JP6279466B2 - 新規な発現ベクター - Google Patents
新規な発現ベクター Download PDFInfo
- Publication number
- JP6279466B2 JP6279466B2 JP2014512690A JP2014512690A JP6279466B2 JP 6279466 B2 JP6279466 B2 JP 6279466B2 JP 2014512690 A JP2014512690 A JP 2014512690A JP 2014512690 A JP2014512690 A JP 2014512690A JP 6279466 B2 JP6279466 B2 JP 6279466B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- expression vector
- cells
- downstream
- ribosome binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 123
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 228
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 150
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 104
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 58
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 46
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 claims description 28
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 28
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims description 27
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 claims description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 23
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 22
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 22
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 claims description 20
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 claims description 17
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 13
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 claims description 12
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 claims description 12
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 claims description 12
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 11
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 8
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003166 dihydrofolate reductase inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims description 7
- 229940117937 Dihydrofolate reductase inhibitor Drugs 0.000 claims description 6
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims description 5
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims description 5
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 claims description 5
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 claims description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 4
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 92
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 73
- 101150074355 GS gene Proteins 0.000 description 68
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 56
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 52
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 50
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 36
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 30
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 23
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 23
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 14
- 102100023795 Elafin Human genes 0.000 description 12
- 101001048718 Homo sapiens Elafin Proteins 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 10
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 10
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 6
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 6
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 5
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 5
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 5
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 5
- 230000004545 gene duplication Effects 0.000 description 5
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 5
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 4
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 3
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 3
- 102000004627 Iduronidase Human genes 0.000 description 3
- 108010003381 Iduronidase Proteins 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-HNFCZKTMSA-N L-idopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-HNFCZKTMSA-N 0.000 description 3
