TW202227630A - α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶之變異體 - Google Patents
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Abstract
本發明有關於一種人類α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(hNAGLU)之變異體,詳言之,係有關於一種藉由對hNAGLU的胺基酸序列施加變異,相較於經導入編碼野生型hNAGLU的基因之情形,可使經導入編碼hNAGLU的基因之宿主細胞中之hNAGLU的表現量提高的hNAGLU變異體。
Description
本發明有關於人類α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(hNAGLU)之變異體,詳言之,係有關於一種新穎的hNAGLU變異體,其藉由對hNAGLU的胺基酸序列施加變異,相較於經導入編碼野生型hNAGLU的基因之情形,可使經導入編碼hNAGLU的基因之宿主細胞中之hNAGLU的表現量提高。
為溶酶體病(lysosomal disease)之一種的黏多醣病第IIIB型(MPS-IIIB)亦已知為聖菲利柏氏症候群(Sanfilippo’s syndrome)B型,係一種伴隨酵素α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(NAGLU)的基因異常之因酵素活性降低或缺損而發病的遺傳疾病,而該酵素α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶係對於在溶酶體內為糖胺聚多糖(GAG)之一種的硫酸乙醯肝素(HS)的分解為必要者。重症例之情形,因HS往包含腦之各式各樣的臟器的貯積而於2歲至6歲前後表現認知功能降低、行為障礙等之嚴重的神經障礙或組織疾病,且認為有過動等之行為上的問題及精神發育遲滯。然後認為有伴隨中樞神經退化症狀的急速惡化之重度的精神遲滯、及運動障礙,且語言能力會於7~8歲為止消失。若長到10多歲,則可見到睡眠障礙、肝脾腫大、抽搐發作,且因運動不能而臥床不起,大多會於20多歲前後因呼吸器官傳染病等而死亡。
為了補充於聖菲利柏氏症候群B型患者中不足或者是缺損的酵素,而進行酵素補充療法。酵素α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(NAGLU)具有催化使硫酸乙醯肝素之非還原末端α-N-乙醯葡萄糖胺殘基進行水解的反應之作用,可藉由對患者投予而將於患者體內的溶酶體中貯積的HS分解。
編碼野生型人類NAGLU(hNAGLU)的基因於1995年被單離(專利文獻1)。酵素補充療法中使用的hNAGLU,係使用以經併入編碼其之基因的表現載體進行轉形而成之細胞所生產的重組hNAGLU。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特表2000-500972號公報
[發明欲解決之課題]
本發明之目的為提供一種新穎的hNAGLU變異體,其藉由對hNAGLU的胺基酸序列施加變異,相較於經導入編碼野生型hNAGLU的基因之情形,可使經導入編碼hNAGLU的基因之宿主細胞中之hNAGLU的表現量提高。
[用以解決課題之手段]
於為了上述目的之研究中,本發明人等反覆進行專心致力探討的結果,發現於本說明書中詳述之經導入藉由改變編碼hNAGLU的胺基酸序列所得之hNAGLU變異體的基因之宿主細胞,係與經導入編碼野生型hNAGLU的基因之宿主細胞比較而表現更多的hNAGLU,完成了本發明。亦即,本發明包含以下。
1.一種選自包含下述(1)~(7)之群組的人類α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(hNAGLU)之變異體:
(1)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第36位的離胺酸被麩胺酸、且第37位的脯胺酸被絲胺酸所分別取代之序列識別號3所示胺基酸序列者;
(2)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號5所示胺基酸序列者;
(3)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第209位的麩醯胺酸被精胺酸所取代之序列識別號9所示胺基酸序列者;
(4)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第228位的麩胺酸被離胺酸所取代之序列識別號11所示胺基酸序列者;
(5)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第320位的蘇胺酸被脯胺酸、且第321位的麩胺酸被天冬胺酸所分別取代之序列識別號15所示胺基酸序列者;
(6)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第505位的絲胺酸被丙胺酸、且第506位的異白胺酸被纈胺酸所分別取代之序列識別號17所示胺基酸序列者;及
(7)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第526位的絲胺酸被天冬醯胺酸、且第528位的丙胺酸被蘇胺酸所分別取代之序列識別號19所示胺基酸序列者。
2.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號3所示胺基酸序列的上述1之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第36位的麩胺酸及第37位的絲胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(1’-a)~(1’-h)之群組者:
(1’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(1’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(1’-c)組合上述1’-a之取代與1’-b之缺失者;
(1’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(1’-e)組合上述1’-a之取代與1’-d之附加者;
(1’-f)組合上述1’-b之缺失與1’-d之附加者;
(1’-g)組合上述1’-a之取代、1’-b之缺失、及1’-d之附加者;及
(1’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
3.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號5所示胺基酸序列的上述1之hNAGLU變異體(1),一方面保存該胺基酸序列之第45位的絲胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(2’-a)~(2’-h)之群組者:
(2’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(2’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(2’-c)組合上述2’-a之取代與2’-b之缺失者;
(2’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(2’-e)組合上述2’-a之取代與2’-d之附加者;
(2’-f)組合上述2’-b之缺失與2’-d之附加者;
(2’-g)組合上述2’-a之取代、2’-b之缺失、及2’-d之附加者;及
(2’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
4.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號9所示胺基酸序列的上述1之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第209位的精胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(3’-a)~(3’-h)之群組者:
(3’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(3’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(3’-c)組合上述3’-a之取代與3’-b之缺失者;
(3’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(3’-e)組合上述3’-a之取代與3’-d之附加者;
(3’-f)組合上述3’-b之缺失與3’-d之附加者;
(3’-g)組合上述3’-a之取代、3’-b之缺失、及3’-d之附加者;及
(3’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
5.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號11所示胺基酸序列的上述1之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第228位的離胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(4’-a)~(4’-h)之群組者:
(4’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(4’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(4’-c)組合上述4’-a之取代與4’-b之缺失者;
(4’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(4’-e)組合上述4’-a之取代與4’-d之附加者;
(4’-f)組合上述4’-b之缺失與4’-d之附加者;
(4’-g)組合上述4’-a之取代、4’-b之缺失、及4’-d之附加者;及
(4’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
6.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號15所示胺基酸序列的上述1之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第320位的脯胺酸及第321位的天冬胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(5’-a)~(5’-h)之群組者:
(5’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(5’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(5’-c)組合上述5’-a之取代與5’-b之缺失者;
(5’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(5’-e)組合上述5’-a之取代與5’-d之附加者;
(5’-f)組合上述5’-b之缺失與5’-d之附加者;
(5’-g)組合上述5’-a之取代、5’-b之缺失、及5’-d之附加者;及
(5’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
7.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號17所示胺基酸序列的上述1之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第505位的丙胺酸及第506位的纈胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(6’-a)~(6’-h)之群組者:
(6’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(6’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(6’-c)組合上述6’-a之取代與6’-b之缺失者;
(6’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(6’-e)組合上述6’-a之取代與6’-d之附加者;
(6’-f)組合上述6’-b之缺失與6’-d之附加者;
(6’-g)組合上述6’-a之取代、6’-b之缺失、及6’-d之附加者;及
(6’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
8.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號19所示胺基酸序列的上述1之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第526位的天冬醯胺酸及第528位的蘇胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(7’-a)~(7’-h)之群組者:
(7’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(7’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(7’-c)組合上述7’-a之取代與7’-b之缺失者;
(7’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(7’-e)組合上述7’-a之取代與7’-d之附加者;
(7’-f)組合上述7’-b之缺失與7’-d之附加者;
(7’-g)組合上述7’-a之取代、7’-b之缺失、及7’-d之附加者;及
(7’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
9.如上述4之hNAGLU變異體,其係選自包含以下的(8)~(15)之群組者:
(8)為對於具有序列識別號9所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第209位的精胺酸,同時經施加變異而成的hNAGLU變異體,其係具有第36位的離胺酸被麩胺酸、第37位的脯胺酸被絲胺酸所分別取代之序列識別號25所示胺基酸序列者;
(9)為對於具有序列識別號9所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第209位的精胺酸,同時經施加變異而成的hNAGLU變異體,其係具有第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號27所示胺基酸序列者;
(10)為對於具有序列識別號9所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第209位的精胺酸,同時經施加變異而成的hNAGLU變異體,其係具有第320位的蘇胺酸被脯胺酸、第321位的麩胺酸被天冬胺酸所分別取代之序列識別號29所示胺基酸序列者;
(11)為對於具有序列識別號9所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第209位的精胺酸,同時經施加變異而成的hNAGLU變異體,其係具有第36位的離胺酸被麩胺酸、第37位的脯胺酸被絲胺酸所分別取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號31所示胺基酸序列者;
(12)為對於具有序列識別號9所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第209位的精胺酸,同時經施加變異而成的hNAGLU變異體,其係具有第54位的纈胺酸被異白胺酸、第620位的精胺酸被離胺酸所分別取代之序列識別號33所示胺基酸序列者;
(13)為對於具有序列識別號9所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第209位的精胺酸,同時經施加變異而成的hNAGLU變異體,其係具有第54位的纈胺酸被異白胺酸所取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號35所示胺基酸序列者;
(14)為對於具有序列識別號9所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第209位的精胺酸,同時經施加變異而成的hNAGLU變異體,其係具有第620位的精胺酸被離胺酸所取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號37所示胺基酸序列者;及
(15)為對於具有序列識別號9所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第209位的精胺酸,同時第54位的纈胺酸被異白胺酸、第620位的精胺酸被離胺酸所分別取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號39所示胺基酸序列者。
10.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號25所示胺基酸序列的上述9所記載之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第209位的精胺酸、第36位的麩胺酸、及第37位的絲胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(8’-a)~(8’-h)之群組者:
(8’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(8’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(8’-c)組合上述8’-a之取代與8’-b之缺失者;
(8’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(8’-e)組合上述8’-a之取代與8’-d之附加者;
(8’-f)組合上述8’-b之缺失與8’-d之附加者;
(8’-g)組合上述8’-a之取代、8’-b之缺失、及8’-d之附加者;
(8’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
11.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號27所示胺基酸序列的上述9所記載之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第210位的精胺酸、及第45位的絲胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(9’-a)~(9’-h)之群組者:
(9’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(9’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(9’-c)組合上述9’-a之取代與9’-b之缺失者;
(9’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(9’-e)組合上述9’-a之取代與9’-d之附加者;
(9’-f)組合上述9’-b之缺失與9’-d之附加者;
(9’-g)組合上述9’-a之取代、9’-b之缺失、及9’-d之附加者;
(9’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
12.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號29所示胺基酸序列的上述9所記載之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第209位的精胺酸、第320位的脯胺酸、及第321位的天冬胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(10’-a)~(10’-h)之群組者:
(10’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(10’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(10’-c)組合上述10’-a之取代與10’-b之缺失者;
(10’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(10’-e)組合上述10’-a之取代與10’-d之附加者;
(10’-f)組合上述10’-b之缺失與10’-d之附加者;
(10’-g)組合上述10’-a之取代、10’-b之缺失、及10’-d之附加者;
(10’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
13.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號31所示胺基酸序列的上述9所記載之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第210位的精胺酸、第36位的麩胺酸、第37位的絲胺酸、及第45位的絲胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(11’-a)~(11’-h)之群組者:
(11’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(11’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(11’-c)組合上述11’-a之取代與11’-b之缺失者;
