TWI288644B - New liquid pharmaceutical composition comprising unpegylated erythropoietin protein and preparation process thereof - Google Patents
New liquid pharmaceutical composition comprising unpegylated erythropoietin protein and preparation process thereof Download PDFInfo
- Publication number
- TWI288644B TWI288644B TW094134688A TW94134688A TWI288644B TW I288644 B TWI288644 B TW I288644B TW 094134688 A TW094134688 A TW 094134688A TW 94134688 A TW94134688 A TW 94134688A TW I288644 B TWI288644 B TW I288644B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- composition
- erythropoietin
- protein
- epo
- acid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Virology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
1288644 " 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 - 本發明係關於一種液態醫藥組合物,其包括含於適合保 ' 持溶液pH範圍約5.5至約7.0範圍之醫藥可接受緩衝溶液之 • 紅血球生成素蛋白質,多價無機陰離子,及視情況含有一 種或多種醫藥可接受賦形劑。此組合物特別可用以預防及 治療與紅血球生成作用有關之疾病。 【先前技術】 ® 紅血球生成作用是指製造紅血球細胞,以彌補紅血球細 胞的破壞。紅血球生成作用是種能生成足夠進行適當組織 氧合作用之紅血球細胞的控制性生理機制。天然生成的人 類紅金球生成素(hEPO)在腎臟製造,是種能刺激紅血球細 胞製造之體液血漿因子(Carnot,P及Deflandre,C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson, LO, 鲁 Goldwasser,E,Freid,W及 Plzak,LF (1957) Nature 179: • 6331-4)。天然存在的EPO藉由鍵結至血紅先驅物上之受 • 體,而刺激骨髓中相關血紅原細胞之***及分化,並展現 其生物活性(Krantz,BS (1991) Blood 77: 419)。
利用重組DNA技術,已可藉生物性合成方式生產紅血球 生成素(Egrie,JC,Strickland,TW,Lane,J 等人(1986) Immunobiol. 72: 213-224),此紅血球生成素是選殖人類EPO 基因***至中國倉鼠卵組織細胞(CHO細胞)並表現之產 物。主要並經完全處理過之hEPO形式的一級結構示於SEQ 1288644 IDN0:1。在Cys7-Cys161及Cys29-Cys33間有兩個雙硫鍵,不 含醣部分之EPO聚 鏈的分子量為18,236 Da,在完整的 EPO分子中,約40%的分子量係為位於蛋白質醣化位置將蛋 白質進行醣化之碳水化合物的基團(Sasaki,H,Bothner,B, Dell,A及Fukuda,Μ (1987) J· Biol· Chem. 262: 12059) 〇 因為人類紅血球生成素是紅血球細胞形成所必須的,故 荷爾蒙可用以治療特徵為紅血球細胞生成效率低落或紅血 球生成不足之血液疾病。臨床上,EPO可用以治療慢性腎 功能衰竭病患(CRF)(Eschbach,JW,Egri,JC,Downing,MR 等人(1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach,JW,Abdulhadi, MH,Browne,JK 等人(1989) Ann· Intern. Med· 111: 992; Egrie, JC5 Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988)
Kidney Inti. 33: 262; Lim,VS,Degowin,RL,Zavala, D等人 (1989) Ann. Intern· Med. 110: 108-114)及AIDS病患及接受 化療癌症病患之貧血症(Danna,RP,Rudnick,SA,Abels, RI In: MB,Garnick,ed.紅血球生成素在臨床上的應用-國際展 望·紐約,NY: Marcel Dekker; 1990: 301-324頁)。 已知醫藥組合物至少具有下列其中一項的缺點: -其為冷凍乾燥物。除了繁複的製造過程外,冷凍乾燥物 具有在注射至人體前必須重新調配的缺點,此為醫藥人員 必須做的額外手續,相當的不便,且可能有醫藥品操作不 當的風險存在, -其另外含有人類血清蛋白。因為人類血清蛋白是源自人 類體液的物質,故血清蛋白製劑中的污染物會有病毒感染 1288644 的風險,另外,亦可能發生過敏反應; -所有現有市售紅血球生成素組合物在高溫下是不穩定 的’換§之’其高於冰箱冷藏溫度2至是不穩定的。因 此’其必須保存於冰箱中(2-8°C ),而不能室溫下(約2〇。〇左 右)保存。因為必須低溫保存及運送,故會增加成本,在操 作藥劑產品時亦相當不便。本發明所謂不穩定意指在高溫 下(例如25 C )—段時間(例如數個月,或多於6個月)後,蛋 白質會分解。本發明所述的分解意指在高溫(高於8。〇)時, 蛋白質分子發生已知的物理變化(例如凝集或變性)及化學 變化(例如氧化或化學鍵改變)。將蛋白質置放於近於或高於 其轉換溫度時(亦稱為熔解溫度)會使蛋白質展開,換言之, ^的天然特性及生物活性會消失。轉換溫度與蛋白質的 溫度穩定性極為相關,且視蛋白質環境而定(例如pH,鹽 類,離子強度,緩衝物質等),例如,變性作用會使紅血球 生成素蛋白質凝集,甚至形成顆粒,此會使藥劑的效價降 低,注射至人體後可能會引發不要的副作用。 因此,本發明首要問題是提供一種能夠減少或抑制上述 缺點的組合物。 【發明内容】 根據本發明,解決問題是提供一種液態醫藥組合物,其 包括含於適合保持溶液pH範圍約5·5至約7〇範圍醫藥可接 受緩衝溶液中之紅血球生成素蛋白質,多價無機陰離子, 及視情況含有一種或多種醫藥可接受賦形劑。 咸已驚訝發現,調配此組合物中的紅血球生成素可增進 1288644 其在高於冷藏溫度(2_8°C)下之穩定性,特別是在室溫(例 如,低於25°C ),甚至在高溫(例如40°C )下的穩定性。此意 味此組合物在未冷藏情況下保存一段時間後,不會明顯失 去活性,且沒有明顯的分解作用。 除非特別聲明,下列所示定義及意義定義與各種名詞範 圍係用以說明本發明。
"多價無機陰離子"係指每個分子具有二或多負電價的無 機陰離子,例如硫酸根離子SCU2·,或磷酸根陰離子,例如 磷酸氫根離子ΗΡΟ,-。多價無機陰離子可以相對的鹽類形 式(例如,鈉鹽、鉀鹽及其混合物),及/或緩衝物質形式(例 如,磷酸緩衝液)添加。 等滲透或等張”意指與體液混合後不會影響其成分之溶 液。與血液等張的溶液(諸如氣化鈉〇·9%)與血清有相同的 滲透壓,其不會影響紅血球細胞的細胞膜。一般而言,與 血液荨張的溶液約290 mosm/公斤H2〇。 、 …、機強酸”意指為1 N溶液時具有2 〇至丨〇 〇 %解離度之盔 機酸,例如,硫酸。 …、 本專利說明書所用"醫藥上可接受"一詞意指從毒性觀點 而言,該緩衝液或鹽類係可接受的。 . 但意指在醫藥配方中的物質,其並無醫藥活性, 注射用荜劑:所必須或所要的’例如,稀釋劑可以是溶解 /主射用桌劑的液體,例如,水。 :劑”意指可將另一種物質保持 液體,例如,水。 分肝/合狀T的 1288644 ”防腐劑"意指添加至醫藥組合物中,以避免細菌生長的 物質’例如氣化节甲烴錄(benzalkonium chloride)或节醇。 ”聚醇”意指具有多個羥基的任何物質,包括聚氫醇及碳 水化合物。聚氫醇包括的物質有山梨糠醇,甘露醇及甘油。 碳水化合物係具有酮基或醛基的環狀物質,如蔗糖或海藻 糖。 ’’紅灰球生成素”或”紅血球生成素蛋白質"係指具有使骨 髓細胞增加製造網狀血球及紅血球細胞的活體内生物活性 之蛋白質,並選自人類紅血球生成素及後述定義之類似物。 ”配集化紅血球生成素(Peg-EPO或PEG-EPO)”意指與後 述定義之一至三元聚乙烯衍生物共價鏈結之紅血球生成素 蛋白質。 M裝置”意指一種特定目的用的設計,本發明目的係為能 夠、支持或幫助液態醫藥組合物投藥。 【實施方式】 詳而言之,本發明係關於一種液態醫藥組合物,其包括 含於適合保持溶液pH範圍約5·5至約7·0範圍之醫藥可接受 緩衝液中之紅血球生成素蛋白質,多價無機陰離子,及視 情況含有一種或多種醫藥可接受賦形劑。 在一個較佳的具體實例中,組合物是種液態溶液,例如 水心液。在本發明較佳的具體實例中,上述醫藥組合物為 等張溶液。 陰離子較佳選自無機強酸的陰離子,諸如ii2S04 , H3P〇4,或檸檬酸。因此,較佳陰離子選自硫酸根離子,磷 1288644 Μ離子’及檸檬酸根離子,較佳者為硫酸根離子或墙酸 根離子 ,而最佳者為硫酸根離子。多價無機陰離子的濃度可介 - 於10及200毫莫耳/公升中變化,例如硫酸根陰離子可介於 • 10及200毫莫耳/公升。 本發明所用緩衝物係可將持在約5 5至約7 〇範圍之 間(較佳在5.8至6.7範圍,更佳者在6.0至6.5範圍,最佳者為 φ 約6·2)之有機酸或無機酸(例如磷酸緩衝液,精胺酸/h2so4/
Na2S〇4緩衝液’或其他㈣上可接受的緩㈣統)的慣用緩 衝物質。在-個較佳的具體實例中,組合物包括麟酸或精 胺酸/HJCVNaaSO4緩衝液,更佳者為1〇至5〇毫莫耳/公升磷 酸緩衝液H這些緩衝系統的組合亦為本發明的部分。 可分別使用相關的驗(例如鱗酸緩衝液系統中的⑽扣及相 關的酸(例如精胺酸緩衝液系統中的硫酸)來調整pH值。 本發明組合物可包括一種或多種醫藥上可接受賦形劑, • 這些醫藥上可接受賦形劑選自醫藥上可接受鹽類,稀釋劑 及/或溶劑及/或防腐劑等,例如張力劑(等張調整劑),聚 , 醇’抗氧化劑或非離子清潔劑。這些物質的實例有氣化 鈉’氣化鈣,山梨糖醇,甘露醇,甘油,蔗糖,海藻糖, 乙醯基半胱胺酸,聚山梨酸2〇,聚山梨酸80,或普洛尼克(普 洛尼克)F68。 9 在本發明一個較佳的具體實例中,該醫藥組合物可含有 選自甘露醇,山梨糖醇,甘油’海藻糖,及蔵糖的聚醇, 較佳者為甘露醇。聚醇的濃度介於⑷㈣(重量/體積)之 1288644 間。 抗_氧化劑的實例為半胱胺酸,甲硫胺酸,乙醯基半胱胺 酸或抗壞血酸’較佳者為甲硫胺酸。抗-氧化劑通常添加的 濃度介於0·01及〇·5%(重量/體積)之間,或例如以甲硫胺酸 而s ’ ?辰度為1_2〇 〇 又’上述组合物可視情況包括約0.01至約0.9%(重量/重量) 之等張調整劑’這些化合物是技藝中所知的;這些藥劑的 實例為氣化鈉或硫酸鈉。本發明一個較佳的具體實例中, 該組合物為等張溶液。上述組合物亦可含有至高達1% (重量/體積)(較佳至高達〇1%(重量/體積),例如〇 〇〇1至 0.01°/。(重量/體積))之非_離子性清潔劑,諸如聚山梨酸2〇, 聚山梨酸80或普洛尼克F68,較佳者為普洛尼克F68。 上述組合物亦可含有例如高達1毫莫耳/公升CaC1l之額 外鹽類。 本發明特別可用以製備含有以紅血球生成素為醫藥活性 成分之醫藥組合物。,,紅血球生成素,,或,,紅血球生成素蛋白 質"或”EP〇”定義如下··特別是指例如含有胺基酸序列SEQ ID NO · 1或SEQ ID NO : 2(例如人類紅血球生成素)或實質 上胺基酸序列相似的聽蛋白,其生物特性係可刺激紅企球 細胞的產生,並刺激骨髓中血紅原的***及分化。本專利 說月曰所用的這些名柯包括例如以位置指引突變作用或以 突變作用篩選之精確修飾蛋白f,這些名詞包括具有… 個額外St化位置之類似% ’在醣蛋白的緩基^至少含有一 個額外的胺基酸之類似物,其中額外的胺基酸包括至少一 J288644 個醣化作用位置,及包括至少一個醣化作用位置重組胺基 酸序列之類似物。這些名詞包括天然及重組而成之人類紅 血球生成素。
如後詳細所列,製備及純化E0P是技藝中所熟知的。紅 血球生成素是獲自任何慣用來源之天然或重組的蛋白質, 諸如組織,蛋白質合成作用,含有天然或重組細胞之細胞 培養,杈佳是源自人類,包括任何具有紅血球生成素活性 之蛋白質(諸如突變體或其他修飾的蛋白質)。可藉由 重組技術或内因性基因活化作用,在CH0-,BHK-4HeLa 細胞株中的表現製備出重組EP0,蛋白質的表現,包括藉 由内因性基因活化作用是技藝中所熟知的,並揭示於例如 美國專利案號5,733,761,5,641,670,及5,733,746,及國際 專利申凊案 WO 93/09222,WO 94/12650,W0 95/31560 , WO 90/11354,WO 91/06667及WO 91/09955,每一專利案 之内容均併入本專利說明書參考。製備紅血球生成素醣蛋 白產物之較佳EPO群是人類的EP0群,更佳者,Ep〇群為具 有胺基酸序列SEQ ID NO ·· 1或SEq ID N〇 : 2之人類Ep〇 , 更佳者為胺基酸序列SEQ ID NO : 1。 除此之外,紅血球生成素可為具有丨至6個額外醣化作用 位置之醣蛋白類似物,蛋白質的醣化作用(具有一個或多個 寡醣基)發生於聚架骨的特定位置,其大大的影塑蛋白f 的物理特性,諸如蛋白質穩純、分泌、在細 及生物活性。聽化作用通常有兩種類型,〇·鏈結寡膽是键 結至絲胺酸或蘇胺酸殘基,而N-鏈結寡醣則是鏈結至天冬 -12- 1288644 醯胺酸殘基。同時具有N-鏈結及0_鏈結的寡醣類型是N_乙 醯神經胺酸(唾液酸),其為一群含有9個或更多碳原子之胺 基醣類。唾液酸通常在N-鏈結及〇-鏈結寡醣的端點殘基, 因其帶有負電價,可提供醣蛋白酸性的特性。人類紅血球 生成素有165個胺基酸,其含有包括4〇%醣蛋白總分子量之 一個N-鏈結及一個〇_鏈結寡醣鏈。N_鏈結醣化作用發生在 位置24,3 8及83的天冬醯胺酸殘基,而〇-鏈結醣化作用發 生於位置126的絲胺酸殘基,以端點唾液酸殘基修飾寡醣 鏈。以酵素去除紅血球生成素上所有的唾液酸殘基會使其 失去活體内的活性,但不會失去活體外的活性,因為唾液 酸化之紅血球生成素會藉由肝鍵結蛋白質的鍵結而避免其 鍵結’及所造成的清除。 本醫藥組合物中"紅血球生成素”包括具有改變人類紅血 球生成素上胺基酸序列上一個或多個胺基酸殘基之人類紅 金球生成素的類似物,其會使唾液酸連接位置數目增加, 可利用位置-指引突變作用(包括可增加或改變對醣化作用 有益位置之加成,刪除,或取代胺基酸殘基)產生這類醣蛋 白類似物’加入不會混亂生物活性所需之二級或三級構形 之醣化位置可產生唾液酸含量大於人類紅血球生成素者含 量之醣蛋白類似物。本發明醣蛋白亦包括具有在醣化作用 位置上增加碳水化合物鍵結量之類似物,其通常與一個或 多個靠近N·鏈結或〇-鏈結位置的胺基酸有關。本發明醣蛋 白亦包括具有一個或多個自紅血球生成素竣基端伸出之胺 基酸類似物,及提供至少一個額外碳水化合物位置。本發 1288644 明紅血球生成素蛋白質亦包括至少一個重組醣化作用位置 胺基酸序列之類似物,此種重組醣化作用位置與刪除人類 紅血球生成素一個或多個醣化作用位置及加成一個或多個 非-天然存在醣化作用位置有關。增加紅血球生成素上碳水 化合物鏈的數目,及因此每紅血球生成素分子之唾液酸數 目會提供較佳的特性,諸如增加穩定性,增加蛋白水解的 抗性,降低激敏性,增加血清中的半衰期,及增加生物活 性。具有額外醣化作用位置的紅血球生成素類似物更詳細 揭示於Elliot 1995年3月1日印行之歐洲專利案640 619。 在一個較佳具體實例中,本發明醫藥組合物包括其胺基 酸序列上包含至少一個額外醣化作用位置之紅血球生成 素,諸如(但不侷限於)包括修飾過之人類紅血球生成素序列 者,修飾係選自下列:
