JP2023069350A - 抗体の製造方法及び抗体 - Google Patents

抗体の製造方法及び抗体 Download PDF

Info

Publication number
JP2023069350A
JP2023069350A JP2021181139A JP2021181139A JP2023069350A JP 2023069350 A JP2023069350 A JP 2023069350A JP 2021181139 A JP2021181139 A JP 2021181139A JP 2021181139 A JP2021181139 A JP 2021181139A JP 2023069350 A JP2023069350 A JP 2023069350A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
sulfate
sodium
mutant
rituximasib
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021181139A
Other languages
English (en)
Inventor
由里子 江頭
Yuriko Egashira
淳 福永
Atsushi Fukunaga
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sysmex Corp
Original Assignee
Sysmex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sysmex Corp filed Critical Sysmex Corp
Priority to JP2021181139A priority Critical patent/JP2023069350A/ja
Priority to CN202211380445.8A priority patent/CN116334163A/zh
Priority to US18/052,746 priority patent/US20230203435A1/en
Priority to EP22205436.3A priority patent/EP4177269A1/en
Publication of JP2023069350A publication Critical patent/JP2023069350A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】動物細胞を用いるタンパク質発現系による、フレームワーク領域３の少なくとも３つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換された抗体の製造において、抗体の収量を増加する手段を提供することを課題とする。【解決手段】抗体をコードする遺伝子が導入された動物細胞をポリアニオン性化合物の存在下で培養して、動物細胞に抗体を産生させることにより、上記の課題を解決する。【選択図】図１１

Description

本発明は、抗体の製造方法及び抗体に関する。
抗体の相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列を維持したまま、フレームワーク領域(FR)のアミノ酸配列を改変することにより、当該抗体の抗原に対する親和性を制御する技術が知られている。FRとは、抗体の軽鎖及び重鎖のそれぞれの可変領域に存在する、CDR以外の領域である。例えば、特許文献１には、抗体のFR3の少なくとも３つのアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基にすることにより、抗原に対する親和性を制御する方法が記載されている。特許文献１に記載の方法により得られる抗体は、医薬、体外診断薬、試薬などへの利用が期待される。
米国特許出願公開第2018/0179298号明細書
本発明者らは、FR3の少なくとも３つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換された抗体を取得するため、当該抗体をコードする遺伝子が導入された動物細胞を従来の方法により培養した。しかし、得られた抗体の量は十分に満足できるものではなかった。本発明者らは、上記の抗体の収量を増加する手段を提供することを目的とした。
一般に、動物細胞を用いるタンパク質発現系による抗体の製造では、細胞培養の規模を拡大すれば、抗体の収量は増える。しかし、製造コストがかかる。本発明者らは、細胞培養の規模の拡大によらず、抗体の収量を増加する手段を検討した。その結果、本発明者らは、上記の抗体コードする遺伝子が導入された動物細胞をポリアニオン性化合物の存在下で培養することにより、当該抗体の収量が増加することを見出して、本発明を完成した。
本発明は、抗体をコードする遺伝子が導入された動物細胞をポリアニオン性化合物の存在下で培養して、動物細胞に抗体を産生させることを含み、ポリアニオン性化合物が、アニオン性多糖及びアニオン性ポリアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１であり、抗体が、FR3の少なくとも３つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換された抗体である、抗体の製造方法を提供する。また、本発明は、この製造方法により産生された抗体を提供する。
本発明によれば、動物細胞を用いるタンパク質発現系による抗体の製造において、上記の抗体の収量を増加することができる。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、グルコース、スクロース又はトレハロースを添加した培地で培養したときの生存率(Viability)(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、グルコース、スクロース又はトレハロースを添加した培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、グルコース、スクロース又はトレハロースを添加した培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、グルコース、スクロース又はトレハロースを添加した培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、グルコース、スクロース又はトレハロースを添加した培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、グルコース、スクロース又はトレハロースを添加した培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、分子量が5,000又は50,000のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、分子量が5,000又は50,000のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、分子量が5,000又は50,000のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、分子量が5,000又は50,000のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、分子量が5,000、50,000又は500,000のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、分子量が5,000、50,000又は500,000のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、ヘパリンナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ヘパリンナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、ヘパリンナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ヘパリンナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、ポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、ポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン又はデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン又はデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン又はデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン又はデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン又はデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン又はデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、ポリプロリン又はアルギン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ポリプロリン又はアルギン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。 リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、ポリプロリン又はアルギン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ポリプロリン又はアルギン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。 トラスツズマブとその変異体の抗原に対する親和性を示すグラフである。 抗リゾチーム抗体とその変異体の抗原に対する親和性を示すグラフである。 抗インターロイキン(IL)-6抗体とその変異体の抗原に対する親和性を示すグラフである。 抗IL-8抗体とその変異体の抗原に対する親和性を示すグラフである。 リツキマシブとその変異体の抗原に対する親和性を示すグラフである。
本実施形態の抗体の製造方法では、生体外において、抗体をコードする遺伝子が導入された動物細胞を、ポリアニオン性化合物の存在下で培養して、当該動物細胞に抗体を産生させる。ここで、動物細胞に導入された遺伝子がコードする抗体及び動物細胞により産生される抗体は、FR3の少なくとも３つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換された抗体(以下、「変異体」ともいう)である。
本明細書において「抗体」は、IgG、IgA、IgM、IgD及びIgEのいずれであってもよいが、好ましくはIgGである。IgGを製造する場合、抗体をコードする遺伝子として、全長の軽鎖をコードする遺伝子と、全長の重鎖をコードする遺伝子とが組み込まれた動物細胞発現用ベクターを用いることが好ましい。「抗体」は抗体断片であってもよい。抗体断片は、軽鎖の可変領域を含むことが好ましい。そのような抗体断片としては、例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd'、Fv、scFv、ドメイン抗体(dAb)、還元型IgG(rIgG)、ダイアボディ、トリアボディなどが挙げられる。
