JP6060073B2

JP6060073B2 - Ｃｄ１２２に対する抗体

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Publication number: JP6060073B2
Application number: JP2013503965A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ユンツォ，; 直也鶴下; ニコラスエフ．ランドルフィ，; シャンカールクマル，
Original assignee: ジェイエヌバイオサイエンシーズエルエルシー
Priority date: 2010-04-08
Filing date: 2011-04-07
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2031-04-07
Also published as: WO2011127324A2; JP2013523839A; CN102939305B; EP2560994B1; EP2560994A4; WO2011127324A3; EP2560994A2; CA2795279C; CA2795279A1; US20110250213A1; CN102939305A; US9028830B2

Description

関連出願の相互参照
本出願は、非仮出願であり、2010年4月8日に出願の第61/322,229号及び2010年6月30日に出願の第61/360,405号の利益を主張する。そして、各々は、あらゆる目的のためにその全てを参照によって組み込まれる。

配列表に対する参照
ファイル57404154.txtに書かれている配列表は、105キロバイトであり、2011年4月4日に作成され、本願明細書に引用されている。

背景
CD122は、T細胞、NK細胞、単核細胞及びB細胞のサブセットに発現する525アミノ酸長のタイプI膜タンパク質である(Zamai, et al, J. Biol. Regul. Homeost. Agents 15:95-97 (2001))。CD122分子は、2つのタイプIサイトカインである、インターロイキン2(IL-2)及びインターロイキン15(IL-15)の受容体の不可欠な要素である。CD122(IL-2及びIL-15受容体のβ鎖とも呼ばれる)は、他の受容体のサブコンポーネントと結合して、厳密なサイトカイン特異性及び親和性を示す受容体を生成する。細胞表面上のCD122と機能的に関係する分子には、CD25(別名IL-2受容体α鎖又はIL-2Rα)、CD132(共通γ又はγc鎖とも呼ばれる)及びIL-15受容体α鎖(IL-15Rαとも呼ばれ、CD番号をまだ割り当てられない)(Waldmann, Nat. Rev. Immunol. 6:595-601 (2006))が含まれる。CD132と結合するCD122は、IL-2(KD=〜1nM)及びIL-15(KD=〜10nM)に対して中程度のレベルの親和性を示す受容体(中親和性受容体)を形成する。CD25及びCD132の両方と関係するCD122は、IL-2に特異的な高親和性(KD=〜10pM)の受容体となる。その一方で、IL-15Rα及びCD132と結合するCD122は、IL-15に対する高親和性受容体(KD=〜10pM)を生成する(Ma, A., et al., Annu. Rev. Immunol. 24: 657-679 (2006))。

IL-2とIL-15は、Tリンパ球の増殖を刺激する能力をともに有しているが、それぞれ免疫系の維持において独自の活性を有する。IL-2は、活性T細胞をアポトーシスさせる引き金となることによって、T細胞反応を制限する役割を果たすが、IL-15は、NK細胞の発達並びにCD8+メモリーT細胞の発達及び維持に必要である(Waldmann, Nat. Rev. Immunol. 6:595-601 (2006))。これらの2つのサイトカインは、それぞれの受容体コンポーネントと相互作用する手段においても、基本的に異なっている。可溶性サイトカインが細胞表面上の中親和性又は高親和性IL-2受容体と相互作用すると、IL-2シグナル伝達が発生する。この可溶性サイトカイン輸送は、全てのタイプIサイトカイン(IL-15を除く)がそれらのシグナルを伝達させる機構であり、同一又は異なる細胞によって分泌されたサイトカインが、単一の細胞表面上の全ての受容体サブコンポーネントと相互作用するものである。これに対して、IL-15シグナル伝達は、1つの細胞の表面上においてIL-15Rαと結合したIL-15を、CD122及びCD132分子を発現している他の細胞に提示することによって行われる。これはトランス提示と呼ばれる。トランス提示は、以下の機構である；IL-15Rα受容体サブコンポーネント又はその断片（可溶性または1つの細胞に結合したものであってよい）に結合したIL-15が、残りの受容体サブコンポーネント(CD122及びCD132)を発現している異なった細胞に提示されて、これによってIL-15シグナル伝達が生じ得る。IL-15に対する単離されたIL-15Rα又はその断片の親和性は高い(KD=〜10pM)。そして、IL-15及びIL-15Rαは、小胞体において結合し、複合体として細胞表面へ輸送され、他の細胞（表面上でCD122及びCD132を発現している）に対してトランス提示されると考えられている。シス提示は、IL-15が同じ細胞に発現するCD122、CD132及びIL-15Rαと相互作用すると生じる。非常に多くのIL-15シグナル伝達は、トランス提示を介して媒介される。その一方で、シス提示は、役目としてはマイナーなものであり、シグナル伝達は可溶性IL-15輸送によっては、ほとんどか又はまったく生じない(Stonier and Schluns, Immunol. Lett. 127: 85-92 (2010); Ma et al., Annu. Rev. Immunol. 24: 657-679 (2006); Dubois et al., Immunity 17:537-547 (2002))。

IL-2とIL-15は、タイプIサイトカインの基本的な構造的類似点、いくつかの機能的活性及びある種の受容体サブコンポーネントが共通するだけでなく、様々な免疫介在性疾患とそれぞれ関係している。例えば、モノクローナル抗体を用いてIL-2受容体(CD25)のα鎖をターゲッティングすることによってIL-2活性を阻害することは、現在承認されている急性腎臓移植拒絶反応のための効果的免疫調節性戦略である(Vincenti et al., New Engl. J. Med. 338:161-5 (1998))。加えて、抗CD25法の治療上の効用は、喘息(Busse et al, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178: 1002-1008 (2008))及び多発性硬化症(Rose et al, Neurology, 69:785-789 (2007))を標的にする臨床試験においても報告されており、これらの状態におけるIL-2の関与を意味するものである。IL-15特異的モノクローナル抗体は、慢性関節リウマチの臨床試験において治療効果が陽性であることが報告され(Baslund et al., Arthritis Rheum. 52:2686-2692 (2005))、そして、乾癬(Villadsen et al., J. Clin. Invest. 112: 1571-1580 (2003))、小児脂肪便病(Maiuri et al., Gastroenterology 119:996-1066 (2000))及び全身性エリテマトーデス(Bo et al., Scand. J. Immunol. 69:119-129 (2009))の動物モデルにおいて有効性があると報告されている。ヒトCD122に対するマウスモノクローナル抗体は、ヒトT細胞株でマウスを免疫して作成し、その後、様々な技術によってIL-2受容体のβ鎖に特異的であることが同定された(Tsudo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1982-1986 (1989); Takeshita et al., J. Exp. Med. 169: 1323-1332 (1989); Fung et al., J. Immunol. 147: 1253-1260 (1991))。これらの抗CD122モノクローナル抗体は、中親和性のIL-2受容体をもつ細胞に対するIL-2依存的増殖を阻害したが、高親和性のIL-2受容体をもつ細胞に対するIL-2依存的増殖は、効果的に阻害することができなかった。さらに、抗CD122モノクローナル抗体が、IL-15のトランス提示を効果的に阻害するという報告はない。

抗CD122抗体の1つである、Mik-β1(Tsudo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1982-1986 (1989))は、T細胞大型顆粒リンパ球白血病(Morris et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:401-406 (2006))の治療法として試験されてきた。Mik-β1はヒト化もされ、このバージョンであるHuMik-β1(Hakimi et al., J. Immunol. 151 :1075-1085 (1993))は、非ヒト霊長類の心臓同種移植片を長持ちさせることが報告されている(Tinubu et al., J. Immunol. 153: 4330-4338 (1994))。

請求項にかかる発明の要約
発明は、CD122に特異的に結合して、IL-2及びIL-15がCD122及びCD132を含む受容体に結合することを阻害する、単離されたモノクローナル抗体を提供するものである。ある抗体は、IL-2がCD122、CD132及びCD25を含む受容体に結合することを阻害する。ある抗体は、IL-15Rαにトランス提示されて結合しているIL-15がCD122及びCD132を含む受容体に結合することを阻害する。ある抗体は、IL-15がCD122、CD132及びIL-15Rαを含む受容体に結合することを阻害する。ある抗体は、抗体がIL-2又はIL-15に対して100倍モル以下の過剰に存在する場合、これらの状況の一部又は全てにおいて、結合を少なくとも30%阻害する。

CD122に対するあるモノクローナル抗体の結合は、配列番号:73における残基の番号である、残基42、43及び/又は133をアラニンで置換及び/又は残基65をスレオニンで置換及び/又は残基70をリジンで置換することによって阻害される。CD122に対するあるモノクローナル抗体の結合は、配列番号:73における残基の番号である、残基42及び/若しくは43をアラニンで置換並びに/又は残基65をスレオニンで置換することによって阻害される。CD122に対するあるモノクローナル抗体の結合は、配列番号:73における残基の番号である、残基65をスレオニンで置換及び/又は残基70でリジンを置換及び/又は残基133をアラニンで置換することによって阻害される。あるモノクローナル抗体は、配列番号:73における番号である残基42を含むエピトープと特異的に結合する。あるモノクローナル抗体は、配列番号:73における番号である残基65を含むエピトープと特異的に結合する。あるモノクローナル抗体は、配列番号:73の残基133を含むCD122のエピトープと特異的に結合する。あるモノクローナル抗体は、配列番号:73の残基42、43、65、70及び/又は133を含むCD122のエピトープと特異的に結合する。あるモノクローナル抗体は、配列番号:73の残基42、43及び65を含むCD122のエピトープと特異的に結合する。あるモノクローナル抗体は、配列番号:73の残基65、70及び133を含むCD122のエピトープと特異的に結合する。あるモノクローナル抗体は、配列番号:73のフィブロネクチンタイプIIIドメイン1中のCD122のエピトープと特異的に結合する。あるモノクローナル抗体は、配列番号:73のフィブロネクチンタイプIIIドメイン1及び2中のCD122のエピトープと特異的に結合する。CD122に対するあるモノクローナル抗体の結合は、配列番号:73における番号である残基39又は41をアラニンで置換することによっては検出可能なレベルでは阻害されない。

ある抗体は、配列番号:30の成熟軽鎖可変領域及び配列番号:25の成熟重鎖可変領域によって特徴づけられる抗体ABC2又は配列番号:40の成熟軽鎖可変領域及び配列番号:35の成熟重鎖可変領域によって特徴づけられる抗体ABC101と、CD122に対する特異的結合に関して競合する。ある抗体は、ABC2又はABC101と同じCD122上のエピトープに結合する。ある抗体は、3つの軽鎖CDR及び3つの重鎖CDRを含み、各CDRは、ABC2(配列番号:27-29の軽鎖及び22-24の重鎖)又はABC101(配列番号:37-39の軽鎖、32-34の重鎖)の対応するCDRと少なくとも90%の配列同一性がある。ある抗体は、ABC2又はABC101の3つの軽鎖CDR及び3つの重鎖CDRを含む。

ある抗体は、キメラ型か、ヒト化か、ベニア化(veneered)か、ヒト抗体である。ある抗体は、ヒトIgG1カッパアイソタイプを有する。抗体は、完全な抗体又は単鎖抗体、Fab若しくは、F(ab')2断片とすることができる。

本発明は、CD122に特異的に結合するヒト化又はキメラABC2抗体を更に提供するものであって、ABC2は、配列番号:30の成熟軽鎖可変領域及び配列番号:25の成熟重鎖可変領域によって特徴づけられるマウス抗体である。かかる抗体のあるものは、ABC2軽鎖(配列番号:30)の3つのCDRを含むヒト化軽鎖と、ABC2重鎖(配列番号:25)の3つのCDRを含むヒト化重鎖を含む。

ある抗体は、配列番号:42と少なくとも90%同一性があるヒト化軽鎖及び配列番号:41と少なくとも90%同一性があるアミノ酸配列を有するヒト化重鎖を有する。ある抗体において、カバット番号付けによる位置H28、H48、H49、H68、H93及びL71は、それぞれ残基T、I、A、I、A及びYによって占められている。ある抗体において、カバット番号付けによる位置H42は、Gによって占められている。ある抗体において、軽鎖CDRは配列番号:27-29であり、重鎖CDRは配列番号:22-24である。

本発明は、CD122に特異的に結合するヒト化又はキメラABC101抗体を更に提供するものであって、ABC101は、配列番号:40の成熟軽鎖可変領域及び配列番号:35の成熟重鎖可変領域によって特徴づけられる。かかる抗体のあるものは、配列番号:40の3つのCDRを含むヒト化軽鎖及び配列番号:35の3つのCDRを含むヒト化重鎖を含む。かかる抗体のあるものは、配列番号:44と少なくとも90%同一性があるヒト化成熟軽鎖可変領域及び配列番号:43と少なくとも90%同一性があるアミノ酸配列を有するヒト化成熟重鎖可変領域を含む。かかる抗体のあるものにおいて、カバット番号付けによる位置H27、H30、H48、H66、H67、H71及びL49は、それぞれ残基Y、T、M、Q、I、R及びKによって占められている。かかる抗体のあるものにおいて、軽鎖CDRは配列番号:37-39であり、重鎖CDRは配列番号:32-34である。

本発明は、上記の抗体のいずれかと、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を更に提供するものである。

本発明は、患者における望ましくない免疫応答を抑制する方法であって、上記抗体のいずれかに関する効果的な投与計画を患者に施すことを含む方法を更に提供する。ある方法においては、患者は、自己免疫疾患(例えば、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糖尿病、乾癬、小児脂肪便病又はブドウ膜炎)に罹患している。ある方法においては、患者は、喘息又はアレルギーに罹患している。ある方法においては、患者は、移植片対宿主疾患に罹患している。ある方法においては、患者は、宿主対移植片疾患に罹患している。

本発明は、患者の癌を治療する方法であって、上記抗体のいずれかに関する効果的な投与計画を患者に施すことを含む方法を更に提供する。ある方法においては、癌は、検出可能なCD122を発現している。

