CN102802662A

CN102802662A - 用于脑膜炎球菌血清组b的含佐剂疫苗

Info

Publication number: CN102802662A
Application number: CN2011800142952A
Authority: CN
Inventors: M·帕劳罗; D·欧哈根; R·拉普奥利
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Priority date: 2010-03-18
Filing date: 2011-03-18
Publication date: 2012-11-28
Also published as: US20130071422A1; WO2012020326A1; AU2011288203A1; BR112012022896A2; JP2013522287A; EP2547357A1; MX2012010609A; CA2793510A1

Abstract

一种免疫原性组合物，所述组合物包括(i)免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物，其中所述寡核苷酸和所述聚合物理想地彼此结合形成复合物，和(ii)脑膜炎球菌血清组B抗原。在大多数实施方式中，所述组合物不包括铝盐且不包括水包油乳液。

Description

用于脑膜炎球菌血清组B的含佐剂疫苗

本申请要求2010年3月18日提交的美国临时专利申请61/315,336和2010年3月25日提交的美国临时专利申请61/317,572的权益，这两项申请的全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及脑膜炎球菌疫苗领域。

技术背景

当前正在研究针对脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)血清组B（“MenB”）的各种疫苗。一些疫苗基于外膜囊泡(OMVs)，如诺华疫苗公司（Novartis Vaccines）MENZB^TM产品，芬莱研究所（Finlay Institute）VA-MENGOC-BC^TM产品，挪威公共卫生研究院（Norwegian Institute of PublicHealth）MENBVAC^TM产品。其他则基于重组蛋白，例如参考文献1中诺华疫苗公司报道的“脑膜炎球菌血清组B的通用疫苗”。

本发明的一个目的是提供针对MenB的修饰并改善的疫苗，尤其是含佐剂疫苗。

发明内容

本发明提供一种免疫原性组合物，所述组合物包括(i)脑膜炎球菌血清组B抗原和(ii)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的佐剂；其中(i)所述免疫原性组合物不包括铝盐；(ii)所述免疫原性组合物不包括水包油乳液;(iii)所述脑膜炎球菌血清组B抗原不包括含选自SEQ ID NO 13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸序列的多肽；和(iv)所述免疫原性组合物不包括fHBP抗原。

所述免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物优选彼此结合。其可形成寡核苷酸/聚合物复合物。

本发明提供一种免疫原性组合物，所述组合物包括(i)脑膜炎球菌血清组B抗原；(ii)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的佐剂和；(iii)选自肺炎球菌抗原、白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳抗原、HBsAg、HAV抗原、Hib抗原和/或IPV的一种或多种其他抗原。所述免疫原性组合物可包括铝盐和/或水包油乳液。

本发明还提供一种免疫原性组合物，所述组合物包括(i)纯化的脑膜炎球菌脂寡糖；和(ii)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的佐剂。所述免疫原性组合物还可包括铝盐和/或水包油乳液。

本发明还提供一种免疫原性组合物，所述组合物包括(i)由MenB抗原、脑膜炎奈瑟球菌血清组A的偶联荚膜糖、脑膜炎奈瑟球菌血清组C的偶联荚膜糖、脑膜炎奈瑟球菌血清组W135的偶联荚膜糖、脑膜炎奈瑟球菌血清组Y的偶联荚膜糖组成的5-价抗原组分；和(ii)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的佐剂，前提是所述免疫原性组合物不包括铝盐且不包括水包油乳液。

在本发明一个实施方式中，所述MenB抗原可吸附于所述佐剂中寡核苷酸和聚合物形成的复合物。或者，所述MenB抗原不吸附于所述佐剂中的寡核苷酸/聚合物复合物。

本发明还包括制备本发明免疫原性组合物的方法，所述方法包括混合以下物质的步骤：(i)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的复合物的佐剂和(ii)脑膜炎球菌血清组B(“MenB”)抗原，前提是所述MenB抗原不包括含选自SEQ ID NO 13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸序列的多肽且不包括fHBP抗原。在替代方法中，MenB抗原和含免疫刺激性寡核苷酸及聚阳离子聚合物的佐剂在形成复合物前进行混合。例如，所述MenB抗原可与寡核苷酸混合，然后加入聚合物；或所述MenB抗原可与聚合物混合，然后加入寡核苷酸。复合物可在寡核苷酸和聚合物接触后形成。

MenB抗原、寡核苷酸和聚合物可以任何顺序混合。

本发明还提供一种药盒，其包括：(i)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的第一容器和(ii)含MenB抗原的第二容器，前提是所述MenB抗原不包括含选自SEQ ID NO 13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸序列的多肽且不包括fHBP抗原。所述药盒中第一容器和第二容器都不包括铝盐或水包油乳液。

本发明还提供一种药盒，所述药盒包括(i)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的第一容器和(ii)含经纯化脑膜炎球菌脂寡糖的第二容器。

本发明还提供一种药盒，所述药盒包括(i)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的第一容器和(ii)含脑膜炎球菌血清组B抗原的第二容器和(iii)含选自肺炎球菌糖抗原、白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳抗原、HBsAg、HAV抗原、Hib抗原和/或IPV的一种或多种其他抗原的容器。部分(iii)中提及的容器可为所述第一容器、所述第二容器或第三容器。

可合并(例如在使用时)这些药盒的内容物，形成本发明免疫原性组合物。这些药盒可包括含有免疫原和/或其他佐剂的另一容器。

在一些实施方式中，组合物或药盒中仅有的佐剂是含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的佐剂。

脑膜炎球菌血清组B免疫原

本发明的免疫原性组合物用于诱发针对脑膜炎球菌血清组B（“MenB”）的免疫应答。引发抗MenB反应的合适免疫原包括多肽抗原、脂寡糖和/或膜囊泡。有用的血清组B抗原在下文进一步详述。

脑膜炎球菌多肽抗原

本发明的免疫原性组合物可包括一种或多种脑膜炎球菌多肽抗原。例如，一种组合物可包含选自下组的多肽抗原：287、NadA、NspA、HmbR、NhhA、App和/或Omp85。这些抗原可有用地作为纯化的多肽，例如重组多肽存在。抗原优选在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的免疫原性组合物可包含287抗原。287抗原作为基因NMB2132包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[2]的已公布基因组序列中(GenBank登录号GI:7227388；本文的SEQ ID NO：3)。之后已出版了来自许多菌株的287抗原序列。例如，287的等位基因形式如参考文献3的图5和15所示，以及例如文献4的实施例13和图21所示(其中的SEQ ID 3179到3184)。已报导了许多287抗原的免疫原性片段。本发明所用的优选287抗原包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：3具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：3的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：3的表位。本发明最有用的287抗原可在给予对象后引起抗体，其能与由氨基酸序列SEQ ID NO：3组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选287抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明组合物的本发明免疫原性组合物可包括NadA抗原。NadA抗原作为基因NMB1994包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[2]的已公布基因组序列中(GenBank登录号GI:7227256；本文的SEQ ID NO：4)。迄今已公布了许多菌株的NadA抗原序列，并详细记载了作为奈瑟氏菌粘附素的蛋白活性。已报导了许多NadA的免疫原性片段。本发明所用的优选NadA抗原包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：4具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：4的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：4的表位。SEQ ID NO：6是一种这类片段。本发明最有用的NadA抗原可在给予对象后引起抗体，其能与由氨基酸序列SEQ ID NO：4组成的脑膜炎多肽结合。用于本发明的优选NadA抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的免疫原性组合物可包含NspA抗原。NspA抗原作为基因NMB0663包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[2]的已公布基因组序列中(GenBank登录号GI:7225888；本文中的SEQ ID NO：5)。先前参考文献5和6提到该抗原。之后已公布了来自许多菌株的NspA抗原序列。还报导了许多NspA的免疫原性片段。本发明所用的优选NspA抗原包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：5具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：5的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：5的表位。本发明最有用的NspA抗原可在给予对象后引起抗体，其能与由氨基酸序列SEQ ID NO：5组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选NspA抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的免疫原性组合物可包含脑膜炎球菌HmbR抗原。全长HmbR序列作为基因NMB1668包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[2]的已公布基因组序列中(本文的SEQ ID NO：12)。本发明可使用包含HmbR全长序列的多肽，但常用含有部分HmbR序列的多肽。因此在一些实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包含与SEQ ID NO：12具有至少i％序列相同性的氨基酸序列，其中i值为50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包含SEQ ID NO：12的至少j个连续氨基酸的片段，其中j值为7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高。在其它实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包含某一氨基酸序列，该序列(i)与SEQ ID NO：12具有至少i％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：12中至少j个连续氨基酸的片段。优选j个氨基酸的片段包含来自SEQ ID NO：12的表位。这些表位通常包含位于HmbR表面上的氨基酸。有用的表位包括涉及HmbR与血凝素结合的氨基酸，因为与这些表位结合的抗体能够阻断细菌与宿主血凝素结合的能力。参考文献7研究了HmbR的拓扑学及其关键功能性残基。本发明最有用的HmbR抗原可在给予对象后引起抗体，其能与由氨基酸序列SEQ ID NO：12组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选HmbR抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的免疫原性组合物可包含NhhA 抗原。NhhA抗原作为基因NMB0992包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[2]的已公布基因组序列中(GenBank登录号GI:7226232；本文的SEQ ID NO：6)。自从例如参考文献3和8之后已公布了来自许多菌株的NhhA抗原序列，也已报导了许多NhhA的免疫原性片段。它也称为Hsf。本发明所用的优选NhhA抗原包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：6具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：6的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：6的表位。本发明最有用的NhhA抗原可在给予对象后引起抗体，其能与由氨基酸序列SEQ ID NO：6组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选NhhA抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的免疫原性组合物可包含App抗原。App抗原作为基因NMB1985包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[2]的已公布基因组序列中(GenBank登录号GI:7227246；本文的SEQ ID NO：7)。之后已公布了来自许多菌株的App抗原序列。还报导了许多App的免疫原性片段。本发明所用的优选App多肽包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：7具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：7的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：7的表位。本发明最有用的App抗原可在给予对象后引起抗体，其能与由氨基酸序列SEQ ID NO：7组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选App抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的免疫原性组合物可包含Omp85抗原。Omp85抗原作为基因NMB0182包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[2]的已公布基因组序列中(GenBank登录号GI:7225401；本文的SEQ ID NO：8)。之后已公布了来自许多菌株的Omp85抗原序列。Omp85的其它信息可见参考文献9和10。还报导了许多Omp85的免疫原性片段。本发明所用的优选Omp抗原包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：8具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：8的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：8的表位。本发明最有用的Omp85抗原可在给予对象后引起抗体，其能与由氨基酸序列SEQ ID NO：8组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选Omp85抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物不包括脑膜炎球菌H因子结合蛋白（fHBP）抗原。fHBP抗原是含下述氨基酸序列的多肽：(i)与SEQ ID NO:9、10或11中任一具有至少80％序列相同性的序列和/或(ii)由SEQ ID NO:9、10或11的至少7个连续氨基酸片段组成的序列。在一些实施方式中，所述组合物不包括参考文献11和12所述的试验中能结合H因子（如人H因子）的蛋白。

