeq配列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/）28,931配列
・2005年2月10日のEnsembl（http://www.ensembl.org/）のヒトゲノムアセンブル配列（NCBI35.nov_26.35）のうち、UCSC（University of California, Santa Cruz, http://www.genome.ucsc.edu/）にてhg 17ヒトゲノムへマッピング済みであった NCBI35.nov_26.35の33,666配列
・我々のプロジェクトにおいて配列解析を行ったヒトcDNA 5'末端配列 1,456,213配列、及び 3'末端配列 109,283配列 (うち公開済み配列アクセッション番号：AU116788〜AU160826, AU279383〜AU280837, DA000001〜DA999999, DB000001〜DB384947)
（２）ゲノムマッピング
上記データセットをBLASTN（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）を用いて相同性（Identity） 95%以上、コンセンサス長50塩基対（bp）以上の条件下でゲノムマッピングを行った。マッピングに使用したデータセットの約99％の配列がゲノムマッピングできた。
（３）クラスタリング
ゲノムマッピング後、ゲノム領域に含まれる配列群を1つの固まりとしてクラスターを形成させた。つまり、各クラスターは、配列群の各ゲノム領域の両端の外側が各ゲノム領域にマップされた配列に重なりがなくなるように選択されたものである。その結果、全部で 87,173クラスター存在した。そこから我々のプロジェクトにおいて取得し配列解析を行ったヒトcDNA 3'末端配列のみによって構成される17,535クラスターを除外すると、69,638クラスターとなった。このうち、36,782クラスターは、我々のプロジェクトにおいて取得し配列解析を行ったヒトcDNA 5'末端配列のみによって構成されていたので除外した（全長cDNA、RefSeq、Ensembl配列が存在しないものは除外した）。この結果、全長cDNA、RefSeq、Ensembl配列を1つでも含むクラスターは、32,856クラスターであった。そのうち一定水準以上の信頼性のあるORF（open reading frame, 翻訳領域）が予測される全長cDNA、RefSeq、Ensembl配列を1本以上含むクラスターを選択することにより、21,703クラスターを取得した。この21,703クラスターについて発現特異性判別を行った。
実施例３：リアルタイムPCRの実験方法
（１）鋳型 （Template） cDNAの合成
１）ヒトmRNA（Human Total RNA）を鋳型に用いた場合
Human Total RNA 50μgに対して150μlの系にて反応を行った。
87μlのH2Oに溶解した50μg のTotal RNAに10μlのランダムプライマー（濃度65ng/μl）と7.5μlのdNTP Mix（濃度10mM each dNTP Mix）を加えた。65℃ 5分インキュベート、氷上で1分インキュベートした。30μlの5×反応緩衝液（Invitrogen SuperScript ＩＩＩ RTキットに添付）と7.5μlの0.1M DTTと3μlのRNase Inhibitor（STRATAGENE）と5μlのSuperScript ＩＩＩ RT（Invitrogen）を加えた。25℃ 5分インキュベート、50℃ 60分インキュベート、70℃ 15分インキュベートした。反応後、フェノール・クロロホルム抽出を行い、酵素を失活させた。3μlのEDTA（0.5M）と22.5μlの0.1N NaOHを加えることでアルカリ処理を行い、RNAの分解を行った。30μlのTris（1M pH 7.8）を加えて、反応液を中和した後、エタノール沈殿を行い、100μlのTE緩衝液に溶解した。
mRNAソースからのヒトmRNA（Human Total RNA）については、実施例１に記載した方法により取得した。
実験に使用したヒトmRNAのリストを表2に示す。
２）ヒトmRNA（Human PolyA(+) RNA）を鋳型に用いた場合
Human PolyA RNA 5μgに対して100μlの系にて反応を行った。
58μlのH2Oに溶解した5μgのPolyA(+) RNAに5μlのランダムプライマー（濃度65ng/μl）と5μlのdNTP Mix（濃度10mM each dNTP Mix）を加えた。65℃ 5分インキュベート、氷上で1分インキュベートした。20μlの5×反応緩衝液（Invitrogen SuperScript ＩＩＩ RTキットに添付）と5μlの0.1M DTTと2μlのRNase Inhibitor （STRATAGENE）と5μlのSuperScript ＩＩＩ RT（Invitrogens）を加えた。25℃ 5分インキュベート、50℃ 60分インキュベート、70℃ 15分インキュベートした。反応後、フェノール・クロロホルム抽出を行い、酵素を失活させた。2μlのEDTA（0.5M）と15μlの0.1N NaOHを加えることでアルカリ処理を行い、RNAの分解を行った。20μlのTris（1M pH 7.8）を加えて、反応液を中和した後、エタノール沈殿を行い、50μlのTE緩衝液に溶解した。
実験に使用したヒトmRNAのリストを表2に示す。
Figure 0005378202
（２）プライマー（Primer）とプローブ（Probe）の設計
Applied Biosystems社のリアルタイムPCR 7500 Fastに付属されているPrimer設計ソフト Primer Express software 3.0を用いて、ソフトが推奨する条件内で比較検討したいcDNAと同じ染色体領域から転写されるほかのスプライスパターンをもつcDNAを個別に検出できるように、変化領域の境界となる部分の配列を用いて、Primer、Probeの設計を行った。また、それらの設計したPrimerを用いて、リアルタイムPCRを行い、それらのバンドが単一であり、1種類のcDNAのみを特異的に検出できることについては、確認を行った。
（３）リアルタイムPCRを用いた発現解析
１）使用したmRNA
使用したmRNAは全てヒト由来である。
10の実験系のうちクラスターchr14-45、chr7-2007、chr12-1875、chr3-1507の4クラスターの実験ではリアルタイムPCRの反応系としてSYBR GREENを用い、テンプレートcDNAとして、NT2細胞［NT2 RA(-)］、NT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導24時間［NT2 RA(+) 24hr］、NT2細胞をレチノイン酸(RA)処理誘導48時間［NT2 RA(+) 48hr］、NT2細胞をレチノイン酸(RA)処理誘導1週間［NT2 RA(+) 1week］、NT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導5週間［NT2 RA(+)］、NT2細胞をRA処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間［NT2 RA(+) Inh(+)］、NT2細胞をRA処理と生育阻害剤処理により神経分化後、神経を濃縮回収 (NT2 Neuron)、胎児脳（Brain, Fetal）、脳（Brain, whole）、アルツハイマー患者大脳皮質（ALZ Visual Cortex Occipital）、内臓組織混合物 (Mix, viscus tissues)［心臓（Heart）、腎臓（Kidney）、肝臓（Liver）、肺（Lung）、結腸（Colon）、胃（Stomach）］、血球系混合物 (Mix, blood cells and related tissues)［骨髄（Bone Marrow）、胸腺（Thymus）、脊髄（Spinal Cord）、脾臓（Spleen）］、腫瘍組織混合物 (Mix, tumor tissues)［結腸癌（Colon Tumor）、腎臓癌（Kidney Tumor）、肝臓癌（Liver Tumor）、肺癌（Lung Tumor）、卵巣癌（Ovary Tumor）、胃癌（Stomach Tumor）、子宮癌（Uterus Tumor）、舌癌（Tongue Tumor）］、正常組織混合物 (Mix, normal tissues［結腸 （Colon）、腎臓（Kidney）、肝臓（Liver）、肺（Lung）、卵巣（Ovary）、胃（Stomach）、子宮（Uterus）、舌（Tongue）］、全脳ポリA（+）RNA ［Brain, whole PolyA(+) RNA］、海馬（Brain, hippocampus）計16種のサンプルを用いた実験を行った。
クラスターchr12-1875については上記16種に加え、結腸（Colon）、腎臓（Kidney）、肝臓（Liver）、肺（Lung）、卵巣（Ovary）、胃（Stomach）、子宮（Uterus）、舌（Tongue）、結腸癌（Colon Tumor）、腎臓癌（Kidney Tumor）、肝臓癌（Liver Tumor）、肺癌（Lung Tumor）、卵巣癌（Ovary Tumor）、胃癌（Stomach Tumor）、子宮癌（Uterus Tumor）、舌癌（Tongue Tumor）を追加した実験も行った。
クラスターchr3-1507については上記16種に加え、小脳（Brain cerebellum）、扁桃（Brain, amygdala）、尾状核（Brain, caudate nucleus）、脳梁（Brain, corpus callosum）、黒質（Brain, substantia nigra）、視床（Brain, thalamus）、視床下核（Brain, subthalamic nucleus）を追加した実験も行った。
10の実験系のうちクラスターchr19-32、chr12+1658の2クラスターの実験ではリアルタイムPCRの反応系としてApplied Biosystems社製のTaqManを用い、テンプレートcDNAとして、NT2細胞［NT2 RA(-)］、NT2細胞をレチノイン酸(RA)処理誘導24時間［NT2 RA(+) 24hr］、NT2細胞をレチノイン酸(RA)処理誘導48時間［NT2 RA(+) 48hr］、NT2細胞をレチノイン酸(RA)処理誘導1週間［NT2 RA(+) 1week］、NT2細胞をレチノイン酸(RA)処理誘導5週間［NT2 RA(+)］、NT2細胞をRA処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間［NT2 RA(+) Inh(+)］、NT2細胞をRA処理と生育阻害剤処理により神経分化後、神経を濃縮回収 (NT2 Neuron)、胎児脳（Brain, Fetal）、脳（Brain, whole）、アルツハイマー患者大脳皮質（ALZ Visual Cortex Occipital）、内臓組織混合物 (Mix, viscus tissues)［心臓（Heart）、腎臓（Kidney）、肝臓（Liver）、肺（Lung）、結腸（Colon）、胃（Stomach）］、血球系混合物 (Mix, blood cells and related tissues) ［骨髄（Bone Marrow）、胸腺（Thymus）、脊髄（Spinal Cord）、脾臓（Spleen）］、腫瘍組織混合物 (Mix, tumor tissues) ［結腸癌（Colon Tumor）、腎臓癌（Kidney Tumor）、肝臓癌（Liver Tumor）、肺癌（Lung Tumor）、卵巣癌（Ovary Tumor）、胃癌（Stomach Tumor）、子宮癌（Uterus Tumor）、舌癌（Tongue Tumor）］、正常組織混合物 (Mix, normal tissues)［結腸（Colon）、腎臓（Kidney）、肝臓（Liver）、肺（Lung）、卵巣（Ovary）、胃（Stomach）、子宮（Uterus）、舌（Tongue）］、全脳ポリA（+）RNA ［Brain, whole PolyA(+) RNA］、海馬（Brain, hippocampus）計16種のサンプルを用いた実験を行った。
10の実験系のうちクラスターchr2-2324、chrX-900、chr8-916、chr3+2014の4クラスターの実験ではリアルタイムPCRの反応系としてSYBR GREENを用い、テンプレートcDNAとして、NT2細胞［NT2 RA(-)］、NT2細胞をレチノイン酸(RA)処理誘導24時間［NT2 RA(+) 24hr］、NT2細胞をレチノイン酸(RA)処理誘導48時間［NT2 RA(+) 48hr］、NT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導1週間［NT2 RA(+) 1week］、NT2細胞をレチノイン酸(RA)処理誘導5週間［NT2 RA(+)］、NT2細胞をRA処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間［NT2 RA(+) Inh(+)］、NT2細胞をRA処理と生育阻害剤処理により神経分化後、神経を濃縮回収(NT2 Neuron) 、胎児脳（Brain, Fetal）、脳（Brain, whole）、アルツハイマー患者大脳皮質（ALZ Visual Cortex Occipital）、内臓組織混合物 (Mix, viscus tissues)［心臓（Heart）、腎臓（Kidney）、肝臓（Liver）、肺（Lung）、結腸（Colon）、胃（Stomach）］、血球系混合物 (Mix, blood cells and related tissues) ［骨髄（Bone Marrow）、胸腺（Thymus）、脊髄（Spinal Cord）、脾臓（Spleen）］、腫瘍組織混合物 (Mix, tumor tissues)［結腸癌（Colon Tumor）、腎臓癌（Kidney Tumor）、肝臓癌（Liver Tumor）、肺癌（Lung Tumor）、卵巣癌（Ovary Tumor）、胃癌（Stomach Tumor）、子宮癌（Uterus Tumor）、舌癌（Tongue Tumor）］、正常組織混合物 (Mix, normal tissues)［結腸（Colon）、腎臓（Kidney）、肝臓（Liver）、肺（Lung）、卵巣（Ovary）、胃（Stomach）、子宮（Uterus）、舌（Tongue）］、全脳ポリA（+）RNA ［Brain, whole PolyA(+) RNA］、海馬（Brain, hippocampus）、小脳（Brain cerebellum）、扁桃（Brain, amygdala）、尾状核（Brain, caudate nucleus）、脳梁（Brain, corpus callosum）、黒質（Brain, substantia nigra）、視床（Brain, thalamus）、視床下核（Brain, subthalamic nucleus）計23種のサンプルを用いた実験を行った。
２）SYBR GREENを用いた場合の反応系
SYBR GREEN I DyeアッセイケミストリーはSYBR GREENが2本鎖DNAに結合することで強い蛍光を発する特徴を利用した実験系である。PCR反応時、DNAが一本鎖に変性する際SYBR GREENはDNAから遊離し蛍光は急激に減少するが、その後のアニーリング・伸張反応に伴い2本鎖DNAに結合し再び蛍光を発する。SYBR GREEN I DyeアッセイケミストリーではPCRサイクル毎に増加する蛍光強度を検出するものである。
鋳型としてそれぞれの組織由来のcDNA 0.2μl（Total RNAに換算して100ng相当）に、Forward Primer（最終濃度250nM）、Reverse Primer（最終濃度250nM）、SYBR Green PCR Master Mix (ABI 4309155) を加えて全量を20μlにした。内在性コントロールとして常に全てのテンプレートにGAPDH (Accession No; NM_002046.2) を反応コントロールとしておいた。
Applied Biosystems社のリアルタイムPCR 7500 Fastの標準プロトコールである以下の条件でPCRを行った。初期ステップ 50℃ 2分、95℃ 10分後、変性95℃ 15秒、アニール伸長60℃ 1分を40サイクル繰り返した。
GAPDH-F (配列番号５)：内在性コントロールGAPDHのForward Primer
GAPDH-R (配列番号６)：内在性コントロールGAPDHのReverse Primer
３）TaqManを用いた場合の反応系
TaqManアッセイケミストリーは、3’末端をリン酸化したプローブの5’末端にFluorescenin系の蛍光色素（リポーター）、3’末端にRhodamine系の蛍光色素（クエンチャー）をラベルしたTaqManプローブを用いる実験系である。TaqManプローブは単体で存在する際にはリポーターの励起光を照射しても蛍光波長がクエンチャーと近似している為、リポーターの蛍光エネルギーがクエンチャーの励起エネルギーとして使用され、リポーターの蛍光が抑制される。しかし、PCR反応時プライマーよりの伸張反応中、TaqManプローブがDNAポリメラーゼの5’-3’エキソヌクレアーゼ活性により分解されると、リポーター蛍光色素がTaqManプローブの5’末端より遊離し、クエンチャー蛍光色素と距離が離れる事で蛍光を発する。TaqManアッセイケミストリーでは、PCRサイクル毎に増加するリポーターの発する蛍光強度を検出するものである。
鋳型としてそれぞれの組織由来のcDNA 0.2μl（Total RNAに換算して 100ng相当）に、Forward Primer（最終濃度900nM）、Reverse Primer（最終濃度900nM）、TaqMan Probe （最終濃度250nM）、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (ABI 466073) を加えて全量を20μlにした。内在性コントロールとして常に全てのテンプレートにGAPDHの反応コントロールをおいた。
Applied Biosystems社のリアルタイムPCR 7500 FastのFastプロトコールである以下の条件でPCRを行った。酵素Activation 95℃ 20秒後、変性95℃ 3秒、アニール伸長60℃ 30秒を40サイクル繰り返した。
GAPDH-Probe (配列番号７) ：内在性コントロールGAPDHのTaqMan Probe
（４）データの統計解析方法
相対定量方法を用いて結果を解析した。
Applied Biosystems社のリアルタイムPCR 7500 FastのRQ studyソフトを用いて、増幅曲線の指数関数的増幅領域に閾値 (Threshold)を設定。その時のサイクル数をCt (Threshold cycle) とした。初期RNA量を補正するために、得られたCtから内在性コントロールであるGAPDHのCtを引いた値を算出、それをdCtとした[dCt = Target Ct - ENDOGENUS Ct (GAPDH)]。得られたdCtからさらに基準となるサンプル（コントロール）のdCtを引いた値を算出、それをddCtとした。[ddCt = Target dCt - Control dCt]その値をもとに、相対値を算出、それをRQとした。[RQ = 2 -ddCt]その結果をもとに、ログ系でグラフを作成、それぞれのPrimer、Probeでの増幅量つまり発現量を比較した。
各実施例において、RQ及びLog10RQの解析結果を示した。RQの数値は小数点1桁で表示した。リアルタイムPCRで検出出来なかったものについては、RQ数値及びLog10RQの数値のところに”Undet.”と記載した。Log10RQの数値は小数点2桁で表示した。ただし、コントロールの正常内臓組織を混合させたサンプル（Mix, viscus tissues）（RQ数値“1.0”）については、Log10RQの数値のところに“0.0”と記載した。
実施例４：クラスターchr19-32（データセット：103）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr19-32 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体19番、63,124,000 bp〜63,140,000 bp) にゲノムマッピングされた8配列の全長cDNA [D-UTERU2026184.1, D-BRACE3000012.1 , AB075836.1, AY695825.1, C-NT2RI2001083, ENST00000358502, ENST00000361044, NM_133460.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより以下のように3種類に分類できた。
[1] D-UTERU2026184.1
[2] D-BRACE3000012.1
[3] AB075836.1, AY695825.1, C-NT2RI2001083 (AK056113.1), ENST00000358502, ENST00000361044, NM_133460.1
[1]、[2]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DB（DDBJ / Genbank / EMBL） に登録されていた[3]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[3]と比較すると、ORF領域内に、[3]の第2、第3エクソンに相当する部分が欠失しているため、ORF領域が異なっていた。
[2]は、既知の[3]と比較すると、ORF領域内に、他のパターンと異なるエクソンが挿入されているため、翻訳開始点が変化し、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[3]の3種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、エクソンが欠失・挿入といった異なるパターンのスプライシングが起こることでアミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-UTERU2026184.1（[1]）の特徴
103_[1]_1-N0 (配列番号8) : D-UTERU2026184.1の核酸配列全領域
103_[1]_1-NA0 (配列番号9) : D-UTERU2026184.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記103_[1]_1-A0 (配列番号10) : D-UTERU2026184.1のアミノ酸配列全領域
既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_133460.1の213〜425塩基に存在する213塩基のエクソン (配列番号13) がD-UTERU2026184.1の223〜224塩基の領域には存在せず欠失している。またNM_133460.1の520〜521塩基に存在する2塩基 (配列番号14) がD-UTERU2026184.1の317〜318塩基の領域には存在せず欠失している (配列番号11)。NM_133460.1の翻訳開始点は128塩基の挿入エクソン上に存在するが、D-UTERU2026184.1はNM_133460.1と共有する第1エクソン上に存在する為、NM_133460.1と比較するとN末端のアミノ酸が43残基異なっていた。