Asn30Thr32 ;
Asn51Thr53 ;
Asn57Thr59 ;
Asn69 ;
Asn69Thr71 ;
Ser68Asn69Thr71 ;
Val87Asn88Thr90 ;
Ser87Asn88Thr90 ;
Ser87Asn88Gly89Thr90 ;
Ser87Asn88Thr90Thr92 ;
Ser87Asn88Thr90Alal62 ; -14- 1288644
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90 ;
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 ;
Asn89Ile90Thr91 ;
Ser87Asn89Ile90Thr91 ;
Asnl36Thrl38 ;
Asnl38Thrl40 ;
Thr125 ;及 Pro124Thr125 〇 本專利說明書所用係將相對於未修飾蛋白質胺基酸位置 (例如hEPO的SEQ ID NO : 1或SEQ ID NO : 2)改變成上角所 編號之胺基酸。 紅血球生成素蛋白質亦可為在醣蛋白叛基端上至少具有 一個額外胺基酸之類似物,其中該額外胺基酸包括至少一 個醣化作用位置,額外胺基酸包括源自人類絨毛膜性腺激 素羧基端之肽片段,較佳者,醣蛋白是選自(a)具有胺基酸 序 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lie Leu Pro Gln(SEQIDNO : 3)之人類紅血球生成素的類似物,自其竣 基端延伸;(b)除了(a)外,尚包括Ser87 Asn88 Thr90 EPO之類 似物;及(c)除了(a)外,尚包括 Asn3G Thr32 Val87 Asn88 Thr90 EPO之類似物。 紅血球生成素蛋白質亦可為具有包括至少一種重組醣化 作用位置胺基酸序列的類似物,該重組作用包括任何人類 紅血球生成素N-鏈結碳水化合物位置之刪除作用,及人類 -15- 1288644 紅血球生成素胺基酸序列位置88 N-鏈結碳水化合物位置 的加成作用,較佳地,醣化蛋白質為選自Gln24 Ser87 Asn88
Thr90 EPO ; Gin38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO ;及 Gin83 Ser87 Asn88 丨Thr9G EPO之類似物。 更明確言之,前述本發明醫藥組合物之紅血球生成素蛋 白質亦可包括其配集化衍生物。紅企球生成素配集化衍生 物及其製備是技藝中所熟知的,例如揭示於 ΕΡ-Α_539,167,ΕΡ_Α·605,963,W0 93/25212,W0 94/20069 , WO 95/1 1924 ,美國專利案號 5,56 , EP-A-584,876,WO 92/16555,WO 94/28024,WO 97/04796, 美國專利申請案號5,359,030及5,681,811,美國專利案號 4,179,337 ’曰本專利申請案,WO 98/32466,美國專利案 號5,324,650。較佳的配集化紅血球生成素種類之具體實例 係為後述的衍生物。 因此,本發明亦為紅血球生成素共輛物,該共軛物包括 前述具有至少一個游離胺基,及具有使骨趙細胞增加網狀 細胞及紅血球細胞產量之活體内生物活性,及選自人類紅 血球生成素及其具有人類紅血球生成素序列類似物之紅血 球生成素蛋白質,該類似物係經1至6個醣化作用位置之加 成作用或至少一個醣化作用位置重組作用之修飾;該紅血 球生成素係每個聚(乙二醇)基之-CO(換言之,羰基)共價鏈 結至-CO-(CH2)x-(〇CH2CH2)m-OR 之,,η,,聚(乙二醇)基上,形 成具有一個胺基的醯胺鍵結;其中R為低碳數烷基;X為2 或3 ; m為約450至約900 ; η為1至3,而所選之η及m會使共 ^^88644 軛物分子量減去紅血球醣化蛋白分子量為2〇千道耳頓至 JOO道耳頓。本發明另外提供含有本專利說明書所述共軛物 之醫藥組合物,其中當11為1時,共軛物的百分比佔組合物 至少為90,較佳為至少92%,或較佳為96%。 前述共軛物更明確言之是具有化學式(j) P-[NHC〇.(CH2)x.(〇CH2CH2)m-〇R]n ⑴ 其中p為本專利說明書所述紅血球生成素蛋白質殘基(換言 之,不具胺基或化學式I中所示與羰基形成醯胺鏈結之胺 基)’其具有使骨髓細胞增加網狀細胞及紅血球細胞產量之 活體内生物活性;及其中R為低碳數烷基;\為2或3 ; 111為 、、勺450至約900,η為1至3 ,而所選之m會使共輛物分子量 減去紅血球醣化蛋白分子量為2〇千道耳頓至1〇〇道耳頓。 本專利說明書所用,,低碳數烷基"係指具有一至六個碳原 子之直鏈或具支鏈烧基,低碳數统基實例包括甲基,乙基, 及異丙基。根據本發明,R為任何的低碳數烷基,共軛物中 的R較佳為甲基。 "m”符號代表聚(伸乙基氧)基團中伸乙基氧殘基 (〇CH2<:H2)的數目。氧化乙烯中一個PEG(聚乙二醇)次單位 的分子量約44道耳頓,因此,共軛物(不含Ep〇分子量)的分 子量視"m”的數目而定。在本發明共軛物中"㈤"約45〇至約 9〇〇(相對分子量為約20kDa至約4〇kDa),較佳為約65〇至約 750(相對分子量約30 kDa),所選的m使所得之本發明共軛 物較未經修飾之EPO具有生理活性,該活性可與未經修飾 EPO之活性相同,或較佳,或為其_部份。分子量中所指,, d -17- 1288644 約’’某一數字係指利用慣用分析技術測定合理範圍之數 目,所選之"mn使鏈結至紅血球醣化蛋白之每個聚(乙二醇) 基的分子量約20 kDa至約40 kDa,而較佳者為約30 kDa。 在本發明共軛物中,數字"η”為共價鏈結至經醯胺鍵結之 紅血球生成素蛋白質游離胺基(包括離胺酸ε -胺基及/或胺 基端的胺基)的聚(乙二醇)數目,本發明共軛物中每個Epo 分子具有一個,兩個,或三個PEG基。”η,,為1至3的整數, ’’η"較佳為1或2,而πη"更佳為1。前述共扼物中較佳的共輛 物包括其中X為2,m為650至750, η為1,R為甲基之化合物。 從已知聚合物可製備式(I)化合物: 將式(II)化合物
其中R及m如前所述與紅血球生成素醣化蛋白進行縮合作 用。X為3之式(II)化合物是聚(乙二醇)脂肪族低碳數烧氧, 丁酸琥珀酯(低烷氧基-PEG-SBA)。X為2之式(II)化合物是聚 (乙二醇)脂肪族低碳數烷氧,丙酸琥珀酯(低烷氧基 -PEG-SPA)。任何活化酯與胺反應形成醯胺的慣用方法均可 使用。在前述的反應中,實例玻拍S旨是脫離基,會促使醯 胺的形成。利用琥珀酯(諸如式II化合物)製備含有蛋白質的 共輛物揭示於1997年9月30日發行的美國專利案號 5,672,662 (Harris,等人)。 人類EPO含有九個游離胺基,胺基端的胺基及8個離胺酸 -18- 1288644 殘基的ε -胺基,當配集化藥劑與式η sb A化合物結合時, 咸已發現在pH 7·5,1 : 3比例之蛋白質·· peg,及反應溫度 介於20-25°C時,會產生單-,雙-,及少量三-配集化的產物, 當配集化藥劑與式II SPA化合物結合時,在相同的條件下 (除了蛋白質:PEG比例為1 : 2),則產生主要產物為單-配 集化。可以混合物形式之配集化EPO投藥,或以經過陽離 子交換層析法分離之不同配集化產物投藥。藉由操控反應 條件(例如,藥劑的比例,pH,溫度,蛋白質濃度,反應時 間等)’不同配集化的產物相對含量會有不同。 前述醫藥組合物亦可含有前述具有至少一個游離胺基及 具有使月知細胞增加網狀細胞及紅血球細胞之活體内生物 活性之紅金球生成素’該紅血球生成素選自人類紅血球生 成素及其具有加成1至6個醣化作用位置之人類紅血球生成 素一級結構之修飾類似物;該醣化蛋白質以共價鍵結至一 至二個低碳數烧氧基聚(乙二醇)基,每個聚(乙二醇)基係經 由式-C(0)-X_S-Y-連結子共價鍵結至醣化蛋白質,其中連 結子的C(0)與其中一個胺基形成醯胺,X為-(CH2)k-,或-CH2 (〇-CH2-CH2)k-,k為 1 至 10,γ為 •19· 1288644
每個聚(乙二醇)部分的分子量約2〇千道耳頓至约4〇千道耳 頓,而共輛物的分子量約51千道耳頓至約175千道耳頓。 φ 此紅血球生成素亦可以式ΠΙ表示 P-[NH.C〇.X.S.Y.(〇CH2CH2)m.〇R]n (ΠΙ) 其中R意指任何具有丨至6個碳原子之直鏈或具支鏈的低碳 數烷基,諸如甲基,乙基,異丙基等。較佳的烷基為甲基。 X 為-(CHA•或-CH2(0-CH2_CH2)k-,其中k為 u1〇。較佳是 U 1至約4,更佳者,]^為丨或2,最佳者,X為_(CH2)。 式1中,Y為
較佳是
-20- 1288644 更佳者
在式(III)中,所選的m使所得之本發明共扼物較未經修飾 之EPO具有生理活性,該活性與未經修飾EPO之活性相同, 或較佳,或為其一部份。m代表的是PEG單位中氧化乙烯殘 基的數目。-(OCH2CH2)-單一 PEG次單位體之分子量約為44 到耳頓。因此共軛物的分子量(減去EPO的分子量)視m的數 目而定。分子量中所指"約"某一數字係指利用慣用分析技 術測定合理範圍之數目,m是介於約450至約900的整數(相 對分子量為20至40 kDa),m較佳為約550至約800(約24至約 35 kDa),而m最佳為約650至約700(約29至約31 kDa)。 在式(III)中,η是經醯胺鏈結共價鍵結至Peg單位之紅血 球生成素上離胺酸的ε-胺基數目,本發明共輛物每分子 ΕΡΟ中具有一’二或三個PEG單位。η數值為1至3的整數, 較佳η為1或2,更佳η為1。 較佳的式(III)紅血球生成素蛋白質具有化學式: 1288644
更佳紅血球生成素醣蛋白產物具有化學式:
其中上述化學式η為1至3的整數;m為450至900的整數;R 為低碳數烷基;X為-(CH2)k-或_CH2(0-CH2-CH2)k-,而p為 不具有與X形成醯胺連結之胺基或基團之紅血球生成素醣 蛋白。 其他較佳的紅血球生成素醣蛋白產物具有下列化學式:
更佳的紅血球生成素醣蛋白產物之化學式: -22- J288644
這些紅血球生成素蛋白質的製備法是: (a) 將化學式為P-[NH2]n之紅血球生成素蛋白質上的離胺 酸之ε ·胺基與化學式為Z-CO-X-S-Q之雙-官能基藥劑共價 反應,形成具有醯胺鏈結化學式為P-[NH-CO-X-S-Q]n之中 間產物。 其中P為缺少形成醯胺鏈結之胺基的紅血球生成素蛋白 質;η為1至3的整數;Z為活性基,例如羧基-NHS酯;X為 -(CH2)k-或-CH2(0-CH2-CH2)k-,其中 k為 1至約 10;及 Q為保 護基,如烧醯基,例如乙酿基。 (b) 將步驟(a)所製得之具有醯胺鏈結之中間產物與化學 式為W-[OCH2CH2]m-OR之活化聚(乙二醇)衍生物共價反 應,形成化學式
十丫x、,+〇R L 0 Jn 之紅血球生成素醣蛋白產物,其中W為Y的硫氫活化形式; m為範圍約450至約900的整數;R為低碳數烷基;及γ的定 義如前所述。 在此具體實例中,雙-官能基藥劑較佳為N-琥珀醯亞胺基 -S-乙醯基硫丙酸或N-號珀醯亞胺基乙醯基硫乙酸,Z較 佳為N-經基-玻ίό醢亞胺,及活化聚(乙二醇)衍生物 -23- 1288644 W-[OCH2CH2]m-OR較佳選自破乙醯基·甲氧基_pEG,甲氧 基-PEG-乙烯基颯,及甲氧基-PEG-順丁烯二醯亞胺。 更詳細言之,將硫醇共價鏈結至EPO上("活化作用”),並 將所得之活化EPO與聚(乙二醇)(PEG)衍生物偶合後,可製 備式(III)紅血球生成素。根據本發明製備配集化Epo的第一 步驟包括將EPO的NH2_基與硫醇共價鍵結,此活化作用是 以雙-官能基藥劑進行的,該雙-官能基藥劑帶有保護硫醇基 及另一個活化基,諸如活化酯(例如琥珀醯亞胺酯),酐,石黃 酸酯,叛酸及績酸的齒化物,硫醇經技藝中熟知的基團保 護,例如乙醢基。這些雙-官能基藥劑可以與離胺酸上的ε •胺基反應形成酿胺鍵結。此反應的第一個步驟可以下列示 之:
ΕΡΟ 十 ΝΗ2]η
EPO,η及X定義如前所述,Ζ為技藝中熟知的活性基團,例 如化學式 之Ν-羥基-琥珀醯亞胺(NHS)取代物。 在一個較佳的具體實例中,離胺酸的ε -胺基活化作用是 與具有琥珀醯亞胺基部分的雙-官能基藥劑反應,該雙_官能 1288644 基藥劑可帶有不同的空間基團,例如-(CH2)k-或 -CH2(0-CH2-CH2)k-部分,其中k為1至約10,較佳1至約4, 更佳為1或2,而最佳者為1。這些藥劑的實例為N-琥珀醯亞 胺基-S-乙醯基硫丙酸(SATP)及N-琥珀醯亞胺基_S-乙醯基 硫乙酸(SATA)。
〇 乙醯基硫烷基-羧酸-NHS-酯,類似