(11’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(11’-e)組合上述11’-a之取代與11’-d之附加者;
(11’-f)組合上述11’-b之缺失與11’-d之附加者;
(11’-g)組合上述11’-a之取代、11’-b之缺失、及11’-d之附加者;
(11’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
14.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號33所示胺基酸序列的上述9所記載之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第209位的精胺酸、第54位的異白胺酸、及第620位的離胺酸,同時經施加變異而成的hNAGLU變異體,其係選自包含以下的(12’-a)~(12’-h)之群組者:
(12’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(12’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(12’-c)組合上述12’-a之取代與12’-b之缺失者;
(12’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(12’-e)組合上述12’-a之取代與12’-d之附加者;
(12’-f)組合上述12’-b之缺失與12’-d之附加者;
(12’-g)組合上述12’-a之取代、12’-b之缺失、及12’-d之附加者;
(12’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
15.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號35所示胺基酸序列的上述9所記載之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第210位的精胺酸、第55位的異白胺酸、及第45位的絲胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(13’-a)~(13’-h)之群組者:
(13’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(13’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(13’-c)組合上述13’-a之取代與13’-b之缺失者;
(13’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(13’-e)組合上述13’-a之取代與13’-d之附加者;
(13’-f)組合上述13’-b之缺失與13’-d之附加者;
(13’-g)組合上述13’-a之取代、13’-b之缺失、及13’-d之附加者;
(13’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
16.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號37所示胺基酸序列的上述9所記載之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第210位的精胺酸、第621位的離胺酸、及第45位的絲胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(14’-a)~(14’-h)之群組者:
(14’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(14’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(14’-c)組合上述14’-a之取代與14’-b之缺失者;
(14’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(14’-e)組合上述14’-a之取代與14’-d之附加者;
(14’-f)組合上述14’-b之缺失與14’-d之附加者;
(14’-g)組合上述14’-a之取代、14’-b之缺失、及14’-d之附加者;
(14’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
17.一種hNAGLU變異體,其係對於具有序列識別號39所示胺基酸序列的上述9所記載之hNAGLU變異體,一方面保存該胺基酸序列之第210位的精胺酸、第55位的異白胺酸、第621位的離胺酸、及第45位的絲胺酸,同時經施加變異而成,其係選自包含以下的(15’-a)~(15’-h)之群組者:
(15’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(15’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(15’-c)組合上述15’-a之取代與15’-b之缺失者;
(15’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(15’-e)組合上述15’-a之取代與15’-d之附加者;
(15’-f)組合上述15’-b之缺失與15’-d之附加者;
(15’-g)組合上述15’-a之取代、15’-b之缺失、及15’-d之附加者;
(15’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
18一種DNA,其係包含編碼上述1~17中任一者之hNAGLU變異體的基因而成。
19.一種表現載體,其係包含上述18之DNA而成。
20.一種哺乳動物細胞,其係經以上述19之表現載體進行轉形。
21.一種hNAGLU變異體之製造方法,其包含以無血清培養基培養上述20之哺乳動物細胞的步驟。
22.一種融合蛋白質,其係上述1~17中任一者所記載之hNAGLU變異體與抗體的融合蛋白質,其藉由該抗體與腦血管內皮細胞上的受體結合,而該融合蛋白質可通過血腦障壁(BBB)。
23.上述22所記載之融合蛋白質,其中該腦血管內皮細胞上的受體選自包含胰島素受體、運鐵蛋白受體、瘦素受體、脂蛋白受體、及IGF受體之群組。
24.上述22所記載之融合蛋白質,其中該腦血管內皮細胞上的受體係運鐵蛋白受體。
25.上述22~24中任一者所記載之融合蛋白質,其中該抗體為Fab抗體、F(ab’)
2抗體、F(ab’)抗體、單域抗體、單鏈抗體、或Fc抗體中任一者。
26.上述22~25中任一項所記載之融合蛋白質,其中該hNAGLU變異體與該抗體之輕鏈的C末端側或是N末端側中任一者結合。
27.上述22~25中任一項所記載之融合蛋白質,其中該hNAGLU變異體與該抗體之重鏈的C末端側或是N末端側中任一者結合。
28.上述22~27中任一項所記載之融合蛋白質,其中該hNAGLU變異體與該抗體之輕鏈的C末端側或是N末端側中任一者、或重鏈的C末端側或是N末端側中任一者,透過連接子(linker)序列而結合。
29.上述37所記載之融合蛋白質,其中該連接子序列由1~50個胺基酸殘基所構成。
30.上述29所記載之融合蛋白質,其中該連接子序列係包含選自下列群組的胺基酸序列,該群組包含1個甘胺酸、1個絲胺酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列識別號3之胺基酸序列、序列識別號4之胺基酸序列、序列識別號5之胺基酸序列、及此等胺基酸序列1~10個連續而成的胺基酸序列。
31.一種DNA,其係包含編碼上述22~30中任一者所記載之融合蛋白質的基因而成。
32.一種表現載體,其係包含上述31所記載之DNA而成。
33.一種哺乳動物細胞,其係經以上述32所記載之表現載體進行轉形。
34.一種hNAGLU變異體與抗體的融合蛋白質之製造方法,其包含以無血清培養基培養上述33所記載之哺乳動物細胞的步驟。
[發明之效果]
若藉由本發明,則可利用基因重組技術而效率良好地製造為了黏多醣病第IIIB型的患者之治療,而能夠作為酵素補充療法來投予的hNAGLU。
[用以實施發明的形態]
於本說明書中,僅稱為「人類α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶」或「hNAGLU」之時,除了由序列識別號1所示720個胺基酸殘基所構成之通常的野生型之hNAGLU以外,只要是具有具可分解硫酸乙醯肝素的酵素活性等之作為通常的野生型hNAGLU的功能者,則亦無特別區別地包含下述hNAGLU之變異體,其係相當於對於序列識別號1所示胺基酸序列,有1個或複數個胺基酸殘基經取代、缺失、及/或附加(於本說明書中,胺基酸殘基之「附加」意指在序列的末端或內部追加殘基。)者。野生型之hNAGLU係由例如具有序列識別號2所示鹼基序列之基因所編碼。將胺基酸殘基以其他胺基酸殘基取代之情形,進行取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個。使胺基酸殘基缺失之情形,缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個。又,使胺基酸殘基缺失之情形,可使N末端之胺基酸殘基缺失,該情形所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個。又,亦可組合此等胺基酸殘基之取代與缺失。
對於序列識別號1所示胺基酸序列附加胺基酸殘基之情形,胺基酸殘基係於hNAGLU的胺基酸序列中、或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側附加1個或複數個胺基酸殘基。此時所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個。又,亦可組合胺基酸殘基之附加與取代,亦可組合胺基酸殘基之附加與缺失,亦可組合胺基酸殘基之附加、取代及缺失。通常的野生型之hNAGLU係以由743個胺基酸殘基所構成的前驅物被生合成,且剔除序列識別號67所示自N末端起由23個胺基酸殘基所構成之前導肽(leader peptide)而成為hNAGLU。hNAGLU的N末端側有胺基酸附加之情形,該胺基酸亦可為源自前導肽者。於該情形,對N末端所附加之胺基酸於胺基酸為1個之情形為Gly,於胺基酸為2個之情形為Ala-Gly,於胺基酸為2個之情形為Ala-Ala-Gly。
就組合此等胺基酸之取代及缺失、以及附加之3種類的變異之中至少2種類的變異進行導入而成的hNAGLU之變異體而言,有以下所示(i)~(iv),但並不受限於此等:
(i)具有對於序列識別號1所示胺基酸序列進行0~10個胺基酸殘基之缺失、0~10個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基之取代、以及進而0~10個胺基酸殘基之附加而成的胺基酸序列者;
(ii)具有對於序列識別號1所示胺基酸序列進行0~5個胺基酸殘基之缺失、0~5個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基之取代、以及進而0~5個胺基酸殘基之附加而成的胺基酸序列者;
(iii)具有對於序列識別號1所示胺基酸序列進行0~3個胺基酸殘基之缺失、0~3個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基之取代、以及進而0~3個胺基酸殘基之附加而成的胺基酸序列者;
(iv)具有對於序列識別號1所示胺基酸序列進行0~2個胺基酸殘基之缺失、0~2個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基之取代、以及進而0~2個胺基酸殘基之附加而成的胺基酸序列者。
為上述之野生型或變異型的hNAGLU,且構成其之胺基酸經糖鏈修飾者亦為hNAGLU。又,為上述之野生型或變異型的hNAGLU,且構成其之胺基酸經磷酸修飾者亦為hNAGLU。又,經糖鏈及磷酸以外之物修飾者亦為hNAGLU。又,為上述之野生型或變異型的hNAGLU,且構成其之胺基酸的側鏈藉由取代反應等而轉換者亦為hNAGLU。就該轉換而言,係有半胱胺酸殘基轉換為甲醯基甘胺酸,但並不受限於此。
亦即,經糖鏈修飾的hNAGLU即包含在具有該修飾之前之胺基酸序列的hNAGLU中。又,經磷酸修飾的hNAGLU即包含在具有磷酸修飾之前之原胺基酸序列的hNAGLU中。又,經糖鏈及磷酸以外之物修飾者亦包含在具有該修飾之前之原胺基酸序列的hNAGLU中。又,構成hNAGLU之胺基酸的側鏈藉由取代反應等而轉換者亦包含在具有該轉換之前之原胺基酸序列的hNAGLU中。就該轉換而言,係有半胱胺酸殘基轉換為甲醯基甘胺酸,但並不受限於此。
於本發明中,「人類α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶變異體」(hNAGLU變異體)一詞,係對於通常的野生型hNAGLU的胺基酸序列(序列識別號1所示胺基酸序列),有1個或複數個胺基酸殘基經取代、缺失、及/或附加(於本說明書中,胺基酸殘基之「附加」意指在序列的末端或內部追加殘基。)者,且為具有具可分解硫酸乙醯肝素的酵素活性等之作為通常的野生型hNAGLU的功能者。於本發明中較佳的hNAGLU變異體,係包含對於序列識別號1所示胺基酸序列,有1個或複數個胺基酸殘基被取代為其他胺基酸殘基、缺失、或者被附加而成的胺基酸序列者。將該胺基酸序列中的胺基酸殘基以其他胺基酸殘基取代之情形,進行取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個又2個。使胺基酸殘基缺失之情形,缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個又2個。又,hNAGLU變異體亦可為組合此等胺基酸殘基之取代與缺失者。
對於序列識別號1所示胺基酸序列附加胺基酸殘基之情形,胺基酸殘基係於hNAGLU的胺基酸序列中、或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側附加1個或複數個胺基酸殘基。此時所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個。又,亦可組合胺基酸殘基之附加與取代,亦可組合胺基酸殘基之附加與缺失,亦可組合胺基酸殘基之附加、取代及缺失。即,hNAGLU變異體,係對於序列識別號1所示胺基酸序列,組合胺基酸之取代及缺失、以及附加之3種類的變異之中至少2種類的變異進行導入而成者。
就組合此等胺基酸之取代及缺失、以及附加之3種類的變異之中至少2種類的變異進行導入而成的hNAGLU之變異體而言,有以下所示(i)~(iv),但並不受限於此等:
(i)具有對於序列識別號1所示胺基酸序列進行0~10個胺基酸殘基之缺失、0~10個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基之取代、以及進而0~10個胺基酸殘基之附加而成的胺基酸序列者(但是,野生型之hNAGLU除外);
(ii)具有對於序列識別號1所示胺基酸序列進行0~5個胺基酸殘基之缺失、0~5個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基之取代、以及進而0~5個胺基酸殘基之附加而成的胺基酸序列者(但是,野生型之hNAGLU除外);
(iii)具有對於序列識別號1所示胺基酸序列進行0~3個胺基酸殘基之缺失、0~3個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基之取代、以及進而0~3個胺基酸殘基之附加而成的胺基酸序列者(但是,野生型之hNAGLU除外);
(iv)具有對於序列識別號1所示胺基酸序列進行0~2個胺基酸殘基之缺失、0~2個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基之取代、以及進而0~2個胺基酸殘基之附加而成的胺基酸序列者(但是,野生型之hNAGLU除外)。
各種的hNAGLU變異體中之與通常的野生型hNAGLU進行比較之時的各變異的位置及其形式(缺失、取代、及附加),可藉由兩hNAGLU的胺基酸序列的比對而輕易地確認。
hNAGLU變異體的胺基酸序列,係與序列識別號1所示通常的野生型hNAGLU的胺基酸序列,較佳為顯示80%以上之同一性、顯示85%以上之同一性、顯示90%以上之同一性、或顯示95%以上之同一性,例如為顯示98%以上、或99%之同一性者。
野生型hNAGLU的胺基酸序列與hNAGLU變異體的胺基酸序列之同一性,可使用習知的相同性計算演算法而輕易地算出。例如,作為該種演算法而有:BLAST(Altschul SF. J Mol .Biol. 215. 403-10, (1990));Pearson及Lipman的類似性檢索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988));Smith及Waterman的局部相同性演算法(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等。
野生型hNAGLU或hNAGLU變異體的胺基酸序列中的胺基酸以其他胺基酸之取代,係例如在胺基酸的該等之側鏈及化學性質上有關聯性的胺基酸家族內發生者。預測這種在胺基酸家族內的取代並不會對原蛋白質的功能帶來大的變化(即為保存性胺基酸取代)。就該胺基酸家族而言,係有例如以下的(1)~(12)所示者:
(1)為酸性胺基酸之天冬胺酸與麩胺酸;
(2)為鹼性胺基酸之組胺酸、離胺酸、及精胺酸;
(3)為芳香族胺基酸之***酸、酪胺酸、及色胺酸;
(4)為具有羥基的胺基酸(羥基胺基酸)之絲胺酸與蘇胺酸;
(5)為疏水性胺基酸之甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、及異白胺酸;
(6)為中性的親水性胺基酸之半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、及麩醯胺酸;
(7)為會影響肽鏈之定向(orientation)的胺基酸之甘胺酸與脯胺酸;
(8)為醯胺型胺基酸(極性胺基酸)之天冬醯胺酸與麩醯胺酸;
(9)為脂肪族胺基酸之丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、及纈胺酸;
(10)為側鏈小的胺基酸之丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸、及蘇胺酸;
(11)為側鏈特別小的胺基酸之丙胺酸與甘胺酸;
(12)為具有支鏈的胺基酸之纈胺酸、白胺酸、及異白胺酸。
於本發明之一實施形態中,稱為高表現型hNAGLU變異體之時,係特徵為下述之hNAGLU變異體:使其作為重組蛋白質而在宿主細胞表現之際,與在相同條件下使野生型之hNAGLU作為重組蛋白質而在宿主細胞表現之時比較,至少可得到1.1倍以上、1.5倍以上、2倍以上、4倍以上、5倍以上、或6倍以上,例如1.5~4倍、2~5倍、2~8倍等的表現量。此處所謂相同條件下係指表現載體、宿主細胞、培養條件等相同。
作為該高表現型hNAGLU變異體之較佳的實施形態,可舉出以下的(1)~(7):
(1)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第36位的離胺酸被麩胺酸、且第37位的脯胺酸被絲胺酸所分別取代之序列識別號3所示胺基酸序列者,
(2)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號5所示胺基酸序列者,
(3)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第209位的麩醯胺酸被精胺酸所取代之序列識別號9所示胺基酸序列者,
(4)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第228位的麩胺酸被離胺酸所取代之序列識別號11所示胺基酸序列者,
(5)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第320位的蘇胺酸被脯胺酸、且第321位的麩胺酸被天冬胺酸所分別取代之序列識別號15所示胺基酸序列者,
(6)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第505位的絲胺酸被丙胺酸、且第506位的異白胺酸被纈胺酸所分別取代之序列識別號17所示胺基酸序列者,
(7)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第526位的絲胺酸被天冬醯胺酸、且第528位的丙胺酸被蘇胺酸所分別取代之序列識別號19所示胺基酸序列者。
進一步作為該高表現型hNAGLU變異體之較佳的實施形態,可舉出以下的(1’)~(7’)。
(1’)不對序列識別號3所示胺基酸序列之第36位的麩胺酸及第37位的絲胺酸施加變異:
(1’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(1’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(1’-c)組合上述1’-a之取代與1’-b之缺失者;
(1’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(1’-e)組合上述1’-a之取代與1’-d之附加者;
(1’-f)組合上述1’-b之缺失與1’-d之附加者;
(1’-g)組合上述1’-a之取代、1’-b之缺失、及1’-d之附加者;
(1’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(2’)不對序列識別號5所示胺基酸序列之第45位的絲胺酸施加變異:
(2’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(2’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(2’-c)組合上述2’-a之取代與2’-b之缺失者;
