JP2013503148A - アルミニウム、オリゴヌクレオチドおよびポリカチオンを含むアジュバント - Google Patents

Abstract

免疫学的アジュバントは、アルミニウム塩、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含み、ここで、そのオリゴヌクレオチドおよびポリマーは、理想的には、互いに会合することにより複合体を形成する。そのアジュバントは、例えば、細菌性疾患または真菌性疾患を防御する免疫応答を誘発するために、免疫原を含む組成物中に含められ得る。本発明はまた、（ｉ）本発明のアジュバントおよび（ｉｉ）免疫原を含む免疫原性組成物も提供する。その免疫原は：そのアジュバント中のアルミニウム塩に吸着され得るか；そのアジュバント中のオリゴヌクレオチド／ポリマー複合体に吸着され得るか；および／またはアルミニウム塩にも複合体にも吸着されない場合がある。

Description

本出願は、２００９年８月２７日に出願された米国仮出願第６１／２３７，５９５号の利益を主張し、上記米国仮出願の全容は、本明細書によって、全ての目的について、参照によって本明細書に援用される。

（技術分野）
本発明は、ワクチンアジュバントおよびそれらの組み合わせの分野におけるものである。

（背景技術）
アジュバントは、現在多くのワクチンに含まれている。アルミニウム塩、代表的には、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムが、間違いなく最も一般的なアジュバントである。それらは、通常、単一のアジュバントとして使用されるが、さらに、他の非アルミニウムアジュバントと組み合わされており、例えば、ＦＥＮＤＲＩＸ^ＴＭ製品は、リン酸アルミニウム＋３ｄ−ＭＰＬのアジュバントを含み、ＣＥＲＶＡＲＩＸ^ＴＭ製品のアジュバントは、水酸化アルミニウム＋３ｄ−ＭＰＬである。

アルミニウム塩を含む改変および改善された組み合わせアジュバントを提供することが、本発明の目的である。

（発明の開示）
本発明は、アルミニウム塩、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含む免疫学的アジュバントを提供する。そのオリゴヌクレオチドおよびポリマーは、理想的には、互いに会合することにより複合体を形成する。

本発明はまた、（ｉ）本発明のアジュバントおよび（ｉｉ）免疫原を含む免疫原性組成物も提供する。その免疫原は：そのアジュバント中のアルミニウム塩に吸着され得るか；そのアジュバント中のオリゴヌクレオチド／ポリマー複合体に吸着され得るか；および／またはアルミニウム塩にも複合体にも吸着されない場合がある。

本発明はまた、本発明の免疫学的アジュバントを調製するためのプロセスも提供し、そのプロセスは、アルミニウム塩を免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性ポリマーとの複合体と混合する工程を包含する。代替の方法では、アルミニウム塩、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーは、複合体が形成される前に混合される。例えば、アルミニウム塩は、オリゴヌクレオチドと混合され得、次いで、ポリマーが加えられるか；またはアルミニウム塩は、ポリマーと混合され得、次いで、オリゴヌクレオチドが加えられる。複合体は、オリゴヌクレオチドとポリマーとが出会った後に形成され得る。

本発明はまた、免疫原性組成物を調製するためのプロセスも提供し、そのプロセスは、（ｉ）本発明のアジュバントおよび（ｉｉ）免疫原を混合する工程を包含する。

その免疫原、アルミニウム塩、オリゴヌクレオチドおよびポリマーは、任意の順序で混合され得る。例えば、本発明は、（ｉ）アルミニウム塩および（ｉｉ）免疫原を混合する工程；次いでその塩／免疫原混合物を免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーと混合する工程を包含する、本発明の免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供する。本発明はまた、（ｉ）代表的には複合体の形態での、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマー、ならびに（ｉｉ）免疫原を混合する工程；次いでそのオリゴヌクレオチド／ポリマー／免疫原混合物をアルミニウム塩と混合する工程を包含する、本発明の免疫原性組成物を調製するためのプロセスも提供する。１つの好ましい実施形態において、免疫原は、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムアジュバント）に吸着され、次いで、その吸着された免疫原は、オリゴヌクレオチド／カチオン性ポリマー複合体と混合される。

本発明はまた、（ｉ）本発明のアジュバントを含む第１の容器；ならびに（ｉｉ）免疫原および／またはさらなるアジュバントを含む第２の容器を備えるキットも提供する。本発明はまた、（ｉ）アルミニウム塩を含む第１の容器；および（ｉｉ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含む第２の容器を備えるキットも提供する。その第１および第２の容器の一方または両方が、免疫原を含み得る。したがって、その２つの容器の内容物が組み合わされることにより（例えば、使用時に）、本発明のアジュバントまたは免疫原性組成物が形成され得る。これらのキットは、免疫原および／またはさらなるアジュバントを含む第３の容器を備えてもよい。

（アルミニウム塩）
本発明のアジュバントは、少なくとも１つのアルミニウム塩を含む。適当なアルミニウム塩としては、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして個別に知られているアジュバントが挙げられる。これらの名称は、慣例に則ったものであり、それらの両方は、存在する実際の化合物の正確な説明ではないので、便宜のためだけに使用される［例えば、参考文献１の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般に使用されている任意の「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントを使用し得る。水酸化アルミニウムアジュバントの使用が、好ましい。

「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、代表的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、それは通常、少なくとも部分的に結晶性である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に、１０７０ｃｍ^−１における吸着帯（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｂａｎｄ）および３０９０〜３１００ｃｍ^−１における強い肩（ｓｔｒｏｎｇ ｓｈｏｕｌｄｅｒ）の存在によって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）_３などの他のアルミニウム化合物と区別され得る［参考文献１の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半分の高さにおける回折バンドの幅（ｗｉｄｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｂａｎｄ ａｔ ｈａｌｆ ｈｅｉｇｈｔ）（ＷＨＨ）によって反映され、結晶性の低い粒子は、より小さい結晶子サイズに起因して、より大きな線の広がりを示す。ＷＨＨが大きいほど表面積は大きく、アジュバントのＷＨＨ値が大きいほど抗原吸着能が高いことが判明している。繊維状の形態（例えば、透過型電子顕微鏡像において見られるような形態）が、水酸化アルミニウムアジュバントにとって代表的である。１〜１０μｍの範囲の平均粒子直径が、参考文献２に報告されている。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、代表的には約１１であり、すなわち、そのアジュバント自体が、生理学的ｐＨにおいて正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４における１．８〜２．６ｍｇタンパク質／ｍｇ Ａｌ^＋＋＋という吸着能が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。

「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、代表的には、しばしば少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）も含む、ヒドロキシリン酸アルミニウムである。それらは、沈殿によって得られることがあり、沈殿中の反応条件および濃度は、その塩におけるヒドロキシルからリン酸への置換の程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、通常、０．３〜１．２のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在によって厳密なＡｌＰＯ_４と区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ^−１におけるＩＲスペクトル帯（例えば、２００℃に加熱されたとき）は、構造的ヒドロキシルの存在を示す［参考文献１の第９章］。リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ_４／Ａｌ^３＋モル比は、通常、０．３〜１．２、好ましくは、０．８〜１．２、より好ましくは、０．９５±０．１である。そのリン酸アルミニウムは、一般に非晶質であり、特にヒドロキシリン酸塩の場合、非晶質である。代表的なアジュバントは、０．６ｍｇＡｌ^３＋／ｍｌで含められ、０．８４〜０．９２のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。そのリン酸アルミニウムは、一般に、微粒子である（例えば、透過型電子顕微鏡像において見られるような板状の形態）。それらの粒子の代表的な直径は、任意の抗原が吸着した後、０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）の範囲内である。ｐＨ７．４における０．７〜１．５ｍｇタンパク質／ｍｇＡｌ^＋＋＋という吸着能が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルからリン酸への置換の程度に反比例し、この置換の程度は、沈殿によって塩を調製するために用いられる反応条件および反応体の濃度に応じて変化し得る。ＰＺＣは、溶液中の遊離リン酸イオン濃度を変更することによって（より多いリン酸＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝液などの緩衝液を加えることによっても（ＰＺＣをより塩基性にする）変化する。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０〜７．０、より好ましくは、５．０〜６．５、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。

水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物もまた使用され得る。この状況では、水酸化アルミニウムよりも多いリン酸アルミニウムが存在し得、例えば、少なくとも２：１、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比で存在し得る。

したがって、本発明のアジュバントは：（ｉ）水酸化アルミニウム、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマー；（ｉｉ）リン酸アルミニウム、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマー；または（ｉｉｉ）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含み得る。

本発明の薬学的組成物中のＡｌ^＋＋＋の濃度は、通常、＜１０ｍｇ／ｍｌ、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。

（免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマー）
本発明は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを使用する。これらは、理想的には、互いに会合することにより、有用なことにＴＬＲ９アゴニストである微粒子複合体を形成する。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、有用なアジュバントとして知られている。それらはしばしば、ＣｐＧモチーフ（グアノシンに連結されたメチル化されていないシトシンを含むジヌクレオチド配列）を含み、それらのアジュバントの作用は、参考文献３〜８において考察されている。ＴｐＧモチーフ、パリンドローム配列、複数の連続したチミジンヌクレオチド（例えば、ＴＴＴＴ）、複数の連続したシトシンヌクレオチド（例えば、ＣＣＣＣ）またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドもまた、二本鎖ＲＮＡと同様、公知の免疫刺激剤である。これらの様々な免疫刺激性オリゴヌクレオチドのいずれかを、本発明とともに使用することができるが、デオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジンを含むオリゴデオキシヌクレオチド［９］、ならびに理想的にはデオキシイノシンおよびデオキシシトシンを含むオリゴデオキシヌクレオチドを使用することが好ましい。イノシン含有オリゴデオキシヌクレオチドは、ＣｐＩモチーフ（イノシンに連結されたシトシンを含むジヌクレオチド配列）を含み得る。オリゴデオキシヌクレオチドは、１つより多い（例えば、２、３、４、５、６つまたはそれ以上の）ＣｐＩモチーフを含み得、これらは、直接反復され得るか（例えば、配列（ＣＩ）_ｘを含む（ここで、ｘは２、３、４、５、６またはそれ以上である））、または互いから分断され得る（例えば、配列（ＣＩＮ）_ｘを含む（ここで、ｘは２、３、４、５、６またはそれ以上であり、各Ｎは、独立して１つ以上のヌクレオチドを表す））。シトシン残基は、理想的にはメチル化されていない。

上記オリゴヌクレオチドは、代表的には、１０〜１００ヌクレオチド、例えば、１５〜５０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチドまたは２５〜２８ヌクレオチドを有する。それは、代表的には一本鎖である。

上記オリゴヌクレオチドは、もっぱら天然のヌクレオチド、もっぱら非天然のヌクレオチド、またはその両方の混合物を含み得る。例えば、上記オリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエート結合を含み得、そして／または１つ以上のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル改変を有し得る。

本発明とともに使用するために好ましいオリゴヌクレオチドは、２６ｍｅｒの配列５’−（ＩＣ）_１３−３’（配列番号１）を含む一本鎖デオキシヌクレオチドである。このオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリカチオン性ポリマーと安定な複合体を形成することにより、良好なアジュバントをもたらす。

そのポリカチオン性ポリマーは、理想的には、カチオン性の抗菌性ペプチドなどのポリカチオン性ペプチドである。そのポリマーは、１つ以上のロイシンアミノ酸残基および／または１つ以上のリジンアミノ酸残基を含み得る。そのポリマーは、１つ以上のアルギニンアミノ酸残基を含み得る。そのポリマーは、これらのアミノ酸のうちの１つの少なくとも１つのダイレクトリピート、例えば、１つ以上のＬｅｕ−Ｌｅｕジペプチド配列、１つ以上のＬｙｓ−Ｌｙｓジペプチド配列または１つ以上のＡｒｇ−Ａｒｇジペプチド配列を含み得る。そのポリマーは、少なくとも１つの（好ましくは、複数の、例えば２つまたは３つの）Ｌｙｓ−Ｌｅｕジペプチド配列および／または少なくとも１つの（好ましくは、複数の、例えば２つまたは３つの）Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含み得る。