2-(乙醯基硫Η乙氧基)k-乙酸_NHS-酯 k的定義如前所述。 製備雙-官能基藥劑是技藝中所熟知的。DE-3924705中揭 示2-(乙醯基硫Η乙氧基)k•乙酸_NHS-酯,而衍生化至乙醯 基硫化合物則揭示於March,J·,Advanced Organic Chemistry,McGraw-Hill,1977, 375-376 中。SATA為市售商 品(分子探針,Eugene,OR,USA 及 Pierce,Rockford,IL) 〇 加至EPO分子上的硫醇基團數目可根據反應參數調整, -25- 1288644 換言之,蛋白質(EPO)濃度及蛋白質/雙-官能基藥劑的比 例。較佳地,EPO活化是每EPO分子以1至5硫醇基團共價鏈 結,更佳是每EPO分子1.5至3個硫醇基團,這些範圍係指硫 醇基團與EPO蛋白質群的統計分布言之。 反應在(例如)液態緩衝溶液,pH 6.5-8.0中進行,例如10 mM填酸卸,50 mM NaCl,pH 7·3。雙-官能基藥劑可添加 在DMSO中。完成反應後,較佳在30分鐘之後,添加離胺酸 終止反應,過多的雙官能基藥劑可用技藝中所熟知的方法 分離,例如透析法或管柱過濾、法。利用(例如)Grasetti,D.R. 及 Murray, J.F·揭示於 Appl· Biochem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967)之光學方法測定硫醇加至EPO的平均數量。 緊接上述反應後,是共價偶合活化聚(乙二醇)(PEG)衍生 物。適當的PEG衍生物為平均分子量約20至約40 kDa之活化 PEG分子,更佳者約24至約35 kDa,而最佳者約30 kDa。 活化PEG衍生物是技藝中所熟知的,並揭示(例如)於 Morpurgo, M.等人歐 J. Bioconj. Chem· (1996) 7,第 363 頁的 PEG-乙烯基砜。直鏈及支鏈PEG群適以製備式1化合物,活 化PEG藥劑實例為碘-乙醯基-甲氧基-PEG及甲氧基-PEG-乙烯基颯: 八 ^r0R 或 一 〇 〇 m 這些碘-活化物質為技藝中所熟知的,並揭示於 Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques, Academic Press, -26- J288644
San Diego (1996) p. 147-148。 最佳地,PEG群是利用以順丁烯二醯亞胺活化(烷氧基 -PEG-順丁烯二醯亞胺),諸如甲氧基-PEG-順丁烯二醯亞胺 (MW 30000; Shearwater Polymers,Inc·)。烧氧基-PEG-順丁 烯二醯亞胺的結構如下所示:
其中R及m定義如前所述,較佳者為
以烷氧基-PEG-順丁烯二醯亞胺進行的偶合反應在液態 緩衝溶液(例如10 mM磷酸鉀,50 mM NaCl,2 mM EDTA, pH 6.2)中原位切割硫醇保護基團發生之後,可用25°C溶於 DMSO之羥基胺(ρΗ6·2)90分鐘,以切除保護基團。以PEG 修飾作用而言,活化EPO/烷氧基-PEG-順丁烯二醯亞胺莫耳 比例約1 : 3至約1 : 6,較佳為1 : 4。添加半胱胺酸終止反 應,並以N-甲基順丁烯二醯亞胺或其他適當能形成雙硫鍵 之化合物與所剩硫醇(-SH)基團反應。因為任何所剩活性硫 醇基團可與保護基團(諸如N-甲基順丁烯醯亞胺或其他適 -27- 1288644 當之保護基團)反應,而本發明共軛物中EPO醣蛋白則含有 此種保護基團。通常本專利說明書中所揭示步驟會產生具 有不種數目保護基團硫醇分子之混合物,端視未共軛至 PEG-順丁烯醯亞胺醣蛋白上的活化硫醇基的數目而定。 當用以阻斷配集化蛋白上所剩的硫醇基團,N-甲基順丁 烯醯亞胺形成相同形式之共價鍵,雙硫鍵化合物會與阻斷 藥劑偶合形成中間分子硫/雙硫交換反應。此種類型的阻斷 反應較佳的阻斷藥劑是氧化榖胱甘肽(GSSG),半胱胺酸及 胱胺。半胱胺酸不會將電價引入至配集化蛋白質,而使用 阻斷藥劑GSSG或胱胺會有額外的負電或正電價。 可以技藝中所熟知的方法另外純化式(ΠΙ)化合物,包括 分離單、二及三-配集化ΕΡΟ群,例如管柱層析法。 包括配集化紅血球生成素衍生物組合物較佳含有至少 90/。的單_pEG共軛物,換言之,當打為1時,可以實例$中所 不製備之。通常紅血球生成素醣蛋白單-PEg共軛物是吾人 所要的’因為其比二-PEG共軛物有較高的活性。單_PEg共 軛物百分比與單-及二-PEG共軛物比例可以控制,將沖堤峰 附近之較廣區域分液倒在一起會降低組合物中單-PEG的百 比或若將沖堤峰附近較窄分液區域倒在一起會增加組 口物中的單·PEG的百分比。約90%的單-PEG共軛物是產量 間良好的平衡點。有時,某些組合物中例如至少92% 一至少96%共軛物需為單-PEG群(n等於1)。本發明一個且體 實例中,冬η或! # ’、 爾為1時,共軛物的百分比為90至96%。 又據本發明組合物每毫升可包括10至10000微克前述定
-28- 1288644 義之紅血球生成素蛋白質,較佳地,該組合物每毫升包括 10 至 1000微克,例如 10、50、100、400、800 或 2500微克。 除此之外,根據本發明組合物每毫升可包括1 〇微克至 10000微克紅血球生成素蛋白質’ 10-2 00毫莫耳/公升硫酸, 10至50毫莫耳/公升磷酸,pH 6.0至6.5。此組合物亦可包括 至高達20 mM之曱硫胺酸,1-5%聚醇(重量/體積),至高達 〇·1°/。普洛尼克F68(重量/體積)及視情況高達i mM之 CaCl2。此組合物一個實例包括每毫升含有1〇微克至loooo 微克紅血球生成素蛋白質,40毫莫耳/公升硫酸,1〇毫莫耳 /公升構酸,3%甘露醇(重量/體積),10 mM甲硫胺酸,〇. 〇 1 % 普洛尼克F68(重量/體積),pH 6.2。 本發明另一個具體實例中,組合物可包括每毫升1 〇微克 至10000微克紅血球生成素蛋白質,10至1〇〇毫莫耳/公升 ^0:1,10至50毫莫耳/升雄酸,卩116.0-7.0,視情況1-5%(重 量/體積)聚醇。除此之外,本組合物可包括高達2〇 mM甲硫 胺酸,高達0.1%普洛尼克F68(重量/體積)及視情況7·5微莫 耳/公升CaCh,特定言之,此組合物可包括每毫升1〇微克至 10000微克紅血球生成素蛋白質,1〇〇毫莫耳/公升NaCh 1〇 mM甲硫胺酸,0.01%普洛尼克F68(重量/體積),及1〇〇毫莫 耳/公升磷酸,pH 7.0。 本發明亦係指前述包括每毫升含有1〇微克至1〇〇〇〇微克 紅血球生成素蛋白質,10至50毫莫耳/公升精胺酸,pH 6至 pH 6.5,10至100毫莫耳硫酸鈉。除此之外,此組合物包括 高達20 mM甲硫胺酸,至高達普洛尼克F68(重量/體 -29- 1288644
積),視情況尚達1毫莫耳/公升CaCh,及視情況1-5%(重量/ 體積)之聚醇。特定言之,此組合物包括每毫升微克至 10000微克紅血球生成素蛋白質,40毫莫耳/公升精胺酸, pH 6.2,30毫莫耳硫酸鈉,3%甘露醇(重量/體積),10 mM 甲硫胺酸,0·01 %普洛尼克F68(重量/體積)及視情況i毫莫耳 / 公升 CaCl2。 本發明較佳的一個具體實例係指包括10至10000微克/毫 升紅血球生成素之組合物,較佳為25至2500微克/毫升紅血 球生成素,及 a) 10 mM磷酸鈉 /鉀,100 mM NaCl,pH 7.0,或 b) 10 mM磷酸鈉,120 mM硫酸鈉,pH 6·2,或 c) 10 mM磷酸鈉,40 mM硫酸鈉,3%甘露醇(重量/體積), pH 6.2,或 d) 10 mM磷酸鈉,40 mM硫酸鈉,3%甘露醇(重量/體積), 10mM甲硫胺酸,0.01%普洛尼克F68(重量/體積),ρΗ6·2,或 e) 40mM精胺酸,30mM硫酸鈉,3%甘露醇(重量/體積), pH 6.2,或 f) 40 mM精胺酸,30 mM硫酸鈉,3%甘露醇(重量/體積), 10mM甲硫胺酸,0.01%普洛尼克F68(重量/體積),ρΗ6·2。 在最佳的具體實例中,組合物包括紅血球生成素蛋白質 含量50、100、400、800或2500微克/毫升。另外最佳組合 物尚包括10 mM磷酸鈉,40 mM硫酸鈉,3%甘露醇(重量/ 體積),1〇111]\4甲硫胺酸,0.〇1%普洛尼克卩68(重量/體積), ρΗ6·2或40mM精胺酸,30mM硫酸鈉,3%甘露醇(重量/體 J288644 積)’ 10 mM甲硫胺酸,〇·〇ι〇/0普洛尼克F68(重量/體積),PH 6.2。 本發明組合物可為喷霧乾燥形式之粉末。 除此之外,本發明係關於前述組合物的冷凍乾燥或喷霧 乾燥粉末。該組合物可添加溶劑(例如水)後,再形成液態溶 液’或是經由吸入裝置或經皮施用裝置直接施用。 本發明亦包括製備前述組合物的方法,包括將紅血球生
成素與包括多種負價陰離子及視情況前述一種或多種醫藥 上可接受賦形劑混合。 除此之外,本發明係關於前述組合物在製備用以治療及 預防1*又[生腎衰竭病患(CRF),AIDS及/或治療接受化療病患 有關之貧血疾病藥劑上的用途,此包括治療及預防慢性腎 衰竭病患(CRF),AIDS及治療接受化療癌症病患貧血疾病 之方法’包括對病患施以前述組合物的步驟。 本發明另一個具體實例係關於用以局部及全身性延遲釋 匕括月j述組合物之裝置’此包括任何可提供控制釋放包 括紅A球生成素之前述組合物的植人性裝置,例如聚合物 為基礎之微或毫微顆粒。前述組合物亦可以事先充填之注 射筒或任何其他的施用裝置提供,例如無針注射裝置或吸 :發月、、且可以注射形式或靜脈施用的單位_ 存在m本發明可以液態形式或 因此可分為靜脈或注射施用時之單位劑量形式二:存 發明液態組合物可為投用^.3毫升單—劑量形式,另—方 •31- 面
1288644 ’當:請專利範圍組合物在經銷前保存之包裝劑量形式 體積可南達60公升,繁於祕、奋泣 …胁 升蓉於增進穩定性’本發明組合物可保 存在大體積的容器中,而德至 後再刀裝分送至經銷至醫師、病 患及醫院。 内 本發明注射溶液可利用如針筒之慣用注射方法投用之, 一般投用0.3毫升至2〇毫升單—單位劑量之本發明組合 物:另-方面,本發明組合物可使用含有該組合物之冷來 乾燥粉末或粉末,而後在注射之前以慣用之方法 復水後注射投。另-方面,因為本發明組合物之穩定性, 組合物可分裝成單位劑量形式,諸如含有約〇 3毫升至約1〇 毫升本組合物之小瓶,除此之外,本發明組合物可利用靜 脈‘以靜脈方式投用之。這些靜脈袋中含有約2〇毫升至約 500毫升之溶液,端視投與病患溶液時間而定。根據本發 明,本發明液態溶液可保存在保存容器中,其可以再分裝 成小劑量形式包裝經銷給醫師、醫院及病患。因為本發明 組合物穩定性,這些組合物可長期保存於此種保存容器中。 將紅血球生成素製備成前述組合物之成分,或為製備前 述紅血球生成素衍生物之起始物質詳細揭示於(例如)美國 專利申請案 5,547,933 及 5,621,080,ΕΡ-Β0 148 605,Huang, S.L·,Proc· Natl. Acad. Sci· USA (1984) 2708-2712,EP-B 0 205 564,EP-B 0 209 539及 EP-B 0 41 1 678及 Lai,P.H.等 人,J. Biol· Chem. 261 (1986) 31 16-3121,及 Sasaki,H.等 人,J. Biol· Chem· 262 (1987) 12059-12076。可利用重組方 法製備治療用途之紅血球生成素(ΕΡ·Β 0 148 605,EP_B 〇
•32- •1288644 209 539及 Egrie,J.C.,Strickland,T.W·,Lane,J 等人(1986) Immunobiol. 72: 213_224) 〇 在無血清之培養基中表現及製備紅血球生成素的方法揭 示(例如)於Burg 1996年11月14日印行之WO 96/35718,及 Koch 1992年6月12日印行之歐洲專利案513 738中。除了前 述的申請案外,咸已知可在無金清培養基製得内含ΕΡΟ* 因重組CHO細胞,此種方法揭示(例如)於EP-A 0 513 738, EP-A 0 267 678及 Kawamoto,T等人,Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453之一般形式,EP-A 0 248 656,Kowar,J. 及 Franek,F·酵素學方法 421 (1986) 277-292, Bavister,B. Expcology 271 (1981) 45-51,EP-A 0 481 79卜 EP-A 0 307 247,EP-A 0 343 635,WO 88/00967 〇 在EP-A 0 267 678中以S-Sepharose離子交換層析法,C8 管柱之預備反相HPLC及膠體過濾層析法純化透析作用後 無血清培養產製之EPO。在此發明中,膠體過濾層析法步 驟可以S-Sephar〇se快速之離子交換層析法取代,咸提議可 在離子交換層析法之前先進行Blue Tr is acryl管柱染劑層析 法。
Nobuo, I·等人,j· Biochem· 107 (1990) 352-359 中揭示純 化重組EPO的方法,在此方法中,純化步驟之前,EPO係以 Tween® 20溶液,苯基甲基磺醯基氟,乙基順丁烯二醯亞 胺’胃蛋白酶抑制素A,硫酸銅及草醯胺酸處理。文獻(包 括Burg 1996年11月14日印行之w〇 96/35718)揭示以無血清 發酵方法(EPOsf)製備紅血球生成素。 -33- 1288644 根據本發明之EPO或EPO共軛物專一活性可以技藝中所 熟知的各式方法測定之。本發明純化EPO蛋白質的生物活 性是病患注射投用EP0蛋白質後’所產生骨髓細胞之網狀 細胞及紅血球細胞’與未注射或控制組受體比較後所增加 之量。根據本發明所得及純化之EPO蛋白質,或其片段的 生物活性可根據 Annable等人,Bull· Wld· Hlth. Org. (1972) 47: 99-1 12及 Pharm· Europa Spec· Issue Erythropoietin BRP Bio 1997 (2)所述之方法測定之。其他測定EPO蛋白質活性 之生物分析方法(老鼠正常紅血球分析法)揭示於實例6中。 參考下列實例可更明瞭本發明,但這些實例非用以限制 本專利說明書。 實例1 :發酵及純化人類EPO a)接種物製備及發酵 自液態氮保存槽中氣相中取出一小瓶源自可產製EPO之 CHO細胞株(可使用ATCC CRL8695,揭示於EP 411 678(遺 傳學機構))。細胞移種至玻璃旋轉瓶中,並以碳酸氫鹽為緩 衝液之培養基置於濕控co2培養箱中培養。製備接種物及發 酵時所用的典型無血清培養基揭示於Koch於1992年6月12 曰印行之歐洲專利案513 738,或Burg於1996年11月14曰印 行之W0 96/35718,例如包括培養基DMEM/F12(例如JRH Biosciences/Hazleton Biologies,丹佛,美國,序號 57-736), 及另外加入碳酸氫鈉,L+麩胺酸,D+葡萄糖,重組胰島素, 硒化鈉,二胺基丁烷,氫基可體松,硫酸鐵(II),天冬醯胺 酸,天冬胺酸,絲胺酸及哺乳細胞用之穩定劑,諸如聚乙 1288644 烯醇,甲基纖維素’聚葡聚糖,聚(乙二醇),普洛尼克{?68, 原生質增大聚膠(HEMACCEL®)或聚乙烯咯烷酮(W0 96/35718)。 - 以顯微鏡檢查細胞培養未受微生物污染,並檢視細胞密 ' 度,每次分盤步驟時均需要進行此一測試。 首次生長期後,用新鮮培養基稀釋細胞培養至開始的細 胞密度,並進行另一次的生長循環,重複此一步驟直至每 φ 個玻璃旋轉瓶中約有2公升的培養體積,約12次後,可得1 至5公升細胞培養,可作為1〇公升接種物發酵槽的接種物。 3_5天後,10公升發酵槽中的細胞培養可作為1〇〇公升接 種物發酵槽的接種物。 另外培養3-5天後,100公升發酵槽中的細胞培養可作為 1000公升生產發酵槽中的接種物。 b)收集細胞及細胞分離 使用批次重複培養方法,換言之,當達到所要的細胞密 _ 度時,收集約8〇c/❹的細胞培養,所剩細胞培養再予以補充 新鮮之培養基,並培養至下次細胞收集時。一次生產回合 包括最大10次的細胞收集:9次部分的細胞收集及1次總量 細胞培養收集。每3-4天收集細胞。 測疋收集之細胞體積移至冷卻的容器中,利用離心或過 濾方法去除丟棄細胞。同步過濾離心步驟時的所含Epo澄 清液並收集在另一個冷卻的容器中。純化步驟期間個別處 理每次收集者。 純化EOP-蛋白質的典型方法揭示於Burg ^“年^月14 J288644 日印行之WO 96/3 5718中。純化方法如下所述。 a) Blue Sepharose層析法
