TWI485161B - 抗上皮細胞黏著分子（ＥｐＣＡＭ）抗體及其使用方法 - Google Patents

抗上皮細胞黏著分子（ＥｐＣＡＭ）抗體及其使用方法 Download PDF

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Description

抗上皮細胞黏著分子(EpCAM)抗體及其使用方法
本發明大體上係關於抗癌劑，更特定而言係關於用於癌症治療、診斷及照影成像之抗體。
頭及頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma；HNSCC)是全球已發展國家中第六位最常見的惡性腫瘤。口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma；OSCC)則是頭及頸部位最常見的腫瘤。雖然頭及頸部癌症在診斷、局部處理及化療法上有明顯的改進，但在過去30年間，長期存活率並沒有明顯的增加。即使具有現代的醫療服務，針對口腔內癌症方面的整體死亡率仍維持在約50%的高水平。因此，高風險性癌前病灶的預防及早期診斷與治療在降低HNSCC相關死亡上是有相當幫助的。
在一方面，本發明係關於一種經純化或經分離的單株抗體或其抗原結合片段，其對於位處上皮細胞黏著分子(EpCAM)之EGF樣區域II(SEQ ID NO：1)內之KPEGALQNNDGLYDPDCDE(SEQ ID NO：63)序列內的抗原決定部位具有特異性結合親和力。
在本發明一具體實施例中，該抗體或抗原結合片段會展現出下列的特徵：當EpCAM之EGF樣區域II內的胺基酸95位置處之酪胺酸(Y)或胺基酸96位置處之天門冬胺酸(D)或該Y及D發生突變(或具有取代性突變作用)，則前述的結合親和力會消失。
在本發明另一具體實施例中，該抗體或抗原結合片段包括：(a)一重鏈可變域，其包括(i)包含SEQ ID NO：4之互補決定域1(CDR1)； (ii)包含SEQ ID NO：5之互補決定域2(CDR2)；及(iii)包含SEQ ID NO：6之互補決定域3(CDR3)；及(b)一輕鏈可變域，其包括(i)包含SEQ ID NO：7之CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：8之CDR2；及(iii)包含SEQ ID NO：9之CDR3。
在本發明另一具體實施例中，該結合片段包括該抗體之Fv片段。另一選擇地，該結合片段包括該抗體之Fab片段。
在本發明另一具體實施例中，該抗體是經人化單株抗體。
在本發明另一具體實施例中，該重鏈可變域包括SEQ ID NO：24之胺基酸序列，而該輕鏈可變域包括SEQ ID NO：25之胺基酸序列。
在另一方面，本發明係關於一種經純化或經分離的單鏈可變片段，其包括：(a)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的輕鏈可變域；及(b)連結該重鏈可變域及該輕鏈可變域之連結肽。
除此之外，在另一方面，本發明係關於一種經分離的單株抗體或其抗原結合片段，其具有下列的特徵：(a)對於包括SEQ ID NO：1胺基酸序列之上皮細胞黏著分子(EpCAM)具有特異性結合親和力；(b)對於可表現EpCAM之癌細胞具有特異性結合親和力，該癌細胞係選自由口腔癌細胞、鼻咽癌細胞、結腸直腸癌細胞及卵巢癌細胞所組成之群；及(c)對於人臍靜脈內皮細胞及正常鼻黏膜上皮細胞不具結合親和力。
在本發明一具體實施例中，該抗體或抗原結合片段在活體內可展現出誘導該癌細胞凋亡及/或抑制該癌細胞生長之特徵。
在本發明另一具體實施例中，該抗體或抗原結合片段對於位處EpCAM之EGF樣區域II內之KPEGALQNNDGLYDPDCDE(SEQ ID NO：63)序列內的抗原決定部位具有特異性結合親和力。
在本發明另一具體實施例中，該抗體或抗原結合片段係經一可偵測化合物或酵素加以標記，或係經囊封於脂質體內。
在本發明另一具體實施例中，該抗體或抗原結合片段包括： (a)包含SEQ ID NO：2胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO：3胺基酸序列的輕鏈可變域；或(b)包含SEQ ID NO：24胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO：25胺基酸序列的輕鏈可變域。
除此之外，在另一方面，本發明係關於一種組合物，其包括： (a)如前所提之經分離的抗體或抗原結合片段；(b)一抗癌藥劑；及(c)一醫藥上可接受之載劑。
除此之外，在另一方面，本發明係關於一種抑制癌細胞及/ 或腫瘤啟動細胞生長之方法，該方法包括向一有其需要的個體投予一組合物，該組合物包括：(a)如前所提之經分離的抗體或抗原結合片段；及(b)一醫藥上可接受之載劑，其中該癌細胞及/或腫瘤啟動細胞可表現EpCAM。
在本發明一具體實施例中，係將經人化抗體或抗原結合片段 投予至該個體。該癌細胞係選自由口腔癌細胞、鼻咽癌細胞、結腸直腸癌細胞及卵巢癌細胞所組成之群。
又另一方面，本發明係關於偵測及/或診斷可表現EpCAM之 癌細胞之方法，該方法包括：(a)自一病患取得細胞或組織樣本；(b)將該細胞或組織樣本與如前所提之抗體或結合片段接觸；(c)分析該抗體或結合片段結合至該細胞或組織樣本之情況；及(d)與正常對照組比較結合情況，以判定個體中可表現EpCAM的癌細胞存在。
本發明另外提供如前所提之抗體或其抗原結合片段之用 途，其係用於製造用以治療、偵測及/或診斷可表現EpCAM的癌細胞之藥物。
併與下文圖式及下列較佳實施例的說明，本發明該等或其他 態樣會是顯而易見的，雖然其中可以進行變化及修飾，但不會脫離本發明新穎概念上的精神及範疇。
該等所附圖式可說明清楚本發明一或多個實施例，且併與書 面說明可用以解釋本發明原理。只要有可能的情況下，通篇圖式係使用與實施例同一或類似元件的相同參考編號。
圖1顯示OCAb9-1與各種不同癌細胞株之結合活性。(A)OCAb9-1在各種不同癌細胞株的結合活性之ELISA分析。NM-IgG係作為對照組。(B)OCAb9-1單株抗體對抗口腔癌細胞(SAS)、鼻咽癌細胞(NPC)、肺癌細胞(H441及H520)、結腸直腸癌細胞(HCT116、SW620及COLO 205)及卵巢癌細胞(SKOV-3)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)及正常鼻黏膜上皮細胞(NNM)之西方轉漬分析。(C)抗EpCAM單株抗體(OCAb9-1)在人類組織微陣列中的免疫組織染色。將經包埋石蠟部分與OCAb9-1培養反應，以偵測不同人類癌組織(包括口腔、***、結腸、卵巢、胰臟及子宮及該等對應的正常組織)中的EpCAM表現。EpCAM(染成棕色)、蘇木精(染成藍色)係為背景染色之用。細胞照影成像係放大200倍取得。
圖2顯示OCAb9-1標靶蛋白之鑑定。(A)藉由免疫親和力層析純化之OCAb9-1標靶蛋白。第1行：分子量標誌；第2行：自經共軛OCAb9-1親和力管柱所純化之蛋白質，及第3行：自經共軛OCAb9-1親和力管柱所純化蛋白質之西方轉漬分析。將39 kDa蛋白質(箭頭指示處)經純化，並進行LC/MS/MS分析。(B)以Swiss-Prot資料庫確認OCAb9-1之標靶蛋白。全長的人類TACSTD1(EpCAM)為含有314個胺基酸的多肽。高度亮點序列是被LC/MS/MS點擊的肽。(C)SAS細胞溶解物與OCAb9-1抗體進行免疫沉澱反應，之後與兔子抗EpCAM單株抗體(1144-1)及EpAb3-5、EpAb4-1抗體進行轉漬分析。(D)兩種EpCAM shRNA質體(shEpCAM1及shEpCAM2)分別轉染至SAS細胞株之後，萃取出每一細胞株的總RNA，並以qRT-PCR分析檢測。shEpCAM1及shEpCAM2兩者質體在經轉染SAS細胞株中對於EpCAM mRNA具有明顯的抑制效應。測量經混合選殖體的樣本，每一處代表平均值±SEM(n=3)。***表示P <0.001。(E)進行西方轉漬分析及(F)流式細胞分析，以評估抗OCAb9-1單株抗體與對照組細胞及剔除EpCAM基因SAS細胞之結合。
圖3顯示該等抗EpCAM單株抗體之特徵。OCAb9-1及EpAb單株抗體可辨識人類癌細胞株。將SAS、HCT116及NNM細胞與OCAb9-1及EpAb單株抗體 培養。利用流式細胞分析技術、免疫螢光染色(A)及西方轉漬(B)測量該等抗EpCAM單株抗體的結合活性。以EpAb2-6(0-20μg/ml)處理(C)SAS細胞及(D)HCT116細胞6小時，利用膜聯蛋白V-FITC及PI雙重染色藉由流式細胞分析技術測量細胞死亡情況。膜聯蛋白V-FITC可用以測量細胞族群內在早期(6小時)活躍性地進行細胞凋亡作用的細胞百分比。碘化丙啶(PI)係用以從不具生命力細胞中區分出具生命力的細胞。