片段优选包含来自各SEQ ID NO:序列的表位。其他有用片段缺少各SEQID NO:C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留其至少一个表位。

在一些实施方式中，多肽在例如N-末端半胱氨酸处脂化。对于脂化多肽，与半胱氨酸结合的脂类通常包含棕榈酰残基，例如三棕榈酰-S-甘油酰半胱氨酸(Pam3Cys)、二棕榈酰-S-甘油酰半胱氨酸(Pam2Cys)、N-乙酰基(二棕榈酰-S-甘油酰半胱氨酸)、N-乙酰基(二棕榈酰-S-甘油酰半胱氨酸)等。

脑膜炎球菌脂寡糖

免疫原性组合物可包含一种或多种脑膜炎球菌脂寡糖(LOS)抗原。脑膜炎LOS是基于葡糖胺的磷脂，发现于细菌外膜的外侧单层。其包含脂质A部分和核心寡糖区域，脂质A部分作为膜内的疏水锚起作用。寡糖核心中的异源性产生了不同脑膜炎球菌菌株中的结构和抗原多样性，用于将菌株分成12种免疫型(L1到L12)。发明可用来自任何免疫型，例如来自L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和/或L8的LOS。

L2和L3α-链天然包含乳糖N-新四糖(LNnT)。当发明使用来自L2或L3免疫型的LOS时，该LNnT可以不存在。可通过使用经工程改造破坏在α链中合成LNnT四糖能力的突变菌株来方便地实现这种缺失。已知通过敲除负责相关生物合成添加的酶来实现该目的[13,43]。例如，LgtB酶的敲除阻止了LNnT末端半乳糖的加入，并且阻止了α链末端唾液酸的下游添加。LgtA酶的敲除阻止了LNnT的N-乙酰葡糖胺的加入，以及下游的添加。LgtA敲除可以伴随LgtC敲除。类似的，LgtE和/或GalE酶的敲除阻止了内部半乳糖的加入。LgtF的敲除阻止了Hep^I残基上葡萄糖的加入。可单独或组合使用这些敲除中的任一种，以破坏L2,L3,L4,L7或L9免疫型菌株中的LNnT四糖。优选敲除至少LgtB。因为这提供了保留有用的免疫原性而除去LNnT表位的LOS。

此外或另外，破坏LNnT表位的突变，敲除galE基因也提供了有用的修饰LOS，一种脂质A脂肪转移酶基因也可类似被敲除[14]。可从LOS除去至少一种初级O-连接的脂肪酸[15]。还可使用每个LOS分子上二级酰基链数目减少的LOS[16]。LOS通常包括至少GlcNAc-Hep₂磷酸乙醇胺-KDO₂-脂质A结构[17]。LOS可包括GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc三糖，而缺少LNnT四糖。

可包含各种形式的LOS。可以其自身纯化形式使用。其可与载体蛋白偶联。当LOS偶联时，偶联可通过LOS中的脂质A部分，或可以通过任何其它合适部分，例如其KDO残基。如果不存在LOS的脂质A部分，则需要这种替代连接。LOS的偶联技术如参考文献15、17、18、19等所述。这些偶联物的有用载体蛋白包括例如细菌毒素，如白喉或破伤风毒素，或其类毒素或变体。

LOS可来自具有固定(即非相变)的LOS免疫型的菌株(例如基因工程改造的脑膜炎球菌菌株)，如参考文献20所述。例如，可固定L2和L3LOS免疫型。这些菌株可具有在免疫型之间转换的速率，这种速率与原始野生型菌株相比降低了2倍以上(甚至>50倍)。文献20公开了如何通过修饰lgtA和/或lgtG基因产物来获得这种结果。

例如对于L3，LOS可在结合其庚糖II残基的GlcNac残基上发生O-乙酰化[21]。

本发明免疫原性组合物可包含一种以上类型的LOS，例如来自脑膜炎球菌免疫型L2和L3的LOS。例如，可使用参考文献22中公开的LOS组合。

LOS抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

膜囊泡

本发明的免疫原性组合物可包含脑膜炎球菌外膜囊泡。这些包括任何通过脑膜炎球菌外膜的破坏或发泡形成包含外膜蛋白组分的囊泡而获得的脂蛋白体囊泡。因此该术语包括OMV（有时称为“小泡”）、微囊泡（MV[23]）和“天然OMV”（“NOMV”[24]））。

MV和NOMV是天然产生的膜囊泡，在细菌生长期间自发形成并释放到培养基中。MV可以通过以下方法获得：在肉汤培养基中培养奈瑟球菌（Neisseria），将全细胞与肉汤培养基中较小的MV分离（例如，通过过滤或低速离心，只沉淀细胞而不沉淀较小囊泡），然后从细胞耗尽的培养基中收集MV（例如，通过过滤、差速离心或MV聚集，通过高速离心沉淀MV）。通常可根据培养基中产生的MV量选择用于生产MV的菌株，例如参考文献25和26描述了具有高MV产量的奈瑟球菌。

从细菌人工制备OMV，可以利用去污剂处理（例如用脱氧胆酸盐）或通过非去污剂方式（例如参见参考文献27）进行制备。形成OMV的技术包括：用胆酸盐去污剂（例如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、乌索胆酸等的盐，优选用脱氧胆酸钠[28和29]处理奈瑟球菌）在不会沉淀去污剂的充分高的pH下[30]处理细菌。其它技术基本可以在没有去污剂存在的情况下[27]利用诸如超声、均化、微流化、空化、渗透压休克、研磨、弗氏压碎(French press)、混合等技术进行。不使用或使用低去污剂的方法可以保留有用的抗原，如NspA[27]。因此一种方法可以使用含有约0.5%或更低如约0.2%、约0.1%、<0.05%或0浓度的脱氧胆酸盐的OMV提取缓冲液。

参考文献31描述了一种制备OMV的有用过程，涉及对粗OMV进行超滤，代替高速离心。该过程可以涉及在超滤后进行超离心的步骤。

用于本发明的囊泡可以从任何脑膜炎球菌菌株中制备。所述囊泡通常来自血清组B菌株，但是也可能从B以外的血清组进行制备（例如，参考文献30描述了一种用于血清组A的过程），如A、C、W135或Y。该菌株可以是任何血清型(如1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亚型和任何免疫型(如L1；L2；L3；L3,3,7；L10；等)。所述脑膜炎球菌可以来自任何合适的谱系，包括高侵袭性和超毒力谱系，例如下列7个超毒力谱系中的任何一个：亚组I、亚组III、亚组IV-1、ET-5复合物、ET-37复合物、A4簇、谱系3。这些谱系通过多位点酶电泳（MLEE）确定，但也使用多位点序列分型（MLST）对脑膜炎球菌分类[参考文献32]，例如ET 37复合物为由MLST所分的ST 11复合物，ET 5复合物为ST-32(ET-5)，谱系3为ST 41/44等。囊泡可从具有下列亚型之一的菌株制备：P1.2;P1.2,5;P1.4;P1.5;P1.5,2;P1.5,c;P1.5c,10;P1.7,16;P1.7,16b;P1.7h,4;P1.9;P1.15;P1.9,15;P1.12,13;P1.13;P1.14;P1.21,16;P1.22,14。

用于本发明的囊泡可从野生型脑膜炎球菌菌株或突变脑膜炎球菌菌株获得。例如，参考文献33公开了用修饰的fur基因从脑膜炎奈瑟球菌获得的囊泡制品。参考文献41教导nspA表达可随同时敲除porA与cps而上调。参考文献41-43描述了用于生产OMV的其他脑膜炎奈瑟球菌敲除突变体。参考文献34公开了fHBP上调的囊泡。参考文献35描述了从表达6种不同PorA亚型的修饰菌株进行囊泡构建。也可以使用通过敲除参与LPS生物合成的酶而获得的具有低内毒素水平的奈瑟球菌突变体[36,37]。这些或其它突变体均可以与本发明一起使用。

因此本发明所用的菌株在一些实施方式中可以表达多于一种的PorA亚型。之前已构建出6价和9价PorA菌株。所述菌株可表达2、3、4、5、6、7、8或9种PorA亚型：P1.7,16；P1.5-1,2-2；P1.19,15-1；P1.5-2,10；P1.121.13；P1.7-2,4；P1.22,14；P1.7-1,1和/或P1.18-1,3,6。在其它实施方式中，可以下调菌株中PorA的表达，例如，PorA的量相对于野生型水平（例如相对于H44/76菌株，如参考文献44所公开）减少了至少20%（例如，≥30%、≥40%、≥50%、≥60%、≥70%、≥80%、≥90%、≥95%等），或甚至被敲除。

