TWI360424B

TWI360424B - Vaccine

Info

Publication number: TWI360424B
Application number: TW092121011A
Authority: TW
Inventors: Biemans Ralph; Denoel Philippe; Feron Christiane; Goraj Karine; Poolman Jan; Weynants Vincent
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2003-07-31
Publication date: 2012-03-21
Also published as: EP2258385A3; CN1671413A; KR101237329B1; JP2006505628A; JP2011051997A; PL216662B1; CO5680455A2; ES2575014T3; JP5414651B2; AU2003260357B2; CY1114243T1; ES2408251T3; US20120064120A1; CA2489030A1; NZ587398A; KR101239242B1; US20120064119A1; NZ537181A; US20160082097A1; NO20050421L

Description

1360424 玖、發明說明：【發明所屬之技術領域】

本發明係有關奈瑟氏球菌疫苗組合物、其製法及此等組合物於醫學上之用途之領域。更特定言之，其係有關製造新穎之基因工程處理之腦膜炎球菌菌株之方法，使其更適 &用方；生產奈瑟氏球菌（特足έ之腦膜炎球菌）外膜囊胞（或大疱）疫苗。亦說明以採用對人類更安全且/或更有效之新穎之LOS次單位或腦膜炎球菌外膜囊胞（或大疱）疫苗為主之有利製法與疫苗產品。【先前技術】月si膜炎奈瑟氏球適（Neisseria meningitidis)(腦膜炎球菌）為經常自人類上呼吸道中單離出之格蘭陰性細菌。其係嚴重ik入性細菌疾病之肇因’如：細菌血症與腦膜炎。腦膜炎球菌疾病之發生隨地理位置、季節及年度而異（Schwanz， B., Moore, P.S., Broome, C.V. ； Clin. Microbiol. Rev. 2 (# 充本），S18-S24, 1989^細菌通常依據其莢膜多醣之血清型 · 分類。溫帶地區之大多數疾病歸因於也清型B之菌株，其族群總發生率之變化為1-10/100,000/年-有時候達更高數值 (Kaczmarski, E.B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7： R55-9, 1995 ； Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J.T. et al. Clin. Infect. Dis. 16 ： 237-246, 1993 ； Cruz, C., Pavez, G„

Aguilar, E·，et al. Epidemiol. Infect. l〇5 : 119-126，1990)。以血清型A腦膜炎球菌為主之流行病主要發生在非洲，有 86952 1360424 時候高達 1000/100,000/年（Schwartz, B., Moore, P.S.，Broome， C.V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), SI 8-S24，1989)。幾乎所有病例均為血清型A、B、C、W-135與Y腦膜炎球菌之腦膜炎球菌疾病，可採用四價A、C、W-135、Y英膜多醣疫苗（ArmandJ·，Arminjon，F.，Mynard, M.C·，Lafaix, C·，J.

Biol. Stand. 10 : 335-339,1982)。過去幾十年來，歐洲國家之腦膜炎奈瑟氏球菌感染發生率已提高。其原因為社交活動增加以致傳染性提高所引起 (例如游永池、戲院，等等）❶現已常單離出對有些標準抗生素之敏感性較低或產生抗性之腦膜炎奈瑟氏球菌菌株。此現象造成醫學需求不適當’及需要新的抗微生物劑、疫苗、藥物篩選法及此生物體之診斷試驗。目前可採用之多醣疫苗已藉由其與載劑蛋白質之化學共軛法加以改善（Lieberman，J.M., Chin，S.S_，Wong, V.K., et al. JAMA 275 : 1499-1503, 1996)。然而，血清型B疫苗無法取得。已發現血清型B莢膜多醣為非免疫原性-最可能之原因為其與宿主成份有共通之相似結構（Wyle，F.A., Artenstein，M.S.，Brandt，IvH et al J. Infect. Dis. 126 ： 514-522, 1972 ； Fmne, J.M., Leinonen, M·, MKkeU, P.M. Lancet ii. : 355-357, 1 983)。因此，著重於嘗試由外膜囊胞（或大疱）或其純化之蛋白質成分發展血清型B疫苗。或者’用於發展疫苗之腦膜炎球菌抗原為腦膜炎球菌脂寡醣（LOS)。其係結合外膜之醋脂類，與腸桿菌之脂多醋 86952 1360424 (LPS)之相異處在於缺乏〇側鏈，因此類似lps之未純化型

(Griffiss et al. Rev infect Dis 1988 ; 10 : S287-295)。LOS 之寡St部份體中之異質性造成不同腦膜炎球菌菌株之間之結構與抗原性之差異（Griffiss et aLInf. Immun. 1 987 ; 55 : 1792-1800)。此點已用於再細分菌株形成12種免疫型。免疫型L3'L7、L9具有相同碳水化合物結構，因此稱為L3,7,9 (或為了明確說明’通稱為"L3")。腦膜炎球菌LOS L3,7,9 (L3)、 L2與L5可經唾液酸化而改造，或經添加胞嘧啶核苷5，_單磷酸-N-乙驢基神經胺糖酸而改造。已知l〇s之抗體可於實驗大老鼠中保護防止感染，並於感染腦膜炎奈瑟氏球菌之兒里中產生殺細菌活性（Griffiss et al J Infect Dis 1984 ; 150 : 71-79)。然而’有關腦膜炎球菌疫苗中使用LOS之問題為其毒性 (因其脂質A部份體所致）。 LOS亦出現在腦膜炎球菌大苑之表面。許多年來之努力著重於發展以腦膜炎球菌外膜囊胞（或大疱）為主之疫苗（de Moraes, J.C., Perkins, B., Camargo, M.C. et al. Lancet 340 ： 1074-1078, 1992 , Bjune, G., Hoiby, E.A. Gronnesby, J.K. et al· 338 : 1093-1096, 1991)。此等疫苗之優點在於包括數個呈適當折疊構形之完整外膜蛋白質，當投至宿主體内時，可誘發保護性之免疫反應。此外，奈瑟氏球菌菌株（包括腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B-menB)會排出大量外膜大癌，足以進行工業規模之製造。然而，大疱之製法更常包括使用清潔劑（例如：去氧膽酸鹽）萃取細菌細胞（例如：Ep 86952 1360424 1 1243)，其作用在於排除疫苗中大量之LOS。因為LOS如上述具有毒性（亦稱為内毒素）。使用LOS作為疫苗抗原之另一個問題在於12種LPS免疫型出現不同之竣水化合物結構（Μ. P. Jennings et al, Microbiology 1999, 145，3013-3021)。對其中一種免疫型產生之抗體卻無法辨識不同之免疫型。儘管已著重於製造LOS 免疫型之寡醣部份之通屬”核心”區（例如：WO 94/08021)，但對抗已改造之LOS所產生之抗體已喪失其殺細菌活性。因此需要一種具有許多不同免疫型之LOS成分之有效疫苗。使用L0S(亦稱為LPS或脂多醣）作為人類疫苗之抗原之另一個問題在於其帶有類似人類醣類結構之醣結構（例如：人類紅血球細胞），因此出現使用上之安全問題。此外，由於 L0S抗原之殺細菌有效性之結構敏感性，因此改變L0S結構亦有問題。本發明提出改善上述一種或多種問題之方法，並提出製造以腦膜炎球菌L0S作為保護性抗原（特別當出現在外膜囊胞上時）為主之新穎疫苗。【發明内容】本說明書中述及之公告案與專利案或專利申請案中所揭示之主題與資料已以引用之方式併入本文中。所提及之11脂寡醣"（或"LOS”）亦可稱為π脂多醣π或”LPSn。本文中"包括”、”包含”與"涵括”一詞均可由本發明者視需要分別改用"由—構成”、11由—組成”替代。 86952 -10- 1360424 本發明者發現’因縮短L0S寡醣結構而喪失抗原決定基’會誘發殺細菌性免疫反應。本發明者因此反而發現，為了在疫苗調配物中最有效使用LOS，必須儘可能保留l〇S 券醋結構’但僅有2種L 0 S抗原之組合可產生普遍有效之奈瑟氏球菌（較佳為腦膜炎球菌）疫苗。本發明第一方面為供預防或治療奈瑟氏球菌（較佳為腦膜炎球菌或腦膜炎球菌B) 疾病之免疫原性組合物，其包含奈瑟氏球菌（較佳為腦膜炎球菌）LOS免疫型L2與LOS免疫型L3。LOS可依已知純化法單離’或可自L2與L3奈瑟氏球菌菌株中衍生出至少2種外膜囊胞（或大疱）製劑。為了排除大疱製劑中鬆散結合之毒性 L0S，但仍保留大疱中高量之完整LOS抗原時，最好使用低濃度清潔劑：〇-〇_3%，較佳為0.05-0.2%，最佳為約〇. 1。/0之去氧膽酸鹽較佳（或DOC)萃取大疱。此等LOS抗原之組合在對抗90%以上之腦膜炎奈瑟氏球菌菌株上具有驚人有效性。本發明者亦發現，若免疫顯性之外膜蛋白質之某些組合之表現可以向下調節（較佳為刪除）時，本發明上述大癌免疫原性組合物及事實上任何奈瑟氏球菌（較佳為淋病球菌或腦膜炎球菌）衍生之大疱免疫原性組合物均可加強其表面上保濩性抗原（包括LOS)之效力。因此，本發明第二方面為一種衍生自奈瑟氏球菌菌株之奈瑟氏球菌大疱製劑，該菌株中2種或更多種下列外膜蛋白質之表現相較於天然未改造菌株已向下調節（較佳為刪除）：P〇rA、P〇rB、〇pA、〇pC 或PilC。較佳為porA與OpA、P〇rA與OpC、〇pA與OpC、或 86952 1360424