圖4顯示EpCAM shRNA及EpAb2-6在活體外及活體內對癌細胞生長之抑制作用。藉由EpCAM shRNA(shEpCAM)剔除EpCAM基因在SAS細胞中的表現。單獨使用LKO shRNA載體(對照組shRNA)係作為對照組。(A)EpCAM的向下調節會抑制SAS細胞的細胞增殖。藉由MTT檢測法分析細胞存活率。**表示p <0.01，***表示p <0.001。(B-D)顯示活體外抑制EpCAM的表現會抑制腫瘤細胞的(B)細胞群落形成、(C)遷移及(D)侵犯性。(E)抑制EpCAM的表現會降低活體內腫瘤生長。以EpAb2-6單株抗體(10μg/kg)或PBS處理帶有SAS衍生性腫瘤異種移植的NOD/SCID小鼠，並測量腫瘤體積(n=6)(數據以平均值±SD表示，而p 值是以t -檢定法分析)。誤差線係為±SD。*表示P <0.05。(F)所示Kaplan-Meier存活曲線為經以EpAb2-6及PBS處理的小鼠的長時間存活期(每一組n=6)。
圖5A-D顯示EpAb2-6會減小瘤球形成。經以碘化丙啶(PI)染色藉由流式細胞技術分析，EpAb2-6會增加(A)HCT116及(B)瘤球(HCT116球體細胞)中之異二倍體DNA的含量。(C)EpAb2-6會減小瘤球形成。(D)HCT116球體細胞經以EpAb2-6處理6天，計算所得瘤球數目。
圖6顯示單獨使用EpAb2-6或EpAb2-6併與IFL組合使用對抗帶有HCT116腫瘤小鼠的效果。(A)帶HCT116衍生性結腸癌小鼠投予EpAb2-6、IFL、EpAb2-6與IFL之組合，及PBS。測量每一組的腫瘤大小(每一組的n=6)。每一點表示平均值；誤差線為SD。(B)每一組的體重。(C)治療結束時，測量腫瘤重量。(D)在(C)中所述的分析結果代表性影像。*表示p <0.05為顯著差異。
圖7顯示人化抗體對抗EpCAM之發展。(A)將EpAb2-6的CDR嫁接至人類IgG1基本架構上，以產生經人化抗體EpAb2-6(hEpAb2-6)。hEpAb2-6對人類癌細胞株的結合能力。以ELISA測量mEpAb2-6及hEpAb2-6與(B)SAS 細胞及(C)CCD-1112Sk細胞之結合活性。正常小鼠IgG(NM-IgG)及正常人類IgG(人類IgG)係作為陰性對照組。(D)mEpAb2-6及hEpAb2-6對抗NNM、SAS及HCT116細胞之西方轉漬分析。以hEpAb2-6(0-20μg/ml)處理(E)SAS細胞及(F)HCT116細胞6小時，並以膜聯蛋白V-FITC及碘化丙啶(PI)雙重染色藉由流式細胞技術分析測量細胞死亡。
圖8A-B顯示EpAb2-6特異性B細胞抗原決定部位之鑑定。(A)吾人藉由改變野生型EGF-I區域(Q54A/N55A)或EGF-II區域(Q89A/N90A、D92A/G93A、L94A/Y95A、L94A、Y95A或D96A)胺基酸而構築各種不同的EpCAM突變。(B)各種不同的EpCAM突變體在HEK293細胞中表現。萃取出細胞蛋白質之後，使用西方轉漬分析測定EpAb2-6及EpAb3-5等抗體對抗各種EpCAM突變體的反應性。Y95及D96胺基酸取代會導致EpAb2-6單株抗體結合活性明顯的減損，其對應在EGF-II上的序列如(A)所示。
圖9顯示EpCAM的提高與腫瘤細胞的腫瘤啟動及自我更新能力有關。在球體腫瘤細胞及抗失巢凋亡腫瘤細胞中測定EpCAM的提高量。(A)球體細胞、抗失巢凋亡細胞及附著性HCT116細胞中型態改變的明視野影像。上述細胞中EpCAM表現之(B)即時qPCR(左)及(C)流式細胞技術分析。(D)以三重複方式計算經分篩高表現EpCAM細胞及低表現EpCAM細胞中之球體細胞形成數目。所示圖像係來自高表現EpCAM及低表現EpCAM細胞之瘤球的代表性影像。(E)評估球體細胞及附著性HCT116細胞在小鼠中的腫瘤啟動能力。腫瘤發生率及腫瘤體積計監測35天。(F)經蘇木精及曙紅(H&E)染色腫瘤部分之組織學分析(圖所顯示上方：相鄰鼠科骨骼肌間浸潤前之侵犯性；下方：具有清楚界定的擴張性腫瘤界線，而不是組織浸潤)。
圖10顯示EpCAM會向上調節癌細胞的重新編程基因(c-MYC、OCT4、NANOG及SOX2)表現及自我更新。(A)球體腫瘤細胞中EpCAM表現及重新編程基因表現的增加情況。球體及附著性HCT116細胞中EpCAM、c-Myc、Oct4、Nanog及Sox2表現之即時qPCR(左上圖)、西方轉漬(右上圖)，及免疫螢光染色(下圖)分析。(B)高表現EpCAM及低表現EpCAM之HCT116細胞中該等基因表現之即時qPCR分析。(C)藉由即時qPCR分析HEK293細胞中EpCAM的異位表現及重新編程基因表現。(D)在剔除EpCAM基因的Hep3B細胞及HCT116細胞中EpCAM、c-Myc、Oct4、Nanog 及Sox2 mRNA含量之即時qPCR分析。(E)抑制EpCAM會減小Hep3B及HCT116細胞中瘤球形成，量線=50微米。(F)剔除瘤球中EpCAM基因在活體外會衝擊自我更新能力。實驗步驟示於上文。**為p <0.01表示明顯差異。(G)活體內有限稀釋分析證明瘤球中剔除EpCAM基因會抑制腫瘤啟動能力。*為p <0.01係以對數等級檢定分析。
圖11顯示EpCAM的表現與EMT進展及腫瘤生成有關。(A)在剔除EpCAM基因的Hep3B細胞及HCT116細胞中E-鈣黏著素(E-cad)、細胞角蛋白18(CK18)及中間絲蛋白(Vim)的免疫螢光染色。(B)在剔除EpCAM基因的Hep3B細胞及HCT116細胞中EMT基因表現之即時qPCR(左圖)及西方轉漬(右圖)分析。(C)在高表現EpCAM及低表現EpCAM分篩細胞中EMT基因表現之即時qPCR分析。(D及E)抑制EpCAM會抑制活體外腫瘤細胞之侵犯性(D)及細胞群落形成(E)。(F)抑制EpCAM會降低活體內腫瘤生長。以皮下方式將2×106 的HCT/LKO及HCT/EpCAM shRNA細胞注射至NOD/SCID小鼠中，每3天測量腫瘤體積(左圖)，並在實驗結束時測量腫瘤重量(右圖)(n=6)。(G)利用即時qPCR分析萃取自腫瘤之RNA(數據係以平均值±SD表示，而以t -檢定分析p 值。
圖12顯示EpICD參與調節自我更新及EMT基因。(A)於DAPT(50μM)存在下或不存在DAPT下，HCT116細胞中EpICD細胞轉位之雷射共焦免疫螢光照影成像。量線=10μm。(B)293T/EpCAM-v5細胞經以DAPT處理後之EpICD裂解之西方轉漬分析結果，而蛋白質樣本係與EpICD或v5抗體進行轉漬(黑色箭頭表示EpICD裂解)。(C-E)(C)DAPT會抑制EMT基因表現、(D)腫瘤侵犯性及(E)瘤球形成。(F)EpCAM過度表現會上調節c-Myc、Oct4、Nanog及Sox2的轉錄活性。以螢光素酶分析法評估啟動子活性。(G)DAPT會抑制EpCAM所誘發的c-Myc、Oct4、Nanog及Sox2轉錄活性。(H)EpICD誘發重新編程基因之轉錄活化作用。(I-J)染色質免疫沉澱法(ChIP)分析HCT116及NNM細胞中c-MYC、OCT4、NANOG 及SOX2 基因被EpICD所佔據之DNA情況。**為p <0.01係表示明顯差異。
圖13顯示EpEX係為活化EpCAM訊號之轉換子。(A)293T轉染選殖體中EpEX291 及全長EpCAM蛋白質表現之西方轉漬分析結果。(B)EpEX會誘發c-Myc、Nanog、Oct4及Sox2之啟動子活性。細胞經以pEpEX291轉染(左圖)， 或添加可溶性EpEX(sEpEX；2μg/ml)(右圖)，藉由螢光素酶分析法評估c-Myc、Nanog、Oct4及Sox2的報導子活性，對照組係使用BSA。(C)EpCAM表現細胞之EpEX胞外釋放。以免疫沉澱法及西方轉漬分析HCT116細胞培養上清液中EpEX釋放含量。(D)鑑別來自HCT/LKO及HCT/EpCAM shRNA細胞培養上清液中之EpEX。(E)HCT116細胞經以DAPT(50 μM)、TAPI(40 μM)或兩者(D/T)處理24小時，該培養上清液與EpEX抗體進行免疫沉澱作用，而整個細胞溶解液(whole cell lysate；WCL)係與抗EpEX抗體(中間分格)或抗EpICD抗體(下面分格)進行西方轉漬分析。黑色箭頭：可溶性EpICD；灰色箭頭：中間型EpICD。(F)HCT116細胞以pEpEX291-v5(0.5μg、2μg)轉染72小時(左圖)或以sEpEX(2.5μg/ml、5μg/ml)處理(右圖)，該細胞培養上清液及細胞溶解物以上述西方轉漬技術進行分析。