在一些实施方式中，菌株可以高表达（相对于相应的野生型菌株）某些蛋白质。例如，菌株可以高表达NspA、蛋白287[38]、fHBP[34]、TbpA和/或TbpB[39]、铜、锌超氧化物歧化酶[39]、HmbR等。

在一些实施方式中，菌株可以包括参考文献40-43描述的一个或多个敲除和/或高表达突变。下调和/或敲除的基因优选包括：(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[40]；(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[41]；(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[42]；和(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB和/或SynC[43]。

使用突变菌株时，在一些实施方式中，可以具有一个或多个或全部下列特征：（i）LgtB和/或GalE下调或敲除，以截短脑膜炎球菌LOS；（ii）TbpA上调；（iii）NhhA上调；（iv）Omp85上调；（v）LbpA上调；（vi）NspA上调；（vii）PorA敲除；（viii）FrpB下调或敲除；（ix）Opa下调或敲除；（x）Opc下调或敲除；（xii）cps基因复合体缺失。截短的LOS可以不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，其可以为半乳糖缺陷型LOS。所述LOS可以没有α链。

如果LOS存在于囊泡中，可以处理囊泡以将其LOS与蛋白质组分连接起来（“内泡”偶联[43]）。

本发明可与不同菌株的囊泡混合物一起使用。例如，参考文献44公开了含多价脑膜炎球菌囊泡组合物的疫苗，含有衍生自具有所用国家普遍性血清亚型的脑膜炎球菌菌株的第一囊泡，和衍生自无需具有所用国家普遍性血清亚型的菌株的第二囊泡。参考文献45也公开了不同囊泡的有用组合。在一些实施方式中，可使用各来自L2和L3免疫型菌株的囊泡组合。

在一些实施方式中，所述免疫原性组合物不含MenB OMV。

本发明的免疫原性组合物可给予动物以诱导免疫应答。本发明可用于针对广范围疾病进行治疗或加以保护。

免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子聚合物

本发明使用免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子聚合物。它们彼此理想结合形成颗粒复合物，其通常是TLR9激动剂。

已知免疫刺激性寡核苷酸是有用的佐剂。它们通常含有CpG基序(一种二核苷酸序列，其含有与鸟苷连接的未甲基化胞苷)，其佐剂效果如参考文献46-51中所述。含有TpG基序、回文结构序列、多个连续胸苷核苷酸(例如TTTT)、多个连续胞苷核苷酸(例如CCCC)或聚(dG)序列的寡核苷酸也称作免疫刺激物，如双链RNA一样。虽然这些不同的免疫刺激性寡核苷酸中任一种都可用于本发明，优选使用含脱氧肌苷和/或脱氧尿苷的寡脱氧核苷酸[52]，理想地是含脱氧肌苷和脱氧胞苷的寡脱氧核苷酸。含肌苷的寡脱氧核苷酸可以包含CpI基序(一种二核苷酸序列，含有与肌苷连接的胞苷)。寡脱氧核苷酸可包含一个以上(例如2,3,4,5,6或以上)的CpI基序，这些可以是直接重复(例如包含序列(CI)x,其中x是2,3,4,5,6或更大)或彼此间隔(例如包含序列(CIN)x,其中x是2,3,4,5,6或更大，其中各N独立代表一个或多个核苷酸)。胞苷残基理想上不甲基化。

寡核苷酸通常可具有10-100个核苷酸，例如15-50个核苷酸，20-30个核苷酸，或25-28个核苷酸。其通常为单链。

寡核苷酸可仅包含天然核苷酸，仅包含非天然核苷酸，或其混合物。例如，其可包含一个或多个硫代磷酸酯键，和/或一个或多个核苷酸可具有2'-O-甲基修饰。

用于本发明的优选寡核苷酸是单链脱氧寡核苷酸，具有26聚体序列5'-(IC)13-3'(SEQ ID NO:1)。该寡脱氧核苷酸与聚阳离子聚合物形成稳定复合物，得到良好佐剂。

聚阳离子聚合物理想地是聚阳离子肽，例如阳离子抗微生物肽。聚合物可包含一个或多个亮氨酸残基和/或一个或多个赖氨酸残基。聚合物可包含一个或多个精氨酸残基。其可包含这些氨基酸之一的至少一种直接重复，例如一个或多个Leu-Leu二肽序列，一个或多个Lys-Lys二肽序列，和/或一个或多个Arg-Arg二肽序列。可包含至少一个(和优选多个例如2或3)Lys-Leu二肽序列，和/或至少一个(和优选多个例如2或3)个Lys Lys-Lys三肽序列。

肽可包含序列Rl-XZXZxXZX-R₂,其中：x是3,4,5,6或7;每个X独立地是带正电的天然和/或非天然氨基酸残基；每个Z独立地是氨基酸残基L,V,I,F或W;R1和R2独立选自-H,-NH₂,-COCH₃,或COH。在一些实施方式中，X-R₂是肽C-末端氨基酸残基的酰胺、酯或硫酯。也可见参考文献53。

阳离子肽通常具有5-50个氨基酸，例如6-20个氨基酸，7-15个氨基酸或9-12个氨基酸。

肽可仅包含天然氨基酸，仅包含非天然氨基酸，或两者的混合物。可包含L-氨基酸和/或D-氨基酸。L-氨基酸是典型的。

肽可具有天然N末端(NH₂-)或修饰的N末端，例如羟基、乙酰基等。肽可具有天然C末端(-COOH)或修饰的C末端，例如羟基、乙酰基等。这些修饰可促进肽的稳定性。

优选用于本发明的肽是11聚体KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO:2；参考文献54)，全部都是L氨基酸。可对N末端脱酰胺化，可羟基化C末端。优选的肽是H-KLKL₅KLK-OH,全部都是L-氨基酸。寡肽是已知的抗微生物剂[55]、嗜中性粒细胞激活剂[56]和佐剂[57]，与免疫刺激性寡核苷酸形成稳定复合物，得到良好佐剂。

免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子聚合物的最优选混合物是TLR9激动剂，称作IC31^TM[58-60]，其是寡脱氧核苷酸SEQ ID NO:1和聚阳离子寡肽SEQ IDNO:2的吸附复合物。

可以不同比例混合寡核苷酸和寡肽，但通常它们用摩尔过量的肽混合。摩尔过量可至少是5:1，例如10:1,15:1,20:1,25:1,30;1,35:1,40:1等。约25:1的摩尔比是理想的[61,62]。以此过量比混合可形成寡核苷酸和寡肽间的不溶性颗粒复合物。MenB抗原是纯化的LOS时，所述复合物可与本文所述的铝盐组合。

寡核苷酸和寡肽通常在水性条件下混合，例如寡核苷酸溶液可与寡肽溶液以所需比例混合。可通过在水中或缓冲液中溶解干燥的(例如冻干的)物质以形成可随后混合的储液，制备两种溶液。

可用参考文献63公开的方法分析复合物。典型的是平均直径为1μm-20μm的复合物。

聚精氨酸和CpG寡脱氧核苷酸类似地形成复合物[64]。

可将复合物维持在水性悬液中，例如水中或缓冲液中。用于复合物的典型缓冲液是磷酸盐缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)、Tris缓冲液、Tris/山梨醇缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液等。或者，有时可冻干复合物。

可离心水性悬液中的复合物，将其与团块介质分开(例如通过吸附、倾析等)。如需要，然后可将这些复合物重悬浮于替代介质中。

铝盐

本发明大多数实施方式不包括铝盐。然而一些实施方式可使用铝盐，例如其中所述免疫原性组合物含纯化的MenB LOS或所述组合物包括选自肺炎球菌糖抗原、白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳抗原、HBsAg、HAV抗原、Hib抗原和IPV的一种或多种其他抗原。铝盐包括独立称作氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，但仅为使用方便，因为其均不是出现的实际化合物的准确描述（例如参见参考文献65第9章）。术语“铝盐”可指通常用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸盐"佐剂。在允许使用铝盐的一些实施方式中，优选使用氢氧化铝佐剂。

称为"氢氧化铝"的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。可采用红外(IR)光谱将式AlO(OH)代表的羟基氧化铝与其它铝化合物如氢氧化铝Al(OH)₃区分开，具体区别是1070cm^-1处存在吸收条带和3090-3100cm^-1处存在强肩[参考文献65的第9章]。半峰高处衍射带的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂通常呈纤维形态(例如，如透射电子显微图中所见)。在文献66中报导了1-10μm范围内的平均粒径。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH 7.4时氢氧化铝佐剂的吸附容量为1.8-2.6毫克蛋白质/毫克Al⁺⁺⁺。

称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。羟基磷酸盐的PO₄/Al摩尔比通常为0.3-1.2。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO₄。例如，3164cm¹的IR光谱带(例如，当加热至200℃时)表明存在结构性羟基[参考文献65的第9章]。磷酸铝佐剂的PO₄/Al³⁺摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO₄/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形羟基磷酸铝，包含0.6mg Al³⁺/ml。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微图上观察到的板状形态)。抗原吸附后颗粒直径一般是0.5-20μm(如约5-10μm)。据报道，pH 7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5毫克蛋白质/毫克Al⁺⁺⁺。磷酸铝的零电点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度逆相关，且这种取代程度可根据用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而变化。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根=更酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)来改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。

还可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝比氢氧化铝多，例如重量比为至少2:1，例如≥5:1、≥6:1、≥7:1、≥8:1、≥9:1等。

在本发明一些实施方式中（如其中所述免疫原性组合物包括纯化的MenBLOS），所述组合物可包括：(i)氢氧化铝、免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子聚合物；(ii)磷酸铝、免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子聚合物；或(iii)氢氧化铝、磷酸铝、免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子聚合物。