抗体をコードする遺伝子が導入された動物細胞(以下、「遺伝子導入細胞」ともいう)は、タンパク質としての抗体を発現できるように当該遺伝子が導入された動物細胞である。遺伝子導入細胞は、例えば、当該遺伝子が細胞内ゲノムに組み込まれた動物細胞、又は、当該遺伝子をエピソーマルベクターとして保持する動物細胞であり得る。このような形式で抗体をコードする遺伝子が導入された動物細胞は、安定発現株と呼ばれ、タンパク質としての抗体を恒常的に発現できる。あるいは、遺伝子導入細胞は、当該遺伝子のトランスフェクションにより、タンパク質としての抗体を一過性発現する動物細胞であってもよい。遺伝子導入細胞により発現された抗体は、当該細胞から培養上清中に分泌される。
動物細胞は、遺伝子導入によりタンパク質を発現する宿主細胞である。動物細胞としては、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。それらの中でも、哺乳動物細胞が特に好ましい。哺乳動物細胞は、組織から調製した初代培養細胞でもよいし、樹立された細胞株であってもよい。好ましくは、哺乳動物の細胞株を用いる。細胞株としては、例えばCHO細胞(CHO-K1、CHO-Sを含む)、HEK293細胞(HEK293T、HEK293Eを含む)、BHK細胞、COS細胞、HeLa細胞、VERO細胞、3T3細胞などが挙げられる。細胞株は、ATCC(American Type Culture Collection)、ECACC(European Collection of Cell Cultures)などから入手できる。Expi293(商標)細胞、ExpiCHO(商標)細胞などの市販の細胞株を用いてもよい。
抗体をコードする遺伝子は、動物細胞発現用ベクターに組み込まれていてもよい。動物細胞発現用ベクターの種類は特に限定されず、例えばプラスミドベクター、ウイルスベクターなどであり得る。抗体をコードする遺伝子は、抗体の軽鎖をコードする遺伝子と、抗体の重鎖をコードする遺伝子とを含む。抗体をコードする遺伝子が動物細胞発現用ベクターに組み込まれている場合、抗体の軽鎖をコードする遺伝子及び重鎖をコードする遺伝子は、１つのベクターに組み込まれていてもよいし、２つのベクターにそれぞれ組み込まれていてもよい。
抗体をコードする遺伝子の動物細胞への導入自体は、公知のトランスフェクション法により行うことができる。トランスフェクション法の種類は特に限定されず、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ウイルスベクター法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
ポリアニオン性化合物の存在下での培養は、例えば、ポリアニオン性化合物を添加した培地中で遺伝子導入細胞を培養することにより行うことができる。遺伝子導入細胞をポリアニオン性化合物の存在下で培養することにより、当該細胞による変異体の収量が、ポリアニオン性化合物の非存在下で培養する場合よりも増加する。収量が増加するメカニズムの詳細は明らかではないが、おそらく、遺伝子導入細胞から培養上清中に分泌された変異体と、培地中のポリアニオン性化合物との静電的相互作用が寄与していると考えられる。しかし、本発明は、特定の理論などに拘束されない。
ポリアニオン性化合物の非存在下での培養とは、ポリアニオン性化合物を実質的に含まない培地中で遺伝子導入細胞を培養することをいう。ポリアニオン性化合物を実質的に含まない培地とは、ポリアニオン性化合物が含まれるとしても微量であり、ポリアニオン性化合物を積極的に添加していない培地をいう。培地にポリアニオン性化合物が微量に含まれる場合としては、例えば、後述の添加剤にポリアニオン性化合物が含まれている場合が挙げられる。
ポリアニオン性化合物とは、アニオン性官能基を有するアニオン性化合物をモノマー単位とする重合体及びその塩をいう。アニオン性官能基としては、例えば硫酸基、カルボキシル基などが挙げられる。ポリアニオン性化合物の塩は、薬学的に許容される塩が好ましく、例えばナトリウム塩及びカリウム塩が挙げられる。本実施形態では、ポリアニオン性化合物として、アニオン性多糖及び／又はアニオン性ポリアミノ酸が用いられる。アニオン性多糖としては、例えば硫酸化多糖及びアルギン酸塩が挙げられる。アニオン性ポリアミノ酸としては、例えばポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸及びそれらの塩が挙げられる。ポリアニオン性化合物は、１種でもよいし、２種以上でもよい。
硫酸化多糖としては、例えば、デキストラン硫酸及びその塩、グリコサミノグリカン、及び、硫酸基を含むプロテオグリカンが挙げられる。デキストラン硫酸塩は、薬学的に許容される塩が好ましく、例えばナトリウム塩及びカリウム塩が挙げられる。特に好ましくは、デキストラン硫酸ナトリウムである。
アルギン酸塩は、アルギン酸の薬学的に許容される塩が好ましく、例えばアルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム及びアルギン酸アンモニウムが挙げられる。それらの中でも、アルギン酸ナトリウムが特に好ましい。
グリコサミノグリカンとは、アミノ糖を含む酸性多糖をいう。グリコサミノグリカンとしては、例えばヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ペントサン硫酸及びそれらの塩が挙げられる。コンドロイチン硫酸は、構成要素である糖の種類及び硫酸基の位置により、多様な構造を有する。コンドロイチン硫酸の種類としては、例えば、コンドロイチン硫酸Ａ(コンドロイチン4-硫酸)、コンドロイチン硫酸Ｃ(コンドロイチン6-硫酸)、コンドロイチン硫酸Ｄ(グルクロン酸の２位に硫酸基を有するコンドロイチン6-硫酸)、コンドロイチン硫酸Ｅ(N-アセチルガラクトサミンの４位及び６位に硫酸基を有するコンドロイチン硫酸)などが挙げられる。コンドロイチン硫酸Ｂは、デルマタン硫酸と同じである。本実施形態では、いずれのコンドロイチン硫酸を用いてもよい。
グリコサミノグリカンの塩は、薬学的に許容される塩が好ましく、例えばナトリウム塩及びカリウム塩が挙げられる。特に好ましくは、ナトリウム塩である。本実施形態では、ヘパリンナトリウム、ヘパラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、デルマタン硫酸ナトリウム、ケラタン硫酸ナトリウム、ペントサン硫酸ナトリウムを用いることが好ましい。それらの中でも、ヘパリンナトリウム及びコンドロイチン硫酸ナトリウムを用いることが特に好ましい。
プロテオグリカンとは、グリコサミノグリカンとタンパク質とが共有結合した化合物をいう。硫酸基を含むプロテオグリカンとしては、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及びそれらの塩から選択されるいずれかが共有結合したタンパク質が挙げられる。そのようなタンパク質自体は公知であり、例えばアグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、デコリン、ビグリカン、シンデカン、グリピカンなどが挙げられる。
アニオン性ポリアミノ酸は、複数の酸性アミノ酸を含むことが好ましい。アニオン性ポリアミノ酸に含まれる酸性アミノ酸は、グルタミン酸及びアスパラギン酸のいずれか一種又は両方である。アニオン性ポリアミノ酸は中性アミノ酸及び／又は塩基性アミノ酸を含んでもよいが、塩基性アミノ酸を含む場合、塩基性アミノ酸の残基数は酸性アミノ酸の残基数未満である。アニオン性ポリアミノ酸は、好ましくは塩基性アミノ酸を含まず、より好ましくは酸性アミノ酸のみからなる。アニオン性ポリアミノ酸は、L体のアミノ酸からなる重合体、D体のアミノ酸からなる重合体、及びL体とD体の両方のアミノ酸を含む重合体のいずれであってもよい。アニオン性ポリアミノ酸塩は、薬学的に許容される塩が好ましく、例えばナトリウム塩及びカリウム塩が挙げられる。特に好ましくは、ポリグルタミン酸ナトリウム及びポリアスパラギン酸ナトリウムである。
デキストラン硫酸ナトリウムの平均分子量は、約5,000以上約500,000以下であり得る。本明細書において「平均分子量」は、ゲル浸透クロマトグラフィ(GPC)によって測定される重量平均分子量ある。市販のポリアニオン性化合物を用いる場合、当該化合物の分子量は、製造業者又は供給業者が開示した値であってもよい。
培地中のポリアニオン性化合物の濃度の下限は、0.01 mg/mLより高いことが好ましい。当該濃度の下限は、例えば0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL、0.07 mg/mL、0.08 mg/mL、0.09 mg/mL又は0.1 mg/mLであり得る。培地中のポリアニオン性化合物の濃度の上限は、特に限定されないが、例えば20 mg/mL以下である。当該濃度の上限は、例えば19 mg/mL、18 mg/mL、17 mg/mL、16 mg/mL、15 mg/mL、14 mg/mL、13 mg/mL、12 mg/mL、11 mg/mL又は10 mg/mLであり得る。例えば、遺伝子導入細胞は、ポリアニオン性化合物を0.05 mg/mL以上20 mg/mL以下の濃度、より好ましくは0.1 mg/mL以上10 mg/mL以下の濃度で含む培地で培養され得る。
ポリアニオン性化合物は、あらかじめ培地に添加されてもよいし、細胞培養の途中から培地に添加してもよい。遺伝子導入細胞が安定発現株である場合は、ポリアニオン性化合物があらかじめ添加された培地で培養することが好ましい。遺伝子導入細胞が、トランスフェクションにより抗体を一過性発現する細胞である場合、例えば、遺伝子導入の作業の完了時から３～４時間後に培地に添加することが好ましい。あるいは、培地を、ポリアニオン性化合物があらかじめ添加された培地に交換してもよい。
培養期間は特に限定されず、例えば、動物細胞の種類、タンパク質発現系の種類、培養法などに応じて適宜決定できる。動物細胞が安定発現株である場合、培養期間は、例えば５日以上14日以下であり得る。動物細胞が、変異体をコードする遺伝子のトランスフェクションにより変異体を一過性発現する場合、培養期間は、例えば、遺伝子導入の作業の完了時から24時間以上７日以下であり得る。
培地は特に限定されず、例えば、インビトロでの動物細胞の培養に一般に用いられる培地が挙げられる。そのような培地自体は公知であり、例えばMEM、DMEM、RPMI-1640などが挙げられる。また、CD FortiCHO(商標)培地、Expi293(商標) Expression培地などの市販の培地を用いてもよい。必要に応じて、ウシ胎児血清(FBS)、L-グルタミン、抗生物質、抗真菌剤、抗凝集剤などの添加物を培地に混合してもよい。遺伝子導入細胞が、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーを発現する遺伝子を導入された安定発現株である場合は、培地に選択用薬剤を添加することが好ましい。選択マーカーとこれに対応する選択用薬剤は公知である。
動物細胞の培養条件は、細胞の種類などに応じて公知の条件を採用すればよい。例えば、一般的な哺乳動物細胞は、5%CO2雰囲気下で37℃の条件で培養できる。また、培養の規模に応じて、培養法を選択してよい。培養法としては、例えば回分培養(バッチ培養)、流加培養(フェドバッチ培養)及び連続培養が挙げられる。連続培養には、ケモスタット培養及び灌流培養がある。回分培養は、例えば研究室レベルの小規模培養に適している。流加培養及び連続培養は、例えば工業レベルの大規模培養に適している。
