TW201808315A

TW201808315A - 胚芽乳酸桿菌用於製備改善運動表現及降低肌肉疲勞之益生菌組合物之用途

Info

Publication number: TW201808315A
Application number: TW105126982A
Authority: TW
Inventors: 陳奕鳴; 蔡宗佑; 黃啟彰
Original assignee: 國立體育大學
Priority date: 2016-08-24
Filing date: 2016-08-24
Publication date: 2018-03-16
Also published as: US10188685B2; US20180055893A1; TWI583388B

Abstract

本發明提供一種用於增加運動表現及降低疲勞之益生菌組合物之用途，特別是降低運動所引起之疲勞，該益生菌可增加肌肉重量、肌肉持久力，並且降低血液中乳酸、氨、肌胺酸激酶之濃度，並且改善體組成；本發明之益生菌可用於改善運動表現。

Description

胚芽乳酸桿菌用於製備改善運動表現及降低肌肉疲勞之益生菌組合物之用途

本發明提供一種用於增加運動表現及降低疲勞之益生菌組合物之用途，特別是降低運動所引起之疲勞，並增加能量運用和改善運動表現。

胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)係一種革蘭氏陽性細菌，可發現於發酵食物、或動物唾液中，其具有乳酸菌中最大之基因體，故胚芽乳酸桿菌的變異繁多，也有多樣功能應用。

先前報導指出胚芽乳酸桿菌具有多種醫療用途，包括調節發炎相關之疾病(Santos et al.2016 Biomed Res Int)、保護呼吸道之病毒感染(Rice et al.2016 Antiviral Res)、降低脂肪肝的累積(Ivanovic et al.2016 Food Funct)、以及混和於化療藥物後可增加癌細胞對藥物之敏感性(An and Ha 2016 J Microbiol Biotech)，另有多種食品添加物之用途，例如可用於防止生長於玉米之有毒真菌(Deepthi et al.2016 PLoS One)。

生理上之疲勞可區分為肌肉疲勞、慢性疲勞(chronic fatigue syndrome)、和中樞神經疲勞等，其中肌肉之疲勞可肇因於大量運動，並且造成個體之運動機能降低、肌肉收縮能力降低、和運動神經遲緩等現象。

但研究疲勞有其困難之處，係因疲勞為一複雜之生理交互作用及人體構造反應，故如何降低疲勞亦為本技術領域之研究人員所欲達成之研究目標。

關於疲勞之多項因素，其中肌胺酸(creatine)為重要生理因子，而肌胺酸激酶的作用是催化肌酸和磷酸肌酸的相互轉化，同時釋放ATP，提高血中肌胺酸濃度，大部分由骨骼肌或心肌運動所所造成，和平滑肌相關之機率較低。血液中肌胺酸激酶濃度變化之主要原因包括運動，運動後會增加肌胺酸激酶釋放至血液中，可能長達一週。而肌胺酸激酶濃度過高可能為肌肉細胞損壞之徵兆，相關之疾病包含橫紋肌溶解、心肌梗塞、肌炎、或心肌炎。

血中肌胺酸濃度下降，通常沒有臨床之意義，但是可能反映出肌肉運動量較低或久坐之工作與生活習慣，臥床休息會導致CK的活性下降20%以上。補充肌胺酸一直以來都被認為是治療肌肉性、神經性或神經肌肉性疾病的一個可行的辦法。包括治療關節炎、慢性充血性心力衰竭、廢用性萎縮、環狀萎縮、肌肉磷酸化酶缺乏症、亨廷頓病、多樣性神經肌肉疾病、粒線體疾病、肌肉營養失調和神經保護等。

目前已有多項先前技術揭示可降低疲勞之醫藥組合物，I394574揭示牛樟芝萃取之化合物可增加血氨之代謝以達成減緩疲勞之功效、I465235揭示芝麻素及其衍生物可增強肌肉持久力並減輕疲勞、TW 201244647揭示特定之乳酸桿菌菌株可用於改善生活品質且恢復活力；另，US 9198453揭示給予黃酮類化合物(flavanol)可降低血液乳酸濃度並且降低疲勞產生、US9119416揭示給予丙胺醯基麩醯胺酸(alanylglutamine)可降低疲勞產生和恢復肌肉活力、US9023816揭示紅加侖(Ribes rubrum)所萃取之生物鹼可抑制肌肉發炎並且增強粒線體之功能。

