TW201909926A

TW201909926A - Ｂ７ｈ３抗體－藥物偶聯物及其醫藥用途

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Publication number: TW201909926A
Application number: TW107127102A
Authority: TW
Inventors: 顧津明; 葉鑫; 楊柳青; 梁金棟; 蔣貴陽; 陶維康; 張連山; 應華; 張玲
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2019-03-16
Also published as: CN109963591B; WO2019024911A1; CN109963591A

Abstract

本發明涉及B7H3抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途。具體而言，本發明涉及B7H3抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，以及包含前述偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物的醫藥組成物，以及其製備用於治療B7H3介導的疾病或病症的藥物中的用途；尤其在製備抗癌藥物中的用途。

Description

B7H3抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途

本發明涉及B7H3抗體-藥物偶聯物及其在醫藥上的應用，進一步地，本發明涉及B7H3抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，以及包含前述偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物的醫藥組成物，以及其製備用於治療B7H3介導的疾病或病症的藥物中的用途；尤其在製備抗癌藥物中的用途。

T細胞介導的免疫反應在機體抗腫瘤過程中發揮著極其重要的作用，而T細胞的活化和增殖不僅需要TCR識別的抗原信號，還需要共刺激分子提供的第二信號。B7家族分子屬於共刺激分子免疫球蛋白超家族，越來越多的研究表明，該家族分子在機體正常免疫功能和病理狀態下均發揮了重要的調節作用。

B7H3是B7家族的成員之一，屬於I型跨膜蛋白質，包含胺基端的一個信號肽，一個細胞外的免疫球蛋白樣可變區(IgV)和恆定區(IgC)、一個跨膜區和一個含有45個胺基酸的胞質尾區(TissueAntigens.2007Aug；70(2)： 96-104)。目前，B7H3主要存在2種剪切體，B7H3a和B7H3b。B7H3a胞外段由IgV-IgC2個免疫球蛋白結構域組成，又稱為2IgB7H3，而B7H3b胞外段由IgV-IgC-IgV-IgC4個免疫球蛋白結構域組成，又稱為4IgB7H3。

B7H3蛋白質在正常組織、細胞中不表達或極低表達，卻高表達於多種腫瘤組織，並與腫瘤的進展、患者的生存及預後密切相關。臨床上已經報道，B7H3在許多癌症類型中、特別是在非小細胞肺癌、腎癌、泌尿道上皮癌、結直腸癌、***癌、多形性膠質母細胞瘤、卵巢癌和胰腺癌中過表達(LungCancer.2009Nov；66(2)：245-249；ClinCancerRes.2008Aug15；14(16)：5150-5157)。此外，也有文獻報道，在***癌中，B7H3的表達強度與臨床病理學惡性(諸如腫瘤體積、***外侵襲或Gleason評分)正相關，且也與癌症進展相關(CancerRes.2007Aug15；67(16)：7893-7900)。類似地，在多形性膠質母細胞瘤中，B7H3的表達與無事件存活負相關，且在胰腺癌中，B7H3的表達與淋巴結轉移和病理學進展相關。因此，B7H3被認為是一種新的腫瘤標誌物和潛在的治療靶點。

目前，已有針對B7H3靶點的治療策略用於臨床前研究，如靶向小鼠B7H3的抗體會增強瘤內的浸潤性的CD8-陽性的T細胞和抑制腫瘤生長(ModPathol.2010Aug；23(8)：1104-1112)。此外，WO2008/066691專利顯示，識別B7H3變體B7H3a的抗體會對腺癌表現出體內抗腫瘤作用。在臨床研究中，一種鼠源的B7H3抗體與放射性I¹³¹ 的偶聯藥物可顯著抑制患者成神經母細胞瘤的生長[JNeufooocol97(3)：409-18(2010]。但目前在研的項目都是鼠源抗體經人源化改造的人源化抗體，而人源化抗體在免疫時存在免疫原性相對較高的問題，在人體應用時是一個不利的因素。

噬菌體展示技術(phagedisplaytechnology)是將外源蛋白質或多肽與噬菌體外殼蛋白質融合表達，從而將外源蛋白質表達在噬菌體的表面。噬菌體抗體庫是將噬菌體展示技術、PCR擴增技術、蛋白質表達技術相結合的一項運用綜合技術手段所建立起來的抗體庫。

噬菌體抗體庫最大的優點是不經體內免疫，模擬體內抗體生成的三個過程而製備出完全人源化抗體。除此之外，噬菌體抗體庫還具有以下優勢：①實現了基因型與表型的統一。此外，實驗方法簡單、快速，傳統的藉由融合瘤技術抗體產生方法需歷經數月，而抗體庫技術只需短短幾週的時間。②表達的是完全人源抗體，且分子量小，主要以活性片段Fab、scFV的形式表達，與完整抗體相比在組織穿透力方面都有明顯優勢。③篩選容量大，融合瘤技術是在上千個純株內篩選，抗體庫技術可以對百萬甚至億萬個分子選擇。篩選到的抗體種類越多。④用途廣泛，採用了原核表達系統，當大規模生產時優勢更加明顯(CurrOpinBiotechnol.2002 Dec；13(6)：598-602；Immunotechnology,2013,48(13)：63-73)。

抗體-藥物偶聯物(antibodydrugconjugate,ADC)把單株抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的細胞毒素相連，充分利用了抗體對正常細胞和腫瘤細胞表面抗原結合的特異性和細胞毒性物質的高效性，同時又避免了前者療效偏低和後者毒副作用過大等缺陷。這也就意味著，與以往傳統的化療藥物相比，抗體-藥物偶聯物能更精準地結合腫瘤細胞並降低將對正常細胞的影響。

目前已有多種ADC藥物被用於臨床或臨床研究，如Kadcyla，是靶向Her2的曲妥珠單抗與DM1形成的ADC藥物。同時，也有靶向B7H3的抗體及ADC藥物的專利報道，如WO2008100934、WO2012147713、WO2014061277、WO2015184203、WO2016044383。但仍沒有B7H3靶點的ADC藥物上市或用於臨床治療研究，因此，開發新的B7H3靶點的ADC藥物具有廣闊的前景。

本發明的目的是提供與B7H3的胞外區的胺基酸序列或三維結構結合的單株抗體與細胞毒性物質偶聯的ADC藥物。藉由篩選高活性和高穩定性的抗人B7H3全人抗體ADC藥物，提供使用所述抗體ADC藥物作為活性成分的治療劑。

本發明提供一種通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，Ab-(L₂-L₁-D)_y (A)其中：D是細胞毒性藥物； L₁，L₂是接頭單元；y為選自1至8的數，較佳為選自2至4的數；y可以為小數或整數；Ab為B7H3抗體或其抗原結合片段，其與人B7H3結合，所述B7H3抗體或其抗原結合片段是選自下面(a)至(c)中任一種的單株抗體或其抗原結合片段：(a)單株抗體，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：10、11和12胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：13、14和15胺基酸序列所示；(b)單株抗體，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：16、17和18胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：19、20和21胺基酸序列所示；(c)單株抗體，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：30、31和32胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：33、34和35胺基酸序列所示。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該B7H3抗體或其抗原結合片段是選自下面(a)至(c)中任一種的單株抗體或其抗原結合片段：(a)單株抗體，其包含分別如SEQ ID NO：10、11和12胺基酸序列所示抗體重鏈可變區的HCDR1，HCDR2，HCDR3；和如SEQ ID NO：13、14和15胺基酸序列所示抗體輕鏈可變區的LCDR1，LCDR2，LCDR3；(b)單株抗體，其包含分別如SEQ ID NO：16、17和18胺基酸序列所示抗體重鏈可變區的HCDR1，HCDR2，HCDR3；和如SEQ ID NO：19、20和21胺基酸序列所示抗體輕鏈可變區的LCDR1，LCDR2，LCDR3；(c)單株抗體，，其包含分別如SEQ ID NO：30、31和32胺基酸序列所示抗體重鏈可變區的HCDR1，HCDR2，HCDR3；和如SEQ ID NO：33、34和35胺基酸序列所示抗體輕鏈可變區的LCDR1，LCDR2，LCDR3。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，Ab-(L₂-L₁-D)_y (A)其中：D是細胞毒性藥物；L₁，L₂是接頭單元；y為選自1至8的數，較佳為選自2至4的數；Ab為與如上所定義的B7H3抗體或其抗原結合片段競爭結合人B7H3的單株抗體或其抗原結合片段。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中該Ab是重組抗體。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中該Ab是人源的重組抗體或其抗原結合片段。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中該Ab的輕鏈和重鏈可變區上的輕鏈和重鏈FR區序列分別來源於人種系輕鏈和重鏈序列或其突變序列。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中該Ab的恆定區包括來源於人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳人源IgG1重鏈恆定區；和來源於人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，較佳人源κ鏈輕鏈恆定區。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中該Ab含有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37所示的重鏈可變區或其變體；該變體是在SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37所示的重鏈可變區序列上具有1至10個胺基酸替換的序列。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中該Ab含有SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39所示的輕鏈可變區或其變體；該變體是在SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39所示的輕鏈可變區序列上具有1至10個胺基酸替換的序列。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中該Ab含有選自下面(1)至(7)中任一種的單株抗體或其抗原結合片段：(1)單株抗體，其包含SEQ ID NO：6所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：7所示抗體輕鏈可變區；(2)單株抗體，其包含SEQ ID NO：8所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：9所示抗體輕鏈可變區；(3)單株抗體，其包含SEQ ID NO：28所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：29所示抗體輕鏈可變區；(4)單株抗體，其包含SEQ ID NO：36所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：38所示抗體輕鏈可變區；(5)單株抗體，其包含SEQ ID NO：36所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：39所示抗體輕鏈可變區；(6)單株抗體，其包含SEQ ID NO：37所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：38所示抗體輕鏈可變區；(7)單株抗體，其包含SEQ ID NO：37所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：39所示抗體輕鏈可變區。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中該Ab為全長抗體，其進一步包括人抗體恆定區；其中該全長抗體選自：h1702抗體，其是由SEQ ID NO：22所示的重鏈序列和SEQ ID NO：23所示的輕鏈序列組成的全長抗體，h1703抗體，其是由SEQ ID NO：24所示的重鏈序列和SEQ ID NO：25所示的輕鏈序列組成的全長抗體， h1702-DS抗體，其是由SEQ ID NO：22所示的重鏈序列和SEQ ID NO：26所示的輕鏈序列組成的全長抗體，或者h1704-3抗體，其是由SEQ ID NO：40所示的重鏈序列和SEQ ID NO：41所示的輕鏈序列組成的全長抗體。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中該抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中細胞毒性藥物選自毒素、化療藥物、抗生素、放射性同位素和核溶酶。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中細胞毒性藥物選自DM1、DM3、DM4、MMAF和MMAE。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中細胞毒性藥物選自：