回分培養により本実施形態の抗体の製造方法を行う場合は、培養容器又は培養装置に、遺伝子導入細胞及びポリアニオン性化合物を含む培地を添加して培養する。以下、ポリアニオン性化合物を含む培地中で培養されている遺伝子導入細胞を含む培養容器又は培養装置を「培養系」ともいう。回分培養では、培養期間中は、培養系内への培地の供給及び培養系外への細胞培養物(細胞及び培地)の取り出しを行わない。流加培養により本実施形態の抗体の製造方法を行う場合は、培養容器又は培養装置に、遺伝子導入細胞及びポリアニオン性化合物を含む培地を添加して培養する。培養期間中、所定の成分(培地成分、栄養源、上記の添加物、ポリアニオン性化合物など)を連続的又は間欠的に培養系内に供給する。ケモスタット培養により本実施形態の抗体の製造方法を行う場合は、遺伝子導入細胞及びポリアニオン性化合物を含む培地を添加した培養容器又は培養装置に、当該培地を連続的に供給する。このとき、供給した培地と同量の細胞培養物を連続的に培養系の外へ取り出して、培養系を定常状態に保つ。灌流培養により本実施形態の抗体の製造方法を行う場合は、遺伝子導入細胞及びポリアニオン性化合物を含む培地を添加した培養容器又は培養装置に、当該培地を連続的に供給する。このとき、供給した培地と同量の培養上清を連続的に培養系の外へ取り出して、培養系を定常状態に保つ。灌流培養では、細胞の取り出しはしない。
培養容器又は培養装置は、細胞の種類、培養法などに応じて適宜選択できる。培養容器としては、例えばディッシュ、マイクロプレート、培養フラスコ(T-フラスコ)、スピナーフラスコ、ローラーボトルなどが挙げられる。培養装置としては、例えば撹拌式バイオリアクター、流動層式バイオリアクター、固定床型培養器などが挙げられる。
生体外において遺伝子導入細胞をポリアニオン性化合物の存在下で培養した後、産生された変異体を培養上清又は当該細胞から回収する。遺伝子導入細胞が発現した変異体は、通常、細胞外へ分泌されるので、変異体は培養上清中に存在する。よって、細胞培養物から細胞を除き、培養上清のみを回収することで、変異体の溶液を得ることができる。遺伝子導入細胞が発現した変異体の一部が細胞内に蓄積される場合は、細胞を、適当な可溶化剤を含む溶液で溶解して変異体を遊離させることで、変異体の溶液を得ることができる。必要に応じて、細胞の溶解液を遠心分離して、変異体を含む上清を回収してもよい。液体中に遊離した変異体は、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィなどの公知の方法により精製してもよい。
ポリアニオン性化合物の非存在下での培養で得られる変異体の収量に比べて、本実施形態の抗体の製造方法では、変異体の収量が増加する。一方、本実施形態で製造される変異体の抗体としての機能は、ポリアニオン性化合物の非存在下での培養で得られる変異体と同等である。例えば、本実施形態の抗体の製造方法で得られる変異体の抗原に対する親和性は、ポリアニオン性化合物の非存在下での培養で得られる変異体と同じである。抗原に対する親和性は、例えば、ELISA法などの免疫学的測定法、抗原抗体反応における動力学的パラメータなどにより評価できる。免疫学的測定による親和性の指標としては、例えば50%効果濃度(EC50)が挙げられる。動力学的パラメータとしては、例えば解離定数(KD)、結合速度定数(kon)及び解離速度定数(koff)が挙げられる。抗原抗体反応における動力学的パラメータは、表面プラズモン共鳴(SPR)技術などにより取得できる。以下、変異体について説明する。
本実施形態の抗体の製造方法で得られる変異体は、FR3の少なくとも３つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換された抗体であれば、当該変異体が認識する抗原、由来となる動物種などは特に限定されない。ここで、FRとは、抗体の軽鎖及び重鎖のそれぞれの可変領域に存在する、CDR以外の領域である。FRは、３つのCDRを連結する足場の役割を果たし、CDRの構造安定性に寄与する。そのため、FRのアミノ酸配列は、同じ種(species)の抗体間で高度に保存されている。重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変領域に、CDR1、CDR2及びCDR3の３つのCDRと、FR1、FR2、FR3及びFR4の４つのFRとがある。これらは、可変領域のＮ末端側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4の順に並んでいる。
変異体は、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマ、又はニワトリに由来する抗体であり得る。変異体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体などであり得る。
変異体においては、FR3の少なくとも３つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換されていることにより、変異体の抗原に対する親和性は、当該置換をする前の抗体と比べて向上している。以下、FR3の少なくとも３つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換される前の抗体を「元の抗体」ともいう。元の抗体のFR3の少なくとも３つのアミノ酸残基をアルギニン残基又はリジン残基に置換することを、以下では「改変する」ともいう。当該変異体については、米国特許出願公開第2018-0179298号明細書に記載された抗体であり得る。米国特許出願公開第2018-0179298号明細書は、参照により本明細書に組み込まれる。
本実施形態では、変異体は、軽鎖FR3の少なくとも３つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換された抗体であることが好ましい。一実施形態では、変異体において、アルギニン残基又はリジン残基に置換されたFR3の少なくとも３つのアミノ酸残基は、Chothia法で定義される軽鎖の63位、65位、67位、70位及び72位からなる群より選択される少なくとも３カ所の残基を含む。例えば、変異体の軽鎖FR3において、アルギニン残基又はリジン残基である位置は、以下の(1)～(5)のいずれかであり得る。
(1) Chothia法で定義される軽鎖の63位、65位及び67位；
(2) Chothia法で定義される軽鎖の65位、67位及び70位；
(3) Chothia法で定義される軽鎖の63位、65位、67位及び70位；
(4) Chothia法で定義される軽鎖の65位、67位、70位及び72位；及び
(5) Chothia法で定義される軽鎖の63位、65位、67位、70位及び72位。
Chothia法は、CDRの境界及び長さを定義するための、CDRのアミノ酸残基に番号付けをする方法(以下、「ナンバリング法」ともいう)の１つとして知られている。ナンバリング法によりCDRのアミノ酸残基に番号が付されると、FRのアミノ酸残基にも番号が付されることとなる。ナンバリング法によりアミノ酸残基に付された番号は、軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列における当該アミノ酸残基の位置を示す。本明細書では、CDR及びFR3の境界及び長さは、Chothia法(Chothia C.及びLesk AM., Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins., J Mol Biol., vol.196, pp.901-917, 1987参照)により定義される。Chothia法では、軽鎖FR3は、軽鎖の57～88位のアミノ酸残基からなる領域として定義される。以下、抗体の軽鎖におけるアミノ酸残基の位置を記載した場合、特に断らない限り、当該アミノ酸残基の位置は、Chothia法で定義された位置を意味する。
変異体においては、軽鎖の63位、65位、67位、70位及び72位以外のアミノ酸残基、例えば、軽鎖の57位～62位、74位、76位、77位及び79位～81位から選択されるアミノ酸残基が、アルギニン残基又はリジン残基であってもよい。ここで、軽鎖の57位～62位、74位、76位、77位及び79位～81位は、軽鎖FR3のアミノ酸配列からバーニアゾーン残基及び非露出残基を除いたアミノ酸残基の位置である。「バーニアゾーン残基」とは、FRのアミノ酸配列中、CDRの構造安定性に寄与するアミノ酸残基である。「非露出残基」とは、分子内部に折りたたまれて表面に露出しないアミノ酸残基である。
変異体において、元の抗体のアミノ酸残基から改変された後のアミノ酸残基は、全てアルギニン残基であってもよいし、又は全てリジン残基であってもよい。あるいは、元の抗体のアミノ酸残基から改変された後のアミノ酸残基は、その一部がアルギニン残基であり、残りがリジン残基であってもよい。
本実施形態では、変異体は、CDRの電気的特性が中性又は負電荷であることが好ましい。本明細書において、「CDRの電気的特性」は、以下の式(I)により決定される。
Ｘ＝[１つの抗原結合部位に含まれるCDRのアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸残基の数]－[１つの抗原結合部位に含まれるCDRのアミノ酸配列中の酸性アミノ酸残基の数] ・・・式(I)
(式中、Ｘが－２以下であるとき、CDRの電気的特性は負電荷であり、
Ｘが－１、０又は１であるとき、CDRの電気的特性は中性であり、
Ｘが２以上であるとき、CDRの電気的特性は正電荷である)
「１つの抗原結合部位」とは、１つの重鎖可変領域と、１つの軽鎖可変領域とから構成される部位であって、抗体において抗原と結合する部位である。抗体が有する抗原結合部位の数は、抗体のクラスや形態によって異なる。例えば、抗体がIgG又はF(ab')2であるとき、当該抗体は、抗原結合部位を２つ有する。抗体がFabであるとき、当該抗体は、抗原結合部位を１つ有する。「１つの抗原結合部位に含まれるCDR」とは、当該１つの抗原結合部位を構成する１つの重鎖可変領域及び１つの軽鎖可変領域に存在する全てのCDRである。すなわち、１つの抗原結合部位に含まれるCDRは、１つの重鎖可変領域にあるCDR1、CDR2及びCDR3と、１つの軽鎖可変領域にあるCDR1、CDR2及びCDR3との計６つのCDRである。
上記の式(I)から分かるように、CDRの電気的特性は、１つの抗原結合部位に含まれるCDRのアミノ酸配列における、酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基の数に基づいて決定される。上記の式(I)で算出されるＸが－２以下であるとき、すなわち、１つの抗原結合部位に含まれるCDRのアミノ酸配列において、酸性アミノ酸残基の数が塩基性アミノ酸残基の数よりも２以上多いとき、CDRの電気的特性は負電荷と決定される。また、上記の式(I)で算出されるＸが－１、０又は１であるとき、すなわち、１つの抗原結合部位に含まれるCDRのアミノ酸配列において、酸性アミノ酸残基の数と、塩基性アミノ酸残基の数との差が０又は１であるとき、CDRの電気的特性は中性と決定される。
言い換えると、軽鎖CDR1、軽鎖CDR2、軽鎖CDR3、重鎖CDR1、重鎖CDR2及び重鎖CDR3の６カ所のCDRに含まれる酸性アミノ酸残基の総数が、塩基性アミノ酸残基の総数よりも２以上多いとき、CDRの電気的特性は負電荷と定義される。また、軽鎖CDR1、軽鎖CDR2、軽鎖CDR3、重鎖CDR1、重鎖CDR2及び重鎖CDR3の６カ所のCDRに含まれる酸性アミノ酸残基の総数と、塩基性アミノ酸残基の総数との差が０又は１であるとき、CDRの電気的特性は中性と定義される。本明細書において、酸性アミノ酸残基とは、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基であり、塩基性アミノ酸残基とは、アルギニン残基及びリジン残基である。本明細書において、ヒスチジン残基は、塩基性アミノ酸残基に含まれない。
