WO2007108505A1

WO2007108505A1 - エリスロポエチン溶液製剤

Info

Publication number: WO2007108505A1
Application number: PCT/JP2007/055860
Authority: WO
Inventors: Hidefumi Mizushima; Takayuki Yoshimori
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2006-03-22
Filing date: 2007-03-22
Publication date: 2007-09-27
Also published as: JPWO2007108505A1; US20100234276A1; EP1997505A4; EP1997505A1; US8546329B2; JP5553506B2

Abstract

　本発明は、ポロクサマー類を含み、ｐHが6.5～7.5である、エリスロポエチン含有溶液製剤に関する。本発明はまた、以下のステップを含む微量タンパク質の定量方法に関する：１）タンパク質試料と高輝度蛍光色素を結合させる；２）得られる試料から所望の分析物を適切な分離手段により分離する；３）所望の分析物を定量して、その量からタンパク質の量を換算する。

Description

明細書

エリスロポエチン溶液製剤

技術分野

[0001] 本発明はエリスロポエチン含有溶液製剤に関し、特に長期保存した後も活性成分の損失が少なぐ二量体の生成、分解物の生成が顕著に抑制され、かつ使用時の疼痛を軽減することができる、エリスロポエチン含有溶液製剤に関する。

[0002] 本発明はさらに、上記エリスロポエチン含有溶液製剤の定量、純度試験にも有用な微量タンパク質の定量方法にも関する。

背景技術

[0003] 赤血球系前駆細胞の分化、増殖を促進する酸性糖タンパク質ホルモンであるエリスロポェチン (以下において EPOと記載することもある）は、遺伝子工学的方法によつて組換えヒト EPOとして大量に生産され、本願出願人はこの精製した EPOの製剤化に成功し、腎性貧血改善剤などとして、凍結乾燥製剤または溶液製剤の形で市場に製品を供給している。

[0004] 安定な EPO溶液製剤を巿場に供給するための処方設計では、ロイシン、トリプトフアン、セリン、グノレタミン酸、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンならびにその塩力選択されるアミノ酸を安定化剤として含む EPO溶液製剤が提案されている（特願平 11 — 52314号）。

[0005] 生理活性タンパク質溶液の安定性はその溶液の pHに大きく依存し、酸性の方が比較的安定である。 EP〇では pH6. 0付近の酸性で安定であることが知られている。長期間保存しても安定な EP〇溶液製剤として、現在市場に供給されているのは、生体内 pHからやや離れた弱酸性の pH6. 0の製品である。しかし、弱酸性の溶液製剤を皮下注射すると疼痛を伴うことが予測され、さらに使用性を改善し、かつ長期間保存にも安定な EPO溶液製剤の開発が求められている。

[0006] 注射用製剤の投与時の疼痛を軽減する方法としてマンニトールなどの糖類を添カロすることが提案されている（WO 02/11753)。

[0007] また、界面活性剤としてポロクサマーを含有する抗体製剤が報告されている (WO 2 004/075913)が、 EPOを含む溶液製剤の安定性や、注射時の疼痛については記載がない。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明の目的は、注射時の疼痛を軽減し、し力も長期の保存にも安定な EPO溶液製剤を提供することである。本発明はさらに、上記エリスロポエチン含有溶液製剤の定量、純度試験にも有用な微量タンパク質の定量方法を提供することも目的とする。課題を解決するための手段

[0009] 上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは界面活性剤としてポ口クサマーを使用することにより、 pHが約 7. 0であっても長期間安定で、かつ注射投与時の疼痛が軽減されたエリスロポエチン含有溶液製剤となしうることを見いだし本発明を完成した。