(2’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(2’-e)組合上述2’-a之取代與2’-d之附加者;
(2’-f)組合上述2’-b之缺失與2’-d之附加者;
(2’-g)組合上述2’-a之取代、2’-b之缺失、及2’-d之附加者;
(2’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(3’)不對序列識別號9所示胺基酸序列之第209位的精胺酸施加變異:
(3’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(3’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(3’-c)組合上述3’-a之取代與3’-b之缺失者;
(3’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(3’-e)組合上述3’-a之取代與3’-d之附加者;
(3’-f)組合上述3’-b之缺失與3’-d之附加者;
(3’-g)組合上述3’-a之取代、3’-b之缺失、及3’-d之附加者;
(3’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(4’)不對序列識別號11所示胺基酸序列之第228位的離胺酸施加變異:
(4’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(4’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(4’-c)組合上述4’-a之取代與4’-b之缺失者;
(4’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(4’-e)組合上述4’-a之取代與4’-d之附加者;
(4’-f)組合上述4’-b之缺失與4’-d之附加者;
(4’-g)組合上述4’-a之取代、4’-b之缺失、及4’-d之附加者;
(4’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(5’)不對序列識別號15所示胺基酸序列之第320位的脯胺酸及第321位的天冬胺酸施加變異:
(5’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(5’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(5’-c)組合上述5’-a之取代與5’-b之缺失者;
(5’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(5’-e)組合上述5’-a之取代與5’-d之附加者;
(5’-f)組合上述5’-b之缺失與5’-d之附加者;
(5’-g)組合上述5’-a之取代、5’-b之缺失、及5’-d之附加者;。
(5’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(6’)不對序列識別號17所示胺基酸序列之第505位的丙胺酸及第506位的纈胺酸施加變異:
(6’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(6’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(6’-c)組合上述6’-a之取代與6’-b之缺失者;
(6’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(6’-e)組合上述6’-a之取代與6’-d之附加者;
(6’-f)組合上述6’-b之缺失與6’-d之附加者;
(6’-g)組合上述6’-a之取代、6’-b之缺失、及6’-d之附加者;
(6’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(7’)不對序列識別號19所示胺基酸序列之第526位的天冬醯胺酸及第528位的蘇胺酸施加變異:
(7’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(7’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(7’-c)組合上述7’-a之取代與7’-b之缺失者;
(7’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(7’-e)組合上述7’-a之取代與7’-d之附加者;
(7’-f)組合上述7’-b之缺失與7’-d之附加者;
(7’-g)組合上述7’-a之取代、7’-b之缺失、及7’-d之附加者;
(7’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
作為對具有上述(1)的序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第209位的麩醯胺酸被精胺酸所取代之序列識別號9所示胺基酸序列的高表現型hNAGLU變異體,進一步導入變異而成的高表現型hNAGLU變異體之具體的實施形態,可舉出以下的(8)~(15):
(8)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第209位的麩醯胺酸被精胺酸、第36位的離胺酸被麩胺酸、第37位的脯胺酸被絲胺酸所分別取代之序列識別號25所示胺基酸序列者;
(9)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第209位的麩醯胺酸被精胺酸所取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號27所示胺基酸序列者;
(10)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第209位的麩醯胺酸被精胺酸、第320位的蘇胺酸被脯胺酸、第321位的麩胺酸被天冬胺酸所分別取代之序列識別號29所示胺基酸序列者;
(11)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第209位的麩醯胺酸被精胺酸、第36位的離胺酸被麩胺酸、第37位的脯胺酸被絲胺酸所分別取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號31所示胺基酸序列者;
(12)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第209位的麩醯胺酸被精胺酸、第54位的纈胺酸被異白胺酸、第620位的精胺酸被離胺酸所分別取代之序列識別號33所示胺基酸序列者;
(13)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第209位的麩醯胺酸被精胺酸、第54位的纈胺酸被異白胺酸所分別取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號35所示胺基酸序列者;
(14)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第209位的麩醯胺酸被精胺酸、第620位的精胺酸被離胺酸所分別取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號37所示胺基酸序列者;
(15)具有序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第209位的麩醯胺酸被精胺酸、第54位的纈胺酸被異白胺酸、第620位的精胺酸被離胺酸所分別取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號39所示胺基酸序列者。
進一步作為該高表現型hNAGLU變異體之較佳的實施形態,可舉出以下的(8’)~(15’)。
(8’)不對序列識別號25所示胺基酸序列之第209位的精胺酸、第36位的麩胺酸、及第37位的絲胺酸施加變異:
(8’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(8’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(8’-c)組合上述8’-a之取代與8’-b之缺失者;
(8’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(8’-e)組合上述8’-a之取代與8’-d之附加者;
(8’-f)組合上述8’-b之缺失與8’-d之附加者;
(8’-g)組合上述8’-a之取代、8’-b之缺失、及8’-d之附加者;
(8’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(9’)不對序列識別號27所示胺基酸序列之第210位的精胺酸、及第45位的絲胺酸施加變異:
(9’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(9’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(9’-c)組合上述9’-a之取代與9’-b之缺失者;
(9’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(9’-e)組合上述9’-a之取代與9’-d之附加者;
(9’-f)組合上述9’-b之缺失與9’-d之附加者;
(9’-g)組合上述9’-a之取代、9’-b之缺失、及9’-d之附加者;
(9’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(10’)不對序列識別號29所示胺基酸序列之第209位的精胺酸、第320位的脯胺酸、及第321位的天冬胺酸施加變異:
(10’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(10’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(10’-c)組合上述10’-a之取代與10’-b之缺失者;
(10’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(10’-e)組合上述10’-a之取代與10’-d之附加者;
(10’-f)組合上述10’-b之缺失與10’-d之附加者;
(10’-g)組合上述10’-a之取代、10’-b之缺失、及10’-d之附加者;
(10’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(11’)不對序列識別號31所示胺基酸序列之第210位的精胺酸、第36位的麩胺酸、第37位的絲胺酸、及第45位的絲胺酸施加變異:
(11’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(11’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(11’-c)組合上述11’-a之取代與11’-b之缺失者;
(11’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(11’-e)組合上述11’-a之取代與11’-d之附加者;
(11’-f)組合上述11’-b之缺失與11’-d之附加者;
(11’-g)組合上述11’-a之取代、11’-b之缺失、及11’-d之附加者;
(11’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(12’)不對序列識別號33所示胺基酸序列之第209位的精胺酸、第54位的異白胺酸、及第620位的離胺酸施加變異:
(12’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(12’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(12’-c)組合上述12’-a之取代與12’-b之缺失者;
(12’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(12’-e)組合上述12’-a之取代與12’-d之附加者;
(12’-f)組合上述12’-b之缺失與12’-d之附加者;
(12’-g)組合上述12’-a之取代、12’-b之缺失、及12’-d之附加者;
(12’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(13’)不對序列識別號35所示胺基酸序列之第210位的精胺酸、第55位的異白胺酸、及第45位的絲胺酸施加變異:
(13’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(13’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(13’-c)組合上述13’-a之取代與13’-b之缺失者;
(13’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(13’-e)組合上述13’-a之取代與13’-d之附加者;
(13’-f)組合上述13’-b之缺失與13’-d之附加者;
(13’-g)組合上述13’-a之取代、13’-b之缺失、及13’-d之附加者;
(13’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(14’)不對序列識別號37所示胺基酸序列之第210位的精胺酸、第621位的離胺酸、及第45位的絲胺酸施加變異:
(14’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(14’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(14’-c)組合上述14’-a之取代與14’-b之缺失者;
(14’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(14’-e)組合上述14’-a之取代與14’-d之附加者;
(14’-f)組合上述14’-b之缺失與14’-d之附加者;
(14’-g)組合上述14’-a之取代、14’-b之缺失、及14’-d之附加者;
(14’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
(15’)不對序列識別號39所示胺基酸序列之第210位的精胺酸、第55位的異白胺酸、第621位的離胺酸、及第45位的絲胺酸施加變異:
(15’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基以其他胺基酸殘基所取代者,經取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(15’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(15’-c)組合上述15’-a之取代與15’-b之缺失者;
(15’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個;
(15’-e)組合上述15’-a之取代與15’-d之附加者;
(15’-f)組合上述15’-b之缺失與15’-d之附加者;
(15’-g)組合上述15’-a之取代、15’-b之缺失、及15’-d之附加者;
(15’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
本發明之一實施形態中的hNAGLU變異體,係特徵為:於使其作為重組蛋白質而在宿主細胞表現之時,與在相同條件下使野生型之hNAGLU作為重組蛋白質而在宿主細胞表現之時比較,而表現量多。於本說明書中,將此類型的hNAGLU變異體稱為高表現型hNAGLU變異體。高表現型hNAGLU變異體,由於可於作為重組蛋白質而製造之時,與野生型之hNAGLU比較而使生產效率上升,所以可減少生產成本。再者,此處所謂相同條件下,係指表現載體、宿主細胞、培養條件等相同。
編碼於使其作為重組蛋白質而在宿主細胞表現之時,與野生型之hNAGLU比較而表現量上升之hNAGLU變異體的基因,係例如可藉由以下之手法來取得。將編碼經導入變異之hNAGLU與野生型之hNAGLU的基因,分別併入相同種類的表現載體,並使用其而使相同種類的宿主細胞轉形,取得經導入各個表現載體之細胞。接著,在相同條件下培養此等之細胞,且定量培養上清液中所得之hNAGLU。與經導入編碼野生型之hNAGLU的基因的細胞之定量值比較而顯示大的定量值之細胞中所導入的基因,係被特定為編碼目標之高表現型hNAGLU變異體的基因。再者,作為此處之定量值,係於作為hNAGLU的蛋白質之定量值以外,亦可使用hNAGLU的酵素活性值。例如,亦可使用培養上清液中所含的hNAGLU之酵素活性的總量作為定量值。
對野生型之hNAGLU之變異的導入,可使用將變異隨機地導入編碼野生型之hNAGLU的基因之手法來進行。例如,可藉由將編碼野生型之hNAGLU的基因併入載體,對使用其而經轉形的宿主細胞使變異源(放射線、誘變性(mutagenicity)物質等)作用,而將變異導入編碼野生型之hNAGLU的基因。
對野生型之hNAGLU之變異的導入,亦可使用將變異導入編碼野生型之hNAGLU的基因之預先決定處之手法來進行。例如,可藉由化學合成於預先決定處具有變異之基因,而導入該基因變異。
高表現型hNAGLU變異體,可藉由培養使用經併入編碼該變異體之基因的表現載體進行轉形而成之宿主細胞,而作為重組蛋白質來製造。
此時所用的宿主細胞,只要是可藉由導入該種表現載體而使高表現型hNAGLU變異體表現者,則無特別限制,可為哺乳動物細胞、酵母、植物細胞、昆蟲細胞等真核生物細胞、大腸菌、枯草菌等原核細胞之任一者,但特佳為哺乳動物細胞。
使用哺乳動物細胞作為宿主細胞來使用之情形,針對該哺乳動物細胞的種類並無特別限定,但較佳為源自人類、小鼠、中國倉鼠的細胞,特佳為源自中國倉鼠卵巢細胞的CHO細胞、或源自小鼠骨髓瘤的NS/0細胞。又,此時為了將編碼高表現型hNAGLU變異體之DNA片段併入而且使其表現而使用的表現載體,若為導入哺乳動物細胞內時使該基因表現者,則可無特別限定地使用。被併入表現載體的該基因,被配置於可在哺乳動物細胞內調節基因轉錄之頻度的DNA序列(基因表現調控區)之下游。就可於本發明中使用的基因表現調控區而言,可舉出例如:源自巨細胞病毒的啟動子、SV40早期啟動子、人類延伸因子-1α(EF-1α)啟動子、人類泛蛋白C啟動子等。
已知有於編碼目標之蛋白質的基因之下游側透過內部核糖體進入位點(IRES:internal ribosome entry site),而配置麩醯胺酸合成酵素(GS)作為篩選標記的表現載體(國際專利公報WO2012/063799、WO2013/161958)。此等文獻中記載的表現載體,可特別合適地用於製造高表現型hNAGLU變異體。
例如,下述表現載體可合適地用於製造高表現型hNAGLU變異體,其係用以使目標之蛋白質表現的表現載體,係包含第1基因表現調控區、以及於其下游之編碼該蛋白質的基因、於更下游之內部核糖體進入位點、及於更下游之編碼麩醯胺酸合成酵素的基因,而且於上述第1基因表現調控區的或有別於其之第2基因表現調控區的下游進一步包含二氫葉酸還原酶基因或抗藥性基因而成。於此表現載體中,就第1基因表現調控區或第2基因表現調控區而言,可合適地使用源自巨細胞病毒的啟動子、SV40早期啟動子、人類延伸因子-1α啟動子(hEF-1α啟動子)、人類泛蛋白C啟動子,但特佳為hEF-1α啟動子。
又,就內部核糖體進入位點而言,可合適地使用源自選自包含微小核糖核酸病毒科的病毒、***病毒、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒、冠狀病毒、牛腸內病毒、泰勒氏鼠腦脊髓炎病毒(Theiler's mouse encephalomyelitis virus)、B型柯薩奇病毒(Coxsackie B virus)之群組的病毒之基因體、或選自包含人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白基因、果蠅觸角足基因、果蠅Ultrabithorax基因之群組的基因之5’非轉譯區者,但特佳為源自小鼠腦心肌炎病毒基因體之5’非轉譯區的內部核糖體進入位點。使用源自小鼠腦心肌炎病毒基因體之5’非轉譯區的內部核糖體進入位點之情形,於野生型者以外,亦可合適地使用野生型之內部核糖體進入位點中所包含的複數起始密碼子之中的一部分經破壞者。又,於此表現載體中,可合適地使用的抗藥性基因係較佳為嘌呤黴素或新黴素抗性基因,更佳為嘌呤黴素抗性基因。
又,例如,下述表現載體可合適地用於製造高表現型hNAGLU變異體,其係用以使目標之蛋白質表現的表現載體,該表現載體包含人類延伸因子-1α啟動子、於其下游之編碼該蛋白質的基因、於更下游之源自小鼠腦心肌炎病毒基因體之5’非轉譯區的內部核糖體進入位點、及於更下游之編碼麩醯胺酸合成酵素的基因,而且進一步包含別的基因表現調控區及於其下游之二氫葉酸還原酶基因,且其中該內部核糖體進入位點為野生型之內部核糖體進入位點中所包含的複數起始密碼子之中的一部分經破壞者。作為這種表現載體,可舉出WO2013/161958中記載的表現載體。
又,例如,下述表現載體可合適地用於製造高表現型hNAGLU變異體,其係用以使目標之蛋白質表現的表現載體,該表現載體包含人類延伸因子-1α啟動子、於其下游之編碼該蛋白質的基因、於更下游之源自小鼠腦心肌炎病毒基因體之5’非轉譯區的內部核糖體進入位點、及於更下游之編碼麩醯胺酸合成酵素的基因,而且進一步包含別的基因表現調控區及於其下游之抗藥性基因,且其中該內部核糖體進入位點為野生型之內部核糖體進入位點中所包含的複數起始密碼子之中的一部分經破壞者。作為這種表現載體,可舉出WO2012/063799中記載的pE-mIRES-GS-puro及WO2013/161958中記載的pE-mIRES-GS-mNeo。
於源自野生型的小鼠腦心肌炎病毒基因體之5’非轉譯區的內部核糖體進入位點的3’末端,係存在3個起始密碼子(ATG)。上述之pE-mIRES-GS-puro及pE-mIRES-GS-mNeo,係具有起始密碼子之中的一部分經破壞之IRES的表現載體。