本发明的药物组合物中Al⁺⁺⁺的浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。

吸附

免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的优选复合物为吸附性的，即免疫原可通过各种机制吸附于该复合物。然而在一些情况下，免疫原和复合物都存在于组合物中而未吸附，这是通过免疫原的固有性质，或由于配制中采用的步骤(例如在配制中使用适当的pH来防止发生吸附)。

铝盐佐剂也可为吸附性的。因此在复合物和铝盐都存在的实施方式中，对于免疫原有许多吸附的机会：免疫原可吸附于铝盐，吸附于寡核苷酸/聚合物复合体(以不同比例)，或对两者都不吸附。本发明覆盖了所有这些安排。例如，在一个实施方式中，免疫原可吸附于铝盐，吸附的免疫原/盐可再与寡核苷酸/聚合物复合体混合。在另一个实施方式中，免疫原可吸附于寡核苷酸/聚合物复合体，吸附的免疫原/复合体然后可与铝盐混合。在另一个实施方式中，两种免疫原（相同或不同）可分别吸附于寡核苷酸/聚合物复合体和铝盐，然后混合两种吸附的成分。

在一些情况下，免疫原可改变其吸附状态，例如通过pH或温度的改变，或在混合组分后。已知抗原在体外[67]和体内[68]从铝盐上解吸。可能发生一种吸附的颗粒解吸，然后重新吸附到不同的吸附性颗粒上，从而使得例如免疫原从铝盐佐剂转移到复合物上，或反之亦然。在一些实施方式中，单个抗原分子或复合物可同时吸附于铝盐和复合物上，形成两种吸附性颗粒之间的桥梁。

如果免疫原吸附在吸附性组分上，不需要所有免疫原都吸附。可能发生所述情况，这是由于免疫原在吸附和溶解相之间的固有平衡，或由于吸附表面饱和。因此，组合物中的免疫原可完全或部分吸附，吸附部分可以是一种或多种不同的吸附性组分(例如铝盐和/或寡核苷酸/聚合物复合体)。在这种情况下，吸附部分可以是免疫原在组合物中总量的至少10%(以重量计)，例如>20%,>30%,>40%,>50%,>60%,>70%,>80%,>90%,>95%,>98%或以上。在一些实施方式中，免疫原完全吸附，即通过离心将批量液体介质与复合物分开后，在上清液中检测不到。然而，在其它实施方式中，没有一种特定的免疫原吸附。

在一些情况下，可能复合物的免疫刺激性寡核苷酸和/或聚阳离子聚合物组分能够吸附在所述铝盐上。虽然优选复合物在与所述铝盐混合后保持完整。而且，为了避免复合物吸附于所述铝盐(和相反)，铝盐和复合物具有类似的0电荷点(等电点)会有用，例如彼此差1单位pH以内。因此，有用的复合物具有10-12的PZC，其可用于组合PZC为约11的氢氧化铝佐剂。

水包油乳液

大多数实施方式不含“水包油”乳液，但一些实施方式允许其存在，如其中所述免疫原性组合物含纯化的MenB LOS。水包油乳液通常包括至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解（可代谢）和生物相容的。

乳液中的油滴直径通常小于5μm，理想情况下具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳液。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。在一些有用的乳液中，至少80%（数量上）的油滴具有小于500nm的直径。

所述乳液可以包含如动物（如鱼）或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用来自其它谷类，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草（teff）、黑小麦（triticale）等的油。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然产生。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，即2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。也可采用鲨烯的饱和类似物鲨烷。包括鲨烯和鲨烷在内的鱼油，易于从商业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。优选鲨烯。

其他有用的油是生育酚，它宜包含在用于老年对象(如年龄大于60岁或以上)的疫苗中，因为据报道维生素E在此对象群体中对免疫应答有正作用。它们也具有抗氧化特性，这有助于稳定该乳液。存在各种生育酚(α、β、γ、δ、ε或ξ)，但通常使用α-生育酚。优选的α生育酚是DL-α生育酚。已知琥珀酸α-生育酚与流感疫苗相容，并且是替代含汞化合物的有用防腐剂。

可使用油的混合物，例如，鲨烯和α-生育酚的混合物。

油含量通常为2-20%(体积)。

表面活性剂可以按其‘HLB’(亲水/亲脂平衡)分类。本发明有用的一些表面活性剂的HLB至少为10，例如至少为15，或至少为16。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂（通常称为吐温），特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAX^TM出售的环氧乙烷（EO）、环氧丙烷（PO）和/或环氧丁烷（BO）的共聚物，如直链EO/PO嵌段共聚物；重复乙氧基（氧-1,2-乙二基）数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9（曲通（Triton）X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）；（辛基苯氧基）聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630/NP-40）；磷脂，如磷脂酰胆碱（卵磷脂）；壬酚乙醇酯，如特吉托（Tergitol^TM NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚（称为苄泽（Brij）表面活性剂），如三乙二醇单月桂基醚（苄泽30）；以及脱水山梨糖醇酯（通常称为司盘（SPAN）），如脱水山梨糖醇三油酸酯（司盘85）和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。用于包括在乳液内的最优选表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯；吐温80)。

可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和辛苯聚醇的组合也适用。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

有用的表面活性剂的含量（重量%）为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯（如吐温80）0.01-1%，特定是约0.1%；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇（如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂）0.001-0.1%，特定是0.005-0.02%；聚氧乙烯醚（如月桂醇聚醚9）0.1-20%，如0.1-10%，特定是0.1-1%或约0.5%。

优选含鲨烯乳液，特别是含有聚山梨酯80的那些乳液。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

·鲨烯、聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5%鲨烯、约0.5%聚山梨酯80和约0.5%司盘85。以重量计，这些比例为4.3%鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[69-71]，参考文献65的第10章和参考文献72的第12章更详细地描述了该佐剂。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·鲨烯、生育酚和聚山梨酯80的亚微米乳液。这些乳液可含有2-10%鲨烯、2-10%生育酚和0.3-3%聚山梨酯80，鲨烯:生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这能提供更稳定的乳液。角鲨烯和聚山梨酯80的体积比可以约为5:2，或者重量比约为11:5。可通过将吐温80溶解于PBS产生2%溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物相混合，随后使该混合物微流体化来制备一种这类乳液。得到的乳液含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。该乳液也可含有3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3d-MPL)。此种类型的另一有用乳液可包含(每人剂量)0.5-10mg鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨酯80[73]。

·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。

·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如α-生育酚琥珀酸酯)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。所述乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。

·鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“普流罗尼克^TM L121”(″Pluronic^TMLI21″))的乳液。所述乳液可用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，且已与含苏氨酰基-MDP的“SAF-1”佐剂[74](0.05-1%Thr-MDP、5%鲨烯、2.5%普流罗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)一起使用。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用“AF”佐剂[75](5%鲨烯、1.25%普流罗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)。优选微流体化。

·含有鲨烯、水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90%油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[76]。该乳液也可含有以下一种或多种以下物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。该乳液可包含TLR4激动剂[77]。这类乳液可冻干。

·鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[78]。含佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5%鲨烯、4%泊洛沙姆-105(普流罗尼克多元醇)和2%Abil-Care85(双-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。

·含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献79所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。

·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献80所述)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N,N-双十八烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺。

·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[81]。

·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[82]。

·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[82]。

如上所述，包含鲨烯的水包油乳液是特别优选的。在一些实施方式中，疫苗剂量中的鲨烯浓度可以是5-15mg(即10-30mg/ml的浓度，假设是0.5ml剂量体积)。然而，可以减少鲨烯浓度[83,84]，例如包括<5mg/剂，或甚至<1.1mg/剂。例如，人剂量可包括9.75mg鲨烯/剂(例如在FLUAD^TM产品中：9.75mg鲨烯,1.175mg聚山梨酯80,1.175mg去水山梨糖醇三油酸酯,剂量体积为0.5ml)，或可以包括其部分量，例如3/4、2/3、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10。例如，组合物可包括4.875鲨烯/剂（且因此聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯各0.588mg）、3.25mg鲨烯/剂、2.438毫克/剂、1.95毫克/剂、0.975毫克/剂等。本发明可使用任意这些FLUAD^TM-强度MF59的部分稀释物，而保持鲨烯：聚山梨酯80：去水山梨糖醇三油酸酯之比为8.3:1:1(质量比)。

本发明使用的其他抗原

本发明的组合物和药盒还可包括来自其他病原体尤其是细菌和/或病毒的一种或多种其他抗原。优选的一种或多种其他抗原选自：

·肺炎球菌抗原

·白喉类毒素(‘D’)

·破伤风类毒素(‘T’)

·百日咳抗原（‘P’），通常为无细胞形式（‘aP’）

·乙肝病毒（HBV）表面抗原（‘HBsAg’）

·甲肝病毒(HAV)抗原

·偶联的B型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）荚膜糖('Hib')

·灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)

·偶联的脑膜炎奈瑟球菌（N.meningitidis）血清组A荚膜糖(‘MenA’)

·偶联的脑膜炎奈瑟球菌血清组W135荚膜糖(‘MenW135’)

·偶联的脑膜炎奈瑟球菌血清组Y荚膜糖(‘MenY’)

可使用一种或多种其他抗原。下述抗原组合特别优选用于本发明组合物和药盒：

·MenC PnC。

·D T Pa MenC。

·D T Pa Hib MenC;D T Pa IPV MenC;D T Pa HBsAg MenC;D T Pa MenCPnC。

·D T Pa HBsAg IPV MenC;D T Pa HBsAg MenC PnC。

·D T Pa HBsAg IPV Hib MenC;D T Pa HBsAg Hib MenC-MenA。

·D T Pa HBsAg IPV Hib MenC MenA;D T Pa HBsAg IPV Hib MenC PnC。

这些组合物可由所列抗原组成，或还可包括来自其他病原体的抗原。因此其可单独使用，或者作为其它疫苗的组分。

偶联的脑膜炎奈瑟球菌糖

其他抗原可包括偶联的脑膜炎球菌抗原。偶联的脑膜炎球菌抗原含有偶联于载体蛋白的脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的荚膜糖抗原。针对血清组C的偶联单价疫苗已被批准用于人，其包含MENJUGATE^TM[85]、MENINGITEC^TM和NEISVAC-C^TM。已知血清组A+C的偶联物的混合物[86，87]，已报道了血清组A+C+W135+Y的偶联物的混合物[88-91]，并于2005被批准作为MENACTRA^TM产品上市。