[0010] すなわち、本発明は、以下のものを提供する。

(1)ポロクサマー類を含み、 pHが 6.5〜7.5である、エリスロポエチン含有溶液製剤。

(2)ポロクサマーがポロクサマー 188である（1)記載の製剤。

(3)さらに、安定化剤としてアミノ酸又はその塩を含む（1)記載の製剤。

(4)アミノ酸がヒスチジン、アルギニン又はそれらの塩である（3)記載の製剤。

(5) pHが、 6·8〜7·2である、（1)〜（4)のいずれかに記載の製剤。

(6)ポロクサマー類を含み、安定化剤として L ヒスチジンを含み、かつ pH力 ¾.8〜7. 2である、エリスロポエチン含有溶液製剤。

(7)安定化剤としてのタンパク質を含まない、請求項（1)〜（6)のいずれかに記載の製剤。

(8)安定化剤として糖類を含まない、（1)〜（7)のいずれかに記載の製剤。

(9)ポロクサマー類を添加することを含む、エリスロポエチン含有溶液製剤の長期保存後におけるエリスロポエチン二量体の生成を抑制する方法。

(10)以下のステップを含む微量タンパク質の定量方法：

1)タンパク質試料と高輝度蛍光色素を結合させる；

2)得られる試料から所望の分析物を適切な分離手段により分離する； 3)所望の分析物を定量して、その量力タンパク質の量を換算する。

(11)高輝度蛍光色素が Cyanine Dye系色素である（10)記載の方法。

(12)高輝度蛍光色素が Cy3である（11)記載の方法。

(13)分離手段が電気泳動または高速液体クロマトグラフィー (HPLC)である（10)〜 (12)のいずれかに記載の方法。

(14)微量タンパク質がエリスロポエチンである（10)〜（： 13)のいずれかに記載の方法。

図面の簡単な説明

[0011] [図 1]図 1は、 EPO濃度及び EPO二量体を種々の濃度で測定して、検量線を作成し、検出限界を確認した結果を示す図である。

[図 2]図 2は、 hPM-1及び hPM-1二量体を種々の濃度で測定して、検量線を作成し、検出限界を確認した結果を示す図である。

[図 3]図 3は、 EPOを蛍光色素 Cy5、 Alexa 647および HiLyte Fluor 647を用いて測定した純度試験法の結果を示すグラフである。

[図 4]図 4は、 BSAを蛍光色素 Cy5、 Alexa 647および HiLyte Fluor 647を用いて測定した純度試験法の結果を示すグラフである。

[図 5]図 5は、 BSAを蛍光色素 Cy5を用いて、マイクロ電気泳動システムで測定した純度試験法の結果を示すグラフである。

[図 6]図 6は、 BSAを蛍光色素 Alexa 647を用いて、マイクロ電気泳動システムで測定した純度試験法の結果を示すグラフである。

[図 7]図 7は、 BSAを蛍光色素 HiLyte Fluor 647を用いて、マイクロ電気泳動システムで測定した純度試験法の結果を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 本発明の製剤に使用する EPOは、どのような EPOでも用いることができる力好ましくは高度に精製された EPOであり、より具体的には、哺乳動物 EPO、特にヒト EPO と実質的に同じ生物学的活性を有するものである。

[0013] 本発明で用いる EPOは、いかなる方法で製造されたものでもよぐ例えば、ヒト由来の抽出物から精製して得られた天然のヒト EPO (特公平 1-38800号公報、など）や、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、 C127細胞、 COS細胞、ミエローマ細胞、 BHK細胞、昆虫細胞、などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したヒト EPOなどを用いることができる。本発明において用いられる EP〇は、遺伝子工学的手法により製造された EPOが好ましぐ哺乳動物細胞（特に CHO細胞）を用いて製造された EPOが好ましい（例えば、特公平 1-44317号公報、 Kenneth Jacobs et al.， Nature, 313 806-810 (1985)、など)。

遺伝子組換え法により得られる EP〇には、天然由来の EP〇とアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列中の 1または複数のアミノ酸を欠失、置換、付カロ等したもので、天然由来の EPOと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよレ、。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Gotoh, T. et al. (1995) Gene

152， 271-275 ;Zoller, M.J. and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100， 468-500 ; Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 ; Kramer, W. and Fritz, H.J. (1987) Methods Enzymol. 154, 350- 367 ; Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA. 82， 488-492 ; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85， 2763-2766)などを用いて、 EPOのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、 EPOと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ離 (R、 K、 Η)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に対する 1 又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D.F. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81 , 5662-56 66 ; Zoller, M.J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10， 6487-6500 ; Wang, A . et al. , Science 224, 1431-1433； Dalbadie-McFarland, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413)。また、 EP〇の N末端にシアル酸が付着した糖鎖改変体 EP〇である NESP (Novel Erythropoietin Stimulating Protein: W〇85/02610、 W 091/05867、 WO95/05465等に記載）などの糖鎖の改変された EP〇類似体であつてもよい。

[0015] 又、 EPOと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、 EPOをコードする DNAと他のタンパク質をコードする DNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明の EPOとの融合に付される他のタンパク質としては、特に限定されない。

[0016] 又、化学修飾した EPOを用いることも可能である。化学修飾した EPOの例としては、例えば、ポリエチレングリコール 'ビタミン B 12等、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させた EPOなどを挙げることができる。具体的には、特開 2001-64300などに記載のポリエチレングリコール化 EPOなどを挙げることができる。