hNAGLU變異體(包含高表現型hNAGLU變異體),可藉由培養經導入已併入編碼其之基因的表現載體之宿主細胞,而使其於細胞中或培養基中表現。針對哺乳動物細胞為宿主細胞之情形的hNAGLU變異體之表現方法,於以下詳述。
就用以培養哺乳動物細胞的培養基而言,若為可培養哺乳動物細胞而使其增殖者,則可無特別限定地使用,但較佳為使用無血清培養基。於本發明中,就作為重組蛋白質生產用培養基所使用的無血清培養基而言,例如可合適地使用含有3~700mg/L胺基酸、0.001~50mg/L維生素類、0.3~10g/L單醣類、0.1~10000mg/L無機鹽、0.001~0.1mg/L微量元素、0.1~50mg/L核苷、0.001~10mg/L脂肪酸、0.01~1mg/L生物素、0.1~20μg/L氫皮質酮、0.1~20mg/L胰島素、0.1~10mg/L維生素B12、0.01~1mg/L腐胺、10~500mg/L丙酮酸鈉、及水溶性鐵化合物的培養基。亦可依期望而於培養基添加胸腺嘧啶、次黃嘌呤、慣用的pH指示劑及抗生素等。
就作為重組蛋白質生產用培養基所使用的無血清培養基而言,可使用DMEM/F12培養基(DMEM與F12的混合培養基)作為基本培養基,此等各培養基對本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言為習知。進而還可使用DMEM(HG)HAM改良型(R5)培養基作為無血清培養基,其係包含碳酸氫鈉、L-麩醯胺酸、D-葡萄糖、胰島素、亞硒酸鈉、二胺丁烷、氫皮質酮、硫酸鐵(II)、天冬醯胺酸、天冬胺酸、絲胺酸及聚乙烯醇的培養基。進而亦可使用市售的無血清培養基,例如CD OptiCHO
TM培養基、CHO-S-SFM II培養基或CD CHO培養基(Thermo Fisher Scientific公司,原Life Technologies公司)、IS cho-V
TM培養基(Irvine Scientific公司)、EX-CELL
TM302培養基或EX-CELL
TM325-PF培養基(SAFC Biosciences公司)等作為基本培養基。
高表現型hNAGLU變異體係特徵為:於使其在上述之無血清培養基培養經導入已併入編碼其之基因的表現載體之哺乳動物細胞作為重組蛋白質而表現之時,與在相同條件下使野生型之hNAGLU作為重組蛋白質表現之時比較,可得到至少1.1倍以上、1.5倍以上、2倍以上、4倍以上,5倍以上、或6倍以上,例如1.5~4倍、2~5倍、2~8倍等的表現量。此時所用的哺乳動物細胞為CHO細胞、NS/0細胞等,但尤其是CHO細胞。
藉由培養編碼hNAGLU變異體之宿主細胞,而於細胞內或培養基中表現的重組hNAGLU變異體,可藉由管柱色層分析法等方法而自摻雜物分離且精製。所精製的hNAGLU變異體,可作為醫藥來使用。尤其,hNAGLU變異體可作為以已知為聖菲利柏氏症候群B型之黏多醣病第IIIB型(MPS-IIIB)為對象疾病的醫藥來使用。
含有hNAGLU變異體作為有效成分而成的醫藥,可作為注射劑而對靜脈內、肌肉內、腹腔內、皮下或腦室內進行投予。該等之注射劑可作為冷凍乾燥製劑或水性液劑而供給。作成水性液劑之情形,可作成填充於小瓶之形態,亦可作為預先填充於注射器之預充(prefilled)型的製劑而供給。冷凍乾燥製劑之情形,於使用前溶解於水性媒質進行回復而使用。
本發明之一實施形態中的hNAGLU變異體,可進行與抗體之結合。例如,本發明之一實施形態中的hNAGLU變異體,可作成與可和腦血管內皮細胞上的受體特異性地結合之抗體的結合物。可藉由作成與可和腦血管內皮細胞上的受體特異性地結合之抗體的結合物,而以hNAGLU變異體通過血腦障壁(BBB),使其能夠於中樞神經系統(CNS)中發揮功能。就該種腦血管內皮細胞上的受體而言,可舉出例如胰島素受體、運鐵蛋白受體、瘦素受體、脂蛋白受體、及IGF受體等,但不受限於此等。又,該受體係較佳為源自人類的受體。
於本發明中,「抗體」一詞主要指人類抗體、小鼠抗體、人類化抗體、駱駝科動物(包含羊駝)之抗體、人類抗體與其他哺乳動物之抗體的嵌合抗體、及小鼠抗體與其他哺乳動物之抗體的嵌合抗體,但只要是具有會與特定抗原特異性地結合之性質者,則並不限定於此等,又,對於抗體之動物種,亦無特別限制。
於本發明中,「人類抗體」一詞係指,其蛋白質整體由源自人類的基因所編碼的抗體。但是,由以使基因的表現效率上升等目的而不對原胺基酸序列造成變化地對原人類之基因施加變異而成之基因所編碼的抗體,亦包含在「人類抗體」中。又,組合編碼人類抗體之2個以上的基因,將某人類抗體的一部分以其他人類抗體的一部分取代而製作的抗體,亦為「人類抗體」。人類抗體具有輕鏈之3處的互補性決定區(CDR)、與重鏈之3處的互補性決定區(CDR)。輕鏈之3處的CDR從在N末端側者依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。重鏈之3處的CDR亦從在N末端側者依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。藉由將某人類抗體的CDR以其他人類抗體的CDR取代而改變了人類抗體之抗原特異性、親和性等的抗體,亦包含在人類抗體中。
於本發明中,藉由改變原人類抗體之基因而對原抗體的胺基酸序列施加取代、缺失、附加等變異而成之抗體,亦包含在「人類抗體」中。將原抗體的胺基酸序列中的胺基酸以其他胺基酸取代之情形,進行取代之胺基酸的個數較佳為1~20個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個。使原抗體的胺基酸序列中的胺基酸缺失之情形,缺失之胺基酸的個數較佳為1~20個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個。又,施加組合此等胺基酸之取代與缺失的變異而成之抗體,亦為人類抗體。附加胺基酸之情形,對原抗體的胺基酸序列中或是N末端或C末端,較佳為附加胺基酸1~20個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個。施加組合此等胺基酸之附加、取代及缺失的變異而成之抗體,亦為人類抗體。施加變異而成之抗體的胺基酸序列係與原抗體的胺基酸序列較佳為顯示80%以上之同一性,更佳為顯示90%以上之同一性,進一步較佳為顯示95%以上之同一性,進一步更佳為顯示98%以上之同一性。對人類抗體施加上述變異之情形,該變異可施加於抗體的可變區。對抗體的可變區施加上述變異之情形,該變異可施加於可變區的CDR與框架區之任一者,但尤其可施加於框架區。即,於本發明中稱為「源自人類的基因」之時,於源自人類的原基因以外,亦包含藉由對其施加改變而得之基因。
於本發明中,「人類化抗體」一詞係指可變區的一部分(例如,尤其是CDR的全部或一部分)的胺基酸序列為源自人類以外的哺乳動物,且其以外的區域為源自人類之抗體。例如,作為人類化抗體,可舉出藉由將構成人類抗體之輕鏈之3處的互補性決定區(CDR)與重鏈之3處的互補性決定區(CDR),以其他哺乳動物的CDR取代所製作之抗體。成為要移植在人類抗體之適當位置的CDR之來源的其他哺乳動物之生物種,只要是人類以外的哺乳動物,則無特別限定,但較佳為小鼠、大鼠、兔、馬、或人類以外的靈長類,更佳為小鼠及大鼠,進一步較佳為小鼠。又,對原人類化抗體的胺基酸序列施加與上述可對人類抗體施加的變異同樣的變異而成之抗體,亦包含在「人類化抗體」中。
於本發明中,「嵌合抗體」一詞係指源自2個以上不同種的2個以上不同抗體的片段經連結而成之抗體。
所謂人類抗體與其他哺乳動物之抗體的嵌合抗體,係人類抗體的一部分經以人類以外的哺乳動物之抗體的一部分取代而成的抗體。抗體係由以下所說明之Fc區、Fab區及鉸鏈區(hinge region)構成。作為這種嵌合抗體的具體例,可舉出Fc區源自人類抗體但Fab區源自其他哺乳動物之抗體的嵌合抗體。鉸鏈區係源自人類抗體或其他哺乳動物之抗體的任一者。反之,可舉出Fc區源自其他哺乳動物但Fab區源自人類抗體的嵌合抗體。鉸鏈區係源自人類抗體或其他哺乳動物之抗體的任一者。
又,抗體亦可為由可變區與恆定區所構成。作為嵌合抗體之其他具體例,重鏈之恆定區(C
H)與輕鏈之恆定區(C
L)源自人類抗體但重鏈之可變區(V
H)及輕鏈之可變區(V
L)源自其他哺乳動物之抗體者,反之,亦可舉出重鏈之恆定區(C
H)與輕鏈之恆定區(C
L)源自其他哺乳動物之抗體但重鏈之可變區(V
H)及輕鏈之可變區(V
L)源自人類抗體者。此處,其他哺乳動物之生物種,只要是人類以外的哺乳動物,則無特別限定,但較佳為小鼠、大鼠、兔、馬,或人類以外的靈長類,例如小鼠。
本發明之一實施形態中的抗體,係具有由2條免疫球蛋白輕鏈(或僅稱「輕鏈」)與2條免疫球蛋白重鏈(或僅稱「重鏈」)之合計4條多肽鏈構成的基本結構。但是,於本發明中,稱為「抗體」之時,於具有此基本結構者以外,下述(1)~(6)亦包含在本發明中之「抗體」中:
(1)由1條輕鏈與1條重鏈之合計2條多肽鏈所構成者;
(2)由Fab區所構成者及由Fab區與鉸鏈區的全部或是一部分所構成者,其係自原本意義上之抗體的基本結構缺失了Fc區者(包含Fab、F(ab’)及F(ab’)
2);
(3)於輕鏈之C末端側結合連接子序列,而且進一步於其C末端側結合重鏈而成的單鏈抗體;
(4)於重鏈之C末端側結合連接子序列,而且進一步於其C末端側結合輕鏈而成的單鏈抗體;
(5)由Fc區所構成者,其係自原本意義上之抗體的基本結構缺失了Fab區者,且該Fc區的胺基酸序列經改變成為具有會與特定抗原特異性地結合之性質者(Fc抗體);
(6)後述之單域抗體。
本發明之一實施形態中的抗體為駱駝科動物(包含羊駝)之抗體。駱駝科動物之抗體中,係有由藉由雙硫鍵所連結的2條重鏈所構成者。將由此2條重鏈構成的抗體稱為重鏈抗體。VHH係由包含構成重鏈抗體的重鏈之可變區的1條重鏈所構成的抗體、或由欠缺構成重鏈抗體的恆定區(CH)的1條重鏈所構成的抗體。VHH亦為本發明之實施形態中的抗體之一。此外,由藉由雙硫鍵所連結的2條輕鏈所構成的抗體亦為本發明之實施形態中的抗體之一。將由此2條輕鏈所構成的抗體稱為輕鏈抗體。為了減少對人類投予駱駝科動物之抗體之時的抗原性而對駱駝科動物之抗體的胺基酸序列施加變異而成者,亦為本發明之一實施形態中的抗體。對駱駝科動物之抗體的胺基酸施加變異之情形,可施加與本說明書所記載之可對抗體施加的變異同樣的變異。
本發明之一實施形態中的抗體為鯊魚之抗體。鯊魚之抗體係由藉由雙硫鍵所連結的2條重鏈構成。將由此2條重鏈所構成的抗體稱為重鏈抗體。VNAR係由包含構成重鏈抗體的重鏈之可變區的1條重鏈所構成的抗體、或由欠缺構成重鏈抗體的恆定區(CH)的1條重鏈所構成的抗體。VNAR亦為本發明之實施形態中的抗體之一。為了減少對人類投予鯊魚之抗體之時的抗原性而對鯊魚之抗體的胺基酸序列施加變異而成者,亦為本發明之一實施形態中的抗體。對鯊魚之抗體的胺基酸施加變異之情形,可施加與本說明書所記載之可對人類抗體施加的變異同樣的變異。將鯊魚之抗體進行人類化而成者,亦為本發明之實施形態中的抗體之一。
具有由2條輕鏈與2條重鏈之合計4條多肽鏈構成的基本結構之抗體,係具有於輕鏈之可變區(V
L)之3處的互補性決定區(CDR)、與於重鏈之可變區(V
H)之3處的互補性決定區(CDR)。輕鏈之3處的CDR從在N末端側者依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。重鏈之3處的CDR亦從在N末端側者依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。但是,即使是此等CDR的一部分或全部為不完全、或不存在者,只要是具有會與特定抗原特異性地結合之性質者,則包含在抗體中。輕鏈及重鏈之可變區(V
L及V
H)的CDR以外的區域,係稱為框架區(FR)。FR從在N末端側者依序稱為FR1、FR2、FR3及FR4。通常,CDR與FR從N末端側依序以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的順序存在。
於本發明之一實施形態中,對原抗體的胺基酸序列施加取代、缺失、附加等之變異而成的抗體,亦包含在抗體中。將原抗體的胺基酸序列中的胺基酸以其他胺基酸取代之情形,進行取代之胺基酸的個數較佳為1~20個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個。使原抗體的胺基酸序列中的胺基酸缺失之情形,缺失之胺基酸的個數較佳為1~20個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個。又,施加組合此等胺基酸之取代與缺失的變異而成者,亦為抗體。附加胺基酸之情形,對原抗體的胺基酸序列中或是N末端或C末端,較佳為附加胺基酸1~20個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個。施加組合此等胺基酸之附加、取代及缺失的變異而成者,亦為抗體。施加變異而成之抗體的胺基酸序列係與原抗體的胺基酸序列較佳為顯示80%以上之同一性,更佳為顯示85%以上之同一性,進一步較佳為顯示90%以上、95%以上、或98%以上之同一性。
於本發明之一實施形態中,對原抗體之可變區的胺基酸序列施加取代、缺失、附加等之變異而成的抗體,亦包含在抗體中。將原抗體的胺基酸序列中的胺基酸以其他胺基酸取代之情形,進行取代之胺基酸的個數較佳為1~10個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個。使原抗體的胺基酸序列中的胺基酸缺失之情形,缺失之胺基酸的個數較佳為1~10個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個。又,施加組合此等胺基酸之取代與缺失的變異而成者,亦為抗體。附加胺基酸之情形,對原抗體的胺基酸序列中或是N末端或C末端,較佳為附加胺基酸1~10個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個。施加組合此等胺基酸之附加、取代及缺失的變異而成者,亦為抗體。施加變異而成之抗體的胺基酸序列係與原抗體的胺基酸序列較佳為顯示80%以上之同一性,更佳為顯示85%以上之同一性,進一步較佳為顯示90%以上,95%以上,或98%以上之同一性。對抗體的可變區施加變異之情形,該變異可施加於可變區的CDR與框架區之任一者,但尤其可施加於框架區。
於本發明之一實施形態中,於原抗體之可變區的框架區對胺基酸序列施加取代、缺失、附加等之變異而成的抗體,亦包含在抗體中。將原抗體的胺基酸序列中的胺基酸以其他胺基酸取代之情形,進行取代之胺基酸的個數較佳為1~10個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個。使原抗體的胺基酸序列中的胺基酸缺失之情形,缺失之胺基酸的個數較佳為1~10個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個。又,施加組合此等胺基酸之取代與缺失的變異而成者,亦為抗體。附加胺基酸之情形,對原抗體的胺基酸序列中或是N末端或C末端,較佳為附加胺基酸1~10個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個。施加組合此等胺基酸之附加、取代及缺失的變異而成者,亦為抗體。施加變異而成之抗體的胺基酸序列係與原抗體的胺基酸序列較佳為顯示80%以上之同一性,更佳為顯示85%以上之同一性,進一步較佳為顯示90%以上、95%以上、或98%以上之同一性。
於本發明之一實施形態中,於原抗體之可變區的CDR區對胺基酸序列施加取代、缺失、附加等之變異而成的抗體,亦包含在抗體中。將原抗體的胺基酸序列中的胺基酸以其他胺基酸取代之情形,進行取代之胺基酸的個數較佳為1~5個,更佳為1~3個,進一步較佳為1或2個。使原抗體的胺基酸序列中的胺基酸缺失之情形,缺失之胺基酸的個數較佳為1~5個,更佳為1~3個,進一步較佳為1或2個。又,施加組合此等胺基酸之取代與缺失的變異而成者,亦為抗體。附加胺基酸之情形,對原抗體的胺基酸序列中或是N末端或C末端,較佳為附加胺基酸1~5個、更佳為1~3個,進一步較佳為1或2個胺基酸。施加組合此等胺基酸之附加、取代及缺失的變異而成者,亦為抗體。施加變異而成之抗體的胺基酸序列係與原抗體的胺基酸序列較佳為顯示80%以上之同一性,更佳為顯示85%以上之同一性,進一步較佳為顯示90%以上、95%以上、或98%以上之同一性。
原抗體的胺基酸序列與施加變異而成之抗體的胺基酸序列之同一性,可使用習知的同一性計算演算法而輕易地算出。例如,作為該種演算法而有:BLAST(Altschul SF. J Mol .Biol. 215. 403-10, (1990));Pearson及Lipman的類似性檢索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988));Smith及Waterman的局部同一性演算法(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等。
於本發明之一實施形態中,所謂Fab係指包含可變區與C
L區(輕鏈之恆定區)的1條輕鏈、及包含可變區與C
H1區(重鏈之恆定區的部分1)的1條重鏈,以各自中存在的半胱胺酸殘基彼此藉由雙硫鍵而結合的分子。於Fab中,重鏈係於可變區與C
H1區(重鏈之恆定區的部分1)以外,亦可進一步包含鉸鏈區的一部分,但此情形之鉸鏈區係欠缺存在於鉸鏈區而結合抗體之重鏈彼此的半胱胺酸殘基者。於Fab中,輕鏈與重鏈係藉由在存在輕鏈之恆定區(C
L區)的半胱胺酸殘基、與存在於重鏈之恆定區(C
H1區)或鉸鏈區的半胱胺酸殘基之間所形成的雙硫鍵而結合。將形成Fab的重鏈稱為Fab重鏈。Fab由於欠缺存在於鉸鏈區而結合抗體之重鏈彼此的半胱胺酸殘基,所以由1條輕鏈與1條重鏈構成。構成Fab的輕鏈包含可變區與C
L區。構成Fab的重鏈可為由可變區與C
H1區所構成者,亦可為於可變區、C
H1區以外包含鉸鏈區的一部分者。但是,此情形,係以在鉸鏈區在2條重鏈之間不形成雙硫鍵的方式,選擇鉸鏈區,使其不含結合重鏈間之半胱胺酸殘基。於F(ab’)中,其重鏈係於可變區與C
H1區以外,包含含結合重鏈彼此之半胱胺酸殘基的鉸鏈區的全部或一部分。F(ab’)
2係指2個F(ab’)以互相的鉸鏈區中存在的半胱胺酸殘基彼此藉由雙硫鍵而結合的分子。將形成F(ab’)或F(ab’)
2的重鏈稱為Fab’重鏈。又,複數抗體直接或透過連接子結合而成的二聚體、三聚體等聚合物,亦為抗體。進而,不限於此等,包含抗體分子的一部分,且具有會特異性地與抗原結合之性質者,任一者都包含在本發明中所謂的「抗體」中。即,於本發明中稱為輕鏈之時,係包含源自輕鏈,且具有其可變區的全部或一部分的胺基酸序列者。又,稱為重鏈之時,係包含源自重鏈,且具有其可變區的全部或一部分的胺基酸序列者。所以,只要是具有可變區的全部或一部分的胺基酸序列,則例如Fc區缺失者亦為重鏈。
又,此處所謂Fc或Fc區係指抗體分子中之包含由C
H2區(重鏈之恆定區的部分2)、及C
H3區(重鏈之恆定區的部分3)所構成的片段之區域。
再者,本發明之一實施形態中的抗體亦包含:
(7)使構成上述(2)所示Fab、F(ab’)或F(ab’)
2之輕鏈與重鏈透過連接子序列結合而分別作成單鏈抗體的scFab、scF(ab’)、及scF(ab’)
2。此處,就scFab、scF(ab’)、及scF(ab’)
2而言,可為於輕鏈之C末端側結合連接子序列,而且進一步於其C末端側結合重鏈而成者,又,亦可為於重鏈之C末端側結合連接子序列,而且進一步於其C末端側結合輕鏈而成者。再者,使輕鏈之可變區與重鏈之可變區透過連接子序列結合而作成單鏈抗體的scFv,亦包含在本發明中之抗體中。就scFv而言,可為於輕鏈之可變區的C末端側結合連接子序列,而且進一步於其C末端側結合重鏈之可變區而成者,又,亦可為於重鏈之可變區的C末端側結合連接子序列,而且進一步於其C末端側結合輕鏈之可變區而成者。
再者,本說明書中所謂的「抗體」中,於全長抗體、上述(1)~(7)所示者以外,亦包含為包含(1)~(7)之更廣泛的概念之全長抗體的一部分缺損者,即抗原結合性片段(抗體片段)的任一形態。抗原結合性片段中,亦包含重鏈抗體、輕鏈抗體、VHH、VNAR、及此等之一部分缺損者。
「抗原結合性片段」一詞係指保持與抗原之特異的結合活性之至少一部分的抗體之片段。就結合性片段之例而言,包含Fab、Fab’、F(ab’)
2、可變區(Fv)、以適當連接子使重鏈可變區(V
H)與輕鏈可變區(V
L)連結而成之單鏈抗體(scFv)、為包含重鏈可變區(V
H)與輕鏈可變區(V
L)之多肽之二聚體的雙鏈抗體(diabody)、為恆定區的一部分(C
H3)結合於scFv的重鏈(H鏈)而成者之二聚體的微抗體(minibody)、其他低分子化抗體等。但是,只要是具有與抗原之結合能力,則並不限定於此等之分子。
於本發明之一實施形態中,稱為「單鏈抗體」之時係指連接子序列結合於包含輕鏈之可變區的全部或一部分之胺基酸序列的C末端側,且包含重鏈之可變區的全部或一部分之胺基酸序列進一步結合於其C末端側而成,可與特定抗原特異性地結合之蛋白質。又,連接子序列結合於包含重鏈之可變區的全部或一部分之胺基酸序列的C末端側,且包含輕鏈之可變區的全部或一部分之胺基酸序列進一步結合於其C末端側而成,可與特定抗原特異性地結合之蛋白質,亦為本發明中之「單鏈抗體」。就於重鏈之C末端側透過連接子序列結合輕鏈而成的單鏈抗體而言,通常,重鏈係Fc區缺失。輕鏈之可變區具有3個與抗體之抗原特異性相關的互補性決定區(CDR)。同樣地,重鏈之可變區亦具有3個CDR。此等之CDR係決定抗體之抗原特異性的主要區域。所以,單鏈抗體中較佳為包含重鏈的3個CDR全部、與輕鏈的3個CDR全部。但是,只要是維持住抗體之抗原特異性的親和性,則亦可作成使1個或複數個CDR缺失而成的單鏈抗體。
於單鏈抗體中,被配置於抗體之輕鏈與重鏈之間的連接子序列,係較佳為由2~50個、更佳為由8~50個、進一步較佳為由10~30個、進一步更佳為由12~18個或15~25個胺基酸殘基所構成之肽鏈,例如由15個或是25個胺基酸殘基所構成之肽鏈。該種連接子序列只要是藉其而兩鏈連結而成的抗hTfR抗體保持對hTfR的親和性,則對其胺基酸序列並無限定,但較佳為僅由甘胺酸或由甘胺酸與絲胺酸所構成者,例如,胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號5)、或包含此等胺基酸序列重覆2~10次、或是2~5次之序列者。例如,於由重鏈之可變區的全區域構成之胺基酸序列的C末端側,透過連接子序列結合輕鏈之可變區之情形,特佳為包含相當於3個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)連續而成者之合計15個胺基酸的連接子序列。