本発明は、残基43、65及び133の1又は複数を含む、配列番号:73の100個以下の連続した残基の単離された断片を更に提供する。ある単離された断片は、配列番号:73の残基43及び65を含む。ある単離された断片は、配列番号:73の残基65及び133を含む。ある単離された断片は、配列番号:73の10個又は10個より少ない連続する残基を含む。かかる単離された断片のあるものは、断片に対する抗体反応の誘発を補助する担体に連結している、及び/又は断片に対する抗体反応の誘発を補助するアジュバントを有する組成物のコンポーネントとしてである。

IL-15のトランス提示に対するABC2及びABC101の効果。

高親和性IL-2受容体を介したIL-2媒介細胞増殖に対するABC2及びABC101の効果。

推定アミノ酸配列を共にするABC2 VHのコンセンサスcDNA配列。

推定アミノ酸配列を共にするABC2 VLのコンセンサスcDNA配列。

推定アミノ酸配列を共にするABC 101VHのコンセンサスcDNA配列。

推定アミノ酸配列を共にするABC101 VLのコンセンサスcDNA配列。

成熟ABC2 VH、ヒト化ABC2 VH(HuABC2 VH)及びヒトアクセプターDA430129 VH領域のアミノ酸配列のアライメント。

SpeI及びHindIIIサイトが両脇に位置する設計HuABC2VH遺伝子のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列。

成熟ABC2 VL、ヒト化ABC2 VL(HuABC2 VL)及びヒトアクセプターM29469 VL領域のアミノ酸配列のアライメント。

NheI及びEcoRIサイトが両脇に位置する設計HuABC2 VL遺伝子のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列。

成熟ABC101 VH、ヒト化ABC101 VH(HuABC101 VH)及びヒトアクセプターDA936142 VH領域のアミノ酸配列のアライメント。

SpeI及びHindIIIサイトが両脇に位置する設計HuABC101 VH遺伝子のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列。

成熟ABC101 VL、ヒト化ABC101 VL(HuABC101 VL)及びヒトアクセプターZ46622 VL領域のアミノ酸配列のアライメント。

NheI及びEcoRIサイトが両脇に位置する設計HuABC101 VL遺伝子のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列。

pHuABC2及びpHuABC101発現ベクターの模式的な構造。

IL-15のトランス提示に対するHuABC2及びHuABC101の効果。

高親和性IL-2受容体を介するIL-2媒介細胞増殖に対するHuABC2及びHuABC101の効果。

様々なCD122構造物に対するABC2、ABC101、ABC116及びMik-β1の結合性。

ヒトCD122の様々な単一アミノ酸置換変異体に対するABC2、ABC101及びMik-β1の結合性。

GM-CSF、IL-2又はIL-15/IL-15Rα複合体存在下における野生型又は変異CD122を発現しているTF-1形質導入体の成長。

定義
モノクローナル抗体又は他の生物学的な物質(例えばCD122の断片)は、単離された形態として典型的には提供される。これは、抗体又は他の生物学的な物質がその製造又は精製から生じる干渉タンパク質及び他の汚染物質との関係で典型的には少なくとも50%w/wの純度があるが、これは、モノクローナル抗体が過剰な医薬的に許容可能な担体又は他の媒体であってその使用を容易にすることを意図するものと組合せる可能性を除外しないことを意味する。時には、モノクローナル抗体は、製造又は精製からの干渉タンパク質及び汚染物質との関係で少なくとも60、70、80、90、95又は99%w/wの純度がある。しばしば、単離されたモノクローナル抗体又は他の生物学的な物質の薬剤は、その精製後に残る主要な高分子種である。

その標的抗原に対するモノクローナル抗体の特異的結合は、少なくとも10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、又は10¹⁰M^-1の親和性を意味する。特異的結合とは、強度が検出できる程度に高く、少なくとも1つの無関係な標的に対して発生する非特異的結合から識別可能であることをいう。特異的結合は、特定の機能的グループ間の結合の形成か特定の空間的適合(例えば、鍵と鍵穴型)の結果といえる一方で、非特異的結合は、通常ファンデルワールス力の結果である。しかしながら、特異的結合は、モノクローナル抗体が唯一の標的に結合することを必ずしも意味するわけではない。

CD122における変異がCD122に対する抗体の特異的結合を阻害する場合、(複合体シグナル、親和定数又は他の尺度による評価を問わず)結合の強さは、CD122の野生型(配列番号:73)よりも変異型の方が検出可能レベルが低く(例えば、標準誤差(SEM)を越える低さ)、野生型に対して50%又は10%未満の結合性である。結合性の低下は、ポジティブコントロール抗体(例えば実施例において使用する市販のL5抗FLAG^TM抗体であり、CD122に連結したFLAG^TMペプチドに結合する抗体)の結合性に対して相対的に評価することもできる。例えば、連結FLAG^TMペプチドに対する抗FLAG抗体の結合の強さの50%未満又は好ましくは10%未満で抗体が変異CD122に結合する場合、変異は抗CD122抗体の結合を阻害する。

基本的な抗体構造単位は、サブユニットのテトラマーである。各テトラマーは、2つの同一ポリペプチド鎖対を含み、各対は、1つは「軽」鎖(約25kDa)であり、1つは「重」鎖(約50-70kDa)である。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う、約100〜110又はそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、初めは切断可能シグナルペプチドに連結して発現する。シグナルペプチドのない可変領域は、時に成熟可変領域と呼ばれる。従って、例えば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドのない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。

軽鎖は、カッパ又はラムダに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンと分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれIgG、IgM、IgA、IgD及びIgEと規定する。軽鎖及び重鎖内において、可変及び定常領域は、約12又は12より多いアミノ酸のJ領域によって連結され、重鎖は、約10又は10より多いアミノ酸のD領域を含んでいる。(Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7を一般的に参照)(全ての目的のために完全に引用したものとする)。

各軽鎖/重鎖対の成熟可変領域は、抗体結合部位を形成する。従って、完全な抗体は、2つの結合部位がある。二機能性抗体又は二重特異性抗体を除いて、2つの結合部位は、同じである。鎖のすべては、3つの超可変領域(相補性決定領域又はCDRとも呼ばれる)によって連結している比較的保全された複数のフレームワーク領域(FR)に関する同じ一般構造を示す。各対における2つの鎖由来のCDRは、フレームワーク領域によって整列配置されて、特異的エピトープと結合することが可能になる。N末端からC末端にかけて、軽鎖及び重鎖の両方は、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、カバット(Sequences of Proteins of Immunological Interest)による(National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)、又はコチアとレスク(J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));コチアら(Nature 342:878-883 (1989))の定義に従う。カバットは、広く使われている番号付け規則(カバット番号付け)も提供する。これは、異なる重鎖間又は異なる軽鎖間で対応する残基には、同じ番号を割り当てるものである。

「抗体」という用語には、完全な抗体及びその結合性断片が含まれる。典型的には、断片は、完全な抗体と競合するものであり、標的に対して特異的に結合する抗体を由来とする。これには、分離した重鎖、軽鎖 Fab、Fab'、F(ab')₂、F(ab)c、Dabs、ナノボディ及びFvが含まれる。断片は、組換えDNA技術又は完全な免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的分離によって生産することができる。「抗体」という用語は、二重特異性抗体も含む。二重特異性抗体又は二機能性抗体は、2つの異なる重鎖/軽鎖対及び2つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である(例えば、Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148: 1547-53 (1992)を参照)。

「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の部位をいう。エピトープは、連続したアミノ酸か、1又は複数のタンパク質に関する三次フォールディングが近接して並んだ非連続アミノ酸から形成することができる。連続したアミノ酸(別名線形エピトープ)から形成されたエピトープは、変性溶媒に曝露しても典型的には保持される一方で、三次フォールディングによって形成されるエピトープ(別名配座のエピトープ)は、変性溶媒処理により典型的には失われる。エピトープは、固有の空間的配座において、少なくとも3つ、より通常は少なくとも5つ又は8-10のアミノ酸を典型的には含む。エピトープの空間的配座を決定する方法は、例えば、X線結晶及び二次元NMRを含む。Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)を参照。

同一か重複するエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対してある抗体の能力が他の抗体の結合性と競合することを明らかにする単純なイムノアッセイにて特定することができる。抗体のエピトープは、その抗原に結合した抗体のX線結晶解析で規定して接触残基を特定することができる。あるいは、ある抗体の結合性を減らすか失わせる、抗原におけるアミノ酸変異の全てが、別の抗体の結合性も減らすか失わせる場合、2つの抗体は同じエピトープを有する。ある抗体の結合性を減らすか失わせるアミノ酸変異のいくつかが、別の抗体の結合性も減らすか失わせる場合、2つの抗体は重複するエピトープを有する。

抗体間の競合は、試験下のある抗体が共通抗原に対する参照抗体の特異的な結合を阻害するアッセイによって決定される(例えば、Junghans et al, Cancer Res. 50:1495, 1990を参照)。競合結合アッセイでの測定により、過剰な試験抗体(例えば、少なくとも2x、5x、10x、20x又は100x)が参照抗体の結合性を少なくとも50%、好ましくは75%、90%又は99%阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。競合アッセイによって同定される抗体(競合する抗体)には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体と、参照抗体が結合するエピトープに充分近位の隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。これは、立体障害が発生するためである。

「患者」という用語には、予防か治療処置を受けるヒト及び他の哺乳類被験体が含まれる。

アミノ酸置換を保存的又は非保存的に分類する目的で、アミノ酸を以下のように分類してもよい：
グループI(疎水性側鎖)：met、ala、val、leu、ile；グループII(中性の親水性側鎖)：cys、ser、thr；グループIII(酸性側鎖)：asp、glu；グループIV(塩基性側鎖)：asn、gln、his、lys、arg；グループV(鎖の立体構造に影響を及ぼす残基)：gly、pro；グループVI(芳香族側鎖)：trp、tyr、phe。保存的置換は、同じクラスにおけるアミノ酸間の置換に関するものである。非保存的置換は、これらのクラスの内の１つのメンバーをもう一方のメンバーと交換することから構成される。

配列同一性のパーセンテージは、カバット番号付け規則によって最大限アライメントされた抗体配列によって決定される。アライメントの後、対象の抗体領域(例：重鎖又は軽鎖の全ての成熟可変領域)と、参照する抗体の同じ領域とを比較する場合、対象の抗体領域と参照する抗体領域との間における配列同一性のパーセントは、対象の抗体領域と参照する抗体領域の両方において同じアミノ酸によって占められる位置の数を、2つの領域においてアライメントされた位置の総数(ギャップは数に入れない)で割り、100を掛けることでパーセントに変換されるものである。

1又は複数の詳述されたエレメントを含む組成物又は方法は、特に詳述されていない他のエレメントを含むことができる。例えば、抗体を含む組成物は、抗体単独又は他の成分との組合せとして含むことができる。

詳細な説明
I. 一般
本発明は、IL-2及びIL-15に関する受容体の1つのコンポーネントであるCD122と特異的に結合するモノクローナル抗体を提供するものである。本モノクローナル抗体は、IL-2及びIL-15の両方が媒介する機能を、これらのサイトカインがそれぞれの受容体に結合することを阻害することによって実質的に阻害する能力を有する。本モノクローナル抗体は、他の適用中において、望ましくない免疫応答又は癌の治療を阻害するために用いることができる。

II.標的分子
特に明記しない限り、CD122は、ヒトCD122を意味する。例示的なヒト配列は、Swiss Prot登録番号P14784が割り当てられている。その公知の天然対立遺伝子多型は、10 L → V: dbSNP rs57770674、83 S → F, dbSNP rs2228143及び391 D → E: dbSNP rs228942を含む。完全なヒトCD122配列は、アミノ酸1-26がシグナルペプチドである551個のアミノ酸を有する。およそ、27-240残基は、細胞外ドメインを構成する。およそ、241-265残基は、膜貫通領域を構成し、およそ、266-551残基は、細胞質ドメインを構成する。本発明の抗体は、CD122の細胞外ドメイン中のエピトープに結合する。

変異残基は、配列番号:73(シグナル配列がないヒトCD122の完全な配列)を参照することで規定される。結合実験で使用するCD122の実際の形態が配列番号:73以外の場合(例えば、配列番号:73のN末端切断)は、変異体は、いかなる形態のCD122を使用しようとも配列番号:73と最大限アライメントした場合の対応する残基である。

CD122は、背景で述べられるように、CD132、CD25及び/又はIL-15Rαと結合して受容体を形成する。要するに、CD122及びCD132の組合せは、IL-2及びIL-15に対して中親和性の受容体を構成する。CD122、CD132及びCD25の組合せは、IL-2に対して高親和性の受容体を構成し、CD122、CD132及びIL-15Rαの組合せはIL-15に対して高親和性の受容体を構成する。

特に明記しない限り、CD132、CD25及び/又はIL-15Rαは、これらのタンパク質のヒト型を指す。ヒトCD132に関する例示的なヒト配列は、Swiss Prot P31785と称するものであり、これは、369個のアミノ酸のタンパク質であり、およそ1-22残基がシグナルペプチドで、23-262が細胞外ドメインで、263-283が膜貫通領域で、284-369が細胞質ドメインである。

CD25に関する例示的なヒト配列は、Swiss Prot P01589と称するものであり、これは、272残基のアミノ酸配列であり、およそ残基1-21がシグナルペプチドで、残基22-240が細胞外ドメインで、残基241-259が膜貫通領域で、残基260-272が細胞質ドメインである。

IL-15Rαに関する例示的なヒト配列は、Swiss Prot Q13261と称するものであり、これは、267残基のタンパク質であり、およそ1-30がシグナルペプチドで、31-205が細胞外ドメインで、206-228が膜貫通領域で、229-267が細胞質ドメインである。

もし前後関係から別途明らかでなければ、上記受容体の1つに対する参照は、少なくともタンパク質の細胞外ドメインと、通常は切断可能シグナルペプチドを除く完全なタンパク質とを意味する。