[0017] 本発明の EPO含有溶液製剤では、ポロクサマー類を添加することにより、 pHが約 7 . 0であっても長期間安定で、かつ注射投与時の疼痛が軽減されたエリスロポエチン含有溶液製剤とすることができる。ポロクサマー類を添加した pHが約 7. 0の本発明の EPO含有溶液製剤では、後述する実施例に示すように、マンニトールなどの糖類を添加しなくても疼痛が抑制されることが明らかとなった。

[0018] ポロクサマーは非イオン性の界面活性剤であって、タンパク質溶液製剤にぉレ、ては容器への吸着防止剤としても使用され、一般的にはエチレンオキサイドとプロピレンオキサイドの共重合体を意味する。具体的には、以下の一般式を有するエチレンォキサイドとプロピレンオキサイドのブロック共重合体のシリーズなどが挙げられる： HO (C H O) (C H O) (C H O) H

2 4 a 3 6 b 2 4 a

ポロクサマーに fまポロクサマー 124、 188、 237、 338、 407力 USP (米国薬局方）に収載されている。 USP記載のポロクサマー 188は上記式における aが 80、 bが 27、平均分子量が 7680— 9510であり、 BP (英国薬局方）記載のポロクサマー 188は上記式における aが約 75、 bが約 30、平均分子量が 8350である。さらに、 EP (欧州薬局方）にはこれ以外に、ポロクサマー 182、 184、 331が記載されている。これら以外に、ポロクサマー 108、 335、 403なども使用できる。また、 Pluronic (ポロクサマーの B ASF社の商標）としては、 Pluronic L35, L43、 L44、 L61, L62, L64, F68、 L81、 P84、 P85、 F87、 F88、 L92、 F98、 L101、 P103、 P104、 P105、 F108、 L121 , P123、 F127力 Sあり、これらのものも本発明におけるポロクサマーに含まれる。上記構造式における a、 bの数は一般的に 2〜128、 16〜67の組み合わせであり、好ましくは、 11〜100、 16〜67の組み合わせであり、さらに好ましくは、 50〜100、 20〜40の組み合わせである。また、平均分子量は一般的に 1000〜 15000であり、好ましくは、 200 0〜10000であり、さらに好ましくは、 7000〜10000である。

[0019] 後述する実施例に示すように、ポロクサマー系の界面活性剤を用いた処方ではいずれも、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油やポリソルベートを界面活性剤として用いた処方よりも長期保存後の EPO二量体の生成が抑制され、安定であることが判明した。好ましレヽポロクサマー ίまポロクサマー 108、 124、 188、 335、 403であり、最も好ましいのはポロクサマー 188である。

[0020] ポロクサマーの添加量は使用するポロクサマーの種類により異なる力一般には 0.0 001〜10%であり、好ましくは 0.001〜0.5%であり、さらに好ましくは 0·005〜0· 1%であり、また、 ΕΡΟ/ポロクサマー 188の重量比率としては、 0.001〜5であり、好ましくは 0.017 〜1.2である。

[0021] 本発明の ΕΡΟ含有溶液製剤では、界面活性剤としてポロクサマーを使用することにより、 ρΗ7. 0付近でも安定、すなわち長期間保存した後にも ΕΡΟの残存率が高く、二量体や分解物の生成が抑制され、かつ疼痛の軽減された ΕΡ〇含有溶液製剤とすること力 Sできた。

[0022] 本発明のタンパク質含有製剤には安定化剤としてアミノ酸を添加してもよい。安定化剤として添加されるアミノ酸には、遊離のアミノ酸、そのナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩などが含まれる。アミノ酸は 1種又は 2種以上を組み合わせて添カ卩すること力 Sできる。安定化剤として添加されるアミノ酸は特に限定されなレ、が、好ましいアミノ酸としては、ロイシン、トリプトファン、セリン、グノレタミン酸、ァノレギニン、ヒスチジン、リジンを挙げることができる好ましレ、アミノ酸はヒスチジン、アルギニン又はそれらの塩である。また、アミノ酸は L アミノ酸力 S好ましレ、。最も好ましいアミノ酸は L ヒスチジンである。

[0023] アミノ酸の添加量は、使用するアミノ酸の種類により、好ましい範囲を定めることができる。一般には 0.0001〜5%、アルギニンでは好ましくは 0.01〜4%、さらに好ましくは 0.1 〜1%であり、ヒスチジンでは好ましくは 0.05〜1%、さらに好ましくは 0·05〜0·5%、最も好ましくは 0.05〜0.2%である。

[0024] 本発明のタンパク質製剤の ρΗは、 ρΗ6. 5〜7. 5であり、好ましくは ρΗ6. 8〜7. 2 であり、最も好ましくは ρΗが約 7. 0である。