上記ペプチドは、配列Ｒ_ｌ−ＸＺＸＺ_ｘＸＺＸ−Ｒ_２を含み得、ここで：ｘは、３、４、５、６または７であり；各Ｘは、独立して、正電荷を持つ天然および／または非天然のアミノ酸残基であり；各Ｚは、独立して、アミノ酸残基Ｌ、Ｖ、Ｉ、ＦまたはＷであり；そしてＲ_１およびＲ_２は、独立して、−Ｈ、−ＮＨ_２、−ＣＯＣＨ_３または−ＣＯＨからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ−Ｒ_２は、ペプチドのＣ末端のアミノ酸残基のアミド、エステルまたはチオエステルであり得る。参考文献１０も参照のこと。

ポリカチオン性ペプチドは、代表的には、５〜５０アミノ酸、例えば、６〜２０アミノ酸、７〜１５アミノ酸または９〜１２アミノ酸を有する。

ペプチドは、もっぱら天然のアミノ酸、もっぱら非天然のアミノ酸またはその両方の混合物を含み得る。ペプチドは、Ｌ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸を含み得る。Ｌ−アミノ酸が、代表的である。

ペプチドは、天然のＮ末端（ＮＨ_２−）または改変されたＮ末端、例えば、ヒドロキシル、アセチルなどを有し得る。ペプチドは、天然のＣ末端（−ＣＯＯＨ）または改変されたＣ末端、例えば、ヒドロキシル、アセチルなどを有し得る。そのような改変は、ペプチドの安定性を改善し得る。

本発明ともに使用するために好ましいペプチドは、すべてがＬ−アミノ酸である１１ｍｅｒのＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号２；参考文献１１）である。そのＮ末端は、脱アミノ化されてもよく、Ｃ末端は、ヒドロキシル化されてもよい。好ましいペプチドは、すべてがＬ−アミノ酸であるＨ−ＫＬＫＬ_５ＫＬＫ−ＯＨである。このオリゴペプチドは、公知の抗菌薬［１２］、好中球アクチベーター［１３］およびアジュバント［１４］であり、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと安定な複合体を形成することにより、優れたアジュバントをもたらす。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性ポリマーとの最も好ましい混合物は、ＩＣ３１^ＴＭとして知られているＴＬＲ９アゴニストであり［１５〜１７］、これは、オリゴデオキシヌクレオチド配列番号１とポリカチオン性オリゴペプチド配列番号２との吸着複合体である。

上記オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドは、様々な比で共に混合され得るが、それらは、通常、ペプチドが過剰なモル比で混合される。その過剰なモル比は、少なくとも５：１、例えば、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０；１、３５：１、４０：１などであり得る。約２５：１のモル比が、理想的である［１８，１９］。この過剰なモル比での混合によって、オリゴヌクレオチドとオリゴペプチドとの不溶性の微粒子複合体が形成され得る。それらの複合体は、本明細書中に記載されるようなアルミニウム塩と組み合わされ得る。

上記オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドは、代表的には、水性条件下において混合され、例えば、そのオリゴヌクレオチドの溶液が、オリゴペプチドの溶液と所望の比で混合され得る。それらの２つの溶液は、乾燥された（例えば、凍結乾燥された）材料を水または緩衝液に溶解し、その後混合され得るストック溶液を形成することによって調製され得る。

上記複合体は、参考文献２０に開示されている方法を用いて分析され得る。１μｍ〜２０μｍの範囲の平均直径を有する複合体が代表的である。

ポリアルギニンおよびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドも同様に複合体を形成する［２１］。

上記複合体は、水性懸濁物、例えば、水または緩衝液中に維持され得る。それらの複合体とともに使用するための代表的な緩衝液は、リン酸緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｔｒｉｓ／ソルビトール緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液などである。代案として、複合体は時折、凍結乾燥され得る。

水性懸濁物中の複合体は、遠心分離されることにより、バルク媒質（ｂｕｌｋ ｍｅｄｉｕｍ）から（例えば、吸引、デカントなどによって）分離され得る。次いで、これらの複合体は、所望であれば、代替の媒質に再懸濁され得る。

（アルミニウム塩、オリゴヌクレオチドおよびポリマーの混合）
本発明のアジュバント組成物は、アルミニウム塩の水性懸濁物をオリゴヌクレオチド／ポリマー複合体の水性懸濁物と混合することによって都合よく調製され得る。その塩および複合体は各々、代表的には液体の形態で維持されるので、それらを共処方（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）する簡便な方法が提供される。

いくつかの実施形態において、上記懸濁物の一方または両方が、免疫原を含み、その混合により、本発明の免疫原性組成物が提供される。他の実施形態では、いずれの液体も免疫原を含まないので、その混合生成物（すなわち、本発明のアジュバント組成物）が、後で免疫原と組み合わされることにより、本発明の免疫原性組成物が提供され得る。

２つの液体が混合される場合、その混合の容積比は、変動し得る（例えば、２０：１〜１：２０、１０：１〜１：１０、５：１〜１：５、２：１〜１：２など）が、理想的には、約１：１である。上記２つの懸濁物中の構成要素の濃度は、所望の最終濃度が混合後に達成されるように選択され得る（例えば、両方が２×濃度で調製されて、１：１の混合により最終的な所望の濃度が提供され得る）。

他の方法で、例えば、アルミニウム塩を遠心分離し、次いで、ペレットを複合体の懸濁物に再懸濁すること、複合体を遠心分離し、次いで、ペレットをアルミニウム塩の懸濁物に再懸濁することなどによって、アジュバント組成物を調製することも可能である。

様々な濃度のオリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーが使用され得る（例えば、参考文献１５、１８、１９または２２において使用されている濃度のいずれか）。例えば、ポリカチオン性のオリゴペプチドは、１１００μＭ、１０００μＭ、３５０μＭ、２２０μＭ、２００μＭ、１１０μＭ、１００μＭ、１１μＭ、１０μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、５０ｎＭなどで存在し得る。オリゴヌクレオチドは、４４ｎＭ、４０ｎＭ、２０ｎＭ、１４ｎＭ、４．４ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭなどで存在し得る。２０００ｎＭ未満のポリカチオン性オリゴペプチド濃度が代表的である。ゆえに、１：２５のモル比で混合された配列番号１および２の場合、本発明の３つの実施形態における濃度（単位はｍｇ／ｍＬ）は、０．３１１および１．３２２または０．１０９および０．４６３または０．０３１および０．１３２であり得る。

アルミニウム塩、および免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性ポリマーとの複合体は、代表的には、両方とも微粒子である。アルミニウム塩アジュバントの平均粒子直径は、代表的には、ほぼ１〜２０μｍ程度の大きさである［２，２３］。これは、ＩＣ３１^ＴＭに見られる複合体についてのサイズ範囲でもある。そのような粒子が組み合わされるとき、塩粒子の平均直径は、複合体の平均直径と実質的に同じであり得る。しかしながら、他の実施形態において、塩粒子の平均直径は、複合体の平均サイズより小さいことがある。他の実施形態において、塩粒子の平均直径は、複合体の平均サイズより大きいことがある。平均直径が異なる場合、大きいほうの直径は、少なくとも１．０５×、例えば、１．１×、１．２×、１．３×、１．４×、１．５×、２×、２．５×、３×またはそれ以上だけ大きい可能性がある。その塩または複合体が、ある範囲の直径を有する粒子を有するがその平均直径が異なる場合、その範囲は、重複していてもよいし、していなくてもよい。ゆえに、最も大きい塩粒子は、最も小さい複合体粒子よりも小さいことがあるか、または最も大きい複合体粒子は、最も小さい塩粒子よりも小さいことがある。

上記粒子は通常、大きすぎて濾過滅菌できないので、本発明のアジュバント組成物の滅菌は、代表的には、アルミニウム塩および複合体を滅菌条件下で調製し、次いで、それらを滅菌条件下で混合することによって、達成される。例えば、複合体の構成要素が、濾過滅菌され、次いで、滅菌条件下で混合されることにより、滅菌複合体が形成され得る。次いで、これらの滅菌複合体が、オートクレーブされた（滅菌された）アルミニウム塩アジュバントと混合されることにより、滅菌されたアジュバント組成物が提供され得る。次いで、この滅菌されたアジュバントは、滅菌された免疫原と混合されることにより、患者への投与に適した免疫原性組成物をもたらし得る。

アルミニウム塩粒子の密度は、代表的には、免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性ポリマーとの複合体の密度と異なる（このことは、これら２つの粒子が、例えばスクロース勾配によって、密度に基づいて分離され得ることを意味する）。

アルミニウム塩と免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性ポリマーとの混合物を含む組成物は、（ｉ）緩衝液（例えば、ヒスチジン緩衝液、例えば、１０ｍＭヒスチジン緩衝液）および／または（ｉｉ）５〜１５ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、例えば、９ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムも有用に含み得る。ヒスチジン緩衝液を含む組成物は、６．０〜７．４の範囲、例えば、６．３〜７．０、または約６．５のｐＨを有用に有し得る。

（薬学的組成物）
本発明のアジュバント組成物は、通常、アルミニウム塩、オリゴヌクレオチドおよびポリマーに加えて、構成要素を含み、例えば、代表的には、１つ以上の薬学的に許容され得る構成要素を含む。そのような構成要素は、本発明の免疫原性組成物中にも存在し得、アジュバント組成物または別の組成物から生じる。そのような構成要素の徹底的な考察は、参考文献２４において入手可能である。

組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。ワクチンは、水銀材料を実質的に含まないようにすべきであり（例えば、＜１０μｇ／ｍｌ）、例えば、チオメルサールフリーであることが好ましい。水銀を含まないワクチンが、より好ましい。保存剤フリーのワクチンが、特に好ましい。コハク酸α−トコフェロールは、水銀の化合物に対する代替物としてインフルエンザワクチンに含められ得る。

張度を調節するために、組成物は、ナトリウム塩などの生理学的塩を含み得る。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。存在してもよい他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウムおよび／または塩化マグネシウムなどが挙げられる。

組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有し得、２８０〜３３０ｍＯｓｍ／ｍｇまたは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内であり得る。

組成物のｐＨは、通常、５．０〜８．１、より代表的には、６．０〜８．０、例えば、６．５〜７．５または７．０〜７．８である。

組成物は、好ましくは、滅菌されている。組成物は、好ましくは、発熱性でなく、例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（標準的な尺度であるエンドトキシン単位）、好ましくは、１用量あたり＜０．１ＥＵを含む。組成物は、好ましくは、グルテンフリーである。

有用な組成物は、ヒスチジン緩衝液（例えば、１０ｍＭヒスチジン緩衝液）、塩化ナトリウム（例えば、９ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム）および水酸化アルミニウムアジュバント（例えば、２ｍｇ／ｍｌのＡｌ^＋＋＋）を含む。

免疫原性組成物は、１回の免疫化のための材料を含んでもよいし、複数回の免疫化のための材料を含んでもよい（すなわち、「マルチドーズ（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）」キット）。保存剤を含んでいることは、マルチドーズの準備において有用である。マルチドーズ用組成物に保存剤を含めることに対する代替法として（またはそれに加えて）、本組成物は、材料を取り出すための無菌のアダプターを有する容器に含められ得る。

組成物は通常、投与時には水性の形態である。ワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投薬容積で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）も時折、例えば小児に投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、より高用量、例えば、約１ｍｌで（例えば、２つの０．５ｍｌ容積を混合した後）投与され得る。

（免疫原）
本発明のアジュバント組成物は、免疫原とともに動物に投与されることにより、免疫応答を誘導し得る。本発明は、広範囲の疾患を処置するためかまたは防御するために広範囲の免疫原とともに使用され得る。その免疫原は、ウイルス性疾患（例えば、エンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスに起因する疾患）、細菌性疾患（例えば、グラム陰性菌またはグラム陽性菌に起因する疾患）、真菌性疾患、寄生虫病、自己免疫疾患または他の任意の疾患を防御する免疫応答を誘発し得る。その免疫原は、例えば、腫瘍／がん、アルツハイマー病または嗜癖を処置するための、免疫療法においても有用であり得る。

免疫原は、様々な形態、例えば、生物体全体、外膜小胞、タンパク質、サッカライド、リポサッカライド、結合体（例えば、キャリアとハプテンとの結合体、またはキャリアとサッカライドもしくはリポサッカライドとの結合体）などをとり得る。

免疫原は、インフルエンザＡおよびＢウイルスを含むインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発し得る。様々な形態のインフルエンザウイルス免疫原、代表的には、生ウイルスまたは不活性化ウイルスに基づくものが、現在入手可能である。不活性化ワクチンは、全ビリオン（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｉｏｎ）、分割ビリオン（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）または精製された表面抗原に基づき得る。インフルエンザ抗原は、ビロソームの形態でも提供され得る。赤血球凝集素は、現用の不活性化ワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、代表的にはＳＲＩＤによって測定されるＨＡレベルを参照することにより標準化される。既存のワクチンは、代表的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低用量も、例えば、小児に対して、またはパンデミックの状況において、またはアジュバントを用いるとき、使用され得る。分数用量（例えば、１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８）が使用されており、同様に、より高用量（例えば、３×または９×の用量［２５，２６］）も使用されている。したがって、組成物は、１インフルエンザ株あたり０．１〜１５０μｇのＨＡ、好ましくは、０．１〜５０μｇ、例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどを含み得る。特定の用量としては、例えば、１株あたり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などが挙げられる。ワクチンに含められる各株に対して実質的に同じＨＡ質量を含むことが通常であり、例えば、各株に対するＨＡ質量は、１株あたりの平均ＨＡ質量の１０％以内、好ましくは、その平均値の５％以内である。生ワクチンの場合、投与量は、ＨＡ含有量ではなく５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）によって測定され、１株あたり１０^６〜１０^８（好ましくは、１０^６．５〜１０^７．５）のＴＣＩＤ_５０が代表的である。ＳＰＦ卵をウイルス増殖用の基材として使用するのではなく（ここでは、ウイルスは鶏卵の感染尿膜腔液から収集される）、インフルエンザウイルス複製を支持する細胞株が使用され得る。その細胞株は、代表的には、哺乳動物起源のもの、例えば、ＭＤＣＫである。インフルエンザＡウイルス免疫原は、任意の適当なＨＡサブタイプの株、例えば、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９など、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２および／またはＨ５Ｎ１株由来であり得る。

免疫原は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓなどのＣａｎｄｉｄａ真菌に対する免疫応答を誘発し得る。例えば、その免疫原は、β−グルカンであり得、それは、キャリアタンパク質に結合体化され得る。そのグルカンは、β−１，３結合および／またはβ−１，６結合を含み得る。適当な免疫原としては、参考文献２７および２８に開示されている免疫原が挙げられる。

免疫原は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌に対する免疫応答を誘発し得る。例えば、その免疫原は、莢膜サッカライドであり得、それは、キャリアタンパク質に結合体化され得る。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの場合、そのサッカライドは、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよび／またはＶのうちの１つ以上に由来し得る。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの場合、そのサッカライドは、血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび／または２３Ｆのうちの１つ以上に由来し得る。莢膜サッカライド免疫原に加えて（またはその代わりに）、参考文献２９に開示されているように、防御性の抗連鎖球菌免疫応答を誘発するためにポリペプチド免疫原（例えば、ＲｒｇＢを含む）を使用してもよい。

免疫原は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌に対する免疫応答を誘発し得る。例えば、その免疫原は、ＩｓｄＡ抗原、ＩｓｄＢ抗原、ＣｌｆＡ抗原、ＣｌｆＢ抗原、ＳｄｒＤ抗原、Ｓｐａ抗原、ＥｓｘＡ抗原、ＥｓｘＢ抗原、Ｓｔａ００６抗原、溶血素および／またはＳｔａ０１１抗原を含み得る。適当なＳ．ａｕｒｅｕｓ免疫原およびそれらの組み合わせは、参考文献３０に開示されている。

免疫原は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する免疫応答を誘発し得る。例えば、その免疫原は、莢膜サッカライドであり得、それは、キャリアタンパク質に結合体化され得る。莢膜サッカライドは、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹを防御するために特に有用である。莢膜サッカライド免疫原に加えて（またはその代わりに）、特に血清群Ｂに対して使用するために、例えば、参考文献３１に開示されているように、防御性の抗髄膜炎菌免疫応答を誘発するために、ポリペプチド免疫原および／または外膜小胞を使用してもよい。有用な血清群Ｂ抗原のさらなる詳細は、下に記載される。

免疫原は、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび／またはＣ型肝炎ウイルス）に対する免疫応答を誘発し得る。例えば、その免疫原は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）であり得る。しかし、いくつかの実施形態において、その免疫原は、ＨＢｓＡｇではない（参考文献３２を参照のこと）。

免疫原は、ＲＳウイルスに対する免疫応答を誘発し得る。免疫原は、Ａ群ＲＳＶおよび／またはＢ群ＲＳＶ由来であり得る。適当な免疫原は、例えば、参考文献３３および３４に開示されているような、Ｆおよび／もしくはＧ糖タンパク質またはそれらのフラグメントを含み得る。

免疫原は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むＣｈｌａｍｙｄｉａ菌に対する免疫応答を誘発し得る。適当な免疫原としては、参考文献３５〜４１に開示されている免疫原が挙げられる。

免疫原は、腸外病原性株を含む大腸菌に対する免疫応答を誘発し得る。適当な免疫原としては、参考文献４２〜４５に開示されている免疫原が挙げられる。

免疫原は、ヒトＳＡＲＳコロナウイルスなどのコロナウイルスに対する免疫応答を誘発し得る。適当な免疫原は、スパイク糖タンパク質を含み得る。

免疫原は、ヘリコバクターピロリ菌に対する免疫応答を誘発し得る。適当な免疫原としては、ＣａｇＡ［４６〜４９］、ＶａｃＡ［５０，５１］および／またはＮＡＰ［５２〜５４］が挙げられる。

免疫原は、狂犬病ウイルスに対する免疫応答を誘発し得る。適当な免疫原は、不活性化狂犬病ウイルス［５５，ＲａｂＡｖｅｒｔ^ＴＭ］である。

免疫原は、ヒトパピローマウイルスに対する免疫応答を誘発し得る。有用な免疫原は、Ｌ１キャプシドタンパク質であり、これは、集合することにより、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として知られている構造を形成し得る。このＶＬＰは、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞、例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞）におけるＬ１の組換え発現によって生成され得る。酵母細胞の場合、プラスミドベクターが、Ｌ１遺伝子を有し得；昆虫細胞の場合、バキュロウイルスベクターが、Ｌ１遺伝子を有し得る。より好ましくは、本組成物は、ＨＰＶ−１６株とＨＰＶ−１８株の両方に由来するＬ１ ＶＬＰを含む。この二価の組み合わせは、非常に有効であると示されている［５６］。ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株に加えて、ＨＰＶ−６株およびＨＰＶ−１１株由来のＬ１ ＶＬＰを含めることも可能である。

免疫原は、腫瘍抗原（例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３（ＭＡＧＥ−Ａ３）、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＴＲＰ−２など）に対する免疫応答を誘発し得る。その免疫原は、肺がん、メラノーマ、乳がん、前立腺がんなどに対する免疫療法応答を誘発し得る。

免疫原は、キャリアタンパク質に結合体化されたハプテンに対する免疫応答を誘発し得、ここで、そのハプテンは、乱用薬物である［５７］。例としては、オピエート類、マリファナ、アンフェタミン類、コカイン、バルビツエート類、グルテチミド、メチプリロン、抱水クロラール、メタクワロン、ベンゾジアゼピン類、ＬＳＤ、ニコチン、抗コリン作用薬、抗精神病薬、トリプタミン、他の精神作用薬、鎮静薬、フェンシクリジン、サイロシビン、揮発性ニトレート、ならびに身体依存および／または精神依存を誘導する他の薬物が挙げられるが、これらに限定されない。

他の様々な免疫原を使用してもよい。

（Ｂ血清群髄膜炎菌）
本発明のアジュバントは、髄膜炎菌、特に、Ｂ血清群髄膜炎菌（「ＮｍＢ」）に対する免疫応答を増強するために有用である。抗ＮｍＢ応答を誘発するのに適した免疫原としては、ポリペプチド抗原、リポオリゴ糖および／または膜小胞が挙げられる。

（髄膜炎菌ポリペプチド抗原）
組成物は、１つ以上の髄膜炎菌ポリペプチド抗原を含み得る。例えば、組成物は、２８７、ＮａｄＡ、ＮｓｐＡ、ＨｍｂＲ、ＮｈｈＡ、Ａｐｐ、Ｏｍｐ８５および／またはｆＨＢＰからなる群より選択されるポリペプチド抗原を含み得る。これらの抗原は、精製されたポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドとして有用に存在する。その抗原は、好ましくは、被験体への投与後に殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発する。

本発明の組成物は、２８７抗原を含み得る。この２８７抗原は、遺伝子ＮＭＢ２１３２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２７３８８；本明細書中の配列番号３）として髄膜炎菌のＢ血清群株ＭＣ５８［５８］についての公開ゲノム配列内に含まれていた。多くの株由来の２８７抗原の配列が、それ以後公開されている。例えば、２８７の対立遺伝子型は、参考文献５９の図５および１５ならびに参考文献６０の実施例１３および図２１（その文献内の配列番号３１７９〜３１８４）に見られる。その２８７抗原の様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明とともに使用するための好ましい２８７抗原は、（ａ）配列番号３に対して５０％またはそれ以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号３の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列（ここで、「ｎ」は、７またはそれ以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号３由来のエピトープを含む。本発明の最も有用な２８７抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列の配列番号３からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明とともに使用するための都合のよい２８７抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。

本発明の組成物は、ＮａｄＡ抗原を含み得る。このＮａｄＡ抗原は、遺伝子ＮＭＢ１９９４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２７２５６；本明細書中の配列番号４）として髄膜炎菌のＢ血清群株ＭＣ５８［５８］についての公開ゲノム配列内に含まれていた。多くの株由来のＮａｄＡ抗原の配列が、それ以後公開されており、ナイセリアのアドヘシンとしてのそのタンパク質の活性が、よく実証されている。ＮａｄＡの様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明とともに使用するための好ましいＮａｄＡ抗原は、（ａ）配列番号４に対して５０％またはそれ以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号４の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列（ここで、「ｎ」は、７またはそれ以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号４由来のエピトープを含む。本発明の最も有用なＮａｄＡ抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列の配列番号４からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明とともに使用するための都合のよいＮａｄＡ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。配列番号６は、そのようなフラグメントの１つである。

本発明の組成物は、ＮｓｐＡ抗原を含み得る。このＮｓｐＡ抗原は、遺伝子ＮＭＢ０６６３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２５８８８；本明細書中の配列番号５）として髄膜炎菌のＢ血清群株ＭＣ５８［５８］についての公開ゲノム配列内に含まれていた。この抗原は、参考文献６１および６２によって以前から知られていた。多くの株由来のＮｓｐＡ抗原の配列が、それ以後公開されている。ＮｓｐＡの様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明とともに使用するための好ましいＮｓｐＡ抗原は、（ａ）配列番号５に対して５０％またはそれ以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号５の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列（ここで、「ｎ」は、７またはそれ以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号５由来のエピトープを含む。本発明の最も有用なＮｓｐＡ抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列の配列番号５からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明とともに使用するための都合のよいＮｓｐＡ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。

本発明の組成物は、髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原を含み得る。完全長ＨｍｂＲ配列は、遺伝子ＮＭＢ１６６８（本明細書中の配列番号１２）として髄膜炎菌のＢ血清群株ＭＣ５８［５８］についての公開ゲノム配列内に含まれていた。本発明は、完全長ＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを使用し得るが、しばしば、部分的なＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを使用する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に従って使用されるＨｍｂＲ配列は、配列番号１２に対して少なくともｉ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る（ここで、ｉの値は、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９またはそれ以上である）。他の実施形態において、本発明に従って使用されるＨｍｂＲ配列は、配列番号１２由来の少なくともｊ個連続したアミノ酸のフラグメントを含み得る（ここで、ｊの値は、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上である）。他の実施形態において、本発明に従って使用されるＨｍｂＲ配列は、（ｉ）配列番号１２に対して少なくともｉ％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または（ｉｉ）配列番号１２由来の少なくともｊ個連続したアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を含み得る。ｊ個のアミノ酸の好ましいフラグメントは、配列番号１２由来のエピトープを含む。そのようなエピトープは、通常、ＨｍｂＲの表面上に位置するアミノ酸を含む。有用なエピトープは、ＨｍｂＲがヘモグロビンに結合するのに関わるアミノ酸を含むエピトープを含み、これらのエピトープに結合する抗体は、細菌が宿主のヘモグロビンに結合する能力を阻止し得る。ＨｍｂＲのトポロジーおよび重要な機能性残基は、参考文献６３において調べられた。本発明の最も有用なＨｍｂＲ抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列の配列番号１２からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明とともに使用するための都合のよいＨｍｂＲ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。

本発明の組成物は、ＮｈｈＡ抗原を含み得る。このＮｈｈＡ抗原は、遺伝子ＮＭＢ０９９２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２６２３２；本明細書中の配列番号６）として髄膜炎菌のＢ血清群株ＭＣ５８［５８］についての公開ゲノム配列内に含まれていた。多くの株由来のＮｈｈＡ抗原の配列が、例えば、参考文献５９および６４以後公開されており、ＮｈｈＡの様々な免疫原性フラグメントが報告されている。それは、Ｈｓｆとしても知られる。本発明とともに使用するための好ましいＮｈｈＡ抗原は、（ａ）配列番号６に対して５０％またはそれ以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号６の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列（ここで、「ｎ」は、７またはそれ以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号６由来のエピトープを含む。本発明の最も有用なＮｈｈＡ抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列の配列番号６からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明とともに使用するための都合のよいＮｈｈＡ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。

本発明の組成物は、Ａｐｐ抗原を含み得る。このＡｐｐ抗原は、遺伝子ＮＭＢ１９８５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２７２４６；本明細書中の配列番号７）として髄膜炎菌のＢ血清群株ＭＣ５８［５８］についての公開ゲノム配列内に含まれていた。多くの株由来のＡｐｐ抗原の配列が、それ以後公開されている。Ａｐｐの様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明とともに使用するための好ましいＡｐｐ抗原は、（ａ）配列番号７に対して５０％またはそれ以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号７の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列（ここで、「ｎ」は、７またはそれ以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号７由来のエピトープを含む。本発明の最も有用なＡｐｐ抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列の配列番号７からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明とともに使用するための都合のよいＡｐｐ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。

本発明の組成物は、Ｏｍｐ８５抗原を含み得る。このＯｍｐ８５抗原は、遺伝子ＮＭＢ０１８２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２５４０１；本明細書中の配列番号８）として髄膜炎菌のＢ血清群株ＭＣ５８［５８］についての公開ゲノム配列内に含まれていた。多くの株由来のＯｍｐ８５抗原の配列が、それ以後公開されている。Ｏｍｐ８５についてのさらなる情報は、参考文献６５および６６に見出され得る。Ｏｍｐ８５の様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明とともに使用するための好ましいＯｍｐ８５抗原は、（ａ）配列番号８に対して５０％またはそれ以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号８の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列（ここで、「ｎ」は、７またはそれ以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号８由来のエピトープを含む。本発明の最も有用なＯｍｐ８５抗原は、被験体への投与後に、アミノ酸配列の配列番号８からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合し得る抗体を誘発し得る。本発明とともに使用するための都合のよいＯｍｐ８５抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。

本発明の組成物は、少なくとも１つの髄膜炎菌Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨＢＰ）を含み得る。このｆＨＢＰ抗原は、詳細に特徴づけられている。この抗原は、タンパク質「７４１」［参考文献６０における配列番号２５３５および２５３６］、「ＮＭＢ１８７０」、「ＧＮＡ１８７０」［参考文献６７〜６９］、「Ｐ２０８６」、「ＬＰ２０８６」または「ＯＲＦ２０８６」［７０〜７２］とも呼ばれている。この抗原は、天然にはリポタンパク質であり、すべての髄膜炎菌血清群において発現される。ｆＨＢＰ抗原は、３つの異なるバリアントに分類され［７３］、所与のファミリーに対する血清は、同じファミリー内では殺菌性であるが、他の２つのファミリーのうちの１つを発現する株に対しては活性ではなく、すなわち、ファミリー内の交差保護は存在するが、ファミリー間の交差保護は存在しないことが見出されている。本発明の組成物は、単一のｆＨＢＰバリアントを含み得るが、２つまたは３つのバリアント由来のｆＨＢＰを都合よく含み得る［７３］。本発明とともに使用するための都合のよいｆＨＢＰ抗原は、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。

組成物が、単一のｆＨＢＰバリアントを含む場合、以下のうちの１つを含み得る：
（ａ）第１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド（ここで、第１のアミノ酸配列は、（ｉ）配列番号９に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列および／または（ｉｉ）配列番号９由来の少なくともｘ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む）；
（ｂ）第２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド（ここで、第２のアミノ酸配列は、（ｉ）配列番号１０に対して少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列および／または（ｉｉ）配列番号１０由来の少なくともｙ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む）；
（ｃ）第３のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド（ここで、第３のアミノ酸配列は、（ｉ）配列番号１１に対して少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列および／または（ｉｉ）配列番号１１由来の少なくともｚ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む）。

組成物が、２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む場合、その抗原は、（ｉ）上で定義されたような第１および第２のポリペプチド；（ｉｉ）上で定義されたような第１および第３のポリペプチド；または（ｉｉｉ）上で定義されたような第２および第３のポリペプチドの組み合わせを含み得る。第１および第３のポリペプチドの組み合わせが好ましい。第１および第２のポリペプチドは、第１および第２のアミノ酸配列を含む単一ポリペプチド（融合タンパク質）の一部であり得る。

組成物が、３つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む場合、その抗原は、上で定義されたような第１および第２および第３のポリペプチドの組み合わせを含み得、これらは、第１および第２および第３のアミノ酸配列を含む単一ポリペプチド（融合タンパク質）の一部であり得る。そのような３重のｆＨＢＰ融合タンパク質は、参考文献７４および７５に開示されている（例えば、本明細書中の配列番号１７）。

組成物が、２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む場合、これらは、共通していくつかの配列を共有し得るが、上記の第１、第２および第３のポリペプチドは、異なるｆＨＢＰアミノ酸配列を有する。

上記の第１のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、被験体に投与されると、アミノ酸配列の配列番号９を有する野生型の髄膜炎菌タンパク質（ＭＣ５８）に結合する抗体を含む抗体応答を誘発する。いくつかの実施形態において、これらの抗体の一部または全部は、アミノ酸配列の配列番号１０を有する野生型の髄膜炎菌タンパク質またはアミノ酸配列の配列番号１１を有する野生型の髄膜炎菌タンパク質に結合しない。

上記の第２のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、被験体に投与されると、アミノ酸配列の配列番号１０を有する野生型の髄膜炎菌タンパク質（２９９６）に結合する抗体を含む抗体応答を誘発する。いくつかの実施形態において、これらの抗体の一部または全部は、アミノ酸配列の配列番号９を有する野生型の髄膜炎菌タンパク質またはアミノ酸配列の配列番号１１を有する野生型の髄膜炎菌タンパク質に結合しない。

上記の第３のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、被験体に投与されると、アミノ酸配列の配列番号１１を有する野生型の髄膜炎菌タンパク質（Ｍ１２３９）に結合する抗体を含む抗体応答を誘発する。いくつかの実施形態において、これらの抗体の一部または全部は、アミノ酸配列の配列番号９を有する野生型の髄膜炎菌タンパク質またはアミノ酸配列の配列番号１０を有する野生型の髄膜炎菌タンパク質に結合しない。

いくつかの実施形態において、配列番号９由来の少なくともｘ個連続したアミノ酸のフラグメントは、配列番号１０内にも配列番号１１内にも存在しない。同様に、配列番号１０由来の少なくともｙ個連続したアミノ酸のフラグメントは、配列番号９内にも配列番号１１内にも存在しない場合がある。同様に、配列番号１１由来の少なくともｚ個連続したアミノ酸のフラグメントは、配列番号９内にも配列番号１０内にも存在しない場合がある。いくつかの実施形態において、配列番号９〜１１のうちの１つ由来の前記フラグメントが、他の２つの配列番号に対して連続した配列としてアラインメントされるとき、そのフラグメントとその他の２つの配列番号の各々との間の同一性は、７５％未満、例えば、７０％未満、６５％未満、６０％未満などである。

ａの値は、少なくとも８０、例えば、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９またはそれ以上である。ｂの値は、少なくとも８０、例えば、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９またはそれ以上である。ｃの値は、少なくとも８０、例えば、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９またはそれ以上である。ａ、ｂおよびｃの値は、同じであってもよいし、異なってもよい。いくつかの実施形態において、ａ、ｂおよびｃは、同一である。

ｘの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｙの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｚの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｘ、ｙおよびｚの値は、同じであってもよいし、異なってもよい。いくつかの実施形態において、ｘ、ｙおよびｚは、同一である。

フラグメントは、好ましくは、それぞれの配列番号の配列由来のエピトープを含む。他の有用なフラグメントは、それぞれの配列番号の少なくとも１つのエピトープを保持しつつ、そのそれぞれの配列番号のＣ末端から１つ以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）および／またはＮ末端から１つ以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）を欠く。

いくつかの実施形態において、ｆＨＢＰポリペプチドは、例えば、Ｎ末端のシステインにおいて、脂質付加される。脂質付加されたｆＨＢＰについて、システインに付けられた脂質は、通常、パルミトイル残基を、例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）、Ｎ−アセチル（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）などとして含む。

組成物は、１つより多い髄膜炎菌ポリペプチド抗原を含み得る。例えば、その組成物は、３つのポリペプチドを含み得る：１つは、配列番号１３を含み、１つは、配列番号１４を含み、第３のものは、配列番号１５または２６を含む（参考文献３１および７６を参照のこと）。５つの抗原にわたるこの３つのポリペプチドの組み合わせは、Ｂ血清群髄膜炎菌を防御するために特に都合がよい。代替の組成物は：配列番号１３を含む第１のポリペプチド、配列番号１５を含む第２のポリペプチド、および配列番号１７を含む第３のものを含み得る。代替の組成物は：配列番号１３を含む第１のポリペプチド、配列番号１５を含む第２のポリペプチド、および配列番号１８を含む第３のものを含み得る。代替の組成物は：配列番号１３を含む第１のポリペプチド、配列番号２６を含む第２のポリペプチド、および配列番号１７を含む第３のものを含み得る。代替の組成物は：配列番号１３を含む第１のポリペプチド、配列番号２６を含む第２のポリペプチド、および配列番号１８を含む第３のものを含み得る。

（髄膜炎菌リポオリゴ糖）
組成物は、１つ以上の髄膜炎菌リポオリゴ糖（ＬＯＳ）抗原を含み得る。髄膜炎菌ＬＯＳは、その細菌の外膜の外側の単層に見られるグルコサミンベースのリン脂質である。髄膜炎菌ＬＯＳは、リピドＡ部分およびコアオリゴ糖領域を含み、そのリピドＡ部分は、その膜において疎水性アンカーとして作用する。そのオリゴ糖コア内の不均一性により、異なる髄膜炎菌株の間に構造および抗原性の多様性が生じ、このことは、それらの株を１２種類の免疫型（Ｌ１〜Ｌ１２）に細分するために用いられてきた。本発明は、任意の免疫型由来、例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７および／またはＬ８由来のＬＯＳを使用し得る。

Ｌ２およびＬ３のα鎖は、天然ではラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）を含む。本発明が、Ｌ２またはＬ３免疫型由来のＬＯＳを使用する場合、このＬＮｎＴは、存在しない場合がある。この非存在は、α鎖内のＬＮｎＴテトラサッカライドを合成する能力を破壊するように操作された変異体株を使用することによって、都合よく達成され得る。関連性のある生合成付加に関与する酵素のノックアウトによって、この目標が達成されると知られている［７７，１０７］。例えば、ＬｇｔＢ酵素のノックアウトによって、ＬＮｎＴの末端のガラクトースの付加が妨げられ、ならびにα鎖の末端のシアル酸の下流の付加も妨げられる。ＬｇｔＡ酵素のノックアウトによって、ＬＮｎＴのＮ−アセチル−グルコサミンの付加および下流の付加も妨げられる。ＬｇｔＡノックアウトは、ＬｇｔＣノックアウトに付随してもよい。同様に、ＬｇｔＥおよび／またはＧａｌＥ酵素のノックアウトによって、内部のガラクトースの付加が妨げられ、ＬｇｔＦのノックアウトによって、Ｈｅｐ^Ｉ残基へのグルコースの付加が妨げられる。これらのノックアウトのうちの任意のものが、個々にまたは組み合わせて用いられることにより、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ７またはＬ９免疫型株においてＬＮｎＴテトラサッカライドが破壊され得る。ＬｇｔＢのノックアウトは、ＬＮｎＴエピトープを除去しつつ有用な免疫原性を保持するＬＯＳを提供するので、少なくともＬｇｔＢのノックアウトが好ましい。

ＬＮｎＴエピトープを破壊する変異に加えて、またはその代わりに、ｇａｌＥ遺伝子のノックアウトもまた有用な改変されたＬＯＳを提供する。リピドＡ脂肪トランスフェラーゼ（ｌｉｐｉｄ Ａ ｆａｔｔｙ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子を同様にノックアウトしてもよい［７８］。少なくとも１つの第１のＯ結合脂肪酸が、ＬＯＳから除去され得る［７９］。ＬＯＳ分子１つあたり少数の第２のアシル鎖を有するＬＯＳもまた使用され得る［８０］。そのＬＯＳは、代表的には、少なくともＧｌｃＮＡｃ−Ｈｅｐ_２ホスホエタノールアミン−ＫＤＯ_２−リピドＡ構造を含む［８１］。そのＬＯＳは、ＬＮｎＴテトラサッカライドを欠くのと同時にＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃトリサッカライドを含み得る。

ＬＯＳは、様々な形態で含められ得る。ＬＯＳは、精製された形態そのままで使用され得る。ＬＯＳは、キャリアタンパク質に結合体化され得る。ＬＯＳが結合体化されるとき、結合体化は、ＬＯＳのリピドＡ部分を介して、または他の任意の適当な部分、例えば、そのＫＤＯ残基によって、行われ得る。ＬＯＳのリピドＡ部分が存在しない場合、そのような代替の結合が必要とされる。ＬＯＳに対する結合体化技術は、例えば、参考文献７９、８１、８２、８３などから公知である。これらの結合体についての有用なキャリアタンパク質としては、例えば、細菌トキシン（例えば、ジフテリアトキシンまたは破傷風トキシン）もしくはトキソイドまたはそれらの変異体が挙げられる。

上記ＬＯＳは、参考文献８４に記載されているような固定された（すなわち、相が変わりやすくない）ＬＯＳ免疫型を有する株（例えば、遺伝子操作された髄膜炎菌株）由来であり得る。例えば、Ｌ２およびＬ３のＬＯＳ免疫型が、固定され得る。そのような株は、元の野生型株と比べて２倍超（＞５０倍も）低い免疫型間のスイッチングの割合を有し得る。参考文献８４には、ｌｇｔＡおよび／またはｌｇｔＧ遺伝子産物の改変によって、どのようにしてこの結果が達成され得るかが開示されている。

ＬＯＳは、例えばＬ３の場合、そのヘプトースＩＩ残基に付けられたＧｌｃＮａｃ残基においてＯ−アセチル化され得る［８５］。

免疫原性組成物は、１タイプより多いＬＯＳ、例えば、髄膜炎菌免疫型Ｌ２およびＬ３由来のＬＯＳを含み得る。例えば、参考文献８６に開示されているＬＯＳの組み合わせが使用され得る。

ＬＯＳ抗原は、好ましくは、被験体への投与後に、殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発し得る。

（膜小胞）
組成物は、髄膜炎菌の外膜小胞を含み得る。これらの外膜小胞には、髄膜炎菌の外膜の破壊または髄膜炎菌の外膜からのブレブ形成（ｂｌｅｂｂｌｉｎｇ）（これらから、外膜のタンパク質構成要素を含む小胞を形成する）によって得られる任意のプロテオリポソーム（ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｉｃ）小胞が含まれる。したがって、この用語は、ＯＭＶ（時折「ブレブ」と称される）、微小胞（ＭＶ［８７］）および「ネイティブＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」［８８］）を包含する。

ＭＶおよびＮＯＭＶは、細菌増殖中に自然に形成して培養液中に放出される天然に存在する膜小胞である。ＭＶは、ブロス培養液中でＮｅｉｓｓｅｒｉａを培養し、そのブロス培養液中のより小さいＭＶから細胞全体を分離し（例えば、濾過によって、またはより小さい小胞ではなく細胞だけをペレットにする低速遠心分離によって）、次いで、その細胞枯渇培地からＭＶを収集することによって（例えば、濾過によって、ＭＶの差次的沈殿または凝集によって、ＭＶをペレットにする高速遠心分離によって）得ることができる。ＭＶを生成する際に使用するための株は、通常、培養液中に生成されるＭＶの量に基づいて選択され得、例えば、参考文献８９および９０には、ＭＶを多く生成するＮｅｉｓｓｅｒｉａが記載されている。

ＯＭＶは、細菌から人工的に調製され、洗浄剤処理（例えば、デオキシコレートを用いた処理）を用いて、または非洗浄剤手段（例えば、参考文献９１を参照のこと）によって、調製され得る。ＯＭＶを形成するための手法としては、洗浄剤が沈殿しないように十分に高いｐＨにおいて［９４］、胆汁酸塩洗浄剤（例えば、リトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、コール酸、ウルソコール酸（ｕｒｓｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）などの塩、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａを処理するためにはデオキシコール酸ナトリウム［９２および９３］が好ましい）で細菌を処理することが挙げられる。他の手法は、超音波処理、均質化、マイクロフルイダイゼーション（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）、キャビテーション、浸透圧ショック、粉砕、フレンチプレス、調合などのような手法を用いて、実質的に洗浄剤の非存在下において［９１］行われ得る。洗浄剤を用いないかまたは少量の洗浄剤を用いる方法によって、ＮｓｐＡなどの有用な抗原が保持され得る［９１］。したがって、ある方法は、約０．５％のデオキシコレートまたはそれより低い、例えば、約０．２％、約０．１％、＜０．０５％またはゼロのデオキシコレートを含むＯＭＶ抽出緩衝液を使用し得る。

ＯＭＶ調製のための有用なプロセスは、参考文献９５に記載されており、高速遠心分離の代わりに粗ＯＭＶに対する限外濾過を含む。そのプロセスは、限外濾過を行った後の超遠心分離工程を含み得る。

本発明とともに使用するための小胞は、任意の髄膜炎菌株から調製され得る。その小胞は、通常、血清群Ｂ株由来であるが、その小胞をＢ以外の血清群（例えば、Ａ、Ｃ、Ｗ１３５またはＹ）から調製することも可能である（例えば、参考文献９４には、血清群Ａについてのプロセスが開示されている）。その株は、任意の血清型（例えば、１、２ａ、２ｂ、４、１４、１５、１６など）、任意の血清亜型および任意の免疫型（例えば、Ｌ１；Ｌ２；Ｌ３；Ｌ３，３，７；Ｌ１０；など）であってよい。その髄膜炎菌は、超侵襲性および超毒性の系統をはじめとした任意の適当な系統、例えば、以下の７つの超毒性の系統：サブグループＩ；サブグループＩＩＩ；サブグループＩＶ−１；ＥＴ−５複合体；ＥＴ−３７複合体；Ａ４クラスター；系統３のうちのいずれかに由来し得る。これらの系統は、多座位酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）によって定義されているが、多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）を使用することによっても髄膜炎菌は分類されている［参考文献９６］（例えば、ＥＴ−３７複合体は、ＭＬＳＴによってＳＴ−１１複合体であり、ＥＴ−５複合体は、ＳＴ−３２（ＥＴ−５）であり、系統３は、ＳＴ−４１／４４であるなど）。小胞は、以下のサブタイプ：Ｐ１．２；Ｐ１．２，５；Ｐ１．４；Ｐ１．５；Ｐ１．５，２；Ｐ１．５，ｃ；Ｐ１．５ｃ，１０；Ｐ１．７，１６；Ｐ１．７，１６ｂ；Ｐ１．７ｈ，４；Ｐ１．９；Ｐ１．１５；Ｐ１．９，１５；Ｐ１．１２，１３；Ｐ１．１３；Ｐ１．１４；Ｐ１．２１，１６；Ｐ１．２２，１４のうちの１つを有する株から調製され得る。

本発明とともに使用される小胞は、野生型の髄膜炎菌株または変異体の髄膜炎菌株から調製され得る。例えば、参考文献９７には、改変されたｆｕｒ遺伝子を有するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから得られる小胞の調製法が開示されている。参考文献１０５には、ｐｏｒＡとｃｐｓを共にノックアウトすることによってｎｓｐＡ発現がアップレギュレートされるであろうことが教示されている。ＯＭＶ生成のためのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのさらなるノックアウト変異体が、参考文献１０５〜１０７に開示されている。参考文献９８には、ｆＨＢＰがアップレギュレートされている小胞が開示されている。参考文献９９には、６つの異なるＰｏｒＡサブタイプを発現するように改変された株からの小胞の構築が開示されている。ＬＰＳ生合成に関わる酵素のノックアウトによって達成された低エンドトキシンレベルの変異体Ｎｅｉｓｓｅｒｉａもまた使用され得る［１００，１０１］。これらまたは他の変異体のすべてが、本発明とともに使用され得る。

したがって、本発明とともに使用される株は、いくつかの実施形態において、１つより多いＰｏｒＡサブタイプを発現し得る。６価および９価のＰｏｒＡ株が、以前に構築されている。その株は、ＰｏｒＡサブタイプ：Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．１９，１５−１；Ｐ１．５−２，１０；Ｐ１．１２−１，１３；Ｐ１．７−２，４；Ｐ１．２２，１４；Ｐ１．７−１，１および／またはＰ１．１８−１，３，６のうちの２、３、４、５、６、７、８または９つを発現し得る。他の実施形態において、ある株は、ＰｏｒＡ発現についてダウンレギュレートされている可能性があり、例えば、ここで、ＰｏｒＡの量は、野生型のレベルと比べて（例えば、参考文献１０８に開示されているようなＨ４４／７６株と比べて）、少なくとも２０％（例えば、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％など）減少しているか、またはさらにノックアウトされている。

いくつかの実施形態において、ある株は、ある特定のタンパク質を高発現し得る（対応する野生型の株と比べて）。例えば、ある株は、ＮｓｐＡ、タンパク質２８７［１０２］、ｆＨＢＰ［９８］、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［１０３］、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ［１０３］、ＨｍｂＲなどを高発現し得る。

いくつかの実施形態において、ある株は、参考文献１０４〜１０７に開示されているノックアウト変異および／または高発現変異のうちの１つ以上を含み得る。ダウンレギュレーションおよび／またはノックアウトのための好ましい遺伝子としては：（ａ）Ｃｐｓ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［１０４］；（ｂ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｈｏＰ、ＰｉｌＣ、ＰｍｒＥ、ＰｍｒＦ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［１０５］；（ｃ）ＥｘｂＢ、ＥｘｂＤ、ｒｍｐＭ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＧａｌＥ、ＬｂｐＡ、ＬｐｂＢ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［１０６］；ならびに（ｄ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＯｐＡ、ＯｐＣ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＤ、ＳｙｎＡ、ＳｙｎＢおよび／またはＳｙｎＣ［１０７］が挙げられる。

変異株が使用される場合、いくつかの実施形態において、その変異株は、以下の特徴のうちの１つ以上またはすべてを有し得る：（ｉ）髄膜炎菌ＬＯＳを切断する（ｔｒｕｎｃａｔｅ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＬｇｔＢおよび／またはＧａｌＥ；（ｉｉ）アップレギュレートされたＴｂｐＡ；（ｉｉｉ）アップレギュレートされたＮｈｈＡ；（ｉｖ）アップレギュレートされたＯｍｐ８５；（ｖ）アップレギュレートされたＬｂｐＡ；（ｖｉ）アップレギュレートされたＮｓｐＡ；（ｖｉｉ）ノックアウトされたＰｏｒＡ；（ｖｉｉｉ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＦｒｐＢ；（ｉｘ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＯｐａ；（ｘ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＯｐｃ；（ｘｉｉ）欠失させられたｃｐｓ遺伝子複合体。切断されたＬＯＳは、シアリル−ラクト−Ｎ−ネオテトラオースエピトープを含まないＬＯＳであり得、例えば、それは、ガラクトース欠損ＬＯＳであり得る。そのＬＯＳは、α鎖を有しないことがある。

ＬＯＳが小胞内に存在する場合、そのＬＯＳおよびタンパク質構成要素を連結するようにその小胞を処理することが可能である（「ブレブ内（ｉｎｔｒａ−ｂｌｅｂ）」結合体化［１０７］）。

本発明は、異なる株由来の小胞の混合物とともに使用され得る。例えば、参考文献１０８には、多価の髄膜炎菌小胞組成物を含むワクチンが開示されており、そのワクチンは、使用する国で流行している血清亜型を有する髄膜炎菌株に由来する第１の小胞、および使用する国において流行している（ｐｒｅｖｅｎｔ）血清亜型を必ずしも有していない株に由来する第２の小胞を含む。参考文献１０９もまた、種々の小胞の有用な組み合わせを開示している。Ｌ２およびＬ３免疫型の各々における株由来の小胞の組み合わせが、いくつかの実施形態において使用され得る。

（吸着）
アルミニウム塩アジュバントは吸着性であり、すなわち、免疫原は、種々の機序によってその塩に吸着され得る。しかしながら、いくつかの状況では、免疫原とアルミニウム塩アジュバントの両方が、その免疫原固有の特性によって、または処方中に行われる工程（例えば、吸着が生じるのを防ぐ処方中の適切なｐＨの使用）によって、吸着せずに組成物に存在し得る。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性ポリマーとの好ましい複合体もまた吸着性である。

それゆえ、アルミニウム塩と複合体との混合物において、免疫原に対する複数の吸着機会が存在し得る：免疫原は、アルミニウム塩、オリゴヌクレオチド／ポリマー複合体、その両方（様々な比率で）に吸着し得るか、またはいずれにも吸着しない。本発明は、そのようなすべての準備を包含する。例えば、１つの実施形態において、免疫原は、アルミニウム塩に吸着され得、次いで、吸着された免疫原／塩は、オリゴヌクレオチド／ポリマー複合体と混合され得る。別の実施形態では、免疫原は、オリゴヌクレオチド／ポリマー複合体に吸着され得、次いで、吸着された免疫原／複合体は、アルミニウム塩と混合され得る。別の実施形態では、２つの免疫原（同じまたは異なる）が、別々にオリゴヌクレオチド／ポリマー複合体およびアルミニウム塩に吸着され得、次いで、その吸着された２つの構成要素が、混合され得る。

いくつかの状況において、免疫原は、例えば、ｐＨもしくは温度の変化によって、または構成要素の混合後に、その吸着状態を変化させ得る。インビトロ［１１０］およびインビボ［１１１］におけるアルミニウム塩からの抗原の脱着が知られている。１つの吸着性粒子からの脱着の後に異なる吸着性粒子への再吸着が生じることにより、例えば、アルミニウム塩アジュバントから複合体への免疫原の移動またはその逆が生じ得る。いくつかの実施形態において、単一の抗原分子または複合体が、アルミニウム塩と複合体の両方に吸着され得ることにより、それら２つの吸着性粒子間が架橋され得る。

免疫原が、吸着性の構成要素に吸着する場合、その免疫原のすべてが吸着する必要はない。吸着相と可溶性の相との間の免疫原の固有の平衡状態を理由に、または吸着性の表面が飽和されていることで、この状況が生じ得る。ゆえに、組成物中の免疫原は、完全にまたは部分的に吸着され得、その吸着された画分は、１つ以上の異なる吸着性構成要素（例えば、アルミニウム塩および／またはオリゴヌクレオチド／ポリマー複合体）上に存在し得る。この状況において、吸着された画分は、その組成物中の免疫原の総量の少なくとも１０（重量）％、例えば、＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９８％またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態において、免疫原は、完全に吸着され、すなわち、バルク液体媒質から複合体を分離する遠心分離後の上清中に検出可能なものはない。しかし、他の実施形態において、特定の免疫原が、吸着されない場合がある。

いくつかの状況において、複合体の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはポリカチオン性ポリマー構成要素が、アルミニウム塩に吸着し得る可能性がある。しかし、好ましくは、その複合体は、アルミニウム塩と混合された後もインタクトのままである。また、複合体がアルミニウム塩に吸着する（およびその逆）のを回避するために、そのアルミニウム塩および複合体が、類似のゼロ電荷点（等電点）（例えば、互いに１ｐＨ単位以内）を有することが有用である。したがって、有用な複合体は、１０〜１２のＰＺＣを有し、これは、約１１のＰＺＣを有する水酸化アルミニウムアジュバントと組み合わせるために有用である。

（組成物またはキット構成要素のパッケージング）
本発明のアジュバント組成物、免疫原性組成物およびキット構成要素に適した容器としては、バイアル、注射器（例えば、使い捨て注射器）などが挙げられる。これらの容器は、滅菌されているべきである。それらの容器は、一緒にパッケージングされることにより、例えば同じ箱に入れられた、キットを形成し得る。

ある構成要素が、バイアルに入れられている場合、そのバイアルは、ガラス材料またはプラスチック材料で作製されたものであり得る。そのバイアルは、好ましくは、それに組成物が加えられる前に滅菌される。ラテックス感受性の被験体に関連する問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックスフリーの栓で密閉され、すべてのパッケージング材料にラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは、単一用量のワクチンを含んでもよいし、１より多い用量（「マルチドーズ」バイアル）、例えば１０用量を含んでもよい。有用なバイアルは、無色ガラスで作製されたものである。ホウケイ酸ガラスが、ソーダ石灰ガラスよりも好ましい。バイアルは、ブチルゴムで作製された栓を有し得る。

バイアルは、注射器がキャップに挿入され得るように適合されたキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有し得る。バイアルのキャップは、シールまたはカバーの内側に位置し得、そのシールまたはカバーは、キャップに到達し得る前に除去されなければならない。バイアルは、特にマルチドーズバイアルの場合、その内容物を無菌的に取り出すことを可能にするキャップを有し得る。

構成要素が注射器にパッケージングされる場合、その注射器は、それに取り付けられた針を有し得る。針が取り付けられていない場合、別個の針が、組み立ておよび使用のためにその注射器とともに供給され得る。そのような針は、さやに納められていることがある。注射器におけるプランジャーは、そのプランジャーが吸引中に誤って外れるのを防ぐために、ストッパーを有し得る。その注射器は、ラテックスゴムのキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨て注射器は、単一用量のワクチンを含む。その注射器は、通常、針が取り付けられる前に先端を密閉する先端キャップを有し、その先端キャップは、ブチルゴムで作製されていることがある。その注射器および針が別個にパッケージングされている場合、その針は、好ましくは、ブチルゴム保護物に取り付けられている。有用な注射器は、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」^ＴＭとして販売されている注射器である。

容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半用量の容積を示すマークが付けられていることがある。例えば、０．５ｍｌ用量を含む注射器が、０．２５ｍｌ容積を示すマークを有することがある。

材料を移す際にいかなる非効率さがあろうとも完全な最終用量容積が得られるように、被験体への投与に必要とされる材料よりも多い材料を含むことが、複数構成要素製品では通常である。したがって、個別の容器が、例えば、５〜２０容積％過剰な充填（ｏｖｅｒｆｉｌｌ）を含み得る。

（処置方法および免疫原性組成物の投与）
本発明の組成物は、ヒト被験体への投与に適しており、本発明は、本発明の免疫原性組成物を被験体に投与する工程を包含する、被験体において免疫応答を惹起する方法を提供する。

本発明はまた、本発明のキットの容器の内容物を混合する工程、およびその混合された内容物を被験体に投与する工程を包含する、被験体において免疫応答を惹起する方法を提供する。

本発明はまた、例えば、被験体において免疫応答を惹起する際に使用するための、医薬として使用するための本発明の組成物またはキットも提供する。

本発明はまた、被験体において免疫応答を惹起するための医薬を製造する際のアルミニウム塩、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーの使用も提供する。この医薬は、免疫原と組み合わせて投与され得る。

本発明はまた、被験体において免疫応答を惹起するための医薬を製造する際のアルミニウム塩、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ポリカチオン性ポリマーおよび免疫原の使用も提供する。

これらの方法および使用は、通常、抗体応答、好ましくは、防御性の抗体応答をもたらすために用いられる。

本発明の組成物は、様々な方法で投与され得る。通常の免疫化経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚への注射）によるものであるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻腔内、経口、頬側、舌下、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）などが挙げられる。

本発明に従って調製される免疫原性組成物は、小児と成人の両方を処置するワクチンとして使用され得る。被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であり得る。これらのワクチンを受ける被験体は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳および好ましくは、≧６５歳）、幼若者（例えば、≦５歳）、入院している被験体、医療従事者、軍人および兵士、妊娠中の女性、慢性疾患患者、免疫不全被験体、外国渡航者などであり得る。アルミニウム塩アジュバントは、乳児の集団において日常的に使用されており、ＩＣ３１^ＴＭもまた、この年齢群において有効である［２２，１１２］。しかしながら、上記ワクチンは、これらの群に対してのみ適しているのではなく、より一般的に集団において使用され得る。

処置は、単回投与スケジュールまたは複数投与スケジュールによるものであり得る。複数投与は、初回の免疫化スケジュールおよび／または追加の免疫化スケジュールにおいて用いられ得る。複数投与スケジュールでは、同じ経路または異なる経路によって、例えば、初回は非経口、追加は経粘膜、初回は経粘膜、追加は非経口などによって、様々な投与が行われ得る。１回より多い（代表的には、２回の）投与が、免疫学的にナイーブな被験体において特に有用である。複数投与は、代表的には、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１２週間、約１６週間など）あけて投与される。

（一般）
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、もっぱらＸからなり得るか、または追加のもの、例えば、Ｘ＋Ｙを含み得る。

単語「実質的に」は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない可能性がある。必要ならば、単語「実質的に」は、本発明の定義から省略されてもよい。

数値ｘに関する用語「約」は、随意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。

具体的に述べられていない限り、２つ以上の構成要素を混合する工程を包含するプロセスは、任意の特定の混合順序を要求しない。したがって、構成要素は、任意の順序で混合され得る。３つの構成要素が存在する場合、２つの構成要素が互いに組み合わされ得、次いで、その組み合わされたものが、第３の構成要素と組み合わされ得るなど。

動物（特に、ウシ）の材料が、細胞の培養において使用される場合、それらは、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得るべきである。総じて、動物由来の材料が全く存在しない状況で細胞を培養することが好ましい。

化合物が組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代わりに、適当なプロドラッグによって置き換えられてもよい。

再集合（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）もしくは逆遺伝学の手順またはウイルス増殖のために細胞培養基が使用される場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ Ｅｕｒの総則５．２．３章におけるように、ヒトワクチンの作製において使用が認められたものである。

いくつかの実施形態において、本発明は、アミノ酸配列の配列番号１６［１１３］を含む免疫原を含む組成物を含まないかまたは使用しない。アミノ酸配列の配列番号１６を含む免疫原が組成物中に存在する実施形態において、アルミニウム塩は、代表的には、水酸化アルミニウムであり得、そして／またはその組成物は、少なくとも１つのさらなるおよび異なる髄膜炎菌免疫原を含み得る。

（本発明を実施するための様式）
（アジュバント）
水酸化アルミニウムアジュバント懸濁物を、標準的な方法によって調製する。ＩＣ３１複合体を、参考文献１９に開示されているように調製した。水酸化アルミニウムアジュバントをＩＣ３１複合体と混合することによって、アジュバント組み合わせを作製した。その個別のアジュバント（Ａｌ−Ｈ、ＩＣ３１）およびそれらの混合物（Ａｌ−Ｈ＋ＩＣ３１）は、様々な病原体由来の抗原と組み合わされて、様々な動物モデルにおいて試験されている。Ａｌ−Ｈ、ＩＣ３１および抗原の様々な混合順序が用いられている。

今までに試験された抗原は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｗ１３５／Ｙ、腸外病原性大腸菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、ＲＳウイルスおよびＳ．ａｕｒｅｕｓを含む病原体に由来する。これらの研究では、主にポリペプチド抗原が使用されていたが、サッカライド抗原（髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹならびにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ）も使用された。

（髄膜炎菌（ｉ））
参考文献３１に開示されている「５ＣＶＭＢ」ワクチンを構成する３つのポリペプチドを、アジュバントとしての水酸化アルミニウムおよび／またはＩＣ３１とともに用いた。コードされるポリペプチドは、アミノ酸配列の配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５を有する（参考文献３１および７６を参照のこと）。

第１の実験セットでは、９群のマウスに１０μｇの抗原、３ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムおよび様々な用量のＩＣ３１を投与した。群に、以下の９つの組成物を投与し、群７〜９には、１〜６と同じであるが異なって処方された抗原を投与した。

^＊標準的なＩＣ３１懸濁物を使用した。この懸濁物の１００μｌが完全な強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）を与えた。より少ない容積は、より低い強度を与えた。より低い強度の組成物に対しては容積を保つために、緩衝液を１００μｌまで加えた。

それらのマウスからの血清を、髄膜炎菌株のパネルに対して殺菌性の活性について試験した。

６つの異なる株Ａ〜Ｆに対する実験ＭＰ０３からの殺菌性の力価は、以下のとおりだった。

このように、唯一のアジュバントとしてＡｌ−Ｈを用いて得られた力価（群５）は、様々な比でＩＣ３１を加えることによってパネル全体にわたって概して改善された（群１〜４）。異なる抗原の処方において同じ効果が見られた（群７および８を比較のこと）。

より広範囲のパネルに対するさらなる研究から、ＩＣ３１を加えることにより、Ａｌ−Ｈ単独で使用したときと比べて、力価が改善されることが確かめられた。例えば、１６個の株のパネル（上記のＡ〜Ｆを含む）に対する群１、３および５由来の血清を用いたときの殺菌性の力価は、以下のとおりであり、群５内の株の５０％が、≧１：１０２４の力価を有したが、群１および３では５６．２５％だった。

上記９つの組成物をｐＨおよび重量オスモル濃度について試験した。組成物１〜５、７および８については、ｐＨは、６．２〜６．６の範囲内であり；組成物６および９は、６．９〜７．３の範囲のわずかに高いｐＨを有した。すべての組成物の重量オスモル濃度は、２８０〜３３０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内だった。

上記組成物の上清および抗原を脱着するように処理された組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、抗原が、Ａｌ−Ｈ単独と同様にＡｌ−Ｈ＋ＩＣ３１の混合物に吸着したこと：Ａｌ−Ｈを含むすべての組成物について、９４〜１００％の各抗原が吸着されたことが示された。

（髄膜炎菌（ｉｉ））
ＩＩ−ＩＩＩ−Ｉの順でｆＨＢＰの３つのバリアントを含む３重融合ポリペプチド（参考文献１７に開示されているような；本明細書中の配列番号１７）を、アジュバントとしての水酸化アルミニウムおよび／またはＩＣ３１とともに用いた。

第１の実験セットでは、６群のマウスに２０μｇの抗原（精製タグありまたはなし）、３ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムおよび１００μｌのＩＣ３１を投与した。群に以下を投与した。

それらのマウスからの血清を、髄膜炎菌株のパネルに対して殺菌性の活性について試験した。

実験ＭＰ０５からの殺菌性の力価を、株のパネル（合計２５個）に対して再度試験した。群５（Ａｌ−Ｈ、タグなし）における株の６４％が、≧１：１２８の力価を有し、３６％が、≧１：１０２４の力価を有したが、ＩＣ３１を加えることによって（群３）、これらの数字がそれぞれ７６％および５６％まで上昇した。同様に、群６（Ａｌ−Ｈ、タグ）における株の７６％が、≧１：１２８の力価を有し、６４％が、≧１：１０２４の力価を有したが、ＩＣ３１を加えることによって（群４）、これらの数字がそれぞれ８０％および６８％まで上昇した。２３／２５株について、群３において力価は、群５と同じであるかまたは群５よりも良く；２２／２５株について、群４において力価は、群６と同じであるかまたは群６よりも良かった。ＮＭ００８株およびＭ４２８７株に対して特に良好な改善が見られ、ここで、≦１：３２という非常に低い力価が、１：２５６〜１：４０９６に改善された。

タグを含まない組成物（１、３および５）をｐＨおよび重量オスモル濃度について試験した。そのｐＨは、６．８７〜７．００の範囲内だった。重量オスモル濃度は、３０２〜３０８ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内だった。

上記タグを含まない組成物（１、３および５）の上清および抗原を脱着するように処理された組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、抗原が、Ａｌ−Ｈ単独と同様にＡｌ−Ｈ＋ＩＣ３１の混合物に吸着することが示された。

さらなる免疫原性実験は、同じ群分けおよび株パネルを用いて、実験ＭＰ０４においてＮａｄＡおよび２８７−９５３抗原（配列番号１３および１５）とともにｆＨＢＰ_{ＩＩ−ＩＩＩ−Ｉ}抗原を使用した。群４における力価は、２４／２５株について群６と同じであるかまたは群６よりも良く；２４／２５株についても力価は、群３において群５と同じであるかまたは群５よりも良かった。血清が少なくとも１：１２８の殺菌性の力価を有する株の比率は、群１〜４、群６の各々において１００％だったが、群５では８４％でしかなかった。しかしながら、≧１：１０２４というより厳しい閾値の場合、群１〜４由来の血清が、株の８８％に対して殺菌性であった一方で、その比率は、群６では８０％および群５では５６％でしかなかった。したがって、唯一のアジュバントとしてＡｌ−Ｈを用いて得られた抗髄膜炎菌免疫応答は、ＩＣ３１を加えることによって上記パネル全体に対して概して改善された。

（髄膜炎菌（ｉｉｉ））
参考文献１１３には、以下のものをはじめとしたｆＨＢＰの様々な改変型が開示されている：
ＰＡＴＣＨ＿２Ｓ（本明細書中の配列番号１９）
ＰＡＴＣＨ＿５ｂｉｓ（本明細書中の配列番号２０）
ＰＡＴＣＨ＿５ｐｅｎｔａ（本明細書中の配列番号２１）
ＰＡＴＣＨ＿９Ｃ（本明細書中の配列番号１６）
ＰＡＴＣＨ＿１０Ａ（本明細書中の配列番号２２）。

これらの改変された５つのｆＨＢＰタンパク質、ならびにＰＡＴＣＨ＿９Ｆおよび２９９６株由来の野生型の配列を、マウスを免疫するために水酸化アルミニウム（Ａｌ−Ｈ）、Ａｌ−Ｈ＋ＩＣ３１、またはＩＣ３１単独とともに使用した。１０個の異なる髄膜炎菌株のパネルに対して血清を試験した。１０個すべての株に対する力価が、ＰＡＴＣＨ＿５ＢおよびＰＡＴＣＨ＿９Ｃ配列について、Ａｌ−Ｈ＋ＩＣ３１群において、Ａｌ−Ｈ群とＩＣ３１群の両方と同程度に良好であるかまたはそれらの群よりも高かった。

より通常では、本発明は、参考文献１１３からの配列番号１〜８０のうちのいずれか１つを含むタンパク質とともに使用され得る。

ＰＡＴＣＨ＿９Ｃおよび／またはＰＡＴＣＨ＿１０Ａおよび／または野生型ＭＣ５８ ｆＨＢＰ配列（配列番号３を含む）および／または９３６抗原（配列番号２３を含む）を含む融合タンパク質を用いて試験したときもまた、Ａｌ−Ｈ＋ＩＣ３１の組み合わせが、Ａｌ−Ｈ単独よりも良好な結果をもたらした（例えば、２コピーのＰＡＴＣＨ＿１０Ａ（配列番号１８）に融合された９３６を含む融合タンパク質を用いたときに、Ａｌ−Ｈを用いたときの１／１０株だけに対する効力が、９／１０株に対する効力に変換された）。

９３６−１０Ａ−１０Ａ配列または９３６−９Ｃ−１０Ａ配列（配列番号２５）を用いたときの、１０個の株のパネルに対する殺菌性の力価は、以下だった。

したがって、ＩＣ３１を加えることにより、１つだけを例外として、力価が改善された。

９３６−１０Ａ−１０Ａおよび９３６−９Ｃ−１０Ａポリペプチドは、Ａｌ−Ｈ＋ＩＣ３１の処方において完全に吸着されることが確かめられた。

さらなる研究において、９３６−１０Ａ−１０Ａポリペプチドを、９ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌおよび１０ｍＭヒスチジン，ｐＨ６．５を含む組成物においてＡｌ−Ｈとともに処方した。注射用水およびヒスチジン緩衝液を混合し、次いで、ＮａＣｌを加えることにより、３０８ｍＯｓｍ／ｋｇという最終的な重量オスモル濃度が得られた。Ａｌ−Ｈを加えることにより、３ｍｇ／ｍｌという最終的なＡｌ^＋＋＋濃度が得られた。１００μｇ／ｍｌという最終濃度を得るために上記ポリペプチドを加え、室温で撹拌しながら１５分間放置し、次いで、４℃で一晩保存した。投与の直前に、ＩＣ３１（ペプチド：ＤＮＡの２５：１モル比、１μｍｏｌのペプチドを含む）を水性懸濁物として加え、等容積を混合した。最終的な混合物は、等張性であり、生理学的ｐＨだった。ポリペプチドの吸着は、＞９０％だった（Ａｌ−Ｈ単独において見られたレベルと類似）。

１群あたり８匹の動物（６週齢のＣＤ１雌性マウス）に、０日目に２０μｇのアジュバントが加えられたポリペプチドを腹腔内投与し、２１および３５日目に追加投与を行った。分析用の血液サンプルを４９日目に採取し、ウサギまたはヒトの補体の存在下において、１１個の髄膜炎菌株のパネルに対する殺菌アッセイによって分析した。力価は、以下のとおりだった。

９３６−１０Ａ−１０ＡポリペプチドがＣ末端にヘキサヒスチジンタグを有しても有さなくても（配列番号１８対２４）、同様の結果が見られた。

その９３６−１０Ａ−１０Ａポリペプチドを５ＣＶＭＢ由来の「９３６−７４１」ポリペプチドの代わりに用いることにより、配列番号１３、１５および１８／２４のアミノ酸配列を有する３つのポリペプチドの混合物が得られた。殺菌性の力価は類似であり、ヒスチジンタグを有しないポリペプチドを用いたときにわずかに優れていた。

９３６−１０Ａ−１０Ａポリペプチドを単独でまたは５ＣＶＭＢ混合物からの他のポリペプチドと組み合わせて使用するとき、Ａｌ−Ｈ＋ＩＣ３１混合物は、Ａｌ−Ｈ単独、ＩＣ３１単独またはＭＦ５９と比べて、最も良好な殺菌性株の適用範囲をもたらした。

（髄膜炎菌（ｉｖ））
参考文献３１に開示されている「５ＣＶＭＢ」ワクチンを構成する３つのポリペプチドを、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに対する髄膜炎菌結合体の四価の混合物と組み合わせた。その混合物を、アジュバントとしてのＡｌ−Ｈおよび／またはＩＣ３１（高濃度または低濃度）とともに用いた。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの各々由来の１つの株を用いたとき、パネルに対する殺菌性の力価は、以下のとおりだった。

このように、水酸化アルミニウムをＩＣ３１と組み合わせて使用したとき、血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹに対する最も良好な力価が見られた。

（大腸菌）
大腸菌のＡｃｆＤタンパク質（元々は、参考文献４５において配列番号３５２６として開示された；参考文献４４もまた参照のこと）は、有用な免疫原である。この抗原は、様々なアジュバントと組み合わせて、単独でまたは組み合わせてマウスを免疫するために使用された。次いで、免疫化されたマウスを致死量の大腸菌でチャレンジし、生存を評価する。コントロール群における生存は、０〜２５％の範囲であったのに対し、アジュバント添加ＡｃｆＤで免疫した／チャレンジした後の生存は、以下のとおりだった。

このように、最も良好な結果は、Ａｌ−ＨとＩＣ３１との組み合わせにおいて見られた。

防御は、感染動物の血液中の細菌量の減少と相関した。

本発明が例としてのみ記載されていること、および本発明の範囲内および精神内に留まりつつ改変が行われ得ることが、理解されるだろう。

いくつかの実施形態において、本発明は、アミノ酸配列の配列番号１６［１１３］を含む免疫原を含む組成物を含まないかまたは使用しない。アミノ酸配列の配列番号１６を含む免疫原が組成物中に存在する実施形態において、アルミニウム塩は、代表的には、水酸化アルミニウムであり得、そして／またはその組成物は、少なくとも１つのさらなるおよび異なる髄膜炎菌免疫原を含み得る。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
（ｉ）アルミニウム塩、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含む免疫学的アジュバントであって、ここで、該オリゴヌクレオチドおよび該ポリマーは、互いに会合することにより複合体を形成する、免疫学的アジュバント；ならびに
（ｉｉ）細菌性疾患または真菌性疾患を防御する免疫応答を誘発する免疫原
を含む、免疫原性組成物。
（項目２） アルミニウム塩、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含む免疫学的アジュバントであって、ここで、該オリゴヌクレオチドおよび該ポリマーは、互いに会合することにより複合体を形成する、免疫学的アジュバント。
（項目３） 上記アルミニウム塩が、水酸化アルミニウムである、項目２に記載のアジュバント。
（項目４） 上記アルミニウム塩が、リン酸アルミニウムである、項目２に記載のアジュバント。
（項目５） 上記オリゴヌクレオチドが、一本鎖であり、１０ヌクレオチドから１００ヌクレオチドを有する、項目２から４のいずれか１項に記載のアジュバント。
（項目６） 上記オリゴヌクレオチドが、５’−（ＩＣ） _１３ −３’である、項目５に記載のアジュバント。
（項目７） 上記ポリカチオン性ポリマーが、ペプチドである、項目２から６のいずれか１項に記載のアジュバント。
（項目８） 上記ペプチドが、１つ以上のＬｅｕ−Ｌｅｕジペプチド配列、１つ以上のＬｙｓ−Ｌｙｓジペプチド配列、および／または１つ以上のＡｒｇ−Ａｒｇジペプチド配列を含む、項目７に記載のアジュバント。
（項目９） 上記ペプチドが、１つ以上のＬｙｓ−Ｌｅｕジペプチド配列、および／または１つ以上のＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含む、項目７または項目８に記載のアジュバント。
（項目１０） 上記ペプチドが、５アミノ酸から５０アミノ酸を有する、項目７〜９のいずれかに記載のアジュバント。
（項目１１） 上記ペプチドが、アミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫを有する、項目１０に記載のアジュバント。
（項目１２） 上記オリゴヌクレオチドおよび上記ポリマーが、モル比１：２５で存在する、項目２から１１のいずれか１項に記載のアジュバント。
（項目１３） 上記アルミニウム塩および上記複合体の両方が、１μｍ〜２０μｍの平均粒子直径を有する微粒子である、項目２から１２のいずれか１項に記載のアジュバント。
（項目１４） 上記アジュバントが、滅菌されている、項目２から１３のいずれか１項に記載のアジュバント。
（項目１５） 項目１４に記載のアジュバントを調製するためのプロセスであって、該プロセスは：免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを濾過滅菌する工程；該濾過滅菌された免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを滅菌条件下において混合することにより、滅菌複合体を形成する工程；および該滅菌複合体を滅菌アルミニウム塩と混合する工程を包含する、プロセス。
（項目１６） （ｉ）項目２から１４のいずれか１項に記載のアジュバントおよび（ｉｉ）免疫原を含む、免疫原性組成物。
（項目１７） 項目１６に記載の免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、（ｉ）項目２〜１４のいずれかに記載のアジュバントおよび（ｉｉ）免疫原を混合する工程を包含する、プロセス。
（項目１８） 上記免疫原が、（ａ）上記アルミニウム塩に吸着されているか、および／または（ｂ）上記複合体に吸着されている、項目１もしくは項目１６に記載の組成物または項目１７に記載のプロセス。
（項目１９） （ｉ）項目２〜１４のいずれかに記載のアジュバントを含む第１の容器、ならびに（ｉｉ）免疫原および／またはさらなるアジュバントを含む第２の容器を備える、キット。
（項目２０） （ｉ）アルミニウム塩を含む第１の容器；および（ｉｉ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性ポリマーとの複合体を含む第２の容器を備える、キット。
（項目２１） 上記第１の容器および上記第２の容器の一方または両方が、免疫原を含む、項目２０に記載のキット。
（項目２２） 上記免疫原が、Ｂ血清群髄膜炎菌由来である、項目１６もしくは１８に記載の組成物、または項目１７に記載のプロセス、または項目１９もしくは項目２１に記載のキット。
（項目２３） （ｉ）ヒスチジン緩衝液などの緩衝液、および／または（ｉｉ）５〜１５ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムと組み合わせて、項目２〜１４のいずれかに記載のアジュバントを含む、水性組成物。

Claims (23)

1. （ｉ）アルミニウム塩、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含む免疫学的アジュバントであって、ここで、該オリゴヌクレオチドおよび該ポリマーは、互いに会合することにより複合体を形成する、免疫学的アジュバント；ならびに
   （ｉｉ）細菌性疾患または真菌性疾患を防御する免疫応答を誘発する免疫原
   を含む、免疫原性組成物。
2. アルミニウム塩、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを含む免疫学的アジュバントであって、ここで、該オリゴヌクレオチドおよび該ポリマーは、互いに会合することにより複合体を形成する、免疫学的アジュバント。
3. 前記アルミニウム塩が、水酸化アルミニウムである、請求項２に記載のアジュバント。
4. 前記アルミニウム塩が、リン酸アルミニウムである、請求項２に記載のアジュバント。
5. 前記オリゴヌクレオチドが、一本鎖であり、１０ヌクレオチドから１００ヌクレオチドを有する、請求項２から４のいずれか１項に記載のアジュバント。
6. 前記オリゴヌクレオチドが、５’−（ＩＣ）_１３−３’である、請求項５に記載のアジュバント。
7. 前記ポリカチオン性ポリマーが、ペプチドである、請求項２から６のいずれか１項に記載のアジュバント。
8. 前記ペプチドが、１つ以上のＬｅｕ−Ｌｅｕジペプチド配列、１つ以上のＬｙｓ−Ｌｙｓジペプチド配列、および／または１つ以上のＡｒｇ−Ａｒｇジペプチド配列を含む、請求項７に記載のアジュバント。
9. 前記ペプチドが、１つ以上のＬｙｓ−Ｌｅｕジペプチド配列、および／または１つ以上のＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含む、請求項７または請求項８に記載のアジュバント。
10. 前記ペプチドが、５アミノ酸から５０アミノ酸を有する、請求項７〜９のいずれかに記載のアジュバント。
11. 前記ペプチドが、アミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫを有する、請求項１０に記載のアジュバント。
12. 前記オリゴヌクレオチドおよび前記ポリマーが、モル比１：２５で存在する、請求項２から１１のいずれか１項に記載のアジュバント。
13. 前記アルミニウム塩および前記複合体の両方が、１μｍ〜２０μｍの平均粒子直径を有する微粒子である、請求項２から１２のいずれか１項に記載のアジュバント。
14. 前記アジュバントが、滅菌されている、請求項２から１３のいずれか１項に記載のアジュバント。
15. 請求項１４に記載のアジュバントを調製するためのプロセスであって、該プロセスは：免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを濾過滅菌する工程；該濾過滅菌された免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性ポリマーを滅菌条件下において混合することにより、滅菌複合体を形成する工程；および該滅菌複合体を滅菌アルミニウム塩と混合する工程を包含する、プロセス。
16. （ｉ）請求項２から１４のいずれか１項に記載のアジュバントおよび（ｉｉ）免疫原を含む、免疫原性組成物。
17. 請求項１６に記載の免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、（ｉ）請求項２〜１４のいずれかに記載のアジュバントおよび（ｉｉ）免疫原を混合する工程を包含する、プロセス。
18. 前記免疫原が、（ａ）前記アルミニウム塩に吸着されているか、および／または（ｂ）前記複合体に吸着されている、請求項１もしくは請求項１６に記載の組成物または請求項１７に記載のプロセス。
19. （ｉ）請求項２〜１４のいずれかに記載のアジュバントを含む第１の容器、ならびに（ｉｉ）免疫原および／またはさらなるアジュバントを含む第２の容器を備える、キット。
20. （ｉ）アルミニウム塩を含む第１の容器；および（ｉｉ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性ポリマーとの複合体を含む第２の容器を備える、キット。
21. 前記第１の容器および前記第２の容器の一方または両方が、免疫原を含む、請求項２０に記載のキット。
22. 前記免疫原が、Ｂ血清群髄膜炎菌由来である、請求項１６もしくは１８に記載の組成物、または請求項１７に記載のプロセス、または請求項１９もしくは請求項２１に記載のキット。
23. （ｉ）ヒスチジン緩衝液などの緩衝液、および／または（ｉｉ）５〜１５ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムと組み合わせて、請求項２〜１４のいずれかに記載のアジュバントを含む、水性組成物。