CZ304855B6 - Kapalná farmaceutická kompozice obsahující pegylovaný lidský erythropoetin, způsob její přípravy, léčivo pro léčení chorob korelujících s anemií při chronickém renálním selhání a zařízení s jejím obsahem - Google Patents
Kapalná farmaceutická kompozice obsahující pegylovaný lidský erythropoetin, způsob její přípravy, léčivo pro léčení chorob korelujících s anemií při chronickém renálním selhání a zařízení s jejím obsahem Download PDFInfo
- Publication number
- CZ304855B6 CZ304855B6 CZ2002-4005A CZ20024005A CZ304855B6 CZ 304855 B6 CZ304855 B6 CZ 304855B6 CZ 20024005 A CZ20024005 A CZ 20024005A CZ 304855 B6 CZ304855 B6 CZ 304855B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- composition
- composition according
- epo
- erythropoietin
- mmol
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Virology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Kapalná farmaceutická kompozice, která obsahuje pegylovaný lidský erythropoetinový protein, anorganický anion s vícenásobným nábojem, kterým je sulfátový anion, ve farmaceuticky vhodném pufru vhodném pro udržení hodnoty pH roztoku v rozmezí od 5,5 do 7,0, a popřípadě jeden nebo více farmaceuticky vhodných excipientů, přičemž tato kapalná kompozice je stálá při teplotě místnosti. Způsob její přípravy smícháním pegylovaného lidského erythropoetinového proteinu s roztokem obsahujícím anion s vícenásobným nábojem, kterým je sulfátový anion, a popřípadě jedním nebo více farmaceuticky vhodnými excipienty a nastavením hodnoty ph farmaceuticky vhodným pufrem na rozmezí 5,5 až 7,0. Použití této kompozice pro přípravu léčiva vhodného pro léčení a prevenci chorob korelujících s anemií při chronickém renálním selhání pacientů (CRF), AIDS a/nebo pro léčení pacientů postižených rakovinou, kteří jsou podrobeni chemoterapii. Zařízení pro lokální nebo systemické prodloužené uvolňování, které obsahuje výše uvedenou kompozici, a je zvoleno ze souboru sestávajícího z implantátu, injekční stříkačky a inhalátoru.
Description
Kapalná farmaceutická kompozice obsahující pegylovaný lidský erythropoetin, způsob její přípravy, léčivo pro léčení chorob korelujících s anemií při chronickém renálním selhání a zařízení s jejím obsahem
Oblast techniky
Vynález se týká kapalné farmaceutické kompozice obsahující pegylovaný lidský erythropoetin, způsobu její přípravy, léčiva pro léčení chorob korelujících s anemií při chronickém renálním selhání a zařízení s jejím obsahem. Tato kompozice je tedy užitečná zejména při profylaxi a léčení chorob souvisejících s erythropoézou.
Dosavadní stav techniky
Erythropoéza je produkce červených krvinek, která kompenzuje jejich úbytek vyvolaný destrukcí. Erythropoéza je řízeným fysiologickým mechanismem, který zpřístupňuje dostatečný počet krvinek pro správné okysličování tkání. Přirozený lidský erythropoetin (hEPO) vzniká v ledvinách aje humorálním plasmatickým faktorem, který stimuluje tvorbu červených krvinek (Camot, P. a Deflandre, C., 1906, C. R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, A. J., 1953 Blood 8: 349; Reissmann, K. R., 1950, Blood 5: 372; Jacobson, L. O., Goldwasser, E., Freid, W. a Plzak L. F., 1957, Nátuře 179: 6331 až 6334). Přirozený EPO stimuluje dělení a diferenciaci determinovaných erythroidních progenitorů v kostní dřeni a uplatňuje svou biologickou aktivitu vazbou k receptorům na erythroidních prekursorech (Krantz, B. S., 1991, Blood 77, 419).
Erythropoetin je vyráběn biosynteticky za použití technologie rekombinantní DNA (Egrie J. C., Strickland T. W., Lané, J. et al., 1986, Immunobiol. 72, 213 až 224) aje produktem klonovaného genu lidského EPO insertovaného do buněk tkáně vaječníku čínského křečka (buněk CHO), v nichž je exprimován. Primární struktura převládající, plně upravené formy hEPO je uvedena v SEQ ID NO: 1. V této struktuře jsou dva disulfidové můstky mezi Cys7-Cys161 a Cys29-Cys33. Molekulová hmotnost polypeptidového řetězce EPO bez cukerných zbytků je 18 236 Da. V intaktní molekule EPO asi 40 % molekulové hmotnosti připadá na sacharidové skupiny, které glykosylují protein na glykosylačních místech proteinu (Sasaki, H., Bothner, B., Dell, A., a Fukuda, M., 1987, J. Biol. Chem. 262, 12059).
Jelikož je lidský erythropoetin nezbytný při tvorbě červených krvinek, je tento hormon užitečný při léčení krevních poruch charakterizovaných nízkou nebo defektní tvorbou červených krvinek. Klinicky se EPO používá při léčení anémie u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF) (Eschbach, J. W., Egri, J. C., Downing, M. R. et al., 1987, NEJM 316, 73 až 78; Eschbach, J. W., Abdulhadi, Μ. H., Browne, J. K. et al., 1989, Ann. Intem. Med., 111, 992; Egrie, J. C. Eschbach, J. W., McGuire, T., Adamson, J. W., 1988, Kidney Intl. 33, 262; Lim, V. S.; Degowin, R. L., Zavala, D. et al., 1989, Ann Intem. Med. 110, 108 až 144), u pacientů trpících AIDS a onkologických pacientů, kteří prodělávají chemoterapii (Danna, R. P., Rudnick, S. A., Abels, R. I. MB, ed. Gamick, Erythro-poietin in Clinical Applications - An International Perspective, New York, NY, Marcel Dekker; 1990, str. 301 až 324).
Známé farmaceutické kompozice vykazují alespoň jednu z následujících nevýhod:
-jedná se o lyofilizáty. Kromě komplikovaného výrobního postupu jsou lyofilizáty nevýhodné, jelikož je nutné je před injekčním podáním člověku rekonstituovat. To pro zdravotní personál přináší nutnost další manipulace, což je nevýhodné, a vzniká tak riziko nesprávné manipulace s farmaceutickým produktem;
-jako pomocnou přísadu obsahují lidský sérový albumin. Lidský sérový albumin je produktem, který prochází z lidské tělesné tekutiny, a existuje riziko virových infekcí z kontaminantů albuminového přípravku. Také může docházet k alergickým reakcím;
- 1 CZ 304855 B6
- všechny erythropoetinové kompozice, které jsou v současné době dostupné na trhu, jsou nestabilní při zvýšených teplotách, tj. teplotách vyšších než je obvyklá teplota v chladničce, tj. teplota 2 až 8 °C. Je nutno je tudíž skladovat v chladničce (2 až 8 °C) a nelze je skladovat při teplotě místnosti (asi 20 °C). To vede ke zvýšení nákladů, vyvolanému skladováním a dopravováním při nízké teplotě, a také ztížené manipulaci s léčivem. Pod pojmem „nestabilní“ se v tomto kontextu rozumí, že skladování při zvýšených teplotách, například při 25 °C, po delší dobu (tj. dobu několika měsíců nebo více než 6 měsíců) vede k degradaci proteinu. Degradací se v tomto kontextu rozumí fyzikální změny (například agregace nebo denaturace) a chemické změny (například oxidace nebo obecně změna chemických vazeb) molekuly proteinu, o nichž je známo, že přednostně probíhají při zvýšených teplotách (nad 8 °C). Při inkubaci proteinu při teplotě, která je blízká jeho přechodové teplotě (která je také označována jako teplota tání) nebo je vyšší, dochází k rozvinutí proteinu, tj. jeho nativní struktury, a ke ztrátě jeho biologické aktivity. Přechodová teplota úzce souvisí s tepelnou stabilitou proteinu a závisí na prostředí proteinu (například pH, solích, iontové síle, tlumivé látce atd.). Denaturace například může vést k agregaci molekul erythropoetinu, tj. tvorbě dimerů (kovalentních nebo nekovalentních), agregátů vyššího řádu, a dokonce i částic. To snižuje účinnost léčiva a po injekčním podání člověku může dojít k nežádoucím vedlejším účinkům.
Úkolem tohoto vynálezu je tedy vyvinout kompozici, která umožní minimalizovat nebo potlačit výše uvedené nevýhody.
Podstata vynálezu
Prvním aspektem předmětu vynálezu v hlavním provedení i) je kapalná farmaceutická kompozice, která obsahuje pegylovaný lidský erythropoetinový protein, anorganický anion s vícenásobným nábojem, kterým je sulfátový anion, ve farmaceuticky vhodném pufru vhodném pro udržení hodnoty pH roztoku v rozmezí od 5,5 do 7,0, a popřípadě jeden nebo více farmaceuticky vhodných excipientů, přičemž tato kapalná kompozice je stálá při teplotě místnosti.
Přednostní provedení tohoto aspektu předmětu vynálezu zahrnují zejména ii) kompozici podle provedení i), která je vodným roztokem;
iii) kompozici podle provedení i) nebo ii), která je isotonickým roztokem;
iv) kompozici podle provedení i), která obsahuje 10 až 200 mmol/1 sulfátu;
v) kompozici podle některého z provedení i) až iv), která má pH 5,8 až 6,7;
vi) kompozici podle provedení v), která má pH 6,0 až 6,5;
vii) kompozici podle provedení vi), která má pH 6,2;
viii) kompozici podle některého z provedení i) až vii), ve které je že pufr je zvolen ze souboru sestávajícího z fosforečnanového pufru a arginin/H2SO4/Na2SO4 pufru;
ix) kompozici podle provedení viii), ve které je že pufrem je 10 až 50 mmol/1 fosforečnanový pufr;
x) kompozici podle některého z provedení i) až ix), která obsahuje jeden nebo více farmaceuticky vhodných excipientů;
xi) kompozici podle provedení x), ve které je jeden nebo více farmaceutických excipientů zvoleno ze souboru sestávajícího z farmaceuticky vhodných solí, ředidel, rozpouštědel a konzervačních látek;
xii) kompozici podle provedení x) nebo xi), ve které jsou farmaceuticky vhodné excipienty zvoleny ze souboru sestávajícího z ionizačních činidel, polyolů, antioxidantů a neiontových detergentů;
xiii) kompozici podle některého z provedení x) až xii), ve které je farmaceuticky vhodným excipientem polyol;
-2CZ 304855 B6 xiv) kompozici podle provedení xiii), ve které je polyol zvolen ze souboru sestávajícího z mannitolu, sorbitolu, glycerolu, trehalózy a sacharózy;
xv) kompozici podle provedení xiv), ve které je že polyolem je mannitol;
xvi) kompozici podle některého z provedení x) až xv), která obsahuje antioxidant;
xvii) kompozici podle provedení xvi), ve které je antioxidantem methionin;
xviii) kompozici podle některého z provedení x) až xvii), která obsahuje nejvýše 1 mmol/1 chloridu vápenatého;
xix) kompozici podle některého z provedení xii) až xviii), ve které je neiontovým detergentem polysorbate 80, polysorbate 20 nebo poloxamer 188;
xx) kompozici podle provedení xix), ve které je neiontovým detergentem poloxamer 188;
xxi) kompozici podle provedení xix) nebo xx), která obsahuje 0 až 1 % (hmotn./objem) neiontového detergentů;
xxii) kompozicí podle některého z provedení xix) až xxi), která obsahuje 0 až 0,1 % (hmotn./objem) neiontového detergentů;
xxiii) kompozici podle některého z provedení i) až xxii)m ve které je erythropoetinovým proteinem konjugát, přičemž tento konjugát obsahuje lidský erythropoetinový glykoprotein s alespoň jednou volnou aminoskupinou, přičemž tento glykoprotein je kovalentně vázán k „n“ poly(ethylenglykol)ovým skupinám obecného vzorce
-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-C)R, kde
-CO každé poly(ethylenglykol)ové skupiny tvoří amidovou vazbu sjednou zvýše uvedených aminoskupin;
R představuje lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku;
x představuje 2 nebo 3;
m představuje asi 450 až asi 900;
n představuje 1 až 3; a n a m jsou zvoleny tak, že molekulová hmotnost konjugátu snížená o molekulovou hmotnost erythropoetinového glykoproteinů je 20 až 100 kDa;
xxiv) kompozici podle provedení xxiii), která obsahuje erythropoetinový protein obecného vzorce I
P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I) kde x, m, n a R mají význam uvedený výše, a P představuje zbytek glykoproteinů bez n aminoskupiny nebo aminoskupin, které tvoří amidovou vazbu se skupinou nebo skupinami poly(ethylenglykol)u;
xxv) kompozici podle provedení xxiv), u níž v obecném vzorci I x představuje číslo 2, m představuje číslo 650 až 750, n představuje číslo 1 a R představuje methylskupinu;
xxvi) ; kompozici podle některého z provedení i) až xxii), ve které je erythropoetinovým proteinem konjugát, přičemž tento konjugát obsahuje lidský erythropoetinový glykoprotein obsahující alespoň jednu volnou aminoskupinu, přičemž tento glykoprotein je kovalentně vázán k 1 až 3 alkoxypoly(ethylenglykol)ovým skupinám, z nichž každá obsahuje v alkoxy skupině, která je přímá nebo rozvětvená, 1 až 6 atomů uhlíku aje ke glykoproteinů kovalentně vázána prostřednictvím spojovací skupiny vzorce -C(O)-X-S-Y-, kde
-3 CZ 304855 B6
C(O) této spojovací skupiny tvoří amidovou vazbu s jednou z uvedených aminoskupin;
X představuje skupinu -(CH2)k- nebo -CH2(O-CH2CH2)k-, kde k představuje číslo 1 až 10, a
Y představuje některou ze skupin vzorce
tt průměrná molekulová hmotnost každého poly(ethylenglykol)ového zbytku je asi 20 až asi 40 io kDa a molekulová hmotnost konjugátu je asi 51 až asi 175 kDa;
xxvii) kompozici podle provedení xxvi), ve které je erythropoetinovým proteinem konjugát obecného vzorce — . o o n představuje celé číslo od 1 do 3; m představuje celé číslo od 450 do 900; R představuje lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku; X představuje skupinu -(CH2)k- nebo -(CH2(O-CH2-CH2)k-, a P představuje zbytek erythropoetinového proteinu bez aminoskupiny nebo aminoskupin, které tvoří amidovou vazbu s X;
xxviii) kompozici podle provedení xxvii), ve které je erythropoetinovým proteinem konjugát obecného vzorce
kde n představuje celé číslo od 1 do 3; m představuje celé číslo od 450 do 900; R představuje lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku; X představuje skupinu -(CH2)k- nebo
-4CZ 304855 B6
-CH2(O-CH2-CH2)k- a P představuje zbytek erythropoetinového glykoproteinu bez aminoskupiny nebo aminoskupin, které tvoří amidovou vazbu s X;
xxix) kompozici podle některého z provedení i) až xxviii), která obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu na ml;
xxx) kompozici podle některého z provedení i) až xxix), která obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu na ml, 10 až 200 mmol/1 sulfátu a 10 až 50 mmol/1 fosfátu a pH je 6,5 až 6,5;
xxxi) kompozici podle provedení xxx), která obsahuje 20 mM methioninu, 1 až 5% (hmotn./objem) polyol, 0 % až 0,1 % (hmotn./objem) poloxamer 188 a popřípadě nejvýše lmM chlorid vápenatý;
xxxii) kompozici podle provedení xxix) až xxxi), která obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu v lml, 40 mmol/litr sulfátu, 10 mmol/litr fosfátu, 3 % (hmotn./objem) mannitolu, lOmM methioninu, 0,01 % (hmotn./objem) poloxameru 188, při pH 6,2;
xxxiii) kompozici podle provedení i) až xxix), která obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu v 1 ml, 10 až 100 mmol/litr chloridu sodného, 10 až 50 mmol/litr fosfátu, pH je 6,0 až 7,0 a kompozice popřípadě obsahuje i) až 5 % (hmotn./objem) polyolu;
xxxiv) kompozici podle provedení xxxiii), která obsahuje maximálně do 20mM methioninu, 0 % až 0,1 % (hmotn./objem) poloxameru 188 a popřípadě 7,5 pmol/litr chloridu vápenatého;
xxxv) kompozici podle provedení xxxiii) nebo xxxiv), která obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu v 1 ml, 100 mmol/litr chloridu sodného, lOmM methioninu, 0,01 % (hmotn./objem) poloxameru 188 a 10 mmol/litr fosfátu a pH je 7,0;
xxxvi) kompozici podle provedení i) až xxix), která obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu v 1 ml, 10 až 50 mmol/litr argininu, pH je 6 až 6,5 a kompozice dále obsahuje 10 až 100 mmol/litr síranu sodného;
xxvii) kompozici podle provedení xxxvi), která obsahuje 20mM methioninu, 0 až 0,1 % (hmotn./objem) poloxameru 188, popřípadě nejvýše 1 mmol/litr chloridu vápenatého a popřípadě i) až 5 % (hmotn./objem) polyolu;
xxxviii) kompozici podle provedení xxxvi) nebo xxxvii), která obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu v 1 ml, 40 mmol/litr argininu, pH je 6,2 a kompozice dále obsahuje 30 mmol/litr síranu sodného, 3 % (hmotn./objem) mannitolu, lOmM methioninu, 0,01 % (hmotn./objem) poloxameru 188 a popřípadě 1 mmol/litr chloridu vápenatého;
ixl) kompozici podle provedení i) až xxix), která obsahuje 25 až 2500 pg/ml erythropoetinového proteinu a
a) 1 OmM fosforečnan sodného/draselného, 100 mM chlorid sodný, pH 7,0 nebo
b) lOmM fosforečnan sodný, 120mM síran sodný, pH 6,2 nebo
c) lOmM fosforečnan sodný, 40mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, pH 6,2 nebo
d) lOmM fosforečnan sodný, 40mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotn./objem) poloxamer 188, pH 6,2 nebo
e) 40mM arginin, 30mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, pH 6,2 nebo
f) 40mM arginin, 30mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotn./objem) poloxamer 188, pH 6,2;
xl) kompozici podle provedení i) až ixl), ve které je že množství erythropoetinového proteinu je 50, 100,400, 800 nebo 2500 pg/ml;
xii) kompozici podle provedení xl), která obsahuje lOmM fosforečnan sodný, 4mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol; lOmM methionin, 0,01% (hmotn./objem) poloxamer 188, pH 6,2;
xiii) kompozici podle provedení xl), která obsahuje 40mM arginin, 30mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotn./objem) poloxamer 188, pH 6,2;
-5CZ 304855 B6 xliii) kompozici podle provedení i) až xlii), ve které má erythropoetinový protein aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2;
Dalším aspektem předmětu vynálezu v provedení iliv) je způsob přípravy kompozice podle některého z provedení i) až xl iii), při němž se smíchá pegylovaný lidský erythropoetinový protein s roztokem obsahujícím anion s vícenásobným nábojem, kterým je sulfátový anion, a popřípadě jedním nebo více farmaceuticky vhodnými excipienty a hodnota pH se farmaceuticky vhodným purem nastaví na rozmezí 5,5 až 7,0.