背景で述べられるように、上記受容体は、IL-2及びIL-15に結合し、その後者は、シス又はトランス提示することができる。もし前後関係から別途明示がなければ、これらの分子は、これらのタンパク質のヒト型を指す。ヒトIL-2に関する例示的な配列は、Swiss Prot P60568と称するものであり、アミノ酸1-20がシグナルペプチドである153個のアミノ酸のタンパク質配列である。ヒトIL-15に関する例示的な配列は、Swiss Prot P40933と称するものであり、アミノ酸1-29がシグナルペプチドである162個のアミノ酸のタンパク質である。もし前後関係から別の明示がなければ、IL-2又はIL-15に対する参照は、シグナル配列が取り除かれた成熟タンパク質を意味する。

III. 本発明の抗体
A. 結合特異性及び機能的特性
本発明は、CD122タンパク質内のエピトープに結合するモノクローナル抗体を提供するものである。ABC2及びABC101と称する抗体は、2つのかかる例示的なマウス抗体である。ABC2及びABC101は、ヒトCD122に特異的に結合する。本発明のABC2及びABC101及びいくつかの他の抗体は、カニクイザルCD122に対する特異的結合によって、そしてマウス及びイヌCD122に対する著しい結合性欠損によって更に特徴づけられる。CD122に対する結合は、CD122単独及び/又は上記CD122組み込み受容体のいずれかから立証することができる。本発明のモノクローナル抗体は、以下の点で特徴づけられる；単一の薬剤としてのモノクローナル抗体は、IL-2及びIL-15の両方に対するCD122組み込み受容体の結合と、IL-2及びIL-15の両方に応答する細胞増殖に対するシグナル伝達と、を実質的に阻害する能力を有する点。

好ましい抗体は、低親和性及び高親和性の両方のCD122組み込み受容体にIL-2及びIL-15が結合することを阻害して、シス及びトランスの両方におけるIL-15の結合を阻害することができる。かかる抗体は、以前に報告されているCD122に対する抗体(Mik-β1及びそのヒト化形態を含む)とは区別される。実施例8に示すように、HuMik-β1は、CD122をもつ細胞の可溶性IL-15媒介増殖をわずかに阻害する能力が示され、CD122を含む高親和性IL-2受容体をもつ細胞に対するIL-2媒介増殖を阻害する能力は検出されないことが示される。Mik-β1、そのヒト化形態及びCD122に対する他の公知の抗体は、トランス提示のIL-15を阻害するあらゆる能力又は少なくとも実質的な能力が欠如している。

阻害は、結合性アッセイにおいて立証することができる。結合アッセイは、CD122組み込み受容体を細胞上に発現させて、試験される抗体存在下において、IL-2又はIL-15を結合させるアッセイである。あるいは、又は、加えて、阻害は、IL-2又はIL-15の存在下において適切な細胞上にCD122組み込み受容体を発現させて、IL-2又はIL-15媒介細胞増殖に対するモノクローナル抗体の効果を評価することによって立証することができる。IL-15の阻害は、かかるフォーマットにおいてシス又はトランスについて試験できる。阻害を示す例示的なアッセイフォーマットは、実施例において提供される。任意に、試験抗体の阻害は、CD122若しくはその受容体共コンポーネント又はIL-2及びIL-15に結合しない無関係なコントロール抗体との比較、又は任意の抗体を欠く媒体との比較において立証することができる。

実質的な阻害とは、結合、細胞増殖及び/又は他の機能的な活性であってIL-2又はIL-15によって媒介されるものを、少なくとも25、30、40、50又は75%(例えば、25-75%又は30-70%)阻害することを意味する。阻害は、抗体がIL-2又はIL-15リガンドに対して100倍モル以下のモル過剰(例えば、2-50又は2-10又は2-5倍のモル過剰)であるときに、通常示される。機能的アッセイに関して、IL-2又はIL-15は、試験中、抗体の非存在下で充分な機能的活性を刺激するのに必要最低限の水準で典型的には存在する。抗体は、通常、50nMから5μΜの濃度で存在する。好ましい抗体は、低親和性又は高親和性受容体(又は、両方)とのIL-2相互作用に対して少なくとも40%の阻害を示し、シス及びトランス提示のIL-15に対して少なくとも40%>の阻害を示す。阻害の程度は、実施例2及び8にて説明するように、TF-1β細胞に対するIL-15トランス提示媒介増殖を50%>阻害に必要な抗体濃度(IC50)によって定量化することもできる。抗体濃度は、好ましくは2μg/ml未満、より好ましくは1μg/ml未満(例えば約0.1〜1又は0.5〜1μg/ml)である。加えて、実施例8にて説明するように、高親和性IL-2受容体をもつ細胞に対してIL-2媒介TF-1αβ増殖を50%阻害するのに必要な抗体濃度は、好ましくは100又は50μg/ml未満(例えば10-50μg/ml)である。

これらの結果から明らかであるように、本発明の抗体のIC50は、阻害する相互作用の性質に依存する。高親和性IL-2受容体をもつ細胞に関して、抗CD122がIL-2を阻害することは、IL-15トランス提示を阻害するよりも、非常に困難(即ち、同じ抗体がより高濃度必要)である。中親和性IL-2受容体だけを有する細胞に関して、IL-15トランス提示を阻害することは、可溶性IL-2又はIL-15を阻害するよりも困難(即ち、同じ抗体がより高濃度必要)である。

好ましい抗体は、動物モデル又は臨床試験にて示されるような免疫不全又は癌も阻害する。移植片対宿主疾患に対する活性を試験する動物モデルは、実施例において述べられている。動物モデルに関するいくつかの他の実施例は、背景節で述べられている。かかるモデルの1つは、上記Villadsenらによる記載のSCID/乾癬モデルである。サルCD122と交差反応する抗ヒトCD122抗体は、非ヒト霊長類の臓器移植において試験することができる(上記Tinubuら)。ヒト癌細胞を免疫不全実験動物(例えばマウス又はラット)に導入された癌の動物モデルは、広く利用可能である。

本発明におけるある抗体は、ABC2又はABC101と称する抗体と同一又は重複するエピトープに結合する。これらの抗体の重鎖及び軽鎖の成熟可変領域の配列は、それぞれ所定の配列番号25及び30、並びに35及び40である。かかる結合特異性を有する他の抗体は、CD122又は所望のエピトープを含むその一部分でマウスを免疫して、その結果得られたCD122結合性抗体をスクリーニングする(任意にABC2又はABC101と競合させる)ことで生産することができる。そして、かかるアッセイによって特定された抗体は、実施例又は別の方法で説明するように、IL-2及びIL-15相互作用を阻害する能力についてスクリーニングすることができる。抗体は、CD122抗原の変異形態に対してスクリーニングして、変異による変更体のコレクションに関して同一又は類似の結合プロファイルを示す抗体(例：ABC2又はABC101)を同定することもできる。変異は、一度に1残基か、又はより広い間隔の区間か、CD122抗体の細胞外ドメインの全体にわたってか、若しくはエピトープの存在が公知のセクションの間においてアラニン(又は、アラニンが既に存在する場合はセリン)で系統的に交換置換することができる。

配列番号:73の残基42、43及び65の変異は、CD122に対するABC2の特異的結合を阻害する(例えば、実施例にて述べるポジティブコントロールである抗FLAG抗体の結合性の<10%)。同様に、配列番号:73の残基65、70及び133の変異は、CD122に対するABC101の特異的結合を阻害する。比較的少ない残基が結合性に影響を及ぼし、そして、上記の複数残基は、典型的な線形エピトープ(例えば、3-20個の連続したアミノ酸)より広く間隔が開いているので、これらの結果から、ABC101が(おそらくABC2も)配座エピトープに結合することが示される。あるいは、結合性に影響を及ぼす残基の1又は複数は、抗体と直接接触しないで、アロステリック的にそのようにすることができる。アラニンでなくスレオニンによる残基65の変異生成が結合を阻害するという観察は、この残基がアロステリック的に結合に影響を及ぼしていることを示している。配列番号:73の残基42、43、65、70及び133を1又は複数個含むエピトープ、特に残基42、65及び133を1又は複数個含むエピトープに結合する他の抗体は、ABC2及びABC101と有用な阻害特性を共通する可能性がある。従って、特異的結合が配列番号:73の残基42、43及び65、特に残基42及び65の1又は複数の変異生成によって阻害される抗体は、ABC2と同様の特性が共通する可能性がある。かかる抗体のあるものは、配列番号:73の残基42、43及び/又は65を含む又はからなるエピトープに結合する。かかる抗体のあるものは、残基42及び43を含む又はからなるエピトープであって、残基65が抗体の結合性にアロステリック的に影響を及ぼすエピトープに結合する。エピトープは、特定のアミノ酸(42、43及び65)の1、2又は全3つを含む又はからなる線形(例えばエピトープ(例えば、2-5、3-5、3-10、3-15、3-20、5-10、5-15又は5-20個の連続したアミノ酸))か、特定のアミノ酸の1、2又は全3つを含む又はからなる配座とすることができる。特異的結合が配列番号:73の残基65、70及び133のうちの1、2又は全3つにおける変異生成によって阻害される抗体は、ABC101と類似の阻害特性を示す可能性がある。かかる抗体のあるものは、配列番号:73の残基65若しくは133又はその両方を含む又はからなるエピトープに結合する。かかるエピトープは、特定のアミノ酸(65、70及び133)の1、2又は全3つを含む又はからなる線形(例えば、1つのエピトープ(例：2-5、3-5、3-10、3-15、3-20、5-10、5-15又は5-20個の連続したアミノ酸))か、特定のアミノ酸の1、2又は全3つを含む又はからなる配座とすることができる。本発明におけるある抗体は、アラニンによる配列番号:73の残基39又は41の置換によって、かかる結合性が実質的に阻害(例えば、実施例にて説明するように、ポジティブコントロール抗体の少なくとも50%の結合性)されることなくCD122と特異的に結合する。(残基39及び41の変異は、Mik-β1抗体の結合を阻害する)。上記抗体タイプのいずれも、配列番号:73の残基39又は41を含んでいないエピトープに特異的に結合する抗体が含まれる、言い換えれば、CD122に対する結合はこれらの残基の置換によって検出可能なレベルで阻害されない(実施例にて説明するように、ポジティブコントロール抗FLAG抗体に対して50%を上回る結合性)。

1又は複数の特定の残基を含むエピトープに結合する抗体は、これらの1又は複数の残基を含むCD122断片によって免疫することによって作り出すことができる。断片は、例えば、配列番号:73由来で100、50、25、10又は5個以下の連続したアミノ酸を有することができる。かかる断片は、配列番号:73の少なくとも5、6、7、8又は9個連続した残基を通常有する。断片は、断片に対する抗体反応の誘発を補助する担体に連結すること、及び/又はかかる反応の誘発を補助するアジュバントと組み合わせることができる。あるいは、所望の残基に結合する抗体は、完全長CD122(シグナル配列を除く)又はフィブロネクチンIIIドメイン1及び/又は2の完全長細胞外ドメイン(シグナル配列を除く)を免疫することによって得られる。そして、かかる抗体は、ヒトとマウスCD122のハイブリッドに対する結合性の差又は特定の残基の変異体と比較して野生型CD122に対する結合性の差に関してスクリーニングすることができる。ヒトとマウスCD122のハイブリッドに対するスクリーニングは、CD122内のある種のドメイン(例えばフィブロネクチンIIIドメイン1及び/又は2)に結合する抗体を明らかにする。変異体に対するスクリーニングは、結合特異性をより正確に規定して、残基43、43、65、70及び/又は133の変異生成によって結合性が阻害される抗体の同定を可能にする。上記抗体は、実証済み抗体の阻害特性と共通する可能性がある。

選択したマウス抗体(例えば、ABC2又はABC101)の結合特異性を有する抗体は、ファージディスプレイ法の変法を使用して生産することもできる。Winter、WO 92/20791を参照。この方法は、ヒト抗体の生産に特に適している。この方法では、選択したマウス抗体の重鎖又は軽鎖可変領域が出発物質として使用される。例えば、軽鎖可変領域が出発物質として選択される場合、ファージライブラリーが構築される。そのファージディスプレイの構成要素は、同じ軽鎖可変領域(すなわち、マウス出発物質)と種々の重鎖可変領域を提示する。例えば、重鎖可変領域は、再構成されたヒト重鎖可変領域のライブラリーから得ることができる。CD122に対して強い特異的結合を示すファージ(例えば、少なくとも10⁸及び好ましくは少なくとも10⁹M^-1)が選択される。そして、このファージ由来の重鎖可変領域は、更なるファージライブラリーを構成するための出発物質として役に立つ。このライブラリーにおいて、各ファージは、同じ重鎖可変領域(すなわち、最初のディスプレイライブラリーから特定される領域)と、種々の軽鎖可変領域をディスプレイする。例えば、軽鎖可変領域は、再構成されたヒト可変軽鎖領域のライブラリーから得ることができる。再度、CD122に対して強い特異的結合を示すファージが選択される。得られた抗体は、マウス出発物質と同一又は類似のエピトープ特異性を通常有する。

他の抗体は、例示的な抗体(例えばABC2又はABC101)の重鎖及び軽鎖をコードしているcDNAの変異生成によって得ることができる。以下のモノクローナル抗体も本発明に含まれる；成熟重鎖及び/又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列においてABC2又はABC101と少なくとも90%、95%又は99%の同一性があり、その機能的な特性を維持し、及び/又は、少数の機能的に重要でないアミノ酸置換(例えば、保存的置換)、削除又は挿入によってそれぞれの抗体とは異なるモノクローナル抗体。カバットによって規定される少なくとも1つ、好ましくは全6つのCDRであって、ABC2又はABC101の対応するCDRと90%、95%、99%又は100%の同一性があるものを有するモノクローナル抗体も含まれる。