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 3
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 3
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 3
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 3
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 108010089296 galsulfase Proteins 0.000 description 3
- 229960005390 galsulfase Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 108700006830 Drosophila Antp Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 241001634830 Geometridae Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001038874 Homo sapiens Glycoprotein hormones alpha chain Proteins 0.000 description 2
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 2
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 2
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 2
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710087237 Whey acidic protein Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 2
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000899240 Homo sapiens Endoplasmic reticulum chaperone BiP Proteins 0.000 description 1
- 101000633601 Homo sapiens Thyrotropin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100278853 Mus musculus Dhfr gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241001180873 Saposhnikovia divaricata Species 0.000 description 1
- 241001575928 Siler Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000004052 folic acid antagonist Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
- C12N9/003—Dihydrofolate reductase [DHFR] (1.5.1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/60—Vectors comprising a special translation-regulating system from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
- C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
- C12Y105/01003—Dihydrofolate reductase (1.5.1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
- C12Y603/01—Acid-ammonia (or amine)ligases (amide synthases)(6.3.1)
- C12Y603/01002—Glutamate-ammonia ligase (6.3.1.2)
Description
1.蛋白質を発現させるための発現ベクターであって,遺伝子発現制御部位(A),並びに,その下流に該蛋白質をコードする遺伝子,更に下流に内部リボソーム結合部位,及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み,且つ,該遺伝子発現制御部位(A)の又は該遺伝子発現制御部位(A)とは別の遺伝子発現制御部位(B)の下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含んでなる,発現ベクター。
2.該遺伝子発現制御部位(A)及び/又は該遺伝子発現制御部位(B)が,サイトメガロウイルス由来のプロモーター,SV40初期プロモーター,伸長因子1プロモーターからなる群から選択されるものである,上記1の発現ベクター。
3.該内部リボソーム結合部位が,ピコルナウイルス科のウイルス,***ウイルス,A型肝炎ウイルス,C型肝炎ウイルス,コロナウイルス,ウシ腸内ウイルス,サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス,コクサッキーB型ウイルス,ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子,ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子,ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択されるウイルス又は遺伝子の5'非翻訳領域に由来するものである,上記1又は2の発現ベクター。
4.該内部リボソーム結合部位が,ピコルナウイルス科のウイルスの5'非翻訳領域に由来するものである,上記1又は2の発現ベクター,
5.該内部リボソーム結合部位が,マウス脳心筋炎ウイルスの5'非翻訳領域に由来するものである,上記1又は2の発現ベクター。
6.該内部リボソーム結合部位が,野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列に,1又は2以上の変異を加えたものである,上記1ないし5の何れかの発現ベクター,
7.該野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列が複数の開始コドンを含み,該変異により,それら複数の開始コドンのうち一部が破壊されたものである,上記6の発現ベクター。
8.該内部リボソーム結合部位が,配列番号1の塩基配列を含むものである,上記5の発現ベクター。
9.該内部リボソーム結合部位が,配列番号2の塩基配列を含むものである,上記5の発現ベクター。
10.該内部リボソーム結合部位が,配列番号3の塩基配列を含むものである,上記5の発現ベクター。
11.該内部リボソーム結合部位が,配列番号4の塩基配列を含むものである,上記5の発現ベクター。
12.該内部リボソーム結合部位が,配列番号5の塩基配列を含むものである,上記5の発現ベクター。
13.該内部リボソーム結合部位が,配列番号6の塩基配列を含むものである,上記5の発現ベクター。
14.該蛋白質をコードする該遺伝子と該内部リボソーム結合部位との間の領域又はグルタミン合成酵素をコードする該遺伝子の下流の領域において,該内部リボソーム結合部位とは別の内部リボソーム結合部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる,上記1ないし13の何れかの発現ベクター。
15.該遺伝子発現制御部位(A)及び遺伝子発現制御部位(B)とは別に,更なる遺伝子発現制御部位(C)及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる,上記1ないし13の何れかの発現ベクター。
16.該薬剤耐性遺伝子が,ピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子である,上記14又は15の発現ベクター。
17.該蛋白質をコードする該遺伝子が,ヒト由来の遺伝子である上記1ないし16の何れかの発現ベクター。
18.ヒト由来の該遺伝子が,リソソーム酵素,組織プラスミノーゲンアクチベーター(t-PA),血液凝固因子,エリスロポエチン,インターフェロン,トロンボモジュリン,甲状腺刺激ホルモン(TSH),卵胞刺激ホルモン,顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF),及び抗体をコードする遺伝子からなる群から選択されるものである,上記17の発現ベクター。
19.ヒト由来の該遺伝子が,リソソーム酵素をコードする遺伝子である,上記17の発現ベクター。