PorAM OpA與OpC已向下調節或刪除。Frp]g之表現向下調節（較佳為刪除）之現象已顯示有利於加強交叉保護性抗原 (特定言之由在限制鐵之條件下生長之奈瑟氏球菌菌株製成《大癌製劑）之效力。因此’由具有此突變之菌株衍生之奈瑟.氏球菌大疱，及由向下調節表現<FrpB與上述一種或多種向下調節表現之蛋白質之組合所衍生之大癌已成為本發明另H料突變有利於可衍生大癌免疫原性組合物之任何奈瑟氏球菌（較佳為腦膜炎球菌）菌株，然而最好使用L2或L3免疫型奈瑟氏球菌（較佳為腦膜炎球菌）菌株。較佳者，本發明大疱免疫原性組合物同時包含12與匕3大疱，其中上述免疫顯性外膜蛋白質（或〇MPs)之組合則缺乏其中至少一種（較佳為兩種）。有關向下調節此等基因之技術討論於WO 01/093 50 (其内容已以引用之方式併入本文中）。已知其中四種不同〇pa基因出現在腦膜炎球菌基因組中（Ah〇 et al. 1991 Mol. Microbiol. 5: 1429-37)，因此其中〇pa之表現據稱已向下調節’亦即較佳為腦膜炎球菌中1、2、3或（較佳為）所有4種基因均已向下調節。此等向下調節之基因工程方法說明於WO 01/09350或可尋求〇pa位置上沒有表現或表現低之容易發現之天然且安定之腦膜炎球菌菌株。此等菌株可採用 Poolman等人（1985 J.Med. Micro. 19 : 203-209) 所說之技術發展’其中可在培養盤上或於顯微鏡下，觀察細胞外觀，尋找其表型不同於表現〇pai細胞之〇pa-細胞。 —旦發現時’經過發酵操作後，以細胞内容物進行西方墨點分析法’確認其中缺乏0pa，即可證實該菌株為穩定 86952 -12- 1360424 之 Opa- 〇【實施方式】上述LPS免疫原性組会物之要令性針對L3或L2 LPS產生之抗體之安全性尚有疑慮，因為其結構類似人類糖原鞘脂類中所出現之乳醯基_N_新丁糖寡醣類（Gal 冷 l-4GlcNAc 冷 l-3Gal 冷 1-4G1C冷 1-;圖 1)。即使若許多人已安全地接受含有殘留量之L3 LPSi經去氧膽酸鹽萃取之囊胞疫苗接種（G_ Bjune et al, Lancet (1991)，338, 1093-1096 ； GVG. Sierra et al, NIPH ann (1991), 14, 195-210) ’刪除LOS醋末端之作法仍有利於防止與人類組織之表面上所出現結構之任何交又反應。較佳具體實施例中， lgtB基因之去活性結果產生中間lPs結構，其中末端半乳糖殘基與唾液酸均不存在（參見圖1與2，突變結果在L2與L3 LOS中留下4GlcNAcl召l-3Gai召i_4Glc召丨_結構）。此等中間物可在L3與L2 LPS菌株中得到。另一種可替代但較差之 (短）LPS型可由關閉lgtE基因取得。另一種可替代但較差之 LPS型可由關閉lgtA基因取得。若選拔這種lgtA-突變時，最好亦關閉lgtC表現’以防止非免疫原性^ 1免疫型形成。

LgtB·突變株為最佳者，因為本發明者發現，其係解決安全問題之最佳截短法，同時可保留LPS保護性寡醣抗原決定基’仍可誘發殺細菌性抗體反應。因此，上述本發明L2或L3製劑（不論純化與否或是否呈單離足大疱）或腦膜炎球菌大疱製劑通常均宜衍生自已經過基因工程處理之奈瑟氏球菌菌株（較佳為腦膜炎球菌），以顯 86952 -13- 1360424 著向下調節(較佳為關閉’最佳為刪除基因之所有或部份發動子與/或開放讀碼框）來自lgtB、⑷八或lgtE基因之功= 基因產物之表現。較佳之本發明奈瑟氏球菌菌株無法合成笑膜多醋。若本發明上述大疮製劍衍生自腦膜炎球菌B菌株時，其亦最好脫除莢膜多膽（其中亦包含似人類之醋結構）。僅管可關閉許多基因以達成此目的，但本發明者已發現’生產大疱之菌株最好已經過基因工程處理’使之永久向下調節來自 siaD基因之功能性基因產物之表現（亦即向下調節心2_8 $ 唾液基轉化酶活性），較佳為關閉基因，最佳為刪除基因之所有或部份發動子與/或開放讀碼框。這種去活性法^明於 WO 01/09350中。siaD (亦稱為synD)突.變為自莢膜多醣中脫除類似人類之抗原決定基之許多突變法中最佳者，因為其係唯一不會影響L Ο S之保護性抗原決定基之生合成作用之突變法，因此有利於以最終使用1^03作為保護性抗原為目標之方法，且對細菌生長之影響最小。因此，本發明較佳方面為衍生自lgtE—siaD-、lgtA-siaD或較佳之lgtB- siaD-腦膜炎球菌B哭變株菌株之如上述大疱免疫原性製劑。菌株本身亦為本發明另一方面。雖然基於上述理由，siaD—突變為較佳方式，但亦可使用其他關閉腦膜炎球菌B莢膜多醣合成作用之突變法。因此，生產大疱之菌株可經過基因工程處理，使之永久向下調節下列一種或多種基因之功能性基因產物之表現：ctrA、 ctrB、ctrC、ctrD、synA (相當於 synx與 siaA)、synB(相當 86952 -14 - 1360424 於㈣）或synC(相當於⑽）基因，較佳為關閉基因，最佳為刪除基因之所有或部份發動子與/或開放讀碼框。LgtE. 哭變法可與此等突變法中—種或多種方法組合，較佳為由 IgtB.突變法與其中—種或多種突變法組合。因^卜本發明另一万面為如上述衍生自此等腦膜炎球菌B之組合突變菌株之大疱免疫原性製劑。該菌株本身亦為本發明另—方面。含有不同lgt基因（包括lgtB與lgtE)之奈瑟氏球菌位置及其序列係相關技藝已知（參見M· p Jennings d ^ MicroMology 1999, 145,3013-3021與其中摘錄之參考文獻，與 J. Exp. Med. 180 : 2181-2190 [1994])。知、..；產物中使用全長度（未截短）L〇s時，LOS不可經唾液基化（因為需要這種LOS產生免疫反應以對抗最危險之侵入性腦膜炎球菌B菌株亦未唾液基化）。此時所採用之荚膜陰性菌株宜刪除synA(相當於synX與siaA)、synB(相當於siaB) 或synC(相當於sia〇基因，因為這種突變亦使menB L〇s無法唾液基化。 LOS之基性上述本發明純化之LOS或大疱免疫原性組合物亦可經由向下調節其衍生來源之細菌生產菌株中某些基因之表現，而降低毒性。雖然此等去毒性法並非天然〇MV之鼻内接種法所必要之作法（J.J. Drabick et al，疫苗（2〇〇〇)，18, 160-172)，

但用於非經腸式疫苗接種時’仍宜去除毒性。本發明L 〇 s 純化之LOS或大疮免疫原性組合物之較佳去毒性法為由奈瑟氏球菌生產菌株進行基因工程處理，其係由涉及脂質A 86952 -15- 1360424

生合成之基因進行突變/改造/去活性，特別指由彼等涉及添加二級醯基鏈至脂質A上之基因，特定言之向下調節msbB 與/或htrB基因之功能性基因產物之表現，較佳為關閉基因，最佳為刪除基因之所有或部份發動子與/或開放讀碼框。或者（或另外）純化之LOS或大疱免疫原性組合物可衍生自已經過基因改造以致向上調節下列一種或多種基因之奈瑟氏球菌菌株（經由引進較強力之發動子或整合另一套複製基因）·· pmr A、pmrB、pmrE與pmrF。或者（或另外），純化之LOS或大疱免疫原性組合物可經由添加多黏菌素B之無毒性肽功能性同等物[係一種對脂質A具有高親和性之分子]至組合物中而去除毒性。

.參見WO 01/09350更詳細說明上述去毒性法，及相關之發動子/基因序列及向上調節與向下調節方法。奈瑟氏球菌之 msbB與htrB基因亦分別稱為lpxLl與lpxL2(參見WO 00/2 63 84)，此等基因之刪除突變法之表型特徵在於msbB· 突變株LOS相對於野生型喪失一個二級醯基鏈（並保留4個一級與1個二級醯基鏈），htrB—突變株L0S則喪失兩個二級醯基鏈。這種突變最好與可確定生產缺乏莢膜多醣之菌株 (如上述）之突變法組合，以確保大疱上最適當地出現去毒性之L0S，或有助於純化去毒性之次單位L0S。參見W0 93/14115 ' W0 95/03327 ' Velucchi et al (1997)J Endotoxin Res 4 : 1-12與EP 976402，供進一步詳細說明可用於本發明組合物之多黏菌素B之無毒性肽功能性同等物-特別使用肽 SAEP 2 (序列KTKCKFLKKC，其中2個半胱胺酸形成二硫化 86952 -16- 1360424 物橋鍵）。 ”向下調節功能性基因產物之表現，，咅發動子或開放讀碼框上進_力、^4在所指定基因之基因產物之生合成活性(降低60、7。、8。、90、9二: 二：:然可以引進移碼突變或取代較弱之發動子，然而取佳（作法為删除大部刀4所有開放讀碼框與/或子’以確保水久向下調節（活性）基因產物（說明於WO 01/09350)。 t發明另Γ.方面包括可料本發明之L〇s或域免疫原 t述基因改造《奈瑟氏球菌(較佳為腦膜炎球菌或淋病球菌或腦膜炎球菌B)菌株。主·發明之LOS或含LOS夕七癌製劍本發明另一方面為自本發明奈瑟氏球菌菌株中單離LOS 製劑（特定言之彼等如上者）。較佳者，單離之⑽（或含⑽ 〈大范）為L2或L3免疫型，且較佳為本發明免疫原性組合物包含本發明L2與13 LOS(或大疱）兩種製劑。此等製劑亦可經由上述L〇s之寡醣部份（不論純化與否或是否含在大疱製劑中）與包含τ_細胞抗原決定基來源之載劑共軛而改良（因此可使1^03成為甚至更佳之[依賴τ細胞] 免疫原）。本發明之純化之L0S製劑或者（或另外）可經由形成相關技藝已知之微脂粒調配物而成為更佳抗原（參見例如：WO 96/40063及其中摘綠之參考文獻）。自細菌中單離LOS之方法係相關技藝已知（參見例如： Wesphal與 jann之熱水-苯酚法㈦灿 Carb0. Chem.1965, 86952 17 1360424 5:83-91])。亦參見0狂1&11〇3 61&1.1969，£11]：】61〇。1^1119: 245-249,與 Wu et al. 1987, Anal Bio Chem 160 : 281-289。由單離之LOS進行共軛之技術亦係已知者（參見例如：EP 941 738，其揭示内容已以引用之方式併入本文中）。