Ještě dalším aspektem předmětu vynálezu v provedení i lv) použití kompozice podle některého z provedení xliii) pro přípravu léčiva vhodného pro léčení a prevenci chorob korelujících s anémií při chronickém renálním selhání pacientů (CRF), AIDS a/nebo pro léčení pacientů postižených rakovinou, kteří jsou podrobeni chemoterapii.
Konečně je aspektem předmětu vynálezu (provedení xlvi) také zařízení pro lokální nebo systemické prodloužené uvolňování, vyznačující se tím, že obsahuje kompozici podle některého z nároků 1 až 43, přičemž toto zařízení je zvoleno ze souboru sestávajícího z implantátu, injekční stříkačky a inhalátoru.
Ve výše uvedené charakterizaci předmětu vynálezu jsou použité povrchově aktivní látky označovány zavedenými generickými názvy INN. Pro přehlednost je jejich význam uveden níže: polysorbate 20 = polyoxyethylen(20)sorbitan monolaurát;
polysorbate 80 = polyoxyethylen(20)sorbitan monooleát.
poloxamer 188 = trojblokový kopolymer skládající se z centrálního hydrofobního řetězce polyoxypropylenu lemovaného dvěma hydrofilními řetězci polyoxyethylenu. Ve všech případech se jedná o komerční produkt Pluronic F68.
V dalším popisu je vynález příležitostně objasňován v širším kontextu než odpovídá rozsahu, který je skutečně předmětem tohoto vynálezu. Výslovně se proto uvádí, že do rozsahu vynálezu spadají jen aspekty explicitně uvedené výše, a jen ty jsou také předmětem připojených patentových nároků. Následující popis má jen ilustrativní význam.
S překvapením se zjistilo, že erythropoetinová kompozice podle vynálezu vykazuje zlepšenou stabilitu při teplotách vyšších než je teplota v chladničce (2 až 8 °C), zejména při teplotě místnosti (tj. pod 25 °C), a dokonce i při teplotách vyšších, například při 40 °C. To znamená, že kompozici je možno skladovat po prodlouženou dobu bez chlazení, aniž by došlo k významnému úbytku aktivity a významné degradaci.
Následující definice ilustrují a udávají význam a rozsah různých pojmů, kterých se dále používá při popisu tohoto vynálezu, pokud není uvedeno jinak.
Pod pojmem „anorganický anion s vícenásobným nábojem“ se rozumí anorganický anion se dvěma nebo více zápornými náboji na molekulu, například síranový, SO4 2, nebo fosforečnanový, tj. hydrogenfosforečnanový, HPO32“, anion. Anorganický anion s vícenásobným nábojem je možno přidat ve formě odpovídající soli, například sodné soli, draselné soli a jejich směsí, a/nebo ve formě pufrovací přísady, například fosforečnanového pufru.
Pojmem „isomolámí nebo isotonický“ se označuje roztok, který lze mísit s tělesnými tekutinami, aniž by působil na jejich složky. Roztoky, které jsou isotonické vzhledem ke krvi, jako 0,9% chlorid sodný, mají stejný osmotický tlak jako sérum, takže nepůsobí na membrány červených krvinek. Obecně roztoky isotonické vzhledem ke krvi vykazují hodnotu 290 mosm/kg H2O.
Pod pojmem „silná anorganická kyselina“ se rozumí anorganická kyselina, která v IN roztoku vykazuje 20 až 100% disociaci, například kyselina sírová.
-6CZ 304855 B6
Přívlastkem „farmaceuticky vhodné“ se v tomto textu označují pufry nebo soli, které jsou přijatelné z hlediska toxicity.
Pod pojmem „ředidlo“ se rozumí složka přípravku bez farmakologické aktivity, která je však farmaceuticky nezbytná nebo žádoucí. Ředidlem například může být kapalina, v níž se rozpouští léčivo (léčiva) k injekčnímu podání, například voda.
Pod pojmem „rozpouštědlo“ se rozumí kapalina, která jinou látku udržuje v roztoku, tj. rozpouští ji, například voda.
Pojmem „konzervační přísady“ se označují látky, které se k farmaceutickým kompozicím přidávají, aby se zabránilo bakteriálnímu růstu, například benzalkoniumchlorid nebo benzylalkohol.
Pod pojmem „polyol“ se rozumí jakákoliv látka obsahující větší počet hydroxyskupin, jako vícemocný alkohol nebo sacharid. Jako vícemocné alkoholy je možno uvést takové sloučeniny, jako sorbitol, mannitol a glycerol. Sacharidy jsou cyklické molekuly, které mohou obsahovat ketoskupinu nebo skupinu aldehydu, jako například sacharóza nebo trehalóza.
Pod pojmem „erythropoetin“ nebo „erythropoetinový protein“ se rozumí protein, jehož biologická aktivita in vivo spočívá v tom, že vede buňky kostní dřeně ke zvýšení produkce retikulocytů a červených krvinek, a který je zvolen ze souboru sestávajícího z lidského erythropoetinu a jeho analog definovaných dále.
Pod pojmem „pegylovaný erythropoetin (peg-EPO nebo PEG-EPO)“ se rozumí erythropoetinový protein, k němuž jsou kovalentně vázány 1 až 3 polyethylenglykolové deriváty popsané dále.
Pod pojmem „zařízení“ se rozumí přístroj pro specifický účel. Podle tohoto vynálezu je takovým účelem umožnění, podpora nebo usnadnění podávání kapalné farmaceutické kompozice.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je uvedena primární struktura lidského EPO (165 aminokyselin) (SEQ ID NO: 1).
Na obr. 2 je uvedena primární struktura lidského EPO (166 aminokyselin) (SEQ ID NO: 2).
Na obr. 3 je graficky znázorněna závislost tepelné stability na hodnotě pH. Přechodová teplota je v grafu vynesena proti hodnotě pH.
Na obr. 4 je graficky znázorněna závislost tepelné stability na iontové síle. Přechodová teplota je v grafu vynesena proti koncentraci fosforečnanu.
Na obr. 5 je graficky znázorněna závislost tepelné stability na pufrovací látce.
Na obr. 6 je znázorněno, že síran je vhodným pufřem/pomocnou látkou také pří nízkém pH (například pH 6,2), zatímco fosforečnan je při pH 6,2 méně vhodný oproti pH 7,5. To ukazuje, že síran udržuje vysokou tepelnou stabilitu, dokonce i při nízkém pH.
Na obr. 7 je znázorněna závislost agregace peg-EPO na pH. Vzorky peg-EPO se po tepelném stresování (jak je popsáno výše) analyzují pomocí SDS-PAGE. Proteiny se obarví stříbrem. Pás 1: standard molekulová hmotnosti. Pás 2: pH 5. Pás 3: pH 5, redukce. Pás 4: pH 6. Pás 5: pH 6, redukce. Pás 6: pH 6,5. Pás 7: pH 6,5 redukce. Pás 8: pH 7. Pás 9: pH 7, redukce, Pás 10: pegEPO nepodrobený tepelnému stresu.
-7CZ 304855 B6
Na obr. 8 je znázorněno, že použití acetylcysteinu (1 mg/ml) jako antioxidantu zabraňuje tvorbě agregátů za tepelného stresu. Agregace peg-EPO za tepelného stresu (20 minut při 80 °C): Pás 1: peg-EPO při pH 7,5, tepelně nestresovaný; Pás 2: peg-EPO při pH 7,5, stresovaný; Pás 3: pegEPO při pH 6,2, stresovaný. Pás 4: peg-EPO při pH 6,2, stresovaný. Pás 5: peg-EPO při pH 7,5 +1 mg/ml N-acetylcysteinu, stresovaný; pás 6: peg-EPO při pH 7,5 + 1 mg/ml N-acetylcysteinu, stresovaný, redukce.
Na obr. 9 je znázorněn obsah kyseliny sialové (NANA) ve vzorcích peg-EPO v nových formulacích skladovaných po dobu 6 měsíců při různých teplotách.
Na obr. 10 jsou znázorněny výsledky stanovení biologické aktivity vzorků peg-EPO po óměsíčním skladování v lOmM fosforečnanu sodném, 40mM síranu sodném, 3% (hmotn./objem) mannitolu, pH 6,2, při několika různých teplotách, prováděného na myších.
Na obr. 11 jsou v zákrytu vyrovnány chromatogramy z gelové filtrace vzorků peg-EPO skladovaných 6 měsíců v lOmM fosforečnanu sodném, 40mM síranu sodném, 3 % (hmotn./objem) mannitolu, pH 6,2 (zdola nahoru: pufr, výchozí látka, 4, 25, 30 a 40 °C).
Konkrétněji je předmětem vynálezu farmaceutická kompozice, která obsahuje erythroproteinový protein, anorganický anion s vícenásobným nábojem ve farmaceuticky vhodném pufru, který je vhodný pro udržení pH v rozmezí od asi 5,5 do asi 7,0, a popřípadě jeden nebo více farmaceuticky vhodných excipientů.
V přednostním provedení je kompozicí kapalný roztok, například vodný roztok. V přednostním provedení je výše uvedenou farmaceutickou kompozicí isotonický roztok.
Anion je přednostně zvolen ze souboru sestávajícího z aniontů odvozených od silných anorganických kyselin, jako kyseliny sírové (H2SO4), kyseliny fosforečné (H3PO4), nebo kyseliny citrónové. Přednost se dává aniontům zvoleným ze souboru sestávajícího ze síranového, fosforečnanového a citranového aniontu, výhodněji ze síranového a fosforečnanového, a nejvýhodněji síranového aniontu. Koncentrace anorganického aniontu s vícenásobným nábojem může kolísat v rozmezí od 10 do 200 mmol/1, například v případě síranového aniontu v rozmezí od 10 do 200 mmol/1.
Pufrem, kterého se podle vynálezu používá pro udržení hodnoty pH v rozmezí od 5,5 do 7,0, přednostně od 5,8 do 6,7, výhodněji od 6,0 do 6,3, a nejvýhodněji na hodnotě 6,2, mohou být obvyklé pufry obsahující organické nebo anorganické kyseliny (například fosforečnanový pufr, pufrovací systém arginin/H2SO4/Na2SO4 nebo jakýkoliv jiný farmaceuticky vhodný pufrovací systém). V přednostním provedení kompozice obsahuje fosforečnanový nebo arginin/H2SO4/Na2SO4 pufr, výhodněji fosforečnanový pufr v koncentraci 10 až 50 mmol/1. Do rozsahu vynálezu samozřejmě spadají i kombinace těchto pufrovacích systémů. Hodnotu pH je možno upravit odpovídající bází, například hydroxidem sodným ve fosforečnanovém pufrovacím systému, nebo odpovídající kyselinou, například kyselinou sírovou v argininovém pufrovacím systému.
Kompozice podle vynálezu může obsahovat jeden nebo více farmaceuticky vhodných excipientů. Tyto farmaceuticky vhodné excipienty mohou být zvoleny z farmaceuticky vhodných solí, ředidel a/nebo rozpouštědel a/nebo konzervačních látek atd,, například činidel upravujících tonicitu (isotonizačních činidel), polyolů, antioxidantů a neiontových detergentů. Jako příklady těchto látek je možno uvést chlorid sodný, chlorid vápenatý, sorbitol, mannitol, glycerol, sacharózu, trehalózu, acetylcystein, polysorbate 20, polysorbate 80 nebo pluronic F68.
V přednostním provedení farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou obsahovat polyol zvolený ze souboru sestávajícího z mannitolu, sorbitolu, glycerolu, trehalózy a sacharózy, přednostně mannitol. Koncentrace polyolu může kolísat v rozmezí od 1 do 10 % (hmotnost/objem).
-8CZ 304855 B6
Jako příklady antioxidantů je možno uvést cystein, methionin, acetylcystein nebo kyselinu askorbovou, přednostně methionin. Antioxidanty lze obvykle přidávat v koncentraci od 0,01 do 0,5 % (hmotnost/objem), nebo v případě methioninu v koncentraci 1 až 20mM.
Výše popsané kompozice také popřípadě mohou obsahovat isotonizační činidlo v množství od asi 0,01 do asi 0,9 % hmotn. Tyto látky jsou v tomto oboru známy a jako jejich příklady je možno uvést chlorid sodný nebo síran sodný. V přednostním provedení jsou kompozice podle vynálezu isotonickými roztoky. Výše popsané kompozice také mohou obsahovat neiontové detergenty, jako polysorbate 20, polysorbate 80 nebo pluronic F 68, přednostně pluronic F 68, například až v 1% (hmotnost/objem) koncentraci, výhodněji až v 0,1% (hmotnost/objem) koncentraci, například 0,001 až 0,01% (hmotnost/objem).
Výše popsané kompozice také mohou obsahovat přídavné soli, například chlorid vápenatý v koncentraci až 1 mmol/1.
Tento vynález je zvláště užitečný při přípravě farmaceutických kompozic, které jako účinnou přísadu obsahují erythropoetin. Pojmy „erythropoetin“ nebo „erythropoetinový protein“ nebo „EPO“ mají dále uvedený význam. Zejména se pod nimi rozumí glykoprotein, například lidský erythropoetin, například s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2 nebo aminokyselinovou sekvencí, která je s nimi v podstatě homologní, jehož biologické vlastnosti spočívají ve stimulaci produkce červených krvinek a stimulaci dělení a diferenciace determinovaných erythroidních progenitorů v kostní dřeni. Do rozsahu těchto pojmů, jak se jich používá v tomto textu, spadají takové proteiny modifikované záměrně, jako jsou proteiny modifikované místně cílenou mutagenezí, nebo náhodně modifikované mutacemi. Do rozsahu těchto pojmů také spadají analoga s 1 až 6 přídavnými glykosylačními místy, analoga s alespoň jednou přídavnou aminokyselinou na karboxylovém konci glykoproteinu, v nichž přídavná aminokyselina obsahuje alespoň jedno glykosylační místo, a analoga s aminokyselinovou sekvencí, která zahrnuje přeřazení alespoň jednoho glykosylačního místa. Pod těmito pojmy se rozumí jak přirozený, tak i rekombinantní lidský erythropoetin.
Jak je podrobněji popsáno dále, příprava a čištění EPO jsou v tomto oboru dobře známy. Pod pojmem „EPO“ se rozumí přirozený nebo rekombinantní protein, přednostně lidský, jak byl získán z jakéhokoliv obvyklého zdroje, jako jsou tkáně, syntéza proteinu, buněčná kultura s přirozenými nebo rekombinantními buňkami. Do rozsahu tohoto pojmu spadá jakýkoliv protein, který vykazuje aktivitu EPO, jako jsou muteiny nebo jinak modifikované proteiny. Rekombinantní EPO je možno připravovat expresí v buněčných liniích CHO, BHK nebo HeLa, postupem s rekombinantní DNA nebo aktivací endogenního genu. Exprese proteinů aktivací endogenního genu je v tomto oboru dobře známa a je popsána na příklad v patentech US 5 733 761, US 5 641 670 a US 5 733 746 a mezinárodních patentových přihláškách WO 93/09 222, WO 94/12 650, WO 95/31 560, WO 90/11 354, WO 91/06 667 a WO 91/09 955, které jsou citovány náhradou za přenesení celého jejich obsahu do tohoto textu. Přednostními druhy EPO při výrobě erythropoetinových glykoproteinových produktů jsou druhy lidského EPO. Jako druhu EPO se větší přednost dává lidskému EPO s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou v SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2, výhodněji aminokyselinovou sekvencí znázorněnou v SEQ ID NO: 1.
Erythropoetinem může být glykoproteinový analog s 1 až 6 přídavnými glykosylačními místy. Ke glykosylaci proteinu jedním zbytkem oligosacharidu nebo více zbytky oligosacharidu dochází na specifických místech hlavního řetězce polypeptidu a glykosylace významně ovlivňuje fyzikální vlastnosti proteinu, jako je stabilita, sekreci, subcelulámí lokalizaci a biologickou aktivitu proteinu. Obvykle se vyskytují dva typy glykosylace. O-vázané oligosacharidy jsou navázány ke zbytkům šeřinu nebo threoninu a N-vázané oligosacharidy jsou navázány ke zbytkům asparaginu. Jeden typ oligosacharidu, který může být jak N-vázaný, tak O-vázaný, představuje Nacetylneuraminová kyselina (sialová kyselina), což je rodina aminocukrů obsahujících 9 nebo více atomů uhlíku. Sialová kyselina je obvykle terminálním zbytkem N-vázaných i O-vázaných oligosacharidů a jelikož nese negativní náboj, propůjčuje oligosacharidu kyselé vlastnosti. Lidský
-9CZ 304855 B6 erythropoetin se 165 aminokyselinami obsahuje tři N-vázané oligosacharidové řetězce a jeden O-vázaný oligosacharidový řetězec, které tvoří asi 40 % celkové molekulové hmotnosti glykoproteinu. N-vázaná glykosylace se nachází na asparaginových zbytcích v polohách 24, 38 a 83 a O-vázaná glykosylace se vyskytuje na serinovém zbytku v poloze 126. Oligosacharidové řetězce jsou modifikovány terminálními zbytky sialové kyseliny. Enzymatické odstranění všech zbytků sialové kyseliny z glykosylovaného erythropoetinu vede ke ztrátě aktivity in vivo, nikoliv však in vitro, jelikož sialylace erythropoetinu brání jeho vazbě, a následné clearanci, hepatickým vazebným proteinem.
Do rozsahu pojmu „erythropoetin“, jak se ho používá v souvislosti s kompozicemi podle tohoto vynálezu, spadají analoga lidského erythropoetinu s aminokyselinovou sekvencí lidského erythropoetinu, v níž je provedena jedna nebo větší počet změn vedoucích ke zvýšení počtu míst pro navázání sialové kyseliny. Tato glykoproteinová analoga je možno připravovat místně cílenou mutagenesí zahrnující přidání, delece nebo substituce (nahrazení) aminokyselinových zbytků, kterými se zvýší nebo změní místa, kterájsou dostupná pro glykosylaci. Glykoproteinová analoga, v nichž je úroveň sialové kyseliny vyšší, než je její úroveň v lidském erythropoetinu se obvykle připravují přidáním glykosylačních míst, která nenarušují sekundární nebo terciární konformaci, která je potřebná pro biologickou aktivitu. Do glykoproteinů podle vynálezu také spadají analoga se zvýšenou úrovní navázání sacharidů v glykosylačním místě, která obvykle obsahují substituci jedné nebo více aminokyselin v těsné blízkosti N-vázaného nebo O-vázaného místa. Glykoproteiny podle tohoto vynálezu také zahrnují analoga obsahující jednu nebo více aminokyselin, které prodlužují karboxylový konec erythropoetinu a poskytují alespoň jedno přídavné sacharidové místo. Do erythropoetinových proteinů podle tohoto vynálezu také spadají analoga s aminokyselinovou sekvencí, která obsahuje přeřazení alespoň jednoho glykosylačního místa. Takové přeřazení glykosylačního místa zahrnuje deleci jednoho nebo většího počtu glykosylačních míst v lidském erythropoetinu a přidání jednoho nebo většího počtu nepřirozených glykosylačních míst. Zvýšením počtu sacharidových řetězců na erythropoetinu, a tedy počtu sialových kyselin na molekulu erythropoetinu, se může dosáhnout výhodných vlastností, jako je zvýšená rozpustnost, větší odolnost vůči proteolýze, snížená imunogenicita, prodloužený poločas v séru a zvýšená biologická aktivita. Erythropoetinová analoga s přídavnými glykosylačními místy jsou podrobněji popsána v evropské patentové přihlášce 640 619 (Elliot), zveřejněné 1. března 1995.