20.該リソソーム酵素が,α-ガラクトシダーゼA,イズロン酸2-スルファターゼ,グルコセレブロシダーゼ,ガルスルファーゼ,α-L-イズロニダーゼ,及び酸性α-グルコシダーゼからなる群から選択されるものである,上記19の発現ベクター。
21.ヒト由来の該遺伝子が,エリスロポエチンをコードする遺伝子である上記17の発現ベクター。
22.上記1ないし21の何れかの発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
23.該哺乳動物細胞が,内因性のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を欠損したものである,上記22の細胞。
24.該哺乳動物細胞が,CHO細胞である,上記22又は23の細胞。
25.(a)上記1ないし21の何れかの発現ベクターを,哺乳動物細胞に導入するステップ,
(b)該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を,ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で選択培養するステップ,及び
(c)該選択培養により選択された細胞を,グルタミン合成酵素阻害剤の存在下で更に選択培養するステップ
を含む,該蛋白質をコードする遺伝子を発現する形質転換細胞の製造方法。
26.(a)上記14ないし16の何れかの発現ベクターを,哺乳動物細胞に導入するステップ,
(b)該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を,ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で選択培養するステップ,及び
(c)該選択培養により選択された細胞を,グルタミン合成酵素阻害剤の存在下で更に選択培養するステップ
を含む,該蛋白質をコードする遺伝子を発現する形質転換細胞の製造方法であって,該ステップ(a)と該ステップ(b)の間,又は該ステップ(b)と該ステップ(c)の間に,該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を,該薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の存在下で選択培養するステップを更に含む,製造方法。
pEF/myc/nucベクター(インビトロジェン社)を,KpnIとNcoIで消化し,EF-1プロモーター及びその第一イントロンを含む領域を切り出し,これをT4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。別に,pCI-neo(インビトロジェン社)を,BglII及びEcoRIで消化して,CMVのエンハンサー/プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に,T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに,上記のEF-1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域(平滑末端化処理後のもの)を挿入して,pE-neoベクターを構築した(図1−1及び図1−2)。
発現ベクターpPGKIH(Miyahara M. et.al., J. Biol. Chem. 275,613-618(2000) )を制限酵素(XhoI及びBamHI)で消化し,マウス脳心筋炎ウイルス(EMCV)に由来する内部リボソーム結合部位(IRES),ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hygr遺伝子)及びマウスホスホグリセリン酸キナーゼ(mPGK)のポリアデニル化領域(mPGKpA)を含む塩基配列IRES-Hygr-mPGKpA(配列番号15。5'末端から,塩基1〜6からなる領域が「XhoIサイト」,塩基120〜715及びこれに続く塩基716〜718(atg)からなる領域が「マウス脳心筋炎ウイルスの5'非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位を含む塩基配列」,該塩基716〜718(atg)を含む塩基716〜1741からなる領域が「ハイグロマイシン耐性遺伝子をコードする塩基配列」,塩基1747〜2210からなる領域が「マウスホスホグリセリン酸キナーゼ(mPGK)のポリアデニル化領域を含む塩基配列」,及び3'末端の6個の塩基(塩基2211〜2216)からなる領域が「BamHIサイト」である。)よりなるDNA断片を切り出した(なお,Hygrr遺伝子に対応するアミノ酸配列は,配列番号16で示されたものである。)。このDNA断片をpBluescript SK(-) (Stratagene社)のXhoI及びBamHIサイト間に挿入し,これをpBSK(IRES-Hygr-mPGKpA)とした(図3−1)。
(IRES-Hygr-mPGKpA) のXhoI及びHindIIIサイト間に挿入し,これをpBSK (NotI-IRES-Hygr-mPGKpA) とした(図3−2)。pBSK(NotI-IRES-Hygr-mPGKpA)を制限酵素(NotI及びBamHI)で消化し,pE-hygrベクターのNotI及びBamHIサイト間に挿入し,これをプラスミドpE-IRES-Hygrとした(図3−3)。
M. et.al., J. Biol. Chem. 275,613-618(2000))を鋳型とし,プライマーpuro5'(配列番号24)及びプライマーpuro3'(配列番号25)を用いて,PCRによりピューロマイシン耐性遺伝子(puror遺伝子)を含む塩基配列(配列番号26。5'末端から,塩基2〜7からなる領域が「AflIIサイト」,これに続く塩基8〜607からなる領域が「ピューロマイシン耐性遺伝子(puror遺伝子)をコードする塩基配列」,及び,その次の塩基608〜619からなる領域が「BstXIサイト」である。)よりなるDNA断片を増幅させた(なお,puror遺伝子に対応するアミノ酸配列は,配列番号27で示されたものである。)。このDNA断片を制限酵素(AflII及びBstXI)で消化し,発現ベクターpE-neoのAflII及びBstXIサイト間に挿入し,これをpE-puroとした(図3−7)。
発現ベクターpE-IRES-GS-puroを鋳型とし,プライマーmIRES-GS5'(配列番号30)及びプライマーmIRES-GS3'(配列番号31)を用いて,PCRにより,EMCVのIRESからGSにかけての領域を増幅させ,EMCVのIRESの5'側から2番目に位置する開始コドン(ATG)に変異を加えて破壊したDNA断片を増幅させた。発現ベクターpE-IRES-GS-puroを鋳型として,このDNA断片と上記のプライマーIRES5'を用いて,PCRによりIRESからGSにかけての上記領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素(NotI及びPstI)で消化し,切り出されたDNA断片を,発現ベクターpE-IRES-GS-puroのNotI及びPstIサイト間に挿入し,これをpE-mIRES-GS-puroとした(図4)。
発現ベクターpE-neoを鋳型とし,プライマーSV40polyA5'-2(配列番号32)及びプライマーSV40polyA3'-2(配列番号33)を用いて,PCRによりSV40 後期polyA領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素(XhoI及びBamHI)で消化し,pE-mIRES-GS-puroのXhoI及びBamHIサイト間に挿入し,これをpE-mIRES-GSとした(図5)。
〔pE-mIRES-GS-mNeoの構築〕
pCI-neo(インビトロジェン社)を鋳型とし,プライマーmNeoA5'(配列番号34)及びプライマーmNeoA3'(配列番号35)を用いて,PCRによりこのプラスミド全長を増幅させ,セルフライゲーションによりE182D変異型ネオマイシン耐性遺伝子(mNeor遺伝子)を含むプラスミドpCI-mNeoを構築した。pCI-mNeoベクターを鋳型としてプライマーmNeoB5'(配列番号36)及びプライマーmNeoB3'(配列番号37)を用いてPCRによりmNeor遺伝子を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素(EagI)で消化し,pUC57-IE1(Gene
Script社)のNotIに挿入し,これをpUC57-IE1-mNeoとした。pCI-neoを鋳型とし,プライマーmNeoC5'(配列番号38)及びプライマーmNeoC3'(配列番号39)を用いて,PCRによりネオマイシン耐性遺伝子(neor遺伝子)の3'領域及び合成ポリAシグナルを含む領域を増幅させ,これをメガプライマー(neo-polyA)とした。次に,pUC57-IE1-mNeoを鋳型とし,,プライマーmNeoD5'(配列番号40)及びメガプライマー(neo-polyA)を用いて,PCRによりmNeor遺伝子及び合成ポリAシグナルを含む領域を増幅させた。得られたDNA断片を制限酵素(AflII及びBamHI)で消化し,pE-mIRES-GS-puroのAflII及びBamHIサイト間に挿入し,これをpE-mIRES-GS-mNeoとした(図6)。