B. 非ヒト抗体
例えば、CD122に対する他の非ヒトモノクローナル抗体(例えば、マウス、モルモット、霊長類、ラビット又はラット)の製造は、CD122若しくはその断片又はCD122をもつ細胞(任意に上述したその共受容体タンパク質と共発現したもの)で動物を免疫することによって達成することができる。Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988)を参照(全ての目的のために参照によって組み込まれる)。かかる免疫原は、天然原料から、ペプチド合成によって、又は組換え発現によって得ることができる。任意に、免疫原は、キャリアータンパク質と融合するか、そうでなければ複合体として投与することができる。任意に、免疫原は、アジュバントと共に投与することができる。後述するように、数種類のアジュバントを使用することができる。完全なフロイントアジュバントに続く不完全アジュバントは、実験動物の免疫に好ましい。ラビット又はモルモットは、ポリクローナル抗体を作成するのに一般的に使用されている。マウスは、モノクローナル抗体を作成するのに一般的に使用されている。抗体は、CD122に対する特異的な結合性に関してスクリーニングされる。任意に、抗体は、CD122の特異的領域に対する結合に関して更にスクリーニングされる。かかるスクリーニングは、CD122の欠失変異体のコレクションに対する抗体の結合性を決定することと、どの欠失変異体が抗体に結合するかを決定することによって達成することができる。結合は、例えば、ウエスタンブロット、FACS又はELISAによって評価することができる。

C. ヒト化抗体
ヒト化抗体は、遺伝的に改変された抗体であり、非ヒト「ドナー」抗体由来のCDRをヒト「アクセプター」抗体配列に移植された、遺伝子的に改変された抗体である(例えば、Queen, US 5,530,101及び5,585,089; Winter, US 5,225,539, Carter, US 6,407,213, Adair, US 5,859,205 6,881,557, Foote, US 6,881,557を参照)。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、かかる配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列又は生殖系列領域配列とすることができる。従って、ヒト化抗体は、完全に又は実質的にドナー抗体由来のいくつか又は全てのCDRと、もし存在するならば完全に又は実質的にヒト抗体配列由来の可変領域フレームワーク配列及び定常領域とを有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全に又は実質的にドナー抗体重鎖由来の少なくとも1つ、2及び通常全3つのCDRと、もし存在するならば実質的にヒト重鎖可変領域フレームワーク及び定常領域配列由来の重鎖可変領域フレームワーク配列及び重鎖定常領域とを有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全に又は実質的にドナー抗体軽鎖由来の少なくとも1つ、2及び通常全3つのCDRと、もし存在するならば実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワーク及び定常領域配列由来の軽鎖可変領域フレームワーク配列及び軽鎖定常領域とを有する。ナノボディ及びdAbsを除いて、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体のCDRが非ヒト抗体の対応するCDRから実質的に由来するものといえるのは、対応する残基(カバットにより規定)と少なくとも85%、90%、95%又は100%の同一性がそれぞれのCDR間にある場合である。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列又は抗体鎖の定常領域がそれぞれヒト可変領域フレームワーク配列又はヒト定常領域から実質的に由来するものといえるのは、カバットによって規定される対応する残基と少なくとも85、90、95又は100%の同一性がある場合である。

ヒト化抗体は、しばしばマウス抗体由来の全6つのCDR(好ましくはカバットにより規定)が組み込まれるが、より少ないマウス抗体由来CDR(例えば、少なくとも3、4又は5つ)によって作ることもできる(例：Pascalis et al., J. Immunol. 169: 3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164: 1432-1441, 2000)。

ある抗体においては、CDRの一部、すなわち、結合に必要なCDR残基のサブセット(SDRと称される)だけがヒト化抗体の結合性を保持するのに必要である。抗原に接触せずSDRに存在しないCDR残基は、以下のことに基づいて特定することができる；以前の研究(例えば、CDR H2中の残基H60-H65は、しばしば必要でない)に基づくこと、コチア(Chothia)超可変ループ(Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987)の外側に存在しているカバットCDRの領域由来であること、分子的モデリング及び/又は経験的に、若しくはGonzales et al., Mol. Immunol. 41 : 863, 2004にて説明しているように特定すること。かかるヒト化抗体では、1又は複数のドナーCDR残基を欠いているか、完全なドナーCDRが除かれている位置において、上記位置を占有しているアミノ酸は、アクセプター抗体配列の対応する位置(カバット番号付けによる)を占有しているアミノ酸である。CDR中のドナーアミノ酸をアクセプターに含ませる置換の数は、競合する考慮すべき点のバランスを反映している。かかる置換は、ヒト化抗体におけるマウスアミノ酸の数を減少させて、その結果として潜在的な免疫原性を減少させるという、潜在的に有利な点がある。しかしながら、置換は、親和性の変化を引き起こす可能性があり、親和性の著しい減少は、好ましくは回避される。CDR中の置換の位置及び置換するアミノ酸は、経験的に選択することもできる。

ヒトアクセプター抗体配列は、多くの公知のヒト抗体配列の中から任意に選択して、ヒトアクセプター配列可変領域フレームワークとドナー抗体鎖の対応する可変領域フレームワークとの間における高い配列同一性(例えば、65-85%の同一性)を提供することができる。

ヒト可変領域フレームワーク残基由来のある種のアミノ酸は、CDR配座及び/又は抗原への結合に対する考え得る影響に基づいて置換を選択することができる。そのような考え得る影響の調査は、特定位置でのアミノ酸の特徴に関するモデル試験、又は特定アミノ酸の置換又は変異誘発の効果に関する経験的な観察によるものである。

例えば、マウス可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間でアミノ酸が異なる場合、ヒトフレームワークアミノ酸は、マウス抗体由来の等価なフレームワークアミノ酸によって置換することができる。なお、これは、アミノ酸が、
(1)非共有結合的に直接抗原と結合する、
(2)CDR領域と隣接している、
(3)さもなければCDR領域と相互作用する(例えば、CDR領域の約6Å内である)ことを相当に予想される場合である。

置換の他の候補は、その位置ではヒト免疫グロブリンにとって普通ではないアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体での相当する位置、又はより典型的なヒト免疫グロブリンでの相当する位置由来のアミノ酸によって置換することができる。置換の他の候補は、その位置ではヒト免疫グロブリンにとって普通ではないアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。

本発明の例示的なヒト化抗体は、ABC2のヒト化形態であって、配列番号:42の成熟軽鎖可変領域及び配列番号:41の成熟重鎖可変領域よって特徴づけられるものであり、HuABC2と称する。本発明は、HuABC2の変異体も提供する。かかる変異体は、数個(例：典型的には、1、2、3、5又は10以下)の置換、削除又は挿入によって、HuABC2の配列とは典型的には相違する。かかる相違は、通常、フレームワークにおいてであるが、CDRでも起こることがある。例えば、位置H28、H48、H49、H68、H93及びL71の置換のサブセットだけで作成することができる。ヒト化mAbのCDRと接触しないフレームワーク残基の多くは、ドナーマウスmAb又は他のマウス若しくはヒト抗体の対応する位置由来のアミノ酸に置換することができ、そして、多くの潜在的CDR-接触残基でさえも置換を受け入れ可能であり、CDR中のアミノ酸であっても変更可能である。CDR置換の1つの例は、CDRにおける残基を、可変領域フレームワークの供給に用いるヒトアクセプター配列の対応する位置を占める残基に置換することである。

しばしば、変異ヒト化ABC2配列に作成された置換は、置換されたHuABC2アミノ酸に対して保存的である。好ましくは、(保存的であるか否かにかかわらず)HuABC2の置換は、ヒト化mAbの結合能又は効力、すなわち、CD122及びIL-2及びIL-15を含む受容体間の相互作用を阻害するその能力に実質的な影響を及ぼさない(例えば、変異ヒト化ABC2抗体に関する本実施例又は背景に記載されているアッセイの一部又は全部の有効性は、HuABC2と本質的には同じである、即ち、実験誤差の範囲である)。好ましくは、成熟変異軽鎖及び重鎖V領域配列は、それぞれHuABC2成熟軽鎖及び重鎖V領域に対して少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の同一性がある。あるいは、他のヒト抗体アクセプター配列、特にABC2の可変領域フレームワーク配列に対して高い配列同一性を有するものも、ヒト化抗体可変領域フレームワーク配列を提供するのに適している。

HuABC2におけるある変異体においては、実証済み抗体に関して言及されているドナー置換に対するアクセプターの位置(即ち、H28、H48、H49、H68、H93及びL71)の少なくとも1、2、3、4、5又は全6つは、それぞれ、残基T、I、A、I、A及びY(マウスドナー抗体重鎖の対応する位置を占有している残基)によって好ましくは占められている。ある異体においては、位置H42は、Gによって占められている。重鎖アクセプター配列がDA430129 cDNA(GenBank登録番号)によってコードされた配列以外であるか、軽鎖アクセプター配列がM29469 cDNA(GenBank登録番号)によってコードされた配列以外である場合、ドナー置換に対するアクセプターは、特定の位置を占有している残基がアクセプターとドナー間において既に同じであるかどうかによって、特定の可変フレームワーク領域の位置における特定の占有を必要としてもよいし、必要としなくてもよい。

本発明の他の例示的なヒト化抗体は、ABC101のヒト化形態であって、配列番号:44の成熟軽鎖可変領域と配列番号:43の成熟重鎖可変領域によって特徴づけられるものであり、HuABC101と称される。本発明は、HuABC101の変異も提供する。かかる変異体は、数個(例：典型的には、1、2、3、5又は10以下)の置換、削除又は挿入によって、HuABC101の配列とは典型的には相違する。かかる相違は、通常、フレームワークにおいてであるが、CDRでも起こることがある。例えば、位置H27、H30、H48、H66、H67、H71及びL49の置換のサブセットだけで作成することができる。ヒト化抗体のCDRと接触しないフレームワーク残基の多くは、ドナーマウス抗体又は他のマウス若しくはヒト抗体の対応する位置由来のアミノ酸に置換することができ、そして、多くの潜在的CDR-接触残基でさえも置換を受け入れ可能であり、CDR中のアミノ酸であっても変更可能である。CDR置換の1つの例は、CDRにおける残基を、可変領域フレームワークの供給に用いるヒトアクセプター配列の対応する位置を占める残基に置換することである。

しばしば、変異ヒト化ABC101配列に作成された置換は、置換されたHuABC101アミノ酸に対して保存的である。好ましくは、(保存的であるか否かにかかわらず)HuABC101の置換は、ヒト化mAbの結合能又は効力、すなわち、CD122並びにIL-2及びIL-15を含む受容体間の相互作用を阻害するその能力に実質的な影響を及ぼさない(例えば、変異ヒト化ABC101抗体に関して本明細書に記載されているアッセイの一部又は全部の有効性は、HuABC101と本質的には同じである、即ち、実験誤差の範囲である)。好ましくは、成熟変異体軽鎖及び重鎖V領域配列は、それぞれHuABC101成熟軽鎖及び重鎖V領域に対して少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の同一性がある。あるいは、他のヒト抗体可変領域フレームワークアクセプター配列、特にABC101の可変領域フレームワーク配列に対して高い配列同一性を有するそれらも、ヒト化抗体フレームワークを提供するのに適している。

HuABC101におけるある変異体においては、実証済み抗体に関して言及されたドナー置換に対するアクセプターの位置(即ち、H27、H30、H48、H66、H67、H71及びL49)の少なくとも1、2、3、4、5、6又は全7つは、それぞれ、残基Y、T、M、Q、I、R及びK(マウスドナー抗体重鎖の対応する位置を占有している残基)によって好ましくは占められる。重鎖アクセプター配列がDA936142 cDNA(GenBank登録番号)によってコードされた配列以外であるか、軽鎖アクセプター配列がZ46622 cDNA(GenBank登録番号)によってコードされた配列以外である場合、ドナーから置換されるアクセプターは、特定の位置を占有している残基がアクセプターとドナー間において既に同じことであるかどうかによって、特定の可変フレームワーク領域の位置における特定の占有に必要としても必要としなくてもよい。

D. キメラ及びベニア化抗体
発明は、更にキメラ及びベニア化形態の非ヒト抗体、特に実施例のABC2及びABC101抗体を提供するものである。

キメラ抗体は、非ヒト抗体(例えば、マウス)の軽鎖及び重鎖の成熟可変領域がヒト軽鎖及び重鎖定常領域と結合した抗体である。かかる抗体は、実質的又は完全にマウス抗体の結合特異性を保持し、約2/3がヒト配列になる。

ベニア抗体は、非ヒト抗体のCDRの一部及び通常は全てと、非ヒト可変領域フレームワーク残基の一部とを保持するが、B細胞又はT細胞エピトープ(例えば露出した残基)(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)に関与できる他の可変領域フレームワーク残基をヒト抗体配列の対応する位置由来の残基に置換したヒト化抗体の一種である。その結果物は、CDRは完全に又は実質的に非ヒト抗体由来であり、非ヒト抗体の可変領域フレームワークは、置換によって、よりヒトのようになっている抗体である。ABC2又はABC101抗体のベニア化形態は、本発明に含まれる。

E. ヒト抗体
CD122に対するヒト抗体は、後述する様々な技術によって提供される。あるヒト抗体は、競合結合実験によってか、Winter(上述又は別途)のファージディスプレイ法よってか、そうでなければ特定のマウス抗体(例えば実施例に記載されているマウスモノクローナルの1つ)と同じエピトープ特異性をもたせて選別される。ヒト抗体は、標的抗原としてCD122の断片だけを用いて、及び/又はCD122の欠失変異体のコレクションに対して抗体をスクリーニングすることによって、特定のエピトープ特異性に関してスクリーニングすることもできる。

ヒト抗体を生産する方法には、以下のものが含まれる。トリオーマ法；Oestbergら(Hybridoma 2:361-367 (1983))： Oestberg (米国特許第4,634,664号)：及びEnglemanら(米国特許4,634,666)、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用(例えば、以下を参照、Lonberg et al., W093/12227 (1993): US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)及びファージディスプレイ法(例えば、以下を参照、Dower et al, WO 91/17271及びMcCafferty et al., WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743及びUS 5,565,332。