V přednostním provedení farmaceutická kompozice podle tohoto vynálezu obsahuje erythropoetinové proteiny, jejichž aminokyselinová sekvence obsahuje alespoň jedno přídavné glykosylační místo. Jako neomezující příklady takových glykoproteinů je možno uvést erythropoetiny se sekvencí lidského erythropoetinu, která je změněna modifikací zvolenou ze souboru sestávající z
-10CZ 304855 B6
Asn30Thr32;
Asn51Thr53,
Asn57Thr59;
Asn69;
Asn69Thr71;
Ser68Asn69Thr71;
Val87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Gly89Thr90;
Ser87Asn88Thr90Thr92;
Ser87Asn88Thr90Ala162;
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;
Asn89Ile90Thr91;
Ser87Asn89Ile90Thr91;
AsnI36Thr138;
Asn138Thr140;
Thr125; and Pro124Thr125.
Záznam, kterého se zde používá, pro popis modifikací aminokyselinové sekvence vyjadřuje, že v poloze v odpovídajícím nemodifikovaném proteinu (například hEPO se SEQ ID NO: 1 nebo
SEQ ID NO: 2) vyjádřené horním indexem byla provedena změna na aminokyselinu uvedenou bezprostředně před tímto horním indexem.
Erythropoetinovým proteinem také může být analog s alespoň jednou přídavnou aminokyselinou na svém karboxylovém konci, přičemž tato přídavná aminokyselina obsahuje alespoň jedno glyio kosylační místo. Přídavná aminokyselina může obsahovat peptidový fragment odvozený od karboxylového konce lidského choriového gonadotropinu. V přednostním provedení je glykoproteinem analog zvolený ze souboru sestávajícího ze (a) lidského erythropoetinu s aminokyselinovou sekvencí Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin (SEQ ID NO: 3), připojenou ke karboxylovému konci; (b) analog definovaný v odstavci (a), který dále obsahuje Ser87 Asn88 Thr90 EPO; a (c) analog definovaný v odstavci (a), který dále obsahuje Asn30 Thr3 Val87 Asn88 Thr90 EPO.
Erythropoetinovým proteinem také může být analog s aminokyselinovou sekvencí, která zahrnuje přeřazení alespoň jednoho glykosylačního místa. Přeřazení může představovat deleci jakéhokoliv
N-vázaného sacharidového místa v lidském erythropoetinu a přidání N-vázaného sacharidového místa v poloze 88 aminokyselinové sekvence lidského erythropoetinu. V přednostním provedení je glykoproteinem analog zvolený ze souboru sestávajícího z Gin24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gin38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; a Gin83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO.
Erythropoetinovým proteinem ve farmaceutické kompozici podle tohoto vynálezu také mohou být jeho pegylované deriváty. Pegylované deriváty erythropoetinu a způsoby jejich přípravy jsou
- 11 CZ 304855 B6 známé a jsou popsány například v EP-A 539 167, EP-A 605 963, WO 93/25 212, WO 94/20 069, WO 95/11 924, patentu US 5 56, EP-A 584 876, WO 92/16 555, WO 94/28 024, WO 97/04 796, patentech US 5 359 030, US 5 681 811 a US 4 179 337, Japonském patentu, WO 98/32 466, a patentu US 5 324 650. Přednostní provedení pegylovaných derivátů erythropoetinu jsou popsána dále.
Do rozsahu vynálezu také spadá erythropoetinový konjugát, přičemž tento konjugát obsahuje erythropoetinový glykoprotein popsaný výše s alespoň jednou volnou aminoskupinou, jehož biologická aktivita in vivo spočívá v tom, že vede buňky kostní dřeně ke zvýšení produkce retikulocytů a červených krvinek, a který je zvolen ze souboru sestávajícího z lidského erythropoetinu a jeho analogů, v nichž je sekvence lidského erythropoetinu modifikována přidáním 1 až 6 glykosylačních míst nebo přeřazením alespoň jednoho glykosylačního místa; přičemž tento erythropoetin je kovalentně vázán k „n“ poly(ethylenglykol)ovým skupinám obecného vzorce
-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m_OR, kde
-CO tj. karbonyl, každé poly(ethylenglykol)ové skupiny tvoří amidovou vazbu sjednou zvýše uvedených aminoskupin;
R představuje nižší alkylskupinu; x představuje 2 nebo 3; m představuje asi 450 až asi 900; n představuje 1 až 3; a n a m jsou zvoleny tak, že molekulová hmotnost konjugátu snížená o molekulovou hmotnost erythropoetinového glykoproteinu je 20 až 100 kDa.
Do rozsahu vynálezu dále spadají kompozice, které obsahují konjugáty popsané výše, přičemž podíl konjugátů, kde n představuje číslo 1, v kompozici je alespoň 90 %, výhodněji alespoň 92 %, nebo přednostně 96 %, vztaženo na všechny konjugáty v kompozici.
Konkrétněji lze výše popsané konjugáty znázornit obecným vzorcem I
P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I) kde
P představuje zbytek erythropoetinového proteinu popsaný v tomto textu (tj. bez aminoskupiny nebo aminoskupin, které tvoří amidovou vazbu s karbonylem znázorněným v obecném vzorci I) vykazující biologickou aktivitu, která spočívá v tom, že vede buňky kostní dřeně ke zvýšení produkce retikulocytů a červených krvinek;
R představuje nižší alkylskupinu;
x představuje 2 nebo 3;
m představuje asi 450 až asi 900;
n představuje 1 až 3; a
- 12 CZ 304855 B6 n a m jsou zvoleny tak, že molekulová hmotnost konjugátu snížená o molekulovou hmotnost erythropoetinového glykoproteinů je 20 až 100 kDa.
Pod pojmem „nižší alkyl“ se v tomto textu rozumí přímá nebo rozvětvená alkylskupina s 1 až 6 atomy uhlíku. Jako příklady nižších alkylskupin je možno uvést methyl-, ethyl- a isopropylskupinu. Podle tohoto vynálezu R představuje jakýkoliv nižší alkyl. Přednost se dává konjugátům, kde R představuje methylskupinu.
Symbol „m“ představuje počet ethylenoxidových zbytků (OCH2CH2) v poly(ethylenoxid)ové skupině. Jednoduchá ethylenoxidová podjednotka PEG má molekulovou hmotnost asi 44 Da. Molekulová hmotnost konjugátu (nezahrnující molekulovou hmotnost EPO) tedy závisí na hodnotě „m“. V konjugátech podle tohoto vynálezu „m“ představuje asi 450 až asi 900 (což odpovídá molekulové hmotnosti asi 20 až asi 40 kDa), přednostně asi 650 až asi 750 (což odpovídá molekulové hmotnosti asi 30 kDa). Hodnota m je zvolena tak, aby výsledný konjugát podle tohoto vynálezu vykazoval fyziologickou aktivitu srovnatelnou s nemodifikovaným EPO, přičemž tato aktivita může být stejná jako odpovídající aktivita nemodifikovaného EPO, nebo vyšší či může představovat její zlomek. Molekulová hmotnost, jejíž určitá hodnota je uvozena výrazem „asi“ znamená, že jde o hodnotu vykazující rozumný rozptyl od hodnoty stanovené obvyklými analytickými postupy. Hodnota „m“ je zvolena tak, aby molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykol)ové skupiny kovalentně vázané k erythropoetinovému glykoproteinů byla od asi 20 do asi 40 kDa, přednostně asi 30 kDa.
V konjugátech podle tohoto vynálezu symbol „n“ představuje počet polyethylenglykolových skupin kovalentně vázaných k volným aminoskupinám (včetně epsílon-aminoskupin aminokyseliny lysinu a/nebo aminoskupiny na aminové konci) erythropoetinového proteinu prostřednictvím amidové vazby ěi amidových vazeb. V konjugátu podle vynálezu mohou na jednu molekulu EPO připadat 1, 2 nebo 3 PEG skupiny. Symbol „n“ představuje celé číslo v rozmezí 1 až 3, přednostně číslo 1 nebo 2, výhodněji číslo 1. Z výše popsaných konjugátů se dává přednost konjugátům, kde x představuje číslo 2, m představuje 650 až 750, n představuje číslo 1 a R představuje methylskupinu.
Sloučeniny obecného vzorce I je možno připravovat ze známé polymemí sloučeniny obecného vzorce II
RO(CH2CH20)m(CH2)xCOON (II) kde R a m mají výše uvedený význam, tak, že se sloučenina obecného vzorce II kondenzuje s eiythropoetinovým glykoproteinem. Sloučeninami obecného vzorce II, kde X představuje číslo 3, jsou alfa-nižší alkoxy, máselná kyselina sukcinimidylestery poly(ethylenglykolu) (nižší alkoxy-PEG-SBA). Sloučeniny obecného vzorce II, kde x představuje číslo 2 jsou alfa-nižší alkoxy, propionová kyselina sukcinimidylesteiy poly(ethylenglykolu) (nižší-alkoxy-PEG-SPA). Reakci aktivovaného esteru s aminem za vzniku amidu je možno provádět jakýmkoliv obvyklým způsobem. Při výše popsané reakci je uvedený sukcinimidylester odstupující skupinou vyvolávající tvorbu amidu. Použití sukcinimidylesterů jako sloučenin obecného vzorce II při výrobě konjugátů s proteiny je popsáno v patentu US 5 672 662, uděleném 30. září 1997 (Harris et al.).
Lidský EPO obsahuje volných 9 aminoskupin: aminoskupinu aminového konce a epsílon-aminoskupiny 8 zbytků lysinu. Bylo zjištěno, že když se pegylační činidlo nechá reagovat s SBA sloučeninou obecného vzorce II při pH 7,5, v poměru protein: PEG 1 : 3 a při teplotě od 20 do 25 °C, vznikne směs obsahující mono- a dipegylované sloučeniny a stopová množství tripegylovaných sloučenin. Když je pegylačním činidlem SPA sloučenina obecného vzorce II, poměr protein :
- 13CZ 304855 B6
PEG je 1 : 2 a ostatní podmínky zůstávají stejné, získají se převážně monopegylované sloučeniny. Pegylovaný EPO je možno podávat ve formě směsi nebo ve formě různě pegylovaných sloučenin rozdělených katexovou chromatografií. Se změnami reakčních podmínek (jako je například poměr reagentů, pH, teplota, koncentrace proteinu, reakční doba atd.) se relativní množství různě pegylovaných sloučenin mohou měnit.
Farmaceutické kompozice popsané výše mohou také obsahovat erythropoetinový protein definovaný výše obsahující alespoň jednu volnou aminoskupinu jehož biologická aktivita in vivo spočívá v tom, že vede buňky kostní dřeně ke zvýšení produkce retikulocytů a červených krvinek, a který je zvolen ze souboru sestávajícího z lidského erythropoetinu a jeho analogů, v nichž je sekvence lidského erythropoetinu modifikována přidáním 1 až 6 glykosylačních míst; přičemž tento glykoprotein je kovalentní vázán k 1 až 3 nižší alkoxypoly(ethylenglykol)ovým skupinám, z nichž každá je ke glykoproteinu kovalentně vázána prostřednictvím spojovací skupiny vzorce C(O)-X-S-Y-, kde
C(O) tvoří amidovou vazbu s jednou z uvedených aminoskupin;
X představuje skupinu -(CH2)k- nebo -CH2(O-CH2-CH2)k-, kde k představuje číslo 1 až 10, a Y představuje skupinu vzorce
molekulová hmotnost každého poly(ethylenglykol)ového zbytku je asi 20 až asi 40 kDa a molekulová hmotnost konjugátu je asi 51 až asi 175 kDa.
Tyto erythropoetinové deriváty také lze znázornit obecným vzorcem III
P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n (III) kde R může předstupovat jakýkoliv nižší alkyl, kterým se rozumí lineární nebo rozvětvená alkylskupina s 1 až 6 atomy uhlíku, jako methylskupina, ethylskupina, isopropylskupina atd. Přednostní alkylskupinou je methylskupina. X může představovat skupinu -(CH2)k- nebo -CH2(O-CH2-CH2)k-, kde k představuje číslo 1 až 10. Parametr k přednostně představuje číslo 1 až 4, výhodněji 1 nebo 2. X nejvýhodněji představuje skupinu -(CH2)-.
Y představuje skupinu vzorce
-14CZ 304855 B6
přednostně skupinu vzorce
výhodněji skupinu vzorce
V obecném vzorci III je hodnota m zvolena tak, aby výsledný konjugát obecného vzorce III vykazoval fyziologickou aktivitu srovnatelnou s nemodifikovaným EPO, přičemž tato aktivita může být stejná jako odpovídající aktivita nemodifikovaného EPO, nebo vyšší či může představovat její zlomek. Symbol „m“ představuje počet ethylenoxidových zbytků v PEG jednotce. Jednoduchá ethylenoxidová PEG podj ednotka -(OCH2CH2)- má molekulovou hmotnost asi 44 Da. Molekulová hmotnost konjugátu (nezahrnující molekulovou hmotnost EPO) tedy závisí na hodnotě „m“. Molekulová hmotnost, jejíž určitá hodnota je uvozena slovem „asi“ znamená, že jde o hodnotu vykazující rozumný rozptyl od hodnoty stanovené obvyklými analytickými postupy. Symbol m je celé číslo v rozmezí od asi 450 do 900 (což odpovídá molekulové hmotnosti 20 až 40 kDa), přednostně v rozmezí od asi 550 do asi 800 (což odpovídá asi 24 až 35 kDa), a nej výhodněji v rozmezí od asi 650 do asi 700 (což odpovídá asi 29 až asi 31 kDa).
Symbol „n“ v obecném vzorci III představuje počet epsílon-aminoskupin aminokyseliny lysinu v erythropoetinovém proteinu kovalentně vázáném k PEG jednotce prostřednictvím amidové vazby. V konjugátu podle vynálezu mohou na jednu molekulu EPO připadat 1, 2 nebo 3 PEG jednotky. Symbol „n“ představuje celé číslo v rozmezí 1 až 3, přednostně číslo 1 nebo 2, výhodněji číslo 1.
Přednostní erythropoetinové proteiny obecného vzorce III lze znázornit pomocí následujících vzorců:
- 15CZ 304855 B6
OR
Nejvýhodnější erythropoetinové produkty odpovídají obecnému vzorci
Ve výše uvedených vzorcích n představuje celé číslo od 1 do 3; m představuje celé číslo od 450 do 900; R představuje nižší alkyl; X představuje skupinu -(CH2)k- nebo -CH2(O-CH2-CH2)k-, a P představuje zbytek erythropoetinového proteinu bez aminoskupiny nebo aminoskupin, které ío tvoří amidovou vazbu s X.
Jiné přednostní erythropoetinové glykoproteinové produkty odpovídají vzorcům
H 5
L U 650-700
N
H S
L w 650-700
Výhodnější erythropoetinové proteinové produkty odpovídají vzorci
OCH,
650-700
Tyto erythropoetinové proteiny je možno připravovat tak, že se
- 16CZ 304855 B6 (a) epsílon-aminoskupina aminokyseliny lysinu erythropoetinového proteinu vzorce P-[NH2]n nechá za vzniku kovalentní vazby reagovat s bifunkčním činidlem vzorce Z-CO-X-S-Q, čímž se získá meziprodukt obsahující amidovou vazbu vzorce
P-[NH-CO-X-S-Q]n kde P představuje erythropoetinový protein bez aminoskupiny, která tvoří amidovou vazbu; n představuje celé číslo od 1 do 3; Z představuje reaktivní skupinu, například karboxy-NHS ester; X představuje skupinu -(CH2)k- nebo -CH2(O-CH2-CH2)k-, kde k představuje číslo 1 až asi 10; a Q představuje chránicí skupinu, jako alkanoylskupinu, například acetylskupinu, (b) tento meziprodukt obsahující amidovou vazbu ze stupně (a) se nechá reagovat za vzniku kovalentní vazby s aktivovaným derivátem poly(ethylenglykol)u vzorce W-[OCH2CH2]m-OR, čímž se získá erythropoetinový glykoproteinový produkt vzorce
OR kde W představuje sulfhydrylovou reaktivní formu Y; m představuje celé číslo od asi 450 do asi
900; R představuje nižší alkyl; a Y má výše uvedený význam.
V tomto provedení je bifunkčním činidlem přednostně N-sukcinimidyl-S-acetylthiopropionát nebo N-sukcinimidyl-S-acetylthioacetát, Z přednostně představuje N-hydroxysukcinimid a aktivovaný poly(ethylenglykol)ový derivát vzorce W-[OCH2CH2]n-OR je přednostně zvolen ze souboru sestávajícího zjodacetylmethoxy-PEG, methoxy-PEG-vinylsulfonu a methoxy-PEGmaleinimidu.
Následuje podrobnější popis tohoto způsobu. Erythropoetinové proteiny obecného vzorce III je možno připravovat tak, že se na EPO kovalentně navážou thiolové skupiny („aktivace“) a výsledný aktivovaný EPO se nechá reagovat s derivátem poly(ethylenglykol)u. V prvním stupni přípravy pegylovaného EPO podle tohoto vynálezu se thiolové skupiny prostřednictvím kovalentní vazby navážou ke skupinám NH2 v EPO. Tato aktivace EPO se provádí za použití bifunkčních činidel, které nesou chráněnou thiolovou skupinu a další reaktivní skupinu, jako aktivních esterů (například sukcinimidylesteru), anhydridů, esterů sulfonových kyselin, halogenidů karboxylových kyselin a sulfonových kyselin). Thiolová skupina je chráněna skupinami, které jsou v tomto oboru známy, například acetylskupinami. Tato bifunkční činidla jsou schopna reagovat s epsílon-aminoskupinou aminokyseliny lysinu za vzniku amidové vazby. První stupeň této reakce lze znázornit následujícím schématem:
X—S
EPO
ch3 kde EPO, n a X mají výše uvedený význam, Z představuje známou reaktivní skupinu, například N-hydroxysukcinimidový (NHS) substituent vzorce
- 17CZ 304855 B6
V přednostním provedení se aktivace epsílon-aminoskupin lysinu provádí reakcí s bifunkčními činidly obsahujícími sukcinimidylový zbytek. Bifunkční činidla mohou nést různé spojovací skupiny, například skupiny vzorce -(CH2)k- nebo -CH2(O-CH2-CH2)k-, kde k představuje číslo 1 až asi 10, přednostně 1 až asi 4, výhodněji 1 nebo 2, a nej výhodněji 1. Jako příklady takových činidel je možno uvést N-sukcinimidyl-S-acetylthiopropionát (SATP) a N-sukcinimidyl-Sacetyl-thioacetát (ŠATA)
O acetylthioalkyl-karboxy-NHS-ester, jako
2-(acetylthio)-(ethoxy)k-octová kyselina-NHS-ester kde k má výše uvedený význam.