於本發明之一實施形態中,所謂單域抗體係指,在單一可變區具有與抗原特異性地結合之性質的抗體。單域抗體中包含:可變區僅由重鏈之可變區所構成的抗體(重鏈單域抗體)、可變區僅由輕鏈之可變區所構成的抗體(輕鏈單域抗體)。VHH、VNAR為單域抗體的一種。
於本發明之一實施形態中,「人類運鐵蛋白受體」一詞係指具有序列識別號57所示胺基酸序列的膜蛋白質。本發明之抗體於其一實施樣態中,係對於從自序列識別號57所示胺基酸序列中N末端側起第89個的半胱胺酸殘基至C末端的***酸為止之部分(運鐵蛋白受體的細胞外域)特異性地結合者,但不限定於此。
就抗期望之蛋白質之抗體的製作方法而言,一般的方法為:使用經導入已併入編碼該蛋白質之基因的表現載體之細胞,製作重組蛋白質,且使用此重組蛋白質而使小鼠等之動物進行免疫而獲得。可藉由從免疫後的動物取出產生抗重組蛋白質之抗體的細胞,使其與骨髓瘤細胞融合,而製作具有抗重組蛋白質之抗體之產生能力的融合瘤細胞。
又,藉由使從小鼠等之動物獲得的免疫系統細胞利用體外免疫法而以期望之蛋白質進行免疫,亦可取得產生抗該蛋白質之抗體的細胞。使用體外免疫法之情形,對於該免疫系統細胞之來源的動物種並無特別限定,但較佳為小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、犬、貓、馬、及包含人類之靈長類,更佳為小鼠、大鼠及人類,進一步較佳為小鼠及人類。就小鼠的免疫系統細胞而言,例如可使用由小鼠之脾臟調製成的脾細胞。就人類的免疫系統細胞而言,可使用由人類之末梢血液、骨髓、脾臟等調製成的細胞。使人類的免疫系統細胞藉由體外免疫法而進行免疫之情形,可得到抗重組蛋白質之人類抗體。
藉由體外免疫法而使免疫系統細胞進行免疫之後,可藉由使細胞與骨髓瘤細胞融合,而製作具有抗體產生能力的融合瘤細胞。又,亦可從免疫後的細胞萃取mRNA而合成cDNA,以此cDNA為模板而藉由PCR反應將包含編碼免疫球蛋白之輕鏈及重鏈之基因的DNA片段增幅,且使用此等而人為地再建構抗體基因。
藉由上述方法所得到之狀態的融合瘤細胞中,亦包含會產生辨識目標外的蛋白質作為抗原之抗體的細胞。又,並不一定會產生抗期望之蛋白質之抗體的融合瘤細胞全部都會產生顯示對於該蛋白質具有高親和性等之期望之特性的抗體。
同樣地,經人為地再建構之抗體基因中,亦包含辨識目標外的蛋白質作為抗原之抗體的基因。又,並不一定編碼抗期望之蛋白質之抗體的基因全部都是編碼顯示對於該蛋白質具有高親和性等之期望之特性的抗體者。
所以,從上述所得到之狀態的融合瘤細胞,選擇會產生具有期望之特性的抗體之融合瘤細胞的步驟為必要的。又,就經人為地再建構之抗體基因而言,從該抗體基因,選擇編碼具有期望之特性的抗體之基因的步驟為必要的。例如,作為選擇會產生對於期望之蛋白質顯示高親和性的抗體(高親和性抗體)之融合瘤細胞、或編碼高親和性抗體之基因的方法,以下所詳述之方法係有效。
例如,選擇會產生對於期望之蛋白質為高親和性的抗體之融合瘤細胞之情形,使用下述方法:將該蛋白質添加至盤(plate)中而使其保持於盤中之後,添加融合瘤細胞的培養上清液,接著從盤中除去未與該蛋白質結合的抗體,且測定盤中所保持的抗體量。若藉由此方法,則添加至盤中之融合瘤細胞的培養上清液中所含的抗體對該蛋白質之親和性越高,則盤中會保持的抗體量越多。所以,可測定盤中所保持的抗體量,且選擇保持有更多的抗體之盤所對應的融合瘤細胞,作為會產生對於該蛋白質具有相對高的親和性之抗體的細胞株。亦可藉由從如此地進行所選出的細胞株萃取mRNA而合成cDNA,以此cDNA為模板,使用PCR法將包含編碼抗該蛋白質之抗體之基因的DNA片段增幅,而將編碼高親和性抗體之基因分離。
從上述經人為地再建構之抗體基因,選擇編碼具有高親和性的抗目標之蛋白質的抗體之基因之情形,係一旦將經人為地再建構之抗體基因併入表現載體,且將此表現載體導入宿主細胞。此時,就作為宿主細胞而使用的細胞而言,若為可藉由導入經併入經人為地再建構之抗體基因的表現載體而使抗體基因表現之細胞,則不論原核細胞、真核細胞而無特別限定,但較佳為源自人類、小鼠、中國倉鼠等哺乳動物的細胞,特佳為源自中國倉鼠卵巢的CHO細胞、或源自小鼠骨髓瘤的NS/0細胞。又,為了將編碼抗體基因之基因併入且使其表現而使用的表現載體,若為於導入哺乳動物細胞內時使該基因表現者,則可無特別限定地使用。被併入表現載體的該基因,被配置於可在哺乳動物細胞內調節基因轉錄之頻度的DNA序列(基因表現調控區)之下游。就可於本發明中使用的基因表現調控區而言,可舉出例如:源自巨細胞病毒的啟動子、SV40早期啟動子、人類延伸因子-1α(EF-1α)啟動子、人類泛蛋白C啟動子等。
這種經導入表現載體的哺乳動物細胞,會表現被併入表現載體的上述經人為地再建構之抗體。從如此地進行所得之會表現經人為地再建構之抗體的細胞,選擇產生對於抗期望之蛋白質之抗體具有高親和性的抗體之細胞的情形,使用下述方法:將該蛋白質添加於盤中而使其保持於盤中之後,使該蛋白質接觸細胞的培養上清液,接著,從盤中除去未與該蛋白質結合的抗體,且測定盤中所保持的抗體量。若藉由此方法,則細胞的培養上清液中所含的抗體對該蛋白質之親和性越高,則盤中所保持的抗體量越多。所以,可測定盤中所保持的抗體量,且選擇保持有更多的抗體之盤所對應的細胞,作為會產生對於該蛋白質具有相對高的親和性之抗體的細胞株,還能夠選擇編碼對於該蛋白質具有高親和性的抗體之基因。亦可從如此地進行所選出的細胞株,藉由使用PCR法將包含編碼抗該蛋白質之抗體之基因的DNA片段增幅,而將編碼高親和性抗體之基因分離。
就製造本發明中之hNAGLU變異體、與抗體的結合物之方法而言,有透過非肽連接子或肽連接子使其結合之方法。就非肽連接子而言,可使用聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣類、類糊精、聚乙烯醚、生物分解性高分子、脂質聚合物、幾丁質類、及玻尿酸、或此等之衍生物、或是組合此等者。肽連接子係由經肽鍵結之1~50個胺基酸所構成之肽鏈或是其衍生物,係藉由其N末端與C末端分別與hNAGLU變異體或抗體之任一者形成共價鍵,而使hNAGLU變異體與抗體結合者。
抗體與hNAGLU變異體,亦可於抗體之重鏈或輕鏈的C末端側或N末端側,透過連接子序列或直接地,藉由肽鍵結而分別使hNAGLU變異體的N末端或C末端結合。如此地使抗體與hNAGLU變異體結合而成的結合物,係可藉由下述方法而作為融合蛋白質來獲得:將於編碼抗體之重鏈或輕鏈之cDNA的3’末端側或5’末端側直接或夾著編碼連接子序列之DNA片段而編碼hNAGLU變異體之cDNA被配置在讀碼框(in-frame)的DNA片段,併入哺乳動物細胞用的表現載體,且培養經導入此表現載體之哺乳動物細胞。對於此哺乳動物細胞,就使編碼hNAGLU變異體之DNA片段與重鏈結合之情形而言,經併入編碼抗體之輕鏈之cDNA片段的哺乳動物細胞用的表現載體亦可被導入相同宿主細胞,又,就使編碼hNAGLU變異體之DNA片段與輕鏈結合之情形而言,經併入編碼抗體之重鏈之cDNA片段的哺乳動物細胞用的表現載體亦可被導入相同宿主細胞。抗體為單鏈抗體之情形,使抗體與hNAGLU變異體結合而成的融合蛋白質,係可藉由下述方法而獲得:將於編碼hNAGLU變異體之cDNA的5’末端側或3’末端側直接或夾著編碼連接子序列之DNA片段而連結有編碼單鏈抗體之cDNA的DNA片段併入(哺乳動物細胞、酵母等真核生物或大腸菌等原核生物細胞用的)表現載體,且在經導入此表現載體之此等細胞中使其表現。抗體與hNAGLU變異體之融合蛋白質,係可藉由上述手法而作為重組蛋白質來製造。
就用以培養經導入表現載體之哺乳動物細胞的培養基而言,若為可培養哺乳動物細胞而使其增殖者,則可無特別限定地使用,但較佳為使用無血清培養基。於本發明中,就作為重組蛋白質生產用培養基所使用的無血清培養基而言,例如可特別合適地使用含有3~700mg/L胺基酸、0.001~50mg/L維生素類、0.3~10g/L單醣類、0.1~10000mg/L無機鹽、0.001~0.1mg/L微量元素、0.1~50mg/L核苷、0.001~10mg/L脂肪酸、0.01~1mg/L生物素、0.1~20μg/L氫皮質酮、0.1~20mg/L胰島素、0.1~10mg/L維生素B12、0.01~1mg/L腐胺、10~500mg/L丙酮酸鈉、及水溶性鐵化合物的培養基。亦可依期望而於培養基添加胸腺嘧啶、次黃嘌呤、慣用的pH指示劑及抗生物質等。
就作為抗體與hNAGLU變異體之融合蛋白質的生產用培養基所使用的無血清培養基而言,可使用DMEM/F12培養基(DMEM與F12的混合培養基)作為基本培養基,此等各培養基對本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言為習知。進而還可使用DMEM(HG)HAM改良型(R5)培養基作為無血清培養基,其係包含碳酸氫鈉、L-麩醯胺酸、D-葡萄糖、胰島素、亞硒酸鈉、二胺丁烷、氫皮質酮、硫酸鐵(II)、天冬醯胺酸、天冬胺酸、絲胺酸及聚乙烯醇的培養基。進而亦可使用市售的無血清培養基,例如CD OptiCHO
TM培養基、CHO-S-SFM II培養基或CD CHO培養基(Thermo Fisher Scientific公司,原Life Technologies公司)、IS cho-V
TM培養基(Irvine Scientific公司)、EX-CELL
TM302培養基或EX-CELL
TM325-PF培養基(SAFC Biosciences公司)等作為基本培養基。
作為抗體與hNAGLU變異體之融合蛋白質之較佳的實施形態,可舉出以下的(1)~(7)。亦即:
(1)包含於抗體之重鏈的C末端直接或透過連接子而結合有hNAGLU變異體之結合物、與抗體之輕鏈者;
(2)包含於抗體之重鏈的N末端直接或透過連接子而結合有hNAGLU變異體之結合物、與抗體之輕鏈者;
(3)包含於抗體之輕鏈的C末端直接或透過連接子而結合有hNAGLU變異體之結合物、與抗體之重鏈者;
(4)包含於抗體之輕鏈的N末端透過直接或連接子而結合有hNAGLU變異體之結合物、與抗體之重鏈者。
使抗體與hNAGLU變異體透過連接子序列而結合之情形,被配置於抗體與hNAGLU變異體之間的連接子序列,係較佳為由1~60個或1~50個、更佳為由1~17個、進一步較佳為由1~10個、進一步更佳為由1~5個胺基酸所構成之肽鏈,但構成連接子序列之胺基酸的個數,係可適宜調整為1個、2個、3個、1~17個、1~10個、10~40個、20~34個、23~31個、25~29個、27個等。該種連接子序列,係只要是藉此所連結的抗體保持與腦血管內皮細胞上的受體之親和性,且藉由該連接子序列所連結的hNAGLU變異體在生理條件下可發揮該hNAGLU變異體的生理活性,則對其胺基酸序列並無限定,但較佳為由甘胺酸與絲胺酸所構成者。可舉出例如,由甘胺酸或絲胺酸中任1個胺基酸所構成者、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號58)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號59)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號60)、或包含此等胺基酸序列1~10個、或是2~5個連續而成的序列者。係具有由1~50個胺基酸構成的序列、由2~17個、2~10個、10~40個、20~34個、23~31個、25~29個、或27個胺基酸構成的序列等者。例如,包含胺基酸序列Gly-Ser者,係可合適地使用作為連接子序列。又,包含接續著胺基酸序列Gly-Ser而有5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號58)連續而成的合計27個胺基酸序列者,係可合適地使用作為連接子序列。再者,包含5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號58)連續而成的合計25個胺基酸序列者,亦可合適地使用作為連接子序列。
再者,於本發明中,1個肽鏈中包含複數連接子序列之情形,在方便上,各連接子序列係從N末端側依序命名為第1連接子序列、第2連接子序列。
作為應與本發明之hNAGLU變異體結合之抗體的具體例,可舉出以下的抗人類運鐵蛋白受體抗體(抗hTfR抗體)。亦即,
(1)一種抗hTfR抗體,係該抗體之輕鏈包含序列識別號61之胺基酸序列而成,且重鏈包含序列識別號62之胺基酸序列而成之抗體;及
(2)一種抗hTfR抗體,且為Fab抗體,係該抗體之輕鏈包含序列識別號61之胺基酸序列而成,且重鏈包含序列識別號63之胺基酸序列而成之抗體。但是,不受限於此等,對於上述胺基酸序列,亦可適宜施加取代、缺失、附加等之變異。再者,上述(1)及(2)的抗hTfR抗體,係人類化抗hTfR抗體。
使上述之抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈的胺基酸序列之胺基酸被取代為其他胺基酸之情形,所取代之胺基酸的個數較佳為1~10個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個,進一步更佳為1或2個。使輕鏈的胺基酸序列中的胺基酸缺失之情形,缺失之胺基酸的個數較佳為1~10個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個,進一步更佳為1或2個。又,亦可施加組合此等胺基酸之取代與缺失的變異。
對上述之抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈的胺基酸序列附加胺基酸之情形,對輕鏈的胺基酸序列中或是N末端側或C末端側較佳為有1~10個、更佳為有1~5個、進一步較佳為有1~3個、進一步更佳為有1或2個胺基酸附加。亦可施加組合此等胺基酸之附加、取代及缺失的變異。施加變異而成之輕鏈的胺基酸序列係與原輕鏈的胺基酸序列較佳為具有80%以上之同一性,更佳為顯示90%以上之同一性,進一步較佳為顯示95%以上之同一性。
使上述之抗人類運鐵蛋白受體抗體之重鏈的胺基酸序列之胺基酸被取代為其他胺基酸之情形,所取代之胺基酸的個數較佳為1~10個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個,進一步更佳為1或2個。使重鏈的胺基酸序列中的胺基酸缺失之情形,缺失之胺基酸的個數較佳為1~10個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個,進一步更佳為1或2個。又,亦可施加組合此等胺基酸之取代與缺失的變異。
對上述之抗人類運鐵蛋白受體抗體之重鏈的胺基酸序列附加胺基酸之情形,對重鏈的胺基酸序列中或是N末端側或C末端側較佳為有1~10個、更佳為有1~5個、進一步較佳為有1~3個、進一步更佳為有1或2個胺基酸附加。亦可施加組合此等胺基酸之附加、取代及缺失的變異。施加變異而成之重鏈的胺基酸序列係與原重鏈的胺基酸序列較佳為具有80%以上之同一性,更佳為顯示90%以上之同一性,進一步較佳為顯示95%以上之同一性。
本發明之hNAGLU變異體,由於可藉由使其與抗腦血管內皮細胞上的受體之抗體結合,而使其通過血腦障壁在腦內發揮功能,因此可使用於為了用以治療原因為NAGLU之缺損的中樞神經系統的疾病狀態之血中投予用藥劑的製造。又,已與抗體結合的hNAGLU變異體,係可於包含將原因為NAGLU之缺損的中樞神經系統的疾病狀態之治療上的有效量對符合之患者進行血中投予(包含點滴靜脈注射等之靜脈注射)的治療方法中使用。已與被血中投予之抗體結合的hNAGLU變異體,係除了到達腦內以外,亦可到達會表現NAGLU之其他臟器/器官。又,該藥劑亦可用於為了預防該疾病狀態的發病。
本發明之hNAGLU變異體,可藉由使其與抗腦血管內皮細胞上的受體之抗體結合,而作為應投予至血中而於中樞神經系統(CNS)中發揮藥效的藥劑來使用。該藥劑一般藉由利用點滴靜脈注射等之靜脈注射、皮下注射、肌肉注射而對患者投予,但對於投予途徑並無特別限定。
本發明之一實施形態中的hNAGLU變異體,並不限於與抗體,亦可作成與其他蛋白質的結合物。其他蛋白質並無特別限定,但該蛋白質係例如源自人類的蛋白質。hNAGLU變異體與該其他蛋白質的結合物,係可藉由上述之製造hNAGLU變異體與抗體的結合物之方法而獲得。又,hNAGLU變異體與該其他蛋白質的融合蛋白質,係可藉由上述之製造與抗體的融合蛋白質之方法,而作為重組蛋白質來獲得。本發明之一實施形態中包含:編碼hNAGLU變異體與其他蛋白質的融合蛋白質之基因、經併入該基因之表現載體、及經導入該表現載體之宿主細胞。
本發明之一實施形態中的hNAGLU變異體並不限於抗hTfR抗體,亦可作成與可結合於人類hTfR之物質的結合物。對於該物質並無特別限定,但該蛋白質係例如人類運鐵蛋白。人類運鐵蛋白並不限於野生型者,只要是具有與hTfR之親和性,則亦可為其部分片段、變異體。這種結合物可通過血腦障壁而在腦內發揮功能。hNAGLU變異體與人類運鐵蛋白之融合蛋白質,係可藉由上述之製造與抗體的融合蛋白質之方法,而作為重組蛋白質來獲得。本發明之一實施形態中包含:編碼hNAGLU變異體與人類運鐵蛋白的融合蛋白質之基因,經併入該基因之表現載體,及經導入該表現載體之宿主細胞。
[實施例]
以下,參照實施例而進一步詳細說明本發明,但並無將本發明限定於實施例之意圖。
[實施例1]hNAGLU變異體之表現載體的建構
合成具有包含野生型hNAGLU基因之序列識別號41所示鹼基序列的DNA片段。以此為模板,使用具有序列識別號42所示鹼基序列之附加MluI的5’引子作為順向引子,使用表1所示引子作為逆向引子,而進行表1所示No.1~7及11之PCR。於表1呈示各逆向引子之鹼基序列所對應的序列識別號。
[表1]
表1 用於PCR之引子1 | ||
PCR反應 No. | 逆向引子名 | 序列識別號 (鹼基序列) |
1 | K36E/P37S變異導入3’引子 | 44 |
2 | L44_G45insS變異導入3’引子 | 45 |
3 | R129Q變異導入3’引子 | 46 |
4 | Q209R變異導入3’引子 | 47 |
5 | E228K變異導入3’引子 | 48 |
6 | T240V變異導入3’引子 | 49 |
7 | T320P/E321D變異導入3’引子 | 50 |
11 | H204K變異導入3’引子 | 54 |
接著,以具有序列識別號41所示鹼基序列的DNA片段為模板,使用表1所示No.1~7及11之PCR中所得到的PCR產物作為順向引子,使用具有序列識別號43所示鹼基序列之His標籤-附加NotI的3’引子作為逆向引子,而進行PCR,獲得包含表2所示編碼hNAGLU變異體之基因的PCR產物。於表2呈示各hNAGLU變異體的胺基酸序列所對應的序列識別號、編碼該等之鹼基序列所對應的序列識別號、及各hNAGLU變異體之編號(變異體編號)。
[表2]
表2 PCR產物之名稱1 | ||||
PCR反應 No. | 所編碼之hNAGLU變異體名稱 | 序列識別號 (胺基酸序列) | 序列識別號 (鹼基序列) | 變異體編號 |
1 | K36E/P37S hNAGLU變異體 | 3 | 4 | 1 |
2 | L44_G45insS hNAGLU變異體 | 5 | 6 | 2 |
3 | R129Q hNAGLU變異體 | 7 | 8 | 16 |
4 | Q209R hNAGLU變異體 | 9 | 10 | 3 |
5 | E228K hNAGLU變異體 | 11 | 12 | 4 |
6 | T240V hNAGLU變異體 | 13 | 14 | 17 |
7 | T320P/E321D hNAGLU變異體 | 15 | 16 | 5 |
11 | H204K hNAGLU變異體 | 23 | 24 | 19 |
以具有包含野生型hNAGLU基因之序列識別號41所示鹼基序列的DNA片段為模板,使用表3所示引子作為順向引子,使用具有序列識別號43所示鹼基序列之His標籤-附加NotI的3’引子作為逆向引子,而進行表3所示No.8~10之PCR。於表3呈示各順向引子之鹼基序列所對應的序列識別號。
[表3]
表3 用於PCR之引子2 | ||
PCR反應 No. | 順向引子名 | 序列識別號 (鹼基序列) |
8 | S505A/I506V變異導入5’引子 | 51 |
9 | S526N/A528T變異導入5’引子 | 52 |
10 | D613Q變異導入5’引子 | 53 |
接著,以具有序列識別號41所示鹼基序列的DNA片段為模板,使用具有序列識別號42所示鹼基序列之附加MluI的5’引子作為順向引子,使用表3所示No.8~10之PCR中所得到的PCR產物作為逆向引子,而進行PCR,獲得包含表4所示編碼hNAGLU變異體之基因的PCR產物。於表4呈示各hNAGLU變異體的胺基酸序列所對應的序列識別號、編碼該等之鹼基序列所對應的序列識別號、及各hNAGLU變異體之編號(變異體編號)。
[表4]
表4 PCR產物之名稱2 | ||||
PCR反應 No. | 所編碼之hNAGLU變異體名稱 | 序列識別號 (胺基酸序列) | 序列識別號 (鹼基序列) | 變異體編號 |
8 | S505A/I506V hNAGLU變異體 | 17 | 18 | 6 |
9 | S526N/A528T hNAGLU變異體 | 19 | 20 | 7 |
10 | D613Q hNAGLU變異體 | 21 | 22 | 18 |
接著,將No.1~11之PCR中所得到的PCR產物、及具有編碼野生型hNAGLU之序列識別號41所示鹼基序列的DNA片段,以MluI及NotI(Takara Bio公司)進行限制酵素處理,以瓊脂糖膠體電泳分離。進行EtBr染色之後,於UV照射下切出包含目標之DNA片段的譜帶,使用QIAEX II 膠體萃取套組(QIAGEN公司)而從膠體萃取DNA。同樣地,pCI-neo載體(Promega公司)、pEI-puro載體亦以MluI及NotI進行限制酵素處理,進行膠體萃取、精製。於經以限制酵素進行處理之各載體,分別混合經以限制酵素進行處理之各PCR產物,使用Ligation Mix(Takara Bio公司)於16℃進行30~60分鐘接合反應。關於包含含野生型hNAGLU基因之序列識別號41所示鹼基序列的DNA片段,亦同樣地進行接合反應。