F. 定常領域の選択
キメラ抗体、ヒト化(ベニア化を含む)抗体、又はヒト抗体の重鎖及び軽鎖可変領域は、少なくともヒト定常領域の一部に結合することができる。定常領域の選択は、一つには、抗体依存性補体及び/又は細胞媒介細胞傷害を望むかどうか次第である。例えば、ヒトアイソトープIgG1及びIgG3は補体媒介細胞傷害を有し、ヒトアイソタイプIgG2及びIgG4は有さない。軽鎖定常領域は、ラムダ又はカッパとすることができる。抗体は2つの軽鎖及び2つの重鎖を含むテトラマーとしてか、分離した重鎖、分離した軽鎖か、Fab、Fab'、F(ab')2及びFvか、重鎖及び軽鎖可変ドメインがスペーサーで結合される単鎖抗体として発現することができる。

ヒト定常領域は、種々の個体間にアロタイプバリエーション及びイソアロタイプバリエーションを示す。すなわち、定常領域は、1又は複数の多型位置において種々の個体で異なることができる。イソアロタイプは、イソアロタイプが1又は複数の他のアイソタイプの非多型性領域に結合するという血清認識性の点でアロタイプと異なる。ヒト定常領域に対する参照は、任意の天然アロタイプをもつ定常領域又は天然アロタイプの多型性位置を占有している残基の任意の置換を含む。

軽鎖及び/又は重鎖のアミノ又はカルボキシ末端の1又は複数のアミノ酸(例えば重鎖のC末端リジン)は、ある割合の分子又は全ての分子が欠失するか、誘導体化されてもよい。置換は、定常領域においてなされ、エフェクター機能(例えば補体媒介細胞傷害又はADCC)を低減又は増加させる(例えば、Winterら、米国特許第5,624,821号; Tsoら、米国特許第5,834,597号;そして、Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006を参照)か、ヒトの半減期を延長すること(例えば、Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004を参照)ができる。典型的な置換には、抗体の半減期を増加させるための位置250のGln及び/又は位置428のLeu(EU番号付け)が含まれる。位置234、235、236及び/又は237のいずれの置換も、Fcγ受容体、特にFcγRI受容体に対する親和性を低減させる(米国特許第6,624,821号を参照)。任意に、ヒトIgG2の位置234、236及び/又は237は、アラニンで置換され、位置235はグルタミンで置換される。(米国特許第5,624,821参照)

H. 組換え抗体の発現
キメラ、ヒト化(ベニア化を含む)及びヒト抗体は、組換え発現によって典型的には生産される。組換えポリヌクレオチド構造物は、抗体鎖のコード配列に実施可能な状態で連結した発現制御配列(天然の付随プロモーター領域又は異種プロモーター領域を含む)を典型的には含む。好ましくは、発現コントロール配列は、真核生物宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションできるベクターにおける真核生物プロモーターシステムである。一旦ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現並びに交差反応抗体の回収及び精製に適する条件下で維持される。

哺乳動物細胞は、免疫グロブリン又はその断片をコードしているヌクレオチド部分を発現するのに好ましい宿主である。Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)を参照。完全な異種タンパク質を分泌することができる多くの適切な宿主細胞株は、従来技術において開発されており、それには、CHO細胞株、様々なCOS細胞株、HeLa細胞、HEK293細胞、L細胞及びSp2/0及びNS0を含む非抗体産生ミエローマが含まれる。好ましくは、細胞は、非ヒトである。これらの細胞のための発現ベクターは、発現コントロール配列(例えば、複製開始点、プロモーター、エンハンサー(Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986))、そして、必要なプロセシング情報サイト(例：リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネーター配列))を含むことができる。好ましい発現コントロール配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス等由来のプロモーターである。Co et al., J Immunol. 148: 1149 (1992)を参照。

一旦発現すると、抗体は、HPLC精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等(一般的には、Scopes, Protein Purification(Springer-Verlag、NY、1982)を参照)を含む、標準的な技術手順に従って精製することができる。

IV. 治療的応用
抗体は、様々な望ましくない免疫応答(IL-2又はIL-15の相互作用を阻害する抗体が個々に使われたことによるものを含む)を抑制するために用いることができる。

本発明の抗体によって治療可能な免疫不全の1つのカテゴリーは、移植拒絶反応である。同種異系細胞又は臓器(例えば、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓及び骨髄)が宿主(即ち、臓器提供者及び被移植者は、同じ種由来の互いに異なる個体)に移植されると、宿主免疫系は、移植における外来抗原に対して免疫応答(宿主対移植片疾患)を開始して、移植された組織の破壊を誘導する可能性がある。本発明のモノクローナル抗体は、なかでも、被移植者におけるアロ抗原誘導免疫応答を遮断するため有用である。

本発明のモノクローナル抗体の関連用途は、「移植片対宿主」疾患(GVHD)に伴う免疫応答を調節することにある。GVHDは、免疫適格細胞が同種異系被移植者に移されるときに発生する潜在的に致命的な疾患である。この状態では、臓器提供者の免疫応答細胞が、被移植者の組織を襲う可能性がある。皮膚、腸上皮及び肝臓の組織は、標的になりやすく、GVHDの経過中に破壊される可能性がある。免疫組織が移植される(例えば骨髄移植)と、この疾患は、特に苛酷な問題を提示する;しかし、重症ではないGVHDは、(心臓及び肝移植を含む)他のケースにおいても報告されている。

免疫抑制が望ましい更なる状況は、自己免疫疾患(例えば１型糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、スティフマン症候群、慢性関節リウマチ、重症筋無力症及び紅班性狼瘡)の治療においてである。これらの疾患において、身体は、それ自身の抗原の1つに対して細胞及び/又は体液免疫応答が進行して、その抗原の破壊や、潜在的に酷く及び/又は致命的な結果を引き起こす。自己免疫疾患は、本発明のモノクローナル抗体の1つを投与することによって治療される。

本発明のモノクローナル抗体によって治療可能な他の免疫不全には、喘息、アレルギー、小児脂肪便病、乾癬及びブドウ膜炎が含まれる。小児脂肪便病、乾癬及びブドウ膜炎は、自己免疫疾患である。

発明のモノクローナル抗体によって治療可能な他の疾患には、癌、特に白血病(例：T細胞大型顆粒リンパ球白血病)又はリンパ腫のような血液学的悪性が含まれる。かかる癌あるものは、(例えば、実証済みの抗体の1つを使用するイムノアッセイによる)タンパク質又はmRNAレベルで測定されたCD122が検出可能なレベルを示す。かかる癌のあるものは、同じタイプ、好ましくは同じ患者からの非ガン組織と比較してCD122が高いレベルを示す。任意に、癌のCD122のレベルは、治療を実行する前に測定されている。

モノクローナル抗体は、効果的な投与計画において投与される。効果的な投与計画は、用量、投与のルート及び投与の頻度を意味するものであり、発症を遅延させ、重症度を低下させ、更なる悪化を阻害し、及び/又は障害の兆候又は症状のうちの少なくとも一つを改善するものである。患者が障害を既に被っている場合、投与計画は、治療に効果的な投与計画と称してもよい。患者が一般的な集団と比較して障害リスクが高いが症状を未だ感じていない場合、投与計画は予防に効果的な投与計画と称してもよい。ある場合には、治療又は予防の有効性は、同じ患者の過去に使用したコントロール又は過去の経験と比較して個々の患者において観察することができる。他の場合には、治療又は予防の有効性は、無処置患者の対照群と比較して、処置患者の集団の前臨床又は臨床試験において証明することができる。

モノクローナル抗体の例示的な用量は、0.1-20又は0.5-5mg/kg体重(例えば、0.5、1、2、3、4又は5mg/kg)又は固定用量として10-1500mgである。用量は、治療前の患者及び反応の状態に依存するが、あるとすれば、他の因子との関係で、処置が予防であるか治療であるか、そして、疾患が急性であるか慢性的であるかに依存する。

投与は、腸管外、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所的、鼻腔内、筋肉内とすることができる。静脈内か皮下投与による体循環への投与が好ましい。静脈内投与は、例えば、ある期間(例えば30-90分)にわたる注入によることができる。

投与の頻度は、他の因子との関係で、循環における抗体の半減期、患者の状態及び投与のルートに依存する。頻度は、毎日、毎週、毎月、年四回又は患者の状態又は処置されている疾患の進行の変化に応じて不規則な間隔とすることができる。静脈内投与の例示的な頻度は、治療原因が続いている間であって、毎週から年四回の間である。但し、高い又は低い投与頻度も可能である。皮下投与について、例示的な投薬頻度は、毎日から毎月である。但し、高い又は低い投与頻度も可能である。

投与薬の回数は、疾患が急性であるか慢性であるかと、治療に対する疾患の反応に依存する。急性疾患又は慢性疾患の急性増悪に関しては、1〜10用量でしばしば充分である。時には、単回ボーラス投与(任意に分割方式のもの)は、急性疾患又は慢性疾患の急性増悪に充分である。治療は、急性疾患又は急性増悪の再発に対して繰り返すことができる。慢性疾患に関しては、抗体は、一定の間隔(例えば、毎週、隔週、毎月、四半期、6ヵ月毎)で、少なくとも1、5若しくは10年間又は患者の一生の間、投与することができる。

非経口投与の医薬組成物は、好ましくは無菌且つ実質的に等張であり、GMP条件の下で製造される。医薬組成物は、ユニット用量の形態(すなわち、単回投与用の用量)で提供することができる。医薬組成物は、1又は複数の生理的に許容可能な担体、希釈液、賦形剤又は助剤を使用して調製することができる。製剤は、選択される投与ルートに依存する。注入のために、抗体は、水溶液において、好ましくは生理的に適合する緩衝液(ハンクス液、リンゲル液又は生理食塩水又は酢酸緩衝液(注入部位における不快を低減させる目的の液体))において調製することができる。溶液は、製剤化剤(例えば懸濁、安定化及び/又は分散剤)を含むことができる。あるいは、抗体は、使用の前に適切な媒体(例えば、滅菌された発熱性物質を含まない水)で構成するために凍結乾燥の形態とすることができる。

本発明の抗体での治療は、処置されている疾患に対して、効果的な他の治療と組合せることができる。免疫不全の治療に関しては、従来型の治療には、マスト細胞脱顆粒阻害剤、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬及びより強い抗炎症剤(例えばアザチオプリン、シクロホスファミド、リューケラン、FK506及びサイクロスポリン)が含まれる。生物抗炎症剤(例えばタイサブリ(登録商標)(ナタリズマブ)、又は、ヒュミラ(登録商標)(アダリムマブ))を使用することもできる。癌治療に用いる場合、本発明の抗体は、化学療法、放射線、幹細胞治療、手術又は、他の生物物質(biologies)(例えばHER2抗原に対するハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、VEGFに対してアバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)又はEGFレセプターに対する抗体(例：エルビタックス(登録商標)セツキシマブ及びベクチビックス(登録商標)(パニツムマブ))での治療と組合せることができる。化学療法薬剤は、クロラムブシル、シクロホスファミド又はメルファラン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロン、メトトレキサート、フルダラビン、及びシタラビン、エトポシド又はトポテカン、ビンクリスチン及びビンブラスチンを含む。

V. その他の応用
抗CD122抗体は、臨床診断若しくは治療との関係か、研究においてCD122を検出するために用いることができる。例えば、抗体を使用して、患者が治療に適する免疫媒介疾患を被っているという指標としてT細胞上のCD122の存在を検出することができる。癌上のCD122発現も、癌が本発明の抗体での治療に適するという指標となる。抗体は、T細胞及び様々な刺激に対するそれらの反応を検出することについて、研究室での研究のための調査試薬として販売することもできる。かかる使用において、モノクローナル抗体は、蛍光分子、スピン-標識分子、酵素又はラジオアイソタイプでラベルすることができ、CD122のためのアッセイを実行するために必要な試薬を全て有するキットの形で提供することができる。抗体は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによってCD122を精製するために用いることもできる。

上記又は下記で引用する全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、あたかも個々のアイテムが参照により充分に組込まれていることを具体的且つ個々的に示しているかのようにあらゆる目的に関してそれら全てが参照により同程度に組込まれている。種々のバージョンの配列が種々の時間で受託番号と関連している場合、本願の有効出願日の受託番号と関連するバージョンを意味する。有効出願日は、受託番号(適用可能な場合)を記載している実際の出願日又は優先権適用の出願日の最先のものであることを意味する。同様に、刊行物、ウェブサイト等の種々のバージョンが種々の時間で発表されている場合、有効出願日の最も近くに発表されたバージョンのことを、特に明記しない限り意味する。発明に関する任意の機構、ステップ、エレメント、実施形態又は態様は、別途具体的に明示されない限り、任意のもう一方と組合わせて使用することができる。本発明が明快さや理解のために図と例とをあげて幾らか詳細に記載しているが、ある種の変更及び修正は、添付の特許請求の範囲内で実施してもよいことは明らかである。

下記実施例は、ヒトCD122に対するモノクローナル抗体の製造、特性評価及びヒト化について述べており、本願に記載の抗体を決定できる結合性特性による例示的な方法も提供する。