本发明可包括来自一种或多种血清组A、C、W135和/或Y例如A、C、W135、Y、A+C、C+W135、C+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y的糖。

脑膜炎球菌血清组A荚膜糖是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物，在C3和C4位置部分O-乙酰化。C-3位置的乙酰化可以是70-95%。用于纯化糖的条件可导致脱-O-乙酰化(例如在碱性条件下)，但优选在C-3位置保留OAc。因此，优选至少50%(如至少60%、70%、80%、90%、95%或更多)的甘露糖胺残基在C-3位置处O-乙酰基化。

脑膜炎球菌血清组C荚膜糖是(α2→9)-连接的唾液酸均聚物（N-乙酰神经氨酸），通常C7和C8位置处有O-乙酰(OAc)基团。该化合物表示为:→9)-Neup NAc 7/8OAc-(α2→。一些MenC株系（约12%的侵入性分离物）产生缺少该OAc基团的多糖。OAc基团的存在与否产生独特表位，抗体与糖结合的特异性可影响其对O-乙酰化(OAc-)和脱-O-乙酰化(OAc+)菌株的杀菌活性[92-94]。获得许可的MenC偶联物疫苗包含OAc-(NEISVAC-C^TM)和OAc+(MENJUGATE^TM和MENINGITEC^TM)糖。本发明中使用的血清组C糖可以从OAc+或OAc-菌株获得。生产血清组C偶联物的优选菌株是OAc+菌株，优选血清型16，优选血清亚型P1.7a,1。因此，优选C:16:P1.7a,1OAc+菌株。也可使用血清亚型P1.1的OAc+菌株，例如C11菌株。

血清组W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。类似于血清组C糖，其具有可变的O-乙酰化，但在唾液酸7和9位置[95]。结构如下：

→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→

血清组Y糖类似于血清组W135糖，除了二糖重复单元包括葡萄糖而非半乳糖。类似于血清组W135，在唾液酸7和9位置具有可变的O-乙酰化[95]。血清组Y的结构如下：

→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→

MENJUGATE^TM和MENINGITEC^TM产品采用CRM197载体蛋白，这种载体也可根据本发明使用。NEISVAC-C^TM产品采用破伤风类毒素载体蛋白，如白喉类毒素一样，这种载体也可根据本发明使用。用于脑膜炎球菌偶联物的另一有用载体蛋白是流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的蛋白D，它不存在于任何目前批准的偶联物疫苗中。

其他抗原的糖可含有由脑膜炎球菌制备的全长糖，和/或它可包含全长糖的片段。其他抗原的糖优选短于细菌中发现的天然荚膜糖。因此另外抗原的糖优选解聚，解聚发生在糖纯化之后但在偶联之前。解聚可降低糖链长度。一种解聚方法涉及使用过氧化氢[88]。将过氧化氢加入糖中(例如，H₂O₂终浓度为1%)，然后孵育混合物(例如在约55℃)直到实现所需的链长降低。另一种解聚方法涉及酸水解[89]。其他解聚方法是本领域已知的。用于制备本发明所用偶联物的糖可以通过任何这些解聚方法获得。可利用解聚获得对于免疫原性最佳的链长和/或出于糖的物理可操作性而降低链长。优选的糖具有以下平均聚合度(Dp)：A=10-20；C=12-22；W135=15-25；Y=15-25。以分子量而非Dp形式，对于所有血清组，优选范围是：<100kDa；5kDa-75kDa；7kDa-50kDa；8kDa-35kDa；12kDa-25kDa；15kDa-22kDa。

其他抗原中可采用糖:蛋白之比(w/w)为1:10(即蛋白过量)-10:1(即糖过量)的脑膜炎球菌偶联物，如该比例为1:5-5:1，1:2.5-2.5:1，或1:1.25-1.25:1。可使用1:1的比例。

通常，组合物包含以每剂量1μg-20μg(以糖计)存在的每种其他抗原血清组。

脑膜炎球菌偶联物可吸附或不吸附于铝盐佐剂。

可在根据本发明使用之前将脑膜炎球菌偶联物冻干。若冻干，所述组合物可包括稳定剂如甘露醇。还可包括氯化钠。

偶联的肺炎球菌糖

其他抗原可包括偶联的肺炎球菌抗原。偶联的肺炎球菌抗原包含偶联于载体蛋白的肺炎链球菌(S.pneumoniae)的荚膜糖抗原[例如，参考文献96-98]。优选包含来自一种以上肺炎链球菌血清型的糖：广泛采用23种不同血清型的多糖的混合物，如同采用5-11种不同血清型的多糖的偶联疫苗[99]。例如，PREVNAR^TM[100]含有来自7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，其中各糖通过还原胺化单独偶联于CRM197，每0.5ml剂量含有2μg各糖(4μg血清型6B)。

其他抗原优选包括至少血清型6B、14、19F和23F的糖抗原。其它血清型优选选自：1、3、4、5、7F、9V和18C。7价(如PREVNAR^TM中)，9-价(例如PREVNAR中的7种血清型加上1和5)，10价(例如PREVNAR中的7种血清型加上1、5和7F)和11价(例如，PREVNAR中的7种血清型加上1、3、5和7F)覆盖肺炎球菌血清型尤其有用。

该偶联物的糖部分可含有由肺炎球菌制备的全长糖，和/或它可包含全长糖的片段。根据本发明使用的糖优选短于细菌中观察到的天然荚膜糖，如上就脑膜炎球菌偶联物所述。

可采用糖:蛋白之比(w/w)为1:10(即蛋白过量)-10:1(即糖过量)的肺炎球菌偶联物，如该比例为1:5-5:1，1:2.5-2.5:1，或1:1.25-1.25:1。

PREVNAR^TM产品采用CRM197载体蛋白，这种载体也可根据本发明使用。肺炎球菌糖使用的替代载体包括但不限于破伤风类毒素载体、白喉类毒素载体和/或流感嗜血杆菌蛋白D载体。就混合肺炎球菌血清型使用多重载体可具有优势[101]，例如包括流感嗜血杆菌蛋白D载体和例如破伤风类毒素载体和/或白喉类毒素载体。例如，血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F中的一种或多种（优选所有）可偶联流感嗜血杆菌蛋白D载体，血清型18C可偶联破伤风类毒素，且血清型19F可偶联白喉类毒素载体。

通常，组合物包含每剂量以1μg-20μg(以糖计)存在的每种血清型。

百日咳抗原

其他抗原可包括百日咳抗原。百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis）可导致百日咳。疫苗中的百日咳抗原是细胞(全细胞，灭活的百日咳博德特氏菌（B.pertussis）细胞形式)或无细胞形式。已经详尽记载了细胞百日咳抗原的制备(参见例如参考文献102的第21章)，例如，可通过加热灭活百日咳博德特氏菌的I期培养物获得该抗原。然而，本发明优选使用无细胞抗原。

如果使用无细胞抗原，优选使用一种、两种或(优选)三种以下抗原：(1)脱毒的百日咳毒素(百日咳类毒素或“PT”)；(2)丝状血细胞凝集素(“FHA”)；(3)百日咳杆菌粘附素(也称为“69千道尔顿外膜蛋白”)。优选从改良的Stainer-Scholte液体培养基培养的百日咳博德特氏菌（B.pertussis）培养物中分离制备这三种抗原。可从发酵肉汤中(如通过吸附于羟基磷灰石凝胶)分离PT和FHA，而可通过加热处理和絮凝(如采用氯化钡)从细胞中提取百日咳杆菌粘附素。可用连续的色谱和/或沉淀步骤纯化抗原。可通过例如疏水色谱、亲和色谱和大小排阻色谱纯化PT和FHA。可通过例如离子交换色谱、疏水色谱和大小排阻色谱纯化百日咳杆菌粘附素。在根据本发明使用之前，可用甲醛处理FHA和百日咳杆菌粘附素。优选通过甲醛和/或戊二醛处理使PT脱毒。作为这种化学脱毒方法的替代形式，PT可以是通过诱变降低了酶活性的突变PT[103]，但优选用化学处理脱毒。

无细胞百日咳抗原优选吸附到一种或多种铝盐佐剂上。作为替代形式，它们也可以非吸附状态添加。如果加入百日咳杆菌粘附素，优选其已经吸附在氢氧化铝佐剂上。PT和FHA可吸附到氢氧化铝佐剂或者磷酸铝上。所有PT、FHA和百日咳杆菌粘附素都吸附于氢氧化铝是最优选的。

组合物通常包含：1-50μg/剂的PT；1-50μg/剂的FHA；和1-50μg百日咳杆菌粘附素。优选的含量为约25μg/剂的PT；约25μg/剂的FHA；和约8μg/剂的百日咳杆菌粘附素。

除了PT、FHA和百日咳杆菌粘附素之外，无细胞百日咳疫苗中还可包含菌毛(fimbriae)(例如凝集原2和3)。

灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗

其他抗原可包括灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。脊髓灰质炎病毒可导致脊髓灰质炎。除了使用口服脊髓灰质炎病毒疫苗，其他抗原可使用IPV，详见参考文献102第24章所公开。

脊髓灰质炎病毒可在细胞培养物中生长，优选的培养物采用衍生自猴肾的Vero细胞系。Vero细胞宜在微载体上培养。生长后，可用诸如超滤、渗滤和色谱等技术纯化病毒颗粒。给予患者之前，脊髓灰质炎病毒必需被灭活，这可通过用甲醛处理来实现。