圖14顯示EpCAM(EpICD)與自我更新基因表現及惡性癌症之關聯性。(A)人類結腸直腸癌(HCRC)、鄰近正常黏膜組織及正常結腸組織之EpEX及EpICD細胞轉位之免疫螢光照影成像。所示代表性影像係為EpEX(綠色)及EpICD(紅色)之個別影像(上部分格)，合併影像(中間分格)及從個別影像(虛框處)之放大區域(下部分格)。箭頭係指(HCRC)細胞核及細胞膜中EpICD的細胞轉位，其中會發生與EpEX(鄰近正常黏膜組織)共同轉位。藉由人類結腸癌組織微陣列進行EpICD蛋白質表現之免疫組織分析。(B)所示代表性影像為正常細胞及不同等級腫瘤細胞的隨機放大局部圖，及(C)EpICD表現之箱線圖，以t -檢定分析P 值。圖14D顯示EpICD之細胞轉位表現在細胞膜(M)、細胞質(C)及細胞核(N)中。右邊影像是左邊影像框線區域的局部放大圖。(E)藉由qPCR分析測定42位人類結腸癌病患中EpCAM、c-Myc、Nanog、Oct4及Sox2之mRNA表現含量。EpCAM及重新編程基因間的相關性係以斯皮爾曼氏分析法(Spearman’s analysis)評估。
圖15為該等對抗癌細胞單株抗體之主要特徵的綜整。
圖16為該等抗EpCAM單株抗體之主要特徵的綜整。
圖17顯示EpAb2-6 VH 及VL 區域之胺基酸序列。
圖18顯示該等抗EpCAM單株抗體之動力常數及結合親和力。
圖19顯示經以EpAb2-6篩選之噬菌體展現肽序列之排列比較。
除非另有定義，否則本文所使用的所有技術及科學術語係為熟知本發明所涵蓋技藝者慣常瞭解的意義。在有矛盾的情況下，本發明文件(包括定義)將可以支配主控。
如本文所使用，「左右」、「約」或「大約」通常係指給定數值或範圍的20%內，較佳係10%內，且更佳係5%內。本文給定的數量是大約的，其意指如果未表述說明，該術語係為「左右」、「約」或「大約」的意思。
縮寫： mAb意指單株抗體；NNM意指正常鼻黏膜；FACS意指流式細胞技術分析；ELISA意指酶聯免疫吸附分析；EMT意指上皮間質轉化；qRT-PCR意指定量即時反轉錄聚合酶鏈式反應；ChIP意指染色質沉澱作用；GAPDH意指甘油醛-3-磷酸脫氫酶；HUVEC意指人臍靜脈內皮細胞；IHC意指免疫組織化學；CDR意指互補決定域。
如本文所使用，「調劑」通常應指經製備、製造、特製物質之某物品。
如本文所使用，「抗體」乙詞意指具有可特異性結合至特定抗原之能力的免疫球蛋白(Ig)分子或免疫球蛋白分子的片段。該Ig單體是由4條多肽鏈所組成的「Y」形分子，包括由雙硫鍵連結的2條相同重鏈及2條相同輕鏈。該Y形分子的臂桿上含有可結合抗原的位點，且因此可辨識特異性外來物體。該抗體的此區域被稱為Fab(fragment,antigen binding)區域。
如本文所使用，「抗體」乙詞不只是指全長的抗體分子，也係指仍具有抗原結合能力的抗體分子片段。此等片段亦為技藝所熟知的，且經常性地於活體外及活體內使用。「抗體」乙詞不只是指全長的免疫球蛋白分子，亦係指抗原結合活性片段，諸如眾所熟知的活性片段F(ab’)2 、Fab、Fv及Fd。
抗原結合片段(Fab片段)是指在抗體上可與抗原結合的區域。其係由每條重鏈及輕鏈的一個固定域及一個可變域組成。該兩個可變域會與其特異性抗原上的抗原決定部位結合。Fc及Fab片段可以在實驗室裡 製造產生。酵素木瓜蛋白酶可用以將免疫球蛋白的單體裂解成2個Fab片段及1個Fc片段。酵素胃蛋白酶會切在樞紐區域，因此會形成1個F(ab’)2 片段及1個pFc’片段。酵素IdeS(源於化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes )之免疫球蛋白降解酵素，商品名為FabRICATORTM )在中性pH下會以序列特異性方式裂解IgG。該F(ab’)2 片段藉由溫和還原作用可以切成2個Fab’片段。
抗體的可變域係以Fv區域表示，且其是與抗原結合最重要 的區域。
「Fv片段」是具有活性的抗體片段(Fv)，係由重鏈及輕鏈 的可變部分組成。該「Fv片段」係由重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)係藉由強力非共價方式相互影響結合在一起而組成。因此，每一Fv片段含有一個完整的抗原結合位點，且為衍生自抗體分子之最小活性片段。
重鏈及輕鏈的可變域可以融合在一起，而形成單鏈可變域 (single-chain variable fragment；scFv)，其只有Fab片段大小的一半，但仍保有親本免疫球蛋白原有的特異性。
咸已報導，「完全地」人類抗體可避免某些經人化抗體及嵌 合抗體的副作用。有兩種成功的方法係經確認的一產生抗體的噬菌體表現技術及用以產生更多似人類抗體的老鼠遺傳工程技術。可使用噬菌體表現技術，如此可變的抗體區域便可以表現在絲狀噬菌體抗體上。
技藝中現已為大家接受的是哺乳類抗體的非CDR區域可經 同質特異性或異質特異性抗體的類似區域置換，但仍保有原抗體的抗原決定部位特異性。此在「經人化」抗體的發展及用途上最為明確地顯露，其中為了產生具有功能的抗體，係將非人類CDR以共價方式結合至人類FR及/或Fc/pFc’區域。因此，(例如)PCT國際公開案WO 92/04381揭示經人化鼠科RSV抗體的產生及用途，其中至少一部分的鼠科FR區域業經人類來源的FR區域置換。此等抗體(包括具有抗原結合能力的全長抗體片段)常被稱為”嵌合”抗體。所產生的此等嵌合抗體之其中抗體的某些或全部FR區域業經其他同質性人類FR區域置換。
非人類(例如鼠科)抗體的經人化形式係為含有衍生自非人 類免疫球蛋白最小序列之嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2 或抗體其他抗原結合次序列)。經人化抗體包括人類 免疫球蛋白(接受者抗體)，其中該接受者的互補決定域(CDR)之殘基係被諸如具有所需特異性、親和力及容量之小鼠、大鼠或兔子之非人類物種者(供應者抗體)之CDR的殘基置換。在某些例子中，人類免疫球蛋白的Fv架構殘基係被對應的非人類殘基所置換。經人化抗體亦包括既非發現於接受者抗體亦非發現於外來CDR或架構序列之殘基。一般而言，經人化抗體會包括實質上至少一個及典型地兩個所有的可變域，其中所有或實質所有的CDR區域係對應於非人類免疫球蛋白之CDR區域，且所有或實質所有的FR區域是為人類免疫球蛋白一致性序列之FR區域。該經人化抗體最佳亦包括至少一部分的免疫球蛋白固定域(Fc)，典型地是人類免疫球蛋白的固定域〔Jones et al.,Nature,321：522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596(1992)〕。
將非人類抗體進行人化的方法是技藝中所熟知的。通常地， 經人化抗體具有一或多個併入其中之非人類來源的胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基常被稱為「輸入」殘基，該等典型地是取自「輸入」可變域。 人化作用基本上係根據Winter及共事者的方法〔Joneset al.,Nature,321：522-525(1986)；Riechmannet al.,Nature,332：323-329(1988)；及Verhoeyenet al.,Science,239：1534-1536(1988)〕，藉由將囓齒類動物CDR或CDR序列取代人類抗體的對應序列加以進行的。因此，此等”經人化”抗體是嵌合抗體(美國專利案4,816,567)，其中實質上不超過一個完整人類可變域係經非人類物種的對應序列所取代。實務上，經人化抗體通常地是人類抗體，其中某些CDR殘基及可能某些FR殘基係經齧齒類動物抗體中類似位置處的殘基所取代。
人類抗體亦可利用各種技藝中已知的技術產生，包括噬菌體 表現庫技術。Cole等人及Boerner等人的技術亦可用於製備人類單株抗體〔Coleet al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p77(1985)及Boerneret al.,J.Immunol.,147(1)：86-95(1991)〕。類似地，人類抗體可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入至其中該內源性免疫球蛋白基因業經部分或全部失活之轉殖基因動物(例如小鼠)中而加以製造。當激敏後，可以觀察到人類抗體的產生，其在所有方面係與人類中所見者極為類似，包括基因重新排列、組合及抗體的全部型態。此方法(例如)係 描述於美國專利案5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。此完全性人類單株抗體或經人化單株抗體具有特別用途係在於該等抗體不會引發對抗抗體本身之免疫反應。參見美國專利案7,622,113，該案係以全文併入本文參考。
該抗體可經標記化及固定在固體支撐物上。當本文所使用的 「標記物」乙詞是指以直接方式或間接方式共軛至抗體上的可偵測性化合物或組合物，如此即可產生「經標記」抗體。該標記物本身可以具有偵測性的(例如，放射性同位素標記物或螢光標記物)，或以酵素性質標記物的例子而言，該標記物可催化受質化合物或組合物發生具有偵測性的化學性變化。
實例