本發明係組合胚芽乳酸桿菌之醫療用途及疲勞治療，提供一種增加肌肉質量以及提升運動表現之方法。

為達成前述之發明目的，本發明提供一種胚芽乳酸桿菌用於製備改善運動表現及降低肌肉疲勞之益生菌組合物之用途，該胚芽乳酸桿菌係寄存編號為BCRC910734之胚芽乳酸桿菌。

其中，該降低肌肉疲勞係增加肌肉重量及增加肌肉持久力。

其中，該增加肌肉重量係增加第1型肌肉纖維之數量。

其中，該增加肌肉持久力係改善體組成和改善能量運用。

其中，該降低肌肉疲勞係降低肌肉細胞釋放肌胺酸激酶。

其中，該降低肌肉疲勞係降低血液中乳酸和氨之濃度。

其中，該降低肌肉疲勞係由於骨骼肌疾病或異常所造成。

其中，該降低肌肉疲勞係長時間運動或高強度運動所造成。

其中，該益生菌組合物所包括之益生菌為活化益生菌、不活化益生菌、或前述之組合。

其中，該益生菌組合物包括藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑。

其中，該益生菌組合物之劑型係選自溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、***錠、片劑、口嚼膠、濃漿、和膠囊所構成之群組。

其中，該益生菌組合物進一步製成流體乳品、濃縮牛奶、優酪乳、酸乳、冷凍優格、乳桿菌發酵飲料、奶粉、冰淇淋、乳酪、乾酪、豆漿、發酵豆漿、蔬果汁、果汁、運動飲料、甜點、果凍、糖果、嬰兒食品、健康食品、動物飼料、中草藥組合物、膳食補充品。

其中，該益生菌組合物包括下列益生菌群組其中之一或任意之組合：乳桿菌屬物種、鏈球菌屬物種、雙叉桿菌屬物種、酵母菌。

圖1 實驗小鼠給予LP10六週後對於前肢抓力之影響；6周內小鼠餵食賦形劑、LP10-1X、LP10-5X，再測試其前肢抓力(相異字母a、b表示顯著差異，p<0.05)；圖2 實驗小鼠給予LP10六週後進行游泳運動測試；6周內小鼠餵食賦形劑、LP10-1X、LP10-5X，再進行游泳耗盡試驗，試驗同時於小鼠尾巴給予5%小鼠體重之重量負擔(相異字母a、b表示顯著差異，p<0.05)；圖3 餵食LP10造成血清中(a)尿素、(b)氨、(c)肌胺酸激酶、(d)葡萄糖、(e)血尿素氮之濃度變化(相異字母a、b表示顯著差異，p<0.05)；圖4實驗小鼠於6週實驗期間體重變化(*p<0.05係LP10-1X之統計顯著性，⁺p<0.05係LP10-1X之統計顯著性)；圖5 餵食LP10對於實驗小鼠(a)肝、(b)骨骼肌、(c)心、(d)腎、(e)肺、(f)副睪脂肪墊型態變化之影響(光學顯微鏡200倍放大)；圖6 餵食LP10後，實驗小鼠之腓肚肌免疫組織化學染色結果，分別為(a)餵食賦形劑之控制組、(b)LP10-1X實驗組、(c)LP10-5X實驗組(50倍放大)；圖7 實驗小鼠之腓肚肌之第1型肌肉纖維數量(相異字母a、b表示顯著差異，p<0.05)。

本發明之新穎技術特徵，包含特定特徵，係揭示於申請專利範圍，針對本發明之技術特徵，較佳之理解茲配合說明書、依據本發明原理之實施例、和圖式將本發明較佳之實施例詳細說明。

特定醫學或藥學用語

本發明說明書及申請專利範圍中所述之所有技術性及科學用語，除非另有所定義，皆依據以下敘述定義之。其中單數用語「一」、「一個」、「該」，除非另有說明，皆可指涉多於一個對象。除非另有說明，實施本發明採用之通常技術可包括核磁共振、高效液相層析法、蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術、藥理學技術。本說明書使用之「或」、「以及」、「和」，除非另有說明，皆指涉「或/和」。此外，用語「包含」、「包括」皆非有所限制之開放式連接詞。前述段落僅為系統性之指涉而不應解釋為對發明主體之限制。除非另有說明，本發明所用之材料皆市售易於取得，下列僅為示例可取得之管道。