[0025] 本発明の ΕΡ〇含有溶液製剤には好ましくは安定化剤としてヒト血清アルブミンや精製ゼラチンなどのタンパク質を実質的に含まない。現在市場に供給されているタンパク質製剤には、タンパク質の化学的、物理的変化を抑制するために安定化剤としてヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどのタンパク質が添加されているものがある。しカゝしながら、タンパク質を安定化剤として添加することに関しては、ウィルスのコンタミを除去するために非常に煩雑な工程を必要とすることになるなどの問題がある。

[0026] 本発明の溶液製剤に中に含まれる ΕΡΟの量は、一般には 100〜500000IU/ml 、好ましくは 200〜200000IU/ml、さらに好ましくは 750〜： 108000IU/ml、最も好ましくは 1500〜： 108000IU/mlである。

[0027] 本発明の EPO溶液製剤は、 EPO含量力 ¾8000IU/mLである場合、 35°C— 1ケ月間の加速試験後における EPO残存率が 95%以上、好ましくは 97%以上であり、二量体生成率が 1. 0%以下、好ましくは 0. 7%以下であるか、 35°C— 3ヶ月の加速試験後における EP〇残存率が 93%以上、好ましくは 95%以上であり、二量体生成率が 1. 2%以下、好ましくは 1. 0%以下である。

[0028] 本発明の治療剤には、必要に応じて、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、希釈剤、賦形剤、 pH調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。

[0029] 懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソノレべート 80、ヒドロキシェチルセル口ース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシ

[0030] 溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート 80、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸ェチルエステル等を挙げることができる。

[0031] 安定化剤としては、デキストラン 40、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。

[0032] 等張化剤としては例えば、 D—マンニトール、ソルビート、塩化ナトリウム等を挙げること力 Sできる。

[0033] 保存剤としては例えば、ノラオキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸ェチル、ソルビン酸、フエノール、クレゾール、クロ口タレゾール等を挙げることができる。

[0034] 吸着防止剤としてはポロクサマー類以外に、例えば、ヒト血清ァノレブミン、レシチン、デキストラン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を加えてもよレ、。

[0035] 含硫還元剤としては例えば、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセチルホモシスティン、チォタト酸、チォジグリコール、チォエタノールァミン、チォグリセロール、チォソルビトール、チォグリコール酸及びその塩、チォ硫酸ナトリウム、ダルタチオン、炭素原子数 1〜 7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。

[0036] 酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、プチルヒドロキシァエソール、 _α—トコフエロール、酢酸トコフエロール、 L—ァスコルビン酸及びその塩、 Lーァスコルビン酸パルミテート、 Lーァスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリァミル、没食子酸プロピルあるいはェチレンジァミン四酢酸ニナトリウム（EDTA)、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。

[0037] さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩ィ匕カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸力リウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩;クェン酸ナトリウム、クェン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてもよい。

[0038] 本発明の ΕΡ〇溶液製剤は、これらの成分をリン酸緩衝液 (好ましくはリン酸一水素ナトリウムリン酸二水素ナトリウム系）及び/又はクェン酸緩衝液 (好ましくはクェン酸ナトリウムの緩衝液）などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製する。

[0039] 本発明の EP〇溶液製剤は、例えば通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス容器中に収納されている。容器はアンプル、バイアルまたはデイスポーザブル注射器のような規定用量の形状で供給することができ、あるいは注射用バックまたは瓶のような大用量の形状で供給することもできる。プレフィルドシリンジの形で提供することが便利である。

[0040] 本発明の安定化されたタンパク質製剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。

[0041] 本発明はさらに、本発明の EP〇含有溶液製剤の定量、純度試験にも有用な微量タンパク質の定量方法を提供する。

[0042] 従来、タンパク質溶液中の不純物量を求める時には分離能に優れるゲル電気泳動法がよく用いられるが、検出感度は、汎用される高感度染色法である銀染色法において 0.6〜 1.2ng /band程度と良好な感度を有するものの定量性が乏しいため定量法に用いることは不可能である。一方、さらなる感度向上に対しては、 RI標識、及び膜転写後に免疫染色を行う方法があるが、前者については放射能汚染が危惧され、汎用性に乏しいこと、後者については、最高 pgオーダーまで感度は上昇するが、操作の煩雑性によりバラツキを生じ、定量には向かない。