本發明之目的中，”包含T-細胞抗原決定基來源之載劑" 一詞通常意指一種肽，較佳為多肽或蛋白質。共軛技術係相關技藝已知。典型載劑包括來自非典型流感嗜血菌（H. influenzae)、破傷風類毒素、白喉類毒素與CRM 1 97之蛋白質D。

本發明較佳之單離之LOS組合物為：包含L2與L3單離之 LOS之組合物，其中各LOS之寡醣部份可視需要與包含T-細胞抗原決定基來源之載劑共軛；包含LOS之組合物，其結構符合其自lgtB·腦膜炎球菌菌株衍生之結構，其中各 LOS之寡醣部份可視需要與包含T-細胞抗原決定基來源之載劑共軛；及最佳者為包含L2與L3單離之LOS之組合物，其結構符合其自lgtB·腦膜炎球菌菌株衍生之結構，其中各 LOS之寡醣部份可視需要與包含T-細胞抗原決定基來源之載劑共輛。較佳為本發明LOS組合物已經去除毒性。其作法為採用已知之醯肼或鹼水解化學處理技術，脫除分子之醯基鏈（但可能降低分子之保護效力），但較佳作法為自htrB —或msbB_ 腦膜炎球菌突變株（如上述；特定言之無莢膜多醣菌株）中單離出LOS，或添加多黏菌素B之無毒性肽功能性同等物[係一種對脂質A具有高親和性之分子]至組合物中，特定言之 86952 -18 - 1360424 S ΑΕΡ 2 (如上述）。本發明之LOS可呈單離狀態投與（若脂質a部份體仍完整時，通常呈膠束型式投與）’或可呈微脂粒型式投與。此時，可添加外膜蛋白質至微脂粒中，L〇S可於微脂粒内與此等外膜蛋白質共軛’使寡醣成為依賴T之抗原。其作法為採用類似下文所說明大癌内LOS交聯法之化學技術。 LOS之寡醣部份與大疱表面上所存左外膜|白皙夕士治内交聯（共軛、法若LOS(特定言之本發明之L0S)呈大疱調配物時，L〇s最好於原位進行共輛，其方法應使L〇s與亦存在於大疱製劑上之一種或多種外膜蛋白質（例如：腦膜炎球菌之p〇rA或 PorB)共輛。此方法有利於加強大疱調配物中L 〇 S抗原之安定性與/或免疫原性（形成T-細胞助手）與/或抗原性_因而產生最高保護性構型之不依賴T細胞之寡醣免疫原之丁_細胞助手_因為 LOS之天然環境出現在腦膜炎球菌外膜表面上。此外，大疱中LOS之共軛作用會造成l〇S去除毒性（脂質A部份安定地包埋在外膜中，因此較不容易引起毒性）。因此，可能不需要使自htrB_或msbB_突變株中單離之大疱進行上述之去毒性法或添加多黏菌素B之無毒性肽功能性同等物至組合物中（但為了進一步確定，亦可組合增加）❶因此，本發明者發現，包含大疱之組合物中，若大疱中之L〇s已以大疱内万式與亦存在於大疱中之外膜蛋白質共軛時，此組合物可形成疫苗之基礎，供治療或預防由可衍生該大疱之生物體 86952 -19- 1360424 所引起之疾病，其中此等疫苗實質上無毒，且可能誘發依賴T細胞之殺細菌反應，對抗天然環境中之LOS。因此，本發明進一步提供此等大疱内LOS共軛大疱製劑。該大疱最好衍生自可產生該大疱之任何格蘭陰性生物體（參見 WO 01/09350)，較佳為莫拉氏菌（Moraxella catarrhalis)、非典型流感唁血菌（n〇n-typeable Haemophilus influenzae) 或奈瑟氏球菌（最佳為腦膜炎球菌）。此等大疱製劑可自指定之細菌中單離（參見WO 01/0935 0)，然後依已知之共軛化學法，使LOS之寡醣部份上之基團（例如：NH2或COOH)與大疱外膜蛋白質上之基團 (例如：NH2或COOH)連接。可採用利用戊二醛、曱醛或戊二醛/甲醛混合物進行交聯技術，但最好採用選擇性較高之化學劑，如：EDAC或EDAC/NHS (J_V· Staros,R.W. Wright and D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986);與 Bioconjugsates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) ppl73-176)。其他可用於在LOS與蛋白質分子之間形成共價鏈結之共軛化學或處理法說明於EP 941738中。較佳為使大疱製劑於沒有莢膜多醣下共軛。大疱可自不會產生莢膜多醣之菌株（天然或經過突變）中單離出，或可自大部份（較佳為所有）污染之莢膜多醣中純化。以此方式進行大疱内LOS共軛反應之效率高得多。較佳為使大癌中超過5、10、20、30、40、50、60、70、 86952 -20- 1360424 80、90、95%之LOS已交聯/共輛。若大疱内共軛之大疱衍生物自腦膜炎球菌時，該衍生來源菌株最好為無法產生莢膜多醣之突變菌株（例如：上述一種突變菌株，特定言之si aD — )。亦最好使可有效對抗腦膜炎球菌疾病之免疫原性组合物同時包含L2與L3兩種大疱，其中L2與L3 L0S均與大疱外膜蛋白質共輛。此外，大疱内共軛之大疱中LOS結構最好與自lgtB·腦膜炎球菌菌株衍生之結構一致。最佳免疫原性組合物包含大癌内-共軛之大癌：衍生自無法產生荚膜多醣且為lgtB —之突變株腦膜炎球菌菌株；包含衍生自無法產生莢膜多醣之突變株腦膜炎球菌菌株之L2與L3大癌；包含衍生自lgtB —之突變株腦膜炎球菌菌株之L2與L3大疱；或最佳為包含衍生自無法產生莢膜多醣且為lgtB_之突變株腦膜炎球菌菌株之L2與L3大癌。本發明可使用之典型L3腦膜炎球菌菌株為H44/76 menB 菌株。典型之L2菌株為B16B6 menB菌株或39E腦膜炎球菌C 型菌株或菌株760676。如上述，本發明之大疱可經由共輛作用去除毒性至某一程度，並不需要再進行任何去毒性作用，然而，可再進行去毒性法以進一步確保其安全性，例如：使用衍生自htrB — 或msbB-腦膜炎球菌菌株之大疱，或添加多黏菌素B之無毒性肽功能性同等物[係一種對脂質A具有高親和性之分子](較佳為SAEP2)至大疱組合物中（如上述）。L0S之共軛作用（尤其以大疱内方式）因而使L0S相較於包含等量未共軛之L0S之製劑具有具有令人驚訝之較低毒姓。因此進一步 86952 -21 - 1360424 提供去除大疱毒性之方法，其係採用！^〇3與大疱外膜蛋白質之大癌内共軛作用。上述方法t ’提出腦膜炎球菌大癌與包含該大疱之免疫原性組合物’其具有作為重要抗原之L〇s，實質上沒有毒性、沒有免疫安全問題，具有依賴τ細胞之特性，存在於其天然環境中，且可以針對90%以上之腦膜炎球菌菌株（當使用L2 + L3組合物時）誘發殺細菌性抗體反應。一種或多種MenA、C、丫或貿莢膜多醣或寡醣（較佳為至少MenC、或MenA與MenC、或MenC與MenY)亦可與本發明大疱（外膜蛋白質共軛。雖然其可與L〇s交聯作用於相同反應中進行，但最好於另外分開之反應進行。最適當之大疱内LOS共軛法為本發明另一方面。大疱内共軛法應包括1、2或所有3個下列步驟：共軛法之 ?11應超過1)1^7.0，較佳為超過或等於{)1175(最佳為1)119以下）；反應期間應保持約^5%蔗糖之條件，較佳為2_4%，最佳為約3% ;共軛反應中之NaC1應儘量降低，較佳為低於 0-1M、0.05M、〇·〇1Μ、〇.〇〇5M、0.001M，最佳為完全沒有。所有此等製法之特色為確保共輛過程中之大癌保持安定且呈溶液狀。 ED AC/NHS共軛法為較佳之大疱内共軛法。edac/nhs 優於甲酸之處在於後者造成之交聯程度太高，以致負面影響可過濾性。EDAC會與羧酸反應，形成活性酯中間物。當含有胺親核物時，形成醯胺鍵，同時釋出異肋副產物。然而，EDAC-媒介之反應效率可能因形成磺基-NHS酯中間物 86952 -22- 1360424 而提高。磺基-NHS酯在水溶液中之存留時間比EDAC單獨與羧酸酯反應所形成之活性酯之存留時間長。因此，採用此兩步驟方法可形成較高收量之醯胺键。EDAC/NHS共輛法說明於 J.V· Staros，R.W. Wright and D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156： 220-222 (1986)；及 Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) ppl73-176。最好在反應中使用0.01-5 mg EDAC/mg大疱，較佳為0.05-1 mg EDAC/mg大疱。EDAC之用量依樣本中LOS 含量而定，後者則依用於萃取大疱之DOC%而定。％DOC低時，則使用高量EDAC (1 mg/mg及以上），然而在較高％DOC 下，則使用較低量EDAC (0.05-0.1 mg/mg)，以避免太多大疱之間交聯。因此本發明較佳方法為一種製造大疱内共輛之LOS(較佳為腦膜炎球菌）之方法，其包括之步驟為在EDAC/NHS之存在下，於pH 7.0至pH 9.0之間（較佳為約pH 7.5)，於1-5%(較佳為約3%)蔗糖下，可視需要於實質上不含NaCl之條件下 (如上述），使大癌進行共輛，並自反應混合物中單離共輛之大癌。繼該反應後，由該反應混合物使用抗-LOS (例如：抗-L2 或抗-L3)mAbs進行西方凝膠分離法，以顯示大苑中較大比例之LOS之分子量隨反應時間提高。採用此技術可回收9 9 %大癌。