根據本發明實施例之裝置、方法及其相關結果如下所示，但 非意欲限制本發明範疇。注意的是為方便讀者，實例中使用了標題或次標題，但絕非限制本發明範疇。再者，本文提出及揭示某些理論，然而不論該等理論是對或錯，絕非限制本發明範疇，只要本發明係根據本發明據以實施，不考慮任何特別理論或作用流程為何。
材料與方法
細胞株與培養。 使用下列人類細胞株：口腔癌症(FaDu及SAS)、鼻咽癌(NPC039)、卵巢癌(SKOV-3)、肺癌(CL1-5、H441及H520)、胰臟癌(MIA PaCa-2)、結腸直腸癌(COLO205、HCT116及SW620)、肝細胞癌(Hep3B及Mahlavu)、腎細胞癌(A498)、***癌(PC3)、CCD-1112Sk(人類正常***細胞)及正常鼻黏膜上皮細胞(NNM)之原代培養。NPC細胞係在吾人的實驗室建立的(Lin等人.(1993)「七種新建立鼻咽癌細胞株」Lab.Invest.68 ,716-727)。Mahlavu細胞係Michael Hsiao博士(基因體研究中心，中央研究院)贈與。正常鼻黏膜上皮細胞(NNM)的原代培養係採自罹患鼻息肉患者的手術(Lee等人.,(2007)「愛波斯坦-巴爾病毒感染對於在鼻咽癌的整體基因之效應」Funct.Intergr.Genomics7 ,79-93)。人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)係購買於(龍沙公司(Lonza)，Walkersville鎮，馬里蘭州)，且在EBM-2培養基(龍沙公司(Lonza)，Walkersville鎮，馬里蘭州)中生長。人類口腔癌細胞株SAS獲自日本研究生物資源庫(東京，日 本)，該等細胞係於5% CO2 、37℃下培養在經補充含有10% FBS之杜爾貝克氏改良的伊格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium；DMEM)中。楊泮池(Pan-Chyr Yan)博士所提供的肺腺癌細胞(CL1-5)(Chu等人.,(1997)「從人類肺腺癌細胞株挑選具侵略性及轉移性的次細胞群」Am J Respir Cell Mol Biol.17 ,353-60)係培養在補充含有10%FBS之RPMI培養基中。其他細胞株係購自ATCC並培養於經補充含有5%或10%胎牛血清(FBS)之杜爾貝克氏改良的伊格氏培養基(DMEM)中(置於37℃、5%之CO2 潮濕培養箱中)。該等細胞係根據ATCC的步驟培養，且在細胞復甦後經過少於6個月的繼代培養。
單株抗體的產生及IgG之純化。 依循下列僅稍作修改的標準 程序產生對抗SAS細胞及EpCAM抗原的單株抗體(Wu等人.(2003).「登革熱2型病毒(DEN-2)血清型特異性B細胞抗原決定部位的鑑定及利用以抗原決定部位為主的肽抗原之DEN-2經免疫動物血清樣本的偵測」J.Gen.Virol.84 ,2771-2779；Liu等人.(2011)「藉由抗登革熱病毒非結構性蛋白1之自體抗體之人類內皮細胞抗原之分子擬態」J.Biol.Chem.286 ,9726-36)。 簡而言之，雌性BALB/eJ小鼠以腹膜內方式以3週間隔時間利用SAS進行免疫4次。在最後追加劑的第4天，從經免疫小鼠脾臟獲取脾臟細胞，並藉由50%聚乙二醇(GIBCO,CA,USA)與NSI/1-Ag4-1多發性骨髓瘤細胞進行融合。將經融合細胞懸浮在補充含有次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸腺嘧啶(hypoxanthine-aminopterin-thymidine；HAT)(SIGMATM ，聖路易斯市，密蘇里州)及雜交瘤選殖因子(ICN，奧羅拉市，俄亥俄州)之DMEM培養基中，而後培養於96孔培養盤中。而後藉由有限稀釋法對該等SAS為陽性但NNM為陰性的雜交瘤進行次選殖，並保存於液態氮中。經姥鮫烷(pristane)灌注的BALB/cJ小鼠會產生腹水，而以蛋白G瓊脂糖4G凝膠(GE Healthcare Biosciences，匹茲堡市，賓夕法尼亞州)純化出單株抗體。
ELISA。 以SAS(口腔癌細胞)、NPC、HCT116(結腸癌細胞)、SKOV3(卵巢癌細胞株)、NNM及HUVEC細胞接種於96孔培養盤中(Corning Costar，聖路易斯市，密蘇里州)。該等培養盤以2%多聚甲醛固定並以1%牛血清白蛋白阻斷。將OCAb9-1加至該等培養盤中並培養1小時。而後用含有0.1%(重量體積比)TWEEN®20之PBS(PBST0.1 )清洗該等培 養盤，並與經共軛辣根過氧化酶之抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)再培養1小時。清洗後，該等培養盤與受質溶液鄰-苯二胺二鹽酸鹽(SIGMATM )培養。藉由添加3 N鹽酸終止反應，並以微量盤計讀儀讀取490nm處之讀值。
流式細胞技術。 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA(1 mM)(INVITROGEN®)1-3分鐘將SAS、HCT116及NNM細胞解離分開。用經活化螢光細胞分篩緩衝液(含有1%胎牛血清之PBS)清洗細胞，而後在4℃下與稀釋範圍為0.00001至1μg/ml之OCAb9-1及EpAb培養於經活化螢光細胞分篩緩衝液中1小時。與作為第二抗體之經共軛藻紅蛋白之山羊抗小鼠IgG(稀釋1：250；Jackson ImmunoResearch Laboratories(West Grove，賓夕法尼亞州)在4℃下培養30分鐘。最後清洗之後，該等細胞再以溶於PBS之1%FBS進行懸浮，並以流式細胞儀(BD，聖荷西市，加州)進行分析。
免疫螢光染色。 培養於蓋玻片上的細胞係以多聚甲醛固定、清洗，而後以含有溶於PBS的1%牛血清白蛋白阻斷10分鐘。將細胞與溶於1%牛血清白蛋白之第一抗體培養於室溫下。1小時培養後，細胞經清洗並與異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate；FITC)山羊抗小鼠抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories)、Alexafluor488山羊抗小鼠抗體或Alexaflour568山羊抗兔子(INVITROGEN®)抗體培養。加入4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)以便進行核複染染色。
免疫組織化學分析。 將老鼠腫瘤組織或人類組織微陣列(Pantomics公司，舊金山，加州)與抗體培養，而後與經共軛辣根過氧化酶(HRP)之第二抗體培養。該等部分最後與二胺基聯苯胺培養並以蘇木精(hematoxylin)進行複染。人類結腸癌組織微陣列及15種癌症組織分析(TMA BC05011及TMA MTU391)主要類型係購自BIOMAX®。利用HistoQuest software(TissueGnostics，維也納，奧地利)定量EpICD的表現。藉由具有控制濾片、照相機及機動平台(Märzhäuser，韋茲拉爾，德國)之AQuest軟體(TissueGnostics，維也納，奧地利)進行標準化自動擷取。以影像細胞學而言，所有影像均係利用Tissue-Faxs圖像分析軟體(TissueGnostics，維也納，奧地利)獲得。
標靶蛋白之鑑定。 SAS細胞以補充含有蛋白酶抑制劑雞尾酒 錠片(Roche，印第安納波利斯市，印第安納州)之裂解緩衝液(50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1% NP-40)進行裂解。將上清液施加至與OCAb9-1偶合之蛋白質G瓊脂糖凝膠(GE Healthcare Biosciences，匹茲堡市，賓夕法尼亞州)。清洗之後，用沖脫緩衝液(0.2 M甘胺酸，pH 2.5，150 mM NaCl及1% NP-40)沖脫與OCAb9-1結合的蛋白質，並以1 M Tris-HCl，pH 9.1中和沖脫液(Liu等人.,2011)。該沖脫液藉由SDS-PAGE進行離析。從凝膠上切下感興趣的條紋帶，以溶於25 mM碳酸氫銨(ammonium bicarbonate；ABC)之50 mM二硫蘇糖醇(dithioerythreitol；DTE)於pH 8.5、37℃下進行還原作用1小時，並在室溫下以溶於ABC之100 mM碘乙醯胺(iodoacetamide；IAA)進行烷基化1小時。以溶於ABC之50%乙腈清洗後，將該凝膠浸泡於100%乙腈中，並與0.02μg胰蛋白酶在37℃下培養16小時。該經消化的肽以溶於5%TFA之50%乙腈萃取，並以濃縮器(Eppendorf，漢堡市，德國)濃縮。該樣本以中央研究院蛋白質組學及結構生物學研究所核心設備中心的LC-MC/MS定序加以分析。
