CN114729013A - 抗cd22抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文公开了高亲和力抗CD22抗体和将其用于治疗和/或诊断目的的方法。本文还提供了产生此类抗CD22抗体的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年8月21日提交的美国临时专利申请第62/889,739号的优先权,该申请的全部内容通过引用并入本文。
发明背景
分化簇22(CD22)是SIGLEC凝集素家族的成员。相对于未成熟B细胞,该分子在成熟B细胞表面高水平表达。作为B细胞受体(BCR)信号传导的抑制性受体,它在防止免疫***过度激活方面发挥调节作用。
已经表明,CD22是很有前途的白血病治疗、例如急性淋巴细胞白血病治疗以及治疗全身性自身免疫性疾病的靶点。
发明概述
本公开内容至少部分基于对细胞表面上表达的CD22具有高结合亲和力和特异性的优异抗CD22抗体的开发。本文公开的抗CD22抗体结合不同的CD22表位,如目前临床前和临床研究中的已知抗CD22抗体M971和RFB4(BL22的来源)。此外,IgG形式的某些示例性抗CD22抗体(例如,克隆EP160-D02)显示出对细胞表面CD22的高结合亲和力和特异性,以及相对于BL22和M971更高的ADCC活性。本文提供的结果表明,预期本文公开的抗CD22抗体对CD22+疾病细胞如癌细胞具有高治疗效果。
因此,本公开内容的一个方面特征在于分离的抗体,其结合CD22。这样的抗CD22可与参考抗体结合相同的表位或与参考抗体竞争结合CD22。示例性参考抗体包括EP35-A7,EP35-B5,EP35-C6,EP35-C6,EP35-C8,EP35-D6,EP35-E6,EP35-E7,EP97-A01,EP97-A10,EP97-B03,EP97-F01,EP97-G05,EP160-C07,EP160-D02,EP160-E03,EP160-F04,EP160-F10,EP160-G04,EP160-G05和EP160-H02,在下文中提供了其结构信息。在具体实例中,参考抗体是EP160-D02。在其他具体实例中,参考抗体是EP97-B03。
在一些实施方案中,本文公开的抗CD22抗体可包含:(a)重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3),其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3集体地与参考抗体的重链CDR至少80%相同;和/或轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3),其中LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3集体地与参考抗体的轻链CDR至少80%相同。在一些情况下,抗CD22抗体可以对细胞表面上表达的CD22具有小于10nM(例如小于1nM)的结合亲和力。
在一些实施方案中,本文公开的抗CD22抗体可包含HC CDR,其与参考抗体的HCCDR相比集体地包含不超过8个氨基酸残基变异;和/或抗体的LC CDR与参考抗体的LC CDR相比集体地包含不超过8个氨基酸残基变异。
本文公开的任何抗CD22抗体可包含与参考抗体的VH至少85%相同的VH,和/或与参考抗体的VL至少85%相同的VL。在一些实例中,抗CD22抗体可包含与参考抗体相同的重链互补决定区(HC CDR)和相同的轻链互补决定区(LCCDR)。在具体实例中,抗CD22抗体可包含与参考抗体相同的VH和相同的VL。
本文公开的任何抗CD22抗体可为人抗体或人源化抗体。备选地或此外,抗CD22抗体可为全长抗体或其抗原结合片段。在一些实例中,抗CD22抗体是单链抗体(scFv),例如包含SEQ ID NO:40-59中任一个的氨基酸序列。
在另一方面,本文提供核酸或核酸组,其集体地编码本文公开的任何抗CD22抗体的重链和/或轻链。在一些实施方案中,核酸或核酸组可为载体或载体组,例如表达载体。也在本公开内容的范围内的是宿主细胞(例如哺乳动物细胞或细菌细胞),其包含本文公开的任何核酸或核酸组,以及药物组合物,其包含任何抗CD22抗体、编码其的任何核酸和包含核酸的宿主细胞,药学上可接受的承载体。
而且,本公开内容提供抑制受试者CD22的方法,其包括给有需要的受试者施用任何有效量的本文公开的药物组合物。在一些实施方案中,受试者可以为具有CD22阳性疾病细胞的人患者。例如,受试者可以为患有癌症或自身免疫性疾病或涉及CD22+细胞的其他疾病/病症的人患者。此类人患者可具有CD22阳性癌细胞(例如造血细胞癌细胞)或CD22阳性自身反应性免疫细胞的人患者。同样在本公开内容的范围内的是本文公开的用于治疗疾病的药物组合物,所述疾病包含CD22+疾病细胞,例如本文所述的那些,以及本文公开的任何抗CD22抗体用于制造药物的用途,所述药物用于治疗本文还公开的任何靶疾病。
此外,本公开内容提供检测CD22的存在的方法,其包括:(i)将根据权利要求1-12中任一项所述的抗体与怀疑含有CD22的样品接触,和(ii)检测抗体与CD22的结合。抗体可与可检测标记缀合。在一些情况下,CD22表达在细胞表面上。在一些实例中,可通过将抗体施用于受试者进行接触步骤。
在另一方面,本公开内容提供产生与CD22结合的抗体的方法,其包括:(i)在允许所述与CD22结合的抗体表达的条件下培养权利要求16的宿主细胞;和(ii)从细胞培养物收获由此产生的抗体。
本发明的一个或多个实施方案的细节在以下说明书中阐述。本发明的其他特征或优点将从所附附图和若干实施方案的详细描述以及从所附权利要求书中显而易见。
附图简要说明
下列附图构成本说明书的一部分并被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面,通过参考附图并结合本文所呈现的具体实施方案的详述可以更好地理解这些方面。
图1是显示用于从抗体文库如scFv文库和单重链(VH)文库富集高亲和力CD22结合物的示例性策略的说明图。
图2是显示通过多轮mRNA展示选择随后对单个阳性克隆进行ELISA筛选从scFv文库获得的示例性单链(scFv)CD22结合物的图。
图3A-3D包括显示示例性抗CD22抗体对表达表面CD22的K562细胞的滴定曲线的图。图3A:克隆EP-84-A6,EP84-F6,EP84-H7和EP84-G12。图3B:克隆EP97-A10和EP97-D06。图3C:克隆EP160-C04,EP160-F04,EP160-C07,EP160-H02,EP160-D02,EP97-A10,EP97-B03和EP97-G05。图3D:EP160-G04,EP160-G01,EP160-E03,EP160-F10和EP160-G05。
图4是显示在存在或不存在抗CD22抗体M971的情况下示例性抗CD22抗体与表达CD22的K562细胞的结合活性的图。
图5是显示抗CD22抗体对表达重组或内源CD22的细胞的结合活性的图表。对于每个测试的抗CD22 scFv抗体,从左到右的条对应于K562细胞、CD22K562细胞、CD22HEK293细胞、Daudi细胞和Raji细胞。
图6是显示使用示例性抗CD22 scFv EP097-G05对内源性CD22阳性细胞进行免疫组织化学(IHC)染色的照片。
图7A和7B包括显示与已知抗CD22抗体M971和RFB4相比的示例性抗CD22抗体的表位分区(binning)的图。图7A:相对于M971抗体的表位分区。图7B:相对于来自RFB4抗体的BL22的表位分区。
图8A-8C包括显示IgG形式的抗CD22抗体的结合活性和特异性的图。图8A是显示了使用表达表面CD22的HEK293细胞的结合测定的结果的图。图8B是显示使用表达表面CD123的CHO-K1细胞的结合测定结果的图。图8C是表示通过ELISA测量的结合活性的结果的图。
图9是显示所示的抗CD22 IgG抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性的图。
图10是显示抗CD22 IgG抗体在与细胞表面CD22结合后内化的图。
发明详述
本文提供了能够结合人CD22、特别是在细胞表面上表达的CD22的抗体(“抗CD22抗体”)。本文公开的抗CD22抗体显示对CD22(例如,细胞表面CD22)的高结合亲和力、高稳定性,和/或结合与M971(本领域已知的全人抗CD22)不同的CD22表位。
CD22是主要在成熟B细胞表面上表达的跨膜糖蛋白。这种细胞表面受体通过位于受体N端的免疫球蛋白(Ig)结构域特异性结合唾液酸。CD22作为BCR介导的信号传导通路的抑制受体发挥作用。来自不同物种的CD22分子在本领域中是众所周知的。例如,人CD22的氨基酸序列可以在GenBank登录号NP_001762.2找到。
CD22存在于恶性B细胞上,因此是治疗造血癌的有希望的靶标,特别是B细胞来源的造血癌,例如急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。CD22也参与自身免疫,因此将成为治疗自身免疫性疾病的靶标。
因此,本文公开的抗CD22抗体可用作用于治疗具有CD22+疾病细胞的疾病、例如B细胞谱系的癌症或由CD22+自身反应性免疫细胞介导的自身免疫性疾病的治疗剂。此外,本文公开的抗CD22抗体可用作检测CD22存在、例如CD22阳性细胞的诊断剂。本文公开的抗体也可用于研究目的。
I.与CD22结合的抗体
本公开内容提供了结合CD22、例如人CD22的抗体。在一些实施方案中,本文公开的抗CD22抗体能够结合细胞表面上表达的CD22。因此,本文公开的抗体可用于治疗或诊断目的以靶向CD22阳性细胞(例如,白血病细胞)。如本文所用,术语“抗CD22抗体”是指能够结合CD22多肽(例如,在细胞表面上表达的CD22多肽)的任何抗体,其可以是合适的来源,例如人或非人哺乳动物(例如,小鼠、大鼠、兔、灵长类动物如猴等)。
抗体(复数形式可互换使用)是一种免疫球蛋白分子,能够通过位于抗体可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标,例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。免疫球蛋白分子。如本文所用,术语“抗体”、例如抗CD22抗体,不仅包括完整的(例如,全长)多克隆或单克隆抗体,还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链抗体(scFv)、包含抗体部分的融合蛋白(例如嵌合抗原受体或CAR)、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、单结构域抗体(例如,仅VH抗体,如纳米抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型,包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体、例如抗Galectin-9抗体,包括任何种类的抗体,例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类),并且抗体不需要是任何特定种类的。根据抗体重链恒定结构域的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的类别。免疫球蛋白有五种主要类别:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且其中一些可进一步分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
典型的抗体分子包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),它们通常参与抗原结合。VH和VL区可以进一步细分为高变区,也称为“互补决定区”(“CDR”),其中散布着更保守的区域,称为“框架区”(“FR”)。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成,从氨基端到羧基端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可以使用本领域已知的方法,例如通过Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或Contact定义来精确鉴定框架区和CDR的范围,所有这些都是本领域众所周知的。参见例如Kabat,E.A.等.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242,Chothia等,(1989)Nature 342:877;Chothia,C.等(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani等(1997)J.Molec.Biol.273:927-948;和Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs。
本文所述的抗CD22抗体可以是全长抗体,其包含两条重链和两条轻链,每条包括可变结构域和恒定结构域。或者,抗CD22抗体可以是全长抗体的抗原结合片段。包含在术语全长抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab')2片段,包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546),其由VH结构域组成;(vi)保留功能的分离的互补决定区(CDR)。此外,尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因编码的,但它们可以使用重组方法通过合成接头连接,从而使它们能够制成单个蛋白质链,其中VL和VH区配对形成已知称为单链Fv(scFv)的单价分子。参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883。
本文所述的抗体可以具有合适的来源,例如鼠、大鼠或人。此类抗体是非天然存在的,即不是在没有人类行为的动物中产生的(例如,用所需抗原或其片段免疫此类动物或从抗体文库中分离)。本文所述的任何抗体,例如抗CD22抗体,可以是单克隆的或多克隆的。“单克隆抗体”是指同源抗体群,“多克隆抗体”是指异源抗体群。这两个术语不限制抗体的来源或其制备方式。
在一些实施方案中,抗CD22抗体是人抗体,可以从人抗体库中分离或在转基因小鼠中产生。例如,完全人源抗体可以通过使用经工程改造以表达特定人免疫球蛋白的市售小鼠获得。被设计为产生更理想的(例如,完全人类抗体)或更稳健的免疫反应的转基因动物也可用于产生人源化或人类抗体。此类技术的实例是来自Amgen,Inc.(Fremont,Calif.)的XenomouseTM和来自Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)的HuMAb-MouseTM和TC MouseTM。在另一备选中,抗体可以通过噬菌体展示或酵母技术重组制备。参见例如美国专利号5,565,332;5,580,717;5,733,743;和6,265,150以及Winter等,(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。或者,抗体文库展示技术,例如本领域已知的噬菌体、酵母展示、哺乳动物细胞展示或mRNA展示技术可用于从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因储库在体外产生人抗体和抗体片段。
在其他实施方案中,抗CD22抗体可以是人源化抗体或嵌合抗体。人源化抗体是指非人(例如,鼠)抗体的形式,其是特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其抗原结合片段,其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。一般而言,人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体CDR的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR残基置换。在一些情况下,人免疫球蛋白的一个或多个Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此外,人源化抗体可以包含既不在受体抗体中也不在输入的CDR或框架序列中发现的残基,但包括在内以进一步改进和优化抗体性能。在一些情况下,人源化抗体可以包含基本上所有的至少一个,通常是两个可变结构域,其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区和所有或基本上所有的FR区域是人免疫球蛋白共有序列的区域。人源化抗体最好还包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分,通常是人免疫球蛋白的。抗体可以具有如WO 99/58572中所述修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个),其也被称为一个或多个“衍生自”一个或多个来自原始抗体的CDR的CDR。人源化抗体也可能涉及亲和力成熟。构建人源化抗体的方法也是本领域众所周知的。参见例如Queen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)。
在一些实施方案中,本文公开的抗CD22抗体可以是嵌合抗体。嵌合抗体是指具有来自第一物种的可变区或部分可变区和来自第二物种的恒定区的抗体。通常,在这些嵌合抗体中,轻链和重链的可变区均模拟衍生自一种哺乳动物(例如,非人类哺乳动物,例如小鼠、兔和大鼠)的抗体的可变区,而恒定部分与衍生自另一种哺乳动物如人的抗体中的序列同源。在一些实施方案中,可以在可变区和/或恒定区中进行氨基酸修饰。为生产“嵌合抗体”而开发的技术在本领域是众所周知的。参见例如Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851;Neuberger等(1984)Nature 312,604;和Takeda等(1984)Nature 314:452。
在一些实施方案中,本文所述的抗CD22抗体特异性结合相应的靶抗原(例如CD22)或其表位。“特异性结合”抗原或表位的抗体是本领域熟知的术语。如果一个分子与特定靶抗原的反应比它与替代靶抗原的反应更频繁、更迅速、持续时间更长和/或亲和力更强,则称其表现出“特异性结合”。如果抗体以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或比与其他物质结合的持续时间更长,则抗体“特异性地结合”靶抗原或表位。例如,特异性(或优先)结合抗原(CD22)或其中的抗原表位的抗体是以比其结合的更高的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合其他抗原或同一抗原中的其他表位的抗体。通过该定义还可以理解,例如,特异性结合第一靶抗原的抗体可以或可以不特异性或优先结合第二靶抗原。因此,“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可以包括)排他结合。在一些实例中,与靶抗原或其表位“特异性结合”的抗体可能不与其他抗原或同一抗原中的其他表位结合(即,在常规方法中只能检测到基线结合活性)。在一些实例中,本文公开的抗CD22抗体不结合与FMC63相同的表位。在其他实例中,抗CD22抗体结合不与M971结合的CD22表位重叠的CD22表位。M971的VH和VL序列在本领域中是众所周知的并且提供在下文中(CDR粗体显示):
M971-VH(SEQ ID NO:1):
M971-VL(SEQ ID NO:2):
在一些实施方案中,本文所述的抗CD22抗体对靶抗原(例如CD22)或其抗原表位具有合适的结合亲和力。如本文所用,“结合亲和力”是指表观缔合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。本文所述的抗CD22抗体对CD22可具有至少100nM、10nM、1nM、0.1nM或更低的结合亲和力(KD)。增加的结合亲和力对应于减少的KD。相对于第二抗原,抗体对第一抗原的更高亲和力结合可以通过与结合第二抗原的KA(或数值KD)相比更高的结合第一抗原的KA(或更小的数值KD)来表示。在这种情况下,抗体相对于第二抗原(例如,第二构象的相同第一蛋白质或其模拟物;或第二蛋白质)对第一抗原(例如,第一构象的第一蛋白质或其模拟物)具有特异性。结合亲和力的差异(例如,用于特异性或其他比较)可以是至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、90、100、500、1000、10,000或105倍。在一些实施方案中,任何抗CD22抗体可以进一步亲和力成熟以增加抗体与靶抗原或其抗原表位的结合亲和力。
结合亲和力(或结合特异性)可以通过多种方法确定,包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子体共振或光谱学(例如,使用荧光测定法)。用于评估结合亲和力的示例性条件是在HBS-P缓冲液(10mM HEPESpH7.4、150mM NaCl、0.005%(v/v)表面活性剂P20)中。这些技术可用于测量随着靶蛋白浓度的变化的结合结合蛋白(bound bindingprotein)的浓度。结合结合蛋白的浓度([Bound])通常与游离靶蛋白的浓度([Free])相关,公式如下:
[Bound]=[Free]/(Kd+[Free])
然而,并不总是需要精确测定KA,因为有时获得亲和力的定量测量值就足够了,例如,使用ELISA或FACS分析等方法确定的亲和力与KA成正比,因此可以用于比较,例如确定较高的亲和力是否高2倍,以获得亲和力的定性测量,或获得亲和力的推断,例如,通过功能测定法、例如体外或体内测定法中的活性。
在一些实施方案中,本文公开的抗CD22抗体对于结合CD22阳性细胞的EC50值低于10nM,例如<1nM、<0.5nM或低于0.1nM。如本文所用,EC50值是指与CD22阳性细胞群中50%的细胞结合所需的抗体的最低浓度。EC50值可以使用常规测定法和/或本文公开的测定法来确定。参见例如下面的实施例。
下面提供了许多示例性抗CD22抗体(CDR以粗体表示,其由Chothia方法确定(Chothia等(1992)J.Mol.Biol.,227,776-798,Tomlinson等(1995)EMBO J.,14,4628-4638和Williams等(1996)J.Mol.Biol.,264,220-232)。还参见www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php。
EP160-C07
VH(SEQ ID NO:3):
VL(SEQ ID NO:4):
EP160-E03
VH(SEQ ID NO:5):
VL(SEQ ID NO:6)
EP160-F10(单结构域抗体)
VH(SEQ ID NO:7)
EP97-A10
VH(SEQ ID NO:8)
VL(SEQ ID NO:9)
EP97-B03
VH(SEQ ID NO:10)
VL(SEQ ID NO:11)
EP160-D02
VH(SEQ ID NO:12)
VL(SEQ ID NO:13)
EP160-G04
VH(SEQ ID NO:14)
VL(SEQ ID NO:15)
EP160-H02
VH(SEQ ID NO:16)
VL(SEQ ID NO:17)
EP160-G05
VH(SEQ ID NO:18)
VL(SEQ ID NO:19)
EP35-C6
VH(SEQ ID NO:20)
VL(SEQ ID NO:21)
EP35-A7
VH(SEQ ID NO:22)
VL(SEQ ID NO:23)
EP35-D6
VH(SEQ ID NO:24)
VL(SEQ ID NO:25)
EP35-E6
VH(SEQ ID NO:26)
VL(SEQ ID NO:27)
EP35-C8
VH(SEQ ID NO:28)
VL(SEQ ID NO:29)
EP160-F04
VH(SEQ ID NO:30)
VL(SEQ ID NO:31)
BP35-B05
VH(SEQ ID NO:32)
VL(SEQ ID NO:33)
EP97-G05
VH(SEQ ID NO:34)
VL(SEQ ID NO:35)
EP97-F01
VH(SEQ ID NO:36)
VL(SEQ ID NO:37)
EP97-A01
VH(SEQ ID NO:38)
VL(SEQ ID NO:39)
在一些实施方案中,本文所述的抗CD22抗体与本文所述的任何示例性抗体(例如,EP35-A7,EP35-B5,EP35-C6,EP35-C8,EP35-D6,EP35-E6,EP35-E7,EP97-A01,EP97-A10,EP97-B03,EP97-F01,EP97-G05,EP160-C07,EP160-D02,EP160-E03,EP160-F04,EP160-F10,EP160-G04,EP160-G05,EP160-H02和EP97-A01)结合相同的CD22多肽表位,或与示例性抗体竞争结合CD22抗原。在一些实例中,本文公开的抗CD22抗体与EP160-D02结合相同的CD22多肽表位或与示例性抗体竞争结合CD22抗原。在其他实例中,本文公开的抗CD22抗体与EP97-B03结合相同的CD22多肽表位或与示例性抗体竞争结合CD22抗原。
“表位”是指靶抗原上被抗体识别和结合的位点。该位点可以完全由氨基酸组分组成,完全由蛋白质氨基酸的化学修饰(例如糖基部分)组成,或由它们的组合组成。重叠表位包括至少一个共同氨基酸残基。表位可以是线性的,其长度通常为6-15个氨基酸。或者,表位可以是构象的。抗体结合的表位可以通过常规技术确定,例如,表位作图方法(参见例如以下描述)。与本文所述的示例性抗体结合相同表位的抗体可以结合与示例性抗体完全相同的表位或基本上重叠的表位(例如,含有少于3个非重叠氨基酸残基、少于2个非重叠氨基酸残基,或仅1个非重叠氨基酸残基)。两种抗体是否相互竞争以结合同源抗原可以通过本领域众所周知的竞争测定法来确定。
在一些实例中,抗CD22抗体包含与本文所述的示例性抗体相同的VH和/或VL CDR。具有相同VH和/或VL CDR的两种抗体意味着当通过相同的方法(例如,Kabat方法、Chothia方法、AbM方法、Contact方法或IMGT方法确定时,它们的CDR相同。参见例如bioinf.org.uk/abs/)。此类抗CD22抗体可具有与本文所述的示例性抗体相比相同的VH、相同的VL或两者。
如本文所公开的任何示例性抗CD22抗体的功能变体(例如EP160-D2或EP97-B03)也在本公开内容的范围内。此类功能变体在结构上和功能上都与示例性抗体基本相似。功能变体包含与示例性抗体基本相同的VH和VL CDR。例如,它可以在抗体的总CDR区中仅包含多达8个(例如,8、7、6、5、4、3、2或1个)氨基酸残基变异,并与CD22的相同表位以基本相似的亲和力(例如,具有相同量级的KD值)结合。在一些情况下,功能变体可以具有与示例性抗体相同的重链CDR3,并且任选地具有与示例性抗体相同的轻链CDR3。备选地或此外,功能变体可具有与示例性抗体相同的重链CDR2。这样的抗CD22抗体可以包含与示例性抗体的VH相比仅在重链CDR1中具有CDR氨基酸残基变化的VH片段。在一些实例中,抗CD22抗体可进一步包含具有与示例性抗体相同的VL CDR3和任选地相同的VL CDR1或VL CDR2的VL片段。
备选地或此外,氨基酸残基变异可以是保守的氨基酸残基置换。如本文所用,“保守氨基酸置换”是指不改变进行氨基酸置换的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸置换。可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法制备变体,例如在汇编此类方法的参考文献中发现的,例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等.,eds.,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York,1989,或Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,New York。氨基酸的保守置换包括在以下组内的氨基酸之间进行的置换:(a)M,I,L,V;(b)F,Y,W;(c)K,R,H;(d)A,G;(e)S,T;(f)Q,N;和(g)E,D。
在一些实施方案中,抗CD22抗体可包含与本文所述的示例性抗体的VHCDR相比个别地或集体地具有至少80%(例如,85%、90%、95%或98%)序列同一性的重链CDR。备选地或另外,抗CD22抗体可包含与本文所述的示例性抗体的VL CDR相比个别地或集体地具有至少80%(例如,85%、90%、95%或98%)序列同一性的轻链CDR。如本文所用,“个别地”是指抗体的一个CDR相对于示例性抗体的相应CDR享有指定的序列同一性。“集体地”是指抗体的VH或VL CDR组合起来相对于示例性抗体的相应三个VH或VL CDR组合起来享有指定的序列同一性。
使用Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990并在Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中修改的算法确定两个氨基酸序列的“同一性百分比”。这种算法被集成到Altschul等.J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST蛋白质搜索可以使用XBLAST程序评分=50,字长=3进行,以获得与感兴趣的蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在缺口的情况下,可以使用Gapped BLAST,如Altschul等,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时,可以使用各个程序(例如,XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在一些实施方案中,本文所述的任何抗CD22抗体的重链可进一步包含重链恒定区(CH)或其部分(例如,CH1、CH2、CH3或其组合)。重链恒定区可以来自任何合适的来源,例如人、小鼠、大鼠或兔。备选地或此外,抗CD22抗体的轻链还可以包含轻链恒定区(CL),其可以是本领域已知的任何CL。在一些例子中,CL是κ轻链。在其他实例中,CL是λ轻链。抗体重链和轻链恒定区是本领域众所周知的,例如,在IMGT数据库(www.imgt.org)中或在www.vbase2.org/vbstat.php.中提供的那些,两者均通过引用并入本文。
在一些实施方案中,本文公开的抗CD22抗体可以是单链抗体(scFv)。scFv抗体可以包含VH片段和VL片段,它们可以通过柔性肽接头连接。在某些情况下,scFv抗体可能处于VH→VL方向(从N端到C端)。在其他情况下,scFv抗体可能处于VL→VH方向(从N端到C端)。示例性scFv抗CD22抗体提供于下文中(CDR以粗体显示,肽接头以粗体显示并加下划线):
EP160-C07(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:40)
EP160-E03(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:41)
EP160-F10(单链抗体;SEQ ID NO:42)
EP97-A10(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:43)
EP97-B03(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:44)
EP160-D02(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:45)
EP160-G04(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:46)
EP160-H02(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:47)
EP160-G05(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:48)
EP35-F7(与EP97-A01相同,(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:49)
EP35-C6(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:50)
EP35-A7(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:51)
EP35-D6(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:52)
EP35-E6(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:53)
EP35-C8(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:54)
EP160-F04(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:55)
EP35-B05(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:56)
EP97-G05(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:57)
EP97-F01(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:58)
EP97-A01(scFv,VH-VL方向;SEQ ID NO:59)
如本文所述的任何抗CD22抗体,例如本文提供的示例性抗CD22抗体例如EP160-D2或EP97-B03,可以结合和抑制(例如,降低或消除)CD22阳性细胞(例如,B细胞)的活性。在一些实施方案中,本文所述的抗CD22抗体可以结合CD22阳性细胞并抑制其活性至少30%(例如,35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高,包括其中的任何增量)。本文所述的抗CD22抗体的抑制活性可以通过本领域已知的常规方法来确定,例如通过用于测量Ki, app值的测定法。
在一些实例中,可以通过测量不同浓度的抗体对相关反应程度的抑制作用确定抗体的Ki, app值;将伪一级速率常数(v)的变化作为抑制剂浓度的函数拟合到改进的莫里森方程(方程1)得到表观Ki值的估计值。对于竞争性抑制剂,Kiapp可以从来自Ki, app对底物浓度图的线性回归分析中提取的y截距获得。
其中A等于vo/E,在没有抑制剂(I)的情况下酶促反应的初始速度(vo)除以总酶浓度(E)。在一些实施方案中,本文所述的抗CD22抗体可以针对靶抗原或抗原表位具有1000、500、100、50、40、30、20、10、5pM或更小的Kiapp值。
II.制备抗CD22抗体
如本文所述的能够结合CD22的抗体可以通过本领域已知的任何方法制备。参见例如Harlow and Lane,(1998)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York。在一些实施方案中,抗体可以通过常规杂交瘤技术产生。或者,可以从合适的文库(例如,人抗体文库)中鉴定抗CD22抗体。
在一些情况下,可以按照图1所示的筛选策略从人抗体文库中获得高亲和力的完全人CD22结合物。另参见下面的实施例1。该策略允许最大化文库多样性以覆盖表达CD22的细胞上的广泛(board)和活性表位。
如果需要,可对感兴趣的抗体(单克隆或多克隆)(例如,由杂交瘤细胞系产生或从抗体文库分离)进行测序,然后可将多核苷酸序列克隆到载体中用于表达或增殖。编码感兴趣的抗体的序列可以保持在宿主细胞的载体中,然后可以扩增和冷冻宿主细胞以备将来使用。在备选方案中,多核苷酸序列可用于遗传操作以例如人源化抗体或提高抗体的亲和力(亲和力成熟)或其他特性。例如,如果抗体来自非人来源并且将用于人的临床试验和治疗,则可以将恒定区设计成更类似于人恒定区以避免免疫反应。备选地或此外,可能需要对抗体序列进行遗传操作以获得对靶抗原的更大亲和力和/或特异性以及增强CD22活性的更大功效。对本领域技术人员显而易见的是,可以对抗体进行一种或多种多核苷酸改变并且仍然保持其对靶抗原的结合特异性。
或者,可以通过常规实践从合适的抗体文库中分离出能够与如本文所述的靶抗原(CD22分子)结合的抗体。抗体文库可用于通过常规筛选过程鉴定与靶抗原(例如人CD22,如细胞表面CD22)结合的蛋白质。在选择过程中,用靶抗原或其片段探测多肽组分,如果多肽组分与靶结合,则抗体文库成员得到鉴定,通常通过保留在支持物上。保留的展示文库成员从支持物中恢复并进行分析。分析可以包括在相似或不同条件下的扩增和随后的选择。例如,阳性和阴性选择可以交替进行。分析还可以包括确定多肽组分的氨基酸序列和纯化多肽组分以进行详细表征。
有许多本领域已知的常规方法来鉴定和分离能够与本文所述的靶抗原结合的抗体,包括噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示或哺乳动物展示技术。
可以通过常规方法制备完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段。例如,可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生F(ab')2片段,可以通过还原F(ab')2片段的二硫键产生Fab片段。
可以通过例如常规重组技术产生基因工程抗体,例如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体和双特异性抗体。在一个实例中,编码对靶抗原特异的单克隆抗体的DNA可以使用常规程序容易地分离和测序(例如,通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。一旦分离,DNA可被置于一种或多种表达载体中,然后转染到宿主细胞中,例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞,以获得在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。参见例如PCT公开号WO 87/04462。然后可以这样修饰DNA,例如,通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列,Morrison等,(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851,或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白编码序列。以这种方式,可以制备具有靶抗原结合特异性的基因工程抗体,例如“嵌合”或“杂合”抗体。
为生产“嵌合抗体”而开发的技术在本领域是众所周知的。参见例如Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851;Neuberger等(1984)Nature 312,604和Takeda等(1984)Nature 314:452。
构建人源化抗体的方法在本领域也是众所周知的。参见例如Queen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)。在一个实例中,按照本领域已知的方法对亲本非人抗体的VH和VL可变区进行三维分子建模分析。接下来,使用相同的分子建模分析鉴定预测对正确CDR结构的形成很重要的框架氨基酸残基。与此同时,使用亲本VH和VL序列作为搜索请求从任何抗体基因数据库中鉴定具有与亲本非人抗体同源的氨基酸序列的人VH和VL链。然后选择人VH和VL受体基因。
所选人受体基因内的CDR区可以用来自亲本非人抗体或其功能变体的CDR区替换。必要时,被预测在与CDR区相互作用中重要的亲本链框架区内的残基(参见上面的说明书)可用于置换人受体基因中的相应残基。
单链抗体可以通过重组技术通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来制备。优选地,在两个可变区之间并入柔性接头。或者,描述的用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778和4,704,692)可适用于产生噬菌体展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示或mRNA展示scFv文库,并且可以按照常规程序从文库中鉴定特异性针对CD22的scFv克隆。可以对阳性克隆进行进一步筛选,以鉴定那些增强CD22活性的克隆。
按照本领域已知的和本文描述的方法获得的抗体可以使用本领域熟知的方法进行表征。例如,一种方法是鉴定抗原结合的表位,或“表位作图”。已知有许多本领域用于定位和表征蛋白质上表位位置的方法,包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定法、基因片段表达测定法和基于合成肽的测定法,如在Harlow and Lane,Using Antibodies,aLaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999的第11章中所述。在另外的实例中,表位作图可用于确定抗体结合的序列。表位可以是线性表位,即包含在单个氨基酸链段中,或者是由可能不一定包含在单个链段(一级结构线性序列)中的氨基酸的三维相互作用形成的构象表位。可以分离或合成(例如重组)不同长度的肽(例如,至少4-6个氨基酸长)并用于与抗体的结合测定法。在另一实例中,抗体结合的表位可以在***筛选中通过使用衍生自靶抗原序列的重叠肽并确定抗体的结合来确定。根据基因片段表达测定法,编码靶抗原的开放阅读框被随机或通过特定的基因构造片段化,并确定所表达的抗原片段与待测抗体的反应性。例如,可以通过PCR产生基因片段,然后在放射性氨基酸存在下体外转录和翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳确定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。某些表位也可以通过使用展示在噬菌体颗粒表面的随机肽序列的大型文库(噬菌体文库)来鉴定。
或者,可以在简单的结合测定法中测试定义的重叠肽片段文库与测试抗体的结合。在另一实例中,可以进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以鉴定表位结合所需的、足够的和/或必需的残基。例如,可以使用靶抗原的突变体进行结构域交换实验,其中CD22的各种片段已被来自密切相关但抗原性不同的蛋白质(如肿瘤坏死因子受体家族的另一个成员)的序列替换(交换)。通过评估抗体与突变CD22的结合,可以评估特定抗原片段对抗体结合的重要性。
或者,可以使用已知与相同抗原结合的其他抗体进行竞争测定法,以确定抗体是否结合与其他抗体相同的表位。竞争测定法为本领域技术人员所熟知。
在一些实例中,通过下面示例的重组技术制备抗CD22抗体。
可以将编码如本文所述的抗CD22抗体的重链和轻链的核酸克隆到一个表达载体中,每个核苷酸序列与合适的启动子可操作地连接。在一个实例中,编码重链和轻链的每个核苷酸序列与不同的启动子可操作地连接。或者,编码重链和轻链的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接,使得重链和轻链都由相同的启动子表达。必要时,可在重链和轻链编码序列之间***内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些实例中,将编码抗体两条链的核苷酸序列克隆到两个载体中,这两个载体可以被引入相同或不同的细胞中。当两条链在不同细胞中表达时,它们中的每一条都可以从表达它们的宿主细胞中分离出来,并且可以将分离的重链和轻链混合并在允许形成抗体的合适条件下孵育。
一般而言,可以使用本领域已知的方法将编码抗体的一条或所有链的核酸序列克隆到合适的表达载体中,并与合适的启动子可操作地连接。例如,核苷酸序列和载体可以在合适的条件下与限制性内切酶接触,以在每个分子上产生互补末端,这些末端可以相互配对并通过连接酶连接在一起。或者,合成的核酸接头可以连接到基因的末端。这些合成接头包含对应于载体中特定限制位点的核酸序列。表达载体/启动子的选择将取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
多种启动子可用于表达本文所述的抗体,包括但不限于巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、病毒LTR例如劳斯肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR、猿病毒40(SV40)早期启动子、大肠杆菌lac UV5启动子和单纯疱疹病毒tk病毒启动子。
也可以使用可调节的启动子。此类可调节启动子包括使用来自大肠杆菌的lac阻遏物作为转录调节剂来调节来自带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录的那些[Brown,M.等,Cell,49:603-612(1987)]、使用四环素阻遏物(tetR)的那些[Gossen,M.,andBujard,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551(1992);Yao,F.等,Human GeneTherapy,9:1939-1950(1998);Shockelt,P.等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6522-6526(1995)]。其他***包括使用***(astradiol)、RU486、双酚鼠李酮(diphenolmurislerone)或雷帕霉素的FK506二聚体、VP16或p65。可以从Invitrogen、Clontech和Ariad获得可诱导***。
可以使用包括带有操纵子的阻遏物的可调节启动子。在一个实施方案中,来自大肠杆菌的lac阻遏物可以作为转录调节剂来调节来自带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录[M.Brown等,Cell,49:603-612(1987);Gossen and Bujard(1992);M.Gossen等,Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)]将四环素阻遏物(tetR)与转录激活物(VP16)结合以产生tetR-哺乳动物细胞转录激活物融合蛋白tTa(tetR-VP 16),与tetO-带有衍生自人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期启动子的最小启动子结合以产生tetR-tet操纵***来控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施方案中,使用四环素可诱导开关。当四环素操纵子位于CMVIE启动子的TATA元件下游时,单独的四环素阻遏物(tetR)而非tetR-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物可以作为有效的反式调节剂来调节哺乳动物细胞中的基因表达(Yao等,Human Gene Therapy,10(16):1392-1399(2003))。这种四环素可诱导开关的一个特别优点是它不需要使用在某些情况下可能对细胞有毒的四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活因子或阻遏物融合蛋白(Gossen等,Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992);Shockett等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6522-6526(1995)),以实现其可调节的效果。
另外,载体可以包含例如以下部分或全部:选择标记基因,例如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因;来自人CMV直接早期基因的增强子/启动子序列,用于高水平转录;来自SV40的转录终止和RNA处理信号,用于mRNA稳定性;SV40多瘤复制起点和ColE1,用于适当的附加型复制;内部核糖体结合位点(IRES),多功能多克隆位点;和T7和SP6RNA启动子,用于有义和反义RNA的体外转录。合适的载体和产生含有转基因的载体的方法在本领域是众所周知的并且是可获得的。
可用于实施本文所述方法的多腺苷酸化信号的实例包括但不限于人胶原蛋白I多腺苷酸化信号、人胶原蛋白II多腺苷酸化信号和SV40多腺苷酸化信号。
可以将包含编码任何抗体的核酸的一种或多种载体(例如,表达载体)引入合适的宿主细胞以产生抗体。可以在适合表达抗体或其任何多肽链的条件下培养宿主细胞。此类抗体或其多肽链可以通过常规方法,例如亲和纯化,由培养的细胞(例如,从细胞或培养上清液中)回收。如有必要,抗体的多肽链可以在合适的条件下孵育合适的时间,以产生抗体。
在一些实施方案中,用于制备本文所述抗体的方法涉及编码抗CD22抗体的重链和轻链两者的也如本文所述的重组表达载体。可以通过常规方法,例如磷酸钙介导的转染,将重组表达载体引入合适的宿主细胞(例如dhfr-CHO细胞)。可以选择阳性转化宿主细胞并在允许表达形成抗体的两条多肽链的合适条件下培养,可以从细胞或培养基中回收两条多肽链。必要时,从宿主细胞中回收的两条链可以在适合形成抗体的条件下孵育。
在一个实施例中,提供了两种重组表达载体,一种编码抗CD22抗体的重链,另一种编码抗CD22抗体的轻链。两种重组表达载体都可以通过常规方法例如磷酸钙介导的转染引入合适的宿主细胞(例如dhfr-CHO细胞)中。或者,可以将每种表达载体引入合适的宿主细胞中。可以选择阳性转化体并在允许抗体多肽链表达的合适条件下培养。当将两种表达载体引入相同的宿主细胞时,其中产生的抗体可以从宿主细胞或培养基中回收。如果需要,可以从宿主细胞或培养基中回收多肽链,然后在允许形成抗体的合适条件下孵育。当将两种表达载体引入不同的宿主细胞时,它们中的每一种都可以从相应的宿主细胞或从相应的培养基中回收。然后可以在合适的条件下孵育两条多肽链以形成抗体。
标准分子生物学技术用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。例如,一些抗体可以通过亲和层析与蛋白A或蛋白G偶联基质分离。
编码如本文所述的抗CD22抗体的重链、轻链或两者的任何核酸,包含其的载体(例如,表达载体);和包含载体的宿主细胞在本公开的范围内。
III.抗CD22抗体的应用
本文公开的任何抗CD22抗体可用于治疗、诊断和/或研究目的,所有这些都在本公开内容的范围内。
药物组合物
如本文所述的抗体以及编码核酸或核酸组、包含其的载体或包含载体的宿主细胞可以于药学上可接受的承载体(赋形剂)混合以形成用于治疗靶疾病的药物组合物。“可接受的”是指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地,能够稳定活性成分)并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的赋形剂(承载体),包括本领域熟知的缓冲液。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)LippincottWilliams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover。
本方法中使用的药物组合物可以包含冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的承载体、赋形剂或稳定剂。(Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20thEd.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的承载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒,并且可以包含缓冲剂,例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和蛋氨酸;防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵;六甲铵氯化物;苯扎氯铵、苄索氯铵;苯酚、丁醇或苯甲醇;对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,例如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖;螯合剂,例如EDTA;糖,例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;形成盐的反离子,例如钠;金属络合物(例如锌-蛋白质络合物);和/或非离子表面活性剂,例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施例中,本文所述的药物组合物包含含有抗体(或编码核酸)的脂质体,其可以通过本领域已知的方法制备,例如在Epstein等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985);Hwang等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980);和美国专利号4,485,045和4,544,545中记载的。具有增强循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体通过限定孔径的过滤器挤出,以产生具有所需直径的脂质体。
还可以将抗体或编码核酸包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中,例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊,分别在胶体药物递送***(例如,脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或大乳液(macroemulsion)中。此类技术在本领域中是已知的,参见例如Remington,The Scienceand Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)。
在其他实例中,本文所述的药物组合物可配制成缓释形式。缓释制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质,该基质是成型制品的形式,例如薄膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如,聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物,例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、醋酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内给药的药物组合物必须是无菌的。这很容易通过例如通过无菌过滤膜过滤来实现。治疗性抗体组合物通常放置在具有无菌接入端口的容器中,例如,具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
本文所述的药物组合物可以为单位剂型,例如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂或栓剂,用于口服、肠胃外或直肠施用,或通过吸入或吹入施用。
为了制备固体组合物如片剂,可以将主要活性成分与药物承载体混合,例如常规的压片成分,如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶,和其他药物稀释剂,例如水,以形成含有本发明化合物或其无毒药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。当提到均质的这些预制剂组合物时,是指活性成分均匀地分散在整个组合物中,使得组合物可以容易地细分成同样有效的单位剂型,例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体预制剂组合物细分为上述类型的单位剂型,其含有0.1至约500mg本发明的活性成分。新组合物的片剂或丸剂可以被包衣或以其他方式复合以提供具有延长作用的优点的剂型。例如,片剂或丸剂可以包含内部剂型和外部剂型成分,后者在前者之上是包封(envelope)形式。这两种成分可以通过肠溶层隔开,肠溶层用于抵抗在胃中的崩解,并允许内部成分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于此类肠溶层或包衣,此类材料包括多种聚合酸以及聚合酸与诸如紫胶(shellac)、鲸蜡醇和醋酸纤维素等材料的混合物。
合适的表面活性剂尤其包括非离子试剂,例如聚氧乙烯山梨聚糖(例如,TweenTM20、40、60、80或85)和其他山梨聚糖(例如,SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包含介于0.05和5%之间的表面活性剂,并且可以介于0.1和2.5%之间。可以理解的是,如果需要,可以添加其他成分,例如甘露醇或其他药学上可接受的媒介物。
合适的乳液可以使用市售的脂肪乳液制备,例如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM。活性成分可以溶解在预混合的乳液组合物中,或者它可以溶解在油(例如,大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和用磷脂(例如鸡蛋磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合后形成乳液中。可以理解的是,可以添加其他成分,例如甘油或葡萄糖,以调节乳液的张力。合适的乳液通常会含有高达20%的油,例如5-20%。脂肪乳液可以包含介于0.1和1.0μm之间、特别是0.1和0.5μm之间的脂肪滴,并且具有在5.5至8.0范围内的pH值。
乳液组合物可以是通过将抗体与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些。
用于吸入或吹入的药物组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液,以及粉末。液体或固体组合物可包含如上文所述的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中,组合物通过经口或经鼻呼吸途径施用以产生局部或全身作用。
优选地无菌药学上可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体来雾化。雾化溶液可以直接从雾化装置呼吸,或者雾化装置可以连接到面罩、氧气帐(tent)或间歇正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适当方式递送制剂的装置施用,优选口服或经鼻施用。
治疗应用
为了实施本文公开的方法,有效量的本文所述药物组合物可以通过合适的途径施用于需要治疗的受试者(例如人),例如静脉内施用,例如推注或通过在一段时间内连续输注,通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。用于液体制剂的市售雾化器,包括喷射雾化器和超声雾化器可用于施用。液体制剂可直接雾化,冻干粉可在复溶后雾化。或者,如本文所述的抗体可使用碳氟化合物制剂和计量剂量吸入器气雾化,或作为冻干和研磨粉末吸入。
待通过本文所述方法治疗的受试者可以是哺乳动物,更优选人。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人受试者可以是患有、处于危险中或怀疑患有以携带CD22+疾病细胞为特征的靶疾病/病症的人患者。这种靶疾病/病症的实例包括造血癌症,例如B细胞谱系的癌症。实例包括但不限于血液学B细胞肿瘤,包括淋巴细胞白血病,例如B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL);B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)和B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。或者,CD22+疾病细胞可为特异性针对自身抗原的免疫细胞(例如B细胞)。
可以通过常规医学检查,例如实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超声来识别患有靶癌症的受试者。在一些实施方案中,待通过本文描述的方法治疗的受试者可以是已经或正在接受抗癌疗法例如化学疗法、放射疗法、免疫疗法或手术的人癌症患者。
还可以通过常规医学检查来识别患有靶自身免疫性疾病的受试者。在一些实施方案中,待通过本文所述方法治疗的受试者可以是患有自身免疫性疾病的人患者。这样的人患者可能已经或正在接受自身免疫性疾病的治疗。
怀疑患有任何此类靶疾病/病症的受试者可能表现出该疾病/病症的一种或多种症状。处于该疾病/病症风险中的受试者可以是具有该疾病/病症的一种或多种风险因素的受试者。
如本文所用,“有效量”是指单独或与一种或多种其他活性剂组合赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。确定一定量的抗体是否达到治疗效果对于本领域技术人员来说是显而易见的。如本领域技术人员所知,有效量取决于所治疗的具体病况、病况的严重程度、包括年龄、身体状况、身材、性别和体重在内的个体患者参数、治疗的持续时间、同时疗法(如果有的话)的性质、具体的施用途径以及健康从业者知识和专长范围内的类似因素。这些因素对于本领域普通技术人员来说是众所周知的并且可以通过不超出常规实验的实验来解决。通常优选使用单个组分或其组合的最大剂量,即根据合理的医学判断的最高安全剂量。
经验考虑,例如半衰期,通常有助于确定剂量。例如,与人免疫***相容的抗体,例如人源化抗体或完全人抗体,可用于延长抗体的半衰期并防止抗体受到宿主免疫***的攻击。施用频率可以在治疗过程中确定和调整,并且通常但不一定基于靶疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者,抗体的连续缓释制剂可能是合适的。用于实现缓释的各种制剂和装置是本领域已知的。
在一个实例中,如本文所述的抗体的剂量可以在已被给予一次或多次抗体施用的个体中凭经验确定。个体被给予递增剂量的激动剂。为了评估激动剂的功效,可以遵循疾病/病症的指标。
通常,对于本文所述的任何抗体的施用,初始候选剂量可以是约2mg/kg。为了本公开内容的目的,取决于上述因素,典型的日剂量范围可以从约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg、至30mg/kg至100mg/kg或更多中的任何一个。对于几天或更长时间的重复施用,取决于病况,持续治疗直到出现所需的症状抑制或直到达到足够的治疗水平以减轻靶疾病或病症或其症状。示例性给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量,随后每周施用约1mg/kg抗体的维持剂量,或随后每隔一周施用约1mg/kg的维持剂量。然而,其他剂量方案可能有用,这取决于从业者希望达到的药代动力学衰减模式。例如,考虑每周一到四次给药。在一些实施方案中,可以使用的给药范围为约3μg/mg至约2mg/kg(例如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg约1mg/kg和约2mg/kg)。在一些实施方案中,给药频率为每周、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次;或每月、每2个月、或每3个月或更长时间一次。这种疗法的进度很容易通过常规技术和测定来监测。给药方案(包括使用的抗体)会随时间而变化。
在一些实施方案中,对于体重正常的成年患者,可以施用约0.3至5.00mg/kg的剂量。在一些实例中,本文所述的抗CD22抗体的剂量可以是10mg/kg。特定的给药方案,即剂量、时机的掌握和重复,将取决于特定的个体和该个体的病史,以及个体药剂的特性(例如药剂的半衰期,以及本领域众所周知的其他考虑因素)。
出于本公开内容的目的,如本文所述的抗体的适当剂量将取决于所使用的特异性抗体、多种抗体和/或非抗体肽(或其组合物)、疾病/病症的类型和严重程度,抗体是否针对预防或治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对激动剂的反应以及主治医师的判断进行施用。通常,临床医生将施用抗体,直到实现达到所需结果的剂量。在一些实施方案中,期望的结果是肿瘤微环境中抗肿瘤免疫反应的增加。确定剂量是否产生所需结果的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。一种或多种抗体的施用可以是连续的或间歇的,这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的,以及本领域从业人员已知的其他因素。抗体的施用可以在预先选择的时间段内基本上是连续的,或者可以例如,在发展成靶疾病或病症之前、期间或之后是一系列间隔剂量。
如本文所用,术语“治疗”是指将包含一种或多种活性剂的组合物应用于或施用于患有靶疾病或病症、该疾病/病症的症状或对该疾病/病症的易感性的受试者,目的是治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、补救、改良、改善或影响病症、疾病的症状或对疾病或病症的易感性。
减轻靶疾病/病症包括延缓疾病的发展或进展,或降低疾病严重程度或延长生存期。减轻疾病或延长生存期并不一定需要治愈性结果。如本文所用,“延迟”靶疾病或病症的发展是指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟疾病的进展。这种延迟可能有不同的时间长度,这取决于疾病的病史和/或正在接受治疗的个体。“延迟”或减轻疾病发展或延迟疾病发作的方法是与不使用该方法相比,降低在给定时间范围内发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或降低在给定的时间范围内症状程度的方法。这种比较通常基于临床研究,使用的受试者数量足以给出统计学上显著的结果。
疾病的“发展”或“进展”是指该疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用本领域众所周知的标准临床技术检测和评估疾病的发展。然而,发展也指可能无法察觉的进展。为了本公开内容的目的,发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用,靶疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
取决于要治疗的疾病的类型或疾病的部位,可以使用医学领域普通技术人员已知的常规方法将药物组合物施用于受试者。该组合物还可以通过其他常规途径施用,例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、***或通过植入的储库施用。如本文所用,术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。此外,它可以通过可注射的贮库给药途径施用于受试者,例如使用1个月、3个月或6个月贮库可注射或可生物降解的材料和方法。在一些实例中,药物组合物是眼内或玻璃体内施用的。
可注射组合物可包含各种承载体,例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射,可通过滴注法施用水溶性抗体,由此输注含有抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理学上可接受的赋形剂可以包括,例如,5%右旋糖、0.9%盐水、林格氏溶液或其他合适的赋形剂。肌内制剂,例如抗体的合适可溶盐形式的无菌制剂,可以溶解和施用在药物赋形剂中,例如注射用水、0.9%盐水或5%葡萄糖溶液。
在一个实施方案中,通过位点特异性或靶向局部递送技术施用抗体。位点特异性或靶向局部递送技术的实例包括抗体的各种可植入贮库源或局部递送导管,例如输注导管、留置导管或针头导管、合成移植物、外膜包裹物、分流器和支架或其他可植入装置、位点特异性的承载体、直接注射或直接应用。参见例如PCT公开号WO 00/53211和美国专利号5,981,568。
也可以使用含有反义多核苷酸、表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术描述于,例如,Findeis等,Trends Biotechnol.(1993)11:202;Chiou等,Gene Therapeutics:Methods and Applications of Direct GeneTransfer(J.A.Wolff,ed.)(1994);Wu等,J.Biol.Chem.(1988)263:621;Wu等,J.Biol.Chem.(1994)269:542;Zenke等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:3655;Wu等,J.Biol.Chem.(1991)266:338。
含有多核苷酸(例如,编码本文所述抗体的那些)的治疗组合物以约100ng至约200mg DNA的范围施用,用于基因治疗方案中的局部施用。在一些实施方案中,约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg和约20μg至约100μg或更多的浓度范围的DNA也可以在基因治疗方案中使用。
本文所述的治疗性多核苷酸和多肽可以使用基因递送载体递送。基因递送载体可以是病毒或非病毒来源(一般参见Jolly,Cancer Gene Therapy(1994)1:51;Kimura,HumanGene Therapy(1994)5:845;Connelly,Human Gene Therapy(1995)1:185;and Kaplitt,Nature Genetics(1994)6:148)。可以使用内源哺乳动物或异源启动子和/或增强子来诱导此类编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成型的或受调控的。
用于递送所需多核苷酸并在所需细胞中表达的基于病毒的载体是本领域众所周知的。示例性的基于病毒的载体包括但不限于重组逆转录病毒(参见例如PCT公开号WO 90/07936;WO 94/03622;WO 93/25698;WO 93/25234;WO 93/11230;WO 93/10218;WO 91/02805;美国专利号5,219,740和4,777,127;英国专利号2,200,651和欧洲专利号0 345242)、基于甲病毒的载体(例如Sindbis病毒载体,Semliki森林病毒(ATCC VR-67;ATCC VR-1247),罗斯河病毒(ATCC VR-373;ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923;ATCC VR-1250;ATCC VR 1249;ATCC VR-532))和腺相关病毒(AAV)载体(参见例如PCT公开号WO 94/12649,WO 93/03769;WO 93/19191;WO 94/28938;WO 95/11984和WO 95/00655)。也可以使用如Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147中所述的施用与杀死的腺病毒连接的DNA。
也可以使用非病毒递送载体和方法,包括但不限于仅与杀死的腺病毒连接或未连接的聚阳离子缩合DNA(参见例如Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147);配体连接的DNA(参见例如Wu,J.Biol.Chem.(1989)264:16985);真核细胞递送载体细胞(参见例如美国专利号5,814,482;PCT公开号WO 95/07994;WO 96/17072;WO 95/30763;和WO 97/42338)和核电荷中和或与细胞膜融合。也可以使用裸DNA。示例性裸DNA引入方法描述于PCT公开号WO90/11092和美国专利号5,580,859。可以作为基因传递载体的脂质体描述于美国专利号No.5,422,120;PCT公开号WO 95/13796;WO 94/23697;WO 91/14445;和欧洲专利号0524968。其他方法描述于Philip,Mol.Cell.Biol.(1994)14:2411和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581。
在本文所述的方法中使用的具体给药方案,即剂量、时机的掌握和重复,将取决于具体受试者和该受试者的病史。
在一些实施方案中,可以向需要治疗的受试者施用多于一种抗体,或抗体与另一种合适的治疗剂的组合。抗体也可以与用于增强和/或补充试剂有效性的其他试剂联合使用。
可以通过本领域众所周知的方法评估对靶疾病/病症的治疗功效。
用于治疗疾病的试剂盒
本公开内容还提供了用于治疗或减轻靶疾病例如本文所述的造血癌的试剂盒。此类试剂盒可包括一个或多个容器,该容器包含抗CD22抗体,例如本文所述的任何那些。在一些情况下,抗CD22抗体可以与第二治疗剂共同使用。
在一些实施方案中,该试剂盒可以包括根据本文所述的任何方法使用的说明书。所包含的说明书可以包括对施用抗CD22抗体和任选的第二治疗剂以治疗、延迟发作或减轻如本文所述的那些靶疾病的描述。该试剂盒还可包括基于鉴定个体是否患有靶疾病来选择适合治疗的个体的描述,例如,应用如本文所述的诊断方法。在其他实施方案中,说明书包括对有靶疾病风险的个体施用抗体的描述。
与使用抗CD22抗体有关的说明书通常包括有关预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页(例如,试剂盒中包含的纸张)上的书面说明书,但机器可读说明书(例如,磁或光存储盘上携带的说明书)也是可以接受。
标签或包装插页表明该组合物用于治疗、延缓发作和/或减轻疾病,例如癌症或免疫疾病(例如,自身免疫性疾病)。可以提供用于实践本文所述的任何方法的说明书。
本发明的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、软包装(例如密封的Mylar或塑料袋)等。还考虑了与特定装置组合使用的包装,所述特定装置例如吸入器、鼻施用装置(例如雾化器)或输注装置例如微型泵。试剂盒可以具有无菌进入端口(例如,容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器也可以具有无菌进入端口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述的那些抗CD22抗体。
试剂盒可以选择性地提供额外的组件,例如缓冲液和解释信息。通常,试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。在一些实施方案中,本发明提供了包含上述试剂盒内容物的制品。
一般技术
除非另有说明,否则本公开内容的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术,这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中得到了充分的解释,例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,secondedition(Sambrook等.,1989)Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1989)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.1987);Introuction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather andP.E.Roberts,1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.1993-8)J.Wiley and Sons;Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.);Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weirand C.C.Blackwell,eds.):Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Millerand M.P.Calos,eds.,1987);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等.eds.1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等.,eds.1994);CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等,eds.,1991);Short Protocols in MolecularBiology(Wiley and Sons,1999);Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:a practice approach(D.Catty.,ed.,IRLPress,1988-1989);Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd andC.Dean,eds.,Oxford University Press,2000);Using antibodies:a laboratorymanual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999);TheAntibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.Harwood Academic Publishers,1995);DNACloning:A practical Approach,Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985);NucleicAcid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985》;Transcription andTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.(1984》;Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1986》;Immobilized Cells and Enzymes(lRL Press,(1986》;和B.Perbal,A practical Guide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubel等(eds.)。
无需进一步详述,相信本领域技术人员可以基于以上描述充分利用本发明。因此,以下具体实施例应被解释为仅仅是说明性的,而不以任何方式限制本公开内容的其余部分。出于本文所引用的目的或主题,本文引用的所有出版物均以引用方式并入本文。
实施例1.完全人抗CD22抗体的产生
如下从人抗体文库中鉴定对细胞表面人CD22具有结合特异性的完全人抗体。
CD22过表达重组细胞系的产生
用pCMV6-Entry载体转染HEK293和K562细胞(ATCC),该载体携带编码全长人CD22的核苷酸序列,在C端融合有flag和Myc标签。G418药物选择过程产生了多克隆、抗药性CD22表达细胞库。与此同时,产生用空pCMV6-Entry载体转移的亲本细胞系用作阴性对照。通过FACS分选表CD22的细胞以产生表达CD22的细胞库。该库在G418药物选择下扩增。然后进行单细胞分选,接着进行进一步的药物选择以产生克隆细胞系。通过FACS筛选表达CD22的克隆系。选择显示CD22高表达水平的细胞系用于本文公开的选择、筛选和测定。
从人抗体文库中筛选抗CD22抗体
从多个初始健康供体和自身免疫病患者供体的骨髓MNC和PBMC构建天然人抗体文库。进行RT-PCR以捕获VH和VL结构域的完整免疫球蛋白储库(产生VH和VL文库)。然后通过VH和VL改组构建单链抗体(scFv)文库。文库大小预计为1012-13。VH和scFv文库已被进一步改良,以分别在抗体片段的N端***体外转录和翻译信号,并在抗体片段的C端***flag标签,以供mRNA展示选择。
然后使用mRNA展示技术按照常规实践从上述构建的VH和scFv文库中鉴定CD22结合物(参见例如US6258558B1,其相关公开内容通过引用并入本文以用于本文引用的主题或目的)。简而言之,首先将DNA文库转录成mRNA文库,然后通过嘌呤霉素接头共价偶联翻译成mRNA-VH或scFv融合文库。然后将文库纯化并转化为mRNA/cDNA融合文库。首先用人IgG(阴性选择)或K562细胞对融合文库进行反选择以去除非特异性结合物,然后针对在蛋白G磁珠(第1-3轮)或CD22过表达重组K562细胞(第4轮)上捕获的重组CD22-Fc融合蛋白进行选择。通过PCR扩增回收和富集CD22结合物。在第3轮中,通过使用上述初始VL文库进行改组,将富集的VH文库转换为scFv文库,并进一步富集3轮。总共进行了4轮选择以产生高度富集的抗CD22抗体库,如图1所示。
将富集的抗CD22抗体库克隆到细菌周质表达载体pET22b中,将其转化到TOP 10感受态细胞中。每个scFv分子都经过工程改造而具有C端flag和6xHIS标签,以用于纯化和测定检测。汇集来自TOP 10细胞的克隆,制备小量DNA(miniprep DNA),随后转化到细菌Rosetta II菌株中进行表达。在96孔板中挑选、生长并用0.1mM IPTG诱导单个克隆用于表达。在30℃诱导16-24小时后收集上清液用于鉴定抗CD22抗体的测定。
用夹心ELISA测定法评估上清液样品,以确定其中包含的抗CD22 scFv抗体的存在/水平。简而言之,将96孔板用在1x PBS中、最终浓度为2μg/mL的抗HIS标签抗体(R&DSystems)固定,每孔总体积为50μL。将板在4℃下孵育过夜,然后用每孔200μL的超级封闭缓冲液封闭1小时。将100μl 1:101XPBST稀释的上清液加入每个孔中,并摇动孵育1小时。CD22scFv的表达水平是通过将板中的混合物与50μL的缀合HRP的抗Flag抗体孵育一小时来检测的,该抗体在1x PBST中以1:5000稀释。在每个步骤之间,用洗板机中的1XPBST洗板3次。然后用50μl TMB底物将板显影5分钟,并通过添加50μl 2N硫酸停止显影。在Biotek酶标仪中以OD450nm读取板,并用Excel条形图分析数据。
开发了CD22结合筛选ELISA来鉴定单个CD22结合物。简而言之,将96孔板用在1xPBS中、终浓度为2μg/mL的作为对照的人Fc或人CD22-Fc蛋白固定,每孔总体积为50μL。将板在4℃下孵育过夜,然后用每孔200μL的超级封闭缓冲液封闭1小时。将100μl上清液加入到每个固定有Fc和CD22-Fc融合蛋白的孔中,并摇动孵育1小时。通过添加50μL缀合HRP的抗Flag抗体检测CD22结合,该抗体在1x PBST中以1:5000稀释。在每个步骤之间,在洗板机中用1XPBST洗板3次。然后用50μl TMB底物将板显影5分钟,并通过添加50μl 2N硫酸停止显影。在Biotek酶标仪中以OD450nm读取板,并用Excel条形图分析结合和选择性。
如图2所示,在本文公开的筛选过程中鉴定了许多阳性抗CD22克隆。
实施例2.能够与细胞表面表达CD22结合的示例性抗CD22克隆的鉴定
在大肠杆菌细胞中生产和纯化抗CD22抗体
从甘油储板中挑选出在上文实施例1中公开的筛选过程中鉴定的表达VH或抗CD22scFv抗体的细胞,并在具有透气膜的Thomson 24孔板中过夜生长到5mL培养物中。如本文实施例中所述的细菌细胞在37℃下生长,并在Terrific Broth Complete中以225RPM摇动,加100μg/mL羧苄青霉素和34μg/mL氯霉素,还添加1:5,000稀释的消泡剂204,除非另外明确指明。然后使用过夜的起子培养物以适当的起子培养物稀释率将更大的培养物接种到指定的生产培养物中(例如,125mL Thomson Ultra Yield培养瓶中的50mL培养物、250mL UltraYield Thomson培养瓶中的100mL培养物或250mL在500mL Ultra Yield Thomson培养瓶中培养)并生长直到OD600介于0.5-0.8之间。此时,用最终浓度为0.5mM(VH)和0.1mM(scFv)的IPTG诱导培养物,并在30℃下孵育过夜。然后将培养物以5,000x g离心30分钟,以沉淀细胞,并将上清液通过0.2μm灭菌PES膜过滤灭菌以供进一步分析。
为纯化抗体片段,将3μl GE Ni Sepharose Excel树脂与1mL过滤的上清液混合,并上样到10mL或20mL BioRad Econo-Pac柱上。上样前,用至少20个柱体积(CV)缓冲液A(1xPBS,pH7.4,添加额外的NaCl至500mM)平衡柱的树脂。过滤灭菌的上清液通过重力流,通过将流量控制为1mL/min或倾倒两次,在相同的填充树脂床上进行纯化。然后用以下缓冲液洗涤柱子:10个CV缓冲液A、20个CV缓冲液B(1xPBS,pH7.4,含额外NaCl至500mM,和30mM咪唑)。如果需要,使用两种Detox缓冲液去除内毒素。为了从250mL表达培养物中纯化抗体片段,用20个CV缓冲液C(1xPBS pH7.4,含额外的NaCl至500mM,1%Tx114)、20个CV缓冲液D(1xPBS pH7.4,含额外的NaCl至500mM、1%Tx100+0.2%TNBP)和40个CV缓冲液E(1xPBS pH7.4,含额外NaCl至500mM)依次洗涤抗体结合柱。
用洗脱缓冲液F(1xPBS pH7.4,含额外NaCl至500mM,和500mM咪唑)以总共六个级分(0.5个CV预洗脱,5x 1个CV洗脱)洗脱蛋白质。在Bradford测定法上运行级分(100ul稀释的Bradford溶液+10ul样品)。合并具有亮蓝色的级分并通过A280延伸系数测量其蛋白质浓度。进行SDS-PAGE凝胶测定法以分析纯化抗体的纯度。
在大多数情况下,进行Tm位移热稳定性测定法以测量纯化抗体的热稳定性。
FACS分析抗CD22 ScFv抗体的细胞表面结合活性
为确定每种抗CD22抗体与细胞表面表达的CD22的结合EC50值,从100nM开始在完全培养基中连续稀释2倍来滴定每种纯化的scFv蛋白。将稀释的样品与表达CD22的HEK293细胞(CD22/HEK293细胞)在96孔板中在冰上孵育1小时。在4℃以1200rpm将细胞离心5分钟以去除未结合的抗体。然后用每孔200μL完全培养基洗涤细胞一次。将样品与缀合Alexafluor 488的抗His抗体(二抗,100μL,1:1000稀释)混合,并在4℃避光孵育30分钟。然后在4℃以1200rpm将样品离心5分钟,并用每孔200uL的1x PBS洗涤两次。将所得样品在200uL的1x PBS中复溶,并在Guava EasyCyte上读取。通过仅计数Alexa Fluor 488阳性细胞进行分析,然后在Prism 8.1软件中绘图。
如本研究中所确定的,示例性的抗CD22克隆能够与细胞表面CD22结合。图3A-3D显示了多个示例性抗CD22克隆在所示的不同浓度下的结合曲线。
下表1中提供了本文公开的多种抗CD22抗体对CD22/K562细胞的结合亲和力:
表1
示例性抗CD22抗体对细胞表面CD22的结合亲和力
克隆名: | EC<sub>50</sub>(nM) |
EP160-D02 | 0.24 |
EP160-H02 | 0.68 |
EP97-B03 | 0.7 |
EP97-A10 | 1 |
EP160-G04 | 1.1 |
EP160-F04 | 2.79 |
EP160-G05 | 2.9 |
EP97-G05 | 3.3 |
EP35-C8 | 4.6 |
EP160-C07 | 5.2 |
EP160-E03 | 6.8 |
EP160-F10 | 9 |
EP97-F01 | 10 |
EP35-A7 | 10.38 |
EP35-E7 | 11 |
EP35-E6 | 14.18 |
EP35-F6 | 15 |
EP35-C6 | 19.31 |
EP35-D6 | 47 |
EP35-B5 | 77 |
实施例3.用M971和/或BL22对抗CD22分子进行表位分区
用M971对抗CD22 scFv抗体进行表位分区
进行表位分区测定法以研究本文鉴定的如上述实施例中公开的任何CD22结合剂是否可以与抗CD22抗体M971竞争结合CD22。简而言之,将过表达CD22的重组K562细胞与200nM的本文公开的纯化的抗CD22 scFv抗体或含有200nM的纯化的抗CD22 scFv和20nM的M971 IgG抗体的预混合物在冰上孵育1小时。在4℃以1200rpm将细胞离心5分钟。抗CD22scFv与表达CD22的K562细胞的结合活性包含用缀合Alexa fluor 647的抗His抗体(100uL,1:1000稀释),在4℃避光持续30分钟。在4℃以1200rpm将由此形成的混合物离心5分钟,每孔用200uL 1x PBS洗涤两次。如此收集的细胞在200uL的1x PBS中复溶,并在Attune流式细胞仪上读取。通过将200nM抗CD22 scFv抗体与过表达CD22的重组K562细胞的结合直方图相对于预混合的200nM抗CD22 scFv抗体与20nM M971 IgG抗体与相同重组细胞的结合直方图重叠来进行分析。如此获得的结果表明,所测试的scFv抗体中,包括EP160-G04,EP97-B03,EP160-H02,EP97-A10,EP160-E03,EP160-F04,EP97-A01,EP35-C6,EP160-F10,EP160-G05,EP160-C07,EP35-E6,EP35-C8和EP35-F07没有一个抗体与M971竞争结合细胞表面CD22。
通过ELISA测定法进一步证实了与M971的表位分区。简而言之,在4℃将384孔板用2μg/mL重组人CD22或重组人Fc包被过夜。然后将板在室温用Pierce超级封闭缓冲液封闭1小时。将如本文公开的200nM纯化的抗CD22 scFv抗体或含有200nM纯化的抗CD22 scFv和100nM M971 IgG抗体的预混合物加载到预包被有重组人Fc或重组人的板中CD22。然后将板在室温摇动孵育1小时。之后,将25uL缀合HRP的抗标记抗体(以1:5000稀释)添加到每个孔中,并将板在室温避光孵育1小时。在每个步骤之间用80uL 1x PBST洗涤板3次。然后,用20uL 1-step ultra TMB-ELISA底物溶液显色板5分钟,然后加入20μL2N硫酸终止反应。在Biotek酶标仪上以OD450读取板。通过在Excel条形图上作图比较仅200nM抗CD22 scFv抗体相对于预先混合的200nM抗CD22 scFv与100nM IgG M971抗体在重组人CD22蛋白板上的结合来进行分析。
如图4所示,所示的示例性抗CD22 scFv抗体中没有一个与M971竞争结合CD22。
与M971和BL22相比的抗CD22抗体结合表位
BL22(也称为CAT-3888)是一种重组抗CD22免疫毒素,被提议用作治疗B细胞恶性肿瘤的治疗剂,并且是本领域已知的。BL22是一种重组融合蛋白,包含与称为PE38的截短形式的假单胞菌外毒素A融合的小鼠抗CD22单克隆抗体RFB4的二硫键连接的VH和VL链。RFB4的表位特异性和组织反应性在Li等,Cell Immunol.118(1):85-99(1989)中有所报道。
用EP160-D02 scFv和CD22过表达重组K562细胞系通过FACS分析完成与M971和BL22的CD22EP160-D02抗体表位分区。将纯化的抗CD22 scFv从200nM和5.13nM、1.77nM的M971或0.7nM、0.175nM的BL22mAb的预混合物分别在冰上2倍连续稀释一小时。在4℃以1200rpm将细胞离心5分钟。抗His Alexa fluor 647通过添加100uL 1:1000稀释的二抗并在4℃避光孵育30分钟来检测抗CD22 scFv的结合活性。在4℃以1200rpm将样品离心5分钟,每孔用200uL 1x PBS洗涤两次。将细胞在200uL的1x PBS中复溶,并在Attune流式细胞仪上读取。通过在存在和不存在M971和BL22mAb的情况下计数过表达CD22的重组K562细胞上的抗CD22 scFv阳性染色细胞来进行分析。使用Prism8.0计算EC50。
如图7A和7B所示,M971和BL22的存在对克隆EP160-D02与表达CD22的K562细胞的结合活性没有显著影响,表明M971和BL22不与EP160-D02竞争结合细胞表面CD22。换言之,结果显示EP160-D02不结合与M971或BL22相同的表位。在该测定中测定的EP160-D02的EC50和IC50值提供在下表2和表3中:
表2.M971存在或不存在时EP160-D02的EC50值
EC<sub>50</sub>(nM) | |
EP160-D02 scFv | 0.1246 |
EP160-D02 scFv+1.77nM M971 | 0.09457 |
EP160-D02 scFv+5.13nM M971 | 0.1436 |
EP160-D02 scFv,K562 | N/D |
表3.BL22存在或不存在时EP160-D02的IC50值
IC<sub>50</sub>(nM) | |
EP160-D02 scFv | 0.08216 |
EP160-D02 scFv,0.175nM BL22 | 0.0811 |
EP160-D02 scFv,0.77nM BL22 | 0.08978 |
EP160-D02 scFv,K562 | N/D |
总之,来自这些表位分区测定法的结果表明,与已知的抗CD22抗体M971和RFB4相比,本文报道的示例性抗CD22抗体(例如,EP160-D02)不结合相同的CD22表位。因此,预期本文公开的示例性抗CD22抗体在至少一些方面相对于已知的抗CD22抗体具有不同的生物活性。
实施例4.抗CD22 scFv抗体的结合动力学
已通过SPR技术用Biacore T200评估了抗CD22 scFv与CD22结合的动力学分析。该测定法使用Biacore T200控制软件2.0版运行。对于每个循环,在蛋白G传感器芯片上的1xHBST缓冲液中以10ul/min的流速在流动池2上捕获1μg/mL人CD22-Fc融合蛋白60秒。以30ul/min的流速将2倍系列稀释的HIS标签纯化的抗CD22 scFv注射到参考流动池1和CD22捕获的流动池2上150秒,接着洗涤300秒。然后用甘氨酸pH 2以30ul/min的流速再生流动池60秒。在96孔板中测定每个抗CD22 scFv从100-0nM的8个浓度点。用Biacore T200评估软件3000分析scFv与CD22蛋白结合的动力学。特异性结合响应单位来源于从CD22捕获的流动池2中减去与参考流动池1的结合。结果提供在下表4中。
表4.示例性抗CD22 scFv抗体的结合动力学
实施例5.示例性抗CD22 scFv抗体的热稳定性评估
在此实施例中,至少一式两份制备每种样品和对照,以确保结果可重现。首先在Excel中设计了一个板图,以便每种样品的确切位置可以与用于运行和分析样品的软件相匹配。
在水中将蛋白质热迁移染料(1000x)新鲜稀释至8x。LifeTech的MicroAmpOptical 96孔板或8cap strip用于实验。以下试剂按所列顺序添加:
-第一样品:5ul蛋白质热迁移缓冲液,
-第二样品:12.5ul样品在水中稀释至0.4mg/mL,
-第三样品:2.5ul稀释的热迁移染料8x,总体积为20ul/孔。
-阴性对照样品:12.5ul不含蛋白质的缓冲液
-阳性对照样品:10.5ul水和2.0uL蛋白质热迁移对照蛋白质。
加入热迁移染料后,上下移液吹吸10次。然后,一旦用帽的MicroAmp光学膜密封,将板或条以1000RPM旋转1分钟。之后,将板或条放入Thermo Fisher的Quant Studio 3仪器中,运行方法如下。
-步骤1:2分钟内以100%的斜率上升到25.0°
-步骤2:2分钟内以1%的斜率上升到99.0℃
然后使用QuantStudio Design and Analysis Software和Protein ThermalShift Software 1.3分析样品和随后的Tm(并计算Tm)。结果如下表5所示:
表5.示例性抗CD22抗体的热位移测定法
scFv | Tm℃ |
EP160-D02 | 57.5 |
EP97-G05 | 56.6 |
EP97-F01 | 59.8 |
EP160-G04 | 52.0 |
EP97-B03 | 54.4 |
EP160-H02 | 57.7 |
EP97-A10 | 61.8 |
EP160-E03 | 71.4 |
EP160-F04 | 47.2 |
EP35-F07 | 56.3 |
EP97-A01 | 72.3 |
EP35-C06 | 71.2 |
EP35-B05 | 66.7 |
EP160-F10 | 69.7 |
EP160-G05 | 59.7 |
EP160-C07 | 48.5 |
EP35-C08 | 52 |
实施例6:抗CD22抗体与细胞表面上的内源性CD22和重组CD22结合
使用FACS分析测试了示例性抗CD22 scFv抗体,包括EP97-G05,EP97-A10,EP160-E03和EP160-H02,它们与细胞表面表达的内源性CD22和细胞表面表达的重组CD22结合的能力。
简而言之,将200nM的每种纯化的CD22 scFv抗体(含有HIS标签)稀释在完全培养基中,并在冰上的96孔板中与Daudi和Raji、CD22/HEK293、CD22/K562和K562细胞系一起温育1小时。在4℃以1200rpm将细胞离心5分钟以去除未结合的scFv。然后用每孔200uL完全培养基洗涤细胞一次。通过添加100uL稀释的二抗并在4℃避光孵育30分钟,用抗HIS生物素/链霉抗生物素fluor 647检测样品。在4℃以1200rpm将样品离心5分钟,每孔用200uL 1x PBS洗涤两次。样品在200uL的1x PBS中复溶,并在Attune NxT细胞仪上读取。通过Attune NxT软件绘制CD22蛋白与阴性和靶细胞系结合的叠加直方图进行分析。抗CD22小鼠抗体和抗HIS生物素/链霉抗生物素二级Alexafluor 647作为该测定法的阳性和阴性(背景)对照。
如图5所示,在测试的抗体浓度下,所有四种抗CD22 scFv抗体都与在细胞表面表达重组CD22的HEK和K562细胞结合。还发现抗CD22 scFv与细胞表面上表达内源性CD22的Daudi和Raji结合。
此外,使用IHC染色方案在Ventana Ultra自动化平台上对***固定、石蜡包埋的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)FFPE组织块的5mm切片进行免疫组织化学(IHC)研究。简而言之,在脱蜡和再水化后,使用标准CC1抗体修复(基于EDTA的抗原修复缓冲液,pH 9.0,Cat#950-500)进行抗原修复。在染色步骤之间用Ventana Discovery洗涤液Cat#905-510和Discovery反应缓冲液Cat#950-300进行透化和洗涤。Discovery抑制剂CM Cat#764-4307和IHC/ICCIHC蛋白封闭剂(Invitrogen Cat#00-4952-54)在染色期间应用了非特异性染色的预处理。
将与人Fc多肽融合的示例性抗CD22 scFv EP97-G05与上述组织样品以10ug/ml的浓度在37℃孵育60分钟,然后与以1/250稀释的抗人IgG FC HRP抗体(Abcam Cat#ab98624)孵育。Ventana ChromapDAB试剂盒(Cat#760-159)用于最后的IHC步骤。所有切片都用苏木精复染,整个载玻片通过Aperio AT2扫描镜成像,并使用Indica labs CytoNuclear v1.6算法进行图像分析。
如图7所示,在本文所述的该IHC研究中发现EP97-G05与CD22阳性DLBCL组织结合,表明该抗体能够与可能由疾病细胞上表达的内源性CD22结合。
实施例7:抗CD22 IgG抗体的制备和表征
(i)抗CD22 IgG抗体的重组产生
按照常规实践,将抗CD22 ScFv抗体转化为IgG形式。简而言之,VH和VL序列与人IgG1k主链的恒定结构域融合。基因针对哺乳动物表达进行了密码子优化,由LifeTechnologies合成并亚克隆到pCDNA3.4表达载体。根据标准方案,抗体在自由式***(Invitrogen)中在ExpiHEK293-F细胞中瞬时表达。细胞在收获前生长五天。通过离心收集上清液并通过0.2μm PES膜过滤。
Fc融合激动剂首先通过MabSelect PrismA蛋白A树脂(GE Health)纯化。用100mMGly pH2.5加150mM NaCl洗脱蛋白质,并用20mM Tris-HCl pH 8.0加300mM NaCl快速中和。
然后通过Superdex 200 Increase 10/300 GL柱进一步纯化抗体。汇集并浓缩单体峰级分。最终纯化蛋白的内毒素低于10EU/mg,并保存在1xPBS缓冲液中。
(ii)抗CD22 IgG抗体细胞结合活性
通过FACS结合测定法确定抗CD22 IgG对CD22过表达重组细胞系的EC50。纯化的IgG在完全培养基中连续稀释2倍,共稀释12次。将稀释的IgG与每孔100,000个CD22K562细胞在96孔板中在冰上孵育1小时。在4℃以1200rpm将细胞离心5分钟以去除未结合的抗体。然后用每孔200uL完全培养基洗涤细胞一次。BL22用作抗CD22抗体的阳性对照,表达CD123(但不是CD22)的CHO-K1细胞用作阴性对照。
通过添加100uL 1:1000稀释的二抗,用抗hFc Alexa fluor 488检测样品,并在4℃避光孵育30分钟。在4℃以1200rpm将样品离心5分钟,每孔用200uL1x PBS洗涤两次。样品在200uL的1x PBS中复溶并在Guava EasyCyte上读取。通过仅计数阳性Alexa Fluor 488细胞进行分析,然后在Prism 8.1软件中绘图。
如图8A和8B所示,IgG形式的克隆EP160-D02显示出与细胞表面CD22的强结合,但不与细胞表面CD123结合。示例性EP160-D2(IgG)抗体的EC50值提供于下表6和7中。
表6.与细胞表面CD22结合的EC50值
表7.与细胞表面CD123结合的EC50值
还通过ELISA测定抗CD22 IgG抗体与细胞表面CD22的结合,并观察到类似的结果。参见图8C和下面的表8。
表8.通过ELISA测定的抗CD22 IgG抗体的EC50值
EC<sub>50</sub>(nM) | |
EP160-D02 | 0.039 |
EP97-B03 | 1.82 |
BL22 | 0.004 |
M971 | 0.059 |
(iii)抗CD22 IgG抗体ADCC活性
抗体依赖性细胞毒作用(ADCC),也称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用,是一种细胞介导的细胞毒作用机制,由此免疫***的效应细胞与抗体接合并主动裂解抗体结合的靶细胞。
使用Promega ADCC Bioreporter检测试剂盒测试抗CD22 IgG抗体的ADCC活性。简而言之,将30,000个CD22/HEK293靶细胞铺在白平底96孔测定板上,并在37℃孵育过夜。按照制造商的方案,抗体在ADCC检测缓冲液中从200nM连续稀释3倍。去除靶细胞的上清液。将25μL ADCC检测缓冲液与25μL抗体稀释液混合到每个细胞孔中。在加入效应细胞之前,将细胞在室温下孵育一小时。
按照制造商的方案解冻效应细胞,并将25μL效应细胞接种到每个靶细胞/抗体混合物上。将板在37℃孵育16小时。
第二天,样品在室温平衡30分钟,然后加入75μL室温Bio-glow试剂并在室温避光孵育30分钟。根据制造方案制备生物发光试剂。在Biotek Neo2酶标仪上以发光读板,并在Prism 8.0上绘制数据。
从该测定获得的结果显示示例性抗CD22 IgG抗体,包括EP97-B03和EP160-D02,表现出ADCC活性,而对照抗体M971表现出很少或没有ADCC活性。至少克隆EP160-D02相对于BL22显示出更好的ADCC活性。测试抗体的EC50值在下表9中提供:
表9.ADCC测定法中抗CD22抗体的EC50
EC<sub>50</sub>(nM) | |
EP97-B03 | 3.714 |
EP160-D02 | 1.947 |
EP160-H02 | ~73.80 |
BL22 | 3.314 |
M971 | ~ |
(iv)抗CD22 IgG抗体内化活性
用基于图像的荧光测定法确定抗CD22抗体内化的动力学。简而言之,将30,000个CD22/HEK293靶细胞铺板在经过聚L-赖氨酸处理的96孔黑色底板上,并在37℃孵育过夜。CD22 IgG和二抗pHrodo分别在不含酚红的10%RPMI中稀释至终浓度为4nM和120nM,并在室温下避光孵育至少5分钟。
然后从靶细胞去除培养基,并向细胞中加入100μL抗体/二级pHrodo混合物。在Cytation 5上立即使用RFP和明场对细胞进行成像,并在37℃每两小时对细胞进行成像。通过Cytation 5分析软件定量内化率,并通过Prism 8.0进行分析。
如图10所示,尽管比BL22分子的内化慢,克隆EP160-D02和EP97-B03显示细胞内化。另见下表10。
表10.抗CD22 IgG抗体的内化
T1/2(小时) | |
BL22 | 3.95 |
M971 | 6.07 |
EP160-D02 | 5.06 |
EP97-B03 | 5.26 |
其他实施方案
本说明书中公开的所有特征可以任意组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等价或类似目的的替代特征替换。因此,除非另有明确说明,否则所公开的每个特征仅是等价或类似特征的通用系列的实例。
通过以上描述,本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的本质特征,并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下,可以对本发明进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此,其他实施方案也在权利要求书的范围内。
等价物
尽管本文已经描述和说明了几个发明实施方案,但是本领域的普通技术人员将容易地设想用于执行功能和/或获得结果和/或本文描述的一个或多个优点的各种其他装置和/或结构,并且每个这样的变化和/或修改被认为是在本文描述的发明实施方案的范围内。更一般地,本领域技术人员将容易理解的是,本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置都是示例性的,并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明的教导的具体应用或多个应用。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的特定发明实施方案的许多等价物。因此,应当理解的是,前述实施方案仅作为示例呈现,并且在所附权利要求书及其等价物的范围内,可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施本发明实施方案。本公开内容的发明实施方案涉及本文所述的每个单独的特征、***、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外,如果此类特征、***、物品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾,则两个或多个此类特征、***、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合也包含在本公开内容的发明范围内。
如本文所定义和使用的所有定义应理解为相对于字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或所定义术语的普通含义以本文所定义和使用的定义为准。
本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用的方式并入每一个所引用的主题,在某些情况下,该主题可涵盖文件的全部内容。
除非明确相反指出,否则在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“a”和“an”应理解为“至少一个”。
如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为表示如此结合的元素中的“一个或两个”,即,在某些情况下结合存在而在其他情况下分离存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应该以相同的方式解释,即“一个或多个”这样结合的元素。除了由“和/或”分句具体标识的元素之外,可以任选地存在其他元素,无论这些其他元素是否与那些具体标识的元素相关或不相关。因此,作为非限制性实例,当与诸如“包括”之类的开放式语言结合使用时,对“A和/或B”的引用,在一个实施方案中可以仅指A(任选地包括除B之外的元素);在另一个实施方案中,可以仅指B(任选地包括除A之外的元素);在又一个实施方案中,可以指A和B两者(任选地包括其他元素);等。
如本文在说明书和权利要求书中使用的,“或”应理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如,当分隔列表中的项目时,“或”或“和/或”应解释为具有包容性,即包括至少一个,但也包括许多元素或一系列元素在的超过一个元素,以及(任选)其他未列出的项目。只有明确指出相反的术语,例如“其中的仅一个”或“其中的恰好一个”,或在权利要求中使用时,“由......组成”将指包含许多元素或一系列元素中的恰好一个元素。一般而言,如果前面带有排他性术语,例如“任一”、“其中的一个”、“其中的仅一个”或“其中的恰好一个”,此处使用的术语“或”仅应解释为表示排他性替代方案(即“一个或另一个但不是两者”)。权利要求书中使用的“基本上由……组成”,应具有专利法领域所使用的一般含义。
如本文在说明书和权利要求书中使用的,短语“至少一个”在提及一种或多种元素的列表时,应理解为表示选自元素列表中的任何一个或多个元素中的至少一个元素,但不一定包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个,并且不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的元素列表中具体标识的元素之外的元素可以任选地存在,无论是否与那些具体标识的元素相关或不相关。因此,作为非限制性实例,“A和B中的至少一个”(或等价地,“A或B中的至少一个”,或等价地“A和/或B中的至少一个”),在一个实施方案中,可以指至少一个、任选地包括多于一个的A而不存在B(并且任选地包括除B之外的元素);在另一个实施方案中,可以指至少一个、任选地包括多于一个的B而不存在A(并且任选地包括除A之外的元素);在又一个实施方案中,可以指至少一个、任选地包括多于一个的A,和至少一个、任选地包括多于一个的B(并且任选地包括其它元素);等。
还应该理解的是,除非有明确相反的指示,否则在本文要求保护的任何包括一个以上步骤或动作的方法中,该方法的步骤或动作的顺序不一定限于所记载该方法的这些步骤或动作的顺序。
Claims (26)
1.分离的抗体,其结合CD22,其中所述抗体与参考抗体结合相同的表位或与参考抗体竞争结合CD22,并且其中所述参考抗体选自EP35-A7,EP35-B05,EP35-C6,EP35-C8,EP35-D6,EP35-E6,EP35-E7,EP97-A01,EP97-A10,EP97-B03,EP97-F01,EP97-G05,EP160-C07,EP160-D02,EP160-E03,EP160-F04,EP160-F10,EP160-G04,EP160-G05和EP160-H02。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体,其中所述抗体包含:
(a)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3),其中所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3集体地与所述参考抗体的重链CDR至少80%相同;和/或
(b)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3),其中所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3集体地与所述参考抗体的轻链CDR至少80%相同。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的抗体,其中所述抗体的HCCDR与所述参考抗体的HC CDR相比集体地包含不超过8个氨基酸残基变异;和/或其中所述抗体的LC CDR与所述参考抗体的LC CDR相比集体地包含不超过8个氨基酸残基变异。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体,其中所述抗体包含与所述参考抗体的VH至少85%相同的VH,和/或与所述参考抗体的VL至少85%相同的VL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗体,其中所述抗体对细胞表面上表达的CD22具有小于10nM的结合亲和力。
6.根据权利要求5所述的分离的抗体,其中所述抗体对细胞表面上表达的CD22具有小于1nM的结合亲和力。
7.根据权利要求1所述的分离的抗体,其包含与所述参考抗体相同的重链互补决定区(HC CDR)和相同的轻链互补决定区(LC CDR)。
8.根据权利要求7所述的分离的抗体,其包含与所述参考抗体相同的VH和相同的VL。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的抗体,其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的抗体,其中所述抗体是全长抗体或其抗原结合片段。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的抗体,其中所述抗体是单链抗体(scFv)。
12.根据权利要求11所述的分离的抗体,其中所述抗体包含选自由SEQ ID NO:40-59组成的组的氨基酸序列。
13.核酸或核酸组,其集体地编码根据权利要求1-12中任一项所述的抗体。
14.根据权利要求13所述的核酸或核酸组,其为载体或载体组。
15.根据权利要求14所述的核酸或核酸组,其中所述载体是表达载体。
16.宿主细胞,其包含根据权利要求13-15中任一项所述的核酸或核酸组。
17.药物组合物,其包含根据权利要求1-12中任一项所述的抗体、根据权利要求13-15中任一项所述的核酸或核酸组或根据权利要求16所述的宿主细胞,以及药学上可接受的承载体。
18.抑制受试者中CD22的方法,其包括给有需要的受试者施用任何有效量的根据权利要求17所述的药物组合物。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述受试者是具有CD22阳性疾病细胞的人患者。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法,其中所述受试者是患有癌症或自身免疫性疾病的人患者。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述人患者具有CD22阳性癌细胞或CD22阳性自身反应性免疫细胞。
22.检测CD22的存在的方法,其包括:
(i)将根据权利要求1-12中任一项所述的抗体与怀疑含有CD22的样品接触,和
(ii)检测所述抗体与CD22的结合。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述抗体与可检测标记缀合。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法,其中所述CD22在细胞表面上表达。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的方法,其中通过将所述抗体施用于受试者进行所述接触步骤。
26.产生与CD22结合的抗体的方法,其包括:
(i)在允许所述与CD22结合的抗体表达的条件下培养根据权利要求16所述的宿主细胞;和
(ii)从细胞培养物收获由此产生的抗体。
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