已發現EDAC為一種優越之大癌内交聯劑，因為其使L0S 86952 -23 - 1360424 與〇MP充分交聯，以改善LOS依賴T細胞之免疫原性，但不會達到造成如過濾性差、凝集及發生大疱之間交聯等問題之高度交聯程度。大疱所產量之形態類似未共軛之大疱。此外’上述方法避免發生過高之交聯程度（此點可能降低天然存在於大疱表面上之保護性〇MPs，例如：TbpA或Hsf之免疫原性）。單離大病,之枯偷外膜囊胞（OMVs或大疱）可採用已知技術單離（Fredriksen et al, NIPH Annals (1991), 14, 67-79 ； Zollinger et al, J. Clin Invest (1979), 63, 836-848 ； Saunders et al. Infect Immun (1999), 67, 113-119 ； J.J.Drabick et al. Vaccine (1999), 18, 160-172)。其分成兩大類_使用去氧膽酸鹽（約〇.5%)在腦膜炎球菌中萃取大疱之技術，及使用低量去氧膽酸鹽（D〇c) 或完全不使用去氧膽酸鹽之技術。無DOC法製成之大癌之有利特色為在OMV中保持咼量LOS-此點有利於以l〇s為保護性抗原之疫苗。相較於使用DOC萃取之大疱，採用無D〇c 法製得之OMV中L3 Ags濃度高出約1〇倍。基於此理由，以無清潔劑（較佳為無DOC)之方法製備大疱之方法較適於本發明方法之目的，但以含低量清潔劑（較佳為D〇c)進行之萃取法亦有利，因為此步驟將會在大疱中留下緊密交互作用炙LOS，同去除任何毒性較高但鬆散結合之L〇s。典型地採用〇-〇.5%清潔劑（較佳為DOC)萃取大疱，較佳為〇·〇2-0·4%、0.04_3% 或〇〇6_2% 清潔劑，更佳為〇.〇δ_〇 j% , 取佳為約0·1%或整，以使最適量之LOS安定存留在大 86952 -24- 1360424 癌中。無DOC(或低DOC)萃取法特別佳，其中LOS已經由上述詳細說明之一種或多種方法去除毒性。疫苗組厶物本發明免疫原性組合物很容易經由添加醫藥上可接受之賦形劑調配成疫苗組合物。本發明尚提供一種製備本發明奈瑟氏球菌（較佳為腦膜炎球菌）免疫原性組合物或疫苗之方法，其包括之步驟為依上述單離、純化本發明之LOS(較佳為L2或L3)或依上述產生本發明之單離大癌（較佳為L2或L3免疫型），並使用醫藥上可接受之賦形劑調配LOS或大疱。較佳為由本發明免疫型 L2與L3之純化LOS ’或本發明免疫型L2與L3之大疱，或L2 灸純化LOS與L3之大疱（或反之亦然）於混合步驟中組合。較佳為由本發明之純化LOS或大疱於單離後’依上述進行共軛。純化之LOS亦可增加另一個調配微脂粒之步驟（採用相關技藝已知之技術-參見例如：w〇 96/4〇〇63及其中摘錄之參考文獻）。較佳之大疱製劑係利用低濃度（或無濃度）DOC(如上述）單離者。此等L2與L3組合法可產生有效對抗幾乎所有腦膜炎球菌 B菌株之疫苗。上述免疫原性組合物（或方法）可添加一種或多種（2、3或4 種）選自血清型A、C、Y或W之腦膜炎球菌多醣或寡醣（可未共軛或已與包含T-細胞抗原決定基之載劑共軛，如上述）至組合物中。較佳為至少添加c型（以共軛最佳），更佳為八與C 或Y與C(較佳為均共輛）及最佳為A、c、丫與…(較佳為均共 86952 -25- 1360424 幸尼）°上述組合物中宜亦包括共輛之流感嗜血菌B莢膜多醋或寡酶，以產生通用之腦膜炎疫苗。較佳者’包括WO 94/08021中明確說明之組合物或由此組合物組成之組合物並非本發明之申請專利範圍。塑之癌苗調配物本發明免疫原性組合物可使用合適輔劑調配，以產生本發明疫苗組合物。合適辅劑包括鋁鹽，如：氫氧化鋁凝膠（明礬）或磷酸鋁（較佳為氫氧化鋁），但亦可使用鈣之鹽類（特定言之碳酸約）、鐵或鋅’或亦可使用醯基化酪胺酸之不可溶懸浮液，或醯基化糖類、陽離子性或陰離子性衍化之多酷或聚磷腈。適合添加之Th 1輔劑系統包括單磷醯基脂質a，特定言之去氧-醯基化單磷醯基脂質a(或其他無毒性之LPS衍生物）’及單鱗醯基脂質A ’較佳為3 -去氧-gi基化單磷醯基脂質A (3D-MPL)[或無毒性LPS衍生物]與鋁鹽（較佳為磷酸銘）之组合。加強之系統涉及單磷醯基脂質A與皂角苷衍生物之組合，特定言之QS21 [或其他息角苷]與3D-MPL[或無毒性LPS衍生物](揭示於w〇 94/00153中）之組合，或反應性較低之組合物，其中QS21[或皂角苷]依WO 96/33739所揭示之方法’使用膽固醇淬息反應。一種涉及含qS2i、3D-MPL 與生百驗之水包油性乳液之特別有效輔劑調配物說明於 WO 95/1 721 0中’且為可添加之較佳調配物。其他可添加之辅劑包括琶角苷’更佳為QS21與/或水包油性乳液及生育酚。亦可添加含未甲基化CpG之寡核苷酸（WO 96/02555)。 86952 -26- 1360424 疫苗製劑一般說明於"疫苗設計"(Vaccine Design) —書中 ("The subunit and adjuvant approach"(編輯 p〇well M.F. & Newman M.J·) (1995) Plenum Press New York)。疫苗之免疫保護劑量可經由全身或黏膜途徑投與。此等投藥法包括經由肌内、腹膜内、皮内或皮下等途徑之注射法；或經由黏膜投藥至口 /消化道（較佳為鼻内投藥法）、呼吸道、生殖泌尿道。各疫苗劑量中典型之大癌含量選擇在可誘發免疫保護性反應且沒有典型疫苗中所出現之顯著不良副作用之用量。此等用量將依所採用之明確免疫原及其所呈現之方式而定。通常希望各劑量中各大癌含量為1-1 00 Bg ’較佳為5-50 pg，最典型在5-25 Kg之範圍内。本發明大病，免疫原性組合物之進一步改良法

若衍生上述本發明大疱組合物之奈瑟氏球菌菌株（包括淋病球菌，較佳為腦膜炎球菌，最佳為腦膜炎奈瑟氏球菌 B)具有下列一種或多種基因（編碼保護性抗原），經由嵌插其他基因之複製本至基因組中，或引進現存基因上游之較強發動子，或依WO 01/09350中所討論之任何其他方式向上調節，可誘發改造菌株之抗原製造量達未改造菌株之1.2、 1.5、2、3、5或 10倍時：NspA (W〇 96/29412)、Hsf或其截短體（WO 99/31132 & WO 01/55182 ;亦稱為 NhhA)、 Hap(PCT/EP99/02766) 、OMP85 (WO 00/23595) 、PilQ (PCT/EP99/03603)、PldA (PCT/EP99/06718)、FrpB (WO 96/31618)、TbpA (WO 92/03467、US 5912336、WO 93/06861 與 EP586266)、TbpB(WO 93/06861 與EP586266)、NadA (Comanducci 1360424 et al J. Exp. Med. 2002 195 ; 1445-1454)、FrpA/FrpC或此等抗原之間涉及5個或更多個重覆序列之共通部份（WO 92/01460 ; Thompson et al.，（1993)J. Bacteriol. 175 : 811-818 ;

Thompson et al., (1993)Meet. Immun.. 61 : 2906-2911)、 LbpA ' LbpB(PCT/EP98/05117)、FhaB (WO 98/02547 SEQ ID NO 38 [核苷酸 3083-9025])、HasR (PCT/EP99/05989)、lipo02 (PCT/EP99/08315)、Tbp2 (WO 99/57280)、MltA (WO 99/57280)、TspA (WO 00/03003)、TspB (WO 00/03003)與 ctrA (PCT/EPOO/00 13 5)，上述本發明大疱組合物可進一步改善本發明疫苗之效力。若本文中述及Hsf時，該名詞可於各例中替代Hsf截短體-特定言之彼等揭示於WO 01/5 5 182中者。特別佳之作法為同時向上調節Hsf與TbpA(低或高分子量型，或低分子量型與高分子量型[EP 586266])，或Hsf與 OMP85，或OMP85與TbpA(低或南分子量型，或低分子量型與高分子量型），或NspA與Hsf，或NspA與OMP85，或NspA 與Tbp A((低或高分予量型，或低分子量型與高分子量型）兩者。若2種大疱均涵括在組合物中時，各大癌最好具有不同之向上調節作用。若Tbp A高與低分子量型均向上調節時，最好在分別存在於由兩種天然包含2種Tbp A型之菌株衍生之組合物中向上調節。最佳者’ 2種菌株具有L2與L3 LOS 免疫型。TbpA可經基因工程處理而向上調節或由生產奈瑟氏球菌/腦膜炎球菌之菌株於限制鐵之條件下生長，例如：於50-70 μΜ Desferal(去鐵胺甲磺酸鹽，來自sigma藥廠）之存在下生長。若採用後項方法時，最好向下調節FrpB基因 86952 -28- 1360424 表現（較佳為刪除），因為這種可變抗原可能在於限制鐵之條件下所單離之腦膜炎球菌菌株中單離之大癌中轉呈免疫顯性。

較佳具體實施例中，本發明組合物包含來自lgtB—莢膜多醣_msbB_之L3大疱（最好向上調節TbpA高分子量型與Hsf) 及來自lgtB-莢膜多—msbB —之L2大癌（最好向上調節TbpA 低分子量型與0mp85)。更佳為兩種大疱均再向下調節PorA 與/或FrpB表現，及可視需要向下調節OpC與/或OpA表現。大疱最好經由上述低DOC法單離，且兩種大疱中之LOS均與外膜蛋白質進行大癌内交聯。空殼或已殺死之完整細胞疫苗