103_[1]_1-N1 (配列番号11) : D-UTERU2026184.1の欠失核酸配列領域
103_[1]_1-A1 (配列番号12) : D-UTERU2026184.1の欠失によって変化したアミノ酸領域
103_[1]_1-N2 (配列番号11と同一) : D-UTERU2026184.1の欠失核酸領域中のORF核酸領域
103_[1]_1-A2 (配列番号12と同一) : D-UTERU2026184.1の欠失核酸領域に関わるORFアミノ酸領域
103_[1]_C-N1 (配列番号13) : D-UTERU2026184.1の223〜224塩基の領域に挿入されるNM_133460.1の213〜425塩基に存在する213塩基の挿入核酸配列
103_[1]_C-N2 (配列番号14) : D-UTERU2026184.1の317〜318塩基の領域に挿入されるNM_133460.1の520〜521塩基に存在する2塩基の挿入核酸配列
103_[1]_C-A1 (配列番号15) : D-UTERU2026184.1の223〜224塩基の領域及びに317〜318塩基の領域に挿入されるNM_133460.1の213〜425塩基及び520〜521塩基の挿入核酸配列に関わるアミノ酸領域。
この変化に伴い、コントロールとなるNM_133460.1の5〜45アミノ酸目に存在しているPfam モチーフ ”KRAB box” がD-UTERU2026184.1では消失していた（http://pfam.janelia.org/）。
３）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-BRACE3000012.1（[2]）の特徴
103_[2]_1-N0 (配列番号16) : D-BRACE3000012.1の核酸配列全領域
103_[2]_1-NA0 (配列番号17) : D-BRACE3000012.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
103_[2]_1-A0 (配列番号18) : D-BRACE3000012.1のアミノ酸配列全領域
D-BRACE3000012.1の314〜533塩基 (配列番号19) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_133460.1では存在しないエクソンが挿入するバリアントで、挿入するエクソン上に翻訳開始点と存在する為、NM_133460.1と比較するとN末端のアミノ酸が23残基 (配列番号20) 異なっていた。
103_[2]_1-N1 (配列番号19) : D-BRACE3000012.1の220塩基の挿入核酸配列領域
103_[2]_1-A1 (配列番号20) : D-BRACE3000012.1の23残基の挿入アミノ酸配列領域
103_[2]_1-N2 (配列番号21) : D-BRACE3000012.1の220塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
103_[2]_1-A2 (配列番号22) : D-BRACE3000012.1の220塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域
４）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマー及びTaqManプローブの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
103_01 - [1]のcDNAパターンのエクソンが欠失している領域の境界にある配列情報を利用して特異的に抽出した領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンにおいて、ORFを変化させているエクソンの欠失領域
→Primer103_01F (配列番号23) とPrimer103_01R (配列番号24) によって増幅される断片103_01 (配列番号25)
使用したTaqManプローブ103_01TP：(配列番号26)
103_02 - [2]のcDNAパターンのエクソンが挿入している領域の配列情報を利用して特異的に抽出した領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[2]のcDNAパターンにおいて、ORFを変化させているエクソンの挿入領域
→Primer103_02F (配列番号27) とPrimer103_02R (配列番号28) によって増幅される断片103_02 (配列番号29)
使用したTaqManプローブ103_02TP：(配列番号30)
103_03 -既存の公共DBに登録されている[3]のcDNAパターンの[1]の欠失領域、[2]の挿入領域と比較した場合にどちらとも区別できるような特異的な領域であり、[1]、[2]を比較検討するためのコントロール
→Primer103_03F (配列番号31) とPrimer103_03R (配列番号32) によって増幅される断片103_03 (配列番号33)
使用したTaqManプローブ103_03TP：(配列番号34)
103_04 -[1]〜[3]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]、[2]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[3]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域→Primer103_04F (配列番号35) とPrimer103_04R (配列番号36) によって増幅される断片103_04 (配列番号37)
使用したTaqManプローブ103_04TP：(配列番号38)
上記に示された[1]、[2]、[3]のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が1配列存在し、その由来は子宮 (Uterus) が1配列（解析母数49,561）であった。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[2]のパターンでは5’末端配列が2配列存在し、小脳 (Brain, cerebellum) が1配列（解析母数 82,880）、NT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導（NT2RP）が1配列（解析母数 39,242）であった。
既存の公共DBに登録されているcDNA の[3]のパターンでは5’末端配列が14配列存在し、その由来はNT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導5週間(NT2RP) が4配列（解析母数 39,242）、NT2細胞をRA処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間 （NT2RI） が2配列（解析母数 32,662）、小脳 (Brain, cerebellum) が1配列（解析母数 82,880）、扁桃(Brain, amygdala)が1配列（解析母数58,640）、海馬 (Brain, hippocampus) が1配列（解析母数 57,918）、黒質(Brain, substantia nigra) が1配列（解析母数 15,897）、新生児正常皮膚繊維芽細胞 (Normal Human Dermal Fibroblasts) が1配列（解析母数 10,103）、胎児脳 (Brain, Fetal) が2配列（解析母数 79,560）、子宮 (Uterus) が1配列（解析母数 49,561）であった。
この結果より、[1]のエクソンが欠失するパターンは子宮 (Uterus) での発現、また、[2]のエクソンが挿入するパターンは、小脳 (Brain, cerebellum) やNT2細胞をレチノイン酸誘導したもの（NT2RP）で発現している事が判った。[3]の既知の配列は、NT2細胞をレチノイン酸誘導したもの （NT2RP） や脳組織での発現が多い事が判った。
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
エクソンの選択性によるタンパク質発現の多様性の変化を検出するために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表3に示す。
Figure 0005378202
実施例3記載の海馬(Brain, hippocampus)、全脳 (Brain ,whole)、胎児脳 (Brain, Fetal)、アルツハイマー患者大脳皮質 (ALZ Visual Cortex Occipital)、7種類の分化段階のNT2細胞など16サンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合させたサンプル(Mix, viscus tissues)を用いて比較した。
103_01 (配列番号25) と103_02 (配列番号29) で比較されるエクソンの挿入・欠失の選択性によってORFが変化する比率は、以下の脳、NT2細胞の分化段階で大きく変化していた。
103_01 (配列番号25) で表されるエクソンの欠失するパターンの発現は、未分化のNT2細胞NT2RA (-) とレチノイン酸を添加して分化誘導をした初期のステージであるNT2RA (+) 48hrまでは発現が低く、分化誘導後期のNT2RA(+) 1week からNT2RA (+) 5weeks, Inh (+) までの発現が多く、NT2 Neuronになると低くなっていた。また、胎児脳 (Brain, Fetal) での発現も低かった（表3）。
103_02 (配列番号29) で表されるエクソンの挿入されるパターンの発現は、未分化のNT2細胞NT2RA(-) とレチノイン酸を添加して分化誘導をした初期のステージからNT2RA (+) 5weeks, Inh (+) までの発現が多く、NT2 Neuronになると低くなっていた（表3）。また、胎児脳 (Fetal Brain) だけでなく脳全体での発現が低かった（表3）。
これらの結果より、103_01 (配列番号25) 及び103_02 (配列番号29) という検出領域で示される新たに取得したcDNAの選択的なエクソン領域103_[1]_1-N1 (配列番号11) 及び103_[2]_1-N1 (配列番号19) の発現を比較することにより神経細胞の分化又は再生の段階を検出する分化マーカーとして用いることが可能になることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても神経細胞の分化又は再生の段階を検出する分化マーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-UTERU2026184.1においてPrimer103_01R (配列番号24) がプライミングする285〜306塩基目を含む上流配列062_[1]_1-N3 (配列番号39)。
[2]のcDNAパターンのD-BRACE3000012.1においてPrimer103_02R (配列番号28) がプライミングする521〜541塩基目を含む上流配列062_[1]_1-N3 (配列番号40)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer103_01F (配列番号23) とPrimer103_01R (配列番号24)によって増幅される領域103_01 (配列番号25)
[2]のcDNAパターンにおいてPrimer103_02F (配列番号27) とPrimer103_02R (配列番号28)によって増幅される領域103_02 (配列番号29)
実施例５：クラスターchr14-45（データセット：019）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr14-45 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体14番、104,305,000 bp〜104,335,000 bp) にゲノムマッピングされた13配列の全長cDNA [D-NT2RP8004156.1, BC000479.2, BC084538.1, BX647722.1, BX648205.1, C-BRACE2006105, C-BRHIP2019884, C-PLACE7003657, C-TESTI4021482, ENST00000310523, ENST00000349310, M63167.1, NM_005163.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより7種類に分類されるが、主なものとして以下の2種類が存在した。
[1] D-NT2RP8004156.1
[2] BC000479.2, BC084538.1, BX648205.1, C-PLACE7003657 (AK122894.1), ENST00000310523, M63167.1, NM_005163.1
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2]よりも下流にある染色体領域より発現するため、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンが持つORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-NT2RP8004156.1（[1]）の特徴
019_[1]_1-N0 (配列番号41) : D-NT2RP8004156.1の核酸配列全領域
019_[1]_1-NA0 (配列番号42) : D-NT2RP8004156.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
019_[1]_1-A0 (配列番号43) : D-NT2RP8004156.1のアミノ酸配列全領域
D-NT2RP8004156.1の1〜119塩基 (配列番号44) は既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_005163.1では存在しないエクソンでありNM_005163.1と相同性がない。
この変化に伴いD-NT2RP8004156.1の翻訳開始点はNM_005163.1に比べ3’側にシフトし、D-NT2RP8004156.1の131塩基目が翻訳開始点となる。その為、NM_005163.1よりN末端のアミノ酸配列が62残基短くなっていた（配列番号264）。
019_[1]_1-N1 (配列番号44) : D-NT2RP8004156.1の119塩基の挿入核酸配列領域
019_[1]_1-N2 (配列番号45) : D-NT2RP8004156.1の131塩基目を翻訳開始点とするORFの5’UTR領域130塩基
019_[1]_C-A1（配列番号264）：NM_005163.1に存在するD-NT2RP8004156.1の62残基の欠失アミノ酸配列領域
この変化に伴いNM_005163.1の6〜108アミノ酸目に存在しているPfamモチーフ ”PH domain”がD-NT2RP8004156.1では消失していた。
３）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
019_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer019_01F (配列番号46) とPrimer019_01R (配列番号47) によって増幅される断片019_01 (配列番号48)
019_02 - 既存の公共DBに登録されている[2]の転写開始点領域、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer019_02F (配列番号49) とPrimer019_02R (配列番号50) によって増幅される断片019_02 (配列番号51)
019_03 - [1]〜[2]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer019_03F (配列番号52) とPrimer019_03R (配列番号53) によって増幅される断片019_03 (配列番号54)
上記に示された[1]〜[2]のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が4配列存在し、その由来は全てNT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導（NT2RP）であった。
既存の公共DBに登録されているcDNA の[2]のパターンでは5’末端配列が11配列存在し、脳組織由来が4配列、その他複数の臓器などから7配列発現している事が判った。
この結果より、[1]の転写開始点は、分化後のNT2細胞でのみ特異的に発現していることが判った。また、[2]の転写開始点からは、様々な臓器からの発現が見られた。これにより、分化後のNT2細胞という神経細胞の分化段階でのみ、この染色体領域において転写の機構が異なり、用いられている転写開始点も異なる可能性が考えられた。
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
どのような状態の時に発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表4及び表5に示す。
Figure 0005378202
Figure 0005378202
実施例3記載の海馬(Brain, hippocampus)、全脳 (Brain ,whole)、胎児脳 (Brain, Fetal)、アルツハイマー患者大脳皮質 (ALZ Visual Cortex Occipital)、7種類の分化段階のNT2細胞など16サンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合させたサンプル(Mix, viscus tissues)を用いて比較した。
019_01 (配列番号48) と019_02 (配列番号51) で比較される転写開始点の選択性によってORFが変化する比率は、NT2細胞の分化段階で大きく変化する。NT2細胞の分化について詳細に比較すると、未分化のNT2細胞 NT2RA (-) とレチノイン酸を添加して分化誘導をした初期のステージであるNT2RA (+) 48hrまでは、019_01 (配列番号48) と019_02 (配列番号51) で表される2種類の転写開始点に大きな差は見られなかった（表4・表5）。しかし、分化のステージが進むNT2RA (+) 1week より差が大きくなりNT2RA (+) 5weeksでは、019_01 (配列番号48) で表される下流の転写開始点からの転写の割合がかなり多くなる（表4・表5）。しかし、その後NT2RA (+) 5weeks, Inh (+) ではその差が縮まり、NT2 Neuronでは、逆に019_02 (配列番号51) で表される既知の転写開始点からの転写の割合が多くなっていた（表4・表5）。他の組織では大きな差は見られなかった。
これらの結果より、019_01 (配列No.019-8) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域 （転写開始点付近の領域）019_[1]_1-N1 (配列番号44) の発現を比較することにより、神経細胞の分化又は再生の段階でも特に神経分化又は再生の後期の状態になっている細胞を検出する分化マーカーとして用いることが可能になることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても神経分化又は再生の後期の状態になっている細胞を検出する分化マーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-NT2RP8004156.1においてPrimer019_01R (配列番号47) がプライミングする195〜213塩基目を含む上流配列019_[1]_1-N3 (配列番号55)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer019_01F (配列番号46) とPrimer019_01R (配列番号47)によって増幅される領域019_01 (配列番号48)
実施例６：クラスターchr2-2324（データセット：031）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr2-2324 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体2番、65,440,000 bp〜65,580,000 bp) にゲノムマッピングされた7配列の全長cDNA [D-NT2RI3005525.1, D-TRACH3029063.1, AY299090.1, C-HEP03447, C-NT2RP7004925, ENST00000356388, NM_181784.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより5種類に分類されるが、主なものとして以下の2種類が存在した。
[1] D-NT2RI3005525.1
[2] AY299090.1, C-NT2RP7004925 (AK056479.1), NM_181784.1
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2]よりも下流にある染色体領域より発現し、[2]と相同性のない新しいエクソン上に翻訳開始点が存在するため、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンが持つORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-NT2RI3005525.1（[1]）の特徴
031_[1]_1-N0 (配列番号56) : D-NT2RI3005525.1の核酸配列全領域
031_[1]_1-NA0 (配列番号57) : D-NT2RI3005525.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
031_[1]_1-A0 (配列番号58) : D-NT2RI3005525.1のアミノ酸配列全領域
D-NT2RI3005525.1の1〜61塩基 (配列番号59) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_181784.1では存在しないエクソンが挿入するバリアントで、挿入するエクソン上に翻訳開始点と存在する為、NM_181784.1と比較するとN末端のアミノ酸が6残基 (配列番号60) 異なっていた。
031_[1]_1-N1 (配列番号59) : D-NT2RI3005525.1の61塩基の挿入核酸配列領域
031_[1]_1-A1 (配列番号60) : D-NT2RI3005525.1の6残基の挿入アミノ酸配列領域