Příprava takových bifunkčních činidel je známá. Prekursory 2—(acetylthio)—(ethoxy)k-octová kyselina-NHS-esterů jsou popsány v DE-3924705 a derivatizace na acetylthiosloučeninu je popsána v March, J. Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375 až 376. ŠATA je činidlo dostupné na trhu (Molecular Probes, Eugene, OR, USA a Pierce, Rockfold IL, USA).
Počet thiolových skupin, které se mají navázat na molekulu EPO je možno určovat úpravou reakčních parametrů, tj. koncentrace proteinu (EPO) a poměru protein/bifunkční činidlo. EPO se přednostně aktivuje tak, že se na molekulu EPO prostřednictvím kovalentní vazby naváže 1 až 5 thiolových skupin, výhodněji 1,5 až 3 thiolové skupiny. Tato rozmezí představují statistickou distribuci thiolových skupin v celém souboru EPO.
Tato reakce se například provádí ve vodném pufrovacím roztoku, pH 6,5 až 8,0, například v ÍOmM fosforečnanu draselném, 50mM chloridu sodném, pH 7,3. Bifunkční činidlo lze přidávat v dimethylsulfoxídu. Po dokončení reakce, přednostně po 30 minutách, se reakce zastaví přídavkem lysinu. Nadbytečné bifunkční činidlo je možno oddělit známým způsobem, například dialýzou nebo sloupcovou filtrací. Průměrný počet thiolových skupin navázaných k EPO je možno
- 18CZ 304855 B6 stanovit fotometrickými postupy popsanými například v Grasetti, D. R. a Murray, J. F., J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41 až 49 (1967).
Po výše uvedené reakci se aktivovaný poly(ethylenglykol)ový (PEG) derivát podrobí kopulační reakci za vzniku kovalentní vazby. Vhodnými PEG deriváty jsou aktivované molekuly PEG s průměrnou molekulovou hmotností od asi 20 do asi 40 kDa, výhodněji od asi 24 do asi 35 kDa, a nejvýhodněji s průměrnou molekulovou hmotností asi 30 kDa.
Aktivované PEG deriváty jsou známé a jsou popsány například v Morpurgo, M. et al., J. Bioconj. Chem. (1996) 7, str. 363 ff (pro PEG-vinylsulfon). Pro výrobu výše uvedených sloučenin jsou vhodné PEG deriváty s lineárním a rozvětveným řetězcem. Jako příklady reaktivních PEG činidel lze uvést jodacetylmethoxy-PEG a methoxy-PEG-vinylsulfon
O O
Použití těchto látek aktivovaných jodem je známé a je popsáno například v Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academie Press, San Diego, str. 147 až 148.
Ve výhodnějším provedení se PEG sloučeniny aktivují maleinimidem za použití (alkoxy-PEGmaleinimidu), jako methoxy-PEG-maleinimidu (MH 30000; Shearwater Polymers, lne.).
PEG sloučeniny se nejvýhodněji aktivují maleinimidem za použití (alkoxy-PEG-maleinimidu), jako methoxy-PEG-maleinimidu (MH 30000, Shearwater Polymers, lne.). Struktura alkoxyPEG-maleinimidu odpovídá vzorci
kde R a m má výše uvedený význam, přednostně vzorci
H
OR
Kopulační reakce s alkoxy-PEG-maleinimidem se provádí po in šitu odštěpení chránící skupiny thiolu ve vhodném pufřovacím roztoku, například lOmM fosforečnantu draselném, 50mM chloridu sodném, 2mM EDTA, pH 6,2. Chrániči skupinu lze odštěpit například působením hydroxylaminu v dimethylsulfoxidu při teplotě 25 °C, pH 6,2 po dobu asi 90 minut. Při modifikaci PEG by molámí poměr aktivovaného EPO a alkoxy-PEG-maleinimidu měl být asi 1 : 3 až asi 1 : 6, přednostně 1 :4. Reakci je možno zastavit přídavkem cysteinu a reakcí zbývajících thiolových (-SH) skupin s N-methylmaleinimidem nebo jinými vhodnými sloučeninami, které jsou schopny tvořit disulfidové vazby. Vzhledem k reakci všech zbývajících aktivních thiolových skupin
- 19CZ 304855 B6 s chránicí skupinou, jako N-methylmelainimidem nebo jinou vhodnou chránicí skupinou, EPO glykoproteiny v konjugátech podle tohoto vynálezu mohou obsahovat takové chránicí skupiny. Výše popsaným způsobem se obvykle získá směs molekul s různými počty thiolových skupin chráněných různými počty chránících skupin, v závislosti na počtu aktivovaných thiolových skupin na glykoproteinu, které nejsou konjugovány s PEG-maleinimidem.
Zatímco N-methylmaleinimid, použitý pro blokování zbývajících thiolových skupin na pegylovaném proteinu, tvoří stejný typ kovalentní vazby, použití disulfidových sloučenin povede při intermolekulámí výměnné reakci sulfid/disulfid ke kopulační reakci blokovacího činidla na disulfidovém můstku. Jako přednostní činidla pro tento typ blokovací reakce je možno uvést oxidovaný glutathion (GSSG), cystein a cystamin. Zatímco za použití cysteinu se do pegylovaného proteinu nevnese žádný výsledný náboj, použití GSSG nebo cystaminu jako blokovacího činidla vede k přídavnému zápornému nebo kladnému náboji.
Další purifikaci sloučenin obecného vzorce III, včetně izolace mono-, di- a tripegylovaných EPO derivátů, lze provádět známými postupy, například sloupcovou chromatografií.
Kompozici obsahující alespoň 90 % mono-PEG konjugátů, tj. v nichž n představuje číslo 1, je možno připravit způsobem popsaným v příkladu 5. Běžně jsou žádoucí mono-PEG konjugáty erythropoetinových glykoproteinů, jelikož obvykle mají vyšší aktivitu než di-PEG konjugáty. Procentní podíl mono-PEG konjugátu, jakož i poměr mono— a di-PEG produktů lze regulovat takto: za účelem snížení procentního podílu mono-PEH produktu se shromažďuje širší rozmezí frakcí okolo elučního píku, nebo za účelem zvýšení procentního podílu mono-PEG produktu se shromažďuje užší rozmezí frakcí okolo elučního píku. U kompozic s přibližně 90% podílem mono-PEG konjugátů je dobře vyvážen poměr výtěžek/aktivita. Někdy však mohou být potřebné kompozice s konjugáty, z nichž alespoň 92 nebo alespoň 96 % tvoří mono-PEG konjugáty (tj. kde n představuje číslo 1). V provedení podle tohoto vynálezu činí podíl konjugátů, kde n představuje číslo 1, 90 až 96 %.
Kompozice podle tohoto vynálezu mohou, jak je uvedeno výše, obsahovat 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu na 1 ml. V přednostním provedení kompozice obsahují 10 až 1000, například 10, 50, 100, 400, 800 nebo 2500 pg erythropoetinového proteinu na ml.
Dále kompozice podle vynálezu mohou obsahovat 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu na ml, síran -10 až 200 mmol/1, fosforečnan -10 až 50 mmol/1, pH 6,0 až 6,5. Tato kompozice také může obsahovat až 20mM methionin, 1 až 5% (hmotnost/objem) polyol, až 0,1% (hmotnost/objem) pluronic F68 a popřípadě až lmM chlorid vápenatý. Taková kompozice například obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu na ml, síran - 40 mmol/1, fosforečnan 10 mmol/1, 3% (hmotnost/objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotnost/objem) pluronic F68, pH 6,2.
Podle dalšího provedení vynálezu kompozice může obsahovat 10 až 10 000 pg eiythropoetinového proteinu na ml, chlorid sodný - 10 až 100 mmol/1, fosforečnan - 10 až 50 mmol/1, pH 6,0 až 7,0, popřípadě 1 až 5% (hmotnost/objem) polyol. Dále tato kompozice může obsahovat až 20mM methionin, až 0,1% (hmotnost/objem) pluronic F68 a popřípadě chlorid vápenatý - 7,5 pmol/1. Konkrétněji tato kompozice může obsahovat 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu na ml, chlorid sodný - 100 mmol/1, lOmM methionin, 0,01% (hmotnost/objem) pluronic F68 a fosforečnan - 10 mmol/1, pH 7,0.
Do rozsahu vynálezu také spadá výše uvedená kompozice, která obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu na ml, arginin - 10 až 50 mmol/1, pH 6 až pH 6,5, síran sodný - 10 až 100 mmol/1. Dále tato kompozice může obsahovat až 20mM methionin, až 0,1% (hmotnost/objem) pluronic F68, popřípadě síran vápenatý až 1 mmol/1 a popřípadě 1 až 5% (hmotnost/objem) polyol. Konkrétněji tato kompozice může obsahovat 10 až 10 000 pg erythropoeti-20CZ 304855 B6 nového proteinu na ml, arginin - 40 mmol/1, pH 6,2, síran sodný - 30 mmol/1, 3% (hmotnost/objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotnost/objem) pluronic F68 a popřípadě chlorid vápenatý - 1 mmol/1.
V přednostním provedení kompozice obsahuje 10 až 10 000 pg/ml erythropoetinu, přednostně 25 až 2500 pg/ml erythropoetinu a
a) lOmM fosforečnan sodný/draselný, lOOmM chlorid sodný, pH 7,0 nebo
b) lOmM fosforečnan sodný, 120mM síran sodný, pH 6,2 nebo
c) lOmM fosforečnan sodný, 40mM síran sodný, 3% (hmotnost/objem) mannitol, pH 6,2 nebo
d) lOmM fosforečnan sodný, 40mM síran sodný, 3% (hmotnost/objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotnost/objem) pluronic F68, pH 6,2 nebo
e) 40mM arginin, 30mM síran sodný, 3% (hmotnost/objem) mannitol, pH 6,2 nebo
f) 40mM arginin, 30mM síran sodný, 3% (hmotnost/objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotnost/objem) pluronic F68, pH 6,2.
V nej výhodnějším provedení kompozice obsahují erythropoetinový protein v množství 50, 100, 400, 800 nebo 2500 pl/ml. Nejvýhodnější kompozice obsahují buď lOmM fosforečnan sodný, 40mM síran sodný, 3% (hmotnost/objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotnost/objem) pluronic F68, pH 6,2, nebo 40mM arginin, 30mM síran sodný, 3% (hmotnost/objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotnost/objem) pluronic F68, pH 6,2.
Kompozice podle vynálezu mohou mít formu prášků vysušených rozprašováním.
Dále do rozsahu vynálezu spadají kompozice, které jsou lyofilizáty nebo prášky vysušenými rozprašováním výše uvedené kompozice. Kompozici je možno rekonstituovat přidáním rozpouštědla, například vody, za vzniku roztoku, nebo ji aplikovat přímo, například pomocí inhalačního zařízení nebo zařízení pro transdermální aplikaci.
Předmětem vynálezu je také způsob výroby výše popsané kompozice, jehož podstata spočívá v tom, že se erythropoetinový protein smísí s roztokem obsahujícím anion s vícenásobným záporným nábojem a popřípadě jedním nebo více farmaceuticky vhodnými excipienty.
Dále je předmětem vynálezu použití výše definované kompozice pro přípravu léčivých přípravků pro léčení nebo prevenci chorob, které souvisejí s anémií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF), AIDS a/nebo léčení onkologických pacientů, kteří prodělávají chemoterapii. Předmětem vynálezu je také způsob preventivního nebo kurativního léčení poruch zahrnujících anémií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF) nebo AIDS, a onkologických pacientů, kteří prodělávají chemoterapii, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje stupeň, při němž se pacientu podává výše definované kompozice.
Dále jsou předmětem vynálezu zařízení pro místní nebo systemickou dodávku s dlouhodobým uvolňováním, jejichž podstata spočívá v tom, že obsahují kompozici definovanou výše. Takovým zařízením může být jakýkoliv druh implantátu umožňující řízené uvolňování erythropoetinu, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje kompozici popsanou výše, jako například mikro- nebo nanočástice na polymemí bázi. Výše popsaná kompozice také může tvořit náplň předem naplněných injekčních stříkaček nebo jakéhokoliv jiného aplikačního zařízení, například zařízení pro bezjehlové injekce nebo inhalačního zařízení.
-21 CZ 304855 B6
Kompozice podle tohoto vynálezu může mít formu jednotkové dávky k injekčnímu nebo intravenosnímu podávání. Naproti tomu je kompozici podle vynálezu možno skladovat v kapalné nebo tuhé formě, a tuto formu následně dělit na jednotkové dávkovači formy k intravenosnímu nebo injekčnímu podávání. Kapalná kompozice podle vynálezu tedy může být v malém množství, jako 0,3 ml, pro použití jako jednotková dávkovači forma. Objem nárokované kompozice také může být až 60 litrů (při skladování před distribucí v balené dávkovači formě). Vzhledem ke zvýšené stabilitě je kompozici podle vynálezu možno skladovat ve velkých obalech, jejichž obsah se má později rozplnit do obalů vhodných pro distribuci lékařům, pacientům a nemocnicím.
Injekční roztoky podle tohoto vynálezu je možno podávat za použití obvyklých prostředků, jako injekčních stříkaček, které obvykle umožňují podávat 0,3 ml až 20 ml kompozice jako jednotkovou dávku. Kompozice podle vynálezu je však také možno podávat za použití ampulí, které obsahují kompozici ve formě lyofdizátu nebo prášku vysušeného rozprašováním, které se před injekčním podáním obvyklým způsobem rekonstituují. Vzhledem ke stabilitě je však kompozice podle vynálezu možno dělit na jednodávkové jednotkové aplikační formy, jako injekční lahvičky, které obsahují asi 0?3 až asi 10 ml této kompozice. Kromě toho je kompozice podle tohoto vynálezu možno podávat intravenosně za použití intravenosních vaků. Tyto vaky obsahují asi 20 ml až asi 500 ml roztoku, v závislosti na době, po kterou se roztok má pacientu podávat. Kapalný roztok podle tohoto vynálezu je možno skladovat ve skladovacích obalech, jejichž obsah je možno dále dělit na malá balení aplikačních forem pro distribuci lékařům, nemocnicím a pacientům. Vzhledem ke stabilitě je kompozice podle tohoto vynálezu možno v takových skladovacích obalech skladovat dlouhou dobu před podáním.
Příprava erythropoetinu jako složky výše popsaných kompozic nebo jako výchozí látky při výrobě jeho derivátů popsaných výše je podrobně popsána například v patentech US 5 547 933 a US 5 621 080, EP-B 0 148 605, Huang, S. L., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1984, 2708 až 2712, EPB 0 205 564, EP-B 0 209 539 a EP-B 0 411 678 a také v Lai, P. H. et al., J. Biol. Chem. 261, 1986, 3116 až 3121 a Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262, 1987, 12059 až 12076. Erythropoetin pro použití při léčení je možno vyrábět rekombinantními postupy (EP-B 0 148 605, EPB 0 209 539 a Egrie, J. C., Strickland, T. W., Lané, J. et al., 1986, Immunobiol. 72, 213 až 224).
Způsoby exprese a výroby erythropoetinu v médiu bez séra jsou popsány například v přihlášce WO 96/35 718 (Koch), zveřejněné 12. června 1992. Kromě těchto způsobů popsaných v uvedených publikacích je známo, že je možno provést bezsérovou fermentaci rekombinantních buněk CHO, které obsahují gen pro EPO. Takové způsoby jsou popsány například vEP-A 0 513 738, EP A 0 267 678 a v obecné formě v Kawamato, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445 až 453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. a Franěk, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277 až 292, Bavister, B., Expocology 271 (1981), 45 až 51, EP-A 0 481 791, EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635 a WO 88/00 967.
V EP-A 0 267 678 jsou popsány ionexová chromatografie na S-Sepharose, preparativní vysokotlaká kapalinová chromatografie s reversními fázemi na sloupci C8 a gelová filtrační chromatografie pro čištění EPO získaného v kultuře bez séra pro dialýze. V této souvislosti lze stupeň gelové filtrační chromatografie nahradit ionexovou chromatografií na S-Sepharose Fast Flow. Před ionexovou chromatografií je také možno provést chromatografii na sloupci s barvivém Blue Trisacryl.
Způsob čištění rekombinantního EPO je popsán v Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107, 1990, 352 až 359. Při tomto postupu se však před provedením purifíkačního stupně EPO zpracovává roztokem Tween(R)20, fenylmethylsulfonylchloridu, ethylmaleinimidu, pepstatinu A, síranu měďnatého a kyseliny oxamové. Publikace, včetně WO 96/35 718 (Burg), zveřejněné 14. listopadu 1996, popisují způsob výroby erythropoetinu fermentaci bez séra (EPOsf).
Specifickou aktivitu EPO nebo EPO konjugátů podle tohoto vynálezu je možno stanovit za použití různých zkoušek známých v tomto oboru. Biologická aktivita purifikovaných EPO proteinů
-22CZ 304855 B6 podle tohoto vynálezu je taková, že injekční podání EPO proteinu humánnímu pacientovi vede u buněk kostní dřeně k produkci retikulocytů a červených krvinek, která je oproti kontrolním skupinám subjektů zvýšena. Biologickou aktivitu EPO proteinů nebo jejich fragmentů, které byly získány a purifikovány podle tohoto vynálezu, je možno zkoušet postupy popsanými v Annable et al., Bull. Wld. Hlth. Org., 1972, 47, 99 až 112 a Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio, 1977, 2. Jiná biologická zkouška stanovení aktivity EPO proteinu, zkouška na normocythemických myších, je popsána v příkladu 6.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Fermentace a purifíkace lidského EPO
a) Příprava inokula a fermentace
Jedna lahvička Woking Cell Bank obsahující buňky, které pocházejí z CHO buněčné linie produkující EPO (je možno použít ATCC CRL8695, popsané v EP 411 678, Genetics Institute) se vyjme z plynné fáze tanku pro ukládání v kapalném dusíku. Buňky se umístí do skleněných rotačních nádob a kultivují v médiu pufrovaném hydrogenuhličitanem v inkubátoru se zvlhčenou atmosférou CO2. Obvyklá bezsérová média používaná pro přípravu inokula a fermentaci jsou popsána v evropské patentové přihlášce 513 738 (Koch), zveřejněné 12. června 1992, nebo WO 96/35 718 (Burg), zveřejněné 14. listopadu 1996. Tato média například obsahují DMEM/F12 (např. JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, pořadové číslo 57-736) a navíc hydrogenuhličitan sodný, L-(+)-glutamin, D-(+)-glukosu, rekombinantní inzulín, selenit sodný, diaminobutan, hydrokortizon, síran železnatý, asparagin, asparagovou kyselinu, serin a stabilizátor pro savčí buňky, jako je například polyvinylalkohol, methylcelulosa, polydextran, polyethylenglykol, Pluronic F68, plasmový expandér polygelin (HEMACCEL®) nebo polyvinylpyrrolidon (WO 96/35 718).
Kultury se podrobí mikroskopické kontrole, zda neobsahují kontaminující mikroorganismy a stanoví se buněčná densita. Tyto zkoušky se provádějí při každém stupni dělení.
Po počátečním období růstu se buněčná kultura zředí čerstvým médiem na výchozí buněčnou densitu a nechá projít dalším růstovým cyklem. Tento postup se opakuje, dokud se nezíská kultura v objemu asi 2 litrů na skleněnou rotační nádobu. Po asi 12 zdvojeních je dostupných 1 až 5 litrů této kultury, kterou je možno použít jako inokula pro lOlitrový inokulační fermentor.