本說明書用語「益生菌(probiotics)」，係指涉當適當給予時可提供生理健康之益處予服用者之微生物，該微生物具有無毒性、腸道附著力、及增益效果。

本說明書用語「載劑(carrier)」、「賦形劑(vehicle)」，係指涉不具毒性之化合物或藥劑，其具有協助細胞或組織吸收藥物之功能。

前述可為芳香劑(aromatics)、緩衝劑、黏著劑(binders)、著色劑(colorants)、崩解劑(disintegrants)、稀釋劑、乳化劑(emulsifiers)、增量劑(extenders)、氣味改善劑(flavor-improving agents)、膠凝劑(gellants)、滑動劑(glidants)、防腐劑、皮膚滲入促進劑(skin-penetration enhancers)、助溶劑(solubilizers)、安定劑(stabilizers)、懸浮劑(suspending agents)、甜味劑(sweeteners)、張力劑(tonicity agents)、黏度增強劑(viscosity-increasing agents)或上述之任意組合。

本說明書用語「合併使用」或近似用語，係指涉給予、施予一服用者至少一種選擇之藥物，且包含一療程，該療程係同時或分別以相同或多種途徑給藥。

本說明書用語「稀釋劑」，係指涉給藥前用以稀釋藥物之化合物。稀釋劑可用於穩定化合物或藥物，因其可提供較穩定之外在環境。本發明用於溶解鹽類之緩衝溶液並調控酸鹼值，包括但不限於磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline，PBS)。

本說明書用語「有效量(effective amount)」或「治療(therapeutically)有效量」，係指涉化合物或藥物之一足夠量，可於服用者服藥後減輕一或多項疾病症狀或生理狀況；其結果為降低和/或緩和徵象 (sign)、症狀(symptom)、或病因，或為其他生理系統之有意圖之改變。舉例而言，治療之「有效量」係包含一本發明提供化合物之可於臨床上顯著降低疾病症狀之劑量。一適當之有效量，其有效值取決於通常藥學技術，如藥物增量方法(dose escalation methods)。

本說明書用語「提高」、「提升」、「增強」或近似用語，係指涉增加或延長藥物之意圖之效力或持續期間。因此，提升治療藥物之療效，其中「提升」係指涉其餘治療系統中增加或延長之能力，該能力係藥效或持續期間。本說明書用語「提高有效量」係指涉一用以增加另一於治療系統中之治療藥物效果之適當量。

本說明書用語「代謝物」，係指涉化合物代謝後所產生之衍生化合物。本說明書用語「活性代謝物」，係指涉化合物代謝後所產生具生物活性之衍生物。本說明書用語「經代謝後」，係指涉生物體改變特定物質之過程之總和，包括但不限於水解反應、酵素催化反應。故，酵素可令化合物產生特定結構改變；舉例而言，細胞色素P450催化多種氧化還原反應；而二磷酸尿核苷葡萄醣酸酸基轉移酶催化已活化之葡萄糖醛酸產生芳醇、脂族醇、羧酸、胺、硫氫基。

本說明書用語「組合物」，係指涉一產物，該產物係來自混和或組合多於一種活性成分，並且該產物之活性成分係組合藥或非組合藥之組合物。用語「組合藥」說明其活性成分及其助劑(co-agent)係同時以一藥劑給予服用者；用語「非組合藥」說明其活性成分及其助劑(co-agent)係以分離之藥劑同時、分別、或依序地施予服用者且無限制其用藥間隔，前述施予提供服用者於體內具有有效量之多種化合物；其中該非組合藥可應用於雞尾酒療法，即施予三種或多種活性成分。

本說明書用語「疲勞」或其近似用語，係指涉由於長時間運動所造成之肌肉疲勞、由於高強度運動所造成之肌肉疲勞、因長期壓力所造成之肌肉疲勞、個體中高強度運動引起的肌肉疲勞、個體中年齡相關性之肌肉疲勞伴隨於疾病或異常之肌肉疲勞、肌病變所引起之肌肉疲勞、或由於個體的肌肉萎縮症所引起之肌肉疲勞。

本說明書用語「治療」、「治療中」、「療法」，係包含以治療或預防之方式緩和、減輕、或改善至少一項疾病症狀或生理狀況、預防新增之症狀、抑制疾病或生理狀況、阻止或減緩疾病發展、造成疾病或生理狀況之復原、減緩因疾病造成的生理狀況、停止疾病症狀或生理狀況。

