CN111225925A - 抗hla-dq2.5抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的抗体对HLA‑DQ2.5具有特异性结合活性，并且对HLA‑DQ2.2和/或HLA‑DQ7.5可能具有结合活性，但是对HLA‑DQ8、HLA‑DQ5.1、HLA‑DQ6.3、HLA‑DQ7.3、HLA‑DR、HLA‑DP，或恒定链(CD74)与HLA‑DQ2.5的复合物基本上不具有结合活性。在存在谷蛋白肽如麦醇溶蛋白的情况下，抗体结合HLA‑DQ2.5，即，结合与谷蛋白肽形成复合物的HLA‑DQ2.5。抗体具有针对HLA‑DQ2.5与TCR之间结合的中和活性，并因此阻断HLA‑DQ2.5与HLA‑DQ2.5限制性CD4+T细胞之间的相互作用。抗体不经历由恒定链介导的快速内化。

Description

抗HLA-DQ2.5抗体
技术领域
本发明涉及抗HLA-DQ2.5抗体
背景技术
乳糜泻是一种自身免疫性病症，其中摄入谷蛋白对遗传敏感患者的小肠造成损害(NPL 1至5)。约1％的西方人群，即美国和欧盟的800万人被认为患有乳糜泻；然而，自从1940年代认识该疾病以来，尚未取得显著的治疗进展。
属于主要组织相容性复合体(MHC)II类的人白血病抗原(HLA)包括HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ分子，如HLA-DQ2.5同种型(下文称为“HLA-DQ2.5”)，其在细胞表面形成由α和β链组成的异二聚体。大多数(＞90％)的乳糜泻患者具有HLA-DQ2.5单倍型等位基因(NPL 6)。据认为，该同种型对谷蛋白肽具有更强的亲和力。与其它同种型一样，HLA-DQ2.5将源自外源的经加工的抗原呈递给T细胞上的T细胞受体(TCR)。在乳糜泻患者中消化富含谷蛋白的食物(例如面包)的结果是，形成免疫原性的谷蛋白肽(例如麦醇溶蛋白肽)(NPL 2)。该肽通过小肠上皮运输到固有层中，并通过组织转谷氨酰胺酶如转谷氨酰胺酶2(TG2)脱酰胺。脱酰胺的麦醇溶蛋白肽由抗原呈递细胞(APC)加工，所述抗原呈递细胞将它们负载在HLA-DQ2.5上。负载的肽被呈递至HLA-DQ2.5限制性T细胞，并激活先天和适应性免疫应答。这引起小肠粘膜的炎性损伤和包括各种类型的胃肠道紊乱、营养缺乏和全身症状的症状。据报道，抗HLADQ中和抗体抑制来自乳糜泻患者的T细胞的活化。(NPL 7)
目前可行的乳糜泻的治疗是终生坚持无谷蛋白饮食(GFD)。然而，实际上，即使用GFD也难以完全消除谷蛋白暴露。这些患者的可耐受谷蛋白剂量仅为约10至50mg/天(NPL11)。在GFD生产中可广泛发生交叉污染，即使在对GFD顺从性好的患者中，微量的谷蛋白也会引起乳糜泻症状。在存在这种无意的谷蛋白暴露风险的情况下，需要对GFD进行辅助治疗。
引文清单
非专利文献
[NPL 1]N Engl J Med 2007；357：1731-1743
[NPL 2]J Biomed Sci.2012；19(1)：88
[NPL 3]N Engl J Med 2003；348：2517-2524
[NPL4]Gut 2003；52：960-965
[NPL 5]Dig Dis Sci 2004；49：1479-1484
[NPL 6]Gastroenterology 2011；141：610-620
[NPL 7]Gut 2005；54：1217-1223
[NPL 8]Gastroenterology 2014；146：1649-58
[NPL 9]Nutrients 2013Oct 5(10)：3975-3992
[NPL 10]J Clin Invest.2007；117(1)：41-49
[NPL 11]Am J Clin Nutr 2007；85：160-6
发明内容
技术问题
在上述需要辅助治疗的情况下，本发明提供抗HLA-DQ2.5抗体。
解决问题的方案
在某些实施方案中，本发明的抗HLA-DQ2.5抗体(在下文中也称为“本发明的抗体”)对HLA-DQ2.5具有结合活性，并且对HLA-DQ8基本上不具有结合活性。
在某些实施方案中，本发明的抗体对与谷蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5(HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物)具有结合活性。
在某些实施方案中，谷蛋白肽是由33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽、ω2麦醇溶蛋白肽、裸麦醇溶蛋白1肽和裸麦醇溶蛋白2肽组成的组中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部。
在某些实施方案中，所述谷蛋白肽为33聚体麦醇溶蛋白肽。
在某些实施方案中，本发明的抗体阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物和HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
在某些实施方案中，本发明的抗体对HLA-DQ5.1、HLA-DQ6.3或HLA-DQ7.3基本上不具有结合活性。
在某些实施方案中，本发明的抗体对HLA-DR或HLA-DP基本上不具有结合活性。
在某些实施方案中，本发明的抗体对与恒定链(invariant chain)的复合物的形式的HLA-DQ2.5(HLA-DQ2.5/恒定链复合物)基本上不具有结合活性。
在某些实施方案中，本发明的抗体对HLA-DQ2.2具有结合活性，并且对HLA-DQ7.5基本上不具有结合活性。
在某些实施方案中，本发明的抗体对HLA-DQ7.5具有结合活性，并且对HLA-DQ2.2基本上不具有结合活性。
在某些实施方案中，本发明的抗体对HLA-DQ2.2或HLA-DQ7.5基本上不具有结合活性。
在某些实施方案中，本发明的抗体对与谷蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有增强的结合活性。
在某些实施方案中，相比于以下复合物的形式的HLA-DQ2.5，所述复合物为HLA-DQ2.5与由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个或全部的复合物：CLIP肽、沙门氏菌肽、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)肽、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)肽和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞(HLA-DQ2.5/CLIP肽复合物、HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽复合物、HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽复合物、HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽复合物和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞)，本发明的抗体对与由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有更强的结合活性：33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽、ω2麦醇溶蛋白肽、裸麦醇溶蛋白1肽和裸麦醇溶蛋白2肽(HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽复合物和HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽复合物)。
在某些实施方案中，本发明的抗体对与33聚体麦醇溶蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5(HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物)的结合活性强于对以与CLIP肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5(HLA-DQ2.5/CLIP肽复合物)的结合活性。
在某些实施方案中，本发明的抗体针对麦醇溶蛋白结合的HLA-DQ2.5与D2 TCR或S2 TCR之间的结合具有中和活性。
在某些实施方案中，本发明的抗体不经历使用恒定链的细胞内化(即，恒定链介导的快速细胞内化)。
在某些实施方案中，本发明的抗体是人源化抗体。
在某些实施方案中，本发明的抗体具有特异性的重链互补决定区(HCDR)。
在某些实施方案中，本发明的抗体具有特异性的轻链互补决定区(LCDR)。
在某些实施方案中，本发明提供一种抗体，该抗体结合与具有特异性的HCDR和LCDR的抗体所结合的相同的HLA-DQ2.5表位。
在某些实施方案中，本发明提供一种抗体，该抗体与具有特异性的HCDR和LCDR的抗体竞争结合HLA-DQ2.5。
在某些实施方案中，本发明提供一种抗HLA-DQ2.5抗体，其对HLA-DQ2.5的β链具有结合活性并且阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
在某些实施方案中，本发明提供一种抗HLA-DQ2.5抗体，其对HLA-DQ2.5的α链具有结合活性并且阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
在某些实施方案中，本发明提供一种抗体，其对以下复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性，所述复合物为HLA-DQ2.5与由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部的复合物：33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽、ω2麦醇溶蛋白肽、裸麦醇溶蛋白1肽和裸麦醇溶蛋白2肽，并且对以下复合物的形式的HLA-DQ2.5基本上不具有结合活性，所述复合物为HLA-DQ2.5与由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个或全部的复合物：CLIP肽、沙门氏菌肽、牛分枝杆菌肽、乙型肝炎病毒肽和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞，并且阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物和HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
在某些实施方案中，本发明提供一种抗体，其对与33聚体麦醇溶蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性，并且对与CLIP肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5基本上不具有结合活性，并且阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
在某些实施方案中，本发明提供一种筛选抗HLA-DQ2.5抗体的方法，其包括测试抗体对感兴趣的抗原是否具有结合活性，并选择对感兴趣的抗原具有结合活性的抗体；测试抗体对不感兴趣的抗原是否具有特异性结合活性，并选择对不感兴趣的抗原不具有特异性结合活性的抗体。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括：测试所述抗体针对抗HLA-DQ2.5与TCR之间的结合是否具有中和活性；以及选择具有中和活性的抗体。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括：在存在谷蛋白肽如麦醇溶蛋白的情况下，测试所述抗体是否与HLA-DQ2.5结合；以及在存在所述谷蛋白肽的情况下选择与HLA-DQ2.5结合的抗体。
更具体地，本发明提供以下内容。
[1]抗HLA-DQ2.5抗体，其对HLA-DQ2.5具有结合活性，并且对HLA-DQ8基本不具有结合活性。
[2][1]所述的抗体，其中所述抗体对与谷蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5(HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物)具有结合活性。
[3][2]所述的抗体，其中所述谷蛋白肽是由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部：33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽、ω2麦醇溶蛋白肽、裸麦醇溶蛋白1肽和裸麦醇溶蛋白2肽。
[4][2]所述的抗体，其中所述抗体阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物和HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
[5][1]至[4]中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DQ5.1、HLA-DQ6.3或HLA-DQ7.3基本上不具有结合活性。
[6][1]至[5]中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DR或HLA-DP基本上不具有结合活性。
[7][1]至[6]中任一项所述的抗体，其中所述抗体对与恒定链的复合物的形式的HLA-DQ2.5(HLA-DQ2.5/恒定链复合物)基本上不具有结合活性。
[8][1]至[7]中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DQ2.2具有结合活性，并且对HLA-DQ7.5基本上不具有结合活性。
[9][1]至[7]中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DQ7.5具有结合活性，并且对HLA-DQ2.2基本上不具有结合活性。
[10][1]至[7]中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DQ2.2或HLA-DQ7.5基本上不具有结合活性。
[11][10]所述的抗体，其中所述抗体对与谷蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有增强的结合活性。
[12][11]所述的抗体，其中相比于以下复合物的形式的HLA-DQ2.5，所述复合物为HLA-DQ2.5与由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个或全部的复合物：CLIP肽、沙门氏菌肽、牛分枝杆菌肽、乙型肝炎病毒肽和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞(HLA-DQ2.5/CLIP肽复合物、HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽复合物、HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽复合物、HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽复合物和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞)，本发明的抗体对与由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有更强的结合活性：33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽、ω2麦醇溶蛋白肽、裸麦醇溶蛋白1肽和裸麦醇溶蛋白2肽(HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽复合物和HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽复合物)。
[13][1]至[7]中任一项所述的抗体，其为以下(1)至(14)中的任一项：
(1)抗体，其包含SEQ ID NO：13的HCDR1序列、SEQ ID NO：25的HCDR2序列、SEQ IDNO：37的HCDR3序列、SEQ ID NO：61的LCDR1序列、SEQ ID NO：73的LCDR2序列和SEQ ID NO：85的LCDR3序列；
(2)抗体，其包含SEQ ID NO：14的HCDR1序列、SEQ ID NO：26的HCDR2序列、SEQ IDNO：38的HCDR3序列、SEQ ID NO：62的LCDR1序列、SEQ ID NO：74的LCDR2序列和SEQ ID NO：86的LCDR3序列；
(3)抗体，其包含SEQ ID NO：15的HCDR1序列、SEQ ID NO：27的HCDR2序列、SEQ IDNO：39的HCDR3序列、SEQ ID NO：63的LCDR1序列、SEQ ID NO：75的LCDR2序列和SEQ ID NO：87的LCDR3序列；
(4)抗体，其包含SEQ ID NO：16的HCDR1序列、SEQ ID NO：28的HCDR2序列、SEQ IDNO：40的HCDR3序列、SEQ ID NO：64的LCDR1序列、SEQ ID NO：76的LCDR2序列和SEQ ID NO：88的LCDR3序列；
(5)抗体，其包含SEQ ID NO：17的HCDR1序列、SEQ ID NO：29的HCDR2序列、SEQ IDNO：41的HCDR3序列、SEQ ID NO：65的LCDR1序列、SEQ ID NO：77的LCDR2序列和SEQ ID NO：89的LCDR3序列；
(6)抗体，其包含SEQ ID NO：18的HCDR1序列、SEQ ID NO：30的HCDR2序列、SEQ IDNO：42的HCDR3序列、SEQ ID NO：66的LCDR1序列、SEQ ID NO：78的LCDR2序列和SEQ ID NO：90的LCDR3序列；
(7)抗体，其包含SEQ ID NO：19的HCDR1序列、SEQ ID NO：31的HCDR2序列、SEQ IDNO：43的HCDR3序列、SEQ ID NO：67的LCDR1序列、SEQ ID NO：79的LCDR2序列和SEQ ID NO：91的LCDR3序列；
(8)抗体，其包含SEQ ID NO：20的HCDR1序列、SEQ ID NO：32的HCDR2序列、SEQ IDNO：44的HCDR3序列、SEQ ID NO：68的LCDR1序列、SEQ ID NO：80的LCDR2序列和SEQ ID NO：92的LCDR3序列；
(9)抗体，其包含SEQ ID NO：146的HCDR1序列、SEQ ID NO：150的HCDR2序列、SEQID NO：154的HCDR3序列、SEQ ID NO：162的LCDR1序列、SEQ ID NO：166的LCDR2序列和SEQID NO：170的LCDR3序列；
(10)抗体，其包含SEQ ID NO：147的HCDR1序列、SEQ ID NO：151的HCDR2序列、SEQID NO：155的HCDR3序列、SEQ ID NO：163的LCDR1序列、SEQ ID NO：167的LCDR2序列和SEQID NO：17192的LCDR3序列；
(11)抗体，其包含SEQ ID NO：148的HCDR1序列、SEQ ID NO：152的HCDR2序列、SEQID NO：156的HCDR3序列、SEQ ID NO：164的LCDR1序列、SEQ ID NO：168的LCDR2序列和SEQID NO：172的LCDR3序列；
(12)抗体，其包含SEQ ID NO：149的HCDR1序列、SEQ ID NO：153的HCDR2序列、SEQID NO：157的HCDR3序列、SEQ ID NO：165的LCDR1序列、SEQ ID NO：169的LCDR2序列和SEQID NO：173的LCDR3序列；
(13)抗体，其结合至(1)至(12)中任一项所述的抗体所结合的相同的HLA-DQ2.5表位；
(14)抗体，其与(1)至(12)中任一项所述的抗体竞争结合HLA-DQ2.5或谷蛋白肽与HLA-DQ2.5的复合物。
[14]抗HLA-DQ2.5抗体，其对HLA-DQ2.5的β链具有结合活性，并且阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
[15]抗HLA-DQ2.5抗体，其对HLA-DQ2.5的α链具有结合活性，并且阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
[16]抗体，其对以下复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性，所述复合物为HLA-DQ2.5与由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部的复合物：33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽、ω2麦醇溶蛋白肽、裸麦醇溶蛋白1肽和裸麦醇溶蛋白2肽，并且对以下复合物的形式的HLA-DQ2.5基本上不具有结合活性，所述复合物为HLA-DQ2.5与由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个或全部的复合物：CLIP肽、沙门氏菌肽、牛分枝杆菌肽、乙型肝炎病毒肽和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞，并且阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物和HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
[17]抗HLA-DQ2.5抗体，其对HLA-DQ2.5具有结合活性，并且对HLA-DQ8基本不具有结合活性。
[18][17]所述的抗体，其中所述抗体对与谷蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5(HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物)具有结合活性。
[19][18]所述的抗体，其中所述谷蛋白肽是33聚体麦醇溶蛋白肽。
[20][18]所述的抗体，其中所述抗体阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物和HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
[21][17]至[20]中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DQ5.1、HLA-DQ6.3或HLA-DQ7.3基本上不具有结合活性。
[22][17]至[21]中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DR或HLA-DP基本上不具有结合活性。
[23][17]至[22]中任一项所述的抗体，其中所述抗体对与恒定链的复合物的形式的HLA-DQ2.5(HLA-DQ2.5/恒定链复合物)基本上不具有结合活性。
[24][17]至[23]中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DQ2.2具有结合活性，并且对HLA-DQ7.5基本上不具有结合活性。
[25][17]至[23]中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DQ7.5具有结合活性，并且对HLA-DQ2.2基本上不具有结合活性。
[26][17]至[23]中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DQ2.2或HLA-DQ7.5基本上不具有结合活性。
[27][26]所述的抗体，其中所述抗体对与谷蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有增强的结合活性。
[28][27]所述的抗体，其中所述抗体对与33聚体麦醇溶蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5(HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物)的结合活性强于对与CLIP肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5(HLA-DQ2.5/CLIP肽复合物)的结合活性。
[29][17]至[23]中任一项所述的抗体，其为以下(1)至(10)中的任一项：
(1)抗体，其包含SEQ ID NO：13的HCDR1序列、SEQ ID NO：25的HCDR2序列、SEQ IDNO：37的HCDR3序列、SEQ ID NO：61的LCDR1序列、SEQ ID NO：73的LCDR2序列和SEQ ID NO：85的LCDR3序列；
(2)抗体，其包含SEQ ID NO：14的HCDR1序列、SEQ ID NO：26的HCDR2序列、SEQ IDNO：38的HCDR3序列、SEQ ID NO：62的LCDR1序列、SEQ ID NO：74的LCDR2序列和SEQ ID NO：86的LCDR3序列；
(3)抗体，其包含SEQ ID NO：15的HCDR1序列、SEQ ID NO：27的HCDR2序列、SEQ IDNO：39的HCDR3序列、SEQ ID NO：63的LCDR1序列、SEQ ID NO：75的LCDR2序列和SEQ ID NO：87的LCDR3序列；
(4)抗体，其包含SEQ ID NO：16的HCDR1序列、SEQ ID NO：28的HCDR2序列、SEQ IDNO：40的HCDR3序列、SEQ ID NO：64的LCDR1序列、SEQ ID NO：76的LCDR2序列和SEQ ID NO：88的LCDR3序列；
(5)抗体，其包含SEQ ID NO：17的HCDR1序列、SEQ ID NO：29的HCDR2序列、SEQ IDNO：41的HCDR3序列、SEQ ID NO：65的LCDR1序列、SEQ ID NO：77的LCDR2序列和SEQ ID NO：89的LCDR3序列；
(6)抗体，其包含SEQ ID NO：18的HCDR1序列、SEQ ID NO：30的HCDR2序列、SEQ IDNO：42的HCDR3序列、SEQ ID NO：66的LCDR1序列、SEQ ID NO：78的LCDR2序列和SEQ ID NO：90的LCDR3序列；
(7)抗体，其包含SEQ ID NO：19的HCDR1序列、SEQ ID NO：31的HCDR2序列、SEQ IDNO：43的HCDR3序列、SEQ ID NO：67的LCDR1序列、SEQ ID NO：79的LCDR2序列和SEQ ID NO：91的LCDR3序列；
(8)抗体，其包含SEQ ID NO：20的HCDR1序列、SEQ ID NO：32的HCDR2序列、SEQ IDNO：44的HCDR3序列、SEQ ID NO：68的LCDR1序列、SEQ ID NO：80的LCDR2序列和SEQ ID NO：92的LCDR3序列；
(9)抗体，其结合至(1)至(8)中任一项所述抗体所结合的相同的HLA-DQ2.5表位；
(10)抗体，其与(1)至(8)中任一项所述抗体竞争结合HLA-DQ2.5或谷蛋白肽与HLA-DQ2.5的复合物。
[30]抗HLA-DQ2.5抗体，其对HLA-DQ2.5的β链具有结合活性，并且阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
[31]抗HLA-DQ2.5抗体，其对HLA-DQ2.5的α链具有结合活性，并且阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
[32]抗体，其对与33聚体麦醇溶蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性，并且对与CLIP肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5基本上不具有结合活性，并且阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
附图说明
[图1]图1显示了抗体与HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽结合的FACS结果(实施例4.1)。
[图2]图2显示了抗体与HLA-DQ2.5/CLIP肽结合的FACS结果(实施例4.1)。
[图3]图3显示了抗体与HLA-DQ2.5结合的FACS结果(实施例4.1)。
[图4]图4显示了抗体与HLA-DQ2.2结合的FACS结果(实施例4.1)。
[图5]图5显示了抗体与HLA-DQ7.5结合的FACS结果(实施例4.1)。
[图6]图6显示了抗体与HLA-DP结合的FACS结果(实施例4.2)。
[图7]图7显示了抗体与HLA-DR结合的FACS结果(实施例4.2)。
[图8]图8显示了抗体与HLA-DQ8结合的FACS结果(实施例4.2)。
[图9]图9显示了抗体与HLA-DQ5.1结合的FACS结果(实施例4.2)。
[图10]图10显示了抗体与HLA-DQ6.3结合的FACS结果(实施例4.2)。
[图11]图11显示了抗体与HLA-DQ7.3结合的FACS结果(实施例4.2)。
[图12]图12显示了针对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物与D2 TCR之间结合的抗体的基于AlphaLISA的中和活性(实施例4.4)。
[图13]图13显示了针对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物与S2 TCR之间结合的抗体的基于珠子的中和活性(实施例4.4)。
[图14]图14显示了抗体与HLA-DQ2.5/恒定链复合物的结合(实施例4.5)。
[图15]图15显示了针对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物与D2 TCR之间结合的抗体的基于细胞的中和活性(实施例4.6)。
[图16]图16显示了抗体与HLA-DQ2.5结合的FACS结果(实施例7)。
[图17]图17显示了抗体与HLA-DQ2.5/CLIP肽结合的FACS结果(实施例7)。
[图18]图18显示了抗体与HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽结合的FACS结果(实施例7)。
[图19]图19显示了抗体与HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽结合的FACS结果(实施例7)。
[图20]图20显示了抗体与HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽结合的FACS结果(实施例7)。
[图21]图21显示了抗体与HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽结合的FACS结果(实施例7)。
[图22]图22显示了抗体与HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽结合的FACS结果(实施例7)。
[图23]图23显示了抗体与HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽结合的FACS结果(实施例7)。
[图24]图24显示了抗体与HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽结合的FACS结果(实施例7)。
[图25]图25显示了抗体与HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽结合的FACS结果(实施例7)。
[图26]图26显示了抗体与HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽结合的FACS结果(实施例7)。
[图27]图27显示了抗体与HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽结合的FACS结果(实施例7)。
[图28]图28显示了抗体与HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽结合的FACS结果(实施例7)。
[图29]图29显示了抗体与HLA-DQ2.5+PBMC B细胞结合的FACS结果(实施例8)。
[图30]图30显示了抗体与HLA-DQ2.5/几种肽结合的FACS结果的总结(实施例8)。
[图31]图31显示了抗体与HLA-DQ2.2结合的FACS结果(实施例9)。
[图32]图32显示了抗体与HLA-DQ7.5结合的FACS结果(实施例9)。
[图33]图33显示了抗体与HLA-DQ8结合的FACS结果(实施例10)。
[图34]图34显示了抗体与HLA-DQ5.1结合的FACS结果(实施例10)。
[图35]图35显示了抗体与HLA-DQ6.3结合的FACS结果(实施例10)。
[图36]图36显示了抗体与HLA-DQ7.3结合的FACS结果(实施例10)。
[图37]图37显示了抗体与HLA-DR结合的FACS结果(实施例10)。
[图38]图38显示了抗体与HLA-DP结合的FACS结果(实施例10)。
[图39]图39显示了针对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物与D2 TCR之间结合的抗体的基于细胞的中和活性(实施例11)。
[图40]图40显示了针对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物与D2 TCR之间结合的抗体的基于AlphaLISA的中和活性(实施例12)。
[图41]图41显示了针对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物与S2 TCR之间结合的抗体的基于珠子的中和活性(实施例13)。
[图42]图42显示了抗体与HLA-DQ2.5/恒定链复合物的结合(实施例15)。
[图43]图43显示了初步筛选的ELISA结果。鉴定的单命中(阳性)B细胞克隆能够特异性结合IgG1δ-GK和IgG4δ-GK，但不能特异性结合IgG1δ-K和IgG4δ-K。抗匙孔血蓝蛋白(KLH)兔单克隆抗体用作同种型对照。
[图44]图44显示了二次筛选的ELISA结果。鉴定的单命中(阳性)B细胞克隆能够特异性结合IgG1δ-GK和IgG4δ-GK，但不能特异性结合IgG1δ-GK-酰胺和IgG4δ-GK-酰胺。抗KLH兔单克隆抗体用作同种型对照。
[图45]图45显示了纯化的单克隆抗体的ELISA结果。YG55能特异性结合IgG1δ-GK和IgG4δ-GK，但不能特异性结合IgG1δ-GK-酰胺和IgG4δ-GK-酰胺。抗KLH兔单克隆抗体用作同种型对照。
具体实施方式
本文所描述或参考的技术和程序是本领域技术人员通常理解并通常使用常规方法来使用的，所述常规方法是例如在以下中描述的广泛利用的方法学：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编著，(2003))；the series Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)：PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著(1995))，Harlow和Lane，编著(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，and Animal CellCulture(R.I.Freshney，编著(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，编著，1984)；Methods in Molecular Biology，Humana Press；Cell Biology：A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis，编著，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)，编著，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Matherand P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：LaboratoryProcedures(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell，编著，1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编著)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos，编著，1987)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction，(Mullis等人，编著，1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等人，编著，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty.，编著，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd and C.Dean编著.，Oxford University Press，2000)；Using Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra，编著，Harwood Academic Publishers，1995)；以及Cancer：Principles andPractice of Oncology(V.T.DeVita等人，编著，J.B.Lippincott Company，1993)。
I.定义
用于本文目的的“受体人构架”是包含源自人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架，如以下所限定。“源自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可包含其相同的氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用的，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对成员(例如，抗体和抗原)之间1∶1相互作用的。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)代表。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，所述方法包括本文所描述的那些。以下描述用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案。
“亲和力成熟”抗体指在一个或更多个高变区(HVR)中具有一个或更多个改变的抗体，与不具有这种改变的亲本抗体相比，这种改变导致抗体对抗原的亲和力的提高。
术语“抗HLA-DQ2.5抗体”和“对HLA-DQ2.5具有结合活性的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合HLA-DQ2.5(本文中称为“HLA-DQ2.5”)以致该抗体可用作靶向HLA-DQ2.5的诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗HLA-DQ2.5抗体与无关的非HLA-DQ2.5蛋白的结合程度小于该抗体与HLA-DQ2.5结合的约10％，如通过例如放射免疫测定法(RIA)所测量的。在某些实施方案中，对HLA-DQ2.5具有结合活性的抗体具有1μM或更小、100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、0.1nM或更小、0.01nM或更小、或0.001nM或更小(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗HLA-DQ2.5抗体结合HLA-DQ2.5的表位，所述表位在来源于不同物种的HLA-DQ2.5中是保守的。
术语“抗体”本文的以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参比抗体“结合相同表位的抗体”是指这样的抗体，所述抗体在竞争测定中阻断参比抗体与其抗原结合50％或更多，并且相反地，参比抗体在竞争测定中阻断所述抗体与其抗原结合50％或更多。本文提供示例性竞争测定。
“自身免疫性疾病”是指由个体自身组织引起的和针对个体自身组织的非恶性疾病或病症。本文的自身免疫性疾病特别地排除恶性或癌性疾病或病况，尤其排除B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多毛细胞白血病和慢性原始粒细胞性白血病。自身免疫性疾病或病症的实例包括但不限于乳糜泻、炎性反应，例如炎性皮肤疾病(包括银屑病和皮炎(例如特应性皮炎))；***性硬皮病和硬化症；与炎性肠病(例如克罗恩疾病和溃疡性结肠炎)相关的应答；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征；ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏性病况，例如湿疹和哮喘以及涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的其它病况；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；类风湿性关节炎；***性红斑狼疮(SLE)(包括但不限于狼疮肾炎、皮肤性狼疮)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)；多发性硬化；雷诺综合征；自身免疫性甲状腺炎；桥本甲状腺炎；变应性脑脊髓炎；干燥综合征；青少年型糖尿病；和与由通常在结核病、结节病、多肌炎、肉芽肿病和血管炎中发现的细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫反应；恶性贫血(爱迪生氏疾病)；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经***(CNS)炎性疾病；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症或库姆斯阳性贫血)；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜疾病；抗磷脂综合征；过敏性神经炎(allergic neuritis)；格雷夫斯病；朗伯-伊顿肌无力综合征；大疱性类天疱疮(pemphigoid bullous)；天疱疮；自身免疫性多内分泌腺疾病(autoimmunepolyendocrinopathies)；莱特氏病；僵人综合征；眼-口-生殖器三联综合征；巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；IgA肾病；IgM多发性神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症。
术语“乳糜泻”是指遗传性自身免疫性疾病，其是由食物中所含的谷蛋白的摄入(ingenstion)引起小肠损害所致的。乳糜泻的症状包括但不限于胃肠道紊乱如腹痛、腹泻和胃食管反流、维生素缺乏、矿物质缺乏、中枢神经***(CNS)症状如疲劳和焦虑抑郁、骨症状如骨软化症和骨质疏松症、皮肤症状如皮肤炎症、血液症状如贫血和淋巴细胞减少症、和其它症状如不育、性腺机能减退和儿童发育不全和身材矮小。
术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分来源于不同来源或物种。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
试剂(例如，药物制剂)的“有效量”是指实现所需的治疗或预防结果所必要的剂量和时间的有效量。
在本文中，术语“Fc区”用于限定含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或甘氨酸-赖氨酸(残基446-447)可存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***，也称为EU索引，如在Kabat等人Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991中所述。
“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，用于指示这样的抗体，所述抗体具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有含有本文所限定的Fc区的重链。
在本文中，术语“谷蛋白”统指在小麦和其它相关谷物中发现的称为醇溶谷蛋白的储存蛋白的合成物(composite)。在肠腔中，谷蛋白被降解成所谓的谷蛋白肽。谷蛋白肽包括但不限于来自小麦的麦醇溶蛋白、来自大麦的大麦醇溶蛋白、来自黑麦的裸麦醇溶蛋白和来自燕麦的燕麦蛋白。
如本文所用的，短语“基本上不具有结合活性”是指抗体以包括非特异性或背景结合但不包括特异性结合的结合水平结合至不感兴趣抗原的活性。换句话说，这种抗体对不感兴趣的抗原“不具有特异性/显著的结合活性”。特异性可以通过本说明书中提及的或本领域已知的任何方法测量。上述非特异性或背景结合的水平可以是零，或者可以不是零而是接近零，或者可以非常低到足以在技术上被本领域技术人员忽略。例如，当技术人员在合适的结合测定中不能检测或观察到针对抗体与不感兴趣的抗原之间结合的任何显著的(或相对强的)信号时，可以说抗体对不感兴趣的抗原“基本上不具有结合活性”或“不具有特异性/显著的结合活性”。或者，“基本上不具有结合活性”或“不具有特异性/显著的结合活性”可被改述为(对不感兴趣的抗原)“没有特异性地/显著地/基本上结合”。有时，短语“不具有结合活性”与本领域中的短语“基本上不具有结合活性”或“不具有特异性/显著的结合活性”具有基本上相同的含义。
在本文中，“HLA-DR/DP”是指“HLA-DR和HLA-DP”或“HLA-DR或HLA-DP”。这些HLA是由人MHC II类基因座上的相应单倍型等位基因编码的MHC II类分子。“HLA-DQ”总称HLA-DQ同种型，包括HLA-DQ2.5、HLA-DQ2.2、HLA-DQ7.5、HLA-DQ5.1、HLA-DQ6.3、HLA-DQ7.3和HLA-DQ8。在本发明中，“除HLA-DQ2.5、HLA-DQ2.2或HLA-DQ7.5之外的HLA-DQ分子”包括但不限于已知亚型(同种型)的HLA-DQ分子，例如HLA-DQ2.3、HLA-DQ4.3、HLA-DQ4.4、HLA-DQ5.1、HLA-DQ5.2、HLA-DQ5.3、HLA-DQ5.4、HLA-DQ6.1、HLA-DQ6.2、HLA-DQ6.3、HLA-DQ6.4、HLA-DQ6.9、HLA-DQ7.2、HLA-DQ7.3、HLA-DQ7.4、HLA-DQ7.5、HLA-DQ7.6、HLA-DQ8、HLA-DQ9.2和HLA-DQ9.3。类似地，“HLA-DR(DP)”是指HLA-DR(DP)同种型。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指其中已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于其的后代，而不考虑传代次数。后代在核酸内容物上可与亲代细胞不完全相同，并且可含有突变。本文包括具有与在原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物活性的突变后代。
“人抗体”是这样的抗体，其具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体或来源于利用人抗体库或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义明确地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是这样的构架，其代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最常见的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，卷1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，所述亚组是如以上Kabat等人中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚组是如以上Kabat等人中那样的亚组III。
“人源化”抗体是指一种嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个(并且典型地，两个)可变结构域，其中全部或基本上全部的HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”，例如非人抗体，是指已经进行人源化的抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中序列高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构确定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的各区域。通常，抗体包含六个HVR：VH中的三个(H1，H2，H3)和VL中的三个(L1，L2，L3)。本文的示例性HVR包括：
(a)出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；
(b)出现在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；
(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
在一个实施方案中，HVR残基包含说明书中所鉴定的那些。
除非另有说明，在本文中，HVR残基和可变结构域中的其它残基(例如FR残基)根据以上Kabat等人编号。
“免疫缀合物”是与一个或更多个异源分子缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)、兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
本文中，“(所述)恒定链”是指由人CD74(GenBank登录号NM_001025159)的基因编码的蛋白质。因此，“恒定链”也被称为“CD74”或“CD74/恒定链”。恒定链与MHC II类分子如HLA-DQ2.5形成复合物，并且该复合物可位于内质网或内体的膜上，或可位于MHC II类表达细胞的质膜上。术语“恒定链(76-295)”是指由根据GenBank登录号NM_001025159的恒定链的位置76至295的氨基酸残基组成的部分肽。CLIP(II类相关的恒定链肽)是恒定链(CD74)的一部分。在本发明中，当评价抗HLA-DQ2.5抗体与合适的HLA-DQ分子如HLA-DQ2.5、HLA-DQ2.2和HLA-DQ7.5的结合时，CLIP肽(例如，SEQ ID NO：103)可以与这些HLA-DQ分子一起使用。同时，对于HLA-DQ5.1，DBY肽(例如，SEQ ID NO：107)可以用于该目的。该肽是DBY蛋白的一部分，DBY蛋白是HLA-DQ5限制性组织相容性抗原。
“分离的”抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体被纯化至大于95％或99％的纯度，如由例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)所确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经从其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，所述核酸分子被包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但是所述核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色***置的染色***置处。
“分离的编码抗HLA-DQ2.5抗体的核酸”是指一个或更多个编码抗体重链和轻链(或其片段)的核酸分子，包括在单个载体或分开的载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或更多个位置处的此类核酸分子。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同源的抗体群体获得的抗体，即，构成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外，例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的制备过程中产生的变体抗体，这种变体通常少量存在。对比于多克隆抗体制备物(通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)，单克隆抗体制备物的各单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，定语“单克隆”指示抗体的特征是从基本上同源的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法制备抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了这样的方法以及其他用于制备单克隆抗体的示例性方法。
“裸抗体”指不与异源部分或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可存在于药物制剂中。
“天然抗体”指天然存在的具有各种结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N端到C端，每条重链具有可变区(VH)，其也称为可变重结构域或重链可变结构域，之后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端到C端，每条轻链具有可变区(VL)，其也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，之后是恒定轻(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以被分配为两种类型之一，称为κ和λ。
相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”被定义为在对序列进行对比并引入缺口(如果必要)以实现最大百分比序列同一性，而不将任何保守置换认为是序列同一性的一部分之后，候选序列中与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)软件或GENETYX(注册商标)(Genetyx有限公司)。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，Inc.，并且源代码已经与用户文件一起提交于美国版权局，Washington D.C.，20559，其以美国版权注册号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公众获得，或者可从源代码编译。ALIGN-2程序应当被编译为在UNIX操作***，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。在将ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A针对、与或相对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可备选地表述为给定氨基酸序列A针对、与或相对给定氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是在A和B的该程序比对中通过序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文所用的所有％氨基酸序列同一性值都是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物制剂”是指这样的制剂，其具有的形式允许包含在其中的活性成分的生物活性是有效的，并且其不含对将被施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它组分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的成分，其对受试者是无毒的。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
除非另有说明，本文所用的术语“HLA-DQ2.5”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然HLA-DQ2.5。该术语包括“全长”未加工的HLA-DQ2.5以及来源于细胞中的加工的任何形式的HLA-DQ2.5。该术语还包括HLA-DQ2.5的天然存在的变体，例如剪接变体或等位变体。示例性HLA-DQ2.5的氨基酸序列在Research Collaboratory for Structural Bioinformatics(RCSB)蛋白质数据库(PDB)登录号4OZG中是公开可获得的。
本文中，“TCR”是指“T细胞受体”，其是位于T细胞(例如HLA-DQ2.5限制性CD4+T细胞)表面上的膜蛋白，并识别呈递于包括HLA-DQ2.5的MHC分子上的抗原片段(例如谷蛋白肽)。
如本文所用，“治疗”(及其语法上的变体如“治疗(treat)”或“进行治疗(treating)”)是指试图改变被治疗个体的自然过程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接的病理后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中各结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，91页(2007).)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以分别使用来自与所述抗原结合的抗体的VH或VL结构域筛选互补VL或VH结构域的文库来分离。参见例如Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用，术语“载体”是指能够使与其连接的另一核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及掺入到已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文称为“表达载体”。
II.组合物
在一个方面，本发明部分基于抗HLA-DQ2.5抗体与将谷蛋白肽呈递给T细胞的HLA-DQ2.5的结合。在某些实施方案中，提供结合HLA-DQ2.5的抗体。
A.示例性抗HLA-DQ2.5抗体
在一个方面，本发明提供对HLA-DQ2.5具有结合活性的分离的抗体。在某些具体实施方案中，该抗HLA-DQ2.5抗体(“抗体”)具有以下功能/特征。
所述抗体对HLA-DQ2.5具有结合活性。换句话说，所述抗体结合HLA-DQ2.5。更优选地，所述抗体对HLA-DQ2.5具有特异性结合活性。即，该抗体特异性地结合HLA-DQ2.5。由于HLA-DQ2.5、HLA-DQ2.2和HLA-DQ7.5之间的相似性，抗HLA-DQ2.5抗体也可特异性结合HLA-DQ2.2和/或HLA-DQ7.5(或对HLA-DQ2.2和/或HLA-DQ7.5具有特异性结合活性)。
所述抗体对HLA-DR/DP基本上不具有结合活性，即，所述抗体基本上不与HLA-DR/DP结合。换句话说，所述抗体对HLA-DR/DP没有特异性结合活性或对HLA-DR/DP没有显著的结合活性。即，抗体不特异性结合HLA-DR/DP或不显著性地结合HLA-DR/DP。类似地，所述抗体对除HLA-DQ2.5、HLA-DQ2.2或HLA-DQ7.5以外的HLA-DQ分子，如HLA-DQ8、HLA-DQ5.1、HLA-DQ6.3和HLA-DQ7.3基本上不具有结合活性，即，所述抗体基本上不结合除HLA-DQ2.5、HLA-DQ2.2或HLA-DQ7.5以外的HLA-DQ分子，如HLA-DQ8、HLA-DQ5.1、HLA-DQ6.3和HLA-DQ7.3。换言之，抗体对除HLA-DQ2.5、HLA-DQ2.2或HLA-DQ7.5以外的HLA-DQ分子，如HLA-DQ8、HLA-DQ5.1、HLA-DQ6.3和HLA-DQ7.3，没有特异性/显著的结合活性。即，所述抗体不与除HLA-DQ2.5、HLA-DQ2.2或HLA-DQ7.5以外的HLA-DQ分子，例如HLA-DQ8、HLA-DQ5.1、HLA-DQ6.3和HLA-DQ7.3，特异性/显著性地结合。为了防止对这些非靶标MHC II类分子的任何实质抑制作用，并改善乳糜泻患者的抗体PK，其中所述患者是HLA-DQ2.5杂合患者，这些特征是优选的。
*“基本上没有结合活性”的特征可以定义为，例如，如图2-11和16-38的FACS结果中所述。在实施例4.1、4.2和7至10的测量条件下，对特定抗原具有“基本上不具有结合活性”的抗体的MFI(平均荧光强度)值为阴性对照的MFI值的300％或更低，优选200％或更低，更优选150％或更低。
在另一个方面，在实施例4.1和4.2的测量条件下，当把IC17的MFI值当做0％且把DQN00139bb的MFI值当做100％时，对特定抗原具有“基本上不具有结合活性″的抗体的MFI值为5％或更低，优选4％或更低，更优选3％或更低。
该抗体对与谷蛋白肽复合的HLA-DQ2.5具有结合活性。在本文中，HLA-DQ2.5分子和谷蛋白肽之间形成的复合物被称为“HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物”或“HLA-DQ2.5/谷蛋白肽”。它也可以改述为，例如“负载有谷蛋白肽的HLA-DQ2.5”、“谷蛋白肽负载的HLA-DQ2.5”、“谷蛋白肽结合的HLA-DQ2.5”、“与谷蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5”和“HLA-DQ2.5与谷蛋白肽的复合物”。同样适用于“HLA-DQ2.5/麦醇溶蛋白肽复合物”、“HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物”、“HLA-DQ2.5/恒定链复合物”、“HLA-DQ2.5/CLIP肽复合物”、“HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽复合物”、“HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽复合物”、“HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽复合物”、“HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽复合物″、“HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽复合物”、“HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽复合物”、“HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽复合物”、“HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽复合物”、“HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽复合物”和以下提及的“HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽复合物”。
谷蛋白肽优选是麦醇溶蛋白肽。麦醇溶蛋白肽优选为33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽或ω2麦醇溶蛋白肽。更优选地，麦醇溶蛋白肽为33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽或ω2麦醇溶蛋白肽。
在一个方面，所述谷蛋白肽优选为裸麦醇溶蛋白肽。裸麦醇溶蛋白肽优选地是裸麦醇溶蛋白1肽或裸麦醇溶蛋白2肽。为了防止对这些非靶标MHC II类分子和与无关肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5的任何实质性抑制作用，并且为了改善乳糜泻患者的抗体PK，这些特征是优选的。
*本发明的抗HLA-DQ2.5抗体具有5×10-7M或更低，优选5×10-8M或更低，更优选1×10-8M或更低，还更优选7×10-9M或更低的解离常数(Kd)，用于结合至由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或所有：HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白1肽复合物、HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽复合物和HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽复合物。
在另一方面，本发明的抗HLA-DQ2.5抗体针对结合至优选地HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物具有5×10-7M或更低、优选地5×10-8M或更低、更优选地1×10-8M或更低、再更优选地7×10-9M或更低的解离常数(Kd)。
抗体针对HLA-DQ2.5与TCR之间的结合具有中和活性。换句话说，抗体阻断HLA-DQ2.5与TCR之间的结合。更优选地，这种结合在存在谷蛋白肽的情况下发生，即，当HLA-DQ2.5被谷蛋白肽结合，或与谷蛋白肽形成复合物时。谷蛋白肽优选是麦醇溶蛋白肽，更优选是33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽或ω2麦醇溶蛋白肽，还更优选是33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽或ω2麦醇溶蛋白肽。在一个方面，谷蛋白肽优选是裸麦醇溶蛋白肽，更优选地是裸麦醇溶蛋白1肽或裸麦醇溶蛋白2肽。所述抗体阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物和HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。优选地，所述抗体阻断HLA-DQ2.5/麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用和/或HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用，更优选地，阻断HLA-DQ2.5/麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
更优选地，所述抗体阻断由以下各项组成的组中的至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部：HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ 2.5/ω2麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽复合物与HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、和HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽复合物与HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
再更优选地，所述抗体阻断由以下各项组成的组中的至少一种、两种、三种、四种或全部：HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、和HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
再更优选地，所述抗体阻断HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用、和HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
相互作用的阻断可以通过阻断HLA-DQ2.5和TCR之间的上述结合来实现。
*“中和活性”的特征可以定义为，例如，如图12和图13中所述。在实施例4.4所述的测量条件下，具有“中和活性”的抗体，通过1μg/mL的抗体浓度，能够将HLA-DQ2.5和TCR之间的结合中和95％或更多，优选97％或更多，更优选99％或更多。
抗体对恒定链(CD74)基本上不具有结合活性(基本上不与其结合)。换句话说，抗体对恒定链不具有特异性/显著的结合活性(不与其特异性/显著的结合)。HLA-DQ分子定位于具有或不具有恒定链的细胞表面上。当HLA-DQ与恒定链形成复合物时，细胞表面上的复合物快速内化至内体中(快速细胞内化，称为″快速内化″)。在内体中，恒定链被蛋白酶降解，并且游离的HLA-DQ负载有肽，例如谷蛋白肽。HLA-DQ/肽复合物被转移至细胞表面，然后被T细胞上的TCR识别。这可以导致乳糜泻。不具有恒定链的复合物缓慢地内化到内体中(缓慢细胞内化，称为“缓慢内化”)。因为抗体不易被快速内化，所以不与恒定链结合是优选的，所述快速内化能够导致抗体与恒定链一起快速转移至内体并被降解。
抗体对HLA-DQ2.5/恒定链基本上不具有结合活性(基本上不与其结合)。换句话说，抗体对HLA-DQ2.5/恒定链不具有特异性/显著的结合活性(不与其特异性/显著性地结合)。即，抗体不经历由恒定链介导的抗体内化(“快速内化”)。这些特征可以通过上述不与恒定链结合来实现。
“基本上没有结合活性”的特征可以定义为，例如，如图14中所描述的。在实施例4.5描述的测量条件下，对特定抗原(即，HLA-DQ2.5-恒定链)“基本上不具有结合活性”的抗HLA-DQ2.5抗体具有0.4或更低的结合/捕获值，即，抗HLA-DQ2.5抗体与HLA-DQ2.5恒定链的结合水平/捕获的抗HLA-DQ2.5抗体的水平。
另外，本发明的一些抗体对HLA-DQ2.2具有结合活性，并且对HLA-DQ7.5基本上不具有结合活性。基于下表6的比对信息，预期这些抗体对HLA-DQ2.5的β链具有结合活性。
本发明的其它抗体对HLA-DQ7.5具有结合活性，并且对HLA-DQ2.2基本上不具有结合活性。基于比对信息，预期这些抗体对HLA-DQ2.5的α链具有结合活性。
本发明的其它抗体对HLA-DQ2.2或HLA-DQ7.5基本上不具有结合活性。优选地，这些抗体对与谷蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有增强的结合活性。换句话说，相比于与除谷蛋白肽以外的肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5，或者相比于不以与任何肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5，这些抗体对与谷蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有更强的结合活性。
更优选地，相比于由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个或全部：HLA-DQ2.5/CLIP肽、HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽、HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽、HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞，这些抗体对由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部具有更强的结合活性：HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽和HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽。
再更优选地，相比于由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个：HLA-DQ2.5/CLIP肽、HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽、HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽、HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞，这些抗体对由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个或全部具有更强的结合活性：HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽。
再更优选地，相比于HLA-DQ2.5/CLIP肽、HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽、HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽、HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞，这些抗体对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽和HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽具有更强的结合活性。
另外，这些抗体对与谷蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性，而对与除谷蛋白肽以外的肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5基本上不具有结合活性，或者对不以与任何肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5基本上不具有结合活性。
更优选地，这些抗体对由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部具有结合活性：HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽和HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽，并且对由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个或全部基本上不具有结合活性：HLA-DQ2.5/CLIP肽、HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽、HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽、HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞。
再更优选地，这些抗体对由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个或全部具有结合活性：HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽，并且对由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个或全部基本上不具有结合活性：HLA-DQ2.5/CLIP肽、HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽、HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽、HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞。
再更优选地，这些抗体对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽和HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽具有结合活性，并且对HLA-DQ2.5/CLIP肽、HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽、HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽、HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞基本上不具有结合活性。
在一个方面，本发明提供一种抗HLA-DQ2.5抗体，其包含选自以下各项中的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR(CDR)：(a)HVR-H1(HCDR1)，其包含SEQ ID NO：13-23和146-149中的任一氨基酸序列；(b)HVR-H2(HCDR2)，其包含SEQ ID NO：25-35和150-153中的任一氨基酸序列；(c)HVR-H3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO：37-47和154-157中的任一氨基酸序列；(d)HVR-L1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO：61-71和162-165中的任一氨基酸序列；(e)HVR-L2(LCDR2)，其包含SEQ ID NO：73-83和166-169中的任一氨基酸序列；和(f)HVR-L3(LCDR3)，其包含SEQ ID NO：85-95和170-173中的任一氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含VH HVR(HCDR)序列中的至少一个或两个或全部三个，所述VH HVR(HCDR)序列选自(a)HVR-H1(HCDR1)，其包含SEQ ID NO：13-23和146-149中的任一氨基酸序列；(b)HVR-H2(HCDR2)，其包含SEQ ID NO：25-35和150-153中的任一氨基酸序列；和(c)HVR-H3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO：37-47和154-157中的任一氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供一种抗体，其包含VL HVR(LCDR)序列中的至少一个或两个或全部三个，所述VL HVR(LCDR)序列选自(a)HVR-L1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO：61-71和162-165中的任一氨基酸序列；(b)HVR-L2(LCDR2)，其包含SEQ ID NO：73-83和166-169中的任一氨基酸序列；和(c)HVR-L3(LCDR3)，其包含SEQ ID NO：85-95和170-173中的任一氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域和(b)VL结构域；其中所述VH结构域包含VH HVR(HCDR)序列的至少一个或两个或所有三个，所述VH HVR(HCDR)序列选自(i)HVR-H1(HCDR1)，其包含SEQ ID NO：13-23和146-149中的任一氨基酸序列，(ii)HVR-H2(HCDR2)，其包含SEQ ID NO：25-35和150-153中的任一氨基酸序列，和(iii)HVR-H3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO：37-47和154-157中的任一氨基酸序列；所述VL结构域包含VLHVR(LCDR)序列的至少一个或两个或所有三个，所述VL HVR(LCDR)序列选自(i)HVR-L1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO：61-71和162-165中的任一氨基酸序列，(ii)HVR-L2(LCDR2)，其包含SEQ ID NO：73-83和166-169中的任一氨基酸序列，和(c)HVR-L3(LCDR3)，其包含SEQID NO：85-95和170-173中的任一氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)HVR-H1(HCDR1)，其包含SEQ IDNO：13-23和146-149中的任一氨基酸序列；(b)HVR-H2(HCDR2)，其包含SEQ ID NO：25-35和150-153中的任一氨基酸序列；(c)HVR-H3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO：37-47和154-157中的任一氨基酸序列；(d)HVR-L1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO：61-71和162-165中的任一氨基酸序列；(e)HVR-L2(LCDR2)，其包含SEQ ID NO：73-83和166-169中的任一氨基酸序列；和(f)HVR-L3(LCDR3)，其包含选自SEQ ID NO：85-95和170-173中的任一氨基酸序列。
在另一方面，本发明抗体的VH、VL、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的序列ID号(SEQ ID NO)如下：
[表1]
Figure BDA0002437182390000331
在某些实施方案中，如上文提供的抗HLA-DQ2.5抗体的任何一个或更多个氨基酸在任何HVR位置被置换。
在某些实施方案中，所述置换是保守置换，如本文所提供的。
在上述任一实施方案中，抗HLA-DQ2.5抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗HLA-DQ2.5抗体包含如以上任一实施方案中的HVR，并且进一步包含受体人构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在另一实施方案中，抗HLA-DQ2.5抗体包含如以上任一实施方案中的HVR，并且进一步包含下表2和3中所示的FR1、FR2、FR3或FR4序列。
在另一个方面，抗HLA-DQ2.5抗体包含与SEQ ID NO：1-11和142-145的任一氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列一致性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VH序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗HLA-DQ2.5抗体保留结合HLA-DQ2.5的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：1-11和142-145的任一个中，总共1至10个氨基酸已经被置换、***和/或缺失。在某些实施方案中，置换、***或缺失发生在HVR外部的区域中(即FR中)。任选地，抗HLA-DQ2.5抗体包含以下序列：SEQ ID NO：1至11和142至145的任一个的VH序列或包含其翻译后修饰的序列。在一个特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：13-23和146-149中的任一氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：25-35和150-153中的任一氨基酸序列；和(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：37-47和154-157中的任一氨基酸序列。翻译后修饰包括但不限于通过焦谷氨酰化(pyroglutamylation)将重链或轻链的N末端的谷氨酰胺或谷氨酸修饰为焦谷氨酸。
在另一个方面，提供抗HLA-DQ2.5抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO：49-59和158-161的任一氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列一致性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VL序列含有相对于参比序列的置换(例如，保守置换)、***或缺失，但是包含那个序列的抗HLA-DQ2.5抗体保留结合HLA-DQ2.5的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：49-59和158-161的任一个中，总共1至10个氨基酸已经被置换、***和/或缺失。在某些实施方案中，置换、***或缺失发生在HVR外部的区域中(即FR中)。任选地，抗HLA-DQ2.5抗体包含以下序列：SEQ ID NO：49至59和158至161的任一个的VL序列或包含其翻译后修饰的序列。在特定的实施方案中，VL包含一个、两个或三个HVR，所述HVR选自(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：61-71和162-165中的任一氨基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：73-83和166-169中的任一氨基酸序列；和(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：85-95和170-173中的任一氨基酸序列。翻译后修饰包括但不限于通过焦谷氨酰化(pyroglutamylation)将重链或轻链的N末端的谷氨酰胺或谷氨酸修饰为焦谷氨酸。
在另一个方面，提供抗HLA-DQ2.5抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH，以及如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含以下序列：SEQ ID NO：1-10和142-145中任一个的VH序列或包含其翻译后修饰的序列，以及SEQ ID NO：49-59和158-161中任一个的VL序列或包含其翻译后修饰的序列。翻译后修饰包括但不限于通过焦谷氨酰化(pyroglutamylation)将重链或轻链的N末端的谷氨酰胺或谷氨酸修饰为焦谷氨酸。
在另外的方面，本发明提供一种抗体，所述抗体与本文提供的抗HLA-DQ2.5抗体结合相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供与任何上述抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供抗体，所述抗体结合由约8-17个氨基酸组成的HLA-DQ2.5的片段内的表位。
在本发明的另外的方面，根据以上任何实施方案的抗HLA-DQ2.5抗体是单克隆抗体，包括嵌合的、人源化的或人的抗体。在一个实施方案中，抗HLA-DQ2.5抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab′、scFv、双抗体或F(ab′)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或如本文所定义的其它抗体类别或同种型。
在另外的方面，根据以上任何实施方案的抗HLA-DQ2.5抗体可以单独地或组合地并入在以下第1-7节中描述的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文所提供的抗体具有1μM或更小、100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、0.1nM或更小、0.01nM或更小、或0.001nM或更小(例如10-8M或更小，例如10- 8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量Kd。在一个实施方式中，利用感兴趣抗体的Fab形式及其抗原进行RIA。例如，Fab对抗原的溶液结合亲和力通过以下方式测量：在未标记抗原的滴定系列的存在下，用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(参见，例如，Chen等，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。为了建立测定条件，将MICROTITER(注册商标)多孔板(Thermo Scientific)用在50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml的捕获抗Fab抗体(CappelLabs)过夜包被，随后用在PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭二至五小时。在非吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与感兴趣的Fab的连续稀释物混合(例如，与Presta等，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中的抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可以持续更长的时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板用于在室温下温育(例如，持续一小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20(TWEEN-20(注册商标))洗涤平板八次。当平板已经干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将平板在TOPCOUNTTMγ计数仪(Packard)上计数十分钟。选择导致小于或等于20％的最大结合的各Fab的浓度用于竞争性结合测定。
根据另一实施方案，使用BIACORE(注册商标)表面等离振子共振测定法测量Kd。例如，在25℃下利用固定化抗原CM5芯片以～10反应单位(RU)进行使用BIACORE(注册商标)-2000或BIACORE(注册商标)-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)的测定。在一个实施方案中，根据供应商的说明，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE公司)用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗原用10mM乙酸钠(pH4.8)稀释至5μg/ml(～0.2μM)，之后以5μl/分钟的流速注射，以获得约10个反应单位(RU)的偶联蛋白。在注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以约25μl/min的流速，将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)注射到具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中。使用简单的一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型(BIACORE(注册商标)Evaluation Software版本3.2)，通过同时拟合结合和解离传感图，计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。参见，例如，Chen等，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果通过以上表面等离振子共振测定法测量的结合速率超过106M-1s-1，则可以通过荧光淬灭技术来确定结合速率，所述荧光淬灭技术为：如在分光计例如配备有截流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色皿的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中所测量的，在存在增加浓度的抗原的情况下，在25℃，pH7.2，测量PBS中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减小(激发＝295nM；发射＝340nM，16nM带通)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fv和scFv片段，以及以下描述的其它片段。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等Nat.Med.9：129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，113卷，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，New York)，第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，双抗体可以是二价的或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)也描述了三元体和四元抗体。
单结构域抗体是这样的抗体片段，其包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis公司，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。
抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的制备，如本文中所述。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利No.4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在另外的实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类型或亚类已经从亲本抗体的类型或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。典型地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或更多个可变结构域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)源自非人抗体，以及FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还包含至少部分的人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所源自的抗体)的相应残基置换，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法被综述于例如Almagro和Fransson，FrontFront.Biosci.13：1619-1633(2008)中，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述了“表面再建(resurfacing)”)；Dall′Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述了“FR改组”)；和Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)和Klimka等，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述了用于FR改组的“定向选择”方法)中。
可用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳匹配(best-fit)”方法选择的构架区(参见，例如Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；源自特定亚组的轻链可变区或重链可变区的人抗体共有序列的构架区(参见，例如Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；和Presta等J.Immunol.，151：2623(1993))；人成熟(体突变)构架区或人种系构架区(参见，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；和源自筛选FR文库的构架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)以及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的多种技术制备。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
人抗体可以通过向转基因动物施用免疫原来制备，所述转基因动物已经被改良成响应抗原攻击产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这样的动物典型地含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这样的转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被失活。对于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。还参见，例如，美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了HUMAB(注册商标)技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M MOUSE(注册商标)技术，以及美国专利申请公布No.US 2007/0061900，其描述了VELOCIMOUSE(注册商标)技术。来自由这种动物产生的完整抗体的人可变区可以进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于制备人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker公司，纽约，1987)；以及Boerner等，J.Immunol.，147：86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术制备的人抗体也描述于Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)中。另外的方法包括在例如美国专利No.7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系制备单克隆人IgM抗体)和Ni，现代免疫学，26(4)：265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein，Histology andHistopathology，20(3)：927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein，Methods andFindings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)中。
人抗体还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可将这种可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。用于从抗体文库选择人抗体的技术描述如下。
5.来源于文库的抗体
本发明的抗体可以通过筛选具有所需一种或多种活性的抗体的组合文库来分离。例如，本领域已知多种方法用于生成噬菌体展示文库并，针对与所需结合特征的抗体筛选所述文库。此种方法被综述于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O′Brien等人，编，Human Press，Totowa，NJ，2001)中，并被进一步描述于例如McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks和Bradbury，Methods in Molecular Biology248：161-175(Lo，编，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因库通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆并在噬菌体文库中随机重组，然后可针对抗原结合噬菌体筛选所述噬菌体文库，如在Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)中所述。噬菌体典型地将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或者是Fab片段。来自经免疫来源的文库提供对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。备选地，可以(例如，从人)克隆天然(naive)库以提供针对广泛的非自身抗原以及自身抗原的单一来源的抗体，而不需要任何免疫，如Griffiths等人，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，也可通过以下方式合成制备天然文库：从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物，以编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如：美国专利No.5,750,373，和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
在本文中，从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。
a)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体被糖基化的程度。抗体糖基化位点的添加或缺失可以通过改变氨基酸序列以便产生或去除一个或更多个糖基化位点方便地实现。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其附接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体典型地包含支链的、分两支的(biantennary)寡糖，所述寡糖一般通过N-连接与Fc区的CH2结构域的Asn297附接。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接至分两支的寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的性质的抗体变体。
在一个实施方案中，提供抗体变体，其具有缺少与Fc区(直接或间接)附接的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，在此种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量通过计算相对于与Asn297附接的所有糖结构(例如，复合物、杂合物和高甘露糖结构)的总和的Asn297处的糖链内岩藻糖的平均量来确定，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，例如如WO2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区中的大约位置297(Fc区残基的EU编号)处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可以位于位置297的上游或下游约+/-3个氨基酸处，即在位置294和位置300之间。此种岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开No.US2003/0157108(Presta，L)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体的公开的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够制备去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷型Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请No.US 2003/0157108 A1，Presta，L；以及WO 2004/056312 A1，Adams等人，特别是实施例11)，以及敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；以及WO2003/085107)。
进一步提供具有被二等分的寡糖的抗体变体，例如，其中与抗体Fc区附接的分两支的寡糖被GlcNAc二等分。此种抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此种抗体变体的实例描述于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)中。还提供在与Fc区附接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此种抗体变体可具有改善的CDC功能。此种抗体变体描述于例如WO1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju，S.)；和WO 1999/22764(Raju，S.)中。
b)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或更多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或更多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在US2005/0014934A1(Hinton等)中描述了这样的抗体，其具有增加的半衰期和增加的与负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))的结合。那些抗体包含具有其中的一个或更多个置换的Fc区，所述置换增加Fc区与FcRn的结合。此种Fc变体包括在以下一个或更多个Fc区残基处具有置换的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的置换(美国专利No.7,371,826)。
还参见Duncan&Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；和涉及Fc区变体的其它实例的WO 94/29351。
c)半胱氨酸工程改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能理想的是制备半胱氨酸工程改造的抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或更多个残基被半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可接近位点处。通过将那些残基置换为半胱氨酸，反应性硫醇基团由此被定位在抗体的可接近位点处，并且可以用于将抗体缀合至其他部分，诸如药物部分或接头-药物部分，以产生免疫缀合物，如本文进一步所描述的。在某些实施方案中，下列残基中的任何一个或更多个可以被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程改造的抗体可以如例如美国专利No.7,521,541中所述生成。
d)抗体衍生物
在某些实施方案中，本文提供的抗体可以被进一步修饰以含有本领域已知的且可容易获得的另外的非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在生产中可具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支化的或未支化的。与抗体附接的聚合物的数目可以变化，并且如果附接超过一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于以下考虑来确定，包括但不限于，待改善的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供抗体和非蛋白质部分的缀合物，所述非蛋白质部分可通过暴露于辐射而被选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长，并且包括但不限于这样的波长，所述波长不伤害正常细胞但将非蛋白质部分加热至将接近抗体-非蛋白质部分的细胞杀死的温度。
B.重组方法和组合物
抗体可以使用重组方法和组合物来制备，例如，如在美国专利No.4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供编码本文所描述的抗HLA-DQ2.5抗体的分离的核酸。此种核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另外的实施方案中，提供一种或更多种包含此种核酸的载体(例如，表达载体)。在另外的实施方案中，提供包含此种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下列物质转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp2/0细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗HLA-DQ2.5抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含编码如上所提供的抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组制备抗HLA-DQ2.5抗体，将例如如上所述的编码抗体的核酸分离并***一个或更多个载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此种核酸可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中制备，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，美国专利No.5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见，Charlton，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo，编，HumanaPress，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，其描述了在大肠杆菌中的抗体片段的表达)表达后，抗体可以从细菌细胞糊料中以可溶级分分离，并可以被进一步纯化。
除了原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经被“人源化”从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，和Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞共同使用，特别是用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如，美国专利No.5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中制备抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是SV40(COS-7)转化的猴肾CV1细胞系；人胚胎肾细胞系(293或如例如Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。对于适用于抗体制备的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，248卷(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
C.测定
通过本领域已知的多种测定可以鉴定、筛选本文提供的抗HLA-DQ2.5抗体或表征其物理/化学性质和/或生物学活性。
1.结合测定和其它测定
在一个方面，例如通过已知的方法如ELISA、蛋白质印迹等测试本发明抗体的抗原结合活性。
在另一个方面，竞争测定可以用于鉴定与例如任何上述抗体竞争结合HLA-DQ2.5的抗体。在某些实施方案中，此种竞争性抗体结合至与上述抗体所结合的相同的表位(例如，线性或构象表位)。用于将抗体结合的表位作图的详细的示例性方法提供于Methods inMolecular Biology vol.66(Humana Press，Totowa，NJ)中的Morris(1996)″EpitopeMapping Protocols，″中。
在示例性竞争测定中，将固定的HLA-DQ2.5在溶液中温育，该溶液包含第一标记抗体和第二未标记抗体，所述第一标记抗体结合HLA-DQ2.5，测试所述第二未标记抗体与第一抗体竞争结合HLA-DQ2.5的能力。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的HLA-DQ2.5在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与HLA-DQ2.5结合的条件下温育后，去除过量的未结合抗体，并测量与固定的HLA-DQ2.5相关联的标记的量。如果与固定的HLA-DQ2.5相关联的标记的量在测试样品中相对于对照样品显著减少，则这表明第二抗体与第一抗体竞争结合HLA-DQ2.5。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(冷泉港实验室，冷泉港，NY)。
2.活性测定/筛选方法
在一个方面，提供用于鉴定具有结合/生物活性的抗HLA-DQ2.5抗体的测定。此种测定可用于本发明的筛选方法中。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于筛选抗HLA-DQ2.5抗体的方法，其包括：(a)测试抗体对HLA-DQ2.5是否具有结合活性；并选择对HLA-DQ2.5具有结合活性的抗体；(b)测试抗体对HLA-DR或DP是否具有特异性结合活性；并选择对HLA-DR或DP不具有特异性结合活性的抗体；(c)测试抗体对恒定链与HLA-DQ2.5的复合物是否具有特异性结合活性；并选择对恒定链与HLA-DQ2.5的复合物不具有特异性结合活性的抗体。由于HLA-DQ2.2和/或HLA-DQ7.5与HLA-DQ2.5的相似性，以上步骤(a)中选择的抗体也可对HLA-DQ2.2和/或HLA-DQ7.5具有结合活性。这一结合活性可以是特异性结合活性。
在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括：在存在谷蛋白肽的情况下，测试抗体是否结合HLA-DQ2.5(或对其具有结合活性)；以及在存在谷蛋白肽的情况下，选择结合HLA-DQ2.5(或对其具有结合活性)的抗体。优选地，所述谷蛋白肽是麦醇溶蛋白。
在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括：测试所述抗体针对抗HLA-DQ2.5与TCR之间的结合是否具有中和活性；以及选择具有中和活性的抗体。
在进行以下步骤之前，候选抗HLA-DQ2.5抗体可通过例如如实施例3中提到的任何方法来制备。
将动物，例如兔、小鼠、大鼠和其它适于免疫的动物，用抗原(例如HLA-DQ2.5，其任选地被麦醇溶蛋白肽结合)进行免疫。可以使用任何方法将抗原制备为重组蛋白，例如，如实施例1和2中所提及的。从经免疫的动物收集含抗体的样品，如血液和脾脏。对于B细胞选择，例如，制备生物素化的抗原，并且抗原结合的B细胞被生物素化的抗原结合，并且将所述细胞进行细胞分选和培养用于选择。细胞与抗原的特异性结合可以通过任何合适的方法如ELISA方法来评价。该方法也可用于评估对不感兴趣的抗原的交叉反应性的缺乏。为了分离或确定所选抗体的序列，例如，从细胞中纯化RNA，并通过RNA的反转录和PCR扩增来制备编码抗体的DNA编码区域。此外，经克隆的抗体基因可以在合适的细胞中表达，并且可以从培养物上清液中纯化抗体用于进一步分析。
为了测试抗HLA-DQ2.5抗体是否结合感兴趣的抗原(例如，HLA-DQ2.5和由谷蛋白肽如麦醇溶蛋白结合的HLA-DQ2.5)或不感兴趣的抗原(例如，HLA-DR、HLA-DP、恒定链、以及恒定链和HLA-DQ2.5的复合物)，可以使用用于评估结合的任何方法。例如，当使用基于FACS的细胞分选方法时，将表达抗原(例如HLA-DQ2.5、HLA-DR或HLA-DP)的细胞与经测试的抗体一起温育，然后加入针对经测试的抗体(即，一抗)的合适第二抗体并温育。通过FACS分析，使用例如附接至第二抗体的发色/荧光标记(例如，如实施例4.1中所提及的)，检测抗原和经测试的抗体之间的结合。备选地，可以使用本说明书中“1.抗体亲和力”中提及的任何测量方法。例如，通过BIACORE表面等离振子共振测定法对Kd的测量可用于在存在谷蛋白肽(例如麦醇溶蛋白)或恒定链的情况下评估经测试抗体与HLA-DQ之间的结合(例如，如实施例4.3和4.5中所述)。
在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括：测试所述抗体针对抗HLA-DQ2.5与TCR之间的结合(或HLA-DQ2.5与HLA-DQ2.5限制性CD4+T细胞之间的相互作用)是否具有中和活性；以及选择具有中和活性的抗体。这些步骤可以在谷蛋白肽例如麦醇溶蛋白肽的存在下进行，即，使用由肽结合的HLA-DQ2.5。中和活性可以例如如实施例4.4中所提及的进行评价。简言之，适当地制备珠子，例如抗生蛋白链霉素包被的黄色颗粒，并将由麦醇溶蛋白肽结合的可溶性HLA-DQ加入珠子中以固定在平板上。洗涤并封闭平板，向其中加入抗体并温育。当评估HLA-DQ2.5与TCR之间的结合时，例如，可以加入D2 TCR四聚体-PE并温育。基于由HLA-DQ2.5结合的TCR的发色/荧光标记，可以评价两者之间的结合。
在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括：测试抗体是否与恒定链一起内化至细胞中；以及选择(基本上)不与恒定链一起内化至细胞中的抗体。细胞内化(上述“快速内化”)可通过FACS分析来评估。简言之，将发色/荧光标记(例如，AlexaFluor 555)附接至经测试的抗体，并在存在或不存在细胞松弛素D的情况下将其与合适的细胞温育，所述细胞松弛素D阻断II类/恒定链复合物向溶酶体的递送。然后，加入针对经测试的抗体(即第一抗体)的合适的第二抗体，例如具有FITC的抗人IgG Fc抗体，并温育。对其进行FACS测量，并从在细胞松弛素D不存在和存在下获得的值计算抗体的恒定链依赖性细胞内化的速率。如果这些值彼此相等或相当，则可以说抗体不与恒定链一起被内化。
实施例
以下是本发明组合物的实施例。应当理解，根据以上提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。
实施例1
重组蛋白的表达和纯化
1.1.重组HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ8/麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ5.1/DBY肽复合物、HLA-DQ2.2/CLIP肽复合物和HLA-DQ7.5/CLIP肽复合物的表达和纯化
重组HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的表达和纯化
用于表达和纯化的序列是：HLA-DQA1*0501(蛋白质数据库登录号4OZG)和HLA-DQB1*0201(蛋白质数据库登录号4OZG)，二者均具有CAMPATH-1H信号序列：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：99)。HLA-DQA1*0501具有C47S突变、GGGG接头(SEQ IDNO：100)和c-fos亮氨酸拉链序列(PNAS，1998年9月29日；95(20)：11828-33)以及在HLA-DQA1*0501的C末端的Flag-Tag。HLA-DQB1*0201具有33聚体麦醇溶蛋白肽序列：LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF(SEQ ID NO：101)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的因子X切割接头(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2007年12月1日；63(Pt 12)：1021-1025.)，GGGGG接头(SEQ ID NO：102)和C-jun亮氨酸拉链序列(PNAS，1998年9月29日；95(20)：11828-33)，GGGGG接头(SEQ ID NO：102)，和BAP序列(BMC Biotechnol.2008；8：41)，在HLA-DQB1*0201的C末端的8x His-标签。使用FreeStyle293-F细胞系(ThermoFisher)瞬时表达重组HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物。将表达HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的条件培养基与固定化的金属亲和层析(IMAC)树脂一起温育，然后用咪唑洗脱。收集含有HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的级分，随后使其经过用1xPBS平衡的Superdex 200凝胶过滤柱(GE Healthcare)。然后合并含有HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的级分并储存于-80℃。使用BirA(Avidity)将纯化的HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物生物素化。
重组HLA-DQ8/麦醇溶蛋白肽复合物的表达和纯化
用于表达和纯化的序列是：HLA-DQA1*0301(蛋白质数据库登录号4GG6)和HLA-DQB1*0302(蛋白质数据库登录号4GG6)，二者均具有CAMPATH-1H信号序列：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：99)。HLA-DQA1*0301具有SSADLVPRGGGG接头(SEQ IDNO：104)和c-fos亮氨酸拉链序列(PNAS，1998年9月29日；95(20)：11828-33)和在HLA-DQA1*0301的C末端的Flag-Tag。HLA-DQB1*0302具有麦醇溶蛋白肽序列：QQYPSGEGSFQPSQENPQ(SEQ ID NO：105)，和在HLA-DQB1*0302的N末端的因子X切割接头(Acta Crystallogr SectF Struct Biol Cryst Commun.2007年12月1日；63(Pt 12)：1021-1025.)，SSADLVPRGGGGG接头(SEQ ID NO：106)和c-jun亮氨酸拉链序列(PNAS，1998年9月29日；95(20)：11828-33)，GGGGG接头(SEQ ID NO：102)，和BAP序列(BMC Biotechnol.2008；8：41)，在HLA-DQB1*0302的C末端的8x His-标签。使用FreeStyle293-F细胞系瞬时表达重组HLA-DQ8/麦醇溶蛋白肽。将表达HLA-DQ8/麦醇溶蛋白肽复合物的条件培养基与IMAC树脂一起温育，然后用咪唑洗脱。收集含有HLA-DQ8/麦醇溶蛋白肽复合物的级分，随后使其经过用1x PBS平衡的Superdex 200凝胶过滤柱。然后合并含有HLA-DQ8/麦醇溶蛋白肽复合物的级分并储存于-80℃。
重组HLA-DQ5.1/DBY肽复合物的表达和纯化
用于表达和纯化的序列是：HLA-DQA1*0101(IMGT/HLA登录号HLA00601)和HLA-DQB1*0501(IMGT/HLA登录号HLA00638)，二者均具有CAMPATH-1H信号序列：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：99)。HLA-DQA1*0101具有C30Y突变。HLA-DQA1*0101具有SSADLVPRGGGG接头(SEQ ID NO：104)和c-fos亮氨酸拉链序列(PNAS，1998年9月29日；95(20)：11828-33)和在HLA-DQA1*0101的C末端的Flag-标签。HLA-DQB1*0501具有DBY肽序列：ATGSNCPPHIENFSDIDMGE(SEQ ID NO：107)，和在HLA-DQB1*0501的N末端的因子X切割接头(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2007年12月1日；63(Pt 12)：1021-1025.)，SSADLVPRGGGGG接头(SEQ ID NO：104)和c-jun亮氨酸拉链序列(PNAS，1998年9月29日；95(20)：11828-33)，GGGGG接头(SEQ ID NO：102)，和BAP序列(BMCBiotechnol.2008；8：41)，在HLA-DQB1*0501的C末端的8x His-标签。使用FreeStyle293-F细胞系瞬时表达重组HLA-DQ5.1/DBY肽复合物。将表达HLA-DQ5.1/DBY肽复合物的条件培养基与IMAC树脂一起温育，然后用咪唑洗脱。收集含有HLA-DQ5.1/DBY肽复合物的级分，随后使其经过用1x PBS平衡的Superdex 200凝胶过滤柱。然后合并含有HLA-DQ5.1/DBY肽复合物的级分并储存于-80℃。使用BirA将纯化的HLA-DQ5.1/DBY肽生物素化。
重组HLA-DQ2.2/CLIP肽复合物的表达和纯化
用于表达和纯化的序列是：HLA-DQA1*0201(IMGT/HLA登录号HLA00607)和HLA-DQB1*0202(IMGT/HLA登录号HLA00623)，二者均具有CAMPATH-1H信号序列：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：99)。HLA-DQA1*0201具有SSADLVPRGGGG接头(SEQ IDNO：104)和c-fos亮氨酸拉链序列(PNAS，1998年9月29日；95(20)：11828-33)和在HLA-DQA1*0201的C末端的Flag-Tag。HLA-DQB1*0202具有CLIP肽序列：KLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALP(SEQ ID NO：103)，和在HLA-DQB1*0202的N末端的因子X切割接头(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2007年12月1日；63(Pt12)：1021-1025.)，SSADLVPRGGGGG接头(SEQ ID NO：104)和c-jun亮氨酸拉链序列(PNAS，1998年9月29日；95(20)：11828-33)，GGGGG接头(SEQ ID NO：102)，和BAP序列(BMCBiotechnol.2008；8：41)，在HLA-DQB1*0202的C末端的8x His-标签。使用FreeStyle293-F细胞系瞬时表达重组HLA-DQ2.2/CLIP肽复合物。将表达HLA-DQ2.2/CLIP肽复合物的条件培养基与IMAC树脂一起温育，然后用咪唑洗脱。收集含有HLA-DQ2.2/CLIP肽复合物的级分，随后使其经过用1x PBS平衡的Superdex 200凝胶过滤柱。然后合并含有HLA-DQ2.2/CLIP肽复合物的级分并储存于-80℃。
重组HLA-DQ7.5/CLIP肽复合物的表达和纯化
用于表达和纯化的序列是：HLA-DQA1*0505(IMGT/HLA登录号HLA00619)和HLA-DQB1*0301(IMGT/HLA登录号HLA00625)，二者均具有CAMPATH-1H信号序列：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：99)。HLA-DQA1*0505具有C66S突变。HLA-DQA1*0505具有SSADLVPRGGGG接头(SEQ ID NO：104)和c-fos亮氨酸拉链序列(PNAS，1998年9月29日；95(20)：11828-33)和在HLA-DQA1*0505的C末端的Flag-Tag。HLA-DQB1*0301具有CLIP肽序列：KLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALP(SEQ ID NO：103)，和在HLA-DQB1*0301的N末端的因子X切割接头(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2007年12月1日；63(Pt12)：1021-1025.)，SSADLVPRGGGGG接头(SEQ ID NO：104)和c-jun亮氨酸拉链序列(PNAS，1998年9月29日；95(20)：11828-33)，GGGGG接头(SEQ ID NO：102)，和BAP序列(BMCBiotechnol.2008；8：41)，在HLA-DQB1*0301的C末端的8x His-标签。使用FreeStyle293-F细胞系瞬时表达重组HLA-DQ7.5/CLIP肽复合物。将表达HLA-DQ7.5/CLIP肽复合物的条件培养基与IMAC树脂一起温育，然后用咪唑洗脱。收集含有HLA-DQ7.5/CLIP肽复合物的级分，随后使其经过用1x PBS平衡的Superdex 200凝胶过滤柱。然后合并含有HLA-DQ7.5/CLIP肽复合物的级分并储存于-80℃。
1.2.重组HLA-DQ2.5/恒定链复合物的表达和纯化
用于表达和纯化的序列是：HLA-DQA1*0501(蛋白质数据库登录号4OZG)、HLA-DQB1*0201(蛋白质数据库登录号4OZG)、恒定链(76-295)(GenBank登录号NM_001025159)，所有这些均具有CAMPATH-1H信号序列：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：99)。HLA-DQA1*0501具有C47S突变、GGGG接头(SEQ ID NO：100)和在HLA-DQA1*0501的C末端的c-fos亮氨酸拉链序列(PNAS，1998年9月29日；95(20)：11828-33)。HLA-DQB1*0201具有GGGGG接头(SEQID NO：102)和c-jun亮氨酸拉链序列(PNAS，1998年9月29日；95(20)：11828-33)和在HLA-DQA1*0201的C末端的8x His-标签。恒定链(76-295)具有Flag-标签、GCN4变体氨基酸序列(Science.1993Nov 26；262(5138)：1401-7)和在恒定链(76-295)的N末端的GGGGS接头(SEQID NO：102)。使用FreeStyle293-F细胞系瞬时表达重组HLA-DQ2.5/恒定链复合物。将表达重组HLA-DQ2.5/恒定链复合物的条件培养基与IMAC树脂一起温育，然后用咪唑洗脱。收集含有重组HLA-DQ2.5/恒定链复合物的级分，随后使其经过用1x PBS平衡的Superose 6凝胶过滤柱(GE Healthcare)。然后合并含有重组HLA-DQ2.5/恒定链复合物的级分并储存于-80℃。
1.3.重组TCR的表达和纯化
用于表达和纯化的序列是：S2 TCRα链(蛋白质数据库登录号4OZI)、S2 TCRβ链(蛋白质数据库登录号4OZI)、D2 TCRα链(蛋白质数据库登录号4OZG)、D2 TCRβ链(蛋白质数据库登录号4OZG)。S2 TCRα链具有CAMPATH-1H信号序列：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：99)，和BAP序列(BMC Biotechnol.2008；8：41)，在S2 TCRα链的C末端的8x His-标签。S2TCRβ链具有CAMPATH-1H信号序列：MGWSCIILFLVATATGVH(SEQ ID NO：108)，以及在S2TCRβ链的C末端的Flag-标签。D2 TCRα链具有源自大鼠血清白蛋白的信号序列：MKWVTFLLLLFISGSAFS(SEQ ID NO：109)，和BAP序列(BMC Biotechnol.2008；8：41)，在D2TCRα链的C末端的8x His-标签。D2 TCRβ链具有源自大鼠血清白蛋白的信号序列：MKWVTFLLLLFISGSAFS(SEQ ID NO：109)，以及在D2 TCRβ链的C末端的Flag-标签。
使用FreeStyle293-F细胞系瞬时表达重组可溶性TCR蛋白。将表达TCR蛋白的条件培养基应用于装有抗-Flag M2亲和树脂(Sigma)的柱，并用Flag肽(Sigma)洗脱。收集含有TCR蛋白的级分，随后将其应用于装有IMAC树脂的柱，然后用咪唑洗脱。收集含有TCR蛋白的级分，并随后使其经过用1x PBS平衡的Superdex 200凝胶过滤柱。然后合并含有TCR蛋白的级分并储存于-80℃。
使用BirA将纯化的TCR蛋白生物素化，然后与PE标记的抗生蛋白链霉素(BioLegend)结合以形成四聚体TCR蛋白。
实施例2
2.1表达D2 TCR的J.RT3-T3.5细胞系的建立
将D2 TCRα链cDNA(SEQ ID NO：110)***到表达载体pCXND3(WO2008/156083)中。将D2 TCRβ链cDNA(SEQ ID NO：111)***到表达载体pCXZD1(US2009/0324589)中。通过电穿孔(LONZA，4D-Nucleofector X)，将线性化的D2 TCRα链-pCXND3和D2 TCRβ链-pCXZD1(各1500ng)同时引入J.RT-T3.5细胞系中。然后将转染的细胞在含有遗传霉素和博来霉素(Zeocin)的培养基中培养，之后使用AriaIII(Becton Dickinson)进行分选以获得高表达的细胞群。然后进行单细胞克隆，以获得高度表达所需D2 TCR分子的细胞。
2.2表达HLA-DQ2.5、HLA-DQ2.5/麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/CLIP肽、HLA-DQ2.2、HLA-DQ7.5、HLA-DQ8、HLA-DQ5.1、HLA-DQ6.3、HLA-DQ7.3、HLA-DR和HLA-DP的Ba/F3细胞系的建立
将HLA-DQA1*0501 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00613)、HLA-DQA1*0201 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00607)、HLA-DQA1*0505 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00619)、HLA-DQA1*0301cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00608)、HLA-DQA1*0101 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00601)、HLA-DQA1*0103 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00604)、HLA-DQA1*0303 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00611)、HLA-DRA1*0101 cDNA (GenBank登录号NM_019111.4)或HLA-DPA1*0103cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00499)***到表达载体pCXND3(WO2008/156083)中。
将HLA-DQB1*0201 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00622)、HLA-DQB1*0202 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00623)、HLA-DQB1*0301 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00625)、HLA-DQB1*0302cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00627)、HLA-DQB1*0501 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00638)、HLA-DQB1*0603 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00647)、HLA-DRB1*0301 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00671)或HLA-DPB1*0401 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00521)***到表达载体pCXZD1(US/20090324589)中。用于HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的HLA-DQB1*0201具有33聚体麦醇溶蛋白肽序列：LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF(SEQ ID NO：101)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的因子X切割接头：(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol CrystCommun.2007年12月1日；63(Pt 12)：1021-1025.)。用于HLA-DQ2.5/CLIP肽复合物的HLA-DQB1*0201具有CLIP肽序列：KLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALP(SEQ ID NO：103)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的因子X切割接头：(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol CrystCommun.2007年12月1日；63(Pt 12)：1021-1025.)。
通过电穿孔(LONZA，4D-Nucleofector X)，将各自1000ng的线性化的HLA-DQA1*0501-pCXND3和HLA-DQB1*0201-pCXZD1、以及各自500ng的线性化的HLA-DQA1*0201-pCXND3和HLA-DQB1*0202-pCXZD1、HLA-DQA1*0505-pCXND3和HLA-DQB1*0301-pCXZD1、HLA-DQA1*0301-pCXND3和HLA-DQB1*0302-pCXZD1、HLA-DQA1*0101-pCXND3和HLA-DQB1*0501-pCXZD1、HLA-DQA1*0103-pCXND3和HLA-DQB1*0603-pCXZD1、HLA-DQA1*0303-pCXND3和HLA-DQB1*0301-pCXZD1、HLA-DRA1*0101-pCXND3和HLA-DRB1*0301-pCXZD1、HLA-DPA1*0103-pCXND3和HLA-DPB1*0401-pCXZD1、HLA-DQA1*0501-pCXND3和用于HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽的HLA-DQB1*0201-pCXZD1、HLA-DQA1*0501-pCXND3和用于HLA-DQ2.5/CLIP肽的HLA-DQB1*0201-pCXZD1同时引入小鼠IL-3依赖性pro-B细胞来源的细胞系Ba/F3中。然后将转染的细胞在含有遗传霉素和博来霉素(Zeocin)的培养基中培养，之后使用AriaIII(BectonDickinson)进行分选以获得高表达的细胞群。然后进行单细胞克隆，以获得高度表达所需HLA分子的细胞。建立的每个细胞系分别命名为Ba/F3-HLA-DQ2.5(HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*0201)、HLA-DQ2.2(HLA-DQA1*0201、HLA-DQB1*0202)、HLA-DQ7.5(HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0301)、Ba/F3-HLA-DQ8(HLA-DQA1*0301、HLA-DQB1*0302)、HLA-DQ5.1(HLA-DQA1*0101、HLA-DQB1*0501)、HLA-DQ6.3(HLA-DQA1*0103、HLA-DQB1*0603)、HLA-DQ7.3(HLA-DQA1*0303、HLA-DQB1*0301)、Ba/F3-HLA-DR(HLA-DRA1*0101、HLA-DRB1*0301)、Ba/F3-HLA-DP(HLA-DPA1*0103、HLA-DPB1*0401)、HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽的HLA-DQB1*0201)、HLA-DQ2.5/CLIP肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/CLIP肽的HLA-DQB1*0201)。
实施例3
抗DQ2.5抗体的生成
如下制备、选择和测定抗DQ2.5抗体：
用HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物皮内免疫NZW兔。在2个月期间内给予四次重复剂量，随后收集血液和脾脏。对于B细胞选择，制备了生物素化的HLA-DQ5.1/DBY肽复合物、生物素化的HLA-DQ8/麦醇溶蛋白肽复合物和Alexa Fluor 488标记的HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物。将能够结合HLA-DQ2.5但不结合HLA-DQ5.1或HLA-DQ8的B细胞用上述标记的蛋白染色，使用细胞分选仪分选，然后根据WO2016098356A1中描述的步骤铺板和培养。培养后，收集B细胞培养上清液用于进一步分析，并将B细胞团块(pellet)冷冻保存。
评价了对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的特异性结合，并使用B细胞培养上清液通过ELISA证实了对HLA-DQ5.1/DBY肽复合物和HLA-DQ8/麦醇溶蛋白肽复合物的非交叉反应性。结果显示880B细胞系展示出与HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的特异性结合。
为了评价对HLA-DQ2.2/CLIP肽复合物和HLA-DQ7.5/CLIP肽复合物的交叉反应性，使用上述选择的880B细胞上清液进行ELISA。另外，通过使用所选择的880B细胞上清液的中和测定来检查中和活性。
中和测定的步骤与下文描述的AlphaLISA中和测定(HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽-D2 TCR)一致。具有高度中和活性的B细胞是优选的，并选择其用于克隆。
使用ZR-96 Quick-RNA试剂盒(ZYMO RESEARCH，Cat No.R1053)，从冷冻保存的细胞团块中纯化具有所需结合特异性的188B细胞系的RNA。这些被命名为DQN0189-0376。所选细胞系中编码抗体重链可变区的DNA通过反转录PCR扩增，并与编码F1332m重链恒定区(SEQID NO：97)的DNA重组。编码抗体轻链可变区的DNA也通过反转录PCR扩增，并与编码hk0MC轻链恒定区(SEQ ID NO：98)的DNA重组。克隆的抗体在FreestyleTM293-F细胞(Invitrogen)中表达，并从培养上清液中纯化。通过下文描述的进一步的评估，基于结合能力、特异性和功能性选择12个克隆(DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0333hh、DQN0282ff、DQN0356bb、DQN0344xx、DQN0334bb、DQN0225dd、DQN0271hh、DQN0324hh和DQN0370hh)。两个克隆(DQN0089ff和DQN0139bb)用作测定对照。这些抗体的VH和VL序列示于表2和3中。这些抗体的VH、VL、HCDR和LCDR的序列ID编号列于表4中。这些CDR的序列示于表2和3中。
例如，表2中的“DQN0223Hh”和表3中的“DQN0223Lh”分别表示DQN0223hh抗体的H链和L链区序列。这同样适用于其它抗体如DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0333hh、DQN0282ff、DQN0356bb、DQN0344xx、DQN0334bb、DQN0225dd、DQN0271hh、DQN0324hh、DQN0370hh、DQN0089ff、DQN0177aa和DQN0139bb。
抗体的H链序列示于表2中。抗体的L链序列示于表3中。抗体区域的序列ID编号示于表4中。
[表2]
Figure BDA0002437182390000571
[表3]
Figure BDA0002437182390000581
[表4]
Figure BDA0002437182390000591
实施例4
抗HLA-DQ2.5抗体的表征
4.1.抗体对HLA-DQ2.5、HLA-DQ2.2和HLA-DQ7.5的结合分析
图1至图5显示了如通过FACS所确定的抗HLA-DQ抗体与一组表达多个MHC II类的Ba/F3细胞系的结合。测试了抗HLA-DQ抗体与Ba/F3-HLA-DQ2.5(表达HLA-DQ2.5)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽(表达HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/CLIP肽(表达HLA-DQ2.5/CLIP肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.2(表达HLA-DQ2.2)和Ba/F3-HLA-DQ7.5(表达HLA-DQ7.5)的结合。将10μg/ml的抗HLA-DQ抗体与每个细胞系在室温温育30分钟，并用FACS缓冲液(PBS中的2％FBS，2mM EDTA)洗涤。然后加入山羊F(ab′)2抗人IgG、小鼠ads-PE(Southern Biotech，Cat.2043-09)并在4℃温育20分钟，并将其用FACS缓冲液洗涤。数据采集在LSRFortessa X-20(Becton Dickinson)上进行，随后使用FlowJo软件(TreeStar)和GraphPad Prism软件(GraphPad)进行分析。
图1显示实施例3中制备的所有抗HLA-DQ2.5抗体，即DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0333hh、DQN0282ff、DQN0356bb、DQN0344xx、DQN0334bb、DQN0089ff和DQN0139bb对HLA-DQ2.5/麦醇溶蛋白肽复合物具有结合活性。IC17显示其中在实验中未添加抗HLA-DQ2.5抗体的阴性对照(背景)的水平。这同样适用于其它附图。
图2显示DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0333hh、DQN0282ff、DQN0356bb、DQN0089ff和DQN0139bb对HLA-DQ2.5/CLIP肽复合物具有结合活性，而DQN0344xx和DQN0334bb对其基本上不具有结合活性。图3显示DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0333hh、DQN0356bb、DQN0089ff和DQN0139bb对不以与麦醇溶蛋白肽或CLIP肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性，而DQN0282ff、DQN0344xx和DQN0334bb对其基本上不具有结合活性。图4显示DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0089ff和DQN0139bb对HLA-DQ2.2具有结合活性，而DQN0333hh、DQN0282ff、DQN0356bb、DQN0344xx和DQN0334bb对其基本上不具有结合活性。图5显示DQN0333hh、DQN0356bb和DQN0139bb对HLA-DQ7.5具有结合活性，而DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0282ff、DQN0344xx、DQN0334bb和DQN0089ff对其基本上不具有结合活性。
4.2.抗体对HLA-DQ8/5.1/6.3/7.3和HLA-DR/DP的结合分析
已知HLA-DQ5.1/6.1/6.3/6.4/7.3/8是欧裔美国人(European americans)中主要的HLA-DQ等位基因(Tissue Antigens.2003年10月；62(4)：296-307.)。考虑到HLA-DQ6.1/6.3/6.4之间的高度序列相似性，选择HLA-DQ6.3等位基因作为代表。
图6至图11显示了如通过FACS所确定的抗HLA-DQ抗体与表达多个MHC II类的Ba/F3细胞系的结合。测试抗HLA-DQ抗体与Ba/F3-HLA-DQ8、BaF3-HLA-DQ5.1、BaF3-HLA-DQ6.3、Ba/F3-HLA-DQ7.3和Ba/F3-HLA-DR、Ba/F3-HLA-DP的结合。将20μg/ml的抗HLA-DQ抗体与每个细胞系在室温温育30分钟，并用FACS缓冲液(PBS中的2％FBS，2mM EDTA)洗涤。然后加入山羊F(ab′)2抗人IgG、小鼠ads-PE(Southern Biotech，Cat.2043-09)并在4℃温育20分钟，并用FACS缓冲液洗涤。数据采集在LSRFortessa X-20(Becton Dickinson)上进行，随后使用FlowJo软件(Tree Star)和GraphPad Prism软件(GraphPad)进行分析。
图6和7显示DQN0089ff对HLA-DP/DR具有结合活性，而其它抗体对HLA-DP/DR基本上不具有结合活性。图8显示DQN0089ff和DQN0139bb对HLA-DQ8具有结合活性，而其它抗体对HLA-DQ8基本上不具有结合活性。图9和10显示DQN0089ff对HLA-DQ5.1/6.3具有结合活性，而其它抗体对HLA-DQ5.1/6.3基本上不具有结合活性。图11显示DQN0139bb对HLA-DQ7.3具有结合活性，而其它抗体对HLA-DQ7.3基本上不具有结合活性。
4.3.抗体对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的结合分析
使用Biacore 8K仪器(GE Healthcare)在37℃下确定在pH 7.4时抗HLA-DQ抗体对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的亲和力。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将抗人Fc(GE Healthcare)固定化到CM4传感器芯片的所有流动池上。所有抗体和分析物都在pH 7.4的ACES中制备，其中所述ACES含有20mM ACES、150mM NaCl、0.05％Tween 20和0.005％NaN3。通过抗人Fc将每种抗体捕获在传感器表面上。抗体捕获水平的目标是200共振单位(RU)。注射经两倍连续稀释至50-800nM的重组HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物，然后进行解离。在每个循环之后用3M MgCl2使传感器表面再生。通过使用Biacore 8K评估软件(GE Healthcare)处理数据并将数据拟合至1∶1结合模型来确定结合亲和力。
表5中显示了抗HLA-DQ2.5抗体与HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物结合的亲和力。
这些结果证明，本发明的抗HLA-DQ2.5抗体在33聚体麦醇溶蛋白肽的存在下结合HLA-DQ2.5，即，结合由33聚体麦醇溶蛋白肽所结合的HLA-DQ。
[表5]
Figure BDA0002437182390000621
4.4.抗体的中和测定
AlphaLISA中和测定(HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽-D2 TCR)
使用AlphaLISA珠测定平台，评估抗HLA-DQ抗体对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物和D2 TCR的结合的中和活性。将40μg/ml抗生蛋白链霉素-AlphaLISA受体珠(Perkin Elmer，AL125M)与10nM生物素化的HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽在pH 7.4的alphascreen缓冲液(40mM HEPES/NaOH(pH7.4)，100mM NaCl，1mM CaCl2，0.1％BSA，0.05％Tween-20)中于室温固定60分钟。同时，将80μg/ml抗生蛋白链霉素-Alphascreen供体珠(Perkin Elmer，6760002)与2.5nM生物素化的D2 TCR在alphascreen缓冲液中于室温固定60分钟。然后，使用384孔板，将10μl连续稀释的抗HLA-DQ抗体与5μl HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽包被的受体珠和5μl D2 TCR包被的供体珠在室温下温育60分钟。通过SpectraMax Paradigm(Molecular Devices)测量Alphascreen信号(每秒计数，CPS)，随后使用GraphPad Prism软件(GraphPad)分析。
如图12所示，抗体针对麦醇溶蛋白结合的HLA-DQ2.5与D2 TCR之间的结合具有中和活性。
珠子中和测定(HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽-S2 TCR)
使用该珠测定平台，评估抗HLA-DQ抗体对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物和S2 TCR的结合的中和活性。将抗生蛋白链霉素包被的黄色颗粒(Spherotech，SVFB-2552-6K)在封闭缓冲液(PBS中的2％BSA)中于室温振荡温育30分钟。离心并吸取上清液后，然后以1.2×104珠/μl溶液添加可溶性HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物，并于室温在96孔板(Sigma Aldrich，Cat No.M2686)上振荡固定60分钟。HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的最终浓度为0.375μg/ml。用封闭缓冲液洗涤平板，并添加连续稀释的抗HLA-DQ抗体，并在室温下振荡温育60分钟。然后将S2 TCR四聚体-PE添加至HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽包被的珠子，并在4℃振荡温育60分钟，并用封闭缓冲液洗涤。S2 TCR四聚体-PE的最终浓度为2.0μg/ml。数据采集在LSR Fortessa(Becton Dickinson)上进行，随后使用FlowJo软件(Tree Star)和GraphPad Prism软件(GraphPad)进行分析。
如图13所示，抗体针对麦醇溶蛋白结合的HLA-DQ2.5与S2 TCR之间的结合具有中和活性。因此，表明了本发明的抗体能够阻断HLA-DQ2.5和HLA-DQ2.5限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
4.5.抗体对HLA-DQ2.5/恒定链的结合分析
使用Biacore 8K仪器(GE Healthcare)在25℃下确定在pH 7.4时抗HLA-DQ抗体对HLA-DQ2.5/恒定链复合物的结合反应。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将抗人Fc(GEHealthcare)固定化到CM4传感器芯片的所有流动池上。所有抗体和分析物都在pH 7.4的ACES中制备，其中所述ACES含有20mM ACES、150mM NaCl、0.05％Tween 20和0.005％NaN3。通过抗人Fc将每种抗体捕获在传感器表面上。抗体捕获水平的目标是200共振单位(RU)。以100nM注射重组HLA-DQ2.5/恒定链复合物，然后解离。在每个循环之后用3M MgCl2使传感器表面再生。
从结合反应中监测抗HLA-DQ2.5抗体针对HLA-DQ2.5/恒定链的结合水平。结合水平被标准化至相应抗HLA-DQ2.5抗体的捕获水平。
由于在尖端(tip)上捕获的抗体的量是变化的，因此结合水平与捕获水平的比率用于评价结合活性。如图14所示，对于抗HLA-DQ2.5抗体，没有观察到对HLA-DQ2.5/恒定链的显著的结合。因此，认为本发明的抗体不特异性结合恒定链和HLA-DQ的复合物。
如上所述，当HLA-DQ与恒定链形成复合物时，细胞表面上的复合物快速内化至内体中(“快速内化”，其中T1/2为约3.2min)。在内体中的恒定链降解之后，HLA-DQ/肽复合物被转移至细胞表面，然后被T细胞上的TCR识别。不具有恒定链的复合物缓慢地内化到内体中(“缓慢内化”，其中T1/2为789-1500min)。
本发明的抗体在恒定链存在下不显著性地结合HLA-DQ的事实表明了，抗体对快速内化的敏感性较小，其中快速内化可导致抗体快速转移至内体并降解。本发明的抗体缺乏快速的细胞内化(即，快速的内体降解)被认为是有用的。
4.6.基于细胞的中和测定
证实了基于细胞的中和活性。将表达HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物(Ba/F3-HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽)的Ba/F3细胞分布于96孔板中(Corning，3799)。然后添加系列稀释的抗HLA-DQ抗体和表达D2 TCR的J.RT-T3.5细胞，并在37℃、5％CO2下培养过夜。Ba/F3-HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽的最终浓度为3.0x104细胞/孔，表达D2 TCR的J.RT-T3.5细胞为1.0x105细胞/孔，并且最终测定体积为100μl/孔。过夜培养后，收获细胞，并通过FACS缓冲液(PBS中的2％FBS，2mM EDTA)洗涤细胞。然后加入30倍稀释的APC抗小鼠CD45抗体(Biolegend，103112)和40倍稀释的Brilliant Violet 421TM抗人CD69抗体(Biolegend，410930)，并在4℃温育30分钟，并用FACS缓冲液洗涤和重悬。在LSR Fortessa(Becton Dickinson)上进行数据采集，然后使用FlowJo软件(Tree Star)和GraphPadPrism软件(GraphPad)进行分析，以确定抗HLA-DQ抗体对J.RT-T3.5细胞活化的中和活性。将在J.RT-T3.5细胞上的CD69表达用作活化标记。如图15所示，抗体抑制由表达DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的Ba/F3细胞诱导的表达D2 TCR的T细胞的活化。
实施例5
抗HLA-DQ2.5抗体的特征
表6显示了主要的HLA-DQ同种型的α链和β链的比对。表中指出了α1结构域和β1结构域，其一起形成肽(例如谷蛋白肽)的负载位点。α1结构域位于α链的位置24-109，β1结构域位于β链的位置33-127(信息来自Mucosal Immunol.2011年1月；4(1)：112-120)。认为TCR结合位点与上述位置重叠或位于上述位置周围。这些位置也预期含有阻断HLA-DQ2.5与TCR之间的结合的抗HLA-DQ2.5抗体的至少部分的表位。
表6中所示的HLA-DQ链序列的序列ID编号如下。HLA-DQ2.5、2.2、5.1、6.1、6.3、6.4、7.3、7.5和8的α链(表6中的“A”)的序列分别示于SEQ ID NO：112至120中。HLA-DQ2.5、2.2、5.1、6.1、6.3、6.4、7.3、7.5和8的β链(表6中的“A”)的序列分别示于SEQ ID NO：121至129中。
[表6]
Figure BDA0002437182390000661
实施例4的结果显示DQN0223hh、DQN0235ee和DQN0303hh对HLA-DQ2.5和HLA-DQ2.2二者均具有结合活性，而对其它HLA-DQ同种型基本上不具有结合活性。HLA-DQ2.5和HLA-DQ2.2之间β链的相似性表明这些抗体具有对HLA-DQ2.5的β链的结合活性。这些抗体的表位可能包含β链的氨基酸58至109的至少一部分。
DDQN0333hh和DQN0356bb对HLA-DQ2.5和HLA-DQ7.5二者均具有结合活性，而对其它HLA-DQ同种型基本上不具有结合活性。HLA-DQ2.5和HLA-DQ7.5之间α链的相似性表明这些抗体具有对HLA-DQ2.5的α链的结合活性。这些抗体的表位可能包含α链的氨基酸63至78和/或97至98的至少一部分。
DQN0344和DQN0334bb仅对HLA-DQ2.5具有结合活性，而对其它HLA-DQ同种型基本上不具有结合活性。预期这些抗体对HLA-DQ2.5的α链和β链二者均具有结合活性。这些抗体的表位可能包含β链的氨基酸58至109和α链的氨基酸63至78和/或97至98二者的至少一部分。
尽管处于清楚理解的目的，已经通过图示和实施例相当详细地描述了前述发明，但是这些描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地以其整体引入作为参考。
实施例6
表达HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽、HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽、HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽、HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽、HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽、HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽的Ba/F3细胞系的建立。
将HLA-DQA1*0501 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00613)***到表达载体pCXND3(WO2008/156083)中。
将HLA-DQB1*0201 cDNA(IMGT/HLA登录号HLA00622)***到表达载体pCXZD1(US/20090324589)中。用于HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽复合物的HLA-DQB1*0201具有α1麦醇溶蛋白肽序列：QPFPQPELPYPGS(SEQ ID NO：130)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的因子X切割接头：(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2007年12月1日；63(Pt 12)：1021-1025.)。用于HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽复合物的HLA-DQB1*0201具有α1b麦醇溶蛋白肽序列：QLPYPQPELPYPGS(SEQ ID NO：131)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的因子X切割接头：(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2007年12月1日；63(Pt 12)：1021-1025.)。用于HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽复合物的HLA-DQB1*0201具有α2麦醇溶蛋白肽序列：APQPELPYPQPGS(SEQ ID NO：132)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的因子X切割接头：(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2007年12月1日；63(Pt 12)：1021-1025.)。用于HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽复合物的HLA-DQB1*0201具有ω1麦醇溶蛋白肽序列：QQPFPQPEQPFPGS(SEQ ID NO：133)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的因子X切割接头：(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2007年12月1日；63(Pt 12)：1021-1025.)。用于HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽复合物的HLA-DQB1*0201具有ω2麦醇溶蛋白肽序列：QFPQPEQPFPWQGS(SEQ ID NO：134)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的因子X切割接头：(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2007年12月1日；63(Pt 12)：1021-1025.)。用于HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽复合物的HLA-DQB1*0201具有裸麦醇溶蛋白1肽序列：QPEQPFPQPEQPFPQGS(SEQ ID NO：135)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的因子X切割接头：(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2007年12月1日；63(Pt12)：1021-1025.)。用于HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽复合物的HLA-DQB1*0201具有裸麦醇溶蛋白2肽序列：QQPFPQPEQPFPQSQGS(SEQ ID NO：136)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的因子X切割接头：(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2007年12月1日；63(Pt 12)：1021-1025.)。用于HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽复合物的HLA-DQB1*0201具有沙门氏菌肽序列：MMAWRMMRY(SEQ ID NO：137)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的GSGGGS接头。用于HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽复合物的HLA-DQB1*0201具有牛分枝杆菌肽序列：KPLLIIAEDVEGEY(SEQ ID NO：138)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的GSGGGS接头。用于HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽复合物的HLA-DQB1*0201具有乙型肝炎病毒肽序列：PDRVHFASPLHVAWR(SEQ ID NO：139)，和在HLA-DQB1*0201的N末端的GSGGGS接头。
通过电穿孔(LONZA，4D-Nucleofector X)，将每个线性化的HLA-DQA1*0501-pCXND3和用于HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽的HLA*0201-pCXZD1、HLA-DQA1*0501-pCXND3和用于HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽的HLA-DQB1*0201-pCXZD1、HLA-DQA1*0501-pCXND3和用于HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽的HLA-DQB1*0201-pCXZD1、HLA-DQA1*0501-pCXND3和用于HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽的HLA-DQB1*0201-pCXZD1、HLA-DQA1*0501-pCXND3和用于HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽的HLA-DQB1*0201-pCXZD1、HLA-DQA1*0501-pCXND3和用于HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽的HLA-DQB1*0201-pCXZD1、HLA-DQA1*0501-pCXND3和用于HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽的HLA-DQB1*0201-pCXZD1、HLA-DQA1*0501-pCXND3和用于HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽的HLA-DQB1*0201-pCXZD1、HLA-DQA1*0501-pCXND3和用于HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽的HLA-DQB1*0201-pCXZD1、HLA-DQA1*0501-pCXND3和用于HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽的HLA-DQB1*0201-pCXZD1同时引入小鼠IL-3依赖性pro-B细胞来源的细胞系Ba/F3中。然后将转染的细胞在含有遗传霉素和博来霉素的培养基中培养。然后检查培养和扩增的细胞的HLA-DQ2.5分子的表达，并证实HLA-DQ2.5的高表达。建立的各细胞系命名为HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽的HLA-DQB1*0201)、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽的HLA-DQB1*0201)、HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽的HLA-DQB1*0201)、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽的HLA-DQB1*0201)、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽的HLA-DQB1*0201)、HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽的HLA-DQB1*0201)、HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽的HLA-DQB1*0201)、HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽的HLA-DQB1*0201)、HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽的HLA-DQB1*0201)、HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/牛分支杆菌肽的HLA-DQB1*0201)、HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽(HLA-DQA1*0501、用于HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽的HLA-DQB1*0201)。
实施例7
抗体对HLA-DQ2.5的结合分析
图16至28显示了如通过FACS所确定的抗HLA-DQ抗体与一组Ba/F3细胞系的结合，所述Ba/F3细胞系表达以与若干肽的的复合物的形式的HLA-DQ。测试了抗HLA-DQ抗体对以下各项的结合：Ba/F3-HLA-DQ2.5(表达HLA-DQ2.5)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽(表达HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/CLIP肽(表达HLA-DQ2.5/CLIP肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽(表达HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽(表达HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽(表达HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽(表达HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽(表达HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽(表达HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽(表达HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽(表达HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽(表达HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽)、Ba/F3-HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽(表达HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽)。将10μg/ml的抗HLA-DQ抗体与每个细胞系在室温温育30分钟，并用FACS缓冲液(PBS中的2％FBS，2mM EDTA)洗涤。然后加入山羊F(ab′)2抗人IgG、小鼠ads-PE(SouthernBiotech，Cat.2043-09)并在4℃温育20分钟，并将其用FACS缓冲液洗涤。数据采集在LSRFortessa X-20(Becton Dickinson)上进行，随后使用FlowJo软件(Tree Star)和GraphPad Prism软件(GraphPad)进行分析。
图16显示DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0333hh、DQN0356bb、DQN0089ff和DQN0139bb对不以与麦醇溶蛋白肽或裸麦醇溶蛋白肽、CLIP肽、沙门氏菌肽、牛分枝杆菌肽、乙型肝炎病毒肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性，而DQN0282ff、DQN0344xx和DQN0334bb、DQN0225dd、DQN0271hh、DQN0324hh、DQN0370hh对其基本上不具有结合活性。
图17显示DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0333hh、DQN0282ff、DQN0356bb、DQN0089ff和DQN0139bb对HLA-DQ2.5/CLIP肽复合物具有结合活性，而DQN0344xx、DQN0334bb、DQN0225dd、DQN0271hh、DQN0324hh、DQN0370hh对其基本上不具有结合活性。IC17显示阴性对照(背景)的水平，其中在实验中未添加抗HLA-DQ2.5抗体。这同样适用于其它附图。
图18-25显示了DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0333hh、DQN0282ff、DQN0356bb、DQN0225dd、DQN0271hh、DQN0324hh、DQN0370hh、DQN0089ff和DQN0139bb对以与33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽、ω2麦醇溶蛋白肽、裸麦醇溶蛋白1肽和裸麦醇溶蛋白2肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性。DQN0344xx对以与33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽、裸麦醇溶蛋白1肽和裸麦醇溶蛋白2肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性。DQN0334bb对以与33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω2麦醇溶蛋白肽和裸麦醇溶蛋白1肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性。
图26-28显示DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0333hh、DQN0356bb、DQN0089ff和DQN0139bb对以与沙门氏菌肽、牛分枝杆菌肽和乙型肝炎病毒肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性，其中所述沙门氏菌肽、牛分枝杆菌肽和乙型肝炎病毒肽不是谷蛋白衍生肽，而DQN0282ff、DQN0344xx和DQN0334bb、DQN0225dd、DQN0271hh、DQN0324hh、DQN0370hh对其基本上不具有结合活性。
实施例8
抗体对HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞的结合分析
图29显示了如通过FACS所确定的抗HLA-DQ抗体与HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞的结合。在人FcR封闭试剂(Miltenyi Biotech，Cat.130-059-901)存在下，将10μg/mL的抗HLA-DQ抗体与PBMC在室温温育30分钟，并用FACS缓冲液(PBS中的2％FBS，2mM EDTA)洗涤。然后加入Pacific BlueTM抗人CD19抗体小鼠IgG1k(Biolegend，Cat.2043-09)和Alexa Fluor555标记的抗人IgG Fc抗体(参考实施例1-3)，并在4℃温育30分钟，并用FACS缓冲液洗涤。数据采集在LSRFortessa X-20(Becton Dickinson)上进行，随后使用FlowJo软件(TreeStar)和GraphPad Prism软件(GraphPad)进行分析。
图29显示DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0333hh、DQN0356bb、DQN0089ff和DQN0139bb对HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞具有结合活性，而DQN0282ff、DQN0344xx和DQN0334bb、DQN0225dd、DQN0271hh、DQN0324hh、DQN0370hh对其基本上不具有结合活性。
图30是图16-29的概要。DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0333hh、DQN0356bb、DQN0089ff和DQN0139bb对以与或不与任何肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性，而DQN0344xx、DQN0334bb、DQN0225dd、DQN0271hh、DQN0324hh、DQN0370hh仅对当在与谷蛋白衍生肽的复合物中时的HLA-DQ2.5具有结合活性，所述谷蛋白衍生肽特别是谷蛋白33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽、ω2麦醇溶蛋白肽、裸麦醇溶蛋白1肽和裸麦醇溶蛋白2肽，只有少数例外。另一方面，DQN0344xx、DQN0334bb、DQN0225dd、DQN0271hh、DQN0324hh、DQN0370hh对以下基本上不具有结合活性：不具有肽的HLA-DQ2.5和与与谷蛋白衍生肽无关的肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5。图30的数字数据示于表7中。
[表7]
Figure BDA0002437182390000731
实施例9
抗体对HLA-DQ2.2和HLA-DQ7.5的结合分析
图31至图32显示了如通过FACS所确定的抗HLA-DQ抗体与一组表达多个MHC II类的Ba/F3细胞系的结合。测试抗HLA-DQ抗体与Ba/F3-HLA-DQ2.2(表达HLA-DQ2.2)、Ba/F3-HLA-DQ7.5(表达HLA-DQ7.5)的结合。将10μg/ml的抗HLA-DQ抗体与每个细胞系在室温温育30分钟，并用FACS缓冲液(PBS中的2％FBS，2mM EDTA)洗涤。然后加入山羊F(ab′)2抗人IgG、小鼠ads-PE(Southern Biotech，Cat.2043-09)并在4℃温育20分钟，并将其用FACS缓冲液洗涤。数据采集在LSRFortessa X-20(Becton Dickinson)上进行，随后使用FlowJo软件(Tree Star)和GraphPad Prism软件(GraphPad)进行分析。
图31显示DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0089ff和DQN0139bb对HLA-DQ2.2具有结合活性，而DQN0333hh、DQN0282ff、DQN0356bb、DQN0344xx和DQN0334bb、DQN0225dd、DQN0271hh、DQN0324hh、DQN0370hh对其基本上不具有结合活性。
图32显示DQN0333hh、DQN0356bb和DQN0139bb对HLA-DQ7.5具有结合活性，而DQN0223hh、DQN0235ee、DQN0303hh、DQN0282ff、DQN0344xx、DQN0334bb、DQN0225dd、DQN0271hh、DQN0324hh、DQN0370hh和DQN0089ff对其基本上不具有结合活性。
实施例10
抗体对HLA-DQ8/5.1/6.3/7.3和HLA-DR/DP的结合分析
图33至图38显示了如通过FACS所确定的抗HLA-DQ抗体与表达多个MHC II类的Ba/F3细胞系的结合。测试抗HLA-DQ抗体与Ba/F3-HLA-DQ8、BaF3-HLA-DQ5.1、BaF3-HLA-DQ6.3、Ba/F3-HLA-DQ7.3和Ba/F3-HLA-DR、Ba/F3-HLA-DP的结合。将20μg/ml的抗HLA-DQ抗体与每个细胞系在室温温育30分钟，并用FACS缓冲液(PBS中的2％FBS，2mM EDTA)洗涤。然后加入山羊F(ab′)2抗人IgG、小鼠ads-PE(Southern Biotech，Cat.2043-09)并在4℃温育20分钟，并用FACS缓冲液洗涤。数据采集在LSRFortessa X-20(Becton Dickinson)上进行，随后使用FlowJo软件(Tree Star)和GraphPad Prism软件(GraphPad)进行分析。
图37和38显示DQN0089ff对HLA-DP/DR具有结合活性，而其它抗体对HLA-DP/DR基本上不具有结合活性。图33显示DQN0089ff和DQN0139bb对HLA-DQ8具有结合活性，而其它抗体对HLA-DQ8基本上不具有结合活性。图34和35显示DQN0089ff对HLA-DQ5.1/6.3具有结合活性，而其它抗体对HLA-DQ5.1/6.3基本上不具有结合活性。图36显示DQN0139bb对HLA-DQ7.3具有结合活性，而其它抗体对HLA-DQ7.3基本上不具有结合活性。
实施例11
基于细胞的中和测定
证实了基于细胞的中和活性。将表达HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物(Ba/F3-HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽)的Ba/F3细胞分布于96孔板中(Corning，3799)。然后添加系列稀释的抗HLA-DQ抗体和表达D2TCR的J.RT-T3.5细胞，并在37℃、5％CO2下培养过夜。Ba/F3-HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽的最终浓度为3.0x104细胞/孔，表达D2 TCR的J.RT-T3.5细胞为1.0x105细胞/孔，并且最终测定体积为100μl/孔。过夜培养后，收获细胞，并通过FACS缓冲液(PBS中的2％FBS，2mM EDTA)洗涤细胞。然后加入30倍稀释的APC抗小鼠CD45抗体(Biolegend，103112)和40倍稀释的Brilliant Violet 421TM抗人CD69抗体(Biolegend，410930)，并在4℃温育30分钟，并用FACS缓冲液洗涤和重悬。在LSR Fortessa(Becton Dickinson)上进行数据采集，然后使用FlowJo软件(Tree Star)和GraphPadPrism软件(GraphPad)进行分析，以确定抗HLA-DQ抗体对J.RT-T3.5细胞活化的中和活性。将在J.RT-T3.5细胞上的CD69表达用作活化标记。如图39所示，抗体抑制由表达DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的Ba/F3细胞诱导的表达D2 TCR的T细胞的活化。
实施例12
AlphaLISA中和测定(HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽-D2 TCR)
使用AlphaLISA珠测定平台，评估抗HLA-DQ抗体对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物和D2 TCR结合的中和活性。将40μg/ml抗生蛋白链霉素-AlphaLISA受体珠(PerkinElmer，AL125M)与10nM生物素化的HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽在pH 7.4的alphascreen缓冲液(40mM HEPES/NaOH(pH7.4)，100mM NaCl，1mM CaCl2，0.1％BSA，0.05％Tween-20)中于室温固定60分钟。同时，将80μg/ml抗生蛋白链霉素-Alphascreen供体珠(Perkin Elmer，6760002)与2.5nM生物素化的D2 TCR在alphascreen缓冲液中于室温固定60分钟。然后，使用384孔板，将10μl连续稀释的抗HLA-DQ抗体与5μl HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽包被的受体珠和5μl D2 TCR包被的供体珠在室温下温育60分钟。通过SpectraMax Paradigm(Molecular Devices)测量Alphascreen信号(每秒计数，CPS)，随后使用GraphPad Prism软件(GraphPad)分析。
如图40所示，抗体针对麦醇溶蛋白结合的HLA-DQ2.5与D2 TCR之间的结合具有中和活性。
实施例13
珠子中和测定(HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽-S2 TCR)
使用AlphaLISA珠测定平台，评估抗HLA-DQ抗体对HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物和S2 TCR结合的中和活性。将抗生蛋白链霉素包被的黄色颗粒(Spherotech，SVFB-2552-6K)在封闭缓冲液(PBS中的2％BSA)中于室温振荡温育30分钟。离心并吸取上清液后，然后以1.2×104珠/μl溶液添加可溶性HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物，并于室温在96孔板(Sigma Aldrich，Cat No.M2686)上振荡固定60分钟。HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物的最终浓度为0.375μg/mL。用封闭缓冲液洗涤平板，并添加连续稀释的抗HLA-DQ抗体，并在室温下振荡温育60分钟。然后将S2 TCR四聚体-PE添加至HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽包被的珠，并在4℃振荡温育60分钟，并用封闭缓冲液洗涤。S2 TCR四聚体-PE的最终浓度为2.0μg/mL。数据采集在LSR Fortessa(Becton Dickinson)上进行，随后使用FlowJo软件(Tree Star)和GraphPad Prism软件(GraphPad)进行分析。
如图41所示，抗体针对麦醇溶蛋白结合的HLA-DQ2.5与S2 TCR之间的结合具有中和活性。因此，表明了本发明的抗体能够阻断HLA-DQ2.5和HLA-DQ2.5限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
实施例14
用于抗HLA-DQ2.5抗体的结合亲和力评价的Biacore分析。
使用Biacore 8K仪器(GE Healthcare)在37℃下确定在pH 7.4时抗HLA-DQ2.5抗体与人HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物结合的亲和力。使用胺偶联试剂盒(GEHealthcare)将抗人Fc(GE Healthcare)固定化到CM4传感器芯片的所有流动池上。所有抗体和分析物都在pH 7.4的ACES中制备，其中所述ACES含有20mM ACES、150mM NaCl、0.05％Tween 20、0.005％NaN3。通过抗人Fc将每种抗体捕获在传感器表面上。抗体捕获水平的目标是200共振单位(RU)。将通过两倍连续稀释制备的50至800nM的重组人HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物注射，然后解离。每个循环用3M MgCl2使传感器表面再生。通过使用Biacore 8K评估软件(GE Healthcare)处理数据并将数据拟合至1∶1结合模型来确定结合亲和力。
抗HLA-DQ2.5抗体与HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物结合的亲和力显示在表8中。
[表8]
Ab名称 ka(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) kd(s<sup>-1</sup>) KD(M)
DQN0089ff 2.28E+05 9.86E-03 4.31E-08
DQN0139bb 6.96E+04 4.63E-04 6.65E-09
DQN0223hh 1.39E+05 2.94E-02 2.11E-07
DQN0225dd 2.40E+05 1.89E-03 7.88E-09
DQN0235ee 9.16E+04 1.72E-03 1.87E-08
DQN0271hh 2.02E+05 1.23E-03 6.07E-09
DQN0282ff 6.63E+04 7.57E-04 1.14E-08
DQN0303hh 7.38E+04 3.08E-04 4.17E-09
DQN0324hh 6.43E+04 4.06E-04 6.32E-09
DQN0333hh 7.39E+04 1.61E-03 2.18E-08
DQN0334bb 1.03E+05 5.91E-04 5.72E-09
DQN0344xx 1.75E+05 1.54E-03 8.83E-09
DQN0356bb 1.11E+05 4.49E-02 4.04E-07
DQN0370hh 2.52E+05 1.13E-03 4.47E-09
实施例15
HLA-DQ2.5/恒定链复合物结合抗HLA-DQ2.5抗体的评价。
使用Biacore 8K仪器(GE Healthcare)在25℃下确定在pH 7.4时抗HLA-DQ2.5抗体对HLA-DQ2.5/恒定链复合物的结合反应。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将抗人Fc(GE Healthcare)固定化到CM4传感器芯片的所有流动池上。所有抗体和分析物都在pH 7.4的ACES中制备，其中所述ACES含有20mM ACES、150mM NaCl、0.05％Tween 20、0.005％NaN3。通过抗人Fc将每种抗体捕获在传感器表面上。抗体捕获水平的目标是200共振单位(RU)。以100nM注射重组人HLA-DQ/恒定链复合物，然后解离。每个循环用3M MgCl2使传感器表面再生。
从结合反应中监测抗HLA-DQ2.5抗体对人HLA-DQ2.5/恒定链的结合水平。将结合水平标准化为相应抗HLA-DQ2.5抗体的捕获水平。
由于在尖端上捕获的抗体的量是变化的，因此结合水平与捕获水平的比率用于评价结合活性。如图42所示，对于抗HLA-DQ2.5抗体，没有观察到对HLA-DQ2.5/恒定链的显著的结合。因此，认为本发明的抗体不特异性结合恒定链和HLA-DQ的复合物。
参考实施例1
8-GK Fc的制备
使用FreeStyleTM 293表达***(Invitrogen)表达人IgG4衍生的δ-GK Fc片段。通过亲和层析(MabSelect SuRe，GE)从收获的细胞培养物中纯化所表达的Fc片段。在最后一步中，我们将缓冲液换成D-PBS(-)。
参考实施例2
抗δ-GK抗体的产生
如下所述制备、选择和测定抗δ-GK抗体。
用实施例1中所表达的人IgG4衍生的δ-GK Fc片段(100-200μg/剂量/头)皮内免疫NZW兔。在3个月期间内重复给予该剂量6次，随后收集血液和脾脏。为了进行B细胞选择，制备IgG4δ-GK抗体(具有遗传缺失的IgG4 C末端GK的IgG4抗体)和野生型IgG4抗体。使用细胞分选仪分选δ-GK特异性B细胞，然后根据WO2016098356A1中描述的步骤进行铺板和培养。培养后，收获B细胞培养上清液用于进一步分析，并将相应的B细胞团块(pellet)冷冻保存。
使用B细胞培养上清液，通过ELISA评价与IgGδ-GK的特异性结合。在这一初步筛选中，使用四种类型的抗体作为抗原以评价针对δ-GK C末端序列的结合特异性：具有遗传缺失的IgG1 C末端K的IgG1抗体(IgG1δ-K)、具有遗传缺失的IgG1 C末端GK的IgG1抗体(IgG1δ-GK)、具有遗传缺失的IgG4 C末端K的IgG4抗体(IgG4δ-K)和具有遗传缺失的IgG4 C末端GK的IgG4抗体(IgG4δ-GK)。结果显示，仅有一个来自单个B细胞克隆的培养上清液样品显示与IgG1δ-GK和IgG4δ-GK的特异性结合(图43)。
与δ-K Fc相比，δ-GK Fc在结构上更类似于δ-GK-酰胺Fc。我们还使用前述的从阳性B细胞克隆中经选择的培养物上清液，表征了与δ-GK Fc和δ-GK-酰胺Fc的特异性结合。通过用上述IgG1δ-K或IgG4δ-K进行PAM处理来制备IgG1δ-GK-酰胺和IgG4δ-GK-酰胺，并通过常规方法纯化。在这种二级筛选中，使用四种类型的抗体作为ELISA测定中的抗原，以评价针对δ-GK C末端序列的结合特异性：IgG1δ-GK、IgG1δ-GK-酰胺、IgG4δ-GK和IgG4δ-GK-酰胺。出于意料的是，测试的单个B细胞培养上清液针对δ-GK分子显示出极高的特异性(图44)。
基于这些筛选结果，使用ZR-96 Quick-RNA试剂盒(ZYMO RESEARCH，CatNo.R1053)从其冷冻保存的细胞团块中提取所选克隆的RNA。获得编码由所选克隆产生的抗体中的抗体重链可变区的DNA，并通过反转录PCR扩增，然后与编码兔IgG重链恒定区(SEQID NO：140)的DNA重组。还获得编码抗体轻链可变区的DNA，并将其通过反转录PCR进行扩增，然后与编码兔Igk轻链恒定区(SEQ ID NO：141)的DNA重组。从这些重组体中产生称为“YG55”的抗δ-GK抗体，其具有两条重链和两条轻链。重链和轻链的VH、VL和HVR序列描述于表9中。YG55使用FreeStyleTM 293表达***表达，并从培养上清液中纯化。
参考实施例3
抗δ-GK单克隆抗体YG55的表征
基因克隆和抗体表达之后，通过如上文二次筛选中所述的ELISA测定来评价YG55的特异性。抗体基因克隆是成功的，导致YG55保留了命中(阳性)B细胞克隆所显示的相同的特异性(图45)。这种高度特异性结合也通过表面等离振子共振测定法证实了。通过晶体结构分析鉴定特异性结合基序及其表位。
[表9]
Figure BDA0002437182390000791
Figure IDA0002437182440000011
Figure IDA0002437182440000021
Figure IDA0002437182440000031
Figure IDA0002437182440000041
Figure IDA0002437182440000051
Figure IDA0002437182440000061
Figure IDA0002437182440000071
Figure IDA0002437182440000081
Figure IDA0002437182440000091
Figure IDA0002437182440000101
Figure IDA0002437182440000111
Figure IDA0002437182440000121
Figure IDA0002437182440000131
Figure IDA0002437182440000141
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Figure IDA0002437182440000201
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Figure IDA0002437182440000351
Figure IDA0002437182440000361

Claims (16)

1.抗HLA-DQ2.5抗体，其对HLA-DQ2.5具有结合活性，并且对HLA-DQ8基本不具有结合活性。
2.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体对与谷蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5(HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物)具有结合活性。
3.权利要求2所述的抗体，其中所述谷蛋白肽是由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部：33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽、ω2麦醇溶蛋白肽、裸麦醇溶蛋白1肽和裸麦醇溶蛋白2肽。
4.权利要求2所述的抗体，其中所述抗体阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物和HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
5.权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DQ5.1、HLA-DQ6.3或HLA-DQ7.3基本上不具有结合活性。
6.权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DR或HLA-DP基本上不具有结合活性。
7.权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中所述抗体对与恒定链的复合物的形式的HLA-DQ2.5(HLA-DQ2.5/恒定链复合物)基本上不具有结合活性。
8.权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DQ2.2具有结合活性，并且对HLA-DQ7.5基本上不具有结合活性。
9.权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DQ7.5具有结合活性，并且对HLA-DQ2.2基本上不具有结合活性。
10.权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体对HLA-DQ2.2或HLA-DQ7.5基本上不具有结合活性。
11.权利要求10所述的抗体，其中所述抗体对与谷蛋白肽的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有增强的结合活性。
12.权利要求11所述的抗体，其中相比于以下复合物的形式的HLA-DQ2.5，所述复合物为HLA-DQ2.5与由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个或全部的复合物：CLIP肽、沙门氏菌肽、牛分枝杆菌肽、乙型肝炎病毒肽和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞(HLA-DQ2.5/CLIP肽复合物、HLA-DQ2.5/沙门氏菌肽复合物、HLA-DQ2.5/牛分枝杆菌肽复合物、HLA-DQ2.5/乙型肝炎病毒肽复合物和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞)，所述抗体对与由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部的复合物的形式的HLA-DQ2.5具有更强的结合活性：33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽、ω2麦醇溶蛋白肽、裸麦醇溶蛋白1肽和裸麦醇溶蛋白2肽(HLA-DQ2.5/33聚体麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/α1麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/α1b麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/α2麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/ω1麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/ω2麦醇溶蛋白肽复合物、HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白1肽复合物和HLA-DQ2.5/裸麦醇溶蛋白2肽复合物)。
13.权利要求1至7中任一项所述的抗体，其为以下(1)至(14)中的任一项：
(1)抗体，其包含SEQ ID NO：13的HCDR1序列、SEQ ID NO：25的HCDR2序列、SEQ ID NO：37的HCDR3序列、SEQ ID NO：61的LCDR1序列、SEQ ID NO：73的LCDR2序列和SEQ ID NO：85的LCDR3序列；
(2)抗体，其包含SEQ ID NO：14的HCDR1序列、SEQ ID NO：26的HCDR2序列、SEQ ID NO：38的HCDR3序列、SEQ ID NO：62的LCDR1序列、SEQ ID NO：74的LCDR2序列和SEQ ID NO：86的LCDR3序列；
(3)抗体，其包含SEQ ID NO：15的HCDR1序列、SEQ ID NO：27的HCDR2序列、SEQ ID NO：39的HCDR3序列、SEQ ID NO：63的LCDR1序列、SEQ ID NO：75的LCDR2序列和SEQ ID NO：87的LCDR3序列；
(4)抗体，其包含SEQ ID NO：16的HCDR1序列、SEQ ID NO：28的HCDR2序列、SEQ ID NO：40的HCDR3序列、SEQ ID NO：64的LCDR1序列、SEQ ID NO：76的LCDR2序列和SEQ ID NO：88的LCDR3序列；
(5)抗体，其包含SEQ ID NO：17的HCDR1序列、SEQ ID NO：29的HCDR2序列、SEQ ID NO：41的HCDR3序列、SEQ ID NO：65的LCDR1序列、SEQ ID NO：77的LCDR2序列和SEQ ID NO：89的LCDR3序列；
(6)抗体，其包含SEQ ID NO：18的HCDR1序列、SEQ ID NO：30的HCDR2序列、SEQ ID NO：42的HCDR3序列、SEQ ID NO：66的LCDR1序列、SEQ ID NO：78的LCDR2序列和SEQ ID NO：90的LCDR3序列；
(7)抗体，其包含SEQ ID NO：19的HCDR1序列、SEQ ID NO：31的HCDR2序列、SEQ ID NO：43的HCDR3序列、SEQ ID NO：67的LCDR1序列、SEQ ID NO：79的LCDR2序列和SEQ ID NO：91的LCDR3序列；
(8)抗体，其包含SEQ ID NO：20的HCDR1序列、SEQ ID NO：32的HCDR2序列、SEQ ID NO：44的HCDR3序列、SEQ ID NO：68的LCDR1序列、SEQ ID NO：80的LCDR2序列和SEQ ID NO：92的LCDR3序列；
(9)抗体，其包含SEQ ID NO：146的HCDR1序列、SEQ ID NO：150的HCDR2序列、SEQ IDNO：154的HCDR3序列、SEQ ID NO：162的LCDR1序列、SEQ ID NO：166的LCDR2序列和SEQ IDNO：170的LCDR3序列；
(10)抗体，其包含SEQ ID NO：147的HCDR1序列、SEQ ID NO：151的HCDR2序列、SEQ IDNO：155的HCDR3序列、SEQ ID NO：163的LCDR1序列、SEQ ID NO：167的LCDR2序列和SEQ IDNO：17192的LCDR3序列；
(11)抗体，其包含SEQ ID NO：148的HCDR1序列、SEQ ID NO：152的HCDR2序列、SEQ IDNO：156的HCDR3序列、SEQ ID NO：164的LCDR1序列、SEQ ID NO：168的LCDR2序列和SEQ IDNO：172的LCDR3序列；
(12)抗体，其包含SEQ ID NO：149的HCDR1序列、SEQ ID NO：153的HCDR2序列、SEQ IDNO：157的HCDR3序列、SEQ ID NO：165的LCDR1序列、SEQ ID NO：169的LCDR2序列和SEQ IDNO：173的LCDR3序列；
(13)抗体，其结合至(1)至(12)中任一项所述抗体所结合的相同的HLA-DQ2.5表位；
(14)抗体，其与(1)至(12)中任一项所述的抗体竞争结合HLA-DQ2.5或谷蛋白肽与HLA-DQ2.5的复合物。
14.抗HLA-DQ2.5抗体，其对HLA-DQ2.5的β链具有结合活性，并且阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
15.抗HLA-DQ2.5抗体，其对HLA-DQ2.5的α链具有结合活性，并且阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物与HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
16.抗体，其对以下复合物的形式的HLA-DQ2.5具有结合活性，所述复合物为HLA-DQ2.5与由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部的复合物：33聚体麦醇溶蛋白肽、α1麦醇溶蛋白肽、α1b麦醇溶蛋白肽、α2麦醇溶蛋白肽、ω1麦醇溶蛋白肽、ω2麦醇溶蛋白肽、裸麦醇溶蛋白1肽和裸麦醇溶蛋白2肽，并且对以下复合物的形式的HLA-DQ2.5基本上不具有结合活性，所述复合物为HLA-DQ2.5与由以下各项组成的组中的至少一个、两个、三个、四个或全部的复合物：CLIP肽、沙门氏菌肽、牛分枝杆菌肽、乙型肝炎病毒肽和HLA-DQ2.5阳性PBMC-B细胞，并且所述抗体阻断HLA-DQ2.5/谷蛋白肽复合物和HLA-DQ2.5/谷蛋白肽限制性CD4+T细胞之间的相互作用。
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