pE-mIRES-GS-mNeoを制限酵素(EcoRI)で消化し,伸長因子1プロモーター(EF-1p),変異型内部リボソーム結合部位(mIRES)及びグルタミン合成酵素(GS)の一部を含むDNA断片を切り出した。このDNA断片をpBluescript
SK(+) (Stratagene社)のEcoRIサイトに挿入し,これをpBlue-EF1/mIRESとした(図7)。
発現ベクターpE-mIRES-GS-mNeoを鋳型とし,プライマーSVpA-Not-F(配列番号43)及びプライマーSVpA-BstXI-R(配列番号44)を用いて,PCRによりSV40 後期polyA領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素(NotI及びBstXI)で消化し,pBlue-EF1/mIRESのNotI及びBstXIサイト間に挿入し,これをpBlue-EF1/SVpAとした(図8)。
マウスの野生型DHFRのN末端から31位のフェニルアラニンがトリプトファンに置換されたものである配列番号11の変異型DHFR(F31W)遺伝子(mDHFR31)を含むDNA(配列番号45)を合成した。このDNAをpGEM-T easy vector(Promega社)の3'-T overhangs箇所に挿入し,これをpGEM(mDHFR31)とした。pGEM(mDHFR31)を制限酵素(AflII及びBstXI)で消化し,変異型DHFR(F31W)を含むDNA断片を切り出し,このDNA断片をpE-neoのAflII及びBstXIサイト間に挿入し,これをpE-mDHFR31とした(図9)。
ヒト甲状腺刺激ホルモンのα鎖(hTSHα)遺伝子を含むDNA(配列番号46。5'末端から,塩基1〜6からなる領域が「MluIサイト」,塩基14〜364からなる領域が「hTSHα鎖をコードする塩基配列」,及び,これに続く塩基365〜372からなる領域が「NotIサイト」である。),及びヒト甲状腺刺激ホルモンのβ鎖(hTSHβ)遺伝子を含むDNA(配列番号47。5'末端から,塩基1〜6からなる領域が「MluIサイト」,塩基14〜433からなる領域が「TSHβ鎖をコードする塩基配列」,及び,これに続く塩基434〜441からなる領域が「NotIサイト」である。)を合成し,それぞれpUC57に組み込んで,pUC57-hTSHα,pUC57-hTSHβとした(Shanghai ShineGene Molecular
Biotech社)。また,ウサギ乳清酸性タンパク質(WAP)の3'側非翻訳領域(WAP3'UTR)を含むDNA(配列番号48)を合成し,pUC57に組み込んで,pUC57-WAP3'UTRとした(Shanghai ShineGene Molecular Biotech社)。
WAP3'UTRを鋳型とし,メガプライマーTSHαとプライマーWAP3'(配列番号53)を用いて,PCRによりTSHα遺伝子とその下流にWAP3'UTRを有するDNA断片を増幅させた(hTSHα-WAP3'UTR)。また,WAP3'UTRを含むpUC57- WAP3'UTRを鋳型とし,メガプライマーTSHβとプライマーWAP3'を用いて,PCRによりTSHβ遺伝子とその下流にWAP3'UTRを有するDNA断片を増幅させた(hTSHβ-WAP3'UTR)。得られた各DNA断片を制限酵素(MluI及びNotI)で消化し,pCI-neoのMluI及びNotIサイト間に挿入し,それぞれpCI-neo(hTSHα-WAP3'UTR)及びpCI-neo(hTSHβ-WAP3'UTR)とした(図10−1及び図10−2)。
pCI-neo(hTSHβ-WAP3'UTR)を制限酵素(MluI及びNotI)で消化し,hTSHβ遺伝子及びWAP3'UTRを含むDNA断片を切り出した。このDNA断片をpE-mIRES-GS-mNeoのMluI及びNotIサイト間に挿入し,これをpE-mIRES-GS-mNeo(hTSHβ)とした(図11)。
pCI-neo(hTSHα-WAP3'UTR)を制限酵素(MluI及びNotI)で消化し,hTSHα遺伝子及びWAP3'UTRを含むDNA断片を切り出した。このDNA断片をpBlue-EF1/mIRES-mNeoのMluI及びNotIサイト間に挿入し,これをpBlue-EF1/mIRES-mNeo(hTSHα)とした(図12)。
pBlue-EF1/mIRES-mNeo(hTSHα)を制限酵素(ClaI及びBglII)で消化し,伸長因子1プロモーター(EF-1p),hTSHα遺伝子,mIRES及び変異型ネオマイシン耐性遺伝子(mNeor遺伝子)を含むDNA断片を切り出した。このDNA断片をpE-mIRES-GS-mNeo(hTSHβ)のClaI及びBamHIサイト間に挿入し,これをヒト甲状腺刺激ホルモン(hTSH)発現用ベクターのpE-mIRES-GS-mNeo-dual(hTSH)とした(図13)。
pE-mDHFR31を鋳型として,プライマーdE-BbsI-F(配列番号54)及びプライマーSynpA-BbsI-R(配列番号55)を用いてPCRによりSV40初期プロモーター(SV40エンハンサー/プロモーター),変異型DHFR(F31W)及び合成ポリアデニレーションシグナル(合成ポリアデニル化領域)を含むDNA断片を増幅させた。得られたDNA断片を制限酵素(BbsI)で消化し,pE-mIRES-GS-mNeo-dual(hTSH)のBsmBIサイト間に挿入し,これをヒト甲状腺刺激ホルモン(hTSH)発現用ベクターのpE-mIRES-GS-mNeo-dual+mDHFR31(hTSH)とした(図14)。
リツキシマブ重鎖遺伝子を含むDNA(配列番号56。5'末端から,塩基1〜6からなる領域が「MluIサイト」,塩基18〜1430からなる領域が「リツキシマブ重鎖をコードする塩基配列」,及び,これに続く塩基1431〜1438からなる領域が「NotIサイト」である。)を合成した。このDNAを制限酵素(MluI及びNotI)で消化し,得られたDNA断片をpE-mIRES-GS-mNeoのMluI及びNotIサイト間に挿入し,これをpE-mIRES-GS-mNeo(RTX-H)とした(図15)。
リツキシマブ軽鎖遺伝子を含むDNA(配列番号57。5'末端から,塩基1〜6からなる領域が「MluIサイト」,塩基18〜725からなる領域が「リツキシマブ軽鎖をコードする塩基配列」,及び,これに続く塩基726〜733からなる領域が「NotIサイト」である。)を合成した。このDNAを制限酵素(MluI及びNotI)で消化し,得られたDNA断片をpBlue-EF1/mIRES-mNeoのMluI及びNotIサイト間に挿入し,これをpBlue-EF1/mIRES-mNeo(RTX-L)とした(図16)。
pBlue-EF1/mIRES-mNeo(RTX-L)を制限酵素(ClaI及びBglII)で消化し,得られたDNA断片をpE-mIRES-GS-mNeo(RTX-H)のClaI及びBamHIサイト間に挿入し,これをリツキシマブ発現用ベクターのpE-mIRES-GS-mNeo-dual(RTX)とした(図17)。
配列番号57のリツキシマブ軽鎖遺伝子を含むDNAを含む合成DNAを,制限酵素(MluI及びNotI)で消化し,得られたDNA断片をpBlue-EF1/SVpAのMluI及びNotIサイト間に挿入し,これをpBlue-EF1/SVpA(RTX-L)とした(図18−1)。
pE-mDHFR31を鋳型として,プライマーdE-BbsI-F(配列番号58)及びプライマーSynpA-BbsI-R(配列番号59)を用いてPCRによりSV40初期プロモーター(SV40エンハンサー/プロモーター,変異型DHFR(F31W)及び合成ポリアデニレーションシグナルを含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素(BbsI)で消化し,pE-mIRES-GS-dual(RTX)のBsmBIサイト間に挿入し,これをリツキシマブ発現用ベクターのpE-mIRES-GS-dual+mDHFR31(RTX)とした(図18−3)。
チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞のCHO-K1細胞をエレクトロポレーション(Invitrogen社)により,pE-mIRES-GS-mNeo-dual(hTSH),pE-mIRES-GS-mNeo-dual+mDHFR31(hTSH),pE-mIRES-GS-mNeo-dual(RTX)及びpE-mIRES-GS-dual+mDHFR31(RTX)でそれぞれ形質転換した。形質転換後の細胞を,選択培地を用いて選択培養を行い,hTSH発現細胞及びRTX発現細胞を得た。