脊髓灰质炎可能由三种类型的脊髓灰质炎病毒之一引起。这三种类型相似，并且引起相同的症状，但它们的抗原性差异很大，被一种类型感染后并不能保护其免受其它类型的感染。因此本发明优选采用三种脊髓灰质炎病毒抗原：1型脊髓灰质炎病毒(例如Mahoney毒株)、2型脊髓灰质炎病毒(例如MEF-1毒株)和3型脊髓灰质炎病毒(例如Saukett毒株)。优选将病毒单独培养、纯化和灭活，然后合并以得到大量用于本发明的三价混合物。

一般用“DU”单位(“D-抗原单位”[104])表示IPV的量。优选每剂量每种病毒类型使用1-100DU，例如80DU的1型脊髓灰质炎病毒，约16DU的2型脊髓灰质炎病毒，约64DU的3型脊髓灰质炎病毒。

脊髓灰质炎病毒抗原优选在用于制备本发明组合物之前不吸附于任何铝盐佐剂，但它们可以在储存期间吸附到疫苗组合物中的铝盐佐剂上。

白喉类毒素

其他抗原可包括白喉类毒素抗原。白喉棒状杆菌（Corynebacteriumdiphtheriae）引起白喉。可处理(例如用***或甲醛)白喉毒素使其脱毒，同时保留其在注射后诱导特异性抗毒素抗体的能力。参考文献102的第13章更详细地公开了白喉疫苗中使用的这些白喉类毒素。优选的白喉类毒素是通过甲醛处理制备的毒素。用可补充有牛提取物的生长培养基(如Fenton培养基，或Linggoud和Fenton培养基)培养白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)，接着进行甲醛处理、超滤和沉淀，从而获得白喉类毒素。通过包括无菌过滤和/或透析的方法处理此类毒素化物质。

可用国际单位(IU)表示白喉类毒素的量。例如，NIBSC提供了'吸附的白喉类毒素的第三国际标准1999'[105,106]，其含有160IU/安瓿。作为IU***的替代形式，‘Lf’单位(″絮凝单位"或"边界絮凝剂量")定义为与一个国际单位的抗毒素混合时，产生最优絮凝混合物的类毒素量[107]。例如，NIBSC提供了'普通白喉类毒素（Diphtheria Toxoid,Plain）'[108]，其含有300LF/安瓿，也提供了'用于絮凝试验的白喉类毒素的第一国际参比试剂'[109]，其含有900LF/安瓿。

组合物通常包含20-80Lf的白喉类毒素，一般约50Lf。

通过IU测定，组合物通常包含至少30IU/剂。

白喉类毒素优选吸附在氢氧化铝佐剂上。

破伤风类毒素

其他抗原可包括破伤风类毒素抗原。破伤风梭菌(Clostridium tetani)导致破伤风。可处理破伤风毒素得到保护性类毒素。参考文献102的第27章中更详细公开了破伤风疫苗中使用的类毒素。优选的破伤风类毒素是经过甲醛处理的类毒素。用生长培养基(如衍生自牛酪蛋白的Latham培养基)培养破伤风梭菌(C.tetani)，然后进行甲醛处理、超滤和沉淀，从而获得破伤风类毒素。然后通过包括无菌过滤和/或透析的方法处理此物质。

可用国际单位(IU)表示破伤风类毒素的量。例如，NIBSC提供了'吸附的破伤风类毒素的第三国际标准2000'[110,111]，其含有469IU/安瓿。作为IU***的替代形式，‘Lf’单位(″絮凝单位"或"边界絮凝剂量")定义为与一个国际单位的抗毒素混合时，产生最优絮凝混合物的类毒素量[107]。例如，NIBSC提供了“用于絮凝试验的破伤风类毒素的第一国际参比试剂”[112]，其含有1000LF/安瓿。

组合物通常包含5-50Lf的破伤风类毒素，一般约20Lf。

通过IU测定，组合物通常包含至少40IU/剂。

破伤风类毒素可以但不必定吸附于氢氧化铝佐剂(例如，可使用占破伤风类毒素总量0-10%的吸附)。

甲型肝炎病毒抗原

其他抗原可包括甲型肝炎病毒抗原。甲型肝炎病毒(HAV)是一种可导致病毒性肝炎的已知物质。参考文献102的第15章公开了HAV疫苗。优选的HAV组分是基于灭活病毒，可通过甲醛处理实现灭活。可以在人胚肺双倍体成纤维细胞，如MRC5细胞上培养病毒。优选的HAV毒株是HM175，但也可采用CR326F。可以在允许病毒生长的条件下培养细胞。裂解细胞，可通过超滤和凝胶渗透色谱纯化所得到的悬液。

以EU(Elisa单位)计，HAV抗原的含量一般为至少约500EU/ml。

乙型肝炎病毒表面抗原

其他抗原可包括乙型肝炎病毒抗原。乙型肝炎病毒(HBV)是一种可导致病毒性肝炎的已知物质。HBV病毒颗粒由被外部蛋白质外壳或衣壳包裹的内部核心组成，病毒核心含有病毒DNA基因组。衣壳的主要成份是一种称为HBV表面抗原，或者更通常称为‘HBsAg’的蛋白质，这是一种分子量约为24kDa的典型226个氨基酸多肽。所有现有乙肝疫苗均含HBsAg，当这种抗原给予正常接种者时能刺激产生抗-HbsAg抗体从而抵御HBV感染。

为生产疫苗，可用两种方法制备HBsAg。第一种方法涉及从慢性乙肝携带者的血浆中纯化特定形式的抗原，因为HBV感染期间肝脏中会合成大量HBsAg并释放到血流中。第二种方法涉及通过重组DNA法表达蛋白质。本发明方法中使用的HBsAg优选在酵母细胞中重组表达。合适的酵母包括例如酵母属（Saccharomyces）(如酿酒酵母(S.cerevisiae))或汉森酵母属(如多形汉森酵母(H.polymorpha))宿主。

HBsAg优选非糖基化。不同于天然HBsAg(即血浆纯化产品中的HBsAg)，酵母表达的HBsAg通常是非糖基化的，且这是可用于本发明的最优选HBsAg形式，因为它为高度免疫原性且可制备而没有血液产品污染风险。

HBsAg通常采用基本呈球形的颗粒形式(平均直径约为20nm)，包括含有磷脂的脂质基质。酵母表达的HBsAg颗粒可含有在天然HBV病毒颗粒中未发现的磷脂酰肌醇。该颗粒也可含有非毒性量的LPS以刺激免疫***[113]。优选的HbsAg为包括含磷脂、磷脂酰肌醇和聚山梨酯20的脂质基质的颗粒形式。

所有已知的HBV亚型都含有共同的决定簇‘a’。与其它决定簇和亚决定簇联合，鉴定到九种亚型：ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq-和adrq+。除了这些亚型，已经出现其它变体，如在免疫个体中检测到的HBV突变体(″逃逸突变体")。本发明最优选使用的HBV亚型是亚型adw2。

除‘S’序列以外，表面抗原可包含所有或部分前-S序列，如所有或部分前-S1和/或前-S2序列。

细胞破碎后，HBsAg纯化的优选方法涉及：超滤；尺寸排阻色谱法；阴离子交换色谱；超速离心；脱盐；无菌过滤。裂解物可在细胞破碎后沉淀（如用聚乙二醇），将HBsAg留在溶液中用于超滤。

纯化后，可对HBsAg进行透析(如用半胱氨酸)，透析可用于去除任何含汞的防腐剂如在HBsAg制备期间可采用的硫柳汞[114]。

HBsAg的量通常以微克表示，每个疫苗剂量中HBsAg的常用量为5-5μg，例如10μg/剂。

虽然HBsAg可吸附于最终疫苗中的氢氧化铝佐剂(例如在熟知的ENGERIX-B^TM产品中)，或者可保持未吸附，其通常吸附于磷酸铝佐剂[115]。

偶联的b型流感嗜血杆菌抗原

其他抗原可包括偶联的b型流感嗜血杆菌(‘Hib’)抗原。Hib引起细菌性脑膜炎。Hib疫苗通常是基于荚膜糖抗原[例如参考文献102的第14章]，其制备已有详尽记载[如参考文献116-125]。

Hib糖可与载体蛋白偶联以提高其免疫原性，尤其是儿童中的免疫原性。通常载体蛋白为破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉类毒素的CRM197衍生物、流感嗜血杆菌蛋白D和脑膜炎球菌血清组B的外膜蛋白复合物。Hib偶联物中的载体蛋白优选与脑膜炎球菌偶联物中的载体蛋白不同，但相同实施方式中可使用同一载体。

破伤风类毒素是优选的载体，产品中采用的统称为'PRP-T'。用溴化氰激活Hib荚膜多糖，将活化的糖偶联于己二酸接头(如(1-乙基1-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)，一般是盐酸盐)，然后将该接头-糖实体与破伤风类毒素载体蛋白反应，从而制备PRP-T。

所述偶联物的糖部分可包含由Hib细菌制备的全长聚核糖基核醣醇磷酸(PRP)，和/或全长PRP的片段。

可使用糖:蛋白质比例(w/w)为1:5(即蛋白质过量)-5:1(即糖过量)的Hib偶联物，例如比例为1:2-5:1，比例为1:1.25-1:2.5。然而在优选疫苗中，糖与载体蛋白的重量比为1:2-1:4，优选1:2.5-1:3.5。在破伤风类毒素以抗原和载体蛋白形式存在的疫苗中，偶联物中糖与载体蛋白的重量比可以是1:0.3-1:2[126]。

Hib偶联物的含量通常以糖质量表示（即，偶联物（载体+糖）作为整体的剂量高于所述剂量），从而避免载体选择引起的变化。Hib糖/剂的常用量为1-30μg，优选约10g。