免疫沉澱及西方轉漬分析。 用補充含有蛋白酶抑制劑混合錠(Roche，印第安納波利斯市，印第安納州)之RIPA緩衝液(0.01 M磷酸鈉(pH 7.2)，150 mM NaCl，2 mM EDTA，50 mM NaF，1% Nonidet P-40，1%脫氧膽酸鈉，及0.1% SDS)萃取細胞，並在4℃下以20,000 g的速度旋轉離心30分鐘。上清液利用抗EpCAM抗體進行免疫沉澱作用。使用經共軛HRP之第二抗體(Jackson Immuno Research Labs，West Grove，賓夕法尼亞州)，且利用經強化化學發光藥劑(enhanced chemiluminescence reagents；ECL)(Thermo scientific，羅克福德市，伊利諾伊州)將訊號顯影。
細胞凋亡分析。 細胞分別地接種，並以0-20μg/ml單株抗體處理6小時。藉由膜聯蛋白V-FITC及PI偵測細胞凋亡的細胞，並以流式細胞儀(BD免疫細胞分析系統，聖荷西市，加州)進行分析。早期細胞凋亡作用係以膜聯蛋白V-FITC細胞凋亡偵測套組II(BD Pharmingen，拉霍亞市，加州)測量，細胞凋亡的細胞核係以碘化丙啶(PI)染色。
用以分析抗腫瘤功效的動物模式。 帶有SAS衍生性口腔癌異種移植(~75 mm3 )之SCID小鼠在尾部靜脈處以靜脈注射方式注射EpAb2-6或等體積的PBS。經由尾部靜脈注射方式施與治療，每週2次10mg/kg，連續 4週，總劑量80mg/kg。每週以測徑尺(caliper)測量腫瘤2次，且常規性地觀察小鼠重量減少情況，以作為藥劑毒性的表徵。腫瘤體積係以長度×(寬度)2 ×0.52計算得之。以組合式治療腫瘤模式而言，根據不同治療的方案(EpAb2-6、IFL、EpAb2-6加上IFL，及PBS對照組)，將帶有HCT116衍生性結腸癌異種移植(~50 mm3 )之SCID分成4組。以僅接受EpAb2-6的組別而言，小鼠係經由尾部靜脈以靜脈注射方式(i.v.)注射20mg/kg劑量，每週2次施與EpAb2-6單品療法達4週(每週×4)。以僅接受IFL的組別而言，IFL(25mg/kg的5-FU + 10mg/kg的亞葉酸鈣(leucovorin)+ 10mg/kg伊利替康(irinotecan))係藉由靜脈注射方式(i.v.)每週施與2次達4週(每週×4)。 以組合式治療組別而言，EpAb2-6係在IFL前24小時投予；EpAb2-6及IFL兩者一如其他兩組係以相同的劑量週期給藥。EpAb2-6組合IFL的程序係改良自先前報導(Azrak RG等人.(2004)「伊利替康及5-氟尿嘧啶間之治療合作對抗人類腫瘤異種移植」Clin Cancer Res.10 ,1121-9；Kim等人.(2010)「除FOLFIRI方案外，樹突細胞疫苗可經由鼠科結腸直腸癌症模式抑制免疫抑制細胞增進抗腫瘤效應」Vaccine28 ,7787-7796)。
抗EpCAM抗體之選殖及CDR定序。 利用TRIzol試劑 (INVITROGEN®)從雜交瘤細胞中萃取出總RNA，並以NucleoTrap mRNA迷你套組(Macherey-Nagel GmbH & Co.KG.)分離出mRNA。經純化mRNA以寡(dT)作引子在ThermoScript RT-PCR系統(INVITROGEN®)中進行反轉錄。藉由PCR以各種引子組自cDNA產物擴增可變重鏈域及可變輕鏈域(VH 及VL )。利用TA套組(Promega，麥迪遜市，威斯康星州)選殖該等PCR產物，並以DNA定序法測定該等VH 及VL 序列。Software Vector NTI(InforMax)係作為序列分析之用。從該等序列，將架構區域(FR)及互補決定域(CDR)藉由與見於Kabat資料庫者加以比較及與見於ImMunoGeneTics資料庫者校準而進行分析，(Lefranc等人.(2009)「IMGT,國際ImMunoGeneTics資訊系統」Nucleic Acids Res.37 ,D1006-12)。
經人化EpAb2-6之構築及表現。 經人化EpAb2-6 VH 分別係由 編號DI164282基因之經修飾FR1至FR4及EpAb2-6 VH 之CDR1至CDR3所組成。經人化EpAb2-6 VL CDR則係由編號GM882764基因之經修飾FR及EpAb2-6VL 之CDR所組成。將所得VH 選殖至帶有訊號肽及人類IgG1固定域 之經修飾表現載體pcDNA3.1(INVITROGEN®)上。而VL 係選殖至經修飾載體pSecTag(INVITROGEN®)上。該VH 及VL 質體共轉染至CHO-K1細胞中並藉由G418及嘌呤黴素篩選2-3週。其轉型細胞於96孔培養盤中進行有限稀釋。2週後，穩定性細胞選殖體會在麥考伊氏5A(McCoy’s 5A)培養基(SIGMA-ALDRICH®)中產生經人化抗體，並以ELISA加以鑑定。經人化抗體係利用CELLine AD 1000(INTEGRA Biosciences，瑞士)根據製造商的建議所產生的。
噬菌體表現生物淘洗法。 噬菌體表現生物淘洗法步驟係根據 先前報告進行的(Wu等人.,2003；Liu等人.,2011)。簡而言之，ELISA盤以100 μg/ml的單株抗體塗佈。將100μg/ml單株抗體的樣本加至培養盤孔中，並於4℃下培養6小時。清洗及阻斷後，將噬菌體表現肽庫(New England BioLabs公司)稀釋成4×1010 pfu的噬菌體並於室溫下培養50分鐘。清洗後，用100ml的0.2 M甘胺酸/HCl(pH 2.2)沖脫經結合的噬菌體，並以15ml的1 M Tris/HCl(pH 9.1)加以中和。經沖脫的噬菌體於ER2738(New England Biolabs公司，麻薩諸塞州，美國)中進行擴增以便隨後重複循環的挑選工作。該噬菌體係在LB/IPTG/X-Gal培養皿上進行定量。第二輪及第三輪的生物淘洗步驟與第一輪是相同的，但用於生物淘洗時是添加2×1011 pfu經擴增噬菌體。
藉由EpCAM突變株鑑定EpAb2-6抗原決定部位。 吾人使用 重組表現質體pcDNATM 3.1/V5-His以產生EpCAM突變株。藉由衍生自pcDNATM 3.1/V5-His作為模板之定點導向突變作用產生各式的EpCAM突變株。利用pfu ultra DNA聚合酶(MERCK)進行PCR，且所有突變構築體均定序加以確認。生長於6孔培養盤中的80%-90%滿之HEK293細胞以各式EpCAM質體進行轉染。轉染2天後，以PBS清洗該等細胞。用補充含有蛋白酶抑制劑混合錠之RIPA緩衝液萃取細胞，並於4℃下以20,000 g速度離心旋轉30分鐘。該野生型及經突變重組蛋白質係藉由與1μg/ml第一抗體(EpAb2-6或EpAb3-5)培養，接著與經共軛HRP之第二抗體(Jackson Immuno Research Labs，West Grove，賓夕法尼亞州)培養而進行染色，該等訊號係利用經強化化學發光藥劑(ECL)(Thermo Scientific，羅克福德市，伊利諾伊州)進行顯影。
表面電漿共振技術。 藉由表面電漿共振(BIAcore T100,Biacore公司)進行鼠科及經人化抗體的親和力分析。EpCAM抗原係固定在Series S Sensor Chip CM5(Biacore公司)上，並以10μl/min的流速注入。該等單株抗體係於HBS-EP+ 緩衝液(Biacore公司)中稀釋，並以50μl/min的流速注入1.5分鐘，並使其解離超過5分鐘。在每一單株抗體注入前，先注入10 mM甘胺酸HCl，0.2 M NaCl(pH2.5)完成晶片表面的再生作用。該等數據係用整體擬合1：1結合模式藉由BIAevaluation軟體進行分析。
RNA萃取及定量即時RT-PCR。 利用ULTRASPEC RNA分離試劑(Biotecx Laboratories，休士頓市，德州)從細胞株中製備出總RNA。根據製造商的說明書，利用Super-Script III RNaseH-反轉錄酶(INVITROGEN®，卡爾斯巴德市，加州)進行cDNA反轉錄。選殖、定量RT-PCR時所用的之正向及反向引子列示於表1中。利用LightCycler480系統(Roche Applied Science)進行定量RT-PCR。每一樣本的基因表現含量係以同一樣本的GAPDH的表現含量進行標準化。該等反應進行三重複，並計算出標準誤差值(S.D.)。
球體細胞分析。 為了形成球體細胞，將培養的細胞分散成單一細胞。將5×103 細胞接種在超低吸附力6孔培養盤(CORNINGTM )6天，並維持在補充含有B27(INVITROGEN®)、EGF(10ng/ml)及FGF(25ng/ml)之DMEM/F12中，每週2次。顯微鏡下計數球體細胞。為進行血清誘發分化分析，將瘤球培養在經基質膠塗佈(matreigel-coated)內含有補充10%FBS之DMEM的培養盤中達7天，以誘發分化過程。