用語「服用者」、「治療主體」或近似用語，係哺乳動物，該哺乳動物包含但不限於屬於哺乳綱之動物，如人類、非人靈長類如黑猩猩、猿、猴，或畜牧動物如牛、馬、綿羊、山羊、豬，或家庭動物如兔、狗、貓，或實驗動物如囓齒動物、大鼠、小鼠、天竺鼠、或近似動物。

藥物給予途徑和劑量

適當之給藥途徑包含但不限於口服、靜脈、直腸、氣霧、腸胃道、眼、肺、黏膜穿透、皮膚穿透、***、耳、鼻、局部給藥。

此外，腸胃道給藥之示例包括但不限於肌肉內、皮下、靜脈內、髓內注射，以及髓鞘內、心室內、腹腔內、淋巴內、鼻內注射。

以下治療實施僅為例示，由於個體治療療程之變異極大，而大量的建議值之偏離並非異常。劑量可依據變異而改變，而不限於使用之化合物之活性、治療疾病或生理狀態、給藥方式、個體需求、疾病嚴重性、及醫師判斷。

治療療程之毒性和療效可藉由細胞培養或動物實驗之標準醫藥程序而判定，包括但不限於判斷半數有效劑量(ED₅₀，治療效果達成試驗體半數具有療效之劑量)。

本發明所使用之益生菌組合物，其中該益生菌可為活化或不活化，該不活化可為熱不活化或冷凍乾燥不活化。

舉例而言，該益生菌可藉著置於80℃到100℃下10分鐘加熱使其不活化；該益生菌亦可藉由置於離30瓦UVC燈5公分處用紫外線照射5分鐘使其不活化。另外，該益生菌還可用鈷-60源以20公分的距離用2kg-Gray(kGy)伽瑪照射來失活化。

前述本發明所使用之益生菌組合物，其劑型包含但不限於溶液(solution)、乳劑(emulsion)、懸浮液(suspension)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、***錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(capsule)以及其他類似或適用本發明之劑形。

本發明所使用之益生菌組合物，可選擇性地包括本發明所屬技術領域之通常知識所教示之其他菌種。

其中該益生菌組合物，可選擇性地包括至少一種選自於下列群組中的習知益生菌：乳桿菌屬物種(lactobacillus sp.)、鏈球菌屬物種(Streptococcus sp.)、雙叉桿菌屬物種(Bifidobacterium sp.)、酵母菌(yeasts)。

其中該習知乳桿菌屬物種(lactobacillus sp.)包含但不限於：乳酸乳桿菌(lactobacillus lactis)、嗜酸乳桿菌(lactobacillus acidophilus)、瑞士乳桿菌(lactobacillus helveticus)、雙岐乳桿菌(lactobacillus bifidus)、乳酪乳桿菌(lactobacillus casei)、副乳酪乳桿菌副乳酪亞種(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、或前述之任意組合。

其中該習知鏈球菌屬物種(Streptococcus sp.)包含但不限於：乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酪鏈球菌(Streptococcus cremoris)、或前述之任意組合。

其中該習知雙叉桿菌屬物種(Bifidobacterium sp.)包含但不限於：短型雙叉桿菌(Bifidobacterium breve)、乳酸雙叉桿菌(Bifidobacterium lactis)、長型雙叉桿菌(Bifidobacterium longum)、雙叉型雙叉桿菌(Bifidobacterium bifidum)、或前述之任意組合。

其中該習知酵母菌(yeasts)包含但不限於：啤酒酵母菌(Saccharomyces cereviseae)、乳酒假絲酵母菌(Candida kefyr)、弗羅稜酵母菌(Saccharomyces florentinus)、或前述之任意組合。

本發明所使用之益生菌組合物可為食品組合物，進一步製成膠囊，錠劑，飲料，粉末或乳製品；可選擇性地包括其他益生菌，如腸球菌屬、雙叉桿菌屬、乳酸桿菌屬、鏈球菌屬及乳球菌屬者。