Blue Sepharose (Pharmacia)係由 Sepharose珠共價鍵結至 Cibacron藍色染劑的表面上,因為EPO對Blue Sepharose的 鍵結力較大多數非-蛋白質污染物、某些蛋白質不純物及 PVA的鍵結力強,故此步驟EPO佔大多數。增加鹽類濃度及 pH可進行Blue Sepharose的沖堤作用。 管柱以80-100升的Blue Sepharose充填,以NaOH再生, 並以平衡緩衝液(氣化鈉/鈣及乙酸鈉)平衡之,加入酸化及 濾過的發酵澄清液。完成後,以平衡緩衝液相似之緩衝液 (含有較高濃度之氣化納)清洗之,而後用Tris-基緩衝液清 洗,用Tris-基緩衝液沖堤並根據主要沖堤圖收集單一分液。 b) Butyl Toyopearl層析法
Butyl Toyopearl 650C (Toso Haas)是聚苯乙烯基礎之基 質,其上共價鍵結脂肪族丁基殘基。因為EPO比大多數不 純物及PVA對此膠狀物有較強的鍵結力,必須以含有異丙 醇之緩衝液沖堤之。 管柱以 30-40升的Butyl Toyopearl 650C充填,以NaOH再 生,用Tris-基緩衝液清洗,並以含有異丙醇之Tris-基緩衝 液平衡之。 將Blue Sepharose沖堤液中的異丙醇濃度調整至與管柱 平衡緩衝液相同,並加至管柱中,而後以較高的異丙醇濃 度之平衡緩衝液清洗之,用沖堤緩衝液(具有較高異丙醇含 量之Tris-基緩衝液)沖堤產物,並根據主要沖堤圖收集單一
-36- 1288644 分液。 C)經破灰石超膠艘層析法 羥磷灰石超膠體(Biosepra)含有羥磷灰石,其併入至瓊脂 糖基質内,以增加機械特性。EPO對羥磷灰石的親合力低, 故比蛋白質不純物以較低磷酸濃度時可被沖堤出來。 管柱以30-40升的羥磷灰石超膠體充填,以磷酸鉀/氣化鈣 緩衝液及NaOH再生,後用Tris-基緩衝液清洗,而後以含有 低量異丙醇及氣化鈉之Tris-基緩衝液平衡之。 將經Butyl Toyopearl層析法純化含有EPO沖堤液加至管 柱中,而後以平衡緩衝液及不含異丙醇及氣化鈉之Tris_基 緩衝液清洗管柱,以含有低濃度磷酸鉀之Tris-基緩衝液沖 堤產物,根據主要沖堤圖收集單一分液。
d) Vydac C4之反相 HPLC RP-HPLC物質Vydac C4 (Vydac)係由矽膠顆粒所組成,矽 膠表面帶有C4-烷基鏈。自蛋白質不純物中分離epo是基於 對疏水相互作用的強度之差異。用溶於三氟乙酸之梯度濃 度乙腈進行沖堤作用。 利用不鏽鋼管柱(填充2·8至3.2公升之Vydac C4矽膠)進 行預備HPLC,添加二氟乙酸酸化之經鱗灰石超膠體沖堤 液,並加至Vydac C4管柱中,利用溶於稀釋三氟乙酸之梯 度濃度乙腈進行清洗及沖堤,收集分液並立即以磷酸緩衝 液中和。將在IPC限量内的EPO分液倒在一起。 共價鍵結至 e) DEAE Sepharose層析法 DEAE Sepharose (Pharmacia)物質由 -37- 1288644
Sepharose珠表面上之二乙基胺基乙基(DEAE)基團所組 成,EPO鍵結至DEAE基團是經由離子相互作用,乙腈及三 氟乙酸會通過管柱不會滞留。當這些物質被清洗掉後,以 低pH之乙酸緩衝液清洗管柱可去除微量的不純物,而後以 中性磷酸緩衝液清洗管柱,以增加離子強度之緩衝液將 EPO沖堤出來。 以DEAE Sepharose快速流速充填管柱,調整管柱的體 積,確保加入的EPO在範圍3· 10毫克EPO/毫升膠。用水及 平衡緩衝液(鱗酸納/卸)清洗管柱,將倒在一起的HPLC沖堤 液加至管柱中’以平衡緩衝液清洗管柱,而後用清洗緩衝 液(乙酸鈉緩衝液)及平衡緩衝液清洗管柱,其後,以沖堤緩 衝液(氣化鈉、磷酸鈉/鉀)將EP0自管柱中沖堤出來,根據 主要沖堤圖收集單一分液。 將DEAE Sepharose管柱沖堤液調整至特定的導電度,所 得之藥劑物質無菌過濾至Teflon瓶中,保存於-70°C。 實例2:用mPEG_SBA將EPO配集化 均質化根據實例1之無血清步驟純化之EPO (EPOsf),以 分析方法測定,顯示其典型異構形式有8種,利用老鼠正常 紅金球分析法測定顯示其具有專一性活性為19〇,⑼〇 毫 克。所用的配集化藥劑為甲氧基-PEG-SBA ,其為式II化合 物,其中R為甲基;X為3 ;而m為650至750(平均約680,相 對的平均分子量約30 kDa)。 配集化反應 在一百毫克EPOsf (9.71毫升ι〇·3毫克/毫升Ep〇sf濃縮 -38 - .1288644 液,5.48微莫耳)中,加入10毫升含有506毫克30 kDa曱氧基 -PEG-SBA(16.5 微莫耳)(購自 Shearwater Polymers,Inc., Huntsville,Alabama)之 0·1 Μ構酸卸緩衝液(pH 7.5),並在 室溫下(20-23 °C )混合2小時,最終蛋白質濃度為5毫克/毫 升,而蛋白質:PEG藥劑比例為1 : 3。兩小時後,以冰醋 酸調整pH至4.5終止反應,並保存於-20°C下,直至純化。 純化作用 1. 共輛物混合物:將約28毫升的SP-SEPHAROSE FF(硫-丙 基陽離子交換樹脂)填充至AMICON玻璃管柱(2.2x7.5公 分)中,並以20 mM乙酸緩衝液(pH 4.5)平衡之,流速為150 毫升/小時。以平衡緩衝液將内含30毫克蛋白質之6毫升 的反應混合物稀釋5倍,並加至管柱中,以緩衝液清洗掉 未吸附之物質,並以溶於平衡緩衝液之0.175 MNaCl將吸 附之PEG共軛物混合物沖堤出來,以750 mMNaCl將仍留 置於管柱中之未經修飾的EPOsf沖堤出來,管柱再以起始 緩衝液平衡之。以SDS-PAGE分析樣品,並測定其配集化 的程度。咸發現0.175M NaCl沖堤液含有單-及二及少量 的三-配集化產物,而750 mM NaCl沖堤液則含有未經修 飾之EPOsf。 2. 二-PEG及單_PEG-EPOsf :用緩衝液將前述步驟自管柱中 所沖堤出之純化共軛物混合物稀釋4倍,並加至管柱内, 以前述方法清洗。分別以0·1 M NaCl及0.175 MNaCl自管 柱中將二-PEG-EPOsf及單-PEG_EPOsf沖堤出來,以750 mMNaCl將所剩任何未經修飾之EPOsf沖堤出來。另一方 -39· 1288644 面,以乙酸緩衝液將反應混合物稀釋5倍,並加至 SP-Sepharose管柱中(〜0.5毫克蛋白質/毫升膠),清洗管 柱,並以前述方法將所吸附單-PEG-EPOsf,二 -PEG-EPOsf及未經修飾之EPOsf沖堤出來。 結果 利用化學共軛合成平均分子量為30 kDa之直鏈PEG分子 PEG-EPOsf,EPOsf的一級胺基與30 kDa PEG•丁酸之琥珀 酸醯亞胺酯衍生物的醯胺鍵結反應,而產生PEG-EPOsf。 結果摘要於表1。利用SDS-PAGE分析測定顯示,純化共 軛物有單-及二-PEG-EPOsf,且不含未經修飾之EPOsf,共 輛物混合物共有23.4毫克或為78%之起始物質。陽離子交換 層析法分離單-及二-PEG-EPOsf顯示,共軛物混合物中單-與二-PEG的比例幾乎為1 : 1。反應完成之後,單:二:未 經修飾之個別成分比例為40 : 38 : 20(%)。整體產量幾乎完 全定量。 表1 : EPOsf配集化作用結果的摘要 樣品 _蛋白質(毫克)_產量 反應混合物 30 100 單- 12.0 40 - 11.4 38 未經修飾 6.0 20 共軛物混合物 23.4 78 實例3:以mPEG-SPA配集化EP0 與不同於實例2中所用的EPOsf量與30 kDa甲氧基-PEG- 1288644 SPA (Shearwater Polymers,Inc·,Huntsville,Alabama)反 應。反應進行時蛋白質:藥劑的比例為1 : 2,根據實例2 中的純化技術進行純化,主要產生的是單-配集化產物。 實例4:共價鏈結硫醇基至EPO上 此實例揭示測試共價鏈結硫醇基至EPO上的反應條件, 為測定條件,將不同含量之保護硫醇基(此處為SATA或 SATP(溶解於DMSO,約10毫克/毫升))加至EPO溶液(此處為 1毫升的5毫克/毫升EPO,溶解於10 mM磷酸鉀,50 mM NaCb pH 7·3)中,攪拌反應約30分鐘(25°C),並加入1 Μ離 胺酸(最終濃度為10 mM)終止反應。以10 mM磷酸鉀,50 mM NaCl及2 mM EDTA,pH 6·2進行透析作用去除過多的SATA 及SATP。利用羥基胺去除保護基乙醯基,根據Grasetti,D.R. 及 Murray,J.F在 J· Appl· Biochem· Biotechnol· 119,41-49 頁 (1967)中所述的方法,以二硫吡啶利用光學方式測定硫醇基 共價連結至EPO的數目。 每EPO分子共價連結之硫醇基數目如下所示。 EPO : SATA 或 SATP 的 莫耳比例 莫耳硫醇基/莫耳EPO EPO SATA=1 3 1.5 EPO SATA=1 5 2.4 EPO SATA=1 6 3.2 EPO SATP=1 3 1.3 EPO SATP=1 4 2.5 EPO SATP=1 6 3.7 實例5 :以甲氧基-PEG-順丁烯二醯亞胺修飾活化EPO A)活化EPO : •41- ⑧ J288644
根據實例2,以SATA活化根據實例1所製得之100毫克 EPO (以老鼠正常紅血球分析測得190,000 IU/毫克)(莫耳比 例:EPO/SATA=l/5),利用實例1中所述的透析方法,將帶 有共價連結保護硫醇基之所得之EPO("活化EPO")與副產物 (如N-羥基-琥珀醯亞胺或未反應之SATA分離,可得4·5毫克 /毫升溶於 10 mM磷酸鉀,50 mM NaC卜 2 mM EDTA,pH 6.2 之活化EPO溶液。 B)活化EPO的配集化作用: 將前述具有’’最佳π結構之380毫克甲氧基-PEG·順丁烯二 醯亞胺(分子量 30.000 ; Shearwater Polymers,Inc·, Huntsville (Alabama,USA))溶於含有95毫克活化EPO(溶於 10 mM填酸鉀,50 mM NaCl,2 mM EDTA,pH 6.2之 4·5 毫 克/毫升溶液)溶液中,溶液中活化EPO與甲氧基-PEG-順丁 烯二醯亞胺的莫耳比例為1 : 4,添加1 Μ羥基胺水溶液將濃 度調整至30 mM,pH 6.2至上述溶液中,將活化ΕΡΟ共價連 結保護之硫醇基去保護,反應混合物中所得活化的EPO含 有游離硫醇(-SH)基。硫醇去保護後,於此含有游離硫醇 (-SH)基之活化EPO與甲氧基_ PEG-順丁烯二醯亞胺立即進 行偶合反應90分鐘(攪拌,25°C),反應混合物中添加0.2半 胱胺酸水溶液將濃度調整至2 mM以終止偶合反應的進 行,30分鐘後,添加0.5 Μ N-甲基順丁烯二醯亞胺之DMSO 溶液(使最終濃度達5 mM)將未與甲氧基-PEG-順丁烯二醯 亞胺反應之活化的游離硫醇基保護,30分鐘後,將所得含 -42- 1288644 有配集化EPO之反應混合物,以10 mM磷酸鉀,pH 7.5進行 長達15小時以上的透析作用。 C)純化配集化EPO產物: 為自反應混合物中分離配集化EPO產物,進行下列的純 化方法:用1〇1111^1構酸鉀,卩117.5平衡50毫升(5-86卩11&1*〇8€€€ 管柱,將步驟B)所得之反應混合物加至管柱中(流速:每小 時3管柱體積(CV))。為了分離未反應的曱氧基-PEG-順丁烯 二醯亞胺藥劑,以5 CV的10 mM磷酸鉀,pH 7.5清洗管柱, 以增強鹽類梯度濃度之5 CV緩衝液A (10 mM磷酸鉀,pH 7.5)及 5 CV 緩衝液 B (10 mM 磷酸鉀,500 mMNaCP pH 7·5) 利用每小時3 CV的流速沖堤管柱分離配集化EPO產物,根 據NaCl梯度濃度,配集化的EPO產物(三·,二-及單-配集 化EPO產物)先沖堤出來,其後為未配集化的EPO產物。含 有配集化EPO產物沖堤液之分液(三-,二-,及單-配集化EPO 產物)倒在一起,並過濾(以〇·2微米濾膜過濾)。 以 Coomassie 染色 SDS-PAA 膠片(Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970))評估三-,二-,及單-配集化EPO產物的含量 及純度,而蛋白質濃度係根據Beer-Lambert定律在280毫微 米測定之。SDS-PAA電泳所測定EPO產物的視分子量約68 kDa(單-配集化EPO產物),約98 kDa(二-配集化EPO產物), 及約128 kDa(三·配集化EPO產物)。 利用層析法(如大小排除層析法(Superdex,pg 200; 卩]1&]:1]1&(^&)可進一步分離三-,二-,及單-配集化£?0產物。 利用下述的方法進行含有三-,二-,及單-配集化EPO產物 -43 - •1288644 沖堤液的活體内生物活性測定。 實例6 ··利用老鼠正常紅血球方法分析 測定配集化EPO的活體内活性 老鼠正常紅血球生物分析法是技藝中所熟知的(pharm.