質體構築。 將全長的人類EpCAM選殖至帶標誌v5及6xHis 之pcDNA3.1載體中。從pcDNA3.1-EpCAM次選殖出pEpEX291 (係由EpCAM的胞外域及穿膜域所組成)及pEpICD質體。藉由將c-MYC (相對於轉錄起始位點處-1224/+47)、OCT4 (-2616/+1)，及NANOG (-1590/+250)的PCR片段***至pGL4.1質體(Promega)中而製造出螢光素酶報導子活性。編碼EpCAM短夾型RNA之慢病毒(pLKO-shEpCAM)及對照組質體pLKO-AS1係獲自RNAi核心設備中心(中央研究院)。
慢病毒感染。 藉由PolyJET轉染套組(SignaGen Laboratories) 將包裝質體(pCMV-△R8.91)、包膜載體(pMDG)及夾型pLKO-RNAi載體共轉染HEK293T包裝細胞。轉染48小時後，收集含病毒的上清液，與含有聚凝胺(polybrene)(8μg/ml)之新鮮培養基混合，並與標的細胞培養進行另一48小時感染。以嘌呤黴素(4μg/ml)篩選經轉導細胞4天。
螢光素酶報導子分析。 將該等細胞接種於培養盤中，並藉由 PolyJET套組共轉染pcDNA3.1、EpCAM、EpICD，或EpEX-表現載體(400ng)及pGL4-Oct4-Luc、Nanog-Luc、Sox2-Luc，或c-Myc-Luc-表現質體(100ng)24小時。藉由Dul-Glo螢光素酶套組(Promega)測量該等啟動子活性，並藉由與作為內控之pRL-TK(20ng)進行共轉染以標準化經轉染的效率。
細胞群落形成及侵犯性分析。 為了進行細胞群落形成分析， 將密度為5×103 之細胞接種於6孔培養盤中達10天，接著固定並以結晶紫染色。為了進行侵犯性分析，將細胞(1×105 )於室溫下接種於經塗佈基質膠的透孔細胞培養***物(transwell insert)(8-μm聚碳酸酯核孔過濾膜，Corning)中達30分鐘，以便形成名副其實的經重建基礎薄膜。培養24小時後，細胞以甲醇固定10分鐘，而後用棉花棒移除非侵犯細胞。用DAPI藉由染色，在倒立式螢光顯微鏡(Zeiss)下顯像觀察經侵犯的細胞，並藉由ImageJ軟體進行量化。
統計分析。 所有的數據均衍生自至少三組獨立的實驗。數值 係以平均值±標準誤差表示。除非特別說明，否則每一實驗檢定條件與各自對照組的顯著差異係利用學生t -檢定。*表示p 值<0.05，**表示p 值<0.01或***表示p 值<0.001被視為具有顯著差異。存活分析係以對數等級檢定進行。相關係數係藉由斯皮爾曼氏分析法(Spearman’s analysis)分析。
結果 可辨識口腔癌細胞之單株抗體(等)的產生及特徵
為了產生可對抗口腔癌的單株抗體(等)，吾人將SAS細胞注入至BALB/cJ小鼠中。共計篩選超過8,000個雜交瘤選殖體，並挑選出12個對SAS細胞具有較高反應性之選殖體(圖15)。細胞性ELISA及西方轉漬分析顯示，OCAb9-1可特異性地辨識數種人類癌細胞，但卻不會辨識諸如NNM或HUVEC細胞之正常細胞(圖1)。另外利用各種人類癌症組織微陣列的實驗亦顯示，OCAb9-1能夠特異性辨識不同來源的人類癌症組織，但卻無法辨識正常的組織(圖1C)。
為了標靶分子鑑定，製備該SAS細胞溶解物，並藉由經共軛OCAb9-1之免疫親和性層析進行純化。銀染色法及西方轉漬分析證實，OCAb9-1可以辨識具有分子量為39kDa的標靶蛋白(圖2A)。藉由LC-MS/MS分析蛋白質的性質，吾人發現該OCAb9-1的標靶蛋白為人類EpCAM(圖2B)。同時與市售的抗EpCAM抗體1144-1(分別為Santa Cruz Biotech；Epitomics)一起藉由執行免疫沉澱分析及西方轉漬分析確認了OCAb9-1對EpCAM的特異性(圖2C)。經以shRNA剔除EpCAM後(圖2D)，用OCAb9-1之西方轉漬分析(圖2E)及FASC(圖2F)顯示出訊號會戲劇性地減少，此證實OCAb9-1可以特異性地辨識EpCAM(圖2)。
OCAb9-1不會誘發癌細胞凋亡作用。為了開發治療性抗體，吾人從SAS細胞純化出EpCAM蛋白質，並新近產生5種可辨識EpCAM的單株抗體(圖16)。該等單株抗體對於癌細胞株(SAS、NPC039、HCT116及SKOV3)具有強烈的偵測訊號，但該等單株抗體顯示對正常細胞株(HUVEC及NNM)並沒有結合親和力，如細胞性ELISA、西方轉漬分析及FACS分析所示(圖16)。這些單株抗體對SAS及HCT116細胞具有極高的細胞表現結合活性，但該等單株抗體卻無法與NNM細胞反應，如FACS(數據未列)、免疫螢光分析分析(圖3A)及西方轉漬分析(圖3B)所示。該等單株抗體的重鏈及輕鏈中之3個互補決定域(CDR)示於圖17。所有的這些單株抗體對EpCAM具有極高的親和力，且其等的動力學常數範圍為10-9 ~10-13 (圖18)。顯著地，使用SAS及HCT116細胞株時，新近產生的5種單株抗體中的一種單株抗體(EpAb2-6)會誘發癌細胞的細胞凋亡(圖3C-D)。
活體外及活體內癌細胞生長的抑制作用
為了評估EpCAM在腫瘤生成作用的功能性角色，藉由 EpCAM shRNA剔除在SAS細胞中該基因的表現。當EpCAM基因經剔除，生長率(圖4A)、細胞群落形成(圖4B)、移動(圖4C)及侵犯能力(圖4D)會顯著地下降。由於EpCAM基因剔除會影響活體外癌細胞生長並誘發癌細胞的細胞凋亡作用，吾人遂研究探討EpAb2-6是否可用以直接地抑制活體內腫瘤的生長。建立口腔癌異種移植，並以EpAb2-6或對照組PBS處理。經以EpAb2-6處理的腫瘤體積變得比該等兩組的對照組腫瘤體積小。經發現對照組PBS的腫瘤比EpAb2-6組的腫瘤體積分別大1.5倍(n=6；*表示p<0.05；圖4E)。為進一步定出抗體治療功效的特徵，吾人將帶有腫瘤的小鼠經以EpAb2-6及PBS處理後之存活率做一比較。帶有腫瘤小鼠經以EpAb2-6及PBS處理後之整體存活率的中位數分別為71天及48天(圖4F)。EpAb2-6的處理可以有效地壓制瘤球的形成(圖5C)，並誘發腫瘤及瘤球兩者中之異二倍體DNA含量(圖5A及5B)。這些實驗證明，藉由EpAb2-6靶向EpCAM可抑制瘤球形成及腫瘤生長，同時延長了帶有腫瘤小鼠的生命期。
EpAb2-6與IFL組合對於人類結腸癌症異種移植
為了評估EpAb2-6併與IFL組合之治療性功效，吾人將 HCT116(3×106 細胞)注入至NOD/SCID小鼠中。將EpAb2-6(20mg/kg)及IFL(25mg/kg之5-FU + 10mg/kg之亞葉酸鈣+10mg/kg之依利替康(irinotecan))之組合以靜脈注射方式注射至帶有HCT116異種移植(~50 mm3 )之NOD/SCID小鼠中，每週注射兩次，共計注射八次。使用EpAb2-6及IFL組合治療的小鼠中的腫瘤經發現會小於僅以IFL治療小鼠中的腫瘤(*表示P <0.05)(圖6A)。直至第25天時，IFL組的腫瘤大小會逐漸增加至以EpAb2-6 + IFL治療的腫瘤之1.6倍。治療期間，該等EpAb2-6 + IFL組及IFL組在體重上並沒有明顯的變化(圖6B)。治療結束時，相較以EpAb2-6 + IFL治療之最終平均腫瘤重量為0.146公克，經以IFL治療者為0.23公克，注射PBS緩衝液的小鼠的腫瘤則為0.952公克(圖6C及D)。
經人化EpAb2-6(hEpAb2-6)的開發
EpAb2-6對於誘發癌細胞的細胞凋亡具有高度親和力及有效能的活性，因而聯想到其作為治療性抗體的潛在可能性。為了開發經人化單株抗體，吾人定序出源自雜交瘤細胞株之EpAb2-6的VH 及VL 序列(圖 17)。將EpAb2-6的CDR移植至人類IgG1基礎骨幹上，以產生經人化EpAb2-6(hEpAb2-6)(圖7A)。hEpAb2-6在CHO-K1細胞中表現，並從細胞培養上清液中純化出來。保有鼠科特異性之EpAb2-6(mEpAb2-6)的hEpAb2-6會辨識SAS及HCT116癌細胞兩者，但不會辨識CCD-1112Sk正常細胞。細胞性ELISA及西方轉漬分析進一步證實hEpAb2-6的高度結合活性(圖7B-D)。以表面電漿共振分析EpAb2-6及hEpAb2-6針對EpCAM的親和力，並分別測得為0.3491 nM及0.6773 nM(圖18)。除此之外，利用SAS及HCT116細胞株的活體外研究發現，hEpAb2-6會誘發癌細胞的細胞凋亡(圖7E-F)。該等結果顯示，經人化EpAb2-6對EpCAM具有高度結合親合力，此聯想到以治療抗體在癌症治療法、靶向腫瘤藥物遞送及照影成像上的可能性應用。
EpAb2-6-特異性B細胞抗原決定部位之鑑定