本發明所使用之前述組合物，可進一步添加一可食性材料，以製備為一種食品產品或保健產品。其中該可食性材料包含，但不限於：水(water)、流體乳品(fluid milk products)、牛奶(milk)、濃縮牛奶(concentrated milk)；發酵乳品(fermented milk)，諸如優酪乳(yogurt)、酸乳(sour milk)、冷凍優格(frozen yogurt)、乳桿菌發酵飲料(lactic acid bacteria- fermented beverages)；奶粉(milk powder)；冰淇淋(ice cream)；乳酪(cream cheeses)；乾酪(dry cheeses)；豆奶(soybean milk)；發酵豆奶(fermented soybean milk)；蔬果汁(vegetable-fruit juices)；果汁(juices)；運動飲料(sports drinks)；甜點(confectionery)；果凍(jellys)；糖果(candies)；嬰兒食品(infant formulas)；健康食品(health foods)；動物飼料(animal feeds)；中草藥材(Chinese herbals)；膳食補充品(dietary supplements)等。

本發明所使用之前述組合物可為膳食補充品，可以下列方式給予服用者：與合適的可飲用液體混合，例如水，酸乳酪，牛奶或果汁；或可與固體或液體食品進行混合。本說明書中，膳食補充品之形式可為錠劑，丸劑，膠囊，藥錠糖(lozenge)，顆粒，粉劑，懸浮劑，小藥囊，軟錠劑，糖果，棒，糖漿及相應的投予形式，通常為單位劑量的形式，並以製備膳食補充品的常規方法製造。

組合治療(combination treatment)之通常考量

通常而言，關於說明書中說明之組合治療，本說明書所述之組合物以及其他藥劑成分不必以同一醫藥組合物給藥；於實施例中，因不同的物理和化學特性，可經由不同途徑給藥。於本案實施例中，初期給藥係依據已建立之給藥流程，再由依據臨床藥物功效、劑量、給藥模式、給藥次數等而更動。

於本發明實施例中，治療有效劑量依據組合治療而變動。組合治療可進一步包括週期性治療，該週期性治療係指涉多次起始以及停止之治療以助於病患之臨床管理。關於本說明書所述之組合治療，共同給藥之化合物之劑量，依據共同給藥之藥物、主要治療之藥物、疾病、生理異常、生理狀況等因子而變動。

於本發明實施例中，為達成治療、預防、或改善生理狀況以及緩和症狀，給藥療程係依據多項因子而變動或修正；前述因子包含病患之生理異常、年齡、體重、性別、飲食、用藥情況等。因此，於本案另一實施例，劑量療程可廣泛地變動以及偏離起初之給藥療程。

生物材料

本發明所使用之胚芽乳酸桿菌菌株係Lactobacillus plantarum TWK10(以下簡稱LP10)，寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC910734。進行試驗之前，LP10解凍後於MRS培養基、37℃培養24小時以達成活化細菌之目的；活化後、給予模式動物之前，細菌以3000g之離心力離心10分鐘，並以磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗2次，再懸浮於pH7.2之PBS。

六週大之ICR(Institute for Cancer Research)小鼠購自BioLASCO，飼養於無病原菌之生長環境，給予標準實驗飲食(No.5001；PMI Nutrition International，Brentwood)，實驗小鼠均可任意取用蒸餾水，其生活條件為12小時光照/12小時黑暗之循環，溫度為22℃±1℃，濕度為50-60%。

統計方法

所有實驗數據均以每8隻小鼠之平均值±標準誤差(standard error)表示。各組別之間統計差異使用單因子變異數分析(one-way ANOVA)計算，以及使用趨向檢定(Cochran-Armitage test for trend)分析劑量-療效(dose-effect)之趨向，統計軟體為SAS 9.0。p值小於0.05(p<0.05)則視為具有統計顯著性；前述單因子變異數分析係使用鄧肯後設檢定(Duncan’s post hoc test)計算，以及p<0.05則視為具有統計顯著性。

實施例1 小鼠運動實驗

LP10之人類給藥之治療有效劑量1×10¹⁰CFU(菌落形成單位，colony forming unit)/日係依據先前技術(Van Baarlen et al.2009 PNAS，Million et al.2012 Microb Pathog)而計算。小鼠劑量(2.05×10⁸CFU/公斤(kg))係依據美國食藥署(Food and drg administration)提供之人類等同劑量(Human Equivalent Dose)以及體表面積而換算：假設人類體重為60kg，而人類和小鼠之體表面積轉換係數為12.3人類等同劑量：1×10¹⁰CFU÷60(kg)=16.67×10⁷×12.3=每小鼠劑量2.02×10⁸CFU/kg