[0043] そこで、本発明は免疫染色と同程度の感度を持ち、且つ汎用性のある微量タンパク質の定性、定量、純度試験法を提供する。

[0044] 本発明の微量タンパク質の定量方法は以下のステップを含む：

1)タンパク質試料と高輝度蛍光色素を結合させる；

2)得られる試料から所望の分析物を適切な分離手段により分離する；

3)所望の分析物を定量して、その量力タンパク質の量を換算する。

[0045] 本発明では感度を上昇させるために、蛍光試薬を用いた。電気泳動を行ったゲルを蛍光染色する蛍光ゲル染色試薬には、 Ruby stainや、 SYPRO orangeなどがある力これらは、銀染色法に比べ定量性は優れているものの検出感度は劣り、また銀染色と同様に泳動後染色であるため、煩雑な染色操作が必要である。一方、今回用いた蛍光試薬 Cyanine Dyeは泳動後染色には向かなレ、が、 NHS (N—ヒドロキシスクシンイミド）、または Maleimideを介してタンパク質と強固な共有結合をすることから、電気泳動の前にタンパク質を染色することができる。また、 Cyanine Dyeにより標識される部位は特定位置（NHSの場合は NH基、また、 Maleimideの場合は SH基）であることから、 Cyanine Dyeと各タンパク質の結合性にバラツキが少なぐ定量性を確保することが可能となった。したがって、上記ステップ 2)における所望の分析物とは、タンパク質と蛍光色素との結合体であり、 NHS、 Maleimideなどを介して結合したものを含む。

[0046] 本発明の方法で、試料中のタンパク質と高輝度蛍光色素を結合させる方法としては、通常一般的なタンパク質の NH基や SH基に蛍光色素を化学結合させる方法であればいかなる方法でもよぐまた市販の各高輝度蛍光色素の Instructionに沿った方法で行ってもよレ、。その反応温度に関しては通常 0°C〜50°Cの範囲内であればよく、具体的には市販の高輝度蛍光色素の各 Instructionに記載してある反応温度を用いいてもよいが、本発明のごとく試料を定量的に測定する場合は、試料のタンパク質を均一に染色するために試料が凍らない範囲で低温条件、好ましくは 0°C〜10°C、さらに好ましくは 0°C〜5°C、最も好ましくは約 1°Cで行うとよい。

[0047] さらに、 Cyanine Dyeを用いることで、数 10pg/bandと免疫染色と同程度以上の検出が可能となり、定性的な試験に用いることができる。さらに、標準品の検量線や、内標準物質を用いることで、微量タンパク質溶液の定量も可能である。また、 10⁴オーダ一以上の定量範囲（数 10pg〜100ng前後/ band)を有し、標準品等を用いなレ、純度試験として 0.1%以下の会合体等の不純物含有量を正確に評価することが可能である。

[0048] カロえて、泳動前に染色することで、使用する試薬量を少なくでき、コストの面からも泳動後染色を行う蛍光試薬よりも優位となった。

[0049] 本発明の高輝度蛍光色素としては、直接或いは NHS、 Maleimideなどを介してタンパク質と強固に共有結合し、 10⁴以上の広い定量範囲 (ダイナミックレンジ)を有する蛍光色素であればいかなるものでもよぐ例えば、 Cy3、 Cy3.5、 Cy5、そして Cy5.5 M ono-reactive Dye (NHSタイプと Maleimideタイプ）（GE Healthcare社製）などの Cyanin e Dye系の色素を用いることができ、 Cy3 Mono-reactive Dyeの NHSタイプが好ましい

[0050] またその他本発明の高感度蛍光色素としては、 Sulfonated Coumarinや Sulfonated r hodamine Dyeである、 Alexa Fluor 350、 405、 430、 488、 532、 546、 555、 568、 594、 63 3、 647、 680、 700、そして 750のタンパク質ラベリングキット（Molecular Probes社製）、さらに HiLyte Fluor 555、 647などのタンパク質ラベリングキット（同人化学社製）などを用レ、ることもできる。

[0051] 本発明の方法で、試料から所望の分析物を適切に分離する手段としては、 SDS-PA GE、キヤピラリー電気泳動、マイクロチップ電気泳動など電気泳動法全般、そして HP LCによるゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトダラフィ一などで分離することが可能で、電気泳動または HPLCでの分離手段が好ましい

[0052] 電気泳動で分離する場合、泳動イメージの取り込みについては、泳動前染色であることから、電気泳動後のゲルの染色操作を必要とせず、ガラスで固定化されたゲルを用いれば、泳動終了後ガラスプレートの表面を水洗後直ぐに蛍光ゲルイメージヤーによる泳動イメージの取り込みが可能となった。