変異体をコードする遺伝子は、例えば米国特許出願公開第2018/0179298号明細書を参照して、公知のDNA組み換え技術及びその他の分子生物学的技術を用いて取得できる。まず、元の抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを取得する。例えば、元の抗体を産生するハイブリドーマがある場合は、該ハイブリドーマから抽出したRNAを用いて、逆転写反応及びRACE(Rapid Amplification of cDNA ends)法により、元の抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド及び重鎖をコードするポリヌクレオチドを合成する。次に、これらのポリヌクレオチドから、軽鎖FR3及び／又は重鎖FR3を改変したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製する。例えば、元の抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを鋳型として、軽鎖FR3の少なくとも３つのアミノ酸残基を改変するためのプライマーを用いるPCR法により増幅することで、FR3が改変された軽鎖をコードするポリヌクレオチドを取得できる。得られたポリヌクレオチドと、元の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドとを、変異体をコードする遺伝子として用いることができる。必要に応じて、変異体をコードする遺伝子を動物細胞発現用ベクターに組み込んでもよい。
元の抗体を産生するハイブリドーマがない場合、例えばKohler及びMilstein, Nature, vol.256, pp.495-497, 1975に記載される方法などの公知の方法により、抗体産生ハイブリドーマを作製すればよい。あるいは、興味対象の抗原で免疫したマウスなどの動物の脾臓から取得したRNAを用いて、抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド及び重鎖をコードするポリヌクレオチドを合成してもよい。あるいは、公知のデータベースから、興味対象の抗原と特異的に結合する抗体のアミノ酸配列又は抗体遺伝子の塩基配列を取得し、それらの配列に基づいて遺伝子合成をして、抗体遺伝子を取得してもよい。データベースとしては、例えばGeneBank、abYsis、IMGTなどが挙げられる。
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１： 糖類及び硫酸化多糖の効果の検討
リツキマシブ及びその変異体をコードする遺伝子を導入した動物細胞を、糖類又は硫酸化多糖を含む培地で培養して、抗体の収量が増加するか否かを検討した。
(１) リツキマシブの変異体の遺伝子の取得
米国特許出願公開第2018/0179298号明細書に記載の方法と同様にして、リツキマシブ(マウス/ヒトキメラ抗体)をコードする遺伝子を含むプラスミドDNAを鋳型として用いるPCR法により、リツキマシブとそのR3変異体及びR5変異体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを合成した。また、リツキマシブの重鎖をコードするポリヌクレオチドを合成した。R3変異体は、Chothia法で定義される軽鎖の63位、65位及び67位のアミノ酸残基がアルギニン残基に置換された抗体であった。R5変異体は、Chothia法で定義される軽鎖の63位、65位、67位、70位及び72位のアミノ酸残基がアルギニン残基に置換された抗体であった。各変異体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドと、リツキマシブの重鎖をコードするポリヌクレオチドとをFreedom(商標)pCHO 1.0 Expression Vector(Thermo Fisher Scientific社)中に挿入した。これにより、リツキマシブの各変異体をコードする遺伝子を含む動物細胞発現用プラスミドDNAを取得した。また、軽鎖FR3のアミノ酸残基を置換していないリツキマシブをコードする遺伝子を含む動物細胞発現用プラスミドDNAも取得した。
リツキマシブをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、抗体(IgG)の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を決定した。これらのアミノ酸配列は下記のとおりであった。また、作製した各変異体(IgG)の軽鎖のアミノ酸配列も以下に示す。下線部は、アルギニン残基に置換された位置を示す。
・リツキマシブの重鎖
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号１)
・リツキマシブの軽鎖
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号２)
・リツキマシブのR3変異体の軽鎖
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFRGRGRGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号３)
・リツキマシブのR5変異体の軽鎖
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFRGRGRGTRYRLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号４)
(２) 抗体をコードする遺伝子の動物細胞への導入
[試薬]
CHO-S細胞(Thremo Fisher Sientific社)
CD FortiCHO(商標)培地(Thremo Fisher Sientific社)
抗凝集剤(Thremo Fisher Sientific社)
OptiPRO(商標) SFM(Thremo Fisher Sientific社)
FreeStyle(商標) MAX試薬(Thremo Fisher Sientific社)
L-グルタミン(Thremo Fisher Sientific社)
ピューロマイシン・ジヒドロクロリド(Thremo Fisher Sientific社)
メトトレキサート水和物(Sigma Aldrich社)
CHO-S細胞は、8 mM L-グルタミンを含むCD FortiCHO(商標)培地中で8%CO2雰囲気下、37℃及び湿度85%の条件下で振とう培養(130rpm)して増殖させた。サンプル数に応じた数の30 mLの細胞培養物(1.0 x 106 cells/mL)を準備した。リツキマシブ、R3変異体及びR5変異体のそれぞれをコードするプラスミドDNAを制限酵素Pvu Iで切断し、エタノール沈殿法で精製して、線状化プラスミドDNAを得た。線状化プラスミドDNAを用いて、下記の組成のDNA溶液を調製した。また、下記の組成のトランスフェクション試薬を調製し、５分間静置した。
[DNA溶液]
プラスミドDNA溶液 50μgに相当する量(μL)
OptiPRO(商標) SFM 適量(mL)
合計 1.5 mL
[トランスフェクション試薬]
FreeStyle(商標) MAX試薬 80μL
OptiPRO(商標) SFM 1420μL
合計 1.5 mL
調製したDNA溶液及びトランスフェクション試薬を混合して、10分間静置した。得られた混合液(3 mL)を細胞培養物(30 mL)に添加して、5%CO2雰囲気下、37℃にて振とう培養(150 rpm)した。48時間後、各培養物にピューロマイシン及びメトトレキサートを添加し、遺伝子が導入された細胞の選択を行った。生存率及び細胞増殖能が回復するまで培地交換及び継代を行い、リツキマシブ及び各変異体を安定発現するCHO-S細胞(以下、「安定発現株」と呼ぶ)を得た。これらの安定発現株の培養物を常法により冷凍保存した。
(３) 安定発現株の培養
冷凍保存された各安定発現株を、1/100量の抗凝集剤及び8 mM L-グルタミンを含むCD FortiCHO(商標)培地中に融解して培養し、継代を複数回行った。8 mM L-グルタミンを含むCD FortiCHO(商標)培地に糖類又は硫酸化多糖を添加して、試験用培地を調製した。糖類として、D(+)グルコース(富士フイルム和光純薬株式会社)、スクロース(キシダ化学株式会社)又はトレハロース二水和物(富士フイルム和光純薬株式会社)を50 mMの濃度となるよう添加した。硫酸化多糖として、コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム(富士フイルム和光純薬株式会社)、デキストラン硫酸ナトリウム(分子量5000)(Merck社)又はヘパリンナトリウム(富士フイルム和光純薬株式会社)を1 mg/mLの濃度となるよう添加した。継代した各安定発現株を800 rpmで５分間遠心分離して培地を完全に除去した。回収した各安定発現株を3.0 x 105cells/mLの濃度で各試験用培地に播種し、14日間培養した。比較のため、糖類及び硫酸化多糖を添加しなかった培地で各安定発現株を14日間培養した。
(４) 安定発現株の生存及び抗体産生の評価
各試験用培地での培養の開始時(０日目)及び開始から３、７、10及び14日目に細胞培養物の一部を検体として採取した。検体の一部を用いて、生細胞及び死細胞を計数した。また、検体を遠心分離して、上清中の抗体濃度を測定した。細胞の計数は、トリパンブルーで細胞を染色した後、血球計算盤を用いて行った。各安定発現株について、生細胞数及び死細胞数から生存率を算出した。上清中の抗体濃度は、サンドイッチELISA法により測定した。具体的な操作は、以下のとおりであった。
96ウェルプレート(Corning社)の各ウェルに、KPLコーティング溶液(SeraCare Life Sciences社)で2μg/mLに希釈した抗ヒトIgG Fc抗体(Bethyl Laboratories社)の溶液を添加して、４℃で一晩インキュベートした。各ウェルから溶液を除去した後、1% BSA/PBSを添加して、室温で３時間インキュベートした。各ウェルから溶液を除去した後、0.1% Tween(登録商標)20含有PBS(PBST)で３回洗浄した。各ウェルに培養上清を添加して、室温で１時間インキュベートした。各ウェルから溶液を除去した後、PBSTで３回洗浄した。各ウェルに、1% BSA/PBSで0.3μg/mLに希釈したHRP標識抗ヒトIgG Fc抗体(Bethyl Laboratories社)の溶液を添加して、室温で１時間インキュベートした。各ウェルから溶液を除去した後、PBSTで３回洗浄した。KPL ABTS(登録商標)ペルオキシダーゼ基質システム(SeraCare Life Sciences社)を用いて発色反応を行い、KPL ABTS(登録商標)ペルオキシダーゼ停止溶液(SeraCare Life Sciences社)を用いて発色反応を停止させた。SpectraMax(登録商標)190マイクロプレートリーダー(Molecular Devices社)を用いて、405 nmの吸光度を測定した。各上清中の抗体の濃度は、リファレンス抗体のスタンダードカーブを用いて取得した。
(５) 結果