実施例1
マウス抗ヒトCD122モノクローナル抗体の単離
2つの形態の免疫原を用いて、マウスの抗CD122反応を誘発した:ヒトIgG1 Fc領域に融合した単離されたヒトCD122細胞外領域(CD122-Fc)と、完全長ヒトCD122及びヒトCD132(完全なネイティブヒトIL-2/15の中親和性受容体)を細胞表面上に安定して発現しているマウス骨髄腫細胞(NS0)形質導入体(NS0-βγ)。CD122-Fcをコードしている遺伝子は、ヒトCD122細胞外領域(そのシグナルペプチドを含む)コード配列5'にヒトIgG1 Fcコード配列を融合することによって作成した。CD122-Fc遺伝子は、ヒトCMV初期プロモーター制御下の発現ベクターにクローニングした。発現ベクターは、選択のためのgptマーカーも含んでいる。そして、CD122-Fc発現ベクターは、エレクトロポレーションによってマウス骨髄腫細胞株NS0(European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK)へ導入し、形質導入体は、gptマーカーを用いて選択した。形質導入体の使用済み培地をELISAでCD122-Fcの分泌物についてスクリーニングし、無血清細胞増殖培養液を使用したハイブリドーマSFM(Invitrogen, Carlsbad, CA)に高生産性細胞株を展開した。CD122-Fcは、使用済み無血清培地からプロテインAセファロース(登録商標)アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。NS0-βγ安定形質導入体は、完全長ヒトCD122及びCD132コード配列の両方を含んでいる発現ベクターをNS0細胞にトランスフェクションすることによって、同様に作成した。細胞表面上に両遺伝子産物を発現している形質導入体は、市販の抗ヒトCD122及びCD132抗体を用いたフローサイトメトリーによって同定された。

マウスハイブリドーマの作製は、標準的な手順を用いて行われた。ハイブリドーマ培養液上清を、ELISAによってヒトCD122に対する反応性についてまず初めにスクリーニングした。マイクロタイタープレートをCD122-Fc又は無関係なFc融合タンパクで被覆した。マウスハイブリドーマの使用済み培地をマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。インキュベーション後、プレートをPBSによって洗浄し、ペルオキシダーゼ共役ヤギ-抗マウスカッパポリクローナル抗体を用いてインキュベーションし、再び洗浄して、ペルオキシダーゼ担体ABTSによって検出した。無関係なFc-融合タンパクに対してではなくCD122-Fcに対して反応性を示す上清は、CD122に特異的であるとして、そのハイブリドーマを展開した。細胞表面に発現したネイティブヒトCD122に対する反応性は、これらの上清がトランスフェクションしていないNS0ではなく、NS0-βγ及びヒトT細胞(PHA及びIL-2によって活性化されたもの)と反応することがフローサイトメトリーにより示されることによって確認した。

ネイティブヒトCD122に対して特異的結合を示す抗体を分泌しているマウスハイブリドーマを個々にサブクローニングし、アイソタイプ化し、そしてモノクローナル抗体精製用無血清培地を用いたハイブリドーマ-SFMに展開した。マウスIgG2a及びIgG2b抗体は、プロテインAセファロース(登録商標)アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、マウスIgG1は、プロテインGを使用して精製した。精製されたマウス抗ヒトCD122モノクローナル抗体は、フローサイトメトリーによって通常の細胞(ヒトT細胞)及びトランスフェクションした細胞(NS0-βγ)の表面に発現したヒトCD122に対する結合を確認することによってまず初めに特徴付けた。2つの抗CD122抗体、ABC2(IgG1/カッパ)及びABC101(IgG2b/カッパ)は、CD122結合及び機能アッセイにおいて、それらの初期性能に基づいて選別した。ABC2及びABC101の両方は、ヒト及びカニクイザルCD122に対して特異的に結合し、イヌ及びマウスCD122に対する結合性は著しく欠いていた(すなわち、無関係なコントロール抗体と検出可能レベルでは差がなかった)。

実施例2
IL-15媒介増殖の阻害
ヒト赤白血病細胞株TF-1(ATCC, Manassas, VA)の成長は、外因的に供給されるサイトカイン(例えばGM-CSF又はIL-3(Kitamura, T., et al., Blood 73:375-380 (1989)))に、完全に依存している。TF-1は、共通γ鎖(CD132)及びIL-15受容体α鎖を発現する(Mortier et al, J. Biol. Chem., 281 :1612-1619 (2006))が、IL-2/IL-15受容体β鎖(CD122)は発現しないため、IL-15は、TF-1の成長を支えることができない。TF-1におけるCD122遺伝子の発現によって、中及び高親和性IL-15受容体の発現が可能になり、ヒトIL-15が形質導入体の成長を支えることができる。TF-1βは、ヒトCD122をコードする遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を載せた哺乳類発現ベクターによるTF-1の安定トランスフェクションによって作製した。TF-1βは、ヒトIL-15が存在し、ヒトIL-15Rαの細胞外領域の一部に結合したヒトIL-15の可溶性複合体(scIL-15/IL-15Rα)が供給されると成長する。scIL-15/IL-15Rαは、IL-15/IL-15Rα複合体結合細胞の代わりであり、IL-15のトランス提示を表す(Mortier et al., J. Biol. Chem., 281 :1612-1619 (2006))。IL-15/IL-15Rα断片複合体(scIL-15/IL-15Rα)は、ヒトIL-15RαスシドメインをペプチドリンカーでヒトIL-15に接続して、6つのヒスチジン残基をカルボキシル末端に加えること(基本的には、Mortierら(J. Biol. Chem., 281 : 1612-1619 (2006))による報告に従う)によって構成されたものであり、IL-15トランス提示のモデルとなる。

トランス提示のIL-15によって媒介される細胞増殖を阻害する抗CD122モノクローナル抗体の能力は、TF-1β細胞及びscIL-15/IL-15Rαを使用して実験した。典型的実験において、6x10⁴TF-1β細胞を、様々な量の精製マウス抗CD122モノクローナル抗体で37℃10分間インキュベートした。そして、10ng/mlのscIL-15/IL-15Rαを加えて、細胞を更に72時間37℃でインキュベートし、その後、テトラゾリウム塩WST-8(Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD)を加えた。WST-8での3時間37℃のインキュベーション後、450nmでの吸光度を測定することによって細胞増殖を推定した。450nmでの吸光度は、デヒドロゲナーゼ活性を示すものであり、生細胞の数に正比例する。試験抗体存在下の増殖レベルを抗体非存在下のものと比較して、阻害活性を決定した。図1に示すように、ABC2及びABC101は、IL-15のトランス提示(すなわち、scIL-15/IL-15Rα存在下)によって媒介されるTF-1β細胞の成長を実質的に抑制した。このことから、濃度1.0μg/mlのABC2及び0.5μg/mlのABC101でおよそ50%の阻害が示された。

シス提示のIL-15によって媒介される細胞増殖を阻害する抗CD122モノクローナル抗体の能力も、TF-1βを使用して実験した。典型的実験において、6x10⁴TF-1β細胞を、様々な量の精製抗CD122抗体で37℃10分間インキュベートした。そして、IL-15を10ng/ml加え、細胞を更に72時間37℃でインキュベートした。細胞増殖のレベルは、上記の通り、テトラゾリウム塩WST-8を使用して測定し、試験抗体がないものと比較した。ABC2及びABC101は、TF-1β増殖を、370ng/mlの濃度でそれぞれ約75%及び40%実質的に阻害した。

実施例3
中親和性及び高親和性IL-2受容体を介するIL-2媒介増殖の阻害
TF-1β細胞を使用して、中親和性IL-2受容体を介するIL-2媒介細胞増殖を阻害する能力についてABC2及びABC101を分析した。典型的実験において、6x10⁴TF-1β細胞を、様々な量の精製抗CD122抗体で37℃10分間インキュベートした。そして、IL-2を200ng/ml加え、細胞を更に72時間37℃でインキュベートした。細胞増殖のレベルは、上記の通り、テトラゾリウム塩WST-8を使用して測定し、試験抗体のないものと比較した。ABC2及びABC101の両方とも、TF-１β細胞のIL-2媒介成長を、80ng/mlの濃度で50%以上の阻害を示して、実質的にIL-2活性を中和した。

高親和性IL-2受容体を介してIL-2媒介細胞増殖を阻害する能力について、ABC2及びABC101を更に実験した。ヒトCD25及びCD122をコードする哺乳類の発現ベクターを用いるTF-1の安定トランスフェクションによってTF-1αβを作製して、これによって高親和性IL-2受容体を発現させた。典型的実験において、6x10⁴TF-1β細胞を、様々な量の精製抗CD122抗体で37℃10分間インキュベートした。そして、IL-2を10ng/ml加え、細胞を更に72時間37℃でインキュベートした。細胞増殖のレベルは、上記の通り、テトラゾリウム塩WST-8を使用して測定し、試験抗体のないものと比較した。図2に示すように、ABC2及びABC101は、IL-2の存在下で、TF-1αβ細胞の成長を実質的に阻害した。10μg/mlで、ABC2及びABC101は、TF-１β増殖を、それぞれ49%及び46%阻害した。

実施例4
重鎖及び軽鎖可変領域の配列決定
TRIzol試薬(Invitrogen)を使用して、およそ10⁷のハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出した。5'-RACE用oligo dT付きcDNAをGeneRacerキット(Invitrogen, Carlsbad, CA)、又は、SMARTer RACE cDNA Amplificationキット(Clontech, Mountain View, CA)を使用して供給元の手順に従って合成した。重鎖及び軽鎖用可変領域cDNAは、マウスγ-1及びカッパ鎖定常領域に対してそれぞれアニールする3'プライマーと、GeneRacerキット又はSMARTer RACE cDNA Amplificationキットにて提供される5'-RACEプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって増幅した。重鎖可変領域(VH)のPCR増幅のために、3'プライマーは、配列5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3'(ガンマ-1用)(配列番号:17)、5'-GCCAGTGGATAGACCGATGG-3'(ガンマ-2a用)(配列番号:18)又は5'-GCCAGTGGATAGACTGATGG-3'(ガンマ-2b用)(配列番号:19)を有する。軽鎖可変領域(VL)のために、3'プライマーは、配列5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3'(配列番号:20)を有する。増幅されたVH及びVL cDNAは、配列決定のためにpCR4Blunt-TOPOベクター(Invitrogen)にサブクローニングした。いくつかの重鎖及び軽鎖クローンを配列決定し、典型的なマウス重鎖及び軽鎖可変領域に対して特有の配列ホモログが同定された。

ABC2 VHのコンセンサスcDNA及び推定アミノ酸配列は、図3に示される。シグナルペプチド配列(MKLWLNWVFLLTLLHGIQC)(配列番号:21)は、イタリックである。成熟ポリペプチド(E)のN末端アミノ酸残基は、二重下線を引いている。カバットらの定義(Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991)に従うCDR配列は、下線を引いている。ABC VHのCDR1、CDR2及びCDR3配列は、それぞれDFYME(配列番号:22)、ASRNKANDYTTEYSASVKG(配列番号:23)及びSYYRYDGMDY(配列番号:24)である。成熟ABC2 VHのアミノ酸配列は、EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCARSYYRYDGMDYWGQGTSVTVSS(配列番号:25)である。

ABC2 VLのコンセンサスcDNA及び推定アミノ酸配列は、図4に示される。シグナルペプチド配列(MDFQVQIFSFLLISASVIVSRG)(配列番号:26)は、イタリックである。成熟ポリペプチド(Q)のN末端アミノ酸残基は、二重下線を引いている。カバットらの定義(上記)に従うCDR配列は、下線を引いている。ABC2 VLのCDR1、CDR2及びCDR3配列は、それぞれSAISSVSYMY(配列番号:27)、DTSNLVS(配列番号:28)及びQQWNTYPYT(配列番号:29)である。成熟ABC2 VLのアミノ酸配列は、QVVLTQSPVIMSASPGEKVTMTCSAISSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLVSGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWNTYPYTFGGGTKLEIK(配列番号:30)である。

ABC101 VHのコンセンサスcDNA及び推定アミノ酸配列は、図5に示される。シグナルペプチド配列(MRVLILVYLLTVLPGILS)(配列番号:31)は、イタリックである。成熟ポリペプチド(D)のN末端アミノ酸残基は、二重下線を引いている。カバットらの定義(上記)に従うCDR配列は、下線を引いている。ABC101 VHのCDR1、CDR2及びCDR3配列は、それぞれNDNHWWN(配列番号:32)、YIDSSGSSDNNPSLKS(配列番号:33)及びGGGRDYYGMDY(配列番号:34)である。成熟ABC101 VHのアミノ酸配列は、DVQLQESGPGLVKPSQTVSLTCTVTGYSITNDNHWWNWIRQVSGSKLEWMGYIDSSGSSDNNPSLKSQISITRDTSKNQLFLQLNSVTIEDIGTYYCARGGGRDYYGMDYWGQGTSVTVSS(配列番号:35)である。

ABC101 VLのコンセンサスcDNA及び推定アミノ酸配列は、図6に示される。シグナルペプチド配列(METDTLLLWVLLLWVPGSTG)(配列番号:36)は、イタリックである。成熟ポリペプチド(D)のN末端アミノ酸残基は、二重下線を引いている。カバットらの定義(上記)に従うCDR配列は、下線を引いている。ABC101 VLのCDR1、CDR2及びCDR3配列は、それぞれRASQSVSTSSYSYVH(配列番号:37)、YASNLES(配列番号:38)及びQHSWDIPFT(配列番号:39)である。成熟ABC101 VLのアミノ酸配列は、DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYSYVHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWDIPFTFGGGTKLEIK(配列番号:40)である。