總計24隻實驗小鼠隨機分為3組/8隻小鼠，6周內每日口服餵食TWK10，其劑型分別為：賦形劑、2.05×10⁸CFU/kg(組別LP10-1X)、1.03×10⁹CFU/kg(組別LP10-5X)，其中口服餵食之賦形劑之量依小鼠體重增加而等比例增加。餵食進行6週後再以低力測試系統(low-force testing system，Model-RX-5，Aikoh Engineering)測試各組別小鼠之前肢抓力。

各組別小鼠之前肢抓力分別為120±5、158±3、和168±3克(g)(圖1)，其中，實驗組之LP10-1X、LP10-5X分別之抓力為控制組之1.31、1.40倍(p<0.0001)。趨向分析(trend analysis)亦顯示小鼠之抓力依LP10劑量增加而增加(p<0.0001)。

可自前述結果推斷，即使小鼠無進行前置抓力訓練，但仍可於長期給予LP10之後而增加肌肉***力。故，本發明之LP10可增加肌肉重量(muscle mass)並增強前肢抓力。

另，本實施例以游泳耗盡(swim-to-exhaustion)試驗測試小鼠運動能力，該試驗包括賦予小鼠尾巴額外5%體重之重量負擔，並測試小鼠水中運動時間，該水中運動時間係自放入水中至體力耗盡，該體力耗盡係以小鼠無協調動作和連續沉入水面7秒而判斷。

由於肌肉之能量代謝導致疲勞之產生，故運動持久能力即為評估減少疲勞之治療的重要指標。於前述實驗組別中，餵食賦形劑之控制組、LP10-1X、LP10-5X之實驗組，其游泳時間分別為4.8±0.9、9.0±0.6、和23.2±1.4分鐘(圖2)；並且LP10-1X、LP10-5X之實驗組分別之游泳時間為控制組之1.85(p=0.0183)、4.81倍(p<0.0001)。趨向分析亦顯示小鼠之游泳時間依LP10劑量增加而增加(p<0.0001)。

可自前述結果推斷，即使小鼠無進行前置游泳訓練，仍可於長期給予LP10之後而增加游泳時間。

實施例2 小鼠生理因子變化

前述實施例中，小鼠運動後測試小鼠疲勞相關之生化指標。於餵食LP10一小時後，所有小鼠皆進行無額外負擔之15分鐘游泳測試，運動15分後採血並以1500g、4℃離心10分鐘以分離血清。使用Beckman D×C 800自動分析儀測試血清中乳酸、氨、葡萄糖、肌胺酸激酶、和血尿素氮(BUN)。

尿素於與運動相關之血液、肌肉中累積，並且其累積量超出有氧代謝之效能，導致氫離子過量以及酸化，造成疲勞。

餵食賦形劑之控制組、LP10-1X、LP10-5X之實驗組，其血液乳酸濃度分別為6.4±0.3、4.6±0.2、和4.2±0.7毫莫耳/公升(mmol/L)；並且LP10-1X、LP10-5X之實驗組分別之血液乳酸濃度為控制組之27.88%(p=0.0004)、34.11%(p=0.0005)。趨向分析亦顯示小鼠之游泳時間依LP10劑量增加而增加(p<0.0001)(圖3a)。小鼠運動後餵食LP10可有效地除去或降低血液中的乳酸。

又，氨於運動後在血液及腦累積，對於中樞神經系統及疲勞造成負面影響，故為另一能量代謝指標。

餵食賦形劑之控制組、LP10-1X、LP10-5X之實驗組，其血液氨濃度分別為162.1±13、102.5±4.3、和95±5.5微莫耳/公升(μmol/L)；並且LP10-1X、LP10-5X之實驗組分別之血液氨濃度為控制組之36.78%(p=0.0004)、41.40%(p=0.0001)。趨向分析亦顯示小鼠之游泳時間依LP10劑量增加而增加(p<0.0001)(圖3b)。小鼠運動後餵食LP10可有效地除去或降低血液中的氨。

又，血液中葡萄糖濃度為運動持續能力之重要指標。餵食賦形劑之控制組、LP10-1X、LP10-5X之實驗組，其血液葡萄糖濃度分別為154.1±4、148.3±6、和139±7毫克/公合(μmol/dL)，並且三者p值並無顯著差異，但趨向分析顯示小鼠之血液葡萄糖濃度依LP10劑量增加而減少(p=0.0151)(圖3d)。小鼠六周內持續餵食LP10可有效地增加能量之運用及改善運動能力。

再者，血液中肌胺酸激酶為肌肉損傷、肌肉營養缺乏、重度肌肉衰竭等機能障礙之指標。餵食賦形劑之控制組、LP10-1X、LP10- 5X之實驗組，其血液肌胺酸激酶濃度分別為228.3±38.4、154.1±18.8、和147.8±16.5mg/dL；並且LP10-1X、LP10-5X之實驗組分別之血液肌胺酸激酶濃度為控制組之32.48%(p=0.0165)、35.27%(p=0.0142)。趨向分析亦顯示小鼠之游泳時間依LP10劑量增加而增加(p=0.0118)(圖3c)。小鼠運動後餵食LP10可有效地改善劇烈運動所引起的骨骼肌傷害。

另，血尿素氮為疲勞之重要指標，係測量血液中代謝廢棄之尿素之氮濃度，而尿素為含氮化合物之代謝產物。血尿素氮濃度增加反映蛋白質降解，造成肌肉收縮力下降以及疲勞。但於各組別，血尿素氮均無差異(圖3e)。

綜本實施例所述，LP10可應用於改善腸道微生物相並調節能量運用，有效地降低小鼠疲勞相關生理因子。

實施例3 6週餵食LP10後小鼠重量變化

餵食LP10六週後，犧牲實驗小鼠並解剖、測量各器官重量。依據表1所揭示，各組小鼠實驗前起始體重並無顯著差異，而餵食LP10六週後，LP10-1X、LP10-5X之實驗組最終體重分別低於控制組7.47%(p=0.0003)、3.46%(p=0.0567)。此外，LP10-5X組別之飲食量、飲水量均增加；趨向分析顯示其飲食量、飲水量依LP10劑量增加而增加(p<0.0001)。相對地，餵食載劑之控制組於實驗第3週時顯著較高(p<0.05)(圖4)，故連續3週餵食LP10可有效改變體重以及能量運用。

另測量餵食LP10對於肌肉和副睪脂肪墊之重量及相對重量(組織器官重量相對於個體重量)之影響。LP10-1X、LP10-5X之實驗組，其副睪脂肪墊之重量分別低於控制組34.62%(p=0.003)、50.30%(p<0.0001)；趨向分析顯示其副睪脂肪墊重量依LP10劑量增加而降低(p<0.0001)；而副睪脂肪墊之相對重量亦分別降低28.93%(p=0.0048)、48.22%(p<0.0001)。

LP10-1X、LP10-5X之實驗組，其肌肉(腓肚肌和比目魚肌)之相對重量分別高於控制組1.10倍(p=0.0003)、1.07倍(p=0.0098)。依據趨向分析，均顯示副睪脂肪墊相對重量、和肌肉相對重量，依LP10劑量增加而分別降低、增加(p=0.0326)。因此，LP30餵食六週可有效地改善體組成並且使服用個體更加強健。此外，趨向分析顯示，實驗組之腎(p<0.0001)、心(p=0.0018)之相對重量依LP10劑量增加而增加，而於任何器官皆無顯著異常。

表1中結果數據以每8隻小鼠之平均值±標準誤差表示，同列中字母a、b、c表示顯著差異p<0.05；肌肉重量包含小腿後端之腓肚肌和比目魚肌。

實施例4 6週餵食LP10後小鼠生化指標之變化

本實施例檢測6週餵食LP10後小鼠血液中各生化指標之變化，其結果揭示於表2。

依據表2所揭示，各組別之間多項生化指標，包括肌胺酸激酶、總蛋白、肌胺酸、尿酸、總膽固醇、和葡萄糖，均無顯著差異(P>0.05)；而LP10-5X之實驗組，其白蛋白降低15.50%(p=0.0375)。LP10-1X、LP10-5X之實驗組，其血尿素氮分別低於控制組15.50%(p=0.0218)、13.29%(p=0.0037)。依據趨向分析，顯示小鼠血液白蛋白(p=0.0012)、和血尿素氮(p=0.0017)依LP10劑量增加而分別降低。因此，長期服用LP10可增強組織保護以及腎功能。

此外，LP10-1X、LP10-5X之實驗組，其三酸甘油酯分別低於控制組22.76%(p=0.0069)、26.60%(p=0.0021)；依據趨向分析，顯示小鼠血液三酸甘油酯依LP10劑量增加而降低(p=0.0005)。

表2中結果數據以每8隻小鼠之平均值±標準誤差表示，同列中字母a、b表示單因子變異數分析顯著差異p<0.05。

再者，取出小鼠器官後，浸泡於10%福馬林固定、包埋於石蠟中切片成為4μm之樣本，再以HE染色觀察組織變化。結果顯示，餵食LP10六週後，對於各器官，如肝、骨骼肌、心、腎、肺、和副睪脂肪墊均無副作用(圖5a-f)，因此可推斷本說明書實施例所使用之劑量安全。

實施例5 免疫組織化學染色

同實施例4所述進行切片，並使用肌凝蛋白快速重鏈(WB-MHCf)和肌凝蛋白慢速重鏈(WB-MHCs)之抗體(徠卡)，前者可與快肌結合而後者則與慢肌結合。將切片在抗體和4℃的條件下反應一晚後，使用2級抗體(Histofine Simple Stain,NICHIREI)於室溫下作用30分鐘，並以二胺基聯苯胺(3,3'-diaminobenzidine，DAB)呈色方法進行慢肌纖維染色。

實驗小鼠之腓肚肌之免疫組織化學染色結果揭示於圖6，其中紅色纖維為腓肚肌之第1型纖維(慢肌)，圖6紅色箭號處表示第1型纖維於服用LP10後顯著增加；餵食賦形劑之控制組、LP10-1X、LP10-5X之實驗組所具有之第1型肌肉纖維數量分別為62±10、91±2、和108±15(圖7)，LP10-5X之組別相對於控制組增加1.72倍(p=0.0223)。故可推斷餵食LP10可增加小鼠之腓肚肌之第1型肌肉纖維，並增加小鼠之運動持久力。

於本說明書較佳實施例揭示之內容，本發明所屬領域具有通常知識者可明顯得知前述實施例僅為例示；具本發明所屬技術領域通常知識者可藉由諸多變換、替換而實施，而不與本發明之技術特徵有所差異。依據說明書實施例，本發明可有多種變換仍無礙於實施。本說明書提供之請求項界定本發明之範圍，該範圍涵蓋前述方法與結構及與其相等之發明。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

財團法人食品工業發展研究所

2016年6月30日

BCRC910734

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Claims

一種胚芽乳酸桿菌用於製備改善運動表現及降低肌肉疲勞之益生菌組合物之用途，該胚芽乳酸桿菌係寄存編號為BCRC910734之胚芽乳酸桿菌。
如申請專利範圍第1項所述之用途，該降低肌肉疲勞係增加肌肉重量及增加肌肉持久力。
如申請專利範圍第1項所述之用途，該增加肌肉重量係增加第1型肌肉纖維之數量。
如申請專利範圍第1項所述之用途，該增加肌肉持久力係改善體組成和改善能量運用。
如申請專利範圍第1項所述之用途，該降低肌肉疲勞係降低肌肉細胞釋放肌胺酸激酶。
如申請專利範圍第1項所述之用途，該降低肌肉疲勞係降低血液中乳酸和氨之濃度。
如申請專利範圍第1項所述之用途，該降低肌肉疲勞係由於骨骼肌疾病或異常所造成。
如申請專利範圍第1項所述之用途，該降低肌肉疲勞係長時間運動或高強度運動所造成。
如申請專利範圍第1項所述之用途，該益生菌組合物所包括之益生菌為活化益生菌、不活化益生菌、或前述之組合。
如申請專利範圍第1項所述之用途，該益生菌組合物包括藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑。
如申請專利範圍第1項所述之用途，該益生菌組合物之劑型係選自溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、***錠、片劑、口嚼膠、濃漿、和膠囊所構成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之用途，該益生菌組合物進一步製成流體乳品、濃縮牛奶、優酪乳、酸乳、冷凍優格、乳桿菌發酵飲料、奶粉、冰淇淋、乳酪、乾酪、豆漿、發酵豆漿、蔬果汁、果汁、運動飲料、甜點、果凍、糖果、嬰兒食品、健康食品、動物飼料、中草藥組合物、膳食補充品。
如申請專利範圍第1項所述之用途，該益生菌組合物包括下列益生菌群組其中之一或任意之組合：乳桿菌屬物種、鏈球菌屬物種、雙叉桿菌屬物種、酵母菌。