本發明者提出上述相關大疱之組合物與疫苗很容易延伸至有關空殼或已殺死之完整細胞製劑與疫苗（具有相同優點）。由格蘭陰性菌株製備空殼製劑（具有完整外套之空細胞）之方法係相關技藝已知（參見例如：WO 92/01791)。殺低完整細胞以製備用於疫苗之去活性細胞製劑之方法亦已知者。因此，涉及本文獻所述大疱之組合物與疫苗可應用於包含本發明同等空殼與已殺死之完整細胞製劑之相同組合物或疫苗。血清殺細菌分析法血清殺細菌分析法係分析抗原之間於本發明免疫原性組合物中組合時之增效關係。此等增效反應特徵為由抗原之組合所謗發S B A高於各抗原分開使用時所誘發SBA之至少50%、2倍、3倍，較佳為4 86952 -29- 1360424 倍、5倍、6倍' 7倍、8倍、9倍及最佳為10倍。較佳為對抗何生該抗原之同源性菌株來測定SBa，最好亦對抗一組異源性菌株（代表性菌株群為例如下列：屬於A_4群之 BZ10(B : 2b : P1.2);屬於 ET_37複合物之 b16B6 (B : 2a : P1.2);與 H44/76 (B : 15 : P1.7，16))。SBA為可用於預估腦 &炎球菌疫苗效力之最受到認同之免疫標記物（perkms et al_ •Unfect Dis· 1998, 177 : 083-691)。可採用任何已知方法確涊令人滿意之SBA ^可使用得自動物模式或人體之血清進行SBA。使用人類血清進行SBA之較佳方法如下：在第一次接種疋則、第二次接種後2個月及第三次接種後i個月取血樣（一年内接種疫苗3次為典型之人類初次接種疫苗程序，例如：於第0、2及4個月時，或於第〇、丨與6個月時）。此等人類初次接種疫苗計畫可施用於丨歲以下嬰兒（例如：與接種Hib同時進仃）或亦可在2-4歲大時或***時，依此初次接種疫苗計畫接種試驗脱。若可行時，可進_步於初次接種❹至 12個月及追加接種後1個月時取血樣。右第三次接種後1個月（依初次免疫接種計畫）(2_4歲大或 ***，但以一歲以内嬰兒較佳），受試者對抗衍生本發明抗原H炎球菌菌株之SBA(抗體稀釋液）效價（相較於接種前效價）提高4倍之人數百分比超過3〇%，較佳為超過 4〇%，更佳為超過5〇%，最佳為超過6Q%時，則具有同源性殺細菌活性之抗原或太疱製劑具有令人滿意之s B A。具有異源性殺細菌活性之抗原或大翁劑若亦可舒斜其 86952 -30- 1360424 腦膜炎球菌菌株衍生來源亦誘發令人滿意之sba時，當然亦可用於形成具有同源性殺細菌活性之大癌製劑。若第二次接種後1個月（依初次免疫接種計畫）（2_4歲大或 ***，但以一歲以内嬰兒較佳），受試者對抗三種腦膜炎球菌異源性菌株之SBA(抗體稀釋液）效價（相較於接種前效價）提高4倍之人數百分比超過2〇%，較佳為超過3〇%，更佳為超過35%’最佳為超過40%時，則具有異源性殺細菌活性之抗原或大疱製劑具有令人滿意之SBA。此等試驗為指示該具有異源性殺細菌活性之抗原或大疱製劑是否可針對多種腦膜炎球菌菌株誘發交叉殺細菌抗體之良好指標。這三種異源性菌株最好應具有相異電泳型（ET)_複合物或多位置序列型（MLST)圖形（參見 Maiden et al. PNAS USA 1998, 95 : 3 140-5)，且最好不同於製備或衍生該具有異源性殺細菌活性之抗原或大疱製劑之菌株。習此相關技藝之人士咸了解如何決定三種具有不同ET-複合物之菌株，其可反映腦膜炎球菌之間之遺傳差異，特定言之腦膜炎球菌]3型菌株之間之差異可因引起顯著疾病負擔而辨識及/或代表已辨識之MenB過高毒性細胞系（參見如上述Maiden等人之文獻）。例如：可使用下列三種菌株：屬於A-4群之BZ1 0(B : 2b : P1.2);屬於ET-3 7複合物之 B16B6 (B : 2a : P1.2);與屬於 ET-5複合物之H44/76(B : 15 : P1 ·7，16) ’或任何其他屬於相同ET7群落之菌株。此等菌株可用於測試例如：由屬於ΕΤ_5 複合物之腦膜炎球菌菌株CU385 (Β : 4 : Ρ1.15)製備或衍生之具有異源性殺細菌活性之抗原或大疱製劑。另—種可使 86952 -31 - 1360424 用之菌株樣本來自細胞系3流行性純系（例如：NZ124[B : 4 : P 1.7,4])。另一種ET-37 菌株為 NGP165 (B : 2a : pi2)。測定SBA活性之方法係相關技藝已知。例如：可採用之一種方法說明於WO 99/09176之實例i〇c。—般而言，取試驗菌株培養物生長（最好於消耗鐵之條件下_添加鐵螯合物如：EDDA至生長培養基中）至對數生長期。培養物可懸浮於含BSA之培養基中（如：含〇_3%BSA之漢克氏培養基 (Hanks medium))，以得到經調整至約2〇〇〇〇 CFU/ml之操作細胞懸浮液。一系列反應混合物之製法為混合一系列試驗血清之兩倍稀釋液（最好於56。(：下加熱30分鐘去除活性）[例如：體積50 μΐ/孔]與20000 CFU/mUi膜炎球菌試驗菌株懸浮液[例如：體積25 μΐ/孔]。反應瓶應振盪（例如：21〇 rpm 下）培養（例如.37 C 15分鐘）。最終反應混合物[例如：丨〇〇卜丄體積]另含有補體源[如：預備試驗之幼兔血清體積或人類血清學用人類血清終體積之25%]，依上述培養[例如：37。〇下 60分鐘]。此分析法可使用無菌聚苯乙埽u型底“孔微滴定板。使用多管式定量吸管，自各孔中取一小份[例如：1〇叫滴加至MUeller-Hinton洋菜盤中（較佳為包含1%Is〇vitalex與 1 %經加熱去活性之馬血清），並培養（例如：於3rc及5%c〇2 下培養18小時）。較佳為每份可計數達8〇 CFU之個別群落。可使用下列三種試驗樣本作為對照組：缓衝液+細菌+補 ,緩衝液+細菌+去活性之補體；血清+細菌+去活性之補 to SBA效饧可採用程式直接計算，其係處理數據，由迴歸計算法得到相當於5〇%細胞殺死率之稀釋度。 86952 -32- 1360424 本專利說明書所摘錄之所有參考文獻或專利申請案已以引用之方式併入本文中。實例下列實例採用標準技術進行，其係習此相關技藝之人士習知之例行技術，除非另有詳細說明。實例係供說明用，並未限制本發明。實例1 :

說明涉及腦膜炎球菌B生產B莢膜多醣之蛋白質之編碼基因之刪除法，PorA基因之刪除法，腦膜炎球菌大疱表面上多種保護性外膜蛋白質之向上調節法，免疫顯性蛋白質或生合成酵素之向下調節法，及大癌之單離法等之實例說於 WO 01/09350。實例2 : LOS : —種關鍵***叉保#性抗原

為了分析LOS作為潛在交叉保護性抗原之角色，使用 H44/76野生型（WT)腦膜炎球菌B菌株（表現L3 LOS)與表現” 似galE— LOS"之改造H44/76菌株（相較於lgtE· LOS呈短結構），根據兩種不同方法產生大疱。第一種方法使用0.1% DOC，以使大疱中含有高量LOS，第二種使用0.5%DOC，使所得大疱中含低量LOS。使小白鼠經肌内途徑接受3次注射（於第0、2 1與28天），每劑含有5 pg吸附在Al3 +鹽（磷酸鋁）上之大疱與3D-MPL。第三次注射後14天，取血樣。於收集之血清上，使用純化之L3 LOS進行抗-L3 L0S ELISA。圖3A清楚顯示0.1 %DOC法所產生之大疱可誘發小 86952 -33 - 1360424 白鼠抗-LOS反應。結果證實galE_ LOS與L3 LOS可誘發產生抗體。另一方面，〇.5%DOC萃取出太多LOS，以致無法在大症疫苗中作為關键性抗原。血清殺纟田菌分析法使用下列不同NmenB菌株為個別血清進行SBA :同源性 WT H44/76菌株、PorA(-)H44/76菌株、及兩種異源性菌株（以血清亞型為主）Cu385與NZ124。這四種菌株表現L3 L0S。添加第五種菌株。相較於H44/76，此菌株（B16B6)對PorA及 LOS而言均為異源性（其係免疫型L2菌株）。圖3B之結果顯示僅對抗L3菌株之交叉殺細菌反應，但僅可使用 DOC 0.1%WT 大疱。DOC 0.1% galE-大疱與 DOC 0.5% WT大疱之處理沒有觀察到交叉殺細菌反應。此外，已知因PorA抗體引起之殺細菌反應會隨血清型而異。亦在此實驗中使用D0C 0.5重量％大疱或galE·大疱，及使用 PorA(-)H44/76菌株之SBA數據觀察到此結果。所有此等結果均顯示，由含高百分比L3 LOS之大疱誘發之交叉殺細菌反應係歸因於針對LOS抗原直接產生Abs。僅有L3 L0S(並非galE— LOS)可誘發產生殺細菌抗體。雖然ELISA中，使用DOC 0.1% galE·大疱可觀察到良好之抗 -LOS反應，但此反應與生物性無關（無SBA) 〇此外，該反應似乎為專一性LOS免疫型，因為抗-L3 LOS Abs僅殺死L3菌株，但不殺L2菌株，此表示最適當之疫苗理想上應包含L3與L2 LOS，以達到最適當之涵蓋範圍。耗損實驗 86952 -34- 1360424 為了證實WT DOC 0.1%大疱所誘發之反應主要歸因於抗 -LOS抗體，使用不同濃度之純化L3 LOS在所收集之血清中進行耗損處理。耗損後，於殺細菌分析法中使用血清對抗同源性WT H44/76菌株。

使用血清對抗DOC 0.1%WT大疱所得結果（見圖3C)顯示清楚之劑量範圍抑制作用，此證實此製劑所誘發之大部份抗體均針對103(符合使用？(^八（-阳44/76菌株產生之86八結果）。反之，由WT DOC 0.5%誘發之反應經使用 PorA(-)H44/76菌株進行之SBA及由LOS耗損實驗顯示，並非針對LOS。 L2 LOS亦得到類似結果。實例3 :徒用L3輿中間物無DOC大疱（非去喜性之 LOS)誘發交又殺細菌抗體之實驗