给予Hib偶联物优选导致抗PRP抗体浓度≥0.15μg/ml，更优选≥1μg/ml，这些是标准应答阈值。

可在根据本发明使用之前将Hib偶联物冻干。也可在冻干前加入其它组分，如稳定剂。所包含的稳定剂优选为乳糖、蔗糖和甘露醇，及其混合物，如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。因此，最终疫苗可含有乳糖和/或蔗糖。使用蔗糖/甘露醇混合物可加速干燥过程。

Hib偶联物可吸附或不吸附于铝盐佐剂。优选其不吸附于氢氧化铝佐剂。

寡核苷酸和聚合物与MenB抗原混合

本发明免疫原性组合物可通过混合寡核苷酸/聚合物复合体的水性悬液和抗原而常规制备。所述复合物通常维持液体形式，因此提供了一种共同配制的简单途径。

在一些实施方式中，一种或多种悬液包含免疫原，从而混合提供了本发明的免疫原性组合物。

当两种液体混合时，混合体积比可以变化(例如为20:1-1:20,10:1-1:10,5:1-1:5,2:1-1:2等)，但理想地是约1:1。可选择两种悬液中的组分浓度，从而在混合后得到所需终浓度，例如两者都可以2x强度制备，从而1:1混合能得到最终所需的浓度。

可使用不同浓度的寡核苷酸和聚阳离子聚合物，例如参考文献58、61、62或127中所用的任何浓度。例如，聚阳离子寡肽可以1100μM、1000μM、350μM、220μM、200μM、110μM、100μM、11μM、10μM、1μM、500nM、50nM等存在。寡核苷酸可以44nM、40nM、20nM、14nM、4.4nM、4nM、2nM等存在。典型的聚阳离子寡肽浓度小于2000nM。对于以摩尔比1:25混合的SEQID NO：1和2，本发明的三个实施方式中以mg/ml计的浓度因而为0.311和1.322,或0.109和0.463,或0.031和0.132。

本发明一些免疫原性组合物包括铝盐和免疫刺激寡核苷酸及聚阳离子聚合物的复合物。在该组合物中，铝盐和免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子聚合物的复合物通常都为颗粒状。铝盐佐剂的平均粒径通常为1-20μm级[66,128]。这也是IC31^TM中所见复合物的粒径范围。当合并这些颗粒时，盐颗粒的平均粒径可基本与复合物的平均粒径相同。然而在其它实施方式中，盐颗粒的平均粒径可比复合物的平均粒径小。在其它实施方式中，盐颗粒的平均粒径可比复合物的平均粒径大。当平均粒径不同时，较大的粒径可以大至少1.05x，如1.1x、1.2x、1.3x、1.4x、1.5x、2x、2.5x、3x或更多倍。如果盐或复合物具有一定范围粒径的颗粒，但是平均粒径不同，范围可以重叠或不重叠。因此，最大的盐颗粒可小于最小的复合物颗粒，或最大的复合物颗粒可小于最小的盐颗粒。

由于颗粒通常太大以至于不能过滤灭菌，本发明免疫原性组合物的灭菌一般通过在无菌条件下制备复合物和铝盐（合适时），然后在无菌条件下将其混合实现的。例如，所述复合物的组分可过滤灭菌。在一些实施方式中，这些无菌复合物可随后与高压灭菌(无菌)的铝盐佐剂混合，得到无菌佐剂组合物。然后该无菌佐剂可与无菌免疫原混合，得到适合给予病人的免疫原性组合物。

铝盐颗粒的密度通常与免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子聚合物的复合物的密度不同，意味着这两种颗粒可根据密度，例如蔗糖梯度分离。

药物组合物

本发明的免疫原性组合物通常包含除了MenB抗原和寡核苷酸和聚合物以外的组分，例如它们通常含有一种或多种药学上可接受的成分。这些成分还可存在于本发明的免疫原性组合物中，可能来自佐剂组合物或另一种组合物。对这类组分的充分讨论参见参考文献129。

组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。疫苗优选应基本不含(如<10μg/ml)含汞物质，如硫柳汞。更优选无汞的疫苗。特别优选无防腐剂的疫苗，可包含α-生育酚琥珀酸酯以替代流感疫苗中的含汞化合物。

为了控制张力，组合物可包含生理盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其浓度可为1-20mg/ml。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和/或氯化镁等。

组合物可具有200mOsm/kg-400mOsm/kg的渗透压，例如240-360mOsm/kg，也可以是280-330mOsm/kg或290-310mOsm/kg。

组合物的pH通常为5.0-8.1，更常为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。

该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。

免疫原性组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。纳入防腐剂对多剂量配置有用。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，所述组合物可包含在装有无菌接头以取出物质的容器中。

在给药时，本发明组合物通常是水性形式。疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，虽然有时可将一半剂量(即约0.25ml)给予例如儿童。在本发明的一些实施方式中，可以更高剂量给予组合物，例如，约1ml，如混合两个0.5ml的体积后。

组合物或药盒组分的包装

适用于本发明免疫原性组合物和药盒组分的容器包括药瓶、注射器(如一次性注射器)等。这些容器应无菌。可将容器包装在一起成为药盒，如装在同一个盒子里。

组分装在药瓶中时，药瓶可由玻璃或塑料制成。在将组合物加入药瓶之前，优选对其进行灭菌。为了避免胶乳过敏对象可能产生的问题，药瓶优选用无胶乳塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。药瓶可包含单一剂量的疫苗，或者可以包含一个以上剂量('多剂量'药瓶)，如10个剂量。有用的药瓶由无色玻璃制成。与钠钙玻璃相比，更优选硼硅酸盐玻璃。药瓶可具有由丁基橡胶制成的瓶塞。

药瓶可以有适合的帽(如鲁尔（Luer）锁)，从而注射器可***该帽。瓶帽可以位于密封物或覆盖物内侧，因此必须去除密封物或覆盖物后才能接触到该帽。药瓶，特别是多剂量药瓶可装有允许无菌取出其内含物的瓶帽。

将某一组分包装到注射器中时，该注射器可连有针头。如果未连接针头，可随注射器提供单独的针头以便组装和使用。这种针头可装在护罩中。注射器的活塞可带有防脱装置，以防止活塞在吸出期间偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，顶帽可由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选装有丁基橡胶护罩。有用的注射器是以商品名"Tip-Lok"^TM销售的注射器。

容器可标注有半剂量体积，例如有利于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可有显示0.25ml体积的标记。

通常多组分产品包含多于对象给药所需的材料，从而尽管物质转移效率低下但仍可以得到完全的最终剂量体积。因此独立的容器可包含过量充装，例如超过5-20%体积。

治疗方法和免疫原性组合物的给予

本发明组合物适合给予人类对象，本发明提供了在对象中产生免疫应答的方法，包括将本发明的免疫原性组合物给予对象的步骤。

本发明也提供一种在对象中产生免疫应答的方法，包括混合本发明药盒中容器的内容物和将所混合内容物给予对象的步骤。

本发明还提供本发明的组合物或药盒用作药物，例如使对象产生免疫应答。

本发明还提供了MenB抗原（如上定义）、免疫刺激性寡核苷酸和聚阳离子聚合物在生产引起对象免疫应答的药物中的应用。

这些方法和应用通常用于产生抗体应答，优选保护性抗体应答。

可以各种方式给予本发明免疫原性组合物。常用的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内、口服、颊部、舌下、皮内、经皮、透皮等。

按照本发明制备的免疫原性组合物可用作疫苗治疗儿童和成年人。对象可小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的对象可以是老年人(如≥50岁，≥60岁，优选≥65岁)、年轻人(如≤5岁)、住院对象、健康护理人员、军队服务人员和军人、怀孕妇女、慢性疾病患者、免疫缺陷对象和出国旅行的人等。铝盐佐剂可在婴儿群体中常规使用，在该年龄组中IC31^TM也是有效的[127,130]。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。

可通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各剂量，例如采用胃肠外初次免疫和粘膜加强免疫、粘膜初次免疫和胃肠外加强免疫等。对于首次免疫对象，给予一个以上的剂量(一般是两个剂量)特别有效。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。

概述

术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。

词语“基本”不排除“完全”，如“基本不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可以从本发明定义中略去词语“基本”。

与数值x相关的术语“约”是可选的并表示例如x±10%。

除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的过程不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将合并物再与第三种组分混合等。

将动物（且具体是牛）材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病（TSE），具体是未患牛海绵状脑病（BSE）的来源。总之，优选在完全不含动物来源材料的情况下培养细胞。

将化合物作为组合物的一部分给予机体时，该化合物可另外由合适的前药替代。

当细胞底物用于重配或反向遗传学方法时，或用于培养病毒时，优选批准用于人类疫苗生产的细胞底物，例如欧洲药典（Ph Eur）通则5.2.3所述的细胞底物。

具体实施方式

佐剂

如参考文献62所述制备IC31复合物。用标准方法制备氢氧化铝佐剂悬液。组合物含氢氧化铝佐剂和IC31时，通过混合所述氢氧化铝佐剂和IC31复合物制备佐剂组合。

对于下述脑膜炎球菌(iii)和(iv)，如参考文献62所述制备高和低浓度（10倍差异）的IC31以及水包鲨烯乳液。对于脑膜炎球菌(iv)，MF59如参考文献65的第10章所述制备。通过以体积比1:1或体积比5:1混合MF59和IC31^高或IC31^低制备佐剂组合。

脑膜炎球菌(i)

参考文献1中公开的组成“5CVMB”疫苗的三种多肽含氢氧化铝和/或IC31佐剂。所述多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:15(参见参考文献1和131)。

在第一组试验中，9组小鼠接受10μg抗原、3mg/ml氢氧化铝和不同剂量的IC31。各组接受以下9种组合物，组7-9与组1-6接受相同的抗原，但配制不同：

	抗原剂量(μg)	IC31体积*(μl)	Al-H(mg/ml)
				1	10	100	3
2	10	50	3
				3	10	25	3
4	10	10	3
				5	10	0	3
6**	10	100	0
				7	10	0	3
8	10	100	3
				9**	10	100	0