[0053] また、測定前に染色できることから、電気泳動に限らず、蛍光検出器を接続した HP LCなど他の分離手段にも応用可能である。

[0054] 本発明の定量方法を用いて、 EPO含有溶液製剤中の EPOを感度よく定量することができた。さらに、本発明の定量方法は、 EPO以外のタンパク質の定量にも使用できる。後述する実施例に示すように、ヒト型化抗 IL_ 6レセプター抗体である抗体タンパク質 hPM_lや、 BSA (ゥシ血清アルブミン）の定量において、種々の濃度のタンパク質で良好な検量線が得られ、何れの条件においても、非常に高感度で検出することが可能であった。したがって、本発明の方法は、微量タンパク質溶液の定量方法として極めて優れており、その応用範囲は広い。

[0055] 本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。

[0056] なお、以下の実施例において、 EPO試料は、 CHO細胞を用いる遺伝子組換え EP 0 (中外製薬製)を用いた。

実施例

[0057] 実施例 1：処方の疼痛比較試験

二重盲検下で、同一被験者に対し以下の表 1に示す処方 1、処方 2の製剤を片腕ずつに皮下注射した。注射時の痛みの評価を被験者自身が行った。得られた結果を表 2に示す。

[0058] [表 1]

表 1

[0059] [表 2]

被験者内比較による痛みの評価では、処方 1が処方 2よりも痛みが強いとする被験者が 100%であり、処方 2が有意に痛くないことが示された。

実施例 2：処方の安定性試験

以下に示す二種の処方について、安定性を比較するため、 35° C苛酷試験を実施した。 [0060] これらの処方は調製後、無菌濾過を行い、滅菌済みのシリンジに充填、打栓した。試験に用いた処方及び試験結果を表 3に示す。

[0061] [表 3] 表 3

処方 4は処方 3よりも EPOの残存率が高ぐかつ二量体の生成、分解物の生成が顕著に抑制されており、処方 4が安定であることを確認した。

なお、上記の試験では以下の試験方法を用いた。

(1)残存率の測定

液体クロマトグラフ法により測定し、初期品に対して残存率を求めた。使用カラム： 214TP54(Size250mmX4.6mmI.D.粒径 5 zm)： Vydac製

移動相

A:水：ァセトニトリル： TFA = 400:100:1

B：水:ァセトニトリル： TFA= 100 :400:1 A : B = 65 : 35 → A : B = 0 : 100を線形グラジェントで実施した。

(2)二量体の測定

EPO濃度 1250IUに希釈した試料に蛍光試薬（Cy3 Mono-reactive Dyeの NHSタイプ）を溶解した DMSOを加え、 EP〇を標識した後、 SDSを含むサンプルバッファーを加え 50° C-15分加温したもの 15 z Lについて、電気泳動法により試験を行った。電気泳動したゲルをイメージアナライザーで読み込み、二量体のピーク面積％を算出した。

使用ゲル：トリスグリシンゲル 12.5%

(3)低分子量分解物の測定

EPO濃度 3000IUに希釈した試料に SDS、メルカプトエタノールを含むサンプルバッファーを加え 50° C-15分加温したもの 7.5 μ Lにつレ、て、電気泳動法により試験を行つた。抗 ΕΡΟ抗体を用いたウェスタンプロット法により検出し、分解物精製品 25〜500 ng/mLの検量線力も試料の低分子量分解物量を算出した。

使用ゲル：トリスグリシンゲル 8- 16%

実施例 3：界面活性剤種の影響

界面活性剤が EPOの安定性へ与える影響を確認するため、以下の処方にて安定性を確認した。

[0063] これら処方は調製後、無菌濾過を行い、洗浄滅菌したバイアルに充填、打栓した。

試験方法は実施例 2の二量体の測定の方法に従った。試験に用いた処方及び試験結果を表 4に示す。

[0064] [表 4]

ポロクサマーを界面活性剤として用いた処方 10〜14は、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油またはポリソルベートを界面活性剤として用いた処方と比べ、 35°C _ 3ヶ月の加速試験において、二量体生成 J tが顕著に少なぐ安定であった。また、ポロクサマ一系の界面活性剤は全て EPOの二量体生成を抑制した。

実施例 4： EPO含量の安定性に及ぼす影響

pH7.0、界面活性剤としてポロクサマー 188を添カ卩した処方について、 EPO含量の安定性への影響を確認するため安定性試験を行った。

[0065] これら処方は調製後、無菌濾過を行い、滅菌済みのシリンジに充填、打栓した。試験方法は実施例 2の測定の方法に従った。試験に用いた処方及び試験結果を表 5 に示す。