031_[1]_1-N2 (配列番号61) : D-NT2RI3005525.1の61塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
031_[1]_1-A2 (配列番号60と同一) : D-NT2RI3005525.1の61塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域
３）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
031_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer031_01F (配列番号62) とPrimer031_01R (配列番号63) によって増幅される断片031_01 (配列番号64)
031_02 - 既存の公共DBに登録されている[2]の転写開始点領域、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer031_02F (配列番号65) とPrimer031_02R (配列番号66) によって増幅される断片031_02 (配列番号67)
031_03 - [1]〜[2]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer031_03F (配列番号68) とPrimer031_03R (配列番号69) によって増幅される断片031_03 (配列番号70)
上記に示された[1]、[2]のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が28配列存在し、全脳(Brain, whole) が13配列（解析母数 59,069）、海馬 (Brain, hippocampus) が8配列（解析母数 57,918）、扁桃(Brain, amygdala) が5配列（解析母数58,640）、正常頭髪毛乳頭細胞HDPC (Human dermal papilla cells) が1配列（解析母数 8,453）、NT2細胞をレチノイン酸 （RA） 処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間 (NT2RI) が1配列（解析母数 32,662）であった。
既存の公共DBに登録されているcDNA の[2]のパターンでは5’末端配列が35配列存在し、その由来は全脳 (Brain, whole) が10配列（解析母数 59,069）、小脳(Brain, cerebellum) が5配列（解析母数82,880）、胎児脳 (Brain, Fetal) が5配列（解析母数 47,574）、海馬 (Brain, hippocampus) が3配列（解析母数 57,918）、気管(Trachea) が3配列（解析母数 52,352）、視床 (Brain, thalamus) が2配列（解析母数 53,267）、NT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導 (NT2RP) が2配列（解析母数 39,242）、胸腺 (Thymus) が2配列（解析母数 70,578）、NT2細胞をレチノイン酸 （RA） 処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間 (NT2RI) が1配列（解析母数 32,662）、精巣 (Testis) が1配列（解析母数 90,188）、子宮(Uterus) が1配列（解析母数 49,561）であった。
この結果より、[1]の転写開始点は、脳の中でも特に海馬や扁桃での発現が多いことが判った。また[2]の転写開始点でも、脳での発現は多く見られるが、[1]の転写開始点に比べ様々な組織において発現している事が判った。この結果より、脳の中でも特定の部位においては、この染色体領域における転写の機構が異なり、用いられている転写開始点も異なる可能性が考えられた。
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
どのような部位で、どのような状態のときに発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表6及び表7に示す。
Figure 0005378202
Figure 0005378202
実施例3記載の11種類の脳組織、7種類の分化段階のNT2細胞など23種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) を用いて比較した。
031_01 (配列番号64) と031_02 (配列番号67) で比較される転写開始点の選択性によってORFが変化する比率は、以下の脳部位、NT2細胞の分化段階で大きく変化していた。
脳の中でも特に海馬 (Brain, hippocampus) と扁桃 (Brain, amygdala) において、031_01 (配列番号64) で表される下流の転写開始点からの転写が多かった（表6・表7）。他の脳部位では、大きな差は見られなかった。
さらに、NT2細胞の分化について詳細に比較すると、未分化のNT2細胞NT2RA (-) とレチノイン酸を添加して分化誘導をした初期のステージであるNT2RA (+) 1weekまでは、031_02 (配列番号67) で表される既存の公共DBに登録されている転写開始点から転写されるmRNAが多かったが、神経細胞に分化後のものが多く含まれると予測されるNT2RA (+) 5weeksではその発現量が逆転し、それ以降のNT2RA (+) 5weeks, Inh (+)、NT2 Neuronでは031_01 (配列番号64) で表される下流の転写開始点から転写されるmRNAが多かった（表6・表7）。
これらの結果より、031_01 (配列番号64) という検出領域で示される新たに取得したcDNAの5’-末端領域（転写開始点付近の領域）031_[1]-N1 (配列番号59) の発現を比較することにより脳の中でも特に海馬 (Brain, hippocampus) などの神経が多い部位に特異的なマーカー （神経分化、神経再生マーカー等）として、神経細胞の分化又は再生の段階でも特に神経に分化した細胞を検出する分化マーカーとして用いることが可能になることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても脳の中でも特に海馬 (Brain, hippocampus) などの神経が多い部位に特異的なマーカー（神経分化、神経再生マーカー等）として、神経細胞の分化又は再生の段階でも特に神経に分化した細胞を検出する分化マーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-NT2RI3005525.1においてPrimer031_01R (配列番号63) がプライミングする80〜101塩基目を含む上流配列031_[1]_1-N3 (配列番号71)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer031_01F (配列番号62) とPrimer031_01R (配列番号63)によって増幅される領域031_01 (配列番号64)
実施例７：クラスターchr7-2007（データセット：067）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr7-2007 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体7番、26,400,000 bp〜 26,850,000 bp) にゲノムマッピングされた10配列の全長cDNA [D-NT2RP8004592.1, D-NT2RP7010844.1, Z-NT2RP7020087-01, BC002893.2, BC036044.1, ENST00000338865, ENST00000345317, NM_003930.3, XM_498174.1, XM_499404.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより5種類に分類されるが、主なものとして以下の2種類が存在する。
[1] D-NT2RP8004592.1
[2] BC002893.2, BC036044.1, NM_003930.3
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2]よりも下流にある染色体領域より発現し、翻訳開始点がC末側にずれるため、[2]とORF領域が異なっていた。
[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-NT2RP8004592.1（[1]）の特徴
067_[1]_1-N0 (配列番号72) : D-NT2RP8004592.1の核酸配列全領域
067_[1]_1-NA0 (配列番号73) : D-NT2RP8004592.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
067_[1]_1-A0 (配列番号74) : D-NT2RP8004592.1のアミノ酸配列全領域
D-NT2RP8004592.1の1〜169塩基 (配列番号75) のエクソン（第1エクソン）は既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_003930.3には存在しないエクソンであり相同性がない。またNM_003930.3の1〜359塩基のエクソン（第1エクソン）はD-NT2RP8004592.1には存在しないエクソンであり相同性がない。第2エクソン以降は両cDNA共に共通して存在している。NM_003930.3のORFの翻訳終止点はD-NT2RP8004592.1と同じだが、翻訳開始点はD-NT2RP8004592.1に存在しない第1エクソン上に存在するため、ORFのN末端が異なっていた。D-NT2RP8004592.1の翻訳開始点はNM_003930.3と共有する第6エクソン上に存在するため、NM_003930.3に比べN末端側のアミノ酸が172残基短くなっていた（配列番号265）。
067_[1]_1-N 1 (配列番号75) : D-NT2RP8004592.1の169塩基の挿入核酸配列領域
067_[1]_1-N 2 (配列番号76) : D-NT2RP8004592.1の620塩基目を翻訳開始点とするORFの5’UTR領域619塩基
067_[1]_C-A1（配列番号265）：NM_003930.3に存在するD-NT2RP8004592.1の172残基の欠失アミノ酸配列領域
３）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
067_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer067_01F (配列番号77) とPrimer067_01R (配列番号78) によって増幅される断片067_01 (配列番号79)
067_03 - 既存の公共DBに登録されている[2]の転写開始点領域、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer067_03F (配列番号80) とPrimer067_03R (配列番号81) によって増幅される断片067_03 (配列番号82)
067_04 - [1]〜[2]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer067_04F (配列番号83) とPrimer067_04R (配列番号84) によって増幅される断片067_04 (配列番号85)
上記に示された[1]〜[2]のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が18配列存在し、その由来はNT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導 (NR2RP) が16配列（解析母数39,242）、NT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間(NT2RI) が2配列（解析母数 32,662）と、全て分化後のNT2細胞由来であった。
既存の公共DBに登録されているcDNA の[2]のパターンでは5’末端配列が122配列存在し、その由来はNT2細胞由来45配列、脳組織由来が25配列、その他由来が47配列であった。
この結果より、[1]の転写開始点は、分化後のNT2細胞で特異的に発現していることが判った。また、[2]の転写開始点からは、NT2細胞や脳組織の他、様々な組織から発現が見られた。これにより、分化後のNT2細胞という神経細胞の分化が起こっているという状況の時だけ、この染色体領域において、転写の機構が異なり、用いられている転写開始点も異なる可能性が考えられた。
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
どのような状態のときに発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表8及び表9に示す。
Figure 0005378202
Figure 0005378202
実施例3記載の海馬(Brain, hippocampus)、全脳 (Brain ,whole)、胎児脳 (Brain, Fetal)、アルツハイマー患者大脳皮質 (ALZ Visual Cortex Occipital)、7種類の分化段階のNT2細胞など16サンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合させたサンプル(Mix, viscus tissues)を用いて比較した。
067_01 (配列番号79) と067_03 (配列番号82) で比較される転写開始点の選択性によってORFが変化する比率は、NT2細胞の分化段階で大きく変化していた。NT2細胞の分化について詳細に比較すると、未分化のNT2細胞 NT2RA (-) とレチノイン酸を添加して分化誘導をした初期のステージであるNT2RA (+) 48hrまでに比べ、分化のステージが進むNT2RA (+) 1week からNT2RA (+) 5weeks では067_01 (配列番号79) で表される転写開始点の方が067_03 (配列番号82) で表される転写開始点より転写の割合が多くなっていた（表8・表9）。その後NT2RA (+) 5weeks, Inh (+)でその差が縮まるが、NT2 Neuronでは067_01 (配列番号79) 表される転写の割合が再び増加していた（表8・表9）。
これらの結果より、067_01 (配列番号79) という検出領域で示される新たに取得したcDNAの5’-末端領域（転写開始点付近の領域）067_[1]-N1 (配列番号75) の発現を比較することにより、神経細胞の分化又は再生の段階でも特に神経に分化した細胞を検出する分化マーカーとして用いることが可能になることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても神経細胞の分化又は再生の段階でも特に神経に分化した細胞を検出する分化マーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-NT2RP8004592.1においてPrimer067_01R (配列番号78) がプライミングする65〜84塩基目を含む上流配列067_[1]_1-N3 (配列番号86)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer067_01F (配列番号77) とPrimer067_01R (配列番号78)によって増幅される領域067_01 (配列番号79)。
実施例８：クラスターchrX-900（データセット：122）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchrX-900 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体X番、43,380,000 bp〜43,500,000 bp) にゲノムマッピングされた7本の全長cDNA [D-NT2RI2014164.1, D-BRAMY2029564.1, D-BRAMY2029564.1, BC022494.1, ENST00000265833, M69177.1, NM_000898.3] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより4種類に分類されるが、主なものとして下記の3種類が存在した。
[1] D-NT2RI2014164.1
[2] D-BRAMY2029564.1
[3] BC022494.1, ENST00000265833, M69177.1, NM_000898.3
[1]は我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既知の[3]よりも下流にある染色体領域より発現し、既存の公共DBに登録されていた[3]とORFが異なっていた。
[2]は我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既知の[3]と比較すると[3]のORF領域内に他のパターンと異なるエクソンが挿入されているため、ORFが異なっていた。
[1]〜[3]の3種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことや、エクソンが挿入といった異なるスプライスパターンをもつことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。
2) 我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-NT2RI2014164.1（[1]）の特徴
122_[1]_1-N0 (配列番号87) : D-NT2RI2014164.1の核酸配列全領域
122_[1]_1-NA0 (配列番号88) : D-NT2RI2014164.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
122_[1]_1-A0 (配列番号89) : D-NT2RI2014164.1のアミノ酸配列全領域
D-NT2RI2014164.1の1〜156塩基 (配列番号90) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_000898.3 では存在しないエクソンでありNM_000898.3と相同性がない。この変化に伴い、D-NT2RI2014164.1の翻訳開始点はNM_000898.3に比べ3’側にシフトし、D-NT2RI2014164.1の162塩基目が翻訳開始点となる。その為、NM_000898.3よりアミノ酸配列が16残基短くなっていた (配列番号266)。
またNM_000898.3の1,274〜1,371塩基に存在する98塩基のエクソン (配列番号95) がD-NT2RI2014164.1の1,250〜1,251塩基の領域には存在せず欠失している (配列番号92)。
この変化に伴い、翻訳のフレームが変化しNM_000898.3とは異なる終止コドンでORFが終わるためNM_000898.3と比較をするとC末端のアミノ酸が48残基 (配列番号93) 異なっていた。
122_[1]_1-N1 (配列番号90) : D-NT2RI2014164.1の156塩基の挿入核酸配列領域
122_[1]_1-N2 (配列番号91) : D-NT2RI2014164.1の162基目を翻訳開始点とするORFの5’UTR領域161塩基
122_[1]_1-N3 (配列番号92) : D-NT2RI2014164.1の欠失核酸配列領域
122_[1]_1-A1 (配列番号93) : D-NT2RI2014164.1の欠失により変化したアミノ酸配列領域122_[1]_1-N4 (配列番号92と同一) : D-NT2RI2014164.1の欠失領域中のORF核酸領域
122_[1]_1-A2 (配列番号94) : D-NT2RI2014164.1の欠失領域に関わるORFアミノ酸配列領域
122_[1]_C-N1 (配列番号95) : D-NT2RI2014164.1の1,250〜1,251塩基の領域に挿入されるNM_000898.3の1,274〜1,371に存在する98塩基のエクソン核酸配列
122_[1]_C-A1 (配列番号96) : D-NT2RI2014164.1の1,250〜1,251塩基の領域に挿入されるNM_000898.3の1,274〜1,371に存在する98塩基のエクソン核酸配列に関わるアミノ酸配列33残基
122_[1]_C-A2（配列番号266）：NM_000898.3に存在するD-NT2RI2014164.1の16残基の欠失アミノ酸配列領域
3) 我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-BRAMY2029564.1（[2]）の特徴
122_[2]_1-N0 (配列番号97) : D-BRAMY2029564.1の核酸配列全領域
122_[2]_1-NA0 (配列番号98) : D-BRAMY2029564.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
122_[2]_1-A0 (配列番号99) : D-BRAMY2029564.1のアミノ酸配列全領域
D-BRAMY2029564.1の90〜140塩基 (配列番号100) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_000898.3 では存在しないエクソンでありNM_000898.3と相同性がない。この変化に伴い、D-BRAMY2029564.1の翻訳開始点はNM_000898.3に比べ3’側にシフトし、D-BRAMY2029564.1の143塩基目が翻訳開始点となる。その為、NM_000898.3よりアミノ酸配列が16残基短くなっていた (配列番号266と同一)。
122_[2]_1-N1 (配列番号100) : D-BRAMY2029564.1の43塩基の挿入核酸配列領域
122_[2]_1-N2 (配列番号101) : D-BRAMY2029564.1の143基目を翻訳開始点とするORFの5’UTR領域142塩基
122_[2]_C-A1（配列番号266と同一）: NM_000898.3に存在するD-BRAMY2029564.1の16残基の欠失アミノ酸配列領域
4）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
122_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer122_01F (配列番号102) とPrimer122_01R (配列番号103) によって増幅される断片122_01 (配列番号104)
122_02 - [2]のcDNAパターンのエクソンが挿入している領域の配列情報を利用して特異的に抽出した領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[2]のcDNAパターンにおいて、ORFを変化させているエクソンの挿入領域
→Primer122_02F (配列番号105) とPrimer122_02R (配列番号106) によって増幅される断片122_02 (配列番号107)