Po 3 až 5 dnech je kultury z lOlitrového fermentoru možno použít jako inokula pro lOOlitrový inokulační fermentor.
Po dalších 3 až 5 dnech kultivace je kultury ze lOOlitrového fermentoru možno použít jako inokula pro 1 OOOlitrový produkční fermentor.
b) Sklizeň a separace buněk
Po dosažení požadované buněčné denzity se sklidí asi 80 % kultury. Zbytek kultury se doplní čerstvým kultivačním médiem a kultivuje do následující sklizně. Jeden produkční cyklus sestává maximálně z 10 následných sklizní: 9 částečných sklizní a 1 úplné sklizně na závěr fermentace. Sklizeň se provádí každé 3 až 4 dny.
-23CZ 304855 B6
Stanovený objem sklizených buněk se přemístí do chlazené nádoby. Buňky se odstraní centrifugací nebo filtrací a zahodí. Supematant z centrifugačního stupně obsahující EPO se přefiltruje přes filtr zapojený v sérii a shromáždí do druhé chlazené nádoby. Každá sklizeň se podrobí separačnímu postupu odděleně.
Typický postup purifikace EPO proteinu je popsán v WO96/35 718 (Burg), zveřejněné 14. Listopadu 1996. Popis tohoto purifikačního postupu následuje.
a) Chromatografie na Blue Sepharose
Blue Sepharose (Pharmacia) je tvořena perlami Sepharose, k jejichž povrchu je kovalentně navázána modř Cibarcron. Jelikož vazba EPO k Blue Sepharose je silnější než vazba většiny nebílkovinných kontaminantů, některých nečistot bílkovinné povahy a PVA, je v tomto stupni možno získat produkt obohacený EPO. Eluce sloupce Blue Sepharose se provádí za zvyšující se koncentrace soli a hodnoty pH.
Sloupec se naplní 80 až 100 litry Blue Sepharose, regeneruje hydroxidem sodným a ekvilibruje ekvilibračním pufrem (chlorid sodný/vápenatý a octan sodný). Do sloupce se uvede okyselený a přefiltrovaný supematant z fermentoru. Poté se sloupec promyje nejprve pufrem podobným ekvilibračnímu pufru, který obsahuje vyšší koncentraci chloridu sodného a následně pufrem Trisbáze. Produkt se eluuje pufrem Tris-báze a shromáždí v jediné frakci v souladu se vzorovým elučním profilem.
b) Chromatografie na Butyl Toyopearl
Butyl Toyopearl 650 C (Toso Haas) tvoří matrice na bázi polystyrenu, k níž jsou kovalentně vázány alifatické butylové zbytky. Jelikož vazba EPO k tomuto gelu je silnější než vazba většiny nečistot a PVA, musí se eluovat pufrem obsahujícím isopropylalkohol.
Sloupec se naplní 30 až 40 litry Butyl Toyopearl 650 C, regeneruje hydroxidem sodným, promyje pufrem Tris-báze a ekvilibruje pufrem Tris-báze obsahujícím isopropylalkohol.
Eluát ze sloupce Blue Sepharose se nastaví na koncentraci isopropylalkoholu v pufru použitém pro ekvilibraci sloupce a uvede do sloupce. Sloupec se promyje ekvilibračním pufrem se zvýšenou koncentrací isopropylalkoholu. Produkt se eluuje elučním pufrem (pufr Tris-báze s vysokým obsahem isopropylalkoholu) a shromáždí v jediné frakci v souladu se vzorovým elučním profilem.
c) Chromatografie na Hydroxyapatite Ultrogel
Hydroxyapatite Ultrogel (Biosepra) je tvořen hydroxyapatitem, který je z důvodu zlepšení mechanických vlastností začleněn do agarózové matrice. EPO má nízkou afinitu k hydroxyapatitu, a lze ho tedy eluovat při nižší koncentraci fosforečnanu než proteinové nečistoty.
Sloupec se naplní 30 až 40 litry Hydroxyapatite Ultrogel a regeneruje pufrem na bázi fosforečnan draselného/chloridu vápenatého a NaOH a následně pufrem Tris-báze. Poté se sloupec ekvilibruje pufrem Tris-báze obsahujícím malé množství isopropylalkoholu a chloridu sodného.
Eluát z chromatografie na sloupci Butyl Toyopearl obsahující EPO se uvede do sloupce. Sloupec se poté promyje ekvilibračním pufrem a pufrem Tris-báze bez isopropylalkoholu a chloridu sodného. Produkt se eluuje pufrem Tris-báze obsahujícím fosforečnan draselný v nízké koncentraci a shromáždí v jediné frakci v souladu se vzorovým elučním profilem.
d) Vysokotlaká kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi (RP-HPLC) na sloupci Vydac C4
-24CZ 304855 B6
Látka pro RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) je tvořena silikagelovými částicemi, jejichž povrch nese alkylové řetězce se 4 atomy uhlíku. Oddělování EPO od nečistot proteinové povahy je založeno na odlišnostech v síle hydrofobních interakcí. Eluce se provádí gradientem acetonitrilu ve zředěné trifluoroctové kyselině.
Preparativní HPLC se provádí za použití kolony z nerezové oceli (naplnění 2,8 až 3,2 litru silikagelu Vydac C4). Eluát získaný chromatografií na Hydroxyapatite Ultrogel se okyselí přidáním trifluoroctové kyseliny a uvede do sloupce Vydac C4. Pro propláchnutí a eluci se použije gradientu acetonitrilu ve zředěné trifluoroctové kyselině. Frakce se shromáždí a ihned zneutralizují fosforečnanovým pufrem. Shromažďují se frakce EPO, které jsou v rozmezí IPC.
e) Chromatografie na DEAE Sepharose
Látka DEAE Sepharose (Pharmacia) je tvořena perlami Sepharose, k jejichž povrchu jsou kovalentně navázány diethylaminoethylskupiny (DEAE). Vazba EPO ke skupinám DEAE je zprostředkována iontovými interakcemi. Sloupcem se bez zadržování nechá procházet acetonitril a trifluoroctová kyselina. Poté, co se tyto látky vymyjí, se sloupec promyje acetátovým pufrem o nízkém pH, čímž se odstraní stopové nečistoty, načež se sloupec promyje neutrálním fosforečnanovým pufrem a EPO se eluuje pufrem se zvýšenou iontovou silou.
Sloupec se naplní látkou DEAE Sepharose Fast Flow. Objem sloupce se nastaví tak, aby se zajistilo, že na 3 až lOmg dávku EPO bude připadat 1 ml gelu. Sloupec se promyje vodou a ekvilibračním pufrem (fosforečnan sodný/draselný). Shromážděné frakce HPLC eluátu se uvedou do sloupce a sloupec se promyje ekvilibračním pufrem. Poté se sloupec promyje promývacím pufrem (pufr na bázi octanu sodného) a dále ekvilibračním pufrem. Následně se ze sloupce elučním pufrem (chlorid sodný, fosforečnan sodný/draselný) eluuje EPO, který se shromáždí v jediné frakci v souladu se vzorovým elučním profilem.
Eluát ze sloupce DEAE Sepharose se nastaví na specifikovanou vodivost. Výsledné léčivo se přefiltruje za sterilních podmínek do teflonových nádob a skladuje při -70 °C.
Příklad 2
Pegylace EPO pomocí mPEG-SBA
EPO purifikovaný způsobem bez séra popsaným v příkladu 1 (EPOsf) je podle analýz homogenní a vykazuje typický profil tvořený 8 isoformami. Jeho specifická biologická aktivita stanovená na normocythemických myších je 190 000 IU/mg. Jako pegylačního činidla se použije methoxyPEG-SBA, což je sloučenina obecného vzorce II, kde R představuje methylskupinu; x představuje číslo 3; a m představuje číslo 650 až 750 (průměrně asi 680, což odpovídá průměrné molekulové hmotnosti asi 30 kDa).
Pegylační reakce
Ke 100 mg EPOsf (9,71 ml zásobního roztoku EPOsf o koncentraci 10,3 mg/ml, 5,48 pmol) se přidá 10 ml 0,lM pufru obsahujícího fosforečnan draselný (pH 7,5) s obsahem 506 mg 30kDa methoxy-PEG-SBA (16,5 pmol) (od firmy Shearwater Polymers, lne., Huntsville, Alabama, USA). Vzniklá směs se 2 hodiny míchá při teplotě místnosti (20 až 23 C). Konečná koncentrace proteinu je 5 mg/ml a poměr protein : PEG činidlo je 1 : 3. Po 2 hodinách se reakce zastaví nastavením pH na hodnotu 4,5 za použití ledové kyseliny octové. Produkt se uchovává při -20 °C až do purifikace.
-25CZ 304855 B6
Purifikace
1. Konjugátová směs
Asi 28 ml SP-Sepharose FF (sulfo-propylová katexová pryskyřice) se uvede do skleněné kolony Amicon (2,2 x 7,5 cm) a ekvilibruje 20mM acetátovým pufrem (pH 4,5) při rychlosti průtoku 150 ml/h. 6 ml reakční směsi obsahující 30 mg proteinu se pětinásobně zředí ekvilibračním pufrem a uvede do sloupce. Neadsorbované látky se odplaví pufrem a adsorbovaná PEG konjugátová směs se ze sloupce eluuje 0,175M chloridem sodným v ekvilibračním pufru. Nemodifikovaný EPOsf, který ještě zůstal ve sloupci, se eluuje 750mM chloridem sodným. Sloupec se reekvilibruje výchozím pufrem. Vzorky se analyzují postupem SDS-PAGE a stanoví se stupeň jejich pegylace. Zjistilo se, že eluát získaný za použití 0,175M chloridu sodného obsahuje monopegylované a dipegylované produkty a stopová množství tripegylovaných produktů, zatímco eluát získaný za použití 750mM chloridu sodného obsahuje nemodifikovaný EPOsf.
2. Di-PEG a mono-PEG-EPOsf
Purifikovaná konjugátová směs eluovaná ze sloupce v předchozím stupni se čtyřnásobně zředí pufrem a znovu uvede do sloupce a promyje popsaným způsobem. Ze sloupce se odděleně eluuje 0,lM chloridem sodným di-PEG-EPOsf a 0,175M chloridem sodným mono-PEG-EPOsf. Eluce se také provádí pomocí 750mM roztoku chloridu sodného, čímž se eluuje všechen zbytkový nemodifikovaný EPOsf.
Alternativně se reakční směs pětinásobně zředí acetátovým pufrem a uvede do sloupce SPSepharose (asi 0,5 mg proteinu/ml gelu). Sloupec se promyje a neadsorbovaný mono-PEGEPOsf, di-PEG-EPOsf a nemodifikovaný EPOsf se eluují postupem popsaným v předchozím textu.
Výsledky
PEG-EPOsf se syntetizuje chemicky konjugací lineární molekuly PEG s průměrnou molekulovou hmotností 30kDa, PEG-EPOsf vzniká reakcí mezi primárními aminoskupinami EPOsf a 30kDa sukcinimidylesterovým derivátem PEG-máselné kyseliny, která vede k amidové vazbě.
Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 1. Purifikovaná konjugátová směs podle analýzy SDS-PAGE obsahuje mono- a di-PEG-EPOsf a neobsahuje nemodifikovaný EPOsf. Výtěžek konjugované směsi činí 23,4 mg či 78 % vztaženo na výchozí látku. Katexová chromatografická separace mono- a di-PEG-EPOsf ukázala, že poměr mono- a di-PEG-EPOsf v konjugátové směsi je téměř 1 : 1. Po dokončení reakce je poměr jednotlivých složek mono-PEG : di-PEH : nemodifikovaný EPOsf 40 : 38 : 20 (%). Celkový výtěžek je téměř kvantitativní.
Tabulka 1
Souhrn výsledků pegylace EPOsf
-26CZ 304855 B6
Vzorek | Protein (mg) | Výtěžek (%) |
Rxn směs | 30 | 100 |
Mono | 12,0 | 40 |
Di | 11,4 | 38 |
Nemodifikovaný | 6,0 | 20 |
Konjug. směs | 23,4 | 78 |
Příklad 3
Pegylace EPO za použití mPEG-SPA
Alikvot EPOsf, odlišný od alikvotu použitého při postupu podle příkladu 2, se nechá reagovat s 30kDa methoxy-PEG-SPA (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama, USA). Reakce se provádí při poměru proteimčinidlo 1:2a čištění se provádí způsobem popsaným v příkladu 2. Získá se převážně mono-pegylovaný produkt.
Příklad 4
Kovalentní vazba thiolových skupin k EPO
V tomto příkladu je popsáno stanovení reakčních podmínek pro kovalentní vazbu thiolových skupin k EPO. Za účelem tohoto stanovení se k roztoku EPO, v tomto případě 1 ml až 5 mg/ml EPO v lOmM fosforečnanu draselném, 50mM chloridu sodném, pH 7,3 přidají různá množství činidel obsahujících blokované thiolové skupiny, v tomto případě ŠATA nebo SATP (rozpuštěný v dimethylsulfoxidu (do 10 mg/ml). Reakční směs se asi 30 minut míchá a poté se přídavkem IM roztoku lysinu (lOmM) reakce zastaví. Nadbytečná množství ŠATA a SATP se odstraní dialýzou proti lOmM fosforečnanu sodnému, 50mM chloridu sodnému a 2mM EDTA, pH 6,2. Po odstranění chránící acetylskupiny hydroxylaminem, se stanoví počet thiolových skupin kovalentně vázaných k EPO, a to fotometricky za použití dithiodipyridinu způsobem popsaným v Grasetti, D. R. a Murray, J. F., J. Appl. Biotech. Biotechnol. 119, str. 41 až 49 (1967).
Počet thiolových skupin, které jsou kovalentně vázány k EPO na molekulu EPO je uveden v následující tabulce.
-27CZ 304855 B6
Molární poměr EPO : ŠATA nebo SATP | Počet mol thiolových skupin na mol EPO |
EPO : ŠATA = 1 : 3 | Ú5 |
EPO : ŠATA =1:5 | 2,4 |
EPO : ŠATA =1:6 | 3,2 |
EPO:SATP =1:3 | 1,3 |
EPO:SATP =1:4 | 2,5 |
EPO : SATP =1:6 | 3,7 |
Příklad 5
Modifikace aktivovaného EPO methoxy-PEG-maleinimidem
A) Aktivace EPO
100 mg EPO získaného podle příkladu 1 (190 000 IU/mg, stanoveno zkouškou na normocythemických myších) se aktivuje ŠATA (molámí poměr EPO : ŠATA =1:5) podle příkladu 2. Výsledný EPO („aktivovaný EPO“) nesoucí kovalentně vázané blokované thiolové skupiny se od vedlejších produktů, jako N-hydroxysukcinimidu, nebo nezreagovaného ŠATA oddělí dialýzou popsanou v příkladu 1. Získá se roztok aktivovaného EPO (4,5 mg/ml) v lOmM chloridu sodném, 2mM EDTA, pH 6,2.
B) Pegylace aktivovaného EPO
300 mg methoxy-PEG-maleinimidu s „nejvýhodnější strukturou“ ilustrovanou dále (MH 30 000; Shearwater Polymers, lne., Hunstville, Alabama, USA) se rozpustí ve výše uvedeném roztoku obsahujícím 95 mg aktivovaného EPO (4,5 mg/ml v lOmM fosforečnanu draselném, 50mM chloridu sodném, 2mM EDTA, pH 6,2). Výsledný molámí poměr mezi aktivovaným EPO a methoxy-PEG-maleinimidem v roztoku je 1 : 4. Přídavkem 1M vodného roztoku hydroxylaminů (do 30mM, pH 6,2) k výše uvedenému roztoku se odblokují kovalentně vázané thiolové skupiny aktivovaného EPO. Vzniklý aktivovaný EPO v reakční směsi roztoku obsahuje volné thiolové skupiny (-SH). Ihned po odblokování thiolových skupin se provede reakce mezi aktivovaným EPO, který nyní obsahuje volné thiolové skupiny (-SH) a methoxy-PEG-maleinimidem (za míchání, po dobu 90 minut, při 25 °C). Kopulační reakce se zastaví tak, že se k reakční směsi přidá 0,2M vodný roztok cysteinu (do 2mM koncentrace). Po 30 minutách se nadbytek volných thiolových skupin aktivovaného EPO, které nezreagovaly s methoxy-PEG-maleinimidem, blokuje přídavkem 0,5M roztoku N-methylmaleinimidu v dimethylsulfoxidu (do 5 mM koncentrace). Po 30 minutách se směs, která nyní obsahuje pegylované EPO deriváty, dialyzuje proti lOmM fosforečnanu draselnému, pH 7,5, po dobu > 15 hodin.
C) Purifikace pegylovaných derivátů EPO
Pegylované deriváty EPO se z reakční směsi izolují následujícím postupem: Sloupec s náplní 50 ml Q-Sepharose ff se ekvilibruje lOmM fosforečnanem draselným (pH 7,5). Do sloupce se zavádí směs získaná ve stupni B (průtok 3 objemy sloupce (OS) za hodinu). Nezreagované methoxy-28CZ 304855 B6
PEG-maleinimidové činidlo se oddělí tak, že sloupec promyje 5 OS lOmM fosforečnanu draselného (pH 7,5). Pegylované EPO deriváty se izolují za použití elučního gradientu se zvyšující se koncentrací soli, kterýje tvořen 5 OS pufru A (lOmM fosforečnan draselný, pH 7,5) a 5 OS pufru B (lOmM fosforečnan draselný, 500mM chlorid sodný, pH 7,5) při průtoku 3 OS za hodinu. Na základě gradientu chloridu sodného se nejprve eluují pegylované deriváty EPO (tri-, bi- a monopegylované deriváty EPO) a poté nepegylované deriváty EPO. Frakce eluátu, které obsahují pegylované deriváty EPO (tri-, di- a monopegylované deriváty EPO) se shromáždí a přefiltrují (sterilní filtrace přes 0,2 pm filtr).
Obsah a čistota tri-, di- a monopegylovaných derivátů EPO se stanoví na gelech SDS-PAA barvením Coomasie (Laemli, Nátuře, 227, 680 až 685, 1970) a koncentrace proteinu se stanoví při 280 nm podle Beer-Lambertova zákona. Zřejmá molekulová hmotnost derivátů EPO stanovená elektroforézou na SDS-PAA je přibližně 68 kDa (monopegylované deriváty EPO), přibližně 98 kDa (dipegylované deriváty EPO) a 128 kDa (tripegylované deriváty EPO).