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其為式I所示化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中：L₁，L₂是接頭單元；y為選自1至8的數，較佳為選自2至4的數；Ab為如上所定義的B7H3抗體或其抗原結合片段、或與如上所定義的B7H3抗體或其抗原結合片段競爭結合人B7H3的單株抗體或其抗原結合片段。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中L₂如以下通式L₂所示：其中X₁選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；X₂選自烷基、環烷基和雜環基；m為選自0至5的整數，較佳為1、2或3；S為硫原子。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中L₁如以下通式(L₁)所示：其中X₃為烷基，視需要該烷基進一步被選自鹵素、羥基和氰基的取代基所取代；n為選自0至5的整數，較佳為1、2或3。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其中細胞毒性藥物經與連接物L1連接後，得到化合物：

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其為通式(II)所示的抗體-藥物偶聯物：其中，L₂是接頭單元；y為選自1至8的數，較佳為選自2至4的數；Ab為如上所定義的B7H3抗體或其抗原結合片段、或與如上所定義的B7H3抗體或其抗原結合片段競爭結合人B7H3的單株抗體或其抗原結合片段。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，其為通式(III)所示的抗體-藥物偶聯物：其中，L₁是接頭單元；y為選自1至8的數，較佳為選自2至4的數；Ab為如上所定義的B7H3抗體或其抗原結合片段、或與如上所定義的B7H3抗體或其抗原結合片段競爭結合人B7H3的單株抗體或其抗原結合片段。

在一個較佳的實施方案中，如通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，或其可藥用鹽，包括但不限於：。

本發明進一步涉及一種醫藥組成物，其包含如本發明通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，和一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。

本發明進一步涉及通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，或包含其的醫藥組成物，在製備用於治療與人B7H3陽性細胞相關的疾病的藥物中的用途；較佳的，其中該用途，為在於製備用於治療B7H3高表達癌症的藥物中的用途。

本發明進一步涉及通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，或包含其的醫藥組成物在製備用於治療疾病的藥物中的用途，該疾病選自治療膠質瘤(非限制性實施例為人腦星形膠質母細胞瘤)、人咽頭癌、腎上腺腫瘤、AIDS-相關癌症、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、促結締組織增生性小圓細胞腫瘤、室管膜細胞瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維發育不全、骨纖維性發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養細胞病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌、白血病、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤病、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合症、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、小兒癌症、外周神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、***癌、後葡萄膜黑色素瘤、腎轉移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。

本發明進一步涉及一種治療疾病的方法，該方法包括向需要其的患者施用治療有效劑量的該通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，或包含其的醫藥組成物，該疾病選自人腦星形膠質母細胞瘤、人咽頭癌、腎上腺腫瘤、AIDS-相關癌症、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、促結締組織增生性小圓細胞腫瘤、室管膜細胞瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維發育不全、骨纖維性發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養細胞病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌、白血病、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤病、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合症、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、小兒癌症、外周神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、***癌、後葡萄膜黑色素瘤、腎轉移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。

第1圖顯示抗體與U87MG細胞的結合力；第2圖顯示不同抗體在U87MG細胞上的內吞效果；第3圖顯示本發明不同ADCh1702-3024，h1703-3024在U87MG細胞上的內吞效果；第4圖顯示本發明不同ADCh1702-cys-3024，h1702DS-cys-3024和h1704-3-cys-3024，及其相應抗體在U87MG細胞上的內吞效果；第5圖顯示h1702-3024對裸鼠U87MG移植瘤的療效；第6圖顯示h1702-3024對U87MG裸鼠體重的影響。

第7圖顯示h1702DS-cys-3024和h1704-3-cys-3024的穩定性結果。

一.術語

為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

本發明所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2 和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。

本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳為人源化抗體。

術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人B7H3的單株抗體。製備時用B7H3抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本發明一個較佳的實施方案中，該鼠源B7H3抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恆定區。

術語“重組抗體”包括“嵌合抗體”、“人源化抗體”和“完全人源抗體”。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後***表達載體中，最後在真核***或原核***中表達嵌合抗體分子。在本發明一個較佳的實施方案中，該B7H3嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該B7H3嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(如YTE突變或回復突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於携带大量鼠蛋白質成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的参考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本發明的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。在本發明一個較佳的實施方案中，該B7H3人源化抗體中鼠的CDR序列選自SEQ ID NO：8-13或14-19；人的抗體可變區框架經過設計選擇，其中該抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於人種系重鏈IGHV1-18*01和hjh4.1的組合序列或IGHV3-7*01和hjh4.1的組合序列；其中該抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列，來源於人種系輕鏈 IGKV1-33*01和hjk4.1的組合序列或IGKV1-39*01和hjk2.1的組合序列。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。

CDR的移植可由於與抗原接觸的構架殘基而導致產生的B7H3抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細胞高度突變的結果。因此，可能仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人B7H3抗體或其抗原結合片段的参與抗原結合的胺基酸殘基可藉由檢查鼠單株抗體可變區序列和結構來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系，那麼可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分數的鼠序列的共有序列相比较。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中發揮重要作用。

術語“完全人源抗體”或“全人抗體”，也稱“全人源單株抗體”，其抗體的可變區和恆定區都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。單株抗體的發展經歷了四個階段，分别為：鼠源性單株抗體、嵌合性單株抗體、人源化單株抗體和全人源單株抗體。全人源抗體製備的相關技術主要有：人融合瘤技術、EBV轉化B淋巴細胞技術、噬菌體顯示技術(phage display)、轉基因小鼠抗體製備技術(transgenic mouse)和單個B細胞抗體製備技術等。本發明中的“完全人抗體”采用噬菌體顯示技術獲得抗體可變區，可與抗體恆定區進一步重組獲得完整抗體。

術語抗體的“抗原結合片段”或“功能片段”是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，B7H3)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')₂片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能够產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；参見，例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的一般技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1， IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。

本發明的抗原結合片段包括Fab、F(ab')2、Fab'、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)、包含CDR的肽等。

Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。

本發明的Fab可以藉由用木瓜蛋白酶處理本發明的特異性識別人B7H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外，可以藉由將編碼該抗體的Fab的DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab來生產該Fab。

F(ab')2是藉由用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。

本發明的F(ab')2可以藉由用胃蛋白酶處理本發明的特異性識別人B7H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外，可以藉由用硫醚鍵或二硫鍵連接下面描述的Fab'來生產該F(ab')2。

Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。本發明的Fab'可以藉由用還原劑例如二硫蘇糖醇處理本發明的特異性識別B7H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的F(ab')2來生產。

此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。

術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH₂-VL-接頭-VH-COOH或NH₂-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1至4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448)。可用於本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

本發明的scFv可以藉由以下步驟來生產：獲得本發明的特異性識別人B7H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA，將該DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達scFv。

雙抗體是其中scFv被二聚體化的抗體片段，是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中，兩個抗原可以是相同或不同的。

本發明的雙抗體可以藉由以下步驟來生產：獲得本發明的特異性識別人B7H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA以使肽接頭的胺基酸序列長度為8個殘基或更少，將該DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙抗體。

dsFv是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering,7,697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。

本發明的dsFv可以藉由以下步驟來生產：獲得獲得本發明的特異性識別人B7H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達dsFv。

包含CDR的肽是藉由包含VH或VL的CDR中的一個或多個區域而構成的。包含多個CDR的肽可以被直接相連或經由適合的肽接頭相連。

本發明的包含CDR的肽可以藉由以下步驟來生產：構建本發明的特異性識別人B7H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的CDR的編碼DNA，將該DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達該肽。也可以藉由化學合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法來生產該包含CDR的肽。

術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。該6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication 91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應用於輕鏈可變結構域的LCDR1、LCDR2和LCDR3(CDRL1、CDRL2、CDRL3或L1、L2、L3)，以及重鏈可變結構域的HCDR2和HCDR3(CDRH2、CDRH3或H2、H3)。

本文中使用的術語“抗體框架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作该可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。