122_03 -既存の公共DBに登録されている[3]の転写開始点領域、[1]、[2]を比較検討するためのコントロール
→Primer122_03F (配列番号108) とPrimer122_03R (配列番号109) によって増幅される断片122_03 (配列番号110)
122_04 - [1]〜[3]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]、[2]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[3]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer122_04F (配列番号111) とPrimer122_04R (配列番号112) によって増幅される断片122_04 (配列番号113)
上記に示された[1]〜[3] のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が4配列存在し、その由来はNT2細胞をレチノイン酸（RA）処理と生育阻害剤処理により神経分化後、神経を濃縮回収 (NT2NE) が2配列 (解析母数 16,337)、NT2細胞をレチノイン酸（RA）処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間 (NT2RI) が2配列 (解析母数 32,662) であった。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[2]のパターンでは5’末端配列が2配列存在し、その由来は扁桃 (Brain, amygdala) が2配列 (解析母数 58,640) であった。
既存の公共DBに登録されているcDNA の[3]のパターンでは5’末端配列が59配列存在し、その由来は子宮(Uterus)が11配列（解析母数 49,561）、脳組織由来が19配列の他、様々な組織で存在していた。
この結果より、[1]の転写開始点は、分化したNT2細胞での発現が多いことが判った。また、[2]のエクソンが挿入するパターンは、脳での発現が多いことが判った。[3]の転写開始点は、様々な組織で発現が見られた。これにより、脳や分化後の神経細胞といった特定の組織において、この染色体領域では、転写の機構やスプライスのパターンの変化することでアミノ酸が変化し、異なるタンパク質を発現させるようなmRNAのパターン変化の選択機構が働く可能性が考えられた。
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
組織間でおこる転写開始点やエクソンの選択性によるタンパク質発現の多様性の変化を検出するために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表10及び表11に示す。
Figure 0005378202
Figure 0005378202
実施例3記載の11種類の脳組織、7種類の分化段階のNT2細胞など23種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) を用いて比較した。
122_01 (配列番号104) 、122_02 (配列番号107) 及び122_03 (配列番号110) で比較される転写開始点の選択性とエクソンの選択性によってORFが変化する比率は、以下のように脳、NT2細胞の分化段階で大きく変化する。
全ての脳部位で、122_03 (配列番号110) に比べ122_02 (配列番号107) で表されるエクソンの挿入が起こるパターンでの発現が多かった（表10・表11）。
122_01 (配列番号104) で表される下流の転写開始点については、NT2細胞の分化段階で発現量が大きく変化することがわかった。NT2細胞の分化について詳細に比較すると、未分化のNT2細胞 NT2RA (-) の段階では、挿入がおこるパターンの発現量は、おこらないパターンと同じであるが、特にレチノイン酸を添加して分化誘導をした初期のステージであるNT2RA (+) 24hr、NT2RA (+) 48hr、NT2RA（+）1weekといった分化の初期段階では、下流の転写開始点を選択する率が大きく増え、分化の後期では、その差が少なくなっていることがわかった（表10・表11）。
これらの結果より、122_01 (配列番号104) という検出領域で示される新たに取得したcDNAの5’-末端領域 （転写開始点付近の領域）122_[1]-N1 (配列番号90) の発現や、122_02 (配列番号107) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域122_[2]-N1 (配列番号100) の発現を比較することにより、神経細胞の分化又は再生の段階でも特に神経細胞への分化の初期段階を検出する分化マーカーとして用いることが可能になることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても神経細胞の分化又は再生の段階でも特に神経細胞への分化の初期段階を検出する分化マーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-NT2RI2014164.1においてPrimer122_01R (配列番号103) がプライミングする138〜162塩基目を含む上流配列031_[1]_1-N3 (配列番号114)。
[2]のcDNAパターンのD-BRAMY2029564.1においてPrimer122_02R (配列番号106) がプライミングする177〜198塩基目を含む上流配列031_[1]_1-N3 (配列番号115)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer122_01F (配列番号102) とPrimer122_01R (配列番号103) によって増幅される領域122_01 (配列番号104)。
[2]のcDNAパターンにおいてPrimer122_02F (配列番号105) とPrimer122_02R (配列番号106) によって増幅される領域122_02 (配列番号107)。
実施例９：クラスターchr8-916（データセット：124）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr8-916 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体8番、81,100,000 bp〜81,325,000 bp) にゲノムマッピングされた10配列の全長cDNA [D-BRHIP2003515.1 , D-COLON2003937.1, Z-BRCOC2013886-01, BC018117.1, BX640835.1, C-SMINT1000078, ENST00000263850, NM_005079.1, U18914.1, XM_374275.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより4種類に分類されるが、主なものとして下記の2種類が存在した。
[1] D-BRHIP2003515.1
[2] BC018117.1, NM_005079.1, U18914.1
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2]と比較すると、ORF領域内に、他のパターンと異なるエクソンが挿入されているためアミノ酸配列が変化し、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンが持つORF領域は、同じ染色体領域より、異なるスプライスパターンをもつことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-BRHIP2003515.1（[1]）の特徴
124_[1]_1-N0 (配列番号116) : D-BRHIP2003515.1の核酸配列全領域
124_[1]_1-NA0 (配列番号117) : D-BRHIP2003515.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
124_[1]_1-A0 (配列番号118) : D-BRHIP2003515.1のアミノ酸配列全領域
D-BRHIP2003515.1の471〜539塩基 (配列番号119) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_005079.1では存在しないエクソンが挿入するバリアントである。D-BRHIP2003515.1の翻訳開始点と翻訳終止点はNM_005079.1と同じだが、D-BRHIP2003515.1に69塩基のエクソンの挿入する事によりNM_005079.1よりアミノ酸長が23残基 (配列番号120) 長くなっていた。
124_[1]_1-N 1 (配列番号119) : D-BRHIP2003515.1の69塩基の挿入核酸配列領域
124_[1]_1-A 1 (配列番号120) : D-BRHIP2003515.1の23残基の挿入アミノ酸配列領域
124_[1]_1-N 2 (配列番号119と同一) : D-BRHIP2003515.1の69塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
124_[1]_1-A 2 (配列番号120と同一) : D-BRHIP2003515.1の69塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域
３）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
124_04 - [1]のcDNAパターンのエクソンが挿入している領域を境界にある配列情報を利用して特異的に抽出した領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンにおいて、ORFを変化させているエクソンの挿入領域
→Primer124_04F (配列番号121) とPrimer124_04R (配列番号122) によって増幅される断片124_04 (配列番号123)
124_05 - 既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの[1]の挿入領域と比較した場合に欠失領域に相当する特異的な領域であり、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer124_05F (配列番号124) とPrimer124_05R (配列番号125) によって増幅される断片124_05 (配列番号126)
124_06 - [1]〜[2]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer124_06F (配列番号127) とPrimer124_06R (配列番号128) によって増幅される断片124_06 (配列番号129)
上記に示された[1]〜[2] のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が21配列存在し、その由来は扁桃 (Brain, amygdala)、小脳 (Brain, cerebellum)、海馬 (Brain, hippocampus) などの脳組織由来が18配列、腎臓癌 (Kidney, Tumor) 由来が3配列であった。
既存の公共DBに登録されているcDNA の[2]のパターンでは5’末端配列が51配列存在し、その由来は黒質 (Brain, substantia nigra)、海馬 (Brain, hippocampus) 、扁桃 (Brain, amygdala) 、脳梁 (Brain, corpus callosum) などの脳組織由来が17配列、舌癌 (Tongue, Tumor) 、腎臓癌 (Kidney, Tumor) などの腫瘍組織由来が9配列、その他肺 (Lung)、小腸(Small Intestine)、気管 (Trachea) など正常組織由来が25配列であった。
この結果より、[1]のエクソンが挿入するパターンは、脳での発現が多いことが判った。また、[2]のエクソンが欠失するパターンは、脳だけでなく様々な組織で発現していることがわかった。つまり、この染色体領域において、[1]のパターンのように、エクソンが挿入されることでアミノ酸が変化し、異なるタンパク質を発現させるような機構が働くのは、特定の組織でおこる可能性が考えられた。
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
組織間でおこるエクソンの選択性によるタンパク質発現の多様性の変化を検出するために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表12及び表13に示す。
Figure 0005378202
Figure 0005378202
実施例3記載の11種類の脳組織、7種類の分化段階のNT2細胞など23種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) を用いて比較した。
124_04 (配列番号123) と124_05 (配列番号126) で比較されるエクソンの挿入・欠失の選択性によってORFが変化する比率は、以下の組織、NT2細胞の分化段階で大きく変化した。
脳の全ての部位において、124_04 (配列番号123) で表されるエクソンの挿入されるパターンの発現が多かった（表12・表13）。
また、NT2細胞では、分化の段階によりエクソンの選択性が大きく変化することがわかった。NT2細胞の分化について詳細に比較すると、未分化のNT2細胞 NT2RA (-) とNT2細胞にレチノイン酸を添加して分化誘導をした初期のステージであるNT2RA (+) 1weekまでは、124_04 (配列番号123) と124_05 (配列番号126)の2つのパターンにほとんど差がなかったが、NT2RA (+) 5weeks以降からNT2 Neuronでは、124_04 (配列番号123) で表されるエクソンの挿入されるパターンの発現がかなり多かった（表12・表13）。
これらの結果より、124_04 (配列番号123) という検出領域で示される新たに取得したcDNAの選択的なエクソン領域124_[1]_1-N1 (配列番号119) の発現を比較することにより脳に特異的なマーカーとして、神経細胞の分化又は再生の段階でも特に神経分化後又は神経再生後の細胞を検出する分化マーカーとして用いることが可能になることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても脳に特異的なマーカーとして、神経細胞の分化又は再生の段階でも特に神経分化後又は神経再生後の細胞を検出する分化マーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-BRHIP2003515.1においてPrimer124_04R (配列番号122) がプライミングする472〜491塩基目を含む上流配列124_[1]_1-N3 (配列番号130)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer124_04F (配列番号121) とPrimer124_04R (配列番号122) によって増幅される領域124_04 (配列番号123)
実施例１０：クラスターchr3+2014（データセット：112）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr3+2014 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体3番、143,070,000 bp〜 143,130,000 bp) にゲノムマッピングされた7本の全長cDNA [D-BRACE2044661.1, BC011835.2, C-BRAMY2022929, C-PRS09188, ENST00000286371, NM_001679.2, U51478.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより4種類に分類されるが、主なものとして下記の2種類が存在した。
[1] D-BRACE2044661.1
[2] BC011835.2, ENST00000286371, NM_001679.2, U51478.1
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2]と比較すると、ORF領域内に、他のパターンと異なるエクソンが挿入されているため、翻訳開始点が変化し、ORFが異なっていた。
[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なるスプライスパターンをもつことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-BRACE2044661.1（[1]）の特徴
112_[1]_1-N0 (配列番号131) : D-BRACE2044661.1の核酸配列全領域
112_[1]_1-NA0 (配列番号132) : D-BRACE2044661.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
112_[1]_1-A0 (配列番号133) : D-BRACE2044661.1のアミノ酸配列全領域
D-BRACE2044661.1の272〜363塩基 (配列番号134) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_001679.2では存在しないエクソンでありNM_001679.2と相同性がない。このエクソン上に翻訳開始点が存在する為、N末端側のアミノ酸が23残基 (配列番号135) 変化していた。
112_[1]_1-N1 (配列番号134) : D-BRACE2044661.1の92塩基の挿入核酸配列領域
112_[1]_1-A1 (配列番号135) : D-BRACE2044661.1の23残基の挿入アミノ酸配列領域
112_[1]_1-N2 (配列番号136) : D-BRACE2044661.1の92塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
112_[1]_1-A2 (配列番号135と同一) : D-BRACE2044661.1の92塩基の挿入領域中のORFアミノ酸配列領域
また、D-BRACE2044661.1の837〜856塩基 (配列番号137) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_001679.2では存在しないエクソンでありNM_001679.2と相同性がない。この挿入配列により翻訳フレームが変化するため、C末端側のアミノ酸が13残基 (配列番号138) 変化していた。
112_[1]_1-N3 (配列番号137) : D-BRACE2044661.1の20塩基の挿入核酸配列領域
112_[1]_1-A3 (配列番号138) : D-BRACE2044661.1の13残基の挿入アミノ酸配列領域
112_[1]_1-N4 (配列番号137と同一) : D-BRACE2044661.1の20塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
112_[1]_1-A4 (配列番号139) : D-BRACE2044661.1の20塩基の挿入領域中のORFアミノ酸配列領域
３）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
112_01 - [1]のcDNAパターンのエクソンが挿入している領域を境界にある配列情報を利用して特異的に抽出した領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンにおいて、ORFを変化させているエクソンの挿入領域
→Primer112_01F (配列番号140) とPrimer112_01R (配列番号141) によって増幅される断片112_01 (配列番号142)
112_02 - 既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの[1]の挿入領域と比較した場合に欠失領域に相当する特異的な領域であり、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer112_02F (配列番号143) とPrimer112_02R (配列番号144) によって増幅される断片112_02 (配列番号145)
112_03 - [1]〜[2]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer112_03F (配列番号146) とPrimer112_03R (配列番号147) によって増幅される断片112_03 (配列番号148)
上記に示された[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンのそれぞれの特異的な領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が6配列存在し、その由来は小脳 (Brain, cerebellum) が3配列 (解析母数 82,880)、アルツハイマー患者大脳皮質 (Brain, cortex, Alzheimer) が1配列 (解析母数 16,360)、扁桃(Brain, amygdala) が1配列 (解析母数 58,640)、10週令胎児より頭部を多く含む組織（whole embryo, mainly head）が1配列 (解析母数 7,033) であった。
既存の公共DBに登録されているcDNA の[2]のパターンでは5’末端配列が24配列存在し、その由来は胎盤 (Placenta) が4本 (解析母数 46,090)、NT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導 (NT2RP) が3本 （解析母数39,242）、舌癌 (Tongue, Tumor) が2本 (解析母数31,371)、IMR32細胞 (Neuroblastoma) が2本(解析母数 16964)、NT2細胞をレチノイン酸処理と生育阻害剤処理により神経分化後、神経を濃縮回収 (NT2NE) が2本 (解析母数 16,337) など様々な組織で発現していた。
この結果より、[1]のエクソンが挿入するパターンは、脳での発現が多いことがわかった。また、[2]のエクソンが欠失するパターンは、脳だけでなく様々な組織で発現していることがわかった。つまり、この染色体領域において、[1]のパターンのように、エクソンが挿入されることで、N末側のアミノ酸が変化し、異なるタンパクを発現させるようなmRNAのパターン変化の選択機構が働くのは、特定の組織でおこる可能性が考えられた。
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
組織間でおこるエクソンの選択性によるタンパク発現の多様性の変化を検出するために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表14に示す。