再者,pEI-puro載體以以下的程序來製作。將pEF/myc/nuc載體(Invitrogen公司)以限制酵素(KpnI及NcoI)消化,切出包含EF-1a啟動子及其第一內含子(intron)之DNA片段,將此DNA片段以T4 DNA聚合酶進行平滑末端化處理。另外,將pCI-neo(Invitrogen公司)以限制酵素(BglII及EcoRI)消化,且於切除包含CMV之強化子/啟動子及內含子的區域之後,以T4 DNA聚合酶進行平滑末端化處理。於其中***上述之包含EF-1a啟動子及其第一內含子(intron)的區域(經平滑末端化處理後者)。將其命名為pE-neo載體。將pCAGIpuro載體(Miyahara M. et.al., J. Biol. Chem. 275, 613-618(2000))以限制酵素(NotI及BamHI)消化,切出包含源自小鼠腦心肌炎病毒(EMCV)的內部核糖體進入位點(IRES)、嘌呤黴素抗性基因(Puro
r)及源自牛生長激素(bGH)的多腺苷酸化訊息(polyA)之DNA片段。另外,將pE-neo載體以限制酵素(NotI及BamHI)消化,而切除包含新黴素抗性基因(Neo
r)之約2kbp的區域。於其中***上述之包含IRES、PuroR及源自bGH的polyA之DNA片段。將其命名為pEI-puro載體。
接著,使用各接合反應液而將大腸菌(ECOS
TMX Competent E. coli DH5 α,NIPPON GENE公司)分別轉形。為了確認所得之轉形體是否保持目標之質體DNA,而將單一菌落(single colony)以LB液體培養基(LB Broth,Sigma-Aldrich公司)培養一夜,且使用FastGene Plasmid Mini Kit(Nippon Genetics公司)少量精製。將經精製的質體DNA以MluI及NotI進行限制酵素處理,以瓊脂糖膠體電泳分離,藉此確認目標之嵌入DNA已***。又,藉由桑格(Sanger)序列分析而確認目標之改變已導入各hNAGLU基因。藉由常規方法,而精製已確認併入有目標之hNAGLU變異體或野生型hNAGLU的各質體。
[實施例2]hNAGLU變異體的的暫時性表現
hNAGLU變異體的暫時性表現,係使用實施例1中所得經精製的對pCI-neo載體併入編碼各hNAGLU變異體的基因而成之質體來進行。使用對pCI-neo載體併入編碼野生型NAGLU的基因而成之質體作為對照。
依照ExpiCHO Expression System(Thermo Fisher Scientific公司)的高效價(High titer)步驟準則,使用經併入編碼hNAGLU變異體的基因之質體、及經併入編碼野生型hNAGLU的基因之質體,使ExpiCHO細胞轉形。轉形後,培養細胞8天,使各hNAGLU變異體及野生型hNAGLU於培養上清液中表現。培養後,將培養液離心分離而回收培養上清液。
[實施例3]因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的確認(SDS page電泳)
將實施例2中所得到的培養上清液10 μL與8 μL之2×樣品緩衝液(Sample Buffer)(Bio-Rad公司)及2 μL之2-巰基乙醇混合,於100℃保溫3分鐘,以使其在還原條件下熱變性。於設置在含0.1% SDS之50 mM Tris緩衝液/380 mM甘胺酸緩衝液(pH8.3)內的5~20%聚丙烯醯胺膠體的孔中,加入熱變性後的試料各5 μL,以25 mA定電流進行電泳。將電泳後的膠體浸漬於Oriole Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad公司),在室溫振盪90分鐘。以純水清洗膠體之後,以冷光影像分析儀(Lumino-Image Analyzer)(Amersham Imager 600RGB,Cytiva公司)檢測蛋白質的譜帶。
[實施例4]因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的確認(西方墨點法)
與實施例3中記載的方法同樣地進行電泳,將硝化纖維素膜與電泳後的膠體,以經浸漬含20%甲醇之25 mM Tris緩衝液/192 mM甘胺酸緩衝液的轉漬紙(blotting paper)夾住,在印漬裝置以1.0 A、25 V通電10分鐘,藉以將蛋白質轉印至硝化纖維素膜。將轉印後的硝化纖維素膜浸漬於含5%脫脂粉乳之PBST而振盪1小時之後,浸漬於稀釋成0.4 μg/mL的小鼠組胺酸標籤單株抗體(Mouse anti-His tag mAb)(MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.)溶液而振盪1小時。將膜以PBST清洗後,浸漬於稀釋成0.4 μg/mL的抗小鼠IgG (H+L)-HRP結合物(Anti-mouse IgG (H+L)-HRP Conjugate)(Promega公司)溶液而振盪30分鐘,再度以PBST清洗。於膜的轉印面滴下HRP檢測試劑(Bio-Rad公司),使其反應5分鐘,以冷光影像分析儀檢測相當於各hNAGLU變異體及野生型hNAGLU的譜帶。
[實施例5]因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的確認(酵素活性測定)
調製將實施例2中所得到的培養上清液以含0.1% BSA之100 mM檸檬酸緩衝液(pH4.2)進行10倍稀釋而成者,作為試料溶液。調製將4-MU(4-甲基繖形酮(4- Methylumbelliferone),Sigma-Aldrich公司)以含0.1% BSA之100 mM檸檬酸緩衝液(pH4.2)階段稀釋為400~35.12 μM者,作為標準溶液。調製將為NAGLU之人工基質的4-甲基繖形基-N-乙醯-α-D-葡萄醣胺(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-glucosaminide)(Sigma-Aldrich公司)以含0.1% BSA之100 mM檸檬酸緩衝液(pH4.2)稀釋成1 mmol/L者,作為基質溶液。於微孔盤(microplate)對各孔各添加25 μL之試料溶液或標準溶液,進一步添加25 μL/孔之基質溶液而以盤振盪器攪拌並混合。將盤於37℃保溫1小時之後,對各孔各添加150 μL之200 mmol/L甘胺酸-NaOH緩衝液(pH10.7)而使反應停止。以讀盤儀(Gemini XPS,Molecular Devices公司)測定游離之4-MU(4-甲基繖形酮)的螢光強度(激發波長355 nm,螢光波長460 nm)。根據標準溶液的測定結果作成校正曲線,對其內插各試料溶液的測定值,而求出酵素活性量。
[實施例6]因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的確認(結果)
於圖1,呈示實施例2~4中測定之因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的測定結果。表5係將根據圖1中長條圖所示酵素活性測定結果之各hNAGLU變異體的表現量,以將野生型的表現量當成1之時的相對值來表示者。
[表5]
表5 因暫時性表現所致各hNAGLU變異體的表現 (將野生型hNAGLU的表現量作為1之相對量) | ||
hNAGLU變異體名稱 | 變異體編號 | 表現量 |
野生型hNAGLU | - | 1 |
K36E/P37S hNAGLU變異體 | 1 | 2.5 |
L44_G45insS hNAGLU變異體 | 2 | 3.2 |
R129Q hNAGLU變異體 | 16 | 0.5 |
Q209R hNAGLU變異體 | 3 | 4.4 |
E228K hNAGLU變異體 | 4 | 1.5 |
T240V hNAGLU變異體 | 17 | 0.6 |
T320P/E321D hNAGLU變異體 | 5 | 2.0 |
S505A/I506V hNAGLU變異體 | 6 | 1.5 |
S526N/A528T hNAGLU變異體 | 7 | 1.2 |
D613Q hNAGLU變異體 | 18 | 0.6 |
H204K hNAGLU變異體 | 19 | 0.4 |
K36E/P37S hNAGLU變異體、L44_G45insS hNAGLU變異體、Q209R hNAGLU變異體、E228K hNAGLU變異體、T320P/E321 D hNAGLU變異體、S505A/I506V hNAGLU變異體、S526N/A528 T hNAGLU變異體的7種變異體(變異體編號1~7),係與野生型比較而顯示高的暫時性表現。尤其,Q209R hNAGLU變異體(變異體編號3)係與野生型hNAGLU比較而顯示4.4倍的表現量。另一方面,R129Q hNAGLU變異體(變異體編號16)、S526N/A528T hNAGLU變異體(變異體編號17)、D613Q hNAGLU變異體(變異體編號18)、及H204K hNAGLU變異體(變異體編號19),係與野生型比較而顯示低的暫時性表現。
又,於酵素活性量、與在圖1(a)所示SDS page電泳上所確認之hNAGLU變異體的表現量,係認為有正相關。進一步,於酵素活性量、與在圖1(b)所示西方墨點法所確認之hNAGLU變異體的表現量,亦認為有正相關。
[實施例7]表現hNAGLU變異體之大量細胞的製作
使用基因導入裝置(Super Electroporator NEPA21,Nepa Gene公司),而對CHO-K1細胞的無血清馴化株,分別導入實施例1中所得到的經併入各hNAGLU變異體或編碼野生型hNAGLU的基因之表現質體,且以含10 μg/mL嘌呤黴素(Thermo Fisher Scientific公司)之CD OptiCHO培養基(Thermo Fisher Scientific公司)進行選擇培養。每隔3~4日一邊重覆進行培養基交換一邊依次擴大培養液量,在培養中之細大量細胞的生存率超過90%之時間點回收細胞,將其作為表現hNAGLU變異體之及表現野生型hNAGLU之大量細胞。
[實施例8]表現hNAGLU變異體之大量細胞的培養
將實施例7中所得到的各表現hNAGLU變異體之大量細胞及表現野生型hNAGLU之大量細胞,分別以2×10
5個細胞/mL的細胞密度接種於含10 μg/mL嘌呤黴素之CD OptiCHO培養基,在37°C、5% CO
2存在下靜置培養。從培養開始起9日後,將培養上清液離心分離而回收培養上清液。
[實施例9]利用大量細胞之hNAGLU變異體表現量的確認(酵素活性測定)
調製將實施例8中所得到的培養上清液以含0.1% BSA之檸檬酸緩衝液(pH4.2)進行10倍稀釋而成者,作為試料溶液。調製將為hNAGLU之人工基質的4-甲基繖形基-N-乙醯-α-D-葡萄醣胺以檸檬酸緩衝液(pH4.2)稀釋成1 mmol/L者,作為基質溶液。於微孔盤對各孔各添加25 μL之試料溶液或標準溶液,進一步添加25 μL/孔之基質溶液而以盤振盪器攪拌並混合。將盤於37℃保溫1小時之後,對各孔各添加150 μL 之200 mmol/L甘胺酸-NaOH緩衝液(pH10.7)而使反應停止。以螢光讀盤儀測定游離之4-MU(4-甲基繖形酮)的螢光強度(激發波長355 nm,螢光波長460 nm)。根據標準溶液的測定結果作成校正曲線,對其內插各試料溶液的測定值,而求出酵素活性量。酵素活性量係針對各個hNAGLU變異體,而以於培養中從1×10
6個細胞表現之hNAGLU的酵素活性量(nmol/h/1×10
6個細胞)來求出。
[實施例10]利用大量細胞之hNAGLU變異體表現量的確認(結果)
於圖2,呈示實施例9中測定之利用大量細胞之hNAGLU變異體表現量的測定結果。表6係將根據圖2中長條圖所示酵素活性測定結果之各hNAGLU變異體的表現量,以將野生型的表現量當成1之時的相對值來表示者。再者,大量細胞的培養係重覆進行4次,針對各個而實施酵素活性測定。
[表6]
表6 利用大量細胞之各hNAGLU變異體的表現量 (將野生型hNAGLU的表現量作為1之相對量) | ||
hNAGLU變異體名稱 | 變異體編號 | 表現量平均值 (平均值) |
野生型hNAGLU | - | 1 |
K36E/P37S hNAGLU變異體 | 1 | 1.5 |
L44_G45insS hNAGLU變異體 | 2 | 1.6 |
R129Q hNAGLU變異體 | 16 | 0.9 |
Q209R hNAGLU變異體 | 3 | 2.2 |
E228K hNAGLU變異體 | 4 | 1.1 |
T240V hNAGLU變異體 | 17 | 0.5 |
T320P/E321D hNAGLU變異體 | 5 | 1.4 |
S505A/I506V hNAGLU變異體 | 6 | 1.3 |
S526N/A528T hNAGLU變異體 | 7 | 1.2 |
D613Q hNAGLU變異體 | 18 | 0.9 |
H204K hNAGLU變異體 | 19 | 0.3 |
與暫時性表現之情形同樣地,於大量細胞中,K36E/P37S hNAGLU變異體、L44_G45insS hNAGLU變異體、Q209R hNAGLU變異體、E228K hNAGLU變異體、T320P/E321D hNAGLU變異體、S505A/I506V hNAGLU變異體、S526N/A528T hNAGLU變異體的7種變異體(變異體編號1~7)亦與野生型比較而表現量多。尤其,Q209R hNAGLU變異體(變異體編號3)係與野生型hNAGLU比較而顯示2.2倍的表現量。又,與暫時性表現之情形同樣地,R129Q hNAGLU變異體(變異體編號16)、S526N/A528T hNAGLU變異體(變異體編號17)、D613Q hNAGLU變異體(變異體編號18)、及H204K hNAGLU變異體(變異體編號19)係與野生型比較而表現量少。
[實施例11]對Q209R hNAGLU變異體之變異導入及表現載體的建構
根據實施例1~10的實驗結果,得知在hNAGLU變異體之中,Q209R hNAGLU變異體顯示最高的表現量。於是,為了獲得更高表現hNAGLU變異體,而對Q209R hNAGLU變異體進一步導入變異。以實施例1中所得到的經併入編碼Q209R hNAGLU變異體的基因之質體為模板,使用具有序列識別號42所示鹼基序列之附加MluI 的5’引子作為順向引子,使用表7所示引子作為逆向引子,而進行表7所示No. 12~15之PCR。於表7呈示各逆向引子之鹼基序列所對應的序列識別號。
[表7]
表7 用於PCR之引子3 | ||
PCR反應 No. | 逆向引子名 | 序列識別號 (鹼基序列) |
12 | K36E/P37S變異導入3’引子 | 44 |
13 | L44_G45insS變異導入3’引子 | 45 |
14 | T320P/E321D變異導入3’引子 | 50 |
15 | V54I變異導入3’引子 | 55 |
又,以實施例1中所得到的經併入編碼Q209R hNAGLU變異體的基因之質體為模板,使用表8所示引子作為順向引子,使用具有序列識別號43所示鹼基序列之His標籤-附加NotI的3’引子作為逆向引子,而進行表8所示No. 16之PCR。於表8呈示順向引子之鹼基序列所對應的序列識別號。
[表8]
表8 用於PCR之引子4 | ||
PCR反應 No. | 順向引子名 | 序列識別號 (鹼基序列) |
16 | R620K變異導入5’引子 | 56 |
接著,以實施例1中所得到的經併入編碼Q209R hNAGLU變異體的基因之質體為模板,使用表9所示順向引子與逆向引子,而進行表9所示No.17~26之PCR。
[表9]
表9 用於PCR之引子5 | ||
PCR反應 No. | 順向引子名 | 逆向引子名 |
17 | PCR反應No.12 產物 | His標籤-附加NotI的3’引子 |
18 | PCR反應No.13 產物 | His標籤-附加NotI的3’引子 |
19 | PCR反應No.14 產物 | His標籤-附加NotI的3’引子 |
20 | PCR反應No.12 產物 | L44_G45insS變異導入3’引子 |
21 | PCR反應No.15 產物 | PCR反應No.16 產物 |
22 | PCR反應No.13 產物 | V54I變異導入3’引子 |
23 | PCR反應No.13 產物 | PCR反應No.16 產物 |
24 | PCR反應No.22 產物 | PCR反應No.16 產物 |
25 | PCR反應No.20 產物 | His標籤-附加NotI的3’引子 |
26 | PCR反應No.22 產物 | His標籤-附加NotI的3’引子 |
藉由上述No.17~19、21、及23~26之PCR,而將編碼對Q209R hNAGLU變異體進一步導入1~3個變異而成的表10所示hNAGLU變異體之DNA片段增幅。於表10呈示各hNAGLU變異體的胺基酸序列所對應的序列識別號、編碼該等之鹼基序列所對應的序列識別號、及各hNAGLU變異體之編號(變異體編號)。
[表10]
表10 PCR產物之名稱3 | ||||
PCR反應 No. | 所編碼之hNAGLU變異體名稱 | 序列識別號 (胺基酸序列) | 序列識別號 (鹼基序列) | 變異體編號 |
17 | K36E/P37S/Q209R hNAGLU變異體 | 25 | 26 | 8 |
18 | L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體 | 27 | 28 | 9 |
19 | Q209R/T320P/E321D hNAGLU變異體 | 29 | 30 | 10 |
25 | K36E/P37S/L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體 | 31 | 32 | 11 |
21 | V54I/Q209R/R620K hNAGLU變異體 | 33 | 34 | 12 |
26 | L44_G45insS/V54I/Q209R hNAGLU變異體 | 35 | 36 | 13 |
23 | L44_G45insS/Q209R/R620K hNAGLU變異體 | 37 | 38 | 14 |
24 | L44_G45insS/V54I/Q209R/R620K hNAGLU變異體 | 39 | 40 | 15 |
接著,將No.17~19、21、及23~26之PCR中所得到的各PCR產物,以MluI及NotI(Takara Bio公司)進行限制酵素處理,以瓊脂糖膠體電泳分離。進行EtBr染色之後,於UV照射下切出包含目標之DNA片段的譜帶,使用QIAEX II 膠體萃取套組(QIAGEN公司)而從膠體萃取DNA。同樣地,pCI-neo載體(Promega公司)、pEI-puro載體亦以MluI及NotI進行限制酵素處理,進行膠體萃取、精製。於經以限制酵素進行處理之各載體,分別混合經以限制酵素進行處理之各PCR產物,使用Ligation Mix(Takara Bio公司)於16℃進行30~60分鐘接合反應。
接著,使用各接合反應液而將大腸菌(ECOS
TMX Competent E. coli DH5 α,NIPPON GENE公司)分別轉形。為了確認所得之轉形體是否保持目標之質體DNA,而將單一菌落以LB液體培養基(LB Broth,Sigma-Aldrich公司)培養一夜,且使用FastGene Plasmid Mini Kit(Nippon Genetics公司)少量精製質體DNA。將經精製的質體DNA以MluI及NotI進行限制酵素處理,以瓊脂糖膠體電泳分離,藉此確認目標之嵌入DNA已***。又,藉由桑格序列分析而確認目標之改變已導入各hNAGLU基因。藉由常規方法,而精製已確認併入有目標之hNAGLU變異體的各質體。
[實施例12]hNAGLU變異體的暫時性表現
hNAGLU變異體的暫時性表現,係使用實施例11中經精製的對pCI-neo載體併入hwNAGLU變異體而成之質體來進行。使用對pCI-neo載體併入野生型hNAGLU而成之質體作為對照。
依照ExpiCHO Expression System(Thermo Fisher Scientific公司)的高效價(High titer)步驟準則,使用經併入編碼hNAGLU變異體的基因之質體、及經併入編碼野生型hNAGLU的基因之質體,使ExpiCHO細胞轉形。轉形後,培養細胞8天,使各hNAGLU變異體及野生型hNAGLU於培養上清液中表現。培養後,將培養液離心分離而回收培養上清液。又,同樣地回收未轉形之細胞的培養上清液,作為陰性對照。
[實施例13]因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的確認(SDS page電泳)
將實施例12中所得到的培養上清液10μL與8μL之2×樣品緩衝液及2μL之2-巰基乙醇混合,於100℃保溫3分鐘,以使其在還原條件下熱變性。於設置在含0.1% SDS之50 mM Tris緩衝液/380 mM甘胺酸緩衝液(pH8.3)內的5~20%聚丙烯醯胺膠體之孔中,注入熱變性後的試料各5 μL,以25 mA定電流進行電泳。將電泳後的膠體浸漬於Oriole Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad公司),在室溫振盪90分鐘。以純水清洗膠體之後,以冷光影像分析儀檢測蛋白質的譜帶。
[實施例14]因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的確認(西方墨點法)
與實施例13中記載的方法同樣地進行電泳,將硝化纖維素膜與電泳後的膠體,以經浸漬含20%甲醇之25 mM Tris緩衝液/192 mM甘胺酸緩衝液的轉漬紙夾住,在印漬裝置以1.0 A、25 V通電10分鐘,藉以將蛋白質轉印至硝化纖維素膜。將轉印後的硝化纖維素膜浸漬於含5%脫脂粉乳之PBST而振盪1小時之後,浸漬於稀釋成0.4 μg/mL的小鼠組胺酸標籤單株抗體(Mouse anti-His tag mAb)溶液而振盪1小時。將膜以PBST清洗後,浸漬於稀釋成0.4 μg/mL的抗小鼠IgG (H+L)-HRP結合物(Anti-mouse IgG (H+L)-HRP Conjugate)溶液而振盪30分鐘,再度以PBST清洗。於膜的轉印面滴下HRP檢測試劑,使其反應5分鐘,以冷光影像分析儀進行檢測。
[實施例15]因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的確認(酵素活性測定)