[0066] [表 5] 表 5

ΕΡΟ含量が 1500〜108000IU/mLの処方においては、少なくとも 10° C- 1年は安定であることが確認できた。さらに、本実施例において EP〇/ポロクサマー 188の比率が 0.017〜1.2の範囲でも安定性に問題ないことが確認できた。

*EPO 180000IU = lmg

実施例 5： Cyanine Dye (Cy3)を用いた EPO純度試験法の検討 EPO溶液の調製： EPO標準品 (EPO濃度 lmg/mL)に希釈緩衝液（0.005%の Polys orbate80を含有する 0.1Mリン酸緩衝液（pH⁷.⁴) )を加えて、各々の含量の EPO溶液を調製した。

(1)検出限界の確認

EPO濃度 16.3ng/mL〜2083.3ng/mL及び EPO二量体濃度 2ng/mL〜128ng/mLの溶液 60 μ Lに Cy3 stock solution (Cy3 Mono-reactive Dyeの NHSタイプ 1バイアルを 1 00 z Lの DMSOで溶解）を 2 x L加え、約 1°Cで 4時間反応させた。反応終了後、 SDS を含むサンプルバッファーを 24 μ L加え 50°C- 15分加熱した後、 15 Lを電気泳動に供した。蛍光イメージアナライザ一にて、ゲルを読み込み、検量線を作成し、検出限界を確認した。得られた結果を図 1に示す。

[0067] EPOにおいては、 16.3ng/mL〜2083.3ng/mLの溶液（lWell換算： 174pg〜22.3ng) で、良好な検量線 (R²=0.9965)が得られた。また、 EPO二量体においては、 2ng/mL ではピークの検出ができなかったが、 4₁¾/111し〜128₁¾/111し（1\^11換算：43 _§〜1.371 g)の溶液で、良好な検量線（R²=0.9963)が得られ、 lWellあたり 43pgと非常に高感度で検出することが可能であった。

(2)精度の確認

1250IU/mLの EPO溶液に、 EPO二量体を添加し、 EPOに対して 0.094〜2.256%の

EPO二量体を含有した溶液について、精度の確認を n=4にて実施した。得られた結果を表 6に示す。

[0068] [表 6] 表 6

0.094%で C.V. (変動係数）が約 40%であった力 0.188%以上では 20%以下であり、良好な精度であることが確認できた。

実施例 6： Cyanine Dye (Cy3)を用いた抗体（hPM_l)純度試験法の検討

以下の試験で用いた抗体タンパク質 hPM-1はヒト型化抗 IL— 6レセプター抗体（国際特許出願公開番号 W092— 19759を参照）である。

(1)検出限界の確認

hPM-1 1.25 μ g/mL〜40 μ g/mL及び hPM- 1二量体濃度 2.5ng/mL〜1280ng/mLの溶液 60 z Lに Cy3 stock solution (Cy3 Mono-reactive Dyeの NHSタイプ 1バイアルを 1 00 z Lの DMSOで溶解）を 2 カロえ、約 1°Cで 4時間反応させた。反応終了後、 SDS を含むサンプルバッファーを 24 μ L加え 50°C- 15分加熱した後、 15 μ Lを電気泳動に供した。蛍光イメージアナライザ一にて、ゲルを読み込み、検量線を作成し、検出限界を確認した。得られた結果を図 2に示す。

[0069] hPM-1においては、 1·25 μ §/Γηί〜20 μ g/mLの溶液（lWell換算： 13.4ng〜214ng) で、良好な検量線（R²=0.9965)が得られた。また、 hPM-1二量体においては、 5ng/m Lではピークの検出ができなかった力 101¾/111し〜12801¾/111し（1\^11換算：107 _§〜1 3.7ng)の溶液で、良好な検量線（R²=0.9963)が得られ、 lWellあたり 107pgと非常に高感度で検出することが可能であった。

(2)精度の確認

hPM-1濃度を 10 /i g/mL、二量体量が 0.05〜6.4%となるように調製した溶液について、精度の確認を実施した。得られた結果を表 7に示す。

[0070] [表 7]

最大で C.V.が約 7%であり、良好な精度であることが確認できた。

実施例 7 : Cyanine Dye (Cy5)、 Alexa 647および HiLyte Fluor 647を用いた EPOおよび BSAの純度試験法の検討 (1)検出限界の確認