実施例5
ABC2 VH及びVLのヒト化
ヒト化VH及びVL遺伝子の設計及び構造は、以前から述べられている通りに実行した(Tsurushita, N., et al., Methods 36:69-83 (2005))。マウスABC2 VHフレームワークに対するヒトVH配列ホモログは、GenBankデータベース内で検索され、ヒトDA430129 cDNAによりコードされているVH配列(DA430129 VH)(GenBank受託番号; Kimura, K., et al., Genome Res. 16:55-65 (2006))をヒト化用アクセプターとして選択した。成熟ABC2 VH、ヒト化ABC2 VH(HuABC2 VH)及びヒトアクセプターDA430129 VH領域のアミノ酸配列のアライメントは、図7に示されている。配列より上の数字は、カバットら(上記)に従う位置を示す。カバットら(上記)によって定義されたCDR配列は、ABC2 VHアミノ酸配列に下線を引いている。HuABC2 VHアミノ酸配列を設計するために、まず初めにマウスABC2 VHのCDR配列をDA430129 VHの対応する位置へ移した。次に、マウスABC2可変領域の３次元モデルがCDRとの著しい接触を示唆したフレームワークの位置において、マウスABC2VHのアミノ酸残基で対応するヒト残基を置換した。これらの置換(HuABC2アミノ酸配列に下線を引いている)は、位置28、48、49、68及び93で実行した(図7)。加えて、DA430129 VHにおけるヒトフレームワークアミノ酸残基は、対応するV領域サブグループにおいて非定型であることがわかり、典型的残基に置換して潜在的免疫原性を減少させた。この種の置換(HuABC2 VHアミノ酸配列において二重下線を引いている)は、位置42で実行した(図7)。HuABC2 VHをコードする遺伝子は、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル及び哺乳類の発現ベクターへのクローニングのための適切な限定酵素サイトを含んでいるエクソンとして設計された。HuABC2 VH遺伝子のシグナルペプチド配列は、マウスABC2 VH遺伝子から誘導した。HuABC2 VHエクソンのスプライスドナーシグナルは、ヒト生殖細胞系JH1部分を由来とした。SpeI及びHindIIIサイトが両脇に並んでいる設計HuABC2 VH遺伝子のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列は、図8に示されている。シグナルペプチド配列は、イタリックで示している。成熟ポリペプチドのN末端アミノ酸残基は、二重下線を引いている。カバットらの定義(上記)に従うCDR配列は、下線を引いている。成熟HuABC2 VHのアミノ酸配列は、EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPGKGLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSYYRYDGMDYWGQGTTVTVSSである。(配列番号:41)。

マウスABC2 VLフレームワークに対するヒトVk配列ホモログは、GenBankデータベースで検索し、ヒトM29469 cDNA(M29469 VL)(GenBank accession number; Spatz et al, J. Immunol. 144: 2821-2828 (1990))にコードされているVk配列をヒト化用アクセプターとして選択した。成熟ABC2 VL、ヒト化ABC2 VL(HuABC2 VH)及びヒトアクセプターM29469 VL領域のアミノ酸配列のアライメントを図9に示す。配列より上の数字は、カバットら(上記)に従う位置を示す。カバットら(上記)によって定義されたCDR配列は、ABC2 VLアミノ酸配列に下線を引いている。HuABC2 VLアミノ酸配列を設計するために、まず初めにマウスABC2 VLのCDR配列をM29469 VLの対応する位置へ移した。次に、マウスABC2可変領域の３次元モデルから著しいCDR接触が示唆された単一のフレームワークの位置において、位置71(HuABC2 VLにおいて下線を引いている)におけるマウスABC2 VLのアミノ酸で対応するヒト残基を置換した(図9)。HuABC2 VLをコードする遺伝子は、マウスABC2 VL遺伝子のシグナルペプチド配列と、マウス生殖細胞系Jk1部分由来のスプライスドナーシグナルを含むエクソンとして設計された。NheI及びEcoRIサイトが両脇に並んでいる設計HuABC2 VL遺伝子のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列は、図10に示される。シグナルペプチド配列は、イタリックで示している。成熟ポリペプチドのN末端アミノ酸残基は、二重下線を引いている。カバットらの定義(1991)に従うCDR配列は、下線を引いている。成熟HuABC2 VLのアミノ酸配列は、EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAISSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLVSGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWNTYPYTFGGGTKVEIK(配列番号:42)である。

実施例6
ABC101 VH及びVLのヒト化
マウスABC 101VHフレームワークに対するヒトVH配列ホモログは、GenBankデータベースで検索し、ヒトDA936142 cDNA(DA936142 VH)(GenBank受託番号; Kimura, K., et al., Genome Res. 16:55-65 (2006))にコードされているVH配列をヒト化用アクセプターとして選択した。成熟ABC101 VH、ヒト化ABC101 VH(HuABC101 VH)及びヒトアクセプターDA936142 VH領域のアミノ酸配列のアライメントを図11に示す。配列より上の数字は、カバットら(上記)に従う位置を示す。カバットら(上記)によって定義されたCDR配列は、ABC101 VHアミノ酸配列に下線を引いている。HuABC101 VHアミノ酸配列を設計するために、まず始めにマウスABC101 VHのCDR配列をDA936142 VHの対応する位置へ移した。次に、位置27、30、48、66、67及び71におけるマウスアミノ酸は、マウスABC101可変領域の３次元モデルがCDRとの著しい接触を示唆したものであり、これらで対応するヒトフレームワーク残基を置換した。これらの位置のアミノ酸残基は、HuABC101 VH配列(図11)において下線を引いている。HuABC101 VHをコードする遺伝子は、マウスABC101 VH遺伝子のシグナルペプチド配列と、ヒト生殖細胞系JH6部分由来のスプライスドナーシグナルを含むエクソンとして設計された。SpeI及びHindIIIサイトが両脇に並んでいる設計HuABC101 VH遺伝子のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列は、図12に示される。シグナルペプチド配列は、イタリックで示している。成熟ポリペプチドのN末端アミノ酸残基は、二重下線を引いている。カバットらの定義(1991)に従うCDR配列は、下線を引いている。成熟HuABC101 VHのアミノ酸配列は、QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITNDNHWWNWIRQHPGKGLEWMGYIDSSGSSDNNPSLKSQITISRDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARGGGRDYYGMDYWGQGTTVTVSS(配列番号:43)である。

マウスABC101 VLのヒト化のために、ヒトZ46622 cDNA(Z46622 VL)(GenBank受託番号; Giachino et al., J. Exp. Med. 181 : 1245-1250 (1995))にコードされているVk配列をアクセプターとして選択した。成熟ABC101 VL、ヒト化ABC101 VL(HuABC101 VL)及びヒトアクセプターZ46622 VL領域のアミノ酸配列のアライメントを図13に示す。配列より上の数字は、カバットら(上記)に従う位置を示す。カバットら(上記)によって定義されたCDR配列は、ABC101 VLアミノ酸配列に下線を引いている。HuABC101 VLアミノ酸配列を設計するために、まず初めにマウスABC101 VLのCDR配列をZ46622 VLの対応する位置へ移した。次に、位置49のマウスアミノ酸は、マウスABC101可変領域の３次元モデルから著しいCDR接触が示唆されたものであり、これで対応するヒトフレームワーク残基を置換した。この位置のアミノ酸残基は、HuABC101 VL配列(図13)において下線を引いている。HuABC101 VLをコードする遺伝子は、マウスABC101 VL遺伝子のシグナルペプチド配列と、マウス生殖細胞系Jk2部分由来のスプライスドナーシグナルを含むエクソンとして設計された。NheI及びEcoRIサイトが両脇に並んでいる設計HuABC101 VL遺伝子のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列は、図14に示される。シグナルペプチド配列は、イタリックで示している。成熟ポリペプチドのN末端アミノ酸残基は、二重下線を引いている。カバットらの定義(1991)に従うCDR配列は、下線を引いている。成熟HuABC101 VLのアミノ酸配列は、DIVMTQSPDSLGVSLGERATINCRASQSVSTSSYSYVHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSWDIPFTFGQGTKLEIK(配列番号:44)である。

実施例7
HuABC2及びHuABC101 IgG1/κ抗体の発現
SpeI及びHindIIIによって消化したHuABC2 VH遺伝子と、NheI及びEcoRIによって消化したHuABC2 VL遺伝子を哺乳類の発現ベクターの対応するサイトに挿入し、pHuABC2を作製した。SpeI及びHindIIIによって消化したHuABC101 VH遺伝子と、NheI及びEcoRIによって消化したHuABC101 VL遺伝子は、哺乳類の発現ベクターの対応するサイトに挿入し、pHuABC101を作製した。pHuABC2及びpHuABC101の構築物(あわせて、発現ベクター)は、図15に示されている。上部のSalIサイトから時計回りに向かって、発現ベクターは、抗体重鎖遺伝子の転写を開始するためのヒトサイトメガロウイルス(CMV)主要前初期プロモーター及びエンハンサー(CMVプロモーター)から始まる重鎖転写ユニットを含む。CMVプロモーターの後には、VHエクソンと、介在イントロンを有するCH1、ヒンジ、CH2及びCH3エクソンを含むヒトガンマ-1重鎖定常領域を含むゲノム配列と、CH3の次にくるmRNA処理のためのガンマ-1遺伝子のポリアデニル化サイトが続く。重鎖遺伝子配列の後、軽鎖転写ユニットがCMVプロモーターから始まり、VLエクソンと、ヒトカッパ鎖定常領域エクソン(CL)及びその前のイントロン部分を含むゲノム配列、そしてカッパ遺伝子のポリAシグナルが続く。そして、軽鎖遺伝子の後には、SV40初期プロモーター(SV40プロモーター)と、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(gpt)と、SV40ポリアデニル化サイト(SV40ポリ(A)サイト)を含む部分が続いている。最後に、発現ベクターは、細菌性複製開始点(pUC ori)及びベータラクタマーゼ遺伝子(ベータラクタマーゼ)を含むプラスミドpUC19の一部を含んでいる。

HuABC2及びHuABC101 IgG1/κ抗体(それぞれ、HuABC2及びHuABC101)を安定して生産する細胞株を得るために、発現ベクターpHuABC2及びpHuABC101をそれぞれマウス骨髄腫細胞株NS0の染色体に導入した。NS0への安定トランスフェクションは、Bebbingtonら(Bio/Technology 10: 169-175, 1992)に記載されている通り、エレクトロポレーションによって実行した。トランスフェクションの前に、発現ベクターは、FspIを使用して線形化した。およそ、10⁷細胞に10μg線形化プラスミドをトランスフェクトして、10%FBSを含むDME培地に懸濁し、いくつかの９６穴プレートに平板培養した。２４時間後は、選択培地(10%FBS、HT培地補助剤(Sigma, St. Louis, MO)、0.25mg/mlキサンチン、及び1μg/mlミコフェノール酸を含むDME培地)を適用した。選択開始の約10日後、選択を生き残った形質導入体由来の培養上清を抗体産生のために評価した。

HuABC2及びHuABC101の発現は、標準的な手法に従うサンドイッチELISAより、捕獲用ヤギ抗ヒトIgGFcポリクローナル抗体と、捕獲したヒト化抗体を検出するためのHRP共役ヤギ抗ヒトカッパ鎖ポリクローナル抗体を使用して典型的に測定した。適切なヒトIgG1/κ抗体の量を変化させて、標準曲線を作成し、定量化を可能にした。HuABC2及びHuABC101の各々を高レベルに生産しているNS0安定形質導入体は、ハイブリドーマSFM(Invitrogen)を使用する無血清培地に順応させて増加させた。HuABC2及びHuABC101は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって培養上清から精製した。

実施例8
ヒト化抗CD122抗体の特性評価
精製されたHuABC2及びHuABC101は、可溶性IL-15/IL-15Rα複合体(上記の通り、scIL-15/IL-15Rαを使用するIL-15のトランス提示)によって媒介されるTF-1βの増殖を阻害する能力について特徴付けた(図16)。HuABC2及びHuABC101の両方とも、TF-1βの成長を実質的に阻害した一方で、マウス抗CD122モノクローナル抗体Mik-β1のヒト化バージョン(HuMik-β1; Hakimi et al、上記)は、試験した最高濃度(10μg/ml)で、わずかな阻害だけを示した。IL-15のトランス提示によって媒介されるTF-1β細胞の増殖を50%阻害するのに必要とされる抗体濃度は、HuABC2は0.7μg/ml、HuABC101は0.5μg/ml、そしてHuMik-β1はおよそ10μg/mlであった。

精製されたHuABC2及びHuABC101は、上述の通り、IL-2存在下で、高親和性IL-2受容体を発現するTF-1βの増殖を阻害する能力について更に特徴付けた(図17)。HuABC2及びHuABC101の両方とも、TF-1αβの成長を実質的に阻害した一方で、HuMik-β1は、活性を示さず、試験した最高の抗体濃度(100μg/ml)のアイソタイプコントロールで見られたものと等しい阻害レベルが示された。IL-2媒介TF-1αβ増殖を50%阻害するのに必要とされる抗体濃度は、HuABC2は14μg/ml、そしてHuABC101は42μg/mlであった。

実施例9
異物移植片対宿主疾患の進行に対するヒト化抗CD122抗体のインビボ分析
移植片対宿主疾患の進行に対するHuABC2治療の効果は、ヒト免疫適格細胞を移植された免疫不全マウスを用いる異物移植モデルにおいて確立された(van Rijn, R.S., et al., Blood 102:2522-2531 (2003))。異種移植片対宿主疾患(XGVHD)は、文献(Ito, R., et al., Transplantation 87: 1654-1658 (2009))に記載されているように、ヒト末しょう血液単核細胞(PBMC)を移すことによってNOD/Shi-scid、IL-2Rγ^null(NOG)マウスにおいて誘導した。特に、1×10⁷のヒトPBMCを静脈内へ注入してPBMCを移す前に、8-10週齢のNOGマウスを1日で2.5Gy照射した。マウスを毎日モニターして、週2回体重を測定し、疾患の進行を追跡した。XGVHDを発病しているマウスは、PBMCを移した後の2-3日で体重が減り、背中を丸めた姿勢、乱れた毛皮、運動性の低下、頻呼吸及び貧血を示し始める。照射を受けた被移植体に1×10⁷のヒトPBMCを移した10〜14日後に一般的には死亡する。ヒト化抗CD122抗体でのマウス治療がXGVHDの経過を変化させることを明らかにするために、PBMCを移す1日前、PBMCを移した日、PBMCを移した3、7及び10日後に10mg/kg(抗体/体重)のコントロールヒトIgG1抗体又はHuABC2の腹腔内注射でNOGマウスを処置した。マウスは、各抗体の投与前に体重を測定し、死亡するかIACUC指針に従って屠殺するまで、上記の通りにXGVHDの徴候をモニターした。PBMCを移した10日後に、フローサイトメトリーによって各マウスの血液に存在するヒトCD45+細胞のパーセンテージを決定することによって、ヒト細胞移植(疾患進行の指標)をモニターした。PBMCを移した10日後、コントロール抗体で処置されたマウスは、それらの体重が平均して20±2.8%減少した一方で、HuABC2で処置されたマウスは、それらの体重が平均して10±2.3%減少するだけであった。コントロール抗体で処置されたマウスは、PBMCを移した10日後、それらの血液に平均89.2±4.2%のヒトCD45+細胞があった一方で、HuABC2で処置されたマウスは、PBMCを移した10日後、それらの血液に64.9±11.6%のヒトCD45+細胞があった。コントロール抗体で処置された6匹のマウスの全ては、PBMCを移した10日後までに死亡した一方で、HuABC2で処置された6匹のマウスのうちのわずか2匹だけがその日までに死亡した。従って、3つの別々のパラメーター、体重損失のパーセンテージ、ヒト細胞移植のパーセンテージ及び死亡率によって、HuABC2で処置されたマウスは、GVHDがコントロール抗体で処置されたマウスが示したものよりも深刻ではないことが示された。