糖類又は硫酸化多糖を添加した培地で培養した各安定発現株の生存率(%)を、図１～６に示す。糖類又は硫酸化多糖を添加した培地で培養した各安定発現株の抗体収量を、上清中の抗体濃度(mg/L)として、図７～図１２に示す。図中、「WT」とは、軽鎖FR3のアミノ酸残基を置換していないリツキマシブを指す(このことは、図１３以降についても同様である)。
図１～３に示されるように、いずれの糖類を添加しても、リツキマシブ及び各変異体の安定発現株の生存率には、大きな変化は認められなかった。図４～６に示されるように、デキストラン硫酸ナトリウム及びヘパリンナトリウムを添加した場合、各安定発現株の10日目及び14日目の生存率は、コンドロイチン硫酸を添加した場合及び何も添加しなかった場合に比べて、やや高い傾向にあった。
図７に示されるように、いずれの糖類を添加しても、リツキマシブの収量は、何も添加しなかった場合よりも低下した。図８に示されるように、14日目のR3変異体の収量は、スクロースを添加した場合、何も添加しなかった場合よりも、わずかに高くなった。図９に示されるように、７、10及び14日目のR5変異体の収量は、スクロース又はグルコースを添加した場合、糖類を添加しなかった場合よりも、わずかに高くなった。これらの結果より、糖類の添加によって、リツキマシブ及び各変異体の収量がわずかに向上する可能性があることが示唆された。しかし、糖類の添加による変異体の収量の増加は、十分に満足できるものではなかった。
図１０に示されるように、14日目のリツキマシブの収量は、デキストラン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した場合、コンドロイチン硫酸ナトリウムを添加した場合及び何も添加しなかった場合よりも、わずかに高くなった。一方、図１１及び１２に示されるように、７、10及び14日目のR3及びR5変異体の収量は、いずれの硫酸化多糖を添加した場合も、何も添加しなかった場合に比べて、顕著に増加した。具体的には、14日目のR3変異体の収量は、硫酸化多糖の添加により、何も添加しなかった場合の収量の約２倍となった。また、14日目のR5変異体の収量は、コンドロイチン硫酸ナトリウムの添加により、何も添加しなかった場合の収量の3.7倍となり、デキストラン硫酸ナトリウム及びヘパリンナトリウムの添加により、何も添加しなかった場合の収量の約10倍となった。これらの結果より、硫酸化多糖の添加は、リツキマシブのR3変異体及びR5変異体の収量を顕著に向上させることが示唆された。
実施例２： デキストラン硫酸ナトリウムの濃度及び分子量の検討
実施例１で作製したリツキマシブ及びR5変異体の各安定発現株を種々の濃度又は分子量のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養して、抗体の収量が増加するか否かを検討した。
(１) 安定発現株の培養
リツキマシブ及びR5変異体の各安定発現株の冷凍ストックを、実施例１と同様にして融解し、培養及び継代を行った。分子量の検討のため、8 mM L-グルタミンを含むCD FortiCHO(商標)培地に、分子量5,000のデキストラン硫酸ナトリウム(Merck社)又は分子量50,000のデキストラン硫酸ナトリウム(富士フイルム和光純薬株式会社)を1 mg/mLの濃度となるよう添加して、試験用培地を調製した。また、濃度を検討するため、8 mM L-グルタミンを含むCD FortiCHO(商標)培地に、分子量5,000のデキストラン硫酸ナトリウム(Merck社)を0.1、1又は10 mg/mLの濃度となるよう添加して、試験用培地を調製した。実施例１と同様にして、各安定発現株を各試験用培地に播種し、11又は12日間培養した。比較のため、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった培地で各安定発現株を11又は12日間培養した。
(２) 安定発現株の生存及び抗体産生の評価
デキストラン硫酸ナトリウムを異なる濃度で含む試験用培地の実験については、培養の開始時(０日目)及び開始から４、７、９及び11日目に細胞培養物の一部を検体として採取した。分子量の異なるデキストラン硫酸ナトリウムを含む試験用培地の実験については、培養の開始時(０日目)及び開始から５、７、９及び12日目に細胞培養物の一部を検体として採取した。実施例１と同様にして、細胞の生存率を算出し、上清中の抗体濃度を測定した。
(３) 結果
デキストラン硫酸ナトリウムを異なる濃度で含む試験用培地における、リツキマシブ及びR5変異体の各安定発現株の生存率(%)を図１３及び１４に示し、上清中の抗体濃度(mg/L)を図１５及び図１６に示す。分子量の異なるデキストラン硫酸ナトリウムを含む試験用培地における、リツキマシブ及びR5変異体の各安定発現株の生存率(%)を図１７及び１８に示し、上清中の抗体濃度(mg/L)を図１９及び図２０に示す。
図１３及び１４に示されるように、リツキマシブ及びR5変異体の各安定発現株の11日目の生存率は、デキストラン硫酸ナトリウムの濃度が高いほど、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった場合より高くなる傾向にあった。図１５に示されるように、11日目のリツキマシブの収量は、培地中のデキストラン硫酸ナトリウムの濃度が0.1又は1 mg/mLであるとき、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった場合に比べて約1.4倍に増加した。濃度が10 mg/mLであるとき、リツキマシブの収量は、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった場合に比べて減少した。図１６に示されるように、11日目のR5変異体の収量は、デキストラン硫酸ナトリウムの濃度が高いほど向上し、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった場合に比べて最大で約5.4倍に増加した。また、最も低い濃度の0.1 mg/mLの場合でも、R5変異体の収量は、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった場合に比べて約3.3倍に増加した。このようなR5変異体の収量の向上は、デキストラン硫酸ナトリウムの添加による生存率の向上を考慮してもなお顕著な効果であった。
図１７及び１８に示されるように、分子量5,000のデキストラン硫酸ナトリウム及び分子量50,000のデキストラン硫酸ナトリウムを添加した場合、リツキマシブ及びR5変異体の各安定発現株の12日目の生存率は、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった場合より高くなる傾向にあった。図１９に示されるように、リツキマシブの収量は、デキストラン硫酸ナトリウムの添加により、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった場合に比べて、わずかに増加した。図２０に示されるように、デキストラン硫酸ナトリウムを添加した場合の12日目のR5変異体の収量は、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった場合に比べて最大で約3.7倍に増加した。
実施例３： デキストラン硫酸ナトリウムの分子量の検討(２)
実施例１で作製したリツキマシブのR3変異体の安定発現株を種々の分子量のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養して、抗体の収量が増加するか否かを検討した。
(１) 安定発現株の培養
R3変異体の安定発現株の冷凍ストックを、実施例１と同様にして融解し、培養及び継代を行った。実施例２と同様にして、8 mM L-グルタミンを含むCD FortiCHO(商標)培地に、分子量5,000のデキストラン硫酸ナトリウム(Merck社)、分子量50,000のデキストラン硫酸ナトリウム(富士フイルム和光純薬株式会社)又は分子量500,000のデキストラン硫酸ナトリウム(富士フイルム和光純薬株式会社)を1 mg/mLの濃度となるよう添加して、試験用培地を調製した。実施例１と同様にして、各安定発現株を各試験用培地に播種し、12日間培養した。比較のため、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった培地で各安定発現株を12日間培養した。
(２) 安定発現株の生存及び抗体産生の評価
培養の開始時(０日目)及び開始から５、７、９及び12日目に細胞培養物の一部を検体として採取した。実施例１と同様にして、細胞の生存率を算出し、上清中の抗体濃度を測定した。
(３) 結果
R3変異体の安定発現株の生存率(%)を図２１に示し、上清中の抗体濃度(mg/L)を図２２に示す。図２１に示されるように、デキストラン硫酸ナトリウムの添加により、R3変異体の安定発現株の12日目の生存率は、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった場合より高くなる傾向にあった。図２２に示されるように、12日目のR3変異体の収量は、デキストラン硫酸ナトリウムの添加により顕著に増加し、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった場合に比べて最大で約4.6倍に増加した。デキストラン硫酸ナトリウムの分子量の差異は、R3変異体の収量の向上効果にはほとんど影響しなかった。
実施例４： ヘパリンナトリウムの濃度の検討
実施例１で作製したリツキマシブ及びR5変異体の各安定発現株を種々の濃度のヘパリンナトリウムを含む培地で培養して、抗体の収量が増加するか否かを検討した。
(１) 安定発現株の培養
リツキマシブ及びR5変異体の各安定発現株の冷凍ストックを、実施例１と同様にして融解し、培養及び継代を行った。実施例２と同様にして、8 mM L-グルタミンを含むCD FortiCHO(商標)培地に、ヘパリンナトリウム(富士フイルム和光純薬株式会社)を0.1、1又は10 mg/mLの濃度となるよう添加して、試験用培地を調製した。実施例１と同様にして、各安定発現株を各試験用培地に播種し、12日間培養した。比較のため、ヘパリンナトリウムを添加しなかった培地で各安定発現株を12日間培養した。
(２) 安定発現株の生存及び抗体産生の評価
培養の開始時(０日目)及び開始から５、７、９及び12日目に細胞培養物の一部を検体として採取した。実施例１と同様にして、細胞の生存率を算出し、上清中の抗体濃度を測定した。
(３) 結果
リツキマシブ及びR5変異体の各安定発現株の生存率(%)を図２３及び２４に示し、上清中の抗体濃度(mg/L)を図２５及び図２６に示す。図２３及び２４に示されるように、各安定発現株の12日目の生存率は、ヘパリンナトリウムの添加により、添加しなかった場合に比べて高くなった。特に、10 mg/mLのヘパリンナトリウムを添加した場合では、各安定発現株の12日目の生存率は、添加しなかった場合に比べて顕著に高くなった。
図２５に示されるように、リツキマシブの収量は、ヘパリンナトリウムをいずれの濃度で添加しても、添加しなかった場合と、ほとんど変わらなかった。図２６に示されるように、12日目のR5変異体の収量は、ヘパリンナトリウムの濃度が高いほど向上し、ヘパリンナトリウムを添加しなかった場合に比べて最大で約4.2倍に増加した。また、最も低い濃度の0.1 mg/mLの場合でも、R5変異体の収量は、ヘパリンナトリウムを添加しなかった場合に比べて約2.2倍に増加した。上述のとおり、リツキマシブの安定発現株の生存率は、10 mg/mLのヘパリンナトリウムの添加により顕著に高くなったが、リツキマシブの収量に変化はなかった。そうすると、R5変異体の収量の向上は、ヘパリンナトリウムの添加による生存率の向上を考慮してもなお顕著な効果であることが示唆された。