EPO 10 μ g/mL及び BSA 10 μ g/mLの溶液（それぞれ 0.1Mの NaHCOで調製） 100

3

μ Lに Cy5 stock solution (Cy5 Mono-reactive Dyeの NHSタイプ 1バイアルを 100 μ L の DMSOで溶解）を 3.3 μ L、 Alexa 647 stock solution (Alexa 647の NHSタイプ 1バイアルを 10 μ Lの DMSOで溶解）を 1 μ L、または HiLyte Fluor 647 stock solution (HiLy te Fluor 647の NHSタイプ 1バイアルを 10 μ Lの DMSOで溶解）を 1 μ Lカロえ、約 1。Cで 18時間反応させた。反応終了後、希釈緩衝液（0.005%の Polysorbate80を含有する 0 •1Mリン酸緩衝液（ρΗ7·4) )で公比 3で 6濃度 0.046ng/mL〜l l. lng/mL (0.34 pg/well 〜8·3 pg/wellに相当）に希釈した。希釈後、それぞれ 40 μ Lに SDSを含むサンプノレバッファーを 20 z L加え 50°C_ 15分加熱した後、 10 z Lを電気泳動に供した。蛍光ィメージアナライザ一にて、ゲルを読み込み、検量線を作成し、検出限界を確認した。 EP 〇について得られた結果を図 3に、また BSAについて得られた結果を図 4に示す。図 3、図 4から明らかなように EPOおよび BSAの両方において、 0.046ng/mL〜l l. ln g/mLの溶液（lWell換算： 0.34 pg/well〜8.3 pg/well)で、良好な検量線が得られ、何れの条件においても、 lWellあたり 0.34pgと非常に高感度で検出することが可能であつに。

実施例 8：マイクロ電気泳動システムにおけるプレスティンによる高感度化検討 (1)検出限界の確認

BSA lmg/mLの溶液（0.1Mの NaHCOで調製） 100 μ Lに Cy5 stock solution (Cy5 M

3

ono-reactive Dyeの NHSタイプ 1バイアルを 100 β Lの DMSOで溶解）を 3·3 β L、 Alex a 647 stock solution (Alexa 647の NHSタイプ 1バイアルを 10 β Lの DMSOで溶解）を 1 μ L、または HiLyte Fluor 647 stock solution (HiLyte Fluor 647の NHSタイプ 1バイァルを 10 μ Lの DMSOで溶解）を 1 μ L加え、約 1°Cで 18時間反応させた。反応終了後、希釈緩衝液（0.005%の Polysorbate80を含有する 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4) )で公比 2で 10濃度 0.046mg/mL〜50ng/mLに希釈した。希釈後はマイクロチップ電気泳動システムのプロトコールに従って測定を行レ、、同システムによって得られた値から、検量線を作成し、検出限界を確認した。 Cy5で得られた結果を図 5に、 Alexa 647で得られた結果を図 6に、 HiLyte Fluor 647で得られた結果を図 7に示す。図 5〜7から明らかなように、全てのタイプの蛍光色素において、良好な検量線が得られた。本検討で使用したマイクロチップ電気泳動システムの測定法に従って同じ BS Aを測定した際の結果と比較して 250倍以上の高感度化を実現し得た。

Claims

請求の範囲

[I] ポロクサマー類を含み、 pHが 6·5〜7·5である、エリスロポエチン含有溶液製剤。

[2] ポロクサマーがポロクサマー 188である請求項 1記載の製剤。

[3] さらに、安定化剤としてアミノ酸又はその塩を含む請求項 1記載の製剤。

[4] アミノ酸がヒスチジン、アルギニン又はそれらの塩である請求項 3記載の製剤。

[5] pH力 S、 6.8〜7.2である、請求項 1〜4のいずれかに記載の製剤。

[6] ポロクサマー類を含み、安定化剤として L ヒスチジンを含み、かつ pH力 ¾.8〜7.2である、エリスロポエチン含有溶液製剤。

[7] 安定化剤としてのタンパク質を含まなレ、、請求項 1〜6のいずれかに記載の製剤。

[8] 安定化剤として糖類を含まない、請求項 1〜7のいずれかに記載の製剤。

[9] ポロクサマー類を添加することを含む、エリスロポエチン含有溶液製剤の長期保存後におけるエリスロポエチン二量体の生成を抑制する方法。

[10] 以下のステップを含む微量タンパク質の定量方法：

1)タンパク質試料と高輝度蛍光色素を結合させる；

[II] 高輝度蛍光色素が Cyanine Dye系色素である請求項 10記載の方法。

[12] 高輝度蛍光色素が Cy3である請求項 11記載の方法。

[13] 分離手段が電気泳動または高速液体クロマトグラフィー（HPLC)である請求項 10〜

12記載の方法。

[14] 微量タンパク質がエリスロポエチンである請求項 10〜： 13のいずれかに記載の方法。