術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位(例如，B7H3分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續或非連續的胺基酸。参見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecula rBiology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10^-7M，例如大約小於10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的親和力(KD)結合。

術語"KD"或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本發明的抗體以小於大約10^-7M，例如小於大約10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解離平衡常數(KD)結合B7H3，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE仪中测定的。

術語“與B7H3抗體競爭結合人B7H3的單株抗體”是指與本發明的單株抗體競爭識別人B7H3的胞外區上的相同表位(也稱為抗原決定簇)或相同表位的一部分並與該表位結合的抗體。與本發明的B7H3抗體結合相同表位的抗體是指識別並結合於本發明的B7H3抗體識別的人B7H3的胺基酸序列的抗體。

本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增强子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增强子有效地連接至該編碼序列。

術語“載體”是指能够運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質體”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能够在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而随宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人B7H3或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用一般的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用一般方法製備。發明該的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟件，從Im Muno Gene Tics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。

本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人B7H3特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一般技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或GSepharoseFF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用一般方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床無法測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白質中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白質的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。

“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。

“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。

本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。

本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中該擴增的程序或技術。一般來說，需要獲得來自目標區域末端或之外的序列信息，使得可以設計寡核苷酸引子；這些引子在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質粒序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCRTECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，該方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1至3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

此外，本發明涉及用於免疫檢測或測定B7H3的方法、用於免疫檢測或測定B7H3的試劑、用於免疫檢測或測定表達B7H3的細胞的方法和用於診斷與B7H3陽性細胞相關的疾病的診斷劑，其包含本發明的特異性識別人B7H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體或抗體片段作為活性成分。

在本發明中，用於檢測或測定B7H3的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫檢測或測定方法。

免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。

上述與B7H3陽性細胞相關的疾病可以藉由用本發明的單株抗體或抗體片段檢測或測定表達B7H3的細胞來診斷。

為了檢測表達多肽的細胞，可以使用已知的免疫檢測方法，並較佳使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。

在本發明中，對用於檢測或測定B7H3的活體樣品沒有特別限制，只要它具有包含表達B7H3的細胞的可能性即可，例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。

根據所需的診斷方法，含有本發明的單株抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑，例如識別該單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與該標記對應的基質等。

術語“細胞毒性藥物”是指在腫瘤細胞內具有較強破壞其正常生長的化學分子。細胞毒性藥物原則上在足夠高的濃度下都可以殺死腫瘤細胞，但是由於缺乏特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也會導致正常細胞的凋亡，導致嚴重的副作用。該術語意在包括放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)，化療藥物，毒素如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體。

術語“毒素”指來自細菌、真菌、植物或動物的小分子毒素及其衍生物，包括美登木素生物鹼及其衍生物(CN101573384)如DM1、DM3、DM4，澳瑞他汀(auristatin)F(AF)及其衍生物，如MMAF、MMAE、3024(WO2016/127790A1，化合物7)，白喉毒素、外毒素、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)、α-帚麯黴素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)局限麯黴素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。

MMAF、MMAE為澳瑞他汀衍生物，參見US2005/0238649及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124，結構式如下：

具體而言，澳瑞他汀/多拉司他汀藥物模塊諸如MMAF及其衍生物可以使用US2005-0238649A1及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124中記載的方法來製備。澳瑞他汀/多拉司他汀藥物模塊諸如MMAE及其衍生物可以使用Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784中記載的方法來製備。可以藉由一般方法方便地合成藥物-接頭模塊MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF和MC-vc-PAB-MMAE，例如Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784及美國專利申請公開號US2005/0238649A1中所記載的，然後將它們偶聯至感興趣的抗體。

本發明中所述藥物2852，參見WO2016/127790A1(化合物實施例7)，其結構式如下：

藉由該發明中所述方法(化合物實施例8)或所屬領域人員所能推定的方法，合成藥物-接頭模塊(本發明中所述的3024)後，其結構式如下：

術語“化療藥物”是在腫瘤治療中使用的化學化合物。化療藥物實例包括烷化劑，如噻替呱(thiotepa)；環磷醯胺(cyclosphamide)(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸脂如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和呱泊舒凡 (piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯並多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替呱(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶和甲基阿美胺(methylamelamine)包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞胺嗪(triethylenemelamine)，三亞乙基磷醯胺，三亞乙基硫代磷醯胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogenmustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷醯胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環磷醯胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；左旋***酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉黴素，放線菌素，authramycin，重氮絲胺酸，博來黴素，放線菌素C(cactinomycin)，加利車黴素(calicheamicin)，carabicin，洋紅黴素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色黴素，放線菌素D，柔紅菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮胺酸，阿黴素(doxorubicin)，表阿黴素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，發波黴素(marcellomycin)，絲裂黴素，黴酚酸，諾加黴素(nogalamycin)，橄欖黴素(olivomycin)，培洛黴素 (peplomycin)，紫菜黴素(potfiromycin)，嘌呤黴素，三鐵阿黴素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲黴素(streptozocin)，殺結核菌素，烏苯美司(ubenimex)，淨司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如胺甲蝶吟，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，胺甲蝶呤，蝶羅呤，三甲曲沙(trimetrexate)；喋吟類似物氟達拉濱(fludarabine)，6-巰基蝶呤，硫咪蝶呤，硫鳥蝶呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿紮胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，去氟氧尿苷(doxitl uridine)，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素類如二***(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環硫雄醇(epitiostanol)，美雄胺(mepitiostane)，睾內酯(testolactone)；抗腎上腺類如胺魯米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑如醛葉酸(frolinic acid)；醋葡內脂；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(biasntrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(eflomithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫呱達醇 (mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；噴司他丁(pintostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼樹酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2'，2"-三氯二乙胺(trichlorrotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長春堿醯胺；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇；呱溴烷坑(pipobroman)；加西托新(gacytosine)；***糖苷("Ara-C")；環磷醯胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷，如紫杉醇(TAXOL®,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ)和多西紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE®,Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依託泊甙(etoposide)(VP-16)；異環磷航膠；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞賓(vinorelbine)；新黴醯胺(navelbine)；諾消靈(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；柔紅黴素；胺基蝶呤；截瘤達(xeloda)；伊拜磷酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；維甲酸；埃斯黴素(esperamicins)；卡培他濱(capecitabine)；以及上述任何物質的可藥用鹽，酸或衍生物。此定義還包括能調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素製劑，如抗***製劑包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，克昔芬(keoxifene)，LY117018，奧那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素製劑如氟他胺(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，比卡魯胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物質的可藥用鹽，酸或衍生物。

術語“接頭單元”在本發明中為L1和L2，指一端與抗體共價連接而另一端與細胞毒性藥物相連的化學結構片段或鍵。

術語“載藥量”是指分子中每個配體上加載的細胞毒性藥物平均數量，也可以表示為藥物量和抗體量的比值，藥物載量的範圍可以是每個配體(Pc)連接1至8個細胞毒性藥物，在本發明的實施方式中，載藥量表示為y，可用一般方法如UV/可見光光譜法，質譜，ELISA試驗和HPLC特徵鑒定偶聯反應後每個ADC分子的藥物品均數量。

在本發明中，y可能受連接位點數量的限制。本發明的一個實施方式中，細胞毒性藥物藉由接頭單元偶聯在配體的N端胺基和/或賴胺酸殘基的ε-胺基上，一般地，偶聯反應中能與抗體偶聯的藥物分子數將小於理論上的最大值。

可以用以下非限制性方法調控抗體細胞毒性藥物偶聯物的載量，包括：(1)調控連接試劑和單抗的莫耳比，(2)調控反應時間和溫度， (3)選擇不同的反應試劑。

術語“載體”用於本發明的藥物，是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分佈、調控藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶向器官的體系。藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度。如可作為載體的高分子表面活性劑由於其獨特的兩親性結構，可以進行自組裝，形成各種形式的聚集體，較佳的實例如膠束、微乳液、凝膠、液晶、囊泡等。這些聚集體具有包載藥物分子的能力，同時又對膜有良好的滲透性，可以作為優良的藥物載體。

術語“賦形劑”是在藥物製劑中除主藥以外的附加物，也可稱為輔料。如片劑中的黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑；半固體製劑軟膏劑、霜劑中的基質部分；液體製劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調節劑、著色劑等均可稱為賦形劑。

術語“稀釋劑”又稱填充劑，其主要用途是增加片劑的重量和體積。稀釋劑的加入不僅保證一定的體積大小，而且減少主要成分的劑量偏差，改善藥物的壓縮成型性等。當片劑的藥物含有油性組分時，需加入吸收劑吸收油性物，使保持“乾燥”狀態，以利於製成片劑。

醫藥組成物可以是無菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶劑中有水、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。無菌注射製劑可以是其中活性成分溶於油相的無菌注射水包油微乳。可藉由局部大量注射，將注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本發明化合物恆定循環濃度的方式給予溶液和微乳。為保持這種恆定濃度，可使用連續靜脈內遞藥裝置。這種裝置的實例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型靜脈注射泵。

醫藥組成物可以是用於肌內和皮下給藥的無菌注射水或油混懸液的形式。可按已知技術，用上述那些適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配製該混懸液。無菌注射製劑也可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中製備的無菌注射溶液或混懸液。此外，可方便地用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。

本發明還涉及治療人B7H3陽性細胞相關的疾病的方法，特別是在治療癌症和炎症中的用途。

二.實施例與測試例

以下結合實施例進一步描述本發明，但這些實施例及測試例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例或測試例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照一般條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的一般試劑。