Figure 0005378202
実施例3記載の11種類の脳組織、7種類の分化段階のNT2細胞など23種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) を用いて比較した。
112_01 (配列番号142) と112_02 (配列番号145) で比較されるエクソンの挿入・欠失の選択性によってORFが変化する比率は、以下の脳部位、NT2細胞の分化段階で大きく変化する。
脳の中でも特に小脳 (Brain, cerebellum) 、海馬 (Brain, hippocampus)と扁桃 (Brain, amygdala)、尾状核 (Brain,caudate nucleus)、黒質 (Brain, substantia nigra)、視床 ( Brain, thalamus) において、112_01 (配列番号142) で表されるエクソンの挿入されるパターンの発現が多くみられた（表14）。
また、NT2細胞では、分化の段階によりエクソンの選択性が大きく変化することがわかった。NT2細胞の分化について詳細に比較すると、未分化のNT2細胞 NT2RA (-) とレチノイン酸を添加し分化誘導をした初期のステージであるNT2RA (+) 48hr, NT2RA (+) 1week では、112_02 (配列番号145) で表される既存の公共DBに登録されているエクソンの欠失したパターンの発現の方が多いが、神経細胞に分化後のものが多く含まれると予測されるNT2RA (+) 5weeksでその発現量が逆転し、NT2RA (+) 5weeks, Inh (+) 及び NT2 Neuron でも112_01 (配列番号142) で表されるエクソンの挿入されるパターンの発現が多くみられた（表14）。
これらの結果より、112_01 (配列番号142) という検出領域で示される新たに取得したcDNAの選択的なエクソン領域112_[1]-N1 (配列番号134) の発現を比較することにより脳の中でも特に小脳 (Brain, cerebellum)、海馬 (Brain, hippocampus)と扁桃 (Brain, amygdala)、尾状核 (Brain, caudate nucleus)、黒質 (Brain, substantia nigra)、視床 (Brain, thalamus) などの部位に特異的なマーカーとして、神経細胞の分化又は再生の段階でも特に神経に分化又は再生した細胞を検出する分化マーカーとして用いることが可能になることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても分化マーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-BRACE2044661.1においてPrimer112_01R (配列番号141) がプライミングする363〜390塩基目を含む上流配列112_[1]_1-N5 (配列番号149)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer112_01F (配列番号140) とPrimer112_01R (配列番号141) によって増幅される領域112_01 (配列番号142) 。
実施例１１：クラスターchr12+1658（データセット：095）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr12+1658 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体12番、108,470,000 bp〜 108,500,000 bp) にゲノムマッピングされた7配列の全長cDNA [D-BRCAN2027778.1, D-3NB692002462.1, BC016140.1, C-NT2RP3000875, ENST00000228510, M88468.1, NM_000431.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより以下のように主に3種類に分類できた。
[1] D-3NB692002462.1
[2] D-BRCAN2027778.1
[3] BC016140.1, ENST00000228510, M88468.1, NM_000431.1
[1]、[2]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[3]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[3]と比較すると、ORF領域内に、[3]の第3、第4エクソンに相当する部分が欠失しているため、ORF領域が異なっていた。
[2]は、既知の[3]と比較すると、ORF領域内に、[3]の第4エクソンに相当する部分が欠失しているため、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[3]の3種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、エクソンが欠失といった異なるスプライスパターンをもつことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-3NB692002462.1（[1]）の特徴
095_[1]_1-N0 (配列番号150) : D-3NB692002462.1の核酸配列全領域
095_[1]_1-NA0 (配列番号151) : D-3NB692002462.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
095_[1]_1-A0 (配列番号152) : D-3NB692002462.1のアミノ酸配列全領域
既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_000431.1の303〜603塩基に存在する301塩基のエクソン (配列番号155) がD-3NB692002462.1の287〜288塩基の領域には存在せず欠失している (配列番号153)。NM_000431.1の翻訳開始点はD-3NB692002462.1と共有する第1エクソン上に存在するが、D-3NB692002462.1では301塩基の欠失によりフレームが変化するため翻訳開始点がNM_000431.1に比べ3’側にシフトし、D-3NB692002462.1の343塩基目が翻訳開始点となる。その為、NM_000431.1よりN末端のアミノ酸配列が194残基短くなっていた。
095_[1]_1-N1 (配列番号153) : D-3NB692002462.1の欠失核酸配列領域
095_[1]_1-N2 (配列番号154) : D-3NB692002462.1の343基目を翻訳開始点とするORFの5’UTR領域342塩基
095_[1]_C-N1 (配列番号155) : D-3NB692002462.1の287〜288塩基の領域に挿入されるNM_000431.1の303〜603塩基の領域に存在する301塩基のエクソン核酸配列
095_[1]_C-A1 (配列番号156) : D-3NB692002462.1の1,250〜1,251塩基の領域に挿入されるNM_000431.1の303〜603塩基の領域に存在する301塩基のエクソン核酸配列に関わるアミノ酸配列101残基
この変化に伴いNM_000431.1の128〜346アミノ酸目に存在しているPfamモチーフ ”GHMP kinase putative ATP-binding protein” がD-3NB692002462.1では消失していた。
３）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-BRCAN2027778.1（[2]）の特徴
095_[2]_1-N0 (配列番号157) : D-BRCAN2027778.1の核酸配列全領域
095_[2]_1-NA0 (配列番号158) : D-BRCAN2027778.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
095_[2]_1-A0 (配列番号159) : D-BRCAN2027778.1のアミノ酸配列全領域
既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_000431.1の448〜603塩基に存在する156塩基のエクソン (配列番号162) がD-BRCAN2027778.1の422〜423塩基の領域には存在せず欠失している (配列番号160)。
095_[2]_1-N1 (配列番号160) : D-BRCAN2027778.1の欠失核酸配列領域
095_[2]_1-A1 (配列番号161) : D-BRCAN2027778.1の変化しているアミノ酸配列領域
095_[2]_1-N2 (配列番号160と同一) : D-BRCAN2027778.1の欠失領域中のORF核酸配列領域
095_[2]_1-A2 (配列番号161と同一) : D-BRCAN2027778.1の欠失領域に関わるORFアミノ酸領域
095_[2]_C-N1 (配列番号162) : D-BRCAN2027778.1の422〜423塩基の領域に挿入されるNM_000431.1の448〜603塩基の領域に存在する156塩基のエクソン核酸配列
095_[2]_C-A1 (配列番号163) : D-BRCAN2027778.1の423〜424塩基の領域に挿入されるNM_000431.1の448〜603塩基の領域に存在する156塩基のエクソン核酸配列に関わるアミノ酸配列101残基
４）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマー及びTaqManプローブの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
095_01 - [1]のcDNAパターンのエクソンが欠失している領域の境界にある配列情報を利用して特異的に抽出した領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンにおいて、ORFを変化させているエクソンの欠失領域
→Primer095_01F (配列番号164) とPrimer095_01R (配列番号165) によって増幅される断片095_01 (配列番号166)
使用したTaqManプローブ095_01TP：(配列番号167)
095_02 - [2]のcDNAパターンのエクソンが欠失している領域の境界にある配列情報を利用して特異的に抽出した領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[2]のcDNAパターンにおいて、ORFを変化させているエクソンの欠失領域
→Primer095_02F (配列番号168) とPrimer095_02R (配列番号169) によって増幅される断片095_02 (配列番号170)
使用したTaqManプローブ095_02TP：(配列番号171)
095_03 -既存の公共DBに登録されている[3]のcDNAパターンの[1]、[2]の欠失領域と比較した場合にどちらとも区別できるような特異的な領域であり、[1]、[2]を比較検討するためのコントロール
→Primer095_03F (配列番号172) とPrimer095_03R (配列番号173) によって増幅される断片095_03 (配列番号174)
使用したTaqManプローブ095_03TP：(配列番号175)
095_04 -[1]〜[3]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]、[2]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[3]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer095_04F (配列番号176) とPrimer095_04R (配列番号177) によって増幅される断片095_04 (配列番号178)
使用したTaqManプローブ095_04TP：(配列番号179)
上記に示された[1]〜[3] のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が3配列存在し、その由来はNB69細胞が1配列 (解析母数 8,153)、NT2細胞をレチノイン酸(RA) 処理誘導 (NT2RP) が1配列 (解析母数 39,242)、SK-N-MC細胞 (Neuroepithelioma) が1配列 (解析母数 7,700) であった。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[2]のパターンでは5’末端配列が3配列存在し、その由来はアルツハイマー患者大脳皮質組織［BRALZ：アルツハイマー患者大脳皮質 (Brain, cortex, Alzheimer)］のmRNAから作製したcDNAライブラリーから、全脳組織 ［BRAWH：全脳 (Brain, whole)］のmRNAと重複するcDNAをサブトラクトしたライブラリー (BRALZ−BRAWH) が1配列 (解析母数 157)、尾状核(Brain, caudate nucleus) が1配列 (解析母数25,786)、NT2細胞をレチノイン酸処理と生育阻害剤処理により神経分化後、神経を濃縮回収 (NT2NE) が1配列 (解析母数 16,337) であった。
既存の公共DBに登録されているcDNA の[3]のパターンでは5’末端配列が34配列存在し、その由来は小脳 (Brain, cerebellum) が4配列 (解析母数 82,880)、精巣 (Testis) が4配列 (解析母数 90,188)、NT2細胞をRA処理と生育阻害剤処理により神経分化後、神経を濃縮回収(NT2NE)が3配列 (解析母数 16,337)、全脳 (Brain, whole) が2配列 (解析母数 59,069)、視床下核 (Brain, subthalamic nucleus) が2配列 (解析母数 16,308)、腎臓(Kidney) が2配列 (解析母数 17,008)、胸腺 (Thymus) が2配列 (解析母数 70,578)など様々な組織で発現していた。
この結果より、[1]のエクソンが欠失するパターンは、分化したNT2細胞などで発現している事がわかった。また、[2]のエクソンが欠失するパターンは、脳での発現が多いことがわかった。[3]の既知の配列は、[1]、[2]のパターンに比べ様々な臓器での発現が見られた。つまり、この染色体領域において、[1]、[2]のパターンように、エクソンの選択性で、アミノ酸配列が変化し、異なるタンパク質を発現させるようなmRNAのパターン変化の選択機構が特定の組織で起こる可能性が考えられた。
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
組織間でおこるエクソンの選択性によるタンパク質発現の多様性の変化を検出するために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表15に示す。
Figure 0005378202
実施例3記載の海馬(Brain, hippocampus)、全脳 (Brain ,whole)、胎児脳 (Brain, Fetal)、アルツハイマー患者大脳皮質 (ALZ Visual Cortex Occipital)、7種類の分化段階のNT2細胞など16サンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合させたサンプル (Mix, viscus tissues) を用いて比較した。
095_01 (配列番号166) と095_02 (配列番号170) で比較されるエクソンの欠失の選択性によってORFが変化する比率は、以下の脳、NT2細胞の分化段階で大きく変化していた。
095_01 (配列番号166) で表されるエクソンの欠失するパターンの発現は、未分化のNT2細胞 NT2RA (-) とレチノイン酸を添加して分化誘導をした初期のステージであるNT2RA (+) 1weekまでは発現が多い。分化誘導後期のNT2RA (+) 5weeksからNT2RA(+) 5weeks, Inh (+) まで発現が低くなるが、NT2 Neuronになると再び多く発現していた（表15）。
095_02 (配列番号170) で表されるエクソンの欠失するパターンの発現は、未分化のNT2細胞 NT2RA (-) とレチノイン酸を添加して分化誘導をした初期のステージであるNT2RA (+) 24hrまでは発現が多い。分化誘導後期のNT2RA (+) 5weeksからNT2RA (+) 5weeks, Inh (+)、NT2 Neuronになると発現量は低くなっていた（表15）。
これらの結果より、095_01 (配列番号166)、095_02 (配列番号170) という検出領域で示される新たに取得したcDNAの選択的なエクソン領域095_[1]_1-N1(配列番号153)、095_[2]_1-N1 (配列番号160) の発現を比較することにより神経細胞の分化又は再生の段階でも特に神経細胞への分化の初期段階を検出する分化マーカーとして用いることが可能になることが立証された。
さらに、095_01 (配列No.095-17)という検出領域で示される新たに取得したcDNAの選択的なエクソン領域095_[1]_1-N1 (配列番号153) は脳に特異的なマーカーとして、神経細胞の分化又は再生の段階でも特に神経分化後又は神経再生後の細胞を検出する分化マーカーの一つとして用いることが可能になることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても神経細胞の分化又は再生を検出する分化マーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-3NB692002462.1においてPrimer095_01R (配列番号165) がプライミングする304〜326塩基目を含む上流配列095_[1]_1-N3 (配列番号180)。
[2]のcDNAパターンのD-BRCAN2027778.1においてPrimer095_02R (配列番号169) がプライミングする444〜466塩基目を含む上流配列095_[2]_1-N3 (配列番号181)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer095_01F (配列番号164) とPrimer095_01R (配列番号165) によって増幅される領域095_01 (配列番号166)
[2]のcDNAパターンにおいてPrimer095_02F (配列番号168) とPrimer095_02R (配列番号169) によって増幅される領域095_02 (配列番号170)
実施例１２：クラスターchr12-1875（データセット：017）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr12-1875 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体12番、7,840,000 bp〜 7,960,000 bp) にゲノムマッピングされた10配列の全長cDNA [D-NT2RI3001005.1, D-NT2RI3005261.1, AF481879.1, AL110298.1, AL832448.1, BC060766.1, C-TESTI1000257, C-TESTI4028880, ENST00000340749, NM_153449.2] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより4種類に分類されるが、主なものとして下記の2種類が存在した。
[1] D-NT2RI3001005.1, D-NT2RI3005261.1
[2] AF481879.1, C-TESTI4028880 (AK126026.1), NM_153449.2
[1]は我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既知の[2]よりも上流にある染色体領域より発現し、[2]と相同性のない新しいエクソン上に翻訳開始点をもつため、ORF領域が異なっていた。
[1]、[2]の2種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-NT2RI3001005.1（[1]）の特徴
017_[1]_1-N0 (配列番号182) : D-NT2RI3001005.1の核酸配列全領域
017_[1]_1-NA0 (配列番号183) : D-NT2RI3001005.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
017_[1]_1-A0 (配列番号184) : D-NT2RI3001005.1のアミノ酸配列全領域
D-NT2RI3001005.1の1〜153塩基 (配列番号185) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_153449.2では存在しないエクソンでありNM_153449.2と相同性がない。このエクソン上に翻訳開始点が存在する為、N末端側のアミノ酸が44残基 (配列番号186) 変化していた。
017_[1]_1-N1 (配列番号185) : D-NT2RI3001005.1の153塩基の挿入核酸配列領域
017_[1]_1-A1 (配列番号186) : D-NT2RI3001005.1の44残基の挿入アミノ酸配列領域
017_[1]_1-N2 (配列番号187) : D-NT2RI3001005.1の153塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
017_[1]_1-A2 (配列番号186と同一) : D-NT2RI3001005.1の153塩基の挿入領域中のORFアミノ酸配列領域
３）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-NT2RI3005261.1（[1]）の特徴
017_[1]_2-N0 (配列番号188) : D-NT2RI3005261.1の核酸配列全領域
017_[1]_2-NA0 (配列番号189) : D-NT2RI3005261.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
017_[1]_2-A0 (配列番号190) : D-NT2RI3005261.1のアミノ酸配列全領域
D-NT2RI3005261.1の1〜153塩基 (配列番号191) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_153449.2では存在しないエクソンでありNM_153449.2と相同性がない。このエクソン上に翻訳開始点が存在する為、N末端側のアミノ酸が44残基 (配列番号192) 変化していた。
017_[1]_2-N1 (配列番号191) : D-NT2RI3005261.1の153塩基の挿入核酸配列領域
017_[1]_2-A1 (配列番号192) : D-NT2RI3005261.1の44残基の挿入アミノ酸配列領域