使用标准IC31悬液。100μl的这种悬液具有完全强度。较低的体积强度较小。为了保持较低强度的组合物的体积，加入缓冲液至100μl。

**本发明实施方式

测试小鼠血清针对一组脑膜炎球菌菌株的杀菌活性。

针对6种不同的菌株A-F，实验MPO3的杀菌效价如下：

	A	B	C	D	E	F
							1	>65536	4096	8192	4096	256	32768
2	>65536	8192	8192	8192	512	>65536
							3	>65536	4096	4096	8192	512	32768
4	>65536	2048	4096	4096	512	8192
							5	>65536	2048	4096	8192	256	32768
6	>65536	4096	>8192	8192	1024	>65536
							7	>65536	2048	4096	4096	256	4096
8	>65536	>8192	>8192	>8192	512	>65536
							9	32768	8192	>8192	>8192	4096	>65536

因此，Al-H作为唯一佐剂(第5组)获得的效价在整个组中通过加入不同比例的IC31(组1-4)而普遍得到提高。用不同的抗原制剂(比较组7-8)也观察到了相同的效应。

此外，当IC31用作唯一佐剂时(组6和9)，发现所有6种菌株中杀菌效价与Al-H和IC31+Al-H一样高或更高。

测试了9种组合物的pH和渗透压。对于组合物1-5、7和8，pH在6.2-6,6的范围内；组合物6和9具有略高的pH，范围为6.9-7.3。所有组合物的渗透压在280-330mOsm/kg范围内。

脑膜炎球菌(i)

含有三种fHBP变体，顺序为II-III-I的三重融合多肽(如参考文献60中所述，本文中的SEQ ID NO:17)含氢氧化铝和/或IC31佐剂。

在第一组试验中，6组小鼠接受20μg抗原(含或不含纯化标签)、3mg/ml氢氧化铝和100μl IC31。各组接受下列物质：

**本发明实施方式

测试小鼠血清针对一组脑膜炎球菌菌株的杀菌活性。

再次针对一组菌株(总共25株)测试实验MP05的血清。组1(IC31,无标签)和组3(IC31+Al-H,无标签)中56%菌株具有≥1:1024的效价，而组5(Al-OH,无标签)中仅36%菌株具有≥1:1024的效价。相似地，组1和3中76%菌株具有≥1:128的效价，而该效价仅在组5的64％菌株中观察到。因此，没有纯化标签时，用IC31实现最高杀菌效价。

比较带纯化标签抗原的杀菌效价显示组2（IC31,有标签）中84%菌株具有≥1:128的效价。相反，组4（IC31+Al-H）中80%菌株和组6(Al-OH)中仅76%菌株具有≥1:128的效价。因此，存在纯化标签时，单独用IC31实现最高细菌效价。

测试了无标签的组合物(1、3和5)的pH和渗透压。pH的范围是6.87-7.00。渗透压的范围是302-308mOsm/kg。

进一步的免疫原性实验联用fHBP_II-III-I抗原与实验MP04中的NadA与287-953抗原(SEQ ID NO:13和15)，分组和菌株组相同。组1和3测试的菌株中100%具有≥1:128的杀菌效价，相比之下组5中仅为84%。对于更严格的阈值≥1:1024，组1和3中的血清对于88%的菌株具有杀菌性，相比之下第5组中仅为56%。

用带纯化标签的抗原观察到相似结果，其中组2和4内88％具有≥1:128的杀菌效价，相比之下组6仅为80％。

因此，单独用IC31获得最高的抗脑膜炎球菌免疫应答，其至少与IC31+Al-H一样良好且优于单独Al-H。

脑膜炎球菌(iii)

在参考文献1中公开的构成‘5CVMB’疫苗的三种多肽与针对血清组A、C、W135和Y的脑膜炎球菌偶联物的四价混合物联合。所述混合物含Al-H和/或IC31佐剂(高或低浓度)。针对每种血清组A、C、W135和Y中一种菌株组得到的杀菌效价如下：

	A	C	W135	Y
					未免疫	<16	<16	<16	<16
无佐剂	1024	256	128	512
					IC31^高**	32768	16384	4096	4096
IC31^低**	16384	8192	1024	2048
					氢氧化铝	16384	8192	1024	4096
Al-H+IC31^高	16384	32768	4096	8192
					Al-H+IC31^低	8192	65536	2048	8192

**本发明实施方式

因此单独使用IC31时观察到针对血清组A的最佳效价，且针对血清组C、W135和Y的效价高于单独使用Al-H时。

脑膜炎球(iv)

参考文献1中来自脑膜炎球菌血清组B疫苗的抗原含MF59、IC31^高、IC31^低佐剂或其组合。测试免疫小鼠的血清针对各种脑膜炎球菌菌株的杀菌活性。代表性结果包括：

菌株→	A	B	C	D	E	F	G	H
									IC31^低**	1024	256	4096	2048	256	64	512	<16
MF59+IC31^低	4096	1024	4096	2048	1024	128	4096	<16
									MF59	32768	1024	32768	4096	2048	128	4096	<16
MF59+IC31^高	8192	2048	8192	32768	2048	128	8192	<16
									IC31^高**	16384	2048	16384	32768	2048	512	4096	<16

**本发明实施方式

单独使用IC31在B、D、E和F菌株中引发最高的杀菌效价，以及A、C和G中次高的效价。

这些脑膜炎球菌B蛋白抗原还可与血清组A、C、W135和Y抗原的偶联糖抗原组合，并用相同的佐剂混合物测试。针对来自各血清组的测试菌株的杀菌效价如下：

抗原→	A	C	W135	Y
					IC31^低**	16384	8192	1024	2048
MF59+IC31^低	4096	8192	4096	8192
					MF59	16384	8192	2048	4096
MF59+IC31^高	8192	16384	4096	4096
					IC31^高**	32768	16384	4096	4096

**本发明实施方式

因此，用IC31时就血清组A、C和W135观察到最高杀菌效价。

脑膜炎球(v)

含有fHBP三种变体（以II-III-I的顺序）的组合物+961+287-953（标注为rMenB1）添加Al-H、IC31或IC31+Al-H佐剂。这些组合物与添加Al-H佐剂的含936-741+961+287-953+OMV的组合物(rMenB2)作比较。

测试免疫小鼠的血清针对12种脑膜炎球菌菌株的杀菌活性。发现含单独IC31佐剂的rMenB1在12种测试菌株中引起的%覆盖率高于任何其他组合物(如>90%的覆盖率，相比rMenB2的50%覆盖率)。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，在本发明的范围和构思内可对之进行修改。

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Claims

1.一种免疫原性组合物，所述组合物包括(i)脑膜炎球菌血清组B抗原和(ii)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的佐剂；其中(i)所述免疫原性组合物不包括铝盐；(ii)所述免疫原性组合物不包括水包油乳液;(iii)所述脑膜炎球菌血清组B抗原不包括含选自SEQ ID NO 13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸序列的多肽；和(iv)所述免疫原性组合物不包括fHBP抗原。

2.一种免疫原性组合物，所述组合物包括(i)脑膜炎球菌血清组B抗原；(ii)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的佐剂；和(iii)选自肺炎球菌抗原、白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳抗原、HBsAg、HAV抗原、Hib抗原和/或IPV的一种或多种其他抗原。

3.一种免疫原性组合物，所述组合物包括(i)纯化的脑膜炎球菌脂寡糖；和(ii)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的佐剂。

4.如权利要求2或3所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物还包括一种或多种(i)铝盐;和(ii)水包油乳液。

5.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述寡核苷酸和聚合物彼此结合形成复合物。

6.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫刺激性寡核苷酸为单链且具有10-100核苷酸。

7.如权利要求6所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述寡核苷酸是5'-(IC)₁₃-3'。

8.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述聚阳离子聚合物是肽。

9.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述肽包含一个或多个Leu-Leu二肽序列，一个或多个Lys-Lys二肽序列，和/或一个或多个Arg-Arg二肽序列。

10.如权利要求8或9所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述肽含有一个或多个Lys-Leu二肽序列和/或一个或多个Lys Leu-Lys三肽序列。

11.如权利要求8-10中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述肽具有5-50个氨基酸。

12.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述肽具有氨基酸序列KLKLLLLLKLK。

13.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述寡核苷酸和聚合物以1:25的摩尔比存在。

14.一种制备前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括混合(i)免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物和(ii)脑膜炎球菌血清组B抗原的步骤。

15.一种药盒，所述药盒包括：(i)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的第一容器和(ii)含脑膜炎球菌血清组B抗原的第二容器；其中所述免疫原性组合物不包括铝盐；(ii)所述免疫原性组合物不包括水包油乳液;(iii)所述脑膜炎球菌血清组B抗原不包括SEQ ID 13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的肽；和(iv)所述免疫原性组合物不包括fHBP抗原。

16.一种药盒，所述药盒包括(i)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的第一容器和(ii)含脑膜炎球菌血清组B抗原的第二容器，其中所述脑膜炎球菌血清组B抗原是纯化的脑膜炎球菌脂寡糖。

17.一种药盒，所述药盒包括(i)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的容器和(ii)含脑膜炎球菌血清组B抗原的容器和(iii)含选自肺炎球菌糖抗原、白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳抗原、HBsAg、HAV抗原、Hib抗原和/或IPV的一种或多种其他抗原的容器。

18.一种免疫原性组合物，所述组合物包括(i)由MenB抗原、脑膜炎奈瑟球菌血清组A的偶联荚膜糖、脑膜炎奈瑟球菌血清组C的偶联荚膜糖、脑膜炎奈瑟球菌血清组W135的偶联荚膜糖、脑膜炎奈瑟球菌血清组Y的偶联荚膜糖组成的5价抗原组分；和(ii)含免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子聚合物的佐剂，前提是所述免疫原性组合物不包括铝盐且不包括水包油乳液。