擴增與EpAb2-6-特異性抗體具有高度反應性且與正常小鼠IgG中的抗體較低反應性的18個免疫陽性噬菌體選殖體(PC-26、PC-11、PC-29、PC-3、PC-4、PC-18、PC-12、PC-1、PC-19、PC-27、PC-35、PC-21、PC-37、PC-20、PC-2、PC-7、PC-8或PC-44)，並分離出噬菌體DNA用以定序。將所挑選出的選殖體之***核苷酸加以定序，而所有的選殖體經發現含有36個核苷酸(轉譯成12個胺基酸殘基)(圖19)。利用MacDNASIS軟體排列比較肽序列，以分析出EpAb2-6抗體的抗原決定部位及結合的基本結構。藉由PCR擴增編碼涵蓋人類EpCAM第一EGF樣(EGF-I)之重複序列(胺基酸27-59)及涵蓋人類EpCAM第二EGF樣(EGF-II)之重複序列(胺基酸66-135)之cDNA。使用重疊延伸性PCR及以PCR為基礎的定點突變作用，以便將圖8A-B所示的突變引入至野生型EGF-I或EGF-Ⅱ區域中。使用西方轉漬分析測試EpAb2-6或EpAb3-5抗體對變體EpCAM突變體的反應性。研究每一EpAb2-6抗體對個別EpCAM突變體的結合(圖8B)，並與野生型EpCAM分子的結合作比較。EGF-Ⅱ區域Y95或D96位置處的胺基酸突變作用會造成相對結合活性急劇的下降，因此Y95及D96被認為是用於抗體結合的”必須”殘基。圖8係顯示EpCAM之EGF樣區域I中的序列VGAQNTVIC(SEQ ID NO：62)及EGF樣區域II的序列KPEGALQNNDGLYDPDCDE(SEQ ID NO：63)。
EpCAM之提升與腫瘤啟動特性的關聯性
腫瘤啟動細胞天生具有無需附著的能力。因此吾人挑選 HCT116結腸癌細胞進行兩種非貼附性的培養、瘤球形成及抗失巢細胞凋亡篩選(圖9A)。有趣地，相較於附著性細胞(圖9B左)，EpCAM mRNA的表現在抗失巢凋亡細胞(4倍)及球體細胞(12倍)均會上升。經由流式細胞分析，咸發現當與附著細胞之細胞表面EpCAM比較，細胞表面EpCAM在球體形成細胞會增加4倍豐富量(圖9C)，而在抗失巢凋亡細胞則會增加2倍豐富量(數據未列)。同樣地，與附著型細胞表面EpCAM比較(69%豐富量)，球體形成肝癌Hep3B細胞之EpCAM表現(98%豐富量)增加45%。咸發現當球體細胞在分化條件下進行再附著後此升高的狀況會下降。CD133(TIC細胞的標誌)經進一步確認會在球體形成Hep3B細胞中增加4倍，但其在分化後會下降(數據未列)。又，富含EpCAM之HCT116次細胞群展現出戲劇性地球體細胞形成能力(圖9D)。附著性細胞與球體形成細胞間的腫瘤生成潛力之比較顯示，球體細胞衍生HCT116細胞表現出優越的腫瘤啟動能力(圖9E)。吾人亦發現球體衍生腫瘤異種移植展現出更具侵略性及自我更新特性兩者(圖9F)。此推測提高EpCAM的表現可能與腫瘤啟動能力有關。
EpCAM可調控重新編程基因表現及腫瘤啟動能力
定量PCR分析、西方轉漬分析及免疫螢光分析一致性地顯示，EpCAM基因及重新編程基因(c-Myc、Oct4、Nanog 及Sox2 )兩者的表現會相伴性地在球體細胞中向上調控(圖10A)。相似的結果被發現於富含EpCAM之HCT116細胞中(圖10B)。為研究探討是否EpCAM可調控重新編程基因的表現，吾人將EpCAM組成型表現載體轉染至HEK293細胞。定量PCR分析顯示，EpCAM過度表現會誘發增加c-Myc、Oct4、Nanog及Sox2 mRNA含量(圖10C)。相反地，藉由慢病毒介導shRNA剔除Hep3B及HCT116細胞之EpCAM基因會削減EpCAM、c-Myc、Oct4、Nanog及Sox2 mRNA表現(圖10D)。此外，EpCAM沉默不表現會抑制Hcp3B及HCT116球體細胞的數量及大小兩者，此確定了EpCAM在瘤球形成能力上的效應(圖10E)。為了進一步評估EpCAM在腫瘤細胞自我更新能力上的重要性，將HCT116球體細胞分散，並且再生3次，接著進行EpCAM沉默不表現作用。結果顯示，經過EpCAM shRNA處理激發後，球體細胞的再生能力會在之後的繼代培養大大地降低(圖10F)。此外，活體內HCT116球體細胞經連續稀釋移植實驗 顯示，剔除瘤球中EpCAM基因明顯地會阻礙腫瘤啟動潛在能力並有效地阻滯腫瘤的潛力(圖10G)。總體而言，該等數據顯示EpCAM在調節重新編程基因表現及維持自我更新能力上是必須的。
EpCAM可調節EMT發展及腫瘤生成作用
業已證明上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition；EMT)能夠讓腫瘤細胞獲得幹細胞的特性(Mani等人.,2008)，因此，吾人嘗試研究探討是否EpCAM可控制EMT進展。免疫螢光分析顯示出剔除EpCAM基因後發生在EMT標誌(上皮細胞標誌E-鈣黏著素及細胞角蛋白18會上調節)及間質標誌(中間絲蛋白會下調節)的變化(圖11A)。即時PCR數據顯示，與僅有載體的細胞比較，剔除EpCAM基因的細胞中會偵測到mRNA及蛋白質含量兩方面上E-鈣黏著素增加伴隨中間絲蛋白下降(圖11B)。其它EMT調節轉錄因子(諸如Snail及Slug)會同時在剔除EpCAM基因的細胞及低EpCAM表現細胞中降低(圖11B及11C)。評估EpCAM在腫瘤生成潛力上的效應顯示，抑制EpCAM會導致活體外侵犯性及細胞群落形成能力的降低(圖11D及11E)。此外，抑制EpCAM亦會抑制活體內異種移植腫瘤的生長(圖11F)。從原發性腫瘤萃取之RNA樣本證明，相較於僅有載體的細胞而言(圖11G)，EpCAM、重新編程基因(c-Myc、Oct4、Nanog及Sox2)及間質標誌(中間絲蛋白及Snail)的表現在剔除EpCAM基因的腫瘤細胞中明顯地會減少。該等數據顯示EpCAM與調節EMT進展及腫瘤生成作用有關。
EpICD的蛋白裂解參與EpCAM之訊號調控
EpCAM結構含有一胞外域(EpEX)、一穿膜域及胞內域(EpICD)。EpEX係由兩個表皮生長因子類似區域及一個半胱胺酸含量少的區域所組成，而EpICD則係由一短鏈26個胺基酸所組成。檢測EpICD對於重新編程基因調控及腫瘤生成性的效應。雷射共焦影像術描繪出在HCT116細胞的細胞質及細胞核兩者中偵測出可溶性EpICD訊號(圖12A)，然而這些狀況在DAPT(一種γ-分泌酶抑制劑)的存在下會被阻斷。大部分EpICD反而顯示出會與膜聯的EpEX共同轉位(圖12A)。除此之外，相較附著性腫瘤細胞部分，可溶性EpICD在球體細胞衍生腫瘤部分會增加表現。西方轉漬分析證實，293T/EpCAM-v5細胞具有一條分子量為40 kDa的主要條紋帶 (EpCAM-v5)及一條分子量低於10 kDa次要條紋帶(EpICD-v5)；然而，可溶性EpICD-v5(10 kDa)經過DAPT處理後會減少(圖12B)。以DAPT處理會抑制中間絲蛋白、Snail及Slug的表現(圖12C)，此會伴隨發生減少腫瘤的侵犯性及球體細胞形成能力(圖12D及12E)。進一步分析藉由EpICD介導對於重新編程基因的轉錄調控，將EpCAM或EpICD與c-MYC、OCT4、NANOG 及SOX2 的試驗性調節區域共轉染的分析顯示，EpCAM及EpICD兩者會向上調控該等四種基因的轉錄活性(圖12F及12H)；然而，該等被EpCAM所誘發的活性在DAPT存在下會被阻斷(圖12G)。除此之外，染色質免疫沉澱分析顯示在HCT116細胞中偵測到EpICD佔據在c-MYC (近端上游區域取代外顯子1)、OCT4 (遠端上游區域)、NANOG (上游區域)及SOX2 (下游區域)啟動子(圖12I-J)，然而，正常鼻黏膜細胞(NNM)並沒有發現該等現象，該等細胞表現極少量的EpCAM(數據未列)。
EpCAM的胞外域可作為EpCAM訊號的活化子
吾人進一步構築一種截斷EpICD的載體(EpEX291 -v5)，其含有EpCAM的胞外域及穿膜域(圖13A)，以便分清楚EpICD在控制重新編程基因表現上的重要性。令人驚訝地，以EpEX291 -v5轉染HCT116細胞亦會誘發c-MYC、OCT4、NANOG 及SOX2 的報導子活性。當以可溶性EpEX(sEpEX)處理時會發現類似的結果(圖13B)，進而推測EpCAM胞外域的脫落或釋放在協調EpCAM訊號上也扮演一部分的角色。為了試驗此假設，將HCT116細胞的經培養上清液用對抗EpCAM胞外域的抗體進行免疫沉澱反應。結果顯示在血清存在下，確定EpEX會增加釋放(圖13C)。進一步確認在剔除EpCAM基因的細胞中EpEX會減少釋放(圖13D)。另外，經以DAPT(一種γ-分泌酶抑制劑)、TAPI(一種TNF-α轉化酶抑制劑)或兩者處理會同時阻斷EpEX的釋放及抑制EpICD裂解。然而膜聯EpCAM不會受到這些處理的影響(圖13E)。EpEX291 -v5在HCT116細胞中的強迫性表現會導致細胞培養上清液中EpEX釋放的增加，且在EpEX291 -v5轉染體及sEpEX-處理細胞兩者中均可偵測到EpICD裂解及中間絲蛋白表現的誘導作用(圖13F)。再者，人類結腸癌樣本的免疫螢光分析進一步顯示，部分在其細胞核表現可溶性EpICD之腫瘤細胞會遺失其膜-EpEX偵測訊號，然而，其他腫瘤細胞或其鄰近的黏膜細胞則顯示在其細胞膜上EpICD及EpEX完整的共同轉位。正 常結腸組織中EpEX或EpICD較少表現(圖14A)。