Další separaci tri-, di- a monopegylovaných derivátů EPO je možno provádět chromatograficky, například gelovou filtrací (Superdex, pg 200; Pharmacia). Biologická aktivita in vivo eluátu obsahujícího tri-, di- a monopegylované deriváty se stanoví následujícím postupem:
Příklad 6
Aktivita pegylovaného EPO in vivo stanovená zkouškou na normocythemických myších
Biostanovení na normocythemických myších je v tomto oboru známé (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoetin BRP Bio 1997(2)) a postup je popsán v monografii o erythropoetinu Ph. Eur. BRP. Vzorky se zředí BSA-PBS. Normálním zdravým myším o stáří 7 až 15 týdnů se subkutánně podá 0,2 ml EPO frakce obsahující nepegylovaný EPO nebo tri-, di- nebo mono-pegylovaný EPO získaný podle příkladu 2 nebo 3. Během 6 dní se napíchnutím ocasní žíly odebírá krev. Odebraná krev se zředí tak, že v 1 ml 0,15pM akridinového oranžového barvicího roztoku je 1 pl krve. Doba barvení je 3 až 10 minut. Retikulocyty se spočítají mikrofluorometricky v průtokovém cytometru analýzou červeného fluorescenčního histogramu. Počty retikulocytů se uvádějí v absolutních číslech (na 30 000 analyzovaných krvinek). Každou skupinu tvoří 5 myší za den a krev se odebírá jednou denně.
Myším se při odděleně prováděných zkouškách podá jediná dávka nemodifikovaného EPO (25 ng EPO), směs PEG(SBA)-EPO získaná podle příkladu 2 (10 ng konjugátu), mono- a dipegylovaný EPOsf získaný podle příkladu 2 (10 ng konjugátu), PEG(SPA)-EPO získaný podle příkladu 3 (10 mg konjugátu) a pufrovací roztok. Výsledky jsou znázorněny v tabulce 2. Výsledky ukazují vyšší aktivitu a prodloužený poločas pegylovaných EPO produktů, což je doloženo významným zvýšením počtu retikulocytů a posunem maximálního počtu retikulocytů za použití stejné dávky na myš (10 ng) ve srovnání s 25ng dávkou nemodifikovaného EPO.
-29CZ 304855 B6
Tabulka 2 | EPO nemodifikovaný | 30kDa SPA PEG | Mono 30K SBA | Di 30K SBA | PEG-EPO SBA konjugátová směs | Kontrola pufr |
72 h | 1000 | 1393 | 1411 | 994 | 1328 | 857 |
96 h | 500 | 1406 | 1501 | 926 | 1338 | 697 |
120 h | asi 200 | 1100 | 1182 | 791 | 944 | 701 |
144 h | asi 0 | 535 | 607 | 665 | 660 | 708 |
Příklad 7
Příprava převážně mono-PEG-EPO
Pegylační reakce
Použije se 100 mg (5,48 pmol) EPOsf ve ÍOOmM pufru obsahujícím fosforečnan draselný (pH 7,5) připraveného způsobem popsaným v příkladu 1. Přidá se 329 mg (10,96 pmol) 30kDa PEG-SBA činidla rozpuštěného ve 3 ml lmM kyseliny chlorovodíkové. K reakční směsi se přidá ÍOOmM pufrovací roztok fosforečnanu draselného (pH 7,5) v množství dostatečném pro doplnění objemu směsi do 20 ml. Konečná koncentrace proteinu je 5 mg/ml a poměr protein : PEG činidlo je 1 : 2. Reakční směs se 2 hodiny míchá při teplotě místnosti (20 až 22 °C). Po 2 hodinách se reakce zastaví nastavením pH na hodnotu 4,5 za použití ledové kyseliny octové. Produkt se až do purifikace uchovává ve zmrazeném stavu při -20 °C.
Purifikace
Reakční směs získaná v předchozím stupni se zředí v poměru 1:51 OmM octanem sodným (pH 4,5) a uvede do sloupce 4,2 x 19 cm naplněného 300 ml SP-Sepharose FF (sulfopropyl katexová pryskyřice). Sloupec se předběžně ekvilibruje stejným pufrem. Výtok ze sloupce se monitoruje při 280 nm za použití UV monitoru Gilson a hodnoty se zaznamenávají za použití zařízení Kipp and Zonen. Sloupec se promyje ekvilibračním pufrem (300 ml nebo jeden objem lože), aby se odstranil nadbytek reakčních činidel, vedlejší produkty a oligomemí PEG-EPO; a poté dvěma objemy lože ÍOOmM chloridu sodného, aby se odstranil di-PEG-EPO. Poté se 200mM chloridem sodným eluuje mono-PEG-EPO. Při eluci mono-PEG-EPO se prvních 50 ml proteinového píku zahodí a mono-PEG-EPO se shromáždí jako 150ml frakce. Nemodifikovaný EPOsf, který zůstal na sloupci, se eluuje 750mM chloridem sodným. Všechna eluční činidla byla připravena v ekvilibračním pufru. Všechny eluované vzorky se analyzují SDS-PAGE a vysoce výkonnou chromatografií SEC. Mono-PEG-EPO pool získaný ze 150ml frakce, který neobsahuje žádný nemodifikovaný EPOsf, se poté zkoncentruje na koncentraci asi 4,5 až 7,5 mg/ml a diafiltruje do zásobního pufru, lOmM fosforečnanu draselného, ÍOOmM chloridu sodného (pH 7,5). Zkoncentrování/dialfitrace se provádí za použití systému Milipore Labscale® TFF s membránou Millipore Pellicon XL Biomax 50 s vylučovacím limitem 50 kDa při teplotě místnosti. Koncentrovaný mono-PEG-EPO se přefiltruje za sterilních podmínek a uchovává zmrazený při -20 °C.
-30CZ 304855 B6
Přibližně 75 % EPOsf je pegylováno. Po přečištění byl celkový výtěžek mono-PEG-EPO bez detekovatelného nemodifikovaného EPOsf asi 30 % a di-PEG-EPO asi 25 %. Oligomery a nepegylovaný EPOsf se považují za zbývající protein. Mono-PEG-EPO pool získaný ze 150 frakce obsahuje asi 90 % mono-PEG-EPO a asi 10 % di-PEG-EPO.
Příklad 8
Tepelná stabilita EPO a pegylovaného EPO v různých formulacích: Analýza pomocí DSC (diferenciální skenovací kalorimetrie)
Přechodová teplota tepelné denaturace měřená diferenciální skenovací kalorimetrií je obecně přijímána jako validní indikátor tepelné stability proteinů. Roztoky erythropoetinu nebo pegylovaného erythropoetinu o koncentraci od 0,6 do 1,2 mg/ml se analyzují v různých pufrech za přítomnosti nebo za nepřítomnosti stabilizátorů za použití Nano-DSC (Calorimetric Sciences Corporation, Utah, USA) při rychlosti zahřívání 2 K/min. Zvýšení přechodové teploty vyjadřuje zvýšení tepelné stability proteinu. Naměřené teploty by neměly být chápány jako absolutní hodnoty, ale jako hodnoty představující vzájemné rozdíly ve stabilitě jednotlivých formulací.
Za účelem stanovení optimální hodnoty pH formulace, se zkoumá závislost tepelné denaturace pegylovaného erythropoetinu na pH v rozmezí od 4 do 9. Vzorky proteinu se analyzují ve 30mM hydrogenfosforečnanu sodném, 30mM citranu sodném, 30mM boritanu. Na obr. 1 je znázorněno plato maximální přechodové teploty při pH v rozmezí od 6 do 9 a prudký pokles při pH nižším než 5,5. To ukazuje, že pH optimální z hlediska tepelné stability je nižší než 5,5 (viz obr. 3).
Za účelem stanovení účinku iontové síly, se stanoví závislost tepelné denaturace na koncentraci fosforečnanu. Z obr. 4 vyplývá, že se zvýšenou iontovou silou formulace roste i její tepelná stabilita.
Vliv pufrovací látky se také zkoumá pomocí DSC. Z obr. 5 je zřejmé, že z hlediska teplotní stability jsou jako pufrovací nebo přídatné látky vhodné síran, citran nebo fosforečnan. Glycin, kterého používá jako pufru ve formulacích dostupných v současné době (viz výše), příliš vhodný není.
Z obr. 6 je zřejmé, že síran je vhodným pufrem/přídatnou látkou při nízkém pH (například pH 6,2), zatímco fosforečnan je při pH 6,2, oproti pH 7,5, méně vhodný. To ukazuje, že síran udržuje vysokou tepelnou stabilitu dokonce i při nízkém pH. Toto zjištění umožňuje získat formulace s pH 6,0 až 6,5, aniž by došlo k závažným úbytkům tepelné stability erythropoetinu.
Příklad 9
Agregace EPO a peg-EPO za tepelného stresu - Analýza pomocí SDS-PAGE (elektroforézy na polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného)
Zkoumání účinku tepelného stresu na erythropoetinový protein se provádí tak, že se vzorky různých formulací vystaví tepelnému stresu (20 min při 80 °C) a analyzují elektroforézou na polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného za redukčních podmínek (DTT ve vzorkovém pufru) a neredukčních podmínek (bez DTT ve vzorkovém pufru). Tento postup umožňuje detekovat tvorbu kovalentních agregátů. Jak již bylo uvedeno výše, tvorba agregátů je hlavní degradační drahou proteinů, a ve farmaceutických formulacích obsahujících proteiny by se jí tedy mělo zabránit. Agregáty, které jsou detekovatelné za nepřítomnosti redukčního činidla (například DTT) a nedekovatelné za přítomnosti redukčního činidla, s velkou pravděpodobností vznikají na základě nežádoucí tvorby disulfidových můstků, oxidační reakcí za tepelného stresu. Na obr. 5 je znázorněna závislost agregace za tepelného stresu na pH. Tato zkouška jasně ukazuje, že tvorba agregátů je potlačena při pH nižším než 6,5. Při vyšším pH dochází k větší agregaci.
-31 CZ 304855 B6
Většinu takto vzniklých agregátů lze redukovat tak, že se na vzorky během SDS-PAGE působí redukčním činidlem, což napovídá, že větší část těchto agregátů vzniklých za tepelného stresu představují dimery, oligomery a agregáty vyššího řádu s disulfidovými můstky. Tyto výsledky souhrnně ukazují, že tvorbě agregátů lze z velké míry zabránit tak, že se pH formulace udržuje nižší nebo rovné 6,5.
Na obr. 7 je znázorněna závislost agregace peg-EPO na pH. Vzorky peg-EPO se po tepelném stresu (popsaném výše) analyzují pomocí SDS-PAGE. Proteiny se obarví stříbrem. Pás 1: standard molekulová hmotnost. Pás 2: pH 5. Pás 3: pH 5, redukce. Pás 4: pH 6. Pás 5: pH 6, redukce. Pás 6: pH 6,5. Pás 7: pH 6,5 redukce. Pás 8: pH 7. Pás 9: pH 7, redukce Pás 10: peg-EPO nepodrobený tepelnému stresu.
Tvorbě agregátu lze také zabránit pomocí antioxidantů. Na obr. 8 je znázorněno, že použití acetylcysteinu (1 mg/ml) jako antioxidantů zabraňuje tvorbě agregátů za tepelného stresu. Z důvodů zabránění tvorbě agregátů za tepelného stresuje tedy užitečné použít antioxidantů, jako například acetylcysteinu, při nízkém pH, například pH 6,2.
Z obr. 6 vyplývá, že agregaci peg-EPO lze zabránit při pH 6,2 a/nebo za použití acetylcysteinu. Vzorky peg-EPO se po tepelném stresování (viz výše) analyzují SDS-PAGE. Proteiny se barví stříbrem. Pás 1: peg-EPO při pH 7,5, tepelně nestresovaný; Pás 2: peg-EPO při pH 7,5, stresovaný; Pás 3: peg-EPO při pH 6,2, stresovaný. Pás 4: peg-EPO při pH 6,2, stresovaný. Pás 5: pegEPO při pH 7,5, +1 mg/ml N-acetylcysteinu, stresovaný; pás 6: peg-EPO při pH 7,5 + 1 mg/ml N-acetylcysteinu, stresovaný, redukce.
Příklad 10
Stabilita peg-EPO v různých formulacích při 4, 25, 30 a 40 °C
Pegylovaný EPOO v různých formulacích se inkubuje při různých teplotách. V uvedených okamžicích se odebírají vzorky a stabilita se stanoví vysoce účinnou chromatografií s obrácenými fázemi (rpHPLC), vysoce účinnou gelovou filtrací (SEC) a elektroforézou na polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE). V tabulce 3 je porovnána stabilita peg-EPO v různých formulacích při několika teplotách. Tato data jasně dokládají výhodnost formulací popsaných v tomto textu z hlediska izolačního výtěžku a agregace proteinu.
Tabulka 3
Stabilita peg-EPO v různých formulacích při několika teplotách
-32CZ 304855 B6
% izolačního výtěžku po 6 měsících při | Agregace při 30°C detekovatelná (+/-) | |||||
Formulace * | peg-EPO (gg/ml) | 4 °C | 25 °C | 30 °C | 40 °C | |
A | 10 | 92 | 91 | n.d. | 39 | n.d. |
B | 50 | 97 | 98 | 97 | 78 | - |
C | 50 | 95 | 79 | 79 | 52 | + |
E | 50 | 103 | 102 | 100 | 87 | - |
A | 100 | 96 | 97 | n.d. | 50 | n.d. |
B | 400 | 101 | 101 | 101 | 77 | - |
C | 400 | 100 | 94 | 90 | 56 | + |
D | 400 | 98 | 96 | 93 | 79 | - |
E | 400 | 99 | 98 | 100 | 66 | - |
*Formulace jsou následující:
Formulace A: lOmM fosforečnan sodný, lOOmM chlorid sodný, pH 7,5
Formulace B: lOmM fosforečnan sodný, 40mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, pH 6,2
Formulace C: lOmM fosforečnan sodný, lOOmM chlorid sodný, pH 7,0 Formulace D: lOmM fosforečnan sodný, 120mM síran sodný, pH 6,2
Formulace E: 40mM arginin, 30mM síran sodný, 3% mannitol, lmM chlorid vápenatý, io pH 6,2
Příklad 11
Optimalizované formulace potlačují oxidaci methioninu54 v EPO proteinu, methionin jako antioxidant
Pegylovaný EPO v různých formulacích se inkubuje při několika různých teplotách. Po 6 měsících se odeberou vzorky, a oxidace methioninu54 se stanoví postupem, jehož stručný popis ná20 sleduje. Na vzorky EPO se působí endoproteinasou LysC. Získané peptidy se separují chromatografií s obrácenými fázemi. Vypočítá se poměr oxidovaného peptidu T8 (obsahujícího oxidovaný methionin54) k peptidu T8 (obsahujícímu neoxidovaný methionin54). Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 4.
-33 CZ 304855 B6
Tabulka 4
Stupeň oxidace methioninu54 EPO proteinu v různých formulacích po 6 měsících při uvedených teplotách
oxidovaný methionin (%) | |||||
Formulace ★ | pegEPO (Mg/ml) | 4 °C | 25 °C | 30 °C | 40 °C |
A | 400 | 2,00 | 15,89 | 24,89 | 37,89 |
B | 400 | 2,33 | 6,55 | 12,88 | 30,24 |
C | 400 | 2,51 | 2,95 | 5,99 | 14,4 |
A | 50 | 5,37 | 21,36 | 30,62 | 48,05 |
B | 50 | 3,44 | 13,38 | 16,59 | 30,83 |
C | 50 | 4,41 | 5,52 | 10,01 | 15,62 |
*Formulace jsou následující
Formulace A: lOmM fosforečnan sodný, lOOmM chlorid sodný, pH 7,0 ío Formulace B: lOmM fosforečnan sodný, 40mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, pH 6,2
Formulace C. lOmM fosforečnan sodný, 40mM síran sodný, 3 % (hmotn./objem) mannitol, lmM methionin, pH 6,2
Tyto údaje jasně ukazují, že přednostní formulace podle vynálezu (lOmM fosforečnan sodný, 40mM síran sodný, 3 % (hmotn./objem) mannitol, pH 6,2) je z hlediska stupně oxidace methioninu54 lepší než jiné formulace, jako formulace obsahující lOmM fosforečnan sodný, lOOmM chlorid sodný, pH 7,0. Přidáním 1 nebo lOmM methioninu do formulace dojde ke zjevnému potlačení oxidace methioninu54. Methionin tedy působí jako antioxidant a stabilizuje EPO.
Příklad 12
Obsah sialové kyseliny v peg-EPO v různých formulacích
Za účelem analýzy integrity sacharidové struktury peg-EPO glykoproteinů se standardními postupy analyzuje obsah kyseliny sialové v peg-EPO vzorcích v optimalizovaných formulacích po óměsíčním skladování při několika různých teplotách. Výsledky ukazují, že skladování proteinu v nových formulacích popsaných v tomto textu nemá negativní vliv na integritu sacharidové struktury (viz obr. 9).
-34CZ 304855 B6
Příklad 13
Biologická aktivita pegylovaného EPO po delším skladování při zvýšené teplotě
Za účelem zjištění, zda skladování peg-EPO v ÍOmM fosforečnanu sodném, 40mM síranu sodném, 3% (hmotn./objem) mannitolu, pH 6,2, nemá negativní vliv na biologickou aktivitu in vivo, se provede standardní EPO stanovení na myších (viz příklad 6). Vzorky peg-EPO skladované 6 měsíců v ÍOmM fosforečnanu sodném, 40mM síranu sodném, 3% (hmotn./objem) mannitolu, pH 6,2, při uvedených teplotách ve srovnání s čerstvými referenčními standardy nevykazují žádný úbytek aktivity in vivo po skladování při 4, 25 a 30 °C.
Příklad 14
Obsah agregátů peg-EPO po óměsíčním skladování při zvýšení teplotě
Za účelem analýzy obsahu agregátů ve vzorcích peg-EPO po skladování při zvýšených teplotách v ÍOmM fosforečnanu sodném, 40mM síranu sodném, 3% (hmotn./objem) mannitolu, pH 6,2, se po 6 měsících odeberou vzorky, které se analyzují gelovou filtrací.
Po skladování při 4, 25 a 30 °C nejsou detekovatelné žádné agregáty, což dokládá stabilitu pegylovaného EPO ve výše uvedených formulacích. Na obr. 11 jsou znázorněny chromatogramy z gelové filtrace, vyrovnané v zákrytu.
Claims (46)
1. Kapalná farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje pegylovaný lidský erythropoetinový protein, anorganický anion s vícenásobným nábojem, kterým je sulfátový anion, ve farmaceuticky vhodném pufru vhodném pro udržení hodnoty pH roztoku v rozmezí od 5,5 do 7,0, a popřípadě jeden nebo více farmaceuticky vhodných excipientů, přičemž tato kapalná kompozice je stálá při teplotě místnosti.
2. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že je vodným roztokem.
3. Kompozice podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že je isotonickým roztokem.
4. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 200 mmol/1 sulfátu.
5. Kompozice podle některého z nároků 1 až 4, vy zn ač u j í cí se tí m , že pHje 5,8 až 6,7.
6. Kompozice podle nároku 5, vy z n a č uj í c í se t í m , že pHje 6,0 až 6,5.
7. Kompozice podle nároku 6, vyznačující se tím, že pH je 6,2.
8. Kompozice podle některého z nároků laž7, vyznačující se tím, že pufr je zvolen ze souboru sestávajícího z fosforečnanového pufru a arginin/H2SO4/Na2SO4 pufru.
-35 CZ 304855 B6
9. Kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že pufrem je 10 až 50 mmol/1 fosforečnanový pufr.
10. Kompozice podle některého z nároků laž9, vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více farmaceuticky vhodných excipientů.