017_[1]_2-N2 (配列番号193) : D-NT2RI3005261.1の153塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
017_[1]_2-A2 (配列番号192と同一) : D-NT2RI3005261.1の153塩基の挿入領域中のORFアミノ酸配列領域
４）我々が取得し全長cDNA配列解析を行い公共DBに登録済みのC-TESTI4028880 (AK126026.1)（[2]）の特徴
017_[2]_1-N0 (配列番号194) : C-TESTI4028880の核酸配列全領域
017_[2]_1-NA0 (配列番号195) : C-TESTI4028880の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
017_[2]_1-A0 (配列番号196) : C-TESTI4028880のアミノ酸配列全領域
５）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
017_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer017_01F (配列番号197) とPrimer017_01R (配列番号198) によって増幅される断片017_01 (配列番号199)
017_03 - [1]〜[2]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer017_03F (配列番号200) とPrimer017_03R (配列番号201) によって増幅される断片017_03 (配列番号202)
上記に示された[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンのそれぞれの特異的な領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が14配列存在し、その由来はNT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間(NT2RI) が13配列 (解析母数 32,662)、NT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導 (NT2RP) が1配列 (解析母数 39,242) であった。
既存の公共DBに登録されているcDNA の[2]のパターンでは5’末端配列が86配列存在し、その由来は精巣 (Testis) が85配列 (解析母数 90,188)、NT2細胞をRA処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間 (NT2RI) が1配列 (解析母数 32,662) であった。
この結果より、[1]の転写開始点は、分化後のNT2細胞で特異的に発現していることがわかった。また、[2]の転写開始点からは、精巣 (Testis) での発現が非常に多い。これにより、分化後のNT2細胞という神経細胞の分化が起こっているという状況の時だけ、この染色体領域において、転写の機構が異なり、用いられている転写開始点も異なる可能性が考えられた。
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
どのような状態のときに発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表16及び表17に示す。
Figure 0005378202
Figure 0005378202
実施例3記載の海馬(Brain, hippocampus)、全脳 (Brain, whole)、胎児脳 (Brain, Fetal)、アルツハイマー患者大脳皮質 (ALZ Visual Cortex Occipital)、7種類の分化段階のNT2細胞、8種類の正常組織、及び8種類の腫瘍組織など32サンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合させたサンプル (Mix, viscus tissues) を用いて比較した。
017_01 (配列番号199) で表される転写開始点は、NT2細胞において選択的に使われる。つまりNT2細胞では未分化、分化にかかわらず全ての段階で上流の転写開始点からの転写の割合がかなり多くなっていた（表16・表17）。
これらの結果より、017_01 (配列番号199) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域（転写開始点付近の領域）017_[1]_1-N1 (配列番号185) 及び017_[1]_2-N1 (配列番号191) の発現を検出することにより、神経細胞のマーカーとして用いることが可能になることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても神経細胞のマーカーとしてとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-NT2RI3001005.1においてPrimer017_01R (配列番号198) がプライミングする143〜159塩基目を含む上流配列017_[1]_1-N3 (配列番号203)。
[1]のcDNAパターンのD-NT2RI3005261.1においてPrimer017_01R (配列番号198) がプライミングする143〜159塩基目を含む上流配列017_[1]_2-N3 (配列番号204)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer017_01F (配列番号197) とPrimer017_01R (配列番号198) によって増幅される領域017_01 (配列番号199)。
実施例１３：クラスターchr3-1507（データセット：023）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr3-1507 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体3番、73,500,000 bp〜 73,800,000 bp) にゲノムマッピングされた15配列の全長cDNA [D-OCBBF2010718.1, D-OCBBF3004194.1, D-NT2RP8000826.1, D-NT2RP7007268.1, D-BRAWH3008172.1, D-BRAWH3011965.1, AB029018.1, AL049958.1, AL157498.1, BC014432.1, C-HEMBA1005489, ENST00000263666, ENST00000308537, ENST00000319719, NM_015009.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより8種類に分類されるが、主なものとして以下の5種類が存在した。
[1] D-OCBBF2010718.1, D-OCBBF3004194.1
[2] D-NT2RP8000826.1, D-NT2RP7007268.1
[3] D-BRAWH3008172.1
[4] D-BRAWH3011965.1
[5] AB029018.1, ENST00000263666, NM_015009.1
[1]、[2]、[3]、[4]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[5]とORFが異なっていた。
[1]、[2]、[3]、[4]は、既知の[5]よりも下流にある染色体領域より発現し、[5]とは異なる翻訳開始点をもつため、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[5]の5種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-OCBBF2010718.1（[1]）の特徴
023_[1]_1-N0 (配列番号205) : D-OCBBF2010718.1の核酸配列全領域
023_[1]_1-NA0 (配列番号206) : D-OCBBF2010718.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
023_[1]_1-A0 (配列番号207) : D-OCBBF2010718.1のアミノ酸配列全領域
D-OCBBF2010718.1の1〜212塩基 (配列番号208) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_015009.1では存在しないエクソンでありNM_015009.1と相同性がない。このエクソン上に翻訳開始点が存在する為、N末端側のアミノ酸が23残基 (配列番号209) 変化していた。
023_[1]_1-N1 (配列番号208) : D-OCBBF2010718.1の212塩基の挿入核酸配列領域
023_[1]_1-A1 (配列番号209) : D-OCBBF2010718.1の23残基の挿入アミノ酸配列領域
023_[1]_1-N2 (配列番号210) : D-OCBBF2010718.1の212塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
023_[1]_1-A2 (配列番号209と同一) : D-OCBBF2010718.1の212塩基の挿入領域中のORFアミノ酸配列領域
３）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-OCBBF3004194.1（[1]）の特徴
023_[1]_2-N0 (配列番号211) : D-OCBBF3004194.1の核酸配列全領域
023_[1]_2-NA0 (配列番号212) : D-OCBBF3004194.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
023_[1]_2-A0 (配列番号213) : D-OCBBF3004194.1のアミノ酸配列全領域
D-OCBBF3004194.1の1〜197塩基 (配列番号214) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_015009.1では存在しないエクソンでありNM_015009.1と相同性がない。このエクソン上に翻訳開始点が存在する為、N末端側のアミノ酸が23残基 (配列番号215) 変化していた。
023_[1]_2-N1 (配列番号214) : D-OCBBF3004194.1の197塩基の挿入核酸配列領域
023_[1]_2-A1 (配列番号215) : D-OCBBF3004194.1の23残基の挿入アミノ酸配列領域
023_[1]_2-N2 (配列番号216) : D-OCBBF3004194.1の197塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
023_[1]_2-A2 (配列番号215と同一) : D-OCBBF3004194.1の197塩基の挿入領域中のORFアミノ酸配列領域
４）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-NT2RP8000826.1（[2]）の特徴
023_[2]_1-N0 (配列番号217) : D-NT2RP8000826.1の核酸配列全領域
023_[2]_1-NA0 (配列番号218) : D-NT2RP8000826.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
023_[2]_1-A0 (配列番号219) : D-NT2RP8000826.1のアミノ酸配列全領域
D-NT2RP8000826.1の1〜178塩基 (配列番号220) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_015009.1では存在しないエクソンでありNM_015009.1と相同性がない。このエクソン上に翻訳開始点が存在する為、N末端側のアミノ酸が28残基 (配列番号221) 変化していた。
023_[2]_1-N1 (配列番号220) : D-NT2RP8000826.1の178塩基の挿入核酸配列領域
023_[2]_1-A1 (配列番号221) : D-NT2RP8000826.1の28残基の挿入アミノ酸配列領域
023_[2]_1-N2 (配列番号222) : D-NT2RP8000826.1の178塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
023_[2]_1-A2 (配列番号221と同一) : D-NT2RP8000826.1の178塩基の挿入領域中のORFアミノ酸配列領域
５）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-NT2RP7007268.1（[2]）の特徴
023_[2]_2-N0 (配列番号223) : D-NT2RP7007268.1の核酸配列全領域
023_[2]_2-NA0 (配列番号224) : D-NT2RP7007268.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
023_[2]_2-A0 (配列番号225) : D-NT2RP7007268.1のアミノ酸配列全領域
D-NT2RP7007268.1の1〜178塩基 (配列番号226) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_015009.1では存在しないエクソンでありNM_015009.1と相同性がない。このエクソン上に翻訳開始点が存在する為、N末端側のアミノ酸が28残基 (配列番号227) 変化していた。
023_[2]_2-N1 (配列番号226) : D-NT2RP7007268.1の178塩基の挿入核酸配列領域
023_[2]_2-A1 (配列番号227) : D-NT2RP7007268.1の28残基の挿入アミノ酸配列領域
023_[2]_2-N2 (配列番号228) : D-NT2RP7007268.1の178塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
023_[2]_2-A2 (配列番号227と同一) : D-NT2RP7007268.1の178塩基の挿入領域中のORFアミノ酸配列領域
６）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-BRAWH3008172.1（[3]）の特徴
023_[3]_1-N0 (配列番号229) : D-BRAWH3008172.1の核酸配列全領域
023_[3]_1-NA0 (配列番号230) : D-BRAWH3008172.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
023_[3]_1-A0 (配列番号231) : D-BRAWH3008172.1のアミノ酸配列全領域
D-BRAWH3008172.1の1〜169塩基 (配列番号232) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_015009.1では存在しないエクソンでありNM_015009.1と相同性がない。この変化に伴い、D-BRAWH3008172.1の翻訳開始点はNM_015009.1に比べ3’側にシフトし、D-BRAWH3008172.1の281塩基目が翻訳開始点となる。その為、NM_015009.1よりアミノ酸配列が343残基短くなっていた。
023_[3]_1-N1 (配列番号232) : D-BRAWH3008172.1の169塩基の挿入核酸配列領域
023_[3]_1-N2 (配列番号233) : D-BRAWH3008172.1の281基目を翻訳開始点とするORFの5’UTR領域280塩基
７）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-BRAWH3011965.1（[4]）の特徴
023_[4]_1-N0 (配列番号234) : D-BRAWH3011965.1の核酸配列全領域
023_[4]_1-NA0 (配列番号235) : D-BRAWH3011965.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
023_[4]_1-A0 (配列番号236) : D-BRAWH3011965.1のアミノ酸配列全領域
D-BRAWH3011965.1の1〜311塩基 (配列番号237) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_015009.1では存在しないエクソンでありNM_015009.1と相同性がない。このエクソン上に翻訳開始点が存在する為、N末端側のアミノ酸が4残基 (配列番号238)変化していた。
023_[4]_1-N1 (配列番号237) : D-BRAWH3011965.1の311塩基の挿入核酸配列領域
023_[4]_1-A1 (配列番号238) : D-BRAWH3011965.1の4残基の挿入アミノ酸配列領域
023_[4]_1-N2 (配列番号239) : D-BRAWH3011965.1の311塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
023_[4]_1-A2 (配列番号238と同一) : D-BRAWH3011965.1の311塩基の挿入領域中のORFアミノ酸配列領域
８）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
023_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer023_01F (配列番号240) とPrimer023_01R (配列番号241) によって増幅される断片023_01 (配列番号242)
023_02 - [2]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[2]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer023_02F (配列番号243) とPrimer023_02R (配列番号244) によって増幅される断片023_02 (配列番号245)
023_03 - [3]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[3]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer023_03F (配列番号246) とPrimer023_03R (配列番号247) によって増幅される断片023_03 (配列番号248)
023_04 - [4]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[4]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer023_04F (配列番号249) とPrimer023_04R (配列番号250) によって増幅される断片023_04 (配列番号251)
023_05 -既存の公共DBに登録されている[5]のcDNAパターンの[1]、[2]、[3]、[4]のどれとも区別できるような特異的な領域であり、[1]、[2]、[3]、[4]を比較検討するためのコントロール
→Primer023_05F (配列番号252) とPrimer023_05R (配列番号253) によって増幅される断片023_05 (配列番号254)
023_06 -[1]〜[5]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]、[2]、[3]、[4]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[5]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer023_06F (配列番号255) とPrimer023_06R (配列番号256) によって増幅される断片023_06 (配列番号257)
上記に示された[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンのそれぞれの特異的な領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が32配列存在し、その由来はNT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導 (NT2RP) が21配列 (解析母数 39,242)、胎児脳 (Brain, Fetal) が8配列 (解析母数 103,138)、NT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間(NT2RI) が1配列 (解析母数 32,662)、海馬 (Brain, hippocampus) が1配列 (解析母数 57,918)、扁桃 (Brain, amygdala) が1配列 (解析母数 58,640) であった。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[2]のパターンでは5’末端配列が20配列存在し、その由来はNT2細胞をレチノイン酸 (RA) 処理誘導 (NT2RP) が20配列 （解析母数39,242）であった。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[3]のパターンでは5’末端配列が16配列存在し、その由来は全脳 (Brain, whole) が8配列(解析母数 59,069)、扁桃 (Brain, amygdala) が5配列 (解析母数 58,640)、腎臓癌 (Kidney, Tumor) が1配列 (解析母数 15,970)、視床 (Brain, thalamus) が1配列 (解析母数 53,267)、精巣(Testis) が1配列 (解析母数 90,188) であった。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[4]のパターンでは5’末端配列が5配列存在し、その由来は全脳 (Brain, whole) が3配列(解析母数 59,069)、海馬 (Brain, hippocampus)が1配列 (解析母数 57,918)、視床 (Brain, thalamus) が1配列 (解析母数 53,267) であった。
既存の公共DBに登録されているcDNA の[5]のパターンでは5’末端配列が2配列存在し、その由来は胃癌 (Stomach, Tumor) が1配列 (解析母数 2,757)、前立腺 (Prostate) が1配列 (解析母数 16,671) であった。
この結果より、[1]の転写開始点は、分化したNT2細胞と胎児脳での発現が多いことがわかった。[2]の転写開始点は、分化したNT2細胞での発現が多いことがわかった。[3]、[4]の転写開始点は、脳での発現が多いことがわかった。[5]の既知の配列は、胃癌や前立腺での発現が見られた。つまり、この染色体領域において、様々な臓器、細胞の状態により転写の機構が異なり、用いられている転写開始点も異なる可能性が考えられた。
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
どのような状態のときに発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表18-1、18-2及び表19-1、19-2に示す。
Figure 0005378202
Figure 0005378202
Figure 0005378202
Figure 0005378202
実施例3記載の海馬(Brain, hippocampus)、全脳 (Brain, whole)、胎児脳 (Brain, Fetal)、アルツハイマー患者大脳皮質 (ALZ Visual Cortex Occipital)、7種類の分化段階のNT2細胞、7種類の脳組織など23サンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合させたサンプル (Mix, viscus tissues) を用いて比較した。
023_01 (配列番号242)、023_02 (配列番号245)、023_04 (配列番号251) で表される転写開始点は分化後のNT2細胞、特に分化のステージが進むNT2RA (+) 1week で多く発現し、023_01 (配列番号242)はNT2RA (+) 5weeksで最も多く発現していた（表18-1、18-2・表19-1、19-2）。また、脳組織では023_01 (配列番号242)、023_03 (配列番号248)、023_04 (配列番号251) で表される転写開始点からの発現が多く、特に胎児脳での発現が多かった（表18-1、18-2・表19-1、19-2）。
これらの結果より、023_01 (配列番号242)、023_02 (配列番号245)、023_03 (配列番号248)、023_04 (配列番号251) という検出領域で示される新たに取得したcDNAの転写開始点領域023_[1]_1-N1 (配列番号208)、023_[1]_2-N1 (配列番号214)、023_[2]_1-N1 (配列番号220)、023_[2]_2-N1 (配列番号226)、023_[3]_1-N1 (配列番号232)、023_[4]_1-N1 (配列番号237) の発現を比較することにより、神経細胞の分化又は再生の段階を検出する分化マーカーや脳に特異的なマーカーとして用いることが可能になることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても神経細胞の分化又は再生の段階を検出する分化マーカーや脳に特異的なマーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-OCBBF2010718.1において Primer023_01R (配列番号241) がプライミングする191〜219塩基目を含む上流配列023_[1]_1-N3 (配列番号258)。
[1]のcDNAパターンのD-OCBBF3004194.1において Primer023_01R (配列番号241) がプライミングする181〜204塩基目を含む上流配列023_[1]_2-N3 (配列番号259)。
[2]のcDNAパターンのD-NT2RP8000826.1において Primer023_02R (配列番号244) がプライミングする158〜179塩基目を含む上流配列023_[2]_1-N3 (配列番号260)。
[2]のcDNAパターンのD-NT2RP7007268.1においてPrimer023_02R (配列番号244) がプライミングする161〜180塩基目を含む上流配列023_[2]_2-N3 (配列番号261)。
[3]のcDNAパターンのD-BRAWH3008172.1においてPrimer023_03R (配列番号247) がプライミングする293〜316塩基目を含む上流配列023_[3]_1-N3 (配列番号262)。
[4]のcDNAパターンのD-BRAWH3011965.1において Primer023_04R (配列番号250) がプライミングする65〜84塩基目を含む上流配列023_[4]_1-N3 (配列番号263)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer023_01F (配列番号240) とPrimer023_01R (配列番号241) によって増幅される領域023_01 (配列番号242) 。
[2]のcDNAパターンにおいてPrimer023_02F (配列番号243) とPrimer023_02R (配列番号244) によって増幅される領域023_02 (配列番号245) 。
[3]のcDNAパターンにおいてPrimer023_03F (配列番号246) とPrimer023_03R (配列番号247) によって増幅される領域023_03 (配列番号248) 。
[4]のcDNAパターンにおいてPrimer023_04F (配列番号249) とPrimer023_04R (配列番号250) によって増幅される領域023_04 (配列番号251) 。
実施例１４：全長cDNA配列のORF情報と相同性解析結果及びモチーフ等の解析結果
我々が新たに取得し全長cDNA配列解析行った19配列の全長cDNAの機能を知るためにORF予測とアノテーション解析を行った。アノテーション解析結果は比較するデータベースや解析ソフトがバージョンアップされた時には更新することができる。それにより、アノテーションが記載されていないものにも同一条件で新たに付けることが可能となることがある。
１）全長cDNA配列解析したcDNAのORF予測
ATGpr (A. Salamov et al. (1998) Bioinformatics 14: 384-390) 、TRins (K. Kimura et al. (2003) Genome Informatics 14: 456-457) などのORF予測・評価システムを用い全長cDNA配列からORFを予測した。全長cDNA配列から予測したORF領域情報を以下に示す。
ORF領域の記載方法は「DDBJ/EMBL/GenBank Feature Table Definition」(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/collab/FT/index.html) の規則に則って記載した。ORF開始位置はメチオニンをコードする塩基である ”ATG” の一文字目であり、終止位置は終止コドンの3文字目を示している。これを「..」で区切り記載した。ただし、終止コドンが現れないORFについては記載規則に則って” > ” を用いて終止位置を記載した。
- - - - - - - - - - - - - -
cDNA配列名 ORF領域
- - - - - - - - - - - - - -
D-UTERU2026184.1 191..2119
D-BRACE3000012.1 465..2558
D-NT2RP8004156.1 131..1387
D-NT2RI3005525.1 45..1292
D-NT2RP8004592.1 620..1183
D-NT2RI2014164.1 162..1397
D-BRAMY2029564.1 143..1657
D-BRHIP2003515.1 84..707
D-BRACE2044661.1 297..878
D-3NB692002462.1 343..951
D-BRCAN2027778.1 52..1086
D-NT2RI3001005.1 22..1629
D-NT2RI3005261.1 22..1629
D-OCBBF2010718.1 144..2495
D-OCBBF3004194.1 129..2480
D-NT2RP8000826.1 95..2461
D-NT2RP7007268.1 95..2461
D-BRAWH3008172.1 281..2452
D-BRAWH3011965.1 300..>1574
- - - - - - - - - - - - - -
２）BLASTPによる相同性解析結果 （SwissProt）
実施例14の1）に記載した19配列のORFについてBLASTP (blastall 2.2.6; ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) を用い、2006年8月22日のバージョンのSwissProt (ftp://us.expasy.org/databases/swiss-prot/) に対して相同性解析を行った。相同性解析を行った結果より最も高い相同性を示したものでE-valueの値が1E-10以下の相同性を示すものを以下に記載する。ただし、次の条件に当てはまる時は該当候補を選択せず次候補を記載した。
「ALU SUBFAMILY」で始まるdefinitionのもの
「Alu subfamily」で始まるdefinitionのもの
「!!!! ALU SUBFAMILY」で始まるdefinitionのもの
「B-CELL GROWTH FACTOR PRECURSOR」で始まるdefinitionのもの
「NRK2」を含むdefinitionのもの
「PROLINE-RICH」で始まるdefinitionのもの
「GLYCINE-RICH」で始まるdefinitionのもの
「EXTENSIN PRECURSOR」で始まるdefinitionのもの
「COLLAGEN」で始まるdefinitionのもの
「100KD」で始まるdefinitionのもの
「RETROVIRUS-RELATED POL POLYPROTEIN」で始まるdefinitionのもの
「CUTICLE COLLAGEN」で始まるdefinitionのもの
「HYPOTHETICAL」で始まるdefinitionのもの
「Hypothetical」で始まるdefinitionのもの
「SALIVARY PROLINE-RICH PROTEIN」で始まるdefinitionのもの
「IMMEDIATE-EARLY PROTEIN」で始まるdefinitionのもの
アクセッションNoが「P49646」であるもの
各データは、cDNA配列名、ORF領域、ヒットデータのアクセッション番号、ヒットデータのDefinition、ヒットデータのキーワード、E-value、コンセンサス長 (アミノ酸長)、Identity、順に ”//” で区切って記載した。
D-UTERU2026184.1// 191..2119// Q8TF45// Zinc finger protein 418// DNA-binding; Metal-binding; Nuclear protein; Repeat; Repressor; Transcription; Transcription regulation; Zinc; Zinc-finger.// 0// 601// 100
D-BRACE3000012.1// 465..2558// Q8TF45// Zinc finger protein 418// DNA-binding; Metal-binding; Nuclear protein; Repeat; Repressor; Transcription; Transcription regulation; Zinc; Zinc-finger.// 0// 674// 99
D-NT2RP8004156.1// 131..1387// P31749// RAC-alpha serine/threonine-protein kinase (EC2.7.11.1) (RAC-PK-alpha) (Protein kinase B) (PKB)(C-AKT)// 3D-structure; Apoptosis; ATP-binding; Carbohydrate metabolism; Glucose metabolism; Glycogen biosynthesis; Glycogen metabolism; Kinase; Nuclear protein; Nucleotide-binding; Phosphorylation; Serine/threonine-protein kinase; Sugar transport; Transferase; Translation regulation; Transport.// 0// 418// 100
D-NT2RI3005525.1// 45..1292// Q7Z698// Sprouty-related, EVH1 domain-containingprotein 2 (Spred-2)// Membrane; Phosphorylation.// 0// 409// 99
D-NT2RI2014164.1// 162..1397// P27338// Amine oxidase [flavin-containing] B (EC1.4.3.4) (Monoamine oxidase type B) (MAO-B)// 3D-structure; Acetylation; Direct protein sequencing; FAD; Flavoprotein; Membrane; Mitochondrion; Oxidoreductase; Transmembrane.// 0// 367// 93
D-BRAMY2029564.1// 143..1657// P27338// Amine oxidase [flavin-containing] B (EC1.4.3.4) (Monoamine oxidase type B) (MAO-B)// 3D-structure; Acetylation; Direct protein sequencing; FAD; Flavoprotein; Membrane; Mitochondrion; Oxidoreductase; Transmembrane.// 0// 504// 100
D-BRHIP2003515.1// 84..707// P55327// Tumor protein D52 (N8 protein)// Coiled coil.// 7E-93// 184// 88
D-BRACE2044661.1// 297..878// P54709// Sodium/potassium-transporting ATPase subunitbeta-3 (Sodium/potassium- dependent ATPase beta-3subunit) (ATPB-3) (CD298 antigen)// Glycoprotein; Ion transport; Membrane; Potassium; Potassium transport; Signal-anchor; Sodium; Sodium transport; Sodium/potassium transport; Transmembrane; Transport.// 1E-90// 158// 97
D-3NB692002462.1// 343..951// Q03426// Mevalonate kinase (EC 2.7.1.36) (MK)// ATP-binding; Cataract; Cholesterol biosynthesis; Disease mutation; Kinase; Lipid synthesis; Nucleotide-binding; Peroxisome; Polymorphism; Steroid biosynthesis; Sterol biosynthesis; Transferase.// 1E-112// 202// 100
D-BRCAN2027778.1// 52..1086// Q03426// Mevalonate kinase (EC 2.7.1.36) (MK)// ATP-binding; Cataract; Cholesterol biosynthesis; Disease mutation; Kinase; Lipid synthesis; Nucleotide-binding; Peroxisome; Polymorphism; Steroid biosynthesis; Sterol biosynthesis; Transferase.// 0// 343// 86
D-NT2RI3001005.1// 22..1629// Q8TDB8// Solute carrier family 2, facilitated glucosetransporter member 14 (Glucose transporter type 14)// Alternative splicing; Developmental protein; Differentiation; Glycoprotein; Membrane; Spermatogenesis; Sugar transport; Transmembrane; Transport.// 0// 490// 99
D-NT2RI3005261.1// 22..1629// Q8TDB8// Solute carrier family 2, facilitated glucosetransporter member 14 (Glucose transporter type 14)// Alternative splicing; Developmental protein; Differentiation; Glycoprotein; Membrane; Spermatogenesis; Sugar transport; Transmembrane; Transport.// 0// 491// 100
D-OCBBF2010718.1// 144..2495// Q9UPQ7// PDZ domain-containing RING finger protein 3(Ligand of Numb-protein X 3) (Semaphorin cytoplasmicdomain-associated protein 3) (SEMACAP3 protein)// 3D-structure; Alternative splicing; Coiled coil; Metal-binding; Polymorphism; Repeat; Zinc; Zinc-finger.// 0// 758// 99
D-OCBBF3004194.1// 129..2480// Q9UPQ7// PDZ domain-containing RING finger protein 3(Ligand of Numb-protein X 3) (Semaphorin cytoplasmicdomain-associated protein 3) (SEMACAP3 protein)// 3D-structure; Alternative splicing; Coiled coil; Metal-binding; Polymorphism; Repeat; Zinc; Zinc-finger.// 0// 760// 99
D-NT2RP8000826.1// 95..2461// Q9UPQ7// PDZ domain-containing RING finger protein 3(Ligand of Numb-protein X 3) (Semaphorin cytoplasmicdomain-associated protein 3) (SEMACAP3 protein)// 3D-structure; Alternative splicing; Coiled coil; Metal-binding; Polymorphism; Repeat; Zinc; Zinc-finger.// 0// 759// 99
D-NT2RP7007268.1// 95..2461// Q9UPQ7// PDZ domain-containing RING finger protein 3(Ligand of Numb-protein X 3) (Semaphorin cytoplasmicdomain-associated protein 3) (SEMACAP3 protein)// 3D-structure; Alternative splicing; Coiled coil; Metal-binding; Polymorphism; Repeat; Zinc; Zinc-finger.// 0// 759// 99
D-BRAWH3008172.1// 281..2452// Q9UPQ7// PDZ domain-containing RING finger protein 3(Ligand of Numb-protein X 3) (Semaphorin cytoplasmicdomain-associated protein 3) (SEMACAP3 protein)// 3D-structure; Alternative splicing; Coiled coil; Metal-binding; Polymorphism; Repeat; Zinc; Zinc-finger.// 0// 722// 99
D-BRAWH3011965.1// 300..>1574// Q9UPQ7// PDZ domain-containing RING finger protein 3(Ligand of Numb-protein X 3) (Semaphorin cytoplasmicdomain-associated protein 3) (SEMACAP3 protein)// 3D-structure; Alternative splicing; Coiled coil; Metal-binding; Polymorphism; Repeat; Zinc; Zinc-finger.// 0// 421// 99
３）BLASTPによる相同性解析結果 (RefSeq)
実施例14の1）に記載した19配列のORFについてBLASTP (blastall 2.2.6; ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) を用い、2006年7月15日のバージョンのRefSeq (human, mouse, rat； ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/) に対して相同性解析を行った。相同性解析を行った結果より最も高い相同性を示したものでE-valueの値が1E-10以下の相同性を示すものを以下に記載する。ただし、次の条件に当てはまる時は該当候補を選択せず次候補を記載した。
「hypothetical protein FLJ」で始まるdefinitionのもの
「KIAA」で始まるdefinitionのもの
「hypothetical protein DKFZ」で始まるdefinitionのもの
「DKFZ」で始まるdefinitionのもの
「RIKEN cDNA」で始まるdefinitionのもの
「hypothetical protein MGC」で始まるdefinitionのもの
「hypothetical protein」 であるdefinitionのもの
「hypothetical protein PP」で始まるdefinitionのもの
「neuronal thread protein」であるdefinitionのもの
「clone FLB」で始まるdefinitionのもの
「hypothetical protein PRO」で始まるdefinitionのもの
「PRO0483 protein」であるdefinitionのもの
「MNC」を含むdefinitionのもの
「MOST-1」を含むdefinitionのもの
「similar to」で始まるdefinitionのもの
「TPR gene on Y」を含むdefinitionのもの
「HSPC」で始まるdefinitionのもの
「CGI-」で始まるdefinitionのもの
各データは、cDNA配列名、ORF領域、ヒットデータのアクセッション番号、ヒットデータのDefinition、E-value、コンセンサス長 (アミノ酸長)、Identity、順に ”//” で区切って記載した。
D-UTERU2026184.1// 191..2119// NP_597717.1// zinc finger protein 418 [Homo sapiens]// 0// 601// 100
D-BRACE3000012.1// 465..2558// NP_597717.1// zinc finger protein 418 [Homo sapiens]// 0// 674// 99
D-NT2RP8004156.1// 131..1387// NP_005154.2// v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 [Homo sapiens]// 0// 418// 100
D-NT2RI3005525.1// 45..1292// NP_861449.1// sprouty-related protein with EVH-1 domain 2 [Homo sapiens]// 0// 408// 99
D-NT2RP8004592.1// 620..1183// NP_003921.2// src family associated phosphoprotein 2 [Homo sapiens]// 1E-110// 187// 100
D-NT2RI2014164.1// 162..1397// NP_000889.3// amine oxidase (flavin-containing) [Homo sapiens]// 0// 367// 93
D-BRAMY2029564.1// 143..1657// NP_000889.3// amine oxidase (flavin-containing) [Homo sapiens]// 0// 504// 100
D-BRHIP2003515.1// 84..707// NP_001020424.1// tumor protein D52 isoform 2 [Homo sapiens]// 1E-110// 207// 100
D-BRACE2044661.1// 297..878// NP_001670.1// Na+/K+ -ATPase beta 3 subunit [Homo sapiens]// 5E-91// 158// 97
D-3NB692002462.1// 343..951// NP_000422.1// mevalonate kinase [Homo sapiens]// 1E-112// 202// 100
D-BRCAN2027778.1// 52..1086// NP_000422.1// mevalonate kinase [Homo sapiens]// 0// 343// 86
D-NT2RI3001005.1// 22..1629// NP_703150.1// glucose transporter 14 [Homo sapiens]// 0// 490// 99
D-NT2RI3005261.1// 22..1629// NP_703150.1// glucose transporter 14 [Homo sapiens]// 0// 491// 100
D-OCBBF2010718.1// 144..2495// NP_055824.1// PDZ domain containing RING finger 3 [Homo sapiens]// 0// 758// 99
D-OCBBF3004194.1// 129..2480// NP_055824.1// PDZ domain containing RING finger 3 [Homo sapiens]// 0// 760// 99
D-NT2RP8000826.1// 95..2461// NP_055824.1// PDZ domain containing RING finger 3 [Homo sapiens]// 0// 759// 99
D-NT2RP7007268.1// 95..2461// NP_055824.1// PDZ domain containing RING finger 3 [Homo sapiens]// 0// 759// 99
D-BRAWH3008172.1// 281..2452// NP_055824.1// PDZ domain containing RING finger 3 [Homo sapiens]// 0// 722// 99
D-BRAWH3011965.1// 300..>1574// NP_055824.1// PDZ domain containing RING finger 3 [Homo sapiens]// 0// 421// 99
４）Pfamによるモチーフ相同性解析結果
実施例14の1）に記載した19配列のORFについてPfam （ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/databases/Pfam/）を用い、モチーフ相同性解析を行った。解析プログラムにはhmmpfam v2.3.2を使用し、2005年11月バージョンのPfam19.0に対して解析を実施した。相同性解析を行った結果より最も高い相同性を示したものでE-valueの値が1E-10以下の相同性を示すものを以下に記載する。
各データは、cDNA配列名、ORF領域に続き、ヒットデータのアクセッション番号、ヒットデータの名前、ヒットデータのDescription、E-value、InterPro ID、順に”￥”で区切ったものをヒットデータの数だけの”//” 区切りで繰り返し記載した。
D-BRACE3000012.1// 465..2558// PF01352.15\KRAB\KRAB box\2.1e-20\IPR001909
D-NT2RP8004156.1// 131..1387// PF00069.14\Pkinase\Protein kinase domain\1.6e-113\IPR000719// PF07714.5\Pkinase_Tyr\Protein tyrosine kinase\1.3e-18\// PF00433.12\Pkinase_C\Protein kinase C terminal domain\1.4e-11\IPR000961
D-NT2RI3005525.1// 45..1292// PF05210.2\Sprouty\Sprouty protein (Spry)\2.7e-11\IPR007875
D-NT2RI2014164.1// 162..1397// PF01593.12\Amino_oxidase\Flavin containing amine oxidoreductase\9.2e-57\IPR002937
D-BRAMY2029564.1// 143..1657// PF01593.12\Amino_oxidase\Flavin containing amine oxidoreductase\5.8e-103\IPR002937
D-BRHIP2003515.1// 84..707// PF04201.4\TPD52\Tumour protein D52 family\1.5e-119\IPR007327
D-BRACE2044661.1// 297..878// PF00287.7\Na_K-ATPase\Sodium / potassium ATPase beta chain\3.1e-32\IPR000402
D-NT2RI3001005.1// 22..1629// PF00083.13\Sugar_tr\Sugar (and other) transporter\6.3e-200\IPR005828// PF07690.5\MFS_1\Major Facilitator Superfamily\1.1e-14\IPR011701
D-NT2RI3005261.1// 22..1629// PF00083.13\Sugar_tr\Sugar (and other) transporter\5.5e-200\IPR005828// PF07690.5\MFS_1\Major Facilitator Superfamily\1.1e-14\IPR011701
D-OCBBF2010718.1// 144..2495// PF00595.12\PDZ\PDZ domain (Also known as DHR or GLGF)\2e-14\IPR001478
D-OCBBF3004194.1// 129..2480// PF00595.12\PDZ\PDZ domain (Also known as DHR or GLGF)\7.1e-16\IPR001478
D-NT2RP8000826.1// 95..2461// PF00595.12\PDZ\PDZ domain (Also known as DHR or GLGF)\7.1e-16\IPR001478
D-NT2RP7007268.1// 95..2461// PF00595.12\PDZ\PDZ domain (Also known as DHR or GLGF)\7.1e-16\IPR001478
D-BRAWH3008172.1// 281..2452// PF00595.12\PDZ\PDZ domain (Also known as DHR or GLGF)\7.1e-16\IPR001478
D-BRAWH3011965.1// 300..>1574// PF00595.12\PDZ\PDZ domain (Also known as DHR or GLGF)\7.1e-16\IPR001478
５）SOSUIによる膜貫通ドメイン予測解析
実施例14の1）に記載した19配列のORFについてSOSUI（http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/）を用い、膜貫通ドメイン予測解析を行った。解析にはSOSUIバージョン1.5を用いた。SOSUI解析において膜貫通ドメインが予測できたものについて以下に記載する。
各データは、cDNA配列名、ORF領域、膜貫通ドメイン回数を”//” 区切りで記載した。
D-NT2RI3005525.1// 45..1292// 1
D-BRACE2044661.1// 297..878// 2
D-NT2RI3001005.1// 22..1629// 11
D-NT2RI3005261.1// 22..1629// 11
６）PSORTによるN末端分泌シグナル配列予測解析
実施例14の1）に記載した19配列のORFについてPSORT （http://psort.nibb.ac.jp/） を用い、N末端分泌シグナル配列予測を行った。解析にはPSORT IIを用いた。
PSORT解析においてN末端分泌シグナル配列が予測できたものはなかった。
７）SignalP ver.3.0によるN末端分泌シグナル配列予測解析
実施例14の1）に記載した19配列のORFについてSignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) を用い、N末端分泌シグナル配列予測を行った。解析にはSignalP バージョン3.0を用いた。SignalP解析においてN末端分泌シグナル配列が予測できたものについて以下に記載する。
各データは、cDNA配列名、ORF領域を”//” 区切りで記載した。
D-BRACE2044661.1// 297..878
（実施例１〜１４に対する総括）
ヒトゲノム研究の進展により、ヒトの染色体配列の解析は大幅に進んだが、それによりヒト遺伝子機能の全てが明らかになったわけではない。我々は、ヒトの遺伝子をその多様性に重点をおいて解析することにより、多様性が遺伝子の機能の変化に大きく関連していることを解明した。
ヒトゲノムの配列情報とそこから転写された産物であるヒトcDNAのデータを比較することにより、染色体のある領域から複数のmRNAが転写されていることがわかった。それらは、タンパク質をコードすると予測されるORF領域に違いがあり異なるタンパク質ができると予測される場合と、非翻訳領域である5’UTR領域や3’UTR領域に違いがありタンパク質としては同じものとなる場合が存在した。我々は、その中でも特にすでに解析されている既知のcDNAと異なるタンパク質をコードすると予測されるcDNAに重点をおいて、そのようなcDNAの探索と配列解析を行った。すると、多様性が生み出される原因は、主に転写開始点の選択性とエクソンの選択性にあることがわかった。転写開始点の選択性では、ある染色体領域において使われる転写因子が変化することにより、転写の始まる位置が異なり、cDNAに多様性が生じていた。また、エクソンの選択性では、転写されスプライシングが起こる際に、同じ染色体領域から転写していても使われるエクソンが増えたり減ったりすることでcDNAに多様性が生じていた。
遺伝子の多様性が機能とどのような関連があるのかを我々のもつ約150万のヒトcDNAの5’末端配列（5’-onepass配列）によるmRNAの発現頻度情報をもとに解析した。すると、ある臓器のみ選択的に転写開始領域が異なっていたり、ある病態になった時のみエクソンが欠失するなどといった多様性が機能に大きく影響していると思われる例が多数見つかった。我々は、脳の組織部位や神経細胞の分化段階により多様性に変化が現れる遺伝子を見つけ出して詳細な解析を行った。
解析方法としては、リアルタイムPCR（polymerase chain reaction）を用いてその発現量を比較した。例えば、神経細胞に分化後のみ選択的に挿入されると予測されるエクソンがある場合、そのエクソン領域を特異的に検出するPrimer (01)を設計、またそのエクソンが挿入されないパターンのみを特異的に検出するPrimer (02)を設計、さらにどちらのパターンも共有してもつ領域を検出するPrimer (03)を設計する。これらの3種類のPrimerを使って、神経細胞の分化の各段階での増幅量を比較する。共有領域の03の増幅量をコントロールとして、特異的な領域の検出結果である01、02の神経細胞の分化の各段階での比較をすることで、神経細胞の分化によりエクソンの選択性がどのように変化したのかを知ることができる。つまり、エクソンの選択性と組織特異的な発現の相関をみることが出来るのである。
この方法によって、我々は、遺伝子の多様性が組織特異的な発現と関連している遺伝子を多く見つけ出した。発現している組織に特異性があるということは、多様性がその遺伝子の機能に大きく影響していることが示唆される。つまり、多様性が生じている特異的な領域を遺伝子マーカーとして使用することにより、脳の特定の部位の機能解明に用いたり、神経細胞の分化あるいは再生の段階を詳細に検出することが可能になると思われる。さらには、例えば神経細胞の分化あるいは再生のある段階のみに発現する特異的な領域をもつタンパク質を標的にして医薬品の開発を進めることにより、より副作用の少なく効果の高い医薬品の開発が可能になると思われる。
＜神経細胞分化に関する説明＞
神経細胞の分化に関するmRNA（神経系の細胞を分化誘導して発現変化するmRNA）は、神経疾患の治療・診断マーカーとして有用なものであると考えられる。ヒト培養細胞NT2を神経細胞へ分化誘導（レチノイン酸(RA)刺激又はRA刺激後さらに増殖阻害剤処理）する過程で発現変化するmRNAを探索することにより、そのようなmRNAを見出すことができる。また、このようなmRNAは神経再生にも関与していると考えられる。
＜脳各部位の説明＞
１）海馬（hippocampus）
脳組織の中で海馬は記憶を扱う非常に重要な部位であり、得た情報の要・不要を判断して、他の脳部位に記憶を蓄えさせる、記憶固定の働きがある。臨床的知見より、海馬に異常をきたしたり最悪海馬が無くなると、短時間しか新しいことを覚えていられなくなる。また認知症患者の一部はこの海馬に異常をきたしていると考えられている。脳組織全体と海馬とを比較した時、発現に差のあるmRNAは記憶に関与したり、認知症に関係するmRNAであり、記憶のメカニズム解明や治療・診断マーカーとして有用であると考えられる。
２）尾状核（caudate nucleus）
海馬系統は空間認知に関わる記憶に重要な部位である。空間認知は場所を覚える記憶とも言われている。それに対し、尾状核（caudate nucleus）は習慣から覚える記憶（習慣記憶）に重要な部位だと言われていている。
３）扁桃（amygdala）
扁桃は脳の感情中枢である。扁桃を通過した情報は感情反応、例えばパニックや恐怖反応などを引き起こす。刺激が扁桃で情動評価されて強い恐怖を生じたとき、扁桃は脳の各部に警戒信号を出す。その結果、手の平の発汗、心悸亢進、血圧上昇、アドレナリンの急激分泌等の反応が起きる。いわば扁桃体は身体に警戒信号を送り、その結果として体を警戒態勢に入らせる一種の防衛本能を司っている組織とも言える。脳組織全体と扁桃とを比較した時、発現に差のあるmRNAは情動反応に関与するmRNAであり、感情反応や恐怖反応、パニックなどの分子メカニズム解明に有用であると考えられる。
４）小脳（cerebellum）
小脳は平衡感覚と筋肉運動、運動学習の中枢である。この領域は運動の調節に関与していると考えられており、小脳が動作することによって無意識的にスムーズな運動をすることが可能になる。また、運動だけでなく読み書きなどより高次な運動の慣れにも小脳が関与していることも解明されつつある。脳組織全体と小脳とを比較した時、発現に差のあるmRNAは平衡感覚や運動機能に関与するmRNAであり、脳が制御する運動機能の分子メカニズム解明に有用であると考えられる。
５）視床（thalamus）
視床は、大脳と結びつきの強い神経細胞が集まった部分であり、脊髄などから伝わってきた感覚情報を大脳の関係部分に伝えたり、大脳の運動の指令を調節する。例えば視覚では映像を大きさ、形、色に分け、聴覚では音声を音量、耳障りの良し悪しで分け、大脳皮質の感覚野に送る。脳組織全体と視床とを比較した時、発現に差のあるmRNAは感覚器からの情報伝達に関与するmRNAであり、脳が制御する情報伝達の分子メカニズム解明に有用であると考えられる。
６）黒質（substantia nigra）
黒質は中脳の一部を占める神経核である。黒質は、緻密部と、網様部（及び外側部）とによって、大きく二群に大別されるが、いずれも大脳基底核を構成する中心的な要素である。大脳基底核は小脳とともに、随意運動の発現と制御に重要な役割を担う高次中枢として知られている。大脳基底核は大別すると、線条体、淡蒼球、黒質、視床下核の４つの神経核から成り、さらに、線条体は尾状核と被殻に、淡蒼球は外節と内節に、黒質は緻密部と網様部に分類される。これらの神経核を「入力」、「出力」、及び「相互連絡」という情報伝達の面から再分類すると、線条体は大脳基底核の入力部に相当し、淡蒼球内節と黒質網様部はその出力部に相当する。また、入力部と出力部を間接的につなぐ淡蒼球外節と視床下核は大脳基底核の介在部であり、線条体の神経活動をドーパミンにより修飾する黒質緻密部は大脳基底核の修飾部であると考えることができる。
脳内の黒質で作られるドーパミンという神経伝達物質が十分量作られなくなり、その結果、手が震え、筋肉の動きが固くなって身体の動きが鈍くなる等の運動障害を引き起こす脳神経系の疾患がパーキンソン病であると言われている。脳の神経細胞は通常、歳を取るにつれて少しずつ減少するが、パーキンソン病では黒質の神経細胞が普通よりも早く著しく減少する。
脳組織全体と黒質とを比較した時、発現に差のあるmRNAは以上のようなことに関与するmRNAであると考えられる。
７）アルツハイマー患者の大脳皮質
アルツハイマー病とは記憶力が低下し、進行すれば生活が困難となり介護が必要となる脳神経系の疾患であり、進行すれば脳そのものが萎縮する。その発症の要因はストレスなどの環境因子、高血圧やコレステロール血症などの血管因子も関わりがあるといわれているが、未だ十分な解明が完了していない。したがって、正常脳組織とアルツハイマーの病態組織を比較した時、発現に差のあるmRNAはアルツハイマー病に関係するmRNAであり、病態の発症メカニズムの解明や、治療・診断マーカーとして有用であると考えられる。
本出願は、日本国で出願された特願２００７−０６６４３０（出願日：２００７年３月１５日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (11)

  1. 配列番号５８で表されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドからなる、神経細胞分化に特異的なバイオマーカー。
  2. 該ポリペプチドが配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１記載のバイオマーカー。
  3. 異種アミノ酸配列からなるポリペプチドと融合している、請求項１又は２記載のバイオマーカー。
  4. 配列番号６０で表されるアミノ酸配列からなる単離された部分ペプチドである、脳・神経特異的遺伝子３によりコードされるポリペプチドに特異的な部分ペプチドからなる、神経細胞分化に特異的なバイオマーカー。
  5. 請求項１〜４のいずれか１項記載のバイオマーカーをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  6. 配列番号５６で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列を有する単離されたポリヌクレオチドからなる、神経細胞分化に特異的なバイオマーカー。
  7. 該ポリヌクレオチドが配列番号５６で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチドである、請求項６記載のバイオマーカー。
  8. 請求項５〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチド及びそれに機能可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のバイオマーカーの発現ベクター。
  9. 請求項８記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
  10. 以下（ａ）及び（ｂ）を含む、脳・神経特異的遺伝子３によりコードされるポリヌクレオチドに特異的なプライマーセット：
    （ａ）請求項７記載のバイオマーカーの部分ヌクレオチドに存在する核酸配列又は部分ヌクレオチドの５’に存在する核酸配列に対応するセンスプライマー；及び
    （ｂ）請求項７記載のバイオマーカーの部分ヌクレオチドに存在する上記（ａ）と異なる核酸配列又は部分ヌクレオチドの３’に存在する核酸配列に相補的な核酸配列に対応するアンチセンスプライマー。
  11. 請求項１０記載のプライマーセットを含む、神経細胞の分化の判定用試薬又はキット。
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