で形質転換させた細胞の選択培養においては,まず細胞を,メトトレキセート(WAKO社)を含むCD Opti CHO培地(Invitrogen社)で,培地中に含まれるメトトレキセートの濃度を段階的に上昇させながら培養し,最終的にメトトレキセートを0.5μMで含む培地で培養し,メトトレキセートに耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。次いで,培地をメチオニンスルホキシミン(SIGMA社)を含むCD Opti CHO培地(Invitrogen社)に置き換えて,培地中に含まれるメチオニンスルホキシミンの濃度を段階的に上昇させながら培養し,最終的にメチオニンスルホキシミンを300μMの濃度で含む培地で培養し,メチオニンスルホキシミンに耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。ここで得られた細胞をバルク細胞とした。
選択培養して得たhTSH発現細胞を2×105
個/mLの細胞密度で300μMのメチオニンスルホキシミンを含有する5mLのCD Opti CHO培地で,37℃,5%
CO2存在下で10日間培養した。培養,3,7及び10日目に培養上清をサンプリングした。
ng/mLの濃度に希釈したものを標準溶液として,検体と同様にプレートに加えて静置した。液を捨て,プレートをTBS-T液で3回洗浄後,HRP標識したマウス抗hTSH-alphaモノクロナール抗体(Leinco Technologies社)を2次抗体としてプレートに100μLずつ加え,室温で1時間静置した。プレートをTBS-T液で3回洗浄後,HRP基質(WAKO社)を加え,室温で15分間静置した後,硫酸を加えて反応を停止した。マイクロウエルプレートリーダーで490nmにおける吸光度を測定して,標準溶液の吸光度の測定値から得られた検量線に,検体の測定値を内挿し,検体に含まれるhTSHの濃度を求めた。
選択培養して得たRTX発現細胞を2×105
個/mLの細胞密度で300μMのメチオニンスルホキシミンを含有する5mLのCD Opti CHO培地で,37℃,5%
CO2存在下で10日間培養した。培養,3,7及び10日目に培養上清をサンプリングした。
Laboratories社)を用いて行った。ヤギ抗hIgG抗体(Bethyl Laboratories社)溶液を96ウェルプレートに100μLずつ加え,室温で1時間静置して抗体をプレートに固定させた。液を捨て,プレートをTBS-T液で3回洗浄した後,1%BSA/TBS-T液をプレートに200μLずつ加え,室温で1時間静置してプレートをブロッキングした。液を捨て,プレートをTBS-T液で3回洗浄後,サンプリングした培養上清を検体としてプレートに100μLずつ加え,室温で1時間静置した。このとき,必要に応じて,培養上清をTBS-T液で希釈した。また,リツキシマブ(中外製薬社)をTBS-T液で3.9〜500 ng/mLの濃度に希釈したものを標準溶液として,検体と同様にプレートに加えて静置した。液を捨て,プレートをTBS-T液で3回洗浄後,HRP標識したヤギ抗hIgG抗体(Bethyl Laboratories社)を2次抗体としてプレートに100μLずつ加え,室温で1時間静置した。プレートをTBS-T液で3回洗浄後,HRP基質(WAKO社)を加え,室温で15分間静置した後,硫酸を加えて反応を停止した。マイクロウエルプレートリーダーで490
nmにおける吸光度を測定して,標準溶液の吸光度の測定値から得られた検量線に,検体の測定値を内挿し,検体に含まれるリツキシマブの濃度を求めた。
ヒト甲状腺刺激ホルモン(hTSH)発現用ベクターのpE-mIRES-GS-mNeo-dual(hTSH)で形質転換させたCHO細胞では,培養開始後10日目の培地中のhTSHの濃度は,バルク細胞では22.0μg/mL,クローン細胞では29.2μg/mLであった。一方,第2の選択マーカーとしてDHFR遺伝子を組み込んだhTSH発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-mNeo-dual+mDHFR31(hTSH)で形質転換させたCHO細胞では,培養開始後10日目の培地中のhTSHの濃度は,バルク細胞では35.3μg/mL,クローン細胞では85.2μg/mLであった(表1)。
すなわち,伸長因子1プロモーター(EF-1p),hTSH遺伝子,変異型内部リボソーム結合部位(mIRES),及び第1の選択マーカーとしてGS遺伝子をこの順で含むhTSH発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-mNeo-dual(hTSH)と比較して,更に第2の選択マーカーとしてDHFR遺伝子を組み込んだhTSH発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-mNeo-dual+mDHFR31(hTSH)で形質転換させたCHO細胞では,hTSHの発現量が,バルク細胞間で約1.6倍に,クローン細胞間で約2.9倍と,飛躍的に増加した。
RTX発現用ベクターのpE-mIRES-GS-mNeo-dual(RTX)で形質転換させたCHO細胞では,培養開始後10日目の培地中のリツキシマブの濃度は,バルク細胞では188.6μg/mL,クローン細胞では318.9μg/mLであった。一方,第2の選択マーカーとしてDHFR遺伝子を組み込んだRTX発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-dual+mDHFR31(RTX)で形質転換させたCHO細胞では,培養開始後10日目の培地中のリツキシマブの濃度は,バルク細胞では174.1μg/mL,クローン細胞では401.5μg/mLであった(表2)。
すなわち,伸長因子1プロモーター(EF-1p),リツキシマブ遺伝子,変異型内部リボソーム結合部位(mIRES),及び第1の選択マーカーとしてGS遺伝子をこの順で含むRTX発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-mNeo-dual(RTX)と比較して,更に第2の選択マーカーとしてDHFR遺伝子を組み込んだRTX発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-dual+mDHFR31(RTX)で形質転換させた細胞では,RTXの発現量が,バルク細胞間ではほとんど同レベルであるものの,クローン細胞間では約1.26倍に増加した。
これらの結果は,遺伝子発現制御部位の下流に,外来遺伝子,変異型内部リボソーム結合部位,及び第1の選択マーカーとしてグルタミン合成酵素をこの順で組み込み,更に,第2の選択マーカーとしてジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターが,外来遺伝子を高レベルで発現させることができる発現ベクターとして機能することを示すものである。
2 mPGKプロモーター
3 配列番号1に示す塩基配列を含む野生型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位(EMCV-IRES)
3a 配列番号4に示す塩基配列を含む変異型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位(EMCV-mIRES)
4 mPGKのポリアデニル化領域(mPGKpA)
5 EF-1p及び第一イントロンを含む塩基配列
6 SV40後期ポリポリアデニル化領域
7 SV40初期プロモーター(SV40エンハンサー/プロモーター)を含む領域
8 合成ポリポリアデニル化領域
9 サイトメガロウイルスプロモーターを含む領域
10 グルタミン合成酵素遺伝子
encephalomyocarditis virus; n is a, c, g, or t
配列番号3:Modified murine
encephalomyocarditis virus; n is a, c, g, or t
配列番号4:Modified murine
encephalomyocarditis virus
配列番号6:Modified murine
encephalomyocarditis virus
配列番号7:Modified murine encephalomyocarditis
virus; n is a, c, g, or t
配列番号8:Modified murine
encephalomyocarditis virus; n is a, c, g, or t
配列番号11:Modified Mus musculus DHFR
配列番号12:Synthetic Construct
配列番号13:Primer Hyg-Sfi5', synthetic
sequence
配列番号14:Primer Hyg-BstX3', synthetic sequence
配列番号15:IRES-Hygr-mPGKpA, synthetic
sequence
配列番号16:Synthetic Construct
配列番号17:Primer IRES5', synthetic
sequence
配列番号18:Primer IRES3', synthetic
sequence
配列番号19:Primer mPGKP5', synthetic
sequence
配列番号20:Primer mPGKP3', synthetic
sequence
配列番号21:mPGKp, synthetic sequence
配列番号22:Primer GS5', synthetic
sequence
配列番号23:Primer GS3', synthetic
sequence