11. Kompozice podle nároku 10, vyznačující se tím, že jeden nebo více farmaceutických excipientů je zvoleno ze souboru sestávajícího z farmaceuticky vhodných solí, ředidel, rozpouštědel a konzervačních látek.
12. Kompozice podle nároku 10 nebo 11, vyznačující se tím, že farmaceuticky vhodné excipienty jsou zvoleny ze souboru sestávajícího z ionizačních činidel, polyolů, antioxidantů a neiontových detergentů.
13. Kompozice podle některého z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že farmaceuticky vhodným excipientem je polyol.
14. Kompozice podle nároku 13, vyznačující se tím, že polyol je zvolen ze souboru sestávajícího z mannitolu, sorbitolu, glycerolu, trehalózy a sacharózy.
15. Kompozice podle nároku 14, vyznačující se tím, že polyolem je mannitol.
16. Kompozice podle některého z nároků 10 až 15, vyznačující se tím, že obsahuje antioxidant.
17. Kompozice podle nároku 16, vyznačující se tím, že antioxidantem je methionin.
18. Kompozice podle některého z nároků 10 až 17, vyznačující se tím, že obsahuje nejvýše 1 mmol/1 chloridu vápenatého.
19. Kompozice podle některého z nároků 12 až 18, vyznačující se tím, že neiontovým detergentem je polysorbate 80, polysorbate 20 nebo poloxamer 188.
20. Kompozice podle nároku 19, vyznačující se tím, že neiontovým detergentem je poloxamer 188.
21. Kompozice podle nároku 19 nebo 20, vyznačující se tím, že obsahuje 0 až 1 % (hmotn./objem) neiontového detergentů.
22. Kompozice podle některého z nároků 19 až 21, vyznačující se tím, že obsahuje 0 až 0,1 % (hmotn./objem) neiontového detergentů.
23. Kompozice podle některého z nároků 1 až 22, vyznačující se tím, že erythropoetinovým proteinem je konjugát, přičemž tento konjugát obsahuje lidský erythropoetinový glykoprotein s alespoň jednou volnou aminoskupinou, přičemž tento glykoprotein je kovalentně vázán k „n“ poly(ethylenglykol)ovým skupinám obecného vzorce
-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR, kde
-CO každé poly(ethylenglykol)ové skupiny tvoří amidovou vazbu sjednou zvýše uvedených aminoskupin;
R představuje lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku;
-36CZ 304855 B6 x představuje 2 nebo 3;
m představuje asi 450 až asi 900;
n představuje 1 až 3; a n a m jsou zvoleny tak, že molekulová hmotnost konjugátu snížená o molekulovou hmotnost erythropoetinového glykoproteinu je 20 až 100 kDa.
24. Kompozice podle nároku 23, vyznačující se tím, že obsahuje erythropoetinový protein obecného vzorce I
P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I) kde x, m, n a R mají význam uvedený výše, a P představuje zbytek glykoproteinu bez n aminoskupiny nebo aminoskupin, které tvoří amidovou vazbu se skupinou nebo skupinami poly(ethylenglykol)u.
25. Kompozice podle nároku 24, vyznačující se tím, že v obecném vzorci I x představuje číslo 2, m představuje číslo 650 až 750, n představuje číslo 1 a R představuje methylskupinu.
26. Kompozice podle z nároků laž22, vyznačující se tím, že erythropoetinový protein je konjugát, přičemž tento konjugát obsahuje lidský erythropoetinový glykoprotein obsahující alespoň jednu volnou aminoskupinu, přičemž tento glykoprotein je kovalentně vázán k 1 až 3 alkoxypoly(ethylenglykol)ovým skupinám, z nichž každá obsahuje v alkoxyskupině, která je přímá nebo rozvětvená, 1 až 6 atomů uhlíku aje ke glykoproteinu kovalentně vázána prostřednictvím spojovací skupiny vzorce -C(O)-X-S-Y-, kde
C(O) této spojovací skupiny tvoří amidovou vazbu s jednou z uvedených aminoskupin;
X představuje skupinu -(CH2)k- nebo -CH2(O-CH2CH2)k-, kde k představuje číslo 1 až 10, a Y představuje některou ze skupin vzorce průměrná molekulová hmotnost každého poly(ethylenglykol)ového zbytku je asi 20 až asi 40 kDa a molekulová hmotnost konjugátu je asi 51 až asi 175 kDa.
-37CZ 304855 B6
27. Kompozice podle nároku 26, vyznačující se tím, že erythropoetinovým proteinem je konjugát obecného vzorce o
-------_ O o n představuje celé číslo od 1 do 3; m představuje celé číslo od 450 do 900; R představuje lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku; X představuje skupinu -(CH2)k- nebo -(CH2(O-CH2-CH2)k-, a P představuje zbytek erythropoetinového proteinu bez aminoskupiny nebo aminoskupin, které tvoří amidovou vazbu s X.
28. Kompozice podle nároku 27, vyznačující se tím, že erythropoetinovým proteinem je konjugát obecného vzorce kde n představuje celé číslo od 1 do 3; m představuje celé číslo od 450 do 900; R představuje lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku; X představuje skupinu -(CH2)k- nebo -CH2(O-CH2-CH2)k-, a P představuje zbytek erythropoetinového glykoproteinů bez aminoskupiny nebo aminoskupin, které tvoří amidovou vazbu s X.
29. Kompozice podle některého z nároků laž28, vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu na ml.
30. Kompozice podle některého z nároků laž29, vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu na ml, 10 až 200 mmol/1 sulfátu a 10 až 50 mmol/1 fosfátu a pH je 6,0 až 6,5.
31. Kompozice podle nároku 30, vyznačující se tím, že obsahuje 20mM methionin, 1 až 5% (hmotn./objem) polyol, 0 až 0,1% (hmotn./objem) poloxamer 188 a popřípadě nejvýše 1 mM chlorid vápenatý.
32. Kompozice podle nároků 29až31, vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu v 1 ml, 40 mmol/litr sulfátu, 10 mmol/litr fosfátu, 3 % (hmotn./objem) mannitolu, lOmM methioninu, 0,01 % (hmotn./objem) poloxameru 188, při pH 6,2.
33. Kompozice podle nároků laž29, vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu v 1 ml, 10 až 100 mmol/litr chloridu sodného, 10 až 50 mmol/litr fosfátu, pH je 6,0 až 7,0 a kompozice popřípadě obsahuje 1 až 5 % (hmotn./objem) polyolu.
-38CZ 304855 B6
34. Kompozice podle nároku 33, vyznačující se tím, že obsahuje maximálně do 20mM methioninu, 0 až 0,1 % (hmotn./objem) poloxameru 188 a popřípadě 7,5 pmol/litr chloridu vápenatého.
35. Kompozice podle nároku 33 nebo 34, vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu v 1 ml, 100 mmol/litr chloridu sodného, lOmM methioninu, 0,01 % (hmotn./objem) poloxameru 188 a 10 mmol/litr fosfátu a pH je 7,0.
36. Kompozice podle nároků laž29, vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu v 1 ml, 10 až 50 mmol/litr argininu, pH je 6 až 6,5 a kompozice dále obsahuje 10 až 100 mmol/litr síranu sodného.
37. Kompozice podle nároku 36, vy z n a č uj í c í se t í m , že obsahuje 20mM methioninu, 0 až 0,1 % (hmotn./objem) poloxameru 188, popřípadě nejvýše 1 mmol/litr chloridu vápenatého a popřípadě 1 až 5 % (hmotn./objem) polyolu.
38. Kompozice podle nároku 36 nebo 37, vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 10 000 pg erythropoetinového proteinu v 1 ml, 40 mmol/litr argininu, pH je 6,2 a kompozice dále obsahuje 30 mmol/litr síranu sodného, 3% (hmotn./objem) mannitolu, lOmM methioninu, 0,01 % (hmotn./objem) poloxameru 188 a popřípadě 1 mmol/litr chloridu vápenatého.
39. Kompozice podle nároků 1 až 29, vyznačující se tím, že obsahuje 25 až 2500 pg/ml erythropoetinového proteinu a
a) 1 OmM fosforečnan sodného/draselného, 100 mM chlorid sodný, pH 7,0 nebo
b) lOmM fosforečnan sodný, 120mM síran sodný, pH 6,2 nebo
c) lOmM fosforečnan sodný, 40mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, pH 6,2 nebo
d) lOmM fosforečnan sodný, 40mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotn./objem) poloxamer 188, pH 6,2 nebo
e) 40mM arginin, 30mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, pH 6,2 nebo
f) 40mM arginin, 30mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotn./objem) poloxamer 188, pH 6,2.
40. Kompozice podle nároků 1 až 39, vyznačující se tím, že množství erythropoetinového proteinu je 50, 100, 400, 800 nebo 2500 pg/ml.
41. Kompozice podle nároku 40, vyznačující se tím, že obsahuje 1 OmM fosforečnan sodný, 40mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotn./objem) poloxamer 188, pH 6,2.
42. Kompozice podle nároku 40, vyznačující se tím, že obsahuje 40mM arginin, 30mM síran sodný, 3% (hmotn./objem) mannitol, lOmM methionin, 0,01% (hmotn./objem) poloxamer 188, pH 6,2.
43. Kompozice podle nároků laž42, vyznačující se tím, že erythropoetinový protein má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2.
44. Způsob přípravy kompozice podle některého z nároků 1 až 43, vyznačující se tím, že se smíchá pegylováný lidský eiythropoetinový protein s roztokem obsahujícím anion
-39CZ 304855 B6 s vícenásobným nábojem, kterým je sulfátový anion, a popřípadě jedním nebo více farmaceuticky vhodnými excipienty a hodnota pH se farmaceuticky vhodným purem nastaví na rozmezí 5,5 až 7,0.
5
45. Použití kompozice podle některého z nároků 1 až 43 pro přípravu léčiva vhodného pro léčení a prevenci chorob korelujících s anemií při chronickém renálním selhání pacientů (CRF), AIDS a/nebo pro léčení pacientů postižených rakovinou, kteří jsou podrobeni chemoterapii.
46. Zařízení pro lokální nebo systemické prodloužené uvolňování, vyznačující se ío t í m , že obsahuje kompozici podle některého z nároků 1 až 43, přičemž toto zařízení je zvoleno ze souboru sestávajícího z implantátu, injekční stříkačky a inhalátoru.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP00110355 | 2000-05-15 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20024005A3 CZ20024005A3 (cs) | 2004-01-14 |
CZ304855B6 true CZ304855B6 (cs) | 2014-12-10 |
Family
ID=8168722
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2002-4005A CZ304855B6 (cs) | 2000-05-15 | 2001-05-08 | Kapalná farmaceutická kompozice obsahující pegylovaný lidský erythropoetin, způsob její přípravy, léčivo pro léčení chorob korelujících s anemií při chronickém renálním selhání a zařízení s jejím obsahem |
Country Status (36)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7169754B2 (cs) |
EP (2) | EP1525889A1 (cs) |
JP (1) | JP3967594B2 (cs) |
KR (3) | KR20070032815A (cs) |
CN (1) | CN1309416C (cs) |
AR (2) | AR035034A1 (cs) |
AT (1) | ATE291436T2 (cs) |
AU (1) | AU784091B2 (cs) |
BR (1) | BRPI0110914B8 (cs) |
CA (1) | CA2408685C (cs) |
CZ (1) | CZ304855B6 (cs) |
DE (1) | DE60109625T3 (cs) |
DK (1) | DK1311285T4 (cs) |
EC (2) | ECSP024352A (cs) |
ES (1) | ES2237574T5 (cs) |
HK (1) | HK1056683A1 (cs) |
HR (1) | HRP20020880B1 (cs) |
HU (1) | HU230874B1 (cs) |
IL (2) | IL152659A0 (cs) |
JO (1) | JO3404B1 (cs) |
MA (1) | MA26901A1 (cs) |
ME (1) | ME00673B (cs) |
MX (1) | MXPA02011303A (cs) |
MY (1) | MY128654A (cs) |
NO (1) | NO330934B1 (cs) |
NZ (1) | NZ522030A (cs) |
PE (1) | PE20020050A1 (cs) |
PL (1) | PL219131B1 (cs) |
PT (1) | PT1311285E (cs) |
RS (1) | RS51292B (cs) |
RU (1) | RU2281116C2 (cs) |
SI (1) | SI1311285T1 (cs) |
TW (2) | TWI288643B (cs) |
UY (1) | UY26704A1 (cs) |
WO (1) | WO2001087329A1 (cs) |
ZA (1) | ZA200208500B (cs) |
Families Citing this family (130)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
US5545553A (en) * | 1994-09-26 | 1996-08-13 | The Rockefeller University | Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them |
US7304150B1 (en) * | 1998-10-23 | 2007-12-04 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
CZ299516B6 (cs) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
EP1276756A4 (en) * | 2000-04-12 | 2004-06-09 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
PT1311285E (pt) * | 2000-05-15 | 2005-06-30 | Hoffmann La Roche | Composicao farmaceutica liquida contendo um derivado de eritropoietina |
WO2002049673A2 (en) * | 2000-12-20 | 2002-06-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg) |
BR0116381A (pt) | 2000-12-20 | 2004-02-25 | Hoffmann La Roche | Conjugado, composição farmacêutica que compreende o mesmo e sua utilização, processo para o tratamento profilático e/ou terapêutico de distúrbios, processo para a preparação de um conjugado, compostos e glicoproteìnas de eritropoetina |
FR2823220B1 (fr) * | 2001-04-04 | 2003-12-12 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo) |
CA2446739A1 (en) * | 2001-05-25 | 2002-12-05 | Human Genome Sciences, Inc. | Chemokine beta-1 fusion proteins |
US20030104996A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-06-05 | Tiansheng Li | L-methionine as a stabilizer for NESP/EPO in HSA-free formulations |
JP2003152145A (ja) * | 2001-08-31 | 2003-05-23 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 半導体放熱用基板とその製造方法及びパッケージ |
US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7399613B2 (en) * | 2001-10-10 | 2008-07-15 | Neose Technologies, Inc. | Sialic acid nucleotide sugars |
US7157277B2 (en) | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
US7179617B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-02-20 | Neose Technologies, Inc. | Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX |
US7696163B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-04-13 | Novo Nordisk A/S | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
US8008252B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-08-30 | Novo Nordisk A/S | Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII |
US7795210B2 (en) * | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7473680B2 (en) | 2001-11-28 | 2009-01-06 | Neose Technologies, Inc. | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
ES2545090T3 (es) * | 2001-12-21 | 2015-09-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Proteínas de fusión de albúmina y GCSF |
WO2003059934A2 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
MXPA04012496A (es) * | 2002-06-21 | 2005-09-12 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Glicoformos del factor vii pegilados. |
SI21258A (sl) * | 2002-07-17 | 2004-02-29 | LEK farmacevtska dru�ba d.d. | Stabilni farmacevtski pripravek, ki vsebuje eritropoietin in poloksamerni poliol |
US7459435B2 (en) | 2002-08-29 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
JP2006511468A (ja) * | 2002-09-09 | 2006-04-06 | ウォーレン ファーマシューティカルズ,インコーポレーテッド | 内因性エリスロポエチンの組織保護活性を維持する長期作用性エリスロポエチン |
CN1703421B (zh) * | 2002-09-20 | 2010-06-23 | 法玛西亚公司 | 降低peg化蛋白的聚集体水平的方法 |
US7459436B2 (en) | 2002-11-22 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
CA2519092C (en) * | 2003-03-14 | 2014-08-05 | Neose Technologies, Inc. | Branched water-soluble polymers and their conjugates |
WO2006127896A2 (en) * | 2005-05-25 | 2006-11-30 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor ix |
EP1615945B1 (en) * | 2003-04-09 | 2011-09-28 | BioGeneriX AG | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
WO2004091499A2 (en) * | 2003-04-09 | 2004-10-28 | Neose Technologies, Inc. | Intracellular formation of peptide conjugates |
ATE540055T1 (de) * | 2003-05-09 | 2012-01-15 | Biogenerix Ag | Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung von glykosylierungsmutanten des menschlichen wachstumshormons |
EP1628686A2 (en) * | 2003-05-12 | 2006-03-01 | Affymax, Inc. | Spacer moiety for poly (ethylene glycol)-modified peptides |
SI1629007T1 (sl) * | 2003-05-12 | 2009-10-31 | Affymax Inc | Novi peptidi, ki se veĹľejo na eritropoetinski receptor |
EP1626983B8 (en) * | 2003-05-12 | 2010-12-22 | Affymax, Inc. | Novel poly (ethylene glycol) modified erythropoietin agonists and uses thereof |
WO2004101611A2 (en) * | 2003-05-12 | 2004-11-25 | Affymax, Inc. | Peptides that bind to the erythropoietin receptor |
WO2004108152A1 (en) * | 2003-06-10 | 2004-12-16 | Lg Life Sciences Ltd. | Stable, aqueous solution of human erythropoietin, not containing serum albumin |
US9005625B2 (en) | 2003-07-25 | 2015-04-14 | Novo Nordisk A/S | Antibody toxin conjugates |
US8633157B2 (en) * | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
CA2547140A1 (en) * | 2003-11-24 | 2005-06-09 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
NZ547554A (en) * | 2003-12-03 | 2009-09-25 | Biogenerix Ag | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
US20080318850A1 (en) * | 2003-12-03 | 2008-12-25 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated Factor Ix |
US7956032B2 (en) | 2003-12-03 | 2011-06-07 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
CN1901934B (zh) | 2003-12-19 | 2013-09-11 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | ***在治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱中的用途 |
CN101072789B (zh) * | 2004-01-08 | 2013-05-15 | 生物种属学股份公司 | 肽的o-连接的糖基化 |
NZ548256A (en) * | 2004-02-02 | 2010-02-26 | Ambrx Inc | Modified human four helical bundle polypeptides and their uses |
DE202004020676U1 (de) * | 2004-03-10 | 2005-11-10 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Erythropoietin-Flüssigformulierung |
US20050282751A1 (en) * | 2004-03-19 | 2005-12-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Therapeutic agent for renal anemia |
WO2005089743A1 (ja) * | 2004-03-19 | 2005-09-29 | Ajinomoto Co., Inc. | 腎性貧血治療剤 |
EA010889B1 (ru) * | 2004-03-26 | 2008-12-30 | Янссен Фармацевтика Н.В. | Комбинированная схема дозирования эритропоэтина |
AR049580A1 (es) * | 2004-07-07 | 2006-08-16 | Lundbeck & Co As H | Epo carbamilada y metodo para su produccion |
US20080300173A1 (en) | 2004-07-13 | 2008-12-04 | Defrees Shawn | Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1] |
US20090292110A1 (en) * | 2004-07-23 | 2009-11-26 | Defrees Shawn | Enzymatic modification of glycopeptides |
US7772182B2 (en) * | 2004-08-05 | 2010-08-10 | Alza Corporation | Stable suspension formulations of erythropoietin receptor agonists |
US20060029551A1 (en) * | 2004-08-05 | 2006-02-09 | Kui Liu | Stable particle formulations of erythropoietin receptor agonists |
WO2006031811A2 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated interferon alpha |
HUE026826T2 (en) | 2004-10-29 | 2016-07-28 | Ratiopharm Gmbh | Modeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF) |
JP2006137678A (ja) * | 2004-11-10 | 2006-06-01 | Shionogi & Co Ltd | インターロイキン−2組成物 |
WO2006062685A2 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-15 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
CA2587382A1 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-08 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
JP2008526864A (ja) * | 2005-01-06 | 2008-07-24 | ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド | 糖断片を用いる糖結合 |
ES2449195T3 (es) | 2005-01-10 | 2014-03-18 | Ratiopharm Gmbh | Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado |
US20090311247A1 (en) * | 2005-01-25 | 2009-12-17 | Apollo Life Sciences Limited | Molecules and chimeric molecules thereof |
EP1866427A4 (en) * | 2005-03-30 | 2010-09-01 | Novo Nordisk As | MANUFACTURING PROCESS FOR THE PRODUCTION OF CULTIVE PEPTIDES IN CELL LINES OF INSECTS |
WO2006121569A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-11-16 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
US20070037886A1 (en) * | 2005-04-26 | 2007-02-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Bone marrow erythroid progenitor cell(s) differentiation inducer |
EP1888098A2 (en) * | 2005-05-25 | 2008-02-20 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin formulations |
US20110003744A1 (en) * | 2005-05-25 | 2011-01-06 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated Erythropoietin Formulations |
US7919461B2 (en) | 2005-06-03 | 2011-04-05 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US7550433B2 (en) | 2005-06-03 | 2009-06-23 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US8324159B2 (en) * | 2005-06-03 | 2012-12-04 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US7790679B2 (en) | 2005-08-05 | 2010-09-07 | Amgen Inc. | Pharmaceutical formulations |
US20070105755A1 (en) * | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
US20090305967A1 (en) * | 2005-08-19 | 2009-12-10 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor vii and factor viia |
US20070072795A1 (en) * | 2005-09-28 | 2007-03-29 | Anton Haselbeck | Treatment of neurodegenerative disorders |
US20090048440A1 (en) * | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
US8128933B2 (en) | 2005-11-23 | 2012-03-06 | Acceleron Pharma, Inc. | Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody |
DK1973559T3 (da) | 2005-11-23 | 2013-03-25 | Acceleron Pharma Inc | Activin-ActRIIa antagonister samt anvendelser til fremme af knoglevækst |
CN101015684B (zh) * | 2006-02-10 | 2011-08-24 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种重组人红细胞生成素溶液制剂 |
WO2007108505A1 (ja) * | 2006-03-22 | 2007-09-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | エリスロポエチン溶液製剤 |
ES2516694T3 (es) * | 2006-07-21 | 2014-10-31 | Ratiopharm Gmbh | Glicosilación de péptidos a través de secuencias de glicosilación con unión en O |
JP5723528B2 (ja) * | 2006-08-04 | 2015-05-27 | プロロング ファーマシューティカルズ エルエルシー | 修飾されたエリスロポエチン |
US8969532B2 (en) | 2006-10-03 | 2015-03-03 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography |
KR101556248B1 (ko) * | 2006-10-04 | 2015-09-30 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 글리세롤이 연결된 페길화된 당 및 글리코펩티드 |
US20080207487A1 (en) * | 2006-11-02 | 2008-08-28 | Neose Technologies, Inc. | Manufacturing process for the production of polypeptides expressed in insect cell-lines |
US8895016B2 (en) | 2006-12-18 | 2014-11-25 | Acceleron Pharma, Inc. | Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels |
TWI782836B (zh) | 2007-02-02 | 2022-11-01 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 衍生自ActRIIB的變體與其用途 |
PL2144923T3 (pl) | 2007-04-03 | 2013-12-31 | Biogenerix Ag | Sposoby leczenia z użyciem glikopegilowanego G-CSF |
US20090053167A1 (en) * | 2007-05-14 | 2009-02-26 | Neose Technologies, Inc. | C-, S- and N-glycosylation of peptides |
US20080286341A1 (en) * | 2007-05-16 | 2008-11-20 | Sven-Borje Andersson | Buffered coated nicotine containing products |
US20110177029A1 (en) * | 2007-06-04 | 2011-07-21 | Novo Nordisk A/S | O-linked glycosylation using n-acetylglucosaminyl transferases |
US9493499B2 (en) | 2007-06-12 | 2016-11-15 | Novo Nordisk A/S | Process for the production of purified cytidinemonophosphate-sialic acid-polyalkylene oxide (CMP-SA-PEG) as modified nucleotide sugars via anion exchange chromatography |
US7951368B2 (en) * | 2007-06-25 | 2011-05-31 | Amgen Inc. | Compositions of specific binding agents to hepatocyte growth factor |
US7968811B2 (en) * | 2007-06-29 | 2011-06-28 | Harley-Davidson Motor Company Group, Inc. | Integrated ignition and key switch |
CL2008002053A1 (es) * | 2007-07-17 | 2009-05-22 | Hoffmann La Roche | Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion. |
CL2008002054A1 (es) | 2007-07-17 | 2009-05-29 | Hoffmann La Roche | Metodo para la regeneracion de una columna de cromatografia de intercambio cationico despues de la elusion de eritropoyetina monopeguilada y metodo para obtener una eritropoyetina monopeguilada, incorporando el metodo de regeneracion de la columna de intercambio cationico. |
EP2578235A3 (en) | 2007-08-27 | 2013-08-28 | BioGeneriX AG | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
US8207112B2 (en) * | 2007-08-29 | 2012-06-26 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
CN101456911A (zh) * | 2007-12-12 | 2009-06-17 | 江苏豪森药业股份有限公司 | ***模拟肽衍生物及其可药用盐和其制备方法与用途 |
CN102037004A (zh) * | 2008-01-08 | 2011-04-27 | 生物种属学股份公司 | 使用寡糖基转移酶的多肽的糖缀合 |
WO2009108806A1 (en) | 2008-02-27 | 2009-09-03 | Novo Nordisk A/S | Conjugated factor viii molecules |
TWI626945B (zh) | 2008-08-14 | 2018-06-21 | 艾瑟勒朗法瑪公司 | 使用gdf阱以增加紅血球水平 |
US8216997B2 (en) | 2008-08-14 | 2012-07-10 | Acceleron Pharma, Inc. | Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators |
EP2334699B1 (en) * | 2008-09-23 | 2013-09-11 | F. Hoffmann-La Roche AG | Purification of erythropoietin |
EP2440576A4 (en) | 2009-06-08 | 2013-11-20 | Acceleron Pharma Inc | PROCESS FOR INCREASING THE NUMBER OF THERMOUS ADIPOCYTES |
KR20210034684A (ko) | 2009-06-12 | 2021-03-30 | 악셀레론 파마 인코포레이티드 | 절두된 ActRIIB-FC 융합 단백질 |
US8357301B2 (en) | 2009-06-24 | 2013-01-22 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Chromatography equipment characterization |
BRPI0902481B8 (pt) | 2009-07-31 | 2021-05-25 | Soc Beneficente De Senhoras Hospital Sirio Libanes | composição farmacêutica compreendendo hemopressina e seu uso. |
EP3838919A1 (en) * | 2009-08-13 | 2021-06-23 | Acceleron Pharma Inc. | Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels |
MX2012003558A (es) * | 2009-09-23 | 2012-07-03 | Biogenerix Ag | Procedimiento para la purificacion de eritropoyetina humana recombinante (epo), epo asi purificada y composiciones farmaceuticas que la comprenden. |
EP2501400B1 (en) | 2009-11-17 | 2017-11-01 | Acceleron Pharma, Inc. | Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy |
WO2012084828A1 (en) | 2010-12-21 | 2012-06-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Chromatography equipment characterization |
AR094821A1 (es) | 2012-07-25 | 2015-09-02 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada |
CN102816227A (zh) * | 2012-08-30 | 2012-12-12 | 深圳赛保尔生物药业有限公司 | 回收***的方法 |
KR102279522B1 (ko) | 2012-11-02 | 2021-07-19 | 셀진 코포레이션 | 골 및 다른 장애를 치료하기 위한 액티빈-actrii 길항제 및 용도 |
CU20140003A7 (es) | 2014-01-08 | 2015-08-27 | Ct De Inmunología Molecular Biofarmacuba | Conjugado que comprende eritropoyetina y una estructura polimérica ramificada |
US10052361B2 (en) | 2014-03-29 | 2018-08-21 | Intas Pharmaceuticals Ltd | Liquid pharmaceutical composition of conjugated erythropoietin |
EP3154566B1 (en) | 2014-06-13 | 2022-08-03 | Acceleron Pharma Inc. | Actrii antagonist for the treatment or prevention of a cutaneous ulcer in a subject that has anemia |
US11608357B2 (en) | 2018-08-28 | 2023-03-21 | Arecor Limited | Stabilized antibody protein solutions |
EP3372241A1 (en) | 2017-03-06 | 2018-09-12 | Ares Trading S.A. | Liquid pharmaceutical composition |
EP3372242A1 (en) | 2017-03-06 | 2018-09-12 | Ares Trading S.A. | Liquid pharmaceutical composition |
WO2018184692A1 (en) * | 2017-04-07 | 2018-10-11 | Ares Trading S.A. | Liquid pharmaceutical composition |
JP7227633B2 (ja) * | 2017-12-29 | 2023-02-22 | エフ. ホフマン-ラ ロシュ エージー. | Peg化タンパク質組成物を提供するための方法 |
CN111558046A (zh) * | 2020-05-27 | 2020-08-21 | 华润昂德生物药业有限公司 | 海藻糖在制备重组人促红素液体制剂中的应用及重组人促红素液体制剂、制备方法和应用 |
TWI740635B (zh) * | 2020-09-09 | 2021-09-21 | 財團法人工業技術研究院 | 聚偏氟乙烯薄膜組成物及聚偏氟乙烯隔離膜 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0178665A2 (en) * | 1984-10-18 | 1986-04-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stable erythropoietin preparation and process for formulating the same |
GB2171304A (en) * | 1985-02-06 | 1986-08-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Compositions containing erythropoietin |
US4992419A (en) * | 1987-05-09 | 1991-02-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabilized erythropoietin preparations |
WO1996040073A2 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
EP0909564A1 (en) * | 1996-04-26 | 1999-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Erythropoietin solution preparation |
Family Cites Families (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US115833A (en) * | 1871-06-13 | Improvement in grain-driers | ||
US147431A (en) * | 1874-02-10 | Improvement in game boards | ||
DE3734923C1 (de) | 1987-10-15 | 1989-01-26 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung einer sterilen Plasmaproteinloesung,die Fibrinogen und den Gerinnungsfaktor XIII enthaelt |
DE4014654A1 (de) | 1990-05-08 | 1991-11-14 | Behringwerke Ag | Galenische waessrige formulierungen von erythropoietin und ihre verwendung |
CA2069746A1 (en) * | 1990-09-28 | 1992-03-29 | Jonathan I. Rosen | Hybrid growth factors |
US5272135A (en) | 1991-03-01 | 1993-12-21 | Chiron Ophthalmics, Inc. | Method for the stabilization of methionine-containing polypeptides |
US6565841B1 (en) | 1991-03-15 | 2003-05-20 | Amgen, Inc. | Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor |
NZ244778A (en) | 1991-10-21 | 1994-03-25 | Ortho Pharma Corp | Peg imidates and protein derivatives thereof |
DE4135542A1 (de) | 1991-10-28 | 1993-04-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Lagerfaehige proteinloesungen |
US5460944A (en) | 1991-10-28 | 1995-10-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Storable protein solution |
US5661125A (en) * | 1992-08-06 | 1997-08-26 | Amgen, Inc. | Stable and preserved erythropoietin compositions |
US5354934A (en) † | 1993-02-04 | 1994-10-11 | Amgen Inc. | Pulmonary administration of erythropoietin |
WO1994028024A1 (en) | 1993-06-01 | 1994-12-08 | Enzon, Inc. | Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity |
ZA946122B (en) * | 1993-08-17 | 1995-03-20 | Amgen Inc | Erythropoietin analogs |
US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
JP4410852B2 (ja) * | 1996-08-02 | 2010-02-03 | オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド | 単一の共有結合n末端水溶性ポリマーを有するポリペプチド |
US5919656A (en) | 1996-11-15 | 1999-07-06 | Amgen Canada Inc. | Genes encoding telomerase protein 1 |
EP0885613A1 (de) | 1997-06-21 | 1998-12-23 | Roche Diagnostics GmbH | Verwendung von modifizierten Hämoglobinen zur Behandlung von Anämien und Kombinationspräparate umfassend Erythropoietin und modifiziertes Hämoglobin |
DE19734293A1 (de) | 1997-08-08 | 1999-02-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung von pharmazeutischen Kombinationspräparaten enthaltend Erythropoietin und Eisenpräparate zur Behandlung von rheumatischen Erkrankungen |
AR020848A1 (es) | 1998-10-23 | 2002-05-29 | Amgen Inc | Metodos y composiciones para la prevencion y el tratamiento de anemia |
UY25790A1 (es) | 1998-11-06 | 2000-08-21 | Bio Sidus S A | Formas farmaceuticas de eritropoyetina humana recombinante estables a temperatura ambiente y apropiadas para su uso en humanos, formulaciones y procedimientos de liofilizacion para su obtencion. |
JP2000247903A (ja) * | 1999-03-01 | 2000-09-12 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 長期安定化製剤 |
EP1181036B1 (en) † | 1999-04-09 | 2008-07-23 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Pharmaceutical compositions of erythropoietin |
US6309663B1 (en) | 1999-08-17 | 2001-10-30 | Lipocine Inc. | Triglyceride-free compositions and methods for enhanced absorption of hydrophilic therapeutic agents |
CZ299516B6 (cs) † | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
PE20010288A1 (es) * | 1999-07-02 | 2001-03-07 | Hoffmann La Roche | Derivados de eritropoyetina |
EA006220B1 (ru) | 1999-07-22 | 2005-10-27 | Авентис Фармасьютиклс, Инк. | Многодозовые эритропоэтиновые составы |
EP1232753B1 (en) † | 1999-09-08 | 2008-03-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stable protein solution filled in a container made from a hydrophobic resin and method of stabilizing the same |
EP1260230A4 (en) | 2000-02-29 | 2008-08-06 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | LONG-TERM STABILIZED PREPARATIONS |
US6586398B1 (en) | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
PT1311285E (pt) * | 2000-05-15 | 2005-06-30 | Hoffmann La Roche | Composicao farmaceutica liquida contendo um derivado de eritropoietina |
EP1336410A4 (en) † | 2000-08-04 | 2005-10-12 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | PROTEIN INJECTION PREPARATIONS |
BR0116381A (pt) * | 2000-12-20 | 2004-02-25 | Hoffmann La Roche | Conjugado, composição farmacêutica que compreende o mesmo e sua utilização, processo para o tratamento profilático e/ou terapêutico de distúrbios, processo para a preparação de um conjugado, compostos e glicoproteìnas de eritropoetina |
US20030104996A1 (en) | 2001-08-30 | 2003-06-05 | Tiansheng Li | L-methionine as a stabilizer for NESP/EPO in HSA-free formulations |
US6818613B2 (en) | 2001-11-07 | 2004-11-16 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Aqueous sustained-release formulations of proteins |
-
2001
- 2001-05-08 PT PT01943331T patent/PT1311285E/pt unknown
- 2001-05-08 ES ES01943331.7T patent/ES2237574T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-08 AU AU65934/01A patent/AU784091B2/en not_active Expired
- 2001-05-08 EP EP05000984A patent/EP1525889A1/en not_active Withdrawn
- 2001-05-08 AT AT01943331T patent/ATE291436T2/de active
- 2001-05-08 JP JP2001583796A patent/JP3967594B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-08 KR KR1020077003371A patent/KR20070032815A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-05-08 RS YUP-835/02A patent/RS51292B/sr unknown
- 2001-05-08 DE DE60109625.8T patent/DE60109625T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-08 ME MEP-2008-907A patent/ME00673B/me unknown
- 2001-05-08 CZ CZ2002-4005A patent/CZ304855B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-05-08 CN CNB018095607A patent/CN1309416C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-08 CA CA2408685A patent/CA2408685C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-08 HU HU0302114A patent/HU230874B1/hu unknown
- 2001-05-08 EP EP01943331.7A patent/EP1311285B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-08 KR KR1020027015429A patent/KR100758044B1/ko active IP Right Grant
- 2001-05-08 KR KR1020057023568A patent/KR20050121762A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-05-08 BR BRPI0110914A patent/BRPI0110914B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-05-08 MX MXPA02011303A patent/MXPA02011303A/es active IP Right Grant
- 2001-05-08 DK DK01943331.7T patent/DK1311285T4/en active
- 2001-05-08 NZ NZ522030A patent/NZ522030A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-05-08 IL IL15265901A patent/IL152659A0/xx unknown
- 2001-05-08 RU RU2002133236/15A patent/RU2281116C2/ru active
- 2001-05-08 WO PCT/EP2001/005187 patent/WO2001087329A1/en not_active Application Discontinuation
- 2001-05-08 SI SI200130331T patent/SI1311285T1/xx unknown
- 2001-05-08 PL PL361341A patent/PL219131B1/pl unknown
- 2001-05-09 JO JOP/2001/0065A patent/JO3404B1/ar active
- 2001-05-11 MY MYPI20012197A patent/MY128654A/en unknown
- 2001-05-11 US US09/853,731 patent/US7169754B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-11 AR ARP010102248A patent/AR035034A1/es not_active Application Discontinuation
- 2001-05-11 PE PE2001000421A patent/PE20020050A1/es active IP Right Grant
- 2001-05-14 TW TW090111453A patent/TWI288643B/zh not_active IP Right Cessation
- 2001-05-14 UY UY26704A patent/UY26704A1/es not_active IP Right Cessation
- 2001-05-14 TW TW094134688A patent/TWI288644B/zh not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-10-21 ZA ZA200208500A patent/ZA200208500B/en unknown
- 2002-11-05 IL IL152659A patent/IL152659A/en active IP Right Grant
- 2002-11-07 HR HR20020880A patent/HRP20020880B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-11-13 MA MA26907A patent/MA26901A1/fr unknown
- 2002-11-14 NO NO20025450A patent/NO330934B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-11-20 EC EC2002004352A patent/ECSP024352A/es unknown
-
2003
- 2003-12-11 HK HK03109033A patent/HK1056683A1/xx unknown
-
2004
- 2004-02-17 US US10/780,297 patent/US7202208B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-12-21 EC EC2010004352A patent/ECSP10004352A/es unknown
-
2013
- 2013-10-04 AR ARP130103618A patent/AR092919A2/es not_active Application Discontinuation
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0178665A2 (en) * | 1984-10-18 | 1986-04-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stable erythropoietin preparation and process for formulating the same |
GB2171304A (en) * | 1985-02-06 | 1986-08-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Compositions containing erythropoietin |
US4992419A (en) * | 1987-05-09 | 1991-02-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabilized erythropoietin preparations |
WO1996040073A2 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
EP0909564A1 (en) * | 1996-04-26 | 1999-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Erythropoietin solution preparation |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7202208B2 (en) | Erythropoietin composition | |
US6583272B1 (en) | Erythropoietin conjugates | |
JP4190184B2 (ja) | ポリエチレングリコールを有するエリスロポエチン接合体 | |
AU2005225151B2 (en) | New pharmaceutical composition | |
RU2232163C2 (ru) | Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20210508 |