所使用之MC58腦膜炎球菌衍生物菌株為B : P1.7.16， opcf，siaD—。此菌株經基因改造後，表現L3(菌株2G2)或中間抗原決定基（菌株2G EcoNlb-1，如同2G2，但另加lgtB·) 或短型LPS(菌株C6，其係lgtE_)。根據一般高（0.5%)DOC法或無DOC法製造OMV。於第0、20及28天時，採用肌内途徑為小白鼠（每組10隻）免疫接種3次。其接受於Al(OH)3上調配之1或10μ§(蛋白質含量）大疱。於第28天（第II劑之後）與第42天（第III劑之後）抽血。. 使用收集之血清與同源性菌株（MC58與Η44/76)及兩種異源性菌株（Μ97250687與Μ9725078)，以幼兔血清作為外因 86952 -35- 1360424 性補體來源，進行殺細菌分析法。下表综合說明其結果（殺死50%時之殺細菌效價）：菌株與血清型抗原 :血樣 MC58 H44/76TT M97250687 M97252078 P1.7.16 P1.7.16 P1.19.15 P1.4 c6 no doc 10ug IM Post II >2560 >2560 >2560 98 c6 no doc 10ug IM Post III 1 353 >2560 >2560 90 c6 no doc 1 ug IM Post 11 247 620 247 <20 c6 no doc 1ug IM Post III 411 878 748 <20 2g2 no doc 10ug IM Post 11 >320 >2560 >2560 >2560 2g2 no doc 10ug IM Post ill >2560 >2560 >2560 1407 2g2 no doc 1ug IM Post II >2560 >2560 >2560 119 2g2 no doc 1ug IM .Post III >2560 >2560 >2560 348 2gecoN1b-1 no doc 10ug IM Post II >2560 >2560 >2560 1162 2gecoN1t>-1 no doc 10ug IM Post III >2560 >2560 >2560 1213 2gecoN1t>-1 no doc 1ug IM Post II 1 151 >2560 1 696 22 2gecoN1b-1 no doc 1ug IM Post III 2 220 >2560 .1 947 135 c6 doc 10ug IM Post II 308 248 341 <20 c6 doc 10ug IM Post lit 189 104 400 <20 c5 doc 1ug IM Post II 33 43 63 <20 c6 doc 1ug IM Post III NC (>20) 24 156 <20 2g2 doc 10ug IM Postil NC (>20) 25 360 <20 2g2 doc 10ug IM Post III 201 <20 647 <20 2g2 doc 1ug JM Post II 275 <20 299/644 <20 2g2 doc 1ug IM Post III 237 <20 728 <20 2gecoN1b-1 doc 10ug IM Post H 573 31 685 <20 2gecoN1b-1 doclOugIM Post III NC (>40) 21 1 140 <20 2gecoN1b-1 doclugIM Post II 261 NC 118 <20 2gecoN1b-1 doclugIM Post ill 348 NC 692 <20 L3(2g2)或中間（2geconlb-l)抗原決定基之存在顯然可誘發交叉殺細菌抗體，而來自截短之LPS菌株（C6)之大疱則誘發較低量之交叉殺細菌抗體。特別當注射1 pg OMV時。此外，當使用經DOC純化之OMV時，降低大疱之LPS含量可降低誘發交叉殺細菌抗體。除了提高LPS外，無DOC 之大疱亦可能有利地保留一些與OMV鬆散地交互反應之蛋白質，如：脂蛋白。實例4 : L3 LOS與外膜蛋白質之大疳内交聯作用所使用之MenB大疱係衍生自SiaD乂因此不表現莢膜多醣）與PorA·之H44/76菌株（LOS免疫型L3)。使用兩種不同菌株：完整L3 (菌株B1717，siad(-)PorA (-)完整L3)與截短之 -36- 86952 1360424 L3(菌株 B 1727，siad(-)PorA(-)lgtB(-)TrL3)。根據已知方法，使用EDAC/NHS共輛法，使大疱内LOS 與OMP進行交聯，以賦與LOS之寡醣成分成為依賴T細胞之抗原（EDAC/NHS優於甲醛，因為後者造成之交聯程度太高，以致負面影響可過濾性）。EDAC會與羧酸反應，形成活性酯中間物。當含有胺親核物時，形成醯胺键，同時釋出異肋副產物。然而，EDAC-媒介之反應效率可能因形成橫基-N H S自旨令間物而提高。續基-N H S醋在水溶液中之存留時間比EDAC單獨與羧酸酯反應所形成之活性酯之存留時間長。因此，採用此兩步驟方法可形成較高收量之醯胺鍵。 EDAC/NHS共軛法說明於 J.V. Staros，R.W. Wright and D· Μ_ Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156 : 220-222 (1986);及 Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996)ppl73-176。反應混合物為體積1 mL之3%蔗糖（供安定大疱）中包含 1.5 mg續基-NHS與5 mg EDAC。大癌之含量比為0·025 mg EDAC/mg大疱。大疱濃度為2 mg/ml，以0.1N HC1調至pH 7_5。於室溫下反應4小時，混合物相對於含3%蔗糖之pH 7.5， 2mM鱗酸鹽緩衝液透析。混合物經SterivexG10 0.22 pm過滤。回收9 9 %大疮。使用抗-L3 mAb進行西方墨點分局法追蹤反應。反應後低分子量LOS轉呈模糊，凝膠上出現一條較高分子量之新條 86952 -37- 1360424 帶。此較高分子量之條帶似乎為主要條帶，代表大多數共軛LOS已與PorB共價連接。已發現EDAC為一種極優秀之大疱内交聯劑，因為LOS將與OMP進行不可逆之交聯，足以改善L0S依賴T細胞之免疫原性，但其交聯程度不會造成如：過濾性不良、凝集與發生大疱之間交聯等問題。所產生之大疱外形類似未共輛之大疱（由電子顯微鏡觀察）。此外，上述方法避免發生過度交聯之問題（此點可能降低天然存在於大疱表面上保護性 OMPs，例如：TbpA之免疫原性）。實例5 : L3輿截短（中間物，lgtB_)L3可謗發產生可辨識截短 (中間物lgtB· ; TrL3)L3 LOS之殺細菌性Abs OMV(大癌）係由 MenB 菌株 H44/76 siaD_ PorA· L3 或 H44/76 siad_ porA· TrL3產生。進行兩種不同萃取法；所使用DOC之百分比為0.1或0.5%。亦分析兩種不同輔劑調配物：Al(OH)3或磷酸鋁+ 3D-MPL。，採用肌内途徑為小白鼠（OF1雌性小白鼠，6-8週大，每組30隻）注射3次（第0、20 及28天時）（每次注射5 pg大疱）。於第II劑之後（第28天）與第 III劑之後（第42天）之血清中收集SBA。以0.1 %D0C萃取之大疱所誘發血清之幾何平均效價及所收集血清殺死50%細胞時之效價高於使用0.5%DOC萃取時。其可能原因為前者大癌中LOS含量為後者之2·5倍。使用含完整L3 LOS或截短之L3 LOS之大疱所謗發血清之SBA 之間沒有顯著差異。若大癌增加J粦酸銘+ 3D-MPL作為輔劑時，其SB A比使用氫氧化鋁時提高。 86952 -38- 1360424

亦進行血清耗損實驗。使用1 mg/mL純化之L3或trL3 LOS 耗損血清，然後於此等已耗損之血清上進行SBA。結果顯示殺細菌之Abs(包含抗-L3抗體）幾乎完全被血清之trL3 LOS前處理耗損，殺細菌之Abs(包含抗-trL3抗體）幾乎完全被血清之L3 L0S前處理耗損。因此抗-L3殺細菌性Abs可與 trL3 L0S反應，且抗-trL3殺細菌性Abs可與L3 L0S反應。此外，可證實殺細菌性Abs對出現在L3及trL3 LOS兩者中之 LOS結構之專一性。結論為證實TrL3結構（OMVs中）可針對L3菌株誘發產生殺細菌性Abs。與耗損實驗組合時，發現TrL3與L3 LOS之結構在免疫學基礎上極為相近，可用於產生可殺死L3菌株之Ab。實例ό : TrL3解決完整L3結構潛在之自體免疫性問題

若L3與trL3結構在保護性抗體之免疫學上如此相近，則這兩種結果之間與L3(及L2)LOS有關之可能自體免疫問題 [透過乳醯基-N-新丁糖部份體]是否會有任何差異？吾等現在探討冷凝集素是否可辨識trL3 LOS來闡明此問題。已知 MAb 1B2-1B7 (J Bio Chem 256(1981)10967-10972 ; ATCC寄存編號TIB-189)可使成年人類紅血球（RBC)在低溫下凝集，並與LNnT(乳醯基-N-新丁糖）反應。其係一種典型之冷凝集素。下列實驗中使用此單株抗體與可殺死L3腦膜炎球菌菌株之MabL3.7.9單株抗體組合。以這兩種mAbs用於ELISA中，以預先塗覆聚-L-離胺酸之 86952 -39- 1360424 微分析板分析（1 pg/ml，37°C下2小時），然後塗覆純化之L3 或純化之TrL3 LOS(5 pg，於4°C下一夜）。分析板經BSA飽和（1%，於室溫下30分鐘）。然後以這兩種抗體分別進行標準 ELISA。結果（圖4)清楚顯示Mab L379會與L3及TrL3反應（圖 4B)，但1B2-1B7僅與L3 LOS反應（圖4A)。因此，吾等認為 TrL3不會被會與含LNnT四糖類結構（如：L3 LOS與人類紅血細胞）反應之冷凝集素辨識。因此，TrL3 LOS具有最適當之特性，亦即其長度夠長至足以保留保護性抗原決定基，但夠短至喪失可能引起人類自體免疫之抗原決定基。此點當然亦適用於本專利申請案所提出之截短之 L2(lgtB — )LOS結構。實例7 :交聯作用對B 1 820 DOC 0.1 %大疱之熱原性/抗原性之影響採用不同濃度之EDAC(EDAC含量愈多，進行交聯之大疱愈多），使大疱（來自菌株B 1820 ;其係衍生自H44/76，其中 siaD(-)PorA(-)FrpB(-)截短之Hsf向上調節，透過lbtB㈠突變菌株截短L3，於去鐵胺甲續酸鹽（desferral)之存在下培養，以DOC 0.1%萃取大疱）。大疱經過濾殺菌後顯示該交聯作用在大癌内。使用純化之Nmen L3 LOS作為標準物（Tsai, J. Biol.Standardization (1986)14: 25-33)，經 SDS-PAGE電泳分析法後，由銀染色測得大疱中LOS含量為1 8%。通常，使用 86952 -40- 1360424 0.1%DOC萃取法得到之大疱中LOS含量為約20%LOS，使用 0.2%DOC萃取法得到約15%LOS，使用0.3%DOC萃取法得到約10%LOS，及使用0.5%DOC萃取法得到約5%LOS。通常，包含10%或更多未共軛LOS之大疱即為無法接受之熱原。於兔子中之熱原性於依歐洲藥典所述進行之熱原性試驗中，測試兩種調配物（吸附在Al(OH)3或A1P04上之大疱），且兔子經由IV途徑接受 500 ng/kg。結果顯示（下表），大疱内交聯對大疱之熱原性有正面影響力。使用同一批大疱作為對照組或與不同濃度之EDAC交聯。進行交聯之大疱愈多時（愈多EDAC)，熱原性愈低。此結果亦出現在兩種不同調配物中。 ai(oh)3 調配物 Α1Ρ〇4 兩種調配物$ 處理未交聯 3.1* 2.8 5.9 EDAC 0.05£ 2.7 2.2 4.9 EDAC 0.2 1.7 1.7 3.4 EDAC 1 1.5 1.4 2.9 EDAC濃度：每毫克大疱之EDAC毫克量個體溫度（°C )上升總和（每組3隻兔子） 6隻兔子之總和（3隻來自Al(OH)3組，3隻來自A1P04組）交聯大疽之抗原性 86952 -41 - 1360424

分析上述大疱（未吸附）之抗原性，以決定交聯作用是否影響大疱之抗原性。取不同之大疱製劑（有交聯或未交聯）塗覆在微分析板上（10 pg/ml，於4°C下一夜）。經洗滌及飽和後，添加MAb L379或來自接受B1820 DOC 0.1或0.5%免疫接種之小白鼠之血清之一系列稀釋液至分析板中（於室溫下振盪30分鐘）。使用與生物素偶合之抗小白鼠Ig，然後使用抗生物鏈菌素-過氧化酶複合物後，使用OPD與H202顯露所塗覆之大疱上所固定之抗體。使用微分析板讀數器測定各微孔中密度。

結果顯示MAb L379(針對L3 LOS，但不會與TrL3 LOS (lgtB·突變株）反應，且對L3菌株具有殺細菌性）可辨識同樣未處理（未共軛）之B1 820大疱及不同之已交聯大疱（不受 EDAC之使用濃度影響）。參見圖5A。使用EDAC 0.2與1所得反應愈高時，可能反映大疱中LOS之固定性較佳，或至少已交聯之大疱中LOS在此等EDAC濃度下具有較佳安定性。亦使用小白鼠血清分析此等大疱之抗原性。使用兩種不同血清；第一種來自接受B1820 DOC0.5%大疱免疫接種之小白鼠（大疱之LOS含量低於或等於8%，主要誘發抗蛋白質抗體）。第二種血清得自接受B1 820 DOC 0.1 %大疱免疫接種之小白鼠（大疱之LOS含量大於或等於15%，主要針對LOS 誘發交叉殺細菌性Abs)。使用L379 MAb觀察時，由這兩種血清得到之結果（分別為圖5B與5C)並未顯示未處理（未共軛）大疱與交聯大疱之間有任何差異（不受EDAC之使用濃 86952 -42 - 1360424 度影響）。其結論為LOS之抗原性似乎不受交聯作用影響，且大疱之’'通用π抗原性亦不受EDAC處理影響。繼續進行小白鼠之

免疫原性實驗，以證實交聯作用（使用高濃度EDAC時）不會破壞關键性之保護性抗原之免疫原性。儘管如此，預備實驗結果（實例8)顯示，若D0C 0.5%萃取之大疱使用EDAC 0.05進行交聯作用時，此等大疱經過EDAC處理後之免疫原性提高。實例8 :交聯之大疳之免痘原性（EDAC 0.05 mg化學處理）此實驗中，自B 1 727菌株製造大疱。此菌株為基因改造之 H44/76菌株，係 siaD(-)PorA(-)trL3 (lgtB_)Hsf+TbpA向上調節）。使用〇.5%DOC萃取大疱。經由肌内途徑為小白鼠接種三次（第0、21與28天時）。每次注射均接受吸附在Al(OH)3 上之5 pg大疱。

於第三次注射後14天，抽取各個體之血清，針對H44/76 菌株進行血清殺細菌性分析法。結果顯示EDAC處理對反應者之數目（SBA效價>100之小白鼠數目）有正面影響：經 EDAC處理之大癌組中，有反應之比例為37% ，未經處理之大疱組中僅17%有反應。調配物中不含3D-MPL，且0.5%DOC萃取後之大疱製劑中 L0S百分比相當低（約5%)即可解釋這種低反應性之結果。 86952 -43 - B1727 SiaD(-)PorA (-) 大疱 B1727 SiaD(-)PorA ㈠ TrL3 TbpA-Hsf TrL3 TbpA-Hsf 交聯"ED AC" 無處理小白鼠處理法"UF/GPC/UF" 處理法"uf/gpc/uf" GMT 52 27 收集血清之SBA 249 60 反應隻數 11/30 5/30 1360424 亦進行抗-Hsf ELISA分析法，以決定交聯作用是否影響此蛋白質之免疫原性。結果（由所收集之血清得到）顯示交聯作用不影響IgG抗-Hsf反應。未檢測IgM。抗-Hsf ELISA IgM ieG B1727 Siad(-)PorA(-) TbpA-Hsf TrL3 交聯EDAC 50 18140 B1727Siad(-)PorA(-) TbpA-Hsf TrL3 50 15627 陰性對照組 50 50 實例9 : TrL3 LOS數攄分析下列實驗： -TrL3 (lgtB(-)L3 LOS)對誘發可與LNnT(乳醯基_N_新丁 86952 -44- 1360424 糖）反應之Abs之影響； -誘發上述構築體之殺細菌性抗體。由兩種基因改造之H44/7 6菌株製造大癌。這兩種均為 siaD(-)PorA(-)，但其中一種產生WT L3 LOS，另一種產生 TrL3 LOS (lgtB(-))。此等大疱係依據兩種不同製法製成，以具有高量LOS(約18%，使用DOC 0.1%萃取法）或低量 LOS(接近5% ’使用DOC 0.5°/。萃取法）。經由肌内途徑為小白鼠接種三次（第0、21與28夭時），每次注射含或不含3D-MPL之吸附在Al(OH)3上之5 pg大疮。

杭-LNnT ELISA 方法：使用利用間隔基（ADH)與人類血清白蛋白共軛之 LNnT塗覆微分析板（（每ml PBS含5 pg共軛物，每微孔100 μΐ)。於4°C下培養一夜後，以PBS-BSA 1%洗滌分析板並使之飽和（於室溫下40分鐘）。洗滌後，於PBS-0.2% BSA- 0.05% 中進行一系列稀釋，添加Tween20(於室溫下30分鐘）。由小白鼠-IgG與過氧化酶（Jackson藥廠）偶合後，與OPDA及H2〇2 培養，顯露IgG已被LNnT固定。結果：陽性對照組為lB2-lB7MAb。此MAb會與LNnT反應，及與L3 L0S(但不與TrL3 L0S)反應（參見前述實例），會使人類紅血球凝集。陰性對照組（-)為來自僅接受輔劑接種之小白鼠。其結果（圖6)清楚顯示，僅高L0S含量之L3大疱（D0C 0.1%)誘發可與LNnT反應之IgG產生。L0S含量類似之Tr L3 大疱不會針對LNnT誘發產生IgG，兩種LOS含量低之大疱製 86952 -45 - 1360424 劑（DOC 0.5%)亦不會誘發。

H44/76菌株之SBA 以第三次注射後14天所取得之個別血清，針對H44/76菌株進行33八分析法。其結果清楚顯示，忱1^3(^13(-))1^03大疱所誘發之殺細菌性抗體量類似L3 LOS(參見GMT及SBA 效價>1/100 ( = SC)之小白鼠隻數）調配物 L3大疱 TrL3大疽 DOC DOC DOC DOC 0.5% 0.1% 0.5% 0.1% Al(OH)3+MPL GMT 331 4125 1029 3204 SC 19/30 29/30 27/30 30/30 ai(oh)3 GMT 169 2029 138 828 SC 14/30 29/30 13/30 30/30 實例10 : FrpB磬倒試驗下列數據综合說明兩種臨床前實驗法。此等實驗中，使用兩種基因改造之H44/76菌株，使用 0.1%DOC製造大疱。依此方式得到之大疱中LOS含有接近 20%。這兩種H44/76菌株如下： -B1733 : siaD(-)PorA(-)Tr (截短）Hsf向上調節 lgtB(-) -B1820 : siaD(-)PorA(-)TrHsf向上調節 lgtB(-)FrpB(-) 大癌之製法為由菌株於去鐵胺曱續酸鹽（desferral)之存在 86952 -46- 1360424 下生長，向上調節依賴鐵之蛋白質如：LbpA/B、TbpA/B、 FrpB(B1733中），等等之產量。此等不同大疱製劑係吸附在ai(oh)3上，經由肌内途徑注射至小白鼠體内兩次，其間間隔3週。第二次投藥後7天取血樣。每次為小白鼠注射5 pg大癌。 SB A結果

於三種L3菌株（同源性野生型菌株H44/76及兩種異源性 L3菌株：NZ124與M97250687)上進行殺細菌分析法。結果清楚顯示FrpB(-)(擊倒）（B1820)大疱比FrpB(+)大疱（B1733) 誘發較佳之異源***叉殺細菌反應（高效價及較佳血清轉化率SC)。該同源性反應雖然因刪除FrpB而下降，但仍令人滿意。

此等數據顯示，FrpB為大疱所謗發免疫反應之主要驅動者，但由於此外膜蛋白質呈高度變化，因此，針對此蛋白質之抗體僅可誘發殺死同源性菌株。因此，在生產大疱之菌株中刪除FrpB為一種改善所製造大疱疫苗之涵蓋範圍之有利方法。大疮 H44/76 M97250687 NZ124 GMT SC GMT SC GMT SC B1733 1518 30/30 151 11/30 70 4/29 B1820 781 19/30 1316 24/30 276 19/30 實例11 : msbB(lpxLl)突變對大病，之熱原性之影響 86952 -47 - 1360424 此分析法中使用兩種NmenB菌株： -對照組菌株，其係galE(-)[因此無法製造莢膜多醣] -msbB突變菌株：其係galE(-)與msbB(-) 由這兩種菌株，使用0.1%DOC生產大疱，以使OMVs (大疱）中之LOS含量超過15%。如上述實例所說明，LOS含量超過10%之大疱在熱原性之觀點上並不令人滿意，且無法通過歐洲藥典上之兔子熱原性分析法。上述大疱係於A1(OH)3(50 pg OMVs/500 pg Al3+鹽類）上調配，供於兔子體内進行熱原性分析法（經IV途徑注射500 ng大病/kg)。下表清楚證實，刪除msbB(特別用於無法製造莢膜多醣之菌株）後，可使所產生之大疱即使在LOS含量高於15%下亦不會在兔子體内產生熱原性。大疮稀釋度個體體壯升纖0(°C) tG總和結論對照組 DOC 0.1% 0.5pg/kg 0.7-1.4-1.2 3.3 不通過 msbB(-)DOC 0.1% 0.5pg/kg 0.1-0.2-0.2 0.5 通過歐洲藥典規定：

"通過若個體^總和<1.15°C ”在未重覆下不通過π-若個體tG總和在1.15°C至2.65°C之間 "不通過若個體f總和> 2.65°C 結論：包含衍生自lgtB(-)與msbB(-)突變之腦膜炎球菌菌株且 86952 -48 · 1360424 °\ 2.1 Z-ι 〇^/ 經較低濃度（例如：0.1%)去氧膽酸鹽萃取之L3與L2大疱之組合物成為對抗腦膜炎球菌B之有效且安全疫苗之強力基礎。生產大疱之菌株理想上為有莢膜多醣合成缺陷，且其 LOS為在大疱内與外膜蛋白質交聯。PorA(-)與FrpB(-)均對改善交叉殺細菌效力有額外助益，同時向上調節Hsf與/或 TbpA抗原。【圖式簡單說明】圖1顯示L3及L2免疫型（H44/76, MC58菌株）。圖2顯示L3及L1免疫型（例如：126E菌株）。圖3A顯示經不同H44/76菌株所製大疱免疫小鼠血清之抗 -L3 LOS ELISA。圖3B顯示不同NmenB菌株之血清殺細菌分析。圖3C顯示經不同濃度純化L3 LOS耗損之血清之血清殺細菌分析。圖4顯示使用Mab 1B2-1B7(圖4A)及Mab L379 (圖4B)進行之 L3 及 TrL3 LOS ELISA。圖5A至5C顯示未共軛及交聯B1820大疱之抗原性。圖6顯示在3D-MPL存在（圖6A)或不存在（圖6B)下經吸附於AL(OH)3之大疱免疫小鼠之抗-LNnT ELISA。 86952 -49-

Claims

1360424 |：09Π21011 號申諸案公我拾、申請專利範圍： 1. 一種奈瑟氏球菌大疱製劑，其係衍生自具有L2 之奈瑟氏球菌菌株或具有L3 LOS免疫型之奈瑟氏球菌菌請專利範圍替換本(100年9甩) 年月 η - --1- 9. % 3 考‘ 株且其中該菌株為1 gtB ;或一種奈瑟氏球菌大癌製劑，其包含衍生自具有L2 LOS免疫型之奈瑟氏球菌菌株與具有L3 LOS免疫型之奈瑟氏球菌菌株之大疱組合，其中各菌株為1 gtB。 2. 根據申請專利範圍第1項之奈瑟氏球菌大癌製劑，其中該奈瑟氏球菌菌株（群）為腦膜炎球菌。 3. 根據申請專利範圍第2項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中該奈瑟氏球菌菌株（群）為腦膜炎球菌血清型B。 4. 根據申請專利範圍第i、2或3項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中e亥奈瑟氏球菌菌株（群）無法合成莢膜多酷。 5. 根據申請專利範圍第i ' 2或3項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中该奈瑟氏球菌菌株（群）相較於該衍生自該大疱之天然菌株（群）已向下調節下列之一種莢膜多醣基因之表見 ctrA ctrB、ctrC、ctrD、synA、synB、synC，或 siaD。 6. 根據申請專利範圍第5項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中該已向下調節表現之莢臈多醣基因係siaD。 7. 根據申請專利範圍第5項之奈瑟氏球菌大癌製劑，其中該 -已向下調節表現之莢膜多醣基因係經刪除。 8. 根據申請專利範圍第5項之奈瑟氏球菌大癌製劑，其中若 L2與L3兩種大癌均存在時，該魅自該大癌之菌株在各菌株十具有相同向下調節表現之笑膜多醋基因。 9. 根射請專利範圍第卜如項之奈瑟氏球菌大癌製劑， 86952-1000926.DOC 1360424 其中該奈瑟氏球菌菌株（群）相較於該衍生自該大疱之天然菌株（群）已向下調節下列之一或兩種脂質A基因之表現：msbB 或 htrB。 10.根據申請專利範圍第9項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中該 - 已向下調節表現之脂質A基因係msbB。 -11·根據申請專利範圍第9項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中該已向下調節表現之脂質A基因係經刪除。 12. 根據申請專利範圍第9項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中若 • L2與L3兩種大疱均存在時’該衍生自該大疱之菌株在各菌株中具有相同向下調節表現之脂質A基因。 13. 根據申請專利範圍第丨、2或3項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中该奈瑟氏球菌菌株（群）相較於該衍生自該大疱之天然菌株（群）已向下調節下列之一或多種外膜蛋白質基因之表現：porA、porB、〇pA、〇pC、pil(^frpB。 14. 根據中請專利範圍第13項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中該已向下調節表現之外膜蛋白質基因係經刪除。修15.根據中明專利範圍第13項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中若 L2與L3兩種大絲存在時，該衍生自該大癌之菌株在各菌株中具有相同向下調節表現之外膜蛋白質基因。 16.根據中4專利範圍第13項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中該氏球菌g株（群）相較於該衍生自該大癌之天然菌株 (群)已向下調節下列任一種外膜蛋白質基因組合之表見 PorA與 OpA、porA與〇pC、〇pA與〇pC、與 ” OpC P〇rA與 FrpB、〇pc與 FrpB、〇pA與 FrpB、〜八與 OpA及 OpC與 FrpB。 86952-1000926.DOC 1360424 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 根據申請專利範圍第16項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中該已向下調節表現之外膜蛋白質基因組合係經刪除。根據申請專利範圍第1、2或3項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其·中該奈瑟氏球菌菌株（群）已向上調節下列之一或多種外膜蛋白質抗原之表現：NspA、TbpA低分子量型、TbpA 咼分子量型、Hsf、Hap、OMP85、PilQ、NadA、LbpA、 MltA。根據申請專利範圍第18項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中若 L2與L3兩種大疱均存在時，該衍生自該大疱之菌株在各菌株中具有向上調節表現之一或多種不同之外膜蛋白質抗原。一種衍生自奈瑟氏球菌之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中相較於3亥衍生自該大疱之天然菌株已向下調節下列之二或多種外膜蛋白質之表現 :PorA、PorB、OpA、OpC、Pile 或 FrpB。根據申請專利範圍第2〇項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中已向下調節表現之外膜蛋白質係經刪除。根據申請專利範圍第20或21項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中6亥奈瑟氏球菌菌株相較於該衍生自該大疱之天然菌株已向下調節下列任一種外膜蛋白質組合之表現：p〇rA與 0PA、P〇rA與〇pC、0pA與〇pC、p〇rA與〇pA與〇pC、p〇rA 與 FrpB、〇pC與 FrpB、OpA與 FrpB、PorA與 OpA及 OpC與 FrpB。根據申請專利範圍第22項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中已向下調節表現之外膜蛋白質組合係經刪除。 86952-1000926.DOC 1360424 24_根據申請專利範圍第丨、2、3或20項之奈瑟氏球菌大疱製劑’其中所含之L Ο S係與T-助手細胞抗原決定基來源共軛。 25. 根據申請專利範圍第24項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中所含之LOS係與蛋白質或外臈蛋白質共軛。 26. 根據申請專利範圍第24項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其係經由大疱内交聯作用製得。 27. —種單離自奈瑟氏球菌菌株（群）製劑，其中根據申凊專利範圍第1至26項中任一項之奈瑟氏球菌大癌製劑係自5亥菌株（群）所衍生，其包含免疫型[2及/或L3 L〇s。 28·根據申請專利範圍第27項之L〇s製劑，其係呈微脂粒調配 29. 根據申請專利範圍第27或28項之LOS製劑，其中所含之 LOS係與T-助手細胞抗原決定基來源共軛。 30. 根據申請專利範圍第μ項之奈瑟氏球菌大疱製劑，其中所含之LOS係與蛋白質或外膜蛋白質共軛。 31. —種免疫原性組合物或疫苗，其包含根據申請專利範圍第 1至26項中任一項之奈瑟氏球菌大疱製劑或27至30項中任一項之LOS製劑，及醫藥上可接受之賦形劑。 32. 根據申請專利範圍第31項之疫苗，其另包含辅劑。

W-135、腦膜炎球菌血清型γ、型C、胳膜炎球菌血清型及流感嗜血菌b型。 86952-1000926.DOC 1360424 35. —種製造根據申請專利範圍第3〗至34項_任一之夺登氏球菌大痛製劑疫苗之方法，《包括之步鄉為培養奈瑟氏球菌菌株（群），其中根據申請專利範圍第】至26項^一項之奈瑟氏球菌大疱製劑係自該菌株（群）所衍生，自其中單離大癌，若適當時可視需要組合乙2與匕3 寧可接受之賦形劑調配大疱。便用邊樂上 36·根據申請專利範圍第35項之方法，其中該單離步驟係使用〇_〇.5、隨心、G.G4们、⑽G.2或G.㈣.15%去氧膽酸鹽萃取。 37_根據申請專利範圍第+ + 固弟36項之方法，其中該單離步驟係使用 0.1%左右或0.1%整之去氧膽酸鹽萃取。 86952-1000926.DOC