配列番号24:Primer puro5', synthetic
sequence
配列番号25:Primer puro3', synthetic
sequence
配列番号26:Synthetic sequence containing
puromycin resistance gene
配列番号27:Synthetic Construct
配列番号28:Primer SV40polyA5', synthetic
sequence
配列番号29:Primer SV40polyA3', synthetic
sequence
配列番号30:Primer mIRES-GS5', synthetic
sequence
配列番号31:Primer mIRES-GS3', synthetic
sequence
配列番号32:Primer SV40polyA5'-2,
synthetic sequence
配列番号33:Primer SV40polyA3'-2,
synthetic sequence
配列番号34:Primer mNeoA5', synthetic
sequence
配列番号35:Primer mNeoA3', synthetic
sequence
配列番号36:Primer mNeoB5', synthetic
sequence
配列番号37:Primer mNeoB3', synthetic
sequence
配列番号38:Primer mNeoC5', synthetic
sequence
配列番号39:Primer mNeoC3', synthetic
sequence
配列番号40:Primer mNeoD5', synthetic
sequence
配列番号41:Primer SVpA-Mega-F, synthetic
sequence
配列番号42:Primer SVpA-BstXI-R, synthetic
sequence
配列番号43:Primer SVpA-Not-F, synthetic
sequence
配列番号44:Primer SVpA-BstXI-R, synthetic
sequence
配列番号45:Synthetic sequence containing
Modified DHFR(F31W)
配列番号46:Synthetic sequence containing
human TSH alpha
配列番号47:Synthetic sequence containing
human TSH beta
配列番号48:Synthetic sequence containing
WAP3'UTR
配列番号49:Primer TSHalpha5', synthetic
sequence
配列番号50:Primer TSHalpha3', synthetic
sequence
配列番号51:Primer TSHbeta5', synthetic
sequence
配列番号52:Primer TSHbeta3', synthetic
sequence
配列番号53:Primer WAP3', synthetic
sequence
配列番号54:Primer dE-BbsI-F, synthetic
sequence
配列番号55:Primer SynpA-BbsI-R, synthetic
sequence
配列番号56:Rituximab heavy chain,
synthetic sequence
配列番号57:Rituximab light chain,
synthetic sequence
配列番号58:Primer dE-BbsI-F, synthetic
sequence
配列番号59:Primer SynpA-BbsI-R, synthetic
sequence
Claims (14)
- ヘテロダイマーを形成する蛋白質を発現させるための発現ベクターであって,遺伝子発現制御部位(A),並びに,その下流にヘテロダイマーを形成する該蛋白質の第1のサブユニットをコードする遺伝子,更に下流に内部リボソーム結合部位,及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み,且つ,
該遺伝子発現制御部位(A)とは別の遺伝子発現制御部位(A’)の下流にヘテロダイマーを形成する該蛋白質の第2のサブユニットをコードする遺伝子を含み,
該遺伝子発現制御部位(A)及び(A’)の何れとも別の遺伝子発現制御部位(B)の下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含んでなる,発現ベクターであって,
該内部リボソーム結合部位が,マウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来するものであり,且つ,配列番号4で示される塩基配列を含む又は配列番号6で示される塩基配列からなるものである,発現ベクター。 - ヘテロダイマーを形成する該蛋白質の該第2のサブユニットをコードする遺伝子の下流に内部リボソーム結合部位,及び更に下流に薬剤耐性遺伝子を含んでなる,請求項1の発現ベクター。
- 該薬剤耐性遺伝子が,ピューロマイシン耐性遺伝子,ハイグロマイシン耐性遺伝子,ブラストサイジン耐性遺伝子,及びネオマイシン耐性遺伝子からなる群より選択されるものである,請求項2の発現ベクター。
- 該遺伝子発現制御部位(A),(A’),及び/又は該遺伝子発現制御部位(B)が,サイトメガロウイルス由来のプロモーター,SV40初期プロモーター,伸長因子1プロモーターからなる群から選択されるものである,請求項1ないし3の何れかの発現ベクター。
- ヘテロダイマーを形成する該蛋白質の該第1のサブユニットをコードする該遺伝子とその下流の該内部リボソーム結合部位との間の領域又はグルタミン合成酵素をコードする該遺伝子の下流の領域において,該内部リボソーム結合部位とは別の内部リボソーム結合部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる,請求項1ないし4の何れかの発現ベクター。
- 該遺伝子発現制御部位(A),(A’)及び(B)の何れとも別に,更なる遺伝子発現制御部位(C)及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる,請求項1ないし4の何れかの発現ベクター。
- 該薬剤耐性遺伝子が,ピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子である,請求項5又は6の発現ベクター。
- 該蛋白質をコードする該遺伝子が,ヒト由来の遺伝子である請求項1ないし7の何れかの発現ベクター。
- ヒト由来の該遺伝子が,甲状腺刺激ホルモン(TSH),卵胞刺激ホルモン,及び抗体をコードする遺伝子からなる群から選択されるものである,請求項8の発現ベクター。
- 請求項1ないし9の何れかの発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
- 該哺乳動物細胞が,内因性のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を欠損したものである,請求項10の細胞。
- 該哺乳動物細胞が,CHO細胞である,請求項10又は11の細胞。
- (a)請求項1ないし9の何れかの発現ベクターを,哺乳動物細胞に導入するステップ,
(b)該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を,ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で選択培養するステップ,及び
(c)該選択培養により選択された細胞を,グルタミン合成酵素阻害剤の存在下で更に選択培養するステップ
を含む,該蛋白質をコードする遺伝子を発現する形質転換細胞の製造方法。 - (a)請求項2ないし9の何れかの発現ベクターを,哺乳動物細胞に導入するステップ,
(b)該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を,ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で選択培養するステップ,及び
(c)該選択培養により選択された細胞を,グルタミン合成酵素阻害剤の存在下で更に選択培養するステップ
を含む,該蛋白質をコードする遺伝子を発現する形質転換細胞の製造方法であって,該ステップ(a)と該ステップ(b)の間,又は該ステップ(b)と該ステップ(c)の間に,該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を,該薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の存在下で選択培養するステップを更に含む,製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012102796 | 2012-04-27 | ||
JP2012102796 | 2012-04-27 | ||
PCT/JP2013/062251 WO2013161958A1 (ja) | 2012-04-27 | 2013-04-25 | 新規な発現ベクター |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2013161958A1 JPWO2013161958A1 (ja) | 2015-12-24 |