實施例1. B7H3抗原及檢測用蛋白質的製備

以SEQ ID NO：1所示人B7H3作為本發明B7H3的模板，設計本發明涉及的抗原及檢測用蛋白質的胺基酸序列。以下B7H3抗原未特殊說明的均指人B7H3。

1.1 人B7H3全長胺基酸序列：B7H3(SEQ ID NO：1)：注釋：雙下底線部分為信號肽(Signal peptide：1-28)；下底線部分為B7H3胞外區(Extracellular domain：29-466)，其中29-139為Ig-樣V-型1結構域，145-238為Ig-樣C2-型1結構域；243-357為Ig-樣V-型2結構域，363-456為Ig-樣C2-型2結構域；點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：467-487)；斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：488-534)。

1.2 鼠B7H3全長胺基酸序列(SEQ ID NO：2) 注釋：雙下底線部分為信號肽(Signal peptide：1-28)；下底線部分為B7H3胞外區(Extracellular domain：29-248)，其中29-139為Ig-樣V-型結構域，145-238為Ig-樣C2-型結構域；點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：249-269)；斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：270-316)。

1.3 篩選及檢測用人B7H3抗原(SEQ ID NO：3)

為商業化產品(R&D cat#1949-B3-050/CF，簡稱2Ig-B7H3)，序列如下：注釋：下底線部分為B7H3胞外區；斜體部分為His-tag標記。

1.4 檢測用人B7H3抗原(SEQ ID NO：4)

為商業化產品(Sino Biological cat#11188-H08H，簡稱4Ig-B7H3)，序列如下：注釋：下底線部分為B7H3胞外區；斜體部分為His-tag標記。

1.5 篩選及檢測用鼠B7H3抗原(SEQ ID NO：5)

為商業化產品(R&D cat#1397-B3-050/CF)，序列如下：注釋：下底線部分為B7H3胞外區；斜體部分為His-tag標記。

實施例2. 完全人源抗體的製備

2.1 陽性序列的篩選

利用人PBMC、脾臟、淋巴結組織分離B細胞，並提取RNA，構建天然單鏈噬菌體抗體庫(庫容3.2×10¹⁰)。將構建的天然單鏈噬菌體文庫經過包裝形成噬菌體顆粒後，採用液相法進行淘篩，噬菌體與生物素化的B7H3液相結合，再採用鏈黴親和素磁珠分離。為了獲得可分別與人B7H3(R&D cat#1949-B3-050/CF)和鼠B7H3(R&D cat#1397-B3-050/CF)交叉結合的陽性序列，分別採用生物素化的人B7H3和生物素化的鼠B7H3進行交替淘篩，首輪採用2μg/ml生物素化的人B7H3進行淘篩，第二輪採用2μg/ml生物素化的鼠B7H3進行淘篩，第三輪採用0.5μg/ml生物素化的人B7H3進行淘篩，經三輪淘篩後，挑取500個單純株包裝成噬菌體，用於噬菌體ELISA測試。分別測試單純株噬菌體與人B7H3(R&D cat#1949-B3-050/CF)和鼠B7H3(R&D cat#1397-B3-050/CF)的結合活性：ELISA板上分別包被1μg/ml人B7H3或鼠B7H3以及1%BSA，加入1：1封閉緩衝液稀釋的噬菌體上清，最後用anti-M13HRP檢測；將ELISA測試到的OD450值大於0.5，以及結合人和鼠B7H3的ELISA OD450值除以結合1%BSA的ELISA OD450值的兩個比值均大於2.0的純株進行測序，得到9個特異性序列。

2.2 完整單株抗體的構建

噬菌體庫篩選得到的9個特異性序列構建完整抗體後藉由ELISA結合實驗確定其中2個抗體結合力強，分別是h1702和h1703。對其完整單株抗體構建的過程如下：根據測序得到的單鏈抗體序列，設計引子PCR搭建各單鏈抗體序列的VH/VK/VL基因片段。獲得h1702和h1703的重輕鏈可變區。

>h1702重鏈可變區序列 SEQ ID NO：6

>h1702輕鏈可變區序列 SEQ ID NO：7

>h1703重鏈可變區序列 SEQ ID NO：8

>h1703輕鏈可變區序列 SEQ ID NO：9

注：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下底線為CDR序列。

其中各抗體輕重鏈中CDR序列如表1所示。

抗體可變區再與恆定區基因(CH1-FC/CL)片段進行同源重組，構建完整抗體VH-CH1-FC/VK-CL/VL-CL。

構建的完整全長抗體h1702、h1703序列如下： h1702：h1702重鏈(IgG1)胺基酸序列：(SEQ ID NO：22)

h1702輕鏈胺基酸序列：Lamada(SEQ ID NO：23)

h1703：h1703重鏈(IgG1)胺基酸序列：(SEQ ID NO：24)

h1703輕鏈胺基酸序列：Kappa(SEQ ID NO：25)

為進一步提高抗體的穩定性，對h1702的輕鏈序列進行胺基酸突變，具體突變為輕鏈(SEQ ID NO：23)N端第一個胺基酸殘基Q替代為D，缺失突變C端第一個胺基酸殘基S，以獲得更加穩定和均一的單株抗體h1702-DS。

突變修飾後的h1702-DS的重鏈序列為SEQ ID NO：22，輕鏈胺基酸序列如下：(SEQ ID NO：26)。

2.3 全人抗體的表達與純化

分別表達抗體輕重鏈的質體以1.5：1的比例轉染HEK 293E細胞，6天後收集表達上清，高速離心去除雜質，用ProteinA管柱進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性沖提液沖提目的蛋白質，用1M Tris-HCl,pH8.0-9.0中和。沖提樣品適當濃縮後，利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex 200(GE)進一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。

B7H3抗體-藥物偶聯物製備實施例

實施例3、鼠源抗體的製備

3.1 抗原的製備

編碼帶huFc標簽的人B7-H3(h-B7H3-Fc)序列由Integrated DNA Technology(IDT)公司合成(以上B7-H3重組蛋白質均由本發明設計模版序列)，分別選殖到pTT5載體上(Biovector)。重組的B7-H3蛋白質在293T細胞表達後，藉由所屬領域的一般技術進行純化。純化的蛋白質可用於小鼠免疫獲得抗體。

h-B7H3-Fc的序列： SEQ ID NO：27

3.2 抗體的製備

抗人B7H3單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用Swiss Webster白小鼠，雌性，6週齡(Charles River公司)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。免疫抗原為帶Fc標簽的人B7H3重組蛋白質(huB7H3-Fc)。用Titermax(sigma Lot Num：T2684)為佐劑。抗原與佐劑 (titermax)比例為1：1，抗原乳化後進行接種，時間為第0、21、35、49、63天。第0天腹膜內(IP)注射15μg+爪墊(footpad)25/隻的乳化後抗原。21、35、49、63天腹膜內(IP)注射15μg+爪墊(footpad)15/隻的乳化後抗原，在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射15μg+爪墊(footpad)15/隻的生理鹽水配製的抗原溶液。於第42、56、70天進行血檢，用ELISA及FACS方法檢測小鼠血清，確定小鼠血清中的抗體滴度。在第5次免疫以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合，採用優化的電融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287^TM)進行融合得到融合瘤細胞。

融合後的融合瘤細胞培養7-14天後，取培養基上清，使用B7-H3重組蛋白質，ELISA實驗對融合瘤上清進行抗體篩選，得到的陽性抗體株進一步使用穩轉表達B7-H3的CHO-S細胞，對比空白CHO-S細胞以排除非特異性結合抗體融合瘤株，用流式分選方法進行篩選，從而選定兩株結合重組蛋白質且也結合細胞表達抗原的融合瘤。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA並反轉錄(Prime Script^TM Reverse Transcriptase，Takara #2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B0503)進行PCR擴增後測序，最終得到鼠源抗體m1704的序列。

鼠單抗m1704的重鏈和輕鏈可變區序列如下：m1704重鏈 SEQ ID NO：28

m1704輕鏈 SEQ ID NO：29

為了提高抗體的穩定性，對上述鼠抗的CDR序列進行優化設計。優化後的CDR區具有如下序列：

將鼠抗的重鏈和輕鏈可變區分別選殖進入含人IgG1重鏈恆定區和κ輕鏈恆定區的pTT載體質體(Biovector)，然後瞬轉轉染入HEK293細胞，得到了抗B7-H3的嵌合抗體，按一般技術方法純化後備用。

3.3 小鼠抗體的人源化

鼠源抗人B7-H3單株抗體人源化如本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之，使用人恆定結構域替代親本(鼠源抗體)恆定結構域，根據鼠源抗體和人抗體的同源性選擇人種抗體序列，本發明將抗體m1704進行人源化。

在所獲得的鼠源抗體VH/VLCDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與人源抗體種系數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板。其中人類種系輕鏈框架區來自人κ輕鏈基因人種系輕鏈模板IGkV1-33，人類種系重鏈框架區來自人重鏈模版IGHV3-23。

將鼠源抗體m1704的CDR區移植到選擇好的相應人源化模板上，替換人源化可變區，再與IgG恆定區(較佳重鏈為IgG1，輕鏈為κ)重組。然後，以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化，設計並檢測了由如下人源化輕重鏈可變區序列組合而成的抗體。

h1704VH1(SEQ ID NO：36)：

h1704VH2(SEQ ID NO：37)：

h1704VL1(SEQ ID NO：38)：

h1704VL2(SEQ ID NO：39)：

經表達測試和回復突變數量對比，選擇出最終的人源化h1704-3抗體分子(使用VH1重鏈可變區和VL2輕鏈可變區)，其重鏈和輕鏈序列如SEQ ID NO：40和41所示。h1704-3抗體重鏈(IgG1)序列： SEQ ID NO：40

h1704-3抗體輕鏈(Kappa)序列： SEQ ID NO：41

根據以上各人源化抗體輕鏈和重鏈的基因序列合成cDNA片段，***到pcDNA 3.1表達載體(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。將表達載體和轉染試劑PEI(Polysciences,Inc.Cat.No.23966)以1：2的比例轉染HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，並置於CO₂孵育箱中孵育4-5天。表達的抗體藉由離心回收後，進行抗體純化，得到本發明的人源化抗體蛋白質。

B7H3抗體-藥物偶聯物製備實施例

以下實施例4至實施例11為本發明相關ADC的製備過程。其中實施例4至實施例7中抗體(h1702、h1703)藉由在其賴胺酸上偶聯帶有連接單元的藥物(MMAF或3024) 反應，製備ADC；實施例8至實施例11藉由抗體(h1702、h1704-3、h1702DS)半胱胺酸上的巰基，與帶有連接單元的藥物(3024)反應製備ADC。

實施例4：B7H3-h1702-L2-MC-MMAF(h1702-MMAF)的製備

將硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯(0.10mg，0.75μmol)，溶解於0.2mL乙腈溶液，備用；向抗體B7H3-h1702，PH=4.3的乙酸/乙酸鈉緩衝液(2.5mg/ml，2.0mL，0.034umol)加入上述預製的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯的乙腈溶液，然後滴加0.1mL的氰基硼氫化鈉(3.4mg，53μmol)的水溶液，於25℃下振盪反應2小時。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)進行純化，除去未反應的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯以及氰基硼氫化鈉，得到標題產物1b的PBS緩衝溶液(約5.5mL)，超濾離心濃縮至約2.5ml進行下一步反應。

第二步

向1b的PBS緩衝溶液(2.5mL)中加入0.07mL的2.0M鹽酸羥胺溶液，加畢，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應30分鐘，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)進行純化，得到標題產物B7H3-h1702單抗-丙硫醇1c的PBS緩衝溶液(濃度0.84mg/ml，5.0mL)。

第三步

將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸MC-MMAF(0.32mg，0.34μmol)溶解於0.5mL乙腈中，加入B7H3-h1702單抗-丙硫醇PBS緩衝溶液1c(0.84mg/mL，5.0mL)中，置於水浴振盪器中，於25℃下振盪反應4小時後停止反應。

將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物h1702-MMAF的PBS緩衝液(0.21mg/mL，14.5mL)，於4℃冷凍儲存。 Q-TOFLC/MS計算平均值：y=1.76。

實施例5：B7H3-h1703-L2-MC-MMAF(h1703-MMAF)的製備

將硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯(0.11mg，0.82μmol)，溶解於0.2mL乙腈溶液，備用；向抗體B7H3-h1703，PH=4.3的乙酸/乙酸鈉緩衝液(2.5mg/ml，2.0mL，0.034umol)加入上述預製的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯的乙腈溶液，然後滴加0.1mL的氰基硼氫化鈉(3.4mg，53μmol)的水溶液，於25℃下振盪反應2小時。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)進行純化，除去未反應的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯以及氰基硼氫化鈉，得到標題產物2b的PBS緩衝溶液(約5.5mL)，超濾離心濃縮至約2.5ml進行下一步反應。

第二步

向2b的PBS緩衝溶液(2.5mL)中加入0.07mL的2.0M鹽酸羥胺溶液，加畢，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應30分鐘，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)進行純化，得到標題產物B7H3-h1703單抗-丙硫醇2c的PBS緩衝溶液(濃度0.82mg/ml，5.0mL)。

第三步

將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸MC-MMAF(0.32mg，0.34μmol)溶解於0.5mL乙腈中，加入B7H3-h1703單抗-丙硫醇PBS緩衝溶液2c(0.82mg/mL，5.0mL)中，置於水浴振盪器中，於25℃下振盪反應4小時後停止反應。

將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物h1703-MMAF的PBS緩衝液(0.20mg/mL，13.0mL)，於4℃冷凍儲存。

Q-TOFLC/MS計算平均值：y=2.29。

實施例6：B7H3-h1702-L2-3024(h1702-3024)的製備

將硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯(0.45mg，3.38μmol)，溶解於0.8mL乙腈溶液，備用；向抗體B7H3-h1702，pH=4.3的乙酸/乙酸鈉緩衝液(5.0mg/ml，8.0mL，0.270μmol)加入上述預製的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯的乙腈溶液，然後滴加0.1mL的氰基硼氫化鈉(12.8mg，0.2mmol)的水溶液，於25℃下振盪反應2小時。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)進行純化，除去未反應的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯以及氰基硼氫化鈉，得到標題產物3b的PBS緩衝溶液(約14.5mL)，超濾離心濃縮至約7.5ml進行下一步反應。

第二步

向3b的PBS緩衝溶液(7.5mL)中加入0.20mL的2.0M 鹽酸羥胺溶液，加畢，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應30分鐘，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)進行純化，得到標題產物B7H3-h1702單抗-丙硫醇3c的PBS緩衝溶液(濃度2.84mg/ml，14.0mL)。

第三步

將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸化合物3024(2.6mg，2.7μmol)溶解於1.4mL乙腈中，加入B7H3-h1702單抗-丙硫醇PBS緩衝溶液3c(2.84mg/mL，14.0mL)中，置於水浴振盪器中，於25℃下振盪反應4小時後停止反應。

將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物h1702-3024的PBS緩衝液(1.35mg/mL，27.5mL)，於4℃冷凍儲存。

Q-TOFLC/MS計算平均值：y=2.05。

實施例7：B7H3-h1703-L2-3024(h1703-3024)的製備

將硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯(0.50mg，3.78μmol)，溶解於0.8mL乙腈溶液，備用；向抗體B7H3-h1703，pH=4.3的乙酸/乙酸鈉緩衝液(5.0mg/ml，8.0mL，0.270umol)加入上述預製的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯的乙腈溶液，然後滴加0.1mL的氰基硼氫化鈉(12.8mg，0.2mmol)的水溶液，於25℃下振盪反應2小時。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)進行純化，除去未反應的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯以及氰基硼氫化鈉，得到標題產物4b的PBS緩衝溶液(約14.0mL)，超濾離心濃縮至約7.5ml進行下一步反應。

第二步

向4b的PBS緩衝溶液(7.5mL)中加入0.20mL的2.0M鹽酸羥胺溶液，加畢，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應30分鐘，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)進行純化，得到標題產物B7H3-h1703單抗-丙硫醇4c的PBS緩衝溶液(濃度2.64mg/ml，14.5mL)。

第三步

將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸化合物3024(2.6mg，2.7μmol)溶解於1.45mL乙腈中，加入B7H3-h1703單抗-丙硫醇PBS緩衝溶液6c(2.64mg/mL，14.5mL)中，置於水浴振盪器中，於25℃下振盪反應4小時後停止反應。

將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物h1703-3024的PBS緩衝液(1.20mg/mL，28.0mL)，於4℃冷凍儲存。

Q-TOFLC/MS計算平均值：y=1.62。

實施例8. B7H3-h1702-cys-3024(h1702-cys-3024)的製備

在37℃條件下，向抗體h1702，pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液(10.0mg/ml，5.0mL，0.333umol)加入配置好的0.01mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的10mM水溶液0.07mL(0.7umol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，再將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸SHR3024(2.6mg，2.7μmol)溶解於0.5mL乙腈中，加入到降溫至25℃的抗體h1702(含有TCEP)中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應；將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物的PBS緩衝液(6.85mg/mL，7.5mL)，於4℃冷凍儲存。

HIC-HPLC計算平均值：y=3.5。

實施例9. B7H3-h1704-3-cys-3024(h1704-3-cys-3024)的製備

在37℃條件下，向抗體B7H3-h1704-3，PH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液(10.0mg/ml，5.0mL，0.333umol)加入配置好的0.01mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的10mM水溶液0.075mL(0.75umol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，再將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸化合物3024(2.6mg，2.7μmol)溶解於0.5mL乙腈中，加入到降溫至25℃的抗體B7H3-h1704-3(含有TCEP)中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應；將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物的PBS緩衝液(6.75mg/mL，7.8mL)，於4℃冷凍儲存。

HIC-HPLC計算平均值：y=3.4。

實施例10. B7H3-h1702DS-cys-3024(h1702DS-cys-3024)的製備

在37℃條件下，向抗體H1702-DS，pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液(10.0mg/ml，2.0mL，0.133umol)加入配置好的0.01mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的10mM水溶液0.028mL(0.28umol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，再將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸化合物3024(1.02mg，1.1μmol)溶解於0.2mL乙腈中，加入到降溫至25℃的抗體h1702-DS(含有TCEP)中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應；將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物的PBS緩衝液(6.65mg/mL，2.7mL)，於4℃冷凍儲存。

HIC-HPLC計算平均值：y=3.55。

以下用測試方法驗證本發明抗體性能及有益效果。

測試例1. ELISA結合實驗

為檢測篩選到的B7H3抗體，及相應的不同B7H3-ADC對於人不同形式B7H3的體外結合能力，人2Ig-B7H3(Cat.#1949-B3-050/CF，R&D)和人4Ig-B7H3(Cat.#11188-H08H，SinoBiological)被用於進行體外結合檢測。

用pH7.4的PBS(Sigma，P4417-100TAB)緩衝液將人B7H3蛋白質(2Ig/4Ig)稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔酶標板(Corning，CLS3590-100EA)中，於4℃放置過夜16-20小時。棄去液體後，加入用PBST緩衝液(pH7.4 PBS含0.05% Tween-20)稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液120μl/孔，37℃孵育箱孵育2小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次後，加入100μl/孔初始濃度為1μM的相應B7H3抗體(或B7H3-ADC)，用PBST緩衝液倍比稀釋8個梯度，置於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板4次，加入100μl/孔用PBST稀釋(1：4000)的HRP標記的羊抗人IgG(山羊抗人IgG)Fcγ片段特異性的二抗(Jackson Immuno Research,109-005-008)，37℃孵育1 小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色基質(KPL，52-00-03)，於室溫孵育3-5min，加入100μl/孔1MH₂SO₄終止反應，用NOVOStar酶標儀在450nm處讀取吸收值，計算抗體對抗原的結合EC50值，結果見表2。

結論：針對人2Ig-B7H3及人4Ig-B7H3，ADC與裸抗在ELISA實驗上具有類似的結合力，即ADC標記後未降低結合力。

測試例2. 與不同種屬B7H3的交叉結合實驗

為檢測篩選到的B7H3抗體，及相應的不同B7H3-ADC，對於不同種屬來源的B7H3的體外結合能力，小鼠B7H3(Cat.#1397-B3-050/CF，R&D)被用於進行體外結合檢測。

用pH7.4的PBS(Sigma，P4417-100TAB)緩衝液將不同種屬B7H3蛋白質(mouseB7H3)稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔酶標板中，於4℃放置過夜16-20小時。棄去液體後，加入用PBST緩衝液(pH7.4 PBS含0.05% Tween-20)稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液120μl/孔，37℃孵育箱孵育2小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次後，加入100μl/孔初始濃度為1μM的相應B7H3抗體(或B7H3-ADC)，用PBST緩衝液倍比稀釋8個梯度，置於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板4次，加入100μl/孔用PBST稀釋(1：4000)的HRP標記的山羊抗人IgG，Fcγ片段特異性的二抗(Jackson Immuno Research,109-005-008)，37℃孵育1小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色基質(KPL,52-00-03)，於室溫孵育3-5min，加入100μl/孔1MH₂SO₄終止反應，用NOVOStar酶標儀在450nm處讀取吸收值，計算抗體對抗原的結合EC50值(結果見表3)。

結果顯示，h1702和h1703，及不同ADC與鼠B7H3結合力相對較弱，顯示出兩個單株抗體具有良好的人B7H3結合特異性。

測試例3. Biacore抗體親和力實驗

用Biacore，GE儀器測定抗B7H3抗體，及抗B7H3-ADC和人2Ig-B7H3抗原，人4Ig-B7H3抗原各種抗原之間的反應親和力。

用生物傳感芯片ProteinA(Cat.#29127556，GE)親和捕獲一定量的待測抗體/待測ADC，然後於芯片表面流經一系列濃度梯度下的人2Ig-B7H3抗原(Cat.#1949-B3-050/CF，R&D)、人4Ig-B7H3抗原(Cat.#11188-H08H，SinoBiological)、利用Biacore儀器(Biacore T200，GE)實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。在每個循環解離完成後，用甘胺酸-鹽酸再生溶液(pH1.5)(Cat.#BR-1003-54，GE)將生物芯片洗淨再生。實驗中用到的緩衝液為HBS-EP緩衝溶液(pH7.4)(Cat.#BR-1001-88，GE)。

實驗得到的數據用BIA evaluation version4.1，GE軟體以(1：1)Langmuir模型進行擬合，從而得出親和力數值。實驗結果見表4。

結論：針對與人2Ig-B7H3，人4Ig-B7H3在Biacore實驗上的親和力測試表明，ADC與裸抗的親和力相似。

測試例4. 體外細胞結合實驗

本實驗藉由檢測細胞表面抗體的螢光信號，根據螢光信號強弱來評價抗體的結合。將10μg一抗與2×10⁵個U87MG細胞在冰上孵育30分鐘後洗掉多餘的抗體。將細胞與APC抗人IgGFc(Biolegend，409306)在室溫孵育30分鐘，洗掉多餘抗體後使用BDVerse讀取細胞表面的螢光信號(結果見第1圖)。

結果表明：h1702與細胞表面的B7H3抗原具有很強的結合能力。

測試例5. 體外細胞內吞實驗

本實驗藉由檢測細胞內抗體或不同ADC的螢光信號，根據螢光信號強弱來評價抗體的內吞效果。將B7H3抗體/ADC和APC抗人IgGFc(Biolegend，409306)以1：2的莫耳比例混合在冰上孵育15分鐘。將抗體混合物與2×10⁵個U87MG細胞在冰上孵育30分鐘後洗掉多餘的抗體，然後將細胞轉入預溫37℃的培養基中，在37℃分別孵育0，15，30，60和120分鐘。離心細胞並將細胞重新懸浮在抗體沖提液中室溫孵育7分鐘，洗掉抗體沖提液，使用BDVerse讀取細胞內螢光信號，見第2圖，第3圖，第4圖。結果可見ADC在U87MG細胞上的內吞效果與裸抗相當。

測試例6. SD大鼠T1/2評價

SD大鼠4隻，雌雄各半，12/12小時光/暗調節，溫度24±3℃恆溫，濕度50-60%，自由進食飲水。購自傑思捷實驗動物有限公司。實驗當天對SD大鼠分別尾靜脈注射受試藥物B7H3抗體/ADC，給藥劑量為3mg/kg，注射體積5ml/kg。

取血時間點為：第1天給藥後5min、8h、24h(第2天)，第3天，第5天，第8天，第11天，第15天，於大鼠眼底靜脈取血，每次200μL(相當於取血清100μL)；收集的血樣在室溫下置放半小時至凝集，然後4℃下10000×g離心10分鐘。收集上清，立即放置-80℃貯存。

用ELISA檢測血清中的B7H3抗體濃度，進行PK分析，結果見表5。

結果表明，本發明h1702在大鼠體內的半衰期約為185h(7.7天)。

用ELISA檢測血清中的B7H3抗體ADC的濃度，進行PK分析，結果見表6

結果表明，大鼠靜脈給予3mg/kg受試抗體偶聯物h1702-3024，h1702DS-cys-3024，h1704-3-cys-3024後，總 ADC(totalADC)在大鼠體內的半衰期約為97h(4.04天)，98h(4.08天)，65h(2.71天)。

測試例7. B7H3抗體的物理穩定性

利用DSC檢測不同抗體的熱穩定性，比較了不同的緩衝體系不同pH條件下的熱穩定性情況，不同pH對應的示例性緩衝體系如10mM PB(pH7)，10mM Acetate(pH5.2)。將樣品置換到對應緩衝液中，調控樣品濃度在1mg/ml左右，利用Micro Cal*VP-Capillary DSC(Malvern)進行檢測。檢測前，將各個樣品及空白緩衝液用真空脫氣器脫氣1~2min。樣品板每個孔加入400μl樣品或空白緩衝液(儀器上樣量為300μl)。最後兩對孔板分別加入14% Decon 90和ddH₂O，以備清洗用，樣品板加樣完畢後，套上塑料軟蓋板。掃描溫度從25℃開始到100℃結束，掃描速率60℃/h。具體結果如表7所示，在幾個測試體系中h1702、h1703均表現了較好的熱穩定性。

藉由SEC-HPLC監測樣品純度考察一定濃度條件下週期性穩定性，示例性的條件比如將樣品濃度調控在約40-50 mg/ml，在PBS(pH7.4)體系及pH5.2醋酸/蔗糖體系中比較不同抗體在比如-80℃重複凍融及4℃、30℃、40℃保存一個月的穩定性情況。利用Xbridge protein BEH SE C200 A(Waters)HPLC管柱檢測抗體純度，藉由一個月的考察，h1702、h1703均表現了良好的穩定性，結果如表8所示。

結果顯示，h1702和h1703在醋酸和PBS緩衝液中均顯示出良好的週期穩定性。

測試例8. B7H3抗體的化學穩定性

抗體製備後化學修飾是導致產品穩定性的常見問題之一，尤其是CDR區域的部分胺基酸高度脫醯胺、氧化或者異構化修飾一般選擇儘量避免或者突變降低。取500μg待測抗體溶於500μl pH7.4的PBS中，40℃水浴；分別於0、10、20天取樣，用於酶解實驗。將100μg不同時間點取樣的樣品溶於100μl 0.2M His-HCl，8M Gμa-HCl，pH6.0溶液中，加3μl 0.1g/mL DTT，50℃水浴1小時，後用0.02M His-HCl，pH6.0的溶液超濾兩次，加入3μL 0.25mg/mL的胰蛋白酶(trypsin)，37℃水浴酶解過夜。Agilent 6530Q-TOF進行LC-MS檢測分析，對潛在的修飾位點進行質譜分析(結果見表9)，結果顯示本發明中涉及的h1702、h1703均無明顯的脫醯胺、氧化或者異構化加劇趨勢，提示分子良好的理化穩定性。

測試例9：細胞增殖實驗

本實驗藉由檢測細胞內ATP含量，根據IC50大小評價B7H3-ADC對U87MG細胞和ZR-75-1細胞增殖的抑制效果。

1、對U87MG細胞增殖的抑制效果

U87MG細胞(中科院細胞庫，Catalog#TCHu138)培養在含10%FBS的EMEM培養基中，一週繼代2~3次，繼代比列1：2或1：5。繼代時，吸掉培養基，用5ml 0.25%的胰酶沖洗細胞層，然後吸掉胰酶，將細胞放在培養箱中消化3~5分鐘，加入新鮮培養基重新懸浮細胞。在96孔細胞培養板中加入90μL的細胞懸液，密度為4×10⁴細胞/ml，培養基為10%FBS的DMEM，96孔板外圍只加入100μl 10% FBS的DMEM培養基。將培養板在培養箱培養24小時(37℃，5% CO₂)。

將待測樣品用PBS或DMSO稀釋成50mM，並以3倍依次稀釋成10個濃度，設置成空白和對照的孔。取10μl配製成梯度濃度的化合物溶液加入到90μl新鮮培養基中。再向培養板中加入10μl上述含藥物的培養基溶液。將培養板在培養箱孵育3天(37℃，5%CO₂)。在96孔細胞培養板中，每孔加入100μl Cell Titer-Glo試劑，室溫避光放置5-10min，在Victor3中讀取化學發光信號值，數據使用Graph Pad軟體處理。測得的IC50值見表10。

結論：裸抗偶聯毒素得到的ADC在U87MG細胞上具有很好的殺傷作用。

2、對ZR-75-1細胞增殖的抑制效果

ZR-75-1細胞(ATCC，Catalog# CRL-1500)培養在含10%FBS的RPMI-1640培養基中，一週繼代2~3次，繼代比列1：4或1：6。繼代時，吸掉培養基，用5mL 0.25%的胰酶沖洗細胞層，然後吸掉胰酶，將細胞放在培養箱中消化3~5分鐘，加入新鮮培養基重新懸浮細胞。在96孔細胞培養板中加入90μL的細胞懸液，密度為2.8×10⁴細胞/mL，96孔板外圍只加入100μL 10%FBS的RPMI-1640培養基。將培養板在培養箱培養24小時(37℃，5%CO₂)。

將待測樣品用PBS或DMSO稀釋成50mM，並以3倍依次稀釋成10個濃度，設置成空白和對照的孔。取10μl配製成梯度濃度的化合物溶液加入到90μl新鮮培養基中。再向培養板中加入10μl上述含藥物的培養基溶液。將培養板在培養箱孵育6天(37℃，5%CO₂)。在96孔細胞培養板中，每孔加入100μL Cell Titer-Glo試劑，室溫避光放置5-10min，在Victor3中讀取化學發光信號值，數據使用Graph Pad軟體處理。測得的IC50值見表11。

結論：裸抗偶聯毒素得到的ADC在ZR-75-1細胞上具有很好的殺傷作用。

3、對Detroit 562細胞增殖的抑制效果

Detroit 562細胞(ATCC，Catalog# CCL-138)培養在含10%FBS的EMEM培養基中，一週繼代2~3次，繼代比列1：4或1：6。繼代時，吸掉培養基，用5mL 0.25%的胰酶沖洗細胞層，然後吸掉胰酶，將細胞放在培養箱中消化3~5分鐘，加入新鮮培養基重新懸浮細胞。在96孔細胞培養板中加入90μL的細胞懸液，密度為2.2×10⁴細胞/mL，96孔板外圍只加入100μL 10%FBS的EMEM培養基。將培養板在培養箱培養24小時(37℃，5%CO₂)。

將待測樣品用PBS或DMSO稀釋成50mM，並以3倍依次稀釋成10個濃度，設置成空白和對照的孔。取10μl配製成梯度濃度的化合物溶液加入到90μl新鮮培養基中。再向培養板中加入10μl上述含藥物的培養基溶液。將培養板在培養箱孵育6天(37℃，5%CO₂)。在96孔細胞培養板中，每孔加入100μL Cell Titer-Glo試劑，室溫避光放置5-10min，在Victor3中讀取化學發光信號值，數據使用Graph Pad軟體處理。測得的IC50值見表12。

結論：裸抗偶聯毒素得到的ADC在Detroit 562細胞上具有很好的殺傷作用。

4、以上述方法對h1702DS，h1704-3抗體，及其相應的ADC：h1702-cys-3024，h1702DS-cys-3024，h1704-3-cys-3024測試對U87MG，ZR-75-1及Detroit 562細胞的增殖抑制效果，結果如下表13：

結論：裸抗偶聯毒素得到的ADC在U87MG，ZR-75-1和Detroit 562細胞上具有很好的殺傷作用。

體內活性生物學評價

測試例10：ADC對人腦星形膠質母細胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的療效評價

一、測試方法

實驗用BALB/cA-nude裸小鼠，雌性，6-7週，購自上海西普爾．必凱實驗動物有限責任公司(合格證號：SCXK(滬)2008-0016)。飼養環境：SPF級。裸小鼠皮下接種人腦星形膠質母細胞瘤U87MG細胞(中科院，貨號TCHu138)，接種細胞後第十天(腫瘤平均體積122mm³)，將動物隨機分組(D0)，每組8隻，開始腹腔注射給藥1次/ 週，共給藥3次，每週測2-3次瘤體積和體重，記錄數據。腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×a×b2

其中a、b分別表示長、寬。

相對體積(RTV)=VT/V0

抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)

其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的對照組(空白)及實驗組的相對腫瘤體積。

二、測試對象

h1702-3024ADC(1mpk,3mpk,10mpk)； h1702DS-cys-3024ADC(1mpk,3mpk)； h1704-3-cys-3024ADC(1mpk,3mpk)；空白組(空白)：PH7.4的PBS緩衝液

三、抗體ADC的抑瘤效果

1)考察至給藥開始後第26天(D26)時，受試抗體h1702-3024ADC(1mpk,3mpk,10mpk)的抑瘤率分別為33.68%，99.13%，100%；見第5圖，與對照組相比均有顯著差異。給藥第21天時，對照組由於腫瘤過大，個別鼠體重下降明顯，並於給藥第26天時，對照組有兩隻鼠因腫瘤太大死亡。其他各組均體重正常，見第6圖，表14，給藥過程中未出現小鼠死亡，提示h1702-3024各給藥劑量沒有明顯毒副作用。

h1702-3024各劑量間有一定的劑量依賴關係，在3mpk 的時候已經達到95%以上的抑瘤率，10mpk達到100%的抑瘤率。

2)對受試抗體h1702DS-cys-3024ADC，h1704-3-cys-3024ADC抑瘤效果實驗結果見表15。結果顯示，腹腔注射給藥1次/週，共給藥3次，觀察至D26時，受試ADCh1702DS-cys-3024(1mpk)的抑瘤率達到22.99%；h1702DS-cys-3024(3mpk)的抑瘤率達到98.16%；h1704-3-cys-3024(1mpk)的抑瘤率達到31.05%；h1704-3-cys-3024(3mpk)的抑瘤率達到94.83%；1mpk的3個受試抗體組與空白組相比都無顯著差異(P>0.05)，3mpk的3個受試抗體組與空白組相比均有極顯著差異(P<0.001)。

給藥過程中各組動物體重正常，提示ADC無明顯毒副作用。

空白組和1mpk各組在26天時腫瘤體積較大，因此D26時將空白和1mpk各組處死，其餘組觀察至D36時，h1702DS-cys-3024(3mpk)組停藥後腫瘤生長仍然較慢，抑瘤效果最好。h1702DS-cys-3024(3mpk)和h1704-3-cys-3024(3mpk)在D26和D36時的抑瘤率組間比較無明顯差異(P>0.05)。

測試例11：ADC對人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit562裸小鼠移植瘤的療效評價

一、測試方法

實驗用BALB/cA-nude裸小鼠，雌性，6-7週，皮下接種人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit562細胞。接種細胞後第十天，將動物隨機分組(D0)，每組8隻，開始腹腔注射給藥1次/週，共給藥3次，每週測2-3次瘤體積和體重，記錄數據。腫瘤體積(V)計算公式為： V=1/2×a×b2

其中a、b分別表示長、寬。

相對體積(RTV)=VT/V0

抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)

二、測試對象

h1702DS-cys-3024ADC(1mpk,3mpk)；空白組(空白)：PH7.4的PBS緩衝液

三、抗體ADC的抑瘤效果

觀察至D35時，受試抗體ADC抑瘤率分別是：h1702DS-cys-3024ADC(1mpk)的抑瘤率達到39.22%(P<0.05)；h1702DS-cys-3024ADC(3mpk)的抑瘤率達到70.50%(P<0.001)(見表16)。藥過程中各組動物體重正常。

穩定性評價

測試例12：B7H3ADC的物理穩定性

利用DSC檢測不同抗體ADC的熱穩定性，比較了不同的緩衝體系不同pH條件下的熱穩定性情況，不同pH對應的示例性緩衝體系如10mM PBS(pH7.4)，10mM Acetate(pH5.5)。將樣品置換到對應緩衝液中，調控樣品濃度在1mg/ml左右，利用Micro Cal*VP-Capillary DSC(Malvern)進行檢測。檢測前，將各個樣品及空白緩衝液用真空脫氣器脫氣1~2min。樣品板每個孔加入400μl樣品或空白緩衝液(儀器上樣量為300μl)。最後兩對孔板分別加入14% Decon 90和ddH₂O，以備清洗用，樣品板加樣完畢後，套上塑料軟蓋板。掃描溫度從25℃開始到100℃結束，掃描速率60℃/h。具體結果如表17所示，在幾個測試體系中h1702-3024、h1703-3024均表現了較好的熱穩定性。

測試例13：ADC的穩定性

藉由SEC-HPLC監測樣品(h1702DS-cys-3024ADC，h1704-3-cys-3024ADC)純度考察一定濃度條件下穩定性，示例性的條件比如將樣品濃度調控在約50mg/ml，在PBS(pH7.4)體系及pH5.5醋酸/蔗糖體系(代稱559體系)中比較不同抗體在40℃保存28天的穩定性情況。利用Xbridge protein BEH SE C200A(Waters)HPLC管柱檢測抗體純度，藉由28天的考察，h1702DS-cys-3024ADC表現了良好的穩定性，結果如第7圖所示。

結果顯示，h1702DS-cys-3024在醋酸和PBS緩衝液中均顯示出良好的穩定性。

雖然為了清楚的理解，已經借助於附圖和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本發明的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內容藉由引用完整地清楚結合。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司

<120> B7H3抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途

<130> 370063CG

<160> 41

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 534

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人B7H3全長胺基酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠B7H3全長胺基酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人B7H3抗原：2Ig-B7H3

<400> 3

<210> 4

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人B7H3抗原：4Ig-B7H3

<400> 4

<210> 5

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠B7H3抗原

<400> 5

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1702重鏈可變區

<400> 6

<210> 7

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1702輕鏈可變區

<400> 7

<210> 8

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1703重鏈可變區

<400> 8

<210> 9

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1703輕鏈可變區

<400> 9

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1702 HCDR1

<400> 10

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1702 HCDR2

<400> 11

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1702 HCDR3

<400> 12

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1702 LCDR1

<400> 13

<210> 14

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1702 LCDR2

<400> 14

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1702 LCDR3

<400> 15

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1703 HCDR1

<400> 16

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1703 HCDR2

<400> 17

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1703 HCDR3

<400> 18

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1703 LCDR1

<400> 19

<210> 20

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1703 LCDR2

<400> 20

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1703 LCDR3

<400> 21

<210> 22

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1702重鏈

<400> 22

<210> 23

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1702輕鏈

<400> 23

<210> 24

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1703重鏈

<400> 24

<210> 25

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1703輕鏈

<400> 25

<210> 26

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1702-DS輕鏈序列

<400> 26

<210> 27

<211> 666

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗原h-B7H3-FC

<400> 27

<210> 28

<211> 118

<212> PRT

<213> 鼠類腺病毒(Murine adenovirus)

<400> 28

<210> 29

<211> 106

<212> PRT

<213> 鼠類腺病毒(Murine adenovirus)

<400> 29

<210> 30

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1704-HCDR1

<400> 30

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1704-HCDR2

<400> 31

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1704-HCDR3

<400> 32

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1704-LCDR1

<400> 33

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1704-LCDR2

<400> 34

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1704-LCDR3

<400> 35

<210> 36

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1704VH1

<400> 36

<210> 37

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1704VH2

<400> 37

<210> 38

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1704VL1

<400> 38

<210> 39

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1704VL2

<400> 39

<210> 40

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1704-3抗體重鏈序列

<400> 40

<210> 41

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1704-3抗體輕鏈序列

<400> 41

Claims

一種通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，Ab-(L ₂-L ₁-D) _y (A)其中：D是細胞毒性藥物；L ₁，L ₂是接頭單元；y為選自1至8的數；Ab為B7H3抗體或其抗原結合片段，其與人B7H3結合，該B7H3抗體或其抗原結合片段是選自下面(a)至(c)中任一種的單株抗體或其抗原結合片段：(a)單株抗體，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：10、11和12胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：13、14和15胺基酸序列所示；(b)單株抗體，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：16、17和18胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：19、20和21胺基酸序列所示；(c)單株抗體，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：30、31和32胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：33、34和35胺基酸序列所示。
一種通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物，Ab-(L ₂-L ₁-D) _y (A)其中：D是細胞毒性藥物；L1，L2是接頭單元；y為選自1至8的數；Ab為與申請專利範圍第1項中所述的B7H3抗體或其抗原結合片段競爭結合人B7H3的單株抗體或其抗原結合片段。
如申請專利範圍第1或2所述的抗體-藥物偶聯物，其中，y為選自2至4的數。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該Ab是重組抗體。
如申請專利範圍第4項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該Ab的恆定區和/或框架區是來源於人的重組抗體或其抗原結合片段。
如申請專利範圍第5項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該Ab的輕鏈和重鏈可變區上的輕鏈FR區和重鏈FR區序列分別來源於人種系輕鏈和重鏈序列或其突變序列；其中該恆定區包括來源於人源IgG1、IgG2、IgG3 或IgG4或其變體的重鏈恆定區；和來源於人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
如申請專利範圍第6項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該恆定區包括來源於人源IgG1重鏈恆定區。
如申請專利範圍第6或7項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該Ab含有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37所示的重鏈可變區或其變體；該變體是在SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37所示的重鏈可變區序列上具有1至10個胺基酸替換的序列；和含有SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39所示的輕鏈可變區或其變體；該變體是在SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39所示的輕鏈可變區序列上具有1至10個胺基酸替換的序列。
如申請專利範圍第6項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該Ab含有選自下面(1)至(7)中任一種的單株抗體或其抗原結合片段：(1)單株抗體，其包含SEQ ID NO：6所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：7所示抗體輕鏈可變區；(2)單株抗體，其包含SEQ ID NO：8所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：9所示抗體輕鏈可變區；(3)單株抗體，其包含SEQ ID NO：28所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：29所示抗體輕鏈可變區；(4)單株抗體，其包含SEQ ID NO：36所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：38所示抗體輕鏈可變區；(5)單株抗體，其包含SEQ ID NO：36所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：39所示抗體輕鏈可變區；(6)單株抗體，其包含SEQ ID NO：37所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：38所示抗體輕鏈可變區；(7)單株抗體，其包含SEQ ID NO：37所示的抗體重鏈可變區；和SEQ ID NO：39所示抗體輕鏈可變區。
如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該Ab為全長抗體，其進一步包括人抗體恆定區；其中該全長抗體選自：h1702抗體，其是由SEQ ID NO：22所示的重鏈序列和SEQ ID NO：23所示的輕鏈序列組成的全長抗體，h1703抗體，其是由SEQ ID NO：24所示的重鏈序列和SEQ ID NO：25所示的輕鏈序列組成的全長抗體，h1702-DS抗體，其是由SEQ ID NO：22所示的重鏈序列和SEQ ID NO：26所示的輕鏈序列組成的全長抗體，和h1704-3抗體，其是由SEQ ID NO：40所示的重鏈序列和SEQ ID NO：41所示的輕鏈序列組成的全長抗體。
如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。
如申請專利範圍第1至11項中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該細胞毒性藥物選自毒素、化療藥物、抗生素、放射性同位素和核溶酶。
如申請專利範圍第12項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該細胞毒性藥物選自DM1、DM3、DM4、MMAF和MMAE。
如申請專利範圍第12項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該細胞毒性藥物選自：
如申請專利範圍第12項所述的抗體-藥物偶聯物，其為式I所示化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中：L ₁，L ₂是接頭單元；y為選自1至8的數；Ab為申請專利範圍第1至11項中任一項所述的B7H3抗體或其抗原結合片段。
申請專利範圍第15項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，y為選自2至4的數。
如申請專利範圍第15項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，L ₂如以下通式L ₂所示：其中X ₁選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；X ₂選自烷基、環烷基和雜環基；m為選自0至5的整數；S為硫原子。
申請專利範圍第17項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，m為1、2或3。
如申請專利範圍第17項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，L ₁如以下通式(L ₁)所示：其中X ₃為烷基，視需要該烷基進一步被選自鹵素、羥基和氰基的取代基所取代；n為選自0至5的整數。
如申請專利範圍第19項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，n為1、2或3。
如申請專利範圍第15項所述的抗體-藥物偶聯物，其為通式(II)所示的抗體-藥物偶聯物：
如申請專利範圍第15項所述的抗體-藥物偶聯物，其為通式(III)所示的抗體-藥物偶聯物：
如申請專利範圍第1或2項所述的抗體-藥物偶聯物，其選自如下化合物：
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至23項中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或該抗體-藥物偶聯物藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，和一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
一種申請專利範圍第1至23項中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或申請專利範圍第24項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備用於治療與人B7H3相關的疾病的藥物。
如申請專利範圍第25項所述的用途，其用在製備用於治療B7H3高表達癌症的藥物。
一種申請專利範圍第1至23項中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或申請專利範圍第24項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備用於治療疾病的藥物，該疾病選自人腦星形膠質母細胞瘤、人咽頭癌、腎上腺腫瘤、AIDS-相關癌症、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、促結締組織增生性小圓細胞腫瘤、室管膜細胞瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維發育不全、骨纖維性發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養細胞病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌、白血病、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤病、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合症、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、小兒癌症、外周神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、***癌、後葡萄膜黑色素瘤、腎轉移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。