JP2003523208A - 髄膜炎菌表面抗原ＮｈｈＡの保存領域を含むタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）表面抗原の修飾型を構成する新規なタンパク質、およびコードする核酸が提供される。修飾された表面タンパク質は、非保存アミノ酸の欠失を有することを特徴とし、それにより髄膜炎菌に対する交差保護的な免疫応答を誘発することができる。本発明は、診断薬、治療薬、予防ワクチン、ならびに医薬品の設計および／またはスクリーニングにおける、修飾された表面抗原の使用にまで及ぶ。修飾された表面抗原は、対応する野生型の表面抗原から予想されるよりも広いスペクトルの髄膜炎菌菌株に対して効果的な免疫化を生じさせるワクチンにおいて特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）表面
抗原の修飾型を構成する新規なタンパク質、そのような新規なペプチドおよびポ
リペプチドをコードする核酸、診断におけるそれらの使用、治療ワクチンおよび
予防ワクチンにおけるそれらの使用、ならびに医薬のデザインおよび／またはス
クリーニングにおけるこれらの使用に関する。より詳細には、非保存アミノ酸を
欠失させることによって、本発明の修飾型表面抗原は、対応する野生型の表面抗
原から予想されるよりも広い範囲の髄膜炎菌菌株に対して効果的な免疫化をもた
らすワクチンにおいて有用であり得る。

【０００２】 （発明の背景） 髄膜炎菌はグラム陰性細菌であり、髄膜炎菌性の髄膜炎および敗血症の原因菌
である。その唯一の知られている宿主はヒトであり、集団の約１０％が無症状的
に髄膜炎菌を保有する場合がある（Ｃａｕｇａｎｔら、１９９４、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３２ ３２３）。

【０００３】 髄膜炎菌は多糖の莢膜を発現し得る。これにより、この細菌を、発現した莢膜
の性質に従って分類することができる。髄膜炎菌の少なくとも１２種の血清群（
Ａ、Ｂ、Ｃ、２９−Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺ）が存在す
る。これらのうち、Ａ、ＢおよびＣの血清群が髄膜炎菌性疾患の９０％を引き起
こしている（Ｐｏｏｌｍａｎら、１９９５、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔ
ｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ４ １３）。ＡおよびＣの血清群に対するワクチ
ンを得ることができるが、血清群Ｂの莢膜多糖は免疫原性が良くなく、ヒトにお
いて保護を誘導しない。

【０００４】 したがって、他の膜成分および細胞外成分が、現在、ワクチンに含ませるため
のその好適性について調べられている。例として、クラス１、２および３の外膜
タンパク質（ポリン；ｐｏｒ遺伝子によってコードされる）、ならびにクラス４
の外膜タンパク質（Ｒｍｐ）およびクラス５の外膜タンパク質（Ｏｐａｃｉｔｙ
タンパク質；ｏｐａ遺伝子およびｏｐｃ遺伝子によってコードされる）が挙げら
れる。

【０００５】 しかし、今日まで、これらの候補物はどれも、特に小児において完全な保護を
誘導することができない（Ｒｏｍｅｒｏら、１９９４、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ、７ ５５９；Ｐｏｏｌｍａｎら、１９９
５、前掲）。

【０００６】 効果的なワクチンを作製するためには、大部分の菌株に存在し、かつ保護的な
免疫応答（例えば、殺菌性抗体）を誘導することができる髄膜炎菌成分を同定す
ることが必要である。

【０００７】 これに関連して、国際公開公報第９９／２４５７８号、同第９９／３６５４４
号、同第９９／５８６８３号および同第９９／５７２８０号が参照される。これ
らはそれぞれが引用により本明細書に組み込むものとされ、そして髄膜炎菌に対
して免疫化するワクチンにおいて有用であり得る候補タンパク質を多数記載する
。

【０００８】 これに関連して、国際公開公報第９９／３１１３２号、およびＰｅａｋら、２
０００、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８ ３２
９が特に参照される。これらはそれぞれが引用により本明細書に組み込むものと
され、そして髄膜炎菌の多数の異なる菌株から単離された新規な表面抗原を記載
する。そのような表面抗原およびその対立遺伝子変異体は、本明細書の目的のた
めにはＮｈｈＡと呼ばれる。

【０００９】 （発明の概要） 本発明者らは、ＮｈｈＡ表面抗原が、髄膜炎菌の菌株間で変動し得るポリペプ
チド領域と、菌株間で保存されている他の領域とを有することを発見した。この
可変性領域は、髄膜炎菌の特定の菌株に由来するＮｈｈＡ抗原を取り込むワクチ
ンがその特定の菌株に対する優先的な免疫化を生じさせやすいように、免疫原性
であり、菌株特異的な免疫応答を誘発しやすいと考えられる。その結果、本発明
者らは、野生型ＮｈｈＡによって誘発される免疫応答と同じくらい菌株特異的で
ない免疫応答を誘発する修飾されたＮｈｈＡポリペプチドを製造することを試み
た。この修飾されたＮｈｈＡ抗原は、本明細書下記に記載されるように、髄膜炎
菌に対する治療ワクチンおよび／または予防ワクチンを製造するために有用であ
る。免疫応答を主に保存されたエピトープに対して指向させることによって、そ
のようなワクチンは、野生型ＮｈｈＡによる免疫化の後に期待されるよりも広い
スペクトルの髄膜炎菌菌株に対して効果的な免疫化を生じさせるはずである。

【００１０】 したがって、本発明は、一般には、ＮｈｈＡポリペプチドの保存されたアミノ
酸を有する単離タンパク質に関する。 したがって、本発明のタンパク質は、対応する野生型ＮｈｈＡポリペプチドと
比較して、非保存アミノ酸の１または複数の欠失を有し得る。

【００１１】 第１の態様において、本発明は、ＮｈｈＡポリペプチドの１２個以上の連続し
た保存アミノ酸の配列を含み、かつ野生型ＮｈｈＡポリペプチドを含まない単離
タンパク質を提供する。

【００１２】 好適には、本発明のタンパク質は免疫応答を誘発することができる。 好ましくは、免疫応答は、該対応する野生型ＮｈｈＡポリペプチドによって誘
発される免疫応答よりも小さい菌株特異性を有する。 より好ましくは、該免疫応答は、髄膜炎菌の１または複数の菌株に対する保護
をもたらし、またはさらにより好ましくは髄膜炎菌の多数の菌株に対する保護を
もたらす。

【００１３】 野生型ＮｈｈＡポリペプチドの配列が図１に例示される（配列番号１〜１０）
。 コンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）アミノ酸配列もまた図１に示される（配
列番号１１）。

【００１４】 本発明の単離タンパク質は、好ましくは、本明細書では図１におけるＣ１領域
、Ｃ２領域、Ｃ３領域、Ｃ４領域およびＣ５領域と呼ばれるＮｈｈＡポリペプチ
ドの定常領域を１つまたは複数含む。

【００１５】 好適には、図１においてＶ１領域、Ｖ２領域、Ｖ３領域またはＶ４領域と呼ば
れるＮｈｈＡポリペプチドの可変領域の１または複数の非保存アミノ酸が、野生
型ＮｈｈＡポリペプチドに関して欠失していることがこの態様に従って理解され
る。

【００１６】 好ましくは、Ｖ１領域または少なくともその実質的な部分が欠失している。 特定の態様において、単離タンパク質は、「本発明の修飾されたＮｈｈＡポリ
ペプチド」の例である図５〜９（配列番号２３〜２７）のいずれか１つに示され
るアミノ酸配列を有する。図１４（配列番号３３〜３９）には、Ｎ末端シグナル
配列の除去をもたらすことが予想される「成熟」ポリペプチドのさらなる例が示
される。

【００１７】 第２の態様により、本発明は、第１の態様によるポリペプチドをコードする単
離核酸を提供する。 野生型ｎｈｈＡの核酸配列が図２に例示される（配列番号１２〜２１）。 コンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）核酸配列もまた図２に示される（配列番
号２２）。

【００１８】 好ましくは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５の領域が、図２に示されるそ
れぞれのヌクレオチド配列によってコードされる。 好ましくは、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４の領域が、図２に示されるそれぞれ
のヌクレオチド配列によってコードされる。

【００１９】 特定の態様において、本発明の単離核酸は、「本発明の修飾ｎｈｈＡ核酸」の
特定の例である図５〜９（配列番号２８〜３２）のいずれか１つに示されるヌク
レオチド配列を有する。

【００２０】 第１および第２の態様による本発明は、本発明の単離タンパク質および核酸の
ホモログ、フラグメント、変異体および誘導体にまで及ぶ。 野生型のＮｈｈＡポリペプチドおよびｎｈｈＡ核酸は本発明の範囲から特に除
かれる。

【００２１】 第３の態様において、本発明は、発現ベクターおよび第２の態様による核酸を
含む発現構築物にある。この場合、該配列は、該発現ベクターにおいて１または
複数の調節核酸に作動的に連結されている。

【００２２】 第４の態様において、本発明は、第３の態様による発現構築物を含む宿主細胞
を提供する。 本発明の第５の態様では、第１の態様による組換え単離タンパク質を製造する
方法であって、 （ｉ）第３の態様による発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが該
宿主細胞において発現されるように培養する工程と、 （ｉｉ）該組換えタンパク質を単離する工程と、 から成る方法を提供する。

【００２３】 第６の態様において、本発明は、本発明のタンパク質、そのフラグメント、変
異体または誘導体に結合する抗体または抗体フラグメントを提供する。

【００２４】 第７の態様において、本発明は、髄膜炎菌を含むことが疑われる生物学的サン
プルにおいて髄膜炎菌を検出する方法であって、 （ｉ）生物学的サンプルを個体から単離する工程と、 （ｉｉ）前記の抗体または抗体フラグメントを生物学的サンプルと接触させる工
程と、 （ｉｉｉ）髄膜炎菌の存在を示す特異的に結合した抗体または抗体フラグメント
を検出する工程と、 から成る方法を提供する。

【００２５】 第８の態様において、髄膜炎菌細菌を含むことが疑われる生物学的サンプルに
おいて髄膜炎菌細菌を検出する方法であって、 （ｉ）生物学的サンプルを患者から単離する工程と、 （ｉｉ）該細菌の存在を示す、前記第２の態様による核酸配列を該サンプルに
おいて検出する工程と、 から成る方法を提供する。

【００２６】 第９の態様において、本発明は、髄膜炎菌による個体の感染を診断する方法で
あって、 （ｉ）個体から得られた生物学的サンプルを本発明のポリペプチド、フラグメン
ト、変異体または誘導体と接触させる工程と、 （ｉｉ）該ポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体と該サンプル中の
髄膜炎菌特異的抗体との複合体の存在の有無を測定する工程であって、該複合体
の存在により該感染が示される工程と、 から成る方法を提供する。

【００２７】 好ましくは、個体は哺乳動物である。 より好ましくは、個体はヒトである。 第１０の態様において、本発明はまた、生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌細
菌を検出するキットにおける、前記第１の態様による単離タンパク質の使用、前
記第２の態様による単離核酸の使用、または上記に記載された抗体もしくは抗体
フラグメントの使用にまで及ぶ。

【００２８】 本発明の第１１の態様により、前記第１の態様による単離タンパク質を含む医
薬組成物が提供される。

【００２９】 好ましくは、該医薬組成物はワクチンである。 第１２の態様において、本発明は、薬学的に効果的な量の上記ワクチンを投与
する工程を含む、髄膜炎菌による患者の感染を防止する方法を提供する。 第１３の態様において、本発明は、前記第１の態様による単離タンパク質、変
異体または誘導体の免疫原性フラグメントを同定する方法であって、 （ｉ）該ポリペプチド、変異体または誘導体のフラグメントを製造する工程と、 （ｉｉ）該フラグメントを個体に投与する工程と、 （ｉｉｉ）髄膜炎菌および／または該ポリペプチド、変異体もしくは誘導体に特
異的に結合するエレメントの産生、および／または髄膜炎菌の感染に対する保護
作用を含む該個体における免疫応答を検出する工程と、 から成る方法を提供する。

【００３０】 好ましくは、個体は哺乳動物である。 より好ましくは、個体はヒトである。

【００３１】 （発明の詳細な説明） 本明細書を通して、別途示されない限り、表現「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ
」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、任意の他の
要素または要素群を除外することなく、述べられた要素または要素群を包含する
ことを意味することが理解される。

【００３２】 命名法に関して、ＮｈｈＡは、本明細書では本発明のタンパク質が参照される
ときに使用され、一方、ｎｈｈＡは、本明細書では本発明の核酸が参照されると
きに使用される。ＮｈｈＡ／ｎｈｈＡのタンパク質および核酸は、例えば国際公
開公報第９９／３１１３２号において参照されるＨｉａＮｍ／ｈｉａｎｍのタン
パク質および核酸（これらに限定されない）を包含することもまた理解される。

【００３３】 本発明は、少なくとも一部は、１０菌株の髄膜炎菌におけるＮｈｈＡポリペプ
チドにおける保存領域およびあまり保存されてない領域を解明することによって
予測される。対応する領域が、例示されたＮｈｈＡポリペプチドの他の対立遺伝
子変異体において保存されていることが予測される。

【００３４】 本発明にとって重要なことは、野生型ＮｈｈＡポリペプチド内の非保存アミノ
酸を欠失させて、本発明の修飾されたＮｈｈＡポリペプチドを作製することによ
って、免疫応答が、その免疫応答を保存されたエピトープに対して指向させるこ
とにより１または複数の異種の髄膜炎菌菌株に対する保護をもたらす本発明の該
ポリペプチドで免疫化したときに誘発され得るという認識であることが理解され
る。

【００３５】 本明細書で使用される「非保存」アミノ酸は、１つの髄膜炎菌に由来する野生
型ＮｈｈＡポリペプチドには存在するが、１または複数の他の菌株に由来する野
生型ＮｈｈＡポリペプチドには存在していないアミノ酸残基である。

【００３６】 好適には、第１の態様のポリペプチドは、対応する野生型の配列に関して、Ｖ
１領域、Ｖ２領域、Ｖ３領域またはＶ４領域のいずれかの少なくとも一部が欠失
しており、そのため、「欠失変異体」の例としてまとめて示されることがある。

【００３７】 本発明は、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４の領域を、比較的保存されたＣ１〜Ｃ
５の領域と比較して、非保存アミノ酸の頻度が比較的多い野生型ＮｈｈＡポリペ
プチドの領域であるとして同定していることが理解される。

【００３８】 これらのＶ領域のなかで、Ｖ１（超可変）およびＶ２の領域は非保存アミノ酸
の最も大きな頻度を有し、一方、Ｖ３およびＶ４は比較的少ない頻度を有する。
しかし、Ｖ１領域は、（総アミノ酸に関して）Ｖ２領域よりも、野生型ＮｈｈＡ
ポリペプチドの重要な割合を構成している。したがって、前記第１の態様による
単離タンパク質はＶ１領域の少なくとも実質的な部分が欠失していることが好ま
しい。

【００３９】 該欠失変異体を構築する際には、異なる髄膜炎菌菌株のＮｈｈＡポリペプチド
間での領域の「シャフリング」が可能であることもまた当業者によって理解され
るであろう。例えば、本発明のＮｈｈＡポリペプチドは、ＰＭＣ２１のＣ５領域
とともにＨ４１のＣ１領域を含むことができる。

【００４０】 そのような「シャフリング」は組換えＤＮＡ法には特に十分に適している。 本発明の目的で、「単離された」とは、その天然の状態から取り除かれている
か、またはそうでなければヒトの操作に供されている材料を意味する。単離され
た材料は、その天然の状態で通常それに伴う成分を実質的または本質的に含まな
くてもよく、あるいはその天然の状態で通常それに伴う成分とともに人工的な状
態で存在するように操作されていてもよい。単離された材料は天然形態または組
換え形態であってもよい。

【００４１】 「タンパク質」は、アミノ酸のポリマーを意味する。アミノ酸は、当技術分野
において十分に理解されているように、天然型または非天然型のアミノ酸であり
得る。

【００４２】 「ペプチド」は、５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質である。 ポリペプチドは、５０個以上のアミノ酸を有するタンパク質である。 本明細書で使用される表現「免疫応答を誘発する」は、本発明の単離されたポ
リペプチドにより、それが投与される哺乳動物において免疫応答がもたらされ得
ることをいう。この場合、応答は、髄膜炎菌および／または該ポリペプチドに対
するものである。好ましくは、免疫応答は殺菌性抗体の産生を包含する。より好
ましくは、免疫応答は、髄膜炎菌感染に対して保護的である。

【００４３】 「菌株特異的」は、本明細書では、自己の髄膜炎菌菌株に指向するか、または
自己の髄膜炎菌菌株に対して少なくとも優勢的に指向する免疫応答の意味で使用
される。

【００４４】 本明細書中で使用される「交差反応的」は、１または複数の異種の髄膜炎菌菌
株に対する免疫応答が本発明のポリペプチドにより誘発され得ることを意味する
。

【００４５】 本明細書中で使用される「交差保護的」は、本発明のポリペプチドにより、免
疫応答が誘発され、それにより、１または複数の異種の髄膜炎菌菌株による感染
に対する保護がもたらされ得ることを意味する。

【００４６】 したがって、前記に照らして、本発明の該ポリペプチドは、本明細書では、「
免疫原」として、または「免疫原性」であると呼ばれることがある。 本発明の目的のために、該修飾されたＮｈｈＡポリペプチドは、図５〜９（配
列番号２３〜２７）および図１４に示されるアミノ酸配列により例示されるが、
本発明ではまた、例示されたタンパク質のフラグメント、誘導体および変異体（
対立遺伝子変異体など）も考えられる。

【００４７】 例えば、アミノ酸を、菌株特異的な免疫原性を低下させるために、図１に示さ
れるＣ１〜Ｃ５の配列のいずれかから欠失させることができ、一方で、Ｖ１〜Ｖ
４の領域における非保存アミノ酸は必ずしもすべて欠失させる必要はない。

【００４８】 したがって、本発明の単離タンパク質は、Ｃ１〜Ｃ５およびＶ１〜Ｖ４の領域
のフラグメントを含むことができる。 実際、下記の実施例に記載されるように、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ
部位を利用して、安定した免疫原性タンパク質の高レベルな発現を達成するため
に、Ｃ１領域、Ｃ２領域、Ｃ３領域、Ｃ４領域および／またはＣ５領域あるいは
Ｖ１領域、Ｖ２領域、Ｖ３領域および／またはＶ４領域の１個または数個のアミ
ノ酸を欠失させることは、本発明のポリペプチドを組換えＤＮＡに基づいて製造
するためには好都合であり得る。

【００４９】 １つの態様において、「フラグメント」は、該Ｃ１領域、Ｃ２領域、Ｃ３領域
、Ｃ４領域またはＣ５領域の１００％未満であるが、少なくとも２０％、好まし
くは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましく
は少なくとも９０％を構成するアミノ酸配列を含む。

【００５０】 フラグメントは、例えば、Ｃ２領域（配列番号１１）などの１２個もの少数の
アミノ酸、あるいは本明細書に記載されるＣ１領域、Ｃ２領域、Ｃ３領域、Ｃ４
領域および／またはＣ５領域の一部またはすべてに対応する少なくとも２０個の
連続したアミノ酸または１００個を越える連続したアミノ酸を含むペプチドであ
り得る。

【００５１】 本明細書に例示される他のフラグメントは、図１４に示されるなどの成熟ポリ
ペプチドが形成されるために翻訳後プロセシングを受けている本発明の修飾され
たＮｈｈＡポリペプチドである。

【００５２】 別の態様において、「フラグメント」は、例えば、少なくとも６個、好ましく
は少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸の長さである
小ペプチドで、本発明の修飾されたＮｈｈＡタンパク質に由来する１または複数
の抗原決定基またはエピトープを含む小ペプチドである。２つ以上のペプチドを
含むより大きいフラグメントもまた考えられ、これらは、標準的な組換え核酸技
術を適用して得ることができ、または従来の液相合成技術もしくは固相合成技術
を使用して合成することができる。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎにより編集され
、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓによ
り発行された「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」と題される刊行物に含
まれる、ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｈａｒｄによる「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ」と題される第９章に記載されるような溶液合成または固相合
成を例えば参照することができる。または、ペプチドは、本発明のポリペプチド
をプロテイナーゼ（ｅｎｄｏＬｙｓ−Ｃ、ｅｎｄｏＡｒｇ−Ｃ、ｅｎｄｏＧｌｕ
−Ｃおよびブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼなど）で消化することによって製造する
ことができる。消化されたフラグメントは、例えば、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）技術によって精製することができる。

【００５３】 本明細書で使用される「変異体」ポリペプチドは、１または複数のアミノ酸が
異なるアミノ酸で置換されている本発明のポリペプチドである。いくつかのアミ
ノ酸を、ポリペプチドの活性の性質を変化させることなく、ほぼ類似する性質を
有する別のアミノ酸に変化させること（保存的置換）ができることが当技術分野
では十分に理解されている。ポリペプチドにおける例示的な保存的置換を表２に
従って行うことができる。

【００５４】 機能の実質的な変化は、表２に示される置換よりも低い保存的な置換を選択す
ることによって行われる。他の置換は非保存的な置換であるが、これらの比較的
少数が許容され得る。一般に、ポリペプチドの性質において最大の変化をもたら
す可能性がある置換として、（ａ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）
で疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）を置換
する置換、または親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）を疎水性残基（例
えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）で置換する置換；（ｂ）
システインまたはプロリンで任意の他の残基を置換する置換、またはシステイン
またはプロリンを任意の他の残基で置換する置換；（ｃ）電気的陽性側鎖を有す
る残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）で電気的陰性残基（例えば、Ｇ
ｌｕまたはＡｓｐ）を置換する置換、または電気的陽性側鎖を有する残基（例え
ば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）を電気的陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡ
ｓｐ）で置換する置換、あるいは（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例えば、Ｐｈ
ｅまたはＴｒｐ）で、小型側鎖を有する残基（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）もしく
は側鎖を有しない残基（例えば、Ｇｌｙ）を置換する置換、または嵩高い側鎖を
有する残基（例えば、ＰｈｅまたはＴｒｐ）を、小型側鎖を有する残基（例えば
、Ａｌａ、Ｓｅｒ）もしくは側鎖を有しない残基（例えば、Ｇｌｙ）で置換する
置換が挙げられる。

【００５５】 用語「変異体」はまた、本明細書に例示される配列の対立遺伝子変異体から作
製された本発明のＮｈｈＡポリペプチドを包含する。 ＮｈｈＡポリペプチドの変異体は、用語「ポリペプチドホモログ」の範囲に含
まれることがある。

【００５６】 ポリペプチドホモログは、本明細書前記に記載される本発明の修飾されたＮｈ
ｈＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８
０％、より好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する。

【００５７】 本明細書で一般に使用される「ホモログ」は、場合により、本発明の核酸また
はポリペプチドとの規定され得るヌクレオチド配列関係またはアミノ酸配列関係
を有する。

【００５８】 例えば、本明細書に例示されるアミノ酸配列とは異なるが、免疫原性で、交差
保護免疫性をもたらすアミノ酸配列を有するようなホモログが考えられる。 野生型のＮｈｈＡポリペプチドおよびｎｈｈＡ核酸は用語「ホモログ」の範囲
から特に除かれる。

【００５９】 ホモログの範囲には、髄膜炎菌とは異なる細菌株から単離される、機能的に関
連するポリペプチドおよびそのコードする核酸である「オルソログ」が含まれる
。

【００６０】 それぞれの核酸間およびそれぞれのポリペプチド間の配列関係を記載するため
に本明細書で使用される用語には、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配
列同一性のパーセンテージ」および「実施的な同一性」が含まれる。それぞれの
核酸／ポリペプチドはそれぞれ、（１）核酸／ポリペプチドが互いに有する完全
な核酸／ポリペプチド配列の１または複数の部分のみ、および（２）核酸／ポリ
ペプチド間で異なる１または複数の部分を含み得るので、配列比較は、配列類似
性の局所的領域を同定して比較するために「比較ウインドウ」について配列を比
較することによって典型的には行われる。「比較ウインドウ」は、参照配列と比
較される典型的には１２個の連続した残基の概念的なセグメントをいう。比較ウ
インドウは、それぞれの配列を最適にアラインメントするために、（付加または
欠失を含まない）参照配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち
、ギャップ）を含むことができる。比較ウインドウをアラインメントするための
配列の最適なアラインメントは、アルゴリズムのコンピューター化された手段（
ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓによるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；Ｗｉｓ
ｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）におけるＧＡＰ
、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、これらは引用により本明細
書に組み込むものとする）によって、または精査、もしくは選択された様々な方
法のいずれかにより得られた最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウ
について最大のパーセンテージ相同性をもたらすアラインメント）によって行う
ことができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５ ３３８９（これは引用により本明細書に組み込むものとする）
により記載されるようなＢＬＡＳＴファミリーのプログラムもまた参照すること
ができる。

【００６１】 配列分析の詳細な議論を、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯ
ＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（編者：Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ ＮＹ、１９９５〜１９９９）のユニット１９．３に見
出すことができる。

【００６２】 用語「配列同一性」は、比較ウインドウについて配列が同一である範囲を考慮
して標準的なアルゴリズムを使用する適切なアラインメントを考慮した正確なヌ
クレオチド一致またはアミノ酸一致の数を含むようにその最も広い意味で本明細
書では使用される。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最
適にアラインメントされた配列を比較ウインドウについて比較し、一致した位置
の数を得るために、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両方の配
列に存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の
総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算して、配列同一性のパーセンテージ
を得るためにその結果を１００倍することによって計算される。例えば、「配列
同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータープログラム（ウインドウス用バージョ
ン２．５；Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ
．、Ｌｔｄ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ、ＵＳＡ）から入手可能）により計算される「一致パーセンテージ」を意味す
ることが理解され得る。

【００６３】 したがって、本明細書の前記に規定されるような変異体などの本発明のポリペ
プチドホモログを組換えＤＮＡ技術によって調製することは十分に当業者の能力
の範囲内である。例えば、本発明の核酸は、例えばトランスポゾン変異誘発法を
使用するランダム変異誘発法または部位特異的変異誘発法のいずれかを使用して
変異させることができる。得られたＤＮＡフラグメントは、その後、従来の技術
を使用して大腸菌などの好適な発現宿主にクローン化され、そして所望する活性
を保持するクローンが検出される。そのようなクローンが、ランダム変異誘発技
術を使用して得られた場合、陽性のクローンは、変異を検出するために配列決定
しなければならない。

【００６４】 本明細書で使用される「誘導体」ポリペプチドは、当技術分野において理解さ
れるように、例えば、他の化学的成分とのコンジュゲート化または複合体化によ
って、あるいは翻訳後修飾技術によって変化している本発明のポリペプチドであ
る。そのような誘導体には、アミノ酸欠失体および／または本発明のＮｈｈＡポ
リペプチドもしくはその変異体に対するアミノ酸付加体が含まれ、該誘導体によ
り免疫応答が誘発される。

【００６５】 アミノ酸の「付加（体）」は、ポリペプチドまたはその変異体と他のポリペプ
チドまたはタンパク質との融合を包含し得る。これに関連して、本発明のポリペ
プチドまたは変異体はより大きなポリペプチドに組み込まれ得ることが理解され
、そしてそのようなより大きなポリペプチドもまた免疫原性であることが予想さ
れ得る。上記に記載されるポリペプチドは、例えば、髄膜炎菌に由来しないさら
なるタンパク質に融合させることができる。そのような他のタンパク質は、例と
して、タンパク質の精製を助けることができる。例えば、ポリヒスチジンタグま
たはマルトース結合タンパク質を使用することができる。または、髄膜炎菌に対
して効果的な免疫応答を生じさせることができるか、または別の病原体に対する
免疫応答を生じさせることができる。他の可能な融合タンパク質は、免疫調節的
な応答を生じさせる融合タンパク質である。そのようなタンパク質の具体的な例
として、プロテインＡまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が
含まれる。さらに、ポリペプチドは、それが担体タンパク質として作用する多糖
型ワクチン成分に融合させることができる。

【００６６】 本発明により考えられる他の誘導体には、側鎖に対する修飾、ペプチド、ポリ
ペプチドまたはタンパク質を合成しているときにおける様々な非天然アミノ酸お
よび／またはそれらの誘導体の取り込み、ならびに本発明のポリペプチド、フラ
グメントおよび変異体に立体配座的な制約を負わす架橋剤および他の方法の使用
が含まれるが、これらに限定されない。本発明により考えられる側鎖修飾の例に
は、無水酢酸を用いたアシル化によるなどのアミノ基の修飾；無水コハク酸およ
び無水テトラヒドロフタル酸を用いたアミノ基のアシル化；メチルアセトイミダ
ートを用いたアミド化；シアナートを用いたアミノ基のカルバモイル化；ピリド
キサール−５−ホスファートを用い、その後、ＮａＢＨ４で還元することによる
リシンのピリドキシル化；アルデヒドと反応させ、その後、ＮａＢＨ４で還元す
ることによる還元的アルキル化；および２, ４, ６−トリニトロベンゼンスルホ
ン酸（ＴＮＢＳ）を用いたアミノ基のトリニトロベンジル化が含まれる。

【００６７】 カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソウレアの形成を介するカルボジイミド活性
化を行い、その後、続いて誘導体化して、例として、対応するアミドにすること
によって修飾することができる。

【００６８】 アルギニン残基のグアニジン基は、２, ３−ブタンジオン、フェニルグリオキ
サールおよびグリオキサールなどの試薬を用いて複素環縮合生成物を形成させる
ことによって修飾することができる。

【００６９】 スルフヒドリル基は、システイン酸への過ギ酸酸化などの方法；４−クロロメ
ルクリフェニルスルホン酸、４−クロロメルクリ安息香酸；２−クロロメルクリ
−４−ニトロフェノール、フェニル水銀塩化物および他の水銀化合物を使用する
水銀誘導体の形成；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミ
ド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；ヨード酢酸またはヨー
ドアセトアミドを用いたカルボキシメチル化；ならびにアルカル性ｐＨでシアナ
ートを用いたカルバモイル化によって修飾することができる。

【００７０】 トリプトファン残基は、例えば、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル臭化物
もしくはハロゲン化スルホニルを用いたインドール環のアルキル化によって、ま
たはＮ−ブロモスクシンイミドを用いた酸化によって修飾することができる。

【００７１】 チロシン残基は、テトラニトロメタンでニトロ化して、３−ニトロチロシン誘
導体を形成させることによって修飾することができる。 ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ジエチルピロカルボナートを用いたＮ−
カルボエトキシル化によって、またはヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化によ
って修飾することができる。

【００７２】 ペプチド合成時に非天然アミノ酸および誘導体を取り込ませる例には、４−ア
ミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニル
ペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチル
グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコ
シン、２−チエニルアラニンおよび／またはＤ異性体のアミノ酸の使用が含まれ
るが、これらに限定されない。

【００７３】 本発明によりまた、ヒトにおいて免疫原性にするために、本発明のポリペプチ
ド、フラグメントまたは変異体をジニトロフェノールで共有結合的に修飾するこ
とが考えられる。

【００７４】 本発明の単離タンパク質（フラグメント、変異体、誘導体およびホモログを含
む）は、当業者に知られている任意の好適な手法によって調製することができる
。

【００７５】 例えば、タンパク質は、下記の工程： （ｉ）１または複数の調節ヌクレオチド配列に作動的に連結された本発明の修飾
ｎｈｈＡ核酸を含む発現構築物を調製する工程、 （ｉｉ）好適な宿主細胞を発現構築物でトランスフェクションまたは形質転換す
る工程、 （ｉｉｉ）組換えポリペプチドを該宿主細胞において発現させる工程 を含む手法によって組換えポリペプチドとして調製することができる。

【００７６】 ＰＣＲによって本発明の修飾ｎｈｈＡ核酸を製造することを記載する多数の実
施例が下記に示される。 １つの特定の態様において、ＰＣＲは、本明細書下記に記載されるようなスプ
ライスオーバーラップＰＣＲである。この方法は、Ｈｏら、１９８９、Ｇｅｎｅ
７７ ５１において、そしてＨｏｒｔｏｎら、１９８９、Ｇｅｎｅ ７７ ６
１によって記載される方法に基づく。これらはともに参照にとして本明細書に組
み入れられる。

【００７７】 宿主細胞での発現のために、組換え核酸は、発現ベクターにおいて１または複
数の調節配列に作動的に連結される。 「発現ベクター」は、プラスミドなどの自己複製する染色体外ベクター、また
は宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。

【００７８】 「作動的に連結された」により、該調節ヌクレオチド配列（１つまたは複数）
が、転写を開始または調節またはそうでなければ制御するように本発明の組換え
核酸に対して配置されていることが意味される。

【００７９】 様々な調節ヌクレオチド配列が、一般に、発現のために使用される宿主細胞に
適している。多数のタイプの適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が様々な
宿主細胞について当技術分野では知られている。

【００８０】 典型的には、該１または複数の調節ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、
リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転
写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびにエンハンサー配列また
は活性化因子配列を含むことができるが、これらに限定されない。

【００８１】 当技術分野において知られている構成的プロモーターまたは誘導性プロモータ
ーが本発明により考えられる。これらのプロモーターは、天然に存在するプロモ
ーター、または２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッ
ドプロモーターのいずれかであり得る。

【００８２】 好ましい態様において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可
能にする選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は当技術分野では
十分に知られており、使用される宿主細胞によって変化する。

【００８３】 ある態様において、発現ベクターは、下記に詳しく記載されるように、ｐｏｒ
Ａプロモーターおよびカナマイシン選択性遺伝子を有するｐＣＯ１４Ｋである。
この態様により、宿主細胞は、大腸菌および髄膜炎菌からなる群より選択される
細菌である。

【００８４】 発現ベクターはまた、（典型的には、発現ベクターにより提供される）融合パ
ートナーを含むことができ、その結果、本発明の組換えポリペプチドは、該融合
パートナーとの融合ポリペプチドとして発現される。融合パートナーの主な利点
は、融合パートナーにより、該融合ポリペプチドの同定および／または精製が助
けられるということである。

【００８５】 該融合ポリペプチドを発現させるためには、融合パートナーおよび本発明のヌ
クレオチド配列の翻訳リーディングフレームが一致するように本発明によるヌク
レオチド配列を発現ベクターに連結することが必要である。

【００８６】 融合パートナーの十分に知られている例には、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ
）およびヘキサヒスチジン（ＨＩＳ６）が含まれるが、これらに限定されない。
これらは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの精製に
は特に有用である。アフィニティークロマトグラフィーによって融合ポリペプチ
ドを精製する場合、アフィニティークロマトグラフィーについて適切なマトリッ
クスは、それぞれ、グルタチオン結合樹脂、アミロース結合樹脂、およびニッケ
ル結合樹脂またはコバルト結合樹脂である。多くのそのようなマトリックスは、
（ＨＩＳ６）融合パートナーについて有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）シス
テム（Ｑｉａｇｅｎ）およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムなどの「
キット」の形態で得ることができる。

【００８７】 好ましい融合パートナーはＭＢＰであり、これは本明細書の実施例１１に記載
される。 当技術分野において十分に知られている別の融合パートナーは緑色蛍光タンパ
ク質（ＧＦＰ）である。この融合パートナーは、本発明の融合ポリペプチドを蛍
光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって同定できるようにする蛍光「タグ
」として役立つ。ＧＦＰタグは、本発明の融合ポリペプチドの細胞レベル以下で
の局在化を評価するときに、または本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞を
単離するために有用である。蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）などのフローサイ
トメトリー方法がこの後者の適用において特に有用である。

【００８８】 好ましくは、融合パートナーはまた、第Ｘａ因子またはトロンビンなどのプロ
テアーゼ切断部位を有する。これにより、適切なプロテアーゼは本発明の融合ポ
リペプチドを部分的に消化し、それにより本発明の組換えポリペプチドを融合ポ
リペプチドから遊離させることができる。遊離したポリペプチドは、その後、続
くクロマトグラフィー分離によって融合パートナーから単離することができる。

【００８９】 本発明による融合パートナーはまた、特異的な抗体が得られる短いペプチド配
列であることが通常である「エピトープタグ」をその範囲内に含む。特異的なモ
ノクローナル抗体が容易に得られるエピトープタグの十分に知られている例とし
て、ｃ−ｍｙｃタグ、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタグおよびＦＬＡ
Ｇタグが挙げられる。

【００９０】 本明細書前記のように、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドまた
はポリペプチドホモログをコードする核酸を含む該発現構築物で形質転換された
宿主細胞を培養することによって製造することができる。タンパク質発現に適切
な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択とともに変化する。これは、日常
的な実験によって当業者により容易に確認される。

【００９１】 発現に好適な宿主細胞は原核生物性または真核生物性であり得る。本発明に従
ってポリペプチドを発現させるための１つの好ましい宿主細胞は細菌である。使
用される細菌は大腸菌または髄膜炎菌であり得る。

【００９２】 好ましい態様において、宿主細胞は、ＰｏｒＡ、Ｏｐａ、Ｏｐｃまたは莢膜多
糖を発現しないように改変され、かつ所望するリポ多糖表現型を発現する髄膜炎
菌である。

【００９３】 あるいはまた、宿主細胞は、例えば、バキュロウイルス発現システムとともに
用いることができるＳＦ９細胞などの昆虫細胞であり得る。 組換えタンパク質は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ Ｃ
ＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）（これは引用により本明細書に組
み込むものとする）（特に第１６節および第１７節）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯ
ＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（編者：Ａｕｓｕｂ
ｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．１９９５〜１９９９）（こ
れは引用により本明細書に組み込むものとする）（特に第１０章および第１６章
）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮ
ＣＥ（編者：Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．１
９９５〜１９９９）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）（特に
第１章、第５章および第６章）に記載されるような標準的なプロトコルを使用し
て当業者によって都合よく調製することができる。

【００９４】 本発明の組換え修飾ＮｈｈＡタンパク質の好ましい発現方法および発現したタ
ンパク質の検出方法は本明細書下記の実施例に示される。 ヌクレオチド配列 本発明は、本発明の修飾されたＮｈｈＡタンパク質をコードする単離核酸を提
供する。

【００９５】 好ましくは、該単離核酸は、図１および図２に記載されるような１または複数
のＮｈｈＡポリペプチド定常（Ｃ）領域をコードするヌクレオチド配列を有する
。単離核酸は、図１および図２において同様に認められるような１または複数の
非保存（Ｖ領域）アミノ酸をさらにコードすることができる。

【００９６】 そのような単離核酸の具体的な態様が配列番号２８〜３２および図５〜９に示
される。 本明細書で使用される用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のｍＲＮＡ、ＲＮ
Ａ、ｃＲＮＡおよびＤＮＡを意味し、該ＤＮＡはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを
含む。

【００９７】 「ポリヌクレオチド」は８０個以上の連続したヌクレオチドを有する核酸であ
り、「オリゴヌクレオチド」は８０個未満の連続したヌクレオチドを有する。 「プローブ」は、例えば、ノーザンブロッティングまたはサザンブロッティン
グにおいて相補的な配列を検出するために好適に標識された一本鎖または二本鎖
のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。

【００９８】 「プライマー」は、通常、好ましくは１５個〜５０個の連続したヌクレオチド
を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドであり、これは、相補的な核酸「テンプレ
ート」にアニーリングすることができ、かつＴａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメラーゼまたはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）などのＤＮＡポリメラー
ゼの作用によってテンプレートに依存した様式で伸長させることができる。

【００９９】 本発明によりまた、本明細書前記に定義された本発明の核酸のホモログが考え
られる。 そのような核酸ホモログは、全長の野生型ＮｈｈＡポリヌクレオチドをコード
する核酸を含まない。

【０１００】 例えば、核酸ホモログは、免疫化によって髄膜炎菌に対する交差保護的な免疫
性をもたらすために有用であり得る、本発明のＮｈｈＡのＶ領域およびＣ領域に
構造的に関連するペプチドおよびポリペプチドをコードする。

【０１０１】 １つの態様において、核酸ホモログは、本発明のポリペプチドホモログ（その
変異体、フラグメントおよび誘導体を含む）をコードする。 別の態様において、核酸ホモログは、本発明の核酸と少なくとも６０％（好ま
しくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好まし
くは少なくとも９０％）の配列同一性を有する。

【０１０２】 さらに別の態様において、核酸ホモログは、少なくとも低ストリンジェンシー
の条件のもとで、好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシーの条件のも
とで、そしてより好ましくは高ストリンジェンシーの条件のもとで、本発明の核
酸にハイブリダイゼーションする。

【０１０３】 「ハイブリダイゼーションするおよびハイブリダイゼーション」は、本明細書
では、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列が対形成して、ＤＮＡ−Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッドが生じることを示す
ために使用される。相補的なヌクレオチド配列を含むハイブリッドの配列は、当
技術分野において十分に知られているように相補的なプリン間およびピリミジン
環で塩基対形成することによって生じる。

【０１０４】 これに関連して、修飾されたプリン（例えば、イノシン、メチルイノシンおよ
びメチルアデノシン）および修飾されたピリミジン（チオウリジンおよびメチル
シトシン）もまた塩基対形成に関与し得ることが理解される。

【０１０５】 本明細書で使用される「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション時
における温度およびイオン強度の条件ならびにある種の有機溶媒および／または
界面活性剤の存在の有無をいう。ストリンジェンシーが高いほど、大きなレベル
の相補性がハイブリダイゼーション中のヌクレオチド配列間に必要になる。

【０１０６】 「ストリンジェントな条件」は、高頻度の相補的な塩基を有する核酸のみがハ
イブリダイゼーションするそのような条件を示す。 本明細書では、低ストリンジェンシーの条件に対する参照には下記が含まれ、
包含される：

【０１０７】 （ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションについて、少なくとも約１％ｖ／ｖ〜
少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍ〜少なくとも
約２Ｍの塩、そして４２℃での洗浄について、少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約
２Ｍの塩；および （ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションについて、１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％
ＳＤＳ、そして室温での洗浄について、（ｉ）２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、ま
たは（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐ
Ｈ７．２）、５％ＳＤＳ。

【０１０８】 中程度のストリンジェンシーの条件には下記が含まれ、包含される： （ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションについて、少なくとも約１６％ｖ／ｖ
〜少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍ〜少な
くとも約０．９Ｍの塩、そして４２℃での洗浄について、少なくとも約０．５Ｍ
〜少なくとも約０．９Ｍの塩；および （ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションについて、１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％
ＳＤＳ、そして室温での洗浄について、（ａ）２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、ま
たは（ｂ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ
７．２）、５％ＳＤＳ。

【０１０９】 高ストリンジェンシーの条件には下記が含まれ、包含される： （ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションについて、少なくとも約３１％ｖ／ｖ
〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍ〜少
なくとも約０．１５Ｍの塩、そして４２℃での洗浄について、少なくとも約０．
０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩； （ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションについて、１％ＢＳＡ、１ｍＭのＥ
ＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、そして６５℃を
越える温度で約１時間の洗浄について、（ａ）０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
、または（ｂ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（
ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳ；および （ｉｉｉ）６８℃以上で約２０分間の洗浄について、０．２ｘＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ。

【０１１０】 一般に、洗浄は、Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％−１２℃で行われる
。一般に、二重鎖ＤＮＡのＴｍは、ミスマッチした塩基の数が１％増大する毎に
約１℃低下する。

【０１１１】 上記にもかかわらず、ストリンジェントな条件は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら
（前掲）の第２．９章および第２．１０章に記載される（これは引用により本明
細書に組み込むものとする）、当技術分野では十分に知られている。当業者はま
た、様々な要因を操作して、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化できるこ
とを認識する。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高い程度のハイブリ
ダイゼーションを保証するために役立ち得る。

【０１１２】 典型的には、相補的なヌクレオチド配列が、ヌクレオチドをマトリックス（好
ましくは、ニトロセルロースなどの合成メンブラン）に固定化する工程、ハイブ
リダイゼーション工程および検出工程を含むブロッティング技術によって同定さ
れる。サザンブロッティングが、相補的なＤＮＡ配列を同定するために使用され
、ノーザンブロッティングが、相補的なＲＮＡ配列を同定するために使用される
。ドットブロッティングおよびスロットブロッティングを、相補的なＤＮＡ／Ｄ
ＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡのポリヌクレオチド配列を同定する
するために使用することができる。そのような技術は当業者によって十分に知ら
れており、Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲）の２．９．１頁〜２．９．２０頁に記載さ
れている。そのような方法によれば、サザンブロッティングは、ＤＮＡ分子をゲ
ル電気泳動でサイズに従って分離すること、サイズ分離したＤＮＡを合成メンブ
ランに転写すること、およびメンブランに結合させたＤＮＡを相補的なヌクレオ
チド配列にハイブリダイゼーションすることを含む。

【０１１３】 ドットブロッティングおよびスロットブロッティングでは、ＤＮＡサンプルが
合成メンブランに直接適用され、その後、上記のようにハイブリダイゼーション
が行われる。

【０１１４】 ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーにおいて相補的な核酸
を同定するときには、プラークハイブリダイゼーションまたはコロニーハイブリ
ダイゼーションの方法などによる代わりのブロッティング工程が使用される。こ
の手法の他の典型的な例が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）の第８章〜第１２章に
記載される（これは引用により本明細書に組み込むものとする）。

【０１１５】 典型的には、下記の一般的な手法を使用して、ハイブリダイゼーション条件を
決定することができる。核酸は、上記に記載されるように合成メンブランにブロ
ッティング／転写される。本発明の野生型ヌクレオチド配列が、上記に記載され
るように標識され、その後、固定化されたヌクレオチド配列とハイブリダイゼー
ションするこの標識された核酸の能力が分析される。

【０１１６】 当業者は、多数の要因がハイブリダイゼーションに影響することを認識する。
放射能標識されたポリヌクレオチド配列の比活性は、検出可能なシグナルを得る
ためには、典型的には約１０８ｄｐｍ／μｇ以上にすべきである。比活性が１０
８〜１０９ｄｐｍ／μｇである放射能標識されたヌクレオチド配列により、約０
．５ｐｇのＤＮＡを検出することができる。検出を可能にするためには、十分な
ＤＮＡがメンブランに固定化されなければならないことが当技術分野では十分に
知られている。ＤＮＡを過剰に固定化することが望ましい（通常的には１μｇ〜
１０μｇ）。１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸（ＭＷ５００, ０００）または
ポリエチレングリコール６０００などの不活性なポリマーをハイブリダイゼーシ
ョン時に添加することによりまた、ハイブリダイゼーションの感度を増大させる
ことができる（Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲）の２．１０．１０を参照のこと）。

【０１１７】 メンブランに固定化された核酸と標識された核酸とのハイブリダイゼーション
から意味のある結果を達成するためには、十分な量の標識された核酸を、洗浄後
に、固定化された核酸にハイブリダイゼーションさせなければならない。洗浄に
より、標識された核酸に対する所望する程度の相補性を有する固定化された核酸
に対してのみ、標識された核酸がハイブリダイゼーションすることが保証される
。

【０１１８】 固定化された核酸にハイブリダイゼーションした標識された核酸を検出する方
法は、当技術分野では実施者に十分に知られている。そのような方法には、オー
トラジオグラフィー、化学発光、蛍光および比色法による検出が含まれる。

【０１１９】 別の態様において、本発明の核酸ホモログは下記の手法： （ｉ）好適な宿主から核酸抽出物を得ること、 （ｉｉ）それぞれのプライマーが本発明のヌクレオチド配列の一部を含む、必要
な場合には縮重しているプライマーを作製すること、および （ｉｉｉ）該プライマーを使用して、核酸増幅技術により１または複数の増幅産
物を該核酸抽出物から増幅すること に従って調製することができる。

【０１２０】 好適には、宿主は細菌である。 好ましくは、宿主はナイセリア属の宿主である。

【０１２１】 より好ましくは、宿主は髄膜炎菌またはナイセリア・ラクタミカ（Ｎ．ｌａｃ
ｔａｍｉｃａ）である。 核酸配列増幅法による有用なプライマーは、本明細書下記に詳しく記載される
配列番号４０〜５１を含む。

【０１２２】 好適な核酸増幅技術は当業者には十分に知られており、これには下記が含まれ
る：例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲）の第１５章（これは引用により本明細書
に組み込むものとする）に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；
例えば、米国特許第５，４２２，２５２号（これは引用により本明細書に組み込
むものとする）に記載されるような鎖置換増幅（ＳＤＡ）；例えば、Ｌｉｕら、
１９９６、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８ １５８７、ならびに国際公開
公報第９２／０１８１３号およびＬｉｚａｒｄｉら （国際公開公報第９７／１
９１９３号）（これらは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載され
るようなローリングサークル複製（ＲＣＰ）；例えば、Ｓｏｏｋｎａｎａｎら、
１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７ １０７７（これは引用により本
明細書に組み込むものとする）により記載されるような核酸配列型増幅（ＮＡＳ
ＢＡ）；および例えば、Ｔｙａｇｉら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３ ５３９５（これは引用により本明細書に組み込むも
のとする）により記載されるようなＱ−βレプリカーゼ増幅。

【０１２３】 本明細書で使用される「増幅産物」は、核酸増幅技術によって得られた核酸生
成物をいう。 抗体 本発明によりまた、本発明の単離タンパク質、フラグメント、変異体お
よび誘導体に対する抗体が考えられる。本発明の抗体はポリクローナルまたはモ
ノクローナルであり得る。抗体製造、精製および使用に適用され得る十分に知ら
れている様々なプロトコルを、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ Ｐ
ＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ ＮＹ、１９９１〜１９９４）の第２章、およびＨａｒｌｏｗ、Ｅ．＆Ｌａ
ｎｅ、Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）に見出すことができる。これらはとも
に引用により本明細書に組み込むものとする。

【０１２４】 一般に、本発明の抗体は、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体また
は誘導体に結合させられるか、またはそれらとコンジュゲート化される。例えば
、抗体はポリクローナル抗体を含み得る。そのような抗体は、本発明のポリペプ
チド、フラグメント、変異体または誘導体を産生種（マウスまたはウサギが含ま
れ得る）に注射して、ポリクローナル抗血清を得ることによって調製することが
できる。ポリクローナル抗体を製造する方法は当業者には十分に知られている。
使用され得る例示的なプロトコルが、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮ
Ｔ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）およびＨａｒｌ
ｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８、前掲）に記載される。

【０１２５】 産生種において得られるポリクローナル抗体の代わりに、モノクローナル抗体
を、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５
６、４９５による論文（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記
載されるような標準的な方法を使用して、または、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、
ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）に
記載されるそのより最近の改変法により、本発明のポリペプチド、フラグメント
、変異体または誘導体の１つまたは複数が接種された産生種に由来する脾臓また
は他の抗体産生細胞を不死化することによって製造することができる。

【０１２６】 本発明はまた、その範囲内において、上記に示されるポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体のＦｃフラグメントまたはＦａｂフラグメントを含む抗体
を包含する。または、抗体は、本発明のポリペプチドに対する単鎖Ｆｖ抗体（ｓ
ｃＦｖ）を含み得る。そのようなｓｃＦｖは、例えば、米国特許第５, ０９１，
５１３号、欧州特許第２３９，４００号、またはＷｉｎｔｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３４９ ２９３による論文にそれぞれ記載される
方法に従って調製することができる。これらは引用により本明細書に組み込むも
のとする。

【０１２７】 本発明の抗体は、天然または組換えの髄膜炎菌ポリペプチドを単離する際のア
フィニティークロマトグラフィーのために使用することができる。例えば、Ｃｏ
ｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯ
ＧＹ（前掲）の第９．５章に記載される免疫アフィニティークロマトグラフィー
手法を参照することができる。

【０１２８】 抗体は、 （ｉ）発現ライブラリーをスクリーニングして、本発明の変異体ポリペプチドを
同定するために、 （ｉｉ）免疫反応性フラグメントもしくは免疫反応制エピトープを同定するため
に、かつ／または

【０１２９】 （ｉｉｉ）髄膜炎菌感染を検出するために 使用することができる。これらは本明細書下記に記載されるが、本発明はこれら
の特定の使用に限定されない。

【０１３０】 髄膜炎菌の検出 個体における髄膜炎菌の存在または非存在は、該個体から生物学的サンプルを
単離して、上記に記載される抗体または抗体フラグメントを生物学的サンプルと
混合し、そしてサンプル中の髄膜炎菌の存在を示す特異的に結合した抗体または
抗体フラグメントを検出することによって決定することができる。

【０１３１】 本明細書で使用される用語「生物学的サンプル」は、患者などの個体に由来す
る、抽出、未処理、処理、希釈または濃縮され得るサンプルをいう。好適には、
生物学的サンプルは、全血、血清、血漿、唾液、尿、汗、腹水、腹膜液、滑液、
羊水、脳脊髄液、皮膚生検物などからなる群より選択される。

【０１３２】 複合体の形成を明らかにする好適な技術はどれも使用することができる。例え
ば、標識が結合している本発明による抗体または抗体フラグメントを免疫アッセ
イにおいて用いることができる。そのような免疫アッセイとして、当業者に十分
に知られている放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合吸着アッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）および免疫クロマトグラフィー技術（ＩＣＴ）を挙げることができるが、こ
れらに限定されない。

【０１３３】 例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ Ｉ
ＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）の第７章を参照することができる。これには、本発
明に従って使用され得る様々な免疫アッセイが開示されている。免疫アッセイと
して、当技術分野において理解されているような競合的アッセイを挙げることが
できる。

【０１３４】 抗体または抗体フラグメントと結合した標識は下記を含むことができる： （Ａ）抗体または抗体フラグメントに対する標識の直接的な結合、 （Ｂ）抗体または抗体フラグメントに対する標識の間接的な結合、すなわち、 抗体または抗体フラグメントにその後で結合する別のアッセイ試薬に対する標識
の結合、および （Ｃ）抗体または抗体フラグメントのその後の反応生成物に対する結合。

【０１３５】 標識は、発色体、触媒、酵素、蛍光体、化学発光分子、ユーロピウム（Ｅｕ３
4 ）などのランタニドイオン、放射性同位体および直接的な可視標識からなる群
より選択することができる。直接的な可視標識の場合には、コロイド状の金属粒
子または非金属粒子、色素粒子、酵素または基質、有機ポリマー、ラテックス粒
子、リポソーム、あるいはシグナル生成物質などを含有する他の小胞を使用する
ことができる。

【０１３６】 標識として有用な非常に多くの酵素が、米国特許明細書第４，３６６，２４１
号、同第４，８４３，０００号および同第４，８４９，３３８号に開示されてい
る（これらはすべて引用により本明細書に組み込むものとする）。本発明におい
て有用な酵素標識には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ
、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチー
ム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが含まれる。酵素標識は、単独で、または溶
液中の別の酵素と組み合わせて使用することができる。

【０１３７】 好適には、蛍光体は、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、テト
ラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＬ）またはＲ−フィコエリト
リン（ＲＰＥ）を含む群より選択される。

【０１３８】 本発明はまた、髄膜炎菌による患者の感染を検出する方法にまで及ぶ。該方法
は、患者に由来する生物学的サンプルを本発明のポリペプチド、フラグメント、
変異体または誘導体と接触させる工程、および該ポリペプチド、フラグメント、
変異体または誘導体と該血清中の髄膜炎菌特異的抗体との複合体の存在または非
存在を決定する工程を含む。この場合、該複合体の存在により、該感染が示され
る。

【０１３９】 好ましい態様において、上記複合体の検出は、当技術分野において十分に知ら
れているように、該ポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体を好適な
標識で検出可能に修飾し、そして、例えば、上記に記載されるような免疫アッセ
イにおいてそのような修飾された化合物を使用することによって行われる。

【０１４０】 別の態様において、本発明は、髄膜炎菌細菌を含有することが疑われる生物学
的サンプルにおける髄膜炎菌細菌を検出する方法を提供する。該方法は、患者か
ら生物学的サンプルを単離する工程、該細菌の存在を示す本発明による核酸配列
を該サンプルにおいて検出する工程を含む。該核酸配列の検出は、任意の好適な
技術を使用して明らかにすることができる。例えば、標識された本発明による核
酸を、当技術分野において十分に知られているように、患者から得られた核酸抽
出物のサザンブロットにおけるプローブとして使用することができる。

【０１４１】 あるいはまた、標識された本発明による核酸は、患者から得られたＲＮＡ抽出
物のノーザンブロットにおけるプローブとして利用することができる。 好ましくは、患者から得られた核酸抽出物は、本発明による核酸配列のセンス
配列およびアンチセンス配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマー、または
その隣接配列と同時に、ＰＣＲなどの核酸増幅反応において、または例えば、国
際公開公報第８９／０９３８５号（これは引用により本明細書に組み込むものと
する）に記載されるようなリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）において利用される。

【０１４２】 様々な自動化された固相検出技術もまた適している。例えば、非常に大規模な
固定化プライマーアレイ（ＶＬＳＩＰＳ（商標））が、例えば、Ｆｏｄｏｒら
（１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１ ７６７）およびＫａｚａｌら （１９９
６、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２ ７５３）により記載されるように核
酸を検出するために使用される。上記の一般的な技術は当業者には十分に知られ
ている。

【０１４３】 医薬組成物 本発明のさらなる特徴は、髄膜炎菌による感染から患者を保護する医薬組成物
における有効成分としての、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体また
は誘導体（「免疫原因子」）の使用である。

【０１４４】 好適には、医薬組成物は、医薬として許容される担体、希釈剤または賦形剤を
含む。 「医薬として許容される担体、希釈剤または賦形剤」により、全身投与におい
て安全に使用され得る固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質が
意味される。特定の投与経路に依存して、当技術分野において十分に知られてい
る様々な担体を使用することができる。これらの担体は、糖類、デンプン類、セ
ルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油
、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸塩緩衝化溶液、乳化剤、等張的生理
的食塩水、および塩類（塩酸塩、臭化物および硫酸塩を含む無機酸塩、酢酸塩、
プロピオン酸塩およびマロン酸塩などの有機酸塩など）、および無パイロジェン
水を含む群より選択することができる。

【０１４５】 医薬として許容される担体、希釈剤および賦形剤を記載する有用な参考文献は
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（
Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ、１９９１）である
。これは引用により本明細書に組み込むものとする。

【０１４６】 安全な投与経路はどれも、患者に本発明の組成物を与えるために用いることが
できる。例えば、経口的、直腸的、非経口的、舌下、口内、静脈内、関節内、筋
肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮的などを用いることがで
きる。筋肉内注射および皮下注射が、例えば、免疫原組成物、ワクチンおよびＤ
ＮＡワクチンを投与するために適している。

【０１４７】 投薬形態物には、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、溶液剤、シロップ、トロー
チ、カプセル、坐薬、エアロゾル剤、経皮パッチなどが含まれる。これらの投薬
形態物にはまた、この目的のために特に設計された注射用または埋め込み用の徐
放性デバイス、またはこの様式でさらに作用するように改変された他の形態のイ
ンプラントを挙げることができる。治療剤の制御された放出は、治療剤を、例え
ば、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリ
コール酸ならびにある種のセルロース誘導体（ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ースなど）を含む疎水性ポリマーで被覆することによって達成することができる
。さらに、制御された放出は、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／
またはマイクロスフェアを使用することによって達成することができる。

【０１４８】 経口投与または非経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、粉末もしくは顆粒
として、または水性液体、非水性液体、水中油型エマルションもしくは油中水型
液体エマルションにおける溶液もしくは懸濁物として、本発明の１または複数の
治療剤の所定量をそれぞれが含有する、カプセル、サッシェ剤または錠剤などの
個別ユニット物として提供され得る。そのような組成物は、任意の製薬方法によ
って調製することができるが、すべての方法は、上記に記載されるような１また
は複数の免疫原因子を、１または複数の必要な成分を構成する担体とともに一緒
にする工程を含む。一般に、組成物は、本発明の免疫原因子を液体担体または細
かく分割された固体担体またはその両方と均一かつ十分に混合し、その後、必要
な場合には、生成物を所望する剤形に成形することによって調製される。

【０１４９】 上記組成物は、投薬配合物と適合し得る様式で、そして髄膜炎菌感染から患者
を保護するために免疫原性的に効果的であるような量で投与することができる。
患者に投与される用量は、本発明の範囲においては、髄膜炎菌レベルの低下など
の患者において都合の良い応答が長時間もたらされるか、または髄膜炎菌による
感染を阻害するために十分でなければならない。投与される免疫原因子の量は、
処置される対象者、ならびにその年齢、性別、体重および全体的な健康状態に依
存し得る。これに関連して、投与するために必要な免疫原因子の正確な量は医師
の判断に依存する。

【０１５０】 髄膜炎菌に対する処置または予防において投与される免疫原因子の効果的な量
を決定する際に、医師は、循環している血漿中レベル、疾患の進行、および抗髄
膜炎菌抗体の産生を評価することができる。いずれの場合においても、本発明の
免疫原因子の好適な投薬量は当業者によって容易に決定することができる。その
ような投薬量は、本発明の免疫原因子がナノグラム〜ミリグラムの程度であり得
る。 上記組成物は治療ワクチンまたは予防ワクチンとして使用することができ
る。したがって、本発明は、本発明の免疫原因子の１つまたは複数を有効成分と
して含有するワクチンの製造にまで及ぶ。様々な適用可能な手法が、そのような
ワクチンを製造するために考えられる。例示的な手法には、例えば、ＮＥＷ Ｇ
ＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＶＡＣＣＩＮＥＳ（１９９７、Ｌｅｖｉｎｅら、Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｅｌ、Ｈｏｎｇ Ｋ
ｏｎｇ）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載される手法
が含まれる。

【０１５１】 本発明による免疫原因子は、他の抗原のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピト
ープを含む他の抗原と混合、コンジュゲート化または融合することができる。さ
らに、本発明による免疫原因子は、下記に記載されるように担体にコンジュゲー
ト化することができる。

【０１５２】 本発明のハプテン性ペプチド（すなわち、コンジュゲート抗体と反応するが、
それ自身は免疫応答を誘発することができないペプチド）が使用される場合、そ
れを免疫原性担体とコンジュゲート化することができる。有用な担体が当技術分
野では十分に知られており、これには、例えば、チログロブリン；アルブミン（
ヒト血清アルブミンなど）；破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス、大
腸菌、ブドウ球菌および連鎖球菌に由来するトキシン、トキソイドもしくはトキ
シンの任意の変異交差反応性物質（ＣＲＭ）；ポリ（リシン：アルギン酸）など
のポリアミノ酸；インフルエンザ；ロタウイルスＶＰ６、パルボウイルスのＶＰ
１およびＶＰ２；Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質；Ｂ型肝炎ウイルスの組換
えワクチンなどが含まれる。または、担体タンパク質または他の免疫原タンパク
質のフラグメントまたはエピトープを使用することができる。例えば、本発明の
ハプテン性ペプチドを、細菌トキシン、トキソイドまたはＣＲＭのＴ細胞エピト
ープに結合させることができる。これに関連して、米国特許第５，７８５，９７
３号を参照することができる。これは引用により本明細書に組み込むものとする
。

【０１５３】 さらに、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体は、髄膜
炎菌に対するか、または他の細菌もしくはウイルスに対するワクチン組成物にお
ける担体タンパク質として作用し得る。

【０１５４】 本発明の免疫原因子は、髄膜炎菌の抗原と組み合わせて、またはＨ．ｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａ、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、大腸
菌、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの病原性細菌を含む他の生物の抗原と組み合
わせて多価サブユニットワクチンとして投与することができる。代わりに、また
はさらに、本発明の免疫原因子は、髄膜炎菌のオリゴ糖成分または多糖成分と同
時に投与することができる。

【０１５５】 ワクチンはまた、本明細書前記に規定されるような医薬として許容される担体
、希釈剤または賦形剤を含有することができる。 ワクチンおよび免疫原組成物は、当技術分野において十分に知られているよう
なアジュバントを含むことができる。本発明により考えられるアジュバントには
、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、
リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物、Ｎ、Ｎ−ジコクタ
デシル−Ｎ’、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メト
キシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール類などの表面活性
物質；ピランなどのポリアミン、デキストラン硫酸、ポリＩＣカルボポール；ム
ラミルジペプチドなどのペプチドおよび誘導体、ジメチルグリシン、ツフツィン
；オイルエマルション；ならびにリン酸アルミニウム、水酸化アルミまたはミョ
ウバンなどのミネラルゲル；リンホトキシン類、ＱｕｉｌＡおよび免疫刺激複合
体（ＩＳＣＯＭ）が含まれるが、これらに限定されない。

【０１５６】 アジュバントの例に関して、国際公開公報第９９／３６５４４号もまた参照さ
れる。これは引用により本明細書に組み込むものとする。

【０１５７】 ＤＮＡ送達によるワクチン接種 本発明の修飾されたＮｈｈＡタンパク質を含む発現構築物は、宿主を予防的ま
たは治療的に処置するためにヒトに投与することができる。これに関連して、発
現構築物は、１または複数の修飾されたＮｈｈＡペプチド、ポリペプチド、これ
らのフラグメントまたは誘導体（これらはまとめて「免疫原因子」と呼ばれる）
をコードすることができる。

【０１５８】 発現構築物にはまた、遺伝子治療構築物が挙げられ、これには、ワクシニアな
どの特殊化された遺伝子治療ベクター、および遺伝子治療において有用なウイル
スベクターが用いられる。後者には、Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉら、２０００、Ｊ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８ ４７６、Ｂｒａｕｎ−Ｆａｌｃｏら、１９９
９、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６ ４３２に記載されるなどのアデノウイルスおよび
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のベクター、Ｂｕｃｈｓｈａｃｈｅｒら、２００
０、Ｂｌｏｏｄ ９５ ２４９９に記載されるなどのレトロウイルスおよびレン
チウイルスのベクター、ならびに単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイ
ルスに由来するベクターが含まれる。遺伝子治療ベクターおよび送達方法の一般
的な総説を、Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．１６ ３５に見出すことができる。ナイセリア属細菌のタンパク質を使用す
る遺伝子治療に関して潜在的に好適な多数のベクター、および送達方法を記載す
る例示的な参考文献は、国際公開公報第９９／３６５４４号である。これは引用
により本明細書に組み込むものとする。

【０１５９】 本発明の免疫原因子は、弱毒化ウイルス宿主により発現させることができる。
「弱毒化ウイルス宿主」により、天然で実質的に無毒性であるか、または実質的
に無毒性にされている、いずれかのウイルスベクターが意味される。ウイルスは
、任意の好適な物理的手段（例えば、熱処理）または化学的手段（例えば、ホル
ムアルデヒド処理）によって実質的に無毒性にすることができる。「実質的に無
毒性」により、その感染性が破壊されているウイルスが意味される。理想的には
、ウイルスの感染性は、ウイルスの免疫原性を運ぶタンパク質に影響を及ぼすこ
となく破壊される。前記から、弱毒化ウイルス宿主が生ウイルスまたは不活化ウ
イルスを含むことが理解される。

【０１６０】 本発明によるワクチンにおいて有用であり得る弱毒化ウイルス宿主は、アデノ
ウイルス、サイトメガロウイルスおよび好ましくはポックスウイルス（ワクシニ
アなど）を含むウイルスベクター（例えば、ＰａｏｌｅｔｔｉおよびＰａｎｉｃ
ａｌｉ、米国特許第４，６０３，１１２号（これは引用により本明細書に組み込
むものとする）を参照のこと）、ならびに弱毒化されたサルモネラ属菌株（例え
ば、Ｓｔｏｃｋｅｒ、米国特許第４，５５０，０８１号（これは引用により本明
細書に組み込むものとする）を参照のこと）を含むことができる。生ワクチンは
、実質的に長く持続する免疫性をもたらし得る長期間の刺激を生じさせるので特
に好都合である。ナイセリア属細菌のタンパク質を使用する免疫化に関して潜在
的に好適な様々なウイルスベクター、および送達方法を記載する別の例示的な参
考文献は、国際公開公報第９９／３６５４４号である。これは引用により本明細
書に組み込むものとする。

【０１６１】 多価ワクチンは、髄膜炎菌の種々のエピトープ（例えば、髄膜炎菌の他の表面
タンパク質またはエピトープ）を発現する１または複数の微生物から調製するこ
とができる。さらに、他の病原性微生物のエピトープをワクチンに組み入れるこ
とができる。

【０１６２】 好ましい態様において、本発明による核酸配列を発現させるための組換えワク
シニアウイルスの構築が含まれる。宿主に導入したとき、組換えワクシニアウイ
ルスは免疫原因子を発現し、それにより宿主のＣＴＬ応答を誘発する。例えば、
米国特許第４，７２２，８４８号を参照することができる。これは引用により本
明細書に組み込むものとする。これには、免疫化プロトコルにおいて有用なワク
シニアベクターおよび方法が記載されている。

【０１６３】 本発明の免疫原因子を用いた治療的投与または免疫化のために有用な広範囲の
他のベクターが、本開示から当業者には明らかになる。 さらなる態様において、ヌクレオチド配列は、当技術分野において知られてい
るような「裸のＤＮＡ」ワクチンの形態でワクチンとして使用することができる
。例えば、本発明の発現ベクターを哺乳動物に導入することができる。この場合
、発現ベクターは、例えば、Ｂａｒｒｙ、Ｍ．ら （１９９５、Ｎａｔｕｒｅ、
３７７：６３２−６３５）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）
に記載されるように、宿主が免疫応答を高めるポリペプチドのインビボでの産生
を生じさせる。

【０１６４】 検出キット 本発明はまた、生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌を検出するためのキットを
提供する。キットは、用いられる試験方法の性質に依存して、上記に記載される
１または複数の特定の因子を含有する。これに関連して、キットは、本発明によ
るポリペプチド、フラグメント、変異体、誘導体、抗体、抗体フラグメントまた
核酸の１つまたは複数を含むことができる。キットはまた、標識を検出するため
に適切な試薬、陽性対照物および陰性対照物、洗浄液、希釈緩衝液などを必要な
場合には含むことができる。例えば、核酸に基づく検出キットは、（ｉ）本発明
による核酸（これは陽性対照物として使用することができる）、（ｉｉ）本発明
によるオリゴヌクレオチドプライマー、および必要な場合には、用いられる核酸
増幅技術に依存するＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼなどを含むことができ
る。

【０１６５】 免疫反応性フラグメントの調製 本発明はまた、本発明によるポリペプチド、変異体または誘導体の免疫反応性
フラグメントを同定する方法にまで及ぶ。この方法は、本質的には、ポリペプチ
ド、変異体または誘導体のフラグメントを作製して、フラグメントを哺乳動物に
投与すること、および哺乳動物における免疫応答を検出することを含む。そのよ
うな応答には、髄膜炎菌および／または該ポリペプチド、変異体もしく誘導体と
特異的に結合するエレメントの産生、ならびに／あるいは髄膜炎菌感染に対する
保護作用が含まれる。

【０１６６】 上記方法で免疫反応性について特定のフラグメントを試験する前に、様々な予
測方法を使用して、特定のフラグメントが、天然の抗原と交差反応する抗体を得
るために使用できるかどうかを推定することができる。これらの予測方法は、例
えば、Ａｕｓｕｂｅｌら （前掲）の第１１．１４章に記載されるようにアミノ
末端またはカルボキシ末端の配列に基づくことができる。または、これらの予測
方法は、例えば、Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１５７ １０５）およびＨｏｐｐ＆Ｗｏｏｄｓ（１９８３、Ｍｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．２０ ４８３）（これらは引用により本明細書に組み込むものとす
る）によって記載されるように親水性の予測に基づくか、または例えば、Ｃｈｏ
ｏ＆Ｆａｓｍａｎ（１９８７、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７ ２５１
）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）によって記載されるよう
に二次構造の予測に基づくことができる。

【０１６７】 さらに、「エピトープマッピング」では、本発明のモノクローナル抗体を使用
して、交差保護をもたらすその能力を最初に調べ、その後、該抗体により認識さ
れるエピトープを同定することによって交差反応性のエピトープが同定される。
例示的な方法が、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ Ｉ
Ｎ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）に示されている。

【０１６８】 一般には、１０残基〜１５残基からなるペプチドフラグメントにより最適な結
果が得られる。６残基もの小さいペプチドまたは２０残基もの大きいペプチドも
問題なく機能している。そのようなペプチドフラグメントは、その後、例えば、
Ａｕｓｕｂｅｌら （前掲）の第１１．１４節および第１１．１５節に記載され
るように、キーホルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）などの担体分子に化学的にカップリングすることができる。

【０１６９】 ペプチドは、例えば、Ｈｏｏｇｅｒｈｏｕｔら （１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．６３ ３４７３）（これは引用により本明細書に組み込むものとす
る）に記載されるように合成的に環状化され得ることもまた理解される。

【０１７０】 ペプチドは、例えば、上記に議論されているように動物を免疫化するために使
用することができる。ペプチドが選択された天然のポリペプチドまたは元のポリ
ペプチドに対する抗体の力価を、その後、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら （前掲）
の第１１．１６節および第１１４節に記載されるように、例えば、放射免疫アッ
セイまたはＥＬＩＳＡによって測定することができる。

【０１７１】 その後、抗体は、当技術分野において十分に知られているように、硫酸アンモ
ニウム分画またはクロマトグラフィーによって動物の適切な生物学的体液から精
製することができる。抗体精製に対する例示的なプロトコルが、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら （前掲）の第１０．１１節および第１１．１３節に示されている。これは引
用により本明細書に組み込むものとする。

【０１７２】 天然のポリペプチドまたは元のポリペプチドに対する抗体の免疫反応性は、例
えば、ウエスタンブロットなどの任意の適切な手法によって決定することができ
る。

【０１７３】 機能的な遮断剤 国際公開公報第９９／３１１３２号に開示された様々な野生型のＮｈｈＡ／Ｈ
ｉａＮｍポリペプチドは接着性を有すると考えられている。これらのポリペプチ
ドは、実際、表面抗原であるインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎ
ｆｌｕｅｎｚａｅ）の付着因子とのある程度の類似性を有する。具体的には、こ
れらのポリペプチドは、インフルエンザ菌のＨｉａタンパク質に対して約６７％
の相同性であり（Ｂａｒｅｎｋａｍｐ＆Ｓｔ．Ｇｅｍｅ ＩＩＩ、１９９６、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９ １２１５）、インフルエ
ンザ菌のＨｓｆタンパク質に対して７４％の相同性である（Ｓｔ．Ｇｅｍｅ Ｉ
ＩＩら、１９９６、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８
６２８１；および米国特許第５，６４６，２５９号）。これらの比較について
は、３のギャップ加重および０．０１の長さ加重が、ＧＡＰプログラム（Ｄｅｖ
ｅｒａｕｘ、１９８４、前掲）を使用して使用された。したがって、これらのポ
リペプチドの機能を妨げることは、髄膜炎菌細菌が細胞に接着して侵入すること
がこれらのポリペプチドにより妨げられるので著しく治療的に有益である。機能
を妨げることはいくつかの方法で達成することができる。

【０１７４】 例えば、本発明のポリペプチドと相互作用する細胞表面上の受容体を阻止する
化学試薬またはポリペプチドなどの成分を投与することができる。これらは、受
容体の部位を感染性生物と競合する。そのような成分は、例えば、本発明のポリ
ペプチド、特にこれらのフラグメントまたは機能的等価体、ならびに模倣体を含
むことができる。

【０１７５】 用語「模倣体」は、本明細書において、タンパク質またはペプチドの特定の機
能的領域に類似するように設計されている化学物質を示すために使用される。細
菌が細胞表面に結合することを阻止する上記に記載された抗体に対して惹起され
た抗イディオタイプ抗体もまた使用することができる。または、本発明のポリペ
プチドにおける受容体結合部位と相互作用する成分は、髄膜炎菌による細胞感染
を効果的に防止することができる。そのような成分は、阻止性の抗体、ペプチド
または他の化学試薬を含むことができる。

【０１７６】 そのような成分、医薬として許容される担体と組み合わせられている医薬組成
物、および髄膜炎菌感染に罹患している患者をそのような成分または組成物の投
与により処置する方法はすべて、本発明のさらなる態様を構成する。

【０１７７】 本発明のポリペプチドは、上記方法においてそれらが使用される化合物をスク
リーニングする際に使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、
標識と結合させて、試験中の試薬の存在下で細胞培養物にさらすことができる。
標識されたポリペプチドが細胞表面に結合することを阻害する試薬の能力を、そ
の後、観測することができる。そのようなスクリーニングでは、標識されたポリ
ペプチドを、大腸菌などの生物に対して直接使用することができる。または、髄
膜炎菌そのものを、ポリペプチドの修飾された検出可能な形態を発現するように
操作することができる。操作された髄膜炎菌菌株をこの方法において使用するこ
とは、タンパク質の三次構造が、野生型の細菌で発現した三次構造とより密接に
類似する可能性が大きくなるので好ましい。

【０１７８】 本発明を容易に理解して、実際に実行し得るために、特に好ましい態様が、次
に、下記の非限定的な実施例として記載される。

【０１７９】 実施例１ ＮｈｈＡポリペプチドの定常領域および可変領域の同定 本発明者らは、１０菌株の髄膜炎菌間において保存的および／または非保存的
であるＮｈｈＡアミノ酸配列を解明した。非保存領域は４つの可変領域（Ｖ１、
Ｖ２、Ｖ３およびＶ４）に分けられ、定常領域はＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４および
Ｃ５に分けられる（これらは図１および表１に示される；配列番号１〜１１）。
対応するヌクレオチド配列比較が図２に示される（配列番号１２〜２２）。

【０１８０】 実施例２ ＰＭＣ２１のＮｈｈＡポリペプチドの過剰発現 髄膜炎菌の菌株ＰＭＣ２１のｎｈｈＡ遺伝子によってコードされるＮｈｈＡタ
ンパク質を、ｎｈｈＡ遺伝子がプロモーターに作動的に連結されている発現構築
物を作製することによって過剰発現させた。

【０１８１】 下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、髄膜炎菌ＰＭＣ２１株のｎ
ｈｈＡ核酸のオープンリーディングフレームをＰＣＲによって増幅した： ＨＯＭＰ５’：

【０１８２】

【表１】 これは、ＥａｇＩ制限部位（下線部）と、ＮｈｈＡの最初の７アミノ酸をコード
する配列（「 」）とを含む。

【０１８３】 ＨＯＭＰ３’ＡＮ：

【０１８４】

【表２】 これは、ＮｃｏＩ制限部位（下線部）と、ｃ３株のｎｈｈＡオープンリーディン
グフレームの終了部の後の配列４８〜６１のヌクレオチドの逆相補鎖（太字）と
を含む。

【０１８５】 増幅産物は、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩの制限エンドヌクレアーゼで続いて消化
される制限部位を含有した。 サブクローニングのために使用されたプラスミドはｐＣＯ１４Ｋであった。こ
のプラスミドは、髄膜炎菌菌株２９９６の隣接配列とともに髄膜炎菌の強く発現
するクラス１の外膜タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置するｐｏｒＡプ
ロモーターと、Ｒｏｕｐｐｅ ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｔら （Ｉｎｆｅｃｔ
Ｉｍｍｕｎ １９９６ ６４ ２７４５）によって記載されるような選択用の
カナマイシン耐性遺伝子とを含有する。

【０１８６】 消化された増幅産物を、その後、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩの制限エンドヌクレ
アーゼで消化されたｐＣＯ１４Ｋに連結した。連結により、ｐｏｒＡオープンリ
ーディングフレームの大部分がｎｈｈＡ増幅産物で置換された（図３）。これに
より、配列番号１に示されるように５９１アミノ酸のポリペプチドをコードする
組換え核酸発現構築物（配列番号１２に示されるオープンリーディングフレーム
）が作製された。

【０１８７】 これは、強力なｐｏｒＡプロモーターの制御下で本発明のｎｈｈＡ核酸の発現
を行わせる。翻訳は、ＨＯＭＰ５’の３１位から始まるＡＴＧコドンから開始さ
れる。ｐｏｒＡとｎｈｈＡとの融合体の形成を防止するために、ＨＯＭＰ５’配
列は、上記の開始用ＡＴＧの前にＴＡＡ停止コドンを含有する。

【０１８８】 得られたプラスミドｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）を制限消化により線状化し、そ
してＪａｎｉｋら （１９７６、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４ ７１）によって記載される方法を使用して髄膜炎
菌７Ｇ２株を形質転換するために使用した。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌカ
ナマイシンを含有する固体培地において、５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュ
ベーションすることによって選択した。カナマイシン耐性コロニーを選択し、一
晩培養し、そして総細胞タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動的に分
離し、その後、Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して
ニトロセルロースメンブランに転写することによってＮｈｈＡポリペプチドの過
剰発現についてスクリーニングした。その後、メンブランをウサギ抗ＮｈｈＡ血
清（国際公開公報第９９／３１１３２号に記載）およびアルカリホスファターゼ
結合抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と順次インキュベーションし、その後、比色
検出をＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。親株と比較して、より
高いレベルでＮｈｈＡポリペプチドを発現するクローンを１つ単離した（図１１
）。コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒ ｇ．ａｕ において提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想さ
れるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペ
プチド（図１４、配列番号３３）が生成することが示される。 このプラスミド構築物ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）は髄膜炎菌の任意の形質転換
受容性菌株に形質転換することができる。

【０１８９】 実施例３ Ｈ４１のＮｈｈＡポリペプチドの過剰発現 髄膜炎菌のＨ４１株のｎｈｈＡ遺伝子によってコードされるＮｈｈＡタンパク
質を、実施例２に記載されるのと同じ方法を使用して過剰発現させた。これによ
り、配列番号２に示されるように５９１アミノ酸のポリペプチドをコードする組
換え核酸発現構築物（配列番号１３に示されるオープンリーディングフレーム）
が作製された。本実施例では、得られたプラスミドｐＩＰ５２（Ｈ４１）を線状
化して、髄膜炎菌の７Ｇ２株に形質転換した。カナマイシン耐性コロニーを分析
して、ウエスタン免疫ブロットによって調べたときにＮｈｈＡの過剰発現を示す
コロニーを１つ選んだ（図１１）。コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶ
Ｅ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログ
ラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミ
ノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４、配列番号３４）が生成すること
が示される。 この方法は、他の髄膜炎菌菌株の野生型ｎｈｈＡ配列を含有する発現構築物を
作製するために用いることができる。

【０１９０】 実施例４ 都合のよい制限部位を使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築 参照を容易にするために、ＰＭＣ２１株のｎｈｈＡ核酸によってコードされる
ＮｈｈＡポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１に示される。本発明者らは、
菌株間の最も大きな可変性の領域を欠失させた野生型ＰＭＣ２１ｎｈｈＡの欠失
変異体を作製した。野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドのアミノ酸１〜５４
をコードする増幅産物を、下記のプライマーを使用してｎｈｈＡ核酸テンプレー
トからＰＣＲ増幅によって作製した：

【０１９１】 ＨＯＭＰ５’：

【０１９２】

【表３】 これは、過剰発現構築物ｐＩＰ５２を作製するために使用された同じオリゴヌク
レオチドである。

【０１９３】 ＮＨ３’ＢＧ：

【０１９４】

【表４】 これは、ＢｇｌＩＩ制限部位（下線部）と、アミノ酸１３４（二重下線）および
野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡのアミノ酸４９〜５４をコードする配列の逆相補鎖（
太字）とを含む。

【０１９５】 得られた増幅産物はＥａｇＩおよびＢｇｌＩＩの制限エンドヌクレアーゼ部位
を含んだ。ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）は、ｎｈｈＡオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）の開始部の２０ｂｐ上流に単一のＥａｇＩ部位を含み、ＯＲＦ内に
位置する単一のＢｇｌＩＩ部位を含む（図３を参照のこと）。したがって、ｐＩ
Ｐ５２（ＰＭＣ２１）および増幅産物を、ＥａｇＩおよびＢｇｌＩＩを用いた制
限エンドヌクレアーゼ消化に供し、連結して、コンピテントなＤＨ５α株の大腸
菌細菌を形質転換するために使用した。これにより、ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）
のＥａｇＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントがＰＣＲ産物で置換される。これにより、
図５（配列番号２３）に示されるように５１２アミノ酸のポリペプチドをコード
する組換え核酸発現構築物（図５に示されるオープンリーディングフレーム；配
列番号２８）が作製された。このアミノ酸配列は野生型配列のアミノ酸１〜５４
および１３４〜５９２を含み、それにより、野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプ
チドのＶ１領域の大部分、Ｖ２領域およびＣ２領域のすべて、ならびにＣ３領域
の一部が欠失している。

【０１９６】 このプラスミドを制限消化により線状化して、髄膜炎菌の７Ｇ２株に形質転換
した。実施例１に記載されるような方法を使用して、短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ
を過剰発現するコロニーを１つ単離した（図１１）。

【０１９７】 コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ ．ａｕ において提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想され
るアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプ
チド（図１４、配列番号３５）が生成することが示される。切断され得るシグナ
ル配列の存在を確認するために、そして過剰発現したタンパク質の同一性を確認
するために、外膜タンパク質を、界面活性剤サルコシルに溶解しない画分を単離
することによって半精製した。

【０１９８】 単離された膜タンパク質を電気泳動で分離し、その後、ナイロンメンブランに
転写した。過剰発現したタンパク質の位置がクーマシー染色によって明らかにさ
れた。メンブランのこの領域を切り出して、タンパク質のＮ末端配列を決定した
。このタンパク質の最初の１１アミノ酸はＸＸＥＴＤＬＴＳＶＧＴであった。こ
れは、本実施例において規定される発現構築物によって発現することが予測され
るアミノ酸配列のアミノ酸残基５２〜６２（６２を含む）に対応する。

【０１９９】 これは、ポリヌクレオチド配列内に存在する制限部位を使用した欠失体の例で
ある。この構築物は任意の形質転換受容性の髄膜炎菌に形質転換することができ
る。

【０２００】 実施例５ 都合のよい制限部位を使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築 Ｈ４１の野生型ｎｈｈＡ配列を含有する発現構築物を、実施例２に記載される
ように作製した。得られた発現構築物をｐＩＰ５２（Ｈ４１）と名付けた。欠失
変異体を、本実施例に概略される方法を使用して作製した。この場合、使用され
たオリゴヌクレオチドプライマーは下記の通りである：

【０２０１】 ＨＯＭＰ５’：

【０２０２】

【表５】 これは、過剰発現構築物ｐＩＰ５２を作製するために使用された同じオリゴヌク
レオチドである。

【０２０３】 ＮＨ３’ＳＴＵ

【０２０４】

【表６】 これは、ＳｔｕＩ制限部位（下線部）と、アミノ酸１３４（二重下線）および野
生型Ｈ４１ＮｈｈＡのアミノ酸４９〜５４をコードする配列の逆相補鎖（太字）
とを含む。

【０２０５】 得られた増幅産物は単一のＥａｇＩおよびＳｔｕＩの制限エンドヌクレアーゼ
部位を含有する。発現構築物ｐＩＰ５２（Ｈ４１）はこれらの制限部位を含有す
る。したがって、ｐＩＰ５２（Ｈ４１）および増幅産物を、ＥａｇＩおよびＳｔ
ｕＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に供し、連結して、コンピテントなＤ
Ｈ５α株の大腸菌細菌を形質転換するために使用した。この連結により、ｐＩＰ
５２（Ｈ４１）のＥａｇＩ／ＳｔｕＩフラグメントがＰＣＲ産物で置換される。
これにより、図６および配列番号２４に示されるように５１３アミノ酸のポリペ
プチドをコードする組換え核酸発現構築物（図６および配列番号２９に示される
オープンリーディングフレーム）が作製された。このアミノ酸配列は野生型配列
のアミノ酸１〜５４および１３４〜５９３を含み、それにより、野生型Ｈ４１Ｎ
ｈｈＡポリペプチドのＶ１領域の大部分、Ｖ２領域およびＣ２領域のすべて、な
らびにＣ３領域の一部が欠失している。

【０２０６】 このプラスミドを制限消化により線状化して、髄膜炎菌の７Ｇ２株に形質転換
した。実施例１に記載されるような方法を使用して、短縮型Ｈ４１ＮｈｈＡを過
剰発現するコロニーを１つ単離した（図１１）。

【０２０７】 コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ ．ａｕ において提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想され
るアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプ
チド（図１４、配列番号３６）が生成することが示される。 この構築物は任意のコンピテントな髄膜炎菌に形質転換することができる。

【０２０８】 実施例６ スプライスオーバーラップＰＣＲを使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築 ＮｈｈＡをコードするヌクレオチドから可変領域を欠失するために都合の良い
制限部位を使用することに加えて、変異体はまた、Ｈｏら（１９８９、前掲）お
よびＨｏｒｔｏｎ、Ｒ．Ｍ．ら （１９８９、前掲）により記載されるような「
スプライスオーバーラップ発現」ＰＣＲの使用によっても構築することができる
。この方法では、定常領域をコードするが、可変領域が欠失しているポリヌクレ
オチドを作製することができる（図５Ａ、５Ｂ、５Ｃを参照のこと）。

【０２０９】 本実施例では、Ｃ１領域およびＣ５領域を含有し、他の領域のすべてを欠失さ
せた構築物が作製された（図５Ａを参照のこと） 下記のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＭＣ２１株の染色体ＤＮＡからＣ
１領域（図１を参照のこと）に対応するＤＮＡを増幅するためにＰＣＲ反応にお
いて使用した：

【０２１０】 ＨＯＭＰ５’：

【０２１１】

【表７】 これは、過剰発現構築物ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）を作製するために使用された
同じオリゴヌクレオチドである。

【０２１２】 ＳＯ−Ｃ：

【０２１３】

【表８】 この配列は、ＰＭＣ２１株の野生型ＮｈｈＡのＣ５領域の開始部のアミノ酸２３
７〜２４１（下線部）およびＣ１領域の終了部のアミノ酸４５〜５２（太字）を
コードする配列の逆相補鎖である。

【０２１４】 この反応の増幅産物はＨＯＭＰ５’／ＳＯ−Ｃである。 下記のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＭＣ２１株の染色体ＤＮＡからＣ
５を増幅するためにＰＣＲ反応において使用した： ＳＯ−Ｄ：

【０２１５】

【表９】 これはＣ５の開始部のアミノ酸２３７〜２４４をコードする（下線部はプライマ
ーＳＯ−Ｃの逆相補鎖を示す）

【０２１６】 ＨＯ３’ＡＮ：

【０２１７】

【表１０】 これは、ｐＩＰ５２の構築において使用された同じプライマーである。 この反応の増幅産物はＳＯ−Ｄ／ＨＯ３’ＡＮである。 ＨＯＭＰ５’／ＳＯ−ＣおよびＳＯ−Ｄ／ＨＯ３’ＡＮの増幅産物を、電気泳
動で分離した後のアガロースゲルから精製し、混合して、ＨＯＭＰ５’およびＨ
Ｏ３’ＡＮのプライマーを使用するさらなる増幅に供した。得られた増幅産物は
、ＰＭＣ２１の野生型ＮｈｈＡのアミノ酸１〜５２および３３７〜５９１をコー
ドする。この増幅産物を、実施例１に記載されるように、ＥａｇＩおよびＮｃｏ
Ｉを用いた制限消化に供し、そしてｐＣＯ１４Ｋにクローン化した。この組換え
分子はＣ１およびＣ５を含有し、したがってＶ１〜Ｖ４およびＣ２〜Ｃ４の領域
を欠失している。このオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が図７
および配列番号３０に示され、このヌクレオチド配列に由来する予想されるポリ
ペプチド配列が図７および配列番号２５に示される。

【０２１８】 このプラスミドを制限消化により線状化して、髄膜炎菌の７Ｇ２株に形質転換
した。実施例２に記載されるような方法を使用して、短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ
を過剰発現するコロニーを１つ単離した。

【０２１９】 コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ ．ａｕ において提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想され
るアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプ
チド（図１４；配列番号３７）が生成することが示される。 このプラスミドは
髄膜炎菌の任意の形質転換受容性菌株に形質転換することができる。

【０２２０】 実施例７ スプライスオーバーラップＰＣＲを使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築 類似する方法を使用して、ＮｈｈＡの様々な領域をコードする組換えポリヌク
レオチドを作製できることが理解される。下記の方法を使用して、Ｃ１、Ｃ４、
Ｖ４およびＣ５の領域を含む構築物を作製することができる（図５Ｂを参照のこ
と）。

【０２２１】 Ｃ１領域が、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される： ＨＯＭＰ５’：

【０２２２】

【表１１】 ＳＯ−Ｅ：

【０２２３】

【表１２】 これは、ＰＭＣ２１株の野生型ＮｈｈＡのＣ４領域の開始部のアミノ酸２１１〜
２１５（下線部）およびＣ１領域の終了部（太字）の逆相補鎖をコードする。

【０２２４】 この反応の増幅産物はＨＯＭＰ５’／ＳＯ−Ｅである。 下記のオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＭＣ２１株の染色体ＤＮＡから領
域Ｃ４−Ｖ４−Ｃ５を増幅するためにＰＣＲ反応において使用される： ＳＯ−Ｆ：

【０２２５】

【表１３】 これはＣ４の開始部のアミノ酸２１１〜２１８をコードする（下線部はプライマ
ーＳＯ−Ｅの逆相補鎖を示す）

【０２２６】 ＨＯ３’ＡＮ：

【０２２７】

【表１４】 この反応の増幅産物はＳＯ−Ｆ／ＨＯＭＰ３’である。 ＨＯＭＰ５’／ＳＯ−ＥおよびＳＯ−Ｆ／ＨＯ３’ＡＮの増幅産物は、電気泳
動で分離された後のアガロースゲルから精製され、混合されて、ＨＯＭＰ５’お
よびＨＯ３’ＡＮのプライマーを使用するさらなる増幅に供される。得られる生
成物は、ＰＭＣ２１の野生型ＮｈｈＡのアミノ酸１〜５２および２１１〜５９１
をコードする。この増幅産物は、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩを用いた制限消化に供
され、そしてｐＣＯ１４Ｋにクローン化される。この組換え分子は、Ｃ１、Ｃ４
、Ｖ４およびＣ５を含有し、したがってＶ１〜Ｖ３およびＣ２〜Ｃ３の領域を欠
失している。このオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が図８およ
び配列番号３１に示され、このヌクレオチド配列に由来する予想されるポリペプ
チド配列が図８および配列番号２６に示される。コンピュータープログラムＳＩ
ＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣ
Ｇ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最
初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４；配列番号３８）が
生成することが示される。 この構築物は任意の形質転換受容性の髄膜炎菌に形質転換することができる。

【０２２８】 実施例８ スプライスオーバーラップＰＣＲを使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築 類似する方法を使用して、ＮｈｈＡの様々な領域をコードする組換えポリヌク
レオチドを作製できることが理解される。下記の方法を使用して、Ｃ１、Ｃ２、
Ｃ３、Ｃ４およびＣ５の領域を含む構築物を作製することができる（図５Ｃを参
照のこと）。

【０２２９】 Ｃ１およびＣ２が、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅され
る： ＨＯＭＰ５’：

【０２３０】

【表１５】 ＳＯ−Ｇ：

【０２３１】

【表１６】 これは、ＰＭＣ２１株のＣ３領域の開始部のアミノ酸１２５〜１２９（下線部）
、Ｃ２領域のすべて（アミノ酸１０９〜１２０、太字で二重下線部）、およびＣ
１領域の終了部（アミノ酸４６〜５２、太字）の逆相補鎖をコードする。

【０２３２】 この反応の増幅産物はＨＯＭＰ５’／ＳＯ−Ｇである。 Ｃ３領域およびＣ４領域の一部が、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使
用して増幅される： ＳＯ−Ｈ：

【０２３３】

【表１７】 これはＣ３の開始部のアミノ酸１２５〜１３２をコードする（下線部はプライマ
ーＳＯ−Ｇの逆相補鎖を示す） ＳＯ−Ｉ：

【０２３４】

【表１８】 これは、Ｃ３領域の終了部のアミノ酸１８２〜８８（下線部）、およびＣ４領域
のアミノ酸２１１〜２２２（太字）の逆相補鎖をコードする。

【０２３５】 この反応の増幅産物はＳＯ−Ｈ／ＳＯ−Ｉである。 ＨＯＭＰ５’／ＳＯ−ＧおよびＳＯ−Ｈ／ＳＯ−Ｉの増幅産物は、電気泳動で
分離された後のアガロースゲルから精製され、混合されて、ＨＯＭＰ５’および
ＳＯ−Ｉのプライマーを使用するさらなる増幅に供され、アミノ酸１〜５２、１
０３〜１１４、１２５〜１８８および２１１〜２２２（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、
Ｃ３、およびＣ４の一部の領域）をコードする生成物が得られる。

【０２３６】 Ｃ５領域およびＣ４領域の一部が、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使
用して増幅される： ＳＯ−Ｊ：

【０２３７】

【表１９】 これは、ＰＭＣ２１株の野生型ＮｈｈＡのＣ４のアミノ酸２１８〜２２９および
Ｃ５のアミノ酸２３７〜２４３をコードする（太字下線部はプライマーＳＯ−Ｉ
の逆相補鎖を示す）

【０２３８】 ＨＯ３’ＡＮ：

【０２３９】

【表２０】 この反応の増幅産物はＳＯ−Ｊ／ＨＯ３’ＡＮである。 ＨＯＭＰ５’／ＳＯ−ＩおよびＳＯ−Ｊ／ＨＯ３’ＡＮの増幅産物は、電気泳
動で分離された後のアガロースゲルから精製され、混合されて、ＨＯＭＰ５’お
よびＨＯ３’ＡＮのプライマーを使用するさらなる増幅に供される。得られる生
成物は、ＰＭＣ２１株の野生型ＮｈｈＡのアミノ酸１〜５２、１０３〜１１４、
１２５〜１８８、２１１〜２２９および２３７〜５９１をコードする。得られた
生成物は、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩを用いた制限消化に供され、そしてｐＣＯ１
４Ｋにクローン化される。この組換え分子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ
５の領域を含有し、したがってＶ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４の領域を欠失してい
る。このオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が図９および配列番
号３２に示され、このヌクレオチド配列に由来する予想されるポリペプチド配列
が図９および配列番号２７に示される。コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥ
ＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプ
ログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の４９
アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４；配列番号３９）が生成する
ことが示される。 この構築物は髄膜炎菌の任意の形質転換受容性菌株に形質転換することができ
る。

【０２４０】 実施例９ 過剰発現したＮｈｈＡポリヌクレオチドの精製 前記実施例に記載されるような組換えＮｈｈＡポリペプチドは下記の手法によ
って単離することができる。細菌を５％ＣＯ２の雰囲気において３７℃で一晩（
１２時間〜１４時間）生育させる（本実施例では、培地は、Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ
塩基が補充されたＢＨＩ寒天であった。他の生育培地が当業者には十分に知られ
ている）。１０枚の２５ｍＬ寒天平板に由来する細菌を集め、ＨＣｌでｐＨ８．
０に調節された１０ｍＭ Ｔｒｉｓの２５ｍＬに懸濁した。２％サルコシルを含
有する等容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加え、混合物を４℃で１時
間穏やかに混合した。これを１００，０００ｘｇにおいて２０℃で７０分間遠心
分離して、上清を捨てた。ペレットを、２５ゲージの針に通すことによって、１
％サルコシルを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）の２５ｍＬに再懸濁
した。これを１００，０００ｘｇにおいて２０℃で７０分間遠心分離して、上清
を捨てた。ペレットを、２５ゲージの針に通すことによって、１０ｍＬの１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。この画分は、細胞のサルコシル不溶
性成分を含み、外膜タンパク質が濃縮されている。（さらなる工程を、残留する
サルコシル界面活性剤を除くために取り入れることができる。それにより、タン
パク質溶液は、４℃において、例えば、１０ｍＭのＴｒｉｓ．Ｃｌ（ｐＨ８．０
）またはＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）の１００倍容量〜１０００倍容
量に対して４時間〜８時間の４回のサイクルにわたって透析される）。

【０２４１】 ２８０ｎｍの波長における吸光度によって、またはＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃ
ｅ）を使用することによって懸濁物中のタンパク質濃度を測定した後、１％ＳＤ
Ｓ（ラウリル硫酸ナトリウム）、２％β−メルカプトエタノールを含有する溶液
に１０ｍｇのタンパク質を含有する約１ｍＬの溶液をＢｉｏＲａｄ ｍｉｎｉ−
ｐｒｏｔｅａｎＩＩ装置において１．５ｍｍ厚の６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し
た。高分子量のＮｈｈＡを、ＢｉｏＲａｄ「ｍｉｎｉ Ｗｈｏｌｅ ｇｅｌ Ｅ
ｌｕｔｅｒ」を使用してゲルから溶出させた。各溶出画分の約１０％を、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分離し、その後、クーマシー染色することによって調べた。他のタ
ンパク質を本質的に含まないＮｈｈＡ含有画分をまとめた。この手順は、実施例
２に記載されるような過剰発現させた成熟ＮｈｈＡ（配列番号１）、実施例４に
記載されるような過剰発現させたＢｇｌＩＩ欠失変異体ＮｈｈＡ（配列番号２３
）、および実施例６に記載されるような過剰発現させたＮｈｈＡ欠失変異体（配
列番号２５）を単離するために行われた。単離タンパク質は図１２に示される。

【０２４２】 実施例１０ 精製されたＮｈｈＡ欠失変異体ポリヌクレオチドの免疫原性 マウスに、精製された野生型ＮｈｈＡポリヌクレオチド、および前記実施例に
記載される欠失変異体を接種した。１つの群において、各Ｂａｌｂ／ｃマウスに
は、約１３０μｇのＰＭＣ２１ＮｈｈＡがＭＰＬ＋ＴＤＭ（商標）アジュバント
（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）とともに０日目に皮下接種され、そし
て１４日目に１１５μｇが皮下接種された。別の群では、各マウスには、約１２
０μｇのタンパク質がＭＰＬ＋ＴＤＭ（商標）アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌ
ｄｒｉｃｈから入手）とともに０日目に皮下接種され、そして１４日目に１９０
μｇが皮下接種された。さらに別の群では、各マウスには、約２６０μｇのタン
パク質がＭＰＬ＋ＴＤＭ（商標）アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈか
ら入手）とともに０日目に皮下接種され、そして１４日目に１２４０μｇが皮下
接種された。血液サンプルを２１日目に採取して、血清を抽出した。これらの血
清を、全長型のＰＭＣ２１ＮｈｈＡを認識する抗体の存在についてウエスタン免
疫ブロットで試験した（図１３）。Ｐ６（ＰＭＣ２１のＮｈｈＡを過剰発現する
）および２Ａ株（ＮｈｈＡの発現が失われている）のＯＭＣ調製物（５ｍｇ）を
、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｎｉ ＰｒｏｔｅａｎＩＩ電気泳動装置を使用して６％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をニトロセルロースに電気泳動的
に転写して、フィルターを３ｍｍ細片に切断し、その後、５％スキムミルクを含
むＰＢＳでブロッキングした。マウス血清を５％スキムミルク粉末で１：１００
０倍および１：１００００倍に希釈して、ニトロセルロース細片とともにインキ
ュベーションした。抗体の結合を、アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ
（Ｓｉｇｍａ）を使用し、その後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ）を用いた比
色検出により検出した。図１３から理解され得るように、ＮｈｈＡ欠失変異体ま
たは全長型の成熟ＮｈｈＡポリペプチドを接種することによって、全長型の成熟
ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドに対する免疫応答を誘発させることが可能であ
る。

【０２４３】 実施例１１ 大腸菌における欠失変異体の発現 本発明の変異体ポリペプチドを髄膜炎菌において発現させることに加えて、本
発明の変異体ポリペプチドは大腸菌細菌においても発現させることができる。実
施例４〜８の組換えｎｈｈＡ欠失変異体はどれも、ＰＣＲ増幅のテンプレートと
して使用することができる。使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは、国際
公開公報第９９／３１１３２号に記載される通りであり得る（その明細書の配列
番号２４および配列番号２５など）。増幅産物をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの
酵素で制限消化して、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで制限消化されたプラスミド
ｐＭＡＬＣ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と連結し、得られた
プラスミドをコンピテントな大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。得られた菌株は
、ｐＭＡＬＣ２の製造者が指示する条件を使用して高レベルの組換えタンパク質
を発現させるために誘導することができる。得られる組換えタンパク質は、マル
トース結合タンパク質と本発明の欠失変異体ＮｈｈＡポリペプチドとの融合体で
ある。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離、その後、Ｍｉｎｉ−Ｇｅｌ Ｅｌｅ
ｃｔｒｏ−ｅｌｕｔｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を製造者の説明書に従って使用する電
気溶出によって半精製することができる。その後、半精製された融合タンパク質
は、ＰＢＳに対して透析され、その後、プロテアーゼ酵素の第Ｘａ因子で消化し
て、マルトース結合タンパク質成分を組換えＮｈｈＡタンパク質から切断するこ
とができる。組換えＮｈｈＡタンパク質は、例えば、Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ ＵＳＡ、１９９３）によって記載されるような標準的
な方法によって精製することができる。

【０２４４】 本明細書中を通して、目的は、本発明をいずれか１つの態様または特徴の特定
の集合に限定することなく、本発明の好ましい態様を記載することである。した
がって、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な改変お
よび変化を例示された特定の態様において行い得ることが当業者によって理解さ
れる。

【０２４５】 本明細書で参照されるすべてのコンピュータープログラム、アルゴリズム、特
許および科学的文献は参照により組み込むものとする。

【０２４６】

【表２１】

【０２４７】

【表２２】 （表の説明） 表１：髄膜炎菌の示された１０菌株のそれぞれから得られたＮｈｈＡポリペプ
チドの保存領域（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５）および可変領域（Ｖ１、
Ｖ２、Ｖ３およびＶ４）のアミノ酸の同定。関連する配列番号もまた示される。
第１欄＝菌株名。配列番号１〜９は同時係属中の出願である国際公開公報第９９
／３１１３２号に以前に記載された。Ｚ２４９１株のＮｈｈＡおよびｎｈｈＡの
配列はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／
Ｎ＿ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ／から得られた。第２欄＝Ｃ１領域のアミノ酸番
号。第３欄＝Ｖ１領域のアミノ酸番号。第４欄＝Ｃ２領域のアミノ酸番号。第５
欄＝Ｖ２領域のアミノ酸番号。第６欄＝Ｃ３領域のアミノ酸番号。第７欄＝Ｖ２
領域のアミノ酸番号。第８欄＝Ｃ４領域のアミノ酸番号。第９欄＝Ｖ４領域のア
ミノ酸番号。第１０欄＝Ｃ５領域のアミノ酸番号。コンセンサス配列（配列番号
１１）のアミノ酸番号もまた示されていることには留意すること。

【０２４８】 表２：アミノ酸置換の表

【図面の簡単な説明】

【図１】 １０菌株の髄膜炎菌から得られたＮｈｈＡポリペプチドアミノ酸配列（配列番
号１〜１０）とコンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列（配列番号１１）との
アミノ酸アラインメント。このアラインメントで使用された菌株名およびポリペ
プチド配列は表１の第１欄の菌株名および配列番号に対応する。アミノ酸は標準
的な一文字略号によって示される。コンセンサスなアミノ酸は、残基が完全に保
存されている場合にだけ示される。保存領域（二重下線部、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、
Ｃ４、Ｃ５と表記）および可変領域（一本下線部、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４と表
記）がコンセンサス配列の下に示される。

【図２】 図１のアミノ酸配列をコードする、１０菌株の髄膜炎菌から得られたｎｈｈＡ
核酸のヌクレオチド配列アラインメント。Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５および
Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４の各領域は図１および表１に記載される通りである。

【図３】 ｐｏｒＡプロモーターに作動的に連結された野生型ＰＭＣ２１のＮｈｈＡをコ
ードするＰＣＲ増幅産物を有するｐＣＯ１４Ｋに対応するプラスミドマップ（ス
ケール通りには縮尺されていない）。３Ａ：黒矢印は、ｐＣＯ１４Ｋ内のｐｏｒ
Ａ遺伝子およびｋａｎＲ遺伝子の配置を示す。ＰＭＣ２１株のｎｈｈＡ遺伝子を
増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドプライマーＨＯＭＰ５’およびＨ
ＯＭＰ３’ＡＮが示される。ｎｈｈＡ遺伝子は点線矢印により示され、ｐｏｒＡ
プロモーターは黒四角により示され、そして実施例２に記載されるようにｐｏｒ
ＡをｎｈｈＡで置換するために使用されたＥａｇＩおよびＮｃｏＩの制限部位が
示される。３Ｂ：実施例２に記載されるｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）における遺伝
子配置。実施例４に記載される変異体を構築するために使用されたＢｇｌＩＩ部
位が示される。

【図４Ａ】 ＮｈｈＡポリペプチドの特定領域を欠失させるためのスプライスオーバーラッ
プ伸長ＰＣＲ法の概略図。野生型ｎｈｈＡ遺伝子の概略図が図４Ａの上部に示さ
れ、組換えｎｈｈＡがこれらの図の下部に示されており、可変領域が黒四角とし
て、定常領域が白四角により示される。矢印はオリゴヌクレオチドプライマーの
おおよその位置を示す。垂直なハッチング線は増幅産物を示す。オリゴヌクレオ
チド配列がｎｈｈＡ核酸の不連続な領域に由来する場合、これは、そのような不
連続な領域の間における点線により示される。おおよそのスケールで示される。
二重の垂直線は、Ｃ５領域の一部分のみが示されていることを示す。実施例６に
記載される方法を示す。

【図４Ｂ】 図４Ａ同様の概略図で、実施例７に記載される方法を示す。

【図４Ｃ】 図４Ａ同様の概略図で、実施例８に記載される方法を示す。

【図５】 （Ａ）実施例４で作製されたＰＭＣ２１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドの
アミノ酸配列（配列番号２３）。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号
２８）。

【図６】 （Ａ）実施例５で作製されたＨ４１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミ
ノ酸配列（配列番号２４）。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号２９
）。

【図７】 （Ａ）実施例６におけるスプライスオーバーラップＰＣＲによって作製された
ＰＭＣ２１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２５）
。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号３０）。

【図８】 （Ａ）実施例７におけるスプライスオーバーラップＰＣＲによって作製された
ＰＭＣ２１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２６）
。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号３１）。

【図９】 （Ａ）実施例８におけるスプライスオーバーラップＰＣＲによって作製された
ＰＭＣ２１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２７）
。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号３２）。

【図１０】 野生型ポリペプチド配列およびＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチド配列のアミノ
酸アラインメント。これらのポリペプチドは、実施例２、実施例３、実施例４お
よび実施例５に記載されるように作製された。アミノ酸は一文字略号によって示
される。表１および図１に規定される保存領域に対応するＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ
４およびＣ５と記された保存領域が、Ｈ４１およびＰＭＣ２１から得られた全長
配列に二重下線を付すことによって示され、そして表１および図１に規定される
可変領域に対応するＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４と記された可変領域が、Ｈ４１およ
びＰＭＣ２１から得られた全長配列に一本下線を付すことによって示される。

【図１１】 過剰発現したＮｈｈＡを示すウエスタン免疫ブロット。４５μｇの総細胞タン
パク質を、実施例９に記載されるように、４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
離し、その後、ニトロセルロースフィルターに転写して、ウエスタンブロットし
た。レーン１：野生型レベルのＮｈｈＡ発現を示す親株。レーン２：Ｐ６株（実
施例２に記載されるＰＭＣ２１ＮｈｈＡを過剰発現する）。レーン３：ＰΔ６株
（実施例４に記載される短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡを過剰発現する）。レーン４
：Ｈ１４株（実施例３に記載されるＨ４１ＮｈｈＡを過剰発現する）。レーン５
：ＨΔ８株（実施例５に記載される短縮型Ｈ４１ＮｈｈＡを過剰発現する）。レ
ーン６：２Ａ株（ＮｈｈＡの発現が、国際公開公報第９９／３１１３２号に記載
されるようにｎｈｈＡ遺伝子の変異により失われている）。標準物の移動が示さ
れる：１８５ｋＤａ、１１９ｋＤａ、８５ｋＤａ、６２ｋＤａ、５１．２ｋＤａ
、３８．２ｋＤａ、２２．４ｋＤａ。野生型ＮｈｈＡポリペプチドが、レーン１
に存在するが、レーン６には存在しない高分子量の免疫反応性バンドとして存在
する。

【図１２】 単離されたＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチド。ＮｈｈＡポリペプチドを、実施
例９に記載されるように単離し、その後、４〜２０％ＳＤ−ＰＡＧＥで分離した
。ポリアクリルアミドゲルをクーマシー染色した。レーン１：実施例６に記載さ
れる短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドを過剰発現する菌株のＯＭＣ調製物
。レーン２：精製された短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド。レーン３：実
施例４に記載される短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドを過剰発現する菌株
のＯＭＣ調製物。レーン４：精製された短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド
。レーン５：実施例２に記載されるＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドを過剰発現
する菌株のＯＭＣ調製物。レーン６：精製されたＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチ
ド。レーン７：分子量標準物：１７３ｋＤａ、１１１ｋＤａ、８０ｋＤａ、６１
ｋＤａ、４９ｋＤａ、３６ｋＤａ。レーン６以外のすべてのレーンにおける高分
子量の反応性種はおそらくはＮｈｈＡポリペプチドの多量体を表していることに
留意すること。他のバンドは、おそらくは、あまり安定でない形態のＮｈｈＡま
たは分解産物である。これらがレーン６には存在しないことに留意すること。

【図１３】 抗ＮｈｈＡタンパク質のマウス血清を使用するウエスタン免疫ブロット。すべ
てのパネルにおいて、レーン１、３、５、７は、ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチ
ドを過剰発現する菌株のＯＭＣを含有し、レーン２、４、６および８は、Ｎｈｈ
Ａを発現しない２Ａ株のＯＭＣを含有する。パネルＡ：レーン１および２：野生
型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡが１：１０００希釈で接種されたマウスＡ。レーン３およ
び４：野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡが１：１０，０００希釈で接種されたマウスＡ
。レーン５および６：野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡが１：１０００希釈で接種され
たマウスＢ。レーン７および８：野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡが１：１０，０００
希釈で接種されたマウスＢ。パネルＢ：レーン１＆２：短縮型ＰＭＣ２１Ｎｈｈ
Ａポリペプチド（実施例４）が１：１０００希釈で接種されたマウスＣ。レーン
３＆４：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド（実施例４）が１：１０，００
０希釈で接種されたマウスＣ。レーン５＆６：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施
例４）が１：１０００希釈で接種されたマウスＤ。レーン７および８：短縮型Ｐ
ＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例４）が１：１０００希釈で接種されたマウスＤ。パネ
ルＣ：レーン１＆２：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例６）が１：１０００希
釈で接種されたマウスＥ。レーン３および４：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施
例６）が１：１０，０００希釈で接種されたマウスＥ。レーン５＆６：短縮型Ｐ
ＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例６）が１：１０００希釈で接種されたマウスＦ。レー
ン７＆８：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例６）が１：１０００希釈で接種さ
れたマウスＦ。

【図１４】 予測される成熟型ＮｈｈＡポリペプチド欠失変異体。Ａ：実施例２に記載され
る予測される成熟タンパク質（配列番号３３）；Ｂ：実施例３に記載される予測
される成熟タンパク質（配列番号３４）；Ｃ：実施例４に記載される予測される
成熟タンパク質（配列番号３５）；Ｄ：実施例５に記載される予測される成熟タ
ンパク質（配列番号３６）；Ｅ：実施例６に記載される予測される成熟タンパク
質（配列番号３７）；Ｆ：実施例７に記載される予測される成熟タンパク質（配
列番号３８）；およびＧ：実施例８に記載される予測される成熟タンパク質（配
列番号３９）。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年２月１４日（２００２．２．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１９８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１９８】 単離された膜タンパク質を電気泳動で分離し、その後、ナイロンメンブランに
転写した。過剰発現したタンパク質の位置がクーマシー染色によって明らかにさ
れた。メンブランのこの領域を切り出して、タンパク質のＮ末端配列を決定した
。このタンパク質の最初の１１アミノ酸はＸＸＥＴＤＬＴＳＶＧＴ（配列番号５ ２） であった。これは、本実施例において規定される発現構築物によって発現す
ることが予測されるアミノ酸配列のアミノ酸残基５２〜６２（６２を含む）に対
応する。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１】 １０菌株の髄膜炎菌から得られたＮｈｈＡポリペプチドアミノ酸配列（配列番
号１〜１０）とコンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列（配列番号１１）との
アミノ酸アラインメント。このアラインメントで使用された菌株名およびポリペ
プチド配列は表１の第１欄の菌株名および配列番号に対応する。アミノ酸は標準
的な一文字略号によって示される。コンセンサスなアミノ酸は、残基が完全に保
存されている場合にだけ示される。保存領域（二重下線部、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、
Ｃ４、Ｃ５と表記）および可変領域（一本下線部、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４と表
記）がコンセンサス配列の下に示される。この図におけるアミノ酸配列は、以下 のように表１と一致させて命名している：ＰＭＣ２１＝配列番号１；Ｈ４１＝配 列番号２；Ｐ２０＝配列番号３；ＥＧ３２７＝配列番号４；ＥＧ３２９＝配列番 号５；Ｈ３８＝配列番号６；Ｈ１５＝配列番号７；ＢＺ１０＝配列番号８；ＢＺ ＝配列番号９；Ｚ２４９１＝配列番号１０；およびコンセンサス配列＝配列番号 １１。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図２】 図１のアミノ酸配列をコードする、１０菌株の髄膜炎菌から得られたｎｈｈＡ
核酸のヌクレオチド配列アラインメント。Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５および
Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４の各領域は図１および表１に記載される通りである。こ の図におけるアミノ酸配列は、以下のように命名している：ＰＭＣ２１＝配列番 号１２；Ｈ４１＝配列番号１３；Ｐ２０＝配列番号１４；ＥＧ３２７＝配列番号 １５；ＥＧ３２９＝配列番号１６；Ｈ３８＝配列番号１７；Ｈ１５＝配列番号１ ８；ＢＺ１０＝配列番号１９；ＢＺ１９８＝配列番号２０；Ｚ２４９１＝配列番 号２１；コンセンサス配列＝配列番号２２。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 35/76 ４Ｃ０８７ // Ａ６１Ｋ 31/7088 48/00 ４Ｈ０４５ 35/76 Ｃ１２Ｒ 1:36 48/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:36） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジェニングズ、マイケル ポール オーストラリア国 4152 クイーンズラン ド州 ブリスベン カリナ ピカソ スト リート 20 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA15 BA31 CA02 DA05 4B065 AA01 AB01 BA01 CA24 CA45 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA04 MA13 MA17 MA21 MA23 MA31 MA32 MA35 MA52 MA55 MA56 MA57 MA60 MA63 MA65 MA66 NA14 ZB352 4C085 AA03 BA16 BB11 BB23 GG03 GG04 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB35 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZB35 4H045 AA11 AA30 BA10 BA16 BA17 BA19 BA20 CA11 DA86 EA31 EA54

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＮｈｈＡポリペプチドの１２個以上の連続した保存アミノ酸
   を含み、野生型ＮｈｈＡポリペプチドではない単離タンパク質。
2. 【請求項２】 免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載の単離タ
   ンパク質。
3. 【請求項３】 免疫応答が、対応する該ＮｈｈＡポリペプチドによって誘発
   される免疫応答よりも菌株特異性が小さい、請求項２に記載の単離タンパク質。
4. 【請求項４】 該免疫応答が髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の
   １または複数の菌株に対する保護をもたらす、請求項３に記載の単離タンパク質
   。
5. 【請求項５】 該免疫応答が髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の
   多数の菌株に対する保護をもたらす、請求項３に記載の単離タンパク質。
6. 【請求項６】 ２０個以上の連続した保存アミノ酸を含む、請求項１に記載
   の単離タンパク質。
7. 【請求項７】 ５０個以上の連続した保存アミノ酸を含む、請求項６に記載
   の単離タンパク質。
8. 【請求項８】 １００個以上の連続した保存アミノ酸を含む、請求項７に記
   載の単離タンパク質。
9. 【請求項９】 ＮｈｈＡポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番
   号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番
   号９および配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求
   項１に記載の単離タンパク質。
10. 【請求項１０】 （ｉ）配列番号１１の残基１〜５０、 （ｉｉ）配列番号１１の残基１０９〜１２０、 （ｉｉｉ）配列番号１１の残基１３５〜１９８、 （ｉｖ）配列番号１１の残基２２１〜２３９、および （ｖ）配列番号１１の残基２４９〜６０４ からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、野生型ＮｈｈＡポリペプチドで
    はない単離タンパク質。
11. 【請求項１１】 （ｉ）配列番号１の残基１〜５０、 （ｉｉ）配列番号２の残基１〜５０、 （ｉｉｉ）配列番号３の残基１〜５０、 （ｖｉｉ）配列番号４の残基１〜５０、 （ｖｉｉｉ）配列番号５の残基１〜５０、 （ｉｘ）配列番号６の残基１〜５０、 （ｘ）配列番号７の残基１〜５０、 （ｘｉ）配列番号８の残基１〜５０、 （ｘｉｉ）配列番号９の残基１〜５０、 （ｘｉｉｉ）配列番号１０の残基１〜５０、 （ｘｉｖ）配列番号１の残基１２５〜１８８、 （ｘｖ）配列番号２の残基１２５〜１８８、 （ｘｖｉ）配列番号３の残基１２２〜１８５、 （ｘｖｉｉ）配列番号４の残基１２７〜１９０、 （ｘｖｉｉｉ）配列番号５の残基１２５〜１８８、 （ｘｉｘ）配列番号６の残基１３２〜１９５、 （ｘｘ）配列番号７の残基１３１〜１９４、 （ｘｘｉ）配列番号８の残基１３１〜１９４、 （ｘｘｉｉ）配列番号９の残基１２７〜１９０、 （ｘｘｉｉｉ）配列番号１０の残基１２５〜１８８、 （ｘｘｉｖ）配列番号１の残基２１１〜２２９、 （ｘｘｖ）配列番号３の残基２０６〜２２４、 （ｘｘｖｉ）配列番号１の残基２３７〜５９１、 （ｘｘｖｉｉ）配列番号２の残基２３７〜５９２、 （ｘｘｖｉｉｉ）配列番号３の残基２３５〜５８９、 （ｘｘｉｘ）配列番号４の残基２３９〜５９４、 （ｘｘｘ）配列番号５の残基２３７〜５９１、 （ｘｘｘｉ）配列番号６の残基２４４〜５９９、 （ｘｘｘｉｉ）配列番号７の残基２４３〜５９８、 （ｘｘｘｉｉｉ）配列番号８の残基２４３〜５９８、 （ｘｘｘｉｖ）配列番号９の残基２３９〜５９４、及び （ｘｘｘｖ）配列番号１０の残基２３７〜５９２ からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離タンパ
    ク質。 【請求項１１】 ＮｈｈＡポリペプチドの１または複数の可変（Ｖ）領域の
    アミノ酸をさらに含む、請求項１０に記載の単離タンパク質。
12. 【請求項１２】 配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２
    ６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６
    、配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９からなる群より選択されるア
    ミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の単離タンパク質。
13. 【請求項１３】 請求項１０に記載の単離タンパク質の対立遺伝子変異体。
14. 【請求項１４】 請求項１０に記載の単離タンパク質のフラグメントまたは
    誘導体。
15. 【請求項１５】 免疫原性である、請求項１３に記載のフラグメント。
16. 【請求項１６】 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の１または複数の単
    離タンパク質を含む医薬組成物。
17. 【請求項１７】 ワクチンである、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 【請求項１８】 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離タンパク質を
    コードする単離核酸。
19. 【請求項１９】 （ｉ）配列番号２２の残基１〜１５０、 （ｉｉ）配列番号２２の残基３２５〜３６１、 （ｉｉｉ）配列番号２２の残基４０３〜５９５、 （ｉｖ）配列番号２２の残基６６１〜７１７、および （ｖ）配列番号２２の残基７４５〜１８１５ からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１８に記載の単離
    核酸。
20. 【請求項２０】 配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３
    １および配列番号３２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請
    求項１９に記載の単離核酸。
21. 【請求項２１】 請求項１９または請求項２０に記載の単離核酸を含む発現
    ベクター。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細
    胞。
23. 【請求項２３】 細菌である、請求項２２に記載の宿主細胞。
24. 【請求項２４】 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ
    ｓ）である、請求項２３に記載の宿主細胞。