JP6279466B2 true JP6279466B2 (ja) | 2018-02-14 |
Family
ID=49483257
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014512690A Active JP6279466B2 (ja) | 2012-04-27 | 2013-04-25 | 新規な発現ベクター |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9657310B2 (ja) |
EP (1) | EP2848687B1 (ja) |
JP (1) | JP6279466B2 (ja) |
WO (1) | WO2013161958A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022191158A1 (ja) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Jcrファーマ株式会社 | 抗体-リソソーム酵素融合蛋白質の製造方法 |
WO2022202947A1 (ja) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Jcrファーマ株式会社 | 安定な水性医薬組成物又は凍結乾燥医薬組成物 |
WO2022239817A1 (ja) | 2021-05-12 | 2022-11-17 | Jcrファーマ株式会社 | ムコ多糖症i型の治療用医薬組成物 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013137583A1 (en) * | 2012-03-12 | 2013-09-19 | Hanwha Chemical Corporation | An expression vector comprising a polynucleotide encoding a modified glutamine synthetase and a method for preparing a target protein employing the same |
EP3172334B1 (en) | 2014-07-25 | 2021-11-10 | R.P. Scherer Technologies, LLC | Improved host cell for producing proteins |
US10654912B2 (en) | 2015-09-08 | 2020-05-19 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Human serum albumin mutant |
MA50746A (fr) | 2017-10-02 | 2020-08-12 | Denali Therapeutics Inc | Protéines de fusion comprenant des enzymes d'enzymothérapie substitutive |
CA3137457A1 (en) * | 2019-05-07 | 2020-11-12 | Amgen Inc. | Vectors and expression systems for producing recombinant proteins |
WO2021075526A1 (ja) | 2019-10-17 | 2021-04-22 | Jcrファーマ株式会社 | 血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質の製造方法 |
EP4059512A4 (en) | 2019-10-30 | 2023-12-06 | JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. | AQUEOUS PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SERUM ALBUMIN FUSION PROTEIN AND GROWTH HORMONE |
EP4198129A1 (en) | 2020-08-28 | 2023-06-21 | JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. | Mutant of alpha-n-acetylglucosaminidase |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4713339A (en) | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
EP0154576A1 (en) | 1984-02-06 | 1985-09-11 | INTERFERON SCIENCES, INC a Delaware Corporation | Hybrid nucleic acid sequences having tandemly arranged genes |
GB8601597D0 (en) * | 1986-01-23 | 1986-02-26 | Wilson R H | Nucleotide sequences |
EP0426744A1 (en) | 1988-07-29 | 1991-05-15 | Zymogenetics, Inc. | High efficiency translation of polycistronic messages in eucaryotic cells |
GB8924021D0 (en) | 1989-10-25 | 1989-12-13 | Celltech Ltd | Recombinant dna method and vectors for the use therein |
ES2173082T3 (es) | 1991-08-07 | 2002-10-16 | W French Anderson | Vectores retrovirales que contienen sitios de entrada del ribosoma internos. |
DE4228458A1 (de) | 1992-08-27 | 1994-06-01 | Beiersdorf Ag | Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung |
JPH08256776A (ja) | 1995-03-24 | 1996-10-08 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 高効率発現ベクター |
JP3926887B2 (ja) | 1997-05-26 | 2007-06-06 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 多分子発現カセット及びその利用 |
EP1173597A1 (en) * | 1999-04-29 | 2002-01-23 | Aarhus University | Expression of heterologous genes from an ires translational cassette in retroviral vectors |
GB0024550D0 (ja) | 2000-10-06 | 2000-11-22 | Oxford Biomedica Ltd | |
IL149820A0 (en) * | 2002-05-23 | 2002-11-10 | Curetech Ltd | Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency |
ATE465245T1 (de) * | 2003-10-24 | 2010-05-15 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Neue rekombinante tierzellen mit hoher proteinproduktion, verfahren zur konstruktion davon sowie verfahren zur massenproduktion von protein unter verwendung davon |
EP1768999B1 (en) * | 2004-06-30 | 2013-06-19 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | sHIgM12 antibody useful to treat multiple sclerosis |
EP1885860A2 (en) | 2005-05-16 | 2008-02-13 | Morphotek, Inc. | Regulated vectors for selection of cells exhibiting desired phenotypes |