調製將實施例12中所得到的培養上清液以含0.1% BSA之檸檬酸緩衝液(pH4.2)進行10倍稀釋而成者,作為試料溶液。調製將為hNAGLU之人工基質的4-甲基繖形基-N-乙醯-α-D-葡萄醣胺以檸檬酸緩衝液(pH4.2)稀釋成1 mmol/L者,作為基質溶液。於微孔盤添加25 μL/孔之試料溶液或標準溶液,進一步對各孔添加25 μL之基質溶液而以盤振盪器攪拌並混合。將盤於37℃保溫1小時之後,添加150 μL/孔之200 mmol/L 甘胺酸-NaOH緩衝液(pH10.7)而使反應停止。以螢光讀盤儀測定游離之4-MU(4-甲基繖形酮)的螢光強度(激發波長355 nm,螢光波長460 nm)。根據標準溶液的測定結果作成校正曲線,對其內插各試料溶液的測定值,而求出酵素活性量。
[實施例16]因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的確認(結果)
於圖3及圖4,呈示實施例12~15中測定之因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的測定結果。表11係將根據圖3及圖4中長條圖所示酵素活性測定結果之各hNAGLU變異體的表現量,以將野生型的表現量當成1之時的相對值來表示者。
[表11]
表11 因暫時性表現所致各hNAGLU變異體的表現量 (將野生型NAGLU的表現量作為1之相對量) | ||
hNAGLU變異體名稱 | 變異體編號 | 表現量 |
野生型hNAGLU | - | 1 |
Q209R hNAGLU變異體 | 3 | 3.3 |
K36E/P37S/Q209R hNAGLU變異體 | 8 | 3.7 |
L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體 | 9 | 5.4 |
Q209R/T320P/E321D hNAGLU變異體 | 10 | 4.0 |
K36E/P37S/L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體 | 11 | 5.4 |
V54I/Q209R/R620K hNAGLU變異體 | 12 | 5.9 |
L44_G45insS/V54I/Q209R hNAGLU變異體 | 13 | 5.1 |
L44_G45insS/Q209R/R620K hNAGLU變異體 | 14 | 4.2 |
L44_G45insS/V54I/Q209R/R620K hNAGLU變異體 | 15 | 5.6 |
(註) Q209R hNAGLU變異體與K36E/P37S/L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體的表現量 為圖3與圖4所示表現量之平均值。 |
對Q209R hNAGLU變異體進一步施加變異而成的K36E/P37S/Q209R hNAGLU變異體、L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體、Q209R/T320P/E321D hNAGLU變異體、K36E/P37S/L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體、V54I/Q209R/R620K hNAGLU變異體、L44_G45insS/V54I/Q209Rh NAGLU變異體、L44_G45insS/Q209R/R620K hNAGLU變異體、及L44_G45insS/V54I/Q209R/R620K hNAGLU變異體(變異體8~15),係任一者都與Q209R hNAGLU變異體比較而顯示高的暫時性表現。尤其,V54I/Q209R/R620K hNAGLU變異體,係與Q209R hNAGLU變異體比較,而顯示約1.8倍(野生型的5.9倍)的暫時性表現。又,於酵素活性量、與在圖3(b)及圖4(a)所示SDS page電泳上所確認之hNAGLU變異體的表現量,係認為有正相關。進一步,於酵素活性量、與在圖4(b)所示西方墨點法所確認之hNAGLU變異體的表現量,亦認為有正相關。
[實施例17]
以上的結果顯示:於製造重組體hNAGLU之情形,可藉由以重組體Q209R hNAGLU變異體取代重組體野生型hNAGLU來進行製造,而得到2~5倍的生產量。又顯示:可藉由對Q209R hNAGLU變異體進一步施加變異,以重組體K36E/P37S/Q209R hNAGLU變異體、重組體L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體、重組體Q209R/T320P/E321D hNAGLU變異體、重組體K36E/P37S/L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體、重組體V54I/Q209R/R620K hNAGLU變異體、重組體L44_G45insS/V54I/Q209R hNAGLU變異體、重組體L44_G45insS/Q209R/R620K hNAGLU變異體、及重組體L44_G45insS/V54I/Q209R/R620K hNAGLU變異體來進行製造,而進一步使重組體hNAGLU的生產量增加。
[實施例18]抗人類運鐵蛋白受體抗體(抗hTfR抗體)與hNAGLU變異體的融合蛋白質之表現用細胞的建構
抗人類運鐵蛋白受體抗體(抗hTfR抗體)與hNAGLU變異體的融合蛋白質,可藉由以下所詳述之方法而製造。
藉由專利文獻(WO2018/124121)中記載的方法,而建構為表現載體之pE-neo載體與pE-hygr載體。將pE-neo載體與pE-hygr載體分別藉由MluI與NotI進行消化。
合成編碼序列識別號64所示蛋白質之DNA片段,該序列識別號64所示蛋白質,係L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體(變異體編號9)透過由3個序列識別號3所示胺基酸序列連續而成的合計15個胺基酸所構成的連接子序列,而結合於包含序列識別號63之胺基酸序列而成的抗hTfR抗體的Fab重鏈之C末端。對於此DNA片段的5’側,係從5’端依序配置MluI序列、與編碼作為分泌訊息而發揮功能機能的前導肽之序列,對於3’側係配置NotI序列。將此DNA片段以MluI與NotI消化,併入pE-neo載體的MluI與NotI之間,建構pE-neo(HC-mhNAGLU)。
又,合成編碼序列識別號65所示蛋白質之DNA片段,該序列識別號65所示蛋白質,係包含序列識別號63之胺基酸序列而成的抗hTfR抗體的Fab重鏈透過由3個序列識別號3所示胺基酸序列連續而成的合計15個胺基酸所構成的連接子序列,而結合於L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體(變異體編號9)的C末端。對於此DNA片段的5’側,係從5’端依序配置MluI序列、與編碼作為分泌訊息而發揮功能的前導肽之序列,對於3’側係配置NotI序列。將此DNA片段以MluI與NotI消化,併入pE-neo載體的MluI與NotI之間,建構pE-neo(mhNAGLU-HC)。
合成編碼包含序列識別號61之胺基酸序列而成的抗hTfR之輕鏈的DNA片段(序列識別號66)。將此DNA片段以MluI與NotI消化,併入pE-hygr載體的MluI與NotI之間,建構pE-hygr (LC)。
將CHO細胞(CHO-K1:由美國典型菌種保存中心(American Type Culture Collection)取得),藉由下述方法,使用GenePulser(Bio-Rad公司),以pE-neo(HC-mhNAGLU)及pE-neo(HC-mhNAGLU)、或pE-neo(HC-mhNAGLU)及pE-neo(mhNAGLU-HC)分別進行轉形。細胞的轉形大致以以下的方法進行。將5×10
5個CHO-K1細胞接種於經添加CD OptiCHO
TM培養基(Life Technologies公司)的3.5cm培養皿,在37℃、5%CO
2的條件下培養一夜。將培養基交換為Opti-MEM
TMI培養基(Life Technologies公司),使細胞懸浮成為5×10
6細胞/mL的密度。採集100 µL細胞懸浮液,於其中各添加5 µL之以Opti-MEM
TMI培養基稀釋成100 µg/mL的pE-neo(HC-mhNAGLU)及pE-neo(HC-mhNAGLU)質體DNA溶液。使用GenePulser(Bio-Rad公司),實施電穿孔,將質體導入細胞。將細胞在37℃、5%CO
2的條件下培養一夜,接著以經添加0.5mg/mL之潮黴素及0.8mg/mL之G418的CD OptiCHO
TM培養基進行選擇培養。
接著,藉由極限稀釋法,於96孔盤上接種以選擇培養所選出的細胞,使每1孔接種有1個以下的細胞,且培養約10天,使各細胞形成單株菌落(monoclonal colony)。採集有單株菌落形成之孔的培養上清液,以ELISA法調查培養上清液中的人類化抗體含量,且選擇人類化抗體高表現細胞株。
此時的ELISA法大致以以下的方法實施。對96孔微量滴定盤(Nunc公司)的各孔,各加入100 µL之將山羊抗人類IgG多株抗體溶液以0.05M碳酸氫鹽緩衝液(pH9.6)稀釋成4µg/mL者,在室溫靜置至少1小時而使抗體吸附至盤。接著,以PBS-T清洗各孔3次後,對各孔各加入200 µL之Starting Block (PBS)阻斷緩衝液(Blocking Buffer)(Thermo Fisher Scientific公司),將盤在室溫靜置30分鐘。以PBS-T清洗各孔3次後,將以於PBS添加有0.5%BSA及0.05%Tween20者(PBS-BT)稀釋成適當濃度的培養上清液或人類IgG標準品,對各孔各加入100 µL,將盤在室溫靜置至少1小時。將盤以PBS-T清洗3次之後,將以PBS-BT稀釋的HRP標記抗人類IgG多株抗體溶液對各孔各加入100 µL,將盤在室溫靜置至少1小時。以PBS-T清洗各孔3次後,對各孔加入100 µL之含磷酸-檸檬酸緩衝液(pH5.0)的0.4 mg/mL鄰苯二胺,在室溫靜置8~20分鐘。接著,對各孔加入100 µL之1 mol/L硫酸而使反應停止,使用96孔讀盤儀,而測定各孔的490 nm之吸光度。可將顯示高的測定值之孔所對應的細胞,作為高表現細胞株而用於製造融合蛋白質。
[實施例19]抗hTfR抗體與hNAGLU變異體之融合蛋白質之製造
抗hTfR抗體與hNAGLU變異體之融合蛋白質,能夠以以下的方法製造。將實施例18所記載之高表現細胞株,以CD OptiCHO
TM培養基稀釋成細胞濃度為約2×10
5個/mL,於1 L的三角燒瓶中加入200 mL的細胞懸浮液,於37℃,在包含5%CO
2與95%空氣的濕潤環境以約70 rpm的攪拌速度培養6~7天。藉由離心操作而回收培養上清液,以0.22µm過濾器(Millipore公司)過濾,而回收培養上清液。對該培養上清液添加管柱體積之5倍體積的含150mL NaCl之20 mM Tris緩衝液(pH 8.0),負載於已以管柱體積之3倍體積的含150 mM NaCl之20 mM Tris緩衝液(pH 8.0)預先平衡化的Protein A管柱(管柱體積:1 mL,Bio-Rad公司)。接著,供給管柱體積之5倍體積的相同緩衝液而清洗管柱之後,以含150 mM NaCl之管柱體積之4倍體積的50 mM甘胺酸緩衝液(pH 2.8),使所吸附的融合蛋白質溶出。添加1 M Tris緩衝液(pH 8.0),而將包含此融合蛋白質之溶出液的pH調整為pH 7.0。將如此進行而得之溶液作為融合蛋白質的精製品,而於4℃或冷凍保存。
[產業上利用之可能性]
若藉由本發明,則可提供一種hNAGLU變異體,其係為了治療黏多醣病第IIIB型の患者而能夠以酵素補充療法進行投予之hNAGLU變異體,且相較於野生型hNAGLU而作為重組體蛋白質更效率良好地生產。
[序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1:野生型hNAGLU的胺基酸序列
序列識別號2:編碼野生型hNAGLU之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號3:hNAGLU變異體編號1的胺基酸序列
序列識別號4:編碼hNAGLU變異體編號1之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號5:hNAGLU變異體編號2的胺基酸序列
序列識別號6:編碼hNAGLU變異體編號2之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號7:hNAGLU變異體編號16的胺基酸序列
序列識別號8:編碼hNAGLU變異體編號16之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號9:hNAGLU變異體編號3的胺基酸序列
序列識別號10:編碼hNAGLU變異體編號3之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號11:hNAGLU變異體編號4的胺基酸序列
序列識別號12:編碼hNAGLU變異體編號4之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號13:hNAGLU變異體編號17的胺基酸序列
序列識別號14:編碼hNAGLU變異體編號17之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號15:hNAGLU變異體編號5的胺基酸序列
序列識別號16:編碼hNAGLU變異體編號5之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號17:hNAGLU變異體編號6的胺基酸序列
序列識別號18:編碼hNAGLU變異體編號6之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號19:hNAGLU變異體編號7的胺基酸序列
序列識別號20:編碼hNAGLU變異體編號7之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號21:hNAGLU變異體編號18的胺基酸序列
序列識別號22:編碼hNAGLU變異體編號18之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號23:hNAGLU變異體編號19的胺基酸序列
序列識別號24:編碼hNAGLU變異體編號19之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號25:hNAGLU變異體編號8的胺基酸序列
序列識別號26:編碼hNAGLU變異體編號8之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號27:hNAGLU變異體編號9的胺基酸序列
序列識別號28:編碼hNAGLU變異體編號9之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號29:hNAGLU變異體編號10的胺基酸序列
序列識別號30:編碼hNAGLU變異體編號10之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號31:hNAGLU變異體編號11的胺基酸序列
序列識別號32:編碼hNAGLU變異體編號11之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號33:hNAGLU變異體編號12的胺基酸序列
序列識別號34:編碼hNAGLU變異體編號12之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號35:hNAGLU變異體編號13的胺基酸序列
序列識別號36:編碼hNAGLU變異體編號13之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號37:hNAGLU變異體編號14的胺基酸序列
序列識別號38:編碼hNAGLU變異體編號14之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號39:hNAGLU變異體編號15的胺基酸序列
序列識別號40:編碼hNAGLU變異體編號15之DNA片段的鹼基序列,合成序列
序列識別號41:包含編碼hNAGLU之基因的鹼基序列,合成序列
序列識別號42:附加MluI的5’引子,合成序列
序列識別號43:His標籤-附加NotI的3’引子,合成序列
序列識別號44:用以導入K36E/P37S變異之3’引子,合成序列
序列識別號45:用以導入L44_G45insS變異之3’引子,合成序列
序列識別號46:用以導入R129Q變異之3’引子,合成序列
序列識別號47:用以導入Q209R變異之3’引子,合成序列
序列識別號48:用以導入E228K變異之3’引子,合成序列
序列識別號49:用以導入T240V變異之3’引子,合成序列
序列識別號50:用以導入T320P/E321 D變異之3’引子,合成序列
序列識別號51:用以導入S505A/I506V變異之5’引子,合成序列
序列識別號52:用以導入S526N/A528 T變異之5’引子,合成序列
序列識別號53:用以導入D613Q變異之5’引子,合成序列
序列識別號54:用以導入H204K變異之3’引子,合成序列
序列識別號55:用以導入V54I變異之3’引子,合成序列
序列識別號56:用以導入R620K變異之5’引子,合成序列
序列識別號57:人類運鐵蛋白受體的胺基酸序列
序列識別號58:連接子的胺基酸序列之一例1
序列識別號59:連接子的胺基酸序列之一例2
序列識別號60:連接子的胺基酸序列之一例3
序列識別號61:抗hTfR抗體之輕鏈的胺基酸序列
序列識別號62:抗hTfR抗體之重鏈的胺基酸序列
序列識別號63:抗hTfR抗體之Fab重鏈的胺基酸序列
序列識別號64:hNAGLU變異體編號9與抗hTfR抗體的Fab重鏈之融合蛋白質的胺基酸序列1
序列識別號65:hNAGLU變異體編號9與抗hTfR抗體的Fab重鏈之融合蛋白質的胺基酸序列2
序列識別號66:編碼抗hTfR抗體之輕鏈的胺基酸序列之鹼基序列,合成序列
序列識別號67:野生型hNAGLU前驅物之訊息肽的胺基酸序列
無。
圖1係呈示因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的確認實驗的結果之圖(實施例6)。長條圖的縱軸表示螢光強度。分別地,(a)呈示相當於野生型hNAGLU或hNAGLU變異體的譜帶之SDS-page中的圖案,(b)呈示相當於野生型hNAGLU或hNAGLU變異體的譜帶之西方墨點法中的圖案。分別地,(1)呈示K36E/P37S hNAGLU變異體的表現量、(2)呈示L44_G45insS hNAGLU變異體的表現量、(3)呈示R129Q hNAGLU變異體的表現量、(4)呈示Q209R hNAGLU變異體的表現量、(5)呈示E228K hNAGLU變異體的表現量、(6)呈示T240V hNAGLU變異體的表現量、(7)呈示T320P/E321D hNAGLU變異體的表現量、(8)呈示S505A/I506V hNAGLU變異體的表現量、(9)呈示S526N/A528T hNAGLU變異體的表現量、(10)呈示D613Q hNAGLU變異體的表現量、(11)呈示H204K hNAGLU變異體的表現量、及(12)呈示野生型hNAGLU的表現量之數據。
圖2係呈示利用大量細胞之hNAGLU變異體表現量的確認實驗的結果之圖(實施例10)。長條圖的縱軸係針對各個hNAGLU變異體,而呈示1×10
6個細胞所表現之hNAGLU的酵素活性量(nmol/h/10
6細胞)。分別地,(1)呈示K36E/P37S hNAGLU變異體的表現量、(2)呈示L44_G45insS hNAGLU變異體的表現量、(3)呈示R129Q hNAGLU變異體的表現量、(4)呈示Q209R hNAGLU變異體的表現量、(5)呈示E228K hNAGLU變異體的表現量、(6)呈示T240V hNAGLU變異體的表現量、(7)呈示T320P/E321D hNAGLU變異體的表現量、(8)呈示S505A/I506V hNAGLU變異體的表現量、(9)呈示S526N/A528T hNAGLU變異體的表現量、(10)呈示D613Q hNAGLU變異體的表現量、(11)呈示H204K hNAGLU變異體的表現量、及(12)呈示野生型hNAGLU的表現量之數據。針對(1)~(4)之每一者,測定係重覆實施4次,圖中呈示各個的測定值。
圖3係呈示因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的確認實驗的結果之圖(實施例16)。長條圖的縱軸表示螢光強度。分別地,(a)呈示相當於野生型hNAGLU或hNAGLU變異體的譜帶之SDS-page中的圖案,(b)呈示相當於野生型hNAGLU或hNAGLU變異體的譜帶之西方墨點法中的圖案。(1)呈示野生型hNAGLU的表現量、(2)呈示Q209R hNAGLU變異體的表現量、(3)呈示K36E/P37S/Q209R hNAGLU變異體的表現量、(4)呈示L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體的表現量、(5)呈示Q209R/T320P/E321D hNAGLU變異體的表現量、(6)呈示K36E/P37S/L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體的表現量之數據。
圖4係呈示因暫時性表現所致hNAGLU變異體表現量的確認實驗的結果之圖(實施例16)。長條圖的縱軸表示螢光強度。(a)呈示相當於野生型hNAGLU或hNAGLU變異體的譜帶之SDS-page中的圖案。分別地,(1)呈示野生型hNAGLU的表現量、(2)呈示Q209R hNAGLU變異體的表現量、(3)呈示L44_G45insS/Q209R hNAGLU變異體的表現量、(4)呈示V54I/Q209R/R620K hNAGLU變異體的表現量、(5)呈示L44_G45insS/V54I/Q209R hNAGLU變異體的表現量、(6)呈示L44_G45insS/Q209R/R620K hNAGLU變異體的表現量、(7)呈示L44_G45insS/V54I/Q209R/R620K hNAGLU變異體的表現量、(8)呈示陰性對照的表現量之數據。
Claims (34)