Europa Spec· Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2))及是一 種Ph· Eur. BRP·之紅血球生成素的瓜⑽叫哪^之方法。用 BSA-PBS稀釋樣品。以皮下注射方法,將得自實例2或3之 以皮下注射方式,施以正常健康、15週大老鼠〇·2毫升内 含未配集化ΕΡΟ或實例2或3之三-,二,或單_配集化Epo之 ΕΡΟ分液。未配集化ΕΡ0或三_,二_,或單配集化Ερ〇施以 正常健康,7-15週大的老鼠,6天之後,穿刺尾巴靜脈取血, 並將1微升的血液以1毫升之〇·15微莫耳之亞啶橘染色溶液 稀釋,染色時間為3至10分鐘,在流動細胞計數儀分析紅血 球螢光組織圖計數紅血球網狀細胞,紅血球網狀細胞係以 絕對數值表示(分析3〇,〇〇〇紅血球細胞),為呈現數據,每組 是由每天5隻老鼠所得之,而老鼠只採血一次。 另一個實驗’老鼠施以單一劑量未經修飾之Epo (25毫微 克ΕΡ〇),實例2之PEG(SBA)-EP0混合物(1〇毫微克共軛 物),實例2之單-,及二-配集化Ep〇 (1〇毫微克共軛物),實 例3之PEG(SPA)-EP〇 (1〇毫微克共軛物),及緩衝溶液,所 得結果列於表2中。結果顯示配集化epo產物能明顯增加紅 血球網狀細胞的含量,而每隻老鼠施以相同劑量(1〇毫微 克)’與施以25毫微克未經修飾epo比較,紅血球網狀細胞 有最大量的轉換,顯示配集化的Epo有優良的活性及較長 -44- .1288644 的半衰期。 表2 EPO(未 經修飾) 30kDa SPA PEG 單30K SBA 二 30K SBA PEG-EPO SBA共輛 物混合物 控制組 緩衝液 72小時 1000 1393 1411 994 1328 857 96小時 500 1406 1501 926 1338 697 120小時 〜200 1100 1182 791 944 701 144小時 〜0 535 607 665 660 708 實例7 :優勢單-PEG-EPO的製備 配集化反應 起始時,將根據實例1所製得之100毫克(5.48微莫耳) EPOsf溶於100 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5,添加329毫克 (10.96微莫耳)之溶於3毫升1111]^11(:1之30 1<:0&?£0-88八 藥劑,添加足夠量的1 〇〇 mM填酸卸緩衝液pH 7· 5,使反應 混合物體積達20毫升。最終的蛋白質濃度為5毫克/毫升, 而蛋白質:PEG藥劑比例為1 : 2,室溫下(20-22°C )混合反 應混合物2小時,2小時後,以冰醋酸將pH調整至4.5終止反 應,並冷;東保存於-20°C,直至純化。 純化作用
以10 mM乙酸鈉,PH 4.5將先前步驟所得之反應混合物稀 釋1 : 5,並加至300毫升SP-Sepharose FF(硫丙基陽離子交 換樹脂)所填充之4.2x19公分管柱中,管柱事先已用相同的 緩衝液平衡之,用Gilson UV監視器監控管柱洗液在280毫 微米之吸收值,並用Kipp及Zonen紀錄器紀錄。用300毫升 或1基本體積之平衡緩衝液清洗管柱,以去除過多的藥劑, 反應副產物及寡體PEG-EPO。其後用2基本體積的100 mM -45- 1288644
NaCl清洗,以去除二-PEG-EPO,而後用200 mM NaCl沖堤 單-PEG-EPO,在沖堤單-PEG-EPO時,丟棄前50毫升的蛋白 質吸收峰分液,收集150毫升分液之單-PEG-EPO。以750 mM NaCl沖堤仍留置於管柱内未經修飾EPOsf。所有的沖堤緩衝 液均以平衡緩衝液製之,所有的沖堤樣品均以SDS-PAGE 及高效大小排除層析法(SEC)分析。自150毫升分液中所得 之單-PEG-EPO庫中未偵測出未經修飾之EPOsf,將其濃縮 至〜4.5-7.5毫克/毫升,並透析過濾至保存緩衝液(10 mM磷 酸鉀,100 mM NaCl,pH 7·5)中。濃縮/透析過濾係以配備 50 kDa 臨界點之 Millipore Pellicon XL Biomax 50 膜之 Mmipore LabscaleTM TFF系統在室溫下進行,將濃縮的單 -PEG-EPO無菌過濾,並保存於-20QC。 約75%EPOsf經配集化,純化後,總產量〜30單-PEG-EPO (未偵測到未經修飾之EPOsf)及約25%二-PEG-EPO。寡體, 及未配集化EPOsf是所剩的蛋白質,自150毫升分液所得之 單-PEG-EPO 庫含有約 90% 單-PEG-EPO 及約 10% 二-PEG-EPO 〇 實例8 : EPO及配集化EPO在各式調配物中的 熱穩定性:以DSC(區分篩選熱量學)分析 一般接受利用區分篩選熱量學來測定熱變性作用轉換溫 度是蛋白質熱穩定性的有效指標。利用Nano-DSC (Calorimetric Sciences Corporation,Utah,USA)在加熱速率 2 K/分鐘時,分析各式含/不含穩定劑緩衝液中濃度介於0.6 及1.2毫克/毫升之紅血球生成素或配集化紅血球生成素溶 -46- 1288644 液’轉換溫度的上升表示可增加蛋白質的熱穩定性,所測 - @溫度數值不應為絕對的數值,而是代表個㈣配物與另 - 一個調配物間穩定性的差異。 為了定義調配物的最佳PH,研冑介於4至9間ρ·賴之熱 變性配集化紅血球生成素,蛋白質樣品在3〇 mM NMiP〇4 ’ 30 mM檸檬酸鈉,3〇賴硼酸中分析。圖ι顯示 最高的轉換溫度之平原期介於約pH 6至約pH 9之間,而低 φ 於?11 5·5時則快速的下降。此表示最高熱穩定性之最佳?11 是高於5·5(圖3)。 為了研究離子強度的效應,測定熱變性作用與鱗酸濃度 的依賴度,圖4顯示當調配物的離子強度增加時,熱穩定性 會增加。 亦利用DSC來研究緩衝液物質的影響。從圖5吾人可見, 最適合高熱穩定性的緩衝液或添加物是硫酸、檸檬酸或鱗 酸。目前常用於調配物中作為緩衝物之甘胺酸並不非常適 φ 當(參考前文)。 \j' 圖6顯示,硫酸在低pH(例如pH 6·2)時,亦為一適當的緩 衝物/添加物,而磷酸在pH 6·2時比pH 7.5時較為不適當, 此顯示硫酸即使在低pH時仍能保持熱穩定性,此發現讓pH 介於6.0至6·5之調配物不會嚴重失去紅血球生成素的熱穩 定性。 實例9:熱壓力下ΕΡΟ及配集化ΕΡΟ的凝集作用:以 SDS-PAGE(硫酸月桂酸鈉聚丙烯醯胺膠電泳)分析 為了研究熱壓力對紅血球生成素蛋白質的效應’將不同 -47- 1288644 調配物樣品暴露於熱壓力下(20分鐘80。〇),並在還原狀態 (樣品緩衝液中含DTT)及非-還原狀態(樣品緩衝液中不含 DTT)下以SDS-PAGE分析,此方法可以偵測到共價的凝集 形成物質。如前所述,凝集形成物質是蛋白質主要的分解 途徑,因此在醫藥蛋白質調配物中應該避免發生。不含還 原劑(例如DTT)狀態下可偵測到凝集物,而含有還原劑時, 不會偵測到凝集物,此極有可能是因在熱壓力下不正確的 雙硫鍵(一種氧化反應)所致,此實驗明顯顯示在pH低於 6.5時可抑制凝集物的形成,高pH時,則會有高含量的凝集 物。在SDS-PAGE時,以還原劑處理樣品後,可還原大多數 所形成的凝劑物,此推測在熱壓力下所形成之大部分的凝 集物是為雙硫鍵雙體,寡體及高層次的凝集物。綜合以上, 研究顯不將调配物的p Η保持在6 · 5或低於6 · 5,可避免凝集 物大量的形成。 圖7 :配集化-ΕΡΟ凝集作用與ΡΗ的依賴性。以SDS-PAGE 分析經熱壓力處理之配集化-EPO樣品(如前所述)。以銀染 色蛋白質。行1 :分子量標準品。行2 : pH 5。行3 : pH 5, 還原狀態。行4 : pH 6。行5 : pH 6,還原狀態。行6 : pH 6·5。 行7 : pH 6.5,還原狀態。行8 : ρΗ 7。行9 : pH 7,還原狀 態。行10 :配集化-EPO,未經壓力處理。 使用抗氧化劑亦可避免凝集物的形成。圖8顯示使用1毫 克/毫升乙醯基半胱胺酸為抗氧化劑可避免熱壓力下凝集 物的形成,因此,在熱壓力下,在低pH(如pH 6 ·2)時,可使 用抗氧化劑(如乙醯基半胱胺酸)預防凝集物的形成。 -48· •1288644 圖6 : pH 6·2及/或乙醯基半胱胺酸可預防配集化EPO凝集 物。以SDS-PAGE分析經熱壓力處理之配集化EPO樣品(如 前所述)。以銀染色蛋白質。行1 ··配集化EPO,未經壓力處 理。行2 : pH 7·5,經壓力處理。行3 ·· pH 6.2,經壓力處理。 行4 : pH 6.2,經壓力處理,還原狀態。行5 : pH 7.5,1毫 克/毫升乙醯基半胱胺酸,壓力處理。行6: ρΗ7·5,1毫克/ 毫升乙醯基半胱胺酸,壓力處理,還原狀態。 實例10 : 4、25、30及40°C時,於各式 調配物中配集化·ΕΡΟ的穩定性 在數種溫度下,培養各式調配物中的配集化ΕΡΟ,在所 示的時間點,取出樣品,利用反相高效層析法(rpHPLC), 高效大小排除層析法(SEC)及SDS_PAGE分析穩定性。表3 比較數種溫度下各式調配物中配集化EPO的穩定性,這些 數據明顯顯示本專利說明書所揭示之調配物在蛋白質回枚 率及凝集作用方面較優。 表3 :各式調配物之配集化EPO在數種溫度時之穩定性
在不同溫度下6>ί 固月後的1 回收率% 在 30°C^^ 測之凝集作' 用(+M 調配物 * 配集化EPO (微克/毫升) 4°C 25〇C 30°C 40°C A 10 92 91 n.d. 39 n.d. B 50 97 98 97 78 C 50 95 79 79 52 + E 50 103 102 100 87 A 100 96 97 n.d. 50 n.d. B 400 101 101 101 77 C 400 100 94 90 56 + ^ ' D 400 98 96 93 73 —〜 E 400 99 98 100 66 ^—二-- -49- 1288644 *調配物為: 調配物A : 10 mM磷酸鈉,100 mM氯化鈉,pH 7.5。 調配物B : 10 mM磷酸鈉,40 mM硫酸鈉,3%(重量/體積) 甘露醇,pH 6·2。 調配物 C : 10 mM填酸鈉,100 mM NaCl,pH 7.0。 調配物D : 10 mM磷酸納,120 mM硫酸納,pH 6.2。 調配物Ε : 40 mM精胺酸,30 mM硫酸鈉,3%甘露醇,1 mM CaCk,pH 6.2。 實例11 :最佳調配物抑制EPO蛋白質甲硫胺酸54 的氧化作用,甲硫胺酸為抗氧化劑 各式調配物中配集化EPO於數種溫度下培養,6個月後, 取出樣品,並以下方法測定甲硫胺酸54氧化作用的程度。 簡而言之,用内-蛋白酶LysC處理EPO樣品,所得之肽以反 相層析法分離,計算肽T8氧化(含有氧化甲硫胺酸54)與 T8(含非-氧化甲硫胺酸54)之比例,數據摘要於表4。 表4 :各式調配物中ΕΡΟ在所示溫度下6個月後氧化甲硫胺酸 54的程度 甲硫胺酸54氧化% 調配物 本 配集化EPO (微克/毫升) 4°C 25〇C 30°C 40°C A 400 2.00 15.89 24.89 37.89 B 400 2.33 6.55 12.88 30.24 C 400 2.51 2.95 5.99 14.4 A 50 5.37 21.36 30.62 48.05 B 50 3.44 13.38 16.59 30.83 C 50 4.41 5.52 10.01 15.62 *調配物如下所示: -50- 1288644 調配物A : 10 mM蛾酸納,100 mM氣化納,pH 7.0。 調配物B : 10 mM磷酸鈉,40 mM硫酸鈉,3%(重量/體積) 甘露醇,pH 6.2。 調配物C : 10 mM磷酸鈉,40 mM硫酸鈉,3°/。(重量/體積) 甘露醇,1 mM甲硫胺酸,pH 6.2。 這些數據明白顯示本發明較佳調配物(10 mM磷酸鈉,40 mM硫酸鈉,3%(重量/體積)甘露醇,pH 6.2)在甲硫胺酸54 氧化作用方面優於其他調配物,如10 mM磷酸鈉,100 mM 氣化納,pH 7.0。調配物中添加1或10 mM甲硫胺酸明顯可 抑制甲硫胺酸54的氧化作用,因此,曱硫胺酸係作為抗氧 化劑,可穩定EPO。 實例12 :各式調配物配集化EPO的SIALIC酸的含量 為了分析配集化EPO醣蛋白碳水化合物結構的完整性, 利用標準技術分析於各種溫度下保存6個月後,最佳調配物 中配集化EPO樣品中唾液酸的含量。這些數據顯示蛋白質 保存於本專利說明書中新穎調配物後,碳水化合物結構並 未受到負面影響(圖9)。 實例13 :配集化EPO保存於高溫一段時間後的生物活性 為了證明配集化EPO保存在10 mM磷酸鈉,40 mM硫酸 鈉,3%(重量/體積)甘露醇,pH 6.2下,對活體内生物活性 不會有負面影響,進行研究標準老鼠EPO分析(參考實例 6)。配集化EPO樣品在所示的溫度4、25及3 0°C下,保存於 10 mM磷酸鈉,40 mM硫酸鈉,3%(重量/體積)甘露醇,pH 6.2 6個月後,與新鮮參考標準品比較,顯示並未失去活體内活
-51- 1288644 性(圖ίο)。 實例14 : 6個月後保存於高溫下配集化EPO的凝集含量 為了研究配集化EPO樣品增溫保存於1〇 mM磷酸鈉,40 mM硫酸鈉,3%(重量/體積)甘露醇,pH 6.2下6個月後所形 成凝集物含量,取出樣品,並以大小排除層析法分析。 在4、25及30°C下並未有凝集物形成,證明配集化EPO在 上述的調配物中相當的穩定,圖11顯示大小排除層析法分 析的圖形。 【圖式簡單說明】 圖1 :人類EPO —級結構(165個胺基酸)(SEQ ID NO : 1)。 圖2 :人類EPO —級結構(166個胺基酸)(SEQ ID NO : 2)。 圖3 : pH對熱穩定性的影響,轉換溫度與pH的關係圖。 圖4 :離子強度對熱穩定性的影響,轉換溫度與磷酸濃度 的關係圖。 圖5 :熱穩定性對緩衝物質之關係。 圖6:顯示硫酸根離子在低pH時(例如pH 6.2),亦為適當 的緩衝物質/添加物質,而磷酸在pH 6·2時則較pH 7.5時差, 此顯示硫酸根即使在低pH時,仍保有高的熱穩定性。 圖7 : pH與配集化EPO凝集作用之關係。SDS-PAGE分析 經熱壓力處理之配集化-EP0樣品(如前述),以銀染色蛋白 質。行1 :分子量標準品。行2 : pH 5。行3 : pH 5,還原 狀態。行4 : pH 6。行5 : pH 6,還原狀態。行6 : pH 6.5。 行7 · pH 6.5 ’還原狀態。行8 : pH 7。行9 : pH 7,還原狀 態。行10 ··配集化-EPO,未經熱壓力處理。 -52- J288644 圖8 :顯示使用1毫克/毫升乙醯基半胱胺酸為抗氧化劑可 預防熱壓力下凝集物的形成。配集化EPO在熱壓力下(2〇分 鐘80°C)進行之凝集作用。行1 : pH 7.5配集化EPO,未經熱 壓力處理;行2 : pH 7.5配集化EPO,經熱壓力處理;行3 : pH 6.2配集化EPO,經熱壓力處理;行4: pH 6.2配集化EPO, 熱壓力處理,還原狀態;行5 : pH 7.5配集化EPO,+1毫克/ 宅升N-乙醢基-半胱胺酸’經熱壓力處理;行6 ·· pH 7· 5配集 化EPO,+1毫克/毫升N-乙醜基-半胱胺酸 ,經熱壓力處理,還原狀態。 圖9 :配集化-EPO樣品在新調配物中,於各種溫度下保存 6個月後之唾液酸(NANA)含量。 圖10:配集化-EPO樣品保存於數種溫度之1〇 mM磷酸鈉, 40 mM硫酸鈉,3%(重量/體積)甘露醇,pH 6·2下六個月後之 老鼠生物活性分析。 圖11 ··配集化-ΕΡΟ樣品保存於數種溫度之1〇 mM磷酸鈉 ,40 mM硫酸鈉,3%(重量/體積)甘露醇,PH 6.2下六個月 後之大小排除層析法圖(從下至上:緩衝液,起始物質,4 °C,25°C,30°C 及40°C )。 -53- 1288644 序列表 (1) 一般資訊: (i) 申請者:
(A) 姓名:F. Hoffmann-La Roche AG (B) 街名:124Grenzacherstrasse (C) 城市:Basle (E) 國家:Switzerland (F) 郵遞區號(ZIP) : CH-4070 (G) 電話號碼:(61) 688 1 1 1 1 (H) 傳真:(61) 688 13 95 (I) TELEX : 962 292 hlr ch (ii) 發明標題:新穎醫藥組合物 (iii) 序列數目:2 (iv) 電腦讀取: (A) MEDIUM類別:軟碟 (B) 電腦:IBM PC相容者
(C) 操作系統:WORD (D) 軟體:Patentln Release 2.0 <170> Pstentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 165
<212> PRT <213> Homo sapiens 1288644 <400〉 1
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Giy Cys Ala Glu His 20 25 30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr Val Pro Asd Thr Lys Val Asn Phe 35 40 * 45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Giv Gin Gin Ala Val Glu Val Trp 50 55 * 60 r
Gin Glv Leu Ala Leu Leu Ser Glu hi a Val Leu xArg Giy Gin Ala Leu 65 70 75 90
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Tro Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asd 85 SO 95
Lys Ala Val Ser Giy Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110
Giy Ala Gin Lys Giu Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 Ί20 125
Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 一· 135 · 1Ϊ0 一
Tvr Ser Asn Phe Leu Arg Glv Lvs Leu Lys Leu Tyr Thr Giy Glu Ala .145 150 155 160
Cys Arg Thr Giy Asd . 16*5 0 12 3 r-:丄 1 1 2 2 2 2 V < V <
6 T 6 R <400> 2
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Giu Asn lie Thr Thr Giy Cys Ala GIu His 20 25 30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr Vsl Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45
Tvr Ala Trp Lvs Arg Met Glu Val Giy Gin Gin Ala Val Glu Val Trp " 50 55 60 (8 1288644
Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Giu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 85 90 95
Lvs Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110
Gly Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125
Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asd Thr Phe Arg Lvs Leu Phe Arg Val 130 135 * , 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tvr Thr Gly Glu Ala 145 1.50 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
Claims (1)