人類結腸癌症中之EpCAM/EpICD表現係與重新編程基因因子有關
吾人進一步分析EpCAM及EpICD的表現與其重新編程基因因子及腫瘤惡性性質關聯性。結果顯示，與正常組織做比較，癌性結腸組織中EpICD的表現會增加。癌症中EpICD的表現含量似乎與腫瘤的等級有關，雖然此差異並未達到統計學上的意義(圖14B-C)。吾人亦發現，在具有細胞核EpICD表現的某些腫瘤組織(49例中有24例)中，所存在的確實區域在整個區域內少很多。大部分訊號係在細胞質或膜的部分偵測到(圖14D)，進而推論EpICD核轉位作用可能是一動態暫時性調控作用。從42位結腸癌調查對象中進一步評估EpCAM的mRNA含量及其與重新編程基因因子的關連性顯示EpCAM的表現與下列所示者成正相關：c-MYC (係數=0.501；中度相關)、NANOG (係數=0.513；中度相關)及OCT4 (係數=0.244；較低相關)(圖14E)。
總而言之，咸證明EpCAM及幹細胞基因的共同表現在TIC細胞中是上升的。EpCAM會向上調控重新編程基因因子(c-Myc、Oct4、Nanog 及Sox2 )及EMT表現。EpCAM蛋白裂解成EpEX及EpICD在媒介EpCAM訊號上扮演重要的角色。EpICD的核轉位作用會調節重新編程基因的表現，同時EpEX的胞外釋放會進一步觸發EpICD的活化。抑制EpCAM或阻斷EpICD裂解會減低活體外及活體內兩者之侵犯性、生長及自我更新能力。該等結果顯示EpCAM的過度表現有助於促進腫瘤啟動及腫瘤進展。EpCAM單株抗體可用於癌症診斷及預後，及癌症標靶療法及照影。
EpCAM，或上皮特異性抗原(epithelial specific antigen；ESA)是鑑定上皮轉型瘤之癌細胞特異性抗原。EpCAM的過度表現與癌細胞轉移、癌細胞抗藥性及傳播腫瘤細胞具有關聯性，該等均為TIC細胞所有的特徵。數個研究已經成功地利用CD44+ /CD24- 結合EpCAM，經由免疫分析染色分析鑑定出位於胰臟、卵巢、肝臟及結腸直腸癌症中之TIC細胞。本文數據證明EpCAM的向上調控係在瘤球細胞培養中確認的，其對於腫瘤啟動、生長及侵犯性上具有極高的潛力；然而，當剔除EpCAM基因之後，自我更新及啟動能力會受到抑制。另一種情形是，腫瘤細胞失去EpCAM功能 會抑制細胞群落生長、侵犯性及腫瘤生成。吾人亦發現，EpCAM表現增加與腫瘤等級具有關聯性，證明EpCAM在腫瘤進展上的重要角色。
雖然EpCAM及TIC細胞在形成腫瘤的關聯性業已有充分證 明，但TIC細胞藉由EpCAM所調控的基因輪廓仍未明。仍舊缺乏該等基因與TIC細胞相互作用的關聯性之直接證據。吾人的數據顯示，EpCAM升高且持續的表現被偵測到與瘤球及球體細胞衍生異種移植中的c-Myc、Oct4、Nanog及Sox2的存在有一致性。具有或不具有EpCAM功能會直接衝擊到該等基因的產生，且螢光素酶分析法確定該等基因係受到EpCAM調控。癌症組織mRNA微陣列數據進一步確認，EpCAM的表現係與c-Myc、Oct4、Nanog及Sox2成正相關。總體而言，這些數據顯示藉由EpCAM直接調節重新編程基因因子會促進腫瘤啟動。
除了幹細胞基因外，上皮-間質轉化作用的促進可能亦”參 與”EpCAM媒介的腫瘤進展。吾人數據發現，在EpCAM過度表現細胞偵測到Snail、Slug及中間絲蛋白的向上調控及E-鈣黏著素的向下調控兩者。相反地，剔除EpCAM基因或添加DAPT(其會阻斷EpICD的釋放)則會抑制Snail、Slug及中間絲蛋白的mRNA含量，其會伴隨著腫瘤侵犯性的降低。
EpICD先受到TNF-α轉化酵素(TACE)及γ-分泌酶(早衰蛋 白2；PS2)的蛋白裂解，後受到FHL2及Tcf/Lefl協同合作的調節。吾人發現在經培養腫瘤細胞、球體衍生腫瘤異種移植及人類結腸癌細胞中一致性地偵測到細胞質及細胞核中累積的可溶性EpICD。染色質免疫沉澱分析及螢光素酶分析顯示，EpICD會結合至重新編程基因並反激活重新編程基因。以γ-分泌酶抑制劑處理會阻斷EpICD裂解及核轉位作用，此會伴隨著抑制重新編程基因因子及EMT基因表現，藉此抑制了腫瘤自我更新及侵犯性。然而，細胞質或細胞核中可溶性EpICD的存在並非均質性地表現在所有的腫瘤細胞，此推測EpICD裂解可能是動態性的過程。除了EpICD之外，吾人亦發現，EpEX的釋放可觸發EpCAM訊號事件，藉由血清濃度可以增加澄清液中EpEX的釋放，而添加DAPT或TAPI可阻斷EpEX及EpICD的釋放。再者，sEpEX的處理或以pEpEX轉染可促進EpICD裂解並誘發重新編程基因活化，此推論EpEX的裂解可啟動EpCAM訊號，且推論其釋放可進一步觸發EpCAM活化。
本發明係關於對EpCAM具有相當結合親和力的新穎性 EpCAM單株抗體，其展現出有效的腫瘤抑制性活性，且因此可提供具有潛力的治療意義。總而言之，吾人所示完整性證據顯示，EpCAM(特別是EpICD)的提升會透由上調節幹細胞基因表現及EMT過程促進TIC細胞的腫瘤生成。除此之外，EpEX的釋放會經由自分泌效應(autocrine effect)或旁分泌效應(paracrine effect)觸發EpCAM訊號。因此，開發及應用針對EpCAM及/或EpEX的抑制劑或抗體在治療或偵測上有助於消滅腫瘤及TIC細胞，以及腫瘤標靶照影。
SEQUENCE LISTING
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<120> 抗上皮細胞黏著分子(EpCAM)抗體及其使用方法
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Claims (12)

  1. 一種經分離單株抗體或其抗原結合片段，其對於位於上皮細胞黏著分子(EpCAM)之EGF樣區域II(SEQ ID NO：1)內之KPEGALQNNDGLYDPDCDE(SEQ ID NO：63)序列內之抗原決定部位具有特異性結合親和力，其中該抗體或其抗原結合片段包括SEQ ID NO：2胺基酸序列之重鏈可變域及包括SEQ ID NO：3胺基酸序列之輕鏈可變域。
  2. 根據專利申請範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其特徵在於：當EpCAM之EGF樣區域II內的胺基酸95位置處之酪胺酸(Y95)或胺基酸96位置處之天門冬胺酸(D96)或酪胺酸(Y95)及天門冬胺酸(D96)兩者發生突變時，則該結合親和力會消失。
  3. 根據專利申請範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其中該結合片段包括該抗體之Fv片段。
  4. 根據專利申請範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其中該結合片段包括該抗體之Fab片段。
  5. 根據專利申請範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係經人化。
  6. 一種經分離單鏈可變片段，其包括：(a)包括SEQ ID NO：2胺基酸序列之重鏈可變域及包括SEQ ID NO：3胺基酸序列之輕鏈可變域；及(b)連結該重鏈可變域及該輕鏈可變域之連結肽。
  7. 一種根據專利申請範圍第1至6項中任一項之抗體或抗原結合片段或根據專利申請範圍第6項之經分離單鏈可變片段用於製造用以抑制癌細胞及/或腫瘤啟動細胞生長之藥物的用途，其中該等癌細胞及/或腫瘤啟動細胞可表 現EpCAM。
  8. 根據專利申請範圍第7項之用途，其中該抗體或抗原結合片段係經人化。
  9. 根據專利申請範圍第7項之用途，其中該等癌細胞係選自由口腔癌細胞、鼻咽癌細胞、結腸直腸癌細胞及卵巢癌細胞所組成之群。
  10. 一種於活體外偵測及/或診斷可表現EpCAM之癌細胞之方法，該方法包括：(a)自病患取得細胞或組織樣本；(b)將該細胞或組織樣本與專利申請範圍第1至6項中任一項之抗體或結合片段或根據專利申請範圍第6項之經分離單鏈可變片段接觸；(c)分析該抗體或結合片段或該經分離單鏈可變片段與該細胞或組織樣本之結合；及(d)與正常對照組的結合作比較，以判定個體中可表現EpCAM的癌細胞的存在。
  11. 根據專利申請範圍第1至6項中任一項之抗體或抗原結合片段，其係經可偵測化合物或酵素加以標記，或經囊封在脂質體內。
  12. 一種組合物，其包括：(a)如專利申請範圍第1至6項中任一項之抗體或結合片段或根據專利申請範圍第6項之經分離單鏈可變片段；(b)抗癌藥劑；及(c)醫藥學上可接受之載劑。
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