- 一種選自包含下述(1)~(7)之群組的人類α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(hNAGLU)之變異體: (1)包含序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第36位的離胺酸被麩胺酸、且第37位的脯胺酸被絲胺酸所分別取代之序列識別號3所示胺基酸序列者; (2)包含序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號5所示胺基酸序列者; (3)包含序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第209位的麩醯胺酸被精胺酸所取代之序列識別號9所示胺基酸序列者; (4)包含序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第228位的麩胺酸被離胺酸所取代之序列識別號11所示胺基酸序列者; (5)包含序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第320位的蘇胺酸被脯胺酸、且第321位的麩胺酸被天冬胺酸所分別取代之序列識別號15所示胺基酸序列者; (6)包含序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第505位的絲胺酸被丙胺酸、且第506位的異白胺酸被纈胺酸所分別取代之序列識別號17所示胺基酸序列者;及 (7)包含序列識別號1所示野生型之hNAGLU的胺基酸序列中第526位的絲胺酸被天冬醯胺酸、且第528位的丙胺酸被蘇胺酸所分別取代之序列識別號19所示胺基酸序列者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項1之序列識別號3所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第36位的麩胺酸及第37位的絲胺酸以外,包含選自包含以下的(1’-a)~(1’-h)之群組的變異: (1’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (1’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (1’-c)組合上述1’-a之取代與1’-b之缺失者; (1’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (1’-e)組合上述1’-a之取代與1’-d之附加者; (1’-f)組合上述1’-b之缺失與1’-d之附加者; (1’-g)組合上述1’-a之取代、1’-b之缺失、及1’-d之附加者;及 (1’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項1之序列識別號5所示胺基酸序列的hNAGLU之變異體,於該胺基酸序列之第45位的絲胺酸以外,具有選自包含以下的(2’-a)~(2’-h)之群組的變異: (2’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (2’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (2’-c)組合上述2’-a之取代與2’-b之缺失者; (2’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (2’-e)組合上述2’-a之取代與2’-d之附加者; (2’-f)組合上述2’-b之缺失與2’-d之附加者; (2’-g)組合上述2’-a之取代、2’-b之缺失、及2’-d之附加者;及 (2’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項1之序列識別號9所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第209位的精胺酸以外,具有選自包含以下的(3’-a)~(3’-h)之群組的變異: (3’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (3’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (3’-c)組合上述3’-a之取代與3’-b之缺失者; (3’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (3’-e)組合上述3’-a之取代與3’-d之附加者; (3’-f)組合上述3’-b之缺失與3’-d之附加者; (3’-g)組合上述3’-a之取代、3’-b之缺失、及3’-d之附加者;及 (3’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項1之序列識別號11所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第228位的離胺酸以外,具有選自包含以下的(4’-a)~(4’-h)之群組的變異: (4’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (4’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (4’-c)組合上述4’-a之取代與4’-b之缺失者; (4’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (4’-e)組合上述4’-a之取代與4’-d之附加者; (4’-f)組合上述4’-b之缺失與4’-d之附加者; (4’-g)組合上述4’-a之取代、4’-b之缺失、及4’-d之附加者;及 (4’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項1之序列識別號15所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第320位的脯胺酸及第321位的天冬胺酸以外,具有選自包含以下的(5’-a)~(5’-h)之群組的變異: (5’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (5’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (5’-c)組合上述5’-a之取代與5’-b之缺失者; (5’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (5’-e)組合上述5’-a之取代與5’-d之附加者; (5’-f)組合上述5’-b之缺失與5’-d之附加者; (5’-g)組合上述5’-a之取代、5’-b之缺失、及5’-d之附加者;及 (5’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項1之序列識別號17所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第505位的丙胺酸及第506位的纈胺酸以外,具有選自包含以下的(6’-a)~(6’-h)之群組的變異: (6’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (6’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (6’-c)組合上述6’-a之取代與6’-b之缺失者; (6’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (6’-e)組合上述6’-a之取代與6’-d之附加者; (6’-f)組合上述6’-b之缺失與6’-d之附加者; (6’-g)組合上述6’-a之取代、6’-b之缺失、及6’-d之附加者;及 (6’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項1之序列識別號19所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第526位的天冬醯胺酸及第528位的蘇胺酸以外,具有選自包含以下的(7’-a)~(7’-h)之群組的變異: (7’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (7’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (7’-c)組合上述7’-a之取代與7’-b之缺失者; (7’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (7’-e)組合上述7’-a之取代與7’-d之附加者; (7’-f)組合上述7’-b之缺失與7’-d之附加者; (7’-g)組合上述7’-a之取代、7’-b之缺失、及7’-d之附加者;及 (7’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項4之序列識別號9所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,具有選自包含以下的(8)~(15)之群組的變異: (8)包含第36位的離胺酸被麩胺酸、第37位的脯胺酸被絲胺酸所分別取代之序列識別號25所示胺基酸序列者; (9)包含第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號27所示胺基酸序列者; (10)包含第320位的蘇胺酸被脯胺酸、第321位的麩胺酸被天冬胺酸所分別取代之序列識別號29所示胺基酸序列者; (11)包含第36位的離胺酸被麩胺酸、第37位的脯胺酸被絲胺酸所分別取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號31所示胺基酸序列者; (12)包含第54位的纈胺酸被異白胺酸、第620位的精胺酸被離胺酸所分別取代之序列識別號33所示胺基酸序列者; (13)包含第54位的纈胺酸被異白胺酸所取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號35所示胺基酸序列者; (14)包含第620位的精胺酸被離胺酸所取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號37所示胺基酸序列者;及 (15)包含第54位的纈胺酸被異白胺酸、第620位的精胺酸被離胺酸所分別取代,且第44位的白胺酸與第45位的甘胺酸之間有絲胺酸附加之序列識別號39所示胺基酸序列者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項9之序列識別號25所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第209位的精胺酸、第36位的麩胺酸、及第37位的絲胺酸以外,具有選自包含以下的(8’-a)~(8’-h)之群組的變異: (8’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (8’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (8’-c)組合上述8’-a之取代與8’-b之缺失者; (8’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (8’-e)組合上述8’-a之取代與8’-d之附加者; (8’-f)組合上述8’-b之缺失與8’-d之附加者; (8’-g)組合上述8’-a之取代、8’-b之缺失、及8’-d之附加者; (8’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項9之序列識別號27所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第210位的精胺酸、及第45位的絲胺酸以外,具有選自包含以下的(9’-a)~(9’-h)之群組的變異: (9’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (9’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (9’-c)組合上述9’-a之取代與9’-b之缺失者; (9’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (9’-e)組合上述9’-a之取代與9’-d之附加者; (9’-f)組合上述9’-b之缺失與9’-d之附加者; (9’-g)組合上述9’-a之取代、9’-b之缺失、及9’-d之附加者; (9’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項9之序列識別號29所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第209位的精胺酸、第320位的脯胺酸、及第321位的天冬胺酸以外,具有選自包含以下的(10’-a)~(10’-h)之群組的變異: (10’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (10’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (10’-c)組合上述10’-a之取代與10’-b之缺失者; (10’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (10’-e)組合上述10’-a之取代與10’-d之附加者; (10’-f)組合上述10’-b之缺失與10’-d之附加者; (10’-g)組合上述10’-a之取代、10’-b之缺失、及10’-d之附加者; (10’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項9之序列識別號31所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第210位的精胺酸、第36位的麩胺酸、第37位的絲胺酸、及第45位的絲胺酸以外,具有選自包含以下的(11’-a)~(11’-h)之群組的變異: (11’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (11’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (11’-c)組合上述11’-a之取代與11’-b之缺失者; (11’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (11’-e)組合上述11’-a之取代與11’-d之附加者; (11’-f)組合上述11’-b之缺失與11’-d之附加者; (11’-g)組合上述11’-a之取代、11’-b之缺失、及11’-d之附加者; (11’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項9之序列識別號33所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第209位的精胺酸、第54位的異白胺酸、及第620位的離胺酸以外,具有選自包含以下的(12’-a)~(12’-h)之群組的變異: (12’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (12’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (12’-c)組合上述12’-a之取代與12’-b之缺失者; (12’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (12’-e)組合上述12’-a之取代與12’-d之附加者; (12’-f)組合上述12’-b之缺失與12’-d之附加者; (12’-g)組合上述12’-a之取代、12’-b之缺失、及12’-d之附加者; (12’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項9之序列識別號35所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第210位的精胺酸、第55位的異白胺酸、及第45位的絲胺酸以外,具有選自包含以下的(13’-a)~(13’-h)之群組的變異: (13’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (13’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (13’-c)組合上述13’-a之取代與13’-b之缺失者; (13’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (13’-e)組合上述13’-a之取代與13’-d之附加者; (13’-f)組合上述13’-b之缺失與13’-d之附加者; (13’-g)組合上述13’-a之取代、13’-b之缺失、及13’-d之附加者; (13’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項9之序列識別號37所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第210位的精胺酸、第621位的離胺酸、及第45位的絲胺酸以外,具有選自包含以下的(14’-a)~(14’-h)之群組的變異: (14’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (14’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (14’-c)組合上述14’-a之取代與14’-b之缺失者; (14’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (14’-e)組合上述14’-a之取代與14’-d之附加者; (14’-f)組合上述14’-b之缺失與14’-d之附加者; (14’-g)組合上述14’-a之取代、14’-b之缺失、及14’-d之附加者; (14’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種hNAGLU變異體,其係對於包含如請求項9之序列識別號39所示胺基酸序列的hNAGLU變異體,於該胺基酸序列之第210位的精胺酸、第55位的異白胺酸、第621位的離胺酸、及第45位的絲胺酸以外,具有選自包含以下的(15’-a)~(15’-h)之群組的變異: (15’-a)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代者,該被取代之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (15’-b)構成該胺基酸序列之胺基酸殘基缺失者,該所缺失之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (15’-c)組合上述15’-a之取代與15’-b之缺失者; (15’-d)於該胺基酸序列中或於該胺基酸序列的N末端側或是C末端側有1個或複數個胺基酸殘基附加者,該所附加之胺基酸殘基的個數為1~10個、為1~5個、或為1~3個,例如為1個或2個; (15’-e)組合上述15’-a之取代與15’-d之附加者; (15’-f)組合上述15’-b之缺失與15’-d之附加者; (15’-g)組合上述15’-a之取代、15’-b之缺失、及15’-d之附加者; (15’-h)顯示與該胺基酸序列80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同一性、98%以上、或99%之同一性者。
- 一種DNA,其係包含編碼如請求項1至17中任一項之hNAGLU變異體的基因而成。
- 一種表現載體,其係包含如請求項18之DNA而成。
- 一種哺乳動物細胞,其係經以如請求項19之表現載體進行轉形。
- 一種hNAGLU變異體之製造方法,其包含以無血清培養基培養如請求項20之哺乳動物細胞的步驟。
- 一種融合蛋白質,其係如請求項1至17中任一項之hNAGLU變異體與抗體的融合蛋白質,其藉由該抗體與腦血管內皮細胞上的受體結合,而該融合蛋白質可通過血腦障壁(BBB)。
- 如請求項22之融合蛋白質,其中該腦血管內皮細胞上的受體選自包含胰島素受體、運鐵蛋白受體、瘦素受體、脂蛋白受體、及IGF受體之群組。
- 如請求項22之融合蛋白質,其中該腦血管內皮細胞上的受體係運鐵蛋白受體。
- 如請求項22至24中任一項之融合蛋白質,其中該抗體為Fab抗體、F(ab’) 2抗體、F(ab’)抗體、單域抗體、單鏈抗體、或Fc抗體中任一者。
- 如請求項22至25中任一項之融合蛋白質,其中該hNAGLU變異體與該抗體之輕鏈的C末端側或是N末端側中任一者結合。
- 如請求項22至25中任一項之融合蛋白質,其中該hNAGLU變異體與該抗體之重鏈的C末端側或是N末端側中任一者結合。
- 如請求項22至27中任一項之融合蛋白質,其中該hNAGLU變異體與該抗體之輕鏈的C末端側或是N末端側中任一者、或重鏈的C末端側或是N末端側中任一者,透過連接子(linker)序列而結合。
- 如請求項28之融合蛋白質,其中該連接子序列由1~50個胺基酸殘基所構成。
- 如請求項29之融合蛋白質,其中該連接子序列係包含選自包含1個甘胺酸、1個絲胺酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列識別號3之胺基酸序列、序列識別號4之胺基酸序列、序列識別號5之胺基酸序列、及此等胺基酸序列1~10個連續而成的胺基酸序列之群組的胺基酸序列而成者。
- 一種DNA,其係包含編碼如請求項22至30中任一項之融合蛋白質的基因而成。
- 一種表現載體,其係包含如請求項31之DNA而成。
- 一種哺乳動物細胞,其係經以如請求項32之表現載體進行轉形。
- 一種hNAGLU變異體與抗體的融合蛋白質之製造方法,其包含以無血清培養基培養如請求項33之哺乳動物細胞的步驟。
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