実施例10
乾癬のモデルにおけるヒト化抗CD122抗体の分析
ヒト乾癬の皮膚が重症複合免疫不全(immunodeficienct)(SCID)マウスに移植されると、乾癬の表現型の特徴(例えば、表皮肥厚、広範囲な乳頭間***形成及び炎症細胞の存在)は維持される(Nickoloff et al., Am. J. Pathol. 146: 580-588 (1995))。このモデルは、乾癬に対する候補薬の有効性の研究に使用され(Zegler et al., Lab Invest. 81 : 1253-1261 (2001); Villadsen et al., J. Clin. Invest. 112: 1571-1580 (2003); Bhagavathula et al, Am. J. Pathol. 166: 1009-1016 (2005))、このモデルの陽性効果は、通常、ヒトの有効性に対応する。この実施例では、ヒト乾癬の皮膚-SCIDマウス移植モデルにおけるHuABC2の有効性を示すインビボ実験を記載する。

典型的実験において、ヒト乾癬プラーク皮膚をいくつかのSCIDマウス上に移植する。組織が回復できた後、21日間、3日毎に動物当たり10mg/kgのHuABC2又はコントロール抗体を腹腔内注射によってマウスを処置した。動物は、治療期間の最後に殺す。周辺マウス皮膚を少量有する移植済みヒト皮膚を取り除き、10%緩衝ホルマリンにて固定する。ヘマトキシリン(hexatoxylin)及びエオシンによる染色後、組織切片を光学顕微鏡によって組織学的に調べた。各組織切片の表皮領域は、同程度の部分を捕らえ、表皮厚は、盲検下で決定される。10%緩衝ホルマリンにて固定した移植前の乾癬ドナー皮膚の小断片が、表皮厚のゼロ時間評価に使用される。表皮厚は、HuABC2とコントロールグループ間を比較して、乾癬に対するHuABC2の治療的有効性を評価する。HuABC2の効果は、(1) 乾癬の特長(表皮過形成及び乳頭間***形成を含むもの)について皮膚移植を組織学的に分析すること、及び(2) ヒトCD3又は他の細胞表面マーカーに対する抗体で組織切片を着色して浸潤細胞を同定すること、によって更に評価される。

実施例11
エピトープマッピング
CD122の細胞外領域は、D1及びD2と称される2つのフィブロネクチンタイプIIIドメインで構成される(Wang, X. et al. Science 310:1159-1163 (2005))。ABC2及びABC101によって認識されるCD122分子のエピトープの位置を特定するために、JN Biosciencesで得られた全てのマウス抗ヒトCD122抗体、CD122の様々なマウス/ヒトキメラ分子に対するそれらの結合性のパターン及びHEK293細胞の表面に発現するヒトCD122分子の単離されたドメインをフローサイトメトリーによって決定した。加えて、マウス抗CD122モノクローナル抗体Mik-β1( Tsudo et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1982-1986 (1989))を分析に含めた。それは、本出願人によって作製された更なるマウス抗CD122抗体、ABC116であった。ABC116は、ABC2及びABC101と比較してIL-2及びIL-15とのCD122相互作用を阻害する能力が弱い。

図18において表される6つの異なる組換えCD122構築物を分析に使用した。HuD1/HuD2は、ヒトCD122 D1(成熟タンパク質の位置1のAlaから位置101のPhe;配列番号:49)、及び、D2(成熟タンパク質の位置102のGluから位置214のThr;配列番号:50)ドメインを含む。位置1のAlaは、ヒトCD122コード領域のN末端Metから数えた第27番目のアミノ酸に対応する。MoD1/MoD2は、マウスCD122 D1(成熟タンパク質の位置1のAlaから位置102のPhe;配列番号:51)、及び、D2(成熟タンパク質の位置103のAspから位置215のIle;配列番号:52)ドメインを含む。HuD1/MoD2は、ヒトD1及びマウスD2ドメイン(それぞれ配列番号:49及び配列番号:52)を含む。MoD1/HuD2は、マウスD1及びヒトD2ドメイン(それぞれ配列番号:51及び配列番号:50)を含む。HuD1は、単離されたヒトD1ドメイン(配列番号:49)を含み、HuD2は単離されたヒトD2ドメイン(配列番号:50)を含む。6つの構築物の全ては、カルボキシル末端にFLAGペプチドと、その次にヒトCD55遺伝子(配列番号:53)由来のGPIアンカーシグナルを融合させた。これらの構築物は、HEK293細胞の表面発現に適切な発現用プラスミドベクターにクローンした。

6つのCD122構築物の各々を発現している形質導入体に対するABC2、ABC101、ABC116及びMik-β1(5μg/ml)の結合性は、標準的な手法を使用してフローサイトメトリーによって調べた。細胞表面上のこれらの構築物の発現は、ラット抗FLAGペプチド抗体L5(BioLegend, San Diego, CA)を使用して確認した。6つのCD122構築物のそれぞれを一過性発現しているHEK293細胞は、試験抗体の1つとまず初めにインキュベートした。そして、結合したマウス抗体は、PE標識ヤギ抗マウスIgG抗体によって検出した。これらのCD122構築物に対するABC2、ABC101、ABC116及びMik-β1の結合パターンは、図18にまとめられている。図のシンボル「+」は、試験抗体でのMCF(幾何平均チャネル蛍光)値が、各形質導入体に対するL5でのMCF値の少なくとも50%であったことを示す。シンボル「-」は、試験抗体でのMCF値が、L5での値の10%未満であったことを示す(すなわち、かかる結合性を測定できる精度の範囲内で特異的結合性が欠如していることを示す)。単独ヒトCD122のD1ドメインは、ABC2及びMik-β1の結合に充分であった。同様に、単独ヒトCD122のD2ドメインは、ABC116の結合に充分であった。ABC101の結合には、ヒトD1ドメインと、ヒト又はマウスD2ドメインとの両方が必要であったことから、ABC101のエピトープがD1及びD2ドメイン由来のアミノ酸残基を必要とすることが示された。

より詳しくは、CD122分子において認識されるエピトープの場所をABC2、ABC101及びMik-β1の各々によって特定するために、標準的な手法を使用して部位特異的変異によりHuD1/HuD2構築物(配列番号:54)に単一アミノ酸置換変異を発生させた。そして、各変異HuD1/HuD2構築物は、それぞれが、HEK293細胞の表面上での検出及び発現のために、カルボキシル末端にFLAGペプチドと、それに続くヒトCD55遺伝子(配列番号:53)由来のGPIアンカーシグナルを融合させた。分析に使用するHuD1/HuD2変異体は、図19にリストされている。各変異体の名前における、左の文字、中央の数、そして右の文字は、それぞれ野生型CD122のアミノ酸、CD122の位置、そして変異体におけるアミノ酸を意味する。図中のシンボル「+」、「+/-」、そして、「-」は、試験抗体を100ng/mlで用いたときに、試験抗体でのMCF値が、各形質導入体に対するラット抗FLAGペプチド抗体L5により得られたMCF値の少なくとも50%、10%と20%の間、そして10%以下であったことをそれぞれ示している。

ヒトCD122の位置39及び41のアミノ酸残基が、細胞表面に発現されたCD122に対するMik-β1の結合に重要であることを確認した。Dionyssopoulouら(J. Immunol. Methods, 241 :83-95 (2000))は、固相ペプチド走査を用いて、Mik-β1がD2ドメインの2つの領域(1つは、106のLeuから148のPro、もう1つは、170のGluから202のAla)に位置するアミノ酸によって形成された不連続なエピトープを認識すると以前に報告している。CD122が発現した細胞表面を調べた我々の結果からは、D2ドメインは、CD122に対するMik-β1の結合に重要ではなく、Mik-β1によって認識される決定要素は、D1ドメインに唯一存在していることが示唆される。

D1ドメインの位置42、43及び65のアミノ酸残基が、ヒトCD122に対するABC2の結合性に重要であることがわかった(図19)。ABC101の結合については、D1ドメインの位置65及び70のアミノ酸残基及びD2ドメインの位置133の残基が、重要であった(図19)。従って、特有のアミノ酸残基セットが、ヒトCD122に対するABC2及びABC101のそれぞれの結合に関係している。

図19に示されるヒトCD122の単一アミノ酸置換変異体18個に対するHuABC2及びHuABC101の結合も、結合したヒト化抗体をPE標識ヤギ抗ヒトIgG抗体によって検出した点を除いた上述の手法に従うFACSによって調べた。HuABC2及びABC2は、これら18個のCD122変異体に対する結合パターンが同じであることが示された。同様に、これらのCD122変異体に対するHuABC101の結合パターンは、ABC101のそれと同じであった。ヒトCD122のD1及びD2ドメインにおける別の単一アミノ酸置換変異体29個は、CD122に対するHuABC2又はHuABC101の結合性を実質的には減少させなかった。

IL-2及びIL-15媒介シグナル伝達を伝達するヒトCD122の機能的能力における位置42、43、65及び133のアミノ酸残基の重要性は、次の方法により評価した。完全長ヒトCD122(配列番号:73)の発現ベクターは、実施例2のTF-1β細胞の発生に使用されたものであり、これに位置42、43、65及び133で部位特異的変異を受けさせた。F-R42A(配列番号:74)、F-R43A(配列番号:75)、F-G65T(配列番号:76)及びF-H133A(配列番号:77)(図20)と称される得られた変異CD122遺伝子は、それぞれ、位置42のArgをAlaに、位置43のArgをAlaに、位置65のGlyをThrに、そして位置133のHisをAlaに単一アミノ酸置換する。TF-1安定形質導入体は、実施例2にて説明したように、これら4つの変異CD122遺伝子の各々から生み出された。

10%FCSを含むRPMI-1640培地を基本培地として使用した場合、TF-1は、2ng/ml GM-CSF存在下で健康的に生育したが、GM-CSF非存在下では全く生育しなかった。TF-1は、200ng/ml IL-2又は10ng/ml IL-15/IL-15Rα複合体(scIL-15/IL-15Rα；ヒトIL-15Rαの細胞外ドメインの一部に結合したヒトIL-15の可溶性複合体)存在下でも生育しなかった。TF-1βは、中親和性IL-2/IL-15受容体を発現するものであり、GM-CSF、IL-2又はIL-15/IL-15Rα複合体の存在下で健康的に生育した。ヒトCD122のF-R42A、F-G65T又はF-H133A変異体を発現しているTF-1細胞は、IL-2又はIL-15/IL-15Rα複合体存在下で生育する能力を失ったが、それでも、GM-CSF存在下では、それらはまだ生育可能であった。F-R43A変異体発現TF-1細胞は、IL-2、IL-15/IL15Rα複合体又はGM-CSF存在下で生育する能力を維持していた。

Claims

CD122(配列番号：73)に特異的に結合して、CD122及びCD132を含む受容体に対するIL-2及びIL-15の結合を阻害し、
ABC2の3つの軽鎖CDR及び3つの重鎖CDR(配列番号:27-29の軽鎖及び配列番号:22-24の重鎖)又はABC101の3つの軽鎖CDR及び3つの重鎖CDR(配列番号:37-39の軽鎖、配列番号:32-34の重鎖)を含む、モノクローナル抗体。
キメラ型か、ヒト化か、ベニア化である、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
ヒトIgG1カッパアイソタイプを有する、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体。
完全な抗体である、請求項1から3のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
単鎖抗体、Fab又はFab'2断片である、請求項1から3のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
配列番号:27-29の3つの軽鎖CDRを含むヒト化成熟軽鎖可変領域及び配列番号:22-24のCDRを含むヒト化成熟重鎖可変領域を含み、
前記成熟軽鎖可変領域は、配列番号:42と少なくとも90%同一性があり、
前記成熟重鎖可変領域は、配列番号:41と少なくとも90%同一性がある、
CD122に特異的に結合するヒト化抗体。
カバット番号付けによる位置H28、H48、H49、H68、H93及びL71がそれぞれ残基T、I、A、I、A及びYによって占められている、請求項6に記載のヒト化抗体。
更に、カバット番号付けによる位置H42がGによって占められている、請求項7に記載のヒト化抗体。
配列番号:37-39の3つのCDRを含むヒト化成熟軽鎖可変領域及び配列番号:32-34の3つのCDRを含むヒト化成熟重鎖可変領域を含み、
前記ヒト化成熟軽鎖可変領域は、配列番号:44と少なくとも90%同一性があり、
前記ヒト化成熟重鎖可変領域は、配列番号:43と少なくとも90%同一性がある、
CD122に特異的に結合するヒト化抗体。
カバット番号付けによる位置H27、H30、H48、H66、H67、H71及びL49がそれぞれ残基Y、T、M、Q、I、R及びKによって占められる、請求項9に記載のヒト化抗体。