実施例５： アニオン性ポリアミノ酸の効果の検討
リツキマシブ及びその変異体をコードする遺伝子を導入した動物細胞を、アニオン性ポリアミノ酸としてポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養して、抗体の収量が増加するか否かを検討した。
(１) 安定発現株の培養
リツキマシブ、R3変異体及びR5変異体の各安定発現株の冷凍ストックを、実施例１と同様にして融解し、培養及び継代を行った。8 mM L-グルタミンを含むCD FortiCHO(商標)培地に、ポリ-(α,β)-DL-アスパラギン酸ナトリウム(Merck社)又はポリ-L-γ-グルタミン酸ナトリウム(Merck社)を1 mg/mLの濃度となるよう添加して、試験用培地を調製した。実施例１と同様にして、各安定発現株を各試験用培地に播種し、12日間培養した。比較のため、アニオン性ポリアミノ酸を添加しなかった培地で各安定発現株を12日間培養した。
(２) 安定発現株の生存及び抗体産生の評価
培養の開始時(０日目)及び開始から５、７、９及び12日目に細胞培養物の一部を検体として採取した。実施例１と同様にして、細胞の生存率を算出し、上清中の抗体濃度を測定した。
(３) 結果
リツキマシブ、R3変異体及びR5変異体の各安定発現株の生存率(%)を図２７～図２９に示し、上清中の抗体濃度(mg/L)を図３０～図３２に示す。図中、「PASP」とは、ポリアスパラギン酸ナトリウムを指し、「PGA」とは、ポリグルタミン酸ナトリウムを指す。図２７～図２９に示されるように、アニオン性ポリアミノ酸の添加により、各安定発現株の12日目の生存率は、アニオン性ポリアミノ酸を添加しなかった場合より高くなる傾向にあった。図３０に示されるように、リツキマシブの収量は、アニオン性ポリアミノ酸を添加しても、添加しなかった場合と、ほとんど変わらなかった。図３１に示されるように、R3変異体の収量は、アニオン性ポリアミノ酸の添加により、添加しなかった場合に比べて顕著に増加した。図３２に示されるように、R5変異体の収量は、アニオン性ポリアミノ酸の添加により、添加しなかった場合に比べて顕著に増加した。特に、ポリアスパラギン酸ナトリウムを添加した場合の12日目のR5変異体の収量は、アニオン性ポリアミノ酸を添加しなかった場合に比べて約4.5倍に増加した。これらの結果より、硫酸化多糖だけでなく、アニオン性ポリアミノ酸によっても、リツキマシブのR3変異体及びR5変異体の収量を向上できることが示された。
実施例６： 中性多糖の効果の検討
リツキマシブ及びその変異体をコードする遺伝子を導入した動物細胞を、中性多糖としてデキストランを含む培地で培養して、抗体の収量が増加するか否かを検討した。比較のため、アニオン性多糖であるデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地を用いた実験も行った。
(１) 安定発現株の培養
リツキマシブ、R3変異体及びR5変異体の各安定発現株の冷凍ストックを、実施例１と同様にして融解し、培養及び継代を行った。8 mM L-グルタミンを含むCD FortiCHO(商標)培地に、デキストラン(分子量5,000)(Sigma社)又はデキストラン硫酸ナトリウム(分子量5,000)(Sigma社)を1 mg/mLの濃度となるよう添加して、試験用培地を調製した。実施例１と同様にして、各安定発現株を各試験用培地に播種し、12日間培養した。比較のため、いずれの多糖も添加しなかった培地で各安定発現株を12日間培養した。
(２) 安定発現株の生存及び抗体産生の評価
培養の開始時(０日目)及び開始から２、７及び12日目に細胞培養物の一部を検体として採取した。実施例１と同様にして、細胞の生存率を算出し、上清中の抗体濃度を測定した。
(３) 結果
リツキマシブ、R3変異体及びR5変異体の各安定発現株の生存率(%)を図３３～図３５に示し、上清中の抗体濃度(mg/L)を図３６～図３８に示す。図３３に示されるように、リツキマシブの安定発現株の12日目の生存率は、デキストランの添加により、多糖を添加しなかった場合より低下した。図３４及び３５に示されるように、R3変異体及びR5変異体の各安定発現株の12日目の生存率は、デキストランの添加により、多糖を添加しなかった場合より高くなった。いずれの安定発現株も、デキストラン硫酸ナトリウムの添加により、12日目の生存率は、多糖を添加しなかった場合より高くなった。
図３６～図３８に示されるように、リツキマシブ、R3変異体及びR5変異体の収量はいずれも、デキストランの添加により、多糖を添加しなかった場合より、わずかに減少した。一方で、リツキマシブ、R3変異体及びR5変異体の収量はいずれも、デキストラン硫酸ナトリウムの添加により、多糖を添加しなかった場合より増加した。これらの結果から、中性多糖であるデキストランは、リツキマシブ、R3変異体及びR5変異体の収量には影響しないことが示された。
実施例７： 硫酸基のないアニオン性多糖及び中性ポリアミノ酸の効果の検討
リツキマシブ及びR3変異体をコードする遺伝子を導入した動物細胞を、硫酸基のないアニオン性多糖としてアルギン酸塩、又は中性ポリアミノ酸としてポリプロリンを含む培地で培養して、抗体の収量が増加するか否かを検討した。
(１) 安定発現株の培養
リツキマシブ及びR3変異体の各安定発現株の冷凍ストックを、実施例１と同様にして融解し、培養及び継代を行った。8 mM L-グルタミンを含むCD FortiCHO(商標)培地に、アルギン酸ナトリウム80-120(富士フイルム和光純薬株式会社)又はポリ-L-プロリン(Sigma社)を1 mg/mLの濃度となるよう添加して、試験用培地を調製した。実施例１と同様にして、各安定発現株を各試験用培地に播種し、12日間培養した。比較のため、多糖及びポリアミノ酸を添加しなかった培地で各安定発現株を12日間培養した。
(２) 安定発現株の生存及び抗体産生の評価
培養の開始時(０日目)及び開始から５、７、９及び12日目に細胞培養物の一部を検体として採取した。実施例１と同様にして、細胞の生存率を算出し、上清中の抗体濃度を測定した。
(３) 結果
リツキマシブ及びR3変異体の各安定発現株の生存率(%)を図３９及び４０に示し、上清中の抗体濃度(mg/L)を図４１及び４２に示す。図３９に示されるように、リツキマシブの安定発現株の12日目の生存率は、アルギン酸塩又はポリプロリンの添加により、これらを添加しなかった場合より、わずかに高くなった。図４０に示されるように、R3変異体の安定発現株の９日目の生存率は、アルギン酸塩又はポリプロリンの添加により、これらを添加しなかった場合より高くなった。
図４１に示されるように、リツキマシブの収量は、アルギン酸塩又はポリプロリンの添加により、これらを添加しなかった場合より減少した。図４２に示されるように、R3変異体の収量は、ポリプロリンを添加しても、アルギン酸塩及びポリプロリンを添加しなかった場合と、ほとんど変わらなかった。一方で、R3変異体の収量は、アルギン酸塩の添加により、アルギン酸塩又はポリプロリンを添加しなかった場合より顕著に増加した。このようなR3変異体の収量の向上は、アルギン酸塩の添加による生存率の向上を考慮してもなお顕著な効果であった。これらの結果より、硫酸基のないアニオン性多糖であるアルギン酸塩は、リツキマシブ及びR3変異体の収量を向上する効果を有し、中性ポリアミノ酸であるポリプロリンにはそのような効果がないことが示された。
実施例８： リツキマシブ以外の抗体の産生における硫酸化多糖の効果の検討
リツキマシブ以外の各種抗体の変異体をコードする遺伝子を導入した動物細胞を、硫酸化多糖を含む培地で培養して、抗体の収量が増加するか否かを検討した。この実施例では、一過性発現系を用いた。また、各抗体の抗原に対する親和性も評価した。
(１) リツキマシブ以外の各種抗体の変異体の遺伝子の取得
米国特許出願公開第2018/0179298号明細書に記載の方法と同様にして、トラスツズマブ(ヒト化抗体)、抗リゾチーム抗体(マウス抗体)、抗IL-6抗体(マウス/ヒトキメラ抗体)及び抗IL-8抗体(マウス/ヒトキメラ抗体)のそれぞれをコードする遺伝子を含むプラスミドDNAを鋳型として用いるPCR法により、各抗体とそれらの変異体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを合成した。また、各抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを合成した。トラスツズマブ及び抗IL-8抗体の変異体は、R3変異体及びR4変異体であった。抗リゾチーム抗体及び抗IL-6抗体の変異体は、R5変異体であった。
トラスツズマブのR3変異体は、Chothia法で定義される軽鎖の65位、67位及び70位のアミノ酸残基がアルギニン残基に置換された抗体であり、R4変異体は、Chothia法で定義される軽鎖の63位、65位、67位及び70位のアミノ酸残基がアルギニン残基に置換された抗体であった。抗IL-8抗体のR3変異体は、Chothia法で定義される軽鎖の63位、65位及び67位のアミノ酸残基がアルギニン残基に置換された抗体であり、R4変異体は、Chothia法で定義される軽鎖の63位、65位、67位及び70位のアミノ酸残基がアルギニン残基に置換された抗体であった。抗リゾチーム抗体及び抗IL-6抗体のR5変異体は、Chothia法で定義される軽鎖の63位、65位、67位、70位及び72位のアミノ酸残基がアルギニン残基に置換された抗体であった。
各抗体の変異体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドをpcDNA3.4ベクター(Thermo Fisher Scientific社)中に挿入した。これにより、各種抗体とそれらの変異体の軽鎖をコードする遺伝子を含む動物細胞発現用プラスミドDNA(以下、「軽鎖プラスミド」ともいう)を取得した。また、各抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドをpcDNA3.4ベクター中に挿入して、各抗体の重鎖をコードする遺伝子を含む動物細胞発現用プラスミドDNA(以下、「重鎖プラスミド」ともいう)も取得した。抗原に対する親和性を評価するため、実施例１で作製したリツキマシブとそのR3変異体及びR5変異体の動物細胞発現用プラスミドDNAを用いて、リツキマシブとそのR3変異体及びR5変異体の軽鎖プラスミドと、リツキマシブの重鎖プラスミドも作製した。
各抗体をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、抗体(IgG)の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を決定した。これらのアミノ酸配列は下記のとおりであった。また、作製した各変異体(IgG)の軽鎖のアミノ酸配列も以下に示す。下線部は、アルギニン残基に置換された位置を示す。
・トラスツズマブの重鎖
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号５)
・トラスツズマブの軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC (配列番号６)
・トラスツズマブのR3変異体の軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGRRRGTRFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC (配列番号７)
・トラスツズマブのR4変異体の軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFRGRRRGTRFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC (配列番号８)