1288644 十、申請專利範圍: 1 · 一種用於預防及治療與紅血球生成有關疾病之液態醫藥 組合物,其包括未經配集化(unpegylated)紅血球生成素蛋 白質,於適合保持溶液pH範圍約5·5至約7·0範圍之醫藥可 • 接受緩衝溶液中之多價無機陰離子,及視情況含有一種 或多種醫藥上可接受賦形劑,該液態醫藥組合物於室溫 下呈穩定狀態。 φ 2.請求項1之組合物,其為水溶液。 3·清求項1或2之組合物’其為等張溶液。 4·請求項1或2之組合物,其中陰離子是多價無機強酸的陰 離子。 5·請求項4之組合物,其中陰離子選自硫酸、檸檬酸或填酸 所組成之群。 6·請求項4之組合物,其中陰離子為硫酸根陰離子。 7·請求項6之組合物,其包括1〇至200毫莫耳/公升硫酸。 _ 8·請求項1或2之組合物,其中pH為5.8至6.7。 9.請求項8之組合物,其中pH為6.0至6.5。 10·請求項9之組合物,其中pH為6.2。 11·請求項1或2之組合物,其中緩衝液選自磷酸或精胺酸 /H2S04/Na2S04緩衝液所組成之群。 12·請求項11之組合物,其中緩衝液為1〇至5〇毫莫耳磷酸緩 衝液。 13·吻求項丨或2之組合物,其中組合物包括一種或多種醫藥 上可接受之賦形劑。 1288644 14·請求項13之組合物,其中 形劑係選自醫藥上可接受 所組成之群。 一種或多種醫藥上可接受之賦 鹽類、稀釋劑、溶劑及保存劑 15·凊求項13之組合物’其令醫藥上可接受之 16張劑、聚醇、抗-氧化劑及非·離子清潔劑所組成導 16·請求項π之組合物,其中 /、甲醫樂上可接受賦形劑為聚醇。 17·請求項16之組合物,1中枣辟 八中聚醇選自甘露醇、山梨糖醇、 甘油、海藻糖及蔗糖所組成之群。 U·請求項17之組合物,其中聚醇為甘露醇。 19.請求項13之組合物,其包括抗氧化劑。 2〇·請求項19之組合物,其中抗氧化劑為甲硫胺酸。 21·請求項13之組合物,其包括至高達丨毫莫耳/公升caciy 22·明求項15之組合物’其中非·離子清潔劑為聚山梨酸 聚山梨酸20或普洛尼克(piuronic) F68。 23·明求項22之組合物,其中非-離子清潔劑為普洛尼克。 24·明求項22之組合物,其中組合物包括至高達1 %(重量/體 積)之非離子性清潔劑。 25·請求項22之組合物,其中組合物包括至高達〇1%(重量/ 體積)之非離子性清潔劑。 26·請求項1或2之組合物,其中紅血球生成素蛋白質為人類 紅血球生成素。 27·請求項26之組合物,其中紅血球生成素蛋白質藉由内源 性基因活化表現。 28·請求項26之組合物,其中紅血球生成素蛋白質具有SEQ 1288644 ID NO : 1或SEQ ID NO : 2的胺基酸序列。 29.請求項26之組合物,其中蛋白質具有經1至6個醣化位置 加成修飾之人類紅血球生成素序列。 3 0.請求項2 6之組合物’其中紅血球蛋白質具有經修飾之人 類紅血球生成素序列,修飾作用選自下列所組成之群: Asn30Thr32 ; Asn51Thr53 ; Asn57Thr59 ; Asn69 ; Asn69Thr71 ; Ser68Asn69Thr71 ; Val87Asn88Thr90 ; Ser87Asn88Thr90 ; Ser87Asn88Gly89Thr90 ; Ser87Asn88Thr90Thr92 ; Ser87Asn88Thr90Alal62 ; Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90 ; Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 ; Asn89Ile90Thr91 ; Ser87Asn89Ile90Thr91 ; Asnl36Thrl38 ; Asnl38Thrl40 ; Thrl25 ;及 Prol24Thrl25 〇 1288644 31. 請求項26之組合物,其中人類紅血球生成素序列經至少 一個醣化位置之重組作用修舞。 32. 請求項31組合物,其中重組作用包括刪除人類紅血球生 成素任何N -鏈結醣化作用位置及加成人類紅血球生成素 序列位置88 N-鏈結醣化位置。 33·請求項31組合物,其中紅血球蛋白質具有經修飾之人類 紅血球生成素序列,該修飾係選自下列所組成之群: Gin24 Ser87 Asn88 Thr90 ; Gin38 Ser87 Asn88 Thr9° ;及 Gin83 Ser87 Asn88 Thr90 〇 34.請求項1或2之組合物,其包括每毫升1〇微克至i〇〇〇〇微克 紅血球生成素蛋白質。 35·請求項1或2之組合物,其包括每毫升10微克至ι〇〇〇〇微克 紅jk球生成素,10-200毫莫耳/公升硫酸,及1〇至5〇毫莫 耳/公升磷酸pH 6.0至6.5。 36·請求項35之組合物,其包括至高達20 甲硫胺酸,ι_5% 聚醇(重量/體積),至高達0.;1%普洛尼克F68(重量/體積) 及視情況至高達1 mM CaCll。 37·請求項35之組合物,其包括每毫升10微克至ι〇〇〇〇微克紅 血球生成素蛋白質,40毫莫耳/公升硫酸,10毫莫耳/磷 酸,3%甘露醇(重量/體積),1〇 甲硫胺酸,0.01%普洛 尼克F68(重量/體積),pH 6.2。 38·請求項1或2之組合物,其包括每毫升丨〇微克至ι〇〇〇〇微克 紅血球生成素蛋白質,1〇至1〇〇毫莫耳/公升NaC卜1〇至5〇 1288644 毫莫耳/公升磷酸pH 6.0至7.0,視情況1-5%聚醇。 39·請求項38之組合物,其包括至高達20 mM甲硫胺酸,至高 達0.1%普洛尼克?68及視情況7.5微莫耳/公升〇&(:12。 40·請求項38之組合物,其包括每毫升10微克至10000微克紅 血球生成素蛋白質,1〇〇毫莫耳/公升NaC卜10 mM甲硫胺 酸,0.01%普洛尼克F68,及10毫莫耳/公升磷酸,pH 7.0。 41. 請求項1或2之組合物,其包括每毫升10微克至10000微克 紅血球生成素蛋白質,10至50毫莫耳/公升精胺酸,pH 6 至pH 6.5,10至100毫莫耳/公升硫酸鈉。 42. 請求項41之組合物,其包括至高達20 mM甲硫胺酸,至高 達0.1%普洛尼克F68,視情況至高達1毫莫耳/公升CaCl2, 及視情況1-5%聚醇。 43. 請求項41之組合物,其包括每毫升10微克至10000微克紅 血球生成素蛋白質,40毫莫耳/公升精胺酸,pH 6.2,30 毫莫耳/公升硫酸鈉,3%甘露醇,10 mM甲硫胺酸,0.01% 普洛尼克F68及視情況1毫莫耳/公升CaCl2。 44·請求項1或2之組合物,其包括25至2500微克/毫升紅血球 生成素,及 a) 10 mM破酸納 /卸,100 mM NaCl,pH 7.0,或 b) 10 mM填酸納,120 mM硫酸納,pH 6.2,或 c) 10 mM磷酸鈉,40 mM硫酸鈉,3%甘露醇,pH 6.2,或 d) 10mM填酸納,40mM硫酸納,3%甘露醇,10mM曱 硫胺酸,0.01%普洛尼克F68,pH 6.2,或 e)40 mM精胺酸,30 mM硫酸鈉,3%甘露醇,pH 6.2,或 1288644 f)40 mM精胺酸,30 mM硫酸鈉,3%甘露醇,10 mM甲 硫胺酸,0.01%普洛尼克F68,pH 6.2。 45. 請求項1或2之組合物,其中紅金球生成素含量為50、 100、400、800或 2500微克/毫升。 46. 請求項45之組合物,其包括10 mM填酸鈉,40 mM硫酸 鈉,3%甘露醇,10 mM甲硫胺酸,0.01%普洛尼克F68, pH 6.2 〇 47·請求項45之組合物,其包括40 mM精胺酸,30 mM硫酸 鈉,3%甘露醇,10 mM甲硫胺酸,0.01%普洛尼克F68, pH 6·2 〇 48. —種製備請求項1至47中任一項之組合物之方法,其包括 將紅血球生成素蛋白質與含有多負價陰離子及視情況一 種或多種醫藥上可接受賦形劑之溶液混合。 49. 一種請求項1至47中任一項之組合物之用途,其係用以製 備用於治療及預防與慢性腎衰竭(CRF)病患貧血、AIDS 及/或治療接受化療癌症病患相關疾病之藥物。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP00110355 | 2000-05-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TWI288644B true TWI288644B (en) | 2007-10-21 |
Family
ID=8168722
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW094134688A TWI288644B (en) | 2000-05-15 | 2001-05-14 | New liquid pharmaceutical composition comprising unpegylated erythropoietin protein and preparation process thereof |
TW090111453A TWI288643B (en) | 2000-05-15 | 2001-05-14 | New liquid pharmaceutical composition comprising pegylated erythropoietin protein and preparation process thereof |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW090111453A TWI288643B (en) | 2000-05-15 | 2001-05-14 | New liquid pharmaceutical composition comprising pegylated erythropoietin protein and preparation process thereof |
Country Status (36)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7169754B2 (zh) |
EP (2) | EP1525889A1 (zh) |
JP (1) | JP3967594B2 (zh) |
KR (3) | KR20050121762A (zh) |
CN (1) | CN1309416C (zh) |
AR (2) | AR035034A1 (zh) |
AT (1) | ATE291436T2 (zh) |
AU (1) | AU784091B2 (zh) |
BR (1) | BRPI0110914B8 (zh) |
CA (1) | CA2408685C (zh) |
CZ (1) | CZ304855B6 (zh) |
DE (1) | DE60109625T3 (zh) |
DK (1) | DK1311285T4 (zh) |
EC (2) | ECSP024352A (zh) |
ES (1) | ES2237574T5 (zh) |
HK (1) | HK1056683A1 (zh) |
HR (1) | HRP20020880B1 (zh) |
HU (1) | HU230874B1 (zh) |
IL (2) | IL152659A0 (zh) |
JO (1) | JO3404B1 (zh) |
MA (1) | MA26901A1 (zh) |
ME (1) | MEP90708A (zh) |
MX (1) | MXPA02011303A (zh) |
MY (1) | MY128654A (zh) |
NO (1) | NO330934B1 (zh) |
NZ (1) | NZ522030A (zh) |
PE (1) | PE20020050A1 (zh) |
PL (1) | PL219131B1 (zh) |
PT (1) | PT1311285E (zh) |
RS (1) | RS51292B (zh) |
RU (1) | RU2281116C2 (zh) |
SI (1) | SI1311285T1 (zh) |
TW (2) | TWI288644B (zh) |
UY (1) | UY26704A1 (zh) |
WO (1) | WO2001087329A1 (zh) |
ZA (1) | ZA200208500B (zh) |
Families Citing this family (130)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
US5545553A (en) * | 1994-09-26 | 1996-08-13 | The Rockefeller University | Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them |
US7304150B1 (en) | 1998-10-23 | 2007-12-04 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
CZ299516B6 (cs) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
WO2001079480A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
ES2237574T5 (es) | 2000-05-15 | 2017-08-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Composición farmacéutica líquida que contiene un derivado de eritropoyetina |
ATE505204T1 (de) * | 2000-12-20 | 2011-04-15 | Hoffmann La Roche | Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg) |
JP4656814B2 (ja) | 2000-12-20 | 2011-03-23 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | エリスロポエチンコンジュゲート |
FR2823220B1 (fr) * | 2001-04-04 | 2003-12-12 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo) |
US20030143191A1 (en) * | 2001-05-25 | 2003-07-31 | Adam Bell | Chemokine beta-1 fusion proteins |
US20030104996A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-06-05 | Tiansheng Li | L-methionine as a stabilizer for NESP/EPO in HSA-free formulations |
JP2003152145A (ja) * | 2001-08-31 | 2003-05-23 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 半導体放熱用基板とその製造方法及びパッケージ |
US7795210B2 (en) * | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7179617B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-02-20 | Neose Technologies, Inc. | Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX |
US7157277B2 (en) | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
US7399613B2 (en) * | 2001-10-10 | 2008-07-15 | Neose Technologies, Inc. | Sialic acid nucleotide sugars |
US8008252B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-08-30 | Novo Nordisk A/S | Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII |
US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
US7696163B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-04-13 | Novo Nordisk A/S | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
AU2004236174B2 (en) * | 2001-10-10 | 2011-06-02 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7473680B2 (en) | 2001-11-28 | 2009-01-06 | Neose Technologies, Inc. | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
EP1997829A1 (en) * | 2001-12-21 | 2008-12-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
WO2003059934A2 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
DE60336555D1 (de) * | 2002-06-21 | 2011-05-12 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Pegylierte glykoformen von faktor vii |
SI21258A (sl) * | 2002-07-17 | 2004-02-29 | LEK farmacevtska dru�ba d.d. | Stabilni farmacevtski pripravek, ki vsebuje eritropoietin in poloksamerni poliol |
US7459435B2 (en) * | 2002-08-29 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
PL375741A1 (en) * | 2002-09-09 | 2005-12-12 | Warren Pharmaceuticals, Inc. | Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin |
ZA200502320B (en) * | 2002-09-20 | 2006-10-25 | Pharmacia Corp | Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein |
US7459436B2 (en) | 2002-11-22 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
EP1608688B1 (en) * | 2003-03-14 | 2013-02-27 | BioGeneriX AG | Branched water-soluble polymers and their conjugates |
US7691603B2 (en) * | 2003-04-09 | 2010-04-06 | Novo Nordisk A/S | Intracellular formation of peptide conjugates |
US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
ATE540055T1 (de) * | 2003-05-09 | 2012-01-15 | Biogenerix Ag | Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung von glykosylierungsmutanten des menschlichen wachstumshormons |
EP1626983B8 (en) * | 2003-05-12 | 2010-12-22 | Affymax, Inc. | Novel poly (ethylene glycol) modified erythropoietin agonists and uses thereof |
NZ543934A (en) * | 2003-05-12 | 2008-06-30 | Affymax Inc | Novel spacer moiety for poly (ethylene glycol)-modified peptide-based compounds |
MXPA05012313A (es) * | 2003-05-12 | 2006-04-18 | Affymax Inc | Peptidos que se unen al receptor de eritropoyetina. |
DK1629007T3 (da) * | 2003-05-12 | 2009-06-29 | Affymax Inc | Hidtil ukendte peptider som binder til erythropoietin-receptoren |
CA2528988C (en) | 2003-06-10 | 2012-05-01 | Lg Life Sciences Ltd. | Stable, aqueous solution of human erythropoietin, not containing serum albumin |
WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
MXPA06005732A (es) * | 2003-11-24 | 2006-08-17 | Neose Technologies Inc | Eritropoyetina glucopegilada. |
US8633157B2 (en) * | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
US7842661B2 (en) * | 2003-11-24 | 2010-11-30 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin formulations |
US20080305992A1 (en) * | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
US20080318850A1 (en) * | 2003-12-03 | 2008-12-25 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated Factor Ix |
JP4657219B2 (ja) * | 2003-12-03 | 2011-03-23 | バイオジェネリックス アーゲー | GlycoPEG化された顆粒球コロニー刺激因子 |
US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
US7956032B2 (en) | 2003-12-03 | 2011-06-07 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
CN1901934B (zh) | 2003-12-19 | 2013-09-11 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | ***在治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱中的用途 |
AU2005206796B2 (en) * | 2004-01-08 | 2011-06-16 | Ratiopharm Gmbh | O-linked glycosylation of peptides |
CN103755800B (zh) * | 2004-02-02 | 2016-02-24 | Ambrx公司 | 经修饰的人类生长激素多肽与其用途 |
DE102004011663B4 (de) * | 2004-03-10 | 2006-04-27 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Erythropoietin-Flüssigformulierung |
US20050282751A1 (en) * | 2004-03-19 | 2005-12-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Therapeutic agent for renal anemia |
EP1726303A4 (en) * | 2004-03-19 | 2011-03-02 | Ajinomoto Kk | THERAPEUTIC AGENT AGAINST KIDNEY ANEMIA |
KR20070015549A (ko) * | 2004-03-26 | 2007-02-05 | 얀센 파마슈티카 엔.브이. | 에리트로포이에틴의 병용 용량요법 |
AR049580A1 (es) * | 2004-07-07 | 2006-08-16 | Lundbeck & Co As H | Epo carbamilada y metodo para su produccion |
WO2006010143A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-26 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1] |
WO2006020372A2 (en) * | 2004-07-23 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Enzymatic modification of glycopeptides |
US20060029551A1 (en) * | 2004-08-05 | 2006-02-09 | Kui Liu | Stable particle formulations of erythropoietin receptor agonists |
US7772182B2 (en) * | 2004-08-05 | 2010-08-10 | Alza Corporation | Stable suspension formulations of erythropoietin receptor agonists |
EP1799249A2 (en) * | 2004-09-10 | 2007-06-27 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated interferon alpha |
PL2586456T3 (pl) * | 2004-10-29 | 2016-07-29 | Ratiopharm Gmbh | Remodeling i glikopegilacja czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) |
JP2006137678A (ja) * | 2004-11-10 | 2006-06-01 | Shionogi & Co Ltd | インターロイキン−2組成物 |
WO2006062685A2 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-15 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
AU2005310189A1 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-08 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
JP2008526864A (ja) * | 2005-01-06 | 2008-07-24 | ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド | 糖断片を用いる糖結合 |
WO2006074467A2 (en) | 2005-01-10 | 2006-07-13 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
AU2005325768A1 (en) * | 2005-01-25 | 2006-08-03 | Apollo Life Sciences Limited | Molecules and chimeric molecules thereof |
JP2008538181A (ja) * | 2005-03-30 | 2008-10-16 | ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド | 昆虫細胞系において増殖させたペプチドを生産するための製造方法 |
EP2386571B1 (en) | 2005-04-08 | 2016-06-01 | ratiopharm GmbH | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
US20070037886A1 (en) * | 2005-04-26 | 2007-02-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Bone marrow erythroid progenitor cell(s) differentiation inducer |
US20110003744A1 (en) * | 2005-05-25 | 2011-01-06 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated Erythropoietin Formulations |
EP2975135A1 (en) | 2005-05-25 | 2016-01-20 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
US7919461B2 (en) | 2005-06-03 | 2011-04-05 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US8324159B2 (en) * | 2005-06-03 | 2012-12-04 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US7550433B2 (en) * | 2005-06-03 | 2009-06-23 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
CA2915270C (en) | 2005-08-05 | 2017-07-11 | Amgen Inc. | Stable aqueous protein or antibody pharmaceutical formulations and their preparation |
US20070105755A1 (en) * | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
CN102719508A (zh) * | 2005-08-19 | 2012-10-10 | 诺和诺德公司 | 糖基聚乙二醇化的因子vii和因子viia |
US20070072795A1 (en) * | 2005-09-28 | 2007-03-29 | Anton Haselbeck | Treatment of neurodegenerative disorders |
WO2007056191A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
US8128933B2 (en) | 2005-11-23 | 2012-03-06 | Acceleron Pharma, Inc. | Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody |
PL1973559T3 (pl) | 2005-11-23 | 2013-06-28 | Acceleron Pharma Inc | Antagoniści aktywiny-ActRIIa i zastosowanie do pobudzania wzrostu kości |
CN101015684B (zh) * | 2006-02-10 | 2011-08-24 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种重组人红细胞生成素溶液制剂 |
WO2007108505A1 (ja) * | 2006-03-22 | 2007-09-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | エリスロポエチン溶液製剤 |
US20080280818A1 (en) * | 2006-07-21 | 2008-11-13 | Neose Technologies, Inc. | Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences |
WO2008019214A1 (en) * | 2006-08-04 | 2008-02-14 | Prolong Pharmaceuticals, Inc. | Modified erythropoietin |
US8969532B2 (en) | 2006-10-03 | 2015-03-03 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography |
BRPI0717505B8 (pt) * | 2006-10-04 | 2021-05-25 | Novo Nordisk As | conjugado de peptídeo e formulação farmacêutica |
WO2008073620A2 (en) * | 2006-11-02 | 2008-06-19 | Neose Technologies, Inc. | Manufacturing process for the production of polypeptides expressed in insect cell-lines |
US8895016B2 (en) | 2006-12-18 | 2014-11-25 | Acceleron Pharma, Inc. | Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels |
TWI548647B (zh) | 2007-02-02 | 2016-09-11 | 艾瑟勒朗法瑪公司 | 衍生自ActRIIB的變體與其用途 |
KR20150064246A (ko) | 2007-04-03 | 2015-06-10 | 바이오제너릭스 게엠베하 | 글리코페길화 g―csf를 이용하는 치료 방법 |
US20090053167A1 (en) * | 2007-05-14 | 2009-02-26 | Neose Technologies, Inc. | C-, S- and N-glycosylation of peptides |
US20080286341A1 (en) * | 2007-05-16 | 2008-11-20 | Sven-Borje Andersson | Buffered coated nicotine containing products |
JP2010531135A (ja) * | 2007-06-04 | 2010-09-24 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを使用したo結合型グリコシル化 |
US9493499B2 (en) | 2007-06-12 | 2016-11-15 | Novo Nordisk A/S | Process for the production of purified cytidinemonophosphate-sialic acid-polyalkylene oxide (CMP-SA-PEG) as modified nucleotide sugars via anion exchange chromatography |
AU2008269086B2 (en) * | 2007-06-25 | 2014-06-12 | Amgen Inc. | Compositions of specific binding agents to hepatocyte growth factor |
US7968811B2 (en) * | 2007-06-29 | 2011-06-28 | Harley-Davidson Motor Company Group, Inc. | Integrated ignition and key switch |
AR067536A1 (es) * | 2007-07-17 | 2009-10-14 | Hoffmann La Roche | Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea |
AR067537A1 (es) | 2007-07-17 | 2009-10-14 | Hoffmann La Roche | Purificacion de polipeptidos pegilados |
EP2197919B1 (en) | 2007-08-27 | 2014-04-09 | ratiopharm GmbH | Liquid formulation of g-csf conjugate |
US8207112B2 (en) * | 2007-08-29 | 2012-06-26 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
CN101456911A (zh) * | 2007-12-12 | 2009-06-17 | 江苏豪森药业股份有限公司 | ***模拟肽衍生物及其可药用盐和其制备方法与用途 |
US20100286067A1 (en) * | 2008-01-08 | 2010-11-11 | Biogenerix Ag | Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases |
PL2257311T3 (pl) | 2008-02-27 | 2014-09-30 | Novo Nordisk As | Koniugaty cząsteczek czynnika VIII |
TWI617316B (zh) | 2008-08-14 | 2018-03-11 | 艾瑟勒朗法瑪公司 | 使用gdf阱以增加紅血球水平 |
US8216997B2 (en) | 2008-08-14 | 2012-07-10 | Acceleron Pharma, Inc. | Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators |
ES2435272T3 (es) | 2008-09-23 | 2013-12-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Purificación de la eritropoyetina |
WO2010144452A1 (en) | 2009-06-08 | 2010-12-16 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for increasing thermogenic adipocytes |
MX351286B (es) | 2009-06-12 | 2017-10-09 | Acceleron Pharma Inc | Proteinas de fusion actriib-fc truncadas. |
SG177319A1 (en) | 2009-06-24 | 2012-02-28 | Hoffmann La Roche | Characterization of re-useable chromatography equipment |
BRPI0902481B8 (pt) * | 2009-07-31 | 2021-05-25 | Soc Beneficente De Senhoras Hospital Sirio Libanes | composição farmacêutica compreendendo hemopressina e seu uso. |
BR112012003232B1 (pt) * | 2009-08-13 | 2022-02-22 | Acceleron Pharma Inc | Uso de um polipeptídeo em conjunto com um ativador do receptor de eritropoetina para aumentar os níveis de célula vermelha no sangue ou tratar anemia |
CN102712688B (zh) * | 2009-09-23 | 2015-06-24 | 通益制药有限公司 | 重组人红细胞生成素(epo)的纯化方法、由此纯化的epo以及包含纯化的epo的药物组合物 |
US8710016B2 (en) | 2009-11-17 | 2014-04-29 | Acceleron Pharma, Inc. | ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy |
JP5621052B2 (ja) | 2010-12-21 | 2014-11-05 | エフ.ホフマン−ラ ロシュアーゲーF.Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | クロマトグラフィー装置の特徴決定 |
AR094821A1 (es) * | 2012-07-25 | 2015-09-02 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada |
CN102816227A (zh) * | 2012-08-30 | 2012-12-12 | 深圳赛保尔生物药业有限公司 | 回收***的方法 |
EP2914277B1 (en) | 2012-11-02 | 2017-09-13 | Celgene Corporation | Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders |
CU20140003A7 (es) | 2014-01-08 | 2015-08-27 | Ct De Inmunología Molecular Biofarmacuba | Conjugado que comprende eritropoyetina y una estructura polimérica ramificada |
EP3125922B1 (en) * | 2014-03-29 | 2020-10-14 | Intas Pharmaceuticals Limited | Liquid pharmaceutical composition of conjugated erythropoietin |
EP3154566B1 (en) | 2014-06-13 | 2022-08-03 | Acceleron Pharma Inc. | Actrii antagonist for the treatment or prevention of a cutaneous ulcer in a subject that has anemia |
US11608357B2 (en) | 2018-08-28 | 2023-03-21 | Arecor Limited | Stabilized antibody protein solutions |
EP3372242A1 (en) | 2017-03-06 | 2018-09-12 | Ares Trading S.A. | Liquid pharmaceutical composition |
EP3372241A1 (en) | 2017-03-06 | 2018-09-12 | Ares Trading S.A. | Liquid pharmaceutical composition |
WO2018184692A1 (en) * | 2017-04-07 | 2018-10-11 | Ares Trading S.A. | Liquid pharmaceutical composition |
EP3731873B1 (en) * | 2017-12-29 | 2022-01-26 | F. Hoffmann-La Roche AG | Process for providing pegylated protein composition |
CN111558046A (zh) * | 2020-05-27 | 2020-08-21 | 华润昂德生物药业有限公司 | 海藻糖在制备重组人促红素液体制剂中的应用及重组人促红素液体制剂、制备方法和应用 |
TWI740635B (zh) * | 2020-09-09 | 2021-09-21 | 財團法人工業技術研究院 | 聚偏氟乙烯薄膜組成物及聚偏氟乙烯隔離膜 |
Family Cites Families (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US115833A (en) * | 1871-06-13 | Improvement in grain-driers | ||
US147431A (en) * | 1874-02-10 | Improvement in game boards | ||
JPS6197229A (ja) * | 1984-10-18 | 1986-05-15 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 安定なエリトロポエチン製剤 |
US4732889A (en) | 1985-02-06 | 1988-03-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of rheumatoid arthritis |
DE3729863A1 (de) * | 1987-09-05 | 1989-03-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabilisierte erythropoietin-lyophilisate |
DE3734923C1 (de) | 1987-10-15 | 1989-01-26 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung einer sterilen Plasmaproteinloesung,die Fibrinogen und den Gerinnungsfaktor XIII enthaelt |
DE4014654A1 (de) | 1990-05-08 | 1991-11-14 | Behringwerke Ag | Galenische waessrige formulierungen von erythropoietin und ihre verwendung |
CA2069746A1 (en) * | 1990-09-28 | 1992-03-29 | Jonathan I. Rosen | Hybrid growth factors |
US5272135A (en) | 1991-03-01 | 1993-12-21 | Chiron Ophthalmics, Inc. | Method for the stabilization of methionine-containing polypeptides |
US6565841B1 (en) | 1991-03-15 | 2003-05-20 | Amgen, Inc. | Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor |
NZ244778A (en) | 1991-10-21 | 1994-03-25 | Ortho Pharma Corp | Peg imidates and protein derivatives thereof |
US5460944A (en) | 1991-10-28 | 1995-10-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Storable protein solution |
DE4135542A1 (de) | 1991-10-28 | 1993-04-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Lagerfaehige proteinloesungen |
US5716644A (en) | 1992-06-11 | 1998-02-10 | Alkermes, Inc. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
US5661125A (en) * | 1992-08-06 | 1997-08-26 | Amgen, Inc. | Stable and preserved erythropoietin compositions |
US5354934A (en) † | 1993-02-04 | 1994-10-11 | Amgen Inc. | Pulmonary administration of erythropoietin |
WO1994028024A1 (en) | 1993-06-01 | 1994-12-08 | Enzon, Inc. | Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity |
ZA946122B (en) * | 1993-08-17 | 1995-03-20 | Amgen Inc | Erythropoietin analogs |
US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
TWI240627B (en) | 1996-04-26 | 2005-10-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Erythropoietin solution preparation |
DK0964702T3 (da) † | 1996-08-02 | 2007-01-08 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Polypeptider med en enkelt kovalent bundet N-terminal vandoplöselig polymer |
US5919656A (en) | 1996-11-15 | 1999-07-06 | Amgen Canada Inc. | Genes encoding telomerase protein 1 |
EP0885613A1 (de) | 1997-06-21 | 1998-12-23 | Roche Diagnostics GmbH | Verwendung von modifizierten Hämoglobinen zur Behandlung von Anämien und Kombinationspräparate umfassend Erythropoietin und modifiziertes Hämoglobin |
DE19734293A1 (de) | 1997-08-08 | 1999-02-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung von pharmazeutischen Kombinationspräparaten enthaltend Erythropoietin und Eisenpräparate zur Behandlung von rheumatischen Erkrankungen |
AR020848A1 (es) | 1998-10-23 | 2002-05-29 | Amgen Inc | Metodos y composiciones para la prevencion y el tratamiento de anemia |
UY25790A1 (es) | 1998-11-06 | 2000-08-21 | Bio Sidus S A | Formas farmaceuticas de eritropoyetina humana recombinante estables a temperatura ambiente y apropiadas para su uso en humanos, formulaciones y procedimientos de liofilizacion para su obtencion. |
JP2000247903A (ja) * | 1999-03-01 | 2000-09-12 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 長期安定化製剤 |
HUP0201068A3 (en) † | 1999-04-09 | 2002-10-28 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Pharmaceutical compositions of erythropoietin |
US6309663B1 (en) | 1999-08-17 | 2001-10-30 | Lipocine Inc. | Triglyceride-free compositions and methods for enhanced absorption of hydrophilic therapeutic agents |
PE20010288A1 (es) * | 1999-07-02 | 2001-03-07 | Hoffmann La Roche | Derivados de eritropoyetina |
CZ299516B6 (cs) † | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
CZ302750B6 (cs) | 1999-07-22 | 2011-10-19 | Aventis Holdings Inc. | Farmaceutická kompozice a ampulka na bázi erythropoietinu a zpusob inhibování mikrobiálního rustu v roztoku obsahujícím tuto látku |
TWI245645B (en) † | 1999-09-08 | 2005-12-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Protein solution formulations and stabilization methods thereof |
AU2001236005A1 (en) | 2000-02-29 | 2001-09-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Preparations stabilized over long time |
US6586398B1 (en) | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
ES2237574T5 (es) * | 2000-05-15 | 2017-08-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Composición farmacéutica líquida que contiene un derivado de eritropoyetina |
AU2001276737A1 (en) | 2000-08-04 | 2002-02-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Protein injection preparations |
JP4656814B2 (ja) * | 2000-12-20 | 2011-03-23 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | エリスロポエチンコンジュゲート |
US20030104996A1 (en) | 2001-08-30 | 2003-06-05 | Tiansheng Li | L-methionine as a stabilizer for NESP/EPO in HSA-free formulations |
US6818613B2 (en) | 2001-11-07 | 2004-11-16 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Aqueous sustained-release formulations of proteins |
-
2001
- 2001-05-08 ES ES01943331.7T patent/ES2237574T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-08 CA CA2408685A patent/CA2408685C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-08 MX MXPA02011303A patent/MXPA02011303A/es active IP Right Grant
- 2001-05-08 WO PCT/EP2001/005187 patent/WO2001087329A1/en not_active Application Discontinuation
- 2001-05-08 KR KR1020057023568A patent/KR20050121762A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-05-08 KR KR1020027015429A patent/KR100758044B1/ko active IP Right Grant
- 2001-05-08 PT PT01943331T patent/PT1311285E/pt unknown
- 2001-05-08 CN CNB018095607A patent/CN1309416C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-08 IL IL15265901A patent/IL152659A0/xx unknown
- 2001-05-08 HU HU0302114A patent/HU230874B1/hu unknown
- 2001-05-08 RU RU2002133236/15A patent/RU2281116C2/ru active
- 2001-05-08 DE DE60109625.8T patent/DE60109625T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-08 NZ NZ522030A patent/NZ522030A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-05-08 DK DK01943331.7T patent/DK1311285T4/en active
- 2001-05-08 AU AU65934/01A patent/AU784091B2/en not_active Expired
- 2001-05-08 RS YUP-835/02A patent/RS51292B/sr unknown
- 2001-05-08 ME MEP-907/08A patent/MEP90708A/xx unknown
- 2001-05-08 AT AT01943331T patent/ATE291436T2/de active
- 2001-05-08 JP JP2001583796A patent/JP3967594B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-08 CZ CZ2002-4005A patent/CZ304855B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-05-08 EP EP05000984A patent/EP1525889A1/en not_active Withdrawn
- 2001-05-08 EP EP01943331.7A patent/EP1311285B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-08 SI SI200130331T patent/SI1311285T1/xx unknown
- 2001-05-08 PL PL361341A patent/PL219131B1/pl unknown
- 2001-05-08 KR KR1020077003371A patent/KR20070032815A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-05-08 BR BRPI0110914A patent/BRPI0110914B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-05-09 JO JOP/2001/0065A patent/JO3404B1/ar active
- 2001-05-11 US US09/853,731 patent/US7169754B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-11 PE PE2001000421A patent/PE20020050A1/es active IP Right Grant
- 2001-05-11 MY MYPI20012197A patent/MY128654A/en unknown
- 2001-05-11 AR ARP010102248A patent/AR035034A1/es not_active Application Discontinuation
- 2001-05-14 TW TW094134688A patent/TWI288644B/zh not_active IP Right Cessation
- 2001-05-14 UY UY26704A patent/UY26704A1/es not_active IP Right Cessation
- 2001-05-14 TW TW090111453A patent/TWI288643B/zh not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-10-21 ZA ZA200208500A patent/ZA200208500B/en unknown
- 2002-11-05 IL IL152659A patent/IL152659A/en active IP Right Grant
- 2002-11-07 HR HR20020880A patent/HRP20020880B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-11-13 MA MA26907A patent/MA26901A1/fr unknown
- 2002-11-14 NO NO20025450A patent/NO330934B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-11-20 EC EC2002004352A patent/ECSP024352A/es unknown
-
2003
- 2003-12-11 HK HK03109033A patent/HK1056683A1/xx unknown
-
2004
- 2004-02-17 US US10/780,297 patent/US7202208B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-12-21 EC EC2010004352A patent/ECSP10004352A/es unknown
-
2013
- 2013-10-04 AR ARP130103618A patent/AR092919A2/es not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI288644B (en) | New liquid pharmaceutical composition comprising unpegylated erythropoietin protein and preparation process thereof | |
JP4190184B2 (ja) | ポリエチレングリコールを有するエリスロポエチン接合体 | |
AU736067B2 (en) | Erythropoietin derivatives | |
AU2005225151B2 (en) | New pharmaceutical composition | |
RU2232163C2 (ru) | Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK4A | Expiration of patent term of an invention patent |