EP1910550A4 (en) * | 2005-07-21 | 2009-11-04 | Abbott Lab | MULTIGENIC EXPRESSION COMPRISING SORF CONSTRUCTS AND METHODS USING POLYPROTEINS, PRO-PROTEINS, AND PROTEOLYSIS |
EP2089424B1 (en) * | 2006-12-06 | 2015-07-01 | JCR PHARMACEUTICALS Co., LTD. | Method for production of human erythropoietin |
PT2170942E (pt) * | 2007-06-28 | 2013-10-22 | Biogenerix Ag | Clone celular produtor de fsh |
TWI488640B (zh) * | 2008-04-16 | 2015-06-21 | Ferring Int Ct Sa | 藥學製劑 |
JP2009273427A (ja) | 2008-05-16 | 2009-11-26 | Jcr Pharmaceuticals Co Ltd | 組換え体ヒトfshの製造方法 |
CN102409060B (zh) * | 2010-09-26 | 2013-05-08 | 北京华安科创生物技术有限公司 | Gs-dhfr双基因筛选表达载体及其构建方法与应用 |
KR101890446B1 (ko) * | 2010-11-08 | 2018-08-21 | 제이씨알 파마 가부시키가이샤 | 신규 발현 벡터 |
AU2012203048A1 (en) * | 2011-05-24 | 2012-12-13 | Agency For Science, Technology And Research | IRES mediated multicistronic vectors |
CN102321668A (zh) | 2011-07-06 | 2012-01-18 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种表达重组人凝血因子ⅶ的方法及其专用载体 |
-
2013
- 2013-04-25 WO PCT/JP2013/062251 patent/WO2013161958A1/ja active Application Filing
- 2013-04-25 EP EP13782136.9A patent/EP2848687B1/en active Active
- 2013-04-25 JP JP2014512690A patent/JP6279466B2/ja active Active
- 2013-04-25 US US14/396,929 patent/US9657310B2/en active Active
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022191158A1 (ja) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Jcrファーマ株式会社 | 抗体-リソソーム酵素融合蛋白質の製造方法 |
WO2022202947A1 (ja) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Jcrファーマ株式会社 | 安定な水性医薬組成物又は凍結乾燥医薬組成物 |
WO2022239817A1 (ja) | 2021-05-12 | 2022-11-17 | Jcrファーマ株式会社 | ムコ多糖症i型の治療用医薬組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2848687B1 (en) | 2017-09-13 |
US20150337331A1 (en) | 2015-11-26 |
US9657310B2 (en) | 2017-05-23 |
EP2848687A4 (en) | 2015-12-02 |
EP2848687A1 (en) | 2015-03-18 |
WO2013161958A1 (ja) | 2013-10-31 |
JPWO2013161958A1 (ja) | 2015-12-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6279466B2 (ja) | 新規な発現ベクター | |
JP5913122B2 (ja) | 新規発現ベクター | |
JP6152402B2 (ja) | タンパク質の生産方法 | |
JP5432117B2 (ja) | 宿主細胞中の組換えタンパク質の発現を増進するための組換え発現ベクター要素(rEVE) | |
JP4554370B2 (ja) | 多重遺伝子プラスミドおよび組み換えポリペプチドの発現増加法 | |
RU2494147C2 (ru) | Вектор экспрессии млекопитающих | |
ES2840725T3 (es) | Procedimiento de producción | |
JP4817514B2 (ja) | 新規動物細胞用ベクターおよびその使用 | |
JP5835636B2 (ja) | 抗体高生産性細胞の樹立のための発現ベクター及び抗体高生産性細胞 | |
US20170211057A1 (en) | Expression Vector Comprising a Polynucleotide Encoding a Modified Glutamine Synthetase and a Method for Preparing a Target Protein Employing the Same | |
JP2010512776A (ja) | 治療への応用性が高いことで知られている蛋白質を生産するための高転写性活性細胞株 | |
Picanço-Castro et al. | Patents in therapeutic recombinant protein production using mammalian cells | |
JP7010812B2 (ja) | Fc含有タンパク質の発現 | |
RU2656142C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-ht ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ИЗОТИПА IGA1 | |
WO2012081629A1 (ja) | タンパク質の生産方法 | |
JP6150143B2 (ja) | 薬剤選択融合遺伝子を含む高生産性細胞の樹立のための発現ベクター | |
RU2664184C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-Intht ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ИЗОТИПА IgA1 | |
RU2671477C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBiPr-ABIgA2m1F16-ht ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ИЗОТИПА IGA2m1 | |
JP2011019509A (ja) | クローニングに最適化された発現ベクター | |
WO2019225372A1 (ja) | 新規ベクターおよびその利用 | |
JP2012055303A (ja) | 遺伝子増幅を含む高生産性細胞の樹立のための発現ベクター | |
JP2004248509A (ja) | 真核細胞内における配列特異的dna組換え |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160401 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170221 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170413 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20170908 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171114 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20171121 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180116 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180117 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6279466 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |