TW202342541A - 單域抗Ｎｅｃｔｉｎ－４抗體 - Google Patents

Abstract

本發明提供了一種對人類Nectin-4蛋白具有出色的結合親和力的單域抗體。這些抗體特別適合被包含在雙特異性抗體中，例如還靶向免疫細胞上的抗原的抗體。

Description

單域抗Nectin-4抗體

本發明屬於細胞免疫學領域，涉及一種對人類Nectin-4蛋白具有特異性的單域抗體及其用途。

Nectin家族是由Nectin-1、-2、-3和-4四個成員組成的Ca²⁺非依賴性免疫球類蛋白分子。Nectin蛋白在細胞-細胞粘附中起作用。它們通過它們的細胞質尾部結合肌動蛋白絲(F-actin)結合蛋白afadin，並與肌動蛋白血球骨架聯合，與其他細胞粘附分子和細胞表面膜受體配合，調節許多其他細胞活動，如移動、分化、極化和病毒的進入。

Nectin-4，也稱為脊髓灰質炎病毒受體相關蛋白4(PVRL4)，是一種大小約52kDa的I型單次跨膜蛋白。Nectin-4的胞外結構域有三個類Ig亞結構域，分別為V、C1和C2。

Nectin-1、-2和-3在成人組織中廣泛表現，但Nectin-4在胚胎和胎盤中特異性表現。然而，已經證明Nectin-4可以在各種癌細胞中表現，使其成為癌症治療的合適靶點。

在各種實施方式中，本發明提供了對人類Nectin-4蛋白具有結合特異性的單域抗體。這些抗體可以與食蟹猴Nectin-4交叉反應。憑藉出 色的結合親和力和小尺寸，這些抗體可以適當地用於生成雙特異性抗體，例如也靶向免疫細胞的抗體。

因此，根據本發明的一個實施方式，提供了一種對人類Nectin-4蛋白具有特異性的單域抗體或其抗原結合片段，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中該CDR1、CDR2和CDR3分別包含抗體CMB7-6、CMB7-7、CMB7-8、CMB7-9、CMB7-10、CMB7-11、CMB7-12、CMB7-17、CMB7-18、CMB7-19、CMB7-20、CMB7-21、CMB7-22、或CMB7-23中任何一種的CDR1、CDR2和CDR3序列。這些示例性抗體具有如SEQ ID NO：1-14所示的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該CDR1、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID NO：5-17、SEQ ID NO：18-20、SEQ ID NO：21-23、SEQ ID NO：24-26、SEQ ID NO：27-29、SEQ ID NO：30-32、SEQ ID NO：33-35、SEQ ID NO：36-38、SEQ ID NO：39-41、SEQ ID NO：42-44、SEQ ID NO：45-47、SEQ ID NO：48-50、SEQ ID NO：51-53或SEQ ID NO：54-56。

在一些實施方式中，該單域抗體包含選自SEQ ID NO：1-14的胺基酸序列。

本發明還提供了一種雙特異性抗體，其包含本發明公開的單域抗體或其抗原結合片段和對不同於Nectin-4的抗原具有特異性的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施方式中，該抗原為人類CD3。

在一些實施方式中，該雙特異性抗體包含四個單域抗體，每種單域抗體都融合至對人類CD3具有特異性的完整抗原結合片段(fragment-antigen binding；Fab)抗體的重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區 (VL)。在一些實施方式中，每個單鏈結構域抗體都通過肽接頭融合至VH 或VL。

在一些實施方式中，該肽接頭具有長於7個胺基酸的長度。在一些實施方式中，肽接頭具有短於50個胺基酸的長度。

本發明還提供了編碼任何該抗體或片段的多核苷酸。

本發明還提供了一種組合物用於製備治療疾病(例如癌症)癌症之藥物的用途，其中該組合物包括有效量的本發明的抗體或片段。

圖1顯示了證實抗體表現的SDS-PAGE圖像。縮寫：NR指非還原性(Non-reducing)；R指還原性(reducing)。

圖2顯示了基於酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)的抗體親和力測試的結果。縮寫：2^nd Ab指第二抗體(secondary antibody)。

圖3顯示了所有抗人類Nectin-4 VHH抗體與食蟹猴Nectin-4交叉反應。

圖4說明了測試的雙特異性抗體的兩種形式(形式A和形式B)。

圖5顯示了在Nectin-4表現細胞的存在下進行T細胞活化檢測的結果。縮寫：IF指免疫螢光色(immunofluorescence)。

圖6顯示了目標Nectin-4表現細胞(MCF-7細胞)的T細胞殺傷結果

圖7顯示了目標Nectin-4表現細胞(T-47D細胞)的T細胞殺傷結果。

定義

需要注意的是，術語「一種」實體是指該實體中的一個或多個；例如，「一種抗體」被理解為代表一個或多個抗體。因此，術語「一」(或「一個」)、「一個或多個」和「至少一個」在本文中可以互換使用。

本文所用，術語「多肽」旨在包含單數「多肽」以及複數「多肽」，並且是指由通過醯胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(胺基酸)組成的分子。術語「多肽」指兩個或多個胺基酸的任何一條或多條鏈，而不是指產品的特定長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於指代兩個或多個胺基酸鏈的任何其他術語均包括在「多肽」的定義內，並且術語「多肽」可以用來代替、或與這些術語中的任何一個互換。術語「多肽」還意指多肽表現後修飾的產物，包括但不限於醣基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、通過已知的保護/阻斷基團衍生、蛋白水解裂解或通過非天然存在的胺基酸修飾。多肽可以來自天然生物來源或通過重組技術生產，但不一定是從指定的核酸序列轉譯而來。它可以以任何方式產生，包括通過化學合成。

本文中關於細胞、核酸(例如DNA或RNA)使用的術語「分離的」指分別與大分子天然來源中存在的其他DNA或RNA分離的分子。本文使用的術語「分離的」還指當通過重組DNA技術生產時基本上不含細胞材料、病毒材料或培養基的核酸或肽，或在化學合成時基本上不含化學前體或其他化學品的核酸或肽。此外，「分離的核酸」指的是不以片段形式天然出現且不會在天然狀態下發現的核酸片段。術語「分離的」在本文中也 用於指從其他細胞蛋白質或組織分離的細胞或多肽。分離的多肽意在包括純化的和重組的多肽。

如本文所用，涉及多肽或多核苷酸的術語「重組」意指不天然存在的多肽或多核苷酸形式，其非限制性示例可通過組合通常不會同時出現的多核苷酸或多肽來創建。

「同源性」或「同一性」或「相似性」是指兩個肽或兩個核酸分子之間的序列相似性。同源性可以通過比較每個序列中的位置來確定，為了進行比較的目的，這些位置可能會被對齊。當比較序列中的一個位置被相同的鹼基或胺基酸佔據時，則分子在該位置是同源的。序列之間的同源程度是序列共享的匹配或同源位置數量的函數。「不相關的」或「非同源」序列與本發明的其中一個序列具有小於40%的同一性，但較佳地小於25%的同一性。

多核苷酸或多核苷酸區域(或多肽或多肽區域)與另一個序列具有一定百分比(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)的「序列同一性」，這意味著，當對齊時，在比較兩個序列時，鹼基(或胺基酸)的百分比相同。這種比對和同源性百分比或序列同一性可以使用本領域已知的軟體程式來確定，例如Ausubel et al.eds.(2007)Current Protocols in Molecular Biology中所描述的那些。較佳地，默認參數用於對齊。一種對齊程序是BLAST，使用默認參數。特別是，程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默認參數：遺傳代碼=標準；過濾器=無；股=兩者；截止值=60；期望值=10；矩陣=62；描述=50個序列；排序方式=高分；數據庫=非冗餘，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank-CDS- translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。生物等效多核苷酸是指具有上述指定百分比同源性並編碼具有相同或相似生物活性的多肽的多核苷酸。

術語「等效核酸或多核苷酸」是指具有與該核酸或其補體的核苷酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的核苷酸序列的核酸。雙鏈核酸的同源物旨在包括與其補體具有一定程度的同源性核苷酸序列的核酸。一方面，核酸的同源物能夠與核酸或其補體雜交。同樣，「等效多肽」指與參考多肽的胺基酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的多肽。在一些方面，序列同一性為至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。在一些方面，與參考多肽或多核苷酸相比，等效多肽或多核苷酸具有一個、兩個、三個、四個或五個添加、缺失、取代及其組合。在一些方面，等效序列保留參考序列的活性(例如表位結合)或結構(例如鹽橋)。

雜交反應可以在不同的「嚴格」條件下進行。一般來說，低嚴格雜交反應在約40℃下，在約10xSSC或具有同等離子強度/溫度的溶液中進行。中嚴格雜交通常在約50℃下在約6xSSC中進行，而高嚴格雜交反應通常在約60℃下在約1xSSC中進行。雜交反應也可以在本發明所屬技術領域之通常知識者熟知的「生理條件」下進行。生理條件的非限制性示例是細胞中通常存在的溫度、離子強度、pH值和Mg²⁺濃度。

多核苷酸由四個核苷酸鹼基的特定序列組成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；當多核苷酸是RNA時，尿嘧啶(U)代表胸腺嘧啶。因此，術語「多核苷酸序列」是多核苷酸分子的按字母順序排列的表示。這種按字母順序排列的表示可以輸入具有中央處理單 元的計算機中的數據庫，並用於生物資訊學應用，如功能基因組學和同源性搜索。術語「多態性」指的是一種以上的基因形式或其部分共存。基因的一部分中至少有兩種不同形式，即兩種不同的核苷酸序列，被稱為「基因多態區」。多態區可以是單個核苷酸，其身份在不同的等位基因中不同。

術語「多核苷酸」和「寡核苷酸」可互換使用，是指任何長度的核苷酸的聚合形式，無論是去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可以具有任何三維結構，並且可以執行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段(例如探針、引子、EST或SAGE標籤)、外顯子、內含子、訊息RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)、核醣體RNA(rRNA)、核酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質體、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引子。多核苷酸可包含經修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，可在多核苷酸組裝之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸序列可被非核苷酸成分打斷。多核苷酸可以在聚合後進一步被修飾，例如通過與標記組分共軛。該術語還指雙鏈和單鏈分子。除非另有說明或要求，否則本發明的任何多核苷酸實施方式均包含雙鏈形式和已知或預測構成雙鏈形式的兩種互補單鏈形式中的每一種。

用於多核苷酸的術語「編碼」是指多核苷酸，如果在其天然狀態下或當由本發明所屬技術領域之通常知識者熟知的方法操作時，其可被轉錄和/或轉譯以產生該多肽和/或其片段的mRNA，則被稱為「編碼」多肽。反義鏈是這種核酸的補體，編碼序列可以從中推導出來。

如本文所用，「抗體」或「抗原結合多肽」是指特異性識別 並結合抗原的多肽或多肽複合物。抗體可以是整個抗體和任何抗原結合片段或其單鏈。因此，術語「抗體」包括任何含有蛋白質或肽的分子，其包含具有與抗原結合的生物活性的免疫球蛋白分子的至少一部分。此類示例包括但不限於重鏈或輕鏈或其配體結合部分的互補決定區(CDR)、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、框架(FR)區或其任何部分，或結合蛋白的至少一部分。

術語「抗體片段」或「抗原結合片段」，如本文所用，是抗體的一部分，例如F(ab’)₂、F(ab)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv等。無論結構如何，抗體片段都與完整抗體所識別的相同抗原結合。術語「抗體片段」包括適體、鏡像體和雙體。術語「抗體片段」還包括通過結合特定抗原形成複合物而起到抗體作用的任何合成或基因工程蛋白質。

「單鏈可變片段」或「scFv」是指免疫球蛋白重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區的融合蛋白。在一些方面，這些區域與10至約25個胺基酸的短接頭連接。該接頭可以富含甘胺酸以提高靈活性，也可以富含絲胺酸或蘇胺酸以提高溶解度，並且可以連接VH的N-末端和VL的C-末端，反之亦然。儘管去除了恆定區並引入了接頭，該蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特異性。本領域已知並描述了scFv分子，例如在美國專利5,892,019中所述。

術語抗體包括各種可以在生物化學上區分的廣泛類別的多肽。本發明所屬技術領域之通常知識者將理解，重鏈被分類為γ、μ、α、δ、ε，其中包括一些子類(例如，γ1-γ4)。正是這條鏈的性質決定了抗體的「類別」分別為IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)，例如 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等都有很好的特徵，並且已知具有功能專一性。鑑於本發明，本發明所屬技術領域之通常知識者容易識別出這些類別和同種型中的每一個的修改版本，並且涵蓋在本發明的範圍內。所有免疫球蛋白類別顯然都在本發明的範圍內，以下討論通常針對免疫球蛋白分子的IgG類別。關於IgG，標準免疫球蛋白分子包含兩條相同的分子量約為23000道爾頓的輕鏈多肽和兩條相同的分子量為53000-70000道爾頓的重鏈多肽。這四條鏈通常通過二硫鍵以「Y」形結構連接，其中輕鏈從「Y」口開始包圍重鏈，並繼續通過可變區域。

「特異性結合」或「具有特異性」通常意味著抗體通過其抗原結合結構域與表位(epitope)結合，並且這種結合需要抗原結合結構域與表位之間的一些互補性。根據這一定義，當抗體通過其抗原結合結構域與表位結合時，它比隨機的、不相關的表位更容易「特異性結合」到該表位。本文使用術語「特異性」來限定特定抗體與特定表位結合的相對親和力。例如，抗體「A」可被認為比抗體「B」對給定表位具有更高的特異性，或者抗體「A」可能被認為與表位「C」結合的特異性比相關表位「D」更高。

如本文所用，術語「治療」或「療法」是指醫療性治療和預防或預防性措施，其中目的是預防或減緩(減輕)不期望的生理變化或紊亂，例如癌症的進展。有益的或期望的臨床結果包括但不限於症狀緩解、疾病程度減輕、疾病狀態穩定(即不惡化)、疾病進展延遲或減緩、疾病狀態改善或減輕，以及緩解(部分或全部)，無論可檢測或不可檢測。「治療」還可以意味著與未接受治療的預期生存期相比延長生存期。需要治療的人 包括已經患有該疾病或紊亂的人，以及容易患有該疾病或紊亂的人，或者需要預防該疾病或紊亂的人。

「對象」或「個體」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」是指需要診斷、預後或治療的任何對象，尤其是哺乳動物對象。哺乳動物對象包括人類、家畜、農場動物、動物園動物、運動動物或寵物動物，如狗、貓、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。

如本文所用，諸如「對需要治療的患者」或「需要治療的對象」之類的短語包括將受益於施用了用於檢測、診斷程序和/或治療的本發明的抗體或組合物的對象，例如哺乳動物對象。

單域抗Nectin-4抗體

Nectin蛋白在細胞-細胞粘附中起重要作用。Nectin-4是一種大小約52kDa的I型單次跨膜蛋白。與在成人組織中廣泛表現的Nectin-1、-2和-3不同，Nectin-4在胚胎和胎盤中特異表現。然而，Nectin-4也可以在各種癌細胞中表現，使其成為癌症治療的合適靶點。

本發明提供單域抗體形式的抗-Nectin-4抗體。單域抗體(sdAb)，也稱為奈米抗體，是由單個單體可變抗體域組成的抗體片段。最早的單域抗體是從駱駝科動物中發現的重鏈抗體改造而來的，也稱為VHH片段。與常規抗體的VH一樣，每個VHH包括三個CDR，CDR1、CDR2和CDR3。VHH可以進一步包括恆定域，例如CH2和CH3。

如圖2所示，從CMB7-6到CMB7-23的所有已鑑定的VHH抗體均表現出與人類Nectin-4蛋白的強結合。同時，這些抗體中的大部分與相應的食蟹猴蛋白也有很強的親和力(圖3)，使其可以在作為臨床前模型的 食蟹猴中進行測試。

其中一種抗體CMB7-6(VHH 36)以兩種不同形式(圖4)的雙特異性抗體進行測試，其也靶向人類CD3複合物。圖5-7中的結果顯示，B形式的雙特異性抗體表現出優異的T細胞活化和T細胞殺傷活性。因此，這些VHH抗體可適當用於治療癌症等疾病。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括CDR1、CDR2和CDR3，分別具有抗體CMB7-6、CMB7-7、CMB7-8、CMB7-9、CMB7-10、CMB7-11、CMB7-12、CMB7-17、CMB7-18、CMB7-19、CMB7-20、CMB7-21、CMB7-22或CMB7-23的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。這些抗體的序列在表1中提供，如SEQ ID NO：1-14所示。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：15-17的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：18-20的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：21-23的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：24-26的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：27-29的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：30-32的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一個實施方式，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：33-35的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：36-38的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：39-41的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：42-44的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：45-47的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：48-50胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：51-53的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括分別具有SEQ ID NO：54-56胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：1-14中任一項的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：1-14中任一項具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，與SEQ ID NO：1-14中的任一項具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：1的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：1具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，與SEQ ID NO：1具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：15、16和17。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：2具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，與SEQ ID NO：2具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：18、19和20。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：3的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：3具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，與SEQ ID NO：3具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：21、22和23。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：4的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：4具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，與SEQ ID NO：4具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：24、25和26。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：5的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：5具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，與SEQ ID NO：5具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：27、28和29。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：6具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，與SEQ ID NO：6具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：30、31和32。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：7的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：7中具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，與SEQ ID NO：7具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：33、34和35。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：8的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：8具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，與SEQ ID NO：8具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：36、37和38。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：9的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：9具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，與SEQ ID NO：9具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：39、40和41。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：10的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：10具有至少85%、90%、 95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，與SEQ ID NO：10具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：42、43和44。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：11具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，與SEQ ID NO：11具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：45、46和47。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：12具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，與SEQ ID NO：12具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：48、49和50。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：13的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：13具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，與SEQ ID NO：13具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：51、52和53。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：14的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：14具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，與SEQ ID NO：14具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列保 留了相應參考抗體的CDR序列，例如SEQ ID NO：54、55和56。

在一個實施方式中，提供了一種抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：1-14中任一項的胺基酸序列，可選地具有1、2、3、4或5個胺基酸的添加、缺失和/或取代。在一些實施方式中，該取代是保守取代。在一些實施方式中，該添加、缺失和/或取代在框架區(framework regions)內。

在一些實施方式中，該抗體或片段進一步包括恆定結構域，例如CH2和/或CH3。在一些實施方式中，該CH2和/或CH3來自人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列。

在一些實施方式中，該取代是保守取代。「保守胺基酸取代」是指用具有類似側鏈的胺基酸殘基取代胺基酸殘基。本領域已經定義了具有類似側鏈的胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如，賴胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、谷胺酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、谷氨醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)，非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、***酸、蛋胺酸、色胺酸)、β支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)和芳香側鏈(例如酪胺酸、***酸、色胺酸、組胺酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需胺基酸殘基較佳地被來自相同側鏈家族的另一胺基酸殘基取代。在另一種實施方式中，胺基酸串可被結構相似的串取代，其在側鏈家族成員的順序和/或組成上不同。

下表提供了保守胺基酸取代的非限制性示例，其中0或更高的相似性得分表示兩種胺基酸之間的保守取代。

表A. 胺基酸相似性矩陣

表B. 保守胺基酸取代

在一些實施方式中，該抗體或片段屬於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4類。在一些實施方式中，該抗體或片段具有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。在一些實施方式中，該抗體或片段不具有ADCC活性。

雙特異性抗體

如上所述，這些新鑑定的抗Nectin-4 VHH抗體適合被包含在雙特異性抗體中。對兩種形式(形式A和形式B)進行了測試，但形式A與細胞表面表現的Nectin-4沒有充分結合。形式B相對於Nectin-4是四價的，與細胞有很強的結合力。此外，當與T細胞(通過結合CD3靶向)和表現Nectin-4的腫瘤細胞孵育時，這些雙特異性抗體表現出強烈的T細胞活化和T細胞介導的腫瘤細胞殺傷。

因此，根據本發明的一個實施方式，提供了一種雙特異性抗體，其包括本發明的任何VHH抗體和結合另一抗原的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施方式中，該第二抗原是在免疫細胞上表現的蛋白質。

免疫細胞上可被靶向的蛋白質包括但不限於CD3、CD47、PD1、PD-L1、4-1BB、OX40、SIRPA、CD16、CD28、CTLA4和CD27。在一些實施方式中，該免疫細胞表面蛋白為CD3。

如數據所示，與測試的其他形式相比，4：2 VHH：Fab形式(形式B)具有出色的治療活性。4：2形式如圖4B所示，其包括常規Fab形式的抗體(例如，抗CD3)和四個特異於Nectin-4的VHH單元。每個VHH通過肽接頭融合到Fab可變區的N-末端，肽接頭例如是GS(GGGGS)(SEQ ID NO：57)、GS(GGGGS)₃(SEQ ID NO：58)和GS(GGGGS)₆(SEQ ID NO：59)。

對於某些VHH，一個有趣的發現是，肽接頭的長度對雙特異性抗體與細胞表面的Nectin-4結合的活性有顯著影響。因此，在一些實施方式中，該肽接頭的長度可為至少2個胺基酸，或至少5、7、8、9、10、12、15、17、20、22或25個胺基酸。在一些實施方式中，長度不超過15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸。

示例性接頭包括多個甘胺酸(G)和絲胺酸(S)。在一些實施方式中，該接頭包括至少50%、60%、70%或80%的甘胺酸。示例性接頭序列包括但不限於GS(GGGGS)(SEQ ID NO：57)、GS(GGGGS)₃(SEQ ID NO：58)和GS(GGGGS)₆(SEQ ID NO：59)。

因此，在一個實施方式中，本發明提供了一種對免疫細胞(例如，靶向CD3)和Nectin-4具有特異性的雙特異性抗體。在一些實施方式中，該雙特異性抗體包括對人類CD3複合物具有特異性的常規抗體。在一些實施方式中，該雙特異性抗體包括多個(例如，2個和4個)靶向Nectin-4的VHH。

因此，在一個實施方式中，提供了一種包含第一部分和第二部分的雙特異性抗體，其中第一部分包括兩對VH和VL，每對都能夠結合人類CD3複合物，第二部分包括如本發明所公開的四個單域抗體(VHH)片段，其中每個VHH片段通過肽接頭融合到第一部分的每個VH和VL的N-端。

在一些實施方式中，該雙特異性抗體進一步包括恆定結構域，例如CH1和CL，以及CH2和/或CH3。在一些實施方式中，該恆定區來自人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列。

本發明所屬技術領域之通常知識者還將理解，本文所公開的抗體可以被修飾，以使其在胺基酸序列上與從其衍生的天然存在的結合多 肽不同。例如，從指定蛋白質衍生的多肽或胺基酸序列可能是相似的，例如，與起始序列具有一定的百分比同一性，例如，它可能與起始序列60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同。

在某些實施方式中，抗體包含通常不與抗體結合的胺基酸序列或一個或多個部分。下面更詳細地描述示例性修飾。例如，本發明的抗體可包含靈活的接頭序列，或可被修飾以添加功能部分(例如，聚乙二醇(PEG)、藥物、毒素或標記)。

本發明的抗體、其變體或衍生物(包括經修飾的衍生物)，即通過將任何類型的分子共價連接到抗體，從而使共價連接不會阻止抗體結合到表位。例如，但不限於，抗體可以被修飾，例如通過醣基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酸化、醯胺化、通過已知保護/阻斷基團衍生化、蛋白水解裂解、與細胞配體或其他蛋白質的連接等。可以通過已知的技術來進行許多化學修飾中的任何一種，包括但不限於特定化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素的代謝合成等。此外，抗體可能包含一個或多個非經典胺基酸。

在一些實施方式中，抗體可與治療劑、前藥、肽、蛋白質、酶、病毒、脂質、生物反應調節劑、藥劑或聚乙二醇(PEG)結合。

抗體可與治療劑結合或融合，治療劑可包括可檢測標記，例如放射性標記、免疫調節劑、激素、酶、寡核苷酸、光活性治療劑或診斷劑、細胞毒性劑(可能是藥物或毒素)、超聲增強劑、非放射性標記、其與本領域已知的其他此類試劑的組合。

抗體可以通過將其與化學發光化合物偶聯而被可檢測地標 記。然後通過檢測化學反應過程中出現的發光來確定化學發光標記的抗原結合多肽的存在。特別有用的化學發光標記化合物的示例包括魯米諾、異魯米諾、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯。

抗體也可以用螢光發射金屬(如¹⁵²Eu)或其他鑭系元素標記。可以使用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金屬螯合基團將這些金屬連接到抗體上。將不同部分結合到抗體上的技術是眾所周知的，例如，參見Arnon et al.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.(1985)；Hellstrom et al.,“Antibodies For Drug Delivery”,in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.,(eds.),Marcel Dekker,Inc.,pp.623-53(1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”,in Monoclonal Antibodies‘84：Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.),Academic Press pp.303-16(1985),and Thorpe et al.,“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”,Immunol.Rev.(52：119-58(1982))。

編碼抗體的多核苷酸和製備抗體的方法

本發明還提供了編碼本發明的抗體、其變體或衍生物的分離多核苷酸或核酸分子。本發明的多核苷酸可以在同一個多核苷酸分子或分離的多核苷酸分子上編碼抗原結合多肽、其變體或衍生物的整個重鏈和輕 鏈可變區。此外，本發明的多核苷酸可以在同一個多核苷酸分子或分離的多核苷酸分子上編碼抗原結合多肽、其變體或衍生物的重鏈和輕鏈可變區的部分。

製備抗體的方法是本領域所熟知的，並在本發明進行了描述。在某些實施方式中，本發明的抗原結合多肽的可變區和恆定區均為全人類的。可使用本領域所述和本發明所述的技術製備全人類的抗體。例如，針對特定抗原的全人類的抗體可通過向轉基因動物施用抗原來製備，該轉基因動物已被修飾以產生此類抗體以對抗原攻擊產生反應，但其內源性位點已被無效。可用於製造此類抗體的示範性技術如美國專利6,150,584；6,458,592；6,420,140中所述，其通過引用整體併入本文。

在某些實施方式中，製備的抗體不會在待治療的動物(例如在人)中引發有害的免疫反應。在一種實施方式中，使用本領域公認的技術對本發明的抗原結合多肽、其變體或衍生物進行修飾以降低其免疫原性。例如，抗體可以是人類化的、靈長類化的、去免疫化的、或者可以製備嵌合抗體。這些類型的抗體源於非人類抗體，通常是鼠類或靈長類抗體，其保留或基本上保留親本抗體的抗原結合特性，但在人類中免疫原性較低。這可以通過多種方法實現，包括(a)將整個非人類可變結構域移植到人類恆定區以產生嵌合抗體；(b)將一個或多個非源於人類互補決定區(CDR)的至少一部分移植到人類框架和恆定區中，並保留或不保留關鍵框架殘基；或者(c)移植整個非人類可變結構域，但通過替換表面殘基，用類似人類的部分「遮蓋」它們。此類方法如Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 57：6851-6855(1984)；Morrison et al.,Adv.Immunol.44：65-92 (1988)；Verhoeyen et al.,Science 239：1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.25：489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.31：169-217(1994)及美國專利5,585,089,5,693,761,5,693,762和6,190,370中所述，其通過引用整體併入本文。

去免疫也可用於降低抗體的免疫原性。如本文所用，術語「去免疫」包括改變抗體以修飾T細胞表位(例如，參見國際申請公開號：WO/9852976 A1和WO/0034317 A2)。例如，分析來自起始抗體的可變重鏈和可變輕鏈序列，並創建每個V區的人類T細胞表位「圖譜」，顯示與互補決定區(CDR)和序列內其他關鍵殘基相關的表位位置。分析T細胞表位圖中的單個T細胞表位，以識別具有改變最終抗體活性的低風險的可選地胺基酸取代。設計了一系列可選地可變重序列和可變輕序列，包括胺基酸取代的組合，並且這些序列隨後被併入一系列結合多肽中。通常，產生12到24種變異抗體，並測試其結合和/或功能。然後將包含修飾可變區和人類恆定區的完整重鏈和輕鏈基因克隆到表現載體中，並且將隨後的質體導入細胞株以產生完整的抗體。然後在適當的生化和生物試驗中比較抗體，並確定最佳變體。

本發明的抗原結合多肽的結合特異性可通過體外試驗來確定，例如免疫沉澱、放射免疫試驗(RIA)或酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)等。

癌症治療

如本文所述，本發明的抗體、變體或衍生物可用於某些治療和診斷方法。

本發明進一步涉及基於抗體的療法，其涉及將本發明的抗體施用於患者(例如動物、哺乳動物和人類)，以治療本發明所述的一種或多種疾病或病症。本發明的治療性化合物包括但不限於本發明的抗體(包括如本發明所述的其變體和衍生物)和編碼本發明抗體的核酸或多核苷酸(包括如本發明所述的其變體和衍生物)。

本發明的抗體也可用於治療或抑制癌症。在一些實施方式中，Nectin-4在腫瘤細胞中過度表現。因此，在一些實施方式中，提供了用於在有需要的患者中治療癌症的方法。在一種實施方式中，該方法需要向患者施用有效量的本發明的抗體。在一些實施方式中，患者的至少一種癌細胞(例如基質細胞)表現、過度表現或被誘導表現腫瘤抗原。例如，可以通過施用腫瘤疫苗或放射療法來實現基因表現的誘導。

可適當治療的腫瘤包括膀胱癌、非小細胞肺癌、腎癌、乳腺癌、尿道癌、結直腸癌、頭頸癌、鱗狀細胞癌、默克爾細胞癌、胃腸道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、腎癌和小細胞肺癌。因此，目前的抗體可用於治療任何一種或多種此類癌症。

可通過本發明的抗體或變體或其衍生物治療、預防、診斷和/或預測的與細胞存活增加相關的其他疾病或病症包括但不限於惡性腫瘤和相關疾病的進展和/或轉移，如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病(包括成髓細胞、前髓細胞、顆粒性單核球、單核球和紅血球白血病))和慢性白血病(例如，慢性骨髓性(顆粒球)白血病和慢性淋巴性白血病)、真性紅血球增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多發性骨髓瘤、華氏巨球蛋白血症、重鏈疾病和實體 瘤，包括但不限於肉瘤和癌，例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、***肉瘤、***內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌、黑色素瘤、***癌、卵巢癌、***癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓質癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、腎母細胞瘤、宮頸癌、睾丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤、血管瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤和視網膜母細胞瘤。

任何特定患者的特定劑量和治療方法將取決於多種因素，包括使用的特定抗體、其變體或衍生物、患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食、以及給藥時間、***率、藥物組合和治療的特定疾病的嚴重程度。醫務人員對此類因素的判斷屬於本領域的普通技術。劑量還取決於待治療的個體患者、給藥途徑、製劑類型、所用化合物的特性、疾病的嚴重程度和預期的效果。用量可通過本領域所熟知的藥理學和藥物代謝動力學原理確定。

抗體、變體或衍生物的施用方法包括但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服途徑。抗原結合多肽或組合物可通過任何方便的途徑施用，例如通過輸液或快速濃注，通過上皮或粘膜皮膚內層(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，並且可與其他生物活性劑一起施用。因此，含有本發明抗原結合多肽的藥物組合物可 口服、經直腸、腸胃外、腦池內(intracistemally)、***內、腹膜內、局部(如通過粉末、軟膏、滴劑或透皮貼劑)、經頰或作為口腔或鼻腔噴霧劑施用。

如本文所用，術語「腸胃外」是指包括靜脈內、肌肉內、腹膜內、胸骨內、皮下和關節內注射和輸注的施用方式。

施用可以是系統性的或局部性的。此外，可能需要通過任何合適的途徑將本發明的抗體引入中樞神經系統，包括心室內和脊髓鞘內注射；可以通過心室內導管促進心室內注射，例如連接到儲液器，如Ommaya儲液器。也可採用肺部施用，例如通過使用吸入器或霧化器，以及使用氣溶膠製劑。

可能需要將本發明的抗體多肽或組合物局部施用於需要治療的區域；這可以通過，例如但不限於，在手術期間局部輸注、局部施用，例如，與手術後的傷口敷料結合，通過注射、通過導管、通過栓劑、或通過植入物的方式，該植入物是多孔的、非多孔的、或凝膠材料(包括膜，例如唾液酸膜、或纖維)。較佳地，當施用本發明的蛋白質(包括抗體)時，必須注意使用蛋白質不吸收的材料。

組合物

本發明還提供了藥物組合物。此類組合物包括有效量的抗體和可接受的載體。

在特定的實施方式中，術語「藥學上可接的受」是指經聯邦或州政府監管機構批准或在美國藥典或其他公認的用於動物，尤其是用於人類的藥典中列出。此外，「藥學上可接受的載體」通常是無毒的固體、半 固體或液體填充劑、稀釋劑、封裝材料或任何類型的輔助製劑。

術語「載體」是指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。此類藥物載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當藥物組合物經靜脈施用時，水是較佳的載體。鹽水溶液、葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可用作液體載體，特別是用於可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，該組合物還可包含少量潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽。抗菌劑，如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；此外，還設想了用於調節張力的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。

這些組合物可以採取溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋製劑等形式。該組合物可用傳統粘合劑和載體(如甘油三酯)製成栓劑。口服製劑可包括標準載體，例如藥物級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥物載體的示例如E.W.Martin在Remington’s Pharmaceutical Sciences中所述，其通過引用併入本發明。此類組合物將包含治療有效量的抗原結合多肽(較佳純化形式)以及適量的載體，以便為患者提供適合施用的形式。製劑應適合施用模式。親代製劑可以裝在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料製成的多劑量瓶中。

在一個實施方式中，根據常規程序將該組合物配製成適合對人類靜脈內施用的藥物組合物。通常，用於靜脈內給藥的組合物是無菌等 滲透壓緩衝液中的溶液。必要時，該組合物還可包括溶解劑和局部麻醉劑，例如利多卡因，以減輕注射部位的疼痛。通常，這些成分以單位劑型單獨提供或混合在一起，例如，作為乾燥的凍乾粉末或無水濃縮物裝在如安瓿或小袋的密封容器中，指示活性劑的數量。當通過輸液施用該組合物，其可與含有無菌藥物級水或生理鹽水的輸液瓶一起配藥。當通過注射施用該組合物，可以提供一安瓿無菌注射用水或生理鹽水，從而可以在施用前混合。

本發明的化合物可以配製成中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括與陰離子形成的鹽，例如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽，以及與陽離子形成的鹽，例如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組胺酸、普魯卡因等的鹽。

實施例

實施例1. 抗人類Nectin-4單域抗體的製備

本實施例展示了如何通過羊駝免疫，然後構建和選擇噬菌體庫，產生抗人類Nectin-4單域抗體。

以重組人類Nectin-4/hFc融合蛋白作為免疫原產生抗人類Nectin-4抗體。收集羊駝外周血單核細胞(PBMC)，通過RNA分離、PCR擴增和克隆到噬菌體展示載體中產生抗體cDNA庫。然後對這些庫進行一輪液相選擇和一輪固相選擇。

通過PCR從抗原陽性噬菌體中擴增結合物並定序。用SDS-PAGE確認表現的蛋白質(圖1)。下表提供了獨特的抗體及其CDR區域的序列。

表1. 抗體序列

表2. CDR序列

實施例2. ELISA結合測試

在該實例中，對抗體進行基於ELISA的結合測試。將相同濃度(0.5μg/mL)的人類Nectin-4塗覆在96孔酶盤上。封閉後加入2μg/mL的每種抗體和不同濃度(0.2μg/mL和1μg/mL)的山羊抗人類Nectin-4抗體(作為對照)。洗去多餘的樣本後，加入偶聯辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗人類IgG Fc交叉吸附抗體(或兔抗山羊IgG抗體)。HRP能與底物3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)反應生成有色產物。CMB7與人類Nectin-4的結合親和力可通過讀取反應溶液的OD₄₅₀值來計算，因為反應溶液的吸光度與結合了抗原的抗體的含量呈正相關。因此，採用ELISA測試CMB7與人類Nectin-4的結合親和力。

試驗步驟

包被抗原製劑

在PBS中將包被抗原(人類Nectin-4)稀釋至工作濃度(0.5μg/mL)。立即以每孔100μL的稀釋包被抗原包被96孔微孔盤。密封微孔盤並在4℃下孵育過夜。

封閉

吸出所有微孔並用300μL/孔洗滌緩衝液通過微孔盤洗滌機洗滌5次。在每個洗滌步驟中留出浸泡時間(約1分鐘)，可提高洗滌效果。然後用微孔盤脫水機將微孔盤脫水，以去除任何殘留的緩衝液。用200μL的封閉緩衝液封閉微孔。在37℃的水浴中孵育1小時。

樣品製備

重複洗滌/脫水。在試驗緩衝液中將樣品稀釋至工作濃度(2μg/mL)。將100μL/孔的預稀釋樣品添加到適當的孔中。密封微孔盤，在37℃的水浴中孵育1小時。

二級抗體孵育

重複洗滌/脫水。將二級抗體在試驗緩衝液中以1：2000稀釋。向每個孔中添加100μL/孔的稀釋的二級抗體(1：2000)。將盤在37℃的水浴中避光孵育1小時。

信號檢測

重複洗滌/脫水。向每個孔中添加100μL/孔的基質溶液(TMB)。將盤在室溫下避光孵育3分鐘。添加50μL/孔的終止溶液。在450nm處讀取盤並分析數據。

結果

ELISA測試結果如圖2和表3所示。如結果所示，所有抗體均表現出與人類Nectin-4蛋白的強結合親和力。

表3. ELISA親和力測試結果

實施例3. 動力學結合測試

本實施例測量了抗體(與人類Fc，VHH Fc融合)與人類Nectin-4的動力學結合親和力。

通過生物層干涉法檢測抗體與人類Nectin-4的動力學結合親和力。將HFC(抗HIgG FC)探針(Probelife)在Crimson 96 MAX 96孔反應盤(ET Healthcare，06-0098)中在30℃的動力學緩衝液(Probelife)中預濕5分鐘。然後將探針浸入Greiner黑色微孔盤的含有在動力學緩衝液中的4μg/mL抗體的孔中。使用不同濃度梯度稀釋(從200nM開始，逐步稀釋2倍，共5個濃度梯度)的分析物(人類Nectin-4)進行5分鐘的結合步驟，然後在動力學緩衝液中進行16分鐘的解離步驟。通過減去參考樣品對數據進行分析，並使用數據分析軟件1.7.2.0609(Gator)對親和常數的結構化數據方法的1：1 K結合模型進行擬合。

試驗過程

探針平衡

將盤的溫度設置為30℃，將採集速率設置為標準動力學(5.0HZ)，在Crimson 96 MAX 96孔反應盤的第1列中每孔添加260μL/孔預濕緩衝液(K緩衝液)，將探針置於緩衝液中，並將探針預濕5min，1000rpm。

基線1

在Greiner 96孔聚丙烯微孔盤的第1列中，以1000rpm的速度在200μL/孔K緩衝液中對6個探針進行基線試驗2分鐘。盡可能平衡，最終斜率最好不高於0.02nm/min。

將抗體加載到探針上

用K緩衝液將抗體稀釋至工作濃度(4μg/mL，200μL/孔)，然後在Greiner 96孔聚丙烯微孔盤的2/3/4/5/6列上以1000rpm的速度加載到探針上5分鐘。

基線2

在Greiner 96孔聚丙烯微孔盤的第8/9/10/11/12列中，以1000rpm的速度在200μL/孔K緩衝液中對探針進行基線試驗2分鐘。為了從生物傳感器中去除未結合的mAb，應盡量減少非特異性結合或減少緩衝效應的偏差。

結合

用K緩衝液將抗原(人類Nectin-4)稀釋至6種濃度(200、100、50、25、12.5、0nM、200μL/孔)，然後將這一系列抗原添加到Greiner 96孔聚丙烯微孔盤第7列A行至F行的孔中。在第7列中，探針上的抗體在1000 rpm下與不同濃度梯度的抗原結合5分鐘。

解離

探針在K緩衝液中解離16分鐘，抗原在Greiner 96孔聚丙烯微孔盤上從第8/9/10/11/12列的探針解離。

再生

探針運行再生程序(探針在Crimson 96 MAX 96well反應盤11列的R緩衝液中再生5s，然後在Crimson 96 MAX 96well反應盤12列的Q緩衝液中中和5s，該過程重複3次)。

結果

下表4總結了測試結果。所有抗體都與人類Nectin-14蛋白具有強大的親和力。

表4. 抗-Nectin 4 VHH-Fc的親和力測量

實施例4. 與食蟹猴Nectin-4的交叉反應

本實施例測試了抗體與食蟹猴Nectin-4的結合親和力。

通過ELISA測試抗體與食蟹猴Nectin-4的結合親和力。將相同濃度(0.5μg/mL)的食蟹猴Nectin-4包被在96孔酶盤上。封閉後加入稀釋的不同濃度梯度的抗體(從2μg/mL開始，逐步3倍稀釋，共7個濃度梯度)。在洗去過量的樣本後，加入偶聯了辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗人類IgG Fc交叉吸附抗體。HRP能與底物3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)反應生成有色產物。CMB7與食蟹猴Nectin-4的結合親和力可通過讀取反應溶液的OD₄₅₀值來計算，因為反應溶液的吸光度與結合了抗原的抗體的含量呈正相關。因此，採用ELISA測試CMB7與食蟹猴Nectin-4的結合親和力。

試驗過程

包被抗原製劑

在PBS中將包被抗原(食蟹猴Nectin-4)稀釋至工作濃度(0.5μg/mL)。立即以每孔100μL稀釋包被抗原包被96孔微孔盤。密封微孔盤並在4℃下孵育過夜。

封閉

吸出所有微孔並用300μL/孔洗滌緩衝液通過微孔盤洗滌機洗滌5次。在每個洗滌步驟中留出浸泡時間(約1分鐘)，可提高洗滌效果。然後用微孔盤脫水機將微孔盤脫水，以去除任何殘留的緩衝液。用200μL的封閉緩衝液封閉微孔。在37℃的水浴中孵育1小時。

樣品準備

重複洗滌/脫水。在試驗緩衝液中將樣品稀釋至工作濃度(2μg/mL)，並進行3倍連續稀釋，以製作總共7個點的曲線。將100μL/孔的預稀釋樣品添加到適當的孔中。密封微孔盤，在37℃的水浴中孵育1小時。

二級抗體孵育

重複洗滌/脫水。將二級抗體在試驗緩衝液中稀釋至1：2000。向每個孔中添加100μL/孔的稀釋的二級抗體(1：2000)。將盤在37℃的水浴中避光孵育1小時。

信號檢測

重複洗滌/脫水。向每個孔中添加100μL/孔的基質溶液(TMB)。將盤在室溫下避光孵育3分鐘。添加50μL/孔的終止溶液。在450nm處讀取盤並分析數據。

結果

測試結果如圖3所示，這顯示所有測試的抗體都與食蟹猴Nectin-4發生交叉反應，其中大多數表現出強結合親和力。這顯示食蟹猴可以成為測試這些抗體的合適的臨床前模型。

實施例5. 與人類乳腺癌細胞結合的流式細胞術分析

本實施例通過螢光激活細胞分選儀(FACS)檢測抗體與表達Nectin-4的人類乳腺癌細胞的結合親和力。

試驗步驟

細胞製備

1. 細胞達到80%匯合後，從100mm培養皿中收集細胞。

2. 用2mL PBS洗滌。加入1mL 0.25%胰蛋白酶EDTA，在37℃下培養至細胞從盤上解離。

3. 加入5mL溫培養基。收集細胞並轉移至15mL錐形管中。

4. 收集細胞並轉移至15mL錐形管中。

5. 在室溫下離心300g 5分鐘。

細胞鋪盤

用5mL PBS-0.2%BSA洗滌，在300g，4℃下離心5min。重複兩次。丟棄上清液，在2mL PBS-0.2%BSA中重新懸浮。計數細胞並向每個孔中添加1*10⁵-2*10⁵個細胞(100μL)。

一級抗體孵育

向每個孔中加入蛋白質(10μg/mL或5nM)，並在4℃下孵育1小時。

洗滌

向每個孔中加入200μL冰冷的PBS-0.2% BSA，在300g，4℃下離心5min。重複3次。加入200μL PBS-0.2%BSA以重新懸浮細胞。

二級抗體孵育

在冰冷的PBS-0.2%BSA中向每個孔中加入Alexa Fluor 488山羊抗人類IgG(H+L)(1：500稀釋度)，並在4℃下孵育1小時。

洗滌

向每個孔中加入200μL冰冷的PBS-0.2% BSA，在300g，4℃下離心5min。重複3次。加入200μL PBS-0.2%BSA以重新懸浮細胞。

應用於流式細胞術。

結果

FACS結果顯示，在每個測試濃度下，每個抗體都與人類乳腺癌細胞株MCF-7結合。

實施例6. 抗-Nectin-4/抗-CD3雙特異性抗體的製備

單域抗體(VHH)CMB7-6(「VHH 36」)用於構建還靶向人類CD3的雙特異性抗體。如圖4所示，使用了兩種不同形式的雙特異性抗體。

圖4A示出了A形式，其中單個VHH和來自抗CD3抗體的單個VH/VL對被融合到Fc片段。因此，格式A形式是不對稱的，具有對CD3和Nectin-4的1：1的效價。

在圖4B的形式(形式B)中，4個VHH中的每一個都融合到一個完全的抗CD3抗體的變體結構域的N-末端。因此，這種形式是對稱的，具有對CD3和Nectin-4的2：4的效價。雙特異性構型和每條鏈的結構如表5-6所示。

表5. 雙特異性抗體和相關鏈的結構

合成了編碼這些雙特異性抗體的cDNA序列，並用於製備抗體。

實施例7. 雙特異性抗體的T細胞活化

在本實施例測試了雙特異性抗體在存在表現Nectin-4的MCF-7細胞或T-47D細胞時活化T細胞的能力。

圖5顯示了所有雙特異性抗體的T細胞活化結果。A形式(BJ182/12L1/BJ183-36)僅包含一個VHH，未顯示出可觀察到的T細胞活化活性。有趣的是，兩種格式B的雙特異性抗體(BJ192-36/BJ196-36和BJ194-36/BJ198-36)表現出劑量依賴性的強活性。

實施例8. 雙特異性抗體的細胞毒性活性

本研究的目的是檢測抗Nectin-4抗體對MCF-7和T-47D細胞的細胞毒性。

通過基於圖像的細胞殺傷試驗檢測抗Nectin-4抗體對MCF-7和T-47D細胞的細胞毒性。在這項研究中，MCF-7和T-47D細胞是靶細胞，原代人類T細胞是效應細胞。從人類外周血單核細胞(PBMC)細胞中分離出原代人類T細胞，並將其冷凍在液氮中。靶細胞和效應細胞以1：2的比例(MCF-7/T-47D細胞為3*10⁴，原代人類T細胞為6*10⁴)添加到含有100nM抗Nectin-4抗體的96孔盤的每個孔中。共培養40小時後掃描圖像。

試驗過程

細胞培養

T細胞

將裝有T細胞的小瓶在37℃的水浴中輕輕攪拌解凍。為了減少污染的可能性，使O形圈和蓋子遠離水。解凍必須迅速。內容物解凍後，立即將小瓶從水浴中取出，並通過浸入或噴灑70%乙醇進行淨化。注：從這一步開始的所有步驟都應在嚴格的無菌條件下進行。將細胞轉移到含有15 mL預熱的生長培養基的更大的小瓶中。以400g離心小瓶5分鐘。去除含有冷凍保護劑的上清液，並用1mL T細胞生長培養基重新懸浮細胞。將小瓶的內容物轉移到含有15mL T細胞生長培養基的T75細胞培養瓶中。將細胞置於37℃、5% CO₂中。

MCF-7/T-47D細胞

將裝有MCF-7/T-47D細胞的小瓶在37℃水浴中輕輕攪拌解凍。為了減少污染的可能性，使O形圈和蓋子遠離水。解凍必須迅速。內容物解凍後，立即將小瓶從水浴中取出，並通過浸入或噴灑70%乙醇進行淨化。從這一步開始的所有步驟都應在嚴格的無菌條件下進行。將細胞轉移到含有10ml預熱培養基的100mm培養皿中。當細胞生長到80-90%時，去除細胞上清液，用PBS洗滌1-2次，並用1mL 0.25%胰蛋白酶EDTA(1X)，酚紅消化。用生長培養基終止消化，輕輕吹動細胞，將其完全去除。300g離心5min。去除上清液並加入1ml培養基以吹走。將小瓶內容物轉移到含有10ml生長培養基的100mm培養皿中。將培養物置於37℃、5% CO₂中。

靶細胞擴散(第1天)

在測試培養基中製備靶細胞。向培養皿中加入200μL細胞懸浮液(每孔約3*10⁴個細胞)。將細胞置於37℃、5% CO₂中，使細胞粘附。

T細胞製備(第2天)

在測試培養基中以6*10⁵/mL準備足量T細胞(每孔約6*10⁴個細胞)

抗體稀釋(第2天)

在測試培養基中將BJ-009和12H3-1/12L1稀釋至工作濃度 (從10nM開始，3倍稀釋，6點)。為了達到10nM的工作濃度，應將抗體稀釋至100nM作為樣品濃度。

將靶細胞與抗體和T細胞混合(第2天)

用測試培養基洗滌靶細胞2次。向每個孔中加入80μL測試培養基。向培養皿中加入20μL抗體溶液。向培養皿中加入100μL T細胞懸浮液(約6*10⁴個細胞/孔)。

成像

設置活細胞成像儀(BioTek，Cytation5)。共培養40小時後掃描圖片。

結果

圖6(MCF-7細胞)和圖7(T-47D細胞)顯示了所有雙特異性抗體的T細胞殺傷結果。較大且較暗的顆粒顯示靶細胞死亡。與實施例7中的T細胞活化結果一致，使用A形式的任何抗體的治療不會導致T細胞殺傷，並且使用大多數B形式的雙特異性抗體的治療會導致靶細胞(MCF-7或T-47D細胞)的細胞死亡，證明了這些抗體的功效。

本發明的範圍不受該具體實施例的限制，該具體實施例旨在作為本發明各個方面的單一說明，且功能等效的任何組合物或方法均包含在本發明的範圍內。對於本發明所屬技術領域之通常知識者而言，顯而易見的是，在不脫離本發明的精神或範圍的情況下，可以對本發明的方法和組合物進行各種修改和變化。因此，本發明旨在涵蓋本發明的修改和變化，只要它們在所附申請專利範圍及其等效物的範圍內。

本說明書中提及的所有出版物和專利申請均通過引用併入 本文，其程度與每個被具體和單獨指示為通過引用併入的出版物或專利申請相同。

Claims (14)

1. 一種對人類Nectin-4蛋白具有特異性的單域抗體或其抗原結合片段，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中該CDR1、CDR2和CDR3分別包含由SEQ ID NO：1-14的胺基酸序列表示的單域抗體的CDR1、CDR2和CDR3序列。
2. 如請求項1所述的單域抗體或其抗原結合片段，其中該CDR1、CDR2和CDR3分別進一步包含SEQ ID NO：15-17、SEQ ID NO：18-20、SEQ ID NO：21-23、SEQ ID NO：24-26、SEQ ID NO：27-29、SEQ ID NO：30-32、SEQ ID NO：33-35、SEQ ID NO：36-38、SEQ ID NO：39-41、SEQ ID NO：42-44、SEQ ID NO：45-47、SEQ ID NO：48-50、SEQ ID NO：51-53或SEQ ID NO：54-56的胺基酸序列。
3. 如請求項1所述的單域抗體或其抗原結合片段，其包含選自SEQ ID NO：1-14的胺基酸序列。
4. 如請求項1所述的單域抗體或其抗原結合片段，其中該CDR1、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID NO：15、16和17的胺基酸序列。
5. 如請求項4所述的單域抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
6. 一種雙特異性抗體，包含請求項1-5中任一項所述的單域抗體或其抗原結合片段和對不同於Nectin-4的抗原具有特異性的第二抗體或抗原結合片段。
7. 如請求項6所述的雙特異性抗體，其中該對不同於Nectin-4的抗原是人類CD3。
8. 如請求項7所述的雙特異性抗體，其進一步包含四個該單域 抗體，每個單域抗體都融合至對人類CD3具有特異性的完整抗原結合片段抗體的重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)。
9. 如請求項8所述的雙特異性抗體，其中每個單域抗體都通過肽接頭與VH或VL融合。
10. 如請求項9所述的雙特異性抗體，其中該肽接頭具有長於7個胺基酸的長度。
11. 如請求項9或10所述的雙特異性抗體，其中該肽接頭具有短於50個胺基酸的長度。
12. 一種或多種編碼如請求項1-11中任一項所述的抗體或片段的多核苷酸。
13. 一種包含如請求項12所述的一種或多種多核苷酸的細胞。
14. 一種組合物用於製備治療癌症之藥物的用途，其中該組合物包括有效量的如請求項1-11中之任一項所述的抗體或片段。