・抗リゾチーム抗体の重鎖
DVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSDYWSWIRKFPGNRLEYMGYVSYSGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLDLNSVTTEDTATYYCANWDGDYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (配列番号９)
・抗リゾチーム抗体の軽鎖
DIVLTQSPATLSVTPGNSVSLSCRASQSIGNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (配列番号10)
・抗リゾチーム抗体のR5変異体の軽鎖
DIVLTQSPATLSVTPGNSVSLSCRASQSIGNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFRGRGRGTRFRLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (配列番号11)
・抗IL-6抗体の重鎖
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAREGYGNLERDCWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号12)
・抗IL-6抗体の軽鎖
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDGFGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYVASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDSAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTMSFNRGEC (配列番号13)
・抗IL-6抗体のR5変異体の軽鎖
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDGFGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYVASNQGSGVPARFRGRGRGTRFRLNIHPMEEDDSAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTMSFNRGEC (配列番号14)
・抗IL-8抗体の重鎖
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFNNYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGNTYYPDSVKGRFTLSRDNARNILYLQMSRLRSEDTAMYYCARDKLRLPNWYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号15)
・抗IL-8抗体の軽鎖
DIVLTQSPPSLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIYPVEEEDAATYYCQQSNEDPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTMSFNRGEC (配列番号16)
・抗IL-8抗体のR3変異体の軽鎖
DIVLTQSPPSLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYGASNLESGIPARFRGRGRGTDFTLNIYPVEEEDAATYYCQQSNEDPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTMSFNRGEC (配列番号17)
・抗IL-8抗体のR4変異体の軽鎖
DIVLTQSPPSLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYGASNLESGIPARFRGRGRGTRFTLNIYPVEEEDAATYYCQQSNEDPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTMSFNRGEC (配列番号18)
(２) 抗体をコードする遺伝子の動物細胞への導入及び細胞培養
[試薬]
Expi293(商標)細胞(Thermo Fisher Scientific社)
Expi293(商標) Expression培地(Thermo Fisher Scientific社)
ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションキット(Thermo Fisher Scientific社)
(2.1) トランスフェクション
Expi293(商標)細胞は、5%CO2雰囲気下、37℃にて振とう培養(150 rpm)して増殖させた。サンプル数に応じた数の25.5mLの細胞培養物(3x106 cells/mL)を準備した。軽鎖プラスミド及び重鎖プラスミドを用いて、以下の組成のDNA溶液を調製し、５分間静置した。
[DNA溶液]
軽鎖プラスミド溶液 15μgに相当する量(μL)
重鎖プラスミド溶液 15μgに相当する量(μL)
Opti-MEM(商標) 適量(mL)
合計 1.5 mL
以下の組成のトランスフェクション試薬を調製し、５分間静置した。
ExpiFectamine試薬 80μL
Opti-MEM(商標) 1420μL
合計 1.5 mL
調製したDNA溶液及びトランスフェクション試薬を混合して、20分間静置した。得られた混合液(3 mL)を細胞培養物(25.5 mL)に添加して、細胞へのトランスフェクションを行った。トランスフェクションした細胞を5%CO2雰囲気下、37℃にて４時間振とう培養(125 rpm)した。細胞培養物にデキストラン硫酸ナトリウム(分子量5000)(Sigma社)を1 mg/mLの濃度となるよう添加して、さらに振とう培養を行った。比較のため、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった細胞培養物も同様に振とう培養した。トランスフェクションから20時間後、細胞培養物に、ExpiFectamine(商標)トランスフェクションエンハンサー1及び2をそれぞれ150μL及び1.5 mLを添加して、5%CO2雰囲気下、37℃にて４日間振とう培養(125 rpm)した。トランスフェクションから５日後、各細胞培養物から培養上清を回収した。
(３) 抗体産生の評価
回収した培養上清の一部を取り、抗体濃度を測定するための試料とした。サンドイッチELISA法により、培養上清中の各抗体の濃度を測定した。リツキマシブ、トラスツズマブ、抗IL-6抗体及び抗IL-8抗体については、実施例１と同様にして測定した。マウス抗体である抗リゾチーム抗体については、以下のようにして測定した。
96ウェルプレート(Corning社)の各ウェルに、KPLコーティング溶液(SeraCare Life Sciences社)で5μg/mLに希釈したヤギ抗マウスIgG(H+L) Highly Cross-Adsorbed(Thermo Fisher Scientific社)の溶液を添加して、４℃で一晩インキュベートした。各ウェルから溶液を除去した後、1% BSA/PBSを添加して、室温で３時間インキュベートした。各ウェルから溶液を除去した後、PBSTで３回洗浄した。各ウェルに培養上清を添加して、室温で１時間インキュベートした。各ウェルから溶液を除去した後、PBSTで３回洗浄した。各ウェルに、1% BSA/PBSで0.3μg/mLに希釈したHRP標識ヤギF(ab’)2フラグメント抗マウスIgG(H+L)(Beckman社)の溶液を添加して、室温で１時間インキュベートした。各ウェルから溶液を除去した後、PBSTで３回洗浄した。KPL TMBペルオキシダーゼ基質(SeraCare Life Sciences社)を用いて発色反応を行い、KPL TMBペルオキシダーゼ停止溶液(SeraCare Life Sciences社)を用いて発色反応を停止させた。SpectraMax(登録商標)190マイクロプレートリーダー(Molecular Devices社)を用いて、450 nmの吸光度を測定した。各上清中の抗体の濃度は、リファレンス抗体のスタンダードカーブを用いて取得した。
(４) 抗体の抗原に対する親和性の評価
(4.1) 抗体の精製
デキストラン硫酸ナトリウムを添加した細胞培養物から回収した培養上清中の抗体を、MabSelect(商標)(Cytiva社)を用いて精製した。得られた抗体溶液を、Superdex(登録商標)200 Increase 10/300 GL(Cytiva社)を用いるゲルろ過クロマトグラフィーにより、さらに精製した。移動相にはPBSを用い、流速0.75 mL/minの条件で精製を行った。精製により得られた抗体溶液中の抗体濃度は、280 nmの吸光度を測定することによって算出した。
(4.2) トラスツズマブ及びその変異体のビオチン標識
トラスツズマブとそのR3変異体及びR4変異体を、ビオチンラベリングキット-NH2(株式会社同仁化学研究所)を用いてビオチン標識した。具体的な操作は、キットの添付文書に従って行った。
(4.3) 抗原に対する親和性の測定
各抗体の抗原に対する親和性をELISA法により測定した。各抗体の抗原として、ヒトCD20/MS4A1全長タンパク質, Hisタグ(HEK293)(ACROBiosystems社)、リコンビナント・ヒトErbB2/Her2 Fcキメラ(R&D Systems社)、ニワトリ卵白由来リゾチーム(Sigma社)、アニマルフリー・リコンビナント・ヒトIL-6(PEPROTECH社)及びインターロイキン8(CXCL8)(Shenandoah Biotechnology社)を用いた。具体的な操作は、次のとおりであった。96ウェルプレート(Nunc社)の各ウェルに、PBSで5μg/mLに希釈した各種抗原の溶液を添加して、４℃で一晩インキュベートした。各ウェルから溶液を除去した後、1% BSA/PBSを添加して、室温で３時間インキュベートした。各ウェルから溶液を除去した後、PBSTで３回洗浄した。各ウェルに抗体溶液を添加して、室温で15分間インキュベートした。各ウェルから溶液を除去した後、PBSTで３回洗浄した。各ウェルに、1% BSA/PBSで0.3μg/mLに希釈したHRP標識抗ヒトIgG Fc抗体(Bethyl Laboratories社)、HRP標識ヤギF(ab’)2フラグメント抗マウスIgG(H+L)(Beckman社)又はHRP結合ストレプトアビジン(Thermo Fisher Scientific社)の溶液を添加して、室温で１時間インキュベートした。各ウェルから溶液を除去した後、PBSTで３回洗浄した。KPL TMBペルオキシダーゼ基質(SeraCare Life Sciences社)を用いて発色反応を行い、KPL TMBペルオキシダーゼ停止溶液(SeraCare Life Sciences社)を用いて発色反応を停止させた。SpectraMax(登録商標)190マイクロプレートリーダー(Molecular Devices社)を用いて、450 nmの吸光度を測定した。
(５) 結果
リツキマシブ以外の各抗体とそれらの変異体の発現量及び抗原に対する親和性を、表１～４及び図４３～４６に示す。リツキマシブとその変異体の抗原に対する親和性を、表５及び図４７に示す。表及び図において、「WT」とは、軽鎖FR3のアミノ酸残基を置換していない抗体を指す。表中、「-DS」とは、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しなかった細胞培養物の上清中の抗体濃度(mg/L)を指す。「+DS」とは、デキストラン硫酸ナトリウムを添加した細胞培養物の上清中の抗体濃度(mg/L)を指す。「ratio」とは、-DSの値に対する+DSの値の比を指す。「EC50」とは、50%効果濃度を指す。「EC50 ratio」とは、WTのEC50を1.0としたときの各変異体の親和性の比(EC50 ratio)を指す。
Figure 2023069350000002
Figure 2023069350000003
Figure 2023069350000004
Figure 2023069350000005
Figure 2023069350000006
表１～４に示されるように、トラスツズマブ、抗リゾチーム抗体、抗IL-6抗体及び抗IL-8抗体の収量は、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しても、添加しなかった場合と、ほとんど変わらなかった。一方、各抗体の変異体の収量は、デキストラン硫酸ナトリウムの添加により、添加しなかった場合より明らかに増加した。上記の各抗体の変異体においては、軽鎖FR3の所定のアミノ酸残基がアルギニン残基に置換されたことは共通するが、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は互いに異なっている。したがって、ポリアニオン性化合物による変異体の収量の増加効果は、いずれの抗体の変異体にも適用できることが示唆された。また、表１～５及び図４３～４７に示されるように、いずれの抗体の変異体も、WTに比べて、抗原に対する親和性が向上した。デキストラン硫酸ナトリウムを培地に添加しても、抗体の抗原に対する親和性には影響しないことが示唆された。

Claims (11)

  1. 抗体をコードする遺伝子が導入された動物細胞をポリアニオン性化合物の存在下で培養して、前記動物細胞に前記抗体を産生させることを含み、
    前記ポリアニオン性化合物が、アニオン性多糖及びアニオン性ポリアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１であり、
    前記抗体が、フレームワーク領域３(FR3)の少なくとも３つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換された抗体である、抗体の製造方法。
  2. 前記アニオン性多糖が、硫酸化多糖又はアルギン酸塩である請求項１に記載の方法。
  3. 前記硫酸化多糖が、デキストラン硫酸及びその塩、グリコサミノグリカン、及び、硫酸基を含むプロテオグリカンからなる群より選択される少なくとも１である請求項２に記載の方法。
  4. 前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ペントサン硫酸及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１である請求項３に記載の方法。
  5. 前記硫酸基を含むプロテオグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１が共有結合したタンパク質である請求項３又は４に記載の方法。
  6. 前記アニオン性ポリアミノ酸が、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１である請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記ポリアニオン性化合物を0.05 mg/mL以上20 mg/mL以下の濃度で含む培地で、前記動物細胞を培養する請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記抗体がIgGである請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記FR3の少なくとも３つのアミノ酸残基が、Chothia法で定義される軽鎖の63位、65位、67位、70位及び72位からなる群より選択される少なくとも３カ所の残基を含む請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記抗体が、前記アミノ酸残基の置換をする前の抗体と比べて、抗原に対する親和性が向上した抗体である請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法により生産された抗体。
JP2021181139A 2021-11-05 2021-11-05 抗体の製造方法及び抗体 Pending JP2023069350A (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021181139A JP2023069350A (ja) 2021-11-05 2021-11-05 抗体の製造方法及び抗体
CN202211380445.8A CN116334163A (zh) 2021-11-05 2022-11-04 抗体的制造方法及抗体
US18/052,746 US20230203435A1 (en) 2021-11-05 2022-11-04 Method for producing antibody
EP22205436.3A EP4177269A1 (en) 2021-11-05 2022-11-04 Method for producing antibody

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021181139A JP2023069350A (ja) 2021-11-05 2021-11-05 抗体の製造方法及び抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023069350A true JP2023069350A (ja) 2023-05-18

Family

ID=84363019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021181139A Pending JP2023069350A (ja) 2021-11-05 2021-11-05 抗体の製造方法及び抗体

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230203435A1 (ja)
EP (1) EP4177269A1 (ja)
JP (1) JP2023069350A (ja)
CN (1) CN116334163A (ja)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2819695B1 (en) * 2012-03-02 2018-06-27 Academia Sinica ANTI-EPITHELIAL CELL ADHESION MOLECULE (EpCAM) ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
US9677105B2 (en) * 2013-03-14 2017-06-13 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US11267904B2 (en) 2016-12-28 2022-03-08 Sysmex Corporation Method for controlling affinity of antibody for antigen, antibody whose affinity for antigen has been altered, and its production method
WO2020257760A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 Single Cell Technology, Inc. Anti-tigit antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
CN116334163A (zh) 2023-06-27
US20230203435A1 (en) 2023-06-29
EP4177269A1 (en) 2023-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6854322B2 (ja) ヒトプログラム死リガンド１（ｐｄ−ｌ１）に結合する抗体
CN102164962B (zh) 抗gd2抗体和方法及其相关应用
CN113943366A (zh) 新型抗体框架
EP2814842B1 (en) Antibodies that bind peptidoglycan recognition protein 1
US10604586B2 (en) Humanized monoclonal antibody and uses thereof
CN116648462A (zh) Cd3人源化抗体及其应用
US20140056918A1 (en) Oscar antagonists
AU2009216906B2 (en) Procedure for the generation of a high producer cell line for the expression of a recombinant anti-CD34 antibody
JP7222550B2 (ja) ヒトエリスロフェロン抗体及びその使用
JP2023069350A (ja) 抗体の製造方法及び抗体
CN108026180A (zh) 抗羟腐胺赖氨酸抗体及其用途
EP4019540A1 (en) Method for improving affinity of antibody for antigen and use thereof
CN111892657B (zh) 用于检测米田堡血型抗原的抗体及其片段、试剂盒及方法
CN116239688A (zh) 提升抗细胞因子抗体对于抗原的亲和性的方法、抗细胞因子抗体及其制造方法
CN112626009B (zh) 一种调整干细胞成软骨分化的方法
JP7181523B2 (ja) 糖鎖をエピトープとして特異的に認識する新規抗体及びその用途
WO2024061021A1 (zh) 检测抗CD19 Car表达水平的单克隆抗体及其在激活CD19 CAR-T细胞中的应用
TWI615408B (zh) 人源化之單株抗體及其用途
EP4361175A1 (en) Receptor tyrosine kinase agonist, composition for cell culture medium, and undifferentiated maintenance composition
WO2013011062A2 (en) Oscar antagonists
US20230159652A1 (en) Transferrin receptor 1 targeting for carcinogenesis prevention
WO2023147595A2 (en) Materials and methods for enhanced bioproduction processes
JP2023073687A (ja) 改変型抗体
US20120322083A1 (en) Antibody binding to abca1 polypeptide
CN117043187A (zh) GARP